CN110592216B - Lrsam1作为肝细胞癌分子标志物的应用 - Google Patents

Lrsam1作为肝细胞癌分子标志物的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了LRSAM1作为肝细胞癌的分子标志物在制备肝细胞癌检测、预后或治疗产品中的应用。本发明人发现，相对于正常健康人肝组织或细胞或者肝细胞癌患者的癌旁组织或细胞，在肝细胞癌患者的肝细胞癌组织或细胞中LRSAM1的表达水平明显上调，因此可以将LRSAM1用作肝细胞癌辅助诊断和预后的分子标志物，以及制备用于肝细胞癌检测和/或治疗的产品。本发明提供的用于检测肝细胞癌的试剂盒，可以用于肝细胞癌的辅助诊断和预后评估；另外，还可将LRSAM1抑制剂用来制备预防或治疗肝细胞癌的药物组合物以用于肝细胞癌的基因治疗、药物治疗等临床应用。

Description

LRSAM1作为肝细胞癌分子标志物的应用
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及LRSAM1作为肝细胞癌分子标志物的应用。
背景技术
肝癌即为肝脏恶性肿瘤，分为原发性和继发性两大类。肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是最常见的一种原发性肝癌(约占所有肝癌的 70％-85％)，在所有肿瘤中的发病率位居第二，它是世界上最常见的恶性肿瘤之一，同时也是导致肿瘤相关死亡的主要原因。虽然HCC的早期患者预后较好，并且其5年生存率高于70％，但是大多数患者出现症状，且被诊断出时已为到达晚期，这一原因导致HCC患者的总体5年生存率不超过16％， HCC具有高度恶性和致命性，并且在世界上的许多地区，HCC的发病率均在上升，因此寻找治愈HCC的方法是当今世界各个临床研究机构迫切关心的问题。
LRSAM1(Leucine-rich repeat and sterile alpha motif containing 1，含有富亮氨酸重复和不育α基序的蛋白1)是一种参与多种细胞活动的E3泛素连接酶，它也被称为TSG101相关连接酶蛋白，LRSAM1蛋白作用很多，包括调节小泡的运输、细胞的粘附和抗细菌自噬作用，这些都依赖于其E3泛素连接酶活性。LRSAM1的C端具有保守的RING锌指结构域，它的N端具有一个6 组富含亮氨酸重复序列(LRR)结构域。最近的研究表明，LRSAM1通过其LRR 结构域识别细菌，从而通过它的RING锌指结构使得自噬活性在抵抗细菌方面发挥重要的作用。
尽管有报道称，在结直肠癌患者中，LRSAM1的表达水平显著上调，但在肝细胞癌中的表达情况和作用尚不清楚。进一步探索LRSAM1在肝细胞癌中的表达情况及其对肝细胞癌细胞生长的作用机制将有助于改善针对肝细胞癌的检测和治疗。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明的目的在于提供LRSAM1作为肝细胞癌 (HCC)分子标志物的应用。
本发明一个方面提供了肝细胞癌的分子标志物LRSAM1在制备肝细胞癌检测、预后或治疗产品中的应用，其中所述分子标志物为LRSAM1基因或蛋白。
本发明人通过研究发现，相对于正常健康人肝组织或细胞或者肝细胞癌患者的癌旁组织或细胞，在肝细胞癌患者的肝细胞癌组织或细胞中LRSAM1 的表达水平明显上调，并且在正常培养条件下，LRSAM1可促进人肝细胞癌细胞(如Huh7、HepG2、SK-Hep1或BEL-7404细胞系)的生长，其通过促进细胞周期进展而不是细胞的存活来促进人肝细胞癌细胞的生长。
如本发明所用，术语LRSAM1(Leucine-rich repeat and sterile alpha motifcontaining 1，含有富亮氨酸重复和不育α基序-1)是是指LRSAM1基因或蛋白、或其同源物、或具有其生物活性的变体形式，优选为人LRSAM1基因(在 NCBI中的基因ID：90678)。
UALCAN是一个基于TCGA数据库用于癌症转录组数据分析的网站。它是建立在PERL-CGI与高质量图形的基础上，为用户提供方便地访问公开的癌症转录组数据(TCGA和MET500转录组测序)，依据HPRD、GeneCards、 Pubmed、TargetScan、Human Protein Atlas、DRUGBANK、Open Targets和 GTEx，提供关于所选基因和靶点的额外信息。我们查阅TCGA数据库并利用生信分析方法发现，结果如图1所示，在肝细胞癌患者(Primary Tumor)中，LRSAM1 mRNA的表达水平(Transcript per million)明显高于正常肝组织 (Normal)，即LRSAM1在人肝细胞癌组织或细胞中表达上调。
如本发明所用，术语“表达上调”是指所表达基因的序列量测量证明，相对于癌旁正常肝组织或健康人肝组织，所检测的患者肝细胞癌组织中测量的该基因表达量具有至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％或更多的表达增加，例如正常肝组织中该基因表达量为肝细胞癌组织中该基因表达量的90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％或更低。
本发明一个方面提供了肝细胞癌的分子标志物LRSAM1在制备用于肝细胞癌检测或预后的试剂盒中的应用。
在本发明上述应用的一些实施方案中，所述检测或预后为根据所检测对象的生物样本中的LRSAM1表达水平来判断对象中肝细胞癌的疾病状况、进行疗效评估或转移复发监控，优选所述生物学样本为肝细胞癌组织或细胞。
本发明另一个方面提供了用于肝细胞癌检测或预后的试剂盒，其包含特异性扩增GFP-LRSAM1基因的引物对，其中GFP-LRSAM1正向引物为如 SEQ ID NO.1(CTCAAGCTTGCCACCATGGTGCCGCTCTTCTTCCGGAAG) 所示的序列，GFP-LRSAM1反向引物为如SEQ ID NO.2 (CGCGGTACCGTGCTGCTGTGGTAGATGCGGAGGCG)所示的序列。进一步地，所述试剂盒还包含RNA提取试剂、反转录试剂，以及PCR反应常用试剂如逆转录酶、缓冲液、dNTPs、MgCl2、DEPC水和Taq酶等，还可以含有标准品和/或对照品。
本发明又一个方面提供了LRSAM1抑制剂在制备预防或治疗肝细胞癌的药物组合物中的应用，其中所述LRSAM1抑制剂为能降低LRSAM1表达量的siRNA、dsRNA、shRNA、miRNA、反义核苷酸；或者能表达或形成所述 siRNA、dsRNA、shRNA、miRNA、反义核苷酸的构建物。在本发明上述应用的一些实施方案中，所述LRSAM1抑制剂为siRNA或shRNA。进一步地，在本发明上述应用的一些实施方案中，所述LRSAM1抑制剂为具有如SEQ ID NO.3(GCTGATCGTCCACACGAAT)所示基因序列的LRSAM1 siRNA 177#，或具有如SEQ ID NO.4(CCCACGGACAGATTCTCAA)所示基因序列的LRSAM1 siRNA 712#。在本发明上述应用的一些实施方案中，所述 LRSAM1抑制剂为具有如SEQ ID NO.5(GCTGATCGTCCACGAATCA)所示基因序列的LRSAM1 shRNA 549#，或具有如SEQ ID NO.6 (GCCGAAATGGATGAACGATTC)所示基因序列的LRSAM1 shRNA 1636#。
在本发明上述应用的一些实施方案中，所述药物组合物包含有效量的 LRSAM1抑制剂和药学上可接受的载体，进一步地所述药物组合物还包含预防或治疗肝细胞癌的其他药剂。
本发明一个方面提供了一种预防或治疗肝细胞癌的药物组合物，其包含有效量的LRSAM1抑制剂。在一些实施方案中，所述药物组合物包含有效量的LRSAM1抑制剂LRSAM1siRNA 177#和/或LRSAM1 siRNA 712#，其中LRSAM1 siRNA 177#具有如SEQ ID NO.3所示的基因序列，以及LRSAM1 siRNA 712#具有如SEQ ID NO.4所示的基因序列。在一些实施方案中，所述药物组合物包含有效量的LRSAM1抑制剂LRSAM1 shRNA 549#和/或 LRSAM1 shRNA1636#，其中LRSAM1 shRNA 549#具有如SEQ ID NO.5所示的基因序列，以及LRSAM1 shRNA1636#具有如SEQ ID NO.6所示的基因序列。在一些实施方案中，所述药物组合物还包含预防或治疗肝细胞癌的其他药剂。
如本文所用，所述“有效量”是指可对哺乳动物(优选人)产生功能或活性的且可被哺乳动物(优选人)所接受的量。所述“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂；所述载体本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。所述合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。所述药物组合物中的药学上可接受的载体可含有液体如水、盐水、缓冲液，并且还可能存在辅助性物质如填充剂、润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。所述载体中还可以含有细胞(如宿主细胞) 转染试剂。
本发明可以采用本领域熟知的多种方法来将LRSAM1抑制剂、或该抑制剂的编码基因、或该抑制剂的药物组合物施用于患者如哺乳动物，优选人。包括但不限于：皮下注射、肌肉注射、经皮给予、局部给予、植入、缓释给予等；优选的，所述给药方式是非肠道给予的。
也可选择采用基因治疗的手段进行肝细胞癌的治疗，如直接将LRSAM1 抑制剂通过诸如注射等方法施用于患者；或者，可通过一定的途径将携带 LRSAM1抑制剂的表达单位如表达载体或病毒等递送到靶点上，并使之表达具有活性的LRSAM1抑制剂，具体情况需视所述的药剂类型而定，这些均是本领域技术人员所熟知的。
本发明的药物组合物可以进一步包含一种或多种抗癌剂。在具体的实施方案中，药物组合物包含至少一种抑制LRSAM1基因表达的化合物和至少一种化疗剂。用于本发明的药物组合物中的化疗剂，包括但不限于：DNA- 烷化剂、抗肿瘤抗生素剂、抗代谢剂、微管蛋白稳定剂、微管蛋白去稳定剂、激素拮抗剂、拓扑异构酶抑制剂、蛋白激酶抑制剂、HMG-COA抑制剂、CDK 抑制剂、细胞周期蛋白抑制剂、胱天蛋白酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂、反义核酸、三链螺旋DNA、核酸适体和分子修饰的病毒、细菌和外毒素试剂。
在本发明中，“预后”是指癌症患者在通过手术、化疗、药物治疗或其组合处理等抑制或缓解肿瘤生长后的过程或结果。预后可以是通过手术、化疗、药物治疗或其组合处理抑制或缓解肝细胞癌生长后1、2、3、4、5、6、7、8、 9、10、15、20年或更久时的生机状态。预后可以通过检测标志物来评估，所述标志物可为一个或多个基因。预后评估可以这样进行：根据标志物的有或无，或者升高或降低，确定患者的预后是否良好，或者确定良好预后或不良预后的概率。
本发明的药物组合物还可与其他治疗肝细胞癌的药物联用，其他治疗性化合物可以与主要活性成分同时给药，甚至在同一组合物中同时给药。
本发明的药物组合物还可以为单独的组合物，或主要活性成分的部分剂量可以与其它治疗性化合物同时给药，而其它剂量可以单独给药。在治疗过程中，可以根据症状的严重程度、复发的频率和治疗方案的生理应答，调整本发明药物组合物的剂量。
有益效果：
本发明人发现在肝细胞癌患者中，LRSAM1 mRNA的表达水平明显高于正常肝组织，即LRSAM1在人肝细胞癌组织或细胞中表达明显上调，因此可以将LRSAM1用作肝细胞癌辅助诊断和预后的分子标志物，以及制备用于肝细胞癌检测和/或治疗的产品。本发明提供的用于检测肝细胞癌的试剂盒，可以用于肝细胞癌的辅助诊断和预后评估；另外，还可将LRSAM1抑制剂用来制备预防或治疗肝细胞癌的药物组合物以用于肝细胞癌的基因治疗、药物治疗等临床应用。
附图说明
图1所示为在肝细胞癌患者(Primary Tumor)中，LRSAM1 mRNA的表达水平(Transcript per million)明显高于正常肝组织(Normal)。
图2所示为在正常培养条件下LRSAM1对人肝细胞癌细胞生长的影响。其中图2a为人肝细胞癌细胞株(Huh7、HepG2、Sk-Hep1、BEL-7404)经非靶向控制NC siRNA或LRSAM1siRNAs转染，48小时后细胞收样，免疫印迹分析LRSAM1的表达。图2b为连续3天进行细胞计数，观察细胞每天生长率。图2c为细胞周期分析，数据显示为
Figure RE-GDA0002263293190000061
(下同)，n＝3。
图3所示为相比对照组，在LRSAM1低表达(转染LRSAM1 shRNA 549# 或LRSAM1shRNA 1636#)和LRSAM1过表达(转染EGFP-N1-LRSAM1)的 HepG2细胞株中肝癌细胞的生长情况。其中图3a-图3d显示在集落形成实验条件下，LRSAM1表达的下调降低了克隆的形成能力；图3e-图3f显示在集落形成实验条件下，LRSAM1过表达增强了克隆的形成能力。
图4所示为相比对照组，过表达LRSAM1的HepG2细胞在裸鼠中的移植瘤生长情况。其中图4(a)-图4(b)显示过表达LRSAM1明显促进了肿瘤的生长。
图5所示为相比对照组，低表达LRSAM1(转染LRSAM1 shRNA 549# 或LRSAM1 shRNA1636#)的HepG2细胞在裸鼠中的移植瘤生长情况。其中图5(a)-图5(d)显示低表达LRSAM1显著了肿瘤的生长。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例
主要实验材料和试剂：
6-8周龄无胸腺BALB/c实验裸鼠(饲养环境为SPF级)，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。
人肝癌细胞系HepG2为军事医学研究院免疫研究室保存；肝癌细胞系 Huh7、BEL-7404购自中科院上海细胞库，肝癌细胞SK-Hep1购自北京食品药品检定所，均保存在北京军事医学研究院免疫学研究室信号转导课题组。本发明实施例所用细胞均是复苏后连续培养一周左右，细胞状态良好能够稳定生长的细胞。细胞培养条件：本发明实验的所有细胞株均使用添加10％胎牛血清的DMEM培养基，并且加入100U/mL的青霉素和硫酸链霉素霉素，置于37℃，含5％CO2的培养箱中培养。
LRSAM1 siRNA(177#GCTGATCTCCACACG，712# CCCACGGACAGATTCTCAA)和非靶向对照(non-targeting control)的NC siRNA，以及LRSAM1 shRNA(549#GCTGATCGTCCACGAATCA，1636# GCCGAAATGGATGAACGATTC)和非靶向对照shRNA，本实验室设计并均订购于上海吉凯基因化学技术有限公司，其它常用的化学试剂均为分析纯或者进口产品。
GFP-LRSAM1正向引物: CTCAAGCTTGCCACCATGGTGCCGCTCTTCTTCCGGAAG；以及 GFP-LRSAM1反向引物: CGCGGTACCGTGCTGCTGTGGTAGATGCGGAGGCG；均为北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成。
LipofectamineTM 2000，LipofectamineTM RNA iMAX，购自美国Invitrogen 公司；蛋白定量考马斯亮蓝CBB染液，购自TIANGEN生物技术有限公司； PVDF膜(聚偏二氟乙烯膜)，购自美国MILLIPORE公司；TEMED(四甲基乙二胺)，美国AMRESCO公司。
LRSAM1一抗，购自美国Proteintech公司；β-Actin一抗，购自中杉金桥生物技术有限公司；辣根过氧化物酶偶联的山羊抗鼠二抗，辣根过氧化物酶偶联的山羊抗兔二抗，购自中山金桥生物技术有限公司。
实施例
实施例1：在正常体外培养条件下，LRSAM1对人肝细胞癌细胞生长的影响
1.用siRNA下调LRSAM1在肝细胞癌细胞中的表达水平
1)细胞种板及转染
分别取对数生长期肝细胞癌细胞系Huh7、HepG2、SK-Hep1、BEL-7404 的细胞，用0.25％的胰酶消化，经离心后用手把玻璃试管底部的细胞团弹起；用新配的含有10％普通胎牛血清的DMEM培养基，重悬细胞，缓慢反复吹打细胞，制成单细胞悬液，然后按照每孔2×105个细胞，种入六孔板，使六孔板的每个孔的终体积为1.5mL；之后将六孔板放入培养箱中培养，过夜培养；第二天在倒置显微镜下观察细胞。
当细胞状态及贴壁良好，并且细胞生长至70％-80％时，用转染试剂LipofectamineTM RNA iMAX或LipofectamineTM 2000分别转染NC(阴性对照) siRNA、177siRNA(LRSAM1 siRNA 177#:GCTGATCGTCCACACGAAT)、 712siRNA(LRSAM1 siRNA 712#:CCCACGGACAGATTCTCAA)；24h或6h 后用含有10％普通胎牛血清的DMEM培养基给转染后的细胞换液，再过24 h，进行蛋白收样。
2)蛋白样品收样
根据样品的多少，在1.5mL的EP管中加入适量的细胞裂解液(M2细胞裂解液)，蛋白抑制剂根据比例DTT(1:1000)、Aprotinin(1：1000)、PNPP(1： 100)、Na2VO3(1：100)再加入含有M2细胞裂解液的EP管中，混匀；最后取已经处理好的细胞，放置在冰盒上，弃去细胞的上清液，用预冷的生理盐水洗一遍，弃去，在细胞培养板中加入含有蛋白抑制剂的M2细胞裂解液，按照六孔板每孔加入120μL，24孔板每孔加60μL的量加细胞裂解液，然后用细胞刮快速将贴壁的细胞刮下来，对应加入到提前标记好的EP管中，直接插在冰上，裂解15min左右。
若是悬浮细胞，直接收集到EP管中，6000rpm，离心1min后，再在EP 管中加入预冷的生理盐水1mL重悬细胞，6000rpm，离心1min后，在EP 管中按上述加入适量的含有蛋白抑制剂的M2细胞裂解液，重悬细胞后插在冰上直接裂解细胞，15min后，将EP管放在高速冷冻离心机中，13000rpm，离心15min；之后，将上清转移到已经标号的EP管中，继续插在冰上，防止蛋白质的降解。
3)用考马斯亮蓝法测定蛋白的含量
在标记好的EP管中每管加入600mL的考马斯亮蓝，再每管加入对应的 2μL裂解的蛋白样品，用枪混匀后，调整紫外分光光度计，设置波长是595 nm；开始检测蛋白样品的吸光度值，并且记录数值，测完关闭紫外分光光度计，用M2细胞裂解液调整所测的每个蛋白样品的浓度，使其浓度保持一致。
将浓度调节一致的蛋白样品与4×loading buffer按照3：1的比例混匀；打开微波炉将水煮沸，将制好的蛋白样品放在沸水中水煮10min后，6000 rpm，离心30s，用手指轻轻弹匀样品，再按照6000rpm/min，离心30s。蛋白样品可冻存在-20℃冰箱保存待用或者直接进行western blot。
4)蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE电泳)
首先根据所需胶的浓度，将配好的胶按照说明书安装在电泳槽中，将5× SDS电泳缓冲液用双蒸水稀释成1×SDS电泳缓冲液后，加满电泳槽。然后按预定的顺序用Hamilton微量注射器上样，根据需要，在凝胶的一个孔中加入1μL的蛋白Marker与1×loadingBuffer的混合液，用于标记蛋白分子的大小，每上完一个蛋白样品，用自来水洗涤一下上样注射器；最后在所不用的样品孔加入等体积的1×loading Buffer补齐。
然后，以恒压80V或每块胶按照上层胶恒流15mA、下层胶以恒压120V 或每块胶按20mA进行电泳，根据所需蛋白分子的大小决定电泳时间。
5)转印
根据胶的大小裁剪适量大小的PVDF膜，将其放入无水甲醇中浸泡5min 激活。将1×转印液倒入干净的转印槽中，同时转印所用的海绵及剪好的滤纸放在转印液中浸润。卸下电泳架，从玻璃板上取下凝胶放在滤纸上进行转印。安装在转印架子上后，同时放入冰块，再放进转印槽内，将转印槽内的的转印液加满，防止漏液，放在装有冰块的泡沫冰盒中，盖上盖子。恒压60V，转印3个小时。
6)5％的牛奶封闭
用TBST配制5％的牛奶，将其放入洗干净的玻璃皿中，把已经转印好的 PVDF膜取下，将贴凝胶的一面用圆珠笔标记清marker的位置及大小，浸泡在5％的牛奶中；放在摇床上，慢慢摇动，室温封闭1h后即可用一抗孵育。
7)一抗孵育
根据需要封闭的一抗，参阅其使用的浓度，按照适当的比例用5％BSA 稀释一抗，混匀；把膜装进剪好的袋子，标记上所孵育的蛋白名称，将一抗加入袋子，封好口用胶带固定在4℃冰箱的Rotator架上，打开转动过夜。
8)二抗孵育
取出转动过夜的膜，回收一抗，再冻存到-20℃冰箱中，把膜放在盛有 1×TBST的玻璃皿中，放在摇床上缓慢转动，期间根据1：2500的比例，用 5％的脱脂牛奶稀释兔二抗或鼠二抗，重复洗膜3次，每次10min。再把膜放进干净的装有二抗的袋子里(操作同孵育一抗)，同样也要标记好蛋白的名称及二抗的名称后，把袋子固定在转子上，室温下转动1h后；回收二抗，将二抗冻存在-20℃冰箱中，与孵育一抗后洗膜一样(TBST洗膜3次，每次10min)。
9)X光片显影
按照常规操作将上述PVDF膜通过X光片进行显影、定影，并做好相应标记，如标记Marker的位置及大小、X光片上所显蛋白的位置、蛋白的名称及上样顺序等。
结果如图2a，经非靶向控制NC siRNA或LRSAM1 siRNA转染人肝细胞癌细胞株，48小时后进行细胞收样，以Actin(肌动蛋白)作为内参，免疫印迹分析显示在以下四种肝细胞癌细胞系Huh7、HepG2、SK-Hep1、BEL-7404 中，相比转染NC siRNA的细胞，分别转染177siRNA和712siRNA的细胞中的LRSAM1蛋白表达显著降低，因此LRSAM1 siRNA可以有效降低内源性LRSAM1蛋白的表达水平。
2.转染siRNA后肝癌细胞的生长曲线检测试验
按照常规操作复苏Huh7、HepG2、SK-Hep1、BEL-7404肝癌细胞系，然后进行传代培养，转染siRNA后检测生长速率并绘制生长曲线，具体地：
1)取对数生长期的细胞种板，制备细胞悬液，经细胞计数后每孔细胞的个数按照5×104个种入24孔板，每次多种几个孔，使每孔的体积为500μL，将六孔板放置在细胞培养箱中培养过夜。
2)用转染试剂LipofectamineTM 2000，按照说明书使用，转染siRNA(NC siRNA、177siRNA、712siRNA)。
3)细胞计数：分别在转染24h(1天)、48h(2天)、72h(3天)消化对应孔的细胞，在显微镜下计数。
4)最后使用SPSS 13.0统计软件进行统计分析，计数结果按照平均值分析，并且绘制转染NC siRNA、177siRNA、712siRNA的肝癌细胞生长曲线，两组比较采用t检验，当P值小于0.05时，具有统计学意义。
结果如图2b，在正常培养条件下，转染siRNA 1-3天后，通过细胞计数发现，相比转染NC siRNA(阴性对照组)的肝癌细胞，转染LRSAM1 siRNA (177siRNA、712siRNA)的肝癌细胞生长数量明显减少。可见，LRSAM1表达的下调对人肝细胞癌细胞生长有明显的抑制作用。
3.转染siRNA后肝癌细胞的细胞周期分析
复苏HepG2细胞，连续培养2代后，首先取对数生长期的细胞，用0.25％的胰酶消化细胞，然后调整细胞密度，以每孔5×104个细胞的密度种入六孔板中；24h后，进行所需的处理(用LipofectamineTM RNAiMAX转染LRSAM1 siRNA(177siRNA、712siRNA)和NC siRNA(阴性对照组)，24h后换液，再将细胞放入培养箱中，培养24h。特定时间终止培养，进行下一步实验：
1)用0.25％的胰酶消化细胞，收集1×106个细胞，分别放在不同标记的 1.5mL的EP管中，1000rpm/min，离心5min后，弃去上清；再用1mL预冷的PBS重悬细胞，1000rpm/min，离心5min，弃去上清，重复一次后，轻轻弹起EP管中的细胞，加入1mL预冷的75％的无水乙醇，轻轻吹打重悬细胞，最好制成单个细胞悬液。放置4℃冰箱固定过夜，至少固定18h。
2)1000rpm/min，离心5min，将乙醇弃去，再加入预冷的PBS清洗细胞，离心后弃去上清。每管加入100mL RNaseA，混匀，置于水浴锅中，孵育30 min。(注意：加入1mg/mLRNaseA，10mg/mL RNaseA用PBS稀释10倍)。
3)加入100mL的碘化丙啶(PI)，使终浓度≧40mg/mL，室温下避光染色 30min。(注意用冰盒取RNaseA和PI)。
4)提前预约流式分析仪，染色后立即上机检测，结果用FlowJo 7.6软件进行分析。
结果如图2c，细胞周期分析显示，在HepG2细胞中，相比转染NC siRNA (阴性对照组)的细胞，转染LRSAM1 siRNA(177siRNA和712siRNA)的细胞中，G2/M期细胞比例显著降低。因此，敲低LRSAM1后，G2/M期细胞比例显著降低，然而G1前期细胞数量没有增加(数据显示为
Figure RE-GDA0002263293190000111
n＝3)。以上这些数据表明，在常规培养条件下，LRSAM1通过促进细胞周期进展而不是细胞的存活来促进人肝细胞癌细胞的生长。
实施例2：在软琼脂集落形成实验条件下，LRSAM1对人肝细胞癌细胞生长的影响
1.稳定低表达LRSAM1的HepG2细胞株的构建
用0.25％的胰酶消化对数生长期的HepG2细胞，收集于玻璃离心管中，盖上无菌胶塞，1200rpm，离心4min，离心后再用加有10％FBS新的DMEM 培养基重悬细胞(注意轻轻吹打细胞悬液，尽量制成单个细胞悬液)。根据细胞浓度稀释细胞至合适浓度，吸取10μL稀释好的细胞悬液，在显微镜下进行细胞计数，经计算种入六孔板，每孔细胞个数5×104个；经24h后在显微镜下观察细胞的状态及细胞的密度。
当细胞贴壁良好，并且细胞汇合度在70％-90％时，用LipofectamineTM 2000转染试剂，按照说明书的使用方法，转染LRSAM1 shRNA(如阴性对照 NC shRNA、LRSAM1 shRNA549#或LRSAM1 shRNA 1636#)，转染后放入 CO2培养箱进行培养；再过24h后，将细胞用0.25％的胰酶消化，用DMEM 培养基终止消化，用无菌的移液管将细胞收集到无菌的玻璃试管中，盖上胶塞，1200rpm，离心4min，经离心后，玻璃试管口过酒精后倒掉旧培养基，用手轻轻弹起试管底部的细胞，把加有puromycin的DMEM培养基放入50 mL培养瓶中与细胞混匀；然后按照每孔10、100、1000个细胞的密度分别种入3个96孔板中，然后放入高压灭菌后的湿盒中，将湿盒与96孔板一起放进、5％CO2的培养箱中培养。
可以隔几天在显微镜下观察细胞的生长情况，经过14到21天左右，在显微镜下观察，并且挑取单克隆细胞放入24孔板中进行培养；经免疫印迹分析，选取LRSAM1低表达的稳定细胞株，一旦确定，及时对单克隆细胞进行传代培养；并且及时冻存，保种，为后续实验做准备。
2.GFP-LRSAM1表达载体的构建
首先设计GFP-LRSAM1的序列，送北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成引物(GFP-LRSAM1的正向引物： CTCAAGCTTGCCACCATGGTGCCGCTCTTCTTCCGGAAG；GFP-LRSAM1 的反向引物：CGCGGTACCGTGCTGCTGTGGTAGATGCGGAGGCG)，然后用PCR仪进行DNA的扩增，将扩增产物克隆到pEGFP-N1载体中，最后得到GFP-LRSAM1的表达载体，并进一步测序证实。
3.转染HepG2细胞所用质粒的制备
1)使用康为世纪小提试剂盒提取质粒，具体实验步骤如下：将7mL过夜培养的E.coli.JM109菌液分批转移到2mL的EP管中，13000rpm，离心 1min收集细菌，近两期去全部上清。
2)向留有菌体沉淀的离心管中加入500μL Buffer P1(提前加入RNaseA)，使用移液器或涡旋仪充分振荡混匀，使细菌悬浮。
3)向离心管中加入500μL Buffer P2，温和地上下颠倒混8-10次。使菌体充分裂解，室温下放置3-5min后溶液变得清亮粘稠。
4)向离心管中加入500μL Buffer E3后立即上下翻转8-10次，此时出现白色絮状沉淀，室温放置5min，13000rpm，离心5min，将上清液加入到过滤柱(Endo-Remover)中，13000rpm，离心1min，将收集管中的滤液转移到备好的离心管中。
5)向滤液中加入450μL异丙醇，上下颠倒混匀。
6)柱平衡：向吸附柱(Spin Columns DL)中加入200μL Buffer PS，13000 rpm，离心2min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
7)将步骤5)中滤液与异丙醇的混合液转移到平衡好的吸附柱中。
8)13000rpm，离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
9)向吸附柱中加入750μL Buffer PW(提前加入无水乙醇)，13000rpm，离心1min，倒掉收集管中的废液。
10)将吸附柱重新放入收集管，13000rpm，离心1min。
11)最后将吸附柱放进到一个干净的离心管中，在吸附膜中间加100到 200μL的EndoFree Buffer EB，室温放置2-5min，13000rpm，离心2min，所提质粒在-20℃冰箱保存备用。
4.稳定过表达LRSAM1基因的HepG2细胞株的构建
培养HepG2细胞，当细胞长至对数生长期时，用0.25％的胰酶将细胞消化成单个细胞，再用旧的DMEM培养基终止消化，然后用微量移液器将细胞悬液收集到玻璃管中。盖上无菌胶塞后离心，试管口过酒精灯外焰，轻轻倒掉上清，用手指弹匀细胞，用加有10％FBS的DMEM培养基重悬细胞(注意多重悬几次将细胞吹成单个细胞)。根据细胞浓度稀释细胞至合适浓度，吸取10μL，稀释好的细胞悬液，在显微镜下计数后，种入六孔板中，每孔细胞个数5×104个，最后将六孔板放至在CO2细胞培养箱中培养。24h后在显微镜下观察细胞的状态及细胞的密度。
当细胞好贴壁良好，并且当其细胞汇合度在70％-90％时，用 LipofectamineTM2000转染试剂，按照说明书的使用步骤，在细胞中瞬时转入EGFP-N1、EGFP-N1-LRSAM1质粒；转染经过24h后，再用0.25％的胰酶消化细胞，经离心后用新配的DMEM培养基重悬细胞至单个细胞悬液，然后再种入50mL的细胞培养瓶中，同时加入G418(200μg/mL)对细胞进行抗性筛选，并且每天在显微镜下观察细胞死亡情况，以便及时更换培养基及对细胞进行传代培养。
大约经过两周，将耐G418抗性的细胞用0.25％的胰酶消化，离心，用新配制的DMEM培养基重悬，收集到专用的流式管中，封口，送至流式细胞分选仪分选GFP阳性表达的细胞(整个过程无菌操作)；然后再将分选后的细胞用无菌生理盐水在1200rpm的条件下离心5min，重复洗三次后，用 DMEM培养基重悬细胞。之后再根据细胞数量的多少，以每孔5×104个细胞数将细胞种入六孔板或24孔板，放入CO2细胞培养箱培养、传代；培养期间可以取少量细胞进行蛋白裂解，通过免疫印迹分析，确定阳性表达 GFP-LRSAM1的HepG2细胞；经过培养传代及时冻存，保种，便于进行后续实验。
5.软琼脂集落形成实验
复苏构建的GFP-LRSAM1-HepG2的稳定细胞系以及低表达LRSAM1的 HepG2稳定细胞系。待细胞培养几代，取对数生长期的细胞，每个细胞系设置实验组和对照组(实验组为所筛选的过表达或低表达LRSAM1的克隆细胞，对照组为非靶向对照细胞)，并且实验组及对照组各设置两个复孔。
1)实验准备：将2×DMEM(已加双抗)及1×DMEM(已加双抗及血清)放进水浴锅预热，把普通胎牛血清、1.2％Agar(下层胶)及0.6％Agar(上层胶)从 4℃冰箱取出，室温放置30min。
2)下层胶的制备：首先将1.2％Agar(下层胶)放在微波中加热(注意瓶盖稍微松动)，直至完全融化后；然后放进培养箱中，确保下层胶不至于快速凝固。然后按4.5mL(2×DMEM)：4.5mL(1.2％Agar)：1mL(普通胎牛血清)的体积按照2×DMEM→胎牛血清1.2％下层胶的顺序加入25mL细胞培养瓶中，用移液管迅速混匀，按照每孔1.5mL的体积快速将混合液加入六孔板中，十字交叉慢慢摇动六孔板，使每个孔的液体均匀铺展每个孔，整个过程避免气泡的产生。最后将六孔板平放在4℃冰箱中，促凝15min左右。
3)细胞悬液的制备：等待下层胶促凝期间，消化对数生长期的细胞，用新培DMEM养基重悬细胞，按照每孔种1×103个细胞，在显微镜下计数后，取3×103个细胞，备用。
4)上层胶的制备：首先把0.6％Agar(上层胶)放在微波中加热(注意瓶盖稍微松动)，待0.6％Agar完全融化后，放进培养箱中保温，确保上层胶不至于快速凝固。然后按照1400μL：350μL：350μL：1400μL的体积依次将 2×DMEM、普通胎牛血清、单细胞悬液及0.6％Agar快速加入青小瓶中，用移液管混匀；再按照每孔1mL的体积，将混合液加入六孔板的下层胶上，十字交叉晃动，使每个孔的液体均匀铺展在下层胶之上，整个过程避免气泡的产生，最后将六孔板平放在4℃冰箱中，促凝10min。HepG2细胞每孔1×103个细胞。待上层胶完全凝固后，再补加1mL的完全培养基在每个孔中。最终将六孔板缓慢放入湿盒(提前高压灭菌)中，将六孔板连同湿盒一起放入、 5％CO2培养箱中培养，1-3周后观察集落形成情况。
5)1周后要定期观察集落形成情况，若上层完全培养基消耗过多，一定要补加完全培养基。当集落肉眼可见，大小适当时，首先弃去上层胶上的完全培养基，然后每孔加入1mL的MTT(5mg/mL)，然后将六孔板在细胞培养箱再放置4h，之后拿出染好的六孔板，用扫描仪扫描，计数对照组和实验组的集落形成个数。最后采用SPSS 13.0统计软件进行统计分析，两组比较采用t检验，当P值小于0.05时，具有统计学意义。
6.结果
如图3a，在构建的稳定表达的阴性对照shRNA和LRSAM1 shRNA 549# 的HepG2单克隆稳定细胞株，以GAPDH为内参，通过免疫印迹分析确认了相比转染NC shRNA的细胞，在转染LRSAM1 shRNA 549#的细胞中 LRSAM1的表达被有效敲低；另外如图3b，软琼脂形成实验结果显示，相比转染NC shRNA的细胞株，敲低内源性LRSAM1的稳定细胞株(LRSAM1 shRNA549#组)，其观察到的克隆形成数更少，统计学分析表明NC shRNA 组与LRSAM1 shRNA 549#组有显著差异(P<0.05)。
同样，如图3c，在稳定表达的NC shRNA和LRSAM1 shRNA 1636#的 HepG2单克隆细胞株，以GAPDH为内参，通过免疫印迹分析确认了相比转染NC shRNA的细胞，在转染LRSAM1shRNA 549#的细胞中LRSAM1的表达被有效敲低；另外如图3d，软琼脂形成实验结果显示，相比转染NC shRNA 的细胞株，敲低内源性LRSAM1的稳定细胞株(LRSAM1 shRNA1636#组)，其观察到的克隆形成更少，统计学分析表明NC shRNA组与LRSAM1 shRNA 1636#组有显著差异(P<0.05)。上述结果表明，在集落形成实验条件下， LRSAM1表达的下调降低了克隆的形成能力。
如图3e，构建的稳定表达GFP和GFP-LRSAM1的HepG2稳定克隆。如图3f，相比转染EGFP-N1质粒的细胞，转染EGFP-N1-LRSAM1质粒的HepG2 细胞观察到的克隆形成数明显更多。如所预期，过表达LRSAM1增强了克隆的形成能力。数据显示为
Figure RE-GDA0002263293190000161
n＝3；*，p<0.05；**，p<0.01；***， p<0.001；ns，没有意义。
以上结果表明，在集落形成实验条件下，LRSAM1促进了人肝细胞癌细胞的生长。
实施例3：LRSAM1对人肝细胞癌细胞体内生长的影响
分别取对数生长期的克隆细胞，如GFP-HepG2、GFP-LRSAM1-HepG2 的稳定细胞系；或者稳定表达NC shRNA、稳定低表达LRSAM1(LRSAM1 shRNA 549#或LRSAM1 shRNA 1636#)的HepG2细胞系；
先用无菌生理盐水冲洗细胞，用0.25％的胰酶消化细胞，制成单个细胞悬液，放进玻璃试管中，1200rpm/min，离心4min，弃去旧培养基后，再用不含血清的DMEM培养基重悬细胞，进行细胞计数。
根据实验所用裸鼠的个数及每只裸鼠所打的细胞个数，取得自己所需的细胞数，在水平离心机离心后，弃去旧培养基，再用不含血清的DMEM培养基重新重悬细胞，然后把前一天晚上放置4℃冰箱的Matrigel基质胶插在冰上，准备好EP管，将细胞悬液与Matrigel基质胶按照1：1的比例混匀后，分装到EP管中待用。
分别给裸鼠皮下注射转染的HepG2细胞进行移植瘤实验，每只裸鼠注射两个点(左侧对照细胞，右侧实验细胞)，每侧皮下注射细胞数为1×106个 /200μL；定期去动物饲养室观察裸鼠成瘤情况，等瘤子肉眼可见时，在特定时间内观察瘤子生长情况，并且每隔两天用卡尺测量瘤子的长径及短径，最后计算瘤子的体积(计算公式＝0.52×长径×短径2)。
如图4(a)，移植瘤的肿瘤生长曲线显示，相比转染有GFP的HepG2细胞，接种16天后转染有GFP-LRSAM1的HepG2细胞的肿瘤生长更快、体积更大，在第19天的肿瘤体积明显更大；另外，如图4(b)，左图为接种19 天后裸鼠被处死，取出的转染有GFP、GFP-LRSAM1的HepG2细胞的裸鼠皮下肿瘤的图像比较，右图为二者的重量比较图，可见相比转染有GFP的HepG2细胞，接种转染有GFP-LRSAM1的HepG2细胞的肿瘤明显体积更大、重量也大多了。数据均显示为
Figure RE-GDA0002263293190000171
n＝3；*，p<0.05；**，p<0.01； ***，p<0.001；ns，无意义。结果表明，过表达LRSAM1能够促进肿瘤的生长。
如图5(a)和图5(c)，接种19天内移植瘤的肿瘤生长曲线显示，转染有 NC shRNA的对照HepG2细胞生长逐渐加速，而转染有LRSAM1 shRNA 549# 或LRSAM1 shRNA 1636#的HepG2细胞的肿瘤生长极为缓慢，在第19天的肿瘤体积比NC对照组明显小的多了；另外如图5(b)和图5(d)，左图为接种 19天后裸鼠被处死，取出的转染有NC shRNA、LRSAM1 shRNA549#或 LRSAM1 shRNA 1636#的HepG2细胞的裸鼠皮下肿瘤的图像比较，右图为二者的重量比较图，可见相比转染有NC shRNA的HepG2细胞，接种转染有 LRSAM1 shRNA 549#或LRSAM1shRNA 1636#的HepG2细胞的肿瘤明显体积更小、重量也小多了。数据均显示为
Figure RE-GDA0002263293190000172
n＝3；*，p<0.05；**，p< 0.01；***，p<0.001；ns，无意义。以上结果表明，shRNA靶向不同序列的内源性LRSAM1的稳定沉默使得肿瘤生长速率明显降低；因此，低表达 LRSAM1能够显著抑制肿瘤的生长。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院
<120> LRSAM1作为肝细胞癌分子标志物的应用
<130> P190287
<141> 2019-09-29
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 1
ctcaagcttg ccaccatggt gccgctcttc ttccggaag 39
<210> 2
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 2
cgcggtaccg tgctgctgtg gtagatgcgg aggcg 35
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 3
gctgatcgtc cacacgaat 19
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 4
cccacggaca gattctcaa 19
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 5
gctgatcgtc cacgaatca 19
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 6
gccgaaatgg atgaacgatt c 21

Claims (1)

1.LRSAM1抑制剂在制备治疗肝细胞癌的药物组合物中的应用，其特征在于，所述药物组合物包含有效量的LRSAM1抑制剂LRSAM1 siRNA 177#、LRSAM1 siRNA 712#、LRSAM1shRNA 549#、LRSAM1 shRNA 1636#中的一种，其中LRSAM1 siRNA 177#为如SEQ ID NO.3所示的基因序列，LRSAM1 siRNA 712#为如SEQ ID NO.4所示的基因序列，LRSAM1 shRNA 549#为如SEQ ID NO.5所示的基因序列，LRSAM1 shRNA 1636#为如SEQ ID NO.6所示的基因序列。
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