CN109939222B - Creg蛋白用于促进骨骼肌再生的医药用途 - Google Patents
Creg蛋白用于促进骨骼肌再生的医药用途 Download PDFInfo
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Landscapes
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Abstract
本发明涉及E1A激活基因阻遏子蛋白的用途，主要涉及CREG蛋白用于促进骨骼肌再生的医药用途，具体涉及到CREG蛋白或其活性片段在制备用于促进各种骨骼肌损伤的再生修复以及预防和治疗各种疾病或生理现象导致的骨骼肌再生能力减弱药物中的应用。CREG在骨骼肌损伤再生过程中起重要调控作用，CREG蛋白用于促进骨骼肌再生的医药用途，将CREG蛋白或其活性片段制备用于促进各种骨骼肌损伤的再生修复以及预防和治疗各种疾病或生理现象导致的骨骼肌再生能力减弱的药物。
Description
技术领域
本发明涉及E1A激活基因阻遏子（cellular repressor of E1A stimulatedgene, CREG）蛋白的用途，主要涉及CREG蛋白用于促进骨骼肌再生的医药用途，具体涉及到CREG蛋白或其活性片段在制备用于促进各种骨骼肌损伤的再生修复以及预防和治疗各种疾病或生理现象导致的骨骼肌再生能力减弱药物中的应用。
背景技术
骨骼肌占人体重量的40%，一方面骨骼肌收缩牵引骨骼而产生关节的运动，另一方面骨骼肌将细胞外的糖类和脂质摄入到细胞内进行能量代谢，以调控全身能量平衡。人体的骨骼肌共有639块，是由约60亿条肌纤维组成，具有可再生能力。当骨骼肌受到损伤，包括各种急慢性损伤，如运动导致的拉伸伤、各种机械性创伤和中毒导致的骨骼肌溶解等，肌纤维发生断裂或溶解。因此，骨骼肌的可再生能力是维系骨骼肌结构和功能完整的重要保证。卫星细胞存在于成熟的肌纤维表面质膜与基膜之间，是骨骼肌再生的基础。在成熟的骨骼肌中，卫星细胞处于静止状态，当骨骼肌发生损伤时，卫星细胞被激活成为肌原细胞，肌原细胞经历增殖和分化形成肌管，肌管相互融合形成成熟的肌纤维，进而填补受损的肌纤维，完成骨骼肌的损伤修复。因此骨骼肌稳态的维持有赖于损伤与骨骼肌再生修复之间的动态平衡。
当骨骼肌再生能力减弱时，损伤与修复的平衡被打破，就会引起骨骼肌病变。例如，在一些生理或病理因素作用下，如衰老、基因突变所致的肌营养不良，或肥胖及其相关代谢性疾病等导致的骨骼肌再生明显减弱，在相同损伤条件下，骨骼肌得不到及时修复，最终表现为骨骼肌萎缩及功能障碍。因此，只有具备良好的骨骼肌再生能力才能避免骨骼肌萎缩及骨骼肌功能障碍的发生。
CREG是一种在多种组织和细胞中表达，对维持细胞成熟分化状态起重要作用的转录调控因子。研究发现，CREG在肿瘤细胞、平滑肌细胞及胚胎干细胞等的分化中起重要的调控作用。但是，CREG在骨骼肌细胞分化及骨骼肌再生中的作用还不清楚。因此，本发明旨在提供CREG蛋白用于促进骨骼肌再生的医药用途。
发明内容
本发明的目的在于提供CREG蛋白用于促进骨骼肌再生的医药用途。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案。
CREG蛋白或其活性片段在制备用于促进各种骨骼肌损伤的再生修复以及预防和治疗各种疾病或生理现象导致的骨骼肌再生能力减弱药物中的应用。
进一步地，CREG蛋白或其活性片段在制备用于促进各种骨骼肌损伤的再生修复以及预防和治疗各种疾病或生理现象导致的骨骼肌再生能力减弱药物中的应用，所述各种骨骼肌损伤是急性损伤、慢性损伤、牵拉伤、电击伤、物理创伤和化学物质导致的骨骼肌损伤，所述的各种疾病导致骨骼肌再生能力减弱是杜氏肌营养不良、2型糖尿病、肥胖及其相关代谢性疾病导致的骨骼肌再生能力减弱，所述的生理现象包括衰老导致的骨骼肌再生能力减弱。
进一步地，CREG蛋白或其活性片段在制备用于促进各种骨骼肌损伤的再生修复以及预防和治疗各种疾病或生理现象导致的骨骼肌再生能力减弱药物中的应用，其中所述重组细胞含有表达CREG蛋白或其活性片段的重组载体，所述重组载体含有编码CREG蛋白或其活性片段的核苷酸序列。
能够抑制CREG蛋白或其活性片段表达下调，或促进CREG蛋白或其活性片段表达上调的制剂，在制备用于促进各种骨骼肌损伤的再生修复以及预防和治疗各种疾病或生理现象导致的骨骼肌再生能力减弱药物中的应用。
CREG蛋白或其活性片段用于筛选促进各种骨骼肌损伤的再生修复以及预防和治疗各种疾病或生理现象导致的骨骼肌再生能力减弱药物中的应用。
进一步地，组合物，其含有CREG蛋白或其活性片段、表达CREG蛋白或其活性片段的重组载体或重组细胞、能够抑制CREG蛋白或其活性片段表达下调或促进CREG蛋白或其活性片段表达下调的制剂，以及任选的药学上可接受的载体或赋形剂，所述组合物用于制备促进各种骨骼肌损伤的再生修复以及预防和治疗各种疾病或生理现象导致的骨骼肌再生能力减弱药物中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：本发明通过大量实验发现，CREG在小鼠成肌细胞C2C12细胞分化过程中表达明显上调。对CREG进行敲减后，C2C12细胞分化减弱；反之，过表达CREG使C2C12分化加强。采用心脏毒素（cardiotoxin，CTX）损伤小鼠骨骼肌，发现骨骼肌再生过程中CREG表达明显上调，而CREG杂合子小鼠骨骼肌再生能力减弱，表现为肌纤维直径明显低于野生型C57小鼠。以上结果表明，CREG在骨骼肌损伤再生过程中起重要调控作用，CREG蛋白用于促进骨骼肌再生的医药用途，将CREG蛋白或其活性片段制备用于促进各种骨骼肌损伤的再生修复以及预防和治疗各种疾病或生理现象导致的骨骼肌再生能力减弱的药物。
附图说明
图1为CREG表达随C2C12细胞分化增加。其中A是Western blot检测结果；B是A的统计图；C：Realtime PCR检测结果（n=3，*p<0.05，***p<0.001）。
图2为CREG低表达对C2C12细胞分化的影响。其中A是Western blot结果；B是A结果统计图；C是实时荧光定量PCR结果；D是免疫荧光染色结果（scale bar= 50μm）；E是D图3个随机视野计算出的分化指数；F是CK活性（n=3，**P<0.01，***P<0.001，Si-con：control si-RNA；si-CREG：CREG si-RNA）。
图3为CREG过表达对C2C12细胞分化的影响，其中A.为Western blot结果；B为A结果统计图；C为实时荧光定量PCR结果；D为免疫荧光染色结果（scale bar= 50μm）；E为D图3个随机视野计算出的分化指数；F为CK活性（n=3，*P<0.05，**P<0.01，Ad-GFP：GFP腺病毒；ad-CREG：CREG腺病毒）。
图4为骨骼肌再生过程中CREG表达增加，其中A为Western Blot检测CREG及生肌调控因子表达情况；B是A的统计图；C为Realtime PCR检测CREG及生肌调控因子表达情况；D为免疫组织化学染色检测CREG表达情况（scale bar = 50μm，n=3，***p<0.001，CTX：cardiotoxin，心脏毒素；sal：saline，生理盐水）。
图5为CREG+/-小鼠骨骼肌CTX损伤后3天和15天H&E染色结果，其中A为CTX损伤3天，骨骼肌H&E染色结果（scale bar= 50μm）；B为CTX损伤15天，骨骼肌H&E染色结果（scale bar= 50μm）；C为CTX损伤15天后，肌纤维平均直径；D为CTX损伤15天后，肌纤维直径分布情况（n=3，***P<0.001，WT：野生型C57小鼠；CREG+/-：CREG杂合子小鼠；pi: post injection）。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
本发明的实验数据均为百分数，两样本率的比较应用卡方检验，统计学处理均应用SPSS 19.0软件包处理，以P<0.05为有统计学差异。
实施例1小鼠成肌细胞C2C12分化过程CREG表达变化情况。
1. 小鼠骨骼肌细胞系C2C12细胞培养。
小鼠骨骼肌细胞系C2C12细胞购买于美国ATCC公司，在100 mm培养皿中用含10%胎牛血清的DMEM培养基（生长培养基）培养，待细胞生长密度达80%~90%融合时，进行细胞传代。首先，加入5ml PBS清洗3次，再加入2ml 0.25%胰酶对细胞进行消化。待细胞全部消化，加入5 ml生长培养基中和胰酶，用移液枪轻轻将细胞吹散，加入到15 ml离心管中，室温条件下，1000 rpm/s离心5 min，弃去上清。加入10 ml培养基，轻轻吹打细胞，制备单个细胞悬液，按照1:3比例接种于细胞培养皿中。
2. 小鼠骨骼肌细胞系C2C12细胞诱导分化。
小鼠骨骼肌细胞系C2C12细胞在120 mm培养皿中用含10%胎牛血清的生长培养基培养，待细胞密度达到80%~90%时，将生长培养基更换为含有2%马血清的DMED培养基（分化培养基）10 ml，继续培养3天，每天换液1次。
3. Western blot方法检测C2C12细胞分化不同天数CREG表达情况。
为明确CREG在骨骼肌再生中的作用，采用小鼠骨骼肌细胞系C2C12在体外建立骨骼肌细胞分化模型，利用western blot方法分别检测CREG表达情况。分别收取分化第0，1，2，3和4天C2C12细胞，加入适量的蛋白裂解液，同时，按1:100的比例加入蛋白酶抑制剂，于冰上裂解30 min，每隔5 min颠倒混匀一次。在4°C和12000 g条件下，离心10 min，收集上清为细胞总蛋白。采用BCA比色法试剂盒测定裂解液中的蛋白质浓度。使用蛋白裂解液，按终浓度为3 mg/ml进行稀释。再按比例加入5×上样缓冲液，充分混匀后，在100°C水浴条件下，煮沸10 min，室温下12000 g，离心30s。在每个样品孔中加入蛋白样品60 μg，接通电源，开始电泳。按照如下电压和时间进行：100 V电压，30 min，130 V电压，60 min，待溴酚蓝电泳至玻璃板底部后关闭电源。以90V的电压将样品转印到PVDF膜上，时间为2 h。将PVDF膜放入5%牛奶封闭液1 h后加入一抗4℃孵育。分别以1:1000抗CREG(美国Abcam公司)抗体、1：1000抗β-tubulin（美国Sigma公司）抗体作为一抗，以辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠（或抗兔）抗体（美国Cellsignalling公司）作为二抗，行Western blot检测，用ECL试剂盒(美国Amersham公司)发光显影。用CREG抗体和β-tubulin抗体可分别检测到大小约为24KD和54KD的蛋白表达条带。采用ImageJ 1.51软件进行条带的灰度值测量并进行统计学分析。
结果显示，随C2C12细胞分化，CREG蛋白表达持续增加，结果见图1A和1B。
4. 荧光实时定量PCR（Realtime PCR）方法检测C2C12细胞分化不同天数CREG表达情况。
(1) C2C12细胞总RNA提取。
使用北京普洛麦格公司的总RNA提取试剂盒进行RNA提取。具体步骤如下：
1) 分别收取分化第0，1，2，3和4天的C2C12细胞，放入无RNase的EP管中，PBS洗涤一次，在4℃和500 g条件下，离心5min，弃上清，收集细胞。
2) 在细胞中加入300 μl RNA裂解液和300μl RNA稀释液，使用加样枪混匀，室温放置15min，室温以最大离心速度离心5 min。
3) 小心吸取上清到新的2ml无核酸酶的EP管中，加入0.5倍上清体积的无水乙醇，用移液枪轻轻吹打3~4次，混匀。
4) 根据样品数量，取出相应数目的离心柱/收集管（将离心柱安放在收集管上），将混合液转移到离心柱内。
5) 在13000 g条件下，离心1 min，弃滤液，将离心柱重新放回到收集管中。
6) 向离心柱中加入600μl RNA洗液，13000g，离心45 s，弃滤液。
7) DNA酶I消化（现用现配），取一无核酸酶EP管，按照每份样品加入10X DNA酶I缓冲液5 μl，DNA酶I 5 μl，无核酸水40 μl的比例混合后向离心柱中央滴加，室温静置15min。
8) 向离心柱中加入600 μl RNA洗液，13000 g，离心45s，弃滤液。
9) 向离心柱中加入600 μl RNA洗液，13000 g，离心45s，弃滤液。将离心柱重新安置于收集管上，13000 g，离心2min。
10) 将离心柱转移至洗脱管上，在离心柱膜中央加入40 μl无核酸酶水，室温静置2min，13000 g，离心1min，将RNA保存于-80℃冰箱。
(2) 逆转录反应。
使用TAKARA公司的PrimeScript™ RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒进行逆转录反应。
1) 去除基因组DNA。
反应条件：室温，5min。
2)逆转录反应。
反应条件：37°C，15 min，然后85°C，5 s。
3) 引物序列见表3。
4)实时荧光定量PCR反应。
使用TAKARA公司的荧光定量PCR试剂盒进行Realtime PCR检测。
反应条件：第一步：95°C，30 s。
第二步：95°C，5 s；60°C，31s。40个循环。
通过检测得到CT值，用公式2-ΔΔCT计算基因的相对表达量。
结果显示，随C2C12细胞分化，CREGmRNA表达持续增加（结果见图1C）。
上述结果表明，CREG表达在蛋白水平和转录水平与骨骼肌细胞分化呈正相关，提示CREG可能参与小鼠骨骼肌细胞的分化。
实施例2 CREG低表达对C2C12细胞分化的影响。
1. CREG低表达C2C12细胞模型的建立。
使用takara公司Xfect™ RNA转染试剂盒将CREG干扰RNA（Santa Cruz公司）转染到C2C12（si-CREG）细胞，control si-RNA转染C2C12（si-control, si-con）细胞作为对照组，具体操作步骤如下。
(1) 细胞的准备：将C2C12细胞接种于12孔板中，加入1 ml生长培养基，待细胞密度达到80%~90%，准备开始转染。
(2) 充分震荡Xfect RNA Transfection Polymer。
(3) 转染试剂配制：取2只无菌1.5 ml EP管，其中一管加入45 μl转染反应缓冲液和5 μlCREGsi-RNA，另一管中加入45 μl转染反应缓冲液和5 μlXfect RNA TransfectionPolymer，使用旋涡振荡器震荡两管。
(4) 将两管中试剂混合，用旋涡振荡器震荡5 s，混匀。
(5) 将混合物在室温下放置10 min，形成纳米颗粒复合物。
(6) 将100 μl纳米颗粒复合物全部加入到待转染细胞中，轻轻混匀。
(7) 将培养板放入37℃二氧化碳孵箱，孵育4 h。
(8) 吸取带有转染试剂的细胞培养液，加入1 ml新鲜的生长培养基，放入37℃二氧化碳孵箱，孵育24 h。
2. Western blot检测CREG低表达对C2C12细胞分化标志物MyHC表达的影响。
分别收取分化4天的si-con细胞和si-CREG细胞，利用Western blot检测MyHC表达情况，具体方法同实施例1。
结果显示，si-CREG组与si-con比，MyHC表达明显减低，结果见图2A和2B。
3. Realtime PCR检测CREG低表达对C2C12细胞分化标志物MyHC表达的影响。
分别收取分化4天的si-con细胞和si-CREG细胞，利用Realtime PCR检测MyHC表达情况，具体方法同实施例1。
结果显示，与si-con组比，si-CREG组的MyHC表达明显减低（结果见图2C）。
4. 免疫荧光染色检测CREG低表达对C2C12细胞分化标志物MyHC表达的影响。
(1)弃掉分化4天C2C12细胞的培养基，使用冰PBS清洗3次。
(2) 加入2 ml 4%多聚甲醛，室温，固定15 min，使用冰PBS清洗3次。
(3) 加入2 ml 0.5% TritonX-100，室温，通透细胞5 min，使用冰PBS清洗3次。
(4) 将山羊血清封闭液滴加至玻片上，室温封闭30 min。
(5) 将MyHC抗体（Abcam，1:100）滴加至玻片上，4℃过夜。
(6) 使用PBS清洗玻片3次，将荧光标记二抗滴加至玻片上（使用前离心），室温孵育1 h，使用PBS清洗3次。
(7) 使用DAPI染核1 min。
(8) 使用封片液封片，并玻片在四周涂抹指甲油。
(9) 荧光显微镜下观察、并选取多个拍照。
(10) 在多个视野中，计算C2C12肌管分化指数，即计算所有细胞中MyHC阳性细胞所占的百分数。
结果显示，与si-con组比，si-CREG组MyHC表达明显减低，分化指数明显减低，结果见图2D和2E。
4. CREG低表达对C2C12细胞分化成熟标志物CK活性的影响。
为进一步评价CREG低表达对C2C12细胞分化肌管功能的影响，使用Sigma公司的CK活性测定试剂盒对分化肌管的CK活性进行检测，步骤如下。
(1) 细胞收集：将C2C12细胞使用细胞刮从培养皿中刮下。用冰生理盐水清洗细胞，2000 g，离心5 min。
(2) 破碎细胞：使用适量的冰缓冲液（50 mM磷酸钾, pH7.5）对细胞进行匀浆处理。在2~8℃下，以10000 g离心15 min。去除上清，留沉淀待测。
(3) 配制反应试剂体系：每份标本按测试缓冲液100 μl，底物溶液10 μl，酶混合物1 μl的比例进行配制。
(4) 配制标准品和空白：在96孔板中，加入110 μl水作为空白对照，另一个孔中加入100 μl水和10 μl标准品。
(5) 加样：将10 μl样本加入单独孔中，每孔中再加入100 μl反应试剂体系，轻轻敲打反应板，混匀（每个样本做2个复孔）。
(6) 初始孵育：将96孔板放入37℃孵箱，孵育20 min，在340 nm波长检测吸光度(A340)initial。
(7) 二次孵育：将96孔板再次放入37℃孵箱，孵育20 min，在340 nm波长检测吸光度(A340)final。
(8) CK活性结果计算：
。
结果显示，敲减CREG使C2C12细胞分化肌管的CK活性明显减低，结果见图2F。
以上结果表明，CREG低表达抑制C2C12细胞向成熟肌管分化。
实施例3 CREG过表达对C2C12细胞分化的影响。
1. CREG过表达C2C12细胞模型的建立。
使用CREG腺病毒（汉恒生物科技有限公司）感染C2C12细胞（ad-CREG），同时，使用绿色荧光蛋白（GFP）腺病毒（汉恒生物科技有限公司）感染C2C12细胞（ad-GFP）作为对照组。
2. Western blot检测CREG过表达对C2C12细胞分化标志物MyHC表达的影响。
分别收取分化4天的ad-GFP细胞和ad-CREG细胞，利用Western blot检测MyHC表达情况，具体方法同实施例1。
结果显示，ad-CREG组的MyHC表达明显增加，结果见图3A和3B。
3. Realtime PCR检测CREG过表达对C2C12细胞分化标志物MyHC表达的影响。
分别收取分化4天的ad-CREG细胞及ad-GFP细胞，利用Realtime PCR检测MyHC表达情况，具体方法同实施例1。
结果显示，ad-CREG组与ad-GFP组比，MyHC表达明显增加，结果见图3C。
免疫荧光染色检测CREG过表达对C2C12细胞分化标志物MyHC表达的影响。
分别对ad-CREG细胞和ad-GFP细胞分化的肌管进行MyHC免疫荧光染色，并计算分化指数，具体方法同实施例2。
结果显示，ad-CREG组MyHC表达及分化指数明显增加，结果见图3D和3E。
4. CREG过表达对C2C12细胞分化成熟标志物CK活性的影响。
对ad-GFP细胞和ad-CREG细胞分化的肌管进行CK活性测定，具体方法同实施例2。
结果显示，过表达CREG使C2C12细胞分化肌管的CK活性明显增加，结果见图3F。
以上结果表明，CREG过表达促进C2C12细胞向成熟肌管分化。
实施例4 CREG在骨骼肌再生中的表达情况。
1. 实验动物及饲养。
实验动物种属、性别、周龄及来源：C57BL/6（WT）小鼠，雄性，8周龄。C57BL/6小鼠购自北京维通利华生物科技有限公司。小鼠于无特定病原体（specific pathogen free,SPF）级动物房内饲养，室温为 (22±2)℃，湿度为45%~70%，每12小时光照循环，自由进食及饮水。
2. 小鼠骨骼肌损伤模型的建立。
将CTX用生理盐水溶解，配制终浓度为10 mM溶液。将小鼠置入麻醉剂中，麻醉后取出，固定于解剖板。对待注射部位进行消毒，使用无菌注射器将50 μl CTX溶液或生理盐水，采用多点注射的方法将CTX注入小鼠一侧后肢趾长伸肌中，建立小鼠骨骼肌损伤模型，诱发小鼠骨骼肌再生，另一侧后肢趾长伸肌注射生理盐水作为对照。
3. 骨骼肌再生模型鉴定。
CTX注射（post injection，pi）3天后，分别收取小鼠两后肢趾长伸肌，提取组织总蛋白和RNA，具体方法同实施例1。分别利用Western blot和Realtime PCR的方法检测骨骼肌再生标志物Myf5，MyoD和Myogenin的表达情况，比较CTX组和对照组之间的差异，具体方法同实施例1。其中，western blot检测中一抗分别为Myf5抗体（Sigma），MyoD（Santa Cruz）和Myogenin（Abcam）；Realtime PCR中引物序列见表5。
结果显示，CTX组的骨骼肌再生标志物Myf5，MyoD和Myogenin在蛋白水平和mRNA水平均明显高于对照组，结果见图4A-C，表明骨骼肌再生模型建立成功。
4. 骨骼肌再生中CREG表达情。
(1) 蛋白水平。
提取CTX注射3天后小鼠趾长伸肌总蛋白，比较CTX注射组CREG表达与对照组之间的差异，具体方法同实施例1。
结果显示，CTX组CREG蛋白表达明显高于对照组（结果见图4A和4B）。
(2) 转录水平。
提取CTX注射3天后小鼠趾长伸肌总RNA，比较CTX注射组CREG表达与对照组之间的差异，具体方法同实施例1。
结果显示，CTX组CREGmRNA表达明显高于对照组（结果见图4C）。
(3) 免疫组织化学染色。
收取CTX和生理盐水注射3天后的小鼠趾长伸肌，进行CREG免疫组织化学染色，具体操作步骤如下。
1) 石蜡切片的制备。
A. 取材：将小鼠骨骼肌组织放置4%多聚甲醛溶液中过夜。
B. 脱水：按不同酒精浓度进行脱水分别为70%酒精2 h，80%酒精2 h，90%酒精2 h，95%酒精I 4 h，95%酒精II中过夜，100%酒精I 1.5 h，100%酒精II中1.5 h。
C. 透明：将组织块放入二甲苯I液中浸泡1 h，取出后放入二甲苯II液中浸泡1 h。
D. 浸蜡：石蜡I中过夜，石蜡II中放置1 h，石蜡III放置1 h。
E. 包埋：使用石蜡对组织块进行包埋，室温放置。
F. 切片：用石蜡切片机对组织块进行切片，厚度为3 μm，并将切片贴于载玻片上。
G. 烘片及烤片：将载玻片在60°C烘片机上放置1 h后，再将载玻片放于65°C烤箱中，放置48 h。
2) 免疫组织化学染色。
A. 切片脱蜡：按步骤分别将切片放置在下列试剂中，二甲苯I中20 min，二甲苯II中20 min，95%酒精I中15 min，95%酒精II中15 min，90%酒精10 min，80%酒精5 min，70%酒精5 min，最后置于蒸馏水中30 min。
B. 抗原修复：将石蜡切片在200 ml抗原修复液中，置100°C沸水中煮40 min，自然降温。
C. 将50 μl试剂A滴加至石蜡切片上，室温孵育10 min。PBS冲洗3次，每次5 min。
D. 将50 μl试剂B滴加至石蜡切片上，室温孵育10 min，将血清去除。
E. 将50 μl稀释后的CREG抗体滴加至石蜡切片上（使用PBS进行1:100稀释），4°C孵育过夜。
F. 次日将石蜡切片在室温下进行复温30 min。PBS冲洗3次，每次5 min。
G. 将50 μl试剂C溶液滴加至石蜡切片上（使用PBS进行1:100稀释），室温孵育10min。用PBS冲洗3次，每次5 min。
H.将50 μl试剂D溶液滴加至石蜡切片上，室温孵育10 min。用PBS冲洗3次，每次5min。
I.将DAB溶液滴加至切片上，进行显色，显微镜下观察染色效果。
J.将石蜡切片在苏木素中放置10 min，染色，流水冲洗。
K.将石蜡切片在1%盐酸酒精中放置30 s，进行分化，流水冲洗。
L. 将石蜡切片在氨水中放置30 s，进行细胞核返蓝，流水冲洗。
M. 在正置显微镜下观察染色结果并拍照保存图片。
结果显示，小鼠骨骼肌再生过程中，CREG表达明显上调，结果见图4D。
以上结果均显示，CREG在骨骼肌再生过程中表达上调，提示CREG可能参与骨骼肌再生的过程。
实施例5 CREG杂合子（CREG+/-）小鼠骨骼肌再生能力检测。
1. CREG+/-小鼠由南京模式动物研究所提供，饲养条件均同实施例4。
2. H&E染色检测CREG+/-小鼠骨骼肌再生能力。
使用CTX注射的方法建立小鼠骨骼肌损伤再生模型，具体方法同实施例4。分别收取注射后3天和15天小鼠趾长伸肌，进行H&E染色，具体步骤如下。
(1) 切片脱蜡：同免疫组织化学染色（步骤A）。
(2) 细胞核染色：同免疫组织化学染色（步骤J-L）。
(3) 细胞质染色：将石蜡切片在水溶性伊红溶液中放置5 min，染色，流水冲洗。
(4) 透明：将石蜡切片按步骤放于下列试剂中，80%酒精5 min，90%酒精5 min，100%酒精I中5 min，100%酒精II中5 min，二甲苯I中5 min，二甲苯II中5 min。
(5) 封片：将石蜡切片放在通风橱里晾干，使用中性树脂对切片进行封片。
(6) 在显微镜下观察H&E染色结果并拍照留取图片。
结果显示，CTX注射3天后，CREG+/-小鼠骨骼肌再生程度明显低于野生型小鼠；CTX注射15天后，CREG+/-小鼠再生肌纤维直径明显减少，结果见图5，表明CREG缺失导致骨骼肌再生减弱。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国人民解放军北部战区总医院
<120> CREG蛋白用于促进骨骼肌再生的医药用途
<160> 10
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gctggccact atctccacaa 20
<210> 2
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
catgagcctc cgaagacct 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
agtgtttcct cgtcccgtag 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gccgtgagtg gagtcatact 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
accaccaacc ctaaccagag 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
tgttctttcg ggaccagaca 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
caagaccacc aacgctgatc 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
cagaccttcg atgtagcgga 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
ccagtgaatg caactcccac 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
gcatggtttc gtctgggaag 20
Claims (3)
1.CREG蛋白在制备用于促进各种骨骼肌损伤的再生修复以及预防和治疗各种疾病或生理现象导致的骨骼肌再生能力减弱药物中的应用，所述各种骨骼肌损伤是急性损伤、慢性损伤、牵拉伤、电击伤、物理创伤和化学物质导致的骨骼肌损伤，所述的各种疾病导致骨骼肌再生能力减弱是杜氏肌营养不良、2型糖尿病、肥胖及其相关代谢性疾病导致的骨骼肌再生能力减弱，所述的生理现象包括衰老导致的骨骼肌再生能力减弱。
2.如权利要求1所述的CREG蛋白在制备用于促进各种骨骼肌损伤的再生修复以及预防和治疗各种疾病或生理现象导致的骨骼肌再生能力减弱药物中的应用，其中所述CREG蛋白由含有重组表达载体的重组细胞表达，所述重组表达载体含有编码CREG蛋白的核苷酸序列。
3.CREG蛋白用于筛选促进各种骨骼肌损伤的再生修复以及预防和治疗各种疾病或生理现象导致的骨骼肌再生能力减弱药物中的应用，所述各种骨骼肌损伤是急性损伤、慢性损伤、牵拉伤、电击伤、物理创伤和化学物质导致的骨骼肌损伤，所述的各种疾病导致骨骼肌再生能力减弱是杜氏肌营养不良、2型糖尿病、肥胖及其相关代谢性疾病导致的骨骼肌再生能力减弱，所述的生理现象包括衰老导致的骨骼肌再生能力减弱。
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