CN111603561A - microRNA-425及其类似物作为阿尔茨海默病治疗的核苷酸药物的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及microRNA‑425及其类似物作为阿尔茨海默病治疗的核苷酸药物的应用。miR‑425上调剂能够靶向结合Aβ前体蛋白APP和裂解酶BACE1 mRNA的3’非翻译区，减少Aβ前体蛋白APP和裂解酶BACE1的表达水平，改善学习和记忆能力，具有治疗AD的临床应用前景。

Description

microRNA-425及其类似物作为阿尔茨海默病治疗的核苷酸药 物的应用

技术领域

本发明属于生物技术和医学领域，具体涉及microRNA-425及其类似物作为阿尔茨海默病治疗的核苷酸药物的应用。

背景技术

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一种最常见的神经变性疾病，因其高患病率、高致残率及高死亡率而成为当今社会中一种严重影响人类健康的重大疾病。现有的研究发现AD的主要病理学改变表现为β-淀粉样蛋白(Aβ)聚集形成的老年斑(SP)、Tau蛋白异常聚集形成的神经原纤维缠结(NFT)及脑内神经元的大量丢失。针对AD，临床上至今还缺乏有效的早期诊断手段和治疗措施。在发达国家和我国，AD已成为继心脏病、癌症和卒中之后人类的第4位死因。目前，AD的发病机制依然并不清楚，但是普遍的观点认为淀粉样前体蛋白降解通路的激活，导致Aβ产生异常增加和聚集，是导致AD发生的关键因素。因此阐明AD发病机制和寻找新型的治疗策略及靶点就成为目前急需解决的关键所在。

microRNA(miRNA)是一类新近发现、非编码、大小为21-23个核苷酸的单链小分子RNA。miRNA是通过结合靶基因mRNA的3’非翻译区(3’UTR)来降低靶mRNA的稳定性，促进靶mRNA降解，从而抑制翻译过程，减少目的基因的表达。近年来，国际上对于miRNA在AD发病作用的研究日渐增多，目前国内外研究主要集中在miRNA表达谱的建立以寻找在AD中异常表达的miRNA，而对于这些异常表达的miRNA在AD中的功能角色方面的研究还少见报道。作为在外周组织(内脏)及脑组织均有表达的miRNA，miR-425被认为在肿瘤的转移和炎症形成中发挥了关键作用。近年的研究发现，miR-425在多种类型的肿瘤组织，抑制肿瘤细胞的增殖和转移，同时还可以作为某些肿瘤如胃癌的诊断标志物。但在中枢神经系统中，miR-425作用依然并不清楚。同时经对现有技术的国内外文献检索，至今未见有关miRNA(包括miR-425)与AD治疗的研究报道。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的在于提供miR-425在治疗阿尔茨海默病中的应用。

第一方面，本发明提供miR-425上调剂在制备预防和/或治疗阿尔茨海默病的药物中的应用。

所述miR-425上调剂能够靶向结合Aβ前体蛋白APP和裂解酶BACE1 mRNA的3’非翻译区，减少Aβ前体蛋白APP和裂解酶BACE1的表达水平，改善学习和记忆能力，具有治疗AD的临床应用前景。

所述miR-425上调剂包括以下核苷酸序列：5’-AAUGACACGAUCACUCCCGUUGA-3’。

较佳地，所述miR-425上调剂为miR-425、miR-425模拟体、miR-425类似物、miR-425修饰物中的至少一种。

较佳地，所述miR-425修饰物是通过对miR-425进行如下修饰中的至少一种而得：任意核苷酸的核糖修饰、碱基修饰、磷酸骨架修饰、任意核苷酸的增减、替换。

较佳地，所述药物包括miR-425上调剂、以及药学上可接受的载体或辅料。

第二方面，本发明提供miR-425作为靶点在开发、筛选或制备用于预防和/或治疗阿尔茨海默病的药物中的应用。

第三方面，本发明提供miR-425作为靶点在制备用于预防和/或治疗阿尔茨海默病的筛药模型中的应用。

第四方面，本发明提供一种筛选预防和/或治疗阿尔茨海默病的药物的方法，所述方法包括：

用候选物质处理表达miR-425的体系；和

检测所述体系中miR-425的表达；

若miR-425的表达增加，则表明该候选物质是预防和/或治疗阿尔茨海默病的潜在物质。

附图说明

图1示出在AD患者和APP/PS1小鼠脑组织内的miR-425水平，可以看出miR-425水平显著降低。

图2示出miR-425 AntagomiR的荧光素酶报告基因实验结果(A)和蛋白质免疫印迹实验结果(B)。

图3示出AD模型小鼠APP/PS1经脑立体定位注射补充miR-425类似物Agomir-425两月后的学习和记忆能力，其中A是小鼠水迷宫运动轨迹图，B是治疗组与对照组小鼠寻找目标象限潜伏期，C是治疗组与对照组小鼠在目标象限停留时间，D是治疗组与对照组小鼠在目标象限运动的路程，可以看出，与对照组相比，学习和记忆能力显著提高。

图4示出AD模型小鼠APP/PS1经脑立体定位注射补充miR-425类似物Agomir-425两月后淀粉样蛋白病理情况，可以看出，与对照组相比，淀粉样蛋白病理出现显著缓解。

具体实施方式

以下结合附图和下述实施方式进一步说明本发明，应理解，附图和下述实施方式仅用于说明本发明，而非限制本发明。

本发明人经研究发现，非编码小RNA基因microRNA-425(简称miR-425)在阿尔茨海默病患者和模型小鼠脑组织中表达显著降低，并参与脑内淀粉样蛋白病理的产生。针对AD模型小鼠脑内给予miR-425模拟体可以显著缓解脑内淀粉样蛋白病理的发生，改善小鼠学习和记忆能力，表明miR-425及其类似物具有治疗AD的临床应用前景，由此完成本发明。

在此公开了miR-425上调剂在制备预防和/或治疗阿尔茨海默病的药物中的应用。

术语“预防疾病”例如是指在可能暴露或预先处置于疾病但尚未经历或显示疾病症状的哺乳动物中使疾病临床症状不发展。

术语“治疗疾病”可指抑制疾病，例如阻止或降低疾病或其临床症状的发展，或者缓解疾病，例如使疾病或其临床症状退化。

miR-425上调剂包括能够提高miR-425水平的物质。另外，应理解，miR-425上调剂也包括能够提高miR-425活性和稳定性的物质、能够增加miR-425有效作用时间的物质。

miR-425上调剂可以包括以下核苷酸序列：5’-AAUGACACGAUCACUCCCGUUGA-3’。miR-425上调剂可以是miR-425及其类似物，即，可以是miR-425，也可以是具有与miR-425类似功能活性的物质。作为具有与miR-425类似功能活性的物质，例如可举出miR-425模拟体、miR-425类似物、miR-425修饰物等。

miR-425模拟体(miR-425mimics)是指运用化学合成的方法合成，能够增强内源性miR-425的功能的核苷酸序列。

miR-425类似物是指在核苷酸序列上与miR-425相近或者同源的核苷酸序列，例如可以是miR-425激动剂(Agomir 425)。

miR-425修饰物是指miR-425的核苷酸序列设计核酸序列及其修饰物，所述修饰包括任意核苷酸的核糖修饰、碱基修饰和磷酸骨架修饰中的一种或几种的组合或任意核苷酸的增减、替换，只要修饰后的核苷酸序列仍具有与miR-425类似的功能活性。

在此公开了小分子核苷酸miR-425及其类似物在抑制AD脑内淀粉样蛋白病理的效应，应用miR-425及其类似物能够有效抑制AD模型小鼠病理表型的进展，提高学习和记忆能力。研究发现，miR-425在AD患者及APP/PS1小鼠脑组织显著降低。针对AD模型小鼠，通过脑内补充miR-425核苷酸类似物，能够显著减少Aβ前体蛋白APP和关键裂解酶BACE1的表达水平，从而抑制Aβ的产生和淀粉样蛋白病理的产生。本发明所述的应用中可为治疗阿尔茨海默病的一种核苷酸类似物的药物。

miR-425及其类似物能够抑制靶基因APP和BACE1，抑制淀粉样前体蛋白途径，作为新型的核苷酸药物。

本发明一实施方式中分别给神经细胞SHSY-5Y细胞转染miR-425模拟体(miR-425mimics)后发现，miR-425模拟体能够显著减少APP和BACE1蛋白的表达，这表明miR-425在调节APP淀粉样蛋白裂解途径和Aβ产生中具有重要作用。通过荧光素酶报告基因实验发现，miR-425能够靶向结合APP和BACE1 mRNA的3‘UTR区，促进mRNA的降解，抑制APP和BACE1蛋白的表达水平。

针对AD动物模型APP/PS1小鼠，通过脑内补充miR-425核苷酸类似物作为治疗药物，结果证明，miR-425能够显著减少Aβ的产生和淀粉样蛋白病理的形成，促进学习和记忆能力的缓解。

miR-425可以作为靶点，用于开发、筛选或制备用于预防和/或治疗阿尔茨海默病的药物。可以将miR-425作为作用对象，对候选物质进行筛选。筛选出的能够提高miR-425表达、提高miR-425活性和稳定性、和/或增加miR-425有效作用时间的物质可以作为备选的预防和/或治疗阿尔茨海默病的药物。

可以建立一种以miR-425为靶点的筛药模型来筛选以miR-425为作用对象的药物。

一实施方式中，用候选物质处理表达miR-425的体系，检测所述体系中miR-425的表达，若miR-425的表达增加，则表明该候选物质是预防和/或治疗阿尔茨海默病的潜在物质。

在此公开一种药物组合物，其包括有效量miR-425上调剂、以及药学上可接受的载体或辅料。

“有效量”意指miR-425上调剂(i)治疗特定疾病、病症或障碍，(ii)减弱、改善或消除特定疾病、病症或障碍的一或多种症状，或(iii)预防或延迟本文所述特定疾病、病症或障碍的一或多种症状发作的量。

“药学上可以接受的载体”指的是一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质，它们适合于人使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相容性”在此指的是组合物中各组份能和有效成分相互掺和，而不明显降低有效成分的药效。药学上可接受的载体或辅料部分例子有纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素钠、纤维素乙酸酯等)、明胶、滑石、固体润滑剂(如硬脂酸、硬脂酸镁)、硫酸钙、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄榄油等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化剂(如吐温

)、润湿剂(如十二烷基硫酸钠)、着色剂、调味剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、无热原水等。

本公开中的药物或药物组合物可按照药物制备的常用方法制成注射制剂、口服制剂、滴鼻剂、喷雾制剂、软膏制剂或贴剂等。

miR-425上调剂也可以与其它预防和/或治疗阿尔茨海默病的药物进行联合用药。

下面进一步例举实施例以详细说明本发明。同样应理解，以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。下述示例具体的工艺参数等也仅是合适范围中的一个示例，即本领域技术人员可以通过本文的说明做合适的范围内选择，而并非要限定于下文示例的具体数值。

实施例1：在AD患者和模型小鼠脑组织中，miR-425水平显著降低

选择15月龄APP/PS1转基因小鼠及相同年龄和背景的野生对照鼠各5只，麻醉后灌注取脑，脑组织分成两半，一半用于RNA抽提进行miRNA芯片表达谱分析和RNA测序(RNA-seq)，一部分多聚甲醛固定后制作石蜡切片进行原位杂交实验。AD患者海马和前额叶组织及石蜡切片由协和医科大学中国人脑组织库提供，相关操作符合伦理学操作标准和流程。

miRNA芯片表达谱分析：试验使用4-8μg总RNA混合样品，使用Poly(A)聚合酶在总RNA3′端加上poly(A)尾，再将一个寡聚核苷酸标记与这个poly(A)尾巴连接用于后续的荧光标记。杂交反应利用微循环泵(Atactic Technologies)的循环作用在μParaflo微流体芯片上过夜进行。杂交使用含有25％甲酰胺的100μL 6×SSPE缓冲液，杂交温度为37℃。RNA与探针杂交后，与标记特异结合的Cy3染料在微流体芯片上循环流动进行染色。利用激光扫描仪(GenePix 4000B,Molecular Device)采集杂交图像并使用Array-Pro图像分析软件(Media Cybernetics)进行图像数字化转换。数据分析减除背景值，然后使用LOWESS过滤进行信号归一化。

RT-PCR：实验使用TIANGEN公司miRNeasy kit试剂盒说明书提取总RNA，实时荧光定量PCR，根据TIANGEN公司提供miRcute Plus miRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒说明书将RNA反转录成cDNA，按照2×Power Taq PCR miRcute Plus miRNA qPCRDetection Kit试剂盒说明书提供的方法在RT-PCR ABI7300仪上进行实时荧光定量PCR反应，以U6为内参照。反应结束后由配套的计算机软件计算各反应管内的CT值。采用相对定量方法2ΔΔCt来计算miRNA的相对表达水平。

原位杂交实验：miR-425原位杂交检测试剂盒购自丹麦Exiqon公司，原位杂交封闭液与洗涤液购自美国Roche公司。基本过程如下:组织芯片脱蜡，于37℃蛋白酶K消化15min，漂洗后梯度乙醇脱水。55℃预杂交30min后，Cy5标记的miR-425探针(100nmol/L)恒温杂交1h，充分淋洗后DAPI复染。杂交过程选择U6探针(1nmol/L)作为阳性对照，去除探针作为阴性对照。结果判定:miR-425呈红色颗粒的阳性信号定位于细胞胞质和胞核中。

荧光素酶报告基因实验：实验选择处于对数期PC12细胞分别转染miRNA agomiR和乱序对照组，转染后36h裂解细胞，Dual-luciferase Reporter Assay system试剂盒检测荧光素酶报告基因表达情况，具体方法按试剂盒操作。每孔加入100ul细胞裂解液，室温缓慢摇动15min，取10ul细胞裂解液加入50ul荧光素酶检测试剂II，混匀检测荧光素酶活性；然后加入50ul海肾荧光素酶试剂检测海肾荧光素酶活性；最后以萤火虫与海肾荧光素酶活性的相对活性比值作为报告基因活性值。

蛋白免疫印迹实验：PC12细胞转染Antagomir-425及对照后72小时，用RIPA裂解液裂解细胞，20min后将裂解液转移至1.5mL离心管中并标记，用BCA试剂盒蛋白定量。蛋白变性后，经SDS-PAGE系统电泳分离后转PVDF膜，5％脱脂奶粉(0.1％TBST稀释)室温封闭1h，TBST洗3次，每次5min，4℃分别孵育APP，BACE1及内参蛋白GAPDH抗体(1∶1000)过夜，TBST洗涤3次，每次5min，孵育二抗HRP标记抗体(1∶5 000)2h，TBST洗涤3次，最后加ECL发光液、曝光、显影，用Image J软件进行灰度分析。

通过miRNA芯片表达谱分析、RT-PCR及原位杂交实验表明，如图1所示，在AD患者和模型小鼠脑组织中，miR-425水平显著降低。图1中，DAPI表示细胞核，HC表示海马，PFC表示前额皮层。

实施例2：荧光素酶报告基因实验显示miR-425靶向调控APP与BACE1 3‘UTR

神经细胞SHSY-5Y细胞(来自上海中国科学院细胞库)转染miR-425抑制剂(miR-425 AntagomiR)(miR-425反义核苷酸序列，购自上海吉玛生物)和带有APP或BACE1 3’UTR荧光素酶质粒后，通过荧光素酶报告基因实验发现，miR-425 AntagomiR能够显著升高细胞内荧光素酶的活性(图2中的A)，表明miR-425可以靶向结合APP和BACE1 mRNA的3’UTR区。

实施例3：miR-425靶向调控APP与BACE1蛋白表达水平

神经细胞SHSY-5Y细胞转染miR-425抑制剂(miR-425 AntagomiR)后，经蛋白质免疫印迹实验发现，miR-425抑制剂能够显著升高APP和BACE1蛋白的表达，这表明miR-425在调节APP淀粉样蛋白裂解途径和Aβ产生中具有重要作用。miR-425抑制剂可以抑制APP和BACE1 mRNA的降解，促进APP和BACE1蛋白的表达水平(图2中的B)。

实施例4：miR-425类似物缓解AD模型小鼠脑内淀粉样蛋白病理和行为表征

该实验经过上海交通大学医学院动物实验伦理委员会批准，按照动物实验操作指南实施。6月龄APP/PS1雄性小鼠购于南京大学模式动物中心。将小鼠随机分为Control组(对照组)及Agomir425组。3％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉小鼠，俯卧位将其头部固定于立体定位注射仪上，用微量注射器吸取10μl Agomir425(与miR-42相同的核苷酸序列，购自上海吉玛生物)溶液(10uM，Control组使用相同剂量乱序核苷酸序列)，在颅骨孔处竖直插入脑组织。用微量注射泵以0.5μl/min速度入小鼠第三脑室，待注射完毕后将注射器缓慢抽出。小鼠立体定位注射术后将颅骨注射点周围消毒，缝合皮肤后放回鼠笼中继续饲养。两个月后通过Morris水迷宫检测小鼠学习和记忆能力。行为学后处死取脑，固定切片后检测脑内淀粉样蛋白病理。

如图3所示，行为学实验结果表明，miR-425类似物可以显著缩短APP/PS1小鼠的到达平台的潜伏期，提高目标象限的停留时间和路程。如图4所示，脑组织病理检测结果表明，miR-425类似物治疗可以降低脑内淀粉样斑块的沉积，缓解脑内淀粉样蛋白病理的严重程度。

Claims (9)

1.miR-425上调剂在制备预防和/或治疗阿尔茨海默病的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述miR-425上调剂能够靶向结合Aβ前体蛋白APP和裂解酶BACE1 mRNA的3’非翻译区，减少Aβ前体蛋白APP和裂解酶BACE1的表达水平。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述miR-425上调剂包括以下核苷酸序列：5’-AAUGACACGAUCACUCCCGUUGA-3’。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的应用，其特征在于，所述miR-425上调剂为miR-425、miR-425模拟体、miR-425类似物、miR-425修饰物中的至少一种。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述miR-425修饰物是通过对miR-425进行如下修饰中的至少一种而得：任意核苷酸的核糖修饰、碱基修饰、磷酸骨架修饰、任意核苷酸的增减、替换。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的应用，其特征在于，所述药物包括miR-425上调剂、以及药学上可接受的载体或辅料。

7.miR-425作为靶点在开发、筛选或制备用于预防和/或治疗阿尔茨海默病的药物中的应用。

8.miR-425作为靶点在制备用于预防和/或治疗阿尔茨海默病的筛药模型中的应用。

9.一种筛选预防和/或治疗阿尔茨海默病的药物的方法，所述方法包括：

用候选物质处理表达miR-425的体系；和

检测所述体系中miR-425的表达；

若miR-425的表达增加，则表明该候选物质是预防和/或治疗阿尔茨海默病的潜在物质。

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