JP6340366B2 - 運動ニューロン疾患を診断および処置する方法 - Google Patents

Description

本発明は、本発明のいくつかの実施形態において、運動ニューロン疾患を診断および処置する方法に関する。

運動ニューロン疾患（ＭＮＤ）および前頭側頭認知症は、中枢神経系の運動ニューロンの破壊および運動ニューロン経路の退行性変化に起因する神経障害の群に属する。このような疾患は、運動ニューロン以外のニューロンの破壊によって引き起こされる、パーキンソン病、アルツハイマー病、オリーブ橋小脳萎縮症等を含む他の神経変性疾患とは異なっている。典型的に、ＭＮＤは進行性の変性疾患であり、上位および下位運動ニューロンを侵し、連続的な全体的筋肉の除神経をもたらす。一般にＭＮＤは、中年で発症するが、広い年齢範囲で症候的疾患の発症が観測される場合があり、既に研究されているいくつかの変異体については１８〜８５歳にわたる。症状には、つかえ感、四肢脱力、不明瞭発語、歩行不良、顔面脱力およびこむら返りが含まれ得る。疾患の末期では、運動ニューロンの死滅に起因して、呼吸器筋系がその神経支配を喪失し、通常これがＡＬＳ患者の死亡の最終的な原因となる。ほとんどのＭＮＤの原因は知られていないが、環境的、毒性、ウイルス性または遺伝的要因のすべてが疑わしい。

上位運動ニューロンおよび下位運動ニューロンを含む運動ニューロンは、随意筋に影響を及ぼし、随意筋に収縮するように刺激を与える。上位運動ニューロンは、大脳皮質に始まり、脳幹および脊髄まで線維を送り、下位運動ニューロンの調節に関与する。下位運動ニューロンは、脳幹および脊髄に位置し、それらから線維を筋肉に送っている。下位運動ニューロン疾患は、下位運動ニューロン変性を伴う疾患である。下位運動ニューロンが変性すると、その下位運動ニューロンが正常に活性化する筋線維が連絡切断され、収縮しなくなるため、筋力低下および反射減少が引き起こされる。いずれかのタイプのニューロンの喪失は、脱力感を生じさせ、筋萎縮（消耗）および無痛性脱力感は、ＭＮＤの臨床的に顕著な特徴である（さらなる臨床的定義については、非特許文献１を参照されたい）。

筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）は、大脳運動皮質内の錐体細胞（すなわちベッツ巨細胞）、前脊髄運動ニューロンおよび脳幹運動ニューロンの喪失、ならびにそれらの錐体細胞への変性を特徴とする、致命的な運動ニューロン疾患である。ＡＬＳは、臨床面から見ると、上位運動ニューロンおよび下位運動ニューロンの両方の徴候を示し、疾患の発症後に急速な臨床的悪化を示すため、数年以内に死に至る。

多くの他の運動ニューロン疾患と同様に、ごくわずかな割合（約１０％〜２０％）のＡＬＳは、遺伝性である。ＡＬＳの遺伝的疫学により、疾患の遺伝について説明できる少なくとも１２の染色体位置が明らかになっている（ＡＬＳ１〜ＡＬＳ１２）。これらの中でも、いくつかの遺伝子が同定されている。最初の遺伝子は、ＡＬＳの常染色体優性形態の２０％を占める細胞質基質Ｃｕ／Ｚｎスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ−１）遺伝子として１９９３年に同定された（非特許文献２）。

前頭側頭認知症は、ＡＬＳと共通してＴＤＰ−４３およびＦＵＳなどの遺伝子の変異を含む病因病理学的な（etiopathological）遺伝的原因を共有する、ヒトの神経変性疾患である。さらに患者集団の一部は、前頭側頭認知症およびＡＬＳの両方に罹患している。したがってこれらの疾患は、１つの分子および臨床スペクトルで生じる。

リルゾールは、米国および日本でＡＬＳに対して承認されている唯一の薬物である。リルゾールは、元々、グルタミン酸放出を阻害する抗けいれん剤として開発されたものであり、いくつかの臨床試験では、ＡＬＳ患者の生存に対してごくわずかに有効性を呈することが報告されている（非特許文献３および非特許文献４）。

マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡとしても知られる）は、非コード低分子ＲＮＡファミリーの２０〜２４ヌクレオチド（ｎｔ）ＲＮＡ分子メンバーである。マイクロＲＮＡは、哺乳動物、虫、ショウジョウバエおよび植物において同定されており、組織および細胞型に特異的な方式でそれらの標的メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）転写物の安定性を調節すると考えられている。主に、マイクロＲＮＡは、標的ｍＲＮＡの３’−非翻訳領域（３’−ＵＴＲ）に結合し、それにより翻訳を抑制することによって、またはｓｉＲＮＡと同様に配列依存的に標的転写物に結合し、それを破壊することによって、ＲＮＡの安定性を調節する。

マイクロＲＮＡは、ＡＬＳ、脆弱Ｘ症候群、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、早期発症型パーキンソニズム（Ｗａｉｓｍａｎ症候群）およびＸ連鎖精神遅滞（ＭＲＸ３）などの様々な神経学的疾患に関与するとされている。

特許文献１は、ＡＬＳを含む運動ニューロン疾患（ＭＮＤ）を処置するための医薬の調製における、ｍｉＲＮＡ−９またはｍｉＲＮＡ−９^＊の活性または量を上方制御する薬剤を使用することを教示している。

特許文献２は、ＡＬＳを含むＭＮＤを処置するために１００を超えるｍｉＲＮＡを投与することを教示している。

特許文献３は、ＡＬＳを含むＭＮＤを処置するためにｍｉＲ−２０６および／またはｍｉＲ−１を投与することを教示している。

関連する追加の背景技術として、特許文献４が挙げられる。

興味深いことに、ＴＤＰ−４３およびＦＵＳなどのＲＮＡ結合タンパク質をコードする遺伝子の特異的変異^１、２は、ＡＬＳの病因に関連するとされている^３〜６。

非特許文献５は、ＲＮＡ代謝におけるＴＤＰ−４３およびＦＵＳ／ＴＬＳの役割を記載している。これらのタンパク質の誤った局在化は、一般的なｍｉＲＮＡ細胞集団および選択されたメンバーの両方に関して、ドローシャプロセシング酵素の機能を変えるおそれがある。

非特許文献６は、ＴＤＰ−４３が、選択されたｍｉＲＮＡレベルに影響を及ぼすことを示している。

非特許文献７は、細胞質ＴＤＰ−４３が、ダイサー複合体と相互作用し、末端ループと結合して、選択されたｍｉＲＮＡ集団のプロセシングを促進することを示している。

神経細胞の細胞質タンパク質凝集およびＲＮＡ代謝不全は、ＡＬＳ（および恐らく他の神経変性障害）に関与する共通の病原性機構であることが示唆された。さらに、多型ｍｉＲＮＡ媒介性の遺伝子調節は、特に、運動ニューロン疾患を含む神経変性の機序として示唆されている^７〜１０。さらに近年、ダイサー１の不活化によるｍｉＲＮＡバイオプロセシングの喪失は、脊髄運動ニューロン変性を引き起こすのに十分であることが証明された^１１。

関連背景技術
特許文献５は、細胞において対象となるポリヌクレオチドのサイレンシングをモジュレートする化合物を含む方法および組成物を開示している。かかる化合物は、適切なサイレンシング因子と組み合わせると、サイレンシング因子の標的ポリヌクレオチドのレベルをモジュレート（増大または低減）するために使用することができる。遺伝子発現のＲＮＡｉ媒介による抑制を伴う治療、ならびに、対象ポリヌクレオチドの発現のモジュレーションの標的化を可能とするインビトロ法の両方で、かかる組成物を使用する方法が提供されている。このような化合物およびサイレンシング因子を含む医薬用または化粧用組成物も開示されている。異種サイレンシング因子の活性をモジュレートする能力について対象となる化合物をスクリーニングする方法も提供されている。追加の背景関連技術：特許文献６。

国際公開第２０１０／０６４２４号 米国特許出願公開第２００６／０２４７１９３号明細書 米国特許出願公開第２００９／０２４６１３６号明細書 米国特許出願公開第２００８／０１７６７６６号明細書 米国特許出願公開第２０１２／００７１５３９号明細書 米国特許第６，７５６，３６９号明細書 米国特許出願公開第２００９／０３０６０３５号明細書 米国特許第４，６６６，８２８号明細書 米国特許第４，６８３，２０２号明細書 米国特許第４，８０１，５３１号明細書 米国特許第５，１９２，６５９号明細書 米国特許第５，２７２，０５７号明細書 米国特許第３，７９１，９３２号明細書 米国特許第３，８３９，１５３号明細書 米国特許第３，８５０，７５２号明細書 米国特許第３，８５０，５７８号明細書 米国特許第３，８５３，９８７号明細書 米国特許第３，８６７，５１７号明細書 米国特許第３，８７９，２６２号明細書 米国特許第３，９０１，６５４号明細書 米国特許第３，９３５，０７４号明細書 米国特許第３，９８４，５３３号明細書 米国特許第３，９９６，３４５号明細書 米国特許第４，０３４，０７４号明細書 米国特許第４，０９８，８７６号明細書 米国特許第４，８７９，２１９号明細書 米国特許第５，０１１，７７１号明細書 米国特許第５，２８１，５２１号明細書

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本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、運動ニューロン疾患（ＭＮＤ）の処置を必要としている対象の運動ニューロン疾患（ＭＮＤ）を処置する方法であって、対象にプレｍｉＲＮＡのプロセシングを増強することができる治療有効量の薬剤を投与し、それによって対象の運動ニューロン疾患（ＭＮＤ）を処置するステップを含む方法を提供する。

本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、運動ニューロン疾患（ＭＮＤ）の処置を必要としている対象の運動ニューロン疾患（ＭＮＤ）の処置に使用するための、プレｍｉＲＮＡのプロセシングを増強することができる薬剤を提供する。

本発明のいくつかの実施形態によれば、プレｍｉＲＮＡのプロセシングを増強することができる薬剤は、核プロセシングエンハンサー、核外輸送エンハンサーおよび細胞質プロセシングエンハンサーからなる群から選択される。

本発明のいくつかの実施形態によれば、細胞質プロセシングエンハンサーは、ダイサーエンハンサーを含む。

本発明のいくつかの実施形態によれば、ダイサーエンハンサーは、キノロンを含む。

本発明のいくつかの実施形態によれば、ダイサーエンハンサーは、エノキサシン、シプロフロキサシンおよびオフロキサシンからなる群から選択される。

本発明のいくつかの実施形態によれば、キノロンは、エノキサシンを含む。

本発明のいくつかの実施形態によれば、ＭＮＤは、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を含む。

本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の処置を必要としている対象のＡＬＳを処置する方法であって、プレｍｉＲＮＡのプロセシングを増強することができる治療有効量の薬剤および抗ＡＬＳ剤を対象に投与し、それによって対象のＡＬＳを処置するステップを含む方法を提供する。

本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の処置を必要としている対象のＡＬＳの処置に使用するための、プレｍｉＲＮＡのプロセシングを増強することができる薬剤および抗ＡＬＳ剤を提供する。

本発明のいくつかの実施形態によれば、抗ＡＬＳ剤は、リルゾールを含む。

本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、有効成分としてのプレｍｉＲＮＡのプロセシングを増強することができる薬剤、抗ＡＬＳ剤、および薬学的に許容される担体または希釈剤を含む医薬組成物を提供する。

本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、パッケージング材料にパッケージされ、パッケージング材料内または上にあるＡＬＳ処置における使用に関する印刷により識別される、プレｍｉＲＮＡのプロセシングを増強することができる薬剤および抗ＡＬＳ剤を含む製品を提供する。

本発明のいくつかの実施形態によれば、プレｍｉＲＮＡのプロセシングを増強することができる薬剤は、キノロンを含む。

本発明のいくつかの実施形態によれば、キノロンは、エノキサシンを含む。

本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、ＭＮＤを診断する方法であって、前記方法が、ＭＮＤの診断を必要としている対象の試料において、
（ｉ）全ｍｉＲの発現、および任意選択により
（ｉｉ）全プレｍｉＲの発現
を分析することを含み、
所定の閾値を超える（ｉ）または（ｉ）／（ｉｉ）の下方制御がＭＮＤの指標となる、方法を提供する。

本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、ＭＮＤを診断する方法であって、前記方法が、ＭＮＤの診断を必要としている対象の試料において、
（ｉ）ｍｉＲの発現、および
（ｉｉ）ｍｉＲの前駆体の発現
を分析するステップを含み、
所定の閾値を超える（ｉ）／（ｉｉ）の下方制御がＭＮＤの指標となる、方法を提供する。

本発明のいくつかの実施形態によれば、ｍｉＲは、ｍｉＲ−９である。

本発明のいくつかの実施形態によれば、ＭＮＤは、ＡＬＳ、原発性側索硬化症、進行性筋萎縮、仮性球麻痺、進行性球麻痺、下位運動ニューロン疾患および脊髄性筋萎縮症からなる群から選択される。

本発明のいくつかの実施形態によれば、運動ニューロン疾患は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を含む。

本発明のいくつかの実施形態によれば、ＡＬＳは、ＲＮＡ代謝不良に関連する変異を有する遺伝子に関連している。

本発明のいくつかの実施形態によれば、遺伝子は、ＴＤＰ−４３およびＦＵＳからなる群から選択される。

本発明のいくつかの実施形態によれば、ＡＬＳは、遺伝性ＡＬＳである。

本発明のいくつかの実施形態によれば、ＡＬＳは、孤発性ＡＬＳである。

本発明のいくつかの実施形態によれば、試料は、脳脊髄液（ＣＳＦ）試料または血液試料を含む。

本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、ＭＮＤを処置するための薬剤を同定する方法であって、
（ａ）ＡＬＳ患者またはＡＬＳモデルの運動ニューロンを、候補薬剤と接触させるステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）の前およびステップ（ａ）の後に、
（ｉ）運動ニューロンにおける全ｍｉＲの発現、および任意選択により
（ｉｉ）運動ニューロンにおける全プレｍｉＲの発現
を分析するステップとを含み、
ステップ（ａ）の前と比較してステップ（ａ）の後の、所定の閾値を超える（ｉ）または（ｉ）／（ｉｉ）の上方制御が、候補化合物がＭＮＤを処置するための治療剤であることの指標となる、方法を提供する。

別段定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および／または科学用語は、本発明が関与する分野の当業者に共通に理解されている意味と同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似のまたは等価な方法および材料は、本発明の実施形態の実施または試験に使用することができるが、例示的な方法および／または材料を以下に記載する。矛盾が生じた場合、定義を含む本明細書が優先する。さらに、材料、方法および実施例は、単に例示的なものであり、必ずしも制限することを企図されない。

特許または特許出願ファイルは、色付きで作成された少なくとも１つの図を含有する。色付き図面を伴うこの特許または特許出願刊行物の複写は、要求および必要な料金の支払いに応じて庁から提供される。

本発明のいくつかの実施形態を、添付の図を参照することによって本明細書に単なる例として記載する。ここで、特に図を詳細に参照するが、示されている詳細は例示的であり、本発明の実施形態を例示的に議論する目的のものであることを強調しておく。これに関して、図を伴ってなされる説明により、本発明の実施形態を実施し得る方法が当業者に明らかとなる。

ｍｉＲＮＡが孤発性ＡＬＳ患者の運動ニューロンにおいて全体的に低減することを示す図であって、非神経変性（対照）およびＡＬＳ運動ニューロン（患者）におけるｍｉＲ−９の代表的な蛍光性in situハイブリダイゼーション顕微鏡写真である。スケールバーは１０μＭを示す。 ｍｉＲＮＡが孤発性ＡＬＳ患者の運動ニューロンにおいて全体的に低減することを示す図であって、２人のＡＬＳ患者および２人の非ＡＬＳ対照から得た試料によりin situで実施した後の、３００の異なる運動ニューロンにおいて定量化したｍｉＲ−９の信号強度を示す棒グラフである。任意単位は、低分子ＲＮＡ Ｕ６の発現信号に対して正規化したものである。 ｍｉＲＮＡが孤発性ＡＬＳ患者の運動ニューロンにおいて全体的に低減することを示す図であって、２人のＡＬＳ患者および２人の非ＡＬＳ対照から得た試料によりin situで実施した後の、３００の異なる運動ニューロンにおいて定量化したｍｉＲ−１２４の信号強度を示す棒グラフである。任意単位は、低分子ＲＮＡ Ｕ６の発現信号に対して正規化したものである。 ＡＬＳを引き起こすＴＤＰ−４３またはＦＵＳ変異体の発現時のｍｉＲＮＡプロセシングの不良が、エノキサシンによって救済され得ることを示す図である。ＡＬＳを引き起こすＴＤＰ−４３Ａ３１５Ｔ（図２Ａ）、ＴＤＰ−４３^{Ｍ３３７Ｖ}（図２Ｂ）、ＦＵＳ^４９５Ｘ（図２Ｃ）、またはＦＵＳ^{Ｒ５２１Ｇ}（図２Ｄ）変異体のドキシサイクリン誘発性形態をＮＳＣ−３４細胞にトランスフェクトすることにより、成熟ｍｉＲＮＡが下方制御される一方、プレｍｉＲＮＡレベルは、それに応じて上方制御される。棒グラフ表示は、ＧＦＰをトランスフェクトし、ドキシサイクリンで処置した細胞における相対的なｍｉＲＮＡ発現レベルを、低分子ＲＮＡ Ｕ６または５Ｓの発現と比較してｌｏｇ_２尺度で示している。１００μＭエノキサシンを導入すると、ＡＬＳを引き起こす変異体：ＴＤＰ−４３^{Ａ３１５Ｔ}（図２Ｅ）またはＦＵＳ^４９５Ｘ（図２Ｆ）をトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞における成熟ｍｉＲＮＡの発現の下方制御が回復し、ＴＤＰ−４３^{Ａ３１５Ｔ}（図２Ｇ）またはＦＵＳ^４９５Ｘ（図２Ｈ）によるプレｍｉＲＮＡの上方制御が逆転する。データは、ＧＦＰをトランスフェクトし、ドキシサイクリンで処置した培養物におけるｍｉＲＮＡレベルに対して正規化し、低分子ＲＮＡ Ｕ６または５Ｓの発現に対して正規化したものである。プレｍｉＲＮＡ発現は、ベータアクチンに対して正規化した。両側スチューデントｔ試験を使用して、事後Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ−Ｈｏｃｈｂｅｒｇ補正を用いて統計を実施した。^＊ｐ値＜０．０５；^＊＊ｐ値＜０．００５。 ＡＬＳを引き起こすＴＤＰ−４３またはＦＵＳ変異体の発現時のｍｉＲＮＡプロセシングの不良が、エノキサシンによって救済され得ることを示す図である。ＦＵＳ４９５Ｘの影響を、プレｍｉＲＮＡおよび成熟ｍｉＲＮＡのディープシークエンシングによって全体的に研究すると、ダイサーの活性およびｍｉＲＮＡの成熟化が広範に抑止されることが明らかになった。 疾患の進行に対するエノキサシンの影響を示す図である。ＳＯＤ１ Ｇ９３Ａマウスの飲料水にエノキサシンを連続的に投与すると、全般的な生涯期間に対してはわずかな効果しかなかったが（図４Ａ）、神経学的スコア（図４Ｂ）、ハングワイヤー試験における全体強度、および（図４Ｄ）コンピューター化ｃａｔ−ｗａｌｋアッセイにおける全般的な運動機能に対して（図４Ｃ）、有益な影響を呈した。 ｍｉＲ−発現が、ＳＯＤ１変異体ＡＬＳの家族性形態において変化し、エノキサシンによってインビトロで正常化され得ることを示す図である。１００μＭエノキサシンを導入すると、ＡＬＳを引き起こす変異体：ＳＯＤ１^Ｇ９３Ａ（図５Ａ）をトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞における成熟ｍｉＲＮＡの発現の下方制御が回復し、Ｓｏｄ１^Ｇ９３Ａ（図５Ｂ）によるプレｍｉＲＮＡの上方制御が逆転する。データは、ＧＦＰをトランスフェクトし、ドキシサイクリンで処置した培養物におけるｍｉＲＮＡレベルに対して正規化し、低分子ＲＮＡ ５Ｓの発現に対して正規化したものである。プレｍｉＲＮＡ発現は、ベータアクチンに対して正規化した。両側スチューデントｔ試験を使用して、事後Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ−Ｈｏｃｈｂｅｒｇ補正を用いて統計を実施した。^＊ｐ値＜０．０５；^＊＊ｐ値＜０．００５。

本発明は、本発明のいくつかの実施形態において、運動ニューロン疾患を診断および処置する方法に関する。

本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明は、以下の説明に記載され、または実施例によって例示されている詳細にその適用を必ずしも制限されないことを理解されたい。本発明は、他の実施形態を含むことができ、または様々な方式で実施もしくは実行することができる。

筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）は、ヒトの運動系の神経変性疾患である。近年、ＡＬＳを引き起こす変異が、ＲＮＡ結合タンパク質をコードする遺伝子において発見され、ＲＮＡ代謝の調節異常（主にＡＬＳ対象のｍｉＲＮＡレベルの下方制御）に関連するとされた。

本発明者らは本発明を着想しながら、運動ニューロン疾患（ＭＮＤ）では一般的（非特異的）なマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の代謝が変化するので、この代謝変化の逆転は、このような疾患の処置の新規な治療様式として使用できると仮定した。

本発明者らは、マイクロＲＮＡがＡＬＳ運動ニューロンにおいて広範に下方制御される一方（図１Ａ〜Ｃおよび図２Ａ〜Ｄ）、それらの前駆体は高レベルで存在すること（図２Ａ〜Ｄおよび図３）を示すことによって、この仮定を確認した。さらに本発明者らは、ＲＮＡ結合タンパク質におけるＡＬＳを引き起こす変異が、マイクロＲＮＡ前駆体のダイシングを妨げること、およびこの活性が、ＡＬＳを引き起こす変異の遺伝的背景に応じてフルオロキノロン、エノキサシンによって修復されることを示し（ＴＤＰ−４３、ＦＵＳおよびＳＯＤ１、図２Ｅ〜Ｈおよび図５Ｃ〜Ｄ参照）、様々な疾患を引き起こす変異体の存在下で観測されたｍｉＲＮＡの調節異常の全体的性質を示唆した。さらに本発明者らは、ＡＬＳマウスモデルにおいて、神経学的スコア（図４ｂ）、ハングワイヤー試験（図４ｃ）および自動化ｃａｔ−ｗａｌｋ研究（図４ｄ）によってアッセイした場合、マウスの神経筋機能の悪化がエノキサシンによる処置で緩慢になったことを示した。したがって、マイクロＲＮＡの調節異常により、ＡＬＳ病変形成の新しい機構についての見識および治療上の潜在的手掛かりが得られる。さらに、ｍｉＲＮＡ発現プロファイルは、一般にＭＮＤ、特にＡＬＳの診断で使用することができる。

したがって本発明の一態様によれば、運動ニューロン疾患（ＭＮＤ）の処置を必要としている対象における運動ニューロン疾患（ＭＮＤ）を処置する方法であって、対象にプレｍｉＲＮＡのプロセシングを増強することができる治療有効量の薬剤を投与し、それによって対象の運動ニューロン疾患（ＭＮＤ）を処置するステップを含む方法を提供する。

本明細書で使用される場合、用語「処置する」は、状態の進行を阻止し、実質的に阻害し、緩徐し、もしくは逆転し、状態の臨床的もしくは審美的症状を実質的に寛解させ、または状態の臨床的もしくは審美的症状の出現を実質的に防止することを含む。

用語「運動ニューロン疾患（ＭＮＤ）」は、本明細書で使用される場合、運動ニューロンを選択的に破壊する神経学的障害を指す。したがって、ハンチントン舞踏病などの疾患は、ＭＮＤには分類されない。

本発明のさらなる一態様によれば、対象は、前頭側頭認知症に罹患している。

運動ニューロン疾患の例として、ルーゲーリッグ疾患としても知られる筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、原発性側索硬化症、進行性筋萎縮、仮性球麻痺、進行性球麻痺、下位運動ニューロン疾患および脊髄性筋萎縮症１（ＳＭＡ１、ウェルドニッヒ−ホフマン疾患）、脊髄性筋萎縮症タイプ２（ＳＭＡ２）および脊髄性筋萎縮症タイプ３（ＳＭＡ３、クーゲルベルク−ヴェランダー疾患）ならびにシャルコー−マリー−トゥース障害が挙げられるが、それらに限定されない。

具体的な一実施形態によれば、ＭＮＤは、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）である。

さらに具体的な実施形態によれば、対象は、ＲＮＡ代謝の変化が報告されているかまたは本発明の教示に従って決定され得るＭＮＤまたはＡＬＳに罹患している。ＲＮＡ代謝の変化に関連する変異の例として、ＴＤＰ−４３、ＦＵＳ、ＡＮＧおよびＳＥＴＸの変異が挙げられるが、それらに限定されない（Chen et al., 2004; Greenway et al., 2006; Kabashi et al., 2008; Sreedharan et al., 2008; Kwiatkowski et al., 2009; Lagier-Tourenne and Cleveland, 2009; Vance et al., 2009）。

本明細書で使用される場合、用語「対象」または「運動ニューロン疾患（ＭＮＤ）の処置を必要としている対象」は、ＭＮＤと診断された任意の性別または年齢の哺乳動物、例えばヒトを指す。疾患（例えばＡＬＳ）は、家族性（遺伝性）または孤発性であり得る。

さらなる一実施形態によれば、対象は、クラミジア感染症に罹患していない。

本明細書で使用される場合、「プレｍｉＲＮＡのプロセシングを増強することができる薬剤」は、ｍｉＲＮＡプロセシング経路の任意の一部を上方制御または活性化する分子または組成物を指す。典型的に、この薬剤は、プレｍｉＲＮＡ産生の下流経路を上方制御または活性化する。これは本発明者らが、ＡＬＳ派生細胞においてプレｍｉＲが正常に形成され、さらには上方制御されることを示したことに起因する。この薬剤は、「ＲＮＡｉエンハンサー」と呼ぶことができる。

以下は、ｍｉＲＮＡプロセシング経路のいくつかの非常に重要な構成成分であり、それらのそれぞれは、本発明の教示に従って上方制御または活性化することができる。

核プロセシング
単一のｐｒｉ−ｍｉＲＮＡは、１〜６種のｍｉＲＮＡ前駆体を含有し得る。これらのヘアピンループ構造は、それぞれ約７０のヌクレオチドから構成される。各ヘアピンは、効率的なプロセシングに必要な配列に隣接している。ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡにおけるヘアピンの二本鎖ＲＮＡ構造は、ＤｉＧｅｏｒｇｅ症候群に関連して命名されたＤｉＧｅｏｒｇｅ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｇｉｏｎ ８（ＤＧＣＲ８または無脊椎動物の「Ｐａｓｈａ」）として知られる核タンパク質によって認識される。ＤＧＣＲ８は、ＲＮＡを切断して「マイクロプロセッサ」複合体を形成するタンパク質である酵素ドローシャに関連している。この複合体において、ＤＧＣＲ８により、ドローシャの触媒ＲＮａｓｅ ＩＩＩドメインは、ヘアピン塩基から約１１ヌクレオチド離れたＲＮＡを切断することによってｐｒｉ−ｍｉＲＮＡからヘアピンを遊離するように方向付けられる（２つのらせん状ＲＮＡがステムに変わる）。得られた産物は、その３’末端に２つのヌクレオチドオーバーハングを有し、当該オーバーハングは、３’ヒドロキシル基および５’リン酸基を有している。これは、プレｍｉＲＮＡ（前駆体ｍｉＲＮＡ）と呼ばれることが多い。

核外輸送
プレｍｉＲＮＡヘアピンは、核細胞質間シャトルエクスポーチン−５を伴うプロセスで核から輸出される。カリオフェリンファミリーのメンバーであるこのタンパク質は、プレｍｉＲＮＡヘアピンの３’末端においてＲＮａｓｅ ＩＩＩ酵素ドローシャによって残された２つのヌクレオチドオーバーハングを認識する。細胞質へのエクスポーチン−５媒介性輸送は、エネルギー依存性であり、Ｒａｎタンパク質に結合したＧＴＰを使用する。

細胞質プロセシング
細胞質では、プレｍｉＲＮＡヘアピンは、ＲＮａｓｅ ＩＩＩ酵素ダイサーによって切断される。このエンドリボヌクレアーゼは、ヘアピンの３’末端と相互作用し、３’および５’アームをつなぐループを切り取り、長さ約２２のヌクレオチドの不完全なｍｉＲＮＡ：ｍｉＲＮＡ^＊二本鎖を生じる。全般的なヘアピンの長さおよびループの大きさは、ダイサープロセシング効率に影響を及ぼし、ｍｉＲＮＡ：ｍｉＲＮＡ^＊対合の不完全な性質も、切断に影響を及ぼす。二本鎖のいずれかの鎖は、機能的ｍｉＲＮＡとして潜在的に作用することができるが、通常は一方の鎖だけがＲＮＡ誘発型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に組み込まれ、そこでｍｉＲＮＡとそのｍＲＮＡ標的が相互作用する。

したがって本発明の実施形態によれば、プレｍｉＲＮＡのプロセシングを増強することができる薬剤は、核プロセシングエンハンサー、核外輸送エンハンサーおよび細胞質プロセシングエンハンサーからなる群から選択される。

本発明の具体的な実施形態によれば、薬剤は、ＭＮＤに罹患している対象（例えばＭＮＤを引き起こす変異を担持している細胞）の未処理試料におけるプレｍｉＲＮＡプロセシングと比較して、プレｍｉＲＮＡのプロセシングを、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％（例えば、５０％以上）またはそれを超えて上方制御する。

ｍｉＲＮＡプロセシングを評価する方法は、当技術分野で周知である。例えば、全ｍｉＲＮＡのレベルをプレｍｉＲＮＡと比較する分析を、ｍｉＲＮＡプロセシングの強力な指標として使用することができ、以下の実施例に例示する。

具体的な一実施形態によれば、薬剤は、核プロセシングエンハンサー、核外輸送エンハンサーおよび細胞質プロセシングエンハンサーからなる群から選択される。

さらなる一実施形態によれば、細胞質プロセシングエンハンサーは、ダイサーエンハンサーを含む（すなわち、ダイサーの働きを上方制御または活性化する）。

非特許文献８は、ＲＮＡｉ経路のモジュレーターを同定する方法を教示している。このような方法は、本発明の教示に沿って使用できるさらなる薬剤を同定するために実行することができる。

特許文献７は、ＲＮＡｉエンハンサーとしてのキノロンを教示しており、この特許文書はその全体が参照によって本明細書に援用される。

キノロン（またはキノロン）化合物は、広域抗生物質の一クラスを形成する。キノロンは、細菌のＤＮＡジャイレースおよび／またはトポイソメラーゼＩＶ酵素を阻害することによって作用すると考えられている。キノロンは、このようにしてＤＮＡ複製を阻害し、殺菌作用がある。したがってキノロンは、細菌の遺伝的複製を妨害することによって細菌細胞の複製を阻害するので、真の抗生物質ではなく化学剤とみなされる。代表的な非限定的なキノロン系抗生物質は、特許文献７の表１に提示されており、そのいくつかを以下に提示する。

キノロン系抗生物質に共通のファルマコフォアを、式（ａ）に提示する。
［式中、
Ｘ_１およびＸ_２は、それぞれ独立に、炭素または窒素であり、
Ｒ_１は、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルキルアミノ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アリール、および置換アリールからなる群から選択され、
Ｒ_２は、存在してもしなくてもよく、存在する場合、Ｈ、ハロ、アルキル、置換アルキル、およびアルコキシルからなる群から選択され、または
Ｒ_１およびＲ_２は、一緒になって、４〜６員の複素環構造の一部を形成し、ここで４〜６員の複素環構造は、炭素、窒素、酸素、硫黄、およびその組合せからなる群から選択される原子を含み、
Ｒ_３は、Ｈ、ハロ、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロヘテロアルキル、置換シクロヘテロアルキル、ヘテロアリール、および置換ヘテロアリールからなる群から選択され、
Ｒ_４は、ハロであり、
Ｒ_５は、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アミノ、アルコキシル、ヒドロキシル、およびハロからなる群から選択され、
Ｒ_６は、Ｈ、アルキル、および置換アルキルからなる群から選択され、
Ｒ_７は、存在してもしなくてもよく、存在する場合、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アミノ、アルコキシル、ヒドロキシル、およびハロからなる群から選択され、または
Ｒ_１およびＲ_７は、一緒になって、４〜６員の複素環構造の一部を形成し、ここで４〜６員の複素環構造は、炭素、窒素、酸素、硫黄、およびその組合せからなる群から選択される原子を含む］、または
薬学的もしくは化粧用として許容されるその塩。

いくつかの実施形態では、式（ａ）のキノロン化合物は、エノキサシン、シプロフロキサシン、およびオフロキサシンからなる群から選択され、それらの構造をスキームＩに提示する。

スキームＩ．エノキサシン、シプロフロキサシン、およびオフロキサシンの化学構造
エノキサシン、シプロフロキサシン、およびオフロキサシンは、一般に、「第２世代」キノロンに分類される。また第２世代キノロンとして、フレロキサシン、レボフロキサシン、ロメフロキサシン、ナジフロキサシン、ノルフロキサシン、ペフロキサシン、ルフロキサシン、およびトスフロキサシンが挙げられるが、それらに限定されない。これらの化学構造を、スキームＩＩに提示する。

スキームＩＩ．第２世代キノロンの化学構造

特許文献５は、ＲＮＡｉのさらなるエンハンサーを教示している。
（ａ）トリプロリジン、その誘導体および類似体（式ｂ）：
（ｂ）ジヒドロプテロキシリン、その誘導体および類似体（式ｃ）：
（ｃ）フシジン酸、その誘導体および類似体（式ｄ）：
（ｄ）フェンブフェン、その誘導体および類似体（式ｅ）：
（ｅ）３−ベータ−ヒドロキシデオキシオジヒドロデオキシゲデュニン（hydroxydeoxyodihydrodeoxygedunin）、その誘導体および類似体（式ｆ）：
（ｆ）デフェロキサミン、その誘導体および類似体（式ｇ）：
（ｇ）チオグアニン、その誘導体および類似体（式ｈ）：
（ｈ）２−アミノメチル−１，４−ベンゾジオキサン、その誘導体および類似体（式ｉ）：
（ｉ）３−アルファ−ヒドロキシ−３−デオキシアンゴレンス酸メチルエステル、その誘導体および類似体（式ｊ）：
（ｊ）ルナリン（lunarine）、その誘導体および類似体（式ｋ）：ならびに
（ｋ）ブロモクリプチン、その誘導体および類似体（式ｌ）：
［各ｎは、独立に、１〜２０の整数であり、
環式環構造の破線は、結合を表し、この結合は、環に存在してもしなくてもよく、
各Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７、Ｒ_８、Ｒ_９、およびＲ_１０は、独立に、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アリール、および置換アリールからなる群から選択され、
各Ｒ’_１、Ｒ’_２、およびＲ’_３は、独立に、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、ヒドロキシル、およびアルコキシルからなる群から選択され、
各Ｒ’’_１、Ｒ’’_２、およびＲ’’_３は、独立に、−−ＯＲ_１１および−−Ｏ（Ｃ．ｄｂｄ．Ｏ）−−Ｒ_１２からなる群から選択され、Ｒ_１１およびＲ_１２は、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アリール、および置換アリールからなる群から選択され、
各Ｘ_１、Ｘ_２、Ｘ_３、およびＸ_４は、独立に、ＣＨ_２、Ｏ、Ｓ、およびＮＲ’_４からなる群から選択され、Ｒ’_４は、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、ヒドロキシル、およびアルコキシルからなる群から選択され、
各Ｘ’_１、Ｘ’_２、およびＸ’_３は、独立に、ＮまたはＣＨであり、
各Ｘ’’は、独立に、ハロゲンである］、ならびに
薬学的および化粧用として許容されるその塩。

いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉエンハンサーは、トリプロリジン、ジヒドロプテロキシリン、フシジン酸、フェンブフェン、３−ベータ−ヒドロキシデオキソジヒドロデオキシゲデュニン（hydroxydeoxodihydrodeoxygedunin）、デフェロキサミン、チオグアニン、２−アミノメチル−１，４−ベンゾジオキサン、３−アルファ−ヒドロキシ−３−デオキシアンゴレンス酸メチルエステル、ルナリン、ブロモクリプチン、ならびに薬学的および化粧用として許容されるその塩からなる群から選択される。

具体的な一実施形態によれば、ＲＮＡｉエンハンサーは、エノキサシンである。

エノキサシンは、以下の商標Ａｌｍｉｔｉｌ、Ｂａｃｔｉｄａｎ、Ｂａｃｔｉｄｒｏｎ、Ｃｏｍｐｒｅｃｉｎ、Ｅｎｏｋｓｅｔｉｎ、Ｅｎｏｘｅｎ、Ｅｎｒｏｘｉｌ、Ｅｎｏｘｉｎ、Ｅｎｏｘｏｒ、Ｆｌｕｍａｒｋ、Ｐｅｎｅｔｒｅｘ、Ｇｙｒａｍｉｄ、Ｖｉｎｏｎｅで販売されている。化合物は、尿路感染症および淋病の処置に使用される経口用の広範なフルオロキノロン抗菌剤である。

以下の用語は、当業者に十分に理解されていると思われるが、本開示の主題の説明を容易にするために、以下の定義を記載する。

用語「独立に選択される」が使用される場合、言及される置換基（例えばＲ基、例えば基Ｒ_１、Ｒ_２等、または基Ｘ_１およびＸ_２）は、同じでも異なっていてもよい。例えば、Ｒ_１およびＲ_２の両方は、置換アルキルであってもよく、またはＲ_１は水素であってもよく、Ｒ_２は置換アルキル等であってもよい。

命名された「Ｒ」または「Ｘ」基は、一般に、本明細書で別段特定されない限り、その名称を有する基に対応するものとして当技術分野で認識されている構造を有する。前述の特定の代表的な「Ｒ」および「Ｘ」基を、例示目的で以下に定義する。これらの定義は、本開示に照らして当業者に明らかになるはずである定義を排除することなく補足し、例示するためのものである。

本明細書で使用される場合、用語「アルキル」は、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル、オクチル、エテニル、プロペニル、ブテニル、ペンテニル、ヘキセニル、オクテニル、ブタジエニル、プロピニル、ブチニル、ペンチニル、ヘキシニル、ヘプチニル、およびアルケニル基を含む、両端を含みＣ１〜２０の線形（すなわち「直鎖」）、分岐、または環式の飽和の、少なくとも部分的に不飽和の、およびある場合には完全に不飽和の（すなわち、アルケニルおよびアルキニル）炭化水素鎖を指す。「分岐」は、メチル、エチルまたはプロピルなどの低級アルキル基が、線形アルキル鎖に付着しているアルキル基を指す。「低級アルキル」は、１〜約８個の炭素原子を有するアルキル基（すなわちＣ１〜８アルキル）、例えば１、２、３、４、５、６、７または８個の炭素原子を有するアルキル基を指す。「高級アルキル」は、約１０〜約２０個の炭素原子、例えば１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９個または炭素原子を有するアルキル基を指す。特定の実施形態では、「アルキル」は、特にＣ_１〜８直鎖アルキルを指す。他の実施形態では、「アルキル」は、特にＣ_１〜８分岐鎖アルキルを指す。

アルキル基は、同じでも異なっていてもよい１つまたは複数のアルキル基置換基で任意選択により置換されていてもよい（「置換アルキル」）。用語「アルキル基置換基」として、アルキル、置換アルキル、ハロ、アリールアミノ、アシル、ヒドロキシル、アリールオキシル、アルコキシル、アルキルチオ、アリールチオ、アラルキルオキシ、アラルキルチオ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、オキソ、およびシクロアルキルが挙げられるが、それらに限定されない。任意選択により、アルキル鎖に沿って１つまたは複数の酸素、硫黄、または置換もしくは非置換窒素原子が挿入されていてもよく、ここで窒素置換基は、水素、低級アルキル（本明細書では「アルキルアミノアルキル」とも呼ばれる）、またはアリールである。

したがって、本明細書で使用される場合、用語「置換アルキル」には、アルキル基の１つまたは複数の原子または官能基が、例えばアルキル、置換アルキル、ハロゲン、アリール、置換アリール、アルコキシル、ヒドロキシル、ニトロ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、サルファート、およびメルカプトを含む別の原子または官能基で置き換えられている、本明細書で定義のアルキル基が含まれる。

「環式」および「シクロアルキル」は、約３〜約１０個の炭素原子、例えば３、４、５、６、７、８、９、または１０個の炭素原子の非芳香族の単環式または多環式環系を指す。シクロアルキル基は、任意選択により部分的に不飽和であってもよい。シクロアルキル基は、本明細書で定義のアリル基置換基、オキソおよび／またはアルキレンで任意選択により置換されていてもよい。任意選択により、環式アルキル鎖に沿って１つまたは複数の酸素、硫黄、または置換もしくは非置換窒素原子が挿入されていてもよく、ここで窒素置換基は、水素、アルキル、置換アルキル、アリール、または置換アリールであり、したがって複素環式基をもたらす。代表的な単環式シクロアルキル環として、シクロペンチル、シクロヘキシル、およびシクロヘプチルが挙げられる。多環式シクロアルキル環として、アダマンチル、オクタヒドロナフチル、デカリン、カンファー、カンファン、およびノルアダマンチルが挙げられる。

用語「シクロアルキルアルキル」は、本明細書で使用される場合、やはり先に定義のアルキル基を介して親分子部分に付着している、本明細書に定義のシクロアルキル基を指す。シクロアルキルアルキル基の例として、シクロプロピルメチルおよびシクロペンチルエチルが挙げられる。

用語「シクロヘテロアルキル」または「ヘテロシクロアルキル」は、同じでも異なっていてもよくＮ、Ｏ、およびＳからなる群から選択される１つまたは複数のヘテロ原子を含む、３〜７員の置換または非置換シクロアルキル環系などの非芳香族環系を指し、任意選択により１つまたは複数の二重結合を含むことができる。シクロヘテロアルキル環は、任意選択により他のシクロヘテロアルキル環および／または非芳香族炭化水素環に縮合していてもよく、またはその他の方式で付着していてもよい。代表的なシクロヘテロアルキル環系として、ピロリジニル、ピロリニル、イミダゾリジニル、イミダゾリニル、ピラゾリジニル、ピラゾリニル、ピペリジル、ピペラジニル、インドリニル、キヌクリジニル、モルホリニル、チオモルホリニル、チアジアジナニル、テトラヒドロフラニル等が挙げられるが、それらに限定されない。

用語「アルケニル」は、本明細書で使用される場合、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を含有する、設計された数の炭素原子の直鎖または分岐炭化水素を指す。「アルケニル」の例として、ビニル、アリル、２−メチル−３−ヘプテン等が挙げられる。

用語「シクロアルケニル」は、本明細書で使用される場合、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を含有する環式炭化水素を指す。シクロアルケニル基の例として、シクロプロペニル、シクロブテニル、シクロペンテニル、シクロペンタジエン、シクロヘキセニル、１，３−シクロヘキサジエン、シクロヘプテニル、シクロヘプタトリエニル、およびシクロオクテニルが挙げられる。

用語「アルキニル」は、本明細書で使用される場合、少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を含有する、設計された数の炭素原子の直鎖または分岐炭化水素を指す。「アルキニル」の例として、プロパルギル、プロピン、および３−ヘキシンが挙げられる。

「アルキレン」は、１〜約２０個の炭素原子、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０個の炭素原子を有する直鎖または分岐の二価の脂肪族炭化水素基を指す。アルキレン基は、直鎖、分岐または環式であってもよい。またアルキレン基は、任意選択により不飽和であってもよく、かつ／または１つもしくは複数の「アルキル基置換基」で置換されていてもよい。任意選択により、アルキレン基に沿って１つまたは複数の酸素、硫黄、または置換もしくは非置換窒素原子が挿入されていてもよく（本明細書では「アルキルアミノアルキル」とも呼ばれる）、ここで窒素置換基は、前述のアルキルである。

アルキレン基は、約２〜約３個の炭素原子を有することができ、さらに６〜２０個の炭素を有することができる。

用語「アリール」は、本明細書では、単一の芳香族環または複数の芳香族環であり得る芳香族置換基を指すために使用され、この複数の芳香族環は、一緒になって縮合しており、共有結合によって連結しており、または限定されるものではないがメチレンもしくはエチレン部分などの共通の基に連結している。また共通の連結基は、ベンゾフェノンにあるようなカルボニルであってもよく、またはジフェニルエーテルにあるような酸素であってもよく、またはジフェニルアミンにあるような窒素であってもよい。用語「アリール」は、特に複素環式芳香族化合物を包含する。芳香族環は、中でもフェニル、ナフチル、ビフェニル、ジフェニルエーテル、ジフェニルアミンおよびベンゾフェノンを含むことができる。特定の実施形態では、用語「アリール」は、約５〜約１０個の炭素原子、例えば５、６、７、８、９または１０個の炭素原子を含み、５員および６員の炭化水素および複素環式芳香族環を含む環式芳香族を意味する。

アリール基は、同じでも異なっていてもよい１つまたは複数のアリール基置換基で任意選択により置換されていてもよく（「置換アリール」）、ここで「アリール基置換基」として、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アラルキル、ヒドロキシル、アルコキシル、アリールオキシル、アラルキルオキシル、カルボキシル、アシル、ハロ、ニトロ、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、アラルコキシカルボニル、アシルオキシル、アシルアミノ、アロイルアミノ、カルバモイル、アルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、アリールチオ、アルキルチオ、アルキレン、および−−ＮＲ’Ｒ’’（式中、Ｒ’およびＲ’’は、それぞれ独立に、水素、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、およびアラルキルであってもよい）が挙げられる。

したがって、本明細書で使用される場合、用語「置換アリール」は、アリール基の１つまたは複数の原子または官能基が、例えば、アルキル、置換アルキル、ハロゲン、アリール、置換アリール、アルコキシル、ヒドロキシル、ニトロ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、サルファート、およびメルカプトを含む別の原子または官能基で置き換えられている、本明細書で定義のアリール基を含む。

アリール基の具体例として、シクロペンタジエニル、フェニル、フラン、チオフェン、ピロール、ピラン、ピリジン、イミダゾール、ベンズイミダゾール、イソチアゾール、イソオキサゾール、ピラゾール、ピラジン、トリアジン、ピリミジン、キノリン、イソキノリン、インドール、カルバゾール等が挙げられるが、それらに限定されない。

用語「ヘテロアリール」は、同じでも異なっていてもよくＮ、ＯおよびＳからなる群から選択される１つまたは複数のヘテロ原子を含む、限定されるものではないが５員または６員環系などの芳香族環系を指す。ヘテロアリール環は、１つまたは複数のヘテロアリール環、芳香族もしくは非芳香族炭化水素環、またはヘテロシクロアルキル環に縮合していてもよく、またはその他の方式で付着していてもよい。代表的なヘテロアリール環系として、ピリジル、ピリミジル、ピロリル、ピラゾリル、アゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、オキサジアゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、イミダゾリル、フラニル、チエニル、キノリニル、イソキノリニル、インドリニル、インドリル、ベンゾチエニル、ベンゾチアゾリル、エンゾフラニル、ベンズイミダゾリル、ベンズイソキサゾリル、ベンゾピラゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル等が挙げられるが、それらに限定されない。

環構造が芳香族または非芳香族であってもよい、一般に次式によって表される構造
は、本明細書で使用される場合、置換基Ｒ基（Ｒ基は、存在してもしなくてもよく、存在する場合、１つまたは複数のＲ基は、環構造の１つまたは複数の利用可能な炭素原子上でそれぞれ置換されていてもよい）を含む、本明細書に定義の飽和環構造、部分的に飽和の環構造、および不飽和環構造を含む環構造、例えば限定されるものではないが、３個の炭素、４個の炭素、５個の炭素、６個の炭素等の脂肪族および／または芳香族環式化合物を指す。Ｒ基が存在するかしないか、およびＲ基の数は、整数ｎの値によって決定される。各Ｒ基は、２つ以上存在する場合、もう１つのＲ基上ではなく環構造の利用可能な炭素上で置換されている。例えば、ｎが０〜２である先の構造は、
等を含む化合物基を含むことができるが、それらに限定されない。

環式環構造において結合を表す破線は、その結合が環中に存在してもしなくてもよいことを示す。すなわち、環式環構造において結合を表す破線は、その環構造が、飽和環構造、部分的に飽和の環構造、および不飽和環構造からなる群から選択されることを示す。

芳香族環または複素環式芳香族環の命名された原子が、「存在しない」と定義される場合、命名された原子は、直接結合によって置き換えられている。

本明細書で使用される場合、用語「アシル」は、カルボキシル基の−−ＯＨが別の置換基で置き換えられている有機酸基を指す（すなわち、ＲＣＯ−−によって表され、Ｒは、本明細書で定義のアルキルまたはアリール基である）。したがって、用語「アシル」は、特にアリールアシル基、例えばアセチルフランおよびフェナシル基を含む。アシル基の具体例として、アセチルおよびベンゾイルが挙げられる。

「アルコキシル」は、アルキルが前述の通りであるアルキル−Ｏ−−基を指す。用語「アルコキシル」は、本明細書で使用される場合、例えば、メトキシル、エトキシル、プロポキシル、イソプロポキシル、ブトキシル、ｔ−ブトキシル、およびペントキシルを含む、両端を含みＣ_１〜２０の線形、分岐、または環式の飽和または不飽和のオキソ炭化水素鎖を指すことができる。

用語「アルコキシアルキル」は、本明細書で使用される場合、アルキル−Ｏ−アルキルエーテル、例えばメトキシエチルまたはエトキシメチル基を指す。

「アリールオキシル」は、アリール基が、置換アリールを含めて前述の通りであるアリール−Ｏ−−基を指す。用語「アリールオキシル」は、本明細書で使用される場合、フェニルオキシルもしくはヘキシルオキシル、およびアルキル、置換アルキル、ハロ、またはアルコキシル置換フェニルオキシルもしくはヘキシルオキシルを指すことができる。

用語「アルキル−チオ−アルキル」は、本明細書で使用される場合、アルキル−５−アルキルチオエーテル、例えばメチルチオメチルまたはメチルチオエチル基を指す。

「アラルキル」は、アリールおよびアルキルが、置換アリールおよび置換アルキルを含めて前述の通りであるアリール−アルキル基を指す。例示的なアラルキル基として、ベンジル、フェニルエチル、およびナフチルメチルが挙げられる。

「アラルキルオキシル」は、アラルキル基が前述の通りであるアラルキル−Ｏ−−基を指す。例示的なアラルキルオキシル基は、ベンジルオキシルである。

「アルコキシカルボニル」は、アルキル−Ｏ−−ＣＯ−−基を指す。例示的なアルコキシカルボニル基として、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、ブチルオキシカルボニル、およびｔ−ブチルオキシカルボニルが挙げられる。「アリールオキシカルボニル」は、アリール−Ｏ−−ＣＯ−−基を指す。例示的なアリールオキシカルボニル基として、フェノキシ−およびナフトキシ−カルボニルが挙げられる。「アラルコキシカルボニル」は、アラルキル−Ｏ−−ＣＯ−−基を指す。例示的なアラルコキシカルボニル基は、ベンジルオキシカルボニルである。

「カルバモイル」は、Ｈ_２Ｎ−−ＣＯ−−基を指す。「アルキルカルバモイル」は、ＲおよびＲ’の一方が水素であり、ＲおよびＲ’の他方が、前述のアルキルおよび／または置換アルキルであるＲ’ＲＮ−−ＣＯ−−基を指す。「ジアルキルカルバモイル」は、ＲおよびＲ’のそれぞれが、独立に、前述のアルキルおよび／または置換アリルである、Ｒ’ＲＮ−−ＣＯ−−基を指す。

「アシルオキシル」は、アシルが前述の通りであるアシル−Ｏ−−基を指す。

用語「アミノ」は、−−ＮＨ２基を指し、また有機ラジカルによって１つまたは複数の水素ラジカルが置き換えられることによってアンモニアから誘導された、当技術分野で周知の窒素含有基を指す。例えば、用語「アシルアミノ」および「アルキルアミノ」は、それぞれアシル置換基およびアルキル置換基を有する特定のＮ置換有機ラジカルを指す。

用語「アルキルアミノ」は、Ｒが前述のアルキル基および／または置換アルキル基である−−ＮＨＲ基を指す。例示的なアルキルアミノ基として、メチルアミノ、エチルアミノ等が挙げられる。

「ジアルキルアミノ」は、ＲおよびＲ’のそれぞれが、独立に、前述のアルキル基および／または置換アルキル基である−−ＮＲＲ’基を指す。例示的なジアルキルアミノ基として、エチルメチルアミノ、ジメチルアミノ、およびジエチルアミノが挙げられる。

「アシルアミノ」は、アシルが前述の通りであるアシル−ＮＨ−−基を指す。「アロイルアミノ」は、アロイルが前述の通りであるアロイル−ＮＨ−−基を指す。

用語「カルボニル」は、−−（Ｃ＝Ｏ）−−基を指す。

用語「カルボキシル」は、−−ＣＯＯＨ基を指す。

用語「ハロ」、「ハロゲン化物」または「ハロゲン」は、本明細書で使用される場合、フルオロ、クロロ、ブロモおよびヨード基を指す。

用語「ヒドロキシル」は、−−ＯＨ基を指す。

用語「ヒドロキシアルキル」は、−−ＯＨ基で置換されているアルキル基を指す。

用語「メルカプト」は、−−ＳＨ基を指す。

用語「オキソ」は、炭素原子が酸素原子によって置き換えられている、本明細書で既に説明した化合物を指す。

用語「ニトロ」は、−−ＮＯ_２基を指す。

用語「チオ」は、炭素または酸素原子が硫黄原子によって置き換えられている、本明細書で既に説明した化合物を指す。

用語「サルファート」は、−−ＳＯ_４基を指す。

いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉエンハンサーは、プレｍｉＲＮＡのプロセシングに関与するタンパク質を含む。

いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉエンハンサーは、タンパク質ダイサー（例えばダイサー１）を含む。

いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉエンハンサーは、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）結合タンパク質、例えばＰＫＲのタンパク質活性化因子（ＰＡＣＴ）および／もしくはトランス活性化応答ＲＮＡ結合タンパク質（ＴＲＢＰ）、またはアルゴノート（Ａｇｏ）タンパク質ファミリーのメンバー、またはそれらの機能亢進性変異体型を含む。

いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉエンハンサーは、ポリ（Ｃ）−結合タンパク質を含む［例えば、非特許文献９によって教示されているポリ（Ｃ）−結合タンパク質２］。

具体的な一実施形態によれば、ＲＮＡｉエンハンサーは、前述のタンパク質のいずれかの過剰発現を含む。

前述の通り、本発明の方法は、ＡＬＳを処置するために使用することができる。

一実施形態によれば、該方法は、対象にプレｍｉＲＮＡのプロセシングを増強することができる治療有効量の薬剤および抗ＡＬＳ剤を投与し、それによって対象のＡＬＳを処置するステップを含む。

ＡＬＳ疾患の進行を軽減、処置または緩徐することができる任意の抗ＡＬＳ剤は、本発明の教示に従って使用することができる。

本発明の教示に従って使用できる例示的な抗ＡＬＳ剤は、リルゾール（例えばＲｉｌｕｔｅｋ（登録商標））である。

具体的な一実施形態によれば、該方法は、対象にキノロン（例えば、エノキサシン）および抗ＡＬＳ剤（例えば、リルゾール）を投与するステップを含む。

２つ以上の薬剤が対象に投与される場合、それらの薬剤は、同時にまたは別々の時間に（例えば互いに数分、数時間、数日、数週または数カ月以内に）投与できることを理解されよう。

本発明のいくつかの実施形態の薬剤は、それ自体で、またはそれが適切な担体もしくは賦形剤と混合された医薬組成物により、対象に投与することができる。

本明細書で使用される場合、「医薬組成物」は、本明細書に記載の有効成分の１つまたは複数と、生理的に適切な担体および賦形剤などの他の化学的構成成分の調製物を指す。医薬組成物の目的は、生物への化合物の投与を容易にすることである。

本明細書では、用語「有効成分」は、生物学的効果に寄与する薬剤を指す。

以下、用語「生理的に許容される担体」および「薬学的に許容される担体」は、交換可能に使用することができ、生物に著しい刺激作用を生じず、投与された化合物の生物学的活性および特性を阻止しない担体または希釈剤を指す。アジュバントは、これらの用語に含まれる。

本明細書では、用語「賦形剤」は、有効成分の投与をさらに容易にするために医薬組成物に添加される不活性な物質を指す。賦形剤の例として、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖、ならびに様々なタイプのデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油およびポリエチレングリコールが挙げられるが、それらに限定されない。

薬物の製剤化および投与の技術は、参照によって本明細書に援用される非特許文献１０に見出され得る。

適切な投与経路として、例えば経口、直腸、経粘膜、特に経鼻、腸管、または筋肉内、皮下および髄内注射を含む非経口送達、ならびに髄腔内、直接脳室内、心臓内、例えば右もしくは左室内腔内、総冠動脈、静脈内、腹腔内、鼻腔内、または眼内注射を挙げることができる。

中枢神経系（ＣＮＳ）への従来の薬物送達手法として、神経外科的戦略（例えば、脳内注射または脳室内注入）；ＢＢＢの内因性輸送経路の１つを活用するための、薬剤の分子操作（例えば、内皮細胞表面分子に対して親和性を有する輸送ペプチドを、それ自体ＢＢＢを通過することができない薬剤を組み合わせて含むキメラ融合タンパク質の生成）；薬剤の脂溶性を増大するように設計された薬理学的戦略（例えば、水溶性薬剤と脂質またはコレステロール担体とのコンジュゲーション）；および高浸透圧性撹乱によるＢＢＢの完全性の一過性撹乱（頸動脈へのマンニトール溶液の注入またはアンギオテンシンペプチドなどの生物学的活性剤の使用から生じる）が挙げられる。しかし、これらの戦略のそれぞれには、侵襲的な外科手技に関連する固有の危険性、内因性輸送系に固有の制限によって課せられるサイズの制限、ＣＮＳの外側で活性になり得る担体モチーフから構成されたキメラ分子の全身投与に関連する潜在的に望ましくない生物学的副作用、およびＢＢＢが撹乱される、脳領域内で生じる可能性がある脳損傷の危険性などの制限があり、それによって、各戦略は最適以下の送達方法になってしまう。

特に、エノキサシンなどの小分子は、さらなる化学修飾なしに血液脳関門を通過できることが知られている。

あるいは、例えば医薬組成物を患者の組織領域（例えば、脳または脊髄）に直接注射することによって、全身的ではなく局所的に医薬組成物を投与することもできる。

本発明のいくつかの実施形態の医薬組成物は、当技術分野で周知のプロセスによって、例えば従来の混合、溶解、造粒、糖衣錠製造、研和（levigating）、乳化、被包、封入または凍結乾燥プロセスを用いることによって製造することができる。

医薬組成物は、長期間（例えば、経口で長期間）使用することができる。

あるいは、医薬組成物は、急性期治療用とすることができる。

したがって、本発明のいくつかの実施形態に従って使用される医薬組成物は、有効成分を薬学的に使用できる調製物に処理するのを容易にする賦形剤および助剤を含む１つまたは複数の生理的に許容される担体を使用して、従来の方式で製剤化することができる。適切な製剤は、選択された投与経路に応じて変わる。

注射では、医薬組成物の有効成分は、水溶液、好ましくは生理的に適合性のある緩衝液、例えばハンクス溶液、リンゲル溶液、または生理食塩水緩衝液で製剤化することができる。経粘膜投与では、障壁を透過させるのに適した浸透剤が、製剤に使用される。このような浸透剤は、当技術分野で一般に周知である。

経口投与では、医薬組成物は、活性な化合物を、当技術分野で周知の薬学的に許容される担体と組み合わせることによって容易に製剤化することができる。このような担体によって、医薬組成物を、患者の経口摂取のために、錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液等として製剤化することができる。経口で使用するための薬理学的調製物は、固体賦形剤を使用し、任意選択により得られた混合物を粉砕し、所望に応じて適切な助剤を添加した後に顆粒の混合物を処理して、錠剤または糖衣錠コアを得ることによって製造することができる。適切な賦形剤は、特に充填剤、例えばラクトース、スクロース、マンニトールもしくはソルビトールを含む糖；セルロース調製物、例えばトウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、バレイショデンプン、ゼラチン、トラガカントガム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボメチルセルロースナトリウムなど；および／または生理的に許容されるポリマー、例えばポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）である。所望に応じて、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸もしくはその塩、例えばアルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤を添加することができる。

糖衣錠コアには、適切なコーティングが施される。この目的では、任意選択により、アラビアガム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、二酸化チタン、ラッカー溶液および適切な有機溶媒、または溶媒混合物を含有し得る濃縮糖液を使用することができる。活性化合物の用量の異なる組合せを識別し、または特徴付けるために、染料または顔料を錠剤または糖衣錠コーティングに添加することができる。

経口で使用できる医薬組成物は、ゼラチン製の押込み型（push-fit）カプセル、ならびにゼラチンおよびグリセロールまたはソルビトールなどの可塑剤製の軟質封止カプセルを含む。押込み型カプセルは、有効成分を、充填剤、例えばラクトース、結合剤、例えばデンプン、滑沢剤、例えばタルクまたはステアリン酸マグネシウム、および任意選択により安定剤との混合物として含有することができる。軟質カプセルでは、有効成分は、適切な液体、例えば脂肪油、流動パラフィンまたは液体ポリエチレングリコールに溶解または懸濁させることができる。さらに、安定剤を添加することができる。経口投与用のすべての製剤は、選択された投与経路に適した投与量にすべきである。

口腔内頬側投与では、組成物は、従来の方式で製剤化された錠剤またはロゼンジ剤の形態をとることができる。

経鼻吸入による投与では、本発明のいくつかの実施形態に従って使用するための有効成分は、好都合には加圧パックまたはネブライザーからエアロゾルスプレー形態で、適切な噴霧剤、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロ−テトラフルオロエタンまたは二酸化炭素を使用して送達される。加圧エアロゾルの場合、投与量単位は、定量を送達するための弁を提供することによって決定することができる。例えばディスペンサーで使用するためのゼラチン製のカプセルおよびカートリッジに、化合物と、ラクトースまたはデンプンなどの適切な粉末ベースの粉末ミックスを入れて製剤化することができる。

本明細書に記載の医薬組成物は、例えばボーラス注射または持続注入による非経口投与用に製剤化することができる。注射用製剤は、任意で添加保存剤を添加した、アンプル等の単位剤形または多回用量容器として提供することができる。組成物は、油性または水性ビヒクル中懸濁液、溶液または乳濁液であってもよく、懸濁化剤、安定化剤および／または分散化剤などの製剤用薬剤を含有することができる。

非経口投与のための医薬組成物は、水溶性形態の活性調製物の水溶液を含む。さらに、有効成分の懸濁液は、適宜、油または水ベースの注射懸濁液として調製することができる。適切な親油性の溶媒またはビヒクルとして、脂肪油、例えばゴマ油、または合成脂肪酸エステル、例えばオレイン酸エチル、トリグリセリドもしくはリポソームが挙げられる。水性注射懸濁液は、懸濁液の粘度を増大する物質、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールまたはデキストランを含有することができる。任意で、懸濁液は、有効成分の可溶性を増大して、非常に濃縮された溶液を調製することができる適切な安定剤または薬剤を含有することもできる。

あるいは有効成分は、適切なビヒクル、例えば発熱物質を含まない無菌の水ベースの溶液を用いて使用前に構成するために、粉末形態であってもよい。

本発明のいくつかの実施形態の医薬組成物は、例えば従来の坐剤基剤、例えばカカオバターまたは他のグリセリドを使用して、直腸用組成物、例えば坐剤または停留浣腸として製剤化することもできる。

本発明のいくつかの実施形態の文脈で使用するのに適した医薬組成物は、有効成分が所期の目的を達成するのに有効な量で含有されている組成物を含む。より具体的には、治療有効量は、障害（例えばＭＮＤ、例えばＡＬＳ）の症状を防止、軽減もしくは寛解させ、または処置を受ける対象の生存を延長するのに有効な有効成分（薬剤）の量を意味する。

治療有効量の決定は、特に本明細書に提示の詳細な開示に照らして、当業者によって十分に行われる。

本発明の方法で使用される任意の調製物では、治療有効量または用量は、最初にインビトロおよび細胞培養アッセイから推定され得る。例えば、用量は、所望の濃度または滴定量を達成するために、動物モデルで策定することができる。このような情報を使用して、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定することができる。

筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の動物モデルによって、この治癒不能の致命的なヒトの疾患を、臨床的にも病理学的にも研究する絶好の機会が得られる。それにもかかわらず、死後のＡＬＳ組織は、依然として「至適標準」であり、それと動物モデルにおける病理学的な知見を比較しなければならない。３種のマウスモデル：運動ニューロン変性（Ｍｎｄ）、進行性運動神経細胞障害（ｐｍｎ）、ｗｏｂｂｌｅｒ、および１種のイヌモデル：遺伝性イヌ脊髄性筋萎縮症（ＨＣＳＭＡ）を含む４種の天然の疾患モデルが、最も広範に研究されている。ｗｏｂｂｌｅｒマウスは、臨床的、病理学的（核周部、軸索、筋肉）、および生化学的特徴の分析により、これらのモデルの中で最も広範に研究されている。実験的に誘発したＡＬＳの動物モデルにより、様々な神経毒性、ウイルスおよび免疫媒介の機構についての試験を調節できるようになってきた。近年、分子技術により、ヒトの疾患または運動ニューロン生物学に関連する遺伝子が操作されたマウスモデルが作り出されている。ＦＡＬＳ患者の変異ＳＯＤ１遺伝子を過剰発現する遺伝子導入マウスにより、この疾患の運動ニューロン変性機構について意義深い見識が得られる（非特許文献１１によって総説されている）。

このことには、変異体ＴＤＰ−４３を有する新しい遺伝子導入マウスモデルが、ヒト孤発性筋萎縮性側索硬化症に類似しているらしいことが具体的に関連しており、これにより、非特許文献１２に記載されている標的治療に関する研究の新しい機会が開拓される。

具体的な一実施形態によれば、マウスモデルは、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．から得たＡ３１５Ｔ停止マウスモデルである（非特許文献１３）。

別の例示的なマウスモデルは、ヒトＳＯＤ１のＧ９３Ａ変異体形態を発現する、遺伝子導入ＳＯＤ１（スーパーオキシドジスムターゼ１）マウスである（以下の実施例部分に記載されている）。ＳＯＤ１マウス（ＴｇＮ−ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ−１Ｇｕｒ）は、ヒトの筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）に類似の表現型を呈する（非特許文献１４）。

マウスへの投与量は、１０〜１０００ｍｇ／ｋｇ／日、１０〜５００ｍｇ／ｋｇ／日、５０〜２００ｍｇ／ｋｇ／日、５０〜１００ｍｇ／ｋｇ／日で変わる。この用量は、ＦＤＡ変換表を用いることによって、ヒトに使用するために有効に変換することができる。

１日当たり飲料水による経口中間用量１００ｍｇ／ｋｇは、マウスにおいて活性かつ非毒性であり、平均血清ピーク濃度４ｍｇ／ｌをもたらすことが既に説明されている［非特許文献１５］。これは、エノキサシン用量１２．５μＭに相当する。用量が連続的に適用され、十分に吸収されることを考慮すると、ある特定の組織特異的蓄積を想定することができる。エノキサシンは、血液脳関門を通過することが既に説明されている。

ヒトにおいても同等の血清ピーク濃度が観測され、単一エノキサシン６００ｍｇによって３．７ｍｇ／ｍｌの血漿ピーク濃度が得られた。必要な組織浸透に応じて、エノキサシンの一般的用量は、２×２００ｍｇ／日〜２×４００ｍｇ／日で変わり、後者は、長年、標準用量とみなされてきた。このことから、本発明者らは、薬物の抗菌効率に必要な血清ピーク濃度範囲に完全に当てはまる用量を用いたが、この用量が、ｍｉＲＮＡが運動ニューロンのインビボ活性を増強するのに十分であるかどうかを、まだ評価する必要がある（非特許文献１６および非特許文献１７）。

したがって具体的な一実施形態によれば、ヒトの用量は、１００〜２０００ｍｇ／日、１００〜１０００ｍｇ／日、４００〜８００ｍｇ／日または２００〜６００ｍｇ／日である。この用量は、１日１回、２回またはそれ以上投与される複数の単位剤形に分割することができる。

本明細書に記載の有効成分の毒性および治療効果は、標準調剤手順によって、インビトロ、細胞培養または実験動物で決定することができる。これらのインビトロおよび細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータは、ヒトで使用できる範囲の投与量を製剤化するのに使用することができる。投与量は、用いられる剤形および利用される投与経路に応じて変わり得る。正確な製剤、投与経路および投与量は、患者の状態を考慮して個々の医師によって選択され得る。（例えば、非特許文献１８参照）。

投与量および投与間隔は、個々に調整して、生物学的効果を誘発または抑制するのに十分な有効成分の最適レベル（最小有効濃度、ＭＥＣ）を提供することができる。ＭＥＣは、調製毎に変わるが、インビトロデータから推定することができる。ＭＥＣを達成するのに必要な投与量は、個体の特徴および投与経路に応じて変わる。血漿濃度を決定するために、検出アッセイを使用することができる。

投与は、処置を受ける状態の重症度および応答性に応じて、数日から数週間にわたって継続する処置過程により、または治癒がもたらされるかもしくは病状の軽減が達成されるまで、単回または複数回投与で行うことができる。

投与される組成物の量は、当然のことながら、処置を受ける対象、苦痛の重症度、投与方式、担当医の判断等に応じて決まることになる。

本発明の医薬組成物は、有効成分として抗ＡＬＳ剤をさらに含むことができる。

例示的な抗ＡＬＳ剤は、リルゾール（例えばＲｉｌｕｔｅｋ（登録商標））を含む。

具体的な一実施形態によれば、医薬組成物は、キノロン（例えば、エノキサシン）および抗ＡＬＳ剤（例えば、リルゾール）を含む。

一実施形態によれば、本発明の医薬組成物は、例えば、ダイサー（例えば、ダイサー１）、ＰＡＣＴ、ＴＲＢＰおよび／またはポリ（Ｃ）−結合タンパク質２を含む、プレｍｉＲＮＡのプロセシングを増強する追加の因子をさらに含むことができる。

本発明のいくつかの実施形態の組成物は、所望に応じて、有効成分を含有する１つまたは複数の単位剤形を含有することができるパックまたはディスペンサーデバイス、例えばＦＤＡ承認キットで提示することができる。パックは、例えば金属またはプラスチック箔、例えばブリスターパックを含むことができる。パックまたはディスペンサーデバイスは、投与のための指示を伴っていてもよい。パックまたはディスペンサーは、医薬品の製造、使用または販売を規制する行政機関によって規定された形態の、容器に関連する通知を収容していてもよく、この通知は、組成物の形態またはヒトもしくは動物への投与に関与する機関による承認を反映するものである。このような通知は、例えば処方箋薬物または承認製品挿入物について米国食品医薬局によって承認されたラベリングであってもよい。また、適合性のある医薬用担体で製剤化された本発明の調製物を含む組成物を調製し、適切な容器に入れ、既にさらに詳説した通り示した状態の処置に関するラベルを付すことができる。

一実施形態によれば、パッケージング材料にパッケージされ、パッケージング材料内または上にあるＡＬＳ処置における使用に関する印刷により識別される、プレｍｉＲＮＡのプロセシングを増強することができる薬剤および抗ＡＬＳ剤を含む製品を提供する。

具体的な一実施形態によれば、製品は、キノロン（例えば、エノキサシン）および抗ＡＬＳ剤（例えば、リルゾール）を含む。

一般的なｍｉＲＮＡ代謝がＭＮＤにおいて損なわれるという本発明の知見は、これらの疾患へのさらなる診断上の関与を示唆している。

したがって本発明の追加の一態様によれば、ＭＮＤを診断する方法であって、前記方法が、ＭＮＤの診断を必要としている対象の試料において、
（ｉ）全ｍｉＲの発現、および任意選択により
（ｉｉ）全プレｍｉＲの発現
を分析することを含み、
所定の閾値を超える前記（ｉ）または（ｉ）／（ｉｉ）の下方制御がＭＮＤの指標となる、方法を提供する。

あるいはまたはさらには、ＭＮＤを診断する方法であって、ＭＮＤの診断を必要としている対象の試料において、
（ｉ）ｍｉＲの発現、および
（ｉｉ）前記ｍｉＲの前駆体の発現
を分析するステップを含み、
所定の閾値を超える（ｉ）／（ｉｉ）の下方制御がＭＮＤの指標となる、方法を提供する。

本明細書で使用される場合、用語「全ｍｉＲＮＡ」は、細胞／複数細胞／組織当たりの非特異的ｍｉＲＮＡの定量化を指す。具体的な一実施形態によれば、細胞／複数細胞／組織のｍｉＲＮＡの一部だけを定量化するために、成熟ｍｉＲＮＡのレベルだけが測定され、その前駆体は測定されない。

本明細書で使用される場合、用語「全プレｍｉＲＮＡ」は、細胞／複数細胞／組織当たりの非特異的ｍｉＲＮＡの定量化を指す。具体的な一実施形態によれば、細胞／複数細胞／組織のプレｍｉＲＮＡの一部だけを定量化するために、プレｍｉＲＮＡのレベルだけが測定され、その成熟産物（ｍｉＲＮＡ）は測定されない。

したがって、ｍｉＲＮＡ（成熟）とプレｍｉＲＮＡの比は、疾患の病因にとって極めて重要である。

したがって、本発明はさらに、特異的ｍｉＲＮＡのレベルの欠如（または不十分なレベル）が、ＭＮＤまたはＡＬＳに関連するとされている、特異的ｍｉＲＮＡのレベルの分析を企図し、ただしこの分析は、試験する特異的ｍｉＲＮＡの前駆体レベルを定量化することによっても行われる。

このようなｍｉＲＮＡは、それぞれその全体が参照によって本明細書に援用される特許文献２および特許文献３に提示されている。

具体的な一実施形態によれば、特異的ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−９、ｍｉＲ−２０６、ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−２−１、ｍｉＲ−５、ｍｉＲ−７、ｍｉＲ−８、ｍｉＲ−１１、ｍｉＲ−１２、ｍｉＲ−１３、ｍｉＲ−１４、ｍｉＲ−１５、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−１７、ｍｉＲ−１８、ｍｉＲ−１９、ｍｉＲ−２０、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−２３、ｍｉＲ−２４、ｍｉＲ−２５、ｍｉＲ−２６、ｍｉＲ−２７、ｍｉＲ−２８、ｍｉＲ−２９、ｍｉＲ−３０、ｍｉＲ−３１、ｍｉＲ−３２、ｍｉＲ−３３、ｍｉＲ−３４、ｍｉＲ−９２、ｍｉＲ−９３、ｍｉＲ−９４、ｍｉＲ−９５、ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−９７、ｍｉＲ−９８、ｍｉＲ−９９、ｍｉＲ−１００、ｍｉＲ１０１、ｍｉＲ−１０３、ｍｉＲ−１０４、ｍｉＲ−１０５、ｍｉＲ−１０６、ｍｉＲ−１０７、ｍｉＲ−１０９、ｍｉＲ−１１０、ｍｉＲ−１１１、ｍｉＲ−１１２、ｍｉＲ−１１３、ｍｉＲ−１１４、ｍｉＲ−１１６、ｍｉＲ−１１９、ｍｉＲ−１２２、ｍｉＲ−１２５、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１２７、ｍｉＲ−１２９、ｍｉＲ−１３０、ｍｉＲ−１３２、ｍｉＲ−１３３、ｍｉＲ−１３４、ｍｉＲ−１３６、ｍｉＲ−１３８、ｍｉＲ−１４０、ｍｉＲ−１４１、ｍｉＲ−１４４、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１４６、ｍｉＲ−１４７、ｍｉＲ−１４８、ｍｉＲ−１４９、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１５１、ｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−１５４、ｍｉＲ−１５７、ｍｉＲ−１５８、ｍｉＲ−１６０、ｍｉＲ−１６２、ｍｉＲ−１６４、ｍｉＲ−１７２、ｍｉＲ−１７３、ｍｉＲ−１７４、ｍｉＲ−１７５、ｍｉＲ−１７６、ｍｉＲ−１７７、ｍｉＲ−１７８、ｍｉＲ−１７９、ｍｉＲ−１８０、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−１８３、ｍｉＲ−１８４、ｍｉＲ−１８５、ｍｉＲ−１８６、ｍｉＲ−１８７、ｍｉＲ−１８８、ｍｉＲ−１８９、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−１９２、ｍｉＲ−１９３、ｍｉＲ−１９５、ｍｉＲ−１９６、ｍｉＲ−１９７、ｍｉＲ−１９９、ｍｉＲ−２０１、ｍｉＲ−２０３、ｍｉＲ−２０５およびｍｉＲ−２２４またはそれらの前駆体からなる群から選択される。

本明細書で使用される場合、用語「診断する」は、病理（例えば、疾患、障害、症候群、病状および／またはそれらの症候）を分類し、病理の重症度を決定し、病理の進行をモニタし、病理の転帰を予測し、かつ／または回復の見通しを立てる（例えば、予後）ことを指す。

本明細書で使用される場合、「生物学的試料」は、対象に由来する流体試料または組織試料を指す。流体試料の例として、血液、血漿、血清、髄液、リンパ液、涙、唾液、喀痰および乳が挙げられるが、それらに限定されない。組織試料の例として、脳組織試料または神経組織試料（例えば、死後診断のために）が挙げられる。

このような生物学的試料を得る方法は、限定されるものではないが、標準的採血手順および腰椎穿刺を含めて当技術分野で周知である。

本明細書で使用される場合、用語「対象」は、前述の通りヒトなどの哺乳動物を指す。対象は、健康な場合もあり、または筋疲労などのＭＮＤの予備的徴候を示している場合もある。あるいは対象は、疾患への遺伝的素因を有している場合もある。

全ｍｉＲＮＡレベルの決定は、前駆体レベルの決定を伴っても伴わなくても当技術分野で周知の方法を使用して実施される。本明細書では、簡単に例示的に説明する。ＲＮＡは、ＲＮＡ単離キット、例えばＴｒｉｒｅａｇｅｎｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ Ｉｎｃ．）を使用するなどして抽出される。プレｍｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡの発現の連続平行分析のための逆転写は、ｍｉＳｃｒｉｐｔ Ｉ＆ＩＩキット（Ｑｕｉａｇｅｎ）を使用して行われる。ｍｉＲＮＡおよびプレｍｉＲＮＡの発現の定量的分析は、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ系（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）を用いて実施される。すべての実験は、好ましくは生物学的反復により独立に実施される。ｑＰＣＲは、好ましくは技術的にデュプリケートで実施される。

全ｍｉＲおよび任意選択によりプレｍｉＲを分析した後、その結果は典型的に記録され、対象に通知される。診断は、Ｅｌ Ｅｓｃｏｒｉａｌ基準を構成するものを含む他の手段を用いて実証することができる。本発明の方法と共に使用できる他の診断方法は、経頭蓋磁気刺激法（ＴＭＳ）を含むものである。この非侵襲的な手順は、脳内に磁気パルスを与え、そのパルスにより、身体の特定領域の運動活性を刺激する。身体の異なる領域にテープで貼られた電極が、筋肉内の電気的活動を感知し、記録する。

本発明の診断方法は、他の疾患の関与を除外し、または筋肉が関与する程度を測定するための他の実験でも実証できることが理解されよう。以下は、このような試験の一覧である。
１．筋電図検査（ＥＭＧ）を使用して、筋肉および神経の機能障害、ならびに脊髄疾患を診断する。筋電図検査は、特定の神経に沿ってインパルスが移動する速度を測定するためにも使用される。ＥＭＧは、収縮中および静止時に筋肉を調節する脳および／または脊髄から末梢神経根（腕および脚に見出される）への電気的活動を記録する。非常に細いワイヤー電極を、筋肉内に１つずつ挿入して、運動中および筋肉が静止しているときに生じる電圧の変化を評価する。電極は、記録機器に接続されている。試験は、試験される筋肉および神経の数に応じて、通常約１時間以上継続される。
２．ＥＭＧは、通常、神経伝導速度の研究と共に行われる。この手順では、信号を送信する神経の能力を試験するために、電気エネルギーも測定する。技術者は、筋肉を覆う皮膚上に２組の平坦な電極をテープで貼る。第１の組の電極を使用して、小さい電気パルス（静電気による振動に類似している）を送信して、特定の筋肉に向かう神経を刺激する。第２の組の電極は、応答電気信号を記録機に伝える。次に、医師は、その応答を審査して、任意の神経障害または筋肉疾患を検証する。
３．血液、尿または他の物質の実験室スクリーニング試験は、ＭＮＤの症状に類似の症状を有する場合がある筋肉疾患および他の障害を除外することができる。例えば、脳および脊髄を取り囲む流体の分析では、ＰＰＳを含むいくつかの障害を検出することができる。血液検査では、タンパク質クレアチンキナーゼレベル（筋収縮のためのエネルギーを生成する化学反応に必要である）を測定するように指示することができ、このレベルが高いことは、筋ジストロフィーなどの筋肉疾患を診断する一助になり得る。
４．磁気共鳴画像（ＭＲＩ）では、コンピューターによって生じる電波および強力な磁場を使用して、組織、器官、骨および神経を含む身体構造の詳細な画像を生成する。これらの画像は、脳および脊髄の腫瘍、目の疾患、炎症、感染症、ならびに脳卒中に至るおそれがある血管変則性を診断する一助になり得る。ＭＲＩは、多発性硬化症などの変性障害を検出し、モニタすることもでき、外傷から生じる脳障害の証拠を提供することができる。ＭＲＩは、しばしば頭部、頸部および脊髄に影響を及ぼす、ＭＮＤ以外の疾患を除外するために使用される。
５．筋肉または神経生検は、神経疾患および神経再生を確認する一助になり得る。少量の筋肉または神経試料を、局所麻酔剤下で取り出し、顕微鏡で研究する。試料は、外科的に、皮膚の開口部を介して、または細い中空針を皮膚を介して筋肉内に挿入する針生検によって取り出すことができる。筋肉の小片は、身体から取り出されても中空針中に残っている。この試験は、損傷度についての有益な情報を提供できるが、侵襲的手順であり、それ自体、神経障害性の副作用を引き起こすおそれがある。多くの専門家は、生検が診断に常に必要であるとは考えない。

本発明はさらに、ＭＮＤを処置するための薬剤を同定する方法であって、前記方法が、
（ａ）ＡＬＳ患者またはＡＬＳモデルの運動ニューロンを、候補薬剤と接触させるステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）の前およびステップ（ａ）の後に、
（ｉ）前記運動ニューロンにおける全ｍｉＲの発現、および任意選択により
（ｉｉ）前記運動ニューロンにおける全プレｍｉＲの発現
を分析するステップとを含み、
ステップ（ａ）の前と比較してステップ（ａ）の後の、所定の閾値を超える前記（ｉ）または（ｉ）／（ｉｉ）の上方制御が、候補化合物がＭＮＤを処置するための治療剤であることの指標となる、方法を企図する。

運動ニューロンは、マウス、ラットまたはヒトを含む任意の動物から単離することができる。あるいは、運動ニューロンは、例えばマウス運動ニューロン細胞系、ＮＳＣ１９などの運動ニューロン細胞系の一部であってもよい［非特許文献１９］。

またあるいは、運動ニューロンは、幹細胞から分化し得る。一実施形態によれば、幹細胞は、胚性幹細胞（ＥＳＣ）である。このような胚性幹細胞は、ＭＮＤのモデルとして働く遺伝子導入動物（例えば、マウス）から単離することができる。例えば、胚性幹細胞は、Ｔｇ（Ｈｌｘｂ９−ＧＦＰ）１Ｔｍｊ Ｔｇ（ＳＭＮ２）８９Ａｈｍｂ Ｓｍｎ１^{ｔｍ１Ｍｓｄ}／Ｊマウス（ジャクソン研究所ストックナンバー００６５７０）から単離することができる。あるいは、胚性幹細胞は、ダイサーのコリン作動性特異的ノックアウトを含む遺伝子導入動物から単離することもできる。このＭＮＤモデルを、以下において本明細書でさらに説明する。

例えば非特許文献２０に記載のものなどの、胚性幹細胞を運動ニューロンに分化させるための様々な方法が知られている。

例示的な候補薬剤として、小分子薬剤、ポリヌクレオチド薬剤、化学物質、遺伝子発現を修飾することが知られている抗生物質化合物、修飾または非修飾ポリヌクレオチド（オリゴヌクレオチドを含む）、ポリペプチド、ペプチド、低分子ＲＮＡ分子およびｍｉＲＮＡが挙げられる。

本発明のこの態様に従って接触させる方法は、典型的に、試験される候補薬剤のタイプに応じて決まることが理解されよう。したがって、例えばポリヌクレオチド薬剤は、典型的に、遺伝子導入薬剤と一緒に運動ニューロンと接触させられる。典型的に、運動ニューロン培地には、追加の薬剤なしに少量の化学物質が入れられる。

本発明の候補薬剤は、治療剤とみなすと、典型的にステップ（ａ）の前と比較してステップ（ａ）の後に、（ｉ）または（ｉ）／（ｉｉ）を所定の閾値を超えて上方制御する。

ＭＮＤを処置するための治療剤として候補薬剤を選択した後、その薬剤を、例えば疾患の動物モデルで試験することができ、最終的にはヒトで試験することができる。次に、治療効果を検証することによって、候補薬剤を医薬組成物として調製することができる。

このような方法は、研究および製薬業界に対する重要性を超えて、個人医療分野でも有益である。対象の細胞は、候補処置剤（例えば、エノキサシン）と接触させられ、処置へのコンプライアンスは、接触後の（ｉ）または（ｉ）／（ｉｉ）の上方制御に依存して決まる。

本明細書で使用される場合、用語「約」は、±１０％を指す。

用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」およびそれらの同根語は、「含むがそれらに限定されない」を意味する。

用語「からなる」は、「含みかつそれに限定される」を意味する。

用語「から本質的になる」は、追加の成分、ステップおよび／または部分が、特許請求されている組成物、方法または構造の基本的および新規な特徴を実質的に変えない場合に限り、組成物、方法または構造は、その追加の成分、ステップおよび／または部分を含み得ることを意味する。

本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、状況によって別段明示されない限り複数の参照物を含む。例えば、用語「１つの化合物」または「少なくとも１つの化合物」は、化合物の混合物を含む複数の化合物を含むことができる。

本願を通して、本発明の様々な実施形態は、範囲型式で提示され得る。範囲型式の説明は、単に便宜上、簡潔にするためのものであり、本発明の範囲を強固に制限するものと解釈されるべきでないことを理解されたい。したがって、範囲の説明は、範囲内に可能な部分範囲ならびに個々の数値のすべてを具体的に開示しているとみなされるべきである。例えば１〜６などの範囲の説明は、部分範囲、例えば１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６等、ならびに範囲に含まれる個々の数字、例えば１、２、３、４、５および６を具体的に開示しているとみなされるべきである。このことは、範囲の幅に関わらず適用される。

数値範囲が本明細書で示される場合にはいつでも、示された範囲内の任意の引用数値（少数または整数）を含むことを意味する。第１の指示数と第２の指示数「の間の範囲」、および第１の指示数「から」第２の指示数「までの範囲」という用語は、本明細書では交換可能に使用され、その第１および第２の指示数を含み、それらの間のすべての少数値および整数値を含むことを意味する。

本明細書で使用される場合、用語「方法」は、限定されるものではないが、化学、薬理学、生物学、生化学および医療分野の技術者に知られる方式、手段、技術および手順、または周知の方式、手段、技術および手順から技術者によって容易に開発されるものを含む、所与の課題を完遂するための方式、手段、技術および手順を指す。

簡潔にするために別個の実施形態の文脈において説明した本発明の特定の特徴は、組み合わせて単一の実施形態で提供できることも理解されたい。それとは逆に、簡潔にするために単一の実施形態の文脈において説明した本発明の様々な特徴は、別個に提供し、または任意の適切な部分的組合せで、もしくは本発明の記載の任意の他の実施形態において適したものとして提供することもできる。様々な実施形態の文脈において説明した特定の特徴は、それらの要素がなく実施形態が動作不能にならない限り、それらの実施形態の必須の特徴とみなされるべきではない。

本明細書で先に記載されたものであって、添付特許請求の範囲で特許請求される本発明の様々な実施形態および態様は、以下の実施例により実験的に支持される。

ここで、本発明のいくつかの実施形態を、先の説明と共に非限定的に例示する以下の実施例を参照する。

一般に、本明細書で使用される命名法および本発明で利用される実験室手順には、分子、生化学、微生物学および組換えＤＮＡの技術が含まれる。このような技術は、文献に完全に説明されている。例えば、非特許文献２１；非特許文献２２；非特許文献２３；非特許文献２４；非特許文献２５；非特許文献２６；特許文献８、特許文献９、特許文献１０、特許文献１１および特許文献１２に記載の方法論；非特許文献２７；非特許文献２８；非特許文献２９；非特許文献３０；非特許文献３１を参照されたい。利用可能な免疫アッセイは、特許文献および科学文献に広範に記載されており、例えば、特許文献１３、特許文献１４、特許文献１５、特許文献１６、特許文献１７、特許文献１８、特許文献１９、特許文献２０、特許文献２１、特許文献２２、特許文献２３、特許文献２４、特許文献２５、特許文献２６、特許文献２７および特許文献２８；非特許文献３２；非特許文献３３；非特許文献３４；非特許文献３５；非特許文献３６；非特許文献３７および非特許文献３８；非特許文献３９；非特許文献４０を参照されたい。これらの文献のすべては、あたかも本明細書に完全に記載されているように参照によって援用される。他の一般的な参考文献は、本明細書を通して提示されている。当該参考文献の手順は、当技術分野で周知であると思われ、読者の便宜のために提示される。当該参考文献に含有されているあらゆる情報は、参照によって本明細書に援用される。

（実施例１）
実験手順
ヒト組織ｍｉＲＮＡの分析
４ｐｍｏｌの５’および３’ＤＩＧ標識抗ｍｉＲ−９および抗ｍｉＲ−１２４ＬＮＡプローブで製造者（Ｅｘｉｑｏｎ社）の指示書に従った切片のハイブリダイゼーション法に従って^１０、腰部から得た凍結脊髄組織の７μｍ切片に対してin situハイブリダイゼーションを実施した。

培養細胞におけるｍｉＲＮＡ研究では、プレｍｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡの発現の連続平行分析のための逆転写を、ｍｉＳｃｒｉｐｔ Ｉ＆ＩＩキット（Ｑｕｉａｇｅｎ社）を使用して実施した。ｍｉＲＮＡおよびプレｍｉＲＮＡの発現の定量的分析は、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ系（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）を用いて実施した。すべての実験は、少なくとも３回の生物学的反復により独立に実施し、ｑＰＣＲは、技術的にデュプリケートで実施した。

インビボ実験では、ヒトＳＯＤ１のＧ９３Ａ変異体形態を発現する遺伝子導入ＳＯＤ１（スーパーオキシドジスムターゼ１）マウスを使用した。ＳＯＤ１マウス（ＴｇＮ−ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ−１Ｇｕｒ）は、ヒトの筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）に類似の表現型を呈する。２０匹のマウスに、５０日齢から飲料水でエノキサシン（用量２００ｍｇ／ｋｇ）を与えた。マウスの寿命および神経筋機能をモニタした。神経筋機能を、既に非特許文献４１に記載されている通り、マウスの筋肉緊張反射および全般的なケージ内運動活動を試験する神経学的スコアによって評価した。ハングワイヤー試験を利用し、それによって、前肢、後肢の身体的強度全体、ポールに肢をかけたときの内転能および歩行能を測定した。オランダのＮｏｌｄｕｓ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙによるカメラモニタによるコンピューター化自発運動試験自動化システムをベースとする、自動化Ｃａｔｗａｌｋ歩行分析システムを利用した。

両側スチューデントｔ試験を使用して、事後Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ−Ｈｏｃｈｂｅｒｇ補正を用いて統計解析を実施した。値は、ｐ＜０．０５の場合に統計的に有意であるとみなした。結果は、少なくとも３回の独立な実験を代表するものであり、標準偏差で提示される。ヒトｍｉＲＮＡ研究のｑＰＣＲデータ統計値は、ＤａｔａＡｓｓｉｓｔソフトウェア（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して得た。

（実施例２）
ｍｉＲＮＡの発現はＡＬＳにおいて変わる
過去の報告は、一般的（非特異的）なマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）代謝が、対照と比較して孤発性ＡＬＳ（ｓＡＬＳ）の対象の腹側腰部脊髄（ＳＣ）組織において変化していることを示している［非特許文献４２］。本発明の研究では、本発明者らは、ＡＬＳ対象において変化したｍｉＲＮＡ発現が、ｍｉＲＮＡバイオプロセシングの変異に関係しており、適切な処置によって逆転され得るという仮説について試験した。

最初に、ｍｉＲＮＡがＡＬＳ対象において全体的に下方制御されるという観測を、ｍｉＲＮＡのin situハイブリダイゼーションによって実証し^１０、それによって、対照に対して患者の組織のｍｉＲ−９およびｍｉＲ−１２４が同等に下方制御されることが明らかになった（図１ａ〜ｃ）。これらのデータは、ｍｉＲＮＡがＡＬＳ運動ニューロンにおいて広範に下方制御されることを示唆している。ＡＬＳにおけるｍｉＲＮＡの調節異常機構についての見識を得るために、本発明者らは、ＨＥＫ２９３またはＮＳＣ−３４細胞に、ＡＬＳを引き起こすＦＵＳおよびＴＤＰ−４３の変異体形態を発現させるためのベクターをトランスフェクトし、ｍｉＲＮＡの発現を調査した。混合運動ニューロン細胞系、ＮＳＣ−３４に、ＡＬＳを引き起こすＴＤＰ−４３およびＦＵＳの変異体形態を発現させるためのベクターをトランスフェクトすると、すべての場合において成熟ｍｉＲＮＡの発現が下方制御されたことが明らかになった（図２ａ〜ｄおよび図３）。これらのデータにより、ＡＬＳを引き起こす毒性のある変異体が存在することは、ｍｉＲＮＡプロセシングを撹乱するのに十分であることが明らかである。標準的ｍｉＲＮＡバイオプロセシングには、核におけるドローシャ／Ｄｇｃｒ８複合体による、その後の細胞質におけるダイサー１による、プレｍｉＲＮＡ前駆体の消化が含まれる。したがって、バイオプロセシング系の特定の機能障害は、中間体ｍｉＲＮＡ形態の蓄積によって明らかになり得る。ＮＳＣ−３４細胞抽出物におけるプレｍｉＲＮＡの定量的分析では、成熟ｍｉＲＮＡが下方制御されると同時に、それらの同族のプレｍｉＲＮＡ前駆体のレベルが、ＡＬＳを引き起こすＴＤＰ−４３またはＦＵＳの変異体形態の発現によって実際に上方制御されたことが明らかになった（図２ａ〜ｄおよび図３）。注目すべきことには、成熟ｍｉＲＮＡへのプレｍｉＲＮＡプロセシングの機能障害は、異なるＦＵＳおよびＴＤＰ−４３変異体で記録された臨床的重症度の記録と相関するように見える。ヒトＬＣＭ試料におけるプレｍｉＲＮＡを測定する試みは成功しなかったが、これはおそらく、これらの中間体前駆体の発現レベルが非常に小さかったことに起因する。成熟ｍｉＲＮＡレベルが低く、対照よりもプレｍｉＲＮＡ前駆体がより高いというこの相反関係により、ダイサー１によるプレｍｉＲＮＡプロセシングが阻害されることが示唆された^１１。

本発明者らは、プレｍｉＲＮＡのダイシングが、ＡＬＳを引き起こすＴＤＰ−４３またはＦＵＳ型の発現によって阻害されると推論し、したがって同じ患者により、遺伝子発現におけるｍｉＲＮＡ−プロセシング因子をコードするｍＲＮＡの変化およびスプライシングデータについて調査した^９。しかし、これらの照合では、対照に対してＡＬＳ患者におけるこれらの因子の発現が変化することは、明らかにならなかった。本発明者らは、ＡＬＳを引き起こすＴＤＰ−４３およびＦＵＳの変異体形態によって撹乱されたｍｉＲＮＡプロセシングにおけるダイシングの役割を、機能的に実験的に支持するために、ダイサー１活性の増強を介してｍｉＲＮＡレベルを増大することが知られる、フルオロキノロン系抗生物質であるエノキサシンを用いることを試みた^１２。実際、ＨＥＫ２９３細胞にエノキサシンを導入すると、ＡＬＳを引き起こすＴＤＰ−４３またはＦＵＳ変異体の、ｍｉＲＮＡの成熟化に対する負の影響が逆転した（図２ｅ〜ｈ）。したがって、ＡＬＳにおけるｍｉＲＮＡバイオプロセシングの不良は、非毒性フルオロキノロンによって逆転可能となり得る。

この観測は、エノキサシンがＡＬＳの典型的なＳＯＤ１ Ｇ９３Ａモデル（高コピー数、遺伝的背景欠損）において、インビボでも有益となり得るという仮説を後押しした。したがって、本発明者らは、マウスのコホートに、５０日齢から飲料水でエノキサシンを与えることによって、前臨床研究を開始した。この予備研究では、ｍｉＲＮＡの成熟化または活性をモジュレートする既存のまたはまだ開発されていないより強力な分子を用いて将来的に治療上使用できる、いくつかの形態のＡＬＳに関与する機序は明らかに示されなかった。

ｍｉＲＮＡは、脳脊髄液を含む体液において検出可能なので、これにより将来的にはＡＬＳのｍｉＲＮＡベースのマーカーの開発が可能になり得る。さらにこれらの観測により、いくつかの他の脳疾患においてｍｉＲＮＡの調節異常が示唆された通り、神経変性の他の形態で作用する分子機構の理解が深まる。

運動ニューロンにおけるｍｉＲＮＡおよびダイサー１活性の喪失が、マウスの運動ニューロン疾患を引き起こすのに十分であるという認識は^７、ここで報告する全体的ｍｉＲＮＡ下方制御が、ヒトＡＬＳ患者の運動ニューロン生存にも影響を及ぼし得ることを強力に示唆している。したがって本発明の知見は、ｍｉＲＮＡの成熟化または活性をモジュレートする強力な分子が開発され得る場合、ＡＬＳのいくつかの形態に関与する共通の機序が、将来的に治療上使用できることを示唆している。

本発明を、その具体的な実施形態と共に記載してきたが、多くの変更、改変および変形が当業者に明らかになることが明白である。したがって、添付の特許請求の範囲の精神および広範な範囲に含まれるすべてのこのような変更、改変および変形が包含されることを企図する。

本明細書で言及したあらゆる刊行物、特許文書および特許出願文書は、あたかもそれぞれ個々の刊行物、特許文書または特許出願文書が、参照によって本明細書に具体的に個々に援用されることが示されるのと同程度に、それらの全体が参照によって本明細書に援用される。さらに、本願における任意の参考文献の引用または識別は、このような参考文献が、従来技術として本発明に利用可能であることを容認するものと解釈してはならない。各項目の見出しは、それらが使用される範囲で、必ずしも限定的なものと解釈されるべきではない。

参考文献
（他の参考文献は、本願を通して引用される）
¹ Sreedharan, J. et al., TDP-43 mutations in familial and sporadic amyotrophic lateral sclerosis. Science 319 (5870), 1668 (2008).
² Kabashi, E. et al., TARDBP mutations in individuals with sporadic and familial amyotrophic lateral sclerosis. Nat Genet 40 (5), 572 (2008).
³ Bosco, D. A. et al., Mutant FUS proteins that cause amyotrophic lateral sclerosis incorporate into stress granules. Hum Mol Genet (2010).
⁴ Kwiatkowski, T. J., Jr. et al., Mutations in the FUS/TLS gene on chromosome 16 cause familial amyotrophic lateral sclerosis. Science 323 (5918), 1205 (2009); Vance, C. et al., Mutations in FUS, an RNA processing protein, cause familial amyotrophic lateral sclerosis type 6. Science 323 (5918), 1208 (2009).
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⁶ Lagier-Tourenne, C., Polymenidou, M., and Cleveland, D. W., TDP-43 and FUS/TLS: emerging roles in RNA processing and neurodegeneration. Hum Mol Genet 19 (R1), R46 (2010).
⁷ Haramati, S. et al., miRNA malfunction causes spinal motor neuron disease. Proc Natl Acad Sci U S A 107 (29), 13111 (2010).
⁸ Abelson, J. F. et al., Sequence variants in SLITRK1 are associated with Tourette's syndrome. Science 310 (5746), 317 (2005); Rademakers, R. et al., Common variation in the miR-659 binding-site of GRN is a major risk factor for TDP43-positive frontotemporal dementia. Hum Mol Genet 17 (23), 3631 (2008); Georges, M., Coppieters, W., and Charlier, C., Polymorphic miRNA-mediated gene regulation: contribution to phenotypic variation and disease. Curr Opin Genet Dev 17 (3), 166 (2007); Chen, K. and Rajewsky, N., Natural selection on human microRNA binding sites inferred from SNP data. Nat Genet 38 (12), 1452 (2006).
⁹ Rabin, S. J. et al., Sporadic ALS has compartment-specific aberrant exon splicing and altered cell-matrix adhesion biology. Hum Mol Genet 19 (2), 313 (2010).
¹⁰ Pena, J. T. et al., miRNA in situ hybridization in formaldehyde and EDC-fixed tissues. Nat Methods 6 (2), 139 (2009).
¹¹ Gregory, R. I. et al., The Microprocessor complex mediates the genesis of microRNAs. Nature 432 (7014), 235 (2004).
¹² Shan, G. et al., A small molecule enhances RNA interference and promotes microRNA processing. Nat Biotechnol 26 (8), 933 (2008); Melo, S. et al., Small molecule enoxacin is a cancer-specific growth inhibitor that acts by enhancing TAR RNA-binding protein 2-mediated microRNA processing. Proc Natl Acad Sci U S A 108 (11), 4394 (2011).
¹³ Brooks, B. R., Miller, R. G., Swash, M., and Munsat, T. L., El Escorial revisited: revised criteria for the diagnosis of amyotrophic lateral sclerosis. Amyotroph Lateral Scler Other Motor Neuron Disord 1 (5), 293 (2000).

補助参考文献（本明細書中において引用）
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Ge, W. W., Wen, W., Strong, W., Leystra-Lantz, C. and Strong, M. J. (2005) 'Mutant copper-zinc superoxide dismutase binds to and destabilizes human low molecular weight neurofilament mRNA', J Biol Chem 280(1): 118-24.
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Kabashi, E., Valdmanis, P. N., Dion, P., Spiegelman, D., McConkey, B. J., Vande Velde, C., Bouchard, J. P., Lacomblez, L., Pochigaeva, K., Salachas, F. et al. (2008) 'TARDBP mutations in individuals with sporadic and familial amyotrophic lateral sclerosis', Nat Genet 40(5): 572-4.
Kwiatkowski, T. J., Jr., Bosco, D. A., Leclerc, A. L., Tamrazian, E., Vanderburg, C. R., Russ, C., Davis, A., Gilchrist, J., Kasarskis, E. J., Munsat, T. et al. (2009) 'Mutations in the FUS/TLS gene on chromosome 16 cause familial amyotrophic lateral sclerosis', Science 323(5918): 1205-8.
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Sreedharan, J., Blair, I. P., Tripathi, V. B., Hu, X., Vance, C., Rogelj, B., Ackerley, S., Durnall, J. C., Williams, K. L., Buratti, E. et al. (2008) 'TDP-43 mutations in familial and sporadic amyotrophic lateral sclerosis', Science 319(5870): 1668-72.
Strong, M. J. (2010) 'The evidence for altered RNA metabolism in amyotrophic lateral sclerosis (ALS)', J Neurol Sci 288(1-2): 1-12.
Vance, C., Rogelj, B., Hortobagyi, T., De Vos, K. J., Nishimura, A. L., Sreedharan, J., Hu, X., Smith, B., Ruddy, D., Wright, P. et al. (2009) 'Mutations in FUS, an RNA processing protein, cause familial amyotrophic lateral sclerosis type 6', Science 323(5918): 1208-11.

Claims (12)

1. 運動ニューロン疾患（ＭＮＤ）の処置を必要としている対象の前記ＭＮＤの処置に使用するための、エノキサシンを有効成分として含むダイサー活性化剤。
2. 筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の処置を必要としている対象の前記ＡＬＳの処置に使用するための、エノキサシンを有効成分として含むダイサー活性化剤および抗ＡＬＳ剤を含む、医薬組成物。
3. 前記抗ＡＬＳ剤がリルゾールを包含する、請求項２に記載の医薬組成物。
4. 前記ＭＮＤが、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、原発性側索硬化症、進行性筋萎縮、仮性球麻痺、進行性球麻痺、下位運動ニューロン疾患および脊髄性筋萎縮症からなる群から選択される、請求項１に記載のダイサー活性化剤。
5. 前記ＡＬＳが、ＲＮＡ代謝不良に関連する変異を有する遺伝子に関連する、または遺伝性ＡＬＳである、または孤発性ＡＬＳである、請求項２に記載の医薬組成物。
6. 前記ＡＬＳが、ＲＮＡ代謝不良に関連する変異を有する遺伝子に関連する、または遺伝性ＡＬＳである、または孤発性ＡＬＳである、請求項４に記載のダイサー活性化剤。
7. 有効成分としてのエノキサシン、抗ＡＬＳ剤、および薬学的に許容される担体または希釈剤を含む、ＡＬＳの処置に使用するための医薬組成物。
8. パッケージング材料にパッケージされ、前記パッケージング材料内または前記パッケージング材料上のＡＬＳ処置における使用に関する印刷により識別される、エノキサシンおよび抗ＡＬＳ剤を含む、ＡＬＳの処置に使用するための製品。
9. ＭＮＤを検出する方法であって、
   前記ＭＮＤの診断を必要としている対象の試料において、
   （ｉ）全ｍｉＲの発現、および任意選択により
   （ｉｉ）全プレｍｉＲの発現
   を分析するステップを含み、
   所定の閾値を超える前記（ｉ）または（ｉ）／（ｉｉ）の下方制御が前記ＭＮＤの指標となる、方法。
10. 前記ＭＮＤが、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、原発性側索硬化症、進行性筋萎縮、仮性球麻痺、進行性球麻痺、下位運動ニューロン疾患および脊髄性筋萎縮症からなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
11. 前記ＡＬＳが、ＲＮＡ代謝不良に関連する変異を有する遺伝子に関連する、または遺伝性ＡＬＳである、または孤発性ＡＬＳである、請求項１０に記載の方法。
12. ＭＮＤを処置するための薬剤を同定する方法であって、
    （ａ）ＡＬＳ患者またはＡＬＳモデルの運動ニューロンを、候補化合物と接触させるステップと、
    （ｂ）ステップ（ａ）の前およびステップ（ａ）の後に、
    （ｉ）前記運動ニューロンにおける全ｍｉＲの発現、および、任意選択により
    （ｉｉ）前記運動ニューロンにおける全プレｍｉＲの発現
    を分析するステップとを含み、
    ステップ（ａ）の前と比較してステップ（ａ）の後の、所定の閾値を超える前記（ｉ）または（ｉ）／（ｉｉ）の上方制御が、前記候補化合物がＭＮＤを処置するための治療剤であることの指標となる、方法。