CN104726584B - miR‑425在肿瘤的诊断、治疗及预后中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了miR‑425在肿瘤诊断、治疗和患者生存预后中的应用。本发明公开了多种肿瘤的细胞凋亡、增殖、药物敏感性等生物学特征和miR‑425的表达量密切相关。miR‑425拮抗剂antimiR‑425能够显著抑制多种肿瘤细胞增殖、及在裸鼠体内的成瘤能力，并且增强化疗药物顺铂等在裸鼠体内的肿瘤治疗能力。本发明公开了一种肿瘤辅助诊断和患者生存预后的试剂盒，其含有能定量检测miR‑425的引物序列；一种治疗肿瘤的药物组合物，其含有miR‑425拮抗剂antimiR‑425。本发明为癌症提供了新的辅助诊断和预后诊断的方法。本发明发现antimiR‑425在制备治疗肿瘤药物中极具临床应用价值，尤其是为肺癌及肝癌的有效治疗提供了新的药物和治疗方法。

Description

miR-425在肿瘤的诊断、治疗及预后中的应用
技术领域
本发明涉及miR-425在肿瘤诊断、治疗及预后中的应用。
背景技术
恶性肿瘤是严重危害人类生命健康的疾病，我国每年癌症发病人数约307万人，而每年因癌症死亡的人数约220万人。世界卫生组织2012年《世界癌症报告》指出中国新诊断癌症病例为307万，占到全球总数的21.8%；而年死亡人数220万，占到全球癌症年死亡人数的26.9%。更为严重的是这些数据正以惊人的速度逐年增长。恶性肿瘤已超过心血管疾病成为致死的首要原因。因此，探索癌症发生的分子机制研究及寻找其有效治疗手段对人类健康具有重大意义。
根据世界卫生组织（WHO）公布的资料显示，肺癌的发病率和死亡率在世界各国均呈明显上升趋势。在中国，肺癌是目前致死率最高的癌症，而缺乏有效的早期检测手段是导致肺癌预后差的重要因素。已有统计研究表明中晚期肺癌患者的五年生存率仅是约13％，然而早期患者的五年生存率却可达到46%。但是，大多数肺癌患者在疾病中晚期之前经常观察不到明显的临床症状，以至于肺癌扩散前的早期检出率仅有16%。肺癌的早期诊断和预后判断对于提高肺癌患者的存活率非常重要,目前的诊断技术包括X-ray、CT以及唾液细胞学检测等,但是这些检测手段的灵敏度和特异性较差，经常造成假阳性。新的肺癌早期和肺癌进展相关的标记物的发现，可有助于对患者进行有效的诊断和治疗。治疗方案由癌症的类型和阶段决定，包括手术、放疗和/或化疗。然而，许多肺癌患者在诊断时已发生转移，往往失去手术机会，而针对肺癌的化疗方案效果亦欠佳，患者容易产生耐药，五年生存率低于5％，因此，亟需寻找更有效的辅助诊断、治疗和预后判断的方法。
肝癌是世界第五大癌症。我国是肝癌大国，患者高达3000万。目前针对肝癌的治疗主要采用早期手术切除，晚期化疗，同时辅以放疗和免疫制剂注射的传统方案。但肝癌起病隐匿，预后差，肝癌患者在初次诊断时，便已进入肝癌晚期，失去了根治性治疗的机会。开发新型有效的辅助诊断及治疗的方法被迫切需要。截止目前，手术切除和肝移植等被认为是肝癌根治性治疗的手段，肝切除技术已有显著的进步，术后并发症与死亡率也显著降低，然而，以术后5 年生存率为标志的患者生存率仍无根本性改善。传统的治疗方案虽然能缓解早期患者的病情，但对中晚期及转移复发性患者疗效较差。有研究表明，肝癌患者预后与病人的不同分子分型密切相关。因此，寻找并开发新型有效的辅助诊断肝癌、治疗肝癌和肝癌预后判断的方法极为重要。
基因治疗是新兴起的治疗方法。随着基因工程研究的深入，科学家对于运用基因工程研制肿瘤药物表现出浓厚的兴趣。基因治疗有望克服传统治疗的弊端，成为癌症治疗的新途径。
MicroRNA 简称为miRNA，通常长度为19～25个核苷酸，广泛存在于各种动植物甚至单细胞真核生物中，是一类在进化上高度保守的小分子单链RNA。miRNAs已经被证明在肿瘤进程中扮演着一个重要的角色，其主要通过结合到多种靶向mRNAs的3’UTR从而抑制mRNAs的转录。
在人类基因组序列中，miR-425为一种microRNA，miR-425前体定位在三号染色体，其含有87个碱基，序列为gaaagcgctt tggaatgaca cgatcactcc cgttgagtgg gcacccgagaagccatcggg aatgtcgtgt ccgcccagtg ctctttc，成熟体序列为aucgggaaugucguguccgccc。
发明内容
本发明的目的在于提供一种肿瘤检测试剂盒。
本发明的另一目的在于提供一种肿瘤预后试剂盒。
本发明的再一目的在于提供一种肿瘤治疗药剂。
本发明所采取的技术方案是：
miR-425作为肿瘤检测、治疗、预后靶点的应用。
一种肿瘤检测试剂盒，该试剂盒中含有能够定量检测miR-425的试剂。
进一步的，上述试剂盒中含有实时荧光定量检测miR-425的引物序列。
进一步的，上述试剂盒中含有实时荧光定量检测miR-425的引物序列，包括miR-425逆转录引物：CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGA GTCAACGGG；miR-425 PCR检测引物序列：ACGATCACTCCCGTTGACT；以及PCR通用引物序列：ACTGGTGTCGTGGAGTCGG。
进一步的，上述肿瘤为肺癌、肝癌、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、结直肠癌、食管癌、头颈部鳞癌、肾癌、前列腺癌和卵巢癌。
一种肿瘤的预后试剂盒，该试剂盒中含有能够定量检测miR-425的试剂。
进一步的，上述试剂盒中含有实时荧光定量检测miR-425的引物序列。
进一步的，上述试剂盒中含有实时荧光定量检测miR-425的引物序列；包括miR-425逆转录引物：CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGA GTCAACGGG；miR-425 PCR检测引物序列：ACGATCACTCCCGTTGACT；以及PCR通用引物序列：ACTGGTGTCGTGGAGTCGG。
一种肿瘤治疗药剂，该药剂中含有miR-425的拮抗剂antagomir。
进一步的，上述肿瘤为肺癌、肝癌。
本发明的有益效果是：
发明者发现miR-425在多种肿瘤如肺癌、肝癌、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、结直肠癌、食管癌、头颈部鳞癌、肾癌、前列腺癌和卵巢癌中表达显著上调。目前用于肿瘤临床辅助诊断技术尚不完善，而miR-425在肿瘤中的表达较正常组织中的表达是明显上调的，这提示miR-425具有成为肿瘤辅助诊断标记物的潜能。
本发明通过一系列体内、体外功能实验发现：在肺癌细胞和肝癌细胞中miR-425的高表达与肿瘤细胞的增殖、转移和抗凋亡密切相关。而通过抑制miR-425在癌细胞和组织中的表达水平，可以有效抑制肺癌细胞和肝癌细胞的增殖和转移，增强化疗药物顺铂诱导细胞凋亡的敏感性。以上实验数据均足以证明抑制内源性miR-425可显著降低细胞增殖、转移及药物抵抗能力，这提示了miR-425具有成为肿瘤治疗有效靶点的潜能。miR-425抑制剂在制备治疗肺癌及肝癌的药物组合物上极具临床应用价值，为肺癌和肝癌的有效治疗提供了新的药物和方法。
发明者同时发现miR-425高表达与肺癌和肝癌患者5年总生存率及无病生存率显著负相关，miR-425高表达明确指示较差的生存预后。这提示了miR-425具有成为肺癌和肝癌患者生存预后指标的潜能。
附图说明
图1为miR-425在多种肿瘤中的表达情况；显示为miR-425在肺癌、肝癌、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、结直肠癌、食管癌、头颈部鳞癌、肾癌、前列腺癌和卵巢癌病人组织样品中表达上调；
图2显示在164例肺癌临床肿瘤样品中miR-425高表达与患者5年总生存率（Overall survival, OS）显著负相关（a）；在214例肝癌临床肿瘤样本中miR-425高表达与患者5年总生存率（OS）及无病生存率（Disease-free survival, DFS）显著负相关（b）；
图3 为体外实验中的各组细胞生长实验，MTT 的含量检测（a）、平板克隆形成实验（b）和软琼脂克隆形成实验（c）显示高表达miR-425能促进肺癌细胞和肝癌细胞的生长，而沉默miR-425（antimiR-425） 能抑制肺癌细胞和肝癌细胞的生长；
图4为裸鼠皮下成瘤实验显示高表达miR-425增强了肺癌细胞和肝癌细胞的体内成瘤能力，而沉默miR-425的表达减弱了肺癌细胞和肝癌细胞的体内成瘤能力；其中a为各组小鼠体内的成瘤情况，b为各组小鼠体内肿瘤的体积大小；
图5为通过免疫荧光检测实验检测显示高表达miR-425能够减少肺癌细胞和肝癌细胞的细胞凋亡，然而沉默miR-425能够增强顺铂对肺癌细胞和肝癌细胞的诱导凋亡能力；其中a、b分别为各组小鼠体内肝癌、肺癌肿瘤体积的大小及TUNEL检测瘤组织中细胞凋亡的情况；
图6为裸鼠体内肿瘤转移模型实验显示高表达miR-425促进肺癌细胞和肝癌细胞在肺器官的肿瘤细胞定殖及克隆形成能力，而antimiR-425显著降低肺癌细胞和肝癌细胞在肺器官中的肿瘤形成能力，从而延长了小鼠了的生存时间；其中a和c表示活体荧光成像仪检测各组小鼠体内肿瘤形成情况，b和d分别用苦味酸染色和H&E方法进一步鉴定各组小鼠肺器官中肿瘤结节数的检测情况；
图7为TargetScan 网站预测结果显示 miR-425可能通过作用于PTPRJ、PTEN、PHLPP1、PHLPP2 和PPP2R2A这5个基因mRNA的3'UTR发挥功能（a）和免疫印迹实验结果表明高表达miR-425可明显下调靶基因PTPRJ、PTEN、PHLPP1、PHLPP2 和PPP2R2A的蛋白表达水平，沉默miR-425可明显上调这些蛋白的表达水平（b）；
图8中a图为miRNPs免疫共沉淀实验检测高表达miR-425是否促进RISC复合体（RNA-induced silencing complex）与靶基因PTPRJ、PTEN、PHLPP1、PHLPP2 和PPP2R2A的mRNA结合；b图为双荧光素酶活性检测结果表明miR-425通过作用于靶基因PTPRJ、PTEN、PHLPP1、PHLPP2 和PPP2R2A的mRNA 的3'UTR元件抑制荧光素酶的表达。
具体实施方式
miR-425作为肿瘤检测、治疗、预后靶点的应用。
一种肿瘤检测试剂盒，该试剂盒中含有能够定量检测miR-425的试剂。
优选的，上述试剂盒中含有实时荧光定量检测miR-425的引物序列。
优选的，上述试剂盒中含有实时荧光定量检测miR-425的引物序列,包括miR-425逆转录引物：CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGTCAACGGG（SEQ ID NO：1）；miR-425PCR检测引物序列：ACGATCACTCCCGTTGACT（SEQ ID NO：2）；以及PCR通用引物序列：ACTGGTGTCGTGGAGTCGG（SEQ ID NO：3）。
优选的，上述肿瘤为肺癌、肝癌、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、结直肠癌、食管癌、头颈部鳞癌、肾癌、前列腺癌和卵巢癌。
一种肿瘤的预后试剂盒，该试剂盒中含有能够定量检测miR-425的试剂。
优选的，上述试剂盒中含有实时荧光定量检测miR-425的引物序列。
优选的，上述试剂盒中含有实时荧光定量检测miR-425的引物序列，包括miR-425逆转录引物：CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGA GTCAACGGG（SEQ ID NO：1）；miR-425PCR检测引物序列：ACGATCACTCCCGTTGACT（SEQ ID NO：2）；以及PCR通用引物序列：ACTGGTGTCGTGGAGTCGG（SEQ ID NO：3）。
一种肿瘤治疗药剂，该药剂中含有miR-425的拮抗剂antagomir。
优选的，上述miR-425的拮抗剂antagomir为antimiR-425，antimiR-425是根据miR-425成熟体序列GGGCGGACACGACAUUCCCGAU（SEQ ID NO：4）设计的，antimiR-425的序列为ATCGGGAATGTCGTGTCCGCCC（SEQ ID NO：5）并携带有一个锁环结构，能与成熟的miR-425强竞争性结合。
优选的，上述肿瘤为肺癌、肝癌。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明内容。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆实验指南》 (第三版)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1：miR-425在肿瘤样品中表达上调
1.TCGA数据库分析
方法：所有统计学分析用SPSS17.0 统计软件进行处理。不同组间比较用独立t 检验( 常变量)，两组间均数的比较用t 检验，分类变量的比较用χ2检验，多组间比较用单因素方差分析。数值用均数±SD表示。检验系数P < 0.05 认为在统计学上有显著性差异。运用SPSS统计学分析法对TCGA（The Cancer Genome Altas Project）数据库的肺癌、肝癌、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、结直肠癌、食管癌、头颈部鳞癌、肾癌、前列腺癌和卵巢癌microRNA表达谱数据中miR-425的表达情况进行分析。
结果：如图1所示，TCGA数据资料中的肺癌、肝癌、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、结直肠癌、食管癌、头颈部鳞癌、肾癌、前列腺癌和卵巢癌病人肿瘤组织中的miR-425的表达明显高于正常组织中的miR-425的表达（*，P < 0.05）。我们定义miR-425在肿瘤组织中的表达是其在正常组织中的表达2倍（比值已经过Log2转化，相对数1为2倍），为高表达。结果显示在TCGA数据资料中miR-425分别在这11种肿瘤病人的肿瘤组织中表达水平高于其在正常组织中的2倍，为高表达。
结果分析： SPSS统计分析结果表明，TCGA数据资料中的肺癌、肝癌、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、结直肠癌、食管癌、头颈部鳞癌、肾癌、前列腺癌和卵巢癌病人肿瘤组织中的miR-425的表达分别明显高于其对应的正常组织中的miR-425的表达（P < 0.05），在肿瘤组织中检测到miR-425高表达更能确诊为肿瘤。TCGA的数据资料分析提示miR-425可作为辅助诊断的指标。
2. RT-qPCR检测miR-425分别在肺癌和肝癌病人的临床标本中的表达
方法：采用茎环结构RT-qPCR方法检测miR-425的表达水平：miR-425逆转录引物：CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGTCAACGGG（SEQ ID NO：1）；miR-425 PCR检测引物序列：ACGATCACTCCCGTTGACT（SEQ ID NO：2）；通用引物序列：ACTGGTGTCGTGGAGTCGG（SEQ IDNO：3）。（1）依靠逆转录酶将RNA转变成cDNA；（2）PCR扩增cDNA；（3）实时监测和定量测定cDNA的量。
结果：如图2-a和2-b所示，在164例肺癌病人和214例肝癌病人的肿瘤组织中miR-425的表达明显上调。根据RT-qPCR的结果，定义miR-425在肿瘤组织中的表达是其在正常组织中的表达2倍，为高表达。结果显示miR-425在肺癌和肝癌病人的肿瘤组织中表达是其在正常组织中的表达的大约4倍。在肺癌和肝癌病人的肿瘤组织中miR-425高表达。
结果分析：在肺癌和肝癌病人的肿瘤组织中miR-425高表达。因此，用含有特异性结合miR-425的引物的辅助诊断试剂盒检测到临床样本中miR-425高表达，更能确诊为该组织样本为肿瘤样本。临床样本的分析提示miR-425可作为辅助诊断的指标。
3.miR-425高表达的临床意义
方法：所有统计学分析用SPSS17.0 统计软件进行处理。采用Kaplan-Meier方法绘制生存分析曲线，并采用log-rank检验方法检测其统计学意义。检验系数P < 0.05 认为在统计学上有显著性差异。运用SPSS统计软件分析miR-425的表达与肺癌患者五年总生存率（Overall Survival，OS）以及肝癌患者五年总生存率（OS）和无病生存率（Disease FreeSurvival，DFS）的关系。
结果：如图2-a和2-b所示，在164例肺癌病人和214例肝癌病人的肿瘤组织中，miR-425高表达的肺癌病人比miR-425低表达的肺癌病人的5年总生存率（OS）明显降低，miR-425高表达的肝癌病人比miR-425低表达的肝癌病人的5年总生存率（OS）及无病生存率（DFS）明显降低。其中miR-425的高表达和低表达按照miR-425表达水平的中位数来划定。
结果分析：SPSS统计分析结果显示miR-425高表达与肺癌病人5年总生存率负相关，miR-425高表达与肝癌病人5年总生存率及无病生存率负相关（P < 0.05），miR-425高表达明确指示较差的生存预后。因此，miR-425可作为患者生存预后的潜在指标。
实施例2：构建稳定高表达miR-425的细胞系和转染antimiR-425的细胞系。
1.构建稳定的miR-425高表达的细胞株
（1）构建miR-425 的表达质粒
用PCR扩增miR-425前体的cDNA全长序列，引物序列如下：
FP：GCCAGATCTGCAACGGAATCCCAAAA（SEQ ID NO：6）
RP：GCCGAATTCCAAATAATGCGACCATAATAGAA （SEQ ID NO：7）
将纯化的miR-425全长序列构建到pMSCV-retro-puro表达载体（购自Clontech 公司），获得miR-425过表达质粒pMSCV-retro-puro-miR-425。
（2）转染人肺癌细胞A549和肝癌细胞HepG2
分别利用Lipofectamine2000 (Invitrogen，#11668) 和优化的包装质粒(Invitrogen，K4975-00) 将获得的pMSCV-retro-puro-miR-425和作为对照的pMSCV-retro-puro 空载体转入293FT 细胞。并于12 小时后更换DMEM 培养基 (DMEM ；GibcoBRL) 辅以10％的胎牛血清 (Gibco BRL)。48 小时及72 小时后收集逆转录病毒上清，并转导进入肺癌细胞A549细胞和肝癌细胞HepG2。
用puromycin (0.5 μg/mL；Sigma-aldrich) 筛选10天左右可得到稳定的miR-425高表达的细胞株A549-miR-425和HepG2-miR-425，对照细胞株分别为A549-Vector和HepG2-Vector。
（3）培养稳定的高表达miR-425的细胞株
使用DMEM培养基（DMEM；Gibco BRL）辅以10%的胎牛血清（Gibco BRL）的培养基培养肺癌细胞A549和肝癌细胞HepG2，并在37℃的含5%浓度二氧化碳的无菌细胞培养箱中进行培养。
2.构建antimiR-425的细胞株
制备miR-425拮抗剂（antagomir） antimiR-425，antimiR-425通过与体内成熟的miR-425竞争性结合，阻止miR-425与其靶基因mRNA的互补配对，抑制miR-425发挥作用。上述antimiR-425可由相关生物公司进行合成，本发明中具体用到的antimiR-425是根据miR-425成熟体序列GGGCGGACACGACAUUCCCGAU（SEQ ID NO：4）设计的。antimiR-425的序列为ATCGGGAATGTCGTGTCCGCCC（SEQ ID NO：5）并携带有一个锁环结构，而阴性对照Control的序列为：GFP siRNA序列并携带有一个锁环结构。将antimiR-425和阴性对照分别瞬时转染到A549细胞株和HepG2细胞株中，得到含有antimiR-425的A549细胞株和HepG2细胞株（分别简称为A549-antimiR-425、HepG2-antimiR-425）；对照细胞株A549-Control和HepG2-Control。下文所述的含有antimiR-425的A549细胞株和HepG2细胞株；对照细胞株A549-Control细胞株和HepG2-Control细胞株都是用这种方法得到。
使用DMEM培养基（DMEM；Gibco BRL）辅以10%的胎牛血清（Gibco BRL）的培养基培养肺癌细胞A549和肝癌细胞HepG2，并在37℃的含5%浓度二氧化碳的无菌细胞培养箱中进行培养。
实施例3：miR-425在肺癌细胞和肝癌细胞中的功能研究
1. 检测肿瘤细胞增殖
（1）体外实验： 细胞生长实验
通过MTT【3-4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazoliumbromide】实验检测高表达miR-425和沉默miR-425的细胞生长率的变化。实验操作按照细胞增殖MTT 试剂盒(Roche，Mannheim) 说明书进行。简述如下：将实验组细胞（HepG2- miR-425和HepG2-antimiR-425）或对照组细胞（HepG2-VectorA和HepG2-Control ）按1×104 个/孔接种于24 孔培养板中，每隔24 小时往一组细胞中加入100μL浓度为l0.3 mg/mL 的MTT标记混合物，培养4 小时后用酶标仪 (Tecan) 测量吸光值（OD 值），本实验平行重复3 次。
结果：如图3-a所示较对照组细胞HepG2-Vector和HepG2-Control（图中Vector和Control曲线），高表达miR-425的细胞增殖明显加快（图中miR-425曲线），而沉默miR-425的细胞增殖明显减慢（图中antimiR-425曲线）。
结果分析：MTT实验结果显示高表达miR-425能促进肝癌细胞HepG2的生长，而沉默miR-425 能抑制HepG2的生长。
（2）体外实验：平板克隆形成实验（Colony formation assay）
方法：将实验组细胞（A549-miR-425、HepG2-miR-425、A549-antimiR-425和HepG2-antimiR-425）和对照组细胞（A549-Vector、HepG2-VectorA、549-Control和HepG2-Control）接种于6孔板中，每孔1×103 个。常规培养10天后，用结晶紫染色，计数克隆，此实验平行重复3 次，计算平均值和标准差。
结果：如图3-b所示，高表达miR-425的细胞（A549-miR-425、HepG2-miR-425）形成克隆的数目明显多于对照组，而沉默miR-425的细胞（A549-antimiR-425和HepG2-antimiR-425）形成克隆的数目明显低于对照组。
结果分析：实验结果显示 miR-425促进肺癌细胞和肝癌细胞的克隆形成能力，而antimiR-425抑制肺癌细胞和肝癌细胞的克隆形成能力。
（3）体外实验：软琼脂克隆形成实验（Soft agar anchorage independent assay）
方法：软琼脂集落形成实验是应用最为广泛的检测细胞无支持面增殖能力的实验。将1×104 个实验组细胞（A549-miR-425、HepG2-miR-425、A549-antimiR-425和HepG2-antimiR-425）或对照组细胞（A549-Vector、HepG2-VectorA、549-Control和HepG2-Control）分别接种在含0.4％琼脂的培养基中，并平铺于含0.6％琼脂的培养基固化凝胶上。2 到4周后计数集落数目，并计算出集落形成率(集落形成率＝集落数目/所种细胞数×100％ )，本实验平行重复3 次。
结果：如图3-c所示，高表达miR-425的细胞（A549-miR-425、HepG2-miR-425）形成集落的数目明显高于对照组，而沉默miR-425的细胞（A549-antimiR-425和HepG2-antimiR-425）形成集落的数目明显低于对照组。
结果分析：实验结果显示miR-425促进肺癌细胞和肝癌细胞的集落形成能力，而antimiR-425抑制肺癌细胞和肝癌细胞的集落形成能力。
（4）体内实验：皮下成瘤实验
方法：将1×106个实验组细胞（A549-miR-425、HepG2-miR-425、A549-antimiR-425和HepG2-antimiR-425）或对照组细胞（A549-Vector、HepG2-VectorA、549-Control和HepG2-Control ）分别注射到6 只4 周龄左右裸鼠的左测背部皮下。监测注射后2 个月内肿瘤的形成情况和肿瘤的大小。
结果：如图4-a和4-b所示，高表达miR-425的细胞（A549-miR-425、HepG2-miR-425）形成的肿瘤体积和重量明显大于对照组，而沉默miR-425的细胞（A549-antimiR-425和HepG2-antimiR-425）形成的肿瘤体积和重量明显小于对照组。
结果分析：实验结果显示高表达miR-425增强了肺癌细胞和肝癌细胞的体内成瘤能力，而沉默miR-425的表达减弱了肺癌细胞和肝癌细胞的体内成瘤能力。
2.检测细胞凋亡
体内实验：TUNEL法检测细胞凋亡
TUNEL（TdT-mediated dUTP nick end labeling）检测细胞凋亡是用来检测组织细胞在凋亡过程中细胞核DNA的断裂情况。细胞在发生凋亡时，会激活一些DNA内切酶，这些内切酶会切断核小体间的基因组DNA。基因组DNA断裂时，暴露的3’-OH可以在末端脱氧核苷酸转移酶的催化下加上荧光素标记的dUTP，从而可以通过荧光显微镜进行检测细胞凋亡情况，由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA断裂，因而没有3’-OH形成，不能够被染色。
方法：高表达miR-425组：将1×106个miR-425稳定高表达细胞（A549-miR-425和HepG2-miR-425）或对照组细胞（A549-Vector和HepG2-VectorA）分别接种到8 只4 周龄左右裸鼠的左测背部皮下。
沉默miR-425组：将1×106个A549或HepG2细胞接种到4 周龄左右裸鼠的左测背部皮下。接种7天后将裸鼠分成两组（n = 8），分别进行皮下瘤原位注射拮抗剂antimiR-425或Control。
细胞接种15天后，在皮下形成肿瘤原位注射顺铂（Cisplatin，CDDP）。顺铂注射情况为3天/次，每次注射100μL，浓度为10 μM。监测肿瘤细胞皮下接种后2 个月内肿瘤形成情况、肿瘤的大小、及肿瘤组织细胞的凋亡情况。
TUNEL检测实验：将裸鼠皮下肿瘤切片，用冷PBS洗涤细胞两次；用4%多聚甲醛固定细胞10分钟，用PBS洗涤一次；加入含0.1％ Triton X-100的PBS，冰浴孵育2分钟；在样品上加50µL TUNEL检测液，37℃避光孵育60分钟。用抗荧光淬灭封片液封片后荧光显微镜下观察。可以使用的激发波长范围为450-500nm，发射波长范围为515-565nm(绿色荧光)。
结果：如图5所示，高表达miR-425的细胞（A549-miR-425和HepG2-miR-425）可抵抗顺铂诱导凋亡的作用形成较大的皮下肿瘤，且肿瘤组织中的细胞凋亡数目非常少；而沉默miR-425的细胞（A549-antimiR-425和HepG2-antimiR-425）可增强顺铂对肿瘤细胞的诱导凋亡敏感性，肿瘤组织中的细胞凋亡数目明显增多，形成肿瘤较小，甚至消除。
结论：沉默miR-425可增强顺铂对肺癌细胞和肝癌细胞诱导凋亡敏感性，降低肿瘤细胞的成瘤能力。
3. 检测肿瘤转移
体内实验：裸鼠体内肿瘤转移模型
方法：高表达miR-425组：通过尾静脉分别向10只裸鼠体内注射1×106个实验组细胞（A549-miR-425和HepG2-miR-425）或对照组细胞（A549-Vector和HepG2-Vector）。
沉默miR-425组：通过尾静脉向裸鼠体内注射1×106个A549或HepG2细胞。3天后将裸鼠分成两组（n = 10），分别进行腹腔注射antimiR-425或Control。3天/次，每次注射100μL，浓度为2 mg/ml。
监测注射后3个月内肺内转移肿瘤结节的形成情况和裸鼠的生存情况。
结果：图6-a和图6-c活体荧光成像仪检测的结果显示，尾静脉注射高表达miR-425的肿瘤细胞（A549-miR-425和HepG2-miR-425）的裸鼠肺器官中肿瘤形成的能力（肿瘤细胞定殖及克隆形成的能力）明显强于对照组，而注射antimiR-425沉默miR-425的裸鼠在肺器官中形成的肿瘤的能力明显低于对照组，甚至检测不到肿瘤细胞。图6-b和图6-d所示，苦味酸染色和H&E染色方法进一步确定注射高表达miR-425的肿瘤细胞（A549-miR-425和HepG2-miR-425）的裸鼠在肺器官形成的肿瘤克隆数、结节数明显多于对照组，而注射antimiR-425沉默miR-425的裸鼠在肺器官中形成的肿瘤克隆数、结节数明显少于对照组，甚至部分裸鼠看不到肿瘤结节。并且注射antimiR-425沉默miR-425可显著提高裸鼠的生存率（图6-e和6-f）。
结果分析：高表达miR-425促进肺癌细胞和肝癌细胞在肺器官肿瘤形成能力，而用antimiR-425处理后降低肺癌细胞和肝癌细胞在肺器官肿瘤形成能力。结果表明antimiR-425具有抑制肺癌和肝癌细胞转移的效果。
实施例4：miR-425 的靶基因的检测
1.采用TargetScan网站预测miR-425的作用靶基因
方法： TargetScan 网站预测结果表明miR-425可能作用于PTPRJ、PTEN、PHLPP1、PHLPP2 和PP2R2A这5个基因mRNA的3'UTR发挥作用。
miR-425可能通过作用于这5个PI3K/Akt信号通路的负调控基因，激活PI3K/Akt信号通路促进肿瘤的恶性发展。
结果：TargetScan 网站预测结果如图7a所示，miR-425可能与PTPRJ、PTEN、PHLPP1、PHLPP2 和PP2R2A这5个基因mRNA的3'UTR结合。
结果分析：miR-425可能通过与PTPRJ、PTEN、PHLPP1、PHLPP2 和PP2R2A这5个基因mRNA的3'UTR结合，抑制其mRNA的翻译，降低其蛋白表达水平。
2.蛋白免疫印迹实验检测靶蛋白表达水平
通过蛋白免疫印迹实验检测高表达miR-425或沉默miR-425对肺癌细胞系A549，肝癌细胞系HepG2中PTPRJ、PTEN、PHLPP1、PHLPP2 和PP2R2A这5个蛋白的表达影响。
方法：分别提取A549- miR-425和HepG2- miR-425细胞株，对照组A549-Vector细胞和HepG2-Vector细胞， A549-antimiR-425、HepG2-antimiR-425 细胞株以及对照组A549-control和HepG2-control细胞株这些细胞的总蛋白；应用SDS-PAGE电泳分离蛋白后，将蛋白转到硝酸纤维素膜上，脱脂牛奶封闭蛋白；用分别与PTPRJ、PTEN、PHLPP1、PHLPP2 和PP2R2A这五个蛋白特异性结合的单克隆抗体（一抗）与其充分结合后，再用与一抗特异性结合的二抗与其结合后，进行荧光显影，定影；将图片扫描并定量分析。
上述方法中，A549细胞株和HepG2细胞株分别转染miR-425过表达载体、对照载体质粒pMSCV-retro-puro、antimiR-425和对照Control。转染48h后提取细胞总蛋白，检测靶蛋白PTPRJ、PTEN、PHLPP1、PHLPP2 和PP2R2A的蛋白表达水平。
结果：如图7b所示，与对照组相比，过表达miR-425的细胞株A549- miR-425和HepG2- miR-425中可明显下调靶蛋白PTEN，PTPRJ，PHLPP1，PHLPP2 和PP2R2A的表达水平。另外，与对照组相比， miR-425沉默的细胞株A549-antimiR-425、HepG2-antimiR-425可明显上调靶蛋白PTEN，PTPRJ，PHLPP1，PHLPP2 和PP2R2A的表达水平。
结果分析：高表达miR-425可明显下调靶蛋白PTEN，PTPRJ，PHLPP1，PHLPP2 和PP2R2A的表达水平，另外，沉默miR-425可明显上调靶蛋白PTEN，PTPRJ，PHLPP1，PHLPP2 和PP2R2A的表达水平，而这四种蛋白均为磷酸酶，其在细胞中的作用之一是使p-Akt去磷酸化，而去磷酸化的p-Akt可以阻断PI3K/Akt 这条信号通路，从而抑制肿瘤的生长和转移。即miR-425在肿瘤细胞内可能通过下调细胞内磷酸酶PTEN，PTPRJ，PHLPP1，PHLPP2 和PP2R2A的表达，从而促进激活PI3K/Akt 信号通路，进而促进肿瘤的生长和转移。
3.miRNPs免疫共沉淀检测miR-425与靶基因相互结合
方法：将HA-Ago1转染到HepG2-miR-425和HepG2-Vector细胞中，培养24h后用anti-HA抗体进行Ago1的免疫共沉淀，进一步分离提取与Ago1组成的RISC复合体结合的mRNA。运用RT-qPCR分析免疫共沉淀后mRNA中PTEN，PTPRJ，PHLPP1，PHLPP2 和PP2R2A这五个基因的表达水平，从而进一步证明高表达miR-425可促进RISC复合体靶向这5个基因，调控其表达。
结果：如图8-a所示，相比对照组HepG2-Vector，高表达miR-425的细胞HepG2-miR-425中Ago1结合的PTEN，PTPRJ，PHLPP1，PHLPP2 和PP2R2A mRNA量明显增多，说明高表达miR-425的细胞中五种靶基因PTEN，PTPRJ，PHLPP1，PHLPP2 和PP2R2A的mRNA与RISC复合体结合明显增加。
结果分析：实验结果显示miR-425能够介导RISC复合体与基因PTEN，PTPRJ，PHLPP1，PHLPP2 和PP2R2A的mRNA结合，使相关基因蛋白表达下调。
4.双荧光素酶活性检测
方法：设计引物分别扩增PTEN，PTPRJ，PHLPP1，PHLPP2 和PP2R2A的mRNA 3'UTR序列，并分别将其连接到pGL3质粒中荧光素酶基因的3'UTR位置，获得重组质粒。再将所获得的重组质粒分别转染到实验组细胞HepG2-miR-425、HepG2-antimiR-425、HepG2-miR-425-mut（过表达的miR-425序列被突变）、及对照组细胞（HepG2-Vector和HepG2-Control），培养一定时间后用酶标仪检测荧光素酶的表达情况。
结果：如图8-b所示运用酶标仪进行荧光素水平的检测，结果表明高表达miR-425显著抑制荧光素酶的表达。反之，沉默miR-425上调荧光素酶的表达。
结果分析：运用酶标仪进行吸光度的检测发现高表达miR-425的细胞中荧光素酶的表达降低，而转入antimiR-425的细胞中荧光素酶的表达升高。结果证实，miR-425通过作用于靶基因PTEN，PTPRJ，PHLPP1，PHLPP2 和PP2R2A的mRNA的3'UTR元件调控基因的表达。
为本领域的专业技术人员容易理解，以上所述仅为本发明专利的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均落在本发明要求的保护范围之内。
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<120> miR-425在肿瘤的诊断、治疗及预后中的应用
<130>
<160> 7
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 1
ctcaactggt gtcgtggagt cggcaattca gttgagtcaa cggg 44
<210> 2
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<212> DNA
<213> 人工引物
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人工引物
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<212> RNA
<213> 人
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<213> 人工合成序列
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<213> 人工引物
<400> 6
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<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 7
gccgaattcc aaataatgcg accataatag aa 32

Claims (7)

1.能够定量检测miR-425的试剂在制备检测肺癌、肝癌的检测试剂盒中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的试剂盒中含有实时荧光定量检测miR-425的引物序列。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述的试剂盒中含有实时荧光定量检测miR-425的引物序列，包括miR-425逆转录引物：CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGTCAACGGG；miR-425PCR检测引物序列：ACGATCACTCCCGTTGACT；以及PCR通用引物序列：ACTGGTGTCGTGGAGTCGG。
4.能够定量检测miR-425的试剂在制备肺癌的预后试剂盒中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述的试剂盒中含有实时荧光定量检测miR-425的引物序列。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述的试剂盒中含有实时荧光定量检测miR-425的引物序列，包括miR-425逆转录引物：CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGTCAACGGG；miR-425PCR检测引物序列：ACGATCACTCCCGTTGACT；以及PCR通用引物序列：ACTGGTGTCGTGGAGTCGG。
7.miR-425的拮抗剂antagomir在制备治疗肺癌、肝癌药剂中的应用。
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