CN112646887B - Znf239作为肝癌诊治的靶标 - Google Patents

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Abstract

本发明首次证实了ZNF239表达水平在肝细胞癌患者中显著上调，并且沉默ZNF239在体内能够有效地抑制肝细胞癌成瘤，因此，通过定性或定量ZNF239表达水平能够用于诊断肝细胞癌患者，并且沉默ZNF239的制剂可用于制备肝细胞癌药物，为肝细胞癌的预防和治疗提供新途径。

Description

ZNF239作为肝癌诊治的靶标
技术领域
本发明属于生物制药领域，更具体地，涉及ZNF239作为肝癌诊治的靶标。
背景技术
肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，也是肿瘤相关死亡的第四主因。尽管肝脏外科治疗技术的提高以及局部治疗、分子靶向治疗、免疫治疗等综合治疗手段的发展使得肝细胞癌患者的5年生存率有所增加，但是HCC患者的5年生存率仍然不超过20％。因此，寻找肝细胞癌潜在的治疗新靶点，为改善肝细胞癌患者生存质量提供新的路径。
锌指基因在人类基因中占有很大比例，编码的蛋白在细胞生长、分化、发育和许多疾病中发挥重要作用。其中，ZNF239(HGNC：13031)由458个氨基酸组成，目前已发现其与扩张型心肌病相关，然而仍未有任何报道提出ZNF239可否作为肝细胞癌诊治的靶标。
为此，提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供ZNF239在制备肝癌诊断产品及药物的新用途。
为此，本发明提供以下实施方案中的一种或多种：
定性或定量ZNF239表达水平的制剂用于制备肝癌诊断产品的用途。
进一步地，所述ZNF239表达水平包括mRNA水平或蛋白水平。
进一步地，所述制剂包括特异性检测ZNF239 mRNA的引物或探针。
进一步地，所述制剂包括特异性检测ZNF239蛋白的抗体或适体。
进一步地，所述肝癌为肝细胞癌。
进一步地，肝癌患者中ZNF239表达水平上调。
沉默ZNF239的制剂用于制备肝癌药物中的应用。
进一步地，所述制剂包括针对ZNF239设计的干扰RNA、反义寡核苷酸或CRISPRi。
进一步地，所述肝癌为肝细胞癌。
进一步地，所述药物抑制肝癌细胞体内成瘤。
本发明的有益效果包括：
本发明首次证实了ZNF239表达水平在肝细胞癌患者中显著上调，并且沉默ZNF239在体内能够有效地抑制肝细胞癌成瘤，因此，通过定性或定量ZNF239表达水平能够用于诊断肝细胞癌患者，并且沉默ZNF239的制剂可用于制备肝细胞癌药物，为肝细胞癌的预防和治疗提供新途径。
附图说明
图1：肝细胞癌组和正常肝细胞组织中ZNF239 mRNA水平；图中Normal表示正常肝细胞组织，Tumor表示肝细胞癌组织；
图2：配对肝细胞癌组织及癌旁正常组织中ZNF239蛋白水平；图中A为癌旁正常组织；T为肝细胞癌组织，P1-P4为配对样本编号；
图3：肝细胞癌细胞中构建沉默ZNF239模型的mRNA表达情况，
图4：肝细胞癌细胞中构建沉默ZNF239模型的蛋白表达情况；
图5：沉默ZNF239影响裸鼠皮下成瘤；
图6：沉默ZNF239影响裸鼠皮下成瘤的体积；
图7：沉默ZNF239影响裸鼠皮下成瘤的重量；
以上图中Vector为对照，sh-ZNF239-1#和sh-ZNF239-2#为2种沉默ZNF239的质粒。
具体实施方案
现将详细地提供本发明实施方案的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方案的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方案中，来产生更进一步的实施方案。
本发明涉及的实施方案包括：定性或定量ZNF239表达水平的制剂用于制备肝癌诊断产品的用途。在一些实施方案中，可以采取定性或定量的方式评估来自待检对象的离体样本中ZNF239表达水平，以确定待检对象是否患有肝癌。本领域技术人员可以采取不同的检测方式，定量或定性ZNF239表达水平。在一些实施方案中，所述ZNF239表达水平包括mRNA水平或蛋白水平。在一些实施方案中，所述制剂包括特异性检测ZNF239 mRNA的引物或探针。例如本领域技术人员可以采用荧光定量PCR法、Northern印迹杂交、原位杂交法等获取待检对象的离体样本中ZNF239 mRNA水平。在一些实施方案中，所述制剂包括特异性检测ZNF239蛋白的抗体或适体。例如本领域技术人员可以采用免疫组织化学、酶联免疫吸附、免疫层析、电化学方法等获取待检对象的离体样本中ZNF239蛋白水平。在一些实施方案中，所述肝癌为肝细胞癌。在一些实施方案中，肝癌患者中ZNF239表达水平上调。在一些实施方案中，离体样本包括组织、细胞、体液、分泌物、排泄物等，例如全血、血清、血浆等。
本发明涉及的实施方案还包括：沉默ZNF239的制剂用于制备肝癌药物中的应用。药物应当理解为对患者产生干预效果，例如预防疾病的发生、减缓疾病的发展、改善疾病状态、治愈疾病等方面，但不限于此。在一些实施方案中，所述肝癌为肝细胞癌。在一些实施方案中，所述药物抑制肝癌细胞体内成瘤。在一些实施方案中，所述制剂包括针对ZNF239设计的干扰RNA、反义寡核苷酸或CRISPRi。干扰RNA(RNAi)是指能够特异性剔除或关闭特定基因的表达的试剂，包括如siRNA、shRNA。反义寡核苷酸是通过序列特异地与靶基因DNA或mRNA结合而抑制该基因表达，在基因水平调控的分子药物。CRISPRi是利用CRISPR技术从转录水平改变基因表达的试剂。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规操作，如文献书籍报道的条件或试剂厂家推荐的条件实现。
具体实施例1、ZNF239在肝细胞癌中显著高表达
临床样本包括49例肝细胞癌组织和59例正常肝组织。对以上临床样本进行ZNF239mRNA表达水平检测(实时定量PCR法)，简而言之，使用Trizol提取样本中的RNA，对RNA进行逆转录，将逆转录获得的cDNA保存于-20℃备用。准备检测ZNF239的引物(委托广州市锐博生物科技有限公司设计与合成)和SYBR Green mix，按照常规的实时定量PCR方法扩增cDNA进行检测。以GAPDH基因作为内参，所有样本至少设置3个副孔。目的基因DNA相对表达量通过Schmittgen and Livak2-ΔΔCt公式计算得出。对4对配对的肝细胞癌组织及其癌旁正常组织进行ZNF239蛋白表达水平检测(western blotting法)，简而言之，取约100mg的组织，碾碎，加入RIPA裂解液裂解30min，收集裂解液，4℃，12,000g离心15min，收集上清，按BCA蛋白定量试剂盒说明书进行蛋白定量，向上清液加入上样缓冲液，沸水浴10min后，冰浴5min。使用SDS PAGE蛋白电泳，电泳后使用PVDF膜电转90min。电转结束后，加入5％脱脂奶粉封闭，TBST漂洗3遍，加入ZNF239抗体4℃孵育过夜，TBST漂洗3遍，加入封闭液稀释的二抗，室温孵育lh，TBST漂洗3遍，加入ECL发光液，显影，拍照。其中，以α-tubulin为对照。
结果如图1和图2所示，与正常肝组织相比，肝细胞癌组织中ZNF239的mRNA和蛋白水平显著高表达。因此，检测ZNF239的表达水平，可以用于诊断肝细胞癌。
具体实施例2、构建沉默ZNF239的肝细胞癌细胞模型
在Hep 3B细胞和Hep G2细胞中构建沉默ZNF239的模型。Hep 3B和Hep G2细胞培养于二氧化碳浓度为5％，温度为37℃的细胞培养箱中。采用RPMI 1640培养基(Invitrogen,USA)，培养基中加入终浓度为10％的胎牛血清，200mg/ml青霉素，250mg/ml氯霉素，500mg/ml谷胺酰胺。待细胞密度至80％时适宜实验使用。
利用慢病毒构建沉默ZNF239的肝细胞癌细胞模型，通过广州市锐博生物科技有限公司购买ZNF239 shRNA(1#和2#)，分别转染至Hep 3B细胞和Hep G2细胞中，同时设置对照vector。采用实施例1的方法检测细胞系中ZNF239的mRNA和蛋白水平。
结果如图3和图4所示，ZNF239 shRNA(1#和2#)均能显著下调肝细胞癌细胞中ZNF239的mRNA和蛋白水平。
具体实施例3、构建沉默ZNF239的裸鼠皮下成瘤模型
采用6周龄的裸鼠作为研究对象，将裸鼠分为2组(每组5只)，一组接种沉默ZNF239的Hep 3B细胞，另一组接种转染对照vector的Hep 3B细胞。细胞培养至1×105个/μL时，注射至裸鼠背部的皮下组织中，培养28天后，肿瘤体积用游标卡尺测量，体积用(L×W2)/2计算，实验结束后，对裸鼠进行安乐死，取出肿瘤称重。
结果如图5-7所示，沉默ZNF239能够显著抑制肝细胞癌细胞成瘤，且肿瘤体积和重量显著低于对照组。因此，沉默ZNF239能够用于预防或治疗肝细胞癌。

Claims (1)

1.沉默ZNF239基因表达的制剂在制备用于治疗肝细胞癌的药物中的应用，所述制剂为针对ZNF239基因设计的干扰RNA。
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