DE112021002672T5 - Vefahren und zusammensetzungen zum gleichzeitigen editieren beider stränge einer doppelsträngigen nukleotid-zielsequenz - Google Patents

Vefahren und zusammensetzungen zum gleichzeitigen editieren beider stränge einer doppelsträngigen nukleotid-zielsequenz Download PDF

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David R. Liu
Andrew Vito Anzalone
Jonathan Ma Levy
Xin Gao
Christopher J. Podracky
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Abstract

Die vorliegende Offenbarung stellt Systeme, Zusammensetzungen und Verfahren zum gleichzeitigen Editieren beider Stränge einer doppelsträngigen DNA-Sequenz an einer zu editierenden Zielstelle bereit. In einigen Punkten umfassen die Systeme einen ersten und zweiten Prime-Editor-Komplex, wobei der erste und zweite Prime-Editor-Komplex jeweils Folgendes umfassen: (1) einen Prime-Editor, der (i) ein Nukleinsäure-programmierbares DNA- Bindungsprotein (napDNAbp), und (ii) ein Polypeptid mit RNA-abhängiger DNA- Polymeraseaktivität umfasst; und (2) eine PEgRNA, die eine Spacer-Sequenz, einen gRNA- Kern, eine DNA-Synthese-Template, und eine Primer-Bindungsstelle umfasst, wobei die DNA-Synthese-Template eine gewünschte DNA-Sequenz oder ein Komplement ebendieser kodiert, wobei die gewünschte DNA-Sequenz und das Komplement ebendieser einen Duplex bilden, der einen editierten Teil umfasst, der in die zu editierende Zielstelle integriert wird. In einigen Punkten umfassen die Systeme einen ersten, zweiten, dritten und vierten Prime-Editor- Komplex, die jeweils einen Prime-Editor sowie eine PEgRNA umfassen. Ebenfalls hier offenbart sind Verfahren zum gleichzeitigen Editieren beider Stränge einer doppelsträngigen DNA-Sequenz an einer zu editierenden Zielstelle. Ferner sind alle pharmazeutischen Zusammensetzungen, Polynukleotide, Vektoren, Zellen und Kits hier offenbart.

Description

  • STAATLICHE UNTERSTÜTZUNG
  • Diese Erfindung entstand mit staatlicher Unterstützung unter den Förderungsnummern U01AI142756, RM1HG009490, R01EB022376 und R35GM118062 der National Institutes of Health. Der Staat hat bestimmte Rechte an der Erfindung.
  • VERWANDTE ANWENDUNGEN UND EINGLIEDERUNG DURCH REFERENZ
  • Diese Anwendung beansprucht Vorrang gegenüber der vorläufigen US-Anmeldung Nr. 63/022.397 , eingereicht am 8. Mai 2020, und der vorläufigen US-Anmeldung Nr. 63/116.785 , eingereicht am 20. November 2020, deren gesamter Inhalt jeweils durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit hier aufgenommen wird.
  • Diese vorläufige US-Anwendung bezieht sich auch auf die folgenden Anträge und schließt sie durch Bezugnahme ein, nämlich die vorläufige US-Anmeldung Nr. 62/820.813 , eingereicht am 19. März 2019 (Rechtsanwaltsakte Nr. B1195.70074US00), die vorläufige US- Anmeldung Nr. 62/858.958 (Rechtsanwaltsakte Nr. B1195.70074US01), eingereicht am 7. Juni 2019, die vorläufige US-Anmeldung Nr. 62/889.996 (Rechtsanwaltsakte Nr. B1195.70074US02), eingereicht am 21. August 2019, die vorläufige US-Anmeldung Nr. 62/922.654 , eingereicht am 21. August 2019 (Rechtsanwaltsakte Nr. B1 195.70083US00), die vorläufige US-Anmeldung Nr. 62/913.553 (Rechtsanwaltsakte Nr. B1195.70074US03), eingereicht am 10. Oktober 2019, die vorläufige US-Anmeldung Nr. 62/973.558 (Rechtsanwaltsakte Nr. B1 195.70083US01), eingereicht am 10. Oktober 2019, die vorläufige US-Anmeldung Nr. 62/931.195 (Rechtsanwaltsakte Nr. B1 195.70074US04), eingereicht am 5. November 2019, die vorläufige US-Anmeldung Nr. 62/944.231 (Rechtsanwaltsakte Nr. B1195.70074US05), eingereicht am 5. Dezember 2019, die vorläufige US-Anmeldung Nr. 62/974.537 (Rechtsanwaltsakte Nr. B1195.70083US02), eingereicht am 5. Dezember 2019, die vorläufige US-Anmeldung Nr. 62/991.069 (Rechtsanwaltsakte Nr. B1 195.70074US06), eingereicht am 17. März 2020, die vorläufige US-Anmeldung Nr. ( 63/100.548 ) (Rechtsanwaltsakte Nr. B1195.70083US03), eingereicht am 17. März 2020. Darüber hinaus bezieht sich diese vorläufige US-Anmeldung auf die internationale PCT-Anmeldungsnummer und nimmt diese durch Bezugnahme auf: PCT/US20/23721; PCT/US20/23730; PCT/US20/23713; PCT/US20/23712; PCT/US20/23727; PCT/US20/23724; PCT/US20/23725; PCT/LJS20/23728; PCT/US20/23732; PCT/US20/23723; PCT/US20/23553; und PCT/US20/23583 jeweils eingereicht am 19. März 2020.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Einigen Schätzungen zufolge tragen pathogene Einzelnukleotid-Mutationen zu etwa 50 % der menschlichen Krankheiten bei, die eine genetische Komponente aufweisen.7 Leider sind die Behandlungsmöglichkeiten für Patienten mit diesen genetischen Störungen trotz jahrzehntelanger Erforschung der Gentherapie weiterhin äußerst begrenzt.8 Die vielleicht einfachste Lösung für diese therapeutische Herausforderung ist die direkte Korrektur von Einzelnukleotid-Mutationen im Genom der Patienten, die die Ursache der Krankheit bekämpfen und wahrscheinlich einen dauerhaften Nutzen bringen würde. Obwohl eine solche Strategie früher undenkbar war, haben die jüngsten Verbesserungen der Genom-Editing- Möglichkeiten durch das Aufkommen des CRISPR/Cas-Systems9 diesen therapeutischen Ansatz nun in greifbare Nähe gerückt. Durch den einfachen Entwurf einer Guide-RNA (gRNA) -Sequenz, die ~20 Nukleotide enthält, die zur Ziel-DNA-Sequenz komplementär sind, kann auf nahezu jede denkbare, genomische Stelle spezifisch durch CRISPR-assoziierte (Cas) Nukleasen1,2 zugegriffen werden. Bislang wurden mehrere monomere bakterielle Cas- Nuklease-Systeme identifiziert und für Genome-Editing-Anwendungen angepasst.10 Diese natürliche Vielfalt der Cas-Nukleasen bietet zusammen mit einer wachsenden Sammlung technischer Varianten11-4 einen fruchtbaren Boden für die Entwicklung neuer Genom-Editing- Technologien.
  • Während die Gendeaktivierung mit CRISPR inzwischen eine ausgereifte Technik ist, bleibt die Präzisionsbearbeitung einzelner Basenpaare im menschlichen Genom eine große Herausforderung.3 Die homologiegeleitete Reparatur (HDR) wird seit langem in menschlichen Zellen und anderen Organismen eingesetzt, um DNA-Sequenzen an Stellen von Doppelstrangbrüchen (DSBs) einzufügen, zu korrigieren oder auszutauschen. Dabei werden Spender-DNA-Reparatur-Templates verwendet, die für die gewünschten Änderungen kodieren.15 Die herkömmliche HDR ist jedoch bei den meisten menschlichen Zelltypen sehr ineffizient, insbesondere bei sich nicht teilenden Zellen, und die konkurrierende nicht- homologe Endverbindung (NHEJ) führt überwiegend zu Insertions-Deletions-Nebenprodukten (Indel).16 Andere Probleme betreffen die Erzeugung von DSBs, die zu großen Chromosomenumlagerungen und Deletionen an den Zielorten17 führen oder die p53-Achse aktivieren können, was zu Wachstumsstillstand und Apoptose führt.18,19
  • Es wurden verschiedene Ansätze untersucht, um diese Nachteile von HDR zu beheben. So hat sich beispielsweise gezeigt, dass die Reparatur von Einzelstrang-DNA-Brüchen (Nicks) mit Oligonukleotidspendern die Indelbildung reduziert, aber die Ergebnisse an gewünschten Reparaturprodukten gering bleiben.20 Andere Strategien versuchen, die Reparatur mit Hilfe kleiner Moleküle und biologischer Reagenzien in Richtung HDR und nicht in Richtung NHEJ zu lenken.21-23 Die Wirksamkeit dieser Verfahren ist jedoch wahrscheinlich vom Zelltyp abhängig, und die Störung des normalen Zellzustands könnte zu unerwünschten und unvorhersehbaren Auswirkungen führen.
  • Kürzlich haben die Erfinder unter der Leitung von Prof. David Liu et al. das Base Editing als eine Technologie entwickelt, die die Zielnukleotide bearbeitet, ohne DSBs zu erzeugen oder sich auf HDR4-6, 24-27 zu verlassen. Die direkte Modifikation von DNA-Basen durch Cas-fusionierte Deaminase-Enzyme ermöglicht die Umwandlung von C-· in T·A oder A·T in G·C in einem kurzen Zielfenster (~5-7 Basen) mit sehr hoher Effizienz. Infolgedessen wurden die Basis-Editoren schnell von der wissenschaftlichen Gemeinschaft angenommen. Allerdings schränken die folgenden Faktoren ihre Allgemeingültigkeit für das Präzisionsgenom-Editing ein: (1) „Bystander-Editing“ von Nicht-Ziel-C- oder -A-Basen innerhalb des Zielfensters wird beobachtet; (2) Ziel-Nukleotid-Produktmischungen werden beobachtet; (3) die Zielbasen müssen sich 15±2 Nukleotide stromaufwärts einer PAM-Sequenz befinden; und (5) die Reparatur von kleinen Insertions- und Deletionsmutationen ist nicht möglich.
  • Daher ist die Entwicklung programmierbarer Editoren, die flexibel in der Lage sind, jede gewünschte einzelne Nukleotidänderung einzuführen und/oder Basenpaare einzufügen oder zu entfernen (z.B., mindestens 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 oder mehr Basenpaar-Insertionen oder -Deletionen) und/oder die die Nukleotidsequenz an einer Zielstelle mit hoher Spezifität und Effizienz verändern oder modifizieren können, würde den Anwendungsbereich und das therapeutische Potenzial von Genom-Editing-Technologien auf der Grundlage von CRISPR erheblich erweitern.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung beschreibt eine neue Plattform für die Genom-Editierung, die als „Multi-Flap-Prime-Editing“ bezeichnet wird (einschließlich z. B. „Dual-Flap-Prime- Editing“ und „Quadruple-Flap-Prime-Editing“) und eine innovative Weiterentwicklung des „Prime-Editing“ oder „klassischen Prime-Editing“ darstellt, wie von den heutigen Erfindern beschrieben in Anzalone, A. V. et al. Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA. Nature 576, 149-157 (2019), durch Bezugnahme hier aufgenommen. Während beim klassischen Prime-Editing in verschiedenen Ausführungsformen an einer Einstichstelle ein einzelner 3'-Flap polymerisiert wird, der in die Zielnukleinsäure auf demselben Strang integriert wird, umfassen die derzeit beschriebenen Multi-Flap-Prime- Editing-Systeme verschiedene Konstrukte, Systeme und Verfahren, die in verschiedenen Ausführungsformen Paare oder mehrere Paare von 3'-Flaps auf verschiedenen Strängen erzeugen, die Duplexe bilden, die die gewünschten Edits umfassen und in die Ziel- Nukleinsäuremoleküle eingebaut werden, z. B. an spezifischen Loci oder Editierstellen in einem Genom. In verschiedenen Aspekten bilden die Paare oder mehrere Paare von 3'-Flaps Duplexe, weil sie umgekehrt komplementäre Sequenzen enthalten, die sich aneinander anlagern, sobald sie von den hier beschriebenen Prime-Editoren erzeugt wurden. Die Duplexe werden durch zellgesteuerte Mechanismen in die Zielstelle eingebaut, die auf natürliche Weise die endogenen Duplexsequenzen ersetzen, die sich zwischen benachbarten Einstichstellen befinden. In bestimmten Ausführungsformen können die neuen Duplexsequenzen an einer oder mehreren Stellen eingeführt werden (z. B. an benachbarten genomischen Loci oder an zwei verschiedenen chromosomalen Stellen) und können eine oder mehrere Sequenzen von Interesse umfassen, z. B. eine Protein-kodierende Sequenz, eine Peptid-kodierende Sequenz oder eine RNA-kodierende Sequenz. In einer Ausführungsform können die neuen Duplexsequenzen, die von den Multi-Flap-Prime-Editing-Systemen installiert werden, eine Rekombinasestelle umfassen, z. B., eine Bxb1-Rekombinasestelle attB (38 bp) und/oder attP (50 bp) oder eine Rekombinasestelle, die von Hin-Rekombinase, Gin-Rekombinase, Tn3- Rekombinase, β-six-Rekombinase, CinH-Rekombinase, ParA-Rekombinase, γδ- Rekombinase, ϕC31-Rekombinase, TP901-Rekombinase, TG1-Rekombinase, φBT1- Rekombinase, R4-Rekombinase, φRV1-Rekombinase, φFC1-Rekombinase, MR11- Rekombinase, A118-Rekombinase, U153-Rekombinase und gp29-Rekombinase, Cre- Rekombinase, FLP-Rekombinase, R-Rekombinase, Lambda-Rekombinase, HK101- Rekombinase, HK022-Rekombinase und pSAM2-Rekombinase erkannt wird.
  • Die Erfinder haben vor kurzem das Prime Editing entwickelt, das das Einfügen, Löschen oder Ersetzen von genomischen DNA-Sequenzen ermöglicht, ohne dass fehleranfällige Doppelstrang-DNA-Brüche erforderlich sind. Beim Prime Editing wird ein künstlich hergestelltes Cas9-Nickase-Reverse-Transkriptase-Fusionsprotein (PE1 oder PE2) zusammen mit einer künstlich hergestellten Prime-Editing-Guide-RNA (pegRNA) verwendet, die sowohl Cas9 zur genomischen Zielstelle leitet als auch die Informationen für die Installation des gewünschten Schnitts kodiert. Prime Editing erfolgt in einem mehrstufigen Bearbeitungsprozess: 1) Die Cas9-Domäne bindet an die genomische DNA-Zielstelle, die durch die Spacer-Sequenz der pegRNA spezifiziert ist, und schneidet sie ein. 2) Die Domäne der reversen Transkriptase verwendet die eingekerbte genomische DNA als Primer, um die Synthese eines editierten DNA-Strangs zu initiieren, indem sie eine konstruierte Verlängerung der pegRNA als Template für die reverse Transkription verwendet - dies erzeugt einen einzelsträngigen 3'-Flap, der die editierte DNA-Sequenz enthält; 3) die zelluläre DNA- Reparatur löst das 3'-Flap-Zwischenprodukt durch die Verdrängung einer 5'-Flap-Spezies auf, die durch die Invasion des editierten 3'-Flaps, die Exzision des 5'-Flaps, der die ursprüngliche DNA-Sequenz enthält, und die Ligation des neuen 3'-Flaps erfolgt, um den editierten DNA- Strang zu inkorporieren, wodurch ein Heteroduplex aus einem editierten und einem uneditierten Strang gebildet wird; und 4) die zelluläre DNA-Reparatur ersetzt den uneditierten Strang innerhalb des Heteroduplex unter Verwendung des editierten Strangs als Matrize für die Reparatur, wodurch der Editierungsprozess abgeschlossen wird.
  • Eine effiziente Integration der gewünschten Editierung erfordert, dass der neu synthetisierte 3'-Flap einen Teil der Sequenz enthält, der homolog zur genomischen DNA- Stelle ist. Diese Homologie ermöglicht es dem bearbeiteten 3'-Flap, mit dem endogenen DNA- Strang (dem entsprechenden 5'-Flap) um die Integration in den DNA-Duplex zu konkurrieren. Da der bearbeitete 3'-Flap eine geringere Sequenzhomologie aufweist als der endogene 5'-Flap, ist zu erwarten, dass die Konkurrenz den 5'-Flap-Strang begünstigt. Ein potenziell limitierender Faktor für die Effizienz des Prime Editing könnte also die Effizienz des Eindringens in den 3'- Flap der endogenen DNA und die anschließende Verdrängung und Ersetzung des 5'-Flap- Strangs sein. Außerdem wird durch die erfolgreiche Invasion des 3'-Flaps und die Entfernung des 5'-Flaps der Schnitt nur auf einem Strang des doppelsträngigen DNA-Genoms durchgeführt. Die dauerhafte Integration der Editierung erfordert eine zelluläre DNA- Reparatur, um den nicht editierten, komplementären DNA-Strang zu ersetzen, wobei der editierte Strang als Template dient. Während die Zelle dazu gebracht werden kann, den Ersatz des nicht editierten Strangs gegenüber dem editierten Strang (Schritt 4 oben) durch Einführung einer Kerbe in den nicht editierten Strang neben der Editierung unter Verwendung einer sekundären sgRNA (dem PE3-System) zu begünstigen, beruht dieser Prozess immer noch auf einer zweiten Stufe der DNA-Reparatur. Diese DNA-Reparaturschritte können besonders ineffizient sein, wenn lange 5'- und 3'-Flap-Intermediate ausgeglichen werden müssen oder lange nicht-homologe Regionen enthalten, wie z. B. lange Insertionen oder lange Deletionen. Weitere Entwicklungen im Bereich Prime Editing würden die Technik voranbringen.
  • Unter verschiedenen Aspekten beschreibt diese Spezifikation ein Multi-Flap-Prime- Editing-System (einschließlich z. B. Dual-Prime-Editing-Systemen und Quadruple-Prime- Editing-Systemen), das die mit der Flap-Äquilibrierung und dem anschließenden Einbau des Edits in den nicht-editierten komplementären genomischen DNA-Strang verbundenen Herausforderungen angeht, indem es beide DNA-Stränge gleichzeitig editiert. Beim Dual- Flap-Prime-Editing-System zum Beispiel werden zwei pegRNAs verwendet, um gegensätzliche Stränge einer genomischen Stelle anzusteuern und die Synthese von zwei komplementären 3'-Flaps zu steuern, die die editierte DNA-Sequenz enthalten (91). Im Gegensatz zum klassischen Prime Editing muss das Paar der editierten DNA-Stränge (3'-Flaps) nicht direkt mit den 5'-Flaps der endogenen genomischen DNA konkurrieren, da stattdessen der komplementäre editierte Strang für die Hybridisierung zur Verfügung steht. Da beide Stränge des Duplex als editierte DNA synthetisiert werden, erübrigt sich beim Dual-Flap- Prime-Editing-System der Austausch des nicht-editierten komplementären DNA-Strangs, der beim klassischen Prime-Editing erforderlich ist. Stattdessen muss die zelluläre DNA- Reparaturmaschinerie nur die gepaarten 5'-Flaps (ursprüngliche genomische DNA) herausschneiden und die gepaarten 3'-Flaps (bearbeitete DNA) in den Locus einbinden. Daher besteht auch keine Notwendigkeit, in die neu synthetisierten DNA-Stränge Sequenzen aufzunehmen, die homolog zur genomischen DNA sind. Dies ermöglicht eine selektive Hybridisierung der neuen Stränge und erleichtert Bearbeitungen, die eine minimale genomische Homologie enthalten. Nuklease-aktive Versionen von Prime-Editoren, die beide Stränge der DNA schneiden, könnten ebenfalls verwendet werden, um die Entfernung der ursprünglichen DNA-Sequenz zu beschleunigen. Das Quadruple-Flap-Prime-Editing-System, das vier pegRNAs verwendet, bietet ähnliche Vorteile.
  • Wie das klassische Prime Editing ist das Multi-Flap-Prime-Editing ein vielseitiges und präzises Genom-Editing-Verfahren, bei der neue genetische Informationen direkt in eine bestimmte DNA-Stelle geschrieben werden, indem ein mit Nukleinsäure programmierbares DNA-Bindungsprotein („napDNAbp“) in Verbindung mit einer Polymerase (d. h., in Form eines Fusionsproteins oder auf andere Weise in Verbindung mit dem napDNAbp), wobei das Prime-Editing-System mit einer Prime-Editing-(PE)-Guide-RNA („PEgRNA“) programmiert ist, die sowohl die Zielstelle spezifiziert als auch die Synthese des gewünschten Schnitts in Form eines Ersatz-DNA-Strangs durch eine auf eine Guide-RNA (z. B. am 5'- oder 3'-Ende oder an einem internen Teil einer Guide-RNA) aufgebrachte Verlängerung (entweder DNA oder RNA) vorgibt. Der Ersatzstrang, der den gewünschten Schnitt (z. B. eine einzelne Nukleobase Substitution) enthält, hat die gleiche Sequenz wie der endogene Strang der zu editierenden Zielstelle (mit der Ausnahme, dass er die gewünschte Editierung enthält). Durch die DNA-Reparatur- und/oder Replikationsmaschinerie wird der körpereigene Strang der Zielstelle durch den neu synthetisierten Ersatzstrang, der die gewünschte Editierung enthält, ersetzt. In einigen Fällen kann das Prime Editing als eine „Suchen-und-Ersetzen“-Technologie zur Genom-Editierung angesehen werden, da die Prime Editors, wie hier beschrieben, nicht nur die gewünschte zu editierende Zielstelle suchen und lokalisieren, sondern gleichzeitig einen Ersatzstrang kodieren, der eine gewünschte Editierung enthält und anstelle des entsprechenden endogenen DNA-Strangs der Zielstelle installiert wird.
  • Die Multi-Flap-Prime-Editoren der vorliegenden Erfindung beruhen zum Teil auf der Entdeckung, dass der Mechanismus der Target-Primed Reverse Transcription (TPRT) oder des „Prime Editing“ für die Durchführung von präzisem CRISPR/Cas-basiertem Genom-Editing mit hoher Effizienz und genetischer Flexibilität genutzt oder angepasst werden kann (z. B. wie in verschiedenen Ausführungsformen der 1A-1F). TPRT wird auf natürliche Weise von mobilen DNA-Elementen wie Nicht-LTR-Retrotransposons von Säugetieren und bakteriellen Introns28,29 der Gruppe II verwendet. Die Erfinder haben Cas-Protein-Reverse-Transkriptase- Fusionen oder verwandte Systeme verwendet, um eine spezifische DNA-Sequenz mit einer Guide-RNA anzusteuern, einen Einzelstrang-Nick an der Zielstelle zu erzeugen und die eingenickte DNA als Primer für die reverse Transkription einer konstruierten Reverse- Transkriptase-Template zu verwenden, die mit der Guide-RNA integriert ist. Während das Konzept jedoch mit Prime-Editoren beginnt, die reverse Transkriptasen als DNA-Polymerase- Komponente verwenden, sind die hier beschriebenen Multi-Flap-Prime-Editoren nicht auf reverse Transkriptasen beschränkt, sondern können die Verwendung praktisch jeder DNA- Polymerase umfassen. Auch wenn in der Anmeldung durchgehend von Multi-Flap-Prime- Editoren mit „reversen Transkriptasen“ die Rede ist, wird hier dargelegt, dass reverse Transkriptasen nur eine Art von DNA-Polymerase sind, die mit Multi-Flap-Prime-Editoren arbeiten kann. Wenn also in der Spezifikation von „reversen Transkriptasen“ die Rede ist, sollte der Fachmann wissen, dass jede geeignete DNA-Polymerase anstelle der reversen Transkriptase verwendet werden kann. So können die Multi-Flap-Prime-Editoren in einem Aspekt Cas9 (oder ein äquivalentes napDNAbp) umfassen, das so programmiert ist, dass es eine DNA-Sequenz anvisiert, indem es sie mit einer spezialisierten Führungs-RNA (d. h. pegRNA) assoziiert, die eine Spacer-Sequenz enthält, die sich an ein Komplement einer Protospacer-Sequenz in der Ziel-DNA anlagert. Die spezialisierte Guide-RNA enthält auch neue genetische Informationen in Form einer Erweiterung, die für einen Ersatz-DNA-Strang kodiert, der eine gewünschte genetische Veränderung enthält und dazu dient, einen entsprechenden endogenen DNA-Strang an der Zielstelle zu ersetzen. Um die Information von der pegRNA auf die Ziel-DNA zu übertragen, beinhaltet der Mechanismus des Multi-Flap Prime Editing das Einkerben der Zielstelle in einem Strang der DNA, um eine 3'- Hydroxylgruppe freizulegen. Die freiliegende 3'-Hydroxylgruppe kann dann dazu verwendet werden, die DNA-Polymerisation der edit-codierenden Erweiterung der pegRNA direkt an der Zielstelle zu starten. In verschiedenen Ausführungsformen kann die Erweiterung, die die Matrize für die Polymerisation des die Editierung enthaltenden Ersatzstrangs bereitstellt, aus RNA oder DNA gebildet sein. Im Falle einer RNA-Erweiterung kann die Polymerase des Prime Editors eine RNA-abhängige DNA-Polymerase sein (z.B. eine reverse Transkriptase). Im Falle einer DNA-Erweiterung kann die Polymerase des Prime Editors eine DNA-abhängige DNA-Polymerase sein.
  • Beim klassischen Prime-Editing wäre der neu synthetisierte Strang (d. h. der Ersatz- DNA-Strang, der den gewünschten Edit enthält), der durch die hierin offenbarten Prime- Editoren gebildet wird, homolog zur genomischen Zielsequenz (d. h. er hätte die gleiche Sequenz wie diese), mit Ausnahme der Aufnahme einer gewünschten Nukleotidänderung (z. B. eine einzelne Nukleotidänderung, eine Deletion oder eine Insertion oder eine Kombination davon). Der neu synthetisierte (oder ersetzte) DNA-Strang kann auch als Einzelstrang-DNA- Flap bezeichnet werden, der mit dem komplementären homologen endogenen DNA-Strang um die Hybridisierung konkurriert und dadurch den entsprechenden endogenen Strang verdrängt. In bestimmten Ausführungsformen kann das System mit der Verwendung eines fehleranfälligen Enzyms der Reversen Transkriptase kombiniert werden (z. B. als Fusionsprotein mit der Cas9-Domäne oder in trans mit der Cas9-Domäne). Das fehleranfällige Enzym Reverse Transkriptase kann während der Synthese der einzelsträngigen DNA-Flap Veränderungen einführen. So kann in bestimmten Ausführungsformen eine fehleranfällige reverse Transkriptase verwendet werden, um Nukleotidveränderungen in die Ziel-DNA einzuführen. Je nach der fehleranfälligen reversen Transkriptase, die mit dem System verwendet wird, können die Veränderungen zufällig oder nicht zufällig sein.
  • Beim klassischen Prime Editing kann die Auflösung des hybridisierten Zwischenprodukts (bestehend aus dem von der reversen Transkriptase synthetisierten einzelsträngigen DNA-Flap, der an den endogenen DNA-Strang hybridisiert wurde) die Entfernung des resultierenden verdrängten Flaps der endogenen DNA (z. B. mit einer 5'-End- DNA-Flap-Endonuklease, FEN1), die Ligation des synthetisierten einzelsträngigen DNA- Flaps an die Ziel-DNA und die Assimilation der gewünschten Nukleotidveränderung als Ergebnis der zellulären DNA-Reparatur- und/oder Replikationsprozesse umfassen. Da die Template-gestützte DNA-Synthese eine nukleotidgenaue Modifikation jedes beliebigen Nukleotids, einschließlich Insertionen und Deletionen, ermöglicht, ist der Anwendungsbereich dieses Ansatzes sehr breit gefächert und könnte vorhersehbar für unzählige Anwendungen in der Grundlagenforschung und in der Therapeutik genutzt werden.
  • In einigen Aspekten stellt die Spezifikation ein Paar von Prime-Editoren bereit, die jeweils ein Nukleinsäure-programmierbares DNA-Bindungsprotein (napDNAbp) und eine DNA-Polymerase umfassen. In einigen Ausführungsformen ist jeder Prime Editor in der Lage, die Genom-Editierung durch zielgerichtete, reverse Transkription in Anwesenheit einer erweiterten Guide-RNA durchzuführen.
  • In einigen Aspekten stellt die Spezifikation ein Paar von Prime Editors bereit, die jeweils ein Nukleinsäure-programmierbares DNA-Bindungsprotein (napDNAbp) und eine DNA-Polymerase umfassen, wobei die DNA-Polymerase in trans mit dem napDNAbp bereitgestellt wird. In verschiedenen Ausführungsformen ist jeder Prime Editor in der Lage, die Genom-Editierung durch zielgerichtete, reverse Transkription in Anwesenheit einer erweiterten Guide-RNA durchzuführen.
  • In einigen Aspekten stellt die Spezifikation ein Paar von Prime Editors bereit, die jeweils ein Nukleinsäure-programmierbares DNA-Bindungsprotein (napDNAbp) und eine reverse Transkriptase umfassen. In verschiedenen Ausführungsformen ist jeder Prime Editor in der Lage, die Genom-Editierung durch zielgerichtete, reverse Transkription in Anwesenheit einer erweiterten Guide-RNA durchzuführen.
  • In einigen Aspekten stellt die Spezifikation ein Paar von Prime Editors bereit, die jeweils ein Nukleinsäure-programmierbares DNA-Bindungsprotein (napDNAbp) und eine reverse Transkriptase umfassen, wobei die reverse Transkriptase in trans mit dem napDNAbp bereitgestellt wird. In verschiedenen Ausführungsformen ist jeder Prime Editor in der Lage, die Genom-Editierung durch zielgerichtete, reverse Transkription in Anwesenheit einer erweiterten Guide-RNA durchzuführen.
  • In bestimmten Ausführungsformen weist das napDNAbp eine Nickase-Aktivität auf. Das napDNAbp kann auch ein Cas9-Protein oder ein funktionelles Äquivalent davon sein, wie ein Nuklease-aktives Cas9, ein Nuklease-inaktives Cas9 (dCas9) oder eine Cas9-Nickase (nCas9).
  • In bestimmten Ausführungsformen wird das napDNAbp ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Cas9, Cas12e, Cas12d, Cas12a, Cas12b1, Cas13a, Cas12c und Argonaute und weist optional eine Nickase-Aktivität auf.
  • In anderen Ausführungsformen ist jeder Prime Editor der dualen Prime Editors in der Lage, sich an eine Ziel-DNA-Sequenz zu binden, wenn er mit einer erweiterten Guide-RNA komplexiert ist.
  • In noch anderen Ausführungsformen umfasst die Ziel-DNA-Sequenz einen Zielstrang und einen komplementären Nicht-Zielstrang.
  • In anderen Ausführungsformen bildet die Bindung des Prime Editors an die erweiterte Guide-RNA eine R-Schleife. Die R-Schleife kann (i) ein RNA-DNA-Hybrid, das die erweiterte Guide-RNA und den Zielstrang umfasst, und (ii) den komplementären Nicht- Zielstrang umfassen.
  • In noch anderen Ausführungsformen wird der komplementäre Nicht-Zielstrang eingenickt, um eine Priming-Sequenz der reversen Transkriptase mit einem freien 3'-Ende zu bilden.
  • In verschiedenen Ausführungsformen umfasst die erweiterte Guide-RNA (a) eine Guide-RNA und (b) eine RNA-Erweiterung am 5'- oder 3'-Ende der Guide-RNA oder an einer intramolekularen Stelle in der Guide-RNA. Die RNA-Verlängerung kann (i) eine Reverse- Transkriptions-Matrizen-Sequenz mit einer gewünschten Nukleotidänderung, (ii) eine Bindungsstelle für einen Reverse-Transkriptions-Primer und (iii) gegebenenfalls eine Linker- Sequenz umfassen. In verschiedenen Ausführungsformen kann die Matrizensequenz für die reverse Transkription einen einzelsträngigen DNA-Flap kodieren, der komplementär zu einer endogenen DNA-Sequenz neben der Einstichstelle ist, wobei der einzelsträngige DNA-Flap die gewünschte Nukleotidveränderung umfasst.
  • In verschiedenen Ausführungsformen beträgt die RNA-Erweiterung mindestens 5 Nukleotide, mindestens 6 Nukleotide, mindestens 7 Nukleotide, mindestens 8 Nukleotide, mindestens 9 Nukleotide, mindestens 10 Nukleotide, mindestens 11 Nukleotide, mindestens 12 Nukleotide, mindestens 13 Nukleotide, mindestens 14 Nukleotide, mindestens 15 Nukleotide, mindestens 16 Nukleotide, mindestens 17 Nukleotide, mindestens 18 Nukleotide, mindestens 19 Nukleotide, mindestens 20 Nukleotide, mindestens 21 Nukleotide, mindestens 22 Nukleotide, mindestens 23 Nukleotide, mindestens 24 Nukleotide oder mindestens 25 Nukleotide.
  • In noch anderen Ausführungsformen kann der Einzelstrang-DNA-Flap mit der endogenen DNA-Sequenz neben der Einstichstelle hybridisieren und so die gewünschte Nukleotidveränderung bewirken. In noch anderen Ausführungsformen verdrängt der einzelsträngige DNA-Flap die endogene DNA-Sequenz, die an die Einkerbstelle angrenzt und ein freies 5'-Ende hat. In bestimmten Ausführungsformen wird die verdrängte endogene DNA mit dem 5'-Ende von der Zelle ausgeschnitten.
  • In verschiedenen Ausführungsformen führt die zelluläre Reparatur des Einzelstrang- DNA-Flaps zum Einbau der gewünschten Nukleotidveränderung, wodurch ein gewünschtes Produkt entsteht.
  • In verschiedenen anderen Ausführungsformen wird die gewünschte Nukleotidänderung in einem Editierfenster integriert, das zwischen etwa -4 und +10 der PAM-Sequenz liegt.
  • In wieder anderen Ausführungsformen wird die gewünschte Nukleotidänderung in einem Editierfenster integriert, das zwischen etwa -5 bis +5 der Einkerbungsstelle, oder zwischen etwa -10 bis +10 der Einkerbungsstelle, oder zwischen etwa -20 bis +20 der Einkerbungsstelle, oder zwischen etwa -30 bis +30 der Einkerbungsstelle, oder zwischen etwa -40 bis +40 der Einkerbungsstelle, oder zwischen etwa -50 bis +50 der Einkerbungsstelle, oder zwischen etwa -60 bis +60 der Einkerbungsstelle, oder zwischen etwa -70 bis +70 der Einkerbungsstelle, oder zwischen etwa -80 bis +80 der Einkerbungsstelle, oder zwischen etwa -90 bis +90 der Einkerbungsstelle, oder zwischen etwa -100 bis +100 der Einkerbungsstelle, oder zwischen etwa -200 bis +200 der Einkerbungsstelle liegt.
  • In verschiedenen Ausführungsformen umfassen die napDNAbp der Dual Prime Editors jeweils eine Aminosäuresequenz der SEQ-ID-NR.: 18. In verschiedenen anderen Ausführungsformen umfasst das napDNAbp eine Aminosäuresequenz, die zu mindestens 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % oder 99 % mit der Aminosäuresequenz einer der SEQ-ID- Nummern identisch ist: 26-39, 42-61, 75-76, 126, 130, 137, 141, 147, 153, 157, 445, 460, 467 und 482-487 (Cas9); SEQ-ID-NR.: 77-86 (CP-Cas9); SEQ-ID-NR.: 18-25 und 87-88 (SPCas9) und SEQ-ID-Nummern: 62-72(Cas12)
  • In anderen Ausführungsformen kann die reverse Transkriptase der offengelegten Prime Editors und/oder Zusammensetzungen der dualen Prime Editors eine der Aminosäuresequenzen der SEQ-ID-Nummern umfassen: 89-100, 105-122, 128-129, 132, 139, 143, 149, 154, 159, 235, 454, 471, 516, 662, 700-716, 739-742 und 766. In wieder anderen Ausführungsformen kann die reverse Transkriptase eine Aminosäuresequenz umfassen, die zu mindestens 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % oder 99 % mit der Aminosäuresequenz einer der SEQ-ID-Nummern identisch ist: 89-100, 105-122, 128-129, 132, 139, 143, 149, 154, 159, 235, 454, 471, 516, 662, 700-716, 739-742 und 766. Bei diesen Sequenzen kann es sich um natürlich vorkommende, reverse Transkriptase-Sequenzen handeln, z. B. von einem Retrovirus oder einem Retrotransposon, oder um rekombinante Sequenzen.
  • In verschiedenen anderen Ausführungsformen können die Prime Editors der hier offenbarten dualen Prime Editors verschiedene strukturelle Konfigurationen aufweisen. Zum Beispiel kann in Ausführungsformen, in denen die Prime Editors als Fusionsprotein bereitgestellt werden, jedes der dualen Prime Editor-Fusionsproteine die Struktur NH2- [napDNAbp]-[reverse Transkriptase]-COOH; oder NH2-[reverse Transkriptase]- [napDNAbp]-COOH umfassen, wobei jedes „]-[" das Vorhandensein einer optionalen Linker- Sequenz anzeigt.
  • In verschiedenen Ausführungsformen umfasst die Linker-Sequenz eine Aminosäuresequenz der SEQ-ID-Nummern: 127, 165-176, 446, 453 und 767-769, oder eine Aminosäuresequenz, die zu mindestens 80 %, 85 %, 90 %, 95 % oder 99 % mit einer der Linker-Aminosäuresequenzen der SEQ-ID-Nummern identisch ist: 127, 165-176, 446, 453 und 767-769.
  • In verschiedenen Ausführungsformen kann die gewünschte Nukleotidänderung, die in die Ziel-DNA eingebaut wird, eine einzelne Nukleotidänderung (z. B. eine Transition oder Transversion), eine Insertion von einem oder mehreren Nukleotiden oder eine Deletion von einem oder mehreren Nukleotiden sein.
  • In bestimmten Fällen ist die Insertion mindestens 1, mindestens 2, mindestens 3, mindestens 4, mindestens 5, mindestens 6, mindestens 7, mindestens 8, mindestens 9, mindestens 10, mindestens 11, mindestens 12, mindestens 13, mindestens 14, mindestens 15, mindestens 16, mindestens 17, mindestens 18, mindestens 19, mindestens 20, mindestens 30, mindestens 40, mindestens 50, mindestens 60, mindestens 70, mindestens 80, mindestens 90, mindestens 100, mindestens 200, mindestens 300, mindestens 400 oder mindestens 500 Nukleotide lang.
  • In bestimmten anderen Fällen ist die Deletion mindestens 1, mindestens 2, mindestens 3, mindestens 4, mindestens 5, mindestens 6, mindestens 7, mindestens 8, mindestens 9, mindestens 10, mindestens 11, mindestens 12, mindestens 13, mindestens 14, mindestens 15, mindestens 16, mindestens 17, mindestens 18, mindestens 19, mindestens 20, mindestens 30, mindestens 40, mindestens 50, mindestens 60, mindestens 70, mindestens 80, mindestens 90, mindestens 100, mindestens 200, mindestens 300, mindestens 400 oder mindestens 500 Nukleotide lang.
  • In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine erweiterte Guide-RNA bereit, die eine Guide-RNA und mindestens eine RNA-Erweiterung umfasst. Die RNA- Erweiterung kann am 3'-Ende der Guide-RNA positioniert werden. In anderen Ausführungsformen kann die RNA-Erweiterung am 5' der Guide-RNA positioniert werden. In noch anderen Ausführungsformen kann die RNA-Erweiterung an einer intramolekularen Position innerhalb der Guide-RNA positioniert werden. Vorzugsweise stört die intramolekulare Positionierung des erweiterten Abschnitts jedoch nicht die Funktion des Protospacers.
  • In verschiedenen Ausführungsformen ist die erweiterte Guide-RNA in der Lage, an eine napDNAbp zu binden und die napDNAbp zu einer Ziel-DNA-Sequenz zu lenken. Die Ziel-DNA-Sequenz kann einen Zielstrang und einen komplementären Nicht-Zielstrang umfassen, wobei die Guide-RNA mit dem Zielstrang hybridisiert, um ein RNA-DNA-Hybrid und eine R-Schleife zu bilden.
  • In verschiedenen Ausführungsformen der erweiterten Guide-RNA kann die mindestens eine RNA-Erweiterung eine Template-Sequenz für die reverse Transkription umfassen. In verschiedenen anderen Ausführungsformen kann die RNA-Erweiterung außerdem eine Bindungsstelle für einen Primer für die reverse Transkription enthalten. In noch weiteren Ausführungsformen kann die RNA-Erweiterung eine Linker- oder Spacer-Sequenz umfassen, die die RNA-Erweiterung mit der Guide-RNA verbindet.
  • In verschiedenen Ausführungsformen kann die RNA-Erweiterung mindestens 5 Nukleotide, mindestens 6 Nukleotide, mindestens 7 Nukleotide, mindestens 8 Nukleotide, mindestens 9 Nukleotide, mindestens 10 Nukleotide, mindestens 11 Nukleotide, mindestens 12 Nukleotide, mindestens 13 Nucleotide, mindestens 14 Nucleotide, mindestens 15 Nucleotide, mindestens 16 Nucleotide, mindestens 17 Nucleotide, mindestens 18 Nucleotide, mindestens 19 Nucleotide, mindestens 20 Nucleotide, mindestens 21 Nucleotide, mindestens 22 Nucleotide, mindestens 23 Nucleotide, mindestens 24 Nucleotide, mindestens 25 Nucleotide, mindestens 30 Nucleotide, mindestens 40 Nucleotide, mindestens 50 Nucleotide, mindestens 60 Nucleotide, mindestens 70 Nucleotide, mindestens 80 Nukleotide, mindestens 90 Nukleotide, mindestens 100 Nukleotide, mindestens 150 Nukleotide, mindestens 200 Nukleotide, mindestens 300 Nukleotide, mindestens 400 Nukleotide oder mindestens 500 Nukleotide lang sein.
  • In anderen Ausführungsformen ist die Sequenz der reversen Transkription mindestens 3 Nukleotide, mindestens 4 Nukleotide, mindestens 5 Nukleotide, mindestens 6 Nukleotide, mindestens 7 Nukleotide, mindestens 8 Nukleotide, mindestens 9 Nukleotide, mindestens 10 Nukleotide, mindestens 11 Nukleotide, mindestens 12 Nukleotide, mindestens 13 Nukleotide, mindestens 14 Nukleotide, mindestens 15 Nukleotide, mindestens 16 Nukleotide, mindestens 17 Nucleotide, mindestens 18 Nucleotide, mindestens 19 Nucleotide, mindestens 20 Nucleotide, mindestens 30 Nucleotide, mindestens 40 Nucleotide, mindestens 50 Nucleotide, mindestens 60 Nucleotide, mindestens 70 Nukleotide, mindestens 80 Nukleotide, mindestens 90 Nukleotide, mindestens 100 Nukleotide, mindestens 200 Nukleotide, mindestens 300 Nukleotide, mindestens 400 Nukleotide oder mindestens 500 Nukleotide lang.
  • In wiederum anderen Ausführungsformen beträgt die Sequenzlänge der Bindungsstelle des Primers für die reverse Transkription mindestens 3 Nukleotide, mindestens 4 Nukleotide, mindestens 5 Nukleotide, mindestens 6 Nukleotide, mindestens 7 Nukleotide, mindestens 8 Nukleotide, mindestens 9 Nukleotide, mindestens 10 Nukleotide, mindestens 11 Nukleotide, mindestens 12 Nukleotide, mindestens 13 Nukleotide, mindestens 14 Nukleotide, mindestens 15 Nukleotide, mindestens 16 Nukleotide, mindestens 17 Nucleotide, mindestens 18 Nucleotide, mindestens 19 Nucleotide, mindestens 20 Nucleotide, mindestens 30 Nucleotide, mindestens 40 Nucleotide, mindestens 50 Nucleotide, mindestens 60 Nucleotide, mindestens 70 Nukleotide, mindestens 80 Nukleotide, mindestens 90 Nukleotide, mindestens 100 Nukleotide, mindestens 200 Nukleotide, mindestens 300 Nukleotide, mindestens 400 Nukleotide oder mindestens 500 Nukleotide.
  • In anderen Ausführungsformen umfasst die optionale Länge der Linker-Sequenz oder Spacer-Sequenz mindestens 3 Nukleotide, mindestens 4 Nukleotide, mindestens 5 Nukleotide, mindestens 6 Nukleotide, mindestens 7 Nukleotide, mindestens 8 Nukleotide, mindestens 9 Nukleotide, mindestens 10 Nukleotide, mindestens 11 Nukleotide, mindestens 12 Nukleotide, mindestens 13 Nukleotide, mindestens 14 Nukleotide, mindestens 15 Nukleotide, mindestens 16 Nukleotide, mindestens 17 Nucleotide, mindestens 18 Nucleotide, mindestens 19 Nucleotide, mindestens 20 Nucleotide, mindestens 30 Nucleotide, mindestens 40 Nucleotide, mindestens 50 Nucleotide, mindestens 60 Nucleotide, mindestens 70 Nukleotide, mindestens 80 Nukleotide, mindestens 90 Nukleotide, mindestens 100 Nukleotide, mindestens 200 Nukleotide, mindestens 300 Nukleotide, mindestens 400 Nukleotide oder mindestens 500 Nukleotide.
  • In verschiedenen Ausführungsformen der erweiterten Guide-RNAs kann die Matrizensequenz für die reverse Transkription einen einzelsträngigen DNA-Flap kodieren, der komplementär zu einer endogenen DNA-Sequenz ist, die an eine Bruchstelle angrenzt, wobei der einzelsträngige DNA-Flap eine gewünschte Nukleotidveränderung aufweist. Der einzelsträngige DNA-Flap kann eine körpereigene, einzelsträngige DNA an der Bruchstelle verdrängen. Die verdrängte endogene Einzelstrang-DNA an der Bruchstelle kann ein 5'-Ende haben und einen endogenen Flap bilden, der von der Zelle abgeschnitten werden kann. In verschiedenen Ausführungsformen kann die Exzision des endogenen 5'-Flaps dazu beitragen, die Produktbildung voranzutreiben, da die Entfernung des endogenen 5'-Flaps die Hybridisierung des einzelsträngigen 3'-DNA-Flaps mit dem entsprechenden komplementären DNA-Strang und die Inkorporation oder die Assimilation der gewünschten Nukleotidänderung, die der einzelsträngige 3'-DNA-Flap trägt, in die Ziel-DNA fördert.
  • In verschiedenen Ausführungsformen der erweiterten Guide-RNAs führt die zelluläre Reparatur des Einzelstrang-DNA-Flaps zur Integration der gewünschten Nukleotidveränderung, wodurch ein gewünschtes Produkt entsteht.
  • In bestimmten Ausführungsformen umfasst die pegRNA die Nukleotidsequenz der SEQ-ID-Nummern: 101-104, 181-183, 223-234, 237-244, 277, 324-330, 332, 334, 336, 338, 340, 342, 344, 346, 348, 350, 352, 354, 356, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 394, 429-442, 499-505, 641-649, 678-692, 735-736, 757-761, 776-777, 2997-3103, 3113- 3121, 3305-3455, 3479-3493, 3522-3540, 3549-3556, 3628-3698, 3755-3810, 3874, 3890- 3901, 3905-3911, 3913-3929 und 3972-3989 oder eine Nukleotidsequenz mit mindestens 85 %, mindestens 90 %, mindestens 95 %, mindestens 98 % oder mindestens 99 % Sequenzidentität mit einer der SEQ-ID-Nummern: 101-104, 181-183, 223-234, 237-244, 277, 324-330, 332, 334, 336, 338, 340, 342, 344, 346, 348, 350, 352, 354, 356, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 394, 429-442, 499-505, 641-649, 678-692, 735-736, 757-761, 776-777, 2997-3103, 3113-3121, 3305-3455, 3479-3493, 3522-3540, 3549-3556, 3628-3698, 3755-3810, 3874, 3890-3901, 3905-3911, 3913-3929 und 3972-3989.
  • In einem weiteren Aspekt der Erfindung sieht die Spezifikation Komplexe vor, die einen hierin beschriebenen Prime Editor und jede oben beschriebene erweiterte Guide-RNA umfassen.
  • In wiederum anderen Aspekten der Erfindung stellt die Spezifikation einen Komplex bereit, der ein napDNAbp und eine erweiterte Guide-RNA umfasst. Das napDNAbp kann eine Cas9-Nickase oder eine Aminosäuresequenz der SEQ-ID-Nummern sein: 42-57 (Cas9- Nickase) und 65 (AsCas12A-Nickase) oder eine Aminosäuresequenz, die mindestens 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % oder 99 % identisch mit der Aminosäuresequenz einer der SEQ-ID- Nummern ist: 42-57 (Cas9-Nickase) und 65 (AsCas12A-Nickase).
  • In verschiedenen Ausführungsformen, die einen Komplex beinhalten, ist die erweiterte Guide-RNA in der Lage, die napDNAbp zu einer Ziel-DNA-Sequenz zu lenken. In verschiedenen Ausführungsformen kann eine reverse Transkriptase in trans bereitgestellt werden, d.h. aus einer anderen Quelle als der Komplex selbst. Zum Beispiel könnte eine reverse Transkriptase derselben Zelle mit dem Komplex zugeführt werden, indem ein separater Vektor eingeführt wird, der die reverse Transkriptase separat kodiert.
  • In einem anderen Aspekt stellt die Erfindung ein System bereit, das einen ersten und einen zweiten Prime-Editor-Komplex umfasst, wobei jeder Komplex einen Prime Editor und eine Prime-Editing-Guide-RNA (pegRNA) umfasst. In einigen Ausführungsformen umfasst jeder Prime Editor ein Nukleinsäure-programmierbares DNA-Bindungsprotein (napDNAbp) und ein Polypeptid mit einer RNA-abhängigen DNA-Polymerase-Aktivität, und jede pegRNA umfasst eine Spacer-Sequenz, einen gRNA-Kern, eine DNA-Synthese-Template und eine Primer-Bindungsstelle. In bestimmten Ausführungsformen kodiert jede DNA-Synthese- Template eine einzelsträngige DNA-Sequenz, die einen editierten Abschnitt umfasst. Zwei einzelsträngige DNA-Sequenzen, die kodiert werden, können komplementär zueinander sein und einen Duplex bilden, der in die zu editierende Zielstelle integriert wird. In einigen Ausführungsformen können die beiden kodierten einzelsträngigen DNA-Sequenzen eine Region der Komplementarität zueinander umfassen. In bestimmten Ausführungsformen können die beiden kodierten einzelsträngigen DNA-Sequenzen einen Bereich der Komplementarität zueinander umfassen, der mindestens 2 bp, mindestens 3 bp, mindestens 4 bp, mindestens 5 bp, mindestens 10 bp, mindestens 20 bp, mindestens 30 bp, mindestens 40 bp, mindestens 50 bp, mindestens 100 bp, mindestens 200 bp, mindestens 300 bp, mindestens 400 bp, mindestens 500 bp, mindestens 600 bp, mindestens 700 bp, mindestens 800 bp, mindestens 900 bp oder mindestens 1000 bp lang ist. In einigen Ausführungsformen wird der Prime Editor als Fusionsprotein bereitgestellt. In bestimmten Ausführungsformen werden die Komponenten des Prime Editors (d. h. das napDNAbp und das Polypeptid mit einer RNA-abhängigen DNA-Polymerase-Aktivität) in trans bereitgestellt.
  • In einem anderen Aspekt stellt die Erfindung ein System bereit, das einen ersten, einen zweiten, einen dritten und einen vierten Prime-Editor-Komplex umfasst, wobei jeder Komplex einen Prime Editor und eine Prime-Editing-Guide-RNA (pegRNA) umfasst. In einigen Ausführungsformen umfasst jeder Prime Editor ein Nukleinsäure-programmierbares DNA- Bindungsprotein (napDNAbp) und ein Polypeptid mit einer RNA-abhängigen DNA- Polymerase-Aktivität, und jede pegRNA umfasst eine Spacer-Sequenz, einen gRNA-Kern, eine DNA-Synthese-Template und eine Primer-Bindungsstelle. In bestimmten Ausführungsformen kodiert jede DNA-Synthese-Template eine einzelsträngige DNA- Sequenz, die einen editierten Abschnitt umfasst. Zwei einzelsträngige DNA-Sequenzen, die kodiert werden, können komplementär zueinander sein und einen Duplex bilden, der in die zu editierende Zielstelle integriert wird. In einigen Ausführungsformen können die beiden kodierten einzelsträngigen DNA-Sequenzen eine Region der Komplementarität zueinander umfassen. In bestimmten Ausführungsformen können die beiden kodierten einzelsträngigen DNA-Sequenzen einen Bereich der Komplementarität zueinander umfassen, der mindestens 2 bp, mindestens 3 bp, mindestens 4 bp, mindestens 5 bp, mindestens 10 bp, mindestens 20 bp, mindestens 30 bp, mindestens 40 bp, mindestens 50 bp, mindestens 100 bp, mindestens 200 bp, mindestens 300 bp, mindestens 400 bp, mindestens 500 bp, mindestens 600 bp, mindestens 700 bp, mindestens 800 bp, mindestens 900 bp oder mindestens 1000 bp lang ist. In einigen Ausführungsformen wird der Prime Editor als Fusionsprotein bereitgestellt. In bestimmten Ausführungsformen werden die Komponenten des Prime Editors (d. h. das napDNAbp und das Polypeptid mit einer RNA-abhängigen DNA-Polymerase-Aktivität) in trans bereitgestellt.
  • In einigen Ausführungsformen ist jedes napDNAbp eine Cas9-Domäne oder eine Variante davon. In einigen Ausführungsformen ist jedes napDNAbp eine Nuklease-aktive Cas9-Domäne, eine Nuklease-inaktive Cas9-Domäne oder eine Cas9-Nickase-Domäne oder eine Variante davon. In bestimmten Ausführungsformen ist jedes napDNAbp unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Cas9, Cas12e, Cas12d, Cas12a, Cas12b1, Cas13a, Cas12c und Argonaute und weist optional eine Nickase-Aktivität auf. In verschiedenen Ausführungsformen umfasst jedes napDNAbp eine Aminosäuresequenz mit einer der SEQ-ID-NR.: 2-65, oder eine Aminosäuresequenz, die zu mindestens 80 %, 85 %, 90 %, 95 % oder 99 % mit einer der SEQ-ID-NR.: 2-65 identisch ist.
  • In einigen Ausführungsformen ist das Polypeptid, das eine RNA-abhängige DNA- Polymerase-Aktivität aufweist, eine reverse Transkriptase. In bestimmten Ausführungsformen umfasst das Polypeptid, das eine RNA-abhängige DNA-Polymerase-Aktivität aufweist, eine Aminosäuresequenz mit einer der SEQ-ID-NR.: 37, 68-79, 82-98, 81, 98 und 110 oder eine Aminosäuresequenz, die mindestens 80 %, 85 %, 90 %, 95 % oder 99 % Sequenzidentität mit einer der SEQ-ID-NR: 37, 68-79, 82-98, 81, 98 und 110 hat.
  • In einigen Ausführungsformen kann jeder Prime Editor einen Linker umfassen, der das napDNAbp und die reverse Transkriptase miteinander verbindet. In bestimmten Ausführungsformen umfasst der Linker eine Aminosäuresequenz aus einer der SEQ-ID-NR.: 119-128 oder eine Aminosäuresequenz, die mindestens 80 %, 85 %, 90 %, 95 % oder 99 % Sequenzidentität mit einer der SEQ-ID-NR: 119-128 hat. Jeder Linker kann 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 oder 50 Aminosäuren lang sein.
  • In einigen Ausführungsformen kann jede pegRNA unabhängig voneinander eine Nukleotidsequenz aus einer der SEQ-ID-NR.: 192-203 oder eine Nukleotidsequenz umfassen, die mindestens 80 %, 85 %, 90 %, 95 % oder 99 % Sequenzidentität mit einer der SEQ-ID- NR: 192-203 hat.
  • In verschiedenen Ausführungsformen kann jede Spacer-Sequenz jeder pegRNA an eine spezifische Bindungsstelle der doppelsträngigen DNA-Sequenz neben der zu editierenden Zielstelle binden. In einigen Ausführungsformen führt die Bindung einer Spacer-Sequenz eines Prime-Editor-Komplexes an einen Strang der doppelsträngigen DNA-Sequenz und die Bindung einer Spacer-Sequenz eines anderen Prime-Editor-Komplexes an den gegenüberliegenden Strang der doppelsträngigen DNA-Sequenz zum Einkerben beider DNA- Stränge an einer Bruchstelle proximal zu den PAM-Sequenzen auf jedem Strang.
  • In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung Polynukleotide zur Verfügung. In einigen Ausführungsformen können die Polynukleotide für jeden der hier beschriebenen Komplexe kodieren. In bestimmten Ausführungsformen können die Polynukleotide für jede der hier beschriebenen pegRNAs kodieren.
  • In einem weiteren Aspekt stellt die Spezifikation Polynukleotide bereit. In bestimmten Ausführungsformen können die Polynukleotide für jeden der hier offenbarten Prime Editors kodieren. In bestimmten anderen Ausführungsformen können die Polynukleotide für jedes der hier offenbarten napDNAbps kodieren. In wiederum weiteren Ausführungsformen können die Polynukleotide für eine der hierin offenbarten reversen Transkriptasen kodieren. In anderen Ausführungsformen können die Polynukleotide für eine der hierin offenbarten erweiterten Guide-RNAs, für eine der Matrizensequenzen für die reverse Transkription, für eine der Primerstellen für die reverse Transkription oder für eine der optionalen Linker-Sequenzen kodieren.
  • In wiederum anderen Aspekten stellt die Spezifikation Vektoren bereit, die die hier beschriebenen Polynukleotide enthalten. So enthalten die Vektoren in bestimmten Ausführungsformen Polynukleotide zur Kodierung der Prime Editors, die ein napDNAbp und eine reverse Transkriptase (d. h. als Fusionsprotein oder in trans exprimiert) umfassen. In bestimmten Ausführungsformen umfassen die Vektoren Polynukleotide zur Kodierung eines der hier beschriebenen Komplexe. In anderen Ausführungsformen umfassen die Vektoren Polynukleotide, die separat für ein napDNAbp und eine reverse Transkriptase kodieren. In noch anderen Ausführungsformen können die Vektoren Polynukleotide enthalten, die für die erweiterten Guide-RNAs kodieren. In verschiedenen Ausführungsformen können die Vektoren ein oder mehrere Polynukleotide enthalten, die napDNAbps, reverse Transkriptase und erweiterte Guide-RNAs auf denselben oder separaten Vektoren kodieren. In einigen Ausführungsformen umfassen die Vektoren Polynukleotide zur Kodierung einer der hier beschriebenen pegRNAs.
  • In noch anderen Aspekten stellt die Spezifikation Zellen bereit, die einen Prime Editor, wie hier beschrieben, und eine erweiterte Guide-RNA enthalten. Die Zellen können mit den Vektoren transformiert werden, die die Prime Editors, napDNAbps, reverse Transkriptase und erweiterte Guide-RNAs enthalten. Diese genetischen Elemente können auf demselben Vektor oder auf verschiedenen Vektoren enthalten sein. In einigen Ausführungsformen umfassen die Zellen eines der hier beschriebenen Systeme oder Komplexe. Die Zellen können mit Polynukleotiden transformiert werden, die für eines der hierin offenbarten Systeme, Komplexe und/oder pegRNAs kodieren, oder mit Vektoren, die Polynukleotide enthalten, die für eines der hierin offenbarten Systeme, Komplexe oder pegRNAs kodieren.
  • In einem weiteren Aspekt bietet die Spezifikation pharmazeutische Zusammensetzungen. In bestimmten Ausführungsformen umfassen die pharmazeutischen Zusammensetzungen ein oder mehrere napDNAbp, einen Prime Editor, eine reverse Transkriptase und eine erweiterte Guide-RNA. In bestimmten Ausführungsformen umfassen die pharmazeutischen Zusammensetzungen eines der hier beschriebenen Systeme und/oder Komplexe. In bestimmten Ausführungsformen umfassen die pharmazeutischen Zusammensetzungen einen der hier beschriebenen Prime Editors, Systeme oder Komplexe und einen pharmazeutisch akzeptablen Hilfsstoff. In anderen Ausführungsformen umfassen die pharmazeutischen Zusammensetzungen jede hier beschriebene, erweiterte Guide-RNA und einen pharmazeutisch akzeptablen Hilfsstoff. In noch anderen Ausführungsformen umfassen die pharmazeutischen Zusammensetzungen jede hier beschriebene, erweiterte Guide-RNA in Kombination mit jedem hier beschriebenen Prime Editor und einem pharmazeutisch akzeptablen Hilfsstoff. In noch anderen Ausführungsformen umfassen die pharmazeutischen Zusammensetzungen eine beliebige Polynukleotidsequenz, die für einen oder mehrere napDNAbp, einen Prime Editor, eine reverse Transkriptase und eine erweiterte Guide-RNA oder einen der hierin offenbarten Vektoren kodiert. In noch anderen Ausführungsformen können die verschiedenen hier offengelegten Komponenten in eine oder mehrere pharmazeutische Zusammensetzungen getrennt werden. Zum Beispiel kann eine erste pharmazeutische Zusammensetzung einen Prime Editor oder ein napDNAbp, eine zweite pharmazeutische Zusammensetzung eine reverse Transkriptase und eine dritte pharmazeutische Zusammensetzung eine erweiterte Guide-RNA enthalten.
  • Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von Kits. In einer Ausführungsform umfasst das Kit ein oder mehrere Polynukleotide, die eine oder mehrere Komponenten kodieren, einschließlich eines Prime Editors, eines napDNAbp, einer reversen Transkriptase und einer erweiterten Guide-RNA. Die Kits können auch Vektoren, Zellen und isolierte Zubereitungen von Polypeptiden enthalten, einschließlich der hierin offenbarten Prime Editors, napDNAbp oder reversen Transkriptasen.
  • In einem weiteren Aspekt sieht die vorliegende Erfindung Verfahren zur Verwendung der offengelegten Stoffzusammensetzungen vor, einschließlich Verfahren zur Verwendung eines der hierin beschriebenen Systeme zum gleichzeitigen Editieren beider komplementärer Stränge einer doppelsträngigen DNA-Sequenz an einer Zielstelle. In einigen Ausführungsformen umfasst das Verfahren das Inkontaktbringen der doppelsträngigen DNA- Sequenz mit einem der hier offenbarten Systeme.
  • In einer Ausführungsform umfasst das Kit ein oder mehrere Polynukleotide, die eine oder mehrere Komponenten kodieren, einschließlich eines Prime Editors, eines DNA, einer reversen Transkriptase und einer erweiterten Guide-RNA (PEgRNA). In einigen Ausführungsformen umfasst jeder Prime Editor ein Nukleinsäure-programmierbares DNA- Bindungsprotein (napDNAbp) und ein Polypeptid mit einer RNA-abhängigen DNA- Polymerase-Aktivität, und jede pegRNA umfasst eine Spacer-Sequenz, einen gRNA-Kern, eine DNA-Synthese-Template und eine Primer-Bindungsstelle. In einigen Ausführungsformen wird jeder Prime Editor als Fusionsprotein bereitgestellt. In einigen Ausführungsformen werden die Komponenten des Prime Editors in trans bereitgestellt. In bestimmten Ausführungsformen kodiert jede DNA-Synthese-Template eine einzelsträngige DNA- Sequenz, die einen editierten Abschnitt umfasst. Zwei kodierte, einzelsträngige DNA- Sequenzen können komplementär zueinander sein und einen Duplex bilden, der in die zu bearbeitende Zielstelle integriert wird. Die verschiedenen Elemente der Prime-Editor- Komplexe können jede der hier offengelegten Ausführungsformen der Systeme umfassen.
  • In einem anderen Aspekt stellt die Erfindung Verfahren bereit, die das Inkontaktbringen einer doppelsträngigen DNA-Sequenz an einer Zielstelle mit einem ersten, einem zweiten, einem dritten und einem vierten Prime-Editor-Komplex umfassen, wobei jeder Komplex einen Prime Editor und eine Guide-RNA (pegRNA) für das Prime Editing umfasst. In einigen Ausführungsformen umfasst jeder Prime Editor ein Nukleinsäure-programmierbares DNA- Bindungsprotein (napDNAbp) und ein Polypeptid mit einer RNA-abhängigen DNA- Polymerase-Aktivität, und jede pegRNA umfasst eine Spacer-Sequenz, einen gRNA-Kern, eine DNA-Synthese-Template und eine Primer-Bindungsstelle. In einigen Ausführungsformen wird jeder Prime Editor als Fusionsprotein bereitgestellt. In einigen Ausführungsformen werden die Komponenten des Prime Editors in trans bereitgestellt. In bestimmten Ausführungsformen kodiert jede DNA-Synthese-Template eine einzelsträngige DNA- Sequenz. Zwei kodierte, einzelsträngige DNA-Sequenzen können komplementär zueinander sein und einen Duplex bilden, der in die zu bearbeitende Zielstelle integriert wird. Die verschiedenen Elemente der Prime-Editor-Komplexe können jede der hier offengelegten Ausführungsformen der Systeme umfassen.
  • In einigen Ausführungsformen ermöglichen die hier vorgestellten Verfahren die Inversion einer Ziel-DNA-Sequenz. In einigen Ausführungsformen befinden sich die erste einzelsträngige DNA-Sequenz, die von der ersten DNA-Synthese-Template kodiert wird, und die zweite einzelsträngige DNA-Sequenz, die von der zweiten DNA-Synthese-Template kodiert wird, an entgegengesetzten Enden einer Ziel-DNA-Sequenz, und die dritte einzelsträngige DNA-Sequenz, die von der dritten DNA-Synthese-Template kodiert wird, und die vierte einzelsträngige DNA-Sequenz, die von der vierten DNA-Synthese-Template kodiert wird, befinden sich an entgegengesetzten Enden der gleichen Ziel-DNA-Sequenz.
  • In einigen Ausführungsformen umfassen die hier beschriebenen Verfahren außerdem die Bereitstellung eines zirkulären DNA-Donors. In bestimmten Ausführungsformen befinden sich die erste einzelsträngige DNA-Sequenz, die von der ersten DNA-Synthese-Template kodiert wird, und die dritte einzelsträngige DNA-Sequenz, die von der dritten DNA-Synthese- Template kodiert wird, an entgegengesetzten Enden der Ziel-DNA-Sequenz, und die zweite einzelsträngige DNA-Sequenz, die von der zweiten DNA-Synthese-Template kodiert wird, und die vierte einzelsträngige DNA-Sequenz, die von der vierten DNA-Synthese-Template kodiert wird, befinden sich auf dem zirkulären DNA-Donor. In einigen Ausführungsformen ersetzt der Teil des zirkulären DNA-Donors zwischen der zweiten einzelsträngigen DNA- Sequenz und der vierten einzelsträngigen DNA-Sequenz die Ziel-DNA-Sequenz zwischen der ersten einzelsträngigen DNA-Sequenz und der dritten einzelsträngigen DNA-Sequenz.
  • In einigen Ausführungsformen ermöglichen die hier vorgestellten Verfahren die Translokation einer Ziel-DNA-Sequenz von einem ersten Nukleinsäuremolekül (z. B. einem ersten Chromosom) zu einem zweiten Nukleinsäuremolekül (z. B. einem zweiten Chromosom). In einigen Ausführungsformen befinden sich die erste einzelsträngige DNA- Sequenz, die von der ersten DNA-Synthese-Template kodiert wird, und die dritte einzelsträngige DNA-Sequenz, die von der dritten einzelsträngigen DNA-Synthese-Template kodiert wird, auf einem ersten Nukleinsäuremolekül, und die zweite einzelsträngige DNA- Sequenz, die von der zweiten DNA-Synthese-Template kodiert wird, und die vierte einzelsträngige DNA-Sequenz, die von der vierten DNA-Synthese-Template kodiert wird, befinden sich auf einem zweiten Nukleinsäuremolekül. In bestimmten Ausführungsformen wird ein Teil des ersten Nukleinsäuremoleküls zwischen der ersten einzelsträngigen DNA- Sequenz und der dritten einzelsträngigen DNA-Sequenz in das zweite Nukleinsäuremolekül inkorporiert. In bestimmten Ausführungsformen wird ein Teil des zweiten Nukleinsäuremoleküls zwischen der zweiten einzelsträngigen DNA-Sequenz und der vierten einzelsträngigen DNA-Sequenz in das erste Nukleinsäuremolekül inkorporiert.
  • In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Paar pegRNAs zur Verwendung im Multi-Flap Prime Editing bereit. In einigen Ausführungsformen umfasst das Paar eine erste pegRNA und eine zweite pegRNA, und jede pegRNA umfasst unabhängig voneinander eine Spacer-Sequenz, einen gRNA-Kern, eine DNA-Synthese-Template und eine Primer-Bindungsstelle. In bestimmten Ausführungsformen kodiert jede DNA-Synthese- Template eine einzelsträngige DNA-Sequenz. In verschiedenen Ausführungsformen werden die Multi-Flap Prime Editors in Verbindung mit einem Paar pegRNAs verwendet, die separate Prime Editors auf beiden Seiten einer Zielstelle anvisieren, wobei das Paar pegRNAs jeweils für 3'-Nukleinsäure-Flaps kodiert, die Nukleinsäuresequenzen umfassen, die zueinander umgekehrt komplementär sind. In verschiedenen Ausführungsformen können die 3'-Flaps, die die umgekehrten Komplementsequenzen umfassen, aneinander anlagern, um einen Duplex zu bilden, der die gewünschte Schnitt- oder Nukleinsäuresequenz umfasst, die von den pegRNAs kodiert wird. Der Duplex wird dann in die Zielstelle integriert, indem er den entsprechenden endogenen Duplex ersetzt, der sich zwischen benachbarten Bruchstellen befindet.
  • In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine Vielzahl von pegRNAs zur Verwendung im Multi-Flap Prime Editing bereit. In einigen Ausführungsformen umfasst die Vielzahl eine erste, eine zweite, eine dritte und eine vierte pegRNA. In einigen Ausführungsformen umfasst jede der vier pegRNAs unabhängig voneinander eine Spacer- Sequenz, einen gRNA-Kern, eine DNA-Synthese-Matrize und eine Primer-Bindungsstelle. In bestimmten Ausführungsformen kodiert jede DNA-Synthese-Template eine einzelsträngige DNA-Sequenz. Zwei kodierte einzelsträngige DNA-Sequenzen können komplementär zueinander sein.
  • In verschiedenen Aspekten stellt die vorliegende Erfindung Polynukleotide zur Verfügung, die für eines der hier beschriebenen Paare oder eine Vielzahl von pegRNAs kodieren. In bestimmten Aspekten stellt die vorliegende Erfindung Vektoren bereit, die für ein Polynukleotid kodieren, das für eines der hier beschriebenen Paare oder eine Vielzahl von pegRNAs kodiert. In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung Zellen bereit, die einen Vektor umfassen, der für ein Polynukleotid kodiert, das für eines der hier beschriebenen Paare oder eine Vielzahl von pegRNAs kodiert. In anderen Aspekten stellt die Erfindung pharmazeutische Zusammensetzungen zur Verfügung, die eines der hier beschriebenen Paare oder eine Vielzahl von pegRNAs, einen Vektor, der für eines der hier beschriebenen Paare oder eine Vielzahl von pegRNAs kodiert, oder eine Zelle enthalten, die einen Vektor enthält, der für eines der hier beschriebenen Paare oder eine Vielzahl von pegRNAs kodiert. In bestimmten Ausführungsformen enthalten die pharmazeutischen Zusammensetzungen einen pharmazeutischen Hilfsstoff.
  • In einer Ausführungsform beziehen sich die Verfahren auf ein Verfahren zur Integration einer gewünschten Nukleotidänderung in eine doppelsträngige DNA-Sequenz. Das Verfahren umfasst zunächst das Inkontaktbringen der doppelsträngigen DNA-Sequenz mit einem Komplex, der einen Prime Editor und eine erweiterte Guide-RNA umfasst, wobei der Prime Editor ein napDNAbp und eine reverse Transkriptase umfasst und wobei die erweiterte Guide-RNA eine Reverse-Transkriptions-Template-Sequenz umfasst, die die gewünschte Nukleotidänderung umfasst. In einigen Ausführungsformen wird jeder Prime Editor als Fusionsprotein bereitgestellt. In einigen Ausführungsformen werden die Komponenten des Prime Editors in trans bereitgestellt. Als Nächstes wird die doppelsträngige DNA-Sequenz auf dem Nicht-Zielstrang eingekerbt, wodurch eine freie einzelsträngige DNA mit einem 3'-Ende entsteht. Das Verfahren beinhaltet dann die Hybridisierung des 3'-Endes der freien Einzelstrang-DNA mit der Template-Sequenz für die reverse Transkription, wodurch die Domäne der reversen Transkriptase geprimt wird. Das Verfahren beinhaltet dann die Polymerisation eines DNA-Strangs vom 3'-Ende aus, wodurch ein einzelsträngiger DNA-Flap entsteht, der die gewünschte Nukleotidänderung enthält. Anschließend wird bei dem Verfahren ein endogener DNA-Strang in der Nähe der Schnittstelle durch den einzelsträngigen DNA-Flap ersetzt, wodurch die gewünschte Nukleotidänderung in die doppelsträngige DNA- Sequenz eingebaut wird.
  • In anderen Ausführungsformen sieht die Erfindung ein Verfahren zur Einführung einer oder mehrerer Änderungen in der Nukleotidsequenz eines DNA-Moleküls an einem Zielort vor, was das Inkontaktbringen des DNA-Moleküls mit einem Nukleinsäure-programmierbaren DNA-Bindungsprotein (napDNAbp) und einer Guide-RNA umfasst, die das napDNAbp auf den Zielort ausrichtet, wobei die Guide-RNA eine Reverse Transkriptase (RT)- Matrizensequenz umfasst, die mindestens eine gewünschte Nukleotidänderung enthält. Als Nächstes beinhaltet das Verfahren die Bildung eines exponierten 3'-Endes in einem DNA- Strang am Zielort und die anschließende Hybridisierung des exponierten 3'-Endes mit der RT- Template-Sequenz, um die reverse Transkription zu starten. Als Nächstes wird ein einzelsträngiger DNA-Flap, der die mindestens eine gewünschte Nukleotidänderung auf der Basis der RT-Template-Sequenz enthält, durch die reverse Transkriptase synthetisiert oder polymerisiert. Schließlich wird die mindestens eine gewünschte Nukleotidveränderung in die entsprechende endogene DNA eingebaut, wodurch eine oder mehrere Veränderungen in der Nukleotidsequenz des DNA-Moleküls am Ziellocus eingeführt werden.
  • In wiederum anderen Ausführungsformen stellt die Erfindung ein Verfahren zur Einführung einer oder mehrerer Änderungen in der Nukleotidsequenz eines DNA-Moleküls an einem Zielort durch zielgeprimte, reverse Transkription bereit, wobei das Verfahren umfasst: (a) Inkontaktbringen des DNA-Moleküls am Zielort mit einem (i) Prime Editor, der ein Nukleinsäure-programmierbares DNA-Bindungsprotein (napDNAbp) und eine reverse Transkriptase umfasst, und (ii) einer Guide-RNA, die eine RT-Template umfasst, die eine gewünschte Nukleotidveränderung enthält; (b) Durchführen einer zielgeprimten reversen Transkription der RT-Template, um eine einzelsträngige DNA zu erzeugen, die die gewünschte Nukleotidänderung umfasst; und (c) Einbauen der gewünschten Nukleotidänderung in das DNA-Molekül am Zielort durch einen DNA-Reparatur- und/oder Replikationsprozess.
  • In bestimmten Ausführungsformen umfasst der Schritt des Ersetzens des endogenen DNA-Strangs: (i) Hybridisieren des Einzelstrang-DNA-Flaps an den endogenen DNA-Strang, der an die Schnittstelle angrenzt, um eine Sequenzfehlanpassung zu erzeugen; (ii) Ausschneiden des endogenen DNA-Strangs; und (iii) Reparieren der Fehlanpassung, um das gewünschte Produkt zu bilden, das die gewünschte Nukleotidänderung in beiden DNA- Strängen umfasst.
  • In verschiedenen Ausführungsformen kann die gewünschte Nukleotidveränderung eine einzelne Nukleotidsubstitution (z. B. eine Transition oder eine Transversionsveränderung), eine Deletion oder eine Insertion sein. Die gewünschte Nukleotidveränderung kann zum Beispiel (1) eine G-zu-T-Substitution, (2) eine G-zu-A-Substitution, (3) eine G-zu-C- Substitution, (4) eine T-zu-G-Substitution, (5) eine T-zu-A-Substitution, (6) eine T-zu-C- Substitution, (7) eine C-zu-G-Substitution, (8) eine C-zu-T-Substitution, (9) eine C-zu-A- Substitution, (10) eine A-zu-T-Substitution, (11) eine A-zu-G-Substitution oder (12) eine A- zu-C-Substitution sein.
  • In anderen Ausführungsformen kann die gewünschte Nukleoidänderung (1) ein G:C- Basenpaar in ein T:A-Basenpaar, (2) ein G:C-Basenpaar in ein A:T-Basenpaar, (3) ein G:C- Basenpaar in ein C:G-Basenpaar, (4) ein T:A-Basenpaar in ein G:C-Basenpaar, (5) ein T:A- Basenpaar in ein A:T-Basenpaar, (6) ein T: A-Basenpaar in ein C:G-Basenpaar, (7) ein C:G- Basenpaar in ein G:C-Basenpaar, (8) ein C:G-Basenpaar in ein T:A-Basenpaar, (9) ein C:G- Basenpaar in ein A:T-Basenpaar, (10) ein A:T-Basenpaar in ein T:A-Basenpaar, (11) ein A:T- Basenpaar in ein G:C-Basenpaar oder (12) ein A:T-Basenpaar in ein C:G-Basenpaar sein.
  • In wieder anderen Ausführungsformen führt das Verfahren eine gewünschte Nukleotidänderung ein, die eine Insertion ist. In bestimmten Fällen ist die Insertion mindestens 1, mindestens 2, mindestens 3, mindestens 4, mindestens 5, mindestens 6, mindestens 7, mindestens 8, mindestens 9, mindestens 10, mindestens 11, mindestens 12, mindestens 13, mindestens 14, mindestens 15, mindestens 16, mindestens 17, mindestens 18, mindestens 19, mindestens 20, mindestens 30, mindestens 40, mindestens 50, mindestens 60, mindestens 70, mindestens 80, mindestens 90, mindestens 100, mindestens 200, mindestens 300, mindestens 400 oder mindestens 500 Nukleotide lang.
  • In anderen Ausführungsformen führt das Verfahren eine gewünschte Nukleotidänderung ein, die eine Deletion ist. In bestimmten anderen Fällen ist die Deletion mindestens 1, mindestens 2, mindestens 3, mindestens 4, mindestens 5, mindestens 6, mindestens 7, mindestens 8, mindestens 9, mindestens 10, mindestens 11, mindestens 12, mindestens 13, mindestens 14, mindestens 15, mindestens 16, mindestens 17, mindestens 18, mindestens 19, mindestens 20, mindestens 30, mindestens 40, mindestens 50, mindestens 60, mindestens 70, mindestens 80, mindestens 90, mindestens 100, mindestens 200, mindestens 300, mindestens 400 oder mindestens 500 Nukleotide lang.
  • In verschiedenen Ausführungsformen korrigiert die gewünschte Nukleotidänderung ein krankheitsassoziiertes Gen. Das krankheitsassoziierte Gen kann mit einer monogenetischen Störung assoziiert sein, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Adenosindeaminase (ADA) -Mangel; Alpha-1-Antitrypsin-Mangel; Mukoviszidose; Duchenne-Muskeldystrophie; Galaktosämie; Hämochromatose; Huntington-Krankheit; Ahomsirup-Urinerkrankung; Marfan-Syndrom; Neurofibromatose Typ 1; Pachyonychia congenita; Phenylketonurie; Schwere kombinierte Immunschwäche; Sichelzellkrankheit, Smith-Lemli-Opitz-Syndrom und Tay-Sachs-Krankheit. In anderen Ausführungsformen kann das krankheitsassoziierte Gen mit einer polygenen Störung assoziiert sein, die aus der Gruppe bestehend aus: Herzkrankheit, Bluthochdruck, Alzheimer-Krankheit, Arthritis, Diabetes, Krebs und Fettleibigkeit ausgewählt wird.
  • Die hier offengelegten Verfahren können Fusionsproteine mit einem napDNAbp beinhalten, das ein Nuklease-totes Cas9 (dCas9), eine Cas9-Nickase (nCas9) oder ein Nuklease-aktives Cas9 ist. In anderen Ausführungsformen werden ein napDNAbp und eine reverse Transkriptase nicht als ein einziges Fusionsprotein kodiert, sondern können in separaten Konstrukten bereitgestellt werden. So kann in einigen Ausführungsformen die reverse Transkriptase in trans relativ zu dem napDNAbp bereitgestellt werden (und nicht durch ein Fusionsprotein).
  • In verschiedenen Ausführungsformen, die Verfahren beinhalten, kann das napDNAbp eine Aminosäuresequenz der SEQ-ID-Nummern umfassen: 26-61, 75-76, 126, 130, 137, 141, 147, 153, 157, 445, 460, 467 und 482-487 (Cas9); (SpCas9); SEQ-ID-NR.: 77-86 (CP-Cas9); SEQ-ID-NR.: 18-25 und 87-88 (SpCas9); SEQ-ID-Nummern: 62-72 (Cas12). In verschiedenen anderen Ausführungsformen umfasst das napDNAbp eine Aminosäuresequenz, die zu mindestens 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % oder 99 % mit der Aminosäuresequenz einer der SEQ-ID-Nummern identisch ist: 26-61, 75-76, 126, 130, 137, 141, 147, 153, 157,445,460, 467 und 482-487 (Cas9); (SpCas9); SEQ-ID-NR.: 77-86 (CP-Cas9); SEQ-ID-NR.: 18-25 und 87-88 (SpCas9); SEQ-ID-Nummern: 62-72 (Cas12).
  • In verschiedenen Ausführungsformen von Verfahren kann die reverse Transkriptase eine der Aminosäuresequenzen der SEQ-ID-NUMMERN umfassen: 89-100, 105-122, 128- 129, 132, 139, 143, 149, 154, 159, 235, 454, 471, 516, 662, 700-716, 739-742 und 766. In wieder anderen Ausführungsformen kann die reverse Transkriptase eine Aminosäuresequenz umfassen, die zu mindestens 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % oder 99 % mit der Aminosäuresequenz einer der SEQ-ID-NUMMERN identisch ist: 89-100, 105-122, 128-129, 132, 139, 143, 149, 154, 159, 235, 454, 471, 516, 662, 700-716, 739-742 und 766.
  • Die Verfahren können die Verwendung einer pegRNA beinhalten, die eine Nukleotidsequenz von SEQ-ID-NUMMERN umfasst: 101-104, 181-183, 223-234, 237-244, 277, 324-330, 332, 334, 336, 338, 340, 342, 344, 346, 348, 350, 352, 354, 356, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 394, 429-442, 499-505, 641-649, 678-692, 735-736, 757-761, 776-777, 2997- 3103, 3113-3121, 3305-3455, 3479-3493, 3522-3540, 3549-3556, 3628-3698, 3755-3810, 3874, 3890-3901, 3905-3911, 3913-3929 und 3972-3989 oder eine Nukleotidsequenz mit mindestens 80 %, mindestens 85 %, mindestens 90 %, mindestens 95 % oder mindestens 99 % Sequenzidentität dazu. Die Verfahren können die Verwendung von erweiterten Guide-RNAs umfassen, die eine RNA-Erweiterung am 3'-Ende umfassen, wobei die RNA-Erweiterung die Reverse-Transkriptions-Template-Sequenz umfasst.
  • Die Verfahren können die Verwendung von Extended Guide RNAs umfassen, die am 5'-Ende eine RNA-Erweiterung aufweisen, wobei die RNA-Erweiterung die Reverse- Transkriptions-Template-Sequenz umfasst.
  • Die Verfahren können die Verwendung von Extended Guide RNAs umfassen, die an einer intramolekularen Stelle in der Guide RNA eine RNA-Erweiterung aufweisen, wobei die RNA-Erweiterung die Reverse-Transkriptions-Template-Sequenz umfasst.
  • Die Verfahren können die Verwendung von verlängerten Guide RNAs umfassen, die eine oder mehrere RNA-Verlängerungen aufweisen, die mindestens 1, mindestens 2, mindestens 3, mindestens 4, mindestens 5, mindestens 6, mindestens 7, mindestens 8, mindestens 9, mindestens 10, mindestens 11, mindestens 12, mindestens 13, mindestens 14, mindestens 15, mindestens 16, mindestens 17, mindestens 18, mindestens 19, mindestens 20, mindestens 30, mindestens 40, mindestens 50, mindestens 60, mindestens 70, mindestens 80, mindestens 90, mindestens 100, mindestens 200, mindestens 300, mindestens 400 oder mindestens 500 Nukleotide in Länge betragen.
  • Die vorstehenden Konzepte und die im Folgenden erörterten zusätzlichen Konzepte können in jeder geeigneten Kombination angeordnet werden, da die vorliegende Erfindung in dieser Hinsicht nicht beschränkt ist. Weitere Vorteile und neuartige Merkmale der vorliegenden Erfindung werden aus der folgenden detaillierten Beschreibung verschiedener nicht einschränkender Ausführungsformen ersichtlich, wenn sie in Verbindung mit den begleitenden Figuren betrachtet werden.
  • Figurenliste
  • Die folgenden Zeichnungen sind Teil der vorliegenden Spezifikation und dienen der weiteren Veranschaulichung bestimmter Aspekte der vorliegenden Erfindung, die durch Bezugnahme auf eine oder mehrere dieser Zeichnungen in Kombination mit der detaillierten Beschreibung der hierin vorgestellten spezifischen Ausführungsformen besser verstanden werden können.
    • 1A zeigt ein Schema eines beispielhaften Verfahrens zur Einführung einer einzelnen Nukleotidveränderung und/oder Insertion und/oder Deletion in ein DNA-Molekül (z. B. ein Genom) unter Verwendung eines Fusionsproteins, das eine mit einem Cas9-Protein fusionierte reverse Transkriptase im Komplex mit einem erweiterten Guide-RNA-Molekül umfasst. In dieser Ausführungsform ist die Guide-RNA am 3'-Ende verlängert, um eine Reverse Transkriptase-Matrizen-Sequenz zu enthalten. Das Schema zeigt, wie eine mit einer Cas9-Nickase fusionierte Reverse Transkriptase (RT) in einem Komplex mit einer Guide-RNA (gRNA) an die DNA-Zielstelle bindet und den PAM-haltigen DNA-Strang neben dem Zielnukleotid einschneidet. Das RT-Enzym verwendet die eingekerbte DNA als Primer für die DNA-Synthese aus der gRNA, die als Template für die Synthese eines neuen DNA-Strangs verwendet wird, der für den gewünschten Schnitt kodiert. Der gezeigte Editierprozess kann als Target-primed Reverse Transcription Editing (TRT-Editing) oder auch als „Prime Editing“ bezeichnet werden
    • 1B zeigt die gleiche Darstellung wie in 1A, mit der Ausnahme, dass der Prime-Editor-Komplex allgemeiner als [napDNAbp]-[P]:pegRNA oder [P]- [napDNAbp]:pegRNA dargestellt wird, wobei sich „P“ auf eine beliebige Polymerase (z. B. eine reverse Transkriptase), „napDNAbp“ auf ein Nukleinsäure-programmierbares DNA- Bindungsprotein (z. B. SpCas9) und „pegRNA“ auf eine Prime-Editing-Guide-RNA und „]-[" sich auf einen optionalen Linker bezieht. Wie an anderer Stelle beschrieben, z. B. in 3A- 3G umfasst die pegRNA einen 5'-Erweiterungsarm mit einer Primerbindungsstelle und einer DNA-Synthese-Template. Obwohl nicht gezeigt, ist es denkbar, dass der Erweiterungsarm der pegRNA (d. h. der eine Primerbindungsstelle und eine DNA-Synthesematrix umfasst) aus DNA oder RNA bestehen kann. Welche Polymerase in dieser Konfiguration in Frage kommt, hängt von der Art der DNA-Synthese-Template ab. Wenn die Template für die DNA-Synthese beispielsweise RNA ist, dann kann die Polymerase eine RNA-abhängige DNA-Polymerase sein (z. B. eine reverse Transkriptase). Wenn die Template für die DNA-Synthese DNA ist, dann kann die Polymerase eine DNA-abhängige DNA-Polymerase sein.
    • 1C zeigt eine schematische Darstellung eines beispielhaften Verfahrens zur Einführung einer einzelnen Nukleotidveränderung und/oder Insertion und/oder Deletion in ein DNA-Molekül (z. B. ein Genom) unter Verwendung eines Fusionsproteins, das eine mit einem Cas9-Protein fusionierte reverse Transkriptase im Komplex mit einem erweiterten Guide- RNA-Molekül umfasst. In dieser Ausführungsform ist die Guide-RNA am 5'-Ende verlängert, um eine Reverse-Transkriptase-Matrizen-Sequenz zu enthalten. Das Schema zeigt, wie eine mit einer Cas9-Nickase fusionierte Reverse Transkriptase (RT) in einem Komplex mit einer Guide-RNA (gRNA) an die DNA-Zielstelle bindet und den PAM-haltigen DNA-Strang neben dem Zielnukleotid einschneidet. Das RT-Enzym verwendet die eingekerbte DNA als Primer für die DNA-Synthese aus der gRNA, die als Template für die Synthese eines neuen DNA- Strangs verwendet wird, der für den gewünschten Schnitt kodiert. Der gezeigte Editierprozess kann als Target-primed Reverse Transcription Editing (TRT-Editing) oder auch als „Prime Editing“ bezeichnet werden
    • 1D zeigt die gleiche Darstellung wie in 1C, mit der Ausnahme, dass der Prime-Editor-Komplex allgemeiner als [napDNAbp]-[P]:pegRNA oder [P]- [napDNAbp]:pegRNA dargestellt wird, wobei sich „P“ auf eine beliebige Polymerase (z. B., eine reverse Transkriptase), „napDNAbp“ auf ein Nukleinsäure-programmierbares DNA- Bindungsprotein (z. B. SpCas9) und „pegRNA“ auf eine Prime-Editing-Guide-RNA und „]-[" sich auf einen optionalen Linker bezieht. Wie an anderer Stelle beschrieben, z. B. in 3A- 3G umfasst die pegRNA einen 3'-Erweiterungsarm, der eine Primerbindungsstelle und eine DNA-Synthesematrix umfasst. Obwohl nicht gezeigt, ist es denkbar, dass der Erweiterungsarm der pegRNA (d. h. der eine Primerbindungsstelle und eine DNA- Synthesematrix umfasst) aus DNA oder RNA bestehen kann. Welche Polymerase in dieser Konfiguration in Frage kommt, hängt von der Art der DNA-Synthese-Template ab. Wenn die Template für die DNA-Synthese beispielsweise RNA ist, dann kann die Polymerase eine RNA- abhängige DNA-Polymerase sein (z. B. eine reverse Transkriptase). Wenn die Template für die DNA-Synthese DNA ist, dann kann die Polymerase eine DNA-abhängige DNA- Polymerase sein. In verschiedenen Ausführungsformen kann die pegRNA so konstruiert oder synthetisiert werden, dass sie eine DNA-basierte DNA-Synthese-Template einschließt.
    • 1E ist eine schematische Darstellung eines beispielhaften Prozesses, der zeigt, wie der synthetisierte DNA-Einzelstrang (der die gewünschte Nukleotidänderung enthält) aufgelöst wird, so dass die gewünschte Nukleotidänderung in die DNA eingebaut wird. Wie gezeigt, führt nach der Synthese des editierten Strangs (oder „mutagenen Strangs“) die Äquilibrierung mit dem endogenen Strang, die Flap-Spaltung des endogenen Strangs und die Ligation zum Einbau der DNA-Editierung nach Auflösung des fehl angepassten DNA- Duplexes durch die Wirkung endogener DNA-Reparatur- und/oder Replikationsprozesse.
    • 1F ist ein Schema, das zeigt, dass das „gegenläufige Strang-Nicking“ in die Auflösungsmethode integriert werden kann von 1E, um die Bildung des gewünschten Produkts gegenüber dem Reversionsprodukt zu fördern. Beim Nicking in den entgegengesetzten Strang wird ein zweiter Cas9/gRNA-Komplex verwendet, um einen zweiten Nick in den entgegengesetzten Strang des ursprünglich genickten Strangs einzubringen. Dies veranlasst die endogenen zellulären DNA-Reparatur- und/oder Replikationsprozesse dazu, vorzugsweise den unbearbeiteten Strang (d. h. den Strang mit der zweiten Einkerbung) zu ersetzen.
    • 1G zeigt ein weiteres Schema eines beispielhaften Verfahrens zur Einführung einer einzelnen Nukleotidveränderung und/oder Insertion und/oder Deletion in ein DNA- Molekül (z. B. ein Genom) eines Ziellocus unter Verwendung eines Nukleinsäure- programmierbaren DNA-bindenden Proteins (napDNAbp), das mit einer erweiterten Guide- RNA komplexiert ist. Dieser Prozess kann als eine Ausprägung des Prime Editing bezeichnet werden. Die erweiterte Guide-RNA umfasst eine Erweiterung am 3'- oder 5'-Ende der Guide- RNA oder an einer intramolekularen Stelle in der Guide-RNA. In Schritt (a) kontaktiert der napDNAbp/gRNA-Komplex das DNA-Molekül und die gRNA leitet das napDNAbp zur Bindung an den Ziellocus. In Schritt (b) wird eine Einkerbung in einen der DNA-Stränge (den R-Loop-Strang oder den PAM-haltigen Strang oder den Nicht-Ziel-DNA-Strang oder den Protospacer-Strang) des Ziellocus eingeführt (z. B. durch eine Nuklease oder einen chemischen Wirkstoff), wodurch ein verfügbares 3'-Ende in einem der Stränge des Ziellocus entsteht. In bestimmten Ausführungsformen wird der Nick in dem DNA-Strang erzeugt, der dem R-Loop- Strang entspricht, d. h. dem Strang, der nicht mit der RNA-Führungssequenz hybridisiert ist. In Schritt (c) interagiert der DNA-Strang am 3'-Ende mit dem erweiterten Teil der Guide-RNA, um die reverse Transkription zu starten. In bestimmten Ausführungsformen hybridisiert der DNA-Strang mit dem 3'-Ende an eine spezifische RT-Priming-Sequenz auf dem erweiterten Teil der Guide-RNA. In Schritt (d) wird eine reverse Transkriptase eingeführt, die einen einzelnen DNA-Strang vom 3'-Ende der Primed Site zum 3'-Ende der Guide-RNA synthetisiert. Dadurch entsteht ein Einzelstrang-DNA-Flap mit der gewünschten Nukleotidänderung (z. B. die Änderung einer einzelnen Base, die Insertion oder Deletion oder eine Kombination davon). In Schritt (e) werden das napDNAbp und die Guide-RNA freigesetzt. Die Schritte (f) und (g) beziehen sich auf die Auflösung der einzelsträngigen DNA- Flap, so dass die gewünschte Nukleotidänderung in den Ziellocus eingebaut wird. Dieser Prozess kann in Richtung der gewünschten Produktbildung vorangetrieben werden, indem der entsprechende 5' endogene DNA-Flap entfernt wird, der sich bildet, sobald der 3'-Einzelstrang- DNA-Flap eindringt und mit der komplementären Sequenz auf dem anderen Strang hybridisiert. Der Prozess kann auch zur Produktbildung mit einem zweiten Strang führen, wie in 1F gezeigt. Bei diesem Prozess können mindestens eine oder mehrere der folgenden genetischen Veränderungen auftreten: Transversionen, Transitionen, Deletionen und Insertionen.
    • 1H ist ein Schema, das die Arten von genetischen Veränderungen zeigt, die mit den hier beschriebenen Prime-Editing-Verfahren möglich sind. Zu den Arten von Nukleotidänderungen, die durch Prime Editing erreicht werden können, gehören Deletionen (einschließlich kurzer und langer Deletionen), Einzelnukleotidänderungen (einschließlich Transitionen und Transversionen), Inversionen und Insertionen (einschließlich kurzer und langer Deletionen).
    • 1I ist ein Schema, das das zeitlich begrenztes Nicking des zweiten Strangs am Beispiel von PE3b zeigt (PE3b = PE2 Prime Editor Fusionsprotein + pegRNA + Guide RNA des Nickings des zweiten Strangs). Zeitlich begrenztes Nicking des zweiten Strangs ist eine Variante des Nickings des zweiten Strangs, um die Bildung des gewünschten editierten Produkts zu erleichtern. Der Begriff „zeitlich begrenzt“ bezieht sich auf die Tatsache, dass der Nick des zweiten Strangs in den uneditierten Strang erst erfolgt, nachdem der gewünschte Edit im editierten Strang installiert wurde. Dadurch wird vermieden, dass gleichzeitige Kerben auf beiden Strängen zu doppelsträngigen DNA-Brüchen führen.
    • 1J-1K zeigen eine Variante des hierin betrachteten Prime Editing, bei der die napDNAbp (z. B. SpCas9-Nickase) durch eine beliebige programmierbare Nuklease-Domäne ersetzt wird, wie z. B. Zinkfinger-Nukleasen (ZFN) oder Transkriptionsaktivator-ähnliche Effektornukleasen (TALEN). Geeignete Nukleasen müssen also nicht unbedingt durch ein Nukleinsäure-Zielmolekül (wie eine Guide-RNA) „programmiert“ werden, sondern können auch durch die Definition der Spezifität einer DNA-Bindungsdomäne, wie insbesondere einer Nuklease, programmiert werden. Genau wie beim Prime Editing mit napDNAbp-Anteilen ist es vorzuziehen, dass solche alternativen programmierbaren Nukleasen so modifiziert werden, dass nur ein Strang der Ziel-DNA geschnitten wird. Mit anderen Worten: Die programmierbaren Nukleasen sollten vorzugsweise als Nickasen funktionieren. Sobald eine programmierbare Nuklease ausgewählt ist (z. B. eine ZFN oder eine TALEN), können zusätzliche Funktionen in das System eingebaut werden, damit es nach einem Prime-Editingähnlichen Mechanismus arbeitet. Zum Beispiel können die programmierbaren Nukleasen modifiziert werden, indem (z. B. über einen chemischen Linker) ein RNA- oder DNA- Erweiterungsarm daran gekoppelt wird, wobei der Erweiterungsarm eine Primer- Bindungsstelle (PBS) und eine DNA-Synthese-Template umfasst. Die programmierbare Nuklease kann auch (z. B. über einen chemischen oder Aminosäure-Linker) an eine Polymerase gekoppelt sein, deren Art davon abhängt, ob der Erweiterungsarm aus DNA oder RNA besteht. Im Falle eines RNA-Erweiterungsarms kann die Polymerase eine RNA- abhängige DNA-Polymerase sein (z. B. eine reverse Transkriptase). Im Falle eines DNA- Erweiterungsarms kann die Polymerase eine DNA-abhängige DNA-Polymerase sein (z. B. eine prokaryotische Polymerase, einschließlich Pol I, Pol II oder Pol III, oder eine eukaryotische Polymerase, einschließlich Pol a, Pol b, Pol g, Pol d, Pol e oder Pol z). Das System kann auch andere Funktionalitäten enthalten, die als Fusionen zu den programmierbaren Nukleasen hinzugefügt werden, oder die in trans hinzugefügt werden, um die Reaktion als Ganzes zu erleichtern (z. B. (a) eine Helikase zum Abwickeln der DNA an der Schnittstelle, um den geschnittenen Strang mit dem 3'-Ende als Primer verfügbar zu machen, (b) eine Flap-Endonuklease (z. B., FEN1), um die Entfernung des endogenen Strangs auf dem geschnittenen Strang zu unterstützen, um die Reaktion zum Ersatz des endogenen Strangs durch den synthetisierten Strang voranzutreiben, oder (c) ein nCas9:gRNA-Komplex, um einen zweiten Nick auf dem gegenüberliegenden Strang zu erzeugen, der die Integration der synthetisierten Reparatur durch eine bevorzugte zelluläre Reparatur des nicht-editierten Strangs vorantreiben kann). In Analogie zum Prime Editing mit einer napDNAbp könnte ein solcher Komplex mit einer ansonsten programmierbaren Nuklease dazu verwendet werden, einen neu synthetisierten Ersatzstrang der DNA, der einen gewünschten Schnitt trägt, zu synthetisieren und dann dauerhaft in eine Ziel-DNA einzubauen.
    • 1L zeigt in einer Ausführungsform die anatomischen Merkmale einer Ziel-DNA, die durch Prime Editing bearbeitet werden kann. Die Ziel-DNA besteht aus einem „Nicht- Ziel-Strang“ und einem „Ziel-Strang“. Der Zielstrang ist der Strang, der an den Spacer einer pegRNA eines Prime-Editor-Komplexes annealed, der die PAM-Stelle erkennt (in diesem Fall NGG, das von den kanonischen SpCas9-basierten Prime-Editoren erkannt wird). Der Zielstrang kann auch als „Nicht-PAM-Strang“ oder als „nicht editierter Strang“ bezeichnet werden. Im Gegensatz dazu kann der Nicht-Zielstrang (d. h. der Strang, der den Protospacer und die PAM-Sequenz von NGG enthält) als „PAM-Strang“ oder „Edit-Strang“ bezeichnet werden In verschiedenen Ausführungsformen befindet sich die Einkerbung des PE-Komplexes im Protospacer auf dem PAM-Strang (z. B. mit dem SpCas9-basierten PE). Die Position des Nicks ist charakteristisch für das jeweilige Cas9, das das PE bildet. Bei einem SpCas9- basierten PE beispielsweise befindet sich die Einkerbung in der Phosphodiesterbindung zwischen den Basen drei („-3“ Position relativ zur Position 1 der PAM-Sequenz) und vier („- 4“ Position relativ zur Position 1 der PAM-Sequenz). Die Einkerbung im Protospacer bildet eine freie 3'-Hydroxylgruppe, die, wie in den folgenden FIGildungen zu sehen ist, mit der Primer-Bindungsstelle des Erweiterungsarms der pegRNA einen Komplex bildet und das Substrat für den Beginn der Polymerisation eines einzelnen DNA-Strangs bereitstellt, der durch die DNA-Synthese-Template des Erweiterungsarms der pegRNA kodiert wird. Diese Polymerisationsreaktion wird von der Polymerase (z. B. der reversen Transkriptase) des PE- Fusionsproteins in der 5'- zu 3'-Richtung katalysiert. Die Polymerisation endet, bevor der gRNA-Kern erreicht wird (z. B. durch den Einbau eines PolymerisationsFIGruchsignals oder einer Sekundärstruktur, die die Polymerisationsaktivität von PE beendet), wodurch ein einzelsträngiger DNA-Flap entsteht, der von der ursprünglichen 3'-Hydroxylgruppe des eingekerbten PAM-Strangs verlängert wird. Die DNA-Synthese-Template kodiert für einen DNA-Einzelstrang, der homolog zum endogenen 5'-Ende des DNA-Einzelstrangs ist, der unmittelbar auf die Einkerbung des PAM-Strangs folgt und die gewünschte Nukleotidänderung enthält (z. B. Substitution einer einzelnen Base, Insertion, Deletion, Inversion). Die Position des gewünschten Schnitts kann sich an jeder beliebigen Position stromabwärts der Einkerbung auf dem PAM-Strang befinden, einschließlich der Positionen +1, +2, +3, +4 (Beginn der PAM- Stelle), +5 (Position 2 der PAM-Stelle), +6 (Position 3 der PAM-Stelle), +7, +8, +9, +10, +11, +12,+13,+14,+15,+16,+17,+18,+19,+20,+21,+22,+23,+24,+25,+26,+27,+28,+29, +30,+31,+32,+33,+34,+35,+36,+37,+38,+39,+40,+41,+42,+43,+44,+45,+46,+47, +48,+49,+50,+51,+52,+53,+54,+55,+56,+57,+58,+59,+60,+61,+62,+63,+64,+65, +66,+67,+68,+69,+70,+71,+72,+73,+74,+75,+76,+77,+78,+79,+80,+81,+82,+83, +84,+85,+86,+87,+88,+89,+90,+91,+92,+93,+94,+95,+96,+97,+98,+99,+100,+101, +102,+103,+104,+105,+106,+107,+108,+109,+110,+111,+112,+113,+114,+115,+116, +117,+118, +119,+120,+ 121,+122,+123,+124,+125,+126,+127,+128,+129,+130, +131, +132,+133,+134,+135,+l36,+137,+138,+139,+140,+141,+142,+143,+144,+145,+146, +147,+148,+149 oder +150 oder mehr (relativ zur stromabwärts gelegenen Position der Einkerbung). Sobald die einsträngige DNA mit dem 3'-Ende (die den entsprechenden Schnitt enthält) die endogene einsträngige DNA mit dem 5'-Ende ersetzt, führen die DNA-Reparatur- und Replikationsprozesse zu einer permanenten Installation der Schnittstelle auf dem PAM- Strang und einer anschließenden Korrektur der Fehlpaarung auf dem Nicht-PAM-Strang, die an der Schnittstelle vorhanden sein wird. Auf diese Weise erstreckt sich der Schnitt auf beide DNA-Stränge an der Ziel-DNA-Stelle. Sie werden verstehen, dass der Verweis auf den „editierten Strang“ und den „nicht-editierten“ Strang nur dazu dient, die am PE-Mechanismus beteiligten DNA-Stränge abzugrenzen. Der „editierte Strang“ ist der Strang, der zuerst editiert wird, indem die einsträngige DNA mit 5'-Ende unmittelbar stromabwärts der Einkerbung durch die synthetisierte einsträngige DNA mit 3'-Ende ersetzt wird, die den gewünschten Schnitt enthält. Der „nicht-editierte“ Strang ist das Strangpaar mit dem editierten Strang, der jedoch selbst durch Reparatur und/oder Replikation so editiert wird, dass er komplementär zu dem editierten Strang und insbesondere zu dem betreffenden Edit ist.
    • 1M zeigt den Mechanismus des Prime Editing mit den anatomischen Merkmalen der Ziel-DNA, des Prime-Editor-Komplexes und der Interaktion zwischen der pegRNA und der Ziel-DNA. Zunächst wird ein Prime Editor, der ein Fusionsprotein mit einer Polymerase (z. B. Reverse Transkriptase) und einem napDNAbp (z. B. SpCas9-Nickase, z. B. ein SpCas9 mit einer deaktivierenden Mutation in einer HNH-Nuklease-Domäne (z. B. H840A) oder einer deaktivierenden Mutation in einer RuvC-Nuklease-Domäne (D10A)) umfasst, mit einer pegRNA und DNA mit einer zu editierenden Ziel-DNA komplexiert. Die pegRNA besteht aus einem Spacer, einem gRNA-Kern (auch gRNA-Gerüst oder gRNA-Rückgrat genannt) (der an das napDNAbp bindet) und einem Erweiterungsarm. Der Erweiterungsarm kann sich am 3'- Ende, am 5'-Ende oder irgendwo innerhalb des pegRNA-Moleküls befinden. Wie gezeigt, befindet sich der Erweiterungsarm am 3'-Ende der pegRNA. Der Erweiterungsarm umfasst in der 3'-5'-Richtung eine Primerbindungsstelle und eine DNA-Synthese-Template (die sowohl einen interessierenden Schnitt als auch Homologieregionen (d. h. Homologiearme) umfasst), die mit der einzelsträngigen DNA mit 5'-Ende unmittelbar nach der Einkerbung auf dem PAM- Strang homolog sind. Wie gezeigt, wird nach der Einführung des Nicks, wodurch eine freie 3'-Hydroxylgruppe unmittelbar vor der Einkerbung entsteht, der Bereich unmittelbar vor der Einkerbung auf dem PAM-Strang an eine komplementäre Sequenz am 3'-Ende des Erweiterungsarms annektiert, die als „Primer-Bindungsstelle“ bezeichnet wird, wodurch ein kurzer doppelsträngiger Bereich mit einem verfügbaren 3'-Hydroxyl-Ende entsteht, der ein Substrat für die Polymerase des Prime-Editor-Komplexes bildet. Die Polymerase (z. B. Reverse Transkriptase) polymerisiert dann als DNA-Strang vom 3'-Hydroxyl-Ende bis zum Ende des Erweiterungsarms. Die Sequenz der einzelsträngigen DNA wird durch die DNA- Synthese-Template kodiert, d. h. durch den Teil des Erweiterungsarms (d. h. ohne die Primerbindungsstelle), der von der Polymerase „gelesen“ wird, um neue DNA zu synthetisieren. Durch diese Polymerisation wird die Sequenz des ursprünglichen 3'-Hydroxyl- Endes der ursprünglichen Einkerbung effektiv verlängert. Die DNA-Synthese-Template kodiert einen DNA-Einzelstrang, der nicht nur den gewünschten Schnitt enthält, sondern auch Regionen, die homolog zu dem endogenen DNA-Einzelstrang sind, der sich unmittelbar stromabwärts der Einkerbung auf dem PAM-Strang befindet. Als Nächstes verdrängt der kodierte DNA-Einzelstrang mit 3'-Ende (d. h. der 3'-Einzelstrang-DNA-Flap) den entsprechenden homologen endogenen DNA-Einzelstrang mit 5'-Ende unmittelbar stromabwärts der Einkerbung auf dem PAM-Strang und bildet ein DNA-Zwischenprodukt mit einem DNA-Flap mit 5'-Ende, das von der Zelle (z. B. durch eine Flap-Endonuklease) entfernt wird. Der 3'-End-Einzelstrang-DNA-Flap, der sich an das Komplement des endogenen 5'-End- Einzelstrang-DNA-Flaps anlagert, wird an den endogenen Strang ligiert, nachdem der 5'-DNA- Flap entfernt wurde. Der gewünschte Schnitt im 3'-Ende des einzelsträngigen DNA-Flaps, der nun annealed und ligiert wird, bildet eine Fehlpaarung mit dem Komplementstrang, der eine DNA-Reparatur und/oder eine Replikationsrunde durchläuft, wodurch der gewünschte Schnitt dauerhaft auf beiden Strängen installiert wird.
    • 2 zeigt drei Cas-Komplexe (SpCas9, SaCas9 und LbCas12a), die in den hier beschriebenen Prime-Editoren verwendet werden können, sowie ihre PAM-, gRNA- und DNA-Spaltungsmerkmale. Die FIGildung zeigt Entwürfe für Komplexe mit SpCas9, SaCas9 und LbCas12a.
    • 3A-3F zeigen Entwürfe für konstruierte 5' Prime Editor gRNA (3A), 3' Prime Editor gRNA (3B), und eine intramolekulare Erweiterung (3C). Die erweiterte Guide-RNA (oder erweiterte gRNA) kann hier auch als pegRNA oder „prime editing guide RNA“ bezeichnet werden 3D und 3E zeigen zusätzliche Ausführungsformen von 3' und 5' Prime Editor gRNAs (pegRNAs). 3F veranschaulicht die Interaktion zwischen einer 3'-Ende-Prime-Editor-Guide-RNA und einer Ziel-DNA-Sequenz. Die Ausführungsformen von 3A-3C zeigen beispielhafte Anordnungen der Matrizensequenz für die reverse Transkription (d. h., oder allgemeiner als DNA-Synthese-Matrize bezeichnet, wie angegeben, da die RT nur eine Art von Polymerase ist, die im Zusammenhang mit Prime- Editoren verwendet werden kann), die Primer-Bindungsstelle und eine optionale Linker- Sequenz in den erweiterten Abschnitten der 3'-, 5'- und intramolekularen Versionen sowie die allgemeinen Anordnungen der Spacer- und Kernregionen. Der offengelegte Prime-Editing- Prozess ist nicht auf diese Konfigurationen erweiterter Guide-RNAs beschränkt. Die Ausführungsform von 3D zeigt die Struktur einer beispielhaften pegRNA, wie sie hier in Betracht gezogen wird. Die pegRNA besteht aus drei Hauptbestandteilen, die in 5'- zu 3'- Richtung angeordnet sind, nämlich: einem Spacer, einem gRNA-Kern und einem Erweiterungsarm am 3'-Ende. Der Erweiterungsarm kann ferner in die folgenden Strukturelemente in 5'- bis 3'-Richtung unterteilt werden: eine Primerbindungsstelle (A), eine Edit-Template (B) und ein Homologiearm (C). Darüber hinaus kann die pegRNA eine optionale 3'-Endmodifizierungsregion (e1) und eine optionale 5'-Endmodifizierungsregion (e2) umfassen. Darüber hinaus kann die pegRNA ein Transkriptionsterminationssignal am 3'- Ende der pegRNA umfassen (nicht dargestellt). Diese Strukturelemente werden hier weiter definiert. Die Darstellung der Struktur der pegRNA ist nicht als einschränkend zu verstehen und schließt Variationen in der Anordnung der Elemente mit ein. Zum Beispiel könnten die optionalen Sequenzmodifikatoren (e1) und (e2) innerhalb oder zwischen den anderen gezeigten Regionen positioniert werden und sind nicht darauf beschränkt, sich an den 3'- und 5'-Enden zu befinden. Die pegRNA könnte in bestimmten Ausführungsformen eine sekundäre RNA- Struktur umfassen, wie z. B. Haarnadeln, Stamm/Schleifen, Toeloop, RNA-bindende Protein- Rekrutierungsdomänen (z. B. das MS2-Aptamer, das das MS2cp-Protein rekrutiert und daran bindet). Solche Sekundärstrukturen können sich zum Beispiel innerhalb des Spacers, des gRNA-Kerns oder des Erweiterungsarms und insbesondere innerhalb der e1- und/oder e2- Modifikatorregionen befinden. Zusätzlich zu den sekundären RNA-Strukturen könnten die pegRNAs (z. B. innerhalb der e1- und/oder e2-Modifikatorregionen) einen chemischen Linker oder einen Poly(N)-Linker oder -Schwanz umfassen, wobei „N“ eine beliebige Nukleobase sein kann. In einigen Ausführungsformen (z. B. wie in 72(c)), kann der chemische Linker dazu dienen, die reverse Transkription des sgRNA-Gerüsts oder -Kerns zu verhindern. Außerdem können Sie in bestimmten Ausführungsformen (siehe z. B. 72(c)) könnte der Erweiterungsarm (3) aus RNA oder DNA bestehen und/oder eine oder mehrere Nukleobasen- Analoga enthalten (die z. B. zusätzliche Funktionen wie Temperaturbeständigkeit bieten könnten). Darüber hinaus kann die Ausrichtung des Erweiterungsarms (3) in der natürlichen 5'-zu-3'-Richtung erfolgen oder in der entgegengesetzten Ausrichtung in der 3'-zu-5'-Richtung synthetisiert werden (relativ zur Ausrichtung des pegRNA-Moleküls insgesamt). Es wird auch darauf hingewiesen, dass ein Fachmann in der Lage ist, je nach Art der Nukleinsäurematerialien des Erweiterungsarms (d. h. DNA oder RNA) eine geeignete DNA- Polymerase für die Verwendung beim Prime-Editing auszuwählen, die entweder als Fusion mit dem napDNAbp oder in trans als separate Einheit bereitgestellt werden kann, um den gewünschten Template-kodierten 3'-Einzelstrang-DNA-Flap zu synthetisieren, der die gewünschte Editierung enthält. Wenn der Erweiterungsarm beispielsweise RNA ist, dann könnte die DNA-Polymerase eine reverse Transkriptase oder eine andere geeignete RNA- abhängige DNA-Polymerase sein. Wenn der Erweiterungsarm jedoch DNA ist, dann könnte die DNA-Polymerase eine DNA-abhängige DNA-Polymerase sein. In verschiedenen Ausführungsformen könnte die Bereitstellung der DNA-Polymerase in trans erfolgen, z. B. durch die Verwendung einer RNA-Protein-Rekrutierungsdomäne (z. B. eine MS2-Haarnadel, die auf der pegRNA installiert ist (z. B. in der e1- oder e2-Region oder an anderer Stelle und ein MS2cp-Protein, das mit der DNA-Polymerase fusioniert ist, wodurch die DNA-Polymerase an die pegRNA kolokalisiert wird). Es wird auch darauf hingewiesen, dass die Primerbindungsstelle im Allgemeinen keinen Teil der Vorlage bildet, die von der DNA- Polymerase (z. B. der reversen Transkriptase) verwendet wird, um den resultierenden 3'- Einzelstrang-DNA-Flap zu kodieren, der den gewünschten Schnitt enthält. Die Bezeichnung „DNA-Synthese-Template“ bezieht sich also auf die Region oder den Teil des Erweiterungsarms (3), der von der DNA-Polymerase als Matrize verwendet wird, um den gewünschten 3'-Einzelstrang-DNA-Flap zu kodieren, der den Schnitt und die Regionen der Homologie zum 5'-endogenen Einzelstrang-DNA-Flap enthält, der durch das 3'-Einzelstrang- DNA-Strangprodukt der Prime-Editing-DNA-Synthese ersetzt wird. In einigen Ausführungsformen enthält die DNA-Synthese-Template die „Edit-Template“ und den „Homologiearm“ oder einen oder mehrere Homologiearme, z. B. vor und nach der Edit- Template. Die Edit-Template kann so klein wie eine einzelne Nukleotidsubstitution sein, oder es kann sich um eine Insertion oder eine Inversion der DNA handeln. Darüber hinaus kann die Edit-Template auch eine Deletion enthalten, die durch die Kodierung eines Homologiearms, der eine gewünschte Deletion enthält, erzeugt werden kann. In anderen Ausführungsformen kann die DNA-Synthese-Template auch die e2-Region oder einen Teil davon enthalten. Wenn die e2-Region beispielsweise eine Sekundärstruktur enthält, die eine Beendigung der DNA- Polymerase-Aktivität bewirkt, dann ist es möglich, dass die DNA-Polymerase-Funktion beendet wird, bevor ein Teil der e2-Region tatsächlich in die DNA kodiert wird. Es ist auch möglich, dass ein Teil oder sogar die gesamte e2-Region in der DNA kodiert wird. Wie viel von e2 tatsächlich als Vorlage verwendet wird, hängt von seiner Beschaffenheit ab und davon, ob diese Beschaffenheit die Funktion der DNA-Polymerase unterbricht.
    • Die Ausführungsform von 3E zeigt die Struktur einer anderen pegRNA, die hier in Betracht gezogen wird. Die pegRNA besteht aus drei Hauptbestandteilen, die in 5'- zu 3'- Richtung angeordnet sind, nämlich: einem Spacer, einem gRNA-Kern und einem Erweiterungsarm am 3'-Ende. Der Erweiterungsarm kann ferner in die folgenden Strukturelemente in 5'- bis 3'-Richtung unterteilt werden: eine Primerbindungsstelle (A), eine Edit-Template (B) und ein Homologiearm (C). Darüber hinaus kann die pegRNA eine optionale 3'-Endmodifizierungsregion (e1) und eine optionale 5'-Endmodifizierungsregion (e2) umfassen. Darüber hinaus kann die pegRNA ein Transkriptionsterminationssignal am 3'- Ende der pegRNA umfassen (nicht dargestellt). Diese Strukturelemente werden hier weiter definiert. Die Darstellung der Struktur der pegRNA ist nicht als einschränkend zu verstehen und schließt Variationen in der Anordnung der Elemente mit ein. Zum Beispiel könnten die optionalen Sequenzmodifikatoren (e1) und (e2) innerhalb oder zwischen den anderen gezeigten Regionen positioniert werden und sind nicht darauf beschränkt, sich an den 3'- und 5'-Enden zu befinden. Die pegRNA könnte in bestimmten Ausführungsformen sekundäre RNA- Strukturen umfassen, wie z. B. Haarnadeln, Stamm/Schleifen, Toeloop, RNA-bindende Protein-Rekrutierungsdomänen (z. B. das MS2-Aptamer, das das MS2cp-Protein rekrutiert und daran bindet). Diese Sekundärstrukturen können überall im pegRNA-Molekül platziert werden. Solche Sekundärstrukturen können sich zum Beispiel innerhalb des Spacers, des gRNA-Kerns oder des Erweiterungsarms und insbesondere innerhalb der e1- und/oder e2- Modifikatorregionen befinden. Zusätzlich zu den sekundären RNA-Strukturen könnten die pegRNAs (z. B. innerhalb der e1- und/oder e2-Modifikatorregionen) einen chemischen Linker oder einen Poly(N)-Linker oder -Schwanz umfassen, wobei „N“ eine beliebige Nukleobase sein kann. In einigen Ausführungsformen (z. B. wie in 72(c)), kann der chemische Linker dazu dienen, die reverse Transkription des sgRNA-Gerüsts oder -Kerns zu verhindern. Außerdem können Sie in bestimmten Ausführungsformen (siehe z. B. 72(c)) könnte der Erweiterungsarm (3) aus RNA oder DNA bestehen und/oder eine oder mehrere Nukleobasen- Analoga enthalten (die z. B. zusätzliche Funktionen wie Temperaturbeständigkeit bieten könnten). Darüber hinaus kann die Ausrichtung des Erweiterungsarms (3) in der natürlichen 5'-zu-3'-Richtung erfolgen oder in der entgegengesetzten Ausrichtung in der 3'-zu-5'-Richtung synthetisiert werden (relativ zur Ausrichtung des pegRNA-Moleküls insgesamt). Es wird auch darauf hingewiesen, dass ein Fachmann in der Lage ist, je nach Art der Nukleinsäurematerialien des Erweiterungsarms (d. h. DNA oder RNA) eine geeignete DNA- Polymerase für die Verwendung beim Prime-Editing auszuwählen, die entweder als Fusion mit dem napDNAbp oder in trans als separate Einheit bereitgestellt werden kann, um den gewünschten Template-kodierten 3' Einzelstrang-DNA-Flap zu synthetisieren, der die gewünschte Editierung enthält. Wenn der Erweiterungsarm beispielsweise RNA ist, dann könnte die DNA-Polymerase eine reverse Transkriptase oder eine andere geeignete RNA- abhängige DNA-Polymerase sein. Wenn der Erweiterungsarm jedoch DNA ist, dann könnte die DNA-Polymerase eine DNA-abhängige DNA-Polymerase sein. In verschiedenen Ausführungsformen könnte die Bereitstellung der DNA-Polymerase in trans erfolgen, z. B. durch die Verwendung einer RNA-Protein-Rekrutierungsdomäne (z. B. eine MS2-Haarnadel, die auf der pegRNA installiert ist (z. B. in der e1- oder e2-Region oder an anderer Stelle und ein MS2cp-Protein, das mit der DNA-Polymerase fusioniert ist, wodurch die DNA-Polymerase an die pegRNA kolokalisiert wird). Es wird auch darauf hingewiesen, dass die Primerbindungsstelle im Allgemeinen keinen Teil der Vorlage bildet, die von der DNA- Polymerase (z. B. der reversen Transkriptase) verwendet wird, um den resultierenden 3'- Einzelstrang-DNA-Flap zu kodieren, der den gewünschten Schnitt enthält. Die Bezeichnung „DNA-Synthese-Template“ bezieht sich also auf die Region oder den Teil des Erweiterungsarms (3), der von der DNA-Polymerase als Matrize verwendet wird, um den gewünschten 3'-Einzelstrang-DNA-Flap zu kodieren, der den Schnitt und die Regionen der Homologie zum 5'-endogenen Einzelstrang-DNA-Flap enthält, der durch das 3'-Einzelstrang- DNA-Strangprodukt der Prime-Editing-DNA-Synthese ersetzt wird. In einigen Ausführungsformen enthält die DNA-Synthese-Template die „Edit-Template“ und den „Homologiearm“ oder einen oder mehrere Homologiearme, z. B. vor und nach der Edit- Template. Die Edit-Template kann so klein wie eine einzelne Nukleotidsubstitution sein, oder es kann sich um eine Insertion oder eine Inversion der DNA handeln. Darüber hinaus kann die Edit-Template auch eine Deletion enthalten, die durch die Kodierung eines Homologiearms, der eine gewünschte Deletion enthält, erzeugt werden kann. In anderen Ausführungsformen kann die DNA-Synthese-Template auch die e2-Region oder einen Teil davon enthalten. Wenn die e2-Region beispielsweise eine Sekundärstruktur enthält, die eine Beendigung der DNA- Polymerase-Aktivität bewirkt, dann ist es möglich, dass die DNA-Polymerase-Funktion beendet wird, bevor ein Teil der e2-Region tatsächlich in die DNA kodiert wird. Es ist auch möglich, dass ein Teil oder sogar die gesamte e2-Region in der DNA kodiert wird. Wie viel von e2 tatsächlich als Vorlage verwendet wird, hängt von seiner Beschaffenheit ab und davon, ob diese Beschaffenheit die Funktion der DNA-Polymerase unterbricht.
    • Die schematische Darstellung von 3F zeigt die Interaktion einer typischen pegRNA mit einer Zielstelle einer doppelsträngigen DNA und die gleichzeitige Produktion eines 3' einzelsträngigen DNA-Flaps, der die gewünschte genetische Veränderung enthält. Die doppelsträngige DNA ist mit dem oberen Strang (d. h. dem Zielstrang) in der 3' zu 5'- Ausrichtung und dem unteren Strang (d. h. dem PAM-Strang oder Nicht-Zielstrang) in der 5' zu 3'-Richtung dargestellt. Der obere Strang besteht aus dem Komplement des „Protospacers“ und dem Komplement der PAM-Sequenz und wird als „Zielstrang“ bezeichnet, weil er der Strang ist, der an den Spacer der pegRNA anknüpft. Der komplementäre untere Strang wird als „Nicht-Ziel-Strang“ oder „PAM-Strang“ oder „Protospacer-Strang“ bezeichnet, da er die PAM-Sequenz (z. B. NGG) und den Protospacer enthält. Obwohl nicht gezeigt, würde die abgebildete pegRNA mit einer Cas9-Domäne oder einer entsprechenden Domäne eines Prime- Editor-Fusionsproteins komplexiert werden. Wie im Schema dargestellt, bindet der Spacer der pegRNA an die komplementäre Region des Protospacers auf dem Zielstrang. Diese Interaktion bildet ein DNA/RNA-Hybrid zwischen der Spacer-RNA und dem Komplement der Protospacer-DNA und führt zur Bildung einer R-Schleife im Protospacer. Wie an anderer Stelle hierin beschrieben, induziert das Cas9-Protein (nicht gezeigt) dann einen Nick in den Nicht-Zielstrang, wie gezeigt. Dies führt dann zur Bildung der 3' ssDNA-Flap-Region unmittelbar stromaufwärts der Einkerbung, die gemäß *z* mit dem 3'-Ende der pegRNA an der Primerbindungsstelle interagiert. Das 3'-Ende der ssDNA-Flap (d. h. die Primer-Sequenz für die reverse Transkriptase) bindet an die Primer-Bindungsstelle (A) auf der pegRNA, wodurch die reverse Transkriptase geprimt wird. Als Nächstes polymerisiert die reverse Transkriptase (z. B. in trans oder cis als Fusionsprotein an das Cas9-Konstrukt gebunden) einen einzelnen DNA-Strang, der durch die DNA-Synthesematrix (einschließlich der Edit- Template (B) und des Homologiearms (C)) kodiert ist. Die Polymerisation setzt sich zum 5'- Ende des Erweiterungsarms hin fort. Der polymerisierte Strang der ssDNA bildet einen ssDNA 3'-End-Flap, der, wie an anderer Stelle beschrieben (z. B. wie in 1G), in die endogene DNA eindringt, den entsprechenden endogenen Strang (der als 5'-End-DNA-Flap von der endogenen DNA entfernt wird) verdrängt und den gewünschten Nukleotid-Edit (Änderung eines einzelnen Nukleotid-Basenpaares, Deletionen, Insertionen (einschließlich ganzer Gene) durch natürlich auftretende DNA-Reparatur-/Replikationsrunden installiert.
    • 3G zeigt eine weitere Ausführungsform der hier in Betracht gezogenen Hauptbearbeitung. Insbesondere zeigt das obere Schema eine Ausführungsform eines Prime Editors (PE), der ein Fusionsprotein aus einem napDNAbp (z. B. SpCas9) und einer Polymerase (z. B. einer reversen Transkriptase) umfasst, die durch einen Linker verbunden sind. Das PE bildet einen Komplex mit einer pegRNA durch Bindung an den gRNA-Kern der pegRNA. In der gezeigten Ausführungsform ist die pegRNA mit einem 3'-Erweiterungsarm ausgestattet, der, beginnend am 3'-Ende, eine Primerbindungsstelle (PBS) gefolgt von einer DNA-Synthese-Template umfasst. Das untere Schema zeigt eine Variante eines Prime- Editors, die als „trans Prime Editor (tPE)“ bezeichnet wird In dieser Ausführungsform werden die DNA-Synthese-Template und PBS von der pegRNA entkoppelt und auf einem separaten Molekül präsentiert, das als trans Prime Editor RNA-Template („tPERT“) bezeichnet wird und eine RNA-Protein-Rekrutierungsdomäne (z. B. eine MS2-Haarnadel) umfasst. Das PE selbst ist so modifiziert, dass es mit einem rPERT-Rekrutierungsprotein („RP“) fusioniert ist. RP ist ein Protein, das die RNA-Protein-Rekrutierungsdomäne spezifisch erkennt und daran bindet. In dem Beispiel, in dem die RNA-Protein-Rekrutierungsdomäne ein MS2-Hairpin ist, kann das entsprechende rPERT-Rekrutierungsprotein MS2cp des MS2-Tagging-Systems sein. Das MS2-Tagging-System basiert auf der natürlichen Wechselwirkung des MS2-Bakteriophagen- Hüllproteins („MCP“ oder „MS2cp“) mit einer im Genom des Phagen vorhandenen Stielschleifen- oder Haarnadelstruktur, d. h. der „MS2-Haarnadel“ oder dem „MS2-Aptamer“. Im Falle des trans-Prime-Editing „rekrutiert“ der RP-PE:gRNA-Komplex ein tPERT, das die entsprechende RNA-Protein-Rekrutierungsdomäne besitzt, um mit dem PE:gRNA-Komplex zu kolokalisieren, wodurch die PBS- und DNA-Synthese-Template in trans für die Verwendung beim Prime-Editing bereitgestellt wird, wie in dem in 3H dargestellten Beispiel gezeigt.
    • 3H zeigt den Prozess der Trans-Prime-Editing. In dieser Ausführungsform umfasst der trans-Prime-Editor einen „PE2“-Prime-Editor (d. h. eine Fusion von Cas9(H840A) und einer Variante von MMLV RT), der mit einem MS2cp-Protein fusioniert ist (d. h. einer Art von Rekrutierungsprotein, das ein MS2-Aptamer erkennt und daran bindet) und der mit einer sgRNA (d. h. einer Standard-Guide-RNA im Gegensatz zu einer pegRNA) komplexiert ist. Der trans-Prime-Editor bindet sich an die Ziel-DNA und schneidet den Nicht-Zielstrang ein. Das MS2cp-Protein rekrutiert ein tPERT in trans durch die spezifische Interaktion mit der RNA-Protein-Rekrutierungsdomäne auf dem tPERT-Molekül. Der tPERT wird mit dem trans- Prime-Editor kolokalisiert, wodurch die Funktionen von PBS und der DNA-Synthese- Template in trans für die Verwendung durch die Polymerase der reversen Transkriptase bereitgestellt werden, um einen einzelsträngigen DNA-Flap mit einem 3'-Ende zu synthetisieren, der die gewünschte genetische Information enthält, die von der DNA-Synthese- Template kodiert wird.
    • 4A-4E zeigen in vitro TPRT-Assays (d. h. Prime-Editing-Assays). 4A ist ein Schema der fluoreszenzmarkierten DNA-Substrate gRNA, die durch ein RT-Enzym, PAGE, verlängert werden. 4B zeigt TPRT (d. h. Prime Editing) mit vorgenickten Substraten, dCas9 und 5'-erweiterten gRNAs unterschiedlicher Länge der Synthese-Template. 4C zeigt die RT-Reaktion mit vorgekerbten DNA-Substraten in Abwesenheit von Cas9. 4D zeigt TPRT (d. h. Prime Editing) auf vollständigen dsDNA-Substraten mit Cas9(H840A) und 5'-extended gRNAs. 4E zeigt eine 3'-erweiterte gRNA-Vorlage mit vorgenickten und vollständigen dsDNA-Substraten. Alle Reaktionen sind mit M-MLV RT.
    • 5 zeigt In-vitro-Validierungen unter Verwendung von 5'-extended gRNAs mit unterschiedlich langen Synthese-Templates. Als Substrate wurden fluoreszenzmarkierte (Cy5) DNA-Targets verwendet, die in dieser Versuchsreihe mit einem Einschnitt versehen wurden. Bei dem in diesen Experimenten verwendeten Cas9 handelt es sich um katalytisch totes Cas9 (dCas9), und die verwendete RT ist Superscript III, eine kommerzielle RT, die aus dem Moloney-Murine Leukemia Virus (M-MLV) gewonnen wurde. dCas9:gRNA-Komplexe wurden aus gereinigten Komponenten gebildet. Dann wurde das fluoreszierend markierte DNA-Substrat zusammen mit dNTPs und dem RT-Enzym hinzugefügt. Nach 1 Stunde Inkubation bei 37 °C wurden die Reaktionsprodukte mittels denaturierender Hamstoff- Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) analysiert. Das Gelbild zeigt die Erweiterung des ursprünglichen DNA-Strangs auf Längen, die mit der Länge der Vorlage für die reverse Transkription übereinstimmen.
    • 6 zeigt In-vitro-Validierungen unter Verwendung von 5'-erweiterten gRNAs mit unterschiedlich langen Synthese-Templates, die denen in 5 sehr ähnlich sind. Allerdings sind die DNA-Substrate in dieser Reihe von Experimenten nicht vorgekerbt. Das in diesen Experimenten verwendete Cas9 ist eine Cas9-Nickase (SpyCas9 H840A-Mutante) und die verwendete RT ist Superscript III, eine kommerzielle RT, die vom Moloney-Murine Leukemia Virus (M-MLV) abgeleitet ist. Die Reaktionsprodukte wurden mittels denaturierender Harnstoff-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) analysiert. Wie im Gel zu sehen ist, schneidet die Nickase den DNA-Strang effizient, wenn die Standard-gRNA verwendet wird (gRNA_0, Spur 3).
    • 7 zeigt, dass 3'-Erweiterungen die DNA-Synthese unterstützen und die Cas9- Nickase-Aktivität nicht signifikant beeinflussen. Vorgeschnittene Substrate (schwarzer Pfeil) werden nahezu quantitativ in RT-Produkte umgewandelt, wenn entweder dCas9 oder Cas9- Nickase verwendet wird (Spuren 4 und 5). Mehr als 50 % Umwandlung in das RT-Produkt (roter Pfeil) wird mit vollen Substraten (Spur 3) beobachtet. Cas9-Nickase (SpyCas9 H840A- Mutante), katalytisch totes Cas9 (dCas9) und Superscript III, eine kommerzielle RT, die vom Moloney-Murine Leukemia Virus (M-MLV) abgeleitet ist, werden verwendet.
    • 8 zeigt zweifarbige Experimente, die verwendet wurden, um festzustellen, ob die RT-Reaktion vorzugsweise mit der gRNA in cis (im gleichen Komplex gebunden) stattfindet. Zwei separate Experimente wurden für 5'-erweiterte und 3'-erweiterte gRNAs durchgeführt. Die Produkte wurden mittels PAGE analysiert. Produktverhältnis berechnet als (Cy3cis/Cy3trans) / (Cy5trans/Cy5cis).
    • 9A-9D zeigt ein Flap-Modell-Substrat. 9A zeigt einen Dual-FP-Reporter für die Flap-directed Mutagenese. 9B zeigt die Stopcodon-Reparatur in HEK-Zellen. 9C zeigt sequenzierte Hefeklone nach der Flap-Reparatur. 9D zeigt den Test verschiedener Flap-Merkmale in menschlichen Zellen.
    • 10 demonstriert das Prime Editing auf Plasmidsubstraten. Ein dualfluoreszierendes Reporterplasmid wurde für die Expression in Hefe (S. cerevisiae) konstruiert. Die Expression dieses Konstrukts in Hefe produziert nur GFP. Die In-vitro-Prime-Editing- Reaktion führt eine Punktmutation ein und transformiert das Elternplasmid oder ein in vitro Cas9(H840A)-Nicked-Plasmid in Hefe. Die Kolonien werden durch Fluoreszenzbildgebung sichtbar gemacht. Hefe-Dual-FP-Plasmid-Transformanten sind abgebildet. Die Transformation des Elternplasmids oder eines in vitro Cas9(H840A) nicked Plasmids führt nur zu grünen GFP exprimierenden Kolonien. Die Prime-Editing-Reaktion mit 5'-erweiterten oder 3'-erweiterten gRNAs erzeugt eine Mischung aus grünen und gelben Kolonien. Letztere exprimieren sowohl GFP als auch mCherry. Es werden mehr gelbe Kolonien mit der 3'erweiterten gRNA beobachtet. Eine positive Kontrolle, die kein Stopcodon enthält, ist ebenfalls abgebildet.
    • 11 zeigt das Prime Editing auf Plasmidsubstraten ähnlich dem Experiment in 10, aber anstatt eine Punktmutation in das Stopcodon einzubauen, wird beim Prime Editing eine einzelne Nukleotid-Insertion (links) oder -Deletion (rechts) eingebaut, die eine Frameshift-Mutation repariert und die Synthese von mCherry im Downstream ermöglicht. In beiden Experimenten wurden 3' erweiterte gRNAs verwendet.
    • 12 zeigt Editing-Produkte von Prime Editing auf Plasmidsubstraten, die durch Sanger-Sequenzierung charakterisiert wurden. Einzelne Kolonien aus den TRT- Transformationen wurden ausgewählt und mittels Sanger-Sequenzierung analysiert. Bei der Sequenzierung ausgewählter Kolonien wurden präzise Veränderungen beobachtet. Die grünen Kolonien enthielten Plasmide mit der ursprünglichen DNA-Sequenz, während die gelben Kolonien die präzise Mutation enthielten, die durch die Prime Editing gRNA erzeugt wurde. Es wurden keine weiteren Punktmutationen oder Indels beobachtet.
    • 13 zeigt die potenziellen Möglichkeiten der neuen Prime-Editing-Technologie auf und vergleicht sie mit Deaminase-vermittelten Base-Editing-Technologien.
    • 14 zeigt ein Schema des Editierens in menschlichen Zellen.
    • 15 zeigt die Erweiterung der Primerbindungsstelle in gRNA.
    • 16 zeigt verkürzte gRNAs für das benachbarte Targeting.
    • 17A-17C sind Diagramme, die die prozentuale Umwandlung von T in A am Zielnukleotid nach Transfektion der Komponenten in menschlichen embryonalen Nierenzellen (HEK-Zellen) zeigen. 17A zeigt Daten, die Ergebnisse unter Verwendung einer N- terminalen Fusion der unmutierten MLV-Reverse-Transkriptase mit Cas9(H840A)-Nickase (32-Aminosäure-Linker) darstellen. 17B ist ähnlich wie 17A, aber für die C- terminale Fusion des RT-Enzyms. 17C ist ähnlich wie 17A, aber der Linker zwischen dem MLV RT und Cas9 ist 60 Aminosäuren lang statt 32 Aminosäuren.
    • 18 zeigt eine hochreine T-zu-A-Editierung an der HEK3-Stelle durch Hochdurchsatz-Amplikonsequenzierung. Das Ergebnis der Sequenzierungsanalyse zeigt die am häufigsten vorkommenden Genotypen der bearbeiteten Zellen an.
    • 19 zeigt die Editiereffizienz am Zielnukleotid (blaue Balken) und die Indel-Raten (orangefarbene Balken). WT bezieht sich auf den unmutierten Typ des MLV RT-Enzyms. Die mutierten Enzyme (M1 bis M4) enthalten die rechts aufgeführten Mutationen. Die Editierraten wurden durch Hochdurchsatz-Sequenzierung von genomischen DNA-Amplikons quantifiziert.
    • 20 zeigt die Editiereffizienz des Zielnukleotids, wenn ein Einzelstrang-Nick in den komplementären DNA-Strang in der Nähe des Zielnukleotids eingeführt wird. Getestet wurde das Nicking in verschiedenen Abständen vom Zielnukleotid (Dreiecke). Die Editiereffizienz am Zielbasenpaar (blaue Balken) wird zusammen mit der Indel-Bildungsrate (orangefarbene Balken) gezeigt. Das Beispiel „keine“ enthält keine komplementäre Strang- Nicking-Guide-RNA. Die Editierraten wurden durch Hochdurchsatz-Sequenzierung von genomischen DNA-Amplikons quantifiziert.
    • 21 zeigt aufbereitete Hochdurchsatz-Sequenzierungsdaten, die die gewünschte T- zu-A-Transversionsmutation und das generelle Fehlen anderer wichtiger Genom-Editing- Nebenprodukte zeigen.
    • 22 zeigt eine schematische Darstellung eines beispielhaften Verfahrens zur Durchführung einer gezielten Mutagenese mit einer fehleranfälligen reversen Transkriptase an einem Ziellocus unter Verwendung eines programmierbaren DNA-Bindungsproteins (napDNAbp), das mit einer erweiterten Guide-RNA komplexiert ist, d. h. Prime Editing mit einer fehleranfälligen RT. Dieser Prozess kann als eine Ausführungsform des Prime Editing für die gezielte Mutagenese bezeichnet werden. Die erweiterte Guide-RNA umfasst eine Erweiterung am 3'- oder 5'-Ende der Guide-RNA oder an einer intramolekularen Stelle in der Guide-RNA. In Schritt (a) kontaktiert der napDNAbp/gRNA-Komplex das DNA-Molekül und die gRNA leitet das napDNAbp zur Bindung an den zu mutierenden Ziellocus. In Schritt (b) wird eine Einkerbung in einen der DNA-Stränge des Ziellocus eingeführt (z. B. durch eine Nuklease oder einen chemischen Wirkstoff), wodurch ein verfügbares 3'-Ende in einem der Stränge des Ziellocus entsteht. In bestimmten Ausführungsformen wird der Nick in dem DNA- Strang erzeugt, der dem R-Loop-Strang entspricht, d. h. dem Strang, der nicht mit der RNA- Führungssequenz hybridisiert ist. In Schritt (c) interagiert der DNA-Strang am 3'-Ende mit dem erweiterten Teil der Guide-RNA, um die reverse Transkription zu starten. In bestimmten Ausführungsformen hybridisiert der DNA-Strang mit dem 3'-Ende an eine spezifische RT- Priming-Sequenz auf dem erweiterten Teil der Guide-RNA. In Schritt (d) wird eine fehleranfällige reverse Transkriptase eingeführt, die einen mutierten DNA-Einzelstrang vom 3'-Ende der Primed Site zum 3'-Ende der Guide-RNA synthetisiert. Exemplarische Mutationen sind mit einem Sternchen „*“ gekennzeichnet. Dadurch entsteht ein einzelsträngiger DNA- Flap, der die gewünschte mutierte Region enthält. In Schritt (e) werden das napDNAbp und die Guide-RNA freigesetzt. Die Schritte (f) und (g) beziehen sich auf die Auflösung des einzelsträngigen DNA-Flaps (der die mutagenisierte Region umfasst), so dass die gewünschte mutagenisierte Region in den Ziellocus eingebaut wird. Dieser Prozess kann in Richtung der gewünschten Produktbildung vorangetrieben werden, indem der entsprechende 5' endogene DNA-Flap entfernt wird, der sich bildet, sobald der 3'-Einzelstrang-DNA-Flap eindringt und mit der komplementären Sequenz auf dem anderen Strang hybridisiert. Der Prozess kann auch zur Produktbildung mit einem zweiten Strang führen, wie in 1F gezeigt. Nach endogenen DNA-Reparatur- und/oder Replikationsprozessen wird die mutierte Region in beide DNA- Stränge des DNA-Locus eingebaut.
    • 23 ist ein Schema des gRNA-Designs für die Kontraktion von Trinukleotid- Repeat-Sequenzen und die Kontraktion von Trinukleotid-Repeats mit TPRT-Genom-Editing (d. h. Prime Editing). Die Expansion von Trinukleotid-Repeats wird mit einer Reihe von menschlichen Krankheiten in Verbindung gebracht, darunter die Huntington-Krankheit, das Fragile-X-Syndrom und die Friedreich-Ataxie. Die häufigste Trinukleotidwiederholung enthält CAG-Tripletts, obwohl auch GAA-Tripletts (Friedreich-Ataxie) und CGG-Tripletts (Fragiles X-Syndrom) vorkommen. Die Vererbung einer Veranlagung zur Expansion oder der Erwerb eines bereits expandierten elterlichen Allels erhöht die Wahrscheinlichkeit, die Krankheit zu bekommen. Pathogene Expansionen von Trinukleotid-Wiederholungen könnten hypothetisch durch Prime Editing korrigiert werden. Eine Region stromaufwärts der Repeat-Region kann von einer RNA-gesteuerten Nuklease eingekerbt werden, um dann die Synthese eines neuen DNA-Strangs zu starten, der eine gesunde Anzahl von Repeats enthält (die von dem jeweiligen Gen und der Krankheit abhängt). Nach der Wiederholungssequenz wird ein kurzer Abschnitt der Homologie hinzugefügt, der mit der Identität der Sequenz am anderen Ende der Wiederholung (roter Strang) übereinstimmt. Die Invasion des neu synthetisierten Strangs und der anschließende Ersatz der endogenen DNA durch den neu synthetisierten Flap führt zu einem kontrahierten Wiederholungsallel.
    • 24 ist eine schematische Darstellung der präzisen 10-Nukleotid-Deletion mit Prime Editing. Eine Guide-RNA, die auf den HEK3-Locus abzielt, wurde mit einer Vorlage für die reverse Transkription entworfen, die für eine 10-Nukleotid-Deletion nach der Einkerbung kodiert. Die Editing-Effizienz in transfizierten HEK-Zellen wurde durch Amplikon-Sequenzierung ermittelt.
    • 25 ist eine schematische Darstellung des gRNA-Designs für das Peptid-Tagging von Genen an endogenen genomischen Loci und das Peptid-Tagging mit TPRT-Genom- Editing (d. h. Prime Editing). Die Markierungssysteme FlAsH und ReAsH bestehen aus zwei Teilen: (1) eine fluorophor-biarsenische Sonde und (2) ein genetisch kodiertes Peptid, das ein Tetracystein-Motiv enthält, beispielhaft dargestellt durch die Sequenz FLNCCPGCCMEP (SEQ-ID-NR.: 1). Wenn sie in Zellen exprimiert werden, können Proteine, die das Tetracystein-Motiv enthalten, mit Fluorophor-Arsen-Sonden fluoreszierend markiert werden (siehe Ref: J. Am. Chem. Soc., 2002, 124 (21), S. 6063-6076. DOI: 10.1021/ja017687n). Das „Sortagging“-System verwendet bakterielle Sortase-Enzyme, die markierte Peptidsonden kovalent an Proteine konjugieren, die geeignete Peptidsubstrate enthalten (siehe Referenz): Nat. Chem. Biol. 2007 Nov;3(11):707-8. DOI: 10.1038/nchembio.2007.31). Die FLAG-Marke (DYKDDDDK (SEQ-ID-NR.: 2)), V5-Tag (GKPIPNPLLGLDST (SEQ-ID-NR.: 3)), GCN4- Tag (EELLSKNYHLENEVARLKK (SEQ-ID-NR.: 4)), HA-Tag (YPYDVPDYA (SEQ-ID- NR.: 5)) und Myc-Tag (EQKLISEEDL (SEQ-ID-NR.: 6)) werden üblicherweise als Epitop- Tags für Immunoassays verwendet. Der pi-Clamp kodiert eine Peptidsequenz (FCPF (SEQ- ID-NR.: 622)), die mit einem pentafluoro-aromatischen Substrat markiert werden können (Ref: Nat. Chem. 2016 Feb;8(2):120-8. doi: 10.1038/nchem.2413).
    • 26A zeigt den präzisen Einbau eines His6-Tags und eines FLAG-Tags in genomische DNA. Mit einer Vorlage für die reverse Transkription, die entweder für eine 18- nt His-Tag-Insertion oder eine 24-nt FLAG-Tag-Insertion kodiert, wurde eine Guide-RNA entworfen, die auf den HEK3-Locus abzielt. Die Editing-Effizienz in transfizierten HEK- Zellen wurde durch Amplikon-Sequenzierung ermittelt. Beachten Sie, dass die gesamte 24-nt- Sequenz des FLAG-Tags außerhalb des Sichtfeldes liegt (die Sequenzierung bestätigte die vollständige und präzise Insertion). 26B zeigt eine schematische Darstellung verschiedener Anwendungen, bei denen die Markierung von Proteinen/Peptiden eine Rolle spielt. Dazu gehören (a) die Löslichkeit oder Unlöslichkeit von Proteinen, (b) die Veränderung oder Verfolgung der zellulären Lokalisierung eines Proteins, (c) die Erweiterung der Halbwertszeit eines Proteins, (d) die Erleichterung der Proteinreinigung und (e) die Erleichterung des Nachweises von Proteinen.
    • 27 zeigt einen Überblick über das Prime Editing durch Einfügen einer schützenden Mutation in PRNP, die das Fortschreiten der Prionenkrankheit verhindert oder aufhält. Die pegRNA-Sequenzen entsprechen den Restnummern 1-20 von SEQ-ID-NR.: 810 auf der linken Seite (d. h. 5' des sgRNA-Gerüsts) und den Restnummern 21-43 der SEQ-ID- NR.: 810 auf der rechten Seite (d. h. 3' des sgRNA-Gerüsts).
    • 28A ist eine schematische Darstellung der PE-basierten Insertion von Sequenzen, die RNA-Motive kodieren. 28B ist eine (nicht erschöpfende) Liste einiger Beispielmotive, die möglicherweise eingefügt werden könnten, und ihrer Funktionen.
    • 29A ist eine FIGildung eines Prime Editors. 29B zeigt mögliche Modifikationen an genomischer, Plasmid- oder viraler DNA, die durch ein PE gesteuert werden. 29C zeigt ein Beispielschema für die Insertion einer Bibliothek von Peptidschleifen in ein bestimmtes Protein (in diesem Fall GFP) über eine Bibliothek von pegRNAs. 29D zeigt ein Beispiel für mögliche programmierbare Deletionen von Codons oder N- oder C-terminale Verkürzungen eines Proteins unter Verwendung verschiedener pegRNAs. Es wird erwartet, dass Deletionen mit minimaler Generierung von Frameshift- Mutationen auftreten.
    • 30 zeigt ein mögliches Schema für die iterative Insertion von Codons in einem System der kontinuierlichen Evolution, wie z. B. PACE.
    • 31 ist eine Illustration einer konstruierten gRNA, die den gRNA-Kern, den ~20nt- Spacer, der mit der Sequenz des Zielgens übereinstimmt, die Vorlage für die reverse Transkription mit der Nukleotidsequenz des immunogenen Epitops und die Primerbindungsstelle, die mit der Sequenz des Zielgens übereinstimmt, zeigt.
    • 32 ist ein Schema, das die Verwendung von Prime Editing als Mittel zum Einfügen bekannter immunogener Epitope in endogene oder fremde genomische DNA zeigt, was zu einer Veränderung der entsprechenden Proteine führt.
    • 33 ist eine schematische Darstellung des pegRNA-Designs für Primerbindungssequenz-Insertionen und Primerbindungs-Insertionen in genomische DNA unter Verwendung von Prime-Editing zur Bestimmung von Off-Target-Editing. In dieser Ausführungsform wird das Prime Editing in einer lebenden Zelle, einem Gewebe oder einem Tiermodell durchgeführt. In einem ersten Schritt wird eine geeignete pegRNA entworfen. Das obere Schema zeigt eine beispielhafte pegRNA, die in diesem Aspekt verwendet werden kann. Der Spacer in der pegRNA (als „Protospacer“ bezeichnet) ist komplementär zu einem der Stränge des genomischen Ziels. Der PE:pegRNA-Komplex (d. h. der PE-Komplex) installiert einen einzelsträngigen 3'-End-Flap an der Einkerbung, der die kodierte PrimerBindungssequenz und die Region der Homologie (kodiert durch den Homologiearm der pegRNA) enthält, die komplementär zu der Region direkt stromabwärts der Einkerbung (in rot) ist. Durch Flap-Invasion und DNA-Reparatur-/Replikationsprozesse wird der synthetisierte Strang in die DNA eingebaut, wodurch die Primer-Bindungsstelle installiert wird. Dieser Prozess kann am gewünschten genomischen Ziel stattfinden, aber auch an anderen genomischen Stellen, die mit der pegRNA in einer Off-Target-Weise interagieren könnten (d. h. die pegRNA leitet den PE-Komplex aufgrund der Komplementarität der Spacer-Region zu anderen genomischen Stellen, die nicht die beabsichtigte genomische Stelle sind, zu anderen Off-Target-Stellen). So kann die Primerbindungssequenz nicht nur am gewünschten genomischen Ziel, sondern auch an anderen genomischen Stellen im Genom installiert werden. Um die Insertion dieser Primer-Bindungsstellen sowohl an den beabsichtigten genomischen Zielstellen als auch an den genomischen Off-Target-Stellen nachzuweisen, kann die genomische DNA (nach der PE) isoliert, fragmentiert und an Adapternukleotide (in rot dargestellt) ligiert werden. Als Nächstes kann die PCR mit PCR-Oligonukleotiden durchgeführt werden, die an die Adapter und an die eingefügte Primerbindungssequenz binden, um On-Target- und Off-Target-Regionen der genomischen DNA zu amplifizieren, in die die Primerbindungsstelle durch PE eingefügt wurde. Anschließend kann eine Hochdurchsatz- Sequenzierung durchgeführt und die Sequenzen können abgeglichen werden, um die Einfügepunkte der mit PE eingefügten Primer-Bindungssequenzen entweder an der On-Target- Stelle oder an Off-Target-Stellen zu identifizieren.
    • 34 ist ein Schema, das die genaue Insertion eines Gens mit PE zeigt.
    • 35A ist eine schematische Darstellung des natürlichen Insulin-Signalwegs. 35B ist ein Schema, das die Aktivierung des FKBP12-markierten Insulinrezeptors durch FK1012 zeigt.
    • 36 zeigt kleinmolekulare Monomere. Referenzen: gestoßenes FK506 Nachahmerprodukt (2)107
    • 37A-37B zeigen kleinmolekulare Dimere. Referenzen: FK1012 495,96; FK1012 5108; FK1012 6107; AP1903 7107; Cyclosporin A Dimer 898; FK506-Cyclosporin A Dimer (FkCsA) 9100.
    • 38A-38F geben einen Überblick über das Prime Editing und Machbarkeitsstudien in vitro und in Hefezellen. 38A zeigt die 75.122 bekannten pathogenen menschlichen genetischen Varianten in ClinVar (Zugriff im Juli 2019), klassifiziert nach Typ. 38B zeigt, dass ein Prime-Editing-Komplex aus einem Prime-Editor (PE)-Protein besteht, das eine RNA-gesteuerte DNA-Nicking-Domäne enthält, wie z. B. Cas9-Nickase, fusioniert mit einer konstruierten Reversen Transkriptase-Domäne und komplexiert mit einer Prime-Editing- Guide-RNA (pegRNA). Der PE:pegRNA-Komplex bindet an die Ziel-DNA und ermöglicht eine Vielzahl präziser DNA-Editierungen an einer Vielzahl von DNA-Positionen vor oder nach dem Protospacer-benachbartes Motiv (PAM) der Ziel-DNA. 38C zeigt, dass der PE:pegRNA-Komplex nach der Bindung an das DNA-Ziel den PAM-haltigen DNA-Strang einschneidet. Das resultierende freie 3'-Ende hybridisiert mit der Primer-Bindungsstelle der pegRNA. Die Domäne der reversen Transkriptase katalysiert die Primer-Erweiterung unter Verwendung der RT-Template der pegRNA, was zu einem neu synthetisierten DNA-Strang führt, der den gewünschten Schnitt (den 3'-Flap) enthält. Das Gleichgewicht zwischen dem editierten 3'-Flap und dem uneditierten 5'-Flap, der die ursprüngliche DNA enthält, gefolgt von der zellulären 5'-Flap-Spaltung und -Ligation und der DNA-Reparatur oder -Replikation, um die Heteroduplex-DNA aufzulösen, führt zu einer stabil editierten DNA. 38D zeigt in vitro 5'-erweiterte pegRNA-Primer-Erweiterungsassays mit vorgekerbten dsDNA-Substraten, die 5'-Cy5-markierte PAM-Stränge, dCas9 und eine kommerzielle M-MLV-RT-Variante (RT, Superscript III) enthalten. dCas9 wurde mit pegRNAs komplexiert, die RT-Templates unterschiedlicher Länge enthalten, und dann zusammen mit den angegebenen Komponenten zu den DNA-Substraten gegeben. Die Reaktionen wurden 1 Stunde lang bei 37 °C inkubiert, dann mittels denaturierender HarnstoffPAGE analysiert und auf Cy5-Fluoreszenz visualisiert.
    • 38E zeigt Primer-Erweiterungsassays, die wie in 38D unter Verwendung von 3'erweiterten pegRNAs durchgeführt werden, die mit dCas9 oder Cas9 H840A-Nickase vorkomplexiert sind, und mit 5'-Cy5-markierten dsDNA-Substraten mit oder ohne Einkerbung.
    • 38F zeigt Hefekolonien, die mit GFP-mCherry-Fusionsreporterplasmiden transformiert wurden, die in vitro mit pegRNAs, Cas9-Nickase und RT bearbeitet wurden. Plasmide, die Nonsense- oder Frameshift-Mutationen zwischen GFP und mCherry enthielten, wurden mit 5'erweiterten oder 3'-erweiterten pegRNAs editiert, die die mCherry-Translation durch Transversionsmutation, 1-bp-Insertion oder 1-bp-Deletion wiederherstellen. GFP und mCherry doppelt-positive Zellen (gelb) zeigen eine erfolgreiche Bearbeitung an.
    • 39A-39D zeigen das Prime Editing der genomischen DNA in menschlichen Zellen durch PE1 und PE2. 39A zeigt, dass pegRNAs eine Spacer-Sequenz, ein sgRNA- Gerüst und eine 3'-Erweiterung enthalten, die eine Primer-Bindungsstelle (grün) und eine Vorlage für die reverse Transkription (RT) (violett) enthält, die die editierte(n) Base(n) (rot) enthält. Die Primer-Bindungsstelle hybridisiert mit dem PAM-haltigen DNA-Strang unmittelbar vor der Stelle des Nicks. Die RT-Template ist homolog zu der DNA-Sequenz stromabwärts des Nicks, mit Ausnahme des kodierten Schnitts. 39B zeigt die Installation einer T-A-zu-A-T-Transversion an der HEK3-Stelle in HEK293T-Zellen unter Verwendung der Cas9 H840A-Nickase, die mit der unmutierten M-MLV Reverse Transkriptase (PE1) fusioniert ist, und pegRNAs mit unterschiedlichen Primer-Bindungsstellenlängen. 39 C zeigt, dass die Verwendung einer gentechnisch veränderten pentamutanten M-MLV Reversen Transkriptase (D200N, L603W, T306K, W313F, T330P) in PE2 die Effizienz der Prime- Editing-Transversionen an fünf genomischen Stellen in HEK293T-Zellen sowie der kleinen Insertions- und kleinen Deletions-Edits in HEK3-Zellen erheblich verbessert. 39D ist ein Vergleich der PE2-Editing-Effizienz mit unterschiedlichen RT-Template-Längen an fünf genomischen Stellen in HEK293T-Zellen. Die Werte und Fehlerbalken geben den Mittelwert und die Standardabweichung von drei unabhängigen biologischen Replikaten wieder.
    • 40A-40C zeigen, dass die PE3- und PE3b-Systeme den nicht-editierten Strang einschneiden, um die Effizienz des Prime Editing zu erhöhen. 40A ist eine Übersicht über die Prime-Editing durch PE3. Nach der anfänglichen Synthese des editierten Strangs entfernt die DNA-Reparatur entweder den neu synthetisierten Strang, der den Edit enthält (3'-Flap-Exzision), oder den ursprünglichen genomischen DNA-Strang (5'-Flap-Exzision). Die 5'-Flap-Exzision hinterlässt einen DNA-Heteroduplex, der einen editierten Strang und einen nicht-editierten Strang enthält. Die Mismatch-Reparaturmaschinerie oder die DNA-Replikation könnte den Heteroduplex auflösen, so dass entweder editierte oder nicht-editierte Produkte entstehen. Das Einkerben des nicht-editierten Strangs begünstigt die Reparatur dieses Strangs, was zu einer bevorzugten Erzeugung von stabiler Duplex-DNA führt, die den gewünschten Schnitt enthält. 40B zeigt den Effekt des komplementären Strang-Nickings auf die PE3-vermittelte Prime-Editing-Effizienz und Indel-Bildung. „Keine“ bezieht sich auf PE2-Kontrollen, die den komplementären Strang nicht einschneiden. 40C ist ein Vergleich der Editing-Effizienz mit PE2 (kein komplementärer Strang-Nick), PE3 (allgemeiner komplementärer Strang- Nick) und PE3b (edit-spezifischer komplementärer Strang-Nick). Alle Editing-Ergebnisse spiegeln den Prozentsatz der gesamten Sequenzierungs-Werte wider, die den beabsichtigten Edit enthalten und keine Indels unter allen behandelten Zellen enthalten, ohne Sortierung. Die Werte und Fehlerbalken geben den Mittelwert und die Standardabweichung von drei unabhängigen biologischen Replikaten wieder.
    • 41A-41K zeigen gezielte Insertionen, Deletionen und alle 12 Arten von Punktmutationen mit PE3 an sieben endogenen menschlichen genomischen Loci in HEK293T- Zellen. 41A ist ein Diagramm, das alle 12 Arten von Einzelnukleotidtransitionen und Transversionen von Position +1 bis +8 (wobei die Position des pegRNA-induzierten Nicks als zwischen Position +1 und -1 liegend gezählt wird) der HEK3-Stelle unter Verwendung einer 10-nt-RT-Template zeigt. 41B ist ein Diagramm, das weitreichende PE3-Transversionen an der HEK3-Stelle unter Verwendung einer 34-nt-RT-Template zeigt. 41C-41H sind Diagramme, die alle 12 Arten von Transitions- und Transversionsbearbeitungen an verschiedenen Positionen im Hauptbearbeitungsfenster für (41C) RNF2, (41D) FANCF, (41E) EMX1, (41F) RUNX1, (41G) VEGFA und (41H) DNMT1 zeigen. 41I ist ein Diagramm, das gezielte 1- und 3-bp-Insertionen sowie 1- und 3-bp-Deletionen mit PE3 an sieben endogenen genomischen Loci zeigt. 41J ist ein Diagramm, das die gezielten präzisen Deletionen von 5 bis 80 bp an der HEK3-Zielstelle zeigt. 41K ist ein Diagramm, das eine Kombination aus Insertionen und Deletionen, Insertionen und Punktmutationen, Deletionen und Punktmutationen sowie doppelten Punktmutationen an drei endogenen genomischen Loci zeigt. Alle Editing-Ergebnisse spiegeln den Prozentsatz der gesamten Sequenzierungs-Werte wider, die den beabsichtigten Edit enthalten und keine Indels unter allen behandelten Zellen enthalten, ohne Sortierung. Die Werte und Fehlerbalken geben den Mittelwert und die Standardabweichung von drei unabhängigen biologischen Replikaten wieder.
    • 42A-42H zeigen den Vergleich von Prime-Editing und Base-Editing sowie Off- Target-Editing durch Cas9 und PE3 an bekannten Cas9 Off-Target-Stellen. 42A zeigt die gesamte C-G-zu-T-A-Editing-Effizienz an denselben Zielnukleotiden für PE2, PE3, BE2max und BE4max an endogenen HEK3-, FANCF- und EMX1-Stellen in HEK293T-Zellen. 42B zeigt die Indel-Häufigkeit der Behandlungen in 42A. 42C zeigt die Editiereffizienz von präzisen C-G-zu-T-A-Edits (ohne Bystander-Edits oder Indels) für PE2, PE3, BE2max und BE4max bei HEK3, FANCF und EMX1. Für EMX1 sind auch die genauen PE-Kombinations-Edits aller möglichen Kombinationen der C-G-zu-T-A-Umwandlung an den drei Zielnukleotiden gezeigt. 42D zeigt die gesamte A-T-zu-G-C-Editierungseffizienz für PE2, PE3, ABEdmax und ABEmax bei HEK3 und FANCF. 42E zeigt die genaue A-T- zu-G-C-Editing-Effizienz ohne Bystander-Edits oder Indels für HEK3 und FANCF. 42F zeigt die Indel-Häufigkeit der Behandlungen in 42D. 42G zeigt die durchschnittliche Dreifach-Editier-Effizienz (Prozentsatz der Sequenzier-Werte mit Indels) in HEK293T-Zellen für Cas9-Nuklease an vier On-Target- und 16 bekannten Off-Target-Stellen. Bei den 16 untersuchten Off-Target-Stellen handelte es sich um die vier am häufigsten berichteten Off-Target-Stellen118,159 für jede der vier On-Target-Stellen. Für jede On-Target- Stelle wurde Cas9 mit einer sgRNA oder mit jeder der vier pegRNAs gepaart, die denselben Protospacer erkennen. 42H zeigt die durchschnittlichen dreifachen On-Target- und Off- Target-Editing-Effizienzen und Indel-Effizienzen (unten in Klammern) in HEK293T-Zellen für PE2 oder PE3 gepaart mit jeder pegRNA in (42G). Die Ergebnisse des On-Target- Editing spiegeln den Prozentsatz der gesamten Sequenzierungs-Werte wider, die den beabsichtigten Edit enthalten und keine Indels unter allen behandelten Zellen aufweisen, ohne dass eine Sortierung erfolgt. Die Ergebnisse der Off-Target-Editierung spiegeln die Modifikation von Off-Target-Loci wider, die mit dem Prime-Editing übereinstimmen. Die Werte und Fehlerbalken geben den Mittelwert und die Standardabweichung von drei unabhängigen biologischen Replikaten wieder.
    • 43A-43I zeigen das Prime Editing in verschiedenen menschlichen Zelllinien und primären kortikalen Neuronen der Maus, den Einbau und die Korrektur von pathogenen Transversions-, Insertions- oder Deletionsmutationen sowie den Vergleich von Prime Editing und HDR. 43A ist ein Diagramm, das die Installation (durch T-A-zu-A-T-Transversion) und Korrektur (durch A-T-zu-T-A-Transversion) der pathogenen E6V-Mutation in HBB in HEK293T-Zellen zeigt. Gezeigt wird die Korrektur entweder zu unmutierter HBB oder zu HBB mit einer stillen Mutation, die die pegRNA PAM unterbricht. 43B ist ein Diagramm, das die Installation (über 4-bp-Insertion) und Korrektur (über 4-bp-Deletion) des pathogenen HEXA 1278+TATC-Allels in HEK293T-Zellen zeigt. Gezeigt wird die Korrektur entweder zu unmutierter HEXA oder zu HEXA mit einer stillen Mutation, die die pegRNA PAM unterbricht. 43C ist ein Diagramm, das die Installation der schützenden G127V-Variante in PRNP in HEK293T-Zellen durch G-C-zu-T-A-Transversion zeigt. 43D ist ein Diagramm, das das Prime Editing in anderen menschlichen Zelllinien zeigt, darunter K562 (leukämische Knochenmarkzellen), U2OS (Osteosarkomzellen) und HeLa (Gebärmutterhalskrebszellen). 43E ist ein Diagramm, das die Installation einer G-C-zu- T-A-Transversionsmutation in DNMT1 von primären kortikalen Neuronen der Maus unter Verwendung eines dualen Split-Intein PE3-Lentivirus-Systems zeigt, bei dem die N-terminale Hälfte Cas9 (1-573) ist, das mit N-Intein und über ein P2A-Selbstspaltungspeptid mit GFP- KASH fusioniert ist, und die C-terminale Hälfte das C-Intein ist, das mit dem Rest von PE2 fusioniert ist. Die PE2-Hälften werden von einem humanen Synapsin-Promotor exprimiert, der hochspezifisch für reife Neuronen ist. Sortierte Werte spiegeln Editierungen oder Indels aus GFP-positiven Kernen wider, während unsortierte Werte aus allen Kernen stammen. 43F ist ein Vergleich der PE3- und Cas9-vermittelten HDR-Editing-Effizienz an endogenen genomischen Loci in HEK293T-Zellen. 43G ist ein Vergleich der PE3- und Cas9- vermittelten HDR-Editing-Effizienz an endogenen genomischen Loci in K562-, U2OS- und HeLa-Zellen. 43H ist ein Vergleich der PE3- und Cas9-vermittelten HDR Indel- Nebenproduktbildung in HEK293T, K562, U2OS und HeLa-Zellen. 43I zeigt die gezielte Insertion eines His6-Tags (18 bp), eines FLAG-Epitop-Tags (24 bp) oder einer erweiterten LoxP-Stelle (44 bp) in HEK293T-Zellen durch PE3. Alle Editierergebnisse spiegeln den Prozentsatz der gesamten Sequenzierungs-Werte wider, die den beabsichtigten Edit enthalten und keine Indels unter allen behandelten Zellen aufweisen. Die Werte und Fehlerbalken geben den Mittelwert und die Standardabweichung von drei unabhängigen biologischen Replikaten wieder.
    • 44A-44G zeigen in vitro Prime Editing Validierungsstudien mit fluoreszierend markierten DNA-Substraten. 44A zeigt elektrophoretische Mobilitätsverschiebungstests mit dCas9, 5'-erweiterten pegRNAs und 5'-Cy5-markierten DNA-Substraten. Die pegRNAs 1 bis 5 enthalten eine 15-nt-Linkersequenz (Linker A für pegRNA 1, Linker B für pegRNAs 2 bis 5) zwischen dem Spacer und dem PBS, eine 5-nt-PBS-Sequenz und RT-Templates von 7 nt (pegRNAs 1 und 2), 8 nt (pegRNA 3), 15 nt (pegRNA 4) und 22 nt (pegRNA 5). Die pegRNAs sind diejenigen, die in 44E und 44F gezeigt werden; die vollständigen Sequenzen sind in den Tabellen 2A-2C aufgeführt. 44B zeigt in vitro Nicking-Assays von Cas9 H840A unter Verwendung von 5'-erweiterten und 3'-erweiterten pegRNAs. 44C zeigt die Cas9- vermittelte Indel-Bildung in HEK293T-Zellen bei HEK3 unter Verwendung von 5'-erweiterten und 3'-erweiterten pegRNAs. 44D zeigt einen Überblick über die biochemischen Assays für Prime Editing in vitro. Es wurden 5'-Cy5-markierte vorgekerbte und nicht-vergekerbte dsDNA-Substrate getestet. sgRNAs, 5'-erweiterte pegRNAs oder 3'-erweiterte pegRNAs wurden mit dCas9 oder Cas9 H840A-Nickase vorkomplexiert und dann mit dsDNA-Substrat, M-MLV RT und dNTPs kombiniert. Die Reaktionen wurden bei 37 °C für 1 Stunde laufen gelassen, bevor sie durch denaturierende Hamstoff-PAGE aufgetrennt und durch Cy5- Fluoreszenz sichtbar gemacht wurden. 44E zeigt, dass Primer-Erweiterungsreaktionen mit 5'-verlängerten pegRNAs, vorgekerbten DNA-Substraten und dCas9 zu einer signifikanten Umwandlung in RT-Produkte führen. 44F zeigt Primer-Erweiterungsreaktionen mit 5'erweiterten pegRNAs, wie in 44B, mit nicht-genicktem DNA-Substrat und Cas9 H840A- Nickase. Die Produktausbeute ist im Vergleich zu vorgekerbten Substraten stark reduziert. 44G zeigt, dass eine in vitro Primer-Erweiterungsreaktion unter Verwendung einer 3'pegRNA ein einzelnes scheinbares Produkt durch denaturierende Hamstoff-PAGE erzeugt. Die RT-Produktbande wurde herausgeschnitten, aus dem Gel eluiert und dann einem Homopolymer-Tailing mit terminaler Transferase (TdT) unter Verwendung von dGTP oder dATP unterzogen. Die Schwanzprodukte wurden mit poly-T- oder poly-C-Primern verlängert und die resultierende DNA wurde sequenziert. Die Sanger-Spuren zeigen, dass drei Nukleotide, die vom gRNA-Gerüst stammen, revers transkribiert wurden (als die letzten 3' Nukleotide zum DNA-Produkt hinzugefügt). Beachten Sie, dass in Experimenten zum Prime Editing in Säugetierzellen die Insertion von pegRNA-Gerüsten viel seltener ist als in vitro (56A-56D), was möglicherweise darauf zurückzuführen ist, dass die gebundene Reverse Transkriptase keinen Zugang zum Cas9-gebundenen Guide-RNA-Gerüst hat, und/oder auf die zelluläre Exzision von unpassenden 3'-Enden von 3'-Flaps, die pegRNA-Gerüstsequenzen enthalten.
    • 45A-45G zeigen die zelluläre Reparatur in Hefe von 3' DNA-Flaps aus in vitro Prime-Editing-Reaktionen. 45A zeigt, dass duale Fluoreszenzprotein-Reporterplasmide offene Leserahmen von GFP und mCherry enthalten, die durch eine Zielstelle getrennt sind, die ein In-Frame-Stopcodon, einen +1 Frameshift oder einen -1 Frameshift kodiert. Prime- Editing-Reaktionen wurden in vitro mit Cas9 H840A-Nickase, pegRNA, dNTPs und M-MLV Reverse Transkriptase durchgeführt und dann in Hefe transformiert. Kolonien, die unbearbeitete Plasmide enthalten, produzieren GFP, aber kein mCherry. Hefekolonien mit editierten Plasmiden produzieren sowohl GFP als auch mCherry als Fusionsprotein. 45B zeigt eine Überlagerung der GFP- und mCherry-Fluoreszenz für Hefekolonien, die mit Reporterplasmiden transformiert wurden, die ein Stoppcodon zwischen GFP und mCherry enthalten (unbearbeitete Negativkontrolle, oben), oder die kein Stopcodon oder Frameshift zwischen GFP und mCherry enthalten (vorbearbeitete Positivkontrolle, unten). 45C-45F zeigen eine Visualisierung der mCherry- und GFP-Fluoreszenz von Hefekolonien, die mit in vitro Prime Editing Reaktionsprodukten transformiert wurden. 45C zeigt eine Stopcodon- Korrektur durch T-A-zu-A-T-Transversion unter Verwendung einer 3'-erweiterten pegRNA oder einer 5'-erweiterten pegRNA, wie gezeigt in 45D. 45E zeigt eine +1 Frameshift-Korrektur durch eine 1-bp-Deletion mit einer 3'-verlängerten pegRNA. 45F zeigt eine -1 Frameshift-Korrektur durch eine 1-bp-Insertion unter Verwendung einer 3'verlängerten pegRNA. 45G zeigt Sanger-DNA-Sequenzierungsspuren von Plasmiden, die aus reinen GFP-Kolonien isoliert wurden, in 45B, und GFP und mCherry doppeltpositive Kolonien in 45C.
    • 46A-46F zeigen das korrekte Editieren gegenüber der Indel-Generierung mit PE1. 46A zeigt die T-A-zu-A-T-Transversions-Effizienz und die Indel-Generierung durch PE1 an der +1-Position von HEK3 unter Verwendung von pegRNAs mit 10-nt-RT-Templates und PBS-Sequenzen von 8-17 nt. 46B zeigt die Effizienz des Editierens von G-C-zu-T-A- Transversionen und die Erzeugung von Indel durch PE1 an der +5-Position von EMX1 unter Verwendung von pegRNAs, die 13-nt-RT-Templates und PBS-Sequenzen im Bereich von 9- 17 nt enthalten. 46C zeigt die Effizienz der G-C-zu-T-A-Transversion und der Indel- Generierung durch PE1 an der +5-Position von FANCF unter Verwendung von pegRNAs, die 17-nt-RT-Templates und PBS-Sequenzen von 8-17 nt enthalten. 46D zeigt die Effizienz der C-G-zu-A-T-Transversion und der Indel-Generierung durch PE1 an der +1-Position von RNF2 unter Verwendung von pegRNAs, die 11-nt-RT-Templates und PBS-Sequenzen von 9- 17 nt enthalten. 46E zeigt die Effizienz des Editierens von G-C-zu-T-A-Transversionen und die Erzeugung von Indel durch PE1 an der +2-Position von HEK4 unter Verwendung von pegRNAs, die 13-nt-RT-Templates und PBS-Sequenzen im Bereich von 7-15 nt enthalten. 46F zeigt die PE1-vermittelte +1 T-Deletion, +1 A-Insertion und +1 CTT-Insertion an der HEK3-Stelle unter Verwendung einer 13-nt PBS- und 10-nt RT-Template. Die Sequenzen der pegRNAs werden verwendet in 39C (siehe Tabellen 3A-3R). Die Werte und Fehlerbalken geben den Mittelwert und die Standardabweichung von drei unabhängigen biologischen Replikaten wieder.
    • 47A-47S zeigen die Bewertung der M-MLV RT-Varianten für das Prime Editing. 47A zeigt die Abkürzungen für die in dieser FIGildung verwendeten Varianten des Prime Editors. 47B zeigt gezielte Insertions- und Deletions-Edits mit PE1 am HEK3-Locus. 47C-47H zeigen einen Vergleich von 18 Prime-Editor-Konstrukten, die M-MLV RT- Varianten enthalten, hinsichtlich ihrer Fähigkeit, einen +2 G-C-zu-C-G-Transversionsschnitt bei HEK3 zu installieren, wie dargestellt in 47C, eine 24-bp FLAG-Insertion in HEK3, gezeigt in 47D, eine +1 C-G-zu-A-T Transversion-Editierung bei RNF2, gezeigt in 47E, eine +1 G-C-zu-C-G Transversion-Editierung bei EMX1, gezeigt in 47F, eine +2 T-A-zu-A-T-Transversion-Editierung bei HBB, gezeigt in 47G, und eine +1 G-C-zu-C- G Transversion-Editierung bei FANCF, gezeigt in 47H. 47I-47N zeigen einen Vergleich von vier Prime-Editor-Konstrukten, die M-MLV-Varianten enthalten, hinsichtlich ihrer Fähigkeit, die Bearbeitungen zu integrieren, gezeigt in 47C-47H in einer zweiten Runde von unabhängigen Experimenten. 47O-47S zeigen die PE2-Editierungseffizienz an fünf genomischen Loci mit unterschiedlichen PBS-Längen. 47O zeigt eine +1 T-A- zu-A-T Variation bei HEK3. 47P zeigt eine +5 G-C-zu-T-A Variation bei EMX1. 47Q zeigt eine +5 G-C-zu-T-A Variation bei FANCF. 47R zeigt eine +1 C-G-zu-A-T Variation bei RNF2. 47S zeigt eine +2 G-C-zu-T-A Variation bei HEK4. Die Werte und Fehlerbalken geben den Mittelwert und die Standardabweichung von drei unabhängigen biologischen Replikaten wieder.
    • 48A-48C zeigen die Design-Merkmale von pegRNA PBS und RT- Templatessequenzen. 48A zeigt die PE2-vermittelte +5 G-C-zu-T-A- Transversionseffizienz (blaue Linie) bei VEGFA in HEK293T-Zellen als Funktion der RT- Template-Länge. Indels (graue Linie) sind zum Vergleich eingezeichnet. Die Sequenz unter dem Diagramm zeigt das letzte Nukleotid, das für die Synthese durch die pegRNA als Vorlage dient. G-Nukleotide (mit einem C in der pegRNA) sind hervorgehoben. RT-Templates, die auf C enden, sollten beim pegRNA-Design vermieden werden, um die Effizienz des Prime Editing zu maximieren. 48B zeigt +5 G-C-zu-T-A-Transversionen und Indels für DNMT1 wie in 48A. 48C zeigt eine +5 G-C-zu-T-A-Transversion-Editierung und Indels für RUNX1, wie in 48A. Die Werte und Fehlerbalken geben den Mittelwert und die Standardabweichung von drei unabhängigen biologischen Replikaten wieder.
    • 49A-49B zeigen die Auswirkungen von PE2, PE2 R110S K103L, Cas9 H840A Nickase und dCas9 auf die Lebensfähigkeit der Zellen. HEK293T-Zellen wurden mit Plasmiden transfiziert, die für PE2, PE2 R110S K103L, Cas9 H840A Nickase oder dCas9 kodieren, zusammen mit einem HEK3-targeting pegRNA-Plasmid. Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde alle 24 Stunden nach der Transfektion für 3 Tage mit dem CellTiter-Glo 2.0 Assay (Promega) gemessen. 49A zeigt die Lebensfähigkeit, gemessen durch Lumineszenz, 1, 2 oder 3 Tage nach der Transfektion. Die Werte und Fehlerbalken geben den Mittelwert und die s.e.m. von drei unabhängigen biologischen Replikaten wieder, die jeweils in dreifacher technischer Ausführung durchgeführt wurden. 49B zeigt das prozentuale Editing und die Indels für PE2, PE2 R110S K103L, Cas9 H840A Nickase oder dCas9 zusammen mit einem HEK3-targeting pegRNA Plasmid, das für einen +5 G-zu-A Edit kodiert. Die Editing-Effizienz wurde am Tag 3 nach der Transfektion von Zellen gemessen, die parallel zu den Zellen behandelt wurden, die für die Bestimmung der Lebensfähigkeit in 49A. Die Werte und Fehlerbalken geben den Mittelwert und die Standardabweichung von drei unabhängigen biologischen Replikaten wieder.
    • 50A-50B zeigen PE3-vermittelte HBB E6V Korrektur und HEXA 1278+TATC Korrektur durch verschiedene pegRNAs. 50A zeigt einen Screen von 14 pegRNAs zur Korrektur des HBB E6V-Allel in HEK293T-Zellen mit PE3. Alle evaluierten pegRNAs konvertieren das HBB E6V-Allele zurück in den unmutierten HBB, ohne dass eine stille PAM- Mutation eingeführt wird. 50B zeigt einen Screen von 41 pegRNAs zur Korrektur des HEXA 1278+TATC Allels in HEK293T Zellen mit PE3 oder PE3b. Diese pegRNAs mit der Bezeichnung HEXAs korrigieren das pathogene Allel durch eine verschobene 4-bp-Deletion, die das PAM unterbricht und eine stumme Mutation hinterlässt. Die mit HEXA gekennzeichneten pegRNAs korrigieren das pathogene Allel zurück zum unmutierten Status. Einträge, die mit „b“ enden, verwenden eine bearbeitungsspezifische Nicking-sgRNA in Kombination mit der pegRNA (das PE3b-System). Die Werte und Fehlerbalken geben den Mittelwert und die Standardabweichung von drei unabhängigen biologischen Replikaten wieder.
    • 51A-51G zeigen eine PE3-Aktivität in menschlichen Zelllinien und einen Vergleich von PE3 und Cas9-initiierter HDR. Effizienz der Erzeugung des korrekten Schnitts (ohne Indels) und Indel-Häufigkeit für PE3 und Cas9-initiierte HDR in HEK293T-Zellen, gezeigt in 51A, K562-Zellen, gezeigt in 51B, U2OS-Zellen, gezeigt in 51C, und HeLa-Zellen, gezeigt in 51D. Jeder Vergleich der Bearbeitung in Klammern integriert identische Bearbeitungen mit PE3 und Cas9-initiiertem HDR. Nicht zielgerichtete Kontrollen sind PE3 und eine pegRNA, die auf einen nicht zielgerichteten Locus abzielt. 51E zeigt Kontrollexperimente mit nicht zielgerichteter pegRNA+PE3 und mit dCas9+sgRNA im Vergleich zu Experimenten mit unmutierter Cas9-HDR, die bestätigen, dass die ssDNA- Donor-HDR-Vorlage, eine häufige Verunreinigung, die die scheinbaren HDR-Effizienzen künstlich erhöht, nicht beiträgt zu den HDR-Messungen in 51A-51D. 51F-51G zeigen Beispiele für HEK3-Site-Allele aus genomischen DNA-Proben, die aus K562-Zellen nach dem Editing mit PE3 oder mit Cas9-initiierter HDR isoliert wurden. Die Allele wurden mit einem Illumina MiSeq sequenziert und mit CRISPResso2178 analysiert. Die HEK3- Referenzsequenz aus dieser Region ist oben zu sehen. Die Allel-Tabellen sind für eine nicht zielgerichtete pegRNA-Negativkontrolle, eine +1 CTT-Insertion in HEK3 mit PE3 und eine +1 CTT-Insertion in HEK3 mit Cas9-initiierter HDR dargestellt. Für jedes Allel sind die Allelhäufigkeiten und die entsprechenden Illumina-Sequenzierungslesezahlen angegeben. Alle beobachteten Allele mit einer Häufigkeit ≥0,20 % werden gezeigt. Die Werte und Fehlerbalken geben den Mittelwert und die Standardabweichung von drei unabhängigen biologischen Replikaten wieder.
    • 52A-52D zeigen die Verteilung nach Länge der pathogenen Insertionen, Duplikationen, Deletionen und Indels in der ClinVar-Datenbank. Die ClinVar Variantenzusammenfassung wurde am 15. Juli 2019 vom NCBI heruntergeladen. Die Längen der gemeldeten Insertionen, Deletionen und Duplikationen wurden anhand der Referenz- und alternativen Allele, der Start- und Stopp-Positionen der Varianten oder der entsprechenden Informationen im Variantennamen berechnet. Varianten, die keine der oben genannten Informationen enthielten, wurden von der Analyse ausgeschlossen. Die Längen der gemeldeten Indels (einzelne Varianten, die sowohl Insertionen als auch Deletionen im Vergleich zum Referenzgenom enthalten) wurden berechnet, indem die Anzahl der Mismatches oder Lücken im besten paarweisen Alignment zwischen dem Referenzgenom und den alternativen Allelen ermittelt wurde.
    • 53A-53E zeigen FACS-Gating-Beispiele für die Sortierung von GFP-positiven Zellen. Nachfolgend finden Sie Beispiele für Original-Batch-Analysedateien, die die Sortierstrategie für die Erzeugung von HEXA 1278+TATC und HBB E6V HEK293T Zelllinien. Die Bilddaten wurden auf einem Sony LE-MA900 Zytometer mit der Cell Sorter Software v. 3.0.5 erstellt. Grafik 1 zeigt Gating-Plots für Zellen, die kein GFP exprimieren. Grafik 2 zeigt eine Beispielsorte von P2A-GFP-exprimierenden Zellen, die für die Isolierung der HBB E6V HEK293T Zelllinien verwendet werden. HEK293T-Zellen wurden zunächst mit FSC-A/BSC-A (Gate A) auf Population gated und dann mit FSC-A/FSC-H (Gate B) auf Singlets sortiert. Lebende Zellen wurden durch Gating von DAPI-negativen Zellen sortiert (Gate C). Zellen mit GFP-Fluoreszenzwerten, die über denen der Negativ-Kontrollzellen lagen, wurden unter Verwendung von EGFP als Fluorochrom sortiert (Gate D). 53A zeigt HEK293T-Zellen (GFP-negativ). 53B zeigt eine repräsentative Darstellung des FACS- Gatings für Zellen, die PE2-P2A-GFP exprimieren. 53C zeigt die Genotypen für HEXA 1278+TATC homozygote HEK293T Zellen. 53D-53E zeigen Alleltabellen für HBB E6V homozygote HEK293T Zelllinien.
    • 54 ist ein Schema, das das pegRNA-Klonierungsverfahren zusammenfasst.
    • 55A-55G sind schematische Darstellungen von pegRNA-Designs. 55A zeigt ein einfaches Diagramm der pegRNA mit beschrifteten Domänen (links) und an nCas9 gebunden an einer genomischen Stelle (rechts). 55B zeigt verschiedene Arten von Modifikationen an pegRNA, von denen man annimmt, dass sie die Aktivität erhöhen. 55C zeigt Modifikationen an pegRNA, um die Transkription längerer RNAs über die Wahl des Promotors und die 5', 3' Verarbeitung und Terminierung zu erhöhen. 55D zeigt die Erweiterung des P1-Systems, was ein Beispiel für eine Gerüstmodifikation ist. 55E zeigt, dass der Einbau von synthetischen Modifikationen innerhalb der Template-Region oder an anderer Stelle innerhalb der pegRNA die Aktivität erhöhen könnte. 55F zeigt, dass ein gezielter Einbau einer minimalen Sekundärstruktur in die Vorlage die Bildung einer längeren, hemmenden Sekundärstruktur verhindern könnte. 55G zeigt eine geteilte pegRNA mit einer zweiten Template-Sequenz, die durch ein RNA-Element am 3'-Ende der pegRNA verankert ist (links). Der Einbau von Elementen an den 5' oder 3' Enden der pegRNA könnte die RT-Bindung verstärken.
    • 56A-56D zeigen den Einbau der pegRNA-Gerüstsequenz in die Zielloci. Die HTS-Daten wurden für die pegRNA-Gerüstsequenz-Insertion analysiert, wie gezeigt in 60A-60B. 56A zeigt eine Analyse für den EMX1-Locus. Dargestellt ist der prozentuale Anteil der gesamten Sequenzierungs-Werte, die ein oder mehrere pegRNA-Gerüstsequenz- Nukleotide innerhalb einer an die RT-Template angrenzenden Insertion enthalten (links); der prozentuale Anteil der gesamten Sequenzierungs-Werte, die eine pegRNA-Gerüstsequenz- Insertion der angegebenen Länge enthalten (Mitte); und der kumulative Gesamtprozentsatz der pegRNA-Insertion bis zur und einschließlich der auf der X-Achse angegebenen Länge. 56B zeigt das Gleiche wie 56A aber für FANCF. 56C zeigt das Gleiche wie in 56A aber für HEK3. 56D zeigt das Gleiche wie 56A aber für RNF2. Die Werte und Fehlerbalken geben den Mittelwert und die Standardabweichung von drei unabhängigen biologischen Replikaten wieder.
    • 57A-57I zeigen die Auswirkungen von PE2, PE2-dRT und Cas9 H840A-Nickase auf die transkriptomweite RNA-Häufigkeit. Analyse der zellulären RNA, abgereichert an ribosomaler RNA, isoliert aus HEK293T-Zellen, die PE2, PE2-dRT oder Cas9 H840A- Nickase und eine PRNP- oder HEXA-targeting pegRNA exprimieren. RNAs, die 14.410 Genen und 14.368 Genen entsprechen, wurden in PRNP- bzw. HEXA-Proben nachgewiesen. 57A-57F zeigen ein Vulkandiagramm, das den -log10 FDR-bereinigten p-Wert im Vergleich zur log2-fachen Änderung der Transkriptionshäufigkeit für jede RNA anzeigt ( 57A) PE2 vs. PE2-dRT mit PRNP-gerichteter pegRNA, (57B) PE2 vs. Cas9 H840A mit PRNP-gerichteter pegRNA, (57C) PE2-dRT vs. Cas9 H840A mit PRNP-gerichteter pegRNA, (57D) PE2 vs. PE2-dRT mit HEXA-gerichteter pegRNA, (57E) PE2 vs. Cas9 H840A mit HEXA-gerichteter pegRNA, (57F) PE2-dRT vs. Cas9 H840A mit HEXA-gerichteter pegRNA. Rote Punkte kennzeichnen Gene, die eine ≥2fache Veränderung der relativen Häufigkeit aufweisen, die statistisch signifikant ist (FDR-bereinigter p< 0,05). 57G-57I sind Venn-Diagramme der hochregulierten und herunterregulierten Transkripte (≥2fache Veränderung) beim Vergleich von PRNP- und HEXA-Proben für (57G) PE2 vs. PE2-dRT, (57H) PE2 vs. Cas9 H840A und (571) PE2-dRT vs. Cas9 H840A. [0165] 58A-58B zeigen ein repräsentatives FACS-Gating für die Sortierung der neuronalen Kerne. Die Kerne wurden nacheinander auf der Grundlage des DyeCycle Ruby- Signals, des FSC/SSC-Verhältnisses, des SSC-Breiten/SSC-Höhen-Verhältnisses und des GFP/DyeCycle-Verhältnisses gated.
    • 59A-59G zeigen das Protokoll für die Klonierung von 3'-verlängerten pegRNAs in U6-Expressionsvektoren von Säugetieren durch Golden-Gate-Assemblierung. 59A zeigt die Klonübersicht. 59B zeigt „Schritt 1: Digest pU6-pegRNA-GG-Vector Plasmid (Komponente 1)“. 59C zeigt „Schritte 2 und 3: Ordnen und Verbinden der Oligonukleotidteile (Komponenten 2, 3 und 4)“. 59D zeigt „Schritt 2.b.ii.: sgRNA Gerüstphosphorylierung (unnötig, wenn die Oligonukleotide phosphoryliert gekauft wurden)“. 59E zeigt „Schritt 4: Zusammenbau von pegRNA“. 59F zeigt „Schritte 5 und 6: Transformation von assemblierten Plasmiden“. 59G zeigt ein Diagramm, das das pegRNA-Klonierungsprotokoll zusammenfasst.
    • 60A-60B zeigen das Python-Skript zur Quantifizierung der pegRNA- Gerüstintegration. Es wurde ein benutzerdefiniertes Python-Skript erstellt, um die pegRNA- Insertionen an den genomischen Zielloci zu charakterisieren und zu quantifizieren. Das Skript vergleicht iterativ Textstrings zunehmender Länge aus einer Referenzsequenz (Guide RNA Gerüstsequenz) mit den Sequenzierungs-Werte in fastq-Dateien und zählt die Anzahl der Sequenzierungs-Werte, die der Suchanfrage entsprechen. Jede nachfolgende Textzeichenfolge entspricht einem zusätzlichen Nukleotid der Gerüstsequenz der Guide-RNA. Auf diese Weise wurden exakte Längenintegrationen und kumulative Integrationen bis zu einer bestimmten Länge berechnet. Am Anfang der Referenzsequenz werden 5 bis 6 Basen des 3'-Endes des neuen, von der reversen Transkriptase synthetisierten DNA-Strangs eingeschlossen, um das Alignment und die genaue Zählung der kurzen Abschnitte der sgRNA sicherzustellen.
    • 61 ist ein Diagramm, das den Prozentsatz der gesamten Sequenzierungs-Werte mit dem angegebenen Edit für SaCas9(N580A)-MMLV RT HEK3 +6 C>A zeigt. Es werden die Werte für die korrekten Bearbeitungen sowie die Indels angezeigt.
    • 62A-62B zeigen die Bedeutung des Protospacers für die effiziente Installation eines gewünschten Schnitts an einer präzisen Stelle mit erstklassigem Schnitt. 62A ist ein Diagramm, das den Prozentsatz der gesamten Sequenzierungs-Werte mit in A-T umgewandelten T-A-Basenpaaren für verschiedene HEK3-Loci zeigt. 62B ist eine Sequenzanalyse, die das Gleiche zeigt.
    • 63 ist ein Diagramm, das die SpCas9 PAM-Varianten bei der PAM-Bearbeitung zeigt (N=3). Der Prozentsatz der gesamten Sequenzierungs-Werte mit dem gezielten PAM- Edit ist für SpCas9(H840A)-VRQR-MMLV RT, wo NGA > NTA, und für SpCas9(H840A)- VRER-MMLV RT, wo NGCG > NTCG, dargestellt. Die Länge der pegRNA-Primer- Bindungsstelle (PBS), die Länge der RT-Template (RT) und das verwendete PE-System sind aufgeführt.
    • 64A-64F zeigen ein Schema, das die Einführung verschiedener ortsspezifischer Rekombinase (SSR)-Ziele in das Genom mit Hilfe von PE darstellt. 64A zeigt ein allgemeines Schema für die Insertion einer Rekombinase-Zielsequenz durch einen Prime Editor. 64B zeigt, wie ein einzelnes SSR-Target, das durch PE eingefügt wurde, als Ort für die genomische Integration einer DNA-Donor-Vorlage verwendet werden kann. 64C zeigt, wie eine Tandem-Insertion von SSR-Zielstellen verwendet werden kann, um einen Teil des Genoms zu löschen. 64D zeigt, wie eine Tandem-Insertion von SSR-Zielstellen verwendet werden kann, um einen Teil des Genoms zu invertieren. 64E zeigt, wie die Insertion von zwei SSR-Zielstellen an zwei distalen chromosomalen Regionen zu einer chromosomalen Translokation führen kann. 64F zeigt, wie die Insertion von zwei verschiedenen SSR-Zielstellen in das Genom zum Austausch einer Kassette aus einer DNA- Donor-Vorlage verwendet werden kann.
    • 65 zeigt 1) die PE-vermittelte Synthese einer SSR-Zielstelle in einem menschlichen Zellgenom und 2) die Verwendung dieser SSR-Zielstelle zur Integration einer DNA-Donor-Vorlage mit einem GFP-Expressionsmarker. Nach erfolgreicher Integration lässt das GFP die Zelle fluoreszieren.
    • 66 zeigt eine Ausführungsform eines Prime Editors, der als zwei PE-Halbproteine bereitgestellt wird, die sich durch die Selbstspleißung der Split-Intein-Hälften, die sich am Ende oder am Anfang jedes der Prime-Editor-Halbproteine befinden, als ganzer Prime Editor regenerieren.
    • 67A-67B zeigen den Mechanismus der Intein-Entfernung aus einer Polypeptidsequenz und die Neubildung einer Peptidbindung zwischen der N-terminalen und der C-terminalen Extein-Sequenz. 67A zeigt den allgemeinen Mechanismus zweier Halbproteine, die jeweils die Hälfte einer Intein-Sequenz enthalten. Wenn sie in einer Zelle miteinander in Kontakt kommen, entsteht ein voll funktionsfähiges Intein, das sich dann Selbst- Splicing und Exzision unterzieht. Der Prozess der Exzision führt zur Bildung einer Peptidbindung zwischen der N-terminalen Proteinhälfte (oder dem „N-Extein“) und der C- terminalen Proteinhälfte (oder dem „C-Extein“), um ein ganzes, einzelnes Polypeptid zu bilden, das den N-Extein- und den C-Extein-Teil umfasst. In verschiedenen Ausführungsformen kann das N-Extein der N-terminalen Hälfte eines Split Prime Editor Fusionsproteins entsprechen und das C-Extein der C-terminalen Hälfte eines gespaltenen Prime Editors, (b) zeigt einen chemischen Mechanismus der Intein-Exzision und die Neubildung einer Peptidbindung, die die N-Extein-Hälfte (die rot gefärbte Hälfte) und die C- Extein-Hälfte (die blau gefärbte Hälfte) verbindet. Die Exzision der gespaltenen Inteine (d. h. des N-Inteins und des C-Inteins in der gespaltenen Intein-Konfiguration) kann auch als „trans- Spleißung“ bezeichnet werden, da sie die Spleißaktion von zwei separaten Komponenten beinhaltet, sofern in trans.
    • 68A beweist, dass die Verabreichung beider gespaltener Intein-Hälften von SpPE (SEQ-ID-Nummern: 3875, 3876) am Linker die Aktivität an drei Testloci aufrechterhält, wenn es in HEK293T-Zellen co-transfiziert wird.
    • 68B beweist, dass die Verabreichung beider gespaltener Intein-Hälften von SaPE2 (z. B. SEQ-ID-NR.: 443 und SEQ-ID-NR.: 450) die Aktivität von SaPE2 in voller Länge (SEQ-ID-NR.: 134) bei der Co-Transfektion in HEK293T-Zellen rekapitulieren. Die in Anführungszeichen angegebenen Reste sind die Sequenz der Aminosäuren 741-743 in SaCas9 (erste Reste des C-terminalen Exteins), die für die Intein-Trans-Spleißreaktion wichtig sind. ‚SMP‘ sind die nativen Reste, die wir ebenfalls zur ‚CFN‘-Konsensus-Spleißsequenz mutiert haben. Es zeigt sich, dass die Konsenssequenz, gemessen am Prozentsatz des Prime-Editing, die höchste Rekonstitution ergibt.
    • 68C liefert Daten, die zeigen, dass verschiedene offengelegte PE- Ribonukleoprotein-Komplexe (PE2 in hoher Konzentration, PE3 in hoher Konzentration und PE3 in niedriger Konzentration) auf diese Weise abgegeben werden können.
    • 69 zeigt einen Bakteriophagen-Plaque-Assay zur Bestimmung der Wirksamkeit von PE bei PANCE. Plaques (dunkle Kreise) zeigen Phagen an, die E. Coli erfolgreich infizieren können. Eine steigende Konzentration von L-Rhamnose führt zu einer erhöhten Expression von PE und einer Zunahme der Plaquebildung. Die Sequenzierung der Plaques zeigte das Vorhandensein des PE-installierten genomischen Schnitts.
    • 70A-70I liefern ein Beispiel für eine editierte Zielsequenz als Illustration einer Schritt-für-Schritt-Anleitung für das Design von pegRNAs und nicking-sgRNAs für das Prime Editing. 70A: Schritt 1. Zielsequenz und Editierung bestimmen. Rufen Sie die Sequenz der Ziel-DNA-Region (~200 bp) ab, die um die Stelle des gewünschten Schnitts (Punktmutation, Insertion, Deletion oder eine Kombination davon) zentriert ist. 70B: Schritt 2. Ziel-PAMs lokalisieren. Identifizieren Sie PAMs in der Nähe des Bearbeitungsortes. Achten Sie auf die PAMs auf beiden Strängen. Während PAMs in der Nähe der Editierposition bevorzugt werden, ist es möglich, Edits mit Protospacem und PAMs zu installieren, die den Nick ≥ 30 nt von der Editierposition platzieren. 70C: Schritt 3. Einkerbungen lokalisieren. Identifizieren Sie für jede in Frage kommende PAM die entsprechende Einkerbung. Bei der Nickase Sp Cas9 H840A erfolgt die Spaltung im PAM- haltigen Strang zwischen den 3. und 4. Basen 5' zur NGG PAM. Alle editierten Nukleotide müssen 3' von der Einkerbung entfernt sein, so dass geeignete PAMs den Nick 5' zum Zielschnitt auf dem PAM-haltigen Strang platzieren müssen. In dem unten gezeigten Beispiel gibt es zwei mögliche PAMs. Der Einfachheit halber werden die verbleibenden Schritte das Design einer pegRNA nur mit PAM 1 demonstrieren. 70D: Schritt 4. Spacer-Sequenz entwerfen. Der Protospacer von Sp Cas9 entspricht den 20 Nukleotiden 5' zum NGG PAM auf dem PAM-haltigen Strang. Für eine effiziente Pol III-Transkriptionsinitiierung muss ein G das erste transkribierte Nukleotid sein. Wenn das erste Nukleotid des Protospacers ein G ist, ist die Spacer-Sequenz für die pegRNA einfach die Protospacer-Sequenz. Wenn das erste Nukleotid des Protospacers nicht G ist, ist die Spacer-Sequenz der pegRNA G, gefolgt von der Protospacer-Sequenz. 70E: Schritt 5. Primer-Bindungsstelle (PBS) entwerfen. Identifizieren Sie anhand der Ausgangssequenz des Allels den DNA-Primer auf dem PAM- haltigen Strang. Das 3'-Ende des DNA-Primers ist das Nukleotid unmittelbar stromaufwärts der Einkerbung (d. h. die 4. Base 5' zur NGG PAM für Sp Cas9). Als allgemeines Designprinzip für die Verwendung mit PE2 und PE3 kann eine pegRNA-Primer- Bindungsstelle (PBS) mit 12 bis 13 Nukleotiden Komplementarität zum DNA-Primer für Sequenzen verwendet werden, die ~40-60 % GC-Gehalt enthalten. Für Sequenzen mit niedrigem GC-Gehalt sollten längere (14- bis 15-nt) PBSs getestet werden. Für Sequenzen mit höherem GC-Gehalt sollten kürzere (8- bis 11-nt) PBSs getestet werden. Optimale PBS- Sequenzen sollten unabhängig vom GC-Gehalt empirisch ermittelt werden. Um eine Länge -p PBS-Sequenz zu entwerfen, nehmen Sie das umgekehrte Komplement der ersten p Nukleotide 5' der Einkerbung im PAM-haltigen Strang unter Verwendung der anfänglichen Allelsequenz. 70F: Schritt 6. RT-Template entwerfen. Die RT-Template kodiert den geplanten Schnitt und die Homologie zu der Sequenz, die an den Schnitt angrenzt. Die optimale Länge der RT-Template hängt von der Zielstelle ab. Für Editierungen mit kurzer Reichweite (Positionen +1 bis +6) empfiehlt es sich, eine kurze (9 bis 12 nt), eine mittlere (13 bis 16 nt) und eine lange (17 bis 20 nt) RT-Template zu testen. Für weitreichende Schnitte (Positionen +7 und darüber hinaus) wird empfohlen, RT-Templates zu verwenden, die mindestens 5 nt (vorzugsweise 10 oder mehr nt) über die Position des Schnitts hinausreichen, um eine ausreichende 3'-DNA-Flap-Homologie zu gewährleisten. Für langfristige Bearbeitungen sollten mehrere RT-Templates geprüft werden, um funktionale Designs zu identifizieren. Für größere Insertionen und Deletionen (≥5 nt) wird empfohlen, eine größere 3'-Homologie (-20 nt oder mehr) in die RT-Template einzubauen. Die Effizienz des Editierens ist in der Regel beeinträchtigt, wenn die RT-Template für die Synthese eines G als letztes Nukleotid im revers transkribierten DNA-Produkt kodiert (entsprechend einem C in der RT-Template der pegRNA). Da viele RT-Templates ein effizientes Prime-Editing unterstützen, wird empfohlen, bei der Entwicklung von RT-Templates G als letztes synthetisiertes Nukleotid zu vermeiden. Zum Entwerfen einer Länge -r RT-Templatessequenz zu verwenden Sie die gewünschte Allelsequenz und nehmen Sie das umgekehrte Komplement der ersten r Nukleotide 3' der Einkerbung in dem Strang, der ursprünglich die PAM enthielt. Beachten Sie, dass im Vergleich zu SNP-Edits Insertions- oder Deletions-Edits mit RT-Templates gleicher Länge keine identische Homologie aufweisen. 70G: Schritt 7. Vollständige pegRNA-Sequenz zusammenstellen. Verketten Sie die pegRNA-Komponenten in der folgenden Reihenfolge (5' bis 3'): Spacer, Scaffold, RT-Template und PBS. 70H: Schritt 8. Nicking-sgRNAs für PE3 entwickeln. Identifizieren Sie PAMs auf dem nicht-editierten Strang stromaufwärts und stromabwärts des Schnitts. Optimale Einkerbungspositionen sind stark ortsabhängig und sollten empirisch ermittelt werden. Im Allgemeinen führen Einkerbungen, die 40 bis 90 Nukleotide 5' von der Position gegenüber dem pegRNA-induzierten Nick platziert sind, zu einer höheren Editierergebnissen und weniger Indels. Eine nicking sgRNA hat eine Spacer- Sequenz, die mit dem 20-nt-Protospacer im anfänglichen Allel übereinstimmt, mit dem Zusatz eines 5'-G, wenn der Protospacer nicht mit einem G beginnt. 70I: Schritt 9. PE3b nicking-sgRNAs entwickeln. Wenn ein PAM im komplementären Strang existiert und der entsprechende Protospacer sich mit der zu editierenden Sequenz überschneidet, könnte dieser Schnitt ein Kandidat für das PE3b-System sein. Beim PE3b-System stimmt die Spacer- Sequenz der nicking-sgRNA mit der Sequenz des gewünschten editierten Allels überein, aber nicht mit dem Ausgangsallel. Das PE3b-System arbeitet effizient, wenn das/die editierte(n) Nukleotid(e) innerhalb der Seed-Region (~10 nt neben der PAM) des Nicking-sgRNA- Protospacers liegt/liegen. Dadurch wird das Nicking des komplementären Strangs erst nach dem Einbau des editierten Strangs verhindert, wodurch die Konkurrenz zwischen der pegRNA und der sgRNA um die Bindung der Ziel-DNA unterbunden wird. PE3b vermeidet auch die Erzeugung gleichzeitiger Nicks auf beiden Strängen, wodurch die Indel-Bildung deutlich reduziert wird und gleichzeitig eine hohe Editing-Effizienz erhalten bleibt. PE3b sgRNAs sollten eine Spacer-Sequenz haben, die mit dem 20-nt-Protospacer im gewünschten Allel übereinstimmt, mit dem Zusatz eines 5' G, falls erforderlich.
    • 71A zeigt die Nukleotidsequenz eines SpCas9 pegRNA-Moleküls (oben), das am 3'-Ende mit einem „UUU“ endet und kein Toeloop-Element enthält. Der untere Teil der FIGildung zeigt dasselbe SpCas9 pegRNA-Molekül, das jedoch so modifiziert ist, dass es ein Toeloop-Element mit der Sequenz 5'-„GAAANNNNN“-3' unmittelbar vor dem 3'-Ende „UUU“ enthält. Das „N“ kann eine beliebige Nukleobase sein.
    • 71B zeigt, dass die Effizienz des Prime Editing in HEK-Zellen oder EMX-Zellen mit pegRNA, die Toeloop-Elemente enthält, erhöht wird, während der Prozentsatz der Indel- Bildung weitgehend unverändert bleibt.
    • 72A-72C zeigen alternative pegRNA-Konfigurationen, die beim Prime Editing verwendet werden können. 72A zeigt die PE2:pegRNA-Variante des Prime Editing. Bei dieser Ausführungsform wird ein PE2 (ein Fusionsprotein, das ein Cas9 und eine reverse Transkriptase enthält) mit einer pegRNA komplexiert (wie auch in 1A-1I und/oder 3A-3E beschrieben). In dieser Ausführungsform wird die Vorlage für die reverse Transkription in einen 3'-Erweiterungsarm der sgRNA eingebaut, um die pegRNA herzustellen, und das DNA-Polymerase-Enzym ist eine direkt mit Cas9 fusionierte reverse Transkriptase (RT). 72B zeigen die MS2cp-PE2:sgRNA + tPERT-Variante. Diese Ausführungsform umfasst eine PE2-Fusion (Cas9 + eine reverse Transkriptase), die weiter mit dem MS2-Bakteriophagen- Hüllprotein (MS2cp) fusioniert ist, um das MS2cp-PE2-Fusionsprotein zu bilden. Um Prime Editing zu erreichen, wird das MS2cp-PE2-Fusionsprotein mit einer sgRNA komplexiert, die den Komplex auf eine bestimmte Zielstelle in der DNA ausrichtet. Die Ausführungsform beinhaltet dann die Einführung einer trans Prime Editing RNA-Vorlage („tPERT“), die anstelle einer pegRNA wirkt, indem sie eine Primer-Bindungsstelle (PBS) und eine DNA-Synthese- Template auf einem separaten Molekül bereitstellt, d. h. die tPERT, die auch mit einem MS2- Aptamer (Stammschleife) ausgestattet ist. Das MS2cp-Protein rekrutiert das tPERT durch Bindung an das MS2-Aptamer des Moleküls. 72C zeigen alternative Designs für pegRNAs, die durch bekannte Methoden zur chemischen Synthese von Nukleinsäuremolekülen erreicht werden können. Zum Beispiel kann durch chemische Synthese ein hybrides RNA/DNA pegRNA-Molekül für die Verwendung im Prime Editing synthetisiert werden, wobei der Erweiterungsarm der hybriden pegRNA aus DNA statt aus RNA besteht. In einer solchen Ausführungsform kann eine DNA-abhängige DNA- Polymerase anstelle einer reversen Transkriptase verwendet werden, um den 3'-DNA-Flap zu synthetisieren, der die gewünschte genetische Veränderung umfasst, die durch Prime Editing gebildet wird. In einer anderen Ausführungsform kann der Erweiterungsarm so synthetisiert werden, dass er einen chemischen Linker enthält, der die DNA-Polymerase (z. B. eine reverse Transkriptase) daran hindert, das sgRNA-Gerüst oder -Rückgrat als Vorlage zu verwenden. In einer weiteren Ausführungsform kann der Erweiterungsarm eine DNA-Synthese-Template umfassen, die in Bezug auf die Gesamtausrichtung des pegRNA-Moleküls die umgekehrte Orientierung aufweist. Wie zum Beispiel für eine pegRNA in der 5'-zu-3'-Ausrichtung und mit einer Erweiterung, die an das 3'-Ende des sgRNA-Gerüsts angehängt ist, wird die DNA- Synthese-Template in der entgegengesetzten Richtung, d. h. in der 3'-zu-5'-Richtung, ausgerichtet. Diese Ausführungsform kann für pegRNA-Varianten mit Erweiterungsarmen am 3'-Ende einer gRNA von Vorteil sein. Durch die Umkehrung der Ausrichtung des Erweiterungsarms wird die DNA-Synthese durch die Polymerase (z. B. die reverse Transkriptase) beendet, sobald sie die neu ausgerichteten 5' des Erweiterungsarms erreicht, so dass der gRNA-Kern nicht als Vorlage verwendet werden kann.
    • 73 demonstriert das Prime Editing mit tPERTs und dem MS2- Rekrutierungssystem (auch bekannt als MS2-Tagging-Technik). Eine sgRNA, die das Prime- Editor-Protein (PE2) auf den Ziellocus ausrichtet, wird in Kombination mit einem tPERT exprimiert, das eine Primer-Bindungsstelle (ein 13-nt- oder 17-nt-PBS), eine RT-Template, die eine His6-Tag-Insertion und einen Homologiearm kodiert, und ein MS2-Aptamer (am 5'- oder 3'-Ende des tPERT-Moleküls) enthält. Es wurde entweder das Prime-Editor-Protein (PE2) oder eine Fusion des MS2cp mit dem N-Terminus von PE2 verwendet. Die Editierung wurde mit oder ohne eine komplementäre Strang-Nicking-sgRNA durchgeführt, wie bei dem zuvor entwickelten PE3-System (in der x-Achse als „PE2+nick“ bzw. „PE2“ bezeichnet). Dies wird hier auch als „second-strand nicking“ bezeichnet und definiert
    • 74 zeigt, dass die MS2-Aptamer-Expression der reversen Transkriptase in trans und ihre Rekrutierung mit dem MS2-Aptamer-System. Die pegRNApegRNA enthält das MS2 RNA-Aptamer, das in eines von zwei sgRNA-Gerüst-Hairpins eingefügt ist. Die unmutierte M-MLV Reverse Transkriptase wird als N-terminale oder C-terminale Fusion mit dem MS2- Hüllprotein (MCP) exprimiert. Die Editierung erfolgt an der HEK3-Stelle in HEK293T-Zellen.
    • 75 zeigt ein Balkendiagramm, in dem die Effizienz (d. h. „% der gesamten Sequenzierungs-Reads mit dem angegebenen Edit oder Indels“) von PE2, PE2-Trunc, PE3 und PE3-Trunc über verschiedene Zielstellen in verschiedenen Zelllinien verglichen wird. Die Daten zeigen, dass die Prime-Editoren, die die verkürzten RT-Varianten enthielten, etwa genauso effizient waren wie die Prime-Editoren, die die nicht verkürzten RT-Proteine enthielten.
    • 76 demonstriert die Effizienz der Bearbeitung von intein-gesplitteten Prime Editors. HEK239T-Zellen wurden mit Plasmiden transfiziert, die für PE2 in voller Länge oder intein-gesplittetes PE2, pegRNA und Nicking-Guide-RNA kodieren. Die Konsenssequenz (die meisten aminoterminalen Reste des C-terminalen Exteins) sind angegeben. Die prozentuale Bearbeitung an zwei Standorten wird gezeigt: HEK3 +1 CTT-Insertion und PRNP +6 G zu T. Replikat n=3 unabhängige Transfektionen.
    • 77 demonstriert die Effizienz der Bearbeitung von intein-gesplitteten Prime Editors. Das Editing wurde durch gezieltes Deep Sequencing im Bulk-Cortex und in der GFP+ Subpopulation nach der Verabreichung von 5E10vg pro SpPE3-Hälfte und einer kleinen Menge 1E10 von nukleär lokalisiertem GFP:KASH an P0-Mäuse durch ICV-Injektion bewertet. Editoren und GFP wurden in AAV9 mit EFS-Promotor verpackt. Die Mäuse wurden drei Wochen nach der Injektion geerntet und die GFP+ Kerne wurden mittels Durchflusszytometrie isoliert. Es werden einzelne Datenpunkte gezeigt, wobei 1-2 Mäuse pro Bedingung analysiert werden.
    • 78 demonstriert die Effizienz der Bearbeitung von intein-gesplitteten Prime Editors. Die FIGildungen zeigen insbesondere AAV Split-SpPE3 Konstrukte. Die Co- Transduktion durch AAV-Partikel, die SpPE3-N und SpPE3-C getrennt exprimieren, rekapituliert die PE3-Aktivität. Anmerkung: Das N-terminale Genom enthält eine U6-sgRNA- Kassette, die die nicking sgRNA exprimiert, und das C-terminale Genom enthält eine U6- pegRNA-Kassette, die die pegRNA exprimiert.
    • 79 zeigt die Effizienz der Bearbeitung bestimmter optimierter Linker. Die Daten zeigen insbesondere die Editing-Effizienz des PE2-Konstrukts mit dem aktuellen Linker (vermerkt als PE2 - weißer Kasten) im Vergleich zu verschiedenen Versionen, bei denen der Linker durch eine Sequenz ersetzt wurde, wie an den HEK3-, EMX1-, FANCF- und RNF2- Loci für repräsentative pegRNAs für Transition, Transversion, Insertion und Deletion Edits angegeben. Die Ersatzlinker werden als „1x SGGS“ bezeichnet (SEQ-ID-NR.: 174), „2x SGGS“ (SEQ-ID-NR.: 446), „3x SGGS“ (SEQ-ID-NR.: 3889), „1x XTEN“ (SEQ-ID-NR.: 171), „kein Linker“, „1x Gly“, „1x Pro“, „1x EAAAK“ (SEQ-ID-NR.: 3968), „2x EAAAK“ (SEQ-ID-NR.: 3969) und „3x EAAAK" (SEQ-ID-NR.: 3970). Die Bearbeitungseffizienz wird in Form eines Balkendiagramms relativ zur „Kontroll“-Bearbeitungseffizienz von PE2 gemessen. Der Linker von PE2 ist SGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGSS (SEQ- ID-NR.: 127). Das gesamte Editing erfolgte im Kontext des PE3-Systems, d. h. mit dem PE2- Editing-Konstrukt und dem Zusatz der optimalen sekundären sgRNA-Nicking-Guide.
    • [0190] 80. Nimmt man die durchschnittliche Fold-Effizienz im Vergleich zu PE2, ergibt sich das gezeigte Diagramm, das darauf hinweist, dass die Verwendung einer 1x XTEN (SEQ ID NR.: 171) Linker-Sequenz die Editier-Effizienz im Durchschnitt um das 1,14-fache (n=15) verbessert.
    • 81 zeigt das Transkriptionsniveau der pegRNAs von verschiedenen Promotoren.
    • 82 zeigt die Auswirkung verschiedener Arten von Modifikationen der pegRNA- Struktur auf die Editing-Effizienz im Vergleich zu unmodifizierter pegRNA.
    • 83 zeigt ein PE-Experiment, bei dem das HEK3-Gen gezielt editiert wurde, und zwar durch Einfügen einer 10-nt-Insertion an Position +1 relativ zur Einstichstelle und unter Verwendung von PE3.
    • 84A zeigt eine beispielhafte pegRNA mit einem Spacer, einem gRNA-Kern und einem Erweiterungsarm (RT-Template + Primer-Bindungsstelle), der am 3'-Ende der pegRNA mit einem tRNA-Molekül modifiziert und über einen UCU-Linker gekoppelt ist. Die tRNA enthält verschiedene post-transkriptionelle Modifikationen. Diese Änderungen sind jedoch nicht erforderlich.
    • 84B zeigt die Struktur der tRNA, die zur Veränderung der pegRNA-Strukturen verwendet werden kann. Der P1 kann in der Länge variabel sein. Das P1 kann verlängert werden, um die RNAseP-Prozessierung der pegRNA-tRNA-Fusion zu verhindern.
    • 85 zeigt ein PE-Experiment, das auf das Editing des FANCF-Gens abzielt, und zwar durch eine G-zu-T-Konvertierung an Position +5 relativ zur Einkerbung und unter Verwendung des PE3-Konstrukts.
    • 86 zeigt ein PE-Experiment, bei dem das HEK3-Gen gezielt editiert wurde, und zwar durch die Insertion einer 71 nt FLAG-Tag-Insertion an Position +1 relativ zur Einkerbung und unter Verwendung des PE3-Konstrukts.
    • 87 zeigt die Ergebnisse aus einem Screening in N2A-Zellen, bei dem die pegRNA 1412Adel installiert, mit Angaben zur Länge der Primer-Bindungsstelle (PBS) und der Länge der Reversen Transkriptase (RT)-Matrize. (Gezeigt mit und ohne Indels).
    • 88 zeigt die Ergebnisse aus einem Screening in N2A-Zellen, bei dem die pegRNA 1412Adel installiert, mit Angaben zur Länge der Primer-Bindungsstelle (PBS) und der Länge der Reversen Transkriptase (RT)-Matrize. (Gezeigt mit und ohne Indels).
    • 89 zeigt die Ergebnisse des Editierens an einem Proxy-Locus im β-Globin-Gen und an HEK3 in gesunden HSCs, wobei die Konzentration des Editors an pegRNA und nicking gRNA variiert wurde.
    • 90 zeigt eine schematische Darstellung einer Ausführungsform der Dual-Flap- Prime-Editing. Eine DNA-Zielsequenz wird von zwei Prime-Editing-Komplexen (geführt von pegRNA-A und pegRNA-B) bearbeitet. Die beiden pegRNAs zielen auf entgegengesetzte Stränge der Doppelhelix ab. Jeder Prime Editor (pE2·pegRNA) nickt einen einzelnen DNA- Strang und synthetisiert dann einen 3'-DNA-Flap unter Verwendung der pegRNA als Matrize. Die Wirkung der beiden Prime-Editor-Komplexe führt zur Produktion eines Zwischenprodukts, das zwei 3'-Flaps auf gegenüberliegenden Strängen der DNA enthält. Die beiden 3'-Flaps sind an ihren 3'-Enden komplementär zueinander. Das Annealing der 3'-Enden der 3'-Flaps führt zur Bildung einer Doppel-Duplex-Struktur, wobei ein Duplex aus gepaarten 3'-Flaps die neue DNA-Sequenz (rot) und der andere Duplex aus gepaarten 5'-Flaps die ursprüngliche DNA-Sequenz (schwarz) enthält. Die Exzision des dazwischen liegenden ursprünglichen DNA-Duplexes (schwarze gepaarte 5'-Flaps) führt zu einer doppelt eingekerbten DNA-Spezies, die die gewünschte neue DNA-Sequenz (rot) enthält, welche die ursprüngliche DNA-Sequenz ersetzt hat. Die Ligation der beiden Nicks schließt den Bearbeitungsprozess ab.
    • 91A-91B zeigen die Ergebnisse aus Beispiel 7. 91A zeigt die Crispresso2- Ausgangstabelle (ausgerichtet auf das gewünschte Produkt) für den Ersatz einer 90-bp- Sequenz durch eine neue 22-bp-Sequenz an der HEK3-Stelle in HEK293T-Zellen unter Verwendung von Dual-Prime-Editoren. Das gewünschte Produkt macht mehr als 80 % der Sequenzierungs-Werte aus. Das Referenzausgangsallel ist zum Vergleich über den sequenzierten Allelen dargestellt. 91B zeigt die Sequenzen der pegRNAs, die verwendet werden, um die in 91A gezeigte Sequenzersetzung zu erreichen. pegRNA1 und pegRNA 2 zielen auf unterschiedliche Stränge der DNA-Doppelhelix ab und erzeugen 5'-versetzte Kerben, wie in 90 gezeigt.
    • 92 zeigt Ausführungsformen von pegRNA-Entwürfen für das Dual-Flap-Prime- Editing. Für das Dual-Flap Prime Editing werden zwei pegRNAs verwendet, die in der Zeichnung als pegRNA A und pegRNA B dargestellt sind. Jede pegRNA enthält eine Spacer- Sequenz (dunkelblau), die den Prime-Editing-Komplex zur Ziel-DNA-Stelle führt. Die beiden pegRNAs zielen auf entgegengesetzte Stränge der DNA-Doppelhelix ab. Wie andere pegRNAs enthalten dual-flap Prime Editing pegRNAs eine 3'-Erweiterung mit einer Primer- Bindungssequenz (PBS, grün), die sich an den eingekerbten genomischen DNA-Strang anlagert, um die reverse Transkription einzuleiten, sowie eine Vorlage für die reverse Transkription (RT-Template, hellblau), die die Synthese neuer DNA durch das Enzym Reverse Transkriptase vorgibt. Im Gegensatz zu pegRNAs, die für das klassische Prime-Editing verwendet werden und bei denen der neu synthetisierte editierte 3'-Flap benötigt wird, um mit dem endogenen 5'-Flap zu konkurrieren, ist es nicht erforderlich, die Homologie zur Zielstelle innerhalb der RT-Template zu kodieren. Stattdessen müssen die 3'-Enden der beiden synthetisierten 3'-Flaps nur Komplementarität zueinander aufweisen (d. h. die 3'-Enden der 3'- Flaps sind die umgekehrten Komplementsequenzen des jeweils anderen). Diese Komplementarität ermöglicht es den beiden 3'-Flaps, sich zu verbinden und die Bildung der gewünschten editierten DNA-Sequenz zu fördern.
    • 93A-93B zeigen die Ergebnisse von Beispiel 7, in dem die Bxb1 attB- und attP- Stellen mit Dual-Flap-Prime-Editing installiert wurden. 93A zeigt die Installation einer 38-bp Bxb1 attB-Stelle in HEK3. Es wurden sechs pegRNAs konstruiert, drei für den (+) Strang (A1, A2 und A3) und drei für den (-) Strang (B1, B2 und B3). Diese unterscheiden sich in der Menge der in der RT-Template kodierten attB-Sequenz, was zu einer unterschiedlichen Anzahl komplementärer Nukleotide zwischen den beiden Flaps führt. Die 3x3-Matrix der pegRNAs wurde auf den Einbau der attB-Sequenz an der genomischen Zielposition in HEK293T-Zellen untersucht. 93A und 93B zeigen den Einbau einer 50-bp Bxb1 attP-Stelle in HEK3. Es wurden sechs pegRNAs konstruiert, drei für den (+) Strang (A1, A2 und A3) und drei für den (-) Strang (B1, B2 und B3). Diese unterscheiden sich in der Menge der in der RT-Template kodierten attP-Sequenz, was zu einer unterschiedlichen Anzahl komplementärer Nukleotide zwischen den beiden Flaps führt. Die 3x3-Matrix der pegRNAs wurde auf den Einbau der attP-Sequenz an der genomischen Zielposition in HEK293T-Zellen untersucht. Für beide Bearbeitungen in 93A und 93B erfolgt der Einbau der attB- oder attP-Stelle bei gleichzeitiger Deletion der 90 bp der genomischen DNA-Sequenz zwischen den beiden Einkerbungen.
    • 94 zeigt die Ergebnisse der Installation von Bxb1 attB- und attP-Stellen an menschlichen Safe-Harbor-Loci mit Dual-Flap Prime Editing. Installation von Bxb1 attP- Stellen am AAVS1-Locus (links) oder Bxb1 attB-Stellen am CCRS-Locus (rechts) in HEK293T-Zellen. Korrekte Bearbeitungen sind in blau (AAVS1) und rot (CCRS) dargestellt, während Indel-Nebenprodukte in grau gezeigt werden.
    • 95 zeigt ein Schema der genomischen Sequenzinversion mit Quadruple-Flap Prime Editing. Eine Region der genomischen DNA ist für die Inversion vorgesehen (grünes und oranges Segment). Vier pegRNAs werden mit dem PE2 Prime Editor an die Zellen geliefert. Ein Paar pegRNAs zielt auf einen einzelnen genomischen DNA-Strang und dient als Vorlage für die Synthese von zwei komplementären DNA-Flaps (A und A', blau), während das zweite Paar auf den anderen genomischen DNA-Strang zielt und als Vorlage für die Synthese von zwei komplementären DNA-Flaps mit einer orthogonalen DNA-Sequenz dient (B und B', rosa). Die komplementären Flaps annealen, um 3'-Überhang-Duplexe zu bilden. Die 5'- Überhang-Duplexe werden von körpereigenen zellulären Reparaturenzymen abgeschnitten. Nicks werden ligiert, um das Produktallel zu erzeugen, das eine invertierte DNA-Sequenz (grüne und orangefarbene Segmente) und die pegRNA-templierten Sequenzen an den Inversionskreuzungen (blaue und rosa Segmente) enthält.
    • 96 zeigt die Ergebnisse der Amplikon-Sequenzierung von AAVS1- Inversionskreuzungen. Ergebnis der CRISPResso2-Analyse einer 2,7-kb-Inversion am AAVS1-Locus in HEK293T-Zellen unter Verwendung der Quadruple-Flap Primed-Editing- Strategie. Die PCR-Amplifikation und Sequenzierung der erwarteten Inversionskreuzungen ergab die gewünschten Produkte mit Bxb1 attP- oder attB-Sequenzen an den Kreuzungen der Inversion.
    • 97A-97B zeigen die Ergebnisse der gezielten Integration eines zirkulären DNA- Plasmids in das Genom durch Quadruple-Flap-Prime-Editing. (97A) Eine Region der genomischen DNA und eine Region der Plasmid-DNA werden für die Integration des Quadruple Flap Prime Editing ausgewählt. Vier pegRNAs werden mit dem PE2 Prime Editor an die Zellen geliefert. Zwei pegRNAs sind Vorlagen für komplementäre Sequenzen, von denen eine auf einen einzelnen genomischen DNA-Strang und die andere auf einen einzelnen Plasmid-DNA-Strang abzielt (wodurch blaue Flaps entstehen). Die beiden anderen pegRNAs zielen auf entgegengesetzte genomische DNA- und Plasmid-DNA-Stränge als die der ersten beiden pegRNAs ab und templieren die Synthese von zwei komplementären DNA-Flaps (rosa), die orthogonal zum ersten Paar sind. Die komplementären Flaps annealen, um 3'-Überhang- Duplexe zu bilden. Die 5'-Überhang-Duplexe werden von körpereigenen zellulären Reparaturenzymen abgeschnitten. Die Nicks werden ligiert, um das Produktallel zu erzeugen, das eine integrierte Plasmid-DNA-Sequenz (grüne und orangefarbene Segmente) und die pegRNA-templierten Sequenzen an den Integrationsschnittstellen (blaue und rosa Segmente) enthält. (97B) CRISPResso2-Analyse der Amplikon-Sequenzierung der erwarteten Kreuzung, die das Plasmid-Rückgrat und die genomische DNA-Sequenz zeigt, die durch die pegRNA-templierte attP-Sequenz überbrückt werden.
    • 98A-98B zeigen die Ergebnisse einer gezielten chromosomalen Translokation mit Quadruple-Flap Prime Editing. (98A) pegRNAs zielen auf zwei Regionen auf verschiedenen Chromosomen ab. Komplementäre 3'-DNA-Flaps überbrücken die beiden Chromosomensequenzen und steuern die Ausrichtung der Translokation. (98B) Gezielte Translokation zwischen MYC- und TIMM44-Loci in HEK239T-Zellen. CRISPResso2- Analyse der Ergebnisse der Amplikon-Sequenzierung der erwarteten Kreuzungen aus der Translokation zwischen dem MYC-Locus auf Chromosom 8 und dem TIMM44-Locus auf Chromosom 19. Die Mehrheit der Sequenzierungs-Werte entspricht der gewünschten Allelsequenz.
    • 99 zeigt die Installation von Bxb1 attB- und attP-Stellen mit Dual-Flap-Prime- Editing am IDS-Locus. HEK293T-Zellen wurden mit PE2 und verschiedenen Paaren von pegRNAs transfiziert (z. B. in der ersten Spalte pegRNA A1_a und pegRNA B2_a mit Vorlagen für die Installation der attP-Stelle in Vorwärtsrichtung). Die Effizienz wurde mittels HTS gemessen. Diese Daten zeigen, dass das Dual-Flap-Editing die gewünschte Sequenz mit einer Effizienz von bis zu 80 % erfolgreich in den IDS-Locus einfügen kann.
    • 100A-100B beschreiben die Dual-Flap-vermittelte Duplikation. 100A ist eine schematische Darstellung der Dual-Flap-vermittelten Duplikation am AAVS1-Locus in 293T-Zellen. 100B zeigt die Ergebnisse der Verwendung von Dual-Flap pegRNA mit PE2 zur Induktion der Duplikation von genetischen Sequenzen bei AAVS1.
    • 101 zeigt eine durch mehrere Flaps induzierte neue Translokation MYC-CCR5. Die MYC-CCR5-Translokation wurde durch Quad-Flap pegRNAs und PE2 induziert. MYC- CCR5-Translokationsereignisse wurden durch Quadrupel-pegRNAs induziert. Vier verschiedene Sätze von pegRNAs wurden in HEK293T-Zellen getestet. Die Translokations- Kreuzungsprodukte zwischen den abgeleiteten chr8 und chr3 wurden durch Kreuzungsprimer amplifiziert. Der Prozentsatz der Werte, die den erwarteten Kreuzungsallelen zugeordnet sind, wird im Diagramm angezeigt. Das Ergebnis zeigt, dass Quadruple-Flap die Translokation des MYC- und CCRS-Gens mit einer Produktreinheit von nahezu 100 % am Knotenpunkt 1 und ~50 % am Knotenpunkt 2 vermitteln kann. Ein repräsentativer Allelplot zeigt die Sequenzen, die an den erwarteten Allelsequenzen am Knotenpunkt 1 ausgerichtet sind.
    • 102A-102B zeigen Dual-Flap- und Multi-Flap-Editing in anderen menschlichen Zelllinien. 102A zeigt Dual-Flap-Editing in vier verschiedenen menschlichen Zelllinien. HEK293T- und HeLa-Zellen wurden mit dualen pegRNAs und PE2 zur Bearbeitung von drei verschiedenen genomischen Loci (IDS, MYC und TIMM44) transfiziert. U2OS- und K562- Zellen wurden mit denselben Komponenten nukleofiziert. Dual-Flap hat sich in allen vier menschlichen Zellen an den Zielloci als robustes Editing erwiesen, insbesondere in HEK293T- und K562-Zellen. Die zellulären Mechanismen, die das Dual-Flap-Editing ermöglichen, sind in vielen menschlichen Zelltypen konserviert. 102B zeigt eine Multi-Flap (QuadruplepegRNA) gerichtete 2,7 kb Inversion an der AAVS1 in HeLa-Zellen.
    • 103A-103B zeigt die Ergebnisse der Messung der Inversionseffizienz durch HTS am CCRS-Locus. Der Prozentsatz des erwarteten Inversions-Edit-Allels wurde mittels HTS gemessen. Vier quad-pegRNA-Sets PE2 wurden jeweils in HEK293T-Zellen transfiziert. 103A zeigt eine Dual-Flap-vermittelte Sequenzduplikation (-100 nt) am CCRS-Locus in HEK293T-Zellen. Die Editing-Effizienz erreicht -1,5 % über die HTS 300-Zyklus-Paar-End- Sequenzierungsanalyse. 103B zeigt eine Quadruple-Flap-vermittelte Sequenzinversion (-95-117 nt) am CCRS-Locus in HeLa-Zellen. Die Editing-Effizienz erreicht ~1,2 % über die HTS 300-Zyklus-Paar-End-Sequenzierungsanalyse. Dieses Ergebnis zeigt, dass Multi-Flap die Duplikation und Inversion am CCRS-Locus erfolgreich und präzise vermitteln kann. Die Bearbeitungsspezifität ist hoch, wenn die Zielsequenz dupliziert ist (Prozentsatz der Indels< 2 %).
    • 104A-104E zeigen einen gezielten zellulären Reparaturpfad für das Dual-Flap- Editing. In 104A-104D wurden HEK293T-Zellen mit den Plasmiden transfiziert, die Exo1, Fen1, Red Fluorescence Protein (Kontrolle), DNA2, Mlh1 neg und P53 Inhibitor mit pegRNA und PE2 exprimieren. Die Effizienz der Bearbeitung wurde mit HTS gemessen. Die Effizienz der Bearbeitung wurde zwischen dem Kandidaten und der RFP-Kontrolle verglichen. In 104E wurden HEK293T-Zellen mit den siRNA-Plasmiden und pegRNA und PE2 für jeden Ziellocus transfiziert. Nicht zielgerichtete siRNA (siNT) wurde als Kontrolle verwendet. Die Effizienz der Bearbeitung wurde mit HTS gemessen. Die Editing-Effizienz wurde zwischen jeder siRNA-Knockdown und dem siNT ctrl an jedem Ziellocus verglichen. HEK293T-Zellen wurden mit Dual-PegRNAs, PE2 und den Plasmiden transfiziert, die Exo1, Fen1, Red Fluorescence Protein (ctrl), DNA2, Mlh1 neg bzw. P53-Inhibitor exprimieren. Die Effizienz der Bearbeitung wurde mit HTS gemessen. Die Effizienz der Bearbeitung wurde zwischen dem Kandidaten und dem RFP ctrl verglichen. Ein zweiseitiger, gepaarter Student t- Test wurde verwendet, um den statistischen Unterschied zwischen jeder Behandlung und der RFP-Kontrolle zu messen (P< 0,05, *; P< 0,01, **; P< 0,001, ***). Die Überexpression von FEN1 verbessert die Effizienz des Dual-Flap-Editing in allen vier Zielorten (MYC, TIMM44, IDS, CCR5).
    • 105A-105B zeigen eine Dual-Flap-vermittelte Sequenzverdopplung am AAVS1- Locus. 105A zeigt ein schematisches Diagramm der Dual-Flap-vermittelten Sequenzduplikation im AAVS1-Locus. 105B zeigt, dass durch die Verwendung von dualen pegRNAs, die zwei einzigartige 3'-Flap-Strukturen erzeugen, eine -300 bp Sequenzduplikation am AAVS1-Locus in 293T-Zellen induziert wurde. Die erwarteten Allele werden mit spezifischen Primern amplifiziert und einem HTS unterzogen. -94 % der Werte werden an den erwarteten Allelen mit Duplikation ausgerichtet. In den unbehandelten Proben werden keine Duplikationsprodukte beobachtet.
    • 106 zeigt eine gezielte IDS-Genomsequenzinversion mit Quadruple-Flap Prime Editing. Bei ~13 % der Patienten mit Hunter-Syndrom wurde eine Inversion der IDS- Gensequenzen nachgewiesen (Bondeson et al., Human Molecular Genetics, 1995). Das Quadruple-Flap Prime Editing wurde angewandt, um diese pathogene Inversion der -40 kb IDS-Genomsequenz in HEK293T-Zellen zu induzieren. Sechs Sätze von Quadruple-pegRNAs wurden getestet, indem HEK293T-Zellen mit den pegRNAs und PE2 transfiziert wurden. Es wurden Primer verwendet, die spezifisch die invertierten Sequenzen an der Kreuzung „ab“ und der Kreuzung „cd“ amplifizieren. -95 % der erwarteten invertierten Allelsequenzen wurden an beiden Kreuzungen mit IDS_QF1 beobachtet. Andere Sätze von pegRNAs liefern ebenfalls einen hohen Prozentsatz der erwarteten Allelsequenzen an beiden Kreuzungen. In den unbehandelten Proben werden keine invertierten Verbindungsprodukte beobachtet.
    • 107 zeigt, dass die Modifikation des 3'-Motivs der pegRNA die Effizienz des Dual-Flap-Editing am IDS-Locus verbessert. Um die Effizienz der Dual-Flap-Editierung weiter zu verbessern, wurde ein Pseudoknoten evoPreQ1-Motiv eingeführt, um das 3'-Ende der pegRNA zu schützen. Vergleicht man die Editing-Effizienz, die durch die unmodifizierten und die evoPreQ1-modifizierten dualen pegRNAs erzeugt wurde, so zeigt sich insgesamt eine Steigerung der Editing-Effizienz mit den modifizierten pegRNAs am anvisierten IDS-Locus. Die Effizienz der Dual-Flap-Bearbeitung kann bis zum 5,3-fachen gesteigert werden.
    • 108A-108C zeigen einen Überblick über twinPE und die twinPE-vermittelte Sequenzersetzung. 108A zeigt, dass twinPE-Systeme auf genomische DNA-Sequenzen abzielen, die zwei Protospacer-Sequenzen auf gegenüberliegenden Strängen der DNA enthalten. PE2-pegRNA-Komplexe zielen auf jeden Protospacer, erzeugen einen einzelsträngigen Nick und transkribieren die pegRNA-kodierte Vorlage, die die gewünschte Insertionssequenz enthält. Nach der Synthese und Freisetzung der 3'-DNA-Flaps existiert ein hypothetisches Zwischenprodukt, das annealisierte 3'-Flaps mit der editierten DNA-Sequenz und annealisierte 5'-Flaps mit der ursprünglichen DNA-Sequenz enthält. Die Exzision der ursprünglichen DNA-Sequenz, die im 5'-Flap enthalten ist, und die anschließende Ligation des 3'-Flaps an die entsprechende Exzisionsstelle erzeugen das gewünschte editierte Produkt. 108B zeigt ein Beispiel für die twinPE-vermittelte Ersetzung einer 90-bp-Sequenz in HEK- Stelle 3 durch eine 38-bp Bxb1 attB-Sequenz. 108C zeigt eine Auswertung von twinPE in HEK293T-Zellen für den Einbau der 38-bp Bxb1 attB-Stelle, wie gezeigt in 108B, oder der 50-bp Bxb1 attP-Stelle an HEK-Stelle 3 mit Hilfe von pegRNAs, die unterschiedliche Längen der Insertionssequenz vorgeben. Die Werte und Fehlerbalken geben den Mittelwert und die Standardabweichung von drei unabhängigen biologischen Replikaten wieder.
    • 109A-109E zeigen gezielte Sequenzeinfügung, Deletion und Umkodierung mit twinPE in menschlichen Zellen. 109A zeigt die Insertion von FKBP kodierenden Sequenzfragmenten mit PE3 (12 bp, 36 bp, 108 bp oder 321 bp) oder twinPE (108 bp) an HEK site 3 in HEK293T Zellen. 109B zeigt die Rekodierung der Sequenz innerhalb der Exons 4 und 7 in PAH in HEK293T-Zellen mit twinPE. Eine 64-bp-Zielsequenz in Exon 4 wurde unter Verwendung von 24, 36 oder 59 bp überlappenden Flaps editiert, eine 46-bp-Zielsequenz in Exon 7 wurde unter Verwendung von 22 oder 42 bp überlappenden Flaps editiert, oder eine 64-bp-Sequenz in Exon 7 wurde unter Verwendung von 24 oder 47 bp überlappenden Flaps editiert. Die Editing-Aktivität wurde mit Standard-pegRNAs oder epegRNAs mit 3'- EvoPreQ1-Motiven verglichen. 109C ist ein schematisches Diagramm von drei verschiedenen Dual-Flap-Deletionsstrategien, die für die Durchführung von gezielten Deletionen untersucht wurden. Die „Basic-Anchor (BA)“ twinPE-Strategie ermöglicht eine flexible Deletion, die an einer beliebigen Position 3' von einer Einkerbung beginnt und an der anderen Einkerbung endet. Die „Hybrid-Anchor (HA)“ twinPE-Strategie ermöglicht die flexible Deletion von Sequenzen an beliebig gewählten Positionen zwischen den beiden Einkerbungen. Die hier getestete „PrimeDel (PD)“-Strategie ermöglicht die Deletion der Sequenz, die an einer Einkerbung beginnt und an einer anderen Einkerbung endet. 109D zeigt die Deletion von Sequenzen an der HEK-Stelle 3 in HEK293T-Zellen unter Verwendung der BA-twinPE-, HA-twinPE- oder PD-Strategien, die auf dasselbe Protospacer-Paar abzielen. Die Editing-Aktivität wurde mit Standard-pegRNAs oder epegRNAs mit 3'-EvoPreQ1- Motiven verglichen. 109E zeigt die Deletion der Exon 51-Sequenz am DMD-Locus in HEK293T-Zellen unter Verwendung von BA-twinPE, PD, gepaarter Cas9-Nuklease oder twinPE-vermittelter attB-Sequenzersetzung. Die Werte und Fehlerbalken geben den Mittelwert und die Standardabweichung von drei unabhängigen biologischen Replikaten wieder. In dem DMD-Exon 51-Skipping-Experiment wurden mindestens zwei unabhängige biologische Wiederholungen durchgeführt.
    • 110A-110E zeigen eine ortsspezifische genomische Integration von DNA-Fracht mit twinPE und Bxb1-Rekombinase in menschlichen Zellen. 110A zeigt das Screening von twinPE pegRNA-Paaren zur Installation der Bxb1 attP-Sequenz am AAVS1-Locus in HEK293T-Zellen. 110B zeigt das Screening von twinPE pegRNA-Paaren zum Einbau der Bxb1 attB-Sequenz am CCRS-Locus in HEK293T-Zellen. 110C zeigt eine einzelne Knock-in-Transfektion von 5,6-kb-DNA-Spendern mit twinPE pegRNA-Paaren, die auf CCRS (vier Balken ganz links) oder AA VS1 (drei Balken ganz rechts) abzielen. Die twinPE pegRNAs installieren attB an CCRS oder attP an AA VS1. Bxb1 integriert dann einen Donor, der die entsprechende Anheftungsstelle trägt, in die genomische Anheftungsstelle. 110D zeigt die Optimierung eines einzelnen Transfektions-Knock-ins bei CCRS unter Verwendung des 531/584 twinPE pegRNA-Paares. Die Identität der templierten Editierung (attB vs. attP), die Identität des zentralen Dinukleotids (unmutiertes GT vs. orthogonale Mutante GA) und die Länge der Überlappung zwischen den Flaps wurden variiert, um die Kombination zu ermitteln, die die höchste Knock-in-Effizienz unterstützt. 110E zeigt die Insertion der Bxb1 attB Sequenz in Intron 1 von ALB in HEK293T und Huh7 Zelllinien. 110F zeigt einen Vergleich der Einzel-Transfektions-Knock-in-Effizienzen bei CCRS und ALB in HEK293T und Huh7 Zelllinien.
    • 111A-111E zeigen eine ortsspezifische genomische Sequenzinversion mit twinPE und Bxb1-Rekombinase in menschlichen Zellen. 111A ist eine schematische Darstellung der Rekombinations-Hotspots in IDS und IDS2, die zu pathogenen 39-kb- Inversionen führen, sowie der kombinierten twinPE-Bxb1-Strategie zur Installation oder Korrektur der IDS-Inversionsmutation. 111B zeigt ein Screening von pegRNA-Paaren an IDS und IDS2 zur Installation von attP- oder attB-Rekombinationsstellen an IDS- und IDS2- Loci mit spezifischen DNA-Zielen. 111C zeigt eine DNA-Sequenzierungsanalyse der attP- oder attB-Insertion mit sequenzieller DNA-Transfektion. 111D zeigt die Reinheit des Inversionsprodukts an der invertierten Kreuzung 1 und Kreuzung 2 (sequenzielle Transfektion), was auf eine erfolgreiche Inversion an den beiden Kreuzungen hinweist. 111E zeigt die Quantifizierung der Inversionseffizienz an den Kreuzungen (sequenzielle Transfektion und „One-Pot“ RNA-Nukleofektion).
    • 112 zeigt die Umkodierung von Sequenzen innerhalb von Exon 10, 11 und 12 in PAH in HEK293T-Zellen mittels twinPE. Eine 64-bp-Zielsequenz in Exon 10 wurde unter Verwendung von 28 bp überlappenden Flaps editiert, eine 61-bp- und 55-bp-Zielsequenz in Exon 11 wurde unter Verwendung von 25 bp überlappenden Flaps editiert, oder eine 68-bp- und 58-bp-Sequenz in Exon 12 wurde unter Verwendung von 27 bzw. 24 bp überlappenden Flaps editiert. Die Werte und Fehlerbalken geben den Mittelwert und die Standardabweichung von drei unabhängigen biologischen Replikaten wieder.
    • 113 zeigt die Transfektion einer klonalen HEK293T-Zelllinie, die eine homozygote attB-Insertion aufweist, mit BxBI-Plasmiden und attP-haltigen Spender-DNA- Plasmiden. Die Knock-in-Effizienz liegt zwischen 12-17 % an der Zielstelle, gemessen mittels ddPCR.
    • 114 zeigt die HTS-Messung der erwarteten Kreuzungssequenzen, die attL- und attR-Rekombinationsprodukte nach twinPE und BxBI-vermitteltem One-Pot-Knock-in enthalten. Die Produktreinheiten reichen von 71-95 %. Die Werte und Fehlerbalken geben den Mittelwert und die Standardabweichung von drei unabhängigen biologischen Replikaten wieder.
    • 115A zeigt die twinPE-vermittelte attB-Insertionseffizienz mit reduzierter Flap- Überlappungslänge bei den dualen pegRNAs.
    • 115B zeigt PCR-Produkte, die durch spezifische Primer zur Erfassung der Rekombination zwischen Donor-DNA und pegRNA-Plasmiden amplifiziert wurden, auf dem Agarose-Gel. Die Rekombination zwischen der Spender-DNA und dem pegRNA-Plasmid wurde durch eine geringere Überlappung der Flaps reduziert.
    • 116 ist eine schematische Darstellung der entwickelten PCR-Strategien zur Quantifizierung der IDS-Inversions-Effizienz.
  • DEFINITIONEN
  • Sofern nicht anders definiert, haben alle hierin verwendeten technischen und wissenschaftlichen Begriffe die Bedeutung, die ein Fachmann auf dem Gebiet, zu dem diese Erfindung gehört, gemeinhin versteht. Die folgenden Referenzen bieten dem Fachmann eine allgemeine Definition vieler der in dieser Erfindung verwendeten Begriffe: Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2. Aufl. 1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker Ed., 1988); The Glossary of Genetics, 5th Ed., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991); und Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991). Sofern nicht anders angegeben, haben die folgenden Begriffe die ihnen zugewiesene Bedeutung.
  • Antisense-Strang
  • In der Genetik ist der „Antisense“-Strang eines Segments innerhalb der doppelsträngigen DNA der Template-Strang, der in der Orientierung 3' zu 5' verläuft. Im Gegensatz dazu ist der „Sense“-Strang das Segment innerhalb der doppelsträngigen DNA, das von 5' nach 3' verläuft und das komplementär zum Antisense-Strang der DNA, dem Template- Strang, ist, der von 3' nach 5' verläuft. Im Falle eines DNA-Segments, das für ein Protein kodiert, ist der Sense-Strang der DNA-Strang, der die gleiche Sequenz wie die mRNA hat, die während der Transkription den Antisense-Strang als Vorlage verwendet und schließlich (typischerweise, aber nicht immer) in ein Protein übersetzt wird. Der Antisense-Strang ist also für die RNA verantwortlich, die später in Protein übersetzt wird, während der Sense-Strang einen nahezu identischen Aufbau wie die mRNA besitzt. Beachten Sie, dass es für jedes Segment der dsDNA möglicherweise zwei Sätze von Sense und Antisense gibt, je nachdem, in welche Richtung man liest (da Sense und Antisense relativ zur Perspektive sind). Letztlich ist es das Genprodukt, die mRNA, die bestimmt, welcher Strang eines dsDNA-Segments als Sense oder Antisense bezeichnet wird.
  • Bi-spezifischer Ligand
  • Der Begriff „biospezifischer Ligand“ oder „biospezifischer Anteil“, wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf einen Liganden, der an zwei verschiedene ligandenbindende Domänen bindet. In bestimmten Ausführungsformen ist der Ligand eine kleine Molekülverbindung, ein Peptid oder ein Polypeptid. In anderen Ausführungsformen ist die ligandenbindende Domäne eine „Dimerisierungsdomäne“, die als Peptid-Tag in ein Protein eingebaut werden kann. In verschiedenen Ausführungsformen können zwei Proteine, die jeweils die gleichen oder unterschiedliche Dimerisierungsdomänen umfassen, durch die Bindung jeder Dimerisierungsdomäne an den biospezifischen Liganden zur Dimerisierung veranlasst werden. Der hier verwendete Begriff „bi-spezifische Liganden“ kann sich auch auf „chemische Auslöser der Dimerisierung“ oder „CIDs“ beziehen.
  • Cas9
  • Der Begriff „Cas9“ oder „Cas9-Nuklease“ bezieht sich auf eine RNA-gesteuerte Nuklease, die eine Cas9-Domäne oder ein Fragment davon umfasst(z. B. ein Protein, das eine aktive oder inaktive DNA-Spaltungsdomäne von Cas9 und/oder die gRNA-Bindungsdomäne von Cas9 umfasst). Eine „Cas9-Domäne“, wie hier verwendet, ist ein Proteinfragment, das eine aktive oder inaktive Spaltungsdomäne von Cas9 und/oder die gRNA-Bindungsdomäne von Cas9 umfasst. Ein „Cas9-Protein“ ist ein Cas9-Protein in voller Länge. Eine Cas9-Nuklease wird manchmal auch als casn1-Nuklease oder als CRISPRL(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat)-assoziierte Nuklease bezeichnet. CRISPR ist ein adaptives Immunsystem, das Schutz gegen mobile genetische Elemente (Viren, transponierbare Elemente und konjugative Plasmide) bietet. CRISPR-Cluster enthalten Spacer, d. h. Sequenzen, die komplementär zu vorausgehenden mobilen Elementen sind, und zielen auf eindringende Nukleinsäuren ab. CRISPR-Cluster werden transkribiert und zu CRISPR-RNA (crRNA) verarbeitet. In CRISPR-Systemen vom Typ II erfordert die korrekte Verarbeitung der prä-crRNA eine trans-kodierte kleine RNA (tracrRNA), endogene Ribonuklease 3 (rnc) und eine Cas9-Domäne. Die tracrRNA dient als Leitfaden für die Ribonuklease 3-gestützte Verarbeitung der prä-crRNA. Anschließend schneidet Cas9/crRNA/tracrRNA endonukleolytisch ein lineares oder zirkuläres dsDNA-Ziel, das komplementär zum Spacer ist. Der Zielstrang, der nicht komplementär zur crRNA ist, wird zunächst endonukleolytisch geschnitten und dann exonukleolytisch auf 3'-5' gekürzt. In der Natur werden für die Bindung und Spaltung von DNA normalerweise Proteine und RNAs benötigt. Einzelne Guide-RNAs („sgRNA“ oder einfach „gNRA“) können jedoch so konstruiert werden, dass sie Aspekte sowohl der crRNA als auch der tracrRNA in eine einzige RNA-Spezies einbringen. Siehe z. B. Jinek M., Chylinski K., Fonfara I., Hauer M., Doudna J.A., Charpentier E. Science 337:816- 821(2012), dessen gesamter Inhalt hiermit durch Verweis einbezogen wird. Cas9 erkennt ein kurzes Motiv in den CRISPR-Wiederholungssequenzen (das PAM- oder Protospacer- benachbartes Motiv), um zwischen selbst und nicht selbst zu unterscheiden. Die Sequenzen und Strukturen der Cas9-Nuklease sind dem Fachmann gut bekannt (siehe z .B. „Complete genome sequence of an M1 strain of Streptococcus pyogenes“ Ferretti et al., J.J., McShan W.M., Ajdic D.J., Savic D.J., Savic G., Lyon K., Primeaux C., Sezate S., Suvorov A.N., Kenton S., Lai H.S., Lin S.P., Qian Y., Jia H.G., Najar F.Z., Ren Q., Zhu H., Song L., White J., Yuan X., Clifton S.W., Roe B.A., McLaughlin R.E., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98:4658- 4663(2001); „CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III“ Deltcheva E., Chylinski K., Sharma C.M., Gonzales K., Chao Y., Pirzada Z.A., Eckert M.R., Vogel J., Charpentier E., Nature 471:602-607(2011); und „A programmable dual-RNA- guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.“ Jinek M., Chylinski K., Fonfara I., Hauer M., Doudna J.A., Charpentier E. Science 337:816-821(2012), deren gesamter Inhalt hier durch Bezugnahme aufgenommen wird). Cas9-Orthologe wurden in verschiedenen Spezies beschrieben, einschließlich, aber nicht beschränkt auf S. pyogenes und S. thermophilus. Weitere geeignete Cas9-Nukleasen und -Sequenzen sind für Fachleute auf der Grundlage dieser Erfindung offensichtlich. Zu diesen Cas9-Nukleasen und -Sequenzen gehören Cas9- Sequenzen aus den Organismen und Loci, die in Chylinski, Rhun und Charpentier, „The tracrRNA and Cas9 families of type II CRISPR-Cas immunity systems“ (2013) RNA Biology 10:5, 726-737, offengelegt sind; der gesamte Inhalt dieses Dokuments wird hier durch Bezugnahme aufgenommen. In einigen Ausführungsformen umfasst eine Cas9-Nuklease eine oder mehrere Mutationen, die die DNA-Spaltungsdomäne teilweise beeinträchtigen oder inaktivieren.
  • Eine Nuklease-inaktivierte Cas9-Domäne kann auch als „dCas9“-Protein (für Nuklease-„totes“ Cas9) bezeichnet werden. Verfahren zur Erzeugung einer Cas9-Domäne (oder eines Fragments davon) mit einer inaktiven DNA-Spaltungsdomäne sind bekannt (siehe z. B. Jinek et al., Science. 337:816-821(2012); Qi et al., „Repurposing CRISPR as an RNA- Guided Platform for Sequence-Specific Control of Gene Expression“ (2013) Cell. 28; 152(5):1173-83, deren gesamter Inhalt hier durch Bezugnahme aufgenommen wird). So ist zum Beispiel bekannt, dass die DNA-Spaltungsdomäne von Cas9 zwei Subdomänen umfasst, die HNH-Nuklease-Subdomäne und die RuvC1-Subdomäne. Die HNH-Subdomäne schneidet den zur gRNA komplementären Strang, während die RuvC1-Subdomäne den nicht komplementären Strang schneidet. Mutationen innerhalb dieser Subdomänen können die Nukleaseaktivität von Cas9 inaktivieren. Die Mutationen D10A und H840A zum Beispiel inaktivieren die Nukleaseaktivität von S. pyogenes Cas9 vollständig (Jinek et al., Science. 337:816-821(2012); Qi et al., Cell. 28;152(5): 1173-83 (2013)). In einigen Ausführungsformen werden Proteine bereitgestellt, die Fragmente von Cas9 enthalten. In einigen Ausführungsformen umfasst ein Protein zum Beispiel eine von zwei Cas9-Domänen: (1) die gRNA-Bindungsdomäne von Cas9; oder (2) die DNA-Spaltungsdomäne von Cas9. In einigen Ausführungsformen werden Proteine, die Cas9 oder Fragmente davon enthalten, als „Cas9- Varianten“ bezeichnet. Eine Cas9-Variante weist eine Homologie zu Cas9 oder einem Fragment davon auf. Zum Beispiel ist eine Cas9-Variante mindestens etwa 70 % identisch, mindestens etwa 80 % identisch, mindestens etwa 90 % identisch, mindestens etwa 95 % identisch, mindestens etwa 96 % identisch, mindestens etwa 97 % identisch, mindestens etwa 98 % identisch, mindestens etwa 99 % identisch, mindestens etwa 99,5 % identisch, mindestens etwa 99,8 % identisch oder mindestens etwa 99,9 % identisch mit Wildtyp-Cas9 (z. B. SpCas9 von SEQ-ID-NR.: 18). In einigen Ausführungsformen kann die Cas9-Variante 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 21, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 oder mehr Aminosäureänderungen im Vergleich zum unmutierten Cas9 (z. B., SpCas9 der SEQ-ID-NR.: 18) aufweisen. In einigen Ausführungsformen umfasst die Cas9-Variante ein Fragment von SEQ-ID-NR.: 18 Cas9 (z. B. eine gRNA-Bindungsdomäne oder eine DNA-Spaltungsdomäne), so dass das Fragment zu mindestens etwa 70 % identisch, zu mindestens etwa 80 % identisch, zu mindestens etwa 90 % identisch, zu mindestens etwa 95 % identisch, zu mindestens etwa 96 % identisch, zu mindestens etwa 97 % identisch, zu mindestens etwa 98 % identisch, zu mindestens etwa 99 % identisch, zu mindestens etwa 99,5 % identisch oder zu mindestens etwa 99,9 % identisch mit dem entsprechenden Fragment von unmutiertem Cas9 ist (z. B. SpCas9 von SEQ-ID-NR.: 18). In einigen Ausführungsformen ist das Fragment mindestens 30 %, mindestens 35 %, mindestens 40 %, mindestens 45 %, mindestens 50 %, mindestens 55 %, mindestens 60 %, mindestens 65 %, mindestens 70 %, mindestens 75 %, mindestens 80 %, mindestens 85 %, mindestens 90 %, mindestens 95 % identisch, mindestens 96 %, mindestens 97 %, mindestens 98 %, mindestens 99 % oder mindestens 99,5 % der Aminosäurelänge eines entsprechenden unmutierten Cas9 (z. B. SpCas9 von SEQ-ID-NR.: 18).
  • cDNA
  • Der Begriff „cDNA“ bezieht sich auf einen DNA-Strang, der von einer RNA-Vorlage kopiert wurde. cDNA ist komplementär zur RNA-Vorlage.
  • Kreisförmiger Permutant
  • Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „zirkulärer Permutant“ auf ein Protein oder Polypeptid (z. B. Cas9), das eine zirkuläre Permutation aufweist, d. h. eine Änderung der strukturellen Konfiguration des Proteins, die eine Änderung der Reihenfolge der Aminosäuren in der Aminosäuresequenz des Proteins beinhaltet. Mit anderen Worten, zirkuläre Permutanten sind Proteine, die im Vergleich zu ihrem unmutierten Gegenstück veränderte N- und C-Termini aufweisen, z. B. wird die C-terminale Hälfte eines Proteins vom unmutierten Typ zur neuen N- terminalen Hälfte. Bei der zirkulären Permutation (oder CP) handelt es sich im Wesentlichen um die topologische Neuanordnung der primären Sequenz eines Proteins, die dessen N- und C-Terminus miteinander verbindet, häufig mit einem Peptidlinker, während gleichzeitig die Sequenz an einer anderen Position geteilt wird, um neue, benachbarte N- und C-Termini zu schaffen. Das Ergebnis ist eine Proteinstruktur mit unterschiedlicher Konnektivität, die jedoch häufig die gleiche, insgesamt ähnliche dreidimensionale (3D) Form haben kann und möglicherweise verbesserte oder veränderte Eigenschaften aufweist, darunter eine geringere proteolytische Anfälligkeit, eine verbesserte katalytische Aktivität, eine veränderte Substrat- oder Ligandenbindung und/oder eine verbesserte Thermostabilität. Zirkuläre permutante Proteine können in der Natur vorkommen (z. B. Concanavalin A und Lektin). Darüber hinaus kann eine zirkuläre Permutation durch posttranslationale Modifikationen auftreten oder durch rekombinante Techniken erzeugt werden.
  • Kreisförmig permutiertes Cas9
  • Der Begriff „zirkulär permutiertes Cas9“ bezieht sich auf jedes Cas9-Protein oder eine Variante davon, das als zirkuläres Permutant auftritt, wobei seine N- und C-Termini topisch umgeordnet wurden. Solche zirkulär permutierten Cas9-Proteine („CP-Cas9“) oder Varianten davon behalten die Fähigkeit, DNA zu binden, wenn sie mit einer Guide-RNA (gRNA) komplexiert sind. Siehe Oakes et al., „Protein Engineering of Cas9 for enhanced function“, Methods Enzymol, 2014, 546: 491-511 und Oakes et al., „CRISPR-Cas9 Circular Permutants as Programmable Scaffolds for Genome Modification“, Cell, January 10, 2019, 176: 254-267 (die hier jeweils durch Bezugnahme aufgenommen sind). Die unmittelbare Offenlegung berücksichtigt jedes bereits bekannte CP-Cas9 oder die Verwendung eines neuen CP-Cas9, solange das resultierende zirkulär permutierte Protein die Fähigkeit behält, DNA zu binden, wenn es mit einer Guide-RNA (gRNA) komplexiert ist. Beispielhafte CP-Cas9-Proteine sind SEQ-ID-Nummern: 77-86.
  • CRISPR
  • CRISPR ist eine Familie von DNA-Sequenzen (d. h. CRISPR-Cluster) in Bakterien und Archaeen, die Schnipsel früherer Infektionen durch ein Virus darstellen, das in den Prokaryoten eingedrungen ist. Die DNA-Schnipsel werden von der prokaryotischen Zelle verwendet, um DNA von nachfolgenden Angriffen ähnlicher Viren zu erkennen und zu zerstören. Zusammen mit einer Reihe von CRISPR-assoziierten Proteinen (einschließlich Cas9 und dessen Homologen) und CRISPR-assoziierter RNA bilden sie ein prokaryotisches Immunabwehrsystem. In der Natur werden die CRISPR-Cluster transkribiert und zu CRISPR- RNA (crRNA) verarbeitet. Bei bestimmten Arten von CRISPR-Systemen (z. B. Typ-II- CRISPR-Systemen) erfordert die korrekte Verarbeitung der prä-crRNA eine trans-kodierte kleine RNA (tracrRNA), die endogene Ribonuklease 3 (rnc) und ein Cas9-Protein. Die tracrRNA dient als Leitfaden für die Ribonuklease 3-gestützte Verarbeitung der prä-crRNA. Anschließend schneidet Cas9/crRNA/tracrRNA endonukleolytisch ein lineares oder zirkuläres dsDNA-Ziel, das komplementär zur RNA ist. Konkret wird der Zielstrang, der nicht komplementär zur crRNA ist, zunächst endonukleolytisch geschnitten und dann exonukleolytisch auf 3'-5' gekürzt. In der Natur werden für die Bindung und Spaltung von DNA normalerweise Proteine und RNAs benötigt. Einzelne Guide-RNAs („sgRNA“ oder einfach „gNRA“) können jedoch so konstruiert werden, dass sie Aspekte sowohl der crRNA als auch der tracrRNA in eine einzige RNA-Spezies - die Guide-RNA - integrieren. Siehe z. B. Jinek M., Chylinski K., Fonfara I., Hauer M., Doudna J.A., Charpentier E. Science 337:816-821(2012), dessen gesamter Inhalt hiermit durch Bezugnahme aufgenommen wird. Cas9 erkennt ein kurzes Motiv in den CRISPR-Wiederholungssequenzen (das PAM- oder Protospacer-benachbartes Motiv), um zwischen selbst und nicht selbst zu unterscheiden. Die CRISPR-Biologie sowie die Cas9-Nuklease-Sequenzen und -Strukturen sind dem Fachmann gut bekannt (siehe z B. „Complete genome sequence of an M1 strain of Streptococcus pyogenes“ Ferretti et al., J.J., McShan W.M., Ajdic D.J., Savic D.J., Savic G., Lyon K., Primeaux C., Sezate S., Suvorov A.N., Kenton S., Lai H.S., Lin S.P., Qian Y., Jia H.G., Najar F.Z., Ren Q., Zhu H., Song L., White J., Yuan X., Clifton S.W., Roe B.A., McLaughlin R.E., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98:4658-4663(2001); „CRISPR RNA maturation by trans- encoded small RNA and host factor RNase III“ Deltcheva E., Chylinski K., Sharma C.M., Gonzales K., Chao Y., Pirzada Z.A., Eckert M.R., Vogel J., Charpentier E., Nature 471:602- 607(2011); und „A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.“ Jinek M., Chylinski K., Fonfara I., Hauer M., Doudna J.A., Charpentier E. Science 337:816-821(2012), deren gesamter Inhalt hier durch Bezugnahme aufgenommen wird). Cas9- Orthologe wurden in verschiedenen Spezies beschrieben, einschließlich, aber nicht beschränkt auf S. pyogenes und S. thermophilus. Weitere geeignete Cas9-Nukleasen und -Sequenzen sind für Fachleute auf der Grundlage dieser Erfindung offensichtlich. Zu diesen Cas9-Nukleasen und -Sequenzen gehören Cas9-Sequenzen aus den Organismen und Loci, die in Chylinski, Rhun und Charpentier, „The tracrRNA and Cas9 families of type II CRISPR-Cas immunity systems“ (2013) RNA Biology 10:5, 726-737, offengelegt sind; der gesamte Inhalt dieses Dokuments wird hier durch Bezugnahme aufgenommen.
  • Bei bestimmten Arten von CRISPR-Systemen (z. B. Typ-II-CRISPR-Systemen) erfordert die korrekte Verarbeitung der prä-crRNA eine trans-kodierte kleine RNA (tracrRNA), endogene Ribonuklease 3 (rnc) und ein Cas9-Protein. Die tracrRNA dient als Leitfaden für die Ribonuklease 3-gestützte Verarbeitung der prä-crRNA. Anschließend spaltet Cas9/crRNA/tracrRNA endonukleolytisch ein lineares oder zirkuläres Nukleinsäureziel, das komplementär zur RNA ist. Insbesondere wird der Zielstrang, der nicht komplementär zur crRNA ist, zunächst endonukleolytisch geschnitten und dann exonukleolytisch um 3'-5' gekürzt. In der Natur werden für die Bindung und Spaltung von DNA normalerweise Proteine und RNAs benötigt. Einzelne Guide-RNAs („sgRNA“ oder einfach „gRNA“) können jedoch so konstruiert werden, dass sie Elemente sowohl der crRNA als auch der tracrRNA in eine einzige RNA-Spezies - die Guide-RNA - einbinden.
  • Im Allgemeinen bezieht sich ein „CRISPR-System“ auf Transkripte und andere Elemente, die an der Expression oder Steuerung der Aktivität von CRISPR-assoziierten („Cas“) Genen beteiligt sind, einschließlich Sequenzen, die für ein Cas-Gen, eine tracr (transaktivierende CRISPR)-Sequenz (z. B. tracrRNA oder eine aktive partielle tracrRNA), eine tracr mate-Sequenz (die eine „direkte Wiederholung“ und eine tracrRNA-verarbeitete partielle direkte Wiederholung im Kontext eines endogenen CRISPR-Systems umfasst), eine Leitsequenz (die im Kontext eines endogenen CRISPR-Systems auch als „Spacer“ bezeichnet wird) oder andere Sequenzen und Transkripte von einem CRISPR-Locus. Die tracrRNA des Systems ist (vollständig oder teilweise) komplementär zu der tracr mate-Sequenz auf der Guide-RNA.
  • DNA-Synthese-Vorlage
  • Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „DNA-Synthese-Template“ auf die Region oder den Teil des Erweiterungsarms einer pegRNA, der von einer Polymerase eines Prime-Editors als Matrizenstrang verwendet wird, um einen 3'-Einzelstrang-DNA-Flap zu kodieren, der den gewünschten Schnitt enthält und der dann durch den Mechanismus des Prime-Editings den entsprechenden endogenen DNA-Strang an der Zielstelle ersetzt. In verschiedenen Ausführungsformen ist die DNA-Synthese-Template in 3A (im Zusammenhang mit einer pegRNA, die einen 5'-Erweiterungsarm umfasst), 3B (im Zusammenhang mit einer pegRNA, die einen 3'-Erweiterungsarm umfasst), 3C (im Zusammenhang mit einem internen Erweiterungsarm), 3D (im Zusammenhang mit einem 3'-Erweiterungsarm) und 3E (im Zusammenhang mit einem 5'-Erweiterungsarm). Der Erweiterungsarm, einschließlich der DNA-Synthesematrix, kann aus DNA oder RNA bestehen. Im Falle von RNA kann die Polymerase des Prime Editors eine RNA-abhängige DNA-Polymerase sein (z. B. eine reverse Transkriptase). Im Falle von DNA kann die Polymerase des Prime Editors eine DNA-abhängige DNA-Polymerase sein. In verschiedenen Ausführungsformen (z. B. wie in 3D-3E) kann die DNA-Synthese-Template (4) die „Edit- Template“ und den „Homologiearm“ sowie die gesamte oder einen Teil der optionalen 5'- Endmodifizierungsregion e2 umfassen. Das heißt, je nach Beschaffenheit der e2-Region (z. B. ob sie eine Hairpin-, Toeloop- oder Stamm/Schleifen-Sekundärstruktur enthält) kann die Polymerase keine, einige oder auch die gesamte e2-Region kodieren. Anders ausgedrückt: Im Falle eines 3'-Erweiterungsarms kann die DNA-Synthese-Template (3) den Teil des Erweiterungsarms (3) umfassen, der sich vom 5'-Ende der Primer-Bindungsstelle (PBS) bis zum 3'-Ende des gRNA-Kerns erstreckt, der als Matrize für die Synthese eines DNA- Einzelstrangs durch eine Polymerase (z. B. eine reverse Transkriptase) dienen kann. Im Falle eines 5'-Erweiterungsarms kann die DNA-Synthese-Template (3) den Teil des Erweiterungsarms (3) enthalten, der sich vom 5'-Ende des pegRNA-Moleküls bis zum 3'-Ende der Edit-Template erstreckt. Vorzugsweise schließt die DNA-Synthese-Template die Primer- Bindungsstelle (PBS) von pegRNAs aus, die entweder einen 3'-Erweiterungsarm oder einen 5'-Erweiterungsarm haben. Bestimmte hier beschriebene Ausführungsformen (z. B. 71A) beziehen sich auf eine „RT-Template“, die die Edit-Template und den Homologiearm umfasst, d. h. die Sequenz des pegRNA-Erweiterungsarms, die während der DNA-Synthese tatsächlich als Vorlage verwendet wird. Der Begriff „RT-Template“ ist gleichbedeutend mit dem Begriff „DNA-Synthese-Template“
  • Im Fall von trans Prime-Editing (z. B. 3G und 3H) können die Primer- Bindungsstelle (PBS) und die DNA-Synthese-Template in ein separates Molekül eingebaut werden, das als trans Prime Editor RNA Template (tPERT) bezeichnet wird.
  • Dimerisierungsdomäne
  • Der Begriff „Dimerisierungsdomäne“ bezieht sich auf eine ligandenbindende Domäne, die an eine Bindungseinheit eines biospezifischen Liganden bindet. Eine „erste“ Dimerisierungsdomäne bindet an eine erste Bindungseinheit eines biospezifischen Liganden und eine „zweite“ Dimerisierungsdomäne bindet an eine zweite Bindungseinheit des gleichen biospezifischen Liganden. Wenn die erste Dimerisierungsdomäne an ein erstes Protein fusioniert ist (z. B. über PE, wie hier besprochen) und die zweite Dimerisierungsdomäne (z. B. über PE, wie hier besprochen) an ein zweites Protein fusioniert ist, dimerisieren das erste und das zweite Protein in Gegenwart eines bi-spezifischen Liganden, wobei der bi-spezifische Ligand mindestens eine Einheit aufweist, die an die erste Dimerisierungsdomäne bindet, und mindestens eine andere Einheit, die an die zweite Dimerisierungsdomäne bindet.
  • Stromabwärts
  • Wie hier verwendet, sind die Begriffe „stromaufwärts“ und „stromabwärts“ Relativitätsbegriffe, die die lineare Position von mindestens zwei Elementen definieren, die sich in einem Nukleinsäuremolekül (ob einzel- oder doppelsträngig) befinden, das in einer 5'zu-3'-Richtung orientiert ist. Insbesondere befindet sich ein erstes Element stromaufwärts von einem zweiten Element in einem Nukleinsäuremolekül, wobei das erste Element an einer Stelle positioniert ist, die 5' zu dem zweiten Element liegt. Ein SNP befindet sich beispielsweise stromaufwärts von einer Cas9-induzierten Nick-Stelle, wenn der SNP auf der 5'-Seite der Einkerbung liegt. Umgekehrt befindet sich ein erstes Element stromabwärts von einem zweiten Element in einem Nukleinsäuremolekül, wenn das erste Element an einer Stelle positioniert ist, die 3' zum zweiten Element liegt. Zum Beispiel ist ein SNP stromabwärts von einer Cas9- induzierten Einkerbung, wenn der SNP auf der 3'-Seite der Einkerbung liegt. Das Nukleinsäuremolekül kann eine DNA sein (doppel- oder einzelsträngig). RNA (doppel- oder einzelsträngig) oder ein Hybrid aus DNA und RNA. Die Analyse ist für ein einzelsträngiges Nukleinsäuremolekül und ein doppelsträngiges Molekül die gleiche, da sich die Begriffe „stromaufwärts“ und „stromabwärts“ nur auf einen Einzelstrang eines Nukleinsäuremoleküls beziehen, mit der Ausnahme, dass man auswählen muss, welcher Strang des doppelsträngigen Moleküls betrachtet wird. Oft ist der Strang einer doppelsträngigen DNA, der zur Bestimmung der Positionsrelativität von mindestens zwei Elementen verwendet werden kann, der „Sense- Strang“ oder „kodierende Strang“. In der Genetik ist ein „Sense“-Strang das Segment innerhalb der doppelsträngigen DNA, das von 5' nach 3' verläuft und das komplementär zum Antisense-Strang der DNA, dem Templat-Strang, ist, der von 3' nach 5' verläuft. So ist beispielsweise eine SNP-Nukleobase „stromabwärts“ von einer Promotorsequenz in einer genomischen DNA (die doppelsträngig ist), wenn sich die SNP-Nukleobase auf der 3'-Seite des Promotors auf dem Sense- oder Kodierungsstrang befindet.
  • Edit-Template
  • Der Begriff „Edit-Template“ bezieht sich auf einen Teil des Erweiterungsarms, der die gewünschte Editierung in der einzelsträngigen 3'-DNA-Flap kodiert, die von der Polymerase, z. B. einer DNA-abhängigen DNA-Polymerase, einer RNA-abhängigen DNA-Polymerase (z. B. einer reversen Transkriptase) synthetisiert wird. Bestimmte hier beschriebene Ausführungsformen (z. B. 71A) beziehen sich auf „eine RT-Template“, was sich sowohl auf die Edit-Template als auch auf den Homologiearm zusammen bezieht, d. h. auf die Sequenz des pegRNA-Erweiterungsarms, die während der DNA-Synthese tatsächlich als Vorlage verwendet wird. Der Begriff „RT-Edit-Template“ entspricht auch dem Begriff „DNA- Synthese-Template“, wobei die RT-Edit-Template jedoch die Verwendung eines Prime Editors mit einer Polymerase, die eine reverse Transkriptase ist, widerspiegelt und wobei die DNA- Synthese-Template im weiteren Sinne die Verwendung eines Prime Editors mit einer beliebigen Polymerase widerspiegelt.
  • Wirksame Menge
  • Der Begriff „wirksame Menge“, wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf eine Menge eines biologisch aktiven Mittels, die ausreicht, um eine gewünschte biologische Reaktion hervorzurufen. In einigen Ausführungsformen kann sich eine wirksame Menge eines Prime Editors (PE) beispielsweise auf die Menge des Editors beziehen, die ausreicht, um eine Nukleotidsequenz an der Zielstelle, z. B. ein Genom, zu editieren. In einigen Ausführungsformen kann sich eine wirksame Menge eines hier bereitgestellten Prime Editors (PE), z. B. eines Fusionsproteins, das eine Nickase-Cas9-Domäne und eine reverse Transkriptase umfasst, auf die Menge des Fusionsproteins beziehen, die ausreicht, um die Editierung einer Zielstelle zu induzieren, die spezifisch durch das Fusionsprotein gebunden und editiert wird. Wie den Fachleuten klar sein wird, kann die wirksame Menge eines Mittels, z. B. eines Fusionsproteins, einer Nuklease, eines Hybridproteins, eines Proteindimers, eines Komplexes aus einem Protein (oder Proteindimer) und einem Polynukleotid oder eines Polynukleotids von verschiedenen Faktoren abhängen, wie z. B. von der gewünschten biologischen Reaktion, z. B. von dem spezifischen Allel, Genom oder der Zielstelle, der editiert werden soll, von der Zelle oder dem Gewebe, auf die/das abgezielt wird, und von dem verwendeten Mittel.
  • Fehleranfällige reverse Transkriptase
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „fehleranfällige“ reverse Transkriptase (oder im weiteren Sinne eine beliebige Polymerase) auf eine reverse Transkriptase (oder im weiteren Sinne eine beliebige Polymerase), die natürlich vorkommt oder von einer anderen reversen Transkriptase (z. B. einer Wildtyp M-MLV reversen Transkriptase) abgeleitet wurde, die eine Fehlerrate aufweist, die geringer ist als die Fehlerrate der Wildtyp M-MLV reversen Transkriptase. Die Fehlerrate der M-MLV-Wildtyp-Reverse-Transkriptase liegt Berichten zufolge im Bereich von einem Fehler auf 15.000 (höher) bis 27.000 (niedriger). Eine Fehlerquote von 1 zu 15.000 entspricht einer Fehlerquote von 6,7 x 10-5. Eine Fehlerquote von 1 zu 27.000 entspricht einer Fehlerquote von 3,7 x 10-5. Siehe Boutabout et al. (2001) „DNA synthesis fidelity by the reverse transcriptase of the yeast retrotransposon Ty1", Nucleic Acids Res 29(11):2217-2222, das hier durch Bezugnahme aufgenommen wird. Für die Zwecke dieser Anwendung bezieht sich der Begriff „fehleranfällig“ auf jene RT, die eine Fehlerrate von mehr als einem Fehler in 15.000 Nukleobasen (6,7 x 10-5 oder höher) aufweisen, z. B., 1 Fehler in 14.000 Nukleobasen (7,14 x 10-5 oder höher), 1 Fehler in 13.000 Nukleobasen oder weniger (7,7 × 10-5 oder höher), 1 Fehler in 12.000 Nukleobasen oder weniger (7,7 x 10-5 oder höher), 1 Fehler in 11.000 Nukleobasen oder weniger (9.1 × 10-5 oder höher), 1 Fehler in 10.000 Nukleobasen oder weniger (1 × 10-4 oder 0,0001 oder höher), 1 Fehler in 9.000 Nukleobasen oder weniger (0,00011 oder höher), 1 Fehler in 8.000 Nukleobasen oder weniger (0,00013 oder höher), 1 Fehler in 7.000 Nukleobasen oder weniger (0,00014 oder höher), 1 Fehler in 6.000 Nukleobasen oder weniger (0,00016 oder höher), 1 Fehler in 5.000 Nukleobasen oder weniger (0,0002 oder höher), 1 Fehler in 4.000 Nukleobasen oder weniger (0,00025 oder höher), 1 Fehler in 3.000 Nukleobasen oder weniger (0,00033 oder höher), 1 Fehler in 2.000 Nukleobasen oder weniger (0,00050 oder höher), 1 Fehler in 1.000 Nukleobasen oder weniger (0,001 oder höher), 1 Fehler in 500 Nukleobasen oder weniger (0,002 oder höher) oder 1 Fehler in 250 Nukleobasen oder weniger (0,004 oder höher).
  • Extein
  • Der Begriff „Extein“, wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf eine Polypeptidsequenz, die von einem Intein flankiert wird und während des Prozesses des Proteinspleißens an ein anderes Extein ligiert wird, um ein reifes, gespleißtes Protein zu bilden. Normalerweise wird ein Intein von zwei Extein-Sequenzen flankiert, die miteinander ligiert werden, wenn das Intein seine eigene Exzision katalysiert. Exteine sind also das Protein- Analogon zu den Exons in der mRNA. Ein Polypeptid, das ein Intein enthält, kann zum Beispiel die Struktur Extein(N) - Intein - Extein(C) haben. Nach der Exzision des Inteins und dem Spleißen der beiden Exteine entstehen die Strukturen Extein(N) - Extein(C) und ein freies Intein. In verschiedenen Konfigurationen können die Exteine separate Proteine sein (z. B. die Hälfte eines Cas9- oder PE-Fusionsproteins), die jeweils mit einem Split-Intein fusioniert sind, wobei die Exzision der Split-Inteine das Zusammenspleißen der Extein-Sequenzen bewirkt.
  • Erweiterungsarm
  • Der Begriff „Erweiterungsarm“ bezieht sich auf eine Nukleotidsequenzkomponente einer pegRNA, die mehrere Funktionen erfüllt, darunter eine Primer-Bindungsstelle und eine Edit-Template für die reverse Transkriptase. In einigen Ausführungsformen, z. B. 3D befindet sich der Erweiterungsarm am 3'-Ende der Guide-RNA. In anderen Ausführungsformen, z. B. 3E befindet sich der Erweiterungsarm am 5'-Ende der Guide- RNA. In einigen Ausführungsformen umfasst der Erweiterungsarm auch einen Homologiearm. In verschiedenen Ausführungsformen umfasst der Erweiterungsarm die folgenden Komponenten in 5' bis 3' Richtung: den Homologiearm, die Edit-Template und die Primer-Bindungsstelle. Da die Polymerisationsaktivität der reversen Transkriptase in der 5'zu-3'-Richtung erfolgt, ist die bevorzugte Anordnung des Homologiearms, der Edit-Template und der Primer-Bindungsstelle in der 5'-zu-3'-Richtung, so dass die reverse Transkriptase, sobald sie durch eine angelagerte Primer-Sequenz geprimert wurde, einen einzelnen DNA- Strang unter Verwendung der Edit-Template als komplementären Vorlagenstrang polymerisiert. Weitere Details, wie z. B. die Länge des Erweiterungsarms, werden an anderer Stelle beschrieben.
  • Der Erweiterungsarm kann auch so beschrieben werden, dass er im Allgemeinen zwei Regionen umfasst: eine Primer-Bindungsstelle (PBS) und eine DNA-Synthese-Template, wie in 3G (oben) zum Beispiel gezeigt. Die Primer-Bindungsstelle bindet an die Primer- Sequenz, die aus dem endogenen DNA-Strang der Zielstelle gebildet wird, wenn dieser durch den Prime-Editor-Komplex eingekerbt wird, wodurch ein 3'-Ende auf dem endogenen eingekerbten Strang freigelegt wird. Wie hier erläutert, wird durch die Bindung der Primer- Sequenz an die Primer-Bindungsstelle auf dem Erweiterungsarm der pegRNA eine Duplex- Region mit einem freiliegenden 3'-Ende (d. h. dem 3' der Primer-Sequenz) erzeugt, die dann ein Substrat für eine Polymerase bereitstellt, um mit der Polymerisation eines einzelnen DNA- Strangs von dem freiliegenden 3'-Ende entlang der Länge der DNA-Synthese-Template zu beginnen. Die Sequenz des einsträngigen DNA-Produkts ist das Komplement der DNA- Synthese-Template. Die Polymerisation setzt sich in Richtung der 5' der DNA-Synthese- Template (oder des Erweiterungsarms) fort, bis die Polymerisation endet. Somit stellt die DNA-Synthese-Template den Teil des Erweiterungsarms dar, der von der Polymerase des Prime-Editor-Komplexes in ein einzelsträngiges DNA-Produkt (d. h. den 3'-Einzelstrang- DNA-Flap, der die gewünschte genetische Schnittinformation enthält) kodiert wird und der letztendlich den entsprechenden endogenen DNA-Strang der Zielstelle ersetzt, der unmittelbar stromabwärts der PE-induzierten Einkerbung liegt. Ohne an die Theorie gebunden zu sein, setzt sich die Polymerisation der DNA-Synthese-Template zum 5'-Ende des Erweiterungsarms hin fort, bis ein FIGruchereignis eintritt. Die Polymerisation kann auf verschiedene Weise beendet werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf (a) das Erreichen eines 5'-Terminus der pegRNA (z. B. im Fall des 5'-Erweiterungsarms, bei dem der DNA-Polymerase einfach die Vorlage ausgeht), (b) das Erreichen einer unpassierbaren RNA-Sekundärstruktur (z. B., Haarnadel oder Stamm/Schleife) oder (c) das Erreichen eines Replikationsterminationssignals, z. B. einer spezifischen Nukleotidsequenz, die die Polymerase blockiert oder hemmt, oder eines topologischen Nukleinsäuresignals, wie z. B. supergewickelte DNA oder RNA.
  • Flap-Endonuklease (z. B. FEN1)
  • Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „Flap-Endonuklease“ auf ein Enzym, das die Entfernung von 5'-Einzelstrang-DNA-Flaps katalysiert. Dies sind natürlich vorkommende Enzyme, die die Entfernung von 5'-Flap verarbeiten, die während zellulärer Prozesse, einschließlich der DNA-Replikation, gebildet werden. Die hier beschriebenen Prime-Editing- Verfahren können endogen bereitgestellte Flap-Endonukleasen oder solche, die in trans bereitgestellt werden, verwenden, um den 5'-Flap der endogenen DNA zu entfernen, der während des Prime-Editings an der Zielstelle gebildet wird. Flap-Endonukleasen sind in der Technik bekannt und werden beschrieben in Patel et al., „Flap endonucleases pass 5'-flaps through a flexible arch using a disorder-thread-order mechanism to confer specificity for free 5'-ends,“ Nucleic Acids Research, 2012, 40(10): 4507-4519, Tsutakawa et al., „Human flap endonuclease structures, DNA double-base flipping, and a unified understanding of the FEN1 superfamily,“ Cell, 2011, 145(2): 198-211, und Balakrishnan et al., „Flap Endonuclease 1,“ Annu Rev Biochem, 2013, Vol 82: 119-138 (die hier jeweils durch Bezugnahme aufgenommen sind). Eine beispielhafte Flap-Endonuklease ist FEN1, die durch die folgende Aminosäuresequenz dargestellt werden kann:
    BESCHREIBUNG SEQUENZ SEQ- ID- NR.:
    FEN1 WILD TYPE
    Figure DE112021002672T5_0001
    		 SEQ- ID-NR: 7
  • Funktionelles Äquivalent
  • Der Begriff „funktionelles Äquivalent“ bezieht sich auf ein zweites Biomolekül, das in seiner Funktion, aber nicht unbedingt in seiner Struktur einem ersten Biomolekül gleichwertig ist. Ein „Cas9-Äquivalent“ bezieht sich beispielsweise auf ein Protein, das die gleichen oder im Wesentlichen die gleichen Funktionen wie Cas9 hat, aber nicht unbedingt die gleiche Aminosäuresequenz. Im Zusammenhang mit der Erfindung bezieht sich die Spezifikation durchgehend auf „ein Protein X oder ein funktionelles Äquivalent davon“. In diesem Zusammenhang umfasst ein „funktionelles Äquivalent“ von Protein X jedes Homolog, Paralog, Fragment, jede natürlich vorkommende, manipulierte, mutierte oder synthetische Version von Protein X, die eine äquivalente Funktion aufweist.
  • Fusionsprotein
  • Der Begriff „Fusionsprotein“, wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf ein hybrides Polypeptid, das Proteindomänen von mindestens zwei verschiedenen Proteinen umfasst. Ein Protein kann sich am aminoterminalen (N-terminalen) Teil des Fusionsproteins oder am carboxyterminalen (C-terminalen) Protein befinden und bildet somit ein „aminoterminales Fusionsprotein“ bzw. ein „carboxyterminales Fusionsprotein“. Ein Protein kann verschiedene Domänen umfassen, zum Beispiel eine Nukleinsäure-Bindungsdomäne(z. B. die gRNA- Bindungsdomäne von Cas9, die die Bindung des Proteins an eine Zielstelle steuert) und eine Nukleinsäure-Spaltungsdomäne oder eine katalytische Domäne eines Nukleinsäure- Editierproteins. Ein weiteres Beispiel ist Cas9 oder ein Äquivalent davon zu einer reversen Transkriptase. Jedes der hier angebotenen Proteine kann durch jede in der Technik bekannte Methode hergestellt werden. Zum Beispiel können die hier angebotenen Proteine durch rekombinante Proteinexpression und -reinigung hergestellt werden, was sich besonders für Fusionsproteine eignet, die einen Peptidlinker enthalten. Die Verfahren zur Expression und Reinigung rekombinanter Proteine sind allgemein bekannt und werden unter anderem beschrieben von Green und Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4th ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2012)), dessen gesamter Inhalt hier durch Verweis aufgenommen wird.
  • Gen von Interesse (GOI)
  • Der Begriff „Gen von Interesse“ oder „GOI“ bezieht sich auf ein Gen, das für ein Biomolekül von Interesse kodiert (z. B. ein Protein oder ein RNA-Molekül). Ein Protein von Interesse kann ein intrazelluläres Protein, ein Membranprotein oder ein extrazelluläres Protein sein, z. B. ein Kernprotein, ein Transkriptionsfaktor, ein Kernmembrantransporter, ein mit einer intrazellulären Organelle assoziiertes Protein, ein Membranrezeptor, ein katalytisches Protein, ein Enzym, ein therapeutisches Protein, ein Membranprotein, ein Membrantransportprotein, ein Signaltransduktionsprotein oder ein immunologisches Protein (z. B. ein IgG- oder anderes Antikörperprotein) usw. Das Gen von Interesse kann auch für ein RNA-Molekül kodieren, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Boten-RNA (mRNA), Transfer-RNA (tRNA), ribosomale RNA (rRNA), kleine Kern-RNA (snRNA), Antisense- RNA, Guide-RNA, microRNA (miRNA), small interfering RNA (siRNA) und zellfreie RNA (cfRNA).
  • Guide-RNA („gRNA“)
  • Wie hier verwendet, ist der Begriff „Guide-RNA“ eine besondere Art von Guide- Nukleinsäure, die meist mit einem Cas-Protein eines CRISPR-Cas9 assoziiert ist und die mit Cas9 assoziiert und das Cas9-Protein zu einer bestimmten Sequenz in einem DNA-Molekül lenkt, die Komplementarität zur Protospacer-Sequenz der Guide-RNA aufweist. Dieser Begriff umfasst jedoch auch die äquivalenten Leitnukleinsäuremoleküle, die mit Cas9- Äquivalenten, Homologen, Orthologen oder Paralogen assoziiert sind, unabhängig davon, ob sie natürlich vorkommen oder nicht (z. B. gentechnisch verändert oder rekombinant), und die das Cas9-Äquivalent anderweitig darauf programmieren, sich an einer bestimmten Zielnukleotidsequenz zu lokalisieren. Die Cas9-Äquivalente können andere napDNAbp von jedem Typ von CRISPR-Systemen (z. B. Typ II, V, VI) umfassen, einschließlich Cpfl (ein Typ-V-CRISPR-Cas-System), C2c1 (ein Typ-V-CRISPR-Cas-System), C2c2 (ein Typ-VI- CRISPR-Cas-System) und C2c3 (ein Typ-V-CRISPR-Cas-System). Weitere Cas-Äquivalente sind beschrieben in Makarova et al., „C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector“, Science 2016; 353(6299), dessen Inhalt hier durch Bezugnahme aufgenommen wird. Beispielhafte Sequenzen und Strukturen von Guide-RNAs sind hier aufgeführt. Darüber hinaus werden hier Verfahren zum Entwurf geeigneter Guide- RNA-Sequenzen vorgestellt. Wie hier verwendet, kann die „Guide RNA“ auch als „traditionelle Guide-RNA“ bezeichnet werden, um sie von den modifizierten Formen der Guide-RNA zu unterscheiden, die als „prime editing Guide-RNAs“ (oder „pegRNAs“) bezeichnet werden und für die hier offengelegten Prime Editing Verfahren und Zusammensetzungen erfunden wurden.
  • Guide-RNAs oder pegRNAs können verschiedene Strukturelemente umfassen, die unter anderem Folgendes beinhalten:
  • Spacer-Sequenz - die Sequenz in der Guide-RNA oder pegRNA (mit einer Länge von etwa 20 nts), die an den Protospacer in der Ziel-DNA bindet.
  • gRNA-Kern (oder gRNA-Gerüst oder Rückgrat-Sequenz) - bezieht sich auf die Sequenz innerhalb der gRNA, die für die Bindung von Cas9 verantwortlich ist. Sie umfasst nicht die 20 bp Spacer/Targeting-Sequenz, die verwendet wird, um Cas9 zur Ziel-DNA zu führen.
  • Erweiterungsarm - eine Einzelstrangerweiterung am 3'-Ende oder am 5'-Ende der pegRNA, die eine Primer-Bindungsstelle und eine DNA-Synthese-Templaten-Sequenz umfasst, die über eine Polymerase (z. B. eine reverse Transkriptase) einen einzelsträngigen DNA-Flap kodiert, der die gewünschte genetische Veränderung enthält, der dann in die endogene DNA integriert wird, indem der entsprechende endogene Strang ersetzt wird, wodurch die gewünschte genetische Veränderung installiert wird.
  • Transkriptionsterminator - die Guide-RNA oder pegRNA kann eine Transkriptionsterminationssequenz am 3' des Moleküls enthalten.
  • Homologiearm
  • Der Begriff „Homologiearm“ bezieht sich auf einen Teil des Erweiterungsarms, der für einen Teil des resultierenden, durch reverse Transkriptase kodierten Einzelstrang-DNA-Flaps kodiert, der durch Ersetzen des endogenen Strangs in die Ziel-DNA-Stelle integriert werden soll. Der Teil des Einzelstrang-DNA-Flaps, der durch den Homologiearm kodiert wird, ist komplementär zum nicht-editierten Strang der Ziel-DNA-Sequenz, was die Verdrängung des endogenen Strangs und das Anheften des Einzelstrang-DNA-Flaps an dessen Stelle erleichtert, wodurch die Editierung installiert wird. Diese Komponente wird an anderer Stelle näher definiert. Der Homologiearm ist Teil der DNA-Synthese-Template, da er per Definition von der Polymerase der hier beschriebenen Prime-Editoren kodiert wird.
  • Wirtszelle
  • Der Begriff „Wirtszelle“, wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf eine Zelle, die einen hier beschriebenen Vektor beherbergen, replizieren und exprimieren kann, z. B. einen Vektor, der ein Nukleinsäuremolekül umfasst, das für ein Fusionsprotein kodiert, das ein Cas9 oder Cas9-Äquivalent und eine reverse Transkriptase umfasst.
  • Inteins
  • Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „Intein“ auf selbstverarbeitende Polypeptid-Domänen, die in Organismen aus allen Bereichen des Lebens vorkommen. Ein Intein (intervenierendes Protein) führt ein einzigartiges automatisches Verarbeitungsereignis durch, das als Proteinspleißen bekannt ist. Dabei schneidet es sich selbst aus einem größeren Vorläuferpolypeptid durch die Spaltung von zwei Peptidbindungen heraus und bindet dabei die flankierenden Extein-Sequenzen (externe Proteine) durch die Bildung einer neuen Peptidbindung. Diese Umstrukturierung erfolgt posttranslational (oder möglicherweise kotranslational), da Intein-Gene im Rahmen anderer proteinkodierender Gene eingebettet sind. Darüber hinaus erfolgt das Intein-vermittelte Proteinspleißen spontan; es erfordert keinen externen Faktor oder eine Energiequelle, sondern lediglich die Faltung der Intein-Domäne. Dieser Prozess wird auch als cis-Proteinspleißen bezeichnet, im Gegensatz zum natürlichen Prozess des trans-Proteinspleißens mit „gespaltenen Internen“. Inteins sind das Protein- Äquivalent der sich selbst spaltenden RNA-Introns (siehe Perler et al., Nucleic Acids Res. 22:1125-1127 (1994)), die ihre eigene Exzision von einem Vorläuferprotein mit der gleichzeitigen Fusion der flankierenden Proteinsequenzen, den so genannten Exteinen, katalysieren (Übersicht in Perler et al., Curr. Opin. Chem. Biol. 1 :292-299 (1997); Perler, F. B. Cell 92(1):1-4 (1998); Xu et al., EMBO J. 15(19):5146-5153 (1996)).
  • Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „Proteinspleißen“ auf einen Prozess, bei dem eine innere Region eines Vorläuferproteins (ein Intein) herausgeschnitten wird und die flankierenden Regionen des Proteins (Exteine) ligiert werden, um das reife Protein zu bilden. Dieser natürliche Prozess wurde bei zahlreichen Proteinen sowohl von Prokaryoten als auch von Eukaryoten beobachtet (Perler, F. B., Xu, M. Q., Paulus, H. Current Opinion in Chemical Biology 1997, 1, 292-299; Perler, F. B. Nucleic Acids Research 1999, 27, 346-347). Die Intein-Einheit enthält die notwendigen Komponenten, die für die Katalyse des Proteinspleißens erforderlich sind, und enthält oft eine Endonuklease-Domäne, die an der Intein-Mobilität beteiligt ist (Perler, F. B., Davis, E. O., Dean, G. E., Gimble, F. S., Jack, W. E., Neff, N., Noren, C. J., Thomer, J., Belfort, M. Nucleic Acids Research 1994, 22, 1127-1127). Die resultierenden Proteine sind miteinander verbunden, werden aber nicht als separate Proteine exprimiert. Das Spleißen von Proteinen kann auch in trans erfolgen, wobei sich auf getrennten Polypeptiden exprimierte Split-Inteine spontan zu einem einzigen Intein verbinden, das dann den Proteinspleißprozess durchläuft, um sich zu getrennten Proteinen zu verbinden.
  • Die Aufklärung des Mechanismus des Proteinspleißens hat zu einer Reihe von Inteinbasierten Anwendungen geführt (Comb, et al., U.S.. Pat. Nr. 5.496.714 ; Comb, et al., U.S. Pat. Nr. 5.834.247 ; Camarero und Muir, J. Amer. Chem. Soc., 121:5597-5598 (1999); Chong, et al., Gene, 192:271-281 (1997), Chong, et al., Nucleic Acids Res., 26:5109-5115 (1998); Chong, et al., J. Biol. Chem., 273:10567-10577 (1998); Cotton, et al. J. Am. Chem. Soc., 121:1100-1101 (1999); Evans, et al., J. Biol. Chem., 274:18359-18363 (1999); Evans, et al., J. Biol. Chem., 274:3923-3926 (1999); Evans, et al., Protein Sci., 7:2256-2264 (1998); Evans, et al., J. Biol. Chem., 275:9091-9094 (2000); Iwai und Pluckthun, FEBS Lett. 459:166-172 (1999); Mathys, et al., Gene, 231:1-13 (1999); Mills, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:3543-3548 (1998); Muir, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:6705-6710 (1998); Otomo, et al., Biochemistry 38:16040-16044 (1999); Otomo, et al., J. Biolmol. NMR 14:105-114 (1999); Scott, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:13638-13643 (1999); Severinov und Muir, J. Biol. Chem., 273:16205-16209 (1998); Shingledecker, et al., Gene, 207:187-195 (1998); Southworth, et al., EMBO J. 17:918-926 (1998); Southworth, et al., Biotechniques, 27:110- 120 (1999); Wood, et al., Nat. Biotechnol., 17:889-892 (1999); Wu, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:9226-9231 (1998a); Wu, et al., Biochim Biophys Acta 1387:422-432 (1998b); Xu, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:388-393 (1999); Yamazaki, et al., J. Am. Chem. Soc., 120:5591-5592 (1998)). Jede Referenz wird hier durch Bezugnahme aufgenommen.
  • Ligandenabhängiges Intein
  • Der Begriff „ligandenabhängiges Intein“, wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf ein Intein, das eine ligandenbindende Domäne umfasst. Typischerweise wird die ligandenbindende Domäne in die Aminosäuresequenz des Inteins eingefügt, was zu einer Struktur Intein (N) - ligandenbindende Domäne - Intein (C) führt. Typischerweise zeigen ligandenabhängige Inteine in Abwesenheit eines geeigneten Liganden keine oder nur eine minimale Proteinspleißaktivität und in Anwesenheit des Liganden einen deutlichen Anstieg der Proteinspleißaktivität. In einigen Ausführungsformen zeigt das ligandenabhängige Intein in Abwesenheit des Liganden keine beobachtbare Spleißaktivität, wohl aber in Gegenwart des Liganden. In einigen Ausführungsformen zeigt das ligandenabhängige Intein eine beobachtbare Proteinspleißaktivität in Abwesenheit des Liganden und eine Proteinspleißaktivität in Anwesenheit eines geeigneten Liganden, die mindestens 5-mal, mindestens 10-mal, mindestens 50-mal, mindestens 100-mal, mindestens 150-mal, mindestens 200-mal, mindestens 250-mal, mindestens 500-mal, mindestens 1000-mal, mindestens 1500- mal, mindestens 2000-mal, mindestens 2500-mal, mindestens 5000-mal, mindestens 10000- mal, mindestens 20000-mal, mindestens 25000-mal, mindestens 50000-mal, mindestens 100000-mal, mindestens 500000-mal oder mindestens 1000000-mal größer ist als die in Abwesenheit des Liganden beobachtete Aktivität. In einigen Ausführungsformen ist die Zunahme der Aktivität dosisabhängig über mindestens 1 Größenordnung, mindestens 2 Größenordnungen, mindestens 3 Größenordnungen, mindestens 4 Größenordnungen oder mindestens 5 Größenordnungen, was eine Feinabstimmung der Intein-Aktivität durch Anpassung der Ligandenkonzentration ermöglicht. Geeignete ligandenabhängige Inteine sind in der Technik bekannt und umfassen die unten aufgeführten und diejenigen, die beschrieben sind in den veröffentlichten U.S. Patentanmeldung U.S. 2014/0065711 A1; Mootz et al., „Protein splicing triggered by a small molecule“ J. Am. Chem. Soc. 2002; 124, 9044-9045; Mootz et al., „Conditional protein splicing: a new tool to control protein structure and function in vitro and in vivo.“ J. Am. Chem. Soc. 2003; 125, 10561-10569; Buskirk et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004; 101, 10505-10510); Skretas & Wood, „Regulation of protein activity with small-molecule-controlled inteins“ Protein Sci. 2005; 14, 523-532; Schwartz, et al., „Posttranslational enzyme activation in an animal via optimized conditional protein splicing“ Nat. Chem. Biol. 2007; 3, 50-54; Peck et al., Chem. Biol. 2011; 18 (5), 619-630; der gesamte Inhalt wird hiermit durch Bezugnahme aufgenommen. Beispielhafte Sequenzen sind wie folgt:
    NAME SEQUENZ DES LIGANDENABHÄNGIGEN INTEINS
    2-4 INTEIN:
    Figure DE112021002672T5_0002
    3-2 INTEIN
    Figure DE112021002672T5_0003
    30R3-1 INTEIN
    Figure DE112021002672T5_0004
    30R3-2 INTEIN
    Figure DE112021002672T5_0005
    30R3-3 INTEIN
    Figure DE112021002672T5_0006
    37R3-1 INTEIN
    Figure DE112021002672T5_0007
    37R3-2 INTEIN
    Figure DE112021002672T5_0008
    37R3-3 INTEIN
    Figure DE112021002672T5_0009
  • Linker
  • Der Begriff „Linker“, wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf ein Molekül, das zwei andere Moleküle oder Teile miteinander verbindet. Der Linker kann eine Aminosäuresequenz sein, wenn es sich um einen Linker handelt, der zwei Fusionsproteine verbindet. Zum Beispiel kann ein Cas9 durch eine Aminosäure-Linkersequenz an eine reverse Transkriptase fusioniert werden. Der Linker kann auch eine Nukleotidsequenz sein, wenn zwei Nukleotidsequenzen miteinander verbunden werden sollen. Im vorliegenden Fall ist die herkömmliche Guide-RNA beispielsweise über eine Spacer- oder Linker-Nukleotidsequenz mit der RNA-Erweiterung einer Prime-Editing-Guide-RNA verbunden, die eine RT-Template- Sequenz und eine RT-Primer-Bindungsstelle umfassen kann. In anderen Ausführungsformen ist der Linker ein organisches Molekül, eine Gruppe, ein Polymer oder eine chemische Einheit. In einigen Ausführungsformen ist der Linker 5-100 Aminosäuren lang, zum Beispiel 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 30-35, 35-40, 40-45, 45-50, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 90-100, 100-150 oder 150-200 Aminosäuren lang. Längere oder kürzere Linker sind ebenfalls denkbar.
  • Isoliert
  • „Isoliert“ bedeutet verändert oder aus dem natürlichen Zustand entfernt. So ist beispielsweise eine Nukleinsäure oder ein Peptid, die von Natur aus in einem lebenden Tier vorhanden sind, nicht „isoliert“, aber dieselbe Nukleinsäure oder dasselbe Peptid, das teilweise oder vollständig von den koexistierenden Materialien seines natürlichen Zustands getrennt wurde, ist „isoliert“. Eine isolierte Nukleinsäure oder ein isoliertes Protein kann in weitgehend gereinigter Form vorliegen oder in einer nicht nativen Umgebung, wie z. B. Einer Wirtszelle, existieren.
  • In einigen Ausführungsformen wird ein Gen von Interesse von einer isolierten Nukleinsäure kodiert. Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „isoliert“ auf die Eigenschaft eines Materials, das aus seiner ursprünglichen oder natürlichen Umgebung (z. B. Der natürlichen Umgebung, wenn es natürlich vorkommt) entfernt wurde. Daher wird ein natürlich vorkommendes Polynukleotid oder Protein oder Polypeptid, das in einem lebenden Tier vorhanden ist, nicht isoliert, sondern dasselbe Polynukleotid oder Polypeptid, das durch menschliches Eingreifen von einigen oder allen koexistierenden Materialien im natürlichen System abgetrennt wurde, wird isoliert. Ein künstliches oder manipuliertes Material, zum Beispiel ein nicht natürlich vorkommendes Nukleinsäurekonstrukt, wie die hier beschriebenen Expressionskonstrukte und Vektoren, werden dementsprechend auch als isoliert bezeichnet. Ein Material muss nicht gereinigt werden, um isoliert zu werden. Dementsprechend kann ein Material Teil eines Vektors und/oder Teil einer Zusammensetzung sein und dennoch isoliert sein, da dieser Vektor oder diese Zusammensetzung nicht Teil der Umgebung ist, in der das Material in der Natur vorkommt.
  • MS2 Markierungstechnik
  • In verschiedenen Ausführungsformen (z. B. Wie in den Ausführungsformen von FIG.. 72-73 und in Beispiel 19) bezieht sich der Begriff „MS2-Tagging-Technik“ auf die Kombination einer „RNA-Protein-Interaktionsdomäne“ (auch bekannt als „RNA-Protein- Rekrutierungsdomäne oder -protein“) mit einem RNA-bindenden Protein, das die RNA- Protein-Interaktionsdomäne spezifisch erkennt und an sie bindet, z. B. Eine spezifische Haarnadelstruktur. Diese Art von Systemen kann genutzt werden, um eine Vielzahl von Funktionalitäten an einen primären Editor-Komplex zu rekrutieren, der an eine Zielstelle gebunden ist. Die MS2-Tagging-Technik basiert auf der natürlichen Wechselwirkung des MS2-Bakteriophagen-Hüllproteins („MCP“ oder „MS2cp“) mit einer im Genom des Phagen vorhandenen Stielschleifen- oder Haarnadelstruktur, d. H. Der „MS2-Haarnadel“. Im Falle des Prime Editing umfasst die MS2-Tagging-Technik die Einführung der MS2-Haarnadel in ein gewünschtes RNA-Molekül, das am Prime Editing beteiligt ist (z. B. Eine pegRNA oder eine tPERT), die dann ein spezifisches interagierbares Bindungsziel für ein RNA-bindendes Protein darstellt, das diese Struktur erkennt und daran bindet. Im Falle des MS2-Hairpins wird es vom MS2-Bakteriophagen-Hüllprotein (MCP) erkannt und gebunden. Und wenn MCP mit einem anderen Protein fusioniert ist (z. B. Einer reversen Transkriptase oder einer anderen DNA- Polymerase), dann kann die MS2-Haarnadel dazu verwendet werden, dieses andere Protein in trans zu der vom Prime-Editing-Komplex besetzten Zielstelle zu „rekrutieren“.
  • Die hier beschriebenen Prime-Editoren können als einen Aspekt jede bekannte RNA- Protein-Interaktionsdomäne einbeziehen, um spezifische Funktionen von Interesse in einen Prime-Editor-Komplex zu rekrutieren oder zu „kolokalisieren“. Eine Übersicht über andere modulare RNA-Protein-Interaktionsdomänen ist in der Fachliteratur beschrieben, zum Beispiel in Johansson et al., „RNA recognition by the MS2 phage coat protein“, Sem Virol., 1997, Vol. 8(3): 176-185; Delebecque et al., „Organization of intracellular reactions with rationally designed RNA assemblies“, Science, 2011, Vol. 333: 470-474; Mali et al., „Cas9 transcriptional activators for target specificity screening and paired nickases for cooperative genome engineering“, Nat. Biotechnol., 2013, Vol.31: 833-838; und Zalatan et al., „Engineering complex synthetic transcriptional programs with CRISPR RNA scaffolds,“ Cell, 2015, Vol. 160: 339-350, die hier in ihrer Gesamtheit durch Verweis einbezogen sind. Andere Systeme sind die PP7-Haarnadel, die speziell das PCP-Protein rekrutiert, und die „Com“- Haarnadel, die speziell das Com-Protein rekrutiert. Siehe Zalatan et al.
  • Die Nukleotidsequenz des MS2-Hairpins (oder gleichwertig als „MS2-Aptamer“ bezeichnet) ist: GCCAACATGAGGATCACCCATGTCTGCAGGGCC (SEQ-ID-NR.: 763).
  • Die Aminosäuresequenz des MCP oder MS2cp ist: GSASNFTQFVLVDNGGTGDVTVAPSNFANGVAEWISSNSRSQAYKVTCSVRQSSAQNRKYTI KVEVPKVATQTVGGEELPVAGWRSYLNMELTIPIFATNSDCELIVKAMQGLLKDGNPIPSAIA ANSGIY (SEQ ID NO: 764).
  • Die MS2-Haarnadel (oder „MS2-Aptamer“) kann auch als eine Art „RNA-Effektor- Rekrutierungsdomäne“ (oder gleichwertig als „RNA-bindende Protein-Rekrutierungsdomäne“ oder einfach als „Rekrutierungsdomäne“) bezeichnet werden, da es sich um eine physikalische Struktur (z. B. Eine Haarnadel) handelt, die in eine pegRNA oder tPERT eingebaut ist und die effektiv andere Effektor-Funktionen (z. B. RNA-bindende Proteine mit verschiedenen Funktionen, wie DNA-Polymerasen oder andere DNA-modifizierende Enzyme) an die pegRNA oder rPERT rekrutiert, die auf diese Weise modifiziert wird, und somit Effektor- Funktionen in trans zur Prime-Editing-Maschinerie ko-lokalisiert. Diese Anwendung ist in keiner Weise auf bestimmte RNA-Effektor-Rekrutierungsdomänen beschränkt und kann jede verfügbare derartige Domäne umfassen, einschließlich der MS2-Haarnadel. Beispiel 19 und 72(b) zeigt die Verwendung des MS2-Aptamers, das mit einer DNA-Synthese-Domäne (d. H. Dem tPERT-Molekül) verbunden ist, und eines Prime-Editors, der ein mit einem PE2 fusioniertes MS2cp-Protein umfasst, um die Ko-Lokalisierung des an die Ziel-DNA-Stelle gebundenen Prime-Editor-Komplexes (MS2cp-PE2:sgRNA-Komplex) und der DNA- Synthese-Domäne des tPERT-Moleküls zu bewirken, um die
  • napDNAbp
  • Der hier verwendete Begriff „Nukleinsäure-programmierbares DNA-bindendes Protein“ oder „napDNAbp“, für das Cas9 ein Beispiel ist, bezieht sich auf Proteine, die die RNA:DNA-Hybridisierung nutzen, um spezifische Sequenzen in einem DNA-Molekül anzuvisieren und daran zu binden. Jedes napDNAbp ist mit mindestens einer Leitnukleinsäure (z. B. Guide-RNA) assoziiert, die das napDNAbp an einer DNA-Sequenz lokalisiert, die einen DNA-Strang (d. H. Einen Zielstrang) umfasst, der komplementär zu der Leitnukleinsäure oder einem Teil davon (z. B. Dem Protospacer einer Guide-RNA) ist. Mit anderen Worten: Die Leitnukleinsäure „programmiert“ das napDNAbp (z. B. Cas9 oder ein Äquivalent), eine komplementäre Sequenz zu lokalisieren und daran zu binden.
  • Ohne an eine Theorie gebunden zu sein, beinhaltet der Bindungsmechanismus eines napDNAbp - Guide-RNA-Komplexes im Allgemeinen den Schritt der Bildung einer R- Schleife, wodurch das napDNAbp die Abspulung eines doppelsträngigen DNA-Ziels induziert und dadurch die Stränge in der durch das napDNAbp gebundenen Region trennt. Der Protospacer der Guide-RNA hybridisiert dann mit dem „Zielstrang“. Dadurch wird ein „Nicht- Zielstrang“ verdrängt, der komplementär zum Zielstrang ist, der die Einzelstrangregion der R- Schleife bildet. In einigen Ausführungsformen enthält das napDNAbp eine oder mehrere Nuklease-Aktivitäten, die dann die DNA schneiden und verschiedene Arten von Läsionen hinterlassen. Zum Beispiel kann das napDNAbp eine Nukleaseaktivität aufweisen, die den Nicht-Zielstrang an einer ersten Stelle schneidet und/oder den Zielstrang an einer zweiten Stelle schneidet. Je nach Nukleaseaktivität kann die Ziel-DNA so geschnitten werden, dass ein „Doppelstrangbruch“ entsteht, bei dem beide Stränge geschnitten werden. In anderen Ausführungsformen kann die Ziel-DNA nur an einer einzigen Stelle geschnitten werden, d. H. Die DNA wird an einem Strang „eingekerbt“. Beispiele für napDNAbp mit unterschiedlichen Nuklease-Aktivitäten sind „Cas9 Nickase“ („nCas9“) und ein deaktiviertes Cas9 ohne Nuklease-Aktivitäten („dead Cas9“ oder „dCas9“). Beispielhafte Sequenzen für diese und andere napDNAbp sind hier aufgeführt.
  • Nickase
  • Der Begriff „Nickase“ bezieht sich auf ein Cas9, bei dem eine der beiden Nuklease- Domänen inaktiviert ist. Dieses Enzym ist in der Lage, nur einen Strang der Ziel-DNA zu spalten.
  • Nukleare Lokalisierungssequenz (NLS)
  • Der Begriff „nukleare Lokalisierungssequenz“ oder „NLS“ bezieht sich auf eine Aminosäuresequenz, die den Import eines Proteins in den Zellkern fördert, zum Beispiel durch Kerntransport. Nukleare Lokalisierungssequenzen sind in der Kunst bekannt und für den Fachmann offensichtlich. NLS-Sequenzen werden zum Beispiel in der internationalen PCT- Anmeldung PCT/ EP2000/011690 von Plank et al. Beschrieben, die am 23. November 2000 eingereicht und am 31. Mai 2001 als WO/2001/038547 veröffentlicht wurde und deren Inhalt durch Verweis auf die Offenlegung beispielhafter nuklearer Lokalisierungssequenzen hierin aufgenommen wird. In einigen Ausführungsformen umfasst ein NLS die Aminosäuresequenz PKKKRKV (SEQ-ID-NR.: 16) oder MDSLLMNRRKFLYQFKNVRWAKGRRETYLC (SEQ-ID-NR.: 17).
  • Nukleinsäure-Molekül
  • Der Begriff „Nukleinsäure“, wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf ein Polymer aus Nukleotiden. Das Polymer kann natürliche Nukleoside (d. H. Adenosin, Thymidin, Guanosin, Cytidin, Uridin, Desoxyadenosin, Desoxythymidin, Desoxyguanosin und Desoxycytidin), Nukleosid-Analoga (z. B., 2-Aminoadenosin, 2-Thiothymidin, Inosin, Pyrrolo-Pyrimidin, 3-Methyladenosin, 5-Methylcytidin, C5-Bromuridin, C5-Fluoruridin, C5- Joduridin, C5-Propinyluridin, C5-Propinylcytidin, C5-Methylcytidin, 7-Deazaadenosin, 7- Deazaguanosin, 8-Oxoadenosin, 8-Oxoguanosin, O(6)-Methylguanin, 4-Acetylcytidin, 5- (Carboxyhydroxymethyl)uridin, Dihydrouridin, Methylpseudouridin, 1-Methyladenosin, 1- Methylguanosin, N6-Methyladenosin und 2-Thiocytidin), chemisch modifizierte Basen, biologisch modifizierte Basen (z.g., methylierte Basen), interkalierte Basen, modifizierte Zucker (z. B. 2'-Fluoribose, Ribose, 2`-Desoxyribose, 2'-O-Methylcytidin, Arabinose und Hexose) oder modifizierte Phosphatgruppen (z. B. Phosphorothioate und 5' N-Phosphoramidit- Bindungen) umfassen.
  • pegRNA
  • Wie hierin verwendet, beziehen sich die Begriffe „Prime-Editing-Guide-RNA“ oder „pegRNA“ oder „erweiterte Guide-RNA“ auf eine spezialisierte Form einer Guide-RNA, die so modifiziert wurde, dass sie eine oder mehrere zusätzliche Sequenzen zur Implementierung der hier beschriebenen Prime-Editing-Verfahren und -Zusammensetzungen enthält. Wie hier beschrieben, umfasst die Prime-Editing-Guide-RNA eine oder mehrere „erweiterte Regionen“ der Nukleinsäuresequenz. Die erweiterten Regionen können aus einzelsträngiger RNA oder DNA bestehen, sind aber nicht darauf beschränkt. Außerdem können die erweiterten Regionen am 3'-Ende einer herkömmlichen Guide-RNA auftreten. In anderen Anordnungen können die erweiterten Regionen am 5'-Ende einer herkömmlichen Guide-RNA auftreten. In noch anderen Anordnungen kann die erweiterte Region in einer intramolekularen Region der traditionellen Guide-RNA vorkommen, zum Beispiel in der gRNA-Kernregion, die mit dem napDNAbp assoziiert und/oder daran bindet. Die erweiterte Region umfasst eine „DNA- Synthese-Template“, die (durch die Polymerase des Prime Editors) für eine einzelsträngige DNA kodiert, die ihrerseits so konzipiert wurde, dass sie (a) homolog zu der zu editierenden endogenen Ziel-DNA ist und (b) mindestens eine gewünschte Nukleotidveränderung (z. B. Eine Transition, eine Transversion, eine Deletion oder eine Insertion) umfasst, die in die endogene Ziel-DNA eingeführt oder integriert werden soll. Die erweiterte Region kann auch andere funktionelle Sequenzelemente umfassen, wie z. B. Eine „Primer-Bindungsstelle“ und eine „Spacer- oder Linker-Sequenz“ oder andere Strukturelemente, wie z. B. Aptamere, Stammschleifen, Haarnadeln, Toeloop (z. B. Eine 3'-Toeloop) oder eine RNA-Protein- Rekrutierungsdomäne (z. B. MS2-Haarnadel). Wie hier verwendet, umfasst die „Primer- Bindungsstelle“ eine Sequenz, die an eine einzelsträngige DNA-Sequenz mit einem 3'-Ende hybridisiert, das aus der eingekerbten DNA der R-Schleife erzeugt wurde.
  • In bestimmten Ausführungsformen werden die pegRNAs durch 3A, die eine pegRNA mit einem 5' Erweiterungsarm, einem Spacer und einem gRNA-Kern zeigt, dargestellt. Die 5'-Erweiterung umfasst ferner in der 5'- bis 3'-Richtung eine Reverse- Transkriptase-Matrize, eine Primer-Bindungsstelle und einen Linker. Wie gezeigt, kann die Reverse-Transkriptase-Vorlage auch allgemeiner als „DNA-Synthese-Vorlage“ bezeichnet werden, wenn die Polymerase eines hier beschriebenen Prime Editors keine RT ist, sondern eine andere Art von Polymerase.
  • In bestimmten anderen Ausführungsformen werden die pegRNAs durch 3B, die eine pegRNA mit einem 5' Erweiterungsarm, einem Spacer und einem gRNA-Kern zeigt, dargestellt. Die 5'-Erweiterung umfasst ferner in der 5'- bis 3'-Richtung eine Reverse- Transkriptase-Matrize, eine Primer-Bindungsstelle und einen Linker. Wie gezeigt, kann die Reverse-Transkriptase-Vorlage auch allgemeiner als „DNA-Synthese-Vorlage“ bezeichnet werden, wenn die Polymerase eines hier beschriebenen Prime Editors keine RT ist, sondern eine andere Art von Polymerase.
  • In noch anderen Ausführungsformen werden die pegRNAs durch 3D dargestellt, die eine pegRNA zeigt, die in der 5' bis 3' Richtung einen Spacer (1), einen gRNA-Kern (2) und einen Erweiterungsarm (3) aufweist. Der Erweiterungsarm (3) befindet sich am 3'-Ende der pegRNA. Der Erweiterungsarm (3) umfasst ferner in der 5'- bis 3'-Richtung eine „Primer- Bindungsstelle“ (A), eine „Edit-Template“ (B) und einen „Homologiearm“ (C). Der Erweiterungsarm (3) kann auch eine optionale Modifikatorregion an den 3'- und 5'-Enden umfassen, bei denen es sich um dieselben Sequenzen oder unterschiedliche Sequenzen handeln kann. Darüber hinaus kann das 3'-Ende der pegRNA eine Transkriptionsterminatorsequenz umfassen. Diese Sequenzelemente der pegRNAs werden hier weiter beschrieben und definiert.
  • In noch anderen Ausführungsformen werden die pegRNAs durch 3E dargestellt, die eine pegRNA zeigt, die in der 5' bis 3' Richtung einen Erweiterungsarm (3), einen Spacer (1) und einen gRNA-Kern (2) aufweist. Der Erweiterungsarm (3) befindet sich am 5'-Ende der pegRNA. Der Erweiterungsarm (3) umfasst ferner in der 3'- bis 5'-Richtung eine „Primer- Bindungsstelle“ (A), eine „Editiervorlage“ (B) und einen „Homologiearm“ (C). Der Erweiterungsarm (3) kann auch eine optionale Modifikatorregion an den 3'- und 5'-Enden umfassen, bei denen es sich um dieselben Sequenzen oder unterschiedliche Sequenzen handeln kann. Die pegRNAs können auch eine Transkriptionsterminatorsequenz am 3'-Ende umfassen. Diese Sequenzelemente der pegRNAs werden hier weiter beschrieben und definiert.
  • PE1
  • Wie hier verwendet, bezieht sich „PE1“ auf einen PE-Komplex, der ein Fusionsprotein umfasst, das Cas9 (H840A) und ein unmutiertes MMLV-RT mit der folgenden Struktur enthält: [NLS]-[Cas9(H840A)]-[Linker]-[MMLV _RT(wt)] + eine gewünschte pegRNA, wobei die PE-Fusion die Aminosäuresequenz von SEQ-ID-NR.: 123 hat, die wie folgt dargestellt wird;
    Figure DE112021002672T5_0010
  • KEY:
    • NUCLEAR LOCALlZATION SEOUENCE (NLS) TOP:(SEQ ID NO: 124), BOTTOM: (SEQ ID NO: 133)
    • CAS9(H840A) (SEQ ID NO: 126)
    • 33-AMINO ACID LINKER (SEQ ID NO: 127)
    • M-MLV Reverse Transkriptase (SEQ-ID-NR.: 128).
  • PE2
  • Wie hier verwendet, bezieht sich „PE2“ auf einen PE-Komplex, der ein Fusionsprotein umfasst, das Cas9(H840A) und eine Variante von MMLV RT mit der folgenden Struktur enthält: [NLS]-[Cas9(H840A)]-[Linker]- [MMLV_RT(D200N)(T330P)(L603W)(T306K)(W313F)] + eine gewünschte pegRNA, wobei die PE-Fusion die Aminosäuresequenz von SEQ-ID-NR. 134 hat, die wie folgt dargestellt wird:
    Figure DE112021002672T5_0011
  • KEY:
    • NUCLEAR LOCALIZATION SEQUENCE (NLS) TOP:(SEQ ID NO: 124), BOTTOM: (SEQ ID NO: 133)
    • CAS9(H840A) (SEQ ID NO: 137)
    • 33-AMINO ACID LINKER (SEQ ID NO: 127)
    • M-MLV Reverse Transkriptase (SEQ-ID-NR.: 139).
  • PE3
  • Wie hier verwendet, bezieht sich „PE3“ auf PE2 plus eine Zweitstrang-Nicking-Guide- RNA, die mit PE2 einen Komplex bildet und einen Nick in den nicht-editierten DNA-Strang einführt, um eine bevorzugte Ersetzung des editierten Strangs zu bewirken.
  • PE3b
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich „PE3b“ auf PE3, wobei die Zweitstrang-Nick- Guide-RNA für eine zeitliche Kontrolle ausgelegt ist, so dass der Zweitstrang-Nick erst nach der Installation des gewünschten Schnitts eingeführt wird. Dies wird erreicht, indem eine gRNA mit einer Spacer-Sequenz entworfen wird, die nur mit dem editierten Strang übereinstimmt, aber nicht mit dem ursprünglichen Allel. Bei dieser Strategie, die im Folgenden als PE3b bezeichnet wird, sollten Fehlpaarungen zwischen dem Protospacer und dem uneditierten Allel das Nicking durch die sgRNA benachteiligen, bis das Editing-Ereignis auf dem PAM-Strang stattgefunden hat.
  • PE-kurz
  • Wie hier verwendet, bezieht sich „PE-kurz“ auf ein PE-Konstrukt, das mit einer C- terminal abgeschnittenen reversen Transkriptase fusioniert ist und die folgende Aminosäuresequenz aufweist:
    Figure DE112021002672T5_0012
    Figure DE112021002672T5_0013
  • KEY:
    • NUCLEAR LOCALIZATION SEOUENCE (NLS) TOP:(SEQ ID NO: 124), BOTTOM: (SEQ ID NO: 133)
    • CAS9(H840A) (SEQ ID NO: 157)
    • 33-AMINO ACID LINKER 1 (SEQ ID NO: 127)
    • M-MLV TRUNCATED REVERSE TRANSKRIPTASE
    • (SEQ-ID-NR.: 766)
  • Peptid-Tag
  • Der Begriff „Peptid-Tag“ bezieht sich auf eine Peptid-Aminosäuresequenz, die genetisch an eine Proteinsequenz fusioniert ist, um den Proteinen eine oder mehrere Funktionen zu verleihen, die die Manipulation des Proteins für verschiedene Zwecke erleichtern, wie z. B. Visualisierung, Reinigung, Solubilisierung und Trennung usw. Peptid-Tags können verschiedene Arten von Tags umfassen, die nach Zweck oder Funktion kategorisiert sind. Dazu gehören „Affinitäts-Tags“ (zur Erleichterung der Proteinreinigung), „Solubilisierungs-Tags“ (zur Unterstützung der richtigen Faltung von Proteinen), „Chromatographie-Tags“ (zur Veränderung der chromatographischen Eigenschaften von Proteinen), „Epitop-Tags“ (zur Bindung an hochaffine Antikörper), „Fluoreszenz-Tags“ (zur Erleichterung der Visualisierung von Proteinen in einer Zelle oder in vitro).
  • Polymerase
  • Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „Polymerase“ auf ein Enzym, das einen Nukleotidstrang synthetisiert und das in Verbindung mit den hier beschriebenen Prime-Editor- Systemen verwendet werden kann. Die Polymerase kann eine „Template-abhängige“ Polymerase sein (d. H. Eine Polymerase, die einen Nukleotidstrang auf der Grundlage der Reihenfolge der Nukleotidbasen eines Template-Strangs synthetisiert). Die Polymerase kann auch eine „Template-unabhängige“ Polymerase sein (d. H. Eine Polymerase, die einen Nukleotidstrang synthetisiert, ohne dass ein Template-Strang erforderlich ist). Eine Polymerase kann auch als „DNA-Polymerase“ oder „RNA-Polymerase“ kategorisiert werden. In verschiedenen Ausführungsformen umfasst das Prime-Editor-System eine DNA- Polymerase. In verschiedenen Ausführungsformen kann die DNA-Polymerase eine „DNAabhängige DNA-Polymerase“ sein (d. H. Das Template-Molekül ist ein DNA-Strang). In solchen Fällen kann das DNA-Template-Molekül eine pegRNA sein, wobei der Erweiterungsarm einen DNA-Strang umfasst. In solchen Fällen kann die pegRNA als chimäre oder hybride pegRNA bezeichnet werden, die einen RNA-Teil (d. H. Die Guide-RNA- Komponenten, einschließlich des Spacers und des gRNA-Kerns) und einen DNA-Teil (d. H. Den Erweiterungsarm) umfasst. In verschiedenen anderen Ausführungsformen kann die DNA- Polymerase eine „RNA-abhängige DNA-Polymerase“ sein (d. H. Das Template-Molekül ist ein RNA-Strang). In solchen Fällen ist die pegRNA RNA, d. H. Sie enthält eine RNA- Erweiterung. Der Begriff „Polymerase“ kann sich auch auf ein Enzym beziehen, das die Polymerisation von Nukleotiden katalysiert (d. H. Die Polymerase-Aktivität). Im Allgemeinen beginnt das Enzym die Synthese am 3'-Ende eines Primers, der an eine Polynukleotid- Matrizen-Sequenz gebunden ist (z. B. Eine Primer-Sequenz, die an die Primer-Bindungsstelle einer pegRNA gebunden ist) und bewegt sich zum 5'-Ende des Matrizenstrangs. Eine „DNA- Polymerase“ katalysiert die Polymerisation von Desoxynukleotiden. Wie hier in Bezug auf eine DNA-Polymerase verwendet, umfasst der Begriff DNA-Polymerase ein „funktionelles Fragment davon“. Ein „funktionelles Fragment davon“ bezieht sich auf jeden Teil einer Wildtyp- oder mutierten DNA-Polymerase, der weniger als die gesamte Aminosäuresequenz der Polymerase umfasst und der unter mindestens einer Reihe von Bedingungen die Fähigkeit behält, die Polymerisation eines Polynukleotids zu katalysieren. Ein solches funktionelles Fragment kann als eigenständige Einheit existieren, oder es kann Bestandteil eines größeren Polypeptids sein, z. B. Eines Fusionsproteins.
  • Prime-Editing und Multi-Flap Prime-Editing
  • Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „Prime Editing“ oder „klassisches Prime Editing“ auf einen Ansatz für das Gen-Editing unter Verwendung von napDNAbps, einer Polymerase (z. B. Einer reversen Transkriptase) und spezialisierten Guide-RNAs, die eine DNA-Synthese-Template zur Kodierung gewünschter neuer genetischer Informationen (oder zum Löschen genetischer Informationen) enthalten, die dann in eine Ziel-DNA-Sequenz eingebaut wird. Bestimmte Ausführungsformen des Prime Editing werden in den Ausführungsformen der 1A-1H und 72(a)-72(c) neben anderen FIGildungen beschrieben. Das klassische Prime Editing wird in der Veröffentlichung der Erfinder von Anzalone, A. V. Et al. Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA. Nature 576, 149-157 (2019) beschrieben, auf die hier in vollem Umfang Bezug genommen wird.
  • Prime Editing ist eine Plattform für das Genom-Editing, eine vielseitige und präzise Genom-Editing-Methode, bei der neue genetische Informationen direkt in eine bestimmte DNA-Stelle geschrieben werden, indem ein mit Nukleinsäure programmierbares DNA- Bindungsprotein („napDNAbp“) in Verbindung mit einer Polymerase (d. H., in Form eines Fusionsproteins oder auf andere Weise in trans mit dem napDNAbp), wobei das Prime- Editing-System mit einer Prime-Editing-(PE)-Guide-RNA („pegRNA“) programmiert ist, die sowohl die Zielstelle spezifiziert als auch die Synthese des gewünschten Schnitts in Form eines Ersatz-DNA-Strangs durch eine auf eine Guide-RNA (z. B. Am 5'- oder 3'-Ende oder an einem internen Teil einer Guide-RNA) aufgebrachte Erweiterung (entweder DNA oder RNA) vorgibt. Der Ersatzstrang, der den gewünschten Schnitt (z. B. Eine einzelne Nukleobase) enthält, hat die gleiche (oder eine homologe) Sequenz wie der endogene Strang (unmittelbar stromabwärts der Einkerbung) der zu editierenden Zielstelle (mit der Ausnahme, dass er die gewünschte Editierung enthält). Durch die DNA-Reparatur- und/oder Replikationsmaschinerie wird der endogene Strang stromabwärts der Einkerbung durch den neu synthetisierten Ersatzstrang ersetzt, der die gewünschte Editierung enthält. In einigen Fällen kann das Prime Editing als eine „Suchen-und-Ersetzen“-Technologie zur Genom-Editierung angesehen werden, da die Prime Editors, wie hier beschrieben, nicht nur die gewünschte zu editierende Zielstelle suchen und lokalisieren, sondern gleichzeitig einen Ersatzstrang kodieren, der eine gewünschte Editierung enthält und anstelle des entsprechenden endogenen DNA-Strangs der Zielstelle installiert wird. Die Prime Editors der vorliegenden Erfindung beziehen sich zum Teil auf die Entdeckung, dass der Mechanismus der Target-primed Reverse Transkription (TPRT) oder des „Prime Editing“ für die Durchführung von präzisem CRISPR/Cas-basiertem Genome Editing mit hoher Effizienz und genetischer Flexibilität genutzt oder angepasst werden kann (z. B. Wie in verschiedenen Ausführungsformen der 1A-1F). TPRT wird auf natürliche Weise von mobilen DNA-Elementen wie Nicht-LTR-Retrotransposons von Säugetieren und bakteriellen Introns28,29 der Gruppe II verwendet. Die Erfinder haben Cas-Protein-Reverse-Transkriptase- Fusionen oder verwandte Systeme verwendet, um eine spezifische DNA-Sequenz mit einer Guide-RNA anzusteuern, einen Einzelstrang-Nick an der Zielstelle zu erzeugen und die eingenickte DNA als Primer für die reverse Transkription einer konstruierten Reverse- Transkriptase-Template zu verwenden, die mit der Guide-RNA integriert ist. Das Konzept beginnt zwar mit Prime-Editoren, die Reverse Transkriptase als DNA-Polymerase- Komponente verwenden, aber die hier beschriebenen Prime-Editoren sind nicht auf Reverse Transkriptasen beschränkt, sondern können die Verwendung praktisch jeder DNA-Polymerase umfassen. Auch wenn in der Anmeldung durchgängig von Prime-Editoren mit „reversen Transkriptasen“ die Rede ist, wird hier dargelegt, dass reverse Transkriptasen nur eine Art von DNA-Polymerase sind, die mit Prime-Editing arbeiten kann. Wenn also in der Spezifikation von einer „Reversen Transkriptase“ die Rede ist, sollte der Fachmann wissen, dass jede geeignete DNA-Polymerase anstelle der Reversen Transkriptase verwendet werden kann. So können die Prime-Editoren in einem Aspekt Cas9 (oder ein äquivalentes napDNAbp) umfassen, das so programmiert ist, dass es eine DNA-Sequenz anvisiert, indem es sie mit einer spezialisierten Guide-RNA (d. H. pegRNA) assoziiert, die eine Spacer-Sequenz enthält, die sich an ein Komplement eines Protospacers in der Ziel-DNA anlagert. Die spezialisierte Guide- RNA enthält auch neue genetische Informationen in Form einer Erweiterung, die für einen Ersatz-DNA-Strang kodiert, der eine gewünschte genetische Veränderung enthält und dazu dient, einen entsprechenden endogenen DNA-Strang an der Zielstelle zu ersetzen. Um die Informationen von der pegRNA auf die Ziel-DNA zu übertragen, beinhaltet der Mechanismus des Prime Editing das Einkerben der Zielstelle in einem Strang der DNA, um eine 3'- Hydroxylgruppe freizulegen. Die freiliegende 3'-Hydroxylgruppe kann dann dazu verwendet werden, die DNA-Polymerisation der edit-codierenden Erweiterung der pegRNA direkt an der Zielstelle zu starten. In verschiedenen Ausführungsformen kann die Erweiterung, die die Matrize für die Polymerisation des die Editierung enthaltenden Ersatzstrangs bereitstellt, aus RNA oder DNA gebildet sein. Im Falle einer RNA-Erweiterung kann die Polymerase des Prime Editors eine RNA-abhängige DNA-Polymerase sein (z.B. eine reverse Transkriptase). Im Falle einer DNA-Erweiterung kann die Polymerase des Prime Editors eine DNA-abhängige DNA-Polymerase sein. Der neu synthetisierte Strang (d. H. Der Ersatz-DNA-Strang, der den gewünschten Schnitt enthält), der durch die hierin offenbarten Prime-Editoren gebildet wird, wäre homolog zur genomischen Zielsequenz (d. H. Er hätte die gleiche Sequenz wie diese), mit Ausnahme des Einschlusses einer gewünschten Nukleotidänderung (z. B. Eine einzelne Nukleotidänderung, eine Deletion oder eine Insertion oder eine Kombination davon). Der neu synthetisierte (oder ersetzte) DNA-Strang kann auch als Einzelstrang-DNA-Flap bezeichnet werden, der mit dem komplementären homologen endogenen DNA-Strang um die Hybridisierung konkurriert und dadurch den entsprechenden endogenen Strang verdrängt. In bestimmten Ausführungsformen kann das System mit der Verwendung eines fehleranfälligen Enzyms der Reversen Transkriptase kombiniert werden (z. B. Als Fusionsprotein mit der Cas9- Domäne oder in trans mit der Cas9-Domäne). Das fehleranfällige Enzym Reverse Transkriptase kann während der Synthese der einzelsträngigen DNA-Flap Veränderungen einführen. So kann in bestimmten Ausführungsformen eine fehleranfällige reverse Transkriptase verwendet werden, um Nukleotidveränderungen in die Ziel-DNA einzuführen. Je nach der fehleranfälligen reversen Transkriptase, die mit dem System verwendet wird, können die Veränderungen zufällig oder nicht zufällig sein. Die Auflösung des hybridisierten Zwischenprodukts (bestehend aus dem von der reversen Transkriptase synthetisierten einzelsträngigen DNA-Flap, der an den endogenen DNA-Strang hybridisiert wurde) kann die Entfernung des resultierenden verdrängten Flaps der endogenen DNA (z. B. Mit einer 5'-End- DNA-Flap-Endonuklease, FEN1), die Ligation des synthetisierten einzelsträngigen DNA- Flaps an die Ziel-DNA und die Assimilation der gewünschten Nukleotidveränderung als Ergebnis der zellulären DNA-Reparatur- und/oder Replikationsprozesse umfassen. Da die Template-gestützte DNA-Synthese eine nukleotidgenaue Modifikation jedes beliebigen Nukleotids, einschließlich Insertionen und Deletionen, ermöglicht, ist der Anwendungsbereich dieses Ansatzes sehr breit gefächert und könnte vorhersehbar für unzählige Anwendungen in der Grundlagenforschung und in der Therapeutik genutzt werden.
  • In verschiedenen Ausführungsformen erfolgt das Prime-Editing durch den Kontakt eines Ziel-DNA-Moleküls (für das eine Änderung in der Nukleotidsequenz eingeführt werden soll) mit einem Nukleinsäure-programmierbaren DNA-bindenden Protein (napDNAbp), das mit einer Prime-Editing-Guide-RNA (pegRNA) komplexiert ist. Unter Bezugnahme auf 1G umfasst die Prime-Editing-Guide-RNA (pegRNA) eine Erweiterung am 3'- oder 5'-Ende der Guide-RNA oder an einer intramolekularen Stelle in der Guide-RNA und kodiert die gewünschte Nukleotidänderung (z. B. Eine einzelne Nukleotidänderung, Insertion oder Deletion). In Schritt (a) kontaktiert der napDNAbp/erweiterte gRNA-Komplex das DNA- Molekül und die erweiterte gRNA leitet die napDNAbp zur Bindung an einen Ziel-Locus. In Schritt (b) wird eine Einkerbung in einen der DNA-Stränge des Ziellocus eingeführt (z. B. Durch eine Nuklease oder einen chemischen Wirkstoff), wodurch ein verfügbares 3'-Ende in einem der Stränge des Ziellocus entsteht. In bestimmten Ausführungsformen wird der Nick in dem DNA-Strang erzeugt, der dem R-Loop-Strang entspricht, d. H. Dem Strang, der nicht mit der RNA-Führungssequenz hybridisiert ist, d. H. Dem „Nicht-Ziel-Strang“. Der Einschnitt kann jedoch in einem der beiden Stränge erfolgen. Das heißt, der Nick könnte in den „Zielstrang“ der R-Schleife (d. H. Den Strang, der mit dem Protospacer der erweiterten gRNA hybridisiert) oder in den „Nicht-Zielstrang“ (d. H. Den Strang, der den einzelsträngigen Teil der R-Schleife bildet und der komplementär zum Zielstrang ist) eingeführt werden. In Schritt (c) interagiert das 3'-Ende des DNA-Strangs (gebildet durch den Nick) mit dem erweiterten Teil der Guide-RNA, um die reverse Transkription zu starten (d. H. „Target-primed RT“). In bestimmten Ausführungsformen hybridisiert der DNA-Strang am 3'-Ende mit einer spezifischen RT-Priming-Sequenz auf dem erweiterten Teil der Guide-RNA, d. H. Der „Priming-Sequenz der reversen Transkriptase“ oder „Primer-Bindungsstelle“ auf der pegRNA. In Schritt (d) wird eine reverse Transkriptase (oder eine andere geeignete DNA-Polymerase) eingeführt, die einen einzelnen DNA-Strang vom 3'-Ende der Priming-Stelle zum 5'-Ende der Priming-Guide-RNA synthetisiert. Die DNA-Polymerase (z. B. Reverse Transkriptase) kann an das napDNAbp fusioniert werden oder alternativ in trans zu dem napDNAbp bereitgestellt werden. Dadurch wird ein einzelsträngiger DNA-Flap gebildet, der die gewünschte Nukleotidveränderung (z. B. Die Veränderung einer einzelnen Base, die Insertion oder die Deletion oder eine Kombination davon) enthält und der ansonsten homolog zur endogenen DNA an oder neben der Einkerbung ist. In Schritt (e) werden das napDNAbp und die Guide- RNA freigesetzt. Die Schritte (f) und (g) beziehen sich auf die Auflösung der einzelsträngigen DNA-Flap, so dass die gewünschte Nukleotidänderung in den Ziellocus eingebaut wird. Dieser Prozess kann in Richtung der gewünschten Produktbildung vorangetrieben werden, indem der entsprechende endogene 5`-DNA-Flap entfernt wird, der sich bildet, sobald der 3'- Einzelstrang-DNA-Flap in die endogene DNA-Sequenz eindringt und mit ihr hybridisiert. Ohne an eine Theorie gebunden zu sein, lösen die zelleigenen DNA-Reparatur- und Replikationsprozesse die fehlangepasste DNA auf, um die Nukleotidveränderung(en) einzubauen und das gewünschte veränderte Produkt zu bilden. Der Prozess kann auch in Richtung Produktbildung mit „second strand nicking“ getrieben werden, wie in 1F dargestellt. Bei diesem Prozess können mindestens eine oder mehrere der folgenden genetischen Veränderungen auftreten: Transversionen, Transitionen, Deletionen und Insertionen.
  • Der Begriff „Prime-Editor (PE)-System“ oder „Prime-Editor (PE)“ oder „PE-System“ oder „PE-Editiersystem“ bezieht sich auf die Zusammensetzungen, die an der hier beschriebenen Methode des Genom-Editierens unter Verwendung der Target-primed Reverse Transkription (TPRT) beteiligt sind, einschließlich, aber nicht beschränkt auf die napDNAbps, Reverse Transkriptasen, Fusionsproteine (z. B., die napDNAbps und reverse Transkriptasen umfassen), Prime-Editing-Guide-RNAs und Komplexe, die Fusionsproteine und Prime- Editing-Guide-RNAs umfassen, sowie Zusatzelemente, wie Zweitstrang-Nicking- Komponenten (z. B. Zweitstrang-sgRNAs) und Endonukleasen zur Entfernung von 5'- endogenen DNA-Flaps (z. B. FEN1), die dazu beitragen, den Prime-Editing-Prozess zur Bildung des editierten Produkts voranzutreiben.
  • Obwohl in den bisher beschriebenen Ausführungsformen die pegRNA ein einzelnes Molekül darstellt, das eine Guide-RNA (die ihrerseits eine Spacer-Sequenz und einen gRNA- Kern oder ein Gerüst umfasst) und einen 5'- oder 3'-Erweiterungsarm mit der Primer- Bindungsstelle und einer DNA-Synthese-Template umfasst (siehe z. B. 3D), kann die pegRNA auch die Form von zwei einzelnen Molekülen annehmen, die aus einer Guide-RNA und einer trans Prime Editor RNA-Vorlage (tPERT) bestehen, in der im Wesentlichen der Erweiterungsarm (einschließlich insbesondere der Primer-Bindungsstelle und der DNA- Synthese-Domäne) und eine RNA-Protein-Rekrutierungsdomäne (z. B., MS2-Aptamer oder - Haarnadel) in demselben Molekül enthält, das an einen modifizierten Prime-Editor-Komplex kolokalisiert oder rekrutiert wird, der ein tPERT-Rekrutierungsprotein (z. B. Das MS2cp- Protein, das an das MS2-Aptamer bindet) umfasst. Siehe 3G und 3H als Beispiel für ein tPERT, das mit Prime Editing verwendet werden kann.
  • Beim „Dual-Flap-Prime-Editing-System“ werden zwei pegRNAs verwendet, um gegensätzliche Stränge einer genomischen Stelle anzusteuern und die Synthese von zwei komplementären 3'-Flaps zu steuern, die die editierte DNA-Sequenz enthalten (91). Im Gegensatz zum klassischen Prime Editing muss das Paar der editierten DNA-Stränge (3'-Flaps) nicht direkt mit den 5'-Flaps der endogenen genomischen DNA konkurrieren, da stattdessen der komplementäre editierte Strang für die Hybridisierung zur Verfügung steht. Da beide Stränge des Duplex als editierte DNA synthetisiert werden, erübrigt sich beim Dual-Flap- Prime-Editing-System der Austausch des nicht-editierten komplementären DNA-Strangs, der beim klassischen Prime-Editing erforderlich ist. Stattdessen muss die zelluläre DNA- Reparaturmaschinerie nur die gepaarten 5'-Flaps (ursprüngliche genomische DNA) herausschneiden und die gepaarten 3'-Flaps (bearbeitete DNA) in den Locus einbinden. Daher besteht auch keine Notwendigkeit, in die neu synthetisierten DNA-Stränge Sequenzen aufzunehmen, die homolog zur genomischen DNA sind. Dies ermöglicht eine selektive Hybridisierung der neuen Stränge und erleichtert Bearbeitungen, die eine minimale genomische Homologie enthalten. Nuklease-aktive Versionen von Prime-Editoren, die beide Stränge der DNA schneiden, könnten ebenfalls verwendet werden, um die Entfernung der ursprünglichen DNA-Sequenz zu beschleunigen.
  • Wie das klassische Prime-Editing ist das Multi-Flap-Prime-Editing (einschließlich Dual-Flap- und Quadruple-Flap-Prime-Editing) eine vielseitige und präzise Genom-Editing- Methode, bei der neue genetische Informationen direkt in eine bestimmte DNA-Stelle geschrieben werden, indem ein programmierbares Nukleinsäure-DNA-Bindungsprotein („napDNAbp“) in Verbindung mit einer Polymerase (d. H., in Form eines Fusionsproteins oder auf andere Weise in trans mit dem napDNAbp), wobei das Prime-Editing-System mit einer Prime-Editing-(PE)-Guide-RNA („pegRNA“) programmiert ist, die sowohl die Zielstelle spezifiziert als auch die Synthese des gewünschten Schnitts in Form eines Ersatz-DNA-Strangs durch eine auf eine Guide-RNA (z. B. Am 5'- oder 3'-Ende oder an einem internen Teil einer Guide-RNA) aufgebrachte Erweiterung (entweder DNA oder RNA) vorgibt. Der Ersatzstrang, der den gewünschten Schnitt (z. B. Eine einzelne Nukleobase Substitution) enthält, hat die gleiche Sequenz wie der endogene Strang der zu editierenden Zielstelle (mit der Ausnahme, dass er die gewünschte Editierung enthält). Durch die DNA-Reparatur- und/oder Replikationsmaschinerie wird der körpereigene Strang der Zielstelle durch den neu synthetisierten Ersatzstrang, der die gewünschte Editierung enthält, ersetzt. In einigen Fällen kann das Prime Editing als eine „Suchen-und-Ersetzen“-Technologie zur Genom-Editierung angesehen werden, da die Prime Editors, wie hier beschrieben, nicht nur die gewünschte zu editierende Zielstelle suchen und lokalisieren, sondern gleichzeitig einen Ersatzstrang kodieren, der eine gewünschte Editierung enthält und anstelle des entsprechenden endogenen DNA-Strangs der Zielstelle installiert wird.
  • Prime Editor
  • Das hier beschriebene duale Prime-Editing-System umfasst ein Paar Prime-Editoren. Der Begriff „Prime-Editor“ bezieht sich auf die hier beschriebenen Fusionskonstrukte, die eine napDNAbp (z. B. Cas9-Nickase) und eine reverse Transkriptase umfassen und in der Lage sind, Prime-Editing an einer Zielnukleotidsequenz in Gegenwart einer pegRNA (oder „erweiterten Guide-RNA“) durchzuführen. Der Begriff „Prime-Editor“ kann sich auf das Fusionsprotein oder auf das Fusionsprotein beziehen, das mit einer pegRNA komplexiert ist, und/oder weiter mit einer Zweitstrang-Nicking-sgRNA komplexiert ist. In einigen Ausführungsformen kann sich der Prime-Editor auch auf den Komplex beziehen, der ein Fusionsprotein (mit einem napDNAbp fusionierte reverse Transkriptase), eine pegRNA und eine reguläre Guide-RNA umfasst, die in der Lage ist, den Schritt des Einschneidens der zweiten Stelle des nicht-editierten Strangs zu steuern, wie hier beschrieben. In anderen Ausführungsformen kann die Reverse Transkriptase-Komponente des „Primer-Editors“ in trans bereitgestellt werden.
  • Das hier beschriebene Dual-Flap-Prime-Editing-System besteht aus einem Paar von Prime-Editoren. Das hier beschriebene Quadruple-Flap-Prime-Editing-System umfasst vier Prime-Editoren.
  • Primer-Bindungsstelle
  • Der Begriff „Primer-Bindungsstelle“ oder „die PBS“ bezieht sich auf die Nukleotidsequenz, die sich auf einer pegRNA als Bestandteil des Erweiterungsarms befindet (typischerweise am 3'-Ende des Erweiterungsarms) und dazu dient, an die Primersequenz zu binden, die nach dem Cas9-Nicking der Zielsequenz durch den Prime-Editor gebildet wird. Wie an anderer Stelle beschrieben, wird, wenn die Cas9-Nickase-Komponente eines Prime- Editors einen Strang der Ziel-DNA-Sequenz einschneidet, ein 3'-Enden ssDNA-Flap gebildet, der als Primer-Sequenz dient, die sich an die Primer-Bindungsstelle auf der pegRNA anlagert, um die reverse Transkription zu starten.
  • Promoter
  • Der Begriff „Promotor“ ist unter Fachleuten anerkannt und bezieht sich auf ein Nukleinsäuremolekül mit einer Sequenz, die von der zellulären Transkriptionsmaschinerie erkannt wird und in der Lage ist, die Transkription eines nachgeschalteten Gens einzuleiten. Ein Promotor kann konstitutiv aktiv sein, was bedeutet, dass der Promotor in einem bestimmten zellulären Kontext immer aktiv ist, oder bedingt aktiv, was bedeutet, dass der Promotor nur bei Vorliegen einer bestimmten Bedingung aktiv ist. So kann ein konditionaler Promotor beispielsweise nur in Anwesenheit eines spezifischen Proteins aktiv sein, das ein mit einem regulatorischen Element im Promotor assoziiertes Protein mit der grundlegenden Transkriptionsmaschinerie verbindet, oder nur in Abwesenheit eines hemmenden Moleküls. Eine Unterklasse der bedingt aktiven Promotoren sind induzierbare Promotoren, die die Anwesenheit eines kleinen Moleküls als „Induktor“ für ihre Aktivität benötigen. Beispiele für induzierbare Promotoren sind unter anderem Arabinose-induzierbare Promotoren, Tet-on- Promotoren und Tamoxifen-induzierbare Promotoren. Eine Vielzahl von konstitutiven, konditionalen und induzierbaren Promotoren ist den Fachleuten gut bekannt, und diese werden in der Lage sein, eine Vielzahl solcher Promotoren zu ermitteln, die für die Durchführung der vorliegenden Erfindung nützlich sind, die in dieser Hinsicht nicht beschränkt ist.
  • Protospacer
  • Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „Protospacer“ auf die Sequenz (~20 bp) in der DNA, die an die PAM-Sequenz (Protospacer-benachbartes Motiv) angrenzt. Der Protospacer hat die gleiche Sequenz wie die Spacer-Sequenz der Guide-RNA. Die Guide-RNA bindet an das Komplement der Protospacer-Sequenz auf der Ziel-DNA (genauer gesagt, an einen Strang davon, d. H. Den „Zielstrang“ im Gegensatz zum „Nicht-Zielstrang“ der Ziel- DNA-Sequenz). Damit Cas9 funktionieren kann, benötigt es außerdem ein spezifisches Protospacer-benachbartes Motiv (PAM), das je nach Bakterienart des Cas9-Gens variiert. Die am häufigsten verwendete Cas9-Nuklease, die von S. Pyogenes stammt, erkennt eine PAM- Sequenz von NGG, die sich direkt stromabwärts der Zielsequenz in der genomischen DNA auf dem Nicht-Zielstrang befindet. Der Fachmann wird verstehen, dass in der Fachliteratur manchmal der „Protospacer“ als die ~20-nt zielspezifische Leitsequenz auf der Guide-RNA selbst bezeichnet wird, anstatt von einem „Spacer“ zu sprechen Daher kann in einigen Fällen der Begriff „Protospacer“, wie er hier verwendet wird, mit dem Begriff „Spacer“ gleichgesetzt werden. Der Kontext der Beschreibung, in dem der Begriff „Protospacer“ oder „Spacer“ auftaucht, wird dem Leser helfen zu erkennen, ob sich der Begriff auf die gRNA oder das DNA-Ziel bezieht.
  • Protospacer-benachbartes Motiv (PAM)
  • Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „Protospacer-benachbarte Sequence“ oder „PAM“ auf eine DNA-Sequenz mit etwa 2-6 Basenpaaren, die eine wichtige Zielkomponente einer Cas9-Nuklease ist. Normalerweise befindet sich die PAM-Sequenz auf einem der beiden Stränge und liegt stromabwärts in der 5' bis 3' Richtung der Cas9-Schnittstelle. Die kanonische PAM-Sequenz (d. H. Die PAM-Sequenz, die mit der Cas9-Nuklease von Streptococcus pyogenes oder SpCas9 assoziiert ist) ist 5'-NGG-3', wobei „N“ eine beliebige Nukleobase, gefolgt von zwei Guanin-Nukleobasen („G“) ist. Verschiedene PAM-Sequenzen können mit verschiedenen Cas9-Nukleasen oder gleichwertigen Proteinen aus verschiedenen Organismen assoziiert werden. Darüber hinaus kann jede Cas9-Nuklease, z. B. SpCas9, modifiziert werden, um die PAM-Spezifität der Nuklease zu verändern, so dass die Nuklease eine andere PAM-Sequenz erkennt.
  • Bezugnehmend auf die kanonische SpCas9-Aminosäuresequenz SEQ-ID-NR.: 18, kann zum Beispiel die PAM-Sequenz durch die Einführung einer oder mehrerer Mutationen modifiziert werden, einschließlich (a) D1 135V, R1335Q und T1337R „die VQR-Variante“, die die PAM-Spezifität für NGAN oder NGNG verändert, (b) D1 135E, R1335Q und T1337R „die EQR-Variante“, die die PAM-Spezifität für NGAG verändert, und (c) D1135V, G1218R, R1335E und T1337R „die VRER-Variante“, die die PAM-Spezifität für NGCG verändert. Außerdem erkennt die D1 135E-Variante des kanonischen SpCas9 immer noch NGG, aber sie ist selektiver als das unmutierte SpCas9-Protein.
  • Es ist auch bekannt, dass Cas9-Enzyme aus verschiedenen bakteriellen Spezies (d. H. Cas9-Orthologe) unterschiedliche PAM-Spezifitäten haben können. Cas9 aus Staphylococcus aureus (SaCas9) erkennt zum Beispiel NGRRT oder NGRRN. Darüber hinaus erkennt Cas9 aus Neisseria meningitis (NmCas) NNNNGATT. In einem anderen Beispiel erkennt Cas9 aus Streptococcus thermophilis (StCas9) NNAGAAW. Ein weiteres Beispiel: Cas9 aus Treponema denticola (TdCas) erkennt NAAAAC. Dies sind Beispiele und nicht als Einschränkung gedacht. Es wird weiter deutlich, dass Nicht-SpCas9s eine Vielzahl von PAM- Sequenzen binden, was sie nützlich macht, wenn keine geeignete SpCas9-PAM-Sequenz an der gewünschten Zielschnittstelle vorhanden ist. Außerdem können Nicht-SpCas9s andere Eigenschaften haben, die sie nützlicher machen als SpCas9. Cas9 aus Staphylococcus aureus (SaCas9) ist beispielsweise etwa 1 Kilobase kleiner als SpCas9, so dass es in ein Adenoassoziiertes Virus (AAV) verpackt werden kann. Weitere Hinweise finden Sie in Shah et al., „Protospacer recognition motifs: mixed identities and functional diversity“, RNA Biology, 10(5): 891-899 (die hier durch Bezugnahme aufgenommen wird).
  • Rekombinase
  • Der Begriff „Rekombinase“, wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf ein ortsspezifisches Enzym, das die Rekombination von DNA zwischen Rekombinase- Erkennungssequenzen vermittelt, was zur Exzision, Integration, Inversion oder zum Austausch (z. B. Translokation) von DNA-Fragmenten zwischen den Rekombinase- Erkennungssequenzen führt. Rekombinasen lassen sich in zwei verschiedene Familien einteilen: Serin-Rekombinasen(z. B. Resolvasen und Invertasen) und Tyrosin- Rekombinasen(z. B. Integrasen). Beispiele für Serin-Rekombinasen sind, ohne Einschränkung, Hin, Gin, Tn3, β-six, CinH, ParA, γδ, Bxb1, ϕC31, TP901, TG1, φBT1, R4, φRV1, φFC1, MR11, A118, U153 und gp29. Beispiele für Tyrosin-Rekombinasen sind, ohne Einschränkung, Cre, FLP, R, Lambda, HK101, HK022 und pSAM2. Die Namen Serin- und Tyrosin-Rekombinase stammen von dem konservierten nukleophilen Aminosäurerest, mit dem die Rekombinase die DNA angreift und der während des Strangaustauschs kovalent mit der DNA verbunden wird. Rekombinasen haben zahlreiche Anwendungen, darunter die Schaffung von Gen-Knockouts/Knock-ins und Gentherapie-Anwendungen. Siehe z .B.Brown et al., „Serine recombinases as tools for genome engineering" Methods. 2011 ;53(4):372-9; Hirano et al., „Site-specific recombinases as tools for heterologous gene integration." Appl. Microbiol. Biotechnol. 2011; 92(2):227-39; Chavez und Calos, „Therapeutic applications of the ΦC31 integrase system." Curr. Gene Ther. 2011;11(5):375-81; Turan und Bode, „Site-specific recombinases: from tag-and-target- to tag-and-exchange-based genomic modifications." FASEB J. 2011; 25(12):4088-107; Venken und Bellen, „Genome-wide manipulations of Drosophila melanogaster with transposons, Flp recombinase, and ΦC31 integrase." Methods Mol. Biol. 2012; 859:203-28; Murphy, „Phage recombinases and their applications" Adv. Virus Res. 2012; 83:367-414; Zhang et al., „Conditional gene manipulation: Cre-ating a new biological era." J. Zhejiang Univ. Sci. B. 2012; 13(7):511-24; Karpenshif und Bernstein, „From yeast to mammals: recent advances in genetic control of homologous recombination." DNA- Reparatur (Amst). 2012; 1;11(10):781-8 ; der gesamte Inhalt wird hiermit in vollem Umfang durch Bezugnahme aufgenommen. Die hier aufgeführten Rekombinasen sind nicht als exklusive Beispiele für Rekombinasen zu verstehen, die in Ausführungsformen der Erfindung verwendet werden können. Die Methoden und Zusammensetzungen der Erfindung können erweitert werden, indem Datenbanken nach neuen orthogonalen Rekombinasen durchsucht oder synthetische Rekombinasen mit definierten DNA-Spezifitäten entwickelt werden (siehe z .B. Groth et al., „Phage integrases: biology and applications" J. Mol. Biol. 2004; 335, 667-678; Gordley et al., „Synthese von programmierbaren Integrasen" Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 2009; 106, 5053-5058; der gesamte Inhalt wird hiermit in vollem Umfang durch Bezugnahme aufgenommen). Andere Beispiele für Rekombinasen, die in den hier beschriebenen Methoden und Zusammensetzungen nützlich sind, sind dem Fachmann bekannt, und es wird erwartet, dass jede neue Rekombinase, die entdeckt oder erzeugt wird, in den verschiedenen Ausführungsformen der Erfindung verwendet werden kann. In einigen Ausführungsformen sind die katalytischen Domänen einer Rekombinase an eine Nuklease-inaktivierte RNAprogrammierbare Nuklease(z. B. dCas9 oder ein Fragment davon) fusioniert, so dass die Rekombinase-Domäne keine Nukleinsäure-Bindungsdomäne umfasst oder nicht in der Lage ist, an eine Zielnukleinsäure zu binden (z. B. ist die Rekombinase-Domäne so konstruiert, dass sie keine spezifische DNA-Bindungsaktivität besitzt). Rekombinasen, denen es an DNA- Bindungsaktivität mangelt, und Methoden zur Herstellung solcher Rekombinasen sind bekannt, darunter jene beschrieben von Klippel et al., „Isolation and characterisation of unusual gin mutants" EMBO J. 1988; 7: 3983-3989: Burke et al., „Activating mutations of Tn3 resolvase marking interfaces important in recombination catalysis and its regulation. Mol Microbiol. 2004; 51: 937-948; Olorunniji et al., „Synapsis and catalysis by activated Tn3 resolvase mutants" Nucleic Acids Res. 2008; 36: 7181-7191; Rowland et al., „Regulatory mutations in Sin recombinase support a structure-based model of the synaptosome" Mol Microbiol. 2009; 74: 282-298; Akopian et al., „Chimeric recombinases with designed DNA sequence recognition." Proc Natl Acad Sci USA. 2003;100: 8688-8691; Gordley et al., „Evolution of programmable zinc finger-recombinases with activity in human cells. J Mol Biol. 2007; 367: 802-813; Gordley et al., „Synthesis of programmable integrases" Proc Natl Acad Sei USA. 2009; 106: 5053-5058; Amold et al., „Mutants of Tn3 resolvase which do not require accessory binding sites for recombination activity." EMBO J. 1999; 18: 1407-1414; Gaj et al., „Structure-guided reprogramming of serine recombinase DNA sequence specificity" Proc Natl Acad Sei USA. 2011;108(2):498-503; und Proudfoot et al., „Zinc finger recombinases with adaptable DNA sequence specificity." PloS One. 2011;6(4):e19537; der gesamte Inhalt ist hiermit durch Bezugnahme aufgenommen. Zum Beispiel haben die Serin-Rekombinasen der Resolvase-Invertase-Gruppe, z .B. die Tn3- und γδ-Resolvasen und die Hin- und Gin- Invertasen, modulare Strukturen mit autonomen katalytischen und DNA-bindenden Domänen (Siehe z. B. Grindley et al., „Mechanism of site-specific recombination“ Ann Rev Biochem. 2006; 75: 567-605, deren gesamter Inhalt durch Verweis einbezogen wird). Die katalytischen Domänen dieser Rekombinasen können daher mit Nuklease-inaktivierten RNAprogrammierbaren Nukleasen(z. B. dCas9 oder einem Fragment davon) rekombiniert werden, wie hier beschrieben, z .B. nach der Isolierung von „aktivierten“ Rekombinase-Mutanten, die keine zusätzlichen Faktoren(z. B. DNA-Bindungsaktivitäten) benötigen (siehe z. B. Klippel et al., „Isolation and characterisation of unusual gin mutants" EMBO J. 1988; 7: 3983-3989: Burke et al., „Activating mutations of Tn3 resolvase marking interfaces important in recombination catalysis and its regulation. MolMicrobiol. 2004; 51: 937-948; Olorunniji et al., „Synapsis and catalysis by activated Tn3 resolvase mutants" Nucleic Acids Res. 2008; 36: 7181-7191; Rowland et al., „Regulatory mutations in Sin recombinase support a structure- based model of the synaptosome" Mol Microbiol. 2009; 74: 282-298; Akopian et al., „Chimeric recombinases with designed DNA sequence recognition" Proc Natl Acad Sei USA. 2003;100: 8688-8691). Darüber hinaus sind viele andere natürliche Serin-Rekombinasen mit einer N-terminalen katalytischen Domäne und einer C-terminalen DNA-Bindungsdomäne bekannt (z. B. phiC31 Integrase, TnpX Transposase, IS607 Transposase), und ihre katalytischen Domänen können zur Entwicklung programmierbarer ortsspezifischer Rekombinasen, wie hier beschrieben, genutzt werden (siehe z. B. Smith et al., „Diversity in the serine recombinases" Mol Microbiol. 2002;44: 299-307, deren gesamter Inhalt durch Verweis einbezogen wird). Auch die katalytischen Kerndomänen von Tyrosin- Rekombinasen(z. B.Cre, λ-Integrase) sind bekannt und können in ähnlicher Weise genutzt werden, um programmierbare ortsspezifische Rekombinasen zu entwickeln, wie hier beschrieben (siehe z .B. Guo et al., „Structure of Cre recombinase complexed with DNA in a site-specific recombination synapse" Nature. 1997; 389:40-46; Hartung et al., „Cre mutants with altered DNA binding properties" J Biol Chem 1998; 273:22884-22891; Shaikh et al., „Chimeras of the Flp and Cre recombinases: Tests of the mode of cleavage by Flp and Cre. J Mol Biol. 2000; 302:27-48; Rongrong et al., „Effect of deletion mutation on the recombination activity of Cre recombinase" Acta Biochim Pol. 2005; 52:541-544; Kilbride et al., „Determinants of product topology in a hybrid Cre-Tn3 resolvase site-specific recombination system" J Mol Biol. 2006; 355:185-195; Warren et al., „A chimeric cre recombinase with regulated directionality" Proc Natl Acad Sci USA. 2008 105:18278-18283; Van Duyne, „Teaching Cre to follow directions" Proc Natl Acad Sci USA. 2009 Jan 6;106(1):4-5; Numrych et al., „A comparison of the effects of single-base and triple-base changes in the integrase armtype binding sites on the site-specific recombination of bacteriophage λ." Nucleic Acids Res. 1990; 18:3953-3959; Tirumalai et al., „The recognition of core-type DNA sites by λ integrase" J Mol Biol. 1998; 279:513-527; Aihara et al., „A conformational switch controls the DNA cleavage activity of λ integrase" Mol Cell. 2003; 12:187-198; Biswas et al., „A structural basis for allosteric control ofDNA recombination by λ integrase" Nature. 2005; 435:1059-1066; und Warren et al., „Mutations in the amino-terminal domain of λ-integrase have differential effects on integrative and excisive recombination" Mol Microbiol. 2005; 55:1104-1112; der gesamte Inhalt ist durch Bezugnahme aufgenommen).
  • Rekombinase-Erkennungssepuenz
  • Der Begriff „Rekombinase-Erkennungssequenz“ oder auch „RRS“ oder „Rekombinase-Zielsequenz“ oder „Rekombinasestelle“, wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf eine Nukleotidsequenz, die von einer Rekombinase erkannt wird und die einen Strangaustausch mit einem anderen DNA-Molekül erfährt, das eine RRS aufweist, was zu Exzision, Integration, Inversion oder Austausch von DNA-Fragmenten zwischen den Rekombinase-Erkennungssequenzen führt. In verschiedenen Ausführungsformen können die Multi-Strang-Prime-Editoren eine oder mehrere Rekombinasestellen in einer Zielsequenz oder in mehr als einer Zielsequenz installieren. Wenn mehr als eine Rekombinasestelle von einem Multi-Strang-Prime-Editor installiert wird, können die Rekombinasestellen an benachbarten Zielstellen oder nicht benachbarten Zielstellen (z. B. Getrennten Chromosomen) installiert werden. In verschiedenen Ausführungsformen können einzelne installierte Rekombinasestellen als „Landestellen“ für eine rekombinasevermittelte Reaktion zwischen der genomischen Rekombinasestelle und einer zweiten Rekombinasestelle in einem exogen zugeführten Nukleinsäuremolekül, z. B. Einem Plasmid, verwendet werden. Dies ermöglicht die gezielte Integration eines gewünschten Nukleinsäuremoleküls. In anderen Ausführungsformen, bei denen zwei Rekombinasestellen in benachbarte DNA-Regionen eingefügt werden (z. B. Mit einem Abstand von 25-50 bp, 50-100 bp, 100-200 bp, 200-300 bp, 300-400 bp, 400-500 bp, 500-600 bp, 600-700 bp, 700-800 bp, 800-900 bp, 900-1000 bp, 1000-2000 bp, 2000-3000 bp, 3000-4000 bp, 4000-5000 bp oder mehr), die Rekombinasestellen können für die rekombinasevermittelte Exzision oder Inversion der intervenierenden Sequenz oder für den rekombinasevermittelten Kassettenaustausch mit exogener DNA mit denselben Rekombinasestellen verwendet werden. Wenn die zwei oder mehr Rekombinasestellen durch Multi-Flap-Prime-Editoren auf zwei verschiedenen Chromosomen installiert werden, kann es zu einer Translokation der intervenierenden Sequenz von einer ersten chromosomalen Stelle zur zweiten kommen.
  • Rekombinieren oder Rekombination
  • Der Begriff „rekombinieren“ oder „Rekombination“ bezieht sich im Zusammenhang mit einer Nukleinsäuremodifikation (z. B. Einer genomischen Modifikation) auf den Prozess, bei dem zwei oder mehr Nukleinsäuremoleküle oder zwei oder mehr Regionen eines einzelnen Nukleinsäuremoleküls durch die Wirkung eines Rekombinaseproteins (z. B. Eines hierin enthaltenen erfindungsgemäßen Rekombinase-Fusionsproteins) modifiziert werden. Die Rekombination kann unter anderem zu einer Insertion, Inversion, Exzision oder Translokation von Nukleinsäuren führen, z. B. In oder zwischen einem oder mehreren Nukleinsäuremolekülen.
  • Reverse Transkriptase
  • Der Begriff „Reverse Transkriptase“ beschreibt eine Klasse von Polymerasen, die als RNA-abhängige DNA-Polymerasen bezeichnet werden. Alle bekannten reversen Transkriptasen benötigen einen Primer, um ein DNA-Transkript aus einer RNA-Vorlage zu synthetisieren. In der Vergangenheit wurde die reverse Transkriptase vor allem dazu verwendet, mRNA in cDNA zu transkribieren, die dann zur weiteren Bearbeitung in einen Vektor kloniert werden kann. Die Reverse Transkriptase des Avian Myoblastosis Virus (AMV) war die erste weit verbreitete RNA-abhängige DNA-Polymerase (Verma, Biochim. Biophys. Acta 473:1 (1977)). Das Enzym hat 5'-3' RNA-gerichtete DNA-Polymerase- Aktivität, 5'-3' DNA-gerichtete DNA-Polymerase-Aktivität und Rnase H-Aktivität. Rnase H ist eine prozessive 5'- und 3'-Ribonuklease, die spezifisch für den RNA-Strang für RNA-DNA- Hybride ist (Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, New York: Wiley & Sons (1984)). Fehler in der Transkription können von der reversen Transkriptase nicht korrigiert werden, da den bekannten viralen reversen Transkriptasen die für das Korrekturlesen notwendige 3'-5'-Exonuklease-Aktivität fehlt (Saunders und Saunders, Microbial Genetics Applied to Biotechnology, London: Croom Helm (1987)). Eine detaillierte Studie über die Aktivität der reversen Transkriptase des AMV und die damit verbundene Rnase H-Aktivität wurde von Berger et al. In Biochemistry 22:2365-2372 (1983) vorgestellt. Eine weitere reverse Transkriptase, die in der Molekularbiologie häufig verwendet wird, ist die aus dem Moloney- Mausleukämievirus (M-MLV) stammende reverse Transkriptase. Siehe z. B. Gerard, G. R., DNA 5:271-279 (1986) und Kotewicz, M. L., et al., Gene 35:249-258 (1985). Es wurde auch eine M-MLV Reverse Transkriptase beschrieben, der die Rnase H Aktivität weitgehend fehlt. Siehe z. B. U.S. Pat. Nr. 5.244.797 . Die Erfindung sieht die Verwendung solcher reversen Transkriptasen oder von Varianten oder Mutanten davon vor.
  • Darüber hinaus sieht die Erfindung die Verwendung von reversen Transkriptasen vor, die fehleranfällig sind, d. H., die als fehleranfällige reverse Transkriptasen oder reverse Transkriptasen bezeichnet werden können, die den Einbau von Nukleotiden während der Polymerisation nicht mit hoher Zuverlässigkeit unterstützen. Während der Synthese des Einzelstrang-DNA-Flaps auf der Grundlage der RT-Vorlage, die mit der Guide-RNA integriert ist, kann die fehleranfällige reverse Transkriptase ein oder mehrere Nukleotide einführen, die nicht mit der RT-Vorlagensequenz übereinstimmen, wodurch Änderungen der Nukleotidsequenz durch fehlerhafte Polymerisation des Einzelstrang-DNA-Flaps entstehen. Diese Fehler, die während der Synthese des Einzelstrang-DNA-Flaps entstanden sind, werden dann durch Hybridisierung mit dem entsprechenden endogenen Zielstrang, Entfernung des endogenen verdrängten Strangs, Ligation und dann durch eine weitere Runde endogener DNA- Reparatur- und/oder Sequenzierungsprozesse in das Doppelstrangmolekül integriert.
  • Reverse Transkription
  • Der hier verwendete Begriff „reverse Transkription“ bezeichnet die Fähigkeit eines Enzyms, einen DNA-Strang (d. H. Komplementäre DNA oder cDNA) unter Verwendung von RNA als Vorlage zu synthetisieren. In einigen Ausführungsformen kann die reverse Transkription eine „fehleranfällige reverse Transkription“ sein, was sich auf die Eigenschaften bestimmter Enzyme der reversen Transkriptase bezieht, die in ihrer DNA- Polymerisationsaktivität fehleranfällig sind.
  • PACE
  • Der Begriff „Phagen-unterstützte kontinuierliche Evolution (PACE)“, wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf die kontinuierliche Evolution, bei der Phagen als virale Vektoren eingesetzt werden. Das allgemeine Konzept der PACE-Technologie wurde beispielsweise in der internationalen PCT-Anmeldung PCT/US2009/056194 beschrieben, die am 8. September 2009 eingereicht und am 11. März 2010 als WO 2010/028347 veröffentlicht wurde; in der internationalen PCT-Anmeldung PCT/US2011/066747, die am 22. Dezember 2011 eingereicht und am 28. Juni 2012 als WO 2012/088381 veröffentlicht wurde; in der U.S.. Application, U.S. Patent Nr. 9.023.594 , ausgestellt am 5. Mai 2015, internationale PCT- Anmeldung, PCT/US2015/012022, eingereicht am 20. Januar 2015, veröffentlicht als WO 2015/134121 am 11. September 2015, und internationale PCT-Anmeldung, PCT/US2016/027795, eingereicht am 15. April 2016, veröffentlicht als WO 2016/168631 am 20. Oktober 2016, deren gesamter Inhalt hier durch Bezugnahme aufgenommen wird.
  • Phage
  • Der Begriff „Phage“, der hier austauschbar mit dem Begriff „Bakteriophage“ verwendet wird, bezieht sich auf ein Virus, das bakterielle Zellen infiziert. Phagen bestehen in der Regel aus einem äußeren Proteinkapsid, das genetisches Material umschließt. Das genetische Material kann ssRNA, dsRNA, ssDNA oder dsDNA sein, entweder in linearer oder zirkulärer Form. Phagen und Phagenvektoren sind dem Fachmann wohlbekannt und nichteinschränkende Beispiele für Phagen, die für die Durchführung der hier vorgesehenen PACE- Methoden nützlich sind, sind λ (Lysogen), T2, T4, T7, T12, R17, M13, MS2, G4, P1, P2, P4, Phi X174, N4, Φ6 und Φ29. In bestimmten Ausführungsformen ist der in der vorliegenden Erfindung verwendete Phage M13. Weitere geeignete Phagen und Wirtszellen sind für den Fachmann offensichtlich, und die Erfindung ist in diesem Punkt nicht beschränkt. Für eine beispielhafte Beschreibung weiterer geeigneter Phagen und Wirtszellen siehe Elizabeth Kutter und Alexander Sulakvelidze: Bacteriophages: Biology and Applications. CRC Press; 1. Auflage (Dezember 2004), ISBN: 0849313368; Martha R. J. Clokie und Andrew M. Kropinski: Bacteriophages: Methods and Protocols, Band 1: Isolation, Characterization, and Interactions (Methods in Molecular Biology) Humana Press; 1. Auflage (Dezember, 2008), ISBN: 1588296822; Martha R. J. Clokie und Andrew M. Kropinski: Bacteriophages: Methods and Protocols, Band 2: Molecular and Applied Aspects (Methods in Molecular Biology) Humana Press; 1. Auflage (Dezember 2008), ISBN: 1603275649, die hier vollständig durch Verweis auf die Offenlegung geeigneter Phagen und Wirtszellen sowie auf Methoden und Protokolle zur Isolierung, Kultur und Manipulation solcher Phagen einbezogen sind).
  • Protein, Peptid und Polypeptid
  • Die Begriffe „Protein“, „Peptid“ und „Polypeptid“ werden hier austauschbar verwendet und beziehen sich auf ein Polymer aus Aminosäureresten, die durch Peptidbindungen (Amide) miteinander verbunden sind. Die Begriffe beziehen sich auf ein Protein, Peptid oder Polypeptid jeglicher Größe, Struktur oder Funktion. In der Regel ist ein Protein, Peptid oder Polypeptid mindestens drei Aminosäuren lang. Ein Protein, Peptid oder Polypeptid kann sich auf ein einzelnes Protein oder eine Sammlung von Proteinen beziehen. Eine oder mehrere der Aminosäuren in einem Protein, Peptid oder Polypeptid können modifiziert werden, beispielsweise durch Hinzufügen einer chemischen Einheit wie einer Kohlenhydratgruppe, einer Hydroxylgruppe, einer Phosphatgruppe, einer Famesylgruppe, einer Isofarnesylgruppe, einer Fettsäuregruppe, eines Linkers zur Konjugation, Funktionalisierung oder einer anderen Modifikation usw. Ein Protein, Peptid oder Polypeptid kann auch ein einzelnes Molekül sein oder einen multimolekularen Komplex darstellen. Ein Protein, Peptid oder Polypeptid kann nur ein Fragment eines natürlich vorkommenden Proteins oder Peptids sein. Ein Protein, Peptid oder Polypeptid kann natürlich vorkommen, rekombinant oder synthetisch sein, oder eine Kombination davon. Jedes der hier angebotenen Proteine kann durch jede in der Technik bekannte Methode hergestellt werden. Zum Beispiel können die hier angebotenen Proteine durch rekombinante Proteinexpression und -reinigung hergestellt werden, was sich besonders für Fusionsproteine eignet, die einen Peptidlinker enthalten. Die Verfahren zur Expression und Reinigung rekombinanter Proteine sind allgemein bekannt und werden unter anderem beschrieben von Green und Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2012)), dessen gesamter Inhalt hier durch Verweis aufgenommen wird.
  • Proteinspleißen
  • Der Begriff „Proteinspleißen“, wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf einen Prozess, bei dem eine Sequenz, ein Intein (oder gegebenenfalls gespaltene Inteine), aus einer Aminosäuresequenz herausgeschnitten wird und die verbleibenden Fragmente der Aminosäuresequenz, die Exteine, über eine Amidbindung ligiert werden, um eine kontinuierliche Aminosäuresequenz zu bilden. Der Begriff „trans“-Proteinspleißen bezieht sich auf den speziellen Fall, dass die Inteine gespaltene Inteine sind und sich auf verschiedenen Proteinen befinden.
  • Einschneiden des zweiten Strangs
  • Die Auflösung von Heteroduplex-DNA (d. H. Mit einem editierten und einem nicht- editierten Strang), die als Ergebnis des Prime Editing entsteht, bestimmt die langfristigen Editing-Ergebnisse. Mit anderen Worten: Ein Ziel des Prime Editing ist die Auflösung der Heteroduplex-DNA (der editierte Strang gepaart mit dem endogenen, nicht editierten Strang), die als Zwischenprodukt von PE entsteht, indem der editierte Strang dauerhaft in den komplementären, endogenen Strang integriert wird. Der Ansatz des „second-strand nicking“ kann hier verwendet werden, um die Auflösung von Heteroduplex-DNA zugunsten einer dauerhaften Integration des editierten Strangs in das DNA-Molekül zu unterstützen. Wie hier verwendet, bezieht sich das Konzept des „second-strand nicking“ auf die Einführung eines zweiten Nicks an einer Stelle stromabwärts des ersten Nicks (d. H. Der anfänglichen Einkerbung, die das freie 3'-Ende für die Verwendung beim Priming der reversen Transkriptase auf dem erweiterten Teil der Guide-RNA bereitstellt), vorzugsweise auf dem unbearbeiteten Strang. In bestimmten Ausführungsformen befinden sich die erste Einkerbung und die zweite Einkerbung auf gegenüberliegenden Strängen. In anderen Ausführungsformen befinden sich die erste Einkerbung und die zweite Einkerbung auf gegenüberliegenden Strängen. In einer weiteren Ausführungsform befindet sich der erste Nick auf dem Nicht- Zielstrang (d. H. Dem Strang, der den Einzelstrangteil der R-Schleife bildet) und der zweite Nick auf dem Zielstrang. In wieder anderen Ausführungsformen befindet sich der erste Nick auf dem bearbeiteten Strang und der zweite Nick auf dem unbearbeiteten Strang. Der zweite Nick kann mindestens 5 Nukleotide stromabwärts des ersten Nicks oder mindestens 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140 oder 150 oder mehr Nukleotide stromabwärts des ersten Nicks positioniert sein. Der zweite Nick kann in bestimmten Ausführungsformen zwischen etwa 5- 150 Nukleotiden auf dem uneditierten Strang, entfernt von der Stelle des pegRNA-induzierten Nicks, zwischen etwa 5-140, zwischen etwa 5-130, zwischen etwa 5-120, zwischen etwa 5- 110, zwischen etwa 5-100, zwischen etwa 5-90, zwischen etwa 5-80, zwischen etwa 5-70, zwischen etwa 5-60, zwischen etwa 5-50, zwischen etwa 5-40, zwischen etwa 5-30, zwischen etwa 5-20 oder zwischen etwa 5-10 eingefügt werden. In einer Ausführungsform wird der zweite Nick in einem Abstand von 14-116 Nukleotiden von dem pegRNA-induzierten Nick eingeführt. Ohne an eine Theorie gebunden zu sein, veranlasst der zweite Nick die endogenen DNA-Reparatur- und Replikationsprozesse der Zelle zum Ersatz oder zur Editierung des uneditierten Strangs, wodurch die editierte Sequenz dauerhaft auf beiden Strängen installiert und der Heteroduplex aufgelöst wird, der als Ergebnis von PE entstanden ist. In einigen Ausführungsformen ist der editierte Strang der Nicht-Zielstrang und der uneditierte Strang der Zielstrang. In anderen Ausführungsformen ist der editierte Strang der Zielstrang und der uneditierte Strang ist der Nicht-Zielstrang.
  • Sense-Strang
  • In der Genetik ist ein „Sense“-Strang das Segment innerhalb der doppelsträngigen DNA, das von 5' nach 3` verläuft und das komplementär zum Antisense-Strang der DNA, dem Templat-Strang, ist, der von 3' nach 5' verläuft. Im Falle eines DNA-Segments, das für ein Protein kodiert, ist der Sense-Strang der DNA-Strang, der die gleiche Sequenz wie die mRNA hat, die während der Transkription den Antisense-Strang als Vorlage verwendet und schließlich (typischerweise, aber nicht immer) in ein Protein übersetzt wird. Der Antisense-Strang ist also für die RNA verantwortlich, die später in Protein übersetzt wird, während der Sense-Strang einen nahezu identischen Aufbau wie die mRNA besitzt. Beachten Sie, dass es für jedes Segment der dsDNA möglicherweise zwei Sätze von Sense und Antisense gibt, je nachdem, in welche Richtung man liest (da Sense und Antisense relativ zur Perspektive sind). Letztlich ist es das Genprodukt, die mRNA, die bestimmt, welcher Strang eines dsDNA-Segments als Sense oder Antisense bezeichnet wird.
  • Im Zusammenhang mit einer pegRNA ist der erste Schritt die Synthese einer einzelsträngigen komplementären DNA (d. H. Der 3' ssDNA-Flap, der inkorporiert wird), die in der 5'-zu-3'-Richtung orientiert ist und vom pegRNA-Erweiterungsarm abgeschnitten wird. Ob der 3' ssDNA-Flap als Sense- oder Antisense-Strang zu betrachten ist, hängt von der Richtung der Transkription ab, da es allgemein anerkannt ist, dass beide Stränge der DNA als Vorlage für die Transkription dienen können (aber nicht gleichzeitig). In einigen Ausführungsformen dient also der 3' ssDNA-Flap (der insgesamt in der 5'-zu-3'-Richtung verläuft) als Sense-Strang, da er der kodierende Strang ist. In anderen Ausführungsformen dient der 3' ssDNA-Flap (der insgesamt in Richtung 5' zu 3' verläuft) als Antisense-Strang und damit als Vorlage für die Transkription.
  • Sequenz-Homologie
  • Eine „homologe Sequenz“ oder eine Sequenz, die „Homologie“ zu einer anderen Sequenz aufweist, bedeutet eine Sequenz eines Nukleinsäuremoleküls, die mindestens etwa 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 % oder 90 % Sequenzidentität mit einem anderen Nukleinsäuremolekül aufweist. In anderen Ausführungsformen kann eine „homologe Sequenz“ von Nukleinsäuren 93 %, 95 % oder 98 % Sequenzidentität mit der Referenznukleinsäure aufweisen.
  • Wenn im Zusammenhang mit zwei Nukleinsäuresequenzen oder zwei Polypeptidsequenzen ein Prozentsatz der Sequenzhomologie oder -identität angegeben wird, bezieht sich der Prozentsatz der Homologie oder Identität im Allgemeinen auf die Ausrichtung von zwei oder mehr Sequenzen über einen Teil ihrer Länge, wenn sie verglichen und auf maximale Übereinstimmung ausgerichtet werden. Sofern nicht anders angegeben, wird die Sequenzhomologie oder -identität über die angegebene Länge der Nukleinsäure, des Polypeptids oder eines Teils davon bewertet. In einigen Ausführungsformen wird die Homologie oder Identität über einen funktionalen Teil oder einen bestimmten Teil der Länge bewertet.
  • Der Abgleich von Sequenzen zur Bewertung der Sequenzhomologie kann mit in der Technik bekannten Algorithmen durchgeführt werden, wie z. B. Dem Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) Algorithmus, der in Altschul et al, J. Mol. Biol. 215:403- 410, 1990. Eine öffentlich zugängliche Internet-Schnittstelle zur Durchführung von BLAST-Analysen ist über das National Center for Biotechnology Information zugänglich. Weitere bekannte Algorithmen sind unter anderem veröffentlicht in: Smith & Waterman, „Comparison of Biosequences“, Adv. Appl. Math. 2:482, 1981; Needleman & Wunsch, „A general method applicable to the search for similarities in the amino acid sequence of two proteins“ J. Mol. Biol. 48:443, 1970; Pearson & Lipman „Improved tools for biological sequence comparison“, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988; oder durch automatische Implementierung dieser oder ähnlicher Algorithmen. Globale Alignment-Programme können auch verwendet werden, um ähnliche Sequenzen von ungefähr gleicher Größe auszurichten. Beispiele für globale Ausrichtungsprogramme sind NEEDLE (verfügbar unter www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/), das Teil des EMBOSS-Pakets ist (Rice P et al., Trends Genet., 2000; 16: 276-277), und das GGSEARCH-Programm fasta.bioch. Virginia. Edu/fasta_www2/fasta_www.cgi?rm= compare&pgm=gnw), das Teil des FASTA-Pakets ist (Pearson W und Lipman D, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 2444-2448). Beide Programme basieren auf dem Needleman-Wunsch-Algorithmus, der verwendet wird, um die optimale Ausrichtung (einschließlich Lücken) zweier Sequenzen über deren gesamte Länge zu finden. Eine ausführliche Diskussion der Sequenzanalyse finden Sie auch in Unit 19.3 von Ausubel et al („Current Protocols in Molecular Biology“ John Wiley & Sons Inc, 1994-1998, Chapter 15, 1998).
  • Spacer-Sequenz
  • Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „Spacer-Sequenz“ im Zusammenhang mit einer Guide-RNA oder einer pegRNA auf den Teil der Guide-RNA oder pegRNA von etwa 20 Nukleotiden, der eine Nukleotidsequenz enthält, die dieselbe Sequenz wie die Protospacer- Sequenz in der Ziel-DNA-Sequenz hat. Die Spacer-Sequenz bindet an das Komplement der Protospacer-Sequenz, um eine ssRNA/ssDNA-Hybridstruktur an der Zielstelle und eine entsprechende R-Loop-ssDNA-Struktur des endogenen DNA-Strangs zu bilden.
  • Subjekt
  • Der Begriff „Subjekt“, wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf einen einzelnen Organismus, zum Beispiel ein einzelnes Säugetier. In einigen Ausführungsformen ist das Subjekt ein Mensch. In einigen Ausführungsformen ist das Subjekt ein nicht-menschliches Säugetier. In einigen Ausführungsformen ist das Subjekt ein nicht-menschlicher Primat. In einigen Ausführungsformen ist das Subjekt ein Nagetier. In einigen Ausführungsformen ist das Subjekt ein Schaf, eine Ziege, ein Rind, eine Katze oder ein Hund. In einigen Ausführungsformen ist das Subjekt ein Wirbeltier, eine Amphibie, ein Reptil, ein Fisch, ein Insekt, eine Fliege oder ein Fadenwurm. In manchen Fällen ist das Subjekt ein Versuchstier. In einigen Ausführungsformen ist das Subjekt gentechnisch verändert, z. B. Ein gentechnisch verändertes nicht-menschliches Subjekt. Die Testperson kann beiden Geschlechtern angehören und sich in jedem Entwicklungsstadium befinden.
  • Split Intein
  • Obwohl Inteine am häufigsten als zusammenhängende Domäne vorkommen, gibt es auch einige in einer natürlich geteilten Form. In diesem Fall werden die beiden Fragmente als separate Polypeptide exprimiert und müssen sich verbinden, bevor das Spleißen stattfindet, das so genannte Trans-Splicing von Proteinen.
  • Ein beispielhaftes Split-Intein ist das Ssp DnaE-Intein, das aus zwei Untereinheiten besteht, nämlich DnaE-N und DnaE-C. Die beiden verschiedenen Untereinheiten werden von separaten Genen kodiert, nämlich dnaE-n und dnaE-c, die für die Untereinheiten DnaE-N bzw. DnaE-C kodieren. DnaE ist ein natürlich vorkommendes Split-Intein in Synechocytis sp. PCC6803 und ist in der Lage, das Trans-Splicing von zwei separaten Proteinen zu steuern, die jeweils eine Fusion mit entweder DnaE-N oder DnaE-C umfassen.
  • Weitere natürlich vorkommende oder künstlich hergestellte Split-Intein-Sequenzen sind bekannt oder können aus den hier beschriebenen oder in der Technik verfügbaren Ganz- Intein-Sequenzen hergestellt werden. Beispiele für Split-Intein-Sequenzen finden Sie in Stevens et al., „A promiscuous split intein with expanded protein engineering applications", PNAS, 2017, Vol.114: 8538-8543; Iwai et al., „Highly efficient protein trans-splicing by a naturally split DnaE intein from Nostc punctiforme, FEBS Lett, 580: 1853-1858 (die hier jeweils durch Verweis einbezogen sind). Weitere Split-Intein-Sequenzen finden Sie z. B. In WO 2013/045632 , WO 2014/055782 , WO 2016/069774 und EP2877490 , deren Inhalt hier durch Bezugnahme aufgenommen wird.
  • Darüber hinaus wurde Proteinspleißen in trans in vivo und in vitro beschrieben (Shingledecker, et al.,Gene 207:187 (1998), Southworth, et al., EMBOJ. 17:918 (1998); Mills, et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 95:3543-3548 (1998); Lew, et al., J. Biol. Chem., 273:15887- 15890 (1998); Wu, et al., Biochim. Biophys. Acta 35732:1 (1998b), Yamazaki, et al., J. Am. Chem. Soc. 120:5591 (1998), Evans, et al., J. Biol. Chem. 275:9091 (2000); Otomo, et al., Biochemistry 38:16040-16044 (1999); Otomo, et al., J. Biolmol. NMR 14:105-114 (1999); Scott, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:13638-13643 (1999)) und bietet die Möglichkeit, ein Protein in Form von zwei inaktiven Fragmenten zu exprimieren, die anschließend durch Ligation ein funktionelles Produkt bilden, z. B. Wie in FIG.. 66 und 67 im Hinblick auf die Bildung eines vollständigen PE-Fusionsproteins aus zwei getrennt exprimierten Hälften gezeigt.
  • Zielstelle
  • Der Begriff „Zielstelle“ bezieht sich auf eine Sequenz innerhalb eines Nukleinsäuremoleküls, die von einem hier offengelegten Prime Editor (PE) bearbeitet wird. Die Zielstelle bezieht sich ferner auf die Sequenz innerhalb eines Nukleinsäuremoleküls, an die ein Komplex aus dem Prime Editor (PE) und der gRNA bindet.
  • tPERT
  • Siehe Definition für „trans Prime Editor RNA template (tPERT)“.
  • Zeitlich begrenztes Nicking des zweiten Strangs
  • Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „zeitlich begrenztes Nicking des zweiten Strangs“ auf eine Variante des Second-Strand-Nickings, bei der die Installation des zweiten Nicks im uneditierten Strang erst erfolgt, nachdem der gewünschte Edit im editierten Strang installiert wurde. Dadurch werden gleichzeitige Einschnitte auf beiden Strängen vermieden, die zu doppelsträngigen DNA-Brüchen führen könnten. Die Zweitstrang-Nick-Guide-RNA ist für eine zeitliche Kontrolle ausgelegt, so dass der Zweitstrang-Nick erst nach der Installation des gewünschten Schnitts eingeführt wird. Dies wird erreicht, indem eine gRNA mit einer Spacer-Sequenz entworfen wird, die nur mit dem editierten Strang übereinstimmt, aber nicht mit dem ursprünglichen Allel. Bei dieser Strategie sollten Fehlpaarungen zwischen dem Protospacer und dem uneditierten Allel das Nicking durch die sgRNA benachteiligen, bis das Editing-Ereignis auf dem PAM-Strang stattgefunden hat.
  • Trans Prime-Editing
  • Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „trans Prime Editing“ oder ähnlich „trans dual prime editing“ auf eine modifizierte Form des Prime Editing oder dual Prime Editing, bei der eine geteilte pegRNA verwendet wird, d. H. Bei der die pegRNA in zwei getrennte Moleküle aufgeteilt ist: eine sgRNA und eine trans Prime Editing RNA-Vorlage (tPERT). Die sgRNA dient dazu, den Prime-Editor (oder allgemeiner, die napDNAbp-Komponente des Prime-Editors) auf die gewünschte genomische Zielstelle auszurichten, während das tPERT von der Polymerase (z. B. Einer reversen Transkriptase) verwendet wird, um eine neue DNA- Sequenz in die Zielstelle zu schreiben, sobald das tPERT durch die Interaktion von Bindungsdomänen auf dem Prime-Editor und dem tPERT in trans zum Prime-Editor rekrutiert wurde. In einer Ausführungsform können die Bindungsdomänen RNA-Protein- Rekrutierungseinheiten enthalten, wie z. B. Ein MS2-Aptamer, das sich auf dem tPERT befindet, und ein MS2cp-Protein, das mit dem Prime-Editor fusioniert ist. Ein Vorteil des Trans-Prime-Editings besteht darin, dass man durch die Trennung der DNA-Synthesematrix von der Guide-RNA potenziell längere Templates verwenden kann.
  • Eine Ausführungsform der Trans-Prime-Editing ist in FIG.. 3G und 3H dargestellt. 3G zeigt die Zusammensetzung des trans-Prime-Editor-Komplexes auf der linken Seite („RP-PE:gRNA-Komplex“), der ein napDNAbp umfasst, das jeweils mit einer Polymerase (z. B. Einer reversen Transkriptase) und einem rPERT-Rekrutierungsprotein (z. B. MS2sc) fusioniert ist, und der mit einer Guide-RNA komplexiert ist. 3G zeigt außerdem ein separates tPERT-Molekül, das die Erweiterungsarm-Merkmale einer pegRNA umfasst, einschließlich der DNA-Synthese-Template und der Primer-Bindesequenz. Das tPERT- Molekül enthält auch eine RNA-Protein-Rekrutierungsdomäne (die in diesem Fall eine Stamm- Schleifen-Struktur ist und z. B. Ein MS2-Aptamer sein kann). Wie dargestellt in dem beschriebenen Verfahren in 3H bindet der RP-PE:gRNA-Komplex an die Ziel-DNA- Sequenz und schneidet sie ein. Dann rekrutiert das Rekrutierungsprotein (RP) ein tPERT, damit es an den Prime-Editor-Komplex, der an die DNA-Zielstelle gebunden ist, kolokalisiert, wodurch die Primer-Bindungsstelle an die Primer-Sequenz auf dem eingekerbten Strang binden kann und anschließend die Polymerase (z. B. RT) einen einzelnen DNA-Strang gegen die DNA-Synthesevorlage bis zu den 5' des tPERT synthetisieren kann.
  • Während die tPERT in 3G und 3H das PBS und die DNA-Synthese-Template am 5'-Ende der RNA-Protein-Rekrutierungsdomäne umfasst, kann das tPERT in anderen Konfigurationen so gestaltet sein, dass das PBS und die DNA-Synthese-Template am 3'-Ende der RNA-Protein-Rekrutierungsdomäne angeordnet sind. Das tPERT mit der 5'-Erweiterung hat jedoch den Vorteil, dass die Synthese des DNA-Einzelstrangs auf natürliche Weise am 5'- Ende des tPERT endet und somit nicht das Risiko besteht, dass ein Teil der RNA-Protein- Rekrutierungsdomäne während der DNA-Synthesestufe des Prime Editing als Vorlage verwendet wird.
  • Trans Prime Editor RNA-Vorlage (tPERT)
  • Wie hier verwendet, bezieht sich eine „trans Prime Editor RNA-Vorlage (tPERT)“ auf eine Komponente, die beim Trans-Prime-Editing oder Trans-Dual-Prime-Editing verwendet wird, einer modifizierten Version des Prime Editing, bei der die pegRNA in zwei verschiedene Moleküle aufgeteilt wird: eine Guide-RNA und ein tPERT-Molekül. Das tPERT-Molekül ist so programmiert, dass es mit dem Prime-Editor-Komplex an einer Ziel-DNA-Stelle kolokalisiert und so die Primer-Bindungsstelle und die DNA-Synthese-Template in trans zum Prime-Editor bringt. Siehe zum Beispiel 3G für eine Ausführungsform eines Trans- Prime-Editors (tPE), der ein Zweikomponentensystem zeigt, das (1) einen RP-PE:gRNA- Komplex und (2) ein tPERT umfasst, das die Primer-Bindungsstelle und die DNA-Synthese- Template umfasst, die mit einer RNA-Protein-Rekrutierungsdomäne verbunden sind, wobei die RP-Komponente (Rekrutierungsprotein) des RP-PE:gRNA-Komplexes das tPERT zu einer zu editierenden Zielstelle rekrutiert, wodurch die PBS und die DNA-Synthese-Template mit dem Prime Editor in trans assoziiert werden. Anders ausgedrückt: Das tPERT ist so konstruiert, dass es (ganz oder teilweise) den Erweiterungsarm einer pegRNA enthält, der die Primer-Bindungsstelle und die DNA-Synthese-Template umfasst.
  • Transitionen
  • Wie hier verwendet, beziehen sich „Transitionen“ auf den Austausch von Purin- Nukleobasen (A ↔ G) oder den Austausch von Pyrimidin-Nukleobasen (C ↔ T). An dieser Klasse von Austauschvorgängen sind Nukleobasen mit ähnlicher Form beteiligt. Die hier offengelegten Zusammensetzungen und Methoden sind in der Lage, eine oder mehrere Transitionen in einem Ziel-DNA-Molekül zu induzieren. Die hier offengelegten Zusammensetzungen und Methoden sind auch in der Lage, sowohl Transitionen als auch Transversionen in demselben Ziel-DNA-Molekül zu induzieren. Bei diesen Veränderungen handelt es sich um A ↔ G, G ↔ A, C ↔ T oder T ↔ C. Im Zusammenhang mit einer doppelsträngigen DNA mit Watson-Crick-Nukleobasenpaaren beziehen sich Transversionen auf die folgenden Basenpaaraustausche: A:T ↔ G:C, G:G ↔ A:T, C:G ↔ T:A, oder T:A ↔ C:G. Die hier offengelegten Zusammensetzungen und Methoden sind in der Lage, eine oder mehrere Transitionen in einem Ziel-DNA-Molekül zu induzieren. Die hier offengelegten Zusammensetzungen und Methoden sind auch in der Lage, sowohl Transitionen als auch Transversionen in demselben Ziel-DNA-Molekül sowie andere Nukleotidveränderungen, einschließlich Deletionen und Insertionen, zu induzieren.
  • Transversionen
  • Wie hier verwendet, beziehen sich „Transversionen“ auf den Austausch von Purin- Nukleobasen gegen Pyrimidin-Nukleobasen oder umgekehrt und beinhalten somit den Austausch von Nukleobasen mit unterschiedlicher Form. Diese Veränderungen betreffen T ↔ A, T↔ G, C ↔ G, C ↔ A, A ↔ T, A ↔ C, G ↔ C und G ↔ T. Im Kontext einer doppelsträngigen DNA mit Watson-Crick gepaarten Nukleobasen beziehen sich Transversionen auf die folgenden Basenpaaraustausche: T:A ↔ A:T, T:A ↔ G:C, C:G ↔ G:C, C:G ↔ A:T, A:T ↔ T:A, A:T ↔ C:G, G:C ↔ C:G, und G:C ↔ T:A. Die hier offenbarten Zusammensetzungen und Methoden sind in der Lage, eine oder mehrere Transversionen in einem Ziel-DNA-Molekül zu induzieren. Die hier offengelegten Zusammensetzungen und Methoden sind auch in der Lage, sowohl Transitionen als auch Transversionen in demselben Ziel-DNA-Molekül sowie andere Nukleotidveränderungen, einschließlich Deletionen und Insertionen, zu induzieren.
  • Behandlung
  • Die Begriffe „Behandlung“, „behandeln“ und „Behandeln“ beziehen sich auf eine klinische Intervention, die darauf abzielt, eine Krankheit oder Störung oder eines oder mehrere ihrer Symptome umzukehren, zu lindern, ihren Ausbruch zu verzögern oder ihr Fortschreiten zu hemmen, wie hier beschrieben. Wie hierin verwendet, beziehen sich die Begriffe „Behandlung“, „behandeln“ und „Behandeln“ auf eine klinische Intervention, die darauf abzielt, eine Krankheit oder Störung oder eines oder mehrere ihrer Symptome umzukehren, zu lindern, ihren Ausbruch zu verzögern oder ihr Fortschreiten zu hemmen, wie hier beschrieben. In einigen Ausführungsformen kann die Behandlung verabreicht werden, nachdem sich ein oder mehrere Symptome entwickelt haben und/oder nachdem eine Krankheit diagnostiziert worden ist. In anderen Ausführungsformen kann die Behandlung in Abwesenheit von Symptomen verabreicht werden, z. B. Um das Auftreten eines Symptoms zu verhindern oder zu verzögern oder das Auftreten oder Fortschreiten einer Krankheit zu hemmen. Zum Beispiel kann die Behandlung einer anfälligen Person vor dem Auftreten von Symptomen verabreicht werden(z. B. Aufgrund einer Vorgeschichte von Symptomen und/oder aufgrund von genetischen oder anderen Anfälligkeitsfaktoren). Die Behandlung kann auch nach dem Abklingen der Symptome fortgesetzt werden, zum Beispiel um ein Wiederauftreten der Symptome zu verhindern oder zu verzögern.
  • Trinukleotid-Repeat-Störung
  • Der Begriff „Trinukleotid-Repeat-Störung“ (oder alternativ „Expansions-Repeat- Störung“ oder „Repeat-Expansions-Störung“) bezieht sich auf eine Reihe von genetischen Störungen, die durch eine „Trinukleotid-Repeat-Expansion“ verursacht werden. Dabei handelt es sich um eine Art von Mutation, bei der sich ein bestimmtes Trinukleotid in bestimmten Genen oder Introns wiederholt. Trinukleotid-Wiederholungen galten einst als alltägliche Iterationen im Genom, aber in den 1990er Jahren wurden diese Störungen aufgeklärt. Diese scheinbar „harmlosen“ DNA-Abschnitte können sich manchmal ausdehnen und Krankheiten verursachen. Die durch Trinukleotid-Repeat-Expansionen verursachten Krankheiten weisen mehrere gemeinsame Merkmale auf. Erstens weisen die mutierten Wiederholungen sowohl eine somatische als auch eine Keimbahninstabilität auf, und häufiger expandieren sie bei aufeinanderfolgenden Übertragungen eher, als dass sie sich zusammenziehen. Zweitens sind ein früheres Alter des Auftretens und eine zunehmende Schwere des Phänotyps in den nachfolgenden Generationen (Antizipation) im Allgemeinen mit einer größeren Repeatlänge korreliert. Schließlich kann der elterliche Ursprung des Krankheitsallels oft die Antizipation beeinflussen, wobei die väterliche Übertragung bei vielen dieser Störungen ein größeres Risiko der Ausbreitung birgt.
  • Man geht davon aus, dass die Triplett-Expansion durch ein Abrutschen während der DNA-Replikation verursacht wird. Aufgrund des repetitiven Charakters der DNA-Sequenz in diesen Regionen können sich während der DNA-Replikation „Schleifenstrukturen“ bilden, wobei die komplementäre Basenpaarung zwischen dem Elternstrang und dem zu synthetisierenden Tochterstrang erhalten bleibt. Wenn die Loop-Out-Struktur aus einer Sequenz auf dem Tochterstrang gebildet wird, führt dies zu einer Erhöhung der Anzahl der Wiederholungen. Wenn jedoch die Loop-Out-Struktur auf dem Elternstrang gebildet wird, kommt es zu einer Verringerung der Anzahl der Wiederholungen. Es scheint, dass die Expansion dieser Wiederholungen häufiger vorkommt als die Reduktion. Je größer die Ausdehnung ist, desto wahrscheinlicher ist es, dass sie eine Krankheit verursacht oder den Schweregrad der Krankheit erhöht. Diese Eigenschaft führt zu dem Merkmal der Antizipation, das bei Trinukleotid-Repeat-Störungen zu beobachten ist. Antizipation beschreibt die Tendenz, dass das Alter des Ausbruchs der Krankheit abnimmt und der Schweregrad der Symptome durch die Ausbreitung dieser Wiederholungen über mehrere Generationen einer betroffenen Familie zunimmt.
  • Zu den Nukleotid-Wiederholungsstörungen gehören solche, bei denen die Triplett- Wiederholung in einer nicht-kodierenden Region (d. H. Eine nicht-kodierende Trinukleotid- Wiederholungsstörung) oder in einer kodierenden Region auftritt
  • Das hier beschriebene Prime-Editor (PE)-System kann zur Behandlung von Nukleotid- Wiederholungsstörungen verwendet werden, zu denen unter anderem das fragile X-Syndrom (FRAXA), die fragile XE-MR (FRAXE), die Freidreich-Ataxie (FRDA), die myotone Dystrophie (DM), die spinozerebelläre Ataxie Typ 8 (SCA8) und die spinozerebelläre Ataxie Typ 12 (SCA12) gehören können.
  • Stromaufwärts
  • Wie hier verwendet, sind die Begriffe „stromaufwärts“ und „stromabwärts“ Relativitätsbegriffe, die die lineare Position von mindestens zwei Elementen definieren, die sich in einem Nukleinsäuremolekül (ob einzel- oder doppelsträngig) befinden, das in einer 5'- zu-3'-Richtung orientiert ist. Insbesondere befindet sich ein erstes Element stromaufwärts von einem zweiten Element in einem Nukleinsäuremolekül, wobei das erste Element an einer Stelle positioniert ist, die 5' zu dem zweiten Element liegt. Ein SNP befindet sich beispielsweise stromaufwärts von einer Cas9-induzierten Nick-Stelle, wenn der SNP auf der 5'-Seite der Einkerbung liegt. Umgekehrt befindet sich ein erstes Element stromabwärts von einem zweiten Element in einem Nukleinsäuremolekül, wenn das erste Element an einer Stelle positioniert ist, die 3' zum zweiten Element liegt. Zum Beispiel ist ein SNP stromabwärts von einer Cas9- induzierten Einkerbung, wenn der SNP auf der 3'-Seite der Einkerbung liegt. Das Nukleinsäuremolekül kann eine DNA sein (doppel- oder einzelsträngig). RNA (doppel- oder einzelsträngig) oder ein Hybrid aus DNA und RNA. Die Analyse ist für ein einzelsträngiges Nukleinsäuremolekül und ein doppelsträngiges Molekül die gleiche, da sich die Begriffe „stromaufwärts“ und „stromabwärts“ nur auf einen Einzelstrang eines Nukleinsäuremoleküls beziehen, mit der Ausnahme, dass man auswählen muss, welcher Strang des doppelsträngigen Moleküls betrachtet wird. Oft ist der Strang einer doppelsträngigen DNA, der zur Bestimmung der Positionsrelativität von mindestens zwei Elementen verwendet werden kann, der „Sense- Strang“ oder „kodierende Strang“. In der Genetik ist ein „Sense“-Strang das Segment innerhalb der doppelsträngigen DNA, das von 5' nach 3` verläuft und das komplementär zum Antisense-Strang der DNA, dem Templat-Strang, ist, der von 3' nach 5` verläuft. So ist beispielsweise eine SNP-Nukleobase „stromabwärts“ von einer Promotorsequenz in einer genomischen DNA (die doppelsträngig ist), wenn sich die SNP-Nukleobase auf der 3'-Seite des Promotors auf dem Sense- oder Kodierungsstrang befindet.
  • Variante
  • Der hier verwendete Begriff „Variante“ bezeichnet Eigenschaften, die von dem in der Natur vorkommenden Muster abweichen, z. B. Ist eine Cas9-Variante ein Cas9, das eine oder mehrere Änderungen in den Aminosäureresten im Vergleich zu einer unmutierten Cas9- Aminosäure-Sequenz aufweist. Der Begriff „Variante“ umfasst homologe Proteine, die mindestens 75 % oder mindestens 80 % oder mindestens 85 % oder mindestens 90 % oder mindestens 95 % oder mindestens 99 % prozentuale Identität mit einer Referenzsequenz aufweisen und die gleiche oder im Wesentlichen die gleiche(n) funktionelle(n) Aktivität(en) haben wie die Referenzsequenz. Der Begriff umfasst auch Mutanten, Verkürzungen oder Domänen einer Referenzsequenz, die die gleiche oder im Wesentlichen die gleiche(n) funktionelle(n) Aktivität(en) wie die Referenzsequenz aufweisen.
  • Vektor
  • Der Begriff „Vektor“, wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf eine Nukleinsäure, die modifiziert werden kann, um ein Gen von Interesse zu kodieren, und die in der Lage ist, in eine Wirtszelle einzudringen, zu mutieren und sich innerhalb der Wirtszelle zu replizieren und dann eine replizierte Form des Vektors in eine andere Wirtszelle zu übertragen. Geeignete Vektoren sind zum Beispiel virale Vektoren, wie retrovirale Vektoren oder Bakteriophagen und filamentöse Phagen sowie konjugative Plasmide. Weitere geeignete Vektoren sind für den Fachmann auf der Grundlage der vorliegenden Erfindung offensichtlich.
  • Unmutiert
  • Der hier verwendete Begriff „unmutiert“ ist ein Fachbegriff und steht für die typische Form eines Organismus, Stammes, Gens oder Merkmals, wie sie in der Natur vorkommt, im Unterschied zu mutierten oder abweichenden Formen.
  • 5' endogener DNA-Flap
  • Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „5'-endogener DNA-Flaps“ auf den DNA- Strang, der sich unmittelbar stromabwärts der PE-induzierten Einkerbung in der Ziel-DNA befindet. Das Nicking des Ziel-DNA-Strangs durch PE legt eine 3'-Hydroxylgruppe auf der stromaufwärts gelegenen Seite der Einkerbung und eine 5`-Hydroxylgruppe auf der stromabwärts gelegenen Seite der Einkerbung frei. Der endogene Strang, der mit der 3'- Hydroxylgruppe endet, wird verwendet, um die DNA-Polymerase des Prime-Editors zu primen (z. B. Wenn die DNA-Polymerase eine reverse Transkriptase ist). Der endogene Strang auf der stromabwärts gelegenen Seite der Einkerbung, der mit der exponierten 5'-Hydroxylgruppe beginnt, wird als „5'-endogener DNA-Flap“ bezeichnet und schließlich entfernt und durch den neu synthetisierten Ersatzstrang (d. H. Den „3'-Ersatz-DNA-Flap“) ersetzt, der durch die Verlängerung der pegRNA kodiert wird.
  • Entfernung des 5' endogenen DNA-Flaps
  • Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „Entfernung des endogenen 5`-DNA- Flaps“ oder „5`-Flap-Entfernung“ auf die Entfernung des endogenen 5`-DNA-Flaps, der sich bildet, wenn der RT-synthetisierte Einzelstrang-DNA-Flap konkurrierend in die endogene DNA eindringt und mit ihr hybridisiert und dabei den endogenen Strang verdrängt. Durch die Entfernung dieses endogenen verdrängten Strangs kann die Reaktion zur Bildung des gewünschten Produkts mit der gewünschten Nukleotidveränderung führen. Die zelleigenen DNA-Reparaturenzyme können die Entfernung oder Exzision des endogenen 5'-Flaps katalysieren (z. B. Eine Flap-Endonuklease wie EXO1 oder FEN1). Außerdem können die Wirtszellen so transformiert werden, dass sie ein oder mehrere Enzyme exprimieren, die die Entfernung der endogenen 5'-Flaps katalysieren und so den Prozess der Produktbildung vorantreiben (z. B. Eine Flap-Endonuklease). Flap-Endonukleasen sind in der Technik bekannt und werden beschrieben in Patel et al., „Flap endonucleases pass 5'-flaps through a flexible arch using a disorder-thread-order mechanism to confer specificity for free 5'-ends,“ Nucleic Acids Research, 2012, 40(10): 4507-4519 und Tsutakawa et al., „Human flap endonuclease structures, DNA double-base flipping, and a unified understanding of the FEN1 superfamily,“ Cell, 2011, 145(2): 198-211 (die hier jeweils durch Bezugnahme aufgenommen sind).
  • 3' Ersatz-DNA-Flap
  • Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „3'-Ersatz-DNA-Flap“ oder einfach „Ersatz-DNA-Flap“ auf den DNA-Strang, der vom Prime-Editor synthetisiert und vom Verlängerungsarm des Prime-Editors pegRNA kodiert wird. Insbesondere wird die 3'-Ersatz- DNA-Flap von der Polymerase-Vorlage der pegRNA kodiert. Der 3'-Ersatz-DNA-Flap umfasst dieselbe Sequenz wie der 5'-endogene DNA-Flap, mit der Ausnahme, dass er auch die editierte Sequenz (z. B. Eine einzelne Nukleotidänderung) enthält. Der 3'-Ersatz-DNA-Flap bindet an die Ziel-DNA und verdrängt oder ersetzt dabei den 5'-endogenen DNA-Flap (der zum Beispiel durch eine 5'-Flap-Endonuklease ausgeschnitten werden kann, wie FEN1 oder EXO1) und wird dann ligiert, um das 3'-Ende des 3`-Ersatz-DNA-Flaps mit dem freiliegenden 5'-Hydoxyl-Ende der endogenen DNA (das nach der Entfernung des 5'-endogenen DNA-Flaps freiliegt) zu verbinden, wodurch eine Phospodiesterbindung neu gebildet und der 3'-Ersatz- DNA-Flap installiert wird, um eine Heteroduplex-DNA zu bilden, die einen editierten Strang und einen uneditierten Strang enthält. DNA-Reparaturprozesse lösen den Heteroduplex auf, indem sie die Informationen im editierten Strang auf den komplementären Strang kopieren und den Edit dauerhaft in die DNA einbauen. Dieser Auflösungsprozess kann noch weiter vorangetrieben werden, indem der unbearbeitete Strang eingeklemmt wird, d. H. Durch „second-strand nicking“, wie hier beschrieben.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG BESTIMMTER AUSFÜHRUNGSFORMEN
  • Die Einführung des CRISPR-Systems (clustered regularly interspaced short palindromic repeat) für das Genom-Editing hat die Biowissenschaften revolutioniert1-3 . Auch wenn die Unterbrechung von Genen mithilfe von CRISPR inzwischen Routine ist, stellt die präzise Installation einzelner Nukleotid-Edits nach wie vor eine große Herausforderung dar, auch wenn sie für die Untersuchung oder Korrektur einer großen Anzahl von krankheitsverursachenden Mutationen notwendig ist. Die homologiegeleitete Reparatur (HDR) ist in der Lage, solche Bearbeitungen vorzunehmen, leidet jedoch unter der geringen Effizienz (oft <5 %), der Notwendigkeit von Spender-DNA-Reparaturvorlagen und den schädlichen Auswirkungen der Bildung doppelsträngiger DNA-Brüche (DSB). Kürzlich hat das Labor von Prof. David Liu et al.das Base Editing entwickelt, das eine effiziente Bearbeitung einzelner Nukleotide ohne DSBs ermöglicht. Basen-Editoren (Bes) kombinieren das CRISPR-System mit Basen-modifizierenden Deaminase-Enzymen, um die Zielbasenpaare C-G oder A-T in A-T bzw. G-C umzuwandeln4-6. Obwohl sie bereits von vielen Forschern weltweit eingesetzt werden, ermöglichen die aktuellen Bes nur vier der zwölf möglichen Basenpaarumwandlungen und sind nicht in der Lage, kleine Insertionen oder Deletionen zu korrigieren. Darüber hinaus wird die Reichweite der Basen-Editierung durch die Editierung von C- oder A-Basen, die nicht zur Zielbase gehören („Bystander-Editierung“), und durch die Anforderung, dass eine PAM-Sequenz 15±2 bp von der Zielbase entfernt sein muss, eingeschränkt. Die Überwindung dieser Einschränkungen würde daher die Grundlagenforschung und die therapeutischen Anwendungen des Genome Editing erheblich erweitern.
  • Es wurden neue Präzisions-Editing-Ansätze(z. B. Klassisches Prime-Editing) entwickelt, die viele der Vorteile der Basen-Editierung bieten - nämlich die Vermeidung von Doppelstrangbrüchen und Spender-DNA-Reparaturvorlagen - und gleichzeitig dessen größte Einschränkungen überwinden. Der hier beschriebene Ansatz ermöglicht die direkte Installation von editierten DNA-Strängen an genomischen Zielstellen mit Hilfe der zielgerichteten reversen Transkription (TPRT). In dem hier besprochenen Design wird die CRISPR-Guide-RNA (gRNA) so konstruiert, dass sie eine Reverse Transkriptase (RT)- Matrizen-Sequenz trägt, die eine einzelsträngige DNA mit einer gewünschten Nukleotidveränderung kodiert. Die von der CRISPR-Nuklease (Cas9) aufgespießte Zielstellen-DNA dient als Primer für die reverse Transkription der Template-Sequenz auf der modifizierten gRNA, so dass jede gewünschte Nukleotid-Editierung direkt eingebaut werden kann.
  • Der Mechanismus der zielgerichteten reversen Transkription (TPRT) kann für die Durchführung von präzisem CRISPR/Cas-basiertem Genome Editing mit hoher Effizienz und genetischer Flexibilität genutzt oder angepasst werden (z. B. Wie in verschiedenen Ausführungsformen der 1A-1F). Cas-Protein-Fusionen mit Reverser Transkriptase werden verwendet, um eine spezifische DNA-Sequenz mit einer modifizierten Guide-RNA („eine erweiterte Guide-RNA“) anzusteuern, einen Einzelstrang-Nick an der Zielstelle zu erzeugen und die eingekerbte DNA als Primer für die reverse Transkription einer manipulierten Reversen Transkriptase-Vorlage zu verwenden, die in die erweiterte Guide-RNA integriert ist. Der neu synthetisierte Strang wäre homolog zur genomischen Zielsequenz, mit Ausnahme einer gewünschten Nukleotidänderung (z. B. Eine einzelne Nukleotidänderung, eine Deletion oder eine Insertion oder eine Kombination davon). Der neu synthetisierte DNA-Strang kann als Einzelstrang-DNA-Flaps bezeichnet werden, der mit dem komplementären homologen endogenen DNA-Strang um die Hybridisierung konkurriert und dadurch den entsprechenden endogenen Strang verdrängt. Die Auflösung dieses hybridisierten Zwischenprodukts kann die Entfernung des resultierenden verschobenen Flaps endogener DNA (z. B. Mit einer 5'-End- DNA-Flap-Endonuklease, FEN1), die Ligation des synthetisierten Einzelstrang-DNA-Flaps an die Ziel-DNA und die Assimilation der gewünschten Nukleotidänderung als Ergebnis zellulärer DNA-Reparatur- und/oder Replikationsprozesse umfassen. Da die Template- gestützte DNA-Synthese die Präzision eines einzelnen Nukleotids bietet, ist der Anwendungsbereich dieses Ansatzes sehr breit gefächert und könnte vorhersehbar für unzählige Anwendungen in der Grundlagenforschung und in der Therapeutik genutzt werden.
  • Die vorliegende Erfindung beschreibt eine neue Plattform für die Genom-Editierung, die als „Multi-Flap-Prime-Editing“ bezeichnet wird (einschließlich z. B. „Dual-Flap-Prime- Editing“ und „Quadruple-Flap-Prime-Editing“) und eine innovative Weiterentwicklung des „Prime-Editing“ oder „klassischen Prime-Editing“ darstellt, wie von den heutigen Erfindern beschrieben in Anzalone, A. V. Et al. Search-and-replace genome editing without double- strand breaks or donor DNA. Nature 576, 149-157 (2019), durch Bezugnahme hier aufgenommen. Während beim klassischen Prime-Editing in verschiedenen Ausführungsformen an einer Einstichstelle ein einzelner 3`-Flap polymerisiert wird, der in die Zielnukleinsäure auf demselben Strang integriert wird, umfassen die derzeit beschriebenen Multi-Flap-Prime-Editing-Systeme verschiedene Konstrukte, Systeme und Verfahren, die in verschiedenen Ausführungsformen Paare oder mehrere Paare von 3'-Flaps auf verschiedenen Strängen erzeugen, die Duplexe bilden, die die gewünschten Edits umfassen und in die Ziel- Nukleinsäuremoleküle eingebaut werden, z. B. An spezifischen Loci oder Editierstellen in einem Genom. In verschiedenen Aspekten bilden die Paare oder mehrere Paare von 3'-Flaps Duplexe, weil sie umgekehrt komplementäre Sequenzen enthalten, die sich aneinander anlagern, sobald sie von den hier beschriebenen Prime-Editoren erzeugt wurden. Die Duplexe werden durch zellgesteuerte Mechanismen in die Zielstelle eingebaut, die auf natürliche Weise die endogenen Duplexsequenzen ersetzen, die sich zwischen benachbarten Einstichstellen befinden. In bestimmten Ausführungsformen können die neuen Duplexsequenzen an einer oder mehreren Stellen eingeführt werden (z. B. An benachbarten genomischen Loci oder an zwei verschiedenen chromosomalen Stellen) und können eine oder mehrere Sequenzen von Interesse umfassen, z. B. Eine Protein-kodierende Sequenz, eine Peptid-kodierende Sequenz oder eine RNA-kodierende Sequenz. In einer Ausführungsform können die neuen Duplexsequenzen, die von den Multi-Flap-Prime-Editing-Systemen installiert werden, eine Rekombinasestelle umfassen, z. B., eine Bxb1-Rekombinasestelle attB (38 bp) und/oder attP (50 bp) oder eine Rekombinasestelle, die von Hin-Rekombinase, Gin-Rekombinase, Tn3- Rekombinase, β-six-Rekombinase, CinH-Rekombinase, ParA-Rekombinase, γδ- Rekombinase, ϕC31-Rekombinase, TP901-Rekombinase, TG1-Rekombinase, φBT1- Rekombinase, R4-Rekombinase, (φRV1-Rekombinase, φFC1-Rekombinase, MR11- Rekombinase, A118-Rekombinase, U153-Rekombinase und gp29-Rekombinase, Cre- Rekombinase, FLP-Rekombinase, R-Rekombinase, Lambda-Rekombinase, HK101- Rekombinase, HK022-Rekombinase und pSAM2-Rekombinase erkannt wird.
  • Unter verschiedenen Aspekten beschreibt diese Spezifikation ein Multi-Flap-Prime- Editing-System (einschließlich z. B. Dual-Prime-Editing-Systemen und Quadruple-Prime- Editing-Systemen), das die mit der Flap-Äquilibrierung und dem anschließenden Einbau des Edits in den nicht-editierten komplementären genomischen DNA-Strang verbundenen Herausforderungen angeht, indem es beide DNA-Stränge gleichzeitig editiert. Beim Dual- Flap-Prime-Editing-System zum Beispiel werden zwei pegRNAs verwendet, um gegensätzliche Stränge einer genomischen Stelle anzusteuern und die Synthese von zwei komplementären 3'-Flaps zu steuern, die die editierte DNA-Sequenz enthalten (90). Im Gegensatz zum klassischen Prime Editing muss das Paar der editierten DNA-Stränge (3`-Flaps) nicht direkt mit den 5'-Flaps der endogenen genomischen DNA konkurrieren, da stattdessen der komplementäre editierte Strang für die Hybridisierung zur Verfügung steht. Da beide Stränge des Duplex als editierte DNA synthetisiert werden, erübrigt sich beim Dual-Flap- Prime-Editing-System der Austausch des nicht-editierten komplementären DNA-Strangs, der beim klassischen Prime-Editing erforderlich ist. Stattdessen muss die zelluläre DNA- Reparaturmaschinerie nur die gepaarten 5'-Flaps (ursprüngliche genomische DNA) herausschneiden und die gepaarten 3'-Flaps (bearbeitete DNA) in den Lokus einbinden. Daher besteht auch keine Notwendigkeit, in die neu synthetisierten DNA-Stränge Sequenzen aufzunehmen, die homolog zur genomischen DNA sind. Dies ermöglicht eine selektive Hybridisierung der neuen Stränge und erleichtert Bearbeitungen, die eine minimale genomische Homologie enthalten. Nuklease-aktive Versionen von Prime-Editoren, die beide Stränge der DNA schneiden, könnten ebenfalls verwendet werden, um die Entfernung der ursprünglichen DNA-Sequenz zu beschleunigen. Das Quadruple-Flap-Prime-Editing-System, das vier pegRNAs verwendet, bietet ähnliche Vorteile.
  • [1] napDNAbp
  • Die hier beschriebenen Multi-Flap-Prime-Editoren können ein Nukleinsäureprogrammierbares DNA-bindendes Protein (napDNAbp) enthalten.
  • In einem Aspekt kann ein napDNAbp mit mindestens einer Leitnukleinsäure (z. B. Einer Guide-RNA oder einer pegRNA) assoziiert oder komplexiert sein, die das napDNAbp an einer DNA-Sequenz lokalisiert, die einen DNA-Strang (d. H. Einen Zielstrang) umfasst, der komplementär zu der Leitnukleinsäure oder einem Teil davon ist (z. B. Der Spacer einer Guide- RNA, der an den Protospacer des DNA-Ziels bindet). Mit anderen Worten: Die Leitnukleinsäure „programmiert“ das napDNAbp (z. B. Cas9 oder ein Äquivalent) so, dass es die komplementäre Sequenz des Protospacers in der DNA lokalisiert und daran bindet.
  • Jedes geeignete napDNAbp kann in den hier beschriebenen Multi-Flap-Prime-Editoren verwendet werden. In verschiedenen Ausführungsformen kann das napDNAbp ein beliebiges CRISPR-Cas-System der Klasse 2 sein, einschließlich eines CRISPR-Cas-Enzyms vom Typ II, Typ V oder Typ VI. Angesichts der rasanten Entwicklung von CRISPR-Cas als Werkzeug für die Genom-Editierung hat sich die Nomenklatur zur Beschreibung und/oder Identifizierung von CRISPR-Cas-Enzymen, wie Cas9 und Cas9-Orthologe, ständig weiterentwickelt. Diese Anwendung bezieht sich auf CRISPR-Cas-Enzyme mit einer Nomenklatur, die alt und/oder neu sein kann. Der Fachmann wird in der Lage sein, das spezifische CRISPR-Cas-Enzym, auf das in dieser Anwendung Bezug genommen wird, anhand der verwendeten Nomenklatur zu identifizieren, unabhängig davon, ob es sich um eine alte (d. H. „alte“) oder neue Nomenklatur handelt. Die Nomenklatur von CRISPR-Cas wird ausführlich diskutierte in Makarova et al., „Classification and Nomenclature of CRISPR-Cas Systems: Where from Here?,“ The CRISPR Journal, Vol. 1. Nr. 5, 2018, dessen gesamter Inhalt hier durch Bezugnahme aufgenommen wird. Die spezielle CRISPR-Cas-Nomenklatur, die in dieser Anwendung verwendet wird, ist in keiner Weise einschränkend, und der Fachmann wird in der Lage sein zu erkennen, auf welches CRISPR-Cas-Enzym Bezug genommen wird.
  • Zum Beispiel haben die folgenden CRISPR-Cas-Enzyme vom Typ II, Typ V und Typ VI der Klasse 2 die folgenden nach dem Stand der Technik anerkannten alten (d. H. Veralteten) und neuen Namen. Jedes dieser Enzyme und/oder Varianten davon kann mit den hier beschriebenen Multi-Flap-Prime-Editoren verwendet werden:
    Alte Nomenklatur Aktuelle Nomenklatur*
    typ II CRISPR-Cas Enzyme
    Cas9 ebenso
    typ V CRISPR-Cas Enzyme
    Cpfl Cas12a
    CasX Cas12e
    C2c1 Cas12b1
    Cas 12b2 ebenso
    C2c3 Cas12c
    CasY Cas12d
    C2c4 ebenso
    C2c8 ebenso
    C2c5 ebenso
    C2c10 ebenso
    C2c9 ebenso
    typ VI CRISPR-Cas Enzyme
    C2c2 Cas13a
    Cas13d ebenso
    C2c7 Cas13c
    C2c6 Cas13b

    * Siehe Makarova et al., The CRISPR Journal, Vol. 1, No. 5, 2018
  • Ohne an die Theorie gebunden zu sein, schließt der hier betrachtete Wirkmechanismus bestimmter napDNAbp den Schritt der Bildung einer R-Schleife ein, wodurch das napDNAbp das Abwickeln eines doppelsträngigen DNA-Ziels induziert und dadurch die Stränge in der durch das napDNAbp gebundenen Region trennt. Der Guide-RNA-Spacer hybridisiert dann mit dem „Zielstrang“ an der Protospacer-Sequenz. Dadurch wird ein „Nicht-Zielstrang“ verdrängt, der komplementär zum Zielstrang ist, der die Einzelstrangregion der R-Schleife bildet. In einigen Ausführungsformen enthält das napDNAbp eine oder mehrere Nuklease- Aktivitäten, die dann die DNA schneiden und verschiedene Arten von Läsionen hinterlassen. Zum Beispiel kann das napDNAbp eine Nukleaseaktivität aufweisen, die den Nicht-Zielstrang an einer ersten Stelle schneidet und/oder den Zielstrang an einer zweiten Stelle schneidet. Je nach Nukleaseaktivität kann die Ziel-DNA so geschnitten werden, dass ein „Doppelstrangbruch“ entsteht, bei dem beide Stränge geschnitten werden. In anderen Ausführungsformen kann die Ziel-DNA nur an einer einzigen Stelle geschnitten werden, d. H. Die DNA wird an einem Strang „eingekerbt“. Beispiele für napDNAbp mit unterschiedlichen Nuklease-Aktivitäten sind „Cas9 Nickase“ („nCas9“) und ein deaktiviertes Cas9 ohne Nuklease-Aktivitäten („dead Cas9“ oder „dCas9“).
  • Die nachfolgende Beschreibung verschiedener napDNAbps, die in Verbindung mit den hier vorgestellten Multi-Flap-Prime-Editoren verwendet werden können, ist in keiner Weise einschränkend gemeint. Die Multi-Flap-Prime-Editoren können das kanonische SpCas9 oder ein beliebiges orthologes Cas9-Protein oder eine beliebige Variante des Cas9-Proteins umfassen, einschließlich einer natürlich vorkommenden Variante, Mutante oder anderweitig manipulierten Version von Cas9, die bekannt ist oder die durch einen gezielten evolutionären oder anderweitig mutagenen Prozess hergestellt oder entwickelt werden kann. In verschiedenen Ausführungsformen haben die Cas9 oder Cas9-Varianten eine Nickase- Aktivität, d. H. Sie spalten nur einen Strang der Ziel-DNA-Sequenz. In anderen Ausführungsformen haben die Cas9 oder Cas9-Varianten inaktive Nukleasen, d. H. Sie sind „tote“ Cas9-Proteine. Andere Cas9-Varianten, die verwendet werden können, sind solche mit einem geringeren Molekulargewicht als das kanonische SpCas9 (z. B. Zur leichteren Verabreichung) oder mit einer modifizierten oder umgestalteten primären Aminosäurestruktur (z. B. Die zirkulären Permutantenformate).
  • Die hier beschriebenen Multi-Flap-Prime-Editoren können auch Cas9-Äquivalente umfassen, einschließlich Cas12a (Cpfl) und Cas12b1-Proteine, die das Ergebnis einer konvergenten Evolution sind. Die hier verwendeten napDNAbps (z. B. SpCas9, Cas9-Variante oder Cas9-Äquivalente) können auch verschiedene Modifikationen enthalten, die ihre PAM- Spezifizierungen verändern/verbessern. Schließlich umfasst die Anwendung jedes Cas9, jede Cas9-Variante oder jedes Cas9-Äquivalent, das eine Sequenzidentität von mindestens 70 %, mindestens 75 %, mindestens 80 %, mindestens 85 %, mindestens 90 %, mindestens 91 %, mindestens 92 %, mindestens 93 %, mindestens 94 %, mindestens 95 %, mindestens 96 %, mindestens 97 %, mindestens 98 %, mindestens 99 % oder mindestens 99,9 % mit einer Referenz-Cas9-Sequenz, wie einer kanonischen Referenz-SpCas9-Sequenz oder einem Referenz-Cas9-Äquivalent (z. B., Cas12a (Cpfl)) hat.
  • Das napDNAbp kann eine CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeat)-assoziierte Nuklease sein. Wie oben beschrieben, ist CRISPR ein adaptives Immunsystem, das Schutz gegen mobile genetische Elemente (Viren, transponierbare Elemente und konjugative Plasmide) bietet. CRISPR-Cluster enthalten Spacer, d. H. Sequenzen, die komplementär zu vorausgehenden mobilen Elementen sind, und zielen auf eindringende Nukleinsäuren ab. CRISPR-Cluster werden transkribiert und zu CRISPR-RNA (crRNA) verarbeitet. In CRISPR-Systemen vom Typ II erfordert die korrekte Verarbeitung der prä-crRNA eine trans-kodierte kleine RNA (tracrRNA), die endogene Ribonuklease 3 (rnc) und ein Cas9-Protein. Die tracrRNA dient als Leitfaden für die Ribonuklease 3-gestützte Verarbeitung der prä-crRNA. Anschließend schneidet Cas9/crRNA/tracrRNA endonukleolytisch ein lineares oder zirkuläres dsDNA-Ziel, das komplementär zum Spacer ist. Der Zielstrang, der nicht komplementär zur crRNA ist, wird zunächst endonukleolytisch geschnitten und dann exonukleolytisch auf 3'-5' gekürzt. In der Natur werden für die Bindung und Spaltung von DNA normalerweise Proteine und RNAs benötigt. Einzelne Guide-RNAs („sgRNA“ oder einfach „gRNA“) können jedoch so konstruiert werden, dass sie Aspekte sowohl der crRNA als auch der tracrRNA in eine einzige RNA-Spezies einbringen. Siehe z. B. Jinek M. Et al., Science 337:816-821 (2012), dessen gesamter Inhalt hiermit durch Bezugnahme aufgenommen wird.
  • In einigen Ausführungsformen steuert das napDNAbp die Spaltung eines oder beider Stränge an der Stelle einer Zielsequenz, beispielsweise innerhalb der Zielsequenz und/oder innerhalb des Komplements der Zielsequenz. In einigen Ausführungsformen steuert das napDNAbp die Spaltung eines oder beider Stränge innerhalb von etwa 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 50, 100, 200, 500 oder mehr Basenpaaren vom ersten oder letzten Nukleotid einer Zielsequenz. In einigen Ausführungsformen kodiert ein Vektor für ein napDNAbp, das im Vergleich zu einem entsprechenden unmutierten Enzym mutiert ist, so dass dem mutierten napDNAbp die Fähigkeit fehlt, einen oder beide Stränge eines Ziel-Polynukleotids, das eine Zielsequenz enthält, zu spalten. Eine Aspartat-Alanin-Substitution (D10A) in der katalytischen Domäne von RuvC I von Cas9 aus S. Pyogenes verwandelt Cas9 beispielsweise von einer Nuklease, die beide Stränge spaltet, in eine Nickase (die einen einzigen Strang spaltet). Andere Beispiele für Mutationen, die Cas9 zu einer Nickase machen, sind, ohne Einschränkung, H840A, N854A und N863A in Bezug auf die kanonische SpCas9-Sequenz oder äquivalente Aminosäurepositionen in anderen Cas9-Varianten oder Cas9-Äquivalenten.
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „Cas-Protein“ auf ein Cas-Protein in voller Länge, das aus der Natur gewonnen wurde, ein rekombinantes Cas-Protein mit einer Sequenz, die sich von einem natürlich vorkommenden Cas-Protein unterscheidet, oder ein beliebiges Fragment eines Cas-Proteins, das dennoch alle oder eine beträchtliche Menge der erforderlichen grundlegenden Funktionen beibehält, die für die offengelegten Verfahren benötigt werden, d. H. (i) Besitz einer durch Nukleinsäure programmierbaren Bindung des Cas- Proteins an eine Ziel-DNA und (ii) Fähigkeit, die Ziel-DNA-Sequenz auf einem Strang zu nicken. Die hier betrachteten Cas-Proteine umfassen CRISPR Cas9-Proteine sowie Cas9- Äquivalente, Varianten (z. B. Cas9-Nickase (nCas9) oder Nuklease-inaktives Cas9 (dCas9)), Homologe, Orthologe oder Parologe, unabhängig davon, ob sie natürlich vorkommen oder nicht (z. B. Gentechnisch veränderte oder rekombinante) Cas9-Homologe oder Paraloge, und können ein Cas9-Äquivalent aus einem beliebigen CRISPR-System der Klasse 2 (z. B., typ II, V, VI) umfassen, einschließlich Cas12a (Cpfl), Cas12e (CasX), Cas12b1 (C2c1), Cas12b2, Cas12c (C2c3), C2c4, C2c8, C2c5, C2c10, C2c9 Cas13a (C2c2), Cas13d, Cas13c (C2c7), Cas13b (C2c6) und Cas13b. Weitere Cas-Äquivalente sind beschrieben in Makarova et al., „C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector,“ Science 2016; 353(6299) und Makarova et al., „Classification and Nomenclature of CRISPR- Cas Systems: Where from Here?,“ The CRISPR Journal, Vol. 1. Nr. 5, 2018, dessen Inhalt hier durch Bezugnahme aufgenommen wird.
  • Die Begriffe „Cas9“ oder „Cas9-Nuklease“ oder „Cas9-Anteil“ oder „Cas9-Domäne“ umfassen jedes natürlich vorkommende Cas9 aus einem beliebigen Organismus, jedes natürlich vorkommende Cas9-Äquivalent oder funktionelle Fragment davon, jedes Cas9- Homolog, Ortholog oder Paralog aus einem beliebigen Organismus und jede Mutante oder Variante eines Cas9, ob natürlich vorkommend oder künstlich hergestellt. Der Begriff Cas9 ist nicht als besonders einschränkend zu verstehen und kann als „Cas9 oder Äquivalent“ bezeichnet werden. Exemplarische Cas9-Proteine werden hier weiter beschrieben und/oder sind im Stand der Technik beschrieben und werden hier durch Bezugnahme aufgenommen. Die vorliegende Offenbarung ist unbegrenzt in Bezug auf das spezielle Cas9, das in den hier beschriebenen Multi-Flap-Prime-Editoren verwendet wird.
  • Wie bereits erwähnt, sind die Sequenzen und Strukturen der Cas9-Nuklease den Fachleuten gut bekannt (siehe z. B. „Complete genome sequence of an M1 strain of Streptococcus pyogenes“ Ferretti et al., J.J., McShan W.M., Ajdic D.J., Savic D.J., Savic G., Lyon K., Primeaux C., Sezate S., Suvorov A.N., Kenton S., Lai H.S., Lin S.P., Qian Y., Jia H.G., Najar F.Z., Ren Q., Zhu H., Song L., White J., Yuan X., Clifton S.W., Roe B.A., McLaughlin R.E., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98:4658-4663(2001); „CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor Rnase III“ Deltcheva E., Chylinski K., Sharma C.M., Gonzales K., Chao Y., Pirzada Z.A., Eckert M.R., Vogel J., Charpentier E., Nature 471:602-607(2011); und „A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.“ Jinek M., Chylinski K., Fonfara I., Hauer M., Doudna J.A., Charpentier E. Science 337:816-821(2012), deren gesamter Inhalt hier durch Bezugnahme aufgenommen wird).
  • Im Folgenden finden Sie Beispiele für Cas9 und Cas9-Äquivalente; diese spezifischen Beispiele sind jedoch nicht als einschränkend zu verstehen. Die Multi-Flap-Prime-Editoren der vorliegenden Offenbarung können jedes geeignete napDNAbp verwenden, einschließlich jedes geeignete Cas9 oder Cas9-Äquivalent.
  • A. Unmutiertes, kanonisches SpCas9
  • In einer Ausführungsform können die hier beschriebenen Multi-Flap-Prime-Editor- Konstrukte die „kanonische SpCas9“-Nuklease aus S. Pyogenes enthalten, die weithin als Werkzeug für das Genome-Engineering verwendet wird und als Typ-II-Untergruppe von Enzymen der Klasse 2 der CRISPR-Cas-Systeme eingestuft wird. Dieses Cas9-Protein ist ein großes Multidomänen-Protein, das zwei unterschiedliche Nuklease-Domänen enthält. Punktmutationen können in Cas9 eingeführt werden, um eine oder beide Nuklease-Aktivitäten auszuschalten. Das Ergebnis ist ein Nickase-Cas9 (nCas9) bzw. Ein totes Cas9 (dCas9), das immer noch in der Lage ist, DNA auf eine sgRNA-programmierte Weise zu binden. Im Prinzip kann Cas9 oder eine Variante davon (z. B. nCas9), wenn es mit einem anderen Protein oder einer Domäne fusioniert ist, dieses Protein durch Koexpression mit einer geeigneten sgRNA auf praktisch jede DNA-Sequenz ausrichten. Wie hier verwendet, bezieht sich das kanonische SpCas9-Protein auf das unmutierte Protein von Streptococcus pyogenes mit der folgenden Aminosäuresequenz:
    Beschreibung Sequenz SEQ- ID-NR.:
    SpCas9 Streptococcus pyogenes M1 SwissProt- Hinterlegungs nummer Q99ZW2 unmutiert
    Figure DE112021002672T5_0014
    		 SEQ- ID-NR.: 18
    SpCas9 Umgekehrte Übersetzung von SwissProt Hinterlegungs nummer Q99ZW2 Streptococcus pyogenes
    Figure DE112021002672T5_0015
    		 SEQ- ID-NR.: 19
    Figure DE112021002672T5_0016
    Figure DE112021002672T5_0017
  • Die hier beschriebenen Multi-Flap-Prime-Editoren können kanonisches SpCas9 oder eine beliebige Variante davon enthalten, die mindestens 80 %, mindestens 85 %, mindestens 90 %, mindestens 95 % oder mindestens 99 % Sequenzidentität mit einer oben angegebenen, unmutierten Cas9-Sequenz aufweist. Diese Varianten können SpCas9-Varianten umfassen, die eine oder mehrere Mutationen enthalten, einschließlich aller bekannten Mutationen, die unter der SwissProt-Hinterlegungsnr. Q99ZW2 (SEQ-ID-NR.: 18) im Eintrag vermerkt ist, der Folgendes enthält:
    SpCas9-Mutation (relativ zu der Aminosäuresequenz der kanonischen Funktion/Eigenschaft (wie berichtet) (siehe UniProtKB - Q99ZW2 (CAS9_STRPT1)
    SpCas9-Sequenz, SEQ-ID-NR.: 18) Eintrag - hier durch Bezugnahme aufgenommen)
    D10A Nickase-Mutante, die den Protospacer-Strang spaltet (aber keine Spaltung des Nicht- Protospacer-Strangs)
    S15A Verminderte DNA-Spaltungsaktivität
    R66A Verminderte DNA-Spaltungsaktivität
    R70A Keine DNA-Spaltung
    R74A Verminderte DNA-Spaltung
    R78A Verminderte DNA-Spaltung
    97-150 Deletion Keine Nuklease-Aktivität
    R165A Verminderte DNA-Spaltung
    175-307 Deletion Etwa 50 % weniger DNA-Spaltung
    312-409 Deletion Keine Nuklease-Aktivität
    E762A Nickase
    H840A Nickase-Mutante, die den Nicht-Protospacer- Strang spaltet, aber den Protospacer-Strang nicht spaltet
    N854A Nickase
    N863A Nickase
    H982A Verminderte DNA-Spaltung
    D986A Nickase
    1099-1368 Deletion Keine Nuklease-Aktivität
    R1333A Reduzierte DNA-Bindung
  • Andere unmutierte SpCas9-Sequenzen, die in der vorliegenden Offenbarung verwendet werden können, umfassen:
    Beschreibung Sequenz SEQ-ID- NR.:
    SpCas9 Streptococcus pyogenes MGAS1882 unmutiert NC_017053.1
    Figure DE112021002672T5_0018
    		 SEQ-ID- NR.: 20
    Figure DE112021002672T5_0019
    Figure DE112021002672T5_0020
    SpCas9 Streptococcus pyogenes MGAS1882 unmutiert NC_017053.1
    Figure DE112021002672T5_0021
    		 SEQ-ID- NR.: 21
    SpCas9 Streptococcus pyogenes unmutiert SWBC2D7W 014
    Figure DE112021002672T5_0022
    		 SEQ-ID- NR.: 22
    Figure DE112021002672T5_0023
    Figure DE112021002672T5_0024
    SpCas9 Streptococcus pyogenes unmutiert Kodiertes Produkt von SWBC2D7W 014
    Figure DE112021002672T5_0025
    		 SEQ-ID- NR.: 23
    Figure DE112021002672T5_0026
    SpCas9 Streptococcus pyogenes M1GAS unmutiert NC_002737.2
    Figure DE112021002672T5_0027
    		 SEQ-ID- NR.: 24
    Figure DE112021002672T5_0028
    Figure DE112021002672T5_0029
    SpCas9 Streptococcus pyogenes M1GAS unmutiert Kodiertes Produkt von NC_002737.2 (100 % identisch mit dem kanonischen Q99ZW2 unmutiert)
    Figure DE112021002672T5_0030
    		 SEQ-ID- NR.: 25
  • Die hier beschriebenen Multi-Flap-Prime-Editoren können jede der oben genannten SpCas9-Sequenzen oder jede Variante davon mit mindestens 80 %, mindestens 85 %, mindestens 90 %, mindestens 95 % oder mindestens 99 % Sequenzidentität dazu enthalten.
  • B. unmutierte Cas9 Orthologe
  • In anderen Ausführungsformen kann das Cas9-Protein ein unmutiertes Cas9-Ortholog aus einer anderen bakteriellen Spezies als das kanonische Cas9 aus S. pyogenes sein. Zum Beispiel können die folgenden Cas9-Orthologe in Verbindung mit den in dieser Spezifikation beschriebenen Multi-Flap-Prime-Editor-Konstrukten verwendet werden. Darüber hinaus kann jede Cas9-Ortholog-Variante, die mindestens 80 %, mindestens 85 %, mindestens 90 %, mindestens 95 % oder mindestens 99 % Sequenzidentität mit einem der unten genannten Orthologe aufweist, auch mit den Multi-Flap-Prime-Editoren verwendet werden.
    Beschreibung Sequenz
    LfCas9 Lactobacillus fermentum unmutiert GenBank: SNX31424.1 1
    Figure DE112021002672T5_0031
    Beschreibung Sequenz
    SaCas9 Staphylococcus aureus unmutiert GenBank: AYD60528.1
    Figure DE112021002672T5_0032
    SaCas9 Staphylococcus aureus
    Figure DE112021002672T5_0033
    Beschreibung Sequenz
    StCas9 Streptococcus thermophilus UniProtKB/S wiss-Prot: G3ECR1.2 unmutiert
    Figure DE112021002672T5_0034
    LcCas9 Lactobacillus crispatus NCBI- Referenzsequenz: WP_1334780 44.1 unmutiert
    Figure DE112021002672T5_0035
    Beschreibung Sequenz
    PdCas9 Pedicoccus damnosus NCBI- Referenzsequenz: WP_0629132 73.1 unmutiert
    Figure DE112021002672T5_0036
    FnCas9 Fusobaterium nucleatum NCBI- Referenzsequenz: WP_0607989 84.1
    Figure DE112021002672T5_0037
    Beschreibung Sequenz
    EcCas9 Enterococcus cecorum NCBI- Referenzsequenz: WP_0473385 01.1 unmutiert
    Figure DE112021002672T5_0038
    AhCas9 Anaerostipes hadrus NCBI- Referenzsequenz: WP_0449242 78.1 unmutiert
    Figure DE112021002672T5_0039
    Beschreibung Sequenz
    KvCas9 Kandleria vitulina NCBI- Referenzsequenz: WP_0315899 69.1 unmutiert
    Figure DE112021002672T5_0040
    EfCas9 Enterococcus faecalis NCBI- Referenzsequenz: WP _0166310 44.1 unmutiert
    Figure DE112021002672T5_0041
    Beschreibung Sequenz
    Staphylococcus aureus Cas9
    Figure DE112021002672T5_0042
    Geobacillus thermodenitrificans Cas9
    Figure DE112021002672T5_0043
    Beschreibung Sequenz
    ScCas9
    Figure DE112021002672T5_0044
    S. canis
    1375 AA
    159.2 kDa
  • Die hier beschriebenen Multi-Flap-Prime-Editoren können jede der oben genannten Cas9-Ortholog-Sequenzen oder jede Variante davon enthalten, die mindestens 80 %, mindestens 85 %, mindestens 90 %, mindestens 95 % oder mindestens 99 % Sequenzidentität damit aufweist.
  • Das napDNAbp kann alle geeigneten Homologe und/oder Orthologe oder natürlich vorkommende Enzyme, wie Cas9, enthalten. Cas9-Homologe und/oder -Orthologe wurden in verschiedenen Spezies beschrieben, einschließlich, aber nicht beschränkt auf S. pyogenes und S. thermophilus. Vorzugsweise ist die Cas-Einheit als Nickase konfiguriert (z. B. mutiert, rekombinant hergestellt oder anderweitig aus der Natur gewonnen), d. h. sie ist in der Lage, nur einen einzigen Strang der doppelsträngigen Ziel-DNA zu spalten. Weitere geeignete Cas9- Nukleasen und -Sequenzen sind für Fachleute auf der Grundlage dieser Erfindung offensichtlich. Zu diesen Cas9-Nukleasen und -Sequenzen gehören Cas9-Sequenzen aus den Organismen und Loci, die in Chylinski, Rhun und Charpentier, „The tracrRNA and Cas9 families of type II CRISPR-Cas immunity systems“ (2013) RNA Biology 10:5, 726-737, offengelegt sind; der gesamte Inhalt dieses Dokuments wird hier durch Bezugnahme aufgenommen. In einigen Ausführungsformen hat eine Cas9-Nuklease eine inaktive (z. B. eine inaktivierte) DNA-Spaltungsdomäne, d. h. die Cas9 ist eine Nickase. In einigen Ausführungsformen umfasst das Cas9-Protein eine Aminosäuresequenz, die zu mindestens 80 % mit der Aminosäuresequenz eines Cas9-Proteins identisch ist, wie sie von einer der Varianten in Tabelle 3 bereitgestellt wird. In einigen Ausführungsformen umfasst das Cas9- Protein eine Aminosäuresequenz, die zu mindestens 85 %, mindestens 90 %, mindestens 92 %, mindestens 95 %, mindestens 96 %, mindestens 97 %, mindestens 98 %, mindestens 99 % oder mindestens 99,5 % mit der Aminosäuresequenz eines Cas9-Proteins identisch ist, wie sie von einem der Cas9-Orthologen in den obigen Tabellen bereitgestellt wird.
  • C. Tote Cas9 Variante
  • In bestimmten Ausführungsformen können die hier beschriebenen Multi-Flap-Prime- Editoren ein totes Cas9, z. B. totes SpCas9, enthalten, das aufgrund einer oder mehrerer Mutationen, die beide Nuklease-Domänen von Cas9, nämlich die RuvC-Domäne (die den Nicht-Protospacer-DNA-Strang spaltet) und die HNH-Domäne (die den Protospacer-DNA- Strang spaltet), inaktivieren, keine Nuklease-Aktivität besitzt. Die Nuklease-Inaktivierung kann auf eine oder mehrere Mutationen zurückzuführen sein, die zu einer oder mehreren Substitutionen und/oder Deletionen in der Aminosäuresequenz des kodierten Proteins oder einer beliebigen Variante davon führen, die mindestens 80 %, mindestens 85 %, mindestens 90 %, mindestens 95 % oder mindestens 99 % Sequenzidentität dazu aufweist.
  • Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „dCas9“ auf ein Nuklease-inaktives Cas9 oder Nuklease-totes Cas9 oder ein funktionelles Fragment davon und umfasst jedes natürlich vorkommende dCas9 aus einem beliebigen Organismus, jedes natürlich vorkommende dCas9- Äquivalent oder funktionelle Fragment davon, jedes dCas9-Homolog, Ortholog oder Paralog aus einem beliebigen Organismus und jede Mutante oder Variante eines dCas9, ob natürlich vorkommend oder künstlich hergestellt. Der Begriff dCas9 ist nicht als besonders einschränkend zu verstehen und kann als „dCas9 oder Äquivalent“ bezeichnet werden Beispielhafte dCas9-Proteine und Verfahren zur Herstellung von dCas9-Proteinen sind hier weiter beschrieben und/oder in der Fachliteratur beschrieben und werden hier durch Bezugnahme aufgenommen.
  • In anderen Ausführungsformen entspricht dCas9 einer Cas9-Aminosäuresequenz mit einer oder mehreren Mutationen, die die Cas9-Nukleaseaktivität inaktivieren, oder umfasst diese ganz oder teilweise. In anderen Ausführungsformen werden Cas9-Varianten mit anderen Mutationen als D10A und H840A bereitgestellt, die zu einer vollständigen oder teilweisen Inaktivierung der endogenen Cas9-Nukleaseaktivität führen können (z. B. nCas9 bzw. dCas9). Solche Mutationen umfassen beispielsweise andere Aminosäure-Substitutionen an D10 und H840 oder andere Substitutionen innerhalb der Nuklease-Domänen von Cas9 (z. B. Substitutionen in der HNH-Nuklease-Subdomäne und/oder der RuvC1-Subdomäne) im Vergleich zu einer unmutierten Sequenz wie Cas9 aus Streptococcus pyogenes (NCBI Referenzsequenz: NC_017053.1). In einigen Ausführungsformen werden Varianten oder Homologe von Cas9 (z. B. Varianten von Cas9 aus Streptococcus pyogenes (NCBI Reference Sequence: NC_017053.1 (SEQ-ID-NR.: 20)) zur Verfügung gestellt, die mindestens etwa 70 % identisch, mindestens etwa 80 % identisch, mindestens etwa 90 % identisch, mindestens etwa 95 % identisch, mindestens etwa 98 % identisch, mindestens etwa 99 % identisch, mindestens etwa 99,5 % identisch oder mindestens etwa 99,9 % identisch mit der NCBI Referenzsequenz sind: NC_017053.1. In einigen Ausführungsformen werden Varianten von dCas9 (z. B. Varianten der NCBI-Referenzsequenz: NC_017053.1 (SEQ-ID-NR.: 20)) mit Aminosäuresequenzen bereitgestellt, die kürzer oder länger sind als NC_017053.1 (SEQ-ID- NR.: 20) um etwa 5 Aminosäuren, um etwa 10 Aminosäuren, um etwa 15 Aminosäuren, um etwa 20 Aminosäuren, um etwa 25 Aminosäuren, um etwa 30 Aminosäuren, um etwa 40 Aminosäuren, um etwa 50 Aminosäuren, um etwa 75 Aminosäuren, um etwa 100 Aminosäuren oder mehr.
  • In einer Ausführungsform kann das tote Cas9 auf der kanonischen SpCas9-Sequenz von Q99ZW2 basieren und die folgende Sequenz aufweisen, die ein D10X und ein H810X umfasst, wobei X eine beliebige Aminosäure, Substitutionen (unterstrichen und fett gedruckt) oder eine Variante von SEQ-ID-NR.: 40 sein kann mit mindestens 80 %, mindestens 85 %, mindestens 90 %, mindestens 95 % oder mindestens 99 % Sequenzidentität dazu.
  • In einer Ausführungsform kann das tote Cas9 auf der kanonischen SpCas9-Sequenz von Q99ZW2 basieren und die folgende Sequenz aufweisen, die eine D10A- und eine H810A- Substitution (unterstrichen und fettgedruckt) umfasst, oder eine Variante von SEQ-ID-NR.: 41 mit mindestens 80 %, mindestens 85 %, mindestens 90 %, mindestens 95 % oder mindestens 99 % Sequenzidentität zu ihm.
    Beschreibung Sequenz SEQ-ID-NR.:
    totes Cas9 oder dCas9
    Figure DE112021002672T5_0045
    		 SEQ-ID-NR: 40
    Streptococcus pyogenes Q99ZW2 Cas9 mit D10 X und H810 X
    Wobei „X“ eine beliebige Aminosäure ist
    totes Cas9 oder dCas9
    Figure DE112021002672T5_0046
    		 SEQ-ID-NR: 41
    Streptococcus pyogenes Q99ZW2 Cas9 mit D10A und H810A
    Beschreibung Sequenz SEQ-ID-NR.:
    Figure DE112021002672T5_0047
  • D. Cas9-Nickase-Variante
  • In einer Ausführungsform umfassen die hier beschriebenen Multi-Flap-Prime-Editoren eine Cas9-Nickase. Der Begriff „Cas9-Nickase“ oder „nCas9“ bezieht sich auf eine Variante von Cas9, die in der Lage ist, einen Einzelstrangbruch in ein Doppelstrang-DNA-Molekül als Ziel einzuführen. In einigen Ausführungsformen umfasst die Cas9-Nickase nur eine einzige funktionierende Nuklease-Domäne. Der unmutierte Typ von Cas9 (z. B. das kanonische SpCas9) umfasst zwei separate Nuklease-Domänen, nämlich die RuvC-Domäne (die den Nicht-Protospacer-DNA-Strang spaltet) und die HNH-Domäne (die den Protospacer-DNA- Strang spaltet). In einer Ausführungsform umfasst die Cas9-Nickase eine Mutation in der RuvC-Domäne, die die RuvC-Nukleaseaktivität inaktiviert. Zum Beispiel wurden Mutationen in Aspartat (D) 10, Histidin (H) 983, Aspartat (D) 986 oder Glutamat (E) 762 als Loss-of- Function-Mutationen der RuvC-Nuklease-Domäne und die Schaffung einer funktionellen Cas9-Nickase gemeldet (z. B. Nishimasu et al., „Crystal structure of Cas9 in complex with guide RNA and target DNA“, Cell 156(5), 935-949, das hier durch Bezugnahme aufgenommen ist). So könnten Nickase-Mutationen in der RuvC-Domäne D10X, H983X, D986X oder E762X umfassen, wobei X eine beliebige Aminosäure außer der unmutierten Aminosäure ist. In bestimmten Ausführungsformen könnte die Nickase D10A, H983A, D986A oder E762A oder eine Kombination davon sein.
  • In verschiedenen Ausführungsformen kann die Cas9-Nickase eine Mutation in der RuvC-Nuklease-Domäne aufweisen und eine der folgenden Aminosäuresequenzen oder eine Variante davon mit einer Aminosäuresequenz haben, die mindestens 80 %, mindestens 85 %, mindestens 90 %, mindestens 95 % oder mindestens 99 % Sequenzidentität dazu aufweist.
    Beschreibung Sequenz SEQ-ID-NR.:
    Cas9-Nickase
    Figure DE112021002672T5_0048
    		 SEQ-ID-NR: 42
    Streptococcus pyogenes Q99ZW2 Cas9 mit D10X, wobei X eine beliebige alternative Aminosäure ist
    Beschreibung Sequenz SEQ-ID-NR.:
    Cas9-Nickase
    Figure DE112021002672T5_0049
    		 SEQ-ID-NR: 43
    Streptococcus pyogenes Q99ZW2 Cas9 mit E762X, wobei X eine beliebige alternative Aminosäure ist
    Beschreibung Sequenz SEQ-ID-NR.:
    Cas9-Nickase
    Figure DE112021002672T5_0050
    		 SEQ-ID-NR: 44
    Streptococcus pyogenes Q99ZW2 Cas9 mit H983X, wobei X eine beliebige alternative Aminosäure ist
    Cas9-Nickase
    Figure DE112021002672T5_0051
    		 SEQ-ID-NR: 45
    Streptococcus pyogenes Q99ZW2 Cas9 mit D986X, wobei X eine beliebige alternative Aminosäure ist
    Beschreibung Sequenz SEQ-ID-NR.:
    Figure DE112021002672T5_0052
    Cas9-Nickase
    Figure DE112021002672T5_0053
    		 SEQ-ID-NR: 46
    Streptococcus pyogenes Q99ZW2 Cas9 mit D10 A
    Beschreibung Sequenz SEQ-ID-NR.:
    Figure DE112021002672T5_0054
    Cas9-Nickase
    Figure DE112021002672T5_0055
    		 SEQ-ID-NR: 47
    Streptococcus pyogenes Q99ZW2 Cas9 mit E762A
    Beschreibung Sequenz SEQ-ID-NR.:
    Cas9-Nickase
    Figure DE112021002672T5_0056
    		 SEQ-ID-NR: 48
    Streptococcus pyogenes Q99ZW2 Cas9 mit H983A
    Beschreibung Sequenz SEQ-ID-NR.:
    Cas9-Nickase
    Figure DE112021002672T5_0057
    		 SEQ-ID-NR: 49
    Streptococcus pyogenes Q99ZW2 Cas9 mit D986A
  • In einer anderen Ausführungsform umfasst die Cas9-Nickase eine Mutation in der HNH-Domäne, die die HNH-Nukleaseaktivität inaktiviert. Zum Beispiel wurden Mutationen in Histidin (H) 840 oder Asparagin (R) 863 als Loss-of-Function-Mutationen der HNH- Nuklease-Domäne und die Schaffung einer funktionellen Cas9-Nickase berichtet (z. B. Nishimasu et al., „Crystal structure of Cas9 in complex with guide RNA and target DNA“, Cell 156(5), 935-949, das hier durch Bezugnahme aufgenommen ist). So könnten Nickase- Mutationen in der HNH-Domäne H840X und R863X umfassen, wobei X eine beliebige Aminosäure außer der unmutierten Aminosäure ist. In bestimmten Ausführungsformen könnte die Nickase H840A oder R863A oder eine Kombination davon sein.
  • In verschiedenen Ausführungsformen kann die Cas9-Nickase eine Mutation in der HNH-Nuklease-Domäne aufweisen und eine der folgenden Aminosäuresequenzen oder eine Variante davon mit einer Aminosäuresequenz haben, die mindestens 80 %, mindestens 85 %, mindestens 90 %, mindestens 95 % oder mindestens 99 % Sequenzidentität dazu aufweist.
    Beschreibung Sequenz SEQ-ID-NR.:
    Cas9-Nickase
    Figure DE112021002672T5_0058
    		 SEQ-ID-NR: 50
    Streptococcus pyogenes Q99ZW2 Cas9 mit H840 X , wobei X eine beliebige alternative Aminosäure ist
    Cas9-Nickase
    Figure DE112021002672T5_0059
    		 SEQ-ID-NR: 51
    Streptococcus pyogenes Q99ZW2 Cas9 mit H840 A
    Figure DE112021002672T5_0060
    Cas9-Nickase
    Figure DE112021002672T5_0061
    		 SEQ-ID-NR: 52
    Streptococcus pyogenes Q99ZW2 Cas9 mit R863X, wobei X eine beliebige alternative Aminosäure ist
    Figure DE112021002672T5_0062
    Cas9-Nickase
    Figure DE112021002672T5_0063
    		 SEQ-ID-NR: 53
    Streptococcus pyogenes Q99ZW2 Cas9 mit R863 A
  • In einigen Ausführungsformen wird das N-terminale Methionin aus einer Cas9-Nickase oder aus einer Cas9-Variante, einem Ortholog oder einem Äquivalent, das hier offenbart oder in Erwägung gezogen wird, entfernt. Zu den Methionin-Minus-Cas9-Nickasen gehören beispielsweise die folgenden Sequenzen oder eine Variante davon mit einer Aminosäuresequenz, die mindestens 80 %, mindestens 85 %, mindestens 90 %, mindestens 95 % oder mindestens 99 % Sequenzidentität damit aufweist.
    Beschreibung Sequenz
    Cas9-Nickase (Met minus)
    Figure DE112021002672T5_0064
    Streptococcus pyogenes Q99ZW2 Cas9 mit H840 X , wobei X eine beliebige alternative Aminosäure ist
    Cas9-Nickase (Met minus)
    Figure DE112021002672T5_0065
    Streptococcus pyogenes Q99ZW2 Cas9 mit H840 A
    Cas9-Nickase (Met minus)
    Figure DE112021002672T5_0066
    Streptococcus pyogenes Q99ZW2 Cas9 mit R863X, wobei X eine beliebige alternative Aminosäure ist
    Cas9-Nickase (Met minus)
    Figure DE112021002672T5_0067
    Streptococcus pyogenes Q99ZW2 Cas9 mit R863 A
  • E. Andere Cas9-Varianten
  • Neben toten Cas9- und Cas9-Nickase-Varianten können die hier verwendeten Cas9- Proteine auch andere „Cas9-Varianten“ umfassen, die zu mindestens etwa 70 %, mindestens etwa 80 %, mindestens etwa 90 %, mindestens etwa 95 %, mindestens etwa 96 %, mindestens etwa 97 %, mindestens etwa 98 %, mindestens etwa 99 %, mindestens etwa 99,5 % oder mindestens etwa 99,9 % mit einem beliebigen Referenz-Cas9-Protein identisch sind, einschließlich eines unmutierten Cas9 oder eines mutierten Cas9 (z. B., ein totes Cas9 oder eine Cas9-Nickase) oder ein Fragment-Cas9 oder ein zirkuläres permutantes Cas9 oder eine andere Cas9-Variante, die hier offenbart wird oder in der Technik bekannt ist. In einigen Ausführungsformen kann eine Cas9-Variante 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 21, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 oder mehr Aminosäureänderungen im Vergleich zu einem Referenz-Cas9 aufweisen. In einigen Ausführungsformen umfasst die Cas9-Variante ein Fragment eines Referenz-Cas9 (z. B. eine gRNA-Bindungsdomäne oder eine DNA- Spaltungsdomäne), so dass das Fragment zu mindestens etwa 70 % identisch, zu mindestens etwa 80 % identisch, zu mindestens etwa 90 % identisch, zu mindestens etwa 95 % identisch, zu mindestens etwa 96 % identisch, zu mindestens etwa 97 % identisch, zu mindestens etwa 98 % identisch, zu mindestens etwa 99 % identisch, zu mindestens etwa 99,5 % identisch oder zu mindestens etwa 99,9 % identisch mit dem entsprechenden Fragment des unmutierten Cas9 ist. In einigen Ausführungsformen ist das Fragment mindestens 30 %, mindestens 35 %, mindestens 40 %, mindestens 45 %, mindestens 50 %, mindestens 55 %, mindestens 60 %, mindestens 65 %, mindestens 70 %, mindestens 75 %, mindestens 80 %, mindestens 85 %, mindestens 90 %, mindestens 95 % identisch, mindestens 96 %, mindestens 97 %, mindestens 98 %, mindestens 99 % oder mindestens 99,5 % der Aminosäurelänge eines entsprechenden, unmutierten Cas9 (z. B. SEQ-ID-NR.: 18).
  • In einigen Ausführungsformen kann die Offenlegung auch Cas9-Fragmente verwenden, die ihre Funktionalität beibehalten und die Fragmente eines hierin offengelegten Cas9-Proteins sind. In einigen Ausführungsformen ist das Cas9-Fragment mindestens 100 Aminosäuren lang. In einigen Ausführungsformen hat das Fragment eine Länge von mindestens 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250 oder mindestens 1300 Aminosäuren.
  • In verschiedenen Ausführungsformen können die hier offengelegten Multi-Flap-Prime- Editoren eine der nachfolgend beschriebenen Cas9-Varianten oder eine Cas9-Variante davon umfassen, die mindestens zu etwa 70 %, mindestens zu etwa 80 %, mindestens zu etwa 90 %, mindestens zu etwa 95 %, mindestens zu etwa 96 %, mindestens zu etwa 97 %, mindestens zu etwa 98 %, mindestens zu etwa 99 %, mindestens zu etwa 99,5 % oder mindestens zu etwa 99,9 % mit einer beliebigen Referenz-Cas9-Variante identisch ist.
  • F. Kleinere Cas9-Varianten
  • In einigen Ausführungsformen können die hier betrachteten Multi-Flap-Prime-Editoren ein Cas9-Protein enthalten, das ein geringeres Molekulargewicht hat als die kanonische SpCas9-Sequenz. In einigen Ausführungsformen können die kleineren Cas9-Varianten die Einbringung in Zellen erleichtern, z. B. durch einen Expressionsvektor, Nanopartikel oder andere Einbringungsmittel. In bestimmten Ausführungsformen können die kleineren Cas9- Varianten Enzyme umfassen, die als Typ-II-Enzyme der Klasse-2-CRISPR-Cas-Systeme kategorisiert sind. In einigen Ausführungsformen können die kleineren Cas9-Varianten Enzyme umfassen, die als Typ-V-Enzyme der Klasse 2 CRISPR-Cas-Systeme kategorisiert sind. In anderen Ausführungsformen können die kleineren Cas9-Varianten Enzyme umfassen, die als Typ VI-Enzyme der Klasse 2 CRISPR-Cas-Systeme eingestuft werden.
  • Das kanonische SpCas9-Protein ist 1368 Aminosäuren lang und hat ein vorhergesagtes Molekulargewicht von 158 Kilodalton. Der Begriff „kleine Cas9-Variante“, wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf jede Cas9-Variante - natürlich vorkommend, konstruiert oder anderweitig -, die weniger als mindestens 1300 Aminosäuren, oder mindestens weniger als 1290 Aminosäuren, oder weniger als 1280 Aminosäuren, oder weniger als 1270 Aminosäuren, oder weniger als 1260 Aminosäuren, oder weniger als 1250 Aminosäuren, oder weniger als 1240 Aminosäuren, oder weniger als 1230 Aminosäuren, oder weniger als 1220 Aminosäuren, oder weniger als 1210 Aminosäuren, oder weniger als 1200 Aminosäuren, oder weniger als 1190 Aminosäuren, oder weniger als 1180 Aminosäuren, oder weniger als 1170 Aminosäuren, oder weniger als 1160 Aminosäuren, oder weniger als 1150 Aminosäuren, oder weniger als 1140 Aminosäuren, oder weniger als 1130 Aminosäuren, oder weniger als 1120 Aminosäuren, oder weniger als 1110 Aminosäuren, oder weniger als 1100 Aminosäuren, oder weniger als 1050 Aminosäuren, oder weniger als 1000 Aminosäuren, oder weniger als 950 Aminosäuren, oder weniger als 900 Aminosäuren, oder weniger als 850 Aminosäuren, oder weniger als 800 Aminosäuren, oder weniger als 750 Aminosäuren, oder weniger als 700 Aminosäuren, oder weniger als 650 Aminosäuren, oder weniger als 600 Aminosäuren, oder weniger als 550 Aminosäuren, oder weniger als 500 Aminosäuren aufweist, aber mindestens größer als etwa 400 Aminosäuren ist und unter Beibehaltung der erforderlichen Funktionen des Cas9-Proteins. Die Cas9-Varianten können als Typ II, Typ V oder Typ VI Enzyme des Klasse 2 CRISPR-Cas Systems kategorisiert werden.
  • In verschiedenen Ausführungsformen können die hier offengelegten Multi-Flap-Prime- Editoren eine der nachfolgend beschriebenen Cas9-Varianten in kleiner Größe oder eine Cas9- Variante davon umfassen, die zu mindestens etwa 70 %, mindestens etwa 80 %, mindestens etwa 90 %, mindestens etwa 95 %, mindestens etwa 96 %, mindestens etwa 97 %, mindestens etwa 98 %, mindestens etwa 99 %, mindestens etwa 99,5 % oder mindestens etwa 99,9 % mit einem beliebigen Referenz-Cas9-Protein in kleiner Größe identisch ist.
    Beschreibung Sequenz SEQ-ID-NR.:
    SaCas9
    Figure DE112021002672T5_0068
    		 SEQ-ID-NR: 58
    Staphylococcus aureus
    1053 AA
    123 kDa
    NmeCas9
    Figure DE112021002672T5_0069
    		 SEQ-ID-NR: 59
    N. meningitidis
    1083 AA
    124.5 kDa
    CjCas9
    Figure DE112021002672T5_0070
    		 SEQ-ID-NR: 60
    C. jejuni
    984 AA
    114,9 kDa
    GeoCas9
    Figure DE112021002672T5_0071
    		 SEQ-ID-NR: 61
    G. stearothermophilus
    Figure DE112021002672T5_0072
    1087 AA
    127 kDa
    LbaCas 12a
    Figure DE112021002672T5_0073
    		 SEQ-ID-NR: 62
    L. Bakterium
    1228 AA
    143,9 kDa
    BhCas12b
    Figure DE112021002672T5_0074
    		 SEQ-ID-NRR: 63
    B. hisashii
    1108 AA
    130,4 kDa
  • G. Cas9-Äquivalente
  • In einigen Ausführungsformen können die hier beschriebenen Multi-Flap-Prime- Editoren jedes Cas9-Äquivalent enthalten. Wie hier verwendet, ist der Begriff „Cas9- Äquivalent“ ein weit gefasster Begriff, der jedes napDNAbp-Protein umfasst, das die gleiche Funktion wie Cas9 in den vorliegenden Multi-Flap-Prime-Editoren erfüllt, obwohl seine primäre Aminosäuresequenz und/oder seine dreidimensionale Struktur aus evolutionärer Sicht unterschiedlich und/oder nicht verwandt sein kann. Während Cas9-Äquivalente also jedes Cas9-Ortholog, -Homolog, -Mutant oder -Variante umfassen, die hierin beschrieben oder einbezogen sind und die evolutionär verwandt sind, umfassen die Cas9-Äquivalente auch Proteine, die sich durch konvergente Evolutionsprozesse entwickelt haben können, um die gleiche oder eine ähnliche Funktion wie Cas9 zu haben, die aber nicht notwendigerweise eine Ähnlichkeit in Bezug auf die Aminosäuresequenz und/oder die dreidimensionale Struktur aufweisen. Die hier beschriebenen Multi-Flap-Prime-Editoren umfassen jedes Cas9- Äquivalent, das die gleiche oder eine ähnliche Funktion wie Cas9 bietet, auch wenn das Cas9- Äquivalent auf einem Protein basiert, das durch konvergente Evolution entstanden ist. Wenn sich Cas9 beispielsweise auf ein Typ II-Enzym des CRISPR-Cas-Systems bezieht, kann sich ein Cas9-Äquivalent auf ein Typ V- oder Typ VI-Enzym des CRISPR-Cas-Systems beziehen.
  • Cas12e (CasX) zum Beispiel ist ein Cas9-Äquivalent, das Berichten zufolge die gleiche Funktion wie Cas9 hat, sich aber durch konvergente Evolution entwickelt hat. So ist das Cas12e (CasX) Protein, das in Liu et al., „CasX enzymes comprises a distinct family of RNA- guided genome editors“, Nature, 2019, Vol.566: 218-223 beschrieben wird, für die Verwendung mit den hier beschriebenen Multi-Flap-Prime-Editoren vorgesehen. Darüber hinaus ist jede Variante oder Modifikation von Cas12e (CasX) denkbar und liegt im Rahmen der vorliegenden Offenbarung.
  • Cas9 ist ein bakterielles Enzym, das sich in einer Vielzahl von Arten entwickelt hat. Die hier in Betracht gezogenen Cas9-Äquivalente können jedoch auch aus Archaeen gewonnen werden, die eine andere Domäne und ein anderes Reich einzelliger prokaryotischer Mikroben als Bakterien darstellen.
  • In einigen Ausführungsformen können sich Cas9-Äquivalente auf Cas12e (CasX) oder Cas12d (CasY) beziehen, die z. B. beschrieben wurden in Burstein et al., „New CRISPR-Cas systems from uncultivated microbes“ Cell Res. 2017 Feb 21. doi: 10.1038/cr.2017.21, dessen gesamter Inhalt hiermit durch Verweis einbezogen wird. Mithilfe der genomaufgelösten Metagenomik wurde eine Reihe von CRISPR-Cas-Systemen identifiziert, darunter das erste Cas9, das in der archäischen Lebensdomäne gefunden wurde. Dieses abweichende Cas9- Protein wurde in wenig untersuchten Nanoarchaea als Teil eines aktiven CRISPR-Cas-Systems gefunden. In Bakterien wurden zwei bisher unbekannte Systeme entdeckt, CRISPR-Cas12e und CRISPR-Cas12d, die zu den kompaktesten Systemen gehören, die bisher entdeckt wurden. In einigen Ausführungsformen bezieht sich Cas9 auf Cas12e oder eine Variante von Cas12e. In einigen Ausführungsformen bezieht sich Cas9 auf Cas12d oder eine Variante von Cas12d. Es ist zu beachten, dass auch andere RNA-gesteuerte DNA-Bindungsproteine als Nukleinsäure-programmierbares DNA-Bindungsprotein (napDNAbp) verwendet werden können und in den Anwendungsbereich dieser Offenbarung fallen. Siehe auch Liu et al., „CasX enzymes comprises a distinct family of RNA-guided genome editors“, Nature, 2019, Vol.566: 218-223. Jedes dieser Cas9-Äquivalente ist denkbar.
  • In einigen Ausführungsformen umfasst das Cas9-Äquivalent eine Aminosäuresequenz, die mindestens 85 %, mindestens 90 %, mindestens 91 %, mindestens 92 %, mindestens 93 %, mindestens 94 %, mindestens 95 %, mindestens 96 %, mindestens 97 %, mindestens 98 %, mindestens 99 % oder mindestens 99,5 % identisch mit einem natürlich vorkommenden Cas12e (CasX) oder Cas12d (CasY) Protein ist. In einigen Ausführungsformen ist das napDNAbp ein natürlich vorkommendes Cas12e (CasX) oder Cas12d (CasY) Protein. In einigen Ausführungsformen umfasst das napDNAbp eine Aminosäuresequenz, die zu mindestens 85 %, mindestens 90 %, mindestens 91 %, mindestens 92 %, mindestens 93 %, mindestens 94 %, mindestens 95 %, mindestens 96 %, mindestens 97 %, mindestens 98 %, mindestens 99 % oder mindestens 99,5 % mit einer unmutierten Cas-Einheit oder einer hierin bereitgestellten Cas-Einheit identisch ist.
  • In verschiedenen Ausführungsformen umfassen die Nukleinsäure-programmierbaren DNA-Bindungsproteine, ohne Einschränkung, Cas9 (z. B. dCas9 und nCas9), Cas12e (CasX), Cas12d (CasY), Cas12a (Cpfl), Cas12b1 (C2c1), Cas13a (C2c2), Cas12c (C2c3), Argonaute und Cas12b1. Ein Beispiel für ein durch Nukleinsäure programmierbares DNA-bindendes Protein, das eine andere PAM-Spezifität als Cas9 aufweist, ist Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats from Prevotella and Francisella 1 (d. h. Cas12a (Cpfl)). Ähnlich wie Cas9 ist auch Cas12a (Cpfl) ein CRISPR-Effektor der Klasse 2, aber er gehört zur Untergruppe Typ V der Enzyme und nicht zur Untergruppe Typ II. Es hat sich gezeigt, dass Cas12a (Cpfl) eine robuste DNA-Interferenz mit anderen Eigenschaften als Cas9 vermittelt. Cas12a (Cpfl) ist eine einzelne RNA-gesteuerte Endonuklease, der tracrRNA fehlt und die ein T-reiches, an den Protospacer angrenzendes Motiv (TTN, TTTN oder YTN) verwendet. Außerdem spaltet Cpfl die DNA über einen gestaffelten DNA-Doppelstrangbruch. Von den 16 Proteinen der Cpfl-Familie haben zwei Enzyme aus Acidaminococcus und Lachnospiraceae eine effiziente Genom-Editing-Aktivität in menschlichen Zellen gezeigt. Cpfl-Proteine sind in der Fachwelt bekannt und wurden bereits beschrieben, z. B. Yamano et al., „Crystal structure of Cpfl in complex with guide RNA and target DNA“ Cell (165) 2016, S. 949-962; der gesamte Inhalt wird hiermit durch Bezugnahme aufgenommen.
  • In noch anderen Ausführungsformen kann das Cas-Protein jedes CRISPR-assoziierte Protein umfassen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Cas12a, Cas12b1, Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9 (auch bekannt als Csn1 und Csx12), Cas10, Csy1, Csy2, Csy3, Csel, Cse2, Cscl, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4, Homologe davon, oder modifizierte Versionen davon, und vorzugsweise umfassend eine Nickase-Mutation (z. B., eine Mutation, die der D10A-Mutation des unmutierten Cas9-Polypeptids der SEQ-ID-NR.: 18).
  • In verschiedenen anderen Ausführungsformen kann das napDNAbp eines der folgenden Proteine sein: a Cas9, a Cas12a (Cpfl), a Cas12e (CasX), a Cas12d (CasY), a Cas12b1 (C2c1), a Cas13a (C2c2), a Cas12c (C2c3), a GeoCas9, a CjCas9, a Cas12g, a Cas12h, eine Cas12i, eine Cas13b, eine Cas13c, eine Cas13d, eine Cas14, eine Csn2, eine xCas9, eine SpCas9-NG, eine zirkulär permutierte Cas9 oder eine Argonaute (Ago) Domäne oder eine Variante davon.
  • Exemplarische Cas9-äquivalente Proteinsequenzen können die folgenden sein:
    Beschreibung Sequenz
    AsCas 12a (früher bekannt als Cpf1)
    Figure DE112021002672T5_0075
    Acidaminococcus sp. (Stamm BV3L6)
    UniProtKB
    U2UMQ6
    AsCas12a- Nickase (z. B. R1226A)
    Figure DE112021002672T5_0076
    LbCas12a (früher bekannt als Cpf1)
    Figure DE112021002672T5_0077
    Lachnospiraceae Bakterium GAM79
    Ref Seq. WP_11962 3382.1
    PcCas12a - vorher bekannt
    Figure DE112021002672T5_0078
    unter Cpf1
    Figure DE112021002672T5_0079
    Prevotella copri
    Ref Seq. WP_11922 7726.1
    ErCas12a - vorher bekannt unter Cpf1
    Figure DE112021002672T5_0080
    Eubacterium rectale
    Ref Seq. WP_11922 3642.1
    CsCas12a - vorher bekannt unter Cpf1
    Figure DE112021002672T5_0081
    Clostridium
    sp. AF34- 10BH
    Figure DE112021002672T5_0082
    Ref Seq. WP_11853 8418.1
    BhCas12b
    Figure DE112021002672T5_0083
    Bacillus hisashii
    Ref Seq. WP_09514 2515.1
    ThCas12b
    Figure DE112021002672T5_0084
    Thermomonas hydrothermalis
    Ref Seq. WP_07275 4838
    Figure DE112021002672T5_0085
    LsCas12b
    Figure DE112021002672T5_0086
    Laceyella sacchari
    WP_13222 1894.1
    DtCas 12b
    Figure DE112021002672T5_0087
    Dsulfonatronum thiodismutans
    WP_03138 6437
  • Die hier beschriebenen Multi-Flap-Prime-Editoren können auch Cas12a (Cpfl) (dCpfl)-Varianten umfassen, die als eine durch eine Leitnukleotidsequenz programmierbare DNA-bindende Proteindomäne verwendet werden können. Das Cas12a (Cpfl)-Protein hat eine RuvC-ähnliche Endonuklease-Domäne, die der RuvC-Domäne von Cas9 ähnelt, aber keine HNH-Endonuklease-Domäne hat, und der N-Terminus von Cas12a (Cpfl) hat nicht den alfa-helicalen Erkennungslappen von Cas9. In Zetsche et al., Cell, 163, 759-771, 2015 (hier durch Verweis aufgenommen) wurde gezeigt, dass die RuvC-ähnliche Domäne von Cas12a (Cpfl) für die Spaltung beider DNA-Stränge verantwortlich ist und die Inaktivierung der RuvC-ähnlichen Domäne die Nukleaseaktivität von Cas12a (Cpfl) inaktiviert.
  • In einigen Ausführungsformen ist das napDNAbp ein einzelner Effektor eines mikrobiellen CRISPR-Cas-Systems. Zu den einzelnen Effektoren der mikrobiellen CRISPR- Cas-Systeme gehören unter anderem Cas9, Cas12a (Cpfl), Cas12b1 (C2c1), Cas13a (C2c2) und Cas12c (C2c3). Typischerweise werden mikrobielle CRISPR-Cas-Systeme in Klasse-1- und Klasse-2-Systeme unterteilt. Systeme der Klasse 1 haben Effektor-Komplexe mit mehreren Untereinheiten, während Systeme der Klasse 2 einen einzelnen Protein-Effektor haben. Cas9 und Cas12a (Cpfl) zum Beispiel sind Effektoren der Klasse 2. Neben Cas9 und Cas12a (Cpfl) wurden drei weitere CRISPR-Cas-Systeme der Klasse 2 (Cas12b1, Cas13a und Cas12c) beschrieben von Shmakov et al., „Discovery and Functional Characterization of Diverse Class 2 CRISPR Cas Systems“, Mol. Cell, 2015 Nov 5; 60(3): 385-397, deren gesamter Inhalt hiermit durch Verweis einbezogen wird.
  • Die Effektoren von zwei der Systeme, Cas12b1 und Cas12c, enthalten RuvC-ähnliche Endonuklease-Domänen, die mit Cas12a verwandt sind. Ein drittes System, Cas13a, enthält einen Effektor mit zwei vorhergesagten HEPN-RNase-Domänen. Die Produktion von ausgereifter CRISPR-RNA ist unabhängig von tracrRNA, im Gegensatz zur Produktion von CRISPR-RNA durch Cas12b1. Cas12b1 ist für die DNA-Spaltung sowohl auf CRISPR-RNA als auch auf tracrRNA angewiesen. Es hat sich gezeigt, dass bakterielles Cas13a eine einzigartige RNase-Aktivität für die CRISPR-RNA-Reifung besitzt, die sich von seiner RNAaktivierten Aktivität zum FIGau einzelsträngiger RNA unterscheidet. Diese RNase-Funktionen unterscheiden sich voneinander und von dem CRISPR-RNA-verarbeitenden Verhalten von Cas12a. Siehe z. B.z. B. East-Seletsky, et al. „Two distinct RNase activities of CRISPR- Cas13a enable guide-RNA processing and RNA detection“, Nature, 13. Okt. 2016; 538(7624):270-273, dessen gesamter Inhalt hiermit durch Bezugnahme aufgenommen wird. Biochemische In-vitro-Analysen von Cas13a in Leptotrichia shahii haben gezeigt, dass Cas13a von einer einzigen CRISPR-RNA geleitet wird und so programmiert werden kann, dass es ssRNA-Ziele mit komplementären Protospacern spaltet. Katalytische Reste in den beiden konservierten HEPN-Domänen vermitteln die Spaltung. Mutationen in den katalytischen Resten erzeugen katalytisch inaktive RNA-bindende Proteine. Siehe z. B. Abudayyeh et al. „C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector“, Science, 5. Aug. 2016; 353(6299), dessen gesamter Inhalt hiermit durch Bezugnahme aufgenommen wird.
  • Die Kristallstruktur von Alicyclobaccillus acidoterrastris Cas12b1 (AacC2c1) wurde im Komplex mit einer chimären Einzelmolekül-Leit-RNA (sgRNA) veröffentlicht. Siehe z. B. Liu et al. „C2c1-sgRNA Complex Structure Reveals RNA-Guided DNA Cleavage Mechanism“, Mol. Cell, 19. Jan 2017; 65(2):310-322, dessen gesamter Inhalt hiermit durch Bezugnahme aufgenommen wird. Die Kristallstruktur wurde auch für Alicyclobacillus acidoterrestris C2c1, gebunden an Ziel-DNAs als ternäre Komplexe, berichtet. Siehe z. B. Yang et al., „PAM-dependent Target DNA Recognition and Cleavage by C2C1 CRISPR-Cas endonuclease“, Cell, 15. Dez. 2016; 167(7):1814-1828, dessen gesamter Inhalt hiermit durch Bezugnahme aufgenommen wird. Katalytisch kompetente Konformationen von AacC2c1, sowohl mit Ziel- als auch mit Nicht-Ziel-DNA-Strängen, wurden unabhängig voneinander in einer einzigen katalytischen RuvC-Tasche erfasst, wobei die C2c1-vermittelte Spaltung zu einem gestaffelten Sieben-Nukleotid-Bruch der Ziel-DNA führt. Strukturelle Vergleiche zwischen ternären C2c1-Komplexen und zuvor identifizierten Cas9- und Cpfl-Gegenstücken zeigen die Vielfalt der von CRISPR-Cas9-Systemen verwendeten Mechanismen.
  • In einigen Ausführungsformen kann das napDNAbp ein C2c1-, ein C2c2- oder ein C2c3-Protein sein. In einigen Ausführungsformen ist das napDNAbp ein C2c1-Protein. In einigen Ausführungsformen ist das napDNAbp ein Cas13a-Protein. In einigen Ausführungsformen ist das napDNAbp ein Cas12c-Protein. In einigen Ausführungsformen umfasst das napDNAbp eine Aminosäuresequenz, die zu mindestens 85 %, mindestens 90 %, mindestens 91 %, mindestens 92 %, mindestens 93 %, mindestens 94 %, mindestens 95 %, mindestens 96 %, mindestens 97 %, mindestens 98 %, mindestens 99 % oder mindestens 99,5 % identisch mit einem natürlich vorkommenden Cas12b1 (C2c1)-, Cas13a (C2c2)- oder Cas12c (C2c3)-Protein ist. In einigen Ausführungsformen ist das napDNAbp ein natürlich vorkommendes Cas12b1 (C2c1)-, Cas13a (C2c2)- oder Cas12c (C2c3)-Protein.
  • H. Zirkuläre Cas9-Permutanten
  • In verschiedenen Ausführungsformen können die hierin offenbarten Multi-Flap-Prime- Editoren eine zirkuläre Permutante von Cas9 umfassen.
  • Der Begriff „zirkulär permutiertes Cas9“ oder „zirkulärer Permutant“ von Cas9 oder „CP-Cas9“) bezieht sich auf jedes Cas9-Protein oder eine Variante davon, das als zirkulär permutierte Variante auftritt oder modifiziert wurde, was bedeutet, dass der N-Terminus und der C-Terminus eines Cas9-Proteins (z. B. eines Wildtyp-Cas9-Proteins) topisch umgeordnet wurden. Solche zirkulär permutierten Cas9-Proteine oder Varianten davon behalten die Fähigkeit, DNA zu binden, wenn sie mit einer Leit-RNA (gRNA) komplexiert sind. Siehe, Oakes et al. „Protein Engineering of Cas9 for enhanced function“, Methods Enzymol, 2014, 546: 491-511 und Oakes et al. „CRISPR-Cas9 Circular Permutants as Programmable Scaffolds for Genome Modification,“ Cell, 10. Januar 2019, 176: 254-267, die hierin jeweils durch Bezugnahme aufgenommen sind. Die vorliegende Offenbarung berücksichtigt jedes bereits bekannte CP-Cas9 oder die Verwendung eines neuen CP-Cas9, solange das resultierende zirkulär permutierte Protein die Fähigkeit behält, DNA zu binden, wenn es mit einer Leit-RNA (gRNA) komplexiert ist.
  • Jedes der hierin beschriebenen Cas9-Proteine, einschließlich jeder Variante, jedes Ortholog, jedes natürlich vorkommende Cas9 oder ein Äquivalent davon, kann als zirkulär permutierte Variante rekonfiguriert werden.
  • In verschiedenen Ausführungsformen können die zirkulären Permutanten von Cas9 die folgende Struktur aufweisen:
    • N-Terminus-[ursprünglicher C-Terminus] - [optionaler Linker] - [ursprünglicher N- Terminus]-C-Terminus.
  • Zum Beispiel betrachtet die vorliegende Offenbarung die folgenden zirkulären Permutanten von kanonischem S. pyogenes Cas9 (1368 Aminosäuren von UniProtKB - Q99ZW2 (CAS9_STRP1) (die Nummerierung basiert auf der Aminosäureposition in SEQ-ID- NR: 18)):
    • N-Terminus-[1268-1368]-[optionaler Linker]-[1-1267]-C-Terminus;
    • N-Terminus-[1168-1368]-[optionaler Linker]-[1-1167]-C-Terminus;
    • N-Terminus-[1068-1368]-[optionaler Linker 1 -1 067]-C-Terminus;
    • N-Terminus-[968-1368]-[optionaler Linker]-[1-967]-C-Terminus;
    • N-Terminus-[868-1368]-[optionaler Linker]-[1-867]-C-Terminus;
    • N-Terminus-[768-1368]-[optionaler Linker]-[1-767]-C-Terminus;
    • N-Terminus-[668-1368]-[optionaler Linker]-[1-667]-C-Terminus;
    • N-Terminus-[568-1368]-[optionaler Linker]-[1-567]-C-Terminus;
    • N-Terminus-[468-1368]-[optionaler Linker]-[1-467]-C-Terminus;
    • N-Terminus-[368-1368]-[optionaler Linker]-[1-367]-C-Terminus;
    • N-Terminus-[268-1368]-[optionaler Linker]-[1-267]-C-Terminus;
    • N-Terminus-[168-1368]-[optionaler Linker]-[1-167]-C-Terminus;
    • N-Terminus-[68-1368]-[optionaler Linker]-[1-67]-C-Terminus; oder
    • N-Terminus-[10-1368]-[optionaler Linker]-[1-9]-C-Terminus, oder die entsprechenden zirkulären Permutanten anderer Cas9-Proteine (einschließlich anderer Cas9-Orthologe, Varianten usw.).
  • In bestimmten Ausführungsformen weist das zirkuläre permuante Cas9 die folgende Struktur auf (basierend auf S. pyogenes Cas9 (1368 Aminosäuren von UniProtKB - Q99ZW2 (CAS9_STRP1) (die Nummerierung basiert auf der Aminosäureposition in SEQ-ID-NR: 18):
    • N-Terminus-[102-1368]-[optionaler Linker]-[1-101]-C-Terminus;
    • N-Terminus-[1028-1368]-[optionaler Linker]-[1-1027]-C-Terminus;
    • N-Terminus-[1041-1368]-[optionaler Linker]-[1-1043]-C-Terminus;
    • N-Terminus-[1249-1368]-[optionaler Linker]-[1-1248]-C-Terminus; oder
    • N-Terminus-[1300-1368]-[optionaler Linker]-[1-1299]-C-Terminus, oder die entsprechenden zirkulären Permutanten anderer Cas9-Proteine (einschließlich anderer Cas9-Orthologe, Varianten usw.).
  • In noch anderen Ausführungsformen weist das zirkuläre permuante Cas9 die folgende Struktur auf (basierend auf S. pyogenes Cas9 (1368 Aminosäuren von UniProtKB - Q99ZW2 (CAS9 _STRP1) (die Nummerierung basiert auf der Aminosäureposition in SEQ-ID-NR: 18):
    • N-Terminus-[103-1368]-[optionaler Linker]-[1-102]-C-Terminus;
    • N-Terminus-[1029-1368]-[optionaler Linker]-[1-1028]-C-Terminus;
    • N-Terminus-[1042-1368]-[optionaler Linker]-[1-1041]-C-Terminus;
    • N-Terminus-[1250-1368]-[optionaler Linker]-[1-1249]-C-Terminus; oder
    • N-Terminus-[1301-1368]-[optionaler Linker]-[1-1300]-C-Terminus, oder die entsprechenden zirkulären Permutanten anderer Cas9-Proteine (einschließlich anderer Cas9-Orthologe, Varianten usw.).
  • In einigen Ausführungsformen kann die zirkuläre Permutante durch Verknüpfung eines C-terminalen Fragments eines Cas9 mit einem N-terminalen Fragment eines Cas9 gebildet werden, entweder direkt oder durch Verwendung eines Linkers, wie etwa eines Aminosäure- Linkers. In einigen Ausführungsformen kann das C-terminale Fragment den C-terminalen 95 % oder mehr der Aminosäuren eines Cas9 (z. B. Aminosäuren etwa 1300-1368) oder den C-terminalen 90 %, 85 %, 80 %, 75 %, 70 %, 65 %, 60 %, 55 %, 50 %, 45 %, 40 %, 35 %, 30 %, 25 %, 20 %, 15 %, 10 % oder 5 % oder mehr eines Cas9 entsprechen (z. B. jede der SEQ-ID-NR: 77-86). Der N-terminale Abschnitt kann den C-terminalen 95 % oder mehr der Aminosäuren eines Cas9 (z. B. Aminosäuren etwa 1-1300) oder den C-terminalen 90 %, 85 %, 80 %, 75 %, 70 %, 65 %, 60 %, 55 %, 50 %, 45 %, 40 %, 35 %, 30 %, 25 %, 20 %, 15 %, 10 % oder 5 % oder mehr eines Cas9 entsprechen (z. B. von SEQ-ID-NR: 18).
  • In einigen Ausführungsformen kann die zirkuläre Permutante durch Verknüpfung eines C-terminalen Fragments eines Cas9 mit einem N-terminalen Fragment eines Cas9 gebildet werden, entweder direkt oder durch Verwendung eines Linkers, wie etwa eines Aminosäure- Linkers. In einigen Ausführungsformen beinhaltet oder entspricht das C-terminale Fragment, das zum N-Terminus umgeordnet wird, den C-terminalen 30 % oder weniger der Aminosäuren eines Cas9 (z. B. die Aminosäuren 1012-1368 von SEQ-ID-NR: 18). In einigen Ausführungsformen beinhaltet oder entspricht das C-terminale Fragment, das zum N-Terminus umgeordnet ist, den C-terminalen 30 %, 29 %, 28 %, 27 %, 26 %, 25 %, 24 %, 23 %, 22 %, 21 %, 20 %, 19 %, 18 %, 17 %, 16 %, 15 %, 14 %, 13 %, 12 %, 11 %, 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 % oder 1 % der Aminosäuren eines Cas9 (z. B. das Cas9 der SEQ-ID- NR: 18). In einigen Ausführungsformen beinhaltet oder entspricht das C-terminale Fragment, das zum N-Terminus umgeordnet ist, den C-terminalen 410 Resten oder weniger eines Cas9 (z. B. das Cas9 von SEQ-ID-NR: 18). In einigen Ausführungsformen beinhaltet oder entspricht der C-terminale Abschnitt, der zum N-Terminus umgeordnet ist, den C-terminalen 410, 400, 390, 380, 370, 360, 350, 340, 330, 320, 310, 300, 290, 280, 270, 260, 250, 240, 230, 220, 210, 200, 190, 180, 170, 160, 150, 140, 130, 120, 110, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20 oder 10 Resten eines Cas9 (z. B, das Cas9 der SEQ-ID-NR: 18). In einigen Ausführungsformen beinhaltet oder entspricht der C-terminale Abschnitt, der zum N-Terminus umgeordnet ist, den C-terminalen 357, 341, 328, 120 oder 69 Resten eines Cas9 (z. B. das Cas9 von SEQ-ID-NR: 18).
  • In anderen Ausführungsformen können zirkuläre permutante Cas9-Varianten als eine topologische Umstrukturierung einer Cas9-Primärstruktur definiert werden, basierend auf dem folgenden Verfahren, das auf S. pyogenes Cas9 der SEQ-ID-NR: 18 basiert: (a) Auswählen einer zirkulären Permutantenstelle (circular permutant - CP), die einem internen Aminosäurerest der Cas9-Primärstruktur entspricht, wodurch das ursprüngliche Protein in zwei Hälften zerlegt wird: eine N-terminale Region und eine C-terminalen Region; (b) Modifizieren der Cas9-Proteinsequenz (z. B. durch gentechnische Verfahren) durch Verschieben der ursprünglichen C-terminalen Region (die die Aminosäure der CP-Stelle umfasst) vor die ursprüngliche N-terminale Region, wodurch ein neuer N-Terminus des Cas9-Proteins gebildet wird, der nun mit dem Aminosäurerest der CP-Stelle beginnt. Die CP-Stelle kann sich in einer beliebigen Domäne des Cas9-Proteins befinden, die zum Beispiel die spiralförmige 11-Domäne, die RuvCIII-Domäne oder die CTD-Domäne beinhaltet. Zum Beispiel kann sich die CP-Stelle (bezogen auf das S. pyogenes Cas9 der SEQ-ID-NR: 18) am ursprünglichen Aminosäurerest 181, 199, 230, 270, 310, 1010, 1016, 1023, 1029, 1041, 1247, 1249 oder 1282 befinden. So würde die ursprüngliche Aminosäure 181, 199, 230, 270, 310, 1010, 1016, 1023, 1029, 1041, 1247, 1249 oder 1282 zur neuen N-terminalen Aminosäure werden, sobald sie an den N- Terminus verlagert wurde. Die Nomenklatur dieser CP-Cas9-Proteine kann als Cas9-CP181, Cas9-CP199, Cas9-CP230, Cas9-CP270, Cas9-CP310, Cas9-CP1010, Cas9-CP1016, Cas9-CP1023, Cas9-CP1029, Cas9-CP1041, Cas9-CP1247, Cas9-CP1249bzw. Cas9-CP1282 bezeichnet werden. Diese Beschreibung soll sich nicht auf die Herstellung von CP-Varianten aus SEQ-ID-NR: 18 beschränken, sondern kann zur Herstellung von CP-Varianten in jeder Cas9-Sequenz eingesetzt werden, entweder an CP-Stellen, die diesen Positionen entsprechen, oder an ganz anderen CP-Stellen. Diese Beschreibung ist nicht dazu gedacht, die spezifischen CP-Stellen in irgendeiner Weise einzuschränken. Praktisch jede CP-Stelle kann zur Bildung einer CP-Cas9- Variante verwendet werden.
  • Beispielhafte CP-Cas9-Aminosäuresequenzen, basierend auf dem Cas9 der SEQ-ID- NR: 18, werden im Folgenden bereitgestellt, wobei Linker-Sequenzen durch Unterstreichung und optionale Methionin (M)-Reste fett dargestellt sind. Es sei darauf hingewiesen, dass die Offenbarung CP-Cas9-Sequenzen bereitstellt, die keine Linker-Sequenz oder andere Linker- Sequenzen beinhalten. Es sei darauf hingewiesen, dass CP-Cas9-Sequenzen auf anderen Cas9- Sequenzen als denen von SEQ-ID-NR: 18 basieren können, und die hierin bereitgestellten Beispiele sind nicht als einschränkend zu betrachten. Beispielhafte CP-Cas9-Sequenzen sind wie folgt:
    CP-Name Sequenz SEQ-ID-NR:
    CP1012
    Figure DE112021002672T5_0088
    		 SEQ-ID-NR: 77
    CP-Name Sequenz SEQ-ID-NR:
    CP1028
    Figure DE112021002672T5_0089
    		 SEQ-ID-NR: 78
    CP1041
    Figure DE112021002672T5_0090
    		 SEQ-ID-NR: 79
    CP-Name Sequenz SEQ-ID-NR:
    Figure DE112021002672T5_0091
    CP1249
    Figure DE112021002672T5_0092
    		 SEQ-ID-NR: 80
    CP-Name Sequenz SEQ-ID-NR:
    CP1300
    Figure DE112021002672T5_0093
    		 SEQ-ID-NR: 81
  • Die zirkulären Cas9-Permutanten können in den hierin beschriebenen Multi-Flap- Prime-Editing-Konstrukten nützlich sein. Beispielhafte C-terminale Fragmente von Cas9, basierend auf dem Cas9 von SEQ-ID-NR: 18, die zu einem N-Terminus von Cas9 umgeordnet werden können, werden im Folgenden bereitgestellt. Es sei darauf hingewiesen, dass solche C- terminalen Fragmente von Cas9 beispielhaft sind und nicht als Einschränkung verstanden werden sollen. Diese beispielhaften CP-Cas9-Fragmente haben die folgenden Sequenzen:
    CP-Name Sequenz SEQ-ID-NR:
    CP1012 C- terminales Fragment
    Figure DE112021002672T5_0094
    		 SEQ-ID-NR: 82
    CP-Name Sequenz SEQ-ID-NR:
    CP1028 C- terminales Fragment
    Figure DE112021002672T5_0095
    		 SEQ-ID-NR: 83
    CP1041 C- terminales Fragment
    Figure DE112021002672T5_0096
    		 SEQ-ID-NR: 84
    CP1249 C- terminales Fragment
    Figure DE112021002672T5_0097
    		 SEQ-ID-NR: 85
    CP1300 C- terminales Fragment
    Figure DE112021002672T5_0098
    		 SEQ-ID-NR: 86
  • I. Cas9-Varianten mit modifizierten PAM-Spezifitäten
  • Die Multi-Flap-Prime-Editoren der vorliegenden Offenbarung können auch Cas9- Varianten mit modifizierten PAM-Spezifitäten umfassen. Einige Aspekte dieser Offenbarung stellen Cas9-Proteine bereit, die eine Aktivität auf einer Zielsequenz aufweisen, die nicht die kanonische PAM (5'-NGG-3', wobei N A, C, G oder T ist) an ihrem 3'-Ende umfasst. In einigen Ausführungsformen zeigt das Cas9-Protein Aktivität gegenüber einer Zielsequenz, die eine 5'- NGG-3'-PAM-Sequenz an ihrem 3'-Ende umfasst. In einigen Ausführungsformen zeigt das Cas9-Protein Aktivität an einer Zielsequenz, die eine 5'-NNG-3'-PAM-Sequenz an ihrem 3'- Ende umfasst. In einigen Ausführungsformen zeigt das Cas9-Protein Aktivität an einer Zielsequenz, die eine 5'-NNA-3'-PAM-Sequenz an ihrem 3'-Ende umfasst. In einigen Ausführungsformen zeigt das Cas9-Protein Aktivität an einer Zielsequenz, die eine 5'-NNC- 3'-PAM-Sequenz an ihrem 3'-Ende umfasst. In einigen Ausführungsformen zeigt das Cas9- Protein Aktivität an einer Zielsequenz, die eine 5'-NNT-3'-PAM-Sequenz an ihrem 3'-Ende umfasst. In einigen Ausführungsformen zeigt das Cas9-Protein Aktivität an einer Zielsequenz, die eine 5'-NGT-3'-PAM-Sequenz an ihrem 3'-Ende umfasst. In einigen Ausführungsformen zeigt das Cas9-Protein Aktivität an einer Zielsequenz, die eine 5'-NGA-3'-PAM-Sequenz an ihrem 3'-Ende umfasst. In einigen Ausführungsformen zeigt das Cas9-Protein Aktivität an einer Zielsequenz, die eine 5'-NGC-3'-PAM-Sequenz an ihrem 3'-Ende umfasst. In einigen Ausführungsformen zeigt das Cas9-Protein Aktivität an einer Zielsequenz, die eine 5'-NAA- 3'-PAM-Sequenz an ihrem 3'-Ende umfasst. In einigen Ausführungsformen zeigt das Cas9- Protein Aktivität an einer Zielsequenz, die eine 5'-NAC-3'-PAM-Sequenz an ihrem 3'-Ende umfasst. In einigen Ausführungsformen zeigt das Cas9-Protein Aktivität an einer Zielsequenz, die eine 5'-NAT-3'-PAM-Sequenz an ihrem 3'-Ende umfasst. In noch anderen Ausführungsformen zeigt das Cas9-Protein Aktivität an einer Zielsequenz, die eine 5'-NAG- 3'-PAM-Sequenz an ihrem 3'-Ende umfasst.
  • Es sei darauf hingewiesen, dass jede der hierin beschriebenen Aminosäuremutationen (z. B. A262T) von einem ersten Aminosäurerest (z. B. A) zu einem zweiten Aminosäurerest (z. B. T) auch Mutationen vom ersten Aminosäurerest zu einem Aminosäurerest beinhalten kann, der dem zweiten Aminosäurerest ähnlich (z. B. konserviert) ist. Zum Beispiel kann die Mutation einer Aminosäure mit einer hydrophoben Seitenkette (z. B. Alanin, Valin, Isoleucin, Leucin, Methionin, Phenylalanin, Tyrosin oder Tryptophan) eine Mutation zu einer zweiten Aminosäure mit einer anderen hydrophoben Seitenkette (z. B. Alanin, Valin, Isoleucin, Leucin, Methionin, Phenylalanin, Tyrosin oder Tryptophan) sein. Zum Beispiel kann eine Mutation von einem Alanin zu einem Threonin (z. B. eine A262T-Mutation) auch eine Mutation von einem Alanin zu einer Aminosäure sein, die in Größe und chemischen Eigenschaften einem Threonin ähnlich ist, z. B. Serin. Zum Beispiel kann die Mutation einer Aminosäure mit einer positiv geladenen Seitenkette (z. B. Arginin, Histidin oder Lysin) eine Mutation zu einer zweiten Aminosäure mit einer anderen positiv geladenen Seitenkette (z. B. Arginin, Histidin oder Lysin) sein. In einem anderen Beispiel kann die Mutation einer Aminosäure mit einer polaren Seitenkette (z. B. Serin, Threonin, Asparagin oder Glutamin) eine Mutation zu einer zweiten Aminosäure mit einer anderen polaren Seitenkette (z. B. Serin, Threonin, Asparagin oder Glutamin) sein. Weitere ähnliche Aminosäurepaare beinhalten unter anderem die folgenden: Phenylalanin und Tyrosin, Asparagin und Glutamin, Methionin und Cystein, Asparaginsäure und Glutaminsäure sowie Arginin und Lysin. Der erfahrene Fachmann wird erkennen, dass solche konservativen Aminosäure-Substitutionen wahrscheinlich nur geringe Auswirkungen auf die Proteinstruktur haben und wahrscheinlich gut toleriert werden, ohne die Funktion zu beeinträchtigen. In einigen Ausführungsformen kann jede Aminosäure der hierin bereitgestellten Aminosäuremutationen von einer Aminosäure zu einem Threonin eine Aminosäuremutation zu einem Serin sein. In einigen Ausführungsformen kann jede Aminosäure der hierin bereitgestellten Aminosäuremutationen von einer Aminosäure zu einem Arginin eine Aminosäuremutation zu einem Lysin sein. In einigen Ausführungsformen kann jede Aminosäure der hierin bereitgestellten Aminosäuremutationen von einer Aminosäure zu einem Isoleucin eine Aminosäuremutation zu einem Alanin, Valin, Methionin oder Leucin sein. In einigen Ausführungsformen kann jede Aminosäure der hierin bereitgestellten Aminosäuremutationen von einer Aminosäure zu einem Lysin eine Aminosäuremutation zu einem Arginin sein. In einigen Ausführungsformen kann jede Aminosäure der hierin bereitgestellten Aminosäuremutationen von einer Aminosäure zu einer Asparaginsäure eine Aminosäuremutation zu einer Glutaminsäure oder einem Asparagin sein. In einigen Ausführungsformen kann jede Aminosäure der hierin bereitgestellten Aminosäuremutationen von einer Aminosäure zu einem Valin eine Aminosäuremutation zu einem Alanin, Isoleucin, Methionin oder Leucin sein. In einigen Ausführungsformen kann jede der hierin bereitgestellten Aminosäuremutationen von einer Aminosäure zu einem Glycin eine Aminosäuremutation zu einem Alanin sein. Es sollte jedoch gewürdigt werden, dass zusätzliche konservierte Aminosäurereste vom Fachmann erkannt werden und jede der Aminosäuremutationen zu anderen konservierten Aminosäureresten ebenfalls in den Umfang dieser Offenbarung fällt.
  • In einigen Ausführungsformen umfasst das Cas9-Protein eine Kombination von Mutationen, die Aktivität auf einer Zielsequenz aufweisen, die an ihrem 3'-Ende eine 5'-NAA- 3'-PAM-Sequenz umfasst. In einigen Ausführungsformen ist die Kombination von Mutationen in einem der in Tabelle 1 aufgeführten Klone vorhanden. In einigen Ausführungsformen sind die Mutationskombinationen konservative Mutationen der in Tabelle 1 aufgeführten Klone. In einigen Ausführungsformen umfasst das Cas9-Protein die Kombination von Mutationen eines der in Tabelle 1 aufgeführten Cas9-Klone. Tabelle 1: NAA-PAM-Klone
    Mutationen von Wildtyp-SpCas9 (z. B. SEQ-ID-Nr: 18)
    D177N, K218R, D614N, D1135N, P1137S, E1219V, A1320V, A1323D, R1333K
    D177N, K218R, D614N, D1135N, E1219V, Q1221H, H1264Y, A1320V, R1333K
    A10T, I322V, S409I, E427G, G715C, D1135N, E1219V, Q1221H, H1264Y, A1320V, R1333K
    A367T, K710E, R1114G, D1135N, P1137S, E1219V, Q1221H, H1264Y, A1320V, R1333K
    A10T, I322V, S409I, E427G, R753G, D861N, D1135N, K1188R, E1219V, Q1221H, H1264H, A1320V, R1333K
    A10T, I322V, S409I, E427G, R654L, V7431, R753G, M1021T, D1135N, D1180G, K1211R, E1219V, Q1221H, H1264Y, A1320V, R1333K
    A10T, I322V, S409I, E427G, V7431, R753G, E762G, D1135N, D1180G, K1211R, E1219V, Q1221H, H1264Y, A1320V, R1333K
    A10T, I322V, S409I, E427G, R753G, D1135N, D1180G, K1211R, E1219V, Q1221H, H1264Y, S1274R, A1320V, R1333K
    A10T, I322V, S409I, E427G, A589S, R753G, D1135N, E1219V, Q1221H, H1264H, A1320V, R1333K
    A10T, I322V, S409I, E427G, R753G, E757K, G865G, D1135N, E1219V, Q1221H, H1264Y, A1320V, R1333K
    A10T, I322V, S4091, E427G, R654L, R753G, E757K, D1135N, E1219V, Q1221H, H1264Y, A1320V, R1333K
    A10T, I322V, S409I, E427G, K599R, M631A, R654L, K673E, V743I, R753G, N758H, E762G, D1135N, D1180G, E1219V, Q1221H, Q1256R, H1264Y, A1320V, A1323D, R1333K
    A10T, I322V, S409I, E427G, R654L, K673E, V743I, R753G, E762G, N869S, Γ11054D, R1114G, D1135N, D1180G, E1219V, Q1221H, H1264Y, A1320V, A1323D, R1333K
    A10T, I322V, S409I, E427G, R654L, L727I, V743I, R753G, E762G, R859S, N946D, F1134L, D1135N, D1180G, E1219V, Q1221H, H1264Y, N1317T, A1320V, A1323D, R1333K
    A10T, I322V, S4091, E427G, R654L, K673E, V743I. R753G, E762G, N803S, N869S, Y1016D, G1077D, R1114G, F1134L, D1135N, D1180G, E1219V, Q1221H, H1264Y, V1290G, L1318S, A1320V, A1323D, R1333K
    A10T, I322V, S409I, E427G, R654L, K673E, V7431, R753G, E762G, N803S, N869S, Y1016D, G1077D, R1114G, F1134L, D1135N, K1151E, D1180G, E1219V, Q1221H, H1264Y, V1290G, L1318S, A1320V, R1333K
    A10T, I322V, S409I, E427G, R654L, K673E, V7431, R753G, E762G, N803S, N869S, Y1016D, G1077D, R1114G, F1134L, D1135N, D1180G, E1219V, Q1221H, H1264Y, V1290G, L1318S, A1320V, A1323D, R1333K
    A10T, 1322V, S409I, E427G, R654L, K673E, F693L, V743I, R753G, E762G, N803S, N869S, L921P, Y1016D, G1077D, F1080S, R1114G, D1135N, D1180G, E1219V, Q1221H, H1264Y, L1318S, A1320V, A1323D, R1333K
    A10T, I322V, S409I, E427G, E630K, R654L, K673E, V743I, R753G, E762G, Q768H, N803S, N869S, Y1016D, G1077D, R1114G, F1134L, D1135N, D1180G, E1219V, Q1221H, H1264Y, L1318S, A1320V, R1333K
    A10T, I322V, S409I, E427G, R654L, K673E, F693L, V743I, R753G, E762G, Q768H, N803S, N869S, Y1016D, G1077D, R1114G, F1134L, D1135N, D1180G, E1219V, Q1221H, G1223S, H1264Y, L1318S, A1320V, R1333K
    A10T, 1322V, S409I, E427G, R654L, K673E, F693L, V7431, R753G, E762G, N803S, N869S, L921P, Y1016D, G1077D, F1801S, R11 14G, D1135N, D1180G, E1219V, Q1221H, H1264Y, L1318S, A1320V, A1323D, R1333K
    A10T, I322V, S409I, E427G, R654L, V7431, R753G, M1021T, D1135N, D1180G, K1211R, E1219V, Q1221H, H1264Y, A1320V, R1333K
    A10T, 1322V, S409I, E427G, R654L, K673E, V7431, R753G, E762G, M6731, N803S, N869S, G1077D, R1114G, D1135N, V1139A, D1180G, E1219V, Q1221H, A1320V, R1333K
    A10T, I322V, S4091, E427G, R654L, K673E, V7431, R753G, E762G, N803S, N869S, R1114G, D1135N, E1219V, Q1221H, A1320V, R1333K
  • In einigen Ausführungsformen umfasst das Cas9-Protein eine Aminosäuresequenz, die zu mindestens 80 % identisch mit der Aminosäuresequenz eines Cas9-Proteins ist, wie es von einer der Varianten von Tabelle 1 bereitgestellt wird. In einigen Ausführungsformen umfasst das Cas9-Protein eine Aminosäuresequenz, die mindestens 85 %, mindestens 90 %, mindestens 92 %, mindestens 95 %, mindestens 96 %, mindestens 97 %, mindestens 98 %, mindestens 99 % oder mindestens 99,5 % identisch mit der Aminosäuresequenz eines Cas9- Proteins ist, wie es von einer der Varianten von Tabelle 1 bereitgestellt wird.
  • In einigen Ausführungsformen weist das Cas9-Protein eine erhöhte Aktivität auf einer Zielsequenz auf, die das kanonische PAM (5'-NGG-3') an seinem 3'-Ende nicht umfasst, im Vergleich zu Streptococcus pyogenes Cas9 gemäß SEQ-ID-Nr: 18. In einigen Ausführungsformen weist das Cas9-Protein eine Aktivität auf einer Zielsequenz mit einem 3'- Ende auf, das nicht direkt an die kanonische PAM-Sequenz (5'-NGG-3') angrenzt, die mindestens 5-fach erhöht ist im Vergleich zur Aktivität von Streptococcus pyogenes Cas9 gemäß SEQ-ID-Nr: 18 auf derselben Zielsequenz. In einigen Ausführungsformen weist das Cas9-Protein eine Aktivität auf einer Zielsequenz auf, die nicht direkt an die kanonische PAM- Sequenz (5'-NGG-3') angrenzt, die mindestens 10-fach, mindestens 50-fach, mindestens 100- fach, mindestens 500-fach, mindestens 1.000-fach, mindestens 5.000-fach, mindestens 10.000- fach, mindestens 50.000-fach, mindestens 100.000-fach, mindestens 500.000-fach oder mindestens 1.000.000-fach erhöht ist im Vergleich zur Aktivität von Streptococcus pyogenes gemäß SEQ-ID-Nr: 18 auf derselben Zielsequenz. In einigen Ausführungsformen grenzt das 3'-Ende der Zielsequenz direkt an eine AAA-, GAA-, CAA- oder TAA-Sequenz an. In einigen Ausführungsformen umfasst das Cas9-Protein eine Kombination von Mutationen, die Aktivität auf einer Zielsequenz aufweisen, die an ihrem 3'-Ende eine 5'-NAC-3'-PAM-Sequenz umfasst. In einigen Ausführungsformen ist die Kombination von Mutationen in einem der in Tabelle 2 aufgeführten Klone vorhanden. In einigen Ausführungsformen sind die Mutationskombinationen konservative Mutationen der in Tabelle 2 aufgeführten Klone. In einigen Ausführungsformen umfasst das Cas9-Protein die Kombination von Mutationen eines der in Tabelle 2 aufgeführten Cas9-Klone. Tabelle 2: NAC-PAM-Klone
    MUTATIONEN VON WILDTYP-SPCAS9 (Z. B. SEQ-ID-NR: 18)
    T472I, R753G, K890E, D1332N, R1335Q, T1337N
    I1057S, D1135N, P1301S, R1335Q, T1337N
    T472I, R753G, D1332N, R1335Q, T1337N
    D1135N, E1219V, D1332N, R1335Q, T1337N
    T472I, R753G, K890E, D1332N, R1335Q, T1337N
    I1057S, D1135N, P1301S, R1335Q, T1337N
    T472I, R753G, D1332N, R1335Q, T1337N
    T472I, R753G, Q771H,D1332N,R1335Q, T1337N
    E627K, T638P, K652T, R753G, N803S, K959N, R1114G, D1135N, E1219V, D1332N, R1335Q, T1337N
    E627K, T638P, K652T, R753G, N803S, K959N, R1114G, D1135N, K1156E, E1219V, D1332N, R1335Q, T1337N
    E627K, T638P, V647I, R753G, N803S, K959N, G1030R, I1055E, R1114G, D1135N, E1219V, D1332N, R1335Q, T1337N
    E627K, E630G, T638P, V647A, G687R, N767D, N803S, K959N, R1114G, D1135N, E1219V, D1332G, R1335Q, T1337N
    E627K, T638P, R753G, N803S, K959N, R1114G, D1135N, E1219V, N1266H, D1332N, R1335Q, T1337N
    E627K, T638P, R753G, N803S, K959N, I1057T, R1114G, D1135N, E1219V, D1332N, R1335Q, T1337N
    E627K, T638P, R753G, N803S, K959N, R1114G, D1135N, E1219V, D1332N, R1335Q, T1337N
    E627K, M631I, T638P, R753G, N803S, K959N, Y1036H, R1114G, D1135N, E1219V, D1251G, D1332G, R1335Q, T1337N
    E627K, T638P, R753G, N803S, V875I, K959N, Y1016C, R1114G, D1135N, E1219V, D1251G, D1332G, R1335Q, T1337N, I1348V
    K608R, E627K, T638P, V647I, R654L, R753G, N803S, T804A, K848N, V922A, K959N, R1114G, D1135N, E1219V, D1332N, R1335Q, T1337N
    K608R, E627K, T638P, V647I, R753G, N803S, V922A, K959N, K1014N, V1015A, R1114G, D1135N, K1156N, E1219V, N1252D, D1332N, R1335Q, T1337N
    K608R, E627K, R629G, T638P, V647I, A711T, R753G, K775R, K789E, N803S, K959N, V1015A, Y1036H, R1114G, D1135N, E1219V, N1286H, D1332N, R1335Q, T1337N
    K608R, E627K, T638P, V647I, T740A, R753G, N803S, K948E, K959N, Y1016S, R1114G, D1135N, E1219V, N1286H, D1332N,R1335Q, T1337N
    K608R, E627K, T638P, V647I, T740A, N803S, K948E, K959N, Y1016S, R1114G, D1135N, E1219V, N1286H, D1332N, R1335Q, T1337N
    I670S, K608R, E627K, E630G, T638P, V647I, R653K, R753G, I795L, K797N, N803S, K866R, K890N, K959N, Y1016C, R1114G, D1135N, E1219V, D1332N, R1335Q, T1337N
    K608R, E627K, T638P, V647I, T740A, G752R, R753G, K797N, N803S, K948E, K959N, V1015A, Y1016S, R1114G, D1135N, E1219V, N1266H, D1332N, R1335Q, T1337N
    I570T, A589V, K608R, E627K, T638P, V647I, R654L, Q716R, R753G, N803S, K948E, K959N, Y1016S, R1114G, D1135N, E1207G, E1219V, N1234D, D1332N, R1335Q, T1337N
    K608R, E627K, R629G, T638P, V647I, R654L, Q740R, R753G, N803S, K959N, N990S, T995S, V1015A, Y1036D, R1114G, D1135N, E1207G, E1219V, N1234D, N1266H, D1332N, R1335Q, T1337N
    I562F, V565D, I570T, K608R, L625S, E627K, T638P, V647I, R654I, G752R, R753G, N803S, N808D, K959N, M1021L, R1114G, D1135N, N1177S, N1234D, D1332N, R1335Q, T1337N
    I562F, I570T, K608R, E627K, T638P, V647I, R753G, E790A, N803S, K959N, V1015A, Y1036H, R1114G, D1135N, D1180E, A1184T, E1219V, D1332N, R1335Q, T1337N
    1570T, K608R, E627K, T638P, V6471, R654H, R753G, E790A, N803S, K959N, V1015A, R1114G, D1127A, D1135N, E1219V, D1332N, R1335Q, T1337N
    1570T, K608R, L625S, E627K, T638P, V647I, R654I, T703P, R753G, N803S, N808D, K959N, M1021L, R1114G, D1135N, E1219V, D1332N, R1335Q, T1337N
    1570S, K608R, E627K, E630G, T638P, V647I, R653K, R753G, 1795L, N803S, K866R, K890N, K959N, Y1016C, R1114G, D1135N, E1219V, D1332N, R1335Q, T1337N
    1570T, K608R, E627K, T638P, V647I, R654H, R753G, E790A, N803S, K959N, V1016A, R1114G, D1135N, E1219V, K1246E, D1332N, R1335Q, T1337N
    K608R, E627K, T638P, V647I, R654L, K673E, R753G, E790A, N803S, K948E, K959N, R1114G, D1127G, D1135N, D1180E, E1219V, N1286H, D1332N,R1335Q, T1337N
    K608R, L625S, E627K, T638P, V647I, R654I, I670T, R753G, N803S, N808D, K959N, M1021L, R1114G,D1135N, E1219V, N1286H, D1332N,R1335Q, T1337N
    E627K, M631V,T638P, V6471, K710E, R753G, N803S, N808D, K948E, M1021L, R1114G, D1135N, E1219V, D1332N, R1335Q, T1337N, S1338T, H1349R
  • In einigen Ausführungsformen umfasst das Cas9-Protein eine Aminosäuresequenz, die zu mindestens 80 % identisch mit der Aminosäuresequenz eines Cas9-Proteins ist, wie es von einer der Varianten von Tabelle 2 bereitgestellt wird. In einigen Ausführungsformen umfasst das Cas9-Protein eine Aminosäuresequenz, die mindestens 85 %, mindestens 90 %, mindestens 92 %, mindestens 95 %, mindestens 96 %, mindestens 97 %, mindestens 98 %, mindestens 99 % oder mindestens 99,5 % identisch mit der Aminosäuresequenz eines Cas9- Proteins ist, wie es von einer der Varianten von Tabelle 2 bereitgestellt wird.
  • In einigen Ausführungsformen weist das Cas9-Protein eine erhöhte Aktivität auf einer Zielsequenz auf, die das kanonische PAM (5'-NGG-3') an seinem 3'-Ende nicht umfasst, im Vergleich zu Streptococcus pyogenes Cas9 gemäß SEQ-ID-Nr: 18. In einigen Ausführungsformen weist das Cas9-Protein eine Aktivität auf einer Zielsequenz mit einem 3'- Ende auf, das nicht direkt an die kanonische PAM-Sequenz (5'-NGG-3') angrenzt, die mindestens 5-fach erhöht ist im Vergleich zur Aktivität von Streptococcus pyogenes Cas9 gemäß SEQ-ID-Nr: 18 auf derselben Zielsequenz. In einigen Ausführungsformen weist das Cas9-Protein eine Aktivität auf einer Zielsequenz auf, die nicht direkt an die kanonische PAM- Sequenz (5'-NGG-3') angrenzt, die mindestens 10-fach, mindestens 50-fach, mindestens 100- fach, mindestens 500-fach, mindestens 1.000-fach, mindestens 5.000-fach, mindestens 10.000- fach, mindestens 50.000-fach, mindestens 100.000-fach, mindestens 500.000-fach oder mindestens 1.000.000-fach erhöht ist im Vergleich zur Aktivität von Streptococcus pyogenes gemäß SEQ-ID-Nr: 18 auf derselben Zielsequenz. In einigen Ausführungsformen grenzt das 3'-Ende der Zielsequenz direkt an eine AAC-, GAC-, CAC- oder TAC-Sequenz an.
  • In einigen Ausführungsformen umfasst das Cas9-Protein eine Kombination von Mutationen, die Aktivität auf einer Zielsequenz aufweisen, die an ihrem 3'-Ende eine 5'-NAT- 3'-PAM-Sequenz umfasst. In einigen Ausführungsformen ist die Kombination von Mutationen in einem der in Tabelle 3 aufgeführten Klone vorhanden. In einigen Ausführungsformen sind die Mutationskombinationen konservative Mutationen der in Tabelle 3 aufgeführten Klone. In einigen Ausführungsformen umfasst das Cas9-Protein die Kombination von Mutationen eines der in Tabelle 3 aufgeführten Cas9-Klone. Tabelle 3: NAT PAM-Klone
    MUTATIONEN VON WILDTYP-SPCAS9 (Z. B. SEQ-ID-NR: 18)
    K961E, H985Y, D1135N, K1191N, E1219V, Q1221H, A1320A, P1321S, R1335L
    D1135N, G1218S, E1219V, Q1221H, P1249S, P1321S, D1322G, R1335L
    V7431, R753G, E790A, D1135N, G1218S, E1219V, Q1221H, A1227V, P1249S, N1286K, A1293T, P1321S, D1322G, R1335L, T1339I
    F575S, M631L, R654L, V748I, V743I, R753G, D853E, V922A, R1114G D1135N, G1218S, E1219V, Q1221H, A1227V, P1249S, N1286K, A1293T, P1321S, D1322G, R1335L, T1339I
    F575S, M631L, R654L, R664K, R753G, D853E, V922A, R1114G D1135N, D1180G, G1218S, E1219V, Q1221H, P1249S, N1286K, P1321S, D1322G, R1335L
    M631L, R654L, R753G, K797E, D853E, V922A, D1012A, R1114G D1135N, G1218S, E1219V, Q1221H, P1249S, N1317K, P1321S, D1322G, R1335L
    F575S, M631L, R654L, R664K, R753G, D853E, V922A, R1114G, Y1131C, D1135N, D1180G, G1218S, E1219V, Q1221H, P1249S, P1321S, D1322G, R1335L
    F575S, M631L, R654L, R664K, R753G, D853E, V922A, R1114G, Y1131C, D1135N, D1180G, G1218S, E1219V, Q1221H, P1249S, P1321S, D1322G, R1335L
    F575S, D596Y, M631L, R654L, R664K, R753G, D853E, V922A, R1114G, Y1131C, D1135N, D1180G, G1218S, E1219V, Q1221H, P1249S, Q1256R, P1321S, D1322G, R1335L
    F575S, M631L, R654L, R664K, K710E, V750A, R753G, D853E, V922A, R1114G, Y1131C, D1135N, D1180G, G1218S, E1219V, Q1221H, P1249S, P1321S, D1322G, R1335L
    F575S, M631L, K649R, R654L, R664K, R753G, D853E, V922A, R1114G, Y1131C, D1135N, K1156E, D1180G, G1218S, E1219V, Q1221H, P1249S, P1321S, D1322G, R1335L
    F575S, M631L, R654L, R664K, R753G, D853E, V922A, R1114G, Y1131C, D1135N, D1180G, G1218S, E1219V, Q1221H, P1249S, P1321S, D1322G, R1335L
    F575S, M631L, R654L, R664K, R753G, D853E, V922A, I1057G, R1114G, Y1131C, D1135N, D1180G, G1218S, E1219V, Q1221H, P1249S, N1308D, P1321S, D1322G, R1335L
    M631L, R654L, R753G, D853E, V922A, R1114G, Y1131C, D1135N, E1150V, D1180G, G1218S, E1219V, Q1221H, P1249S, P1321S, D1332G, R1335L
    M631L, R654L, R664K, R753G, D853E, I1057V, Y1131C, D1135N, D1180G, G1218S, E1219V, Q1221H, P1249S, P1321S, D1332G, R1335L
    M631L, R654L, R664K, R753G, I1057V, R1114G, Y1131C, D1135N, D1180G, G1218S, E1219V, Q1221H, P1249S, P1321S, D1332G, R1335L
  • Die obige Beschreibung verschiedener napDNAbps, die in Verbindung mit den derzeit offenbaren Multi-Flap-Prime-Editoren verwendet werden können, soll in keiner Weise einschränkend sein. Die Multi-Flap-Prime-Editoren können das kanonische SpCas9 oder ein beliebiges orthologes Cas9-Protein oder eine beliebige Variante des Cas9-Proteins umfassen - einschließlich einer natürlich vorkommenden Variante, Mutante oder anderweitig manipulierten Version von Cas9, die bekannt ist oder die durch einen gerichteten evolutionären oder anderweitig mutagenen Prozess hergestellt oder entwickelt werden kann. In verschiedenen Ausführungsformen haben die Cas9 oder Cas9-Varianten eine Nickase-Aktivität, d. h., sie spalten nur einen Strang der Ziel-DNA-Sequenz. In anderen Ausführungsformen haben die Cas9 oder Cas9-Varianten inaktive Nukleasen, d. h. sie sind „tote“ Cas9-Proteine. Andere Cas9-Varianten, die verwendet werden können, haben ein geringeres Molekulargewicht als das kanonische SpCas9 (z. B. zur leichteren Einschleusung) oder haben eine modifizierte oder umstrukturierte primäre Aminosäurestruktur (z. B. die zirkulären Permutantenformate). Die hierin beschriebenen Multi-Flap-Prime-Editoren können auch Cas9-Äquivalente umfassen, die Cas12a1Cpf1- und Cas12b-Proteine beinhalten, die das Ergebnis einer konvergenten Evolution sind. Die hierin verwendeten napDNAbps (z. B. SpCas9, Cas9-Variante oder Cas9- Äquivalente) können auch verschiedene Modifikationen enthalten, die ihre PAM-Spezifitäten verändern/erhöhen. Schließlich kommt für die Anwendung jedes Cas9, jede Cas9-Variante oder jedes Cas9-Äquivalent in Betracht, das mindestens 70 %, mindestens 75 %, mindestens 80 %, mindestens 85 %, mindestens 90 %, mindestens 91 %, mindestens 92 %, mindestens 93 %, mindestens 94 %, mindestens 95 %, mindestens 96 %, mindestens 97 %, mindestens 98 %, mindestens 99 % oder mindestens 99,9 % Sequenzidentität mit einer Referenz-Cas9- Sequenz, wie etwa einer kanonischen SpCas9-Referenzsequenz oder einem Referenz-Cas9- Äquivalent (z. B. Cas12a/Cpfl) aufweist.
  • In einer besonderen Ausführungsform ist die Cas9-Variante mit erweiterten PAM- Fähigkeiten SpCas9 (H840A) VRQR (SEQ-ID-NR: 87), die die folgende Aminosäuresequenz aufweist (wobei die Substitutionen V, R, Q, R im Vergleich zu SpCas9 (H840A) von SEQ-ID- NR: 51 in fetter Unterstreichung gezeigt sind. Außerdem wurde der Methionin-Rest in SpCas9 (H840) für SpCas9 (H840A) VRQR entfernt):
    Figure DE112021002672T5_0099
  • In einer anderen besonderen Ausführungsform ist die Cas9-Variante mit erweiterten PAM-Fähigkeiten SpCas9 (H840A) VRER, die die folgende Aminosäuresequenz aufweist (wobei die Substitutionen V, R, E, R im Vergleich zu SpCas9 (H840A) von SEQ-ID-NR: 51 in fetter Unterstreichung gezeigt sind. Außerdem wurde der Methionin-Rest in SpCas9 (H840) für SpCas9 (H840A) VRER entfernt):
    Figure DE112021002672T5_0100
  • In einigen Ausführungsformen ist das napDNAbp, das mit einer nicht-kanonischen PAM-Sequenz funktioniert, ein Argonautenprotein. Ein Beispiel für ein solches nukleinsäureprogrammierbares DNA-Bindungsprotein ist ein Argonautenprotein aus Natronobacterium gregoryi (NgAgo). NgAgo ist eine ssDNA-gesteuerte Endonuklease. NgAgo bindet 5'-phosphorylierte ssDNA von ~24 Nukleotiden (gDNA), um sie zu ihrem Zielort zu leiten, und führt DNA-Doppelstrangbrüche an der gDNA-Stelle durch. Im Gegensatz zu Cas9 benötigt das NgAgo-gDNA-System kein Protospacer-Adjacent-Motiv (PAM). Die Verwendung eines nuklease-inaktiven NgAgo (dNgAgo) kann die Zahl der Basen, die angegriffen werden können, erheblich erweitern. Die Charakterisierung und Verwendung von NgAgo wurde in Gao et al., Nat Biotechnol, Jul 2016; 34(7):768-73. PubMed PMID: 27136078; Swarts et al., Nature. 507(7491) (2014):258-61; und Swarts et al., Nucleic Acids Res. 43(10)(2015):5120-9 beschrieben, die hierin jeweils durch Bezugnahme aufgenommen sind.
  • In einigen Ausführungsformen ist das napDNAbp ein prokaryotisches Homolog eines Argonautenproteins. Prokaryotische Homologe von Argonautenproteinen sind bekannt und wurden zum Beispiel in Makarova K., et al. „Prokaryotic homologs of Argonaute proteins are predicted to function as key components of a novel system of defense against mobile genetic elements“, Biol Direct. 25. Aug. 2009; 4:29. doi: 10.1186/1745-6150-4-29 beschrieben, dessen gesamter Inhalt hiermit durch Bezugnahme aufgenommen wird. In einigen Ausführungsformen ist das napDNAbp ein Marinitoga-piezophila-Argunauten(MpAgo)- Protein. Das CRISPR-assoziierte Marinitoga-piezophila-Argunauten(MpAgo)-Protein spaltet einzelsträngige Zielsequenzen unter Verwendung von 5'-phosphorylierten Guides. Die 5'- Guides werden von allen bekannten Argonauten verwendet. Die Kristallstruktur eines MpAgo- RNA-Komplexes zeigt eine Leitstrang-Bindungsstelle, die Reste umfasst, die 5'-Phosphat- Interaktionen blockieren. Diese Daten deuten auf die Entwicklung einer Argonauten- Unterklasse mit nicht-kanonischer Spezifität für einen 5'-hydroxylierten Guide hin. Siehe z. B. Kaya et al., „A bacterial Argonaute with noncanonical guide RNA specificity“, Proc Natl Acad Sei USA. 12. Apr 2016; 113(15):4057-62, dessen gesamter Inhalt hiermit durch Bezugnahme aufgenommen wird). Es sollte gewürdigt werden, dass andere Argonautenproteine verwendet werden können und in den Umfang dieser Offenbarung fallen.
  • Einige Aspekte der Offenbarung stellen Cas9-Domänen bereit, die unterschiedliche PAM-Spezifitäten aufweisen. Normalerweise benötigen Cas9-Proteine, wie etwa Cas9 aus S. pyogenes (spCas9), eine kanonische NGG-PAM-Sequenz, um eine bestimmte Nukleinsäure- Region zu binden. Dies kann die Fähigkeit einschränken, gewünschte Basen innerhalb eines Genoms zu verändern. In einigen Ausführungsformen müssen die hierin bereitgestellten baseneditierenden Fusionsproteine möglicherweise an einer präzisen Stelle platziert werden, z. B. dort, wo sich eine Zielbase innerhalb einer 4-Basen-Region (z. B. einem „Editing- Fenster“) befindet, die etwa 15 Basen stromaufwärts von der PAM liegt. Siehe Komor, A.C., et al. „Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage“ Nature 533, 420-424 (2016), dessen gesamter Inhalt hiermit durch Bezugnahme aufgenommen wird. Dementsprechend kann in einigen Ausführungsformen jedes der hierin bereitgestellten Fusionsproteine eine Cas9-Domäne enthalten, die in der Lage ist, eine Nukleotidsequenz zu binden, die keine kanonische (z. B. NGG) PAM-Sequenz enthält. Cas9- Domänen, die an nicht-kanonische PAM-Sequenzen binden, sind in der Fachliteratur beschrieben worden und für den Fachmann offensichtlich. Zum Beispiel wurden Cas9- Domänen, die an nicht-kanonische PAM-Sequenzen binden, in Kleinstiver, B. P., et al., „Engineered CRISPR-Cas9 nucleases with altered PAM specificities“ Nature 523, 481-485 (2015); und Kleinstiver, B. P., et al. „Broadening the targeting range of Staphylococcus aureus CRISPR-Cas9 by modifying PAM recognition“ Nature Biotechnology 33, 1293-1298 (2015) beschrieben; der gesamte Inhalt jedes Dokuments wird hiermit durch Bezugnahme aufgenommen.
  • Zum Beispiel eine napDNAbp-Domäne mit veränderter PAM-Spezifität, wie etwa eine Domäne mit mindestens 80 %, mindestens 85 %, mindestens 90 %, mindestens 95 % oder mindestens 99 % Sequenzidentität mit dem Wildtyp Francisella novicida Cpfl (D917, E1006 und D1255) (SEQ-ID-NR: 74), die die folgende Aminosäuresequenz aufweist:
    Figure DE112021002672T5_0101
  • Eine zusätzliche napDNAbp-Domäne mit veränderter PAM-Spezifität, wie etwa eine Domäne mit mindestens 80 %, mindestens 85 %, mindestens 90 %, mindestens 95 % oder mindestens 99 % Sequenzidentität mit dem Wildtyp Geobacillus thermodenitrificans Cas9 (SEQ-ID-NR: 75), die die folgende Aminosäuresequenz aufweist:
    Figure DE112021002672T5_0102
  • In einigen Ausführungsformen ist das nukleinsäureprogrammierbare DNA- Bindungsprotein (napDNAbp) ein nukleinsäureprogrammierbares DNA-Bindungsprotein, das keine kanonische (NGG) PAM-Sequenz benötigt. In einigen Ausführungsformen ist das napDNAbp ein Argonautenprotein. Ein Beispiel für ein solches nukleinsäureprogrammierbares DNA-Bindungsprotein ist ein Argonautenprotein aus Natronobacterium gregoryi (NgAgo). NgAgo ist eine ssDNA-gesteuerte Endonuklease. NgAgo bindet 5'-phosphorylierte ssDNA von ~24 Nukleotiden (gDNA), um sie zu ihrem Zielort zu leiten, und führt DNA- Doppelstrangbrüche an der gDNA-Stelle durch. Im Gegensatz zu Cas9 benötigt das NgAgo- gDNA-System kein Protospacer-Adjacent-Motiv (PAM). Die Verwendung eines nuklease- inaktiven NgAgo (dNgAgo) kann die Zahl der Basen, die angegriffen werden können, erheblich erweitern. Die Charakterisierung und Verwendung von NgAgo wurde in Gao et al. Nat Biotechnol, 34(7): 768-73 (2016), PubMed PMID: 27136078; Swarts et al., Nature, 507(7491): 258-61 (2014); und Swarts et al., Nucleic Acids Res. 43(10) (2015): 5120-9 beschrieben, die hierin jeweils durch Bezugnahme aufgenommen sind. Die Sequenz des Natronobacterium-gregoryi-Argonauten ist in SEQ-ID-NR: 76 bereitgestellt.
  • Die offenbarten Fusionsproteine können eine napDNAbp-Domäne umfassen, die mindestens 80 %, mindestens 85 %, mindestens 90 %, mindestens 95 % oder mindestens 99 % Sequenzidentität mit dem Wildtyp Natronobacterium-gregoryi-Argonauten (SEQ-ID-NR: 76) aufweist, die die folgende Aminosäuresequenz aufweist:
    Figure DE112021002672T5_0103
  • Darüber hinaus können alle verfügbaren Verfahren verwendet werden, um eine Variante oder ein mutiertes Cas9-Protein zu erhalten oder zu konstruieren. Der Begriff „Mutation“, wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf die Substitution eines Restes innerhalb einer Sequenz, z. B. einer Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenz, durch einen anderen Rest oder eine Deletion oder Insertion eines oder mehrerer Reste innerhalb einer Sequenz. Mutationen werden hierin in der Regel durch Angabe des ursprünglichen Restes, gefolgt von der Position des Restes innerhalb der Sequenz und der Identität des neu substituierten Restes beschrieben. Verschiedene Verfahren zur Durchführung der hierin bereitgestellten Aminosäuresubstitutionen (Mutationen) sind in der Fachwelt wohlbekannt und werden zum Beispiel von Green und Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2012)) bereitgestellt. Mutationen können eine Vielzahl von Kategorien beinhalten, wie etwa Einzelbasen- Polymorphismen, Mikroduplikationsregionen, Indel und Inversionen, und sind in keiner Weise als einschränkend zu verstehen. Mutationen können „loss-of-function“-Mutationen beinhalten, die das normale Ergebnis einer Mutation sind, die eine Proteinaktivität reduziert oder aufhebt. Die meisten „loss-of-function“-Mutationen sind rezessiv, da bei einem Heterozygoten die zweite Chromosomenkopie eine nicht mutierte Version des Gens trägt, die für ein voll funktionsfähiges Protein kodiert, dessen Vorhandensein die Wirkung der Mutation ausgleicht. Mutationen umfassen auch „gain-of-function“-Mutationen, d. h. Mutationen, die einem Protein oder einer Zelle eine abnorme Aktivität verleihen, die im Normalzustand nicht vorhanden ist. Viele gain-of-function-Mutationen befinden sich in regulatorischen Sequenzen und nicht in kodierenden Regionen und können daher eine Reihe von Konsequenzen haben. Zum Beispiel kann eine Mutation dazu führen, dass ein oder mehrere Gene in den falschen Geweben exprimiert werden und diese Gewebe Funktionen erhalten, die ihnen normalerweise fehlen. Aufgrund ihrer Natur sind gain-of-function-Mutationen in der Regel dominant.
  • Mutationen können durch ortsgerichtete Mutagenese in ein Cas9-Referenzprotein eingeführt werden. Ältere Verfahren der im Fach bekannten ortsgerichteten Mutagenese beruhen auf der Subklonierung der zu mutierenden Sequenz in einen Vektor, wie etwa einen M13-Bakteriophagenvektor, der die Isolierung eines einzelsträngigen DNA-Templats ermöglicht. Bei diesen Verfahren wird ein mutagener Primer (d. h. ein Primer, der in der Lage ist, an die zu mutierende Stelle zu binden, aber ein oder mehrere Nukleotide mit Diskrepanz an der zu mutierenden Stelle trägt) an das einzelsträngige Templat gebunden und dann das Komplement des Templats ausgehend vom 3'-Ende des mutagenen Primers polymerisiert. Die resultierenden Duplexe werden dann in Wirtsbakterien transformiert und die Plaques auf die gewünschte Mutation untersucht. In jüngerer Zeit werden bei der ortsgerichteten Mutagenese PCR-Verfahren eingesetzt, die den Vorteil haben, dass sie keine einzelsträngige Template benötigen. Darüber hinaus wurden Verfahren entwickelt, die keine Subklonierung erfordern. Beim Ausführen der PCR-basierten ortsgerichteten Mutagenese müssen mehrere Aspekte berücksichtigt werden. Erstens ist es bei diesen Verfahren wünschenswert, die Anzahl der PCR-Zyklen zu reduzieren, um die Ausbreitung unerwünschter, von der Polymerase eingeführter Mutationen zu verhindern. Zweitens muss eine Selektion durchgeführt werden, um die Anzahl der nicht mutierten Elternmoleküle zu reduzieren, die in der Reaktion verbleiben. Drittens wird ein verlängertes PCR-Verfahren bevorzugt, um die Verwendung eines einzigen PCR-Primersatzes zu ermöglichen. Und viertens ist es aufgrund der nicht- templat-abhängigen terminalen Verlängerungsaktivität einiger thermostabiler Polymerasen häufig erforderlich, vor der Ligation des durch PCR erzeugten Mutantenprodukts am stumpfen Ende einen Endpolierschritt in das Verfahren einzubauen.
  • Mutationen können auch durch gerichtete Evolutionsprozesse eingeführt werden, wie etwa die phagengestützte kontinuierliche Evolution (PACE) oder die phagengestützte nicht- kontinuierliche Evolution (PANCE). Der hierin verwendete Begriff „phagengestützte kontinuierliche Evolution (PACE)“ bezieht sich auf eine kontinuierliche Evolution, bei der Phagen als virale Vektoren eingesetzt werden. Das allgemeine Konzept der PACE-Technologie wurde beispielsweise beschrieben in der internationalen PCT-Anmeldung PCT/US2009/056194, eingereicht am 8. September 2009, veröffentlicht als WO 2010/028347 am 11. März 2010; der internationalen PCT-Anmeldung PCT/US2011/066747, eingereicht am 22. Dezember 2011, veröffentlicht als WO 2012/088381 am 28. Juni 2012; der US-Anmeldung US-Patent Nr. 9,023,594 , ausgestellt am 5. Mai 2015, der internationalen PCT-Anmeldung PCT/US2015/012022, eingereicht am 20. Januar 2015, veröffentlicht als WO 2015/134121 am 11. September 2015, und der internationalen PCT-Anmeldung PCT/US2016/027795, eingereicht am 15. April 2016, veröffentlicht als WO 2016/168631 am 20. Oktober 2016, deren gesamter Inhalt hierin durch Bezugnahme aufgenommen sind. Cas9-Varianten können auch durch „phagengestützte nicht-kontinuierliche Evolution (PANCE)“ erhalten werden, was sich hierin auf nicht-kontinuierliche Evolution bezieht, bei der Phagen als virale Vektoren eingesetzt werden. PANCE ist eine vereinfachte Technik für die schnelle gerichtete In-vivo- Evolution, bei der serielle Kolbenübertragungen von evolvierenden „Selektionsphagen“ (SP), die ein zu evolvierendes Gen von Interesse enthalten, über frische E. coli-Wirtszellen erfolgen, wodurch die Gene in den E. coli-Wirtszellen konstant gehalten werden können, während die in den SP enthaltenen Gene kontinuierlich evolvieren. Serielle Kolbenübertragungen sind seit langem ein weithin zugänglicher Ansatz für die Laborevolution von Mikroben, und in jüngerer Zeit wurden analoge Ansätze für die Bakteriophagenevolution entwickelt. Das PANCE- System weist eine geringere Stringenz als das PACE-System auf.
  • Alle oben genannten Referenzen, die sich auf Cas9 oder Cas9-Äquivalente beziehen, werden hiermit in ihrer Gesamtheit durch Bezugnahme aufgenommen, sofern dies nicht bereits angegeben ist.
  • J. Geteilte napDNAbp-Domänen für gesplittete PE-Einschleusung
  • In verschiedenen Ausführungsformen können die hierin beschriebenen Prime-Editoren in Form von zwei oder mehr Fragmenten, die innerhalb der Zelle (entweder durch passive Zusammensetzung oder durch aktive Zusammensetzung, wie etwa unter Verwendung von gesplitteten Intein-Sequenzen) zu einem rekonstituierten Prime-Editor zusammengesetzt werden, in Zellen eingeschleust werden. In einigen Fällen kann die Selbstzusammensetzung passiv sein, wobei sich die zwei oder mehr Fragmente des Prime-Editors innerhalb der Zelle kovalent oder nicht kovalent verbinden, um den Prime-Editor zu rekonstituieren. In anderen Fällen kann die Selbstzusammensetzung durch Dimerisierungsdomänen katalysiert werden, die auf jedem der Fragmente eingebaut sind. Beispiele für Dimerisierungsdomänen sind hierin beschrieben. In wieder anderen Fällen kann die Selbstzusammensetzung durch geteilte Intein- Sequenzen katalysiert werden, die auf jedem der Prime-Editor-Fragmente eingebaut sind.
  • Eine geteilte PE-Einschleusung kann vorteilhaft sein, um verschiedenen Größenbeschränkungen unterschiedlicher Einschleusungsansätze zu begegnen. Zum Beispiel können Einschleusungsansätze Verfahren auf der Basis von Viren, Boten-RNA oder RNP (Ribonukleoprotein) beinhalten. Jedes dieser Verfahren kann effizienter und/oder effektiver sein, wenn der Prime-Editor in kleinere Teile zerlegt wird. In der Zelle angekommen, können sich die kleineren Teile zu einem funktionsfähigen Prime-Editor zusammensetzen. Je nach Art des Splittings können sich die geteilten Prime-Editor-Fragmente auf nicht-kovalente oder kovalente Weise wieder zusammensetzen, um den Prime-Editor neu zu bilden. In einer Ausführungsform kann der Prime-Editor an einer oder mehreren Splitstellen in zwei oder mehr Fragmente gesplittet werden. Die Fragmente können unverändert bleiben (außer, dass sie gesplittet werden). Sobald die Fragmente in die Zelle eingeschleust sind (z. B. durch direkte Einschleusung eines Ribonukleoproteinkomplexes oder durch Einschleusung von Nukleinsubstanzen - z. B. mRNA oder durch einen Virusvektor), können sich die Fragmente kovalent oder nicht-kovalent reassoziieren, um den Prime-Editor wiederherzustellen. In einer anderen Ausführungsform kann der Prime-Editor an einer oder mehreren Splitstellen in zwei oder mehr Fragmente gesplittet werden. Jedes der Fragmente kann so modifiziert werden, dass es eine Dimerisierungsdomäne umfasst, wobei jedes entstehende Fragment an eine Dimerisierungsdomäne gekoppelt ist. Sobald die Dimerisierungsdomänen der verschiedenen Fragmente in eine Zelle eingeschleust oder dort exprimiert werden, assoziieren und binden sie sich aneinander, wodurch die verschiedenen Prime-Editor-Fragmente zu einem funktionellen Prime-Editor zusammengefügt werden. In einer weiteren Ausführungsform kann das Prime- Editor-Fragment so modifiziert werden, dass es ein gesplittetes Intein umfasst. Sobald es in eine Zelle eingeschleust oder exprimiert wird, assoziieren und binden sich die gesplitteten Intein-Domänen der verschiedenen Fragmente aneinander und werden dann einem Trans- Splicing unterzogen, das zur Exzision der Split-Intein-Domänen aus jedem der Fragmente und zur gleichzeitigen Bildung einer Peptidbindung zwischen den Fragmenten führt, wodurch der Prime-Editor wiederhergestellt wird.
  • In einer Ausführungsform kann der Prime-Editor durch einen Split-Intein-Ansatz eingeschleustwerden.
  • Der Ort der Splitstelle kann zwischen einem oder mehreren Paaren von Resten im Prime-Editor und in beliebigen Domänen darin positioniert werden, einschließlich innerhalb der napDNAbp-Domäne, der Polymerase-Domäne (z. B. RT-Domäne), der Linker-Domäne, die die napDNAbp-Domäne und die Polymerase-Domäne miteinander verbindet.
  • In einer Ausführungsform, dargestellt in 66, ist der Prime-Editor (PE) an einer Splitstelle innerhalb der napDNAbp geteilt.
  • In bestimmten Ausführungsformen ist das napDNAbp ein kanonisches SpCas9- Polypeptid der SEQ-ID-NR: 18, wie folgt:
    SpCas9 Streptococcus pyogenes M1 SwissProt Zugriffs-Nr. Q99ZW2 Wildtyp
    Figure DE112021002672T5_0104
    		 SEQ-ID-Nr: 18
    1368 AA
  • In bestimmten Ausführungsformen wird das SpCas9 an einer Splitstelle in zwei Fragmente gesplittet, die sich zwischen den Resten 1 und 2, 2 und 3, 3 und 4, 4 und 5, 5 und 6, 6 und 7, 7 und 8, 8 und 9, 9 und 10 oder zwischen zwei beliebigen Paaren von Resten irgendwo zwischen den Resten 1-10, 10-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 90-100, 100-200, 200-300, 300-400, 400-500, 500-600, 600-700, 700-800, 800-900, 1000-1100, 1100- 1200, 1200-1300, oder 1300-1368 des kanonischen SpCas9 der SEQ-ID-NR: 18 befindet.
  • In bestimmten Ausführungsformen wird ein napDNAbp an einer Splitstelle in zwei Fragmente gesplittet, die sich an einem Restepaar befindet, das zwei beliebigen Restepaaren entspricht, die sich irgendwo zwischen den Positionen 1-10, 10-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50- 60, 60-70, 70-80, 80-90, 90-100, 100-200, 200-300, 300-400, 400-500, 500-600, 600-700, 700- 800, 800-900, 1000-1100, 1100-1200, 1200-1300, oder 1300-1368 des kanonischen SpCas9 der SEQ-ID-NR: 18 befindet.
  • In bestimmten Ausführungsformen wird das SpCas9 an einer Splitstelle in zwei Fragmente gesplittet, die sich zwischen den Resten 1 und 2, 2 und 3, 3 und 4, 4 und 5, 5 und 6, 6 und 7, 7 und 8, 8 und 9, 9 und 10 oder zwischen zwei beliebigen Paaren von Resten irgendwo zwischen den Resten 1-10, 10-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 90-100, 100-200, 200-300, 300-400, 400-500, 500-600, 600-700, 700-800, 800-900, 1000-1100, 1100- 1200, 1200-1300, oder 1300-1368 des kanonischen SpCas9 der SEQ-ID-NR: 18 befindet. In bestimmten Ausführungsformen befindet sich die Splitstelle an einer oder mehreren Polypeptidbindungsstellen (d. h. eine „Splitstelle oder Split-Intein-Splitstelle“), die mit einem gesplitteten Intein fusioniert und dann als getrennt kodierte Fusionsproteine in die Zellen eingeschleust werden. Sobald die Split-Intein-Fusionsproteine (d. h. die Proteinhälften) in einer Zelle exprimiert werden, werden die Proteine Trans-Splicing unterzogen, um einen vollständigen oder ganzen PE zu bilden, wobei gleichzeitig die verbundenen Split-Intein- Sequenzen entfernt werden.
  • Zum Beispiel, wie in 66 gezeigt, kann das N-terminale Extein mit einem ersten gesplitteten Protein (z. B. N-Intein) und das C-terminale Extein mit einem zweiten gesplitteten Protein (z. B. C-Intein) fusioniert werden. Das N-terminale Extein wird mit dem C-terminalen Extein fusioniert, um ein ganzes Prime-Editor-Fusionsprotein zu bilden, das eine napDNAbp- Domäne und eine Polymerase-Domäne (z. B. RT-Domäne) umfasst, und zwar nach der Selbstassoziation des N-Inteins und des C-Inteins innerhalb der Zelle, gefolgt von ihrer Selbstabspaltung und der gleichzeitigen Bildung einer Peptidbindung zwischen den N- terminalen Extein- und C-terminalen Extein-Abschnitten eines ganzen Prime-Editors (PE).
  • Um die Vorteile einer Split-PE-Einschleusungsstrategie unter Verwendung von Split- Inteins zu nutzen, muss der Prime-Editor an einer oder mehreren Splitstellen geteilt werden, um mindestens zwei getrennte Hälften eines Prime-Editors zu schaffen, von denen jede innerhalb einer Zelle wieder zusammengefügt werden kann, wenn jede Hälfte mit einer Split- Intein-Sequenz fusioniert ist.
  • In bestimmten Ausführungsformen wird der Prime-Editor an einer einzigen Splitstelle gesplittet. In bestimmten anderen Ausführungsformen wird der Prime-Editor an zwei Splitstellen oder an drei Splitstellen oder an vier Splitstellen oder an mehr gesplittet.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird der Prime-Editor an einer einzigen Splitstelle gesplittet, um zwei getrennte Hälften eines Prime-Editors zu erzeugen, von denen jede mit einer Split-Intein-Sequenz fusioniert werden kann.
  • Ein beispielhaftes Split-Intein ist das Ssp-DnaE-Intein, das zwei Untereinheiten umfasst, nämlich DnaE-N und DnaE-C. Die beiden unterschiedlichen Untereinheiten werden von separaten Genen kodiert, nämlich dnaE-n und dnaE-c, die die Untereinheiten DnaE-N bzw. DnaE-C kodieren. DnaE ist ein natürlich vorkommendes Split-Intein in Synechocytis sp. PCC6803 und ist in der Lage, das Trans-Splicing von zwei separaten Proteinen zu steuern, die jeweils eine Fusion mit DnaE-N oder DnaE-C umfassen.
  • Weitere natürlich vorkommende oder künstlich hergestellte Split-Intein-Sequenzen sind bekannt oder können aus den hierin beschriebenen oder in der Fachwelt verfügbaren Ganz- Intein-Sequenzen hergestellt werden. Beispiele für Split-Intein-Sequenzen sind zu finden in Stevens et al. „A promiscuous split intein with expanded protein engineering applications", PNAS, 2017, Vol. 114: 8538-8543; Iwai et al. „Highly efficient protein trans-splicing by a naturally split DnaE intein from Nostc punctiforme", FEBS Lett, 580: 1853-1858, die hierin durch Bezugnahme aufgenommen sind. Weitere Split-Intein-Sequenzen finden sich zum Beispiel in WO 2013/045632 , WO 2014/055782 , WO 2016/069774 und EP2877490 , deren Inhalte hierin jeweils durch Bezugnahme aufgenommen sind.
  • Darüber hinaus wurde das Proteinspleißen in trans in vivo und in vitro beschrieben (Shingledecker, et al., Gene 207:187 (1998), Southworth, et al., EMBOJ. 17:918 (1998); Mills, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:3543-3548 (1998); Lew, et al., J. Biol. Chem., 273:15887- 15890 (1998); Wu, et al., Biochim. Biophys. Acta 35732:1 (1998b), Yamazaki, et al., J. Am. Chem. Soc. 120:5591 (1998), Evans, et al., J. Biol. Chem. 275:9091 (2000); Otomo, et al., Biochemistry 38:16040-16044 (1999); Otomo, et al., J. Biolmol. NMR 14:105-114 (1999); Scott, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:13638-13643 (1999)) und stellt die Möglichkeit bereit, ein Protein in zwei inaktiven Fragmenten zu exprimieren, die anschließend durch Ligation ein funktionelles Produkt bilden, z. B. wie in 66 und 67 im Hinblick auf die Bildung eines vollständigen PE-Fusionsproteins aus zwei getrennt exprimierten Hälften gezeigt.
  • In verschiedenen hierin beschriebenen Ausführungsformen können die Verfahren der kontinuierlichen Evolution (z. B. PACE) verwendet werden, um einen ersten Abschnitt eines Baseneditors zuevolvieren. Ein erster Abschnitt könnte eine einzelne Komponente oder Domäne beinhalten, z. B. eine Cas9-Domäne, eine Deaminase-Domäne oder eine UGI- Domäne. Die separat evolvierte Komponente oder Domäne kann dann mit den verbleibenden Abschnitten des Baseneditors innerhalb einer Zelle fusioniert werden, indem sowohl der evolvierte Abschnitt als auch die verbleibenden nicht evolvierten Abschnitte mit Split-Intein- Polypeptiddomänen separat exprimiert werden. Der erste Abschnitt könnte im weiteren Sinne einen beliebigen ersten Aminosäureabschnitt eines Baseneditors beinhalten, der mit einem hierin beschriebenen kontinuierlichen Evolutionsverfahren evolviert werden soll. Der zweite Abschnitt würde sich in dieser Ausführungsform auf den verbleibenden Aminosäureabschnitt des Baseneditors beziehen, der nicht mit den hierin beschriebenen Verfahren evolviert wird. Der evolvierte erste Abschnitt und der zweite Abschnitt des Baseneditors könnten jeweils mit Split-Intein-Polypeptiddomänen in einer Zelle exprimiert werden. Die natürlichen Proteinspleißmechanismen der Zelle würden den evolvierten ersten Abschnitt und den nicht evolvierten zweiten Abschnitt zu einem einzigen Fusionsprotein zusammenfügen, das einen evolvierten Basis-Editor darstellt. Der evolvierte erste Abschnitt kann entweder den N- oder den C-terminalen Teil des einzelnen Fusionsproteins umfassen. In analoger Weise könnte die Verwendung eines zweiten orthogonalen Trans-Splicing-Intein-Paares es ermöglichen, dass der evolvierte erste Abschnitt einen internen Teil des einzelnen Fusionsproteins umfasst.
  • Auf diese Weise kann jede der hierin beschriebenen evolvierten und nicht evolvierten Komponenten der Baseneditoren mit Split-Intein-Tags exprimiert werden, um die Bildung eines vollständigen Baseneditors, der die evolvierte und nicht evolvierte Komponente umfasst, in einer Zelle zu erleichtern.
  • Der Mechanismus des Proteinspleißprozesses ist sehr detailliert untersucht worden (Chong, et al., J. Biol. Chem. 1996, 271, 22159-22168; Xu, M-Q & Perler, F. B. EMBO Journal, 1996, 15, 5146-5153) und es wurden konservierte Aminosäuren an den Intein- und Extein-Spleißstellen gefunden (Xu, et al., EMBO Journal, 1994, 13 5517-522). Die hierin beschriebenen Konstrukte enthalten eine Intein-Sequenz, die an den 5'-Terminus des ersten Gens (z. B. den evolvierten Abschnitt des Baseneditors) fusioniert ist. Geeignete Intein- Sequenzen können aus allen Proteinen ausgewählt werden, von denen bekannt ist, dass sie Proteinspleiß-Elemente enthalten. Eine Datenbank, die alle bekannten Inteine enthält, ist im World Wide Web zu finden (Perler, F. B. Nucleic Acids Research, 1999, 27, 346-347). Die Intein-Sequenz ist am 3'-Ende mit dem 5'-Ende eines zweiten Gens fusioniert. Um dieses Gen auf eine bestimmte Organelle auszurichten, kann ein Peptidsignal an die kodierende Sequenz des Gens fusioniert werden. Nach dem zweiten Gen kann die Sequenz des Intein-Gens zur Exprimierung mehrerer Proteine in derselben Zelle beliebig oft wiederholt werden. Bei Konstrukten, die mehrere Inteins enthalten, kann es sinnvoll sein, Intein-Elemente aus verschiedenen Quellen zu verwenden. Nach der Sequenz des letzten zu exprimierenden Gens muss eine Transkriptionsterminationssequenz eingefügt werden. In einer Ausführungsform wird eine modifizierte Intein-Spleißeinheit so ausgestaltet, dass sie sowohl die Exzision der Exteine von den Inteinen katalysieren als auch die Ligation der Exteine verhindern kann. Die Mutagenese der C-terminalen Extein-Kreuzung in der GB-D-DNA-Polymerase der Spezies Pyrococcus führte zu einem veränderten Spleiß-Element, das die Abspaltung von Exteinen und Inteinen bewirkt, aber die anschließende Ligation der Exteine verhindert (Xu, M-Q & Perler, F. B. EMBO Journal, 1996, 15, 5146-5153). Die Mutation von Serin 538 zu einem Alanin oder Glycin induzierte die Spaltung, verhinderte aber die Ligation. Die Mutation äquivalenter Reste in anderen Intein-Spleißeinheiten sollte aufgrund der Erhaltung von Aminosäuren an der C- terminalen Extein-Verbindung zum Intein ebenfalls die Extein-Ligation verhindern. Ein bevorzugtes Intein, das keine Endonuklease-Domäne enthält, ist das Mycobacterium xenopi GyrA-Protein (Telenti, et al. J. Bacteriol. 1997, 179, 6378-6382). Andere wurden in der Natur gefunden oder künstlich hergestellt, indem die Endonuklease-Domänen aus endonukleasehaltigen Inteinen entfernt wurden (Chong, et al. J. Biol. Chem. 1997, 272, 15587- 15590). In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Intein so ausgewählt, dass es aus der minimalen Anzahl von Aminosäuren besteht, die zum Ausführen der Spleißfunktion erforderlich sind, wie etwa das Intein aus dem Mycobacterium xenopi GyrA-Protein (Telenti, A., et al., J. Bacteriol. 1997, 179, 6378-6382). In einer alternativen Ausführungsform wird ein Intein ohne Endonuklease-Aktivität gewählt, wie etwa das Intein des Mycobacterium xenopi GyrA-Proteins oder das VMA-Intein von Saccharaomyces cerevisiae, das so modifiziert wurde, dass die Endonuklease-Domänen entfernt wurden (Chong, 1997). Eine weitere Modifikation der Intein-Spleißeinheit kann es ermöglichen, die Reaktionsgeschwindigkeit der Spaltreaktion zu verändern, so dass die Proteindosierung durch einfache Modifizierung der Gensequenz der Spleißeinheit gesteuert werden kann.
  • Inteine können auch als zwei Fragmente vorliegen, die von zwei getrennt transkribierten und übersetzten Genen kodiert werden. Diese so genannten Split-Inteine assoziieren sich selbst und katalysieren die Proteinspleißaktivität in trans. Split-Inteine wurden in verschiedenen Cyanobakterien und Archaeen nachgewiesen (Caspi et al, Mol Microbiol. 50: 1569-1577 (2003); Choi J. et al, J Mol Biol. 556: 1093-1106 (2006.); Dassa B. et al, Biochemistry. 46:322-330 (2007.); Liu X. und Yang J., J Biol Chem. 275:26315-26318 (2003); Wu H. et al.
  • Proc Natl Acad Sei USA. £5:9226-9231 (1998.); und Zettler J. et al, FEBS Letters. 553:909-914 (2009)), wurden aber bisher noch nicht in Eukaryoten gefunden. Kürzlich wurden bei einer bioinformatischen Analyse von Umwelt-Metagenomdaten 26 verschiedene Loci mit einer neuartigen genomischen Anordnung entdeckt. An jedem Locus ist eine konservierte Enzymkodierungsregion durch ein Split-Intein unterbrochen, wobei zwischen den Abschnitten, die für Intein-Subdomänen kodieren, ein freistehendes Endonuklease-Gen eingefügt ist. Von diesen wurden fünf Loci vollständig zusammengefügt: DNA-Helikasen (gp41-1, gp41-8); Inosin-5'-Monophosphat-Dehydrogenase (IMPDH-1); und katalytische Untereinheiten der Ribonukleotid-Reduktase (NrdA-2 und NrdJ-1). Diese zersplitterte Genorganisation scheint hauptsächlich bei Phagen aufzutreten (Dassa et al, Nucleic Acids Research. 57:2560-2573 (2009)). 57:2560-2573 (2009)).
  • Das Split-Intein Npu DnaE wurde als das mit der höchsten Rate charakterisiert, die für die Protein-Transspleißreaktion berichtet wurde. Darüber hinaus gilt die Npu DnaE- Proteinspleißreaktion als robust und ertragreich in Bezug auf verschiedene Extein-Sequenzen, Temperaturen von 6 bis 37 °C und die Anwesenheit von bis zu 6 M Harnstoff (Zettler J. et al, FEBS Letters. 553:909-914 (2009); Iwai I. et al, FEBS Letters 550: 1853-1858 (2006)). Wie erwartet, wurde bei Einführung der Cysl-Ala-Mutation in der N-Domäne dieser Inteine die anfängliche N- zu S-Acylverschiebung und damit das Proteinspleißen blockiert. Leider wurde auch die C-terminale Spaltreaktion fast vollständig gehemmt. Die Abhängigkeit der Asparagin- Cyclisierung an der C-terminalen Spleißstelle von der Acylverschiebung an der N-terminalen spaltbaren Peptidbindung scheint eine einzigartige Eigenschaft zu sein, die den natürlich gesplitteten DnaE-Intein-Allelen gemeinsam ist (Zettler J. et al. FEBS Letters. 555:909-914 (2009)).
  • Der Mechanismus des Proteinspleißens umfasst in der Regel vier Schritte [29-30]: 1) eine N-S- oder N-O-Acylverschiebung am N-Terminus des Inteins, die die stromaufwärts gelegene Peptidbindung bricht und eine Esterbindung zwischen dem N-Extein und der Seitenkette der ersten Aminosäure des Inteins (Cys oder Ser) bildet; 2) eine Umesterung, die das N-Extein an den C-Terminus des Inteins verlagert und eine neue Esterbindung bildet, die das N-Extein mit der Seitenkette der ersten Aminosäure des C-Exteins (Cys, Ser oder Thr) verknüpft; 3) eine Asn-Cyclisierung, die die Peptidbindung zwischen dem Intein und dem C- Extein bricht; und 4) eine S-N- oder O-N-Acylverschiebung, die die Esterbindung durch eine Peptidbindung zwischen dem N-Extein und dem C-Extein ersetzt.
  • Das Trans-Splicing von Proteinen, das durch Split-Inteine katalysiert wird, stellt ein rein enzymatisches Verfahren zur Proteinbindung bereit [31]. Bei einem Split-Intein handelt es sich im Wesentlichen um ein zusammenhängendes Intein (z. B. ein Mini-Intein), das in zwei Teile, das N-Intein und das C-Intein, gesplittet wird. Das N-Intein und das C-Intein eines Split- Inteins können sich nicht-kovalent assoziieren, um ein aktives Intein zu bilden und die Spleißreaktion im Wesentlichen auf die gleiche Weise zu katalysieren wie ein zusammenhängendes Intein. Split-Inteine wurden in der Natur gefunden und auch in Laboren hergestellt [31-35]. Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „Split-Intein“ auf jedes Intein, bei dem eine oder mehrere Peptidbindungen zwischen den N-terminalen und C- terminalen Aminosäuresequenzen unterbrochen sind, so dass die N-terminalen und C- terminalen Sequenzen zu separaten Molekülen werden, die sich nicht-kovalent reassoziieren oder zu einem Intein rekonstituieren können, das für Trans-Splicing-Reaktionen funktional ist. Jedes katalytisch aktive Intein oder Fragment davon kann verwendet werden, um ein Split- Intein zur Verwendung in den erfindungsgemäßen Verfahren abzuleiten. Zum Beispiel kann in einem Aspekt das Split-Intein von einem eukaryotischen Intein abgeleitet sein. In einem anderen Aspekt kann das Split-Intein von einem bakteriellen Intein abgeleitet sein. In einem anderen Aspekt kann das Split-Intein von einem Archaeen-Intein abgeleitet sein. Vorzugsweise besitzt das so abgeleitete Split-Intein nur die Aminosäuresequenzen, die für die Katalyse von Trans-Splicing-Reaktionen wesentlich sind.
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich das „N-terminale Split-Intein (In)“ auf jede Intein- Sequenz, die eine N-terminale Aminosäuresequenz umfasst, die für Trans-Splicing-Reaktionen funktionell ist. Ein In umfasst also auch eine Sequenz, die beim Trans-Splicing ausgespleißt wird. Ein In kann eine Sequenz umfassen, die eine Modifikation des N-terminalen Abschnitts einer natürlich vorkommenden Intein-Sequenz ist. Zum Beispiel kann ein In zusätzliche Aminosäurereste und/oder mutierte Reste umfassen, solange der Einschluss solcher zusätzlichen und/oder mutierten Reste das In beim Trans-Splicing nicht funktionsunfähig macht. Vorzugsweise verbessert oder steigert die Aufnahme der zusätzlichen und/oder mutierten Reste die Trans-Splicing-Aktivität des In.
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich das „C-terminale Split-Intein (Ic)“ auf jede Intein- Sequenz, die eine C-terminale Aminosäuresequenz umfasst, die für Trans-Splicing-Reaktionen funktionell ist. In einem Aspekt umfasst das Ic 4 bis 7 zusammenhängende Aminosäurereste, von denen mindestens 4 Aminosäuren aus dem letzten β-Strang des Inteins stammen, von dem es abgeleitet wurde. Ein Ic umfasst also auch eine Sequenz, die beim Trans-Splicing ausgespleißt wird. Ein Ic kann eine Sequenz umfassen, die eine Modifikation des C-terminalen Abschnitts einer natürlich vorkommenden Intein-Sequenz ist. Zum Beispiel kann ein Ic zusätzliche Aminosäurereste und/oder mutierte Reste umfassen, solange die Aufnahme solcher zusätzlichen und/oder mutierten Reste das In beim Trans-Splicing nicht funktionsunfähig macht. Vorzugsweise verbessert oder steigert die Aufnahme der zusätzlichen und/oder mutierten Reste die Trans-Splicing-Aktivität des Ic.
  • In einigen Ausführungsformen der Erfindung kann ein mit einem Ic oder einem In verknüpftes Peptid eine zusätzliche chemische Einheit umfassen, die unter anderem Fluoreszenzgruppen, Biotin, Polyethylenglykol (PEG), Aminosäureanaloga, unnatürliche Aminosäuren, Phosphatgruppen, Glycosylgruppen, Radioisotopenmarker und pharmazeutische Moleküle beinhaltet. In anderen Ausführungsformen kann ein mit einem Ic verknüpftes Peptid eine oder mehrere chemisch reaktive Gruppen umfassen, die u. a. Keton, Aldehyd, Cys-Reste und Lys-Reste beinhalten. Das N-Intein und das C-Intein eines Split- Inteins können sich nicht-kovalent verbinden, um ein aktives Intein zu bilden und die Spleißreaktion zu katalysieren, wenn ein „Intein-Splicing-Polypeptid (ISP)“ vorhanden ist. Wie hierin verwendet, bezieht sich „Intein-Splicing-Polypeptid (ISP)“ auf den Abschnitt der Aminosäuresequenz eines Split-Inteins, der übrig bleibt, wenn das Ic, das In oder beide aus dem Split-Intein entfernt werden. In bestimmten Ausführungsformen umfasst das In das ISP. In einer anderen Ausführungsform umfasst das Ic die ISP. In einer weiteren Ausführungsform ist das ISP ein separates Peptid, das weder mit In noch mit Ic kovalent verknüpft ist.
  • Split-Inteine können aus zusammenhängenden Inteinen gebildet werden, indem eine oder mehrere Splitstellen in die unstrukturierte Schleife oder die dazwischen liegende Aminosäuresequenz zwischen den -12 konservierten Betasträngen, die in der Struktur der Mini-Inteine zu finden sind, eingebaut werden [25-28]. Eine gewisse Flexibilität bei der Position der Splitstellen in den Regionen zwischen den Betasträngen ist möglich, vorausgesetzt, dass die Struktur des Inteins, insbesondere die strukturierten Betastränge, durch die Schaffung des Splits nicht so stark gestört wird, dass die Proteinspleißaktivität verloren geht.
  • Beim Trans-Splicing von Proteinen besteht ein Vorläuferprotein aus einem N-Extein- Teil, auf den das N-Intein folgt, ein anderes Vorläuferprotein besteht aus dem C-Intein, auf das ein C-Extein-Teil folgt, und eine Trans-Splicing-Reaktion (die von den N- und C-Inteinen gemeinsam katalysiert wird) schneidet die beiden Intein-Sequenzen heraus und verknüpft die beiden Extein-Sequenzen mit einer Peptidbindung. Protein-Trans-Splicing ist eine enzymatische Reaktion, die mit sehr niedrigen (z. B. mikromolaren) Proteinkonzentrationen arbeiten kann und unter physiologischen Bedingungen durchgeführt werden kann.
  • [2] Andere programmierbare Nukleasen
  • In verschiedenen hierin beschriebenen Ausführungsformen umfassen die Multi-Flap- Prime-Editoren ein napDNAbp, wie etwa ein Cas9-Protein. Diese Proteine sind dadurch „programmierbar“, dass sie mit einer Leit-RNA (bzw. einer PEgRNA) komplexiert werden, die das Cas9-Protein zu einer Zielstelle auf der DNA führt, die eine Sequenz besitzt, die komplementär zum Spacer-Abschnitt der gRNA (oder PEgRNA) ist und die auch die erforderliche PAM-Sequenz besitzt. In bestimmten hier vorgesehenen Ausführungsformen kann das napDNAbp jedoch durch eine andere Art von programmierbarem Protein ersetzt werden, wie etwa eine Zinkfinger-Nuklease oder eine Transkriptionsaktivator-ähnliche Effektornuklease (TALEN).
  • 1J zeigt eine solche hierin vorgesehene Variante des Prime-Editing, bei der das napDNAbp (z. B. SpCas9-Nickase) durch eine beliebige programmierbare Nuklease-Domäne, wie etwa Zinkfinger-Nukleasen (ZFN) oder Transkriptionsaktivator-ähnliche Effektornukleasen (TALEN), ersetzt wird. Geeignete Nukleasen müssen also nicht unbedingt durch ein Nukleinsäure-Zielmolekül (wie etwa eine Leit-RNA) „programmiert“ werden, sondern können auch durch die Definition der Spezifität einer DNA-Bindungsdomäne, wie etwa und insbesondere einer Nuklease, programmiert werden. Wie etwa beim Prime-Editing mit napDNAbp-Molekülen ist es vorzuziehen, dass solche alternativen programmierbaren Nukleasen so modifiziert werden, dass nur ein Strang einer Ziel-DNA geschnitten wird. Mit anderen Worten sollten die programmierbaren Nukleasen vorzugsweise als Nickasen funktionieren. Sobald eine programmierbare Nuklease ausgewählt wurde (z. B. eine ZFN oder eine TALEN), können zusätzliche Funktionalitäten in das System eingebaut werden, damit es gemäß einem Prime-Editing-ähnlichen Mechanismus operieren kann. Zum Beispiel können die programmierbaren Nukleasen modifiziert werden, indem (z. B. über einen chemischen Linker) ein RNA- oder DNA-Verlängerungsarm daran gekoppelt wird, wobei der Verlängerungsarm eine Primer-Bindungsstelle (PBS) und ein DNA-Synthese-Templat umfasst. Die programmierbare Nuklease kann auch (z. B. über einen chemischen Linker oder einen Aminosäure-Linker) an eine Polymerase gekoppelt sein, deren Art davon abhängt, ob der Verlängerungsarm aus DNA oder RNA besteht. Im Falle eines RNA-Verlängerungsarms kann die Polymerase eine RNA-abhängige DNA-Polymerase sein (z. B. eine reverse Transkriptase). Im Falle eines DNA-Verlängerungsarms kann die Polymerase eine DNA-abhängige DNA- Polymerase sein (z. B. eine prokaryotische Polymerase, die Pol I, Pol II oder Pol III beinhaltet, oder eine eukaryotische Polymerase, die Pol a, Pol b, Pol g, Pol d, Pol e oder Pol z beinhaltet). Das System kann auch andere Funktionalitäten beinhalten, die als Fusionen zu den programmierbaren Nukleasen hinzugefügt werden, oder die in trans hinzugefügt werden, um die Reaktion als Ganzes zu erleichtern (z. B. (a) eine Helikase zum Abwickeln der DNA an der Schnittstelle, um den geschnittenen Strang mit dem 3'-Ende als Primer verfügbar zu machen, (b) ein FEN1 zur Unterstützung der Entfernung des endogenen Strangs auf dem geschnittenen Strang, um die Reaktion zum Austausch des endogenen Strangs durch den synthetisierten Strang voranzutreiben, oder (c) einen nCas9:gRNA-Komplex zur Erzeugung eines zweiten Nicks auf dem gegenüberliegenden Strang, der dazu beitragen kann, die Integration der synthetisierten Reparatur durch eine bevorzugte zelluläre Reparatur des nicht editierten Strangs voranzutreiben). In Analogie zum Prime-Editing mit einer napDNAbp könnte ein solcher Komplex mit einer ansonsten programmierbaren Nuklease verwendet werden, um einen neu synthetisierten Austausch-DNA-Strang, der eine gewünschte Änderung trägt, zu synthetisieren und dann dauerhaft in eine Zielstelle der DNA einzubauen.
  • Geeignete alternative programmierbare Nukleasen sind in der Technik wohlbekannt, die anstelle eines napDNAbp:gRNA-Komplexes verwendet werden können, um ein alternatives Prime-Editor-System zu konstruieren, das so programmiert werden kann, dass es selektiv an eine Ziel-DNA-Stelle bindet, und das ferner in der oben beschriebenen Weise modifiziert werden kann, um eine Polymerase und einen RNA- oder DNA-Verlängerungsarm, der eine Primer-Bindungsstelle und ein DNA-Synthese-Templat umfasst, zu einer spezifischen Nickstelle zu kolokalisieren. Zum Beispiel, und wie in 1J dargestellt ist, können Transkriptionsaktivator-ähnliche Effektornukleasen (TALENs) als programmierbare Nuklease in den hierin beschriebenen Verfahren und Stoffzusammensetzungen zum Multi-Flap-Prime- Editing verwendet werden. TALENS sind künstliche Restriktionsenzyme, die durch die Fusion der DNA-Bindungsdomäne des TAL-Effektors mit einer DNA-Spaltungsdomäne erzeugt werden. Diese Reagenzien ermöglichen eine effiziente, programmierbare und spezifische DNA-Spaltung und sind leistungsstarke Werkzeuge für das Genom-Editing in situ. Transkriptionsaktivator-ähnliche Effektoren (TALEs) können schnell so konstruiert werden, dass sie praktisch jede beliebige DNA-Sequenz binden. Der hier verwendete Begriff TALEN ist weit gefasst und beinhaltet einen monomeren TALEN, der doppelsträngige DNA ohne Unterstützung durch einen anderen TALEN spalten kann. Der Begriff TALEN wird auch für ein oder beide Mitglieder eines Paares von TALENs verwendet, die so konstruiert sind, dass sie zusammenarbeiten, um DNA an derselben Stelle zu spalten. TALENs, die zusammenarbeiten, können als Links-TALEN und Rechts-TALEN bezeichnet werden, was sich auf die Händigkeit der DNA bezieht. Siehe US-Ser. Nr. 12/965,590 ; US-Ser. Nr. 13/426,991 (US-Pat. Nr. 8,450,471 ); US-Ser. Nr. 13/427,040 (US-Pat. Nr. 8,440,431 ); US-Ser. Nr. 13/427,137 (US-Pat. Nr. 8,440,432 ); und US-Ser. Nr. 13/738,381 , die hierin jeweils in ihrer Gesamtheit durch Bezugnahme aufgenommen sind. Darüber hinaus werden TALENS beschrieben in WO 2015/027134 , US 9,181,535 , Boch et al., „Breaking the Code of DNA Binding Specificity of TAL-Type III Effectors", Science, Bd. 326, S. 1509-1512 (2009), Bogdanove et al., TAL Effectors: Customizable Proteins for DNA Targeting, Science, Bd. 333, S. 1843-1846 (2011), Cade et al., „Highly efficient generation of heritable zebrafish gene mutations using homo- and heterodimeric TALENs", Nucleic Acids Research, Bd. 40, S. 8001- 8010 (2012), und Cermak et al, „Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting“, Nucleic Acids Research, vol. 39, No. 17, e82 (2011), die hierin jeweils durch Bezugnahme aufgenommen sind.
  • Wie in 1J dargestellt ist, können Zinkfingernukleasen auch als alternative programmierbare Nukleasen zur Verwendung beim Multi-Flap-Prime-Editing anstelle von napDNAbps, wie etwa Cas9-Nickasen, verwendet werden. Wie bei TALENS können die ZFN- Proteine so modifiziert werden, dass sie als Nickasen fungieren, d. h., das ZFN wird so verändert, dass es nur einen Strang der Ziel-DNA schneidet, ähnlich wie das napDNAbp, das bei den hierin beschriebenen Multi-Flap-Prime-Editoren verwendet wird. ZFN-Proteine sind in der Fachwelt ausführlich beschrieben worden, zum Beispiel in Carroll et al. „Genome Engineering with Zinc-Finger Nucleases", Genetics, Aug 2011, Vol. 188: 773-782; Durai et al. „Zinc finger nucleases: custom-designed molecular scissors for genome engineering of plant and mammalian cells," Nucleic Acids Res, 2005, Vol. 33: 5978-90; und Gaj et al. „ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering," Trends Biotechnol. 2013, Vol.31: 397-405, die hierin jeweils in ihrer Gesamtheit durch Bezugnahme aufgenommen sind.
  • [3] Polymerasen (z. B. reverse Transkriptasen)
  • In verschiedenen Ausführungsformen beinhaltet das hierin offenbarte Multi-Flap- Prime-Editor-System eine Polymerase (z. B. DNA-abhängige DNA-Polymerase oder RNA- abhängige DNA-Polymerase, wie etwa Reverse Transkriptase) oder eine Variante davon, die als Fusionsprotein mit einer napDNAbp oder einer anderen programmierbaren Nuklease bereitgestellt werden kann, oder in trans.
  • Jede beliebige Polymerase kann in den hierin beschriebenen Multi-Flap-Prime- Editoren verwendet werden. Bei den Polymerasen kann es sich um Wildtyp-Polymerasen, funktionelle Fragmente, Mutanten, Varianten oder trunkierte Varianten und ähnliches handeln. Die Polymerasen können Wildtyp-Polymerasen aus eukaryotischen, prokaryotischen, archaealen oder viralen Organismen beinhalten und/oder die Polymerasen können durch Gentechnik, Mutagenese oder auf Evolution basierende Verfahren modifiziert sein. Die Polymerasen können T7-DNA-Polymerase, T5-DNA-Polymerase, T4-DNA-Polymerase, Klenow-Fragment-DNA-Polymerase, DNA-Polymerase III und dergleichen beinhalten. Die Polymerasen können auch thermostabil sein und Taq-, Tne-, Tma-, Pfu-, Tfl-, Tth-, Stoffel- Fragment-, VENT®- und DEEPVENT®-DNA-Polymerasen, KOD, Tgo, JDF3 sowie Mutanten, Varianten und Ableitungen davon beinhalten (siehe US-Pat. Nr. 5,436,149 ; US-Pat. Nr. 4,889,818 ; US-Pat. Nr. 4,965,185 ; US-Pat. Nr. 5,079,352 ; US-Pat. Nr. 5,614,365 ; US-Pat. Nr. 5,374,553 ; US-Pat. Nr. 5,270,179 ; US-Pat. Nr. 5,047,342 ; US-Pat. Nr. 5,512,462 ; WO 92/06188 ; WO 92/06200 ; WO 96/10640 ; Barnes, W. M., Gene 112:29-35 (1992); Lawyer, F. C., et al., PCR Meth. Appl. 2:275-287 (1993); Flaman, J.-M, et al., Nuc. Acids Res. 22(15): 3259- 3260(1994), die jeweils durch Bezugnahme aufgenommen sind). Für die Synthese längerer Nukleinsäuremoleküle (z. B. Nukleinsäuremoleküle mit einer Länge von mehr als 3- 5 Kb) können mindestens zwei DNA-Polymerasen eingesetzt werden. In bestimmten Ausführungsformen kann eine der Polymerasen im Wesentlichen keine 3'- Exonukleaseaktivität aufweisen und die andere kann eine 3'-Exonukleaseaktivität aufweisen. Solche Paarungen können gleiche oder unterschiedliche Polymerasen beinhalten. Beispiele für DNA-Polymerasen, denen es im Wesentlichen an 3'-Exonukleaseaktivität fehlt, beinhalten, sind unter anderem Taq, Tne(exo-), Tma(exo-), Pfu(exo-), Pwo(exo-), exo-KOD und Tth- DNA-Polymerasen sowie Mutanten, Varianten und Ableitungen davon.
  • Vorzugsweise sind die in den hierin offenbarten Multi-Flap-Prime-Editoren verwendbaren Polymerasen „Templat-abhängige“ Polymerasen (da die Polymerasen dazu bestimmt sind, sich auf das DNA-Synthese-Templat zu stützen, um die Sequenz des während des Prime-Editings zu synthetisierenden DNA-Strangs zu spezifizieren. Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „Templat-DNA-Molekül“ auf den Strang einer Nukleinsäure, aus dem ein komplementärer Nukleinsäurestrang durch eine DNA-Polymerase synthetisiert wird, zum Beispiel in einer Primer-Verlängerungsreaktion des DNA-Synthese-Templats einer PEgRNA.
  • Hierin bezieht sich der Begriff „Templat-abhängige Weise“ auf einen Prozess, der die Templat-abhängige Verlängerung eines Primermoleküls beinhaltet (z. B. DNA-Synthese durch DNA-Polymerase). Der Begriff „Templat-abhängige Weise“ bezieht sich auf die Polynukleotidsynthese von RNA oder DNA, bei der die Sequenz des neu synthetisierten Polynukleotidstrangs durch die bekannten Regeln der komplementären Basenpaarung bestimmt wird (siehe zum Beispiel Watson, J. D. et al., In: Molecular Biology of the Gene, 4th Ed., W. A. Benjamin, Inc., Menlo Park, Calif. (1987)). Der Begriff „komplementär“ bezieht sich auf das breite Konzept der Sequenzkomplementarität zwischen Regionen zweier Polynukleotidstränge oder zwischen zwei Nukleotiden durch Basenpaarung. Es ist bekannt, dass ein Adenin-Nukleotid in der Lage ist, spezifische Wasserstoffbrückenbindungen („Basenpaarung“) mit einem Nukleotid zu bilden, das Thymin oder Uracil ist. Ebenso ist bekannt, dass ein Cytosin-Nukleotid in der Lage ist, eine Basenpaarung mit einem Guanin- Nukleotid einzugehen. Im Falle des Prime-Editings kann man also sagen, dass der von der Polymerase des Prime-Editors gegen das DNA-Synthese-Templat synthetisierte DNA- Einzelstrang „komplementär“ zur Sequenz des DNA-Synthese-Templats ist.
  • A. Beispielhafte Polymerasen
  • In verschiedenen Ausführungsformen umfassen die hierin beschriebenen Multi-Flap- Prime-Editoren eine Polymerase. Die Offenbarung bezieht sich auf jede beliebige Wildtyp- Polymerase, die aus einem natürlich vorkommenden Organismus oder Virus oder aus einer kommerziellen oder nichtkommerziellen Quelle gewonnen wird. Darüber hinaus können die in den Multi-Flap-Prime-Editoren der Offenbarung verwendbaren Polymerasen jede natürlich vorkommende Mutantenpolymerase, gentechnisch veränderte Mutantenpolymerase oder andere Polymerasevarianten beinhalten, einschließlich trunkierter Varianten, die ihre Funktion beibehalten. Die hierin verwendbaren Polymerasen können auch so konstruiert sein, dass sie spezifische Aminosäuresubstitutionen enthalten, wie etwa die hierin offenbarten. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen sind die in den Multi-Flap-Prime-Editoren der Offenbarung verwendbaren Polymerasen Templat-basierte Polymerasen, d. h. sie synthetisieren Nukleotidsequenzen in einer Templat-abhängigen Weise.
  • Eine Polymerase ist ein Enzym, das einen Nukleotidstrang synthetisiert und das in Verbindung mit den hierin beschriebenen Multi-Flap-Prime-Editor-Systemen verwendet werden kann. Bei den Polymerasen handelt es sich vorzugsweise um „Templat-abhängige“ Polymerasen (d. h. um eine Polymerase, die einen Nukleotidstrang basierend auf der Reihenfolge der Nukleotidbasen eines Templat-Strangs synthetisiert). In bestimmten Konfigurationen können die Polymerasen auch „Templat-unabhängig“ sein (d. h. eine Polymerase, die einen Nukleotidstrang ohne die Notwendigkeit eines Templat-Strangs synthetisiert). Eine Polymerase kann ferner als „DNA-Polymerase“ oder „RNA-Polymerase“ kategorisiert werden. In verschiedenen Ausführungsformen umfassen die Multi-Flap-Prime- Editor-Systeme eine DNA-Polymerase. In verschiedenen Ausführungsformen kann die DNA- Polymerase eine „DNA-abhängige DNA-Polymerase“ sein (d. h. das Templatmolekül ist ein DNA-Strang). In solchen Fällen kann das DNA-Templatmolekül eine PEgRNA sein, wobei der Verlängerungsarm einen DNA-Strang umfasst. In solchen Fällen kann die PEgRNA als chimäre oder hybride PEgRNA bezeichnet werden, die einen RNA-Abschnitt (d. h. die Komponenten der Leit-RNA, einschließlich des Spacers und des gRNA-Kerns) und einen DNA-Abschnitt (d. h. den Verlängerungsarm) umfasst. In verschiedenen anderen Ausführungsformen kann die DNA-Polymerase eine „RNA-abhängige DNA-Polymerase“ sein (d. h. das Templatmolekül ist ein RNA-Strang). In solchen Fällen ist die PEgRNA RNA, d. h. sie beinhaltet eine RNA-Verlängerung. Der Begriff „Polymerase“ kann sich auch auf ein Enzym beziehen, das die Polymerisation von Nukleotiden katalysiert (d. h. die Polymeraseaktivität). Im Allgemeinen beginnt das Enzym die Synthese am 3'-Ende eines Primers, der an eine Polynukleotid-Templatsequenz (wie z. B. eine Primer-Sequenz, die an die Primer-Bindungsstelle einer PEgRNA gebunden ist), und bewegt sich dann zum 5'-Ende des Templat-Strangs. Eine „DNA-Polymerase“ katalysiert die Polymerisation von Desoxynukleotiden. Wenn hierin auf eine DNA-Polymerase Bezug genommen wird, beinhaltet der Begriff „DNA-Polymerase“ ein „funktionelles Fragment davon“. Ein „funktionelles Fragment davon“ bezieht sich auf einen beliebigen Abschnitt einer Wildtyp- oder mutierten DNA-Polymerase, der weniger als die gesamte Aminosäuresequenz der Polymerase umfasst und der unter mindestens einem Satz von Bedingungen die Fähigkeit behält, die Polymerisation eines Polynukleotids zu katalysieren. Ein solches funktionales Fragment kann als eigenständige Einheit existieren oder Bestandteil eines größeren Polypeptids, wie etwa eines Fusionsproteins, sein.
  • In einigen Ausführungsformen können die Polymerasen von Bakteriophagen stammen. Bakteriophagen-DNA-Polymerasen besitzen im Allgemeinen keine 5'-3'-Exonukleaseaktivität, da diese Aktivität von einem separaten Polypeptid kodiert wird. Beispiele für geeignete DNA- Polymerasen sind T4-, T7- und phi29-DNA-Polymerase. Die im Handel erhältlichen Enzyme sind: T4 (erhältlich von vielen Quellen, z. B. Epicentre) und T7 (erhältlich von vielen Quellen, z. B. Epicentre für unmodifizierte und USB für 3' zu 5' exo T7 „Sequenase“ DNA-Polymerase).
  • Bei den anderen Ausführungsformen handelt es sich um Archaeen-Polymerasen. Es gibt 2 verschiedene Klassen von DNA-Polymerasen, die in Archaeen identifiziert worden sind: 1. Familie B/Pol I type (Homologe von Pfu aus Pyrococcus furiosus) und 2. Pol II type (Homologe von P. furiosus DP1/DP2-Polymerase mit 2 Untereinheiten). Eswurde nachgewiesen, dass DNA-Polymerasen aus beiden Klassen von Natur aus keine 5'-3'- Exonukleaseaktivität aufweisen, wohl aber eine 3'-5'-Exonukleaseaktivität (Korrekturlesen). Geeignete DNA-Polymerasen (Pol I oder Pol II) können aus Archaeen mit optimalen Wachstumstemperaturen, die den gewünschten Testtemperaturen ähnlich sind, gewonnen werden.
  • Thermostabile archaeale DNA-Polymerasen werden aus Pyrococcus-Arten (furiosus, Arten GB-D, woesii, abysii, horikoshii), Thermococcus-Arten (kodakaraensis KOD1, litoralis, Arten 9 Grad Nord-7, Arten JDF-3, gorgonarius), Pyrodictium occultum und Archaeoglobus fulgidus isoliert.
  • Die Polymerasen können auch von eubakteriellen Arten stammen. Es gibt 3 Klassen von eubakteriellen DNA-Polymerasen, Pol I, II und III. Die Enzyme der Pol-I-DNA- Polymerase-Familie besitzen eine 5'-3'-Exonukleaseaktivität, und einige Mitglieder weisen auch eine 3'-5'-Exonukleaseaktivität auf. Den Pol II-DNA-Polymerasen fehlt natürlicherweise die 5'-3'-Exonukleaseaktivität, aber sie zeigen eine 3'-5'-Exonukleaseaktivität. Pol III-DNA- Polymerasen stellen die wichtigste replikative DNA-Polymerase der Zelle dar und bestehen aus mehreren Untereinheiten. Der katalytischen Untereinheit von Pol III fehlt die 5'-3'- Exonukleaseaktivität, aber in einigen Fällen befindet sich die 3'-5'-Exonukleaseaktivität im selben Polypeptid.
  • Es gibt eine Reihe von im Handel erhältlichen Pol I-DNA-Polymerasen, von denen einige modifiziert wurden, um die 5'-3'-Exonukleaseaktivität zu reduzieren oder aufzuheben.
  • Geeignete thermostabile Pol I-DNA-Polymerasen können aus einer Vielzahl thermophiler Eubakterien isoliert werden, die Thermus-Arten und Thermotoga maritima beinhalten, wie etwa Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth) und Thermotoga maritima (Tma UlTma).
  • Weitere Eubakterien, die mit den oben genannten verwandt sind, werden in Thermophilic Bacteria (Kristjansson, J. K., Hrsg.) CRC Press, Inc. 1992, Boca Raton, Florida, beschrieben.
  • Die Erfindung stellt ferner chimäre oder nicht-chimäre DNA-Polymerasen bereit, die chemisch modifiziert sind gemäß den Verfahren, die in US-Pat. Nr. 5,677,152 , 6,479,264 und 6,183,998 offenbart sind, deren Inhalt hiermit in vollem Umfang durch Bezugnahme aufgenommen sind.
  • Zusätzliche Archaea-DNA-Polymerasen, die mit den oben aufgeführten verwandt sind, werden in den folgenden Referenzen beschrieben: Archaea: A Laboratory Manual (Robb, F. T. und Place, A. R., Hrsg.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1995 und Thermophilic Bacteria (Kristjansson, J. K., Hrsg.) CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1992.
  • B. Beispielhafte reverse Transkriptasen
  • In verschiedenen Ausführungsformen umfassen die hierin beschriebenen Multi-Flap- Prime-Editoren eine reverse Transkriptase als Polymerase. Die Offenbarung bezieht sich auf jede beliebige reverse Transkriptase, die aus einem natürlich vorkommenden Organismus oder Virus oder aus einer kommerziellen oder nichtkommerziellen Quelle gewonnen wird. Darüber hinaus können die in den Multi-Flap-Prime-Editoren der Offenbarung verwendbaren reversen Transkriptasen jede beliebige natürlich vorkommende Mutanten-RT, gentechnisch veränderte Mutanten-RT oder andere RT-Varianten beinhalten, einschließlich trunkierter Varianten, die ihre Funktion beibehalten. Die RTs können auch so konstruiert sein, dass sie spezifische Aminosäuresubstitutionen enthalten, wie etwa die hierin offenbarten.
  • Reverse Transkriptasen sind multifunktionale Enzyme mit typischerweise drei enzymatischen Aktivitäten, die eine RNA- und eine DNA-abhängige DNA- Polymerisationsaktivität beinhalten, sowie eine RNaseH-Aktivität, die die Spaltung von RNA in RNA-DNA-Hybriden katalysiert. Einige Mutanten der reversen Transkriptasen weisen eine deaktivierte RNaseH-Komponente auf, um unbeabsichtigte Schäden an der mRNA zu verhindern. Diese Enzyme, die komplementäre DNA (cDNA) unter Verwendung von mRNA als Templat synthetisieren, wurden zuerst in RNA-Viren entdeckt. In der Folge wurden reverse Transkriptasen direkt aus Viruspartikeln, Zellen oder Geweben isoliert und gereinigt, (z. B. siehe Kacian et al., 1971, Biochim. Biophys. Acta 46: 365-83; Yang et al., 1972, Biochem. Biophys. Res. Comm. 47: 505-11; Gerard et al., 1975, J. Virol. 15: 785-97; Liu et al., 1977, Arch. Virol. 55 187-200; Kato et al., 1984, J. Virol. Methods 9: 325-39; Luke et al., 1990, Biochem. 29: 1764-69 and Le Grice et al., 1991, J. Virol. 65: 7004-07, die jeweils durch Bezugnahme aufgenommen sind). In jüngster Zeit wurden auf der Suche nach verbesserten Eigenschaften wie etwa Thermostabilität, Verlässlichkeit und Aktivität auch Mutanten und Fusionsproteine erzeugt. Alle beliebigen Wildtyp-, Varianten- und/oder Mutantenformen der reversen Transkriptase, die auf dem Gebiet der Technik bekannt sind oder mit Hilfe bekannter Verfahren hergestellt werden können, kommen hierin in Betracht.
  • Das Reverse-Transkriptase (RT)-Gen (oder die darin enthaltene genetische Information) kann aus einer Reihe verschiedener Quellen gewonnen werden. So kann das Gen beispielsweise aus eukaryontischen Zellen, die mit einem Retrovirus infiziert sind, oder aus einer Reihe von Plasmiden, die entweder einen Abschnitt oder das gesamte Retrovirus-Genom enthalten, gewonnen werden. Darüber hinaus kann aus Retroviren eine Boten-RNA-ähnliche RNA gewonnen werden, die das RT-Gen enthält. Beispiele für RT-Quellen beinhalten unter anderem Moloney-Mausleukämievirus (M-MLV oder MLVRT), humanes T-Zellen- Leukämievirus Typ 1 (HTLV-1), Rinderleukämievirus (BLV), Rous-Sarkom-Virus (RSV), humanes Immundefizienz-Virus (HIV), Hefe, einschließlich Saccharomyces, Neurospora, Drosophila, Primaten und Nager. Siehe zum Beispiel Weiss, et al., US-Pat. Nr. 4,663,290 (1987); Gerard, G. R., DNA:271-79 (1986); Kotewicz, M. L., et al., Gene 35:249-58 (1985); Tanese, N., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA):4944-48 (1985); Roth, M. J., at al., J. Biol. Chem. 260:9326-35 (1985); Michel, F., et al., Nature 316:641-43 (1985); Akins, R. A., et al., Cell 47:505-16 (1986), EMBO J. 4:1267-75 (1985); und Fawcett, D. F., Cell 47:1007-15 (1986) (die hierin jeweils in vollem Umfang durch Bezugnahme aufgenommen sind).
  • Wildtyp-RTs
  • Beispielhafte Enzyme zur Verwendung mit den hierin offenbaren Multi-Flap-Prime- Editoren können unter anderem M-MLV reverse Transkriptase und RSV reverse Transkriptase beinhalten. Enzyme, die reverse Transkriptase-Aktivität aufweisen, sind im Handel erhältlich. In bestimmten Ausführungsformen wird die reverse Transkriptase in trans zu den anderen Komponenten des Multi-Flap-Prime-Editor (PE)-Systems bereitgestellt. Das heißt, die reverse Transkriptase wird exprimiert oder anderweitig als einzelne Komponente bereitgestellt, d. h. nicht als Fusionsprotein mit einem napDNAbp.
  • Fachleute wissen, dass reverse Transkriptasen des Wildtyps, einschließlich unter anderem Moloney Murines Leukämievirus (M-MLV); reverse Transkriptase des Humanen Immundefizienz-Virus (HIV) und reverse Transkriptase des Aviären Sarkom-Leukose-Virus (ASLV), die unter anderem die reverse Transkriptase des Rous-Sarkom-Virus (RSV), reverse Transkriptase des Aviären Myeloblastose-Virus (AMV), reverse Transkriptase des Aviären Erythroblastose-Virus (AEV) Helfervirus MCAV, reverse Transkriptase des Aviären Myelozytomatose-Virus MC29 Helfervirus MCAV, reverse Transkriptase des Aviären Retikuloendotheliose-Virus (REV-T) Helfervirus REV-A, reverse Transkriptase des Aviären Sarkom-Virus UR2 Helfervirus UR2AV, reverse Transkriptase des Aviären Sarkom-Virus Y73 Helfervirus YAV, reverse Transkriptase des Rous-Assoziierten Virus (RAV) und reverse Transkriptase des Myeloblastose-Assoziierten Virus (MAV) beinhaltet, in den hierin beschriebenen Verfahren und Zusammensetzungen verwendet werden können.
  • Beispiele für Wildtyp-RT-Enzyme sind die folgenden:
    BESCHREIBUNG SEQUENZ
    REVERSE TRANSKRIPTASE (M-MLV RT) WILDTYP
    Figure DE112021002672T5_0105
    MOLONEY-MAUS- LEUKÄMIE-VIRUS
    VERWENDET IN PE1 (PRIME- EDITOR 1 FUSIONSPROTEIN, HIERIN OFFENBART)
    REVERSE TRANSKRIPTASE
    Figure DE112021002672T5_0106
    MOLONEY-MAUS- LEUKÄMIE-VIRUS
    REF-SEQ. AAA66622.1
    REVERSE TRANSKRIPTASE
    Figure DE112021002672T5_0107
    FELINES LEUKÄMIE-VIRUS
    REF-SEQ. NP955579.1
    REVERSE TRANSKRIPTASE
    Figure DE112021002672T5_0108
    HIV-1 RT, KETTE A
    REF-SEQ. ITL3-A
    REVERSE TRANSKRIPTASE
    Figure DE112021002672T5_0109
    HIV-1 RT, KETTE B
    REF-SEQ. ITL3-B
    REVERSE TRANSKRIPTASE
    Figure DE112021002672T5_0110
    ROUS-SARKOM- VIRUS RT
    REF-SEQ. ACL 14945
    REVERSE TRANSKRIPTASE
    Figure DE112021002672T5_0111
    BLUMENKOHLMOSAIK-VIRUS RT
    REF-SEQ. AGT42196
    REVERSE TRANSKRIPTASE
    Figure DE112021002672T5_0112
    KLEBSIELLA PNEUMONIA
    REF-SEQ. RFF81513.1
    REVERSE TRANSKRIPTASE
    Figure DE112021002672T5_0113
    BACILLUS SUBTILIS RT
    REF-SEQ. QBJ66766
    EUBACTERIUM REKTALE GRUPPE II INTRON RT
    Figure DE112021002672T5_0114
    GEOBACILLUS STEAROTHERMOP HILUS GRUPPE II INTRON RT
    Figure DE112021002672T5_0115
  • Abweichende undfehleranfällige RTs
  • Reverse Transkriptasen sind für die Synthese komplementärer DNA-Stränge (cDNA) aus RNA-Templaten unerlässlich. Reverse Transkriptasen sind Enzyme, die aus verschiedenen Domänen bestehen, die unterschiedliche biochemische Aktivitäten aufweisen. Die Enzyme katalysieren die Synthese von DNA aus einem RNA-Templat wie folgt: In Anwesenheit eines hybridisierten Primers bindet die reverse Transkriptase an ein RNA-Templat und leitet die Polymerisationsreaktion ein. Die RNA-abhängige DNA-Polymerase-Aktivität synthetisiert den komplementären DNA-Strang (cDNA) unter Einbindung von dNTPs. Die RNase-H- Aktivität baut das RNA-Templat des DNA:RNA-Komplexes ab. Reverse Transkriptasen umfassen also (a) eine Bindungsaktivität, die ein RNA/DNA-Hybrid erkennt und daran bindet, (b) eine RNA-abhängige DNA-Polymerase-Aktivität und (c) eine RNase-H-Aktivität. Darüber hinaus weisen reverse Transkriptasen im Allgemeinen verschiedene Eigenschaften auf, die ihre Thermostabilität, Prozessivität (dNTP-Einbaurate) und Verlässlichkeit (oder Fehlerrate) beinhalten. Die hierin in Betracht gezogenen Varianten der reversen Transkriptase können alle Mutationen der reversen Transkriptase beinhalten, die eine oder mehrere dieser enzymatischen Aktivitäten (z. B. RNA-abhängige DNA-Polymerase-Aktivität, RNase-H-Aktivität oder DNA/RNA-Hybridbindungsaktivität) oder Enzymeigenschaften (z. B. Thermostabilität, Prozessivität oder Verlässlichkeit) beeinflussen oder verändern. Derartige Varianten können allgemein verfügbar sein, im Handel erhältlich sein oder mit Hilfe bekannter Verfahren der Mutagenese, einschließlich gerichteter Evolutionsprozesse (z. B. PACE oder PANCE), hergestellt werden.
  • In verschiedenen Ausführungsformen kann die reverse Transkriptase eine Variante der reversen Transkriptase sein. Wie hierin verwendet, umfasst eine „Variante der reversen Transkriptase“ jede natürlich vorkommende oder gentechnisch hergestellte Variante, die eine oder mehrere Mutationen (einschließlich singulärer Mutationen, Inversionen, Deletionen, Insertionen und Umlagerungen) im Vergleich zu einer Referenzsequenz (z. B. einer Referenz- Wildtyp-Sequenz) beinhaltet. RT weisen natürlicherweise mehrere Aktivitäten auf, die eine RNA-abhängige DNA-Polymerase-Aktivität, eine Ribonuklease-H-Aktivität und eine DNA- abhängige DNA-Polymerase-Aktivität beinhalten. Zusammengenommen ermöglichen diese Aktivitäten dem Enzym, einzelsträngige RNA in doppelsträngige cDNA umzuwandeln. In Retroviren und Retrotransposons kann diese cDNA dann in das Wirtsgenom integriert werden, aus dem durch Transkription in der Wirtszelle neue RNA-Kopien hergestellt werden können. RT-Varianten können eine Mutation umfassen, die sich auf eine oder mehrere dieser Aktivitäten auswirkt (entweder reduziert oder verstärkt sie diese Aktivitäten, oder sie schaltet sie ganz aus). Darüber hinaus können RT-Varianten eine oder mehrere Mutationen umfassen, die die RT mehr oder weniger stabil machen, weniger anfällig für Aggregation sind, die Reinigung und/oder Erkennung erleichtern und/oder andere Modifikationen von Eigenschaften oder Merkmalen bewirken.
  • Fachleute wissen, dass Varianten reverser Transkriptasen, die von anderen reversen Transkriptasen abgeleitet sind, einschließlich unter anderem Moloney Murines Leukämie- Virus (M-MLV); reverse Transkriptase des Humanen Immundefizienz-Virus (HIV) und reverse Transkriptase des Aviären Sarkom-Leukose-Virus (ASLV), die unter anderem die reverse Transkriptase des Rous-Sarkom-Virus (RSV), reverse Transkriptase des Aviären Myeloblastose-Virus (AMV), reverse Transkriptase des Aviären Erythroblastose-Virus (AEV), reverse Transkriptase des Aviären Myelozytomatose-Virus MC29, reverse Transkriptase des Aviären Retikuloendotheliose-Virus (REV-T) Helper-Virus REV-A, reverse Transkriptase des Aviären Sarkom-Virus UR2 Helfervirus UR2AV, reverse Transkriptase das Aviären Sarkom-Virus Y73 Helfervirus YAV, reverse Transkriptase des Rous-Assoziierten Virus (RAV) und reverse Transkriptase des Myeloblastose-Assoziierten Virus (MAV) beinhaltet, in den hierin beschriebenen Verfahren und Zusammensetzungen verwendet werden können.
  • Ein Verfahren zur Herstellung von RT-Varianten ist die genetische Modifikation (z. B. durch Modifizierung der DNA-Sequenz einer Wildtyp-Reverse-Transkriptase). In der Technik sind eine Reihe von Verfahren bekannt, die sowohl die zufällige als auch die gezielte Mutation von DNA-Sequenzen erlauben (siehe zum Beispiel Ausubel et. al. Short Protocols in Molecular Biology (1995) 3.sup.rd Ed. John Wiley & Sons, Inc.). Darüber hinaus gibt es eine Reihe von kommerziell erhältlichen Kits für die ortsgerichtete Mutagenese, die sowohl konventionelle als auch PCR-basierte Verfahren beinhalten. Beispiele beinhalten die QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kits (AGILENT®), das Q5® Site-Directed Mutagenesis Kit (NEW ENGLAND BIOLABS®) und das GeneArt™ Site-Directed Mutagenesis System (THERMOFISHER SCIENTIFIC®).
  • Darüber hinaus können mutierte reverse Transkriptasen durch Insertionsmutation oder Trunkierung (N-terminale, interne oder C-terminale Insertionen oder Trunkierungen) gemäß den einem Fachmann bekannten Verfahren erzeugt werden. Der Begriff „Mutation“, wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf die Substitution eines Restes innerhalb einer Sequenz, z. B. einer Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenz, durch einen anderen Rest oder eine Deletion oder Insertion eines oder mehrerer Reste innerhalb einer Sequenz. Mutationen werden hierin in der Regel durch Angabe des ursprünglichen Restes, gefolgt von der Position des Restes innerhalb der Sequenz und der Identität des neu substituierten Restes beschrieben. Verschiedene Verfahren zur Durchführung der hierin bereitgestellten Aminosäuresubstitutionen (Mutationen) sind in der Fachwelt wohlbekannt und werden zum Beispiel von Green und Sambrook, Molecular Cloning bereitgestellt: A Laboratory Manual (4. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2012)). Mutationen können eine Vielzahl von Kategorien beinhalten, wie etwa Einzelbasen-Polymorphismen, Mikroduplikationsregionen, Indel und Inversionen, und sind in keiner Weise als einschränkend zu verstehen. Mutationen können „loss-of-function“-Mutationen beinhalten, die das normale Ergebnis einer Mutation sind, die eine Proteinaktivität reduziert oder aufhebt. Die meisten „loss-of-function“-Mutationen sind rezessiv, da bei einem Heterozygoten die zweite Chromosomenkopie eine nicht mutierte Version des Gens trägt, die für ein voll funktionsfähiges Protein kodiert, dessen Vorhandensein die Wirkung der Mutation ausgleicht. Mutationen umfassen auch „gain-of-function“-Mutationen, d. h. Mutationen, die einem Protein oder einer Zelle eine abnorme Aktivität verleihen, die im Normalzustand nicht vorhanden ist. Viele gain-of-function-Mutationen befinden sich in regulatorischen Sequenzen und nicht in codierenden Regionen und können daher eine Reihe von Konsequenzen haben. Zum Beispiel kann eine Mutation dazu führen, dass ein oder mehrere Gene in den falschen Geweben exprimiert werden und diese Gewebe Funktionen erhalten, die ihnen normalerweise fehlen. Aufgrund ihrer Natur sind gain-of-function-Mutationen in der Regel dominant.
  • Ältere Verfahren der ortsgerichteten Mutagenese beruhen auf der Subklonierung der zu mutierenden Sequenz in einen Vektor, wie etwa einen M13-Bakteriophagenvektor, der die Isolierung eines einzelsträngigen DNA-Templats ermöglicht. Bei diesen Verfahren wird ein mutagener Primer (d. h. ein Primer, der in der Lage ist, an die zu mutierende Stelle zu binden, aber ein oder mehrere Nukleotide mit Diskrepanz an der zu mutierenden Stelle trägt) an das einzelsträngige Templat gebunden und dann das Komplement des Templats ausgehend vom 3'-Ende des mutagenen Primers polymerisiert. Die resultierenden Duplexe werden dann in Wirtsbakterien transformiert und die Plaques auf die gewünschte Mutation untersucht.
  • In jüngerer Zeit werden bei der ortsgerichteten Mutagenese PCR-Verfahren eingesetzt, die den Vorteil haben, dass sie kein einzelsträngiges Templat benötigen. Darüber hinaus wurden Verfahren entwickelt, die keine Subklonierung erfordern. Beim Ausführen der PCR- basierten ortsgerichteten Mutagenese müssen mehrere Aspekte berücksichtigt werden. Erstens ist es bei diesen Verfahren wünschenswert, die Anzahl der PCR-Zyklen zu reduzieren, um die Ausbreitung unerwünschter, von der Polymerase eingeführter Mutationen zu verhindern. Zweitens muss eine Selektion durchgeführt werden, um die Anzahl der nicht mutierten Elternmoleküle zu reduzieren, die in der Reaktion verbleiben. Drittens wird ein PCR-Verfahren mit verlängerter Länge bevorzugt, um die Verwendung eines einzigen PCR-Primersatzes zu ermöglichen. Und viertens ist es aufgrund der nicht-templat-abhängigen terminalen Verlängerungsaktivität einiger thermostabiler Polymerasen häufig erforderlich, vor der Ligation des durch PCR erzeugten Mutantenprodukts am stumpfen Ende einen Endpolierschritt in das Verfahren einzubauen.
  • Verfahren der Zufallsmutagenese, die zu einer Gruppe von Mutanten führen, die eine oder mehrere zufällig angeordnete Mutationen tragen, sind in der Technik bekannt. Ein solches Panel von Mutanten kann dann auf diejenigen untersucht werden, die die gewünschten Eigenschaften aufweisen, zum Beispiel eine erhöhte Stabilität im Vergleich zu einer Wildtyp- Reversen-Transkriptase.
  • Ein Beispiel für ein Verfahren zur Zufallsmutagenese ist das sogenannte „fehleranfällige PCR-Verfahren“. Wie der Name schon sagt, wird bei diesem Verfahren eine bestimmte Sequenz unter Bedingungen amplifiziert, unter denen die DNA-Polymerase nicht mit hoher Verlässlichkeit eingebaut werden kann. Obwohl die Bedingungen, die einen fehleranfälligen Einbau begünstigen, für verschiedene DNA-Polymerasen unterschiedlich sind, kann ein Fachmann solche Bedingungen für ein bestimmtes Enzym bestimmen. Eine Schlüsselvariable für die Verlässlichkeit der Amplifikation ist für viele DNA-Polymerasen zum Beispiel die Art und Konzentration des zweiwertigen Metallions im Puffer. Die Verwendung von Mangan-Ionen und/oder die Variation der Magnesium- oder Mangan-IonenKonzentration kann daher zur Beeinflussung der Fehlerrate der Polymerase eingesetzt werden.
  • Unter verschiedenen Aspekten kann die RT des Multi-Flap-Prime-Editors eine „fehleranfällige“ Variante der reversen Transkriptase sein. Fehleranfällige reverse Transkriptasen, die in der Technik bekannt und/oder verfügbar sind, können verwendet werden. Reverse Transkriptasen weisen naturgemäß keine Korrekturlesefunktion auf; daher ist die Fehlerrate von reversen Transkriptasen im Allgemeinen höher als die von DNA- Polymerasen, die eine Korrekturleseaktivität aufweisen. Die Fehlerrate einer bestimmten reversen Transkriptase ist eine Eigenschaft der „Verlässlichkeit“ des Enzyms, die die Genauigkeit der vom Templat gesteuerten Polymerisation der DNA gegen ihr RNA-Templat darstellt. Eine RT mit hoher Verlässlichkeit weist eine niedrige Fehlerrate auf. Umgekehrt weist eine RT mit geringer Verlässlichkeit eine hohe Fehlerrate auf. Die Verlässlichkeit von M-MLV-basierten reversen Transkriptasen weist Berichten zufolge eine Fehlerrate im Bereich von einem Fehler auf 15.000 bis 27.000 synthetisierte Nukleotide auf. Siehe Boutabout et al. „DNA synthesis fidelity by the reverse transcriptase of the yeast retrotransposon Ty1 ", Nucleic Acids Res, 2001, 29: 2217-2222, das durch Bezugnahme aufgenommen wird. Für die Zwecke dieser Anmeldung werden also diejenigen reversen Transkriptasen als „fehleranfällig“ oder mit einer „fehleranfälligen Verlässlichkeit“ betrachtet, die eine Fehlerrate von weniger als einem Fehler auf 15.000 synthetisierte Nukleotide aufweisen.
  • Fehleranfällige reverse Transkriptase kann auch durch Mutagenese eines Ausgangs- RT-Enzyms (z. B. eines Wildtyp-M-MLV-RT) erzeugt werden. Das Verfahren der Mutagenese ist nicht eingeschränkt und kann gerichtete Evolutionsprozesse beinhalten, wie etwa die phagengestützte kontinuierliche Evolution (PACE) oder die phagengestützte nicht- kontinuierliche Evolution (PANCE). Der hierin verwendete Begriff „phagengestützte kontinuierliche Evolution (PACE)“ bezieht sich auf eine kontinuierliche Evolution, bei der Phagen als virale Vektoren eingesetzt werden. Das allgemeine Konzept der PACE-Technologie wurde beispielsweise beschrieben in der internationalen PCT-Anmeldung PCT/US2009/056194, eingereicht am 8. September 2009, veröffentlicht als WO 2010/028347 am 11. März 2010; der internationalen PCT-Anmeldung PCT/US2011/066747, eingereicht am 22. Dezember 2011, veröffentlicht als WO 2012/088381 am 28. Juni 2012; der US-Anmeldung US-Patent Nr. 9,023,594 , ausgestellt am 5. Mai 2015, der internationalen PCT-Anmeldung, PCT/US2015/012022, eingereicht am 20. Januar 2015, veröffentlicht als WO 2015/134121 am 11. September 2015, und der internationalen PCT-Anmeldung, PCT/US2016/027795, eingereicht am 15. April 2016, veröffentlicht als WO 2016/168631 am 20. Oktober 2016, deren gesamter Inhalt hierin durch Bezugnahme aufgenommen sind.
  • Fehleranfällige reverse Transkriptasen können auch durch phagengestützte nicht- kontinuierliche Evolution (PANCE) erhalten werden, was sich hierin auf nicht-kontinuierliche Evolution bezieht, bei der Phagen als virale Vektoren eingesetzt werden. PANCE ist eine vereinfachte Technik für die schnelle gerichtete In-vivo-Evolution, bei der serielle Kolbenübertragungen von evolvierenden „Selektionsphagen“ (SP), die ein zu evolvierendes Gen von Interesse enthalten, über frische E. coli-Wirtszellen erfolgen, wodurch die Gene in den E. coli-Wirtszellen konstant gehalten werden können, während die in den SP enthaltenen Gene kontinuierlich evolvieren. Serielle Kolbenübertragungen sind seit langem ein weithin zugänglicher Ansatz für die Laborevolution von Mikroben, und in jüngerer Zeit wurden analoge Ansätze für die Bakteriophagenevolution entwickelt. Das PANCE-System weist eine geringere Stringenz auf als das PACE-System.
  • Andere fehleranfällige reverse Transkriptasen sind in der Literatur beschrieben worden, die alle für die Verwendung in den hierin beschriebenen Verfahren und Zusammensetzungen in Betracht kommen. Zum Beispiel sind fehleranfällige reverse Transkriptasen beschrieben worden in Bebenek et al. „Error-prone Polymerization by HIV-1 Reverse Transcriptase", JBiol Chem, 1993, Vol. 268: 10324-10334, und Sebastian-Martin et al. „Transcriptional inaccuracy threshold attenuates differences in RNA-dependent DNA synthesis fidelity between retroviral reverse transcriptases", Scientific Reports, 2018, Vol. 8: 627, die jeweils durch Bezugnahme aufgenommen sind. Ferner können reverse Transkriptasen, einschließlich fehleranfälliger reverser Transkriptasen, von einem kommerziellen Anbieter bezogen werden, einschließlich ProtoScript® (II) Reverse Transcriptase, AMV Reverse Transcriptase, WarmStart® Reverse Transcriptase und M-MuLV Reverse Transcriptase, alle von NEW ENGLAND BIOLABS®, oder AMV Reverse Transcriptase XL, SMARTScribe Reverse Transcriptase, GPR ultra-pure MMLV Reverse Transcriptase, alle von TAKARA BIO USA, INC. (ehemals CLONTECH).
  • Die Offenbarung hierin bezieht sich auch auf reverse Transkriptasen, die Mutationen in der RNaseH-Domäne aufweisen. Wie bereits erwähnt, ist eine der intrinsischen Eigenschaften von reversen Transkriptasen die RNase-H-Aktivität, die das RNA-Templat des RNA:cDNA-Hybrids gleichzeitig mit der Polymerisation spaltet. Die RNase-H-Aktivität kann bei der Synthese langer cDNAs unerwünscht sein, da das RNA-Templat vor Abschluss der reversen Transkription in voller Länge abgebaut werden kann. Die RNase-H-Aktivität kann auch die Effizienz der reversen Transkription verringern, vermutlich aufgrund ihrer Konkurrenz mit der Polymeraseaktivität des Enzyms. Die vorliegende Offenbarung bezieht sich daher auf alle Varianten der reversen Transkriptase, die eine modifizierte RNase-H- Aktivität umfassen.
  • Die Offenbarung hierin bezieht sich auch auf reverse Transkriptasen, die Mutationen in der RNA-abhängigen DNA-Polymerase-Domäne aufweisen. Wie bereits erwähnt, ist eine der intrinsischen Eigenschaften von reversen Transkriptasen die RNA-abhängige DNA- Polymerase-Aktivität, die die Nukleobasen in den naszierenden cDNA-Strang einbaut, wie er durch den Templat-Strang des RNA:cDNA-Hybrids kodiert ist. Die Aktivität der RNA- abhängigen DNA-Polymerase kann erhöht oder verringert werden (d. h. in Bezug auf ihre Einbaurate), um die Prozessivität des Enzyms zu erhöhen oder zu verringern. Die vorliegende Offenbarung bezieht sich somit auf alle Varianten der reversen Transkriptase, die eine modifizierte RNA-abhängige DNA-Polymerase-Aktivität umfassen, wie etwa eine erhöhte oder verringerte Prozessivität des Enzyms im Vergleich zu einer unmodifizierten Version.
  • Hierin eingeschlossen sind auch Varianten der reversen Transkriptase, die veränderte Thermostabilitätseigenschaften aufweisen. Die Fähigkeit einer reversen Transkriptase, hohen Temperaturen zu widerstehen, ist ein wichtiger Aspekt der cDNA-Synthese. Erhöhte Reaktionstemperaturen tragen dazu bei, RNA mit starken Sekundärstrukturen und/oder hohem GC-Gehalt zu denaturieren, so dass reverse Transkriptasen die Sequenz durchlesen können. Infolgedessen ermöglicht die reverse Transkription bei höheren Temperaturen die Synthese von cDNA in voller Länge und eine höhere Ausbeute, was zu einer verbesserten Erzeugung der 3'-Flap-sDNA als Ergebnis des Multi-Flap-Prime-Editing-Prozesses führen kann. Die reverse Transkriptase des Wildtyps von M-MLV weist in der Regel eine optimale Temperatur im Bereich von 37-48 °C auf; es können jedoch Mutationen eingeführt werden, die die reverse Transkriptionsaktivität bei höheren Temperaturen als 48°C ermöglichen, die 49 °C, 50 °C, 51 °C, 52 °C, 53 °C, 54 °C, 55 °C, 56 °C, 57 °C, 58 °C, 59 °C, 60 °C, 61 °C, 62 °C, 63 °C,64 °C,65 °C,66 °C und höher beinhalten.
  • Die hierin in Betracht gezogenen Varianten reverser Transkriptasen, einschließlich fehleranfälliger RTs, thermostabiler RTs und RTs mit erhöhter Prozessivität, können durch verschiedene Routinestrategien, einschließlich Mutagenese oder evolutionäre Prozesse, hergestellt werden. In einigen Fällen können die Varianten durch Einführung einer einzigen Mutation hergestellt werden. In anderen Fällen können die Varianten mehr als eine Mutation erfordern. Bei denjenigen Mutanten, die mehr als eine Mutation umfassen, kann die Wirkung einer bestimmten Mutation, die die jeweilige Mutante trägt, durch Einbringen der identifizierten Mutation in das Wildtyp-Gen durch ortsgerichtete Mutagenese isoliert von den anderen Mutationen bewertet werden. Screening-Tests mit der so erzeugten einzelnen Mutante ermöglichen dann die Bestimmung der Wirkung dieser Mutation allein.
  • Die hierin verwendeten RT-Varianten können auch andere „RT-Varianten“ beinhalten, die mindestens etwa 70 % identisch, mindestens etwa 80 % identisch, mindestens etwa 90 % identisch, mindestens etwa 95 % identisch, mindestens etwa 96 % identisch, mindestens etwa 97 % identisch, mindestens etwa 98 % identisch, mindestens etwa 99 % identisch, mindestens etwa 99,5 % identisch oder mindestens etwa 99,9 % identisch mit einem beliebigen RT- Referenzprotein sind, einschließlich aller RT-Wildtypen oder RT-Mutanten oder RT- Fragmente oder anderer RT-Varianten, die hierin offenbart oder in Betracht gezogen werden oder in der Technik bekannt sind.
  • In einigen Ausführungsformen kann eine RT-Variante 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 21, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 oder bis zu 100, oder bis zu 200, oder bis zu 300, oder bis zu 400, oder bis zu 500 oder mehr Aminosäureänderungen im Vergleich zu einer Referenz-RT aufweisen. In einigen Ausführungsformen umfasst die RT-Variante ein Fragment einer Referenz-RT, wie etwa, dass das Fragment zu mindestens etwa 70 % identisch, zu mindestens etwa 80 % identisch, zu mindestens etwa 90 % identisch, zu mindestens etwa 95 % identisch, zu mindestens etwa 96 % identisch, zu mindestens etwa 97 % identisch, zu mindestens etwa 98 % identisch, zu mindestens etwa 99 % identisch, zu mindestens etwa 99,5 % identisch oder zu mindestens etwa 99,9 % identisch mit dem entsprechenden Fragment der Referenz-RT ist. In einigen Ausführungsformen ist das Fragment mindestens 30 %, mindestens 35 %, mindestens 40 %, mindestens 45 %, mindestens 50 %, mindestens 55 %, mindestens 60 %, mindestens 65 %, mindestens 70 %, mindestens 75 %, mindestens 80 %, mindestens 85 %, mindestens 90 %, mindestens 95 % identisch, mindestens 96 %, mindestens 97 %, mindestens 98 %, mindestens 99 % oder mindestens 99,5 % der Aminosäurelänge einer entsprechenden Wildtyp-RT (M-MLV-Reverse Transkriptase) (z. B. SEQ-ID-NR: 89) oder zu einer der reversen Transkriptasen der SEQ-ID-NR: 90-100.
  • In einigen Ausführungsformen können im Rahmen der Offenbarung auch RT- Fragmente verwendet werden, die ihre Funktionalität beibehalten und die Fragmente beliebiger hierin offenbarer RT-Proteine sind. In einigen Ausführungsformen hat das RT-Fragment eine Länge von mindestens 100 Aminosäuren. In einigen Ausführungsformen hat das Fragment eine Länge von mindestens 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550 oder bis zu 600 oder mehr Aminosäuren.
  • In noch anderen Ausführungsformen kann die Offenbarung auch RT-Varianten verwenden, die am N-Terminus oder am C-Terminus oder an beiden um eine bestimmte Anzahl von Aminosäuren trunkiert sind, was zu einer trunkierten Variante führt, die noch eine ausreichende Polymerasefunktion beibehält. In einigen Ausführungsformen weist die RT- trunkierte Variante eine Trunkierung von mindestens 1, mindestens 2, mindestens 3, mindestens 4, mindestens 5, mindestens 6, mindestens 7, mindestens 8, mindestens 9, mindestens 10, mindestens 11, mindestens 12, mindestens 13, mindestens 14, mindestens 15, mindestens 16, mindestens 17, mindestens 18, mindestens 19, mindestens 20, mindestens 21, mindestens 22, mindestens 23, mindestens 24, mindestens 25, mindestens 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, oder 250 Aminosäuren am N-terminalen Ende des Proteins auf. In anderen Ausführungsformen weist die RT-trunkierte Variante eine Trunkierung von mindestens 1, mindestens 2, mindestens 3, mindestens 4, mindestens 5, mindestens 6, mindestens 7, mindestens 8, mindestens 9, mindestens 10, mindestens 11, mindestens 12, mindestens 13, mindestens 14, mindestens 15, mindestens 16, mindestens 17, mindestens 18, mindestens 19, mindestens 20, mindestens 21, mindestens 22, mindestens 23, mindestens 24, mindestens 25, mindestens 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, oder 250 Aminosäuren am N-terminalen Ende des Proteins auf. In noch anderen Ausführungsformen weist die RT-trunkierte Variante eine Trunkierung am N-terminalen und am C-terminalen Ende auf, die gleich oder unterschiedlich lang sind.
  • Zum Beispiel können die hierin offenbarten Multi-Flap-Prime-Editoren eine trunkierte Version der reversen Transkriptase von M-MLV beinhalten. In dieser Ausführungsform enthält die reverse Transkriptase 4 Mutationen (D200N, T306K, W313F, T330P; wobei zu beachten ist, dass die in PE2 vorhandene L603W-Mutation aufgrund des Trunkierens nicht mehr vorhanden ist). Die DNA-Sequenz, die diesen trunkierten Editor kodiert, ist 522 bp kleiner als PE2 und eignet sich daher für Anwendungen, bei denen die Übertragung der DNA-Sequenz aufgrund ihrer Größe eine Herausforderung darstellt (z. B. bei der Übertragung von Adenoassoziierten Viren und Lentiviren). Diese Ausführungsform wird als MMLV-RT(trunc) bezeichnet und weist die folgende Aminosäuresequenz auf
    MMLV- RT(TRUNC)
    Figure DE112021002672T5_0116
  • In verschiedenen Ausführungsformen können die hierin offenbaren Multi-Flap-Prime- Editoren eine der hierin beschriebenen RT-Varianten oder eine RT-Variante davon umfassen, die mindestens etwa 70 % identisch, mindestens etwa 80 % identisch, mindestens etwa 90 % identisch, mindestens etwa 95 % identisch, mindestens etwa 96 % identisch, mindestens etwa 97 % identisch, mindestens etwa 98 % identisch, mindestens etwa 99 % identisch, mindestens etwa 99,5 % identisch oder mindestens etwa 99,9 % identisch mit beliebigen Referenz-Cas9- Varianten aufweist.
  • In noch anderen Ausführungsformen können die vorliegenden Verfahren und Zusammensetzungen eine DNA-Polymerase verwenden, die zu einer reversen Transkriptase evolviert wurde, wie in Effefson et al. „Synthetic evolutionary origin of a proofreading reverse transcriptase“, Science, June 24, 2016, Vol. 352: 1590-1593 beschrieben, deren Inhalt hierin durch Bezugnahme aufgenommen ist.
  • In bestimmten anderen Ausführungsformen wird die reverse Transkriptase als eine Komponente eines Fusionsproteins bereitgestellt, das auch ein napDNAbp umfasst. Mit anderen Worten, in einigen Ausführungsformen ist die reverse Transkriptase mit einem napDNAbp als Fusionsprotein fusioniert.
  • In verschiedenen Ausführungsformen können reverse Transkriptase-Varianten aus der M-MLV-Wildtyp-Reverse-Transkriptase entwickelt werden, dargestellt durch SEQ-ID-NR: 89.
  • In verschiedenen Ausführungsformen können die hierin beschriebenen Multi-Flap- Prime-Editoren (mit RT, die entweder als Fusionspartner oder in trans bereitgestellt wird) eine RT-Variante beinhalten, die eine oder mehrere der folgenden Mutationen umfasst: P51L, S67K, E69K, L139P, T197A, D200N, H204R, F209N, E302K, E302R, T306K, F309N, W313F, T330P, L345G, L435G, N454K, D524G, E562Q, D583N, H594Q, L603W, E607K oder D653N in der Wildtyp-M-MLV-RT von SEQ-ID-NR: 89 oder an einer entsprechenden Aminosäureposition in einer anderen Wildtyp-RT-Polypeptidsequenz.
  • Einige beispielhafte reverse Transkriptasen, die gemäß verschiedener Ausführungsformen dieser Offenbarung an napDNAbp-Proteine fusioniert oder als einzelne Proteine bereitgestellt werden können, werden im Folgenden bereitgestellt. Beispielhafte reverse Transkriptasen beinhalten Varianten mit mindestens 80 %, mindestens 85 %, mindestens 90 %, mindestens 95 % oder mindestens 99 % Sequenzidentität zu den folgenden Wildtyp-Enzymen oder Teilenzymen:
    Beschreibung Sequenz (Varianten-Substitutionen im Vergleich zum Wildtyp)
    Reverse Transkriptase (M-MLV RT) Wildtyp
    Figure DE112021002672T5_0117
    Moloney Murines Leukämie- Virus
    Verwendet in PE1 (Prime- Editor 1 Fusionsprotein, hierin offenbart)
    M-MLV RT D200N
    Figure DE112021002672T5_0118
    M-MLV RT D200N T330P
    Figure DE112021002672T5_0119
    M-MLV RT D200N T330P L603W
    Figure DE112021002672T5_0120
    M-MLV RT D200N T330P L603W E69K
    Figure DE112021002672T5_0121
    M-MLV RT D200N T330P L603 W E302R
    Figure DE112021002672T5_0122
    M-MLV RT D200N T330P L603 W E607K
    Figure DE112021002672T5_0123
    M-MLV RT D200N T330P L603 W L139P
    Figure DE112021002672T5_0124
    M-MLV RT D200N T330P L603 W L435G
    Figure DE112021002672T5_0125
    Figure DE112021002672T5_0126
    M-MLV RT D200N T330P L603 W N454K
    Figure DE112021002672T5_0127
    M-MLV RT D200N T330P L603 W T306K
    Figure DE112021002672T5_0128
    M-MLV RT D200N T330P L603 W W313F
    Figure DE112021002672T5_0129
    M-MLV RT D200N T330P L603 W D524G
    Figure DE112021002672T5_0130
    E562Q D583N
    Figure DE112021002672T5_0131
    M-MLV RT D200N T330P L603W E302R W313F
    Figure DE112021002672T5_0132
    M-MLV RT D200N T330P L603 W E607K L139P
    Figure DE112021002672T5_0133
    M-MLV RT P51L S67K T197A H204R E302K F309N W313F T330P L435G N454K D524G D583N H594Q D653N M-MLV RT D200N P51L S67K T197A
    Figure DE112021002672T5_0134
    H204R E302K F309N W313F T330P L345G N454K D524G D583N H594Q D653N
    Figure DE112021002672T5_0135
    M-MLV RT D200N T330P L603 W T306K W313F
    Figure DE112021002672T5_0136
    in PE2
  • In verschiedenen anderen Ausführungsformen können die hierin beschriebenen Multi- Flap-Prime-Editoren (mit RT, die entweder als Fusionspartner oder in trans bereitgestellt wird) eine RT-Variante beinhalten, die eine oder mehrere der folgenden Mutationen umfasst: P51X, S67X, E69X, L139X, T197X, D200X, H204X, F209X, E302X, T306X, F309X, W313X, T330X, L345X, L435X, N454X, D524X, E562X, D583X, H594X, L603X, E607X oder D653X in der Wildtyp-M-MLV-RT von SEQ-ID-NR: 89 oder an einer entsprechenden Aminosäureposition in einer anderen Wildtyp-RT-Polypeptidsequenz, wobei „X“ eine beliebige Aminosäure sein kann.
  • In verschiedenen anderen Ausführungsformen können die hierin beschriebenen Multi- Flap-Prime-Editoren (mit RT, die entweder als Fusionspartner oder in trans bereitgestellt wird) eine RT-Variante beinhalten, die eine P51X-Mutation in der Wildtyp-M-MLV-RT von SEQ- ID-NR: 89 oder an einer entsprechenden Aminosäureposition in einer anderen Wildtyp-RT- Polypeptidsequenz umfasst, wobei „X“ eine beliebige Aminosäure sein kann. In bestimmten Ausführungsformen ist X L.
  • In verschiedenen anderen Ausführungsformen können die hierin beschriebenen Multi- Flap-Prime-Editoren (mit RT, die entweder als Fusionspartner oder in trans bereitgestellt wird) eine RT-Variante beinhalten, die eine S67X-Mutation in der Wildtyp-M-MLV-RT von SEQ- ID-NR: 89 oder an einer entsprechenden Aminosäureposition in einer anderen Wildtyp-RT- Polypeptidsequenz umfasst, wobei „X“ eine beliebige Aminosäure sein kann. In bestimmten Ausführungsformen ist X K.
  • In verschiedenen anderen Ausführungsformen können die hierin beschriebenen Multi- Flap-Prime-Editoren (mit RT, die entweder als Fusionspartner oder in trans bereitgestellt wird) eine RT-Variante beinhalten, die eine E69X-Mutation in der Wildtyp-M-MLV-RT von SEQ- ID-NR: 89 oder an einer entsprechenden Aminosäureposition in einer anderen Wildtyp-RT- Polypeptidsequenz umfasst, wobei „X“ eine beliebige Aminosäure sein kann. In bestimmten Ausführungsformen ist X K.
  • In verschiedenen anderen Ausführungsformen können die hierin beschriebenen Multi- Flap-Prime-Editoren (mit RT, die entweder als Fusionspartner oder in trans bereitgestellt wird) eine RT-Variante beinhalten, die eine L139X-Mutation in der Wildtyp-M-MLV-RT von SEQ- ID-NR: 89 oder an einer entsprechenden Aminosäureposition in einer anderen Wildtyp-RT- Polypeptidsequenz umfasst, wobei „X“ eine beliebige Aminosäure sein kann. In bestimmten Ausführungsformen ist X P.
  • In verschiedenen anderen Ausführungsformen können die hierin beschriebenen Multi- Flap-Prime-Editoren (mit RT, die entweder als Fusionspartner oder in trans bereitgestellt wird) eine RT-Variante beinhalten, die eine T197X-Mutation in der Wildtyp-M-MLV-RT von SEQ- ID-NR: 89 oder an einer entsprechenden Aminosäureposition in einer anderen Wildtyp-RT- Polypeptidsequenz umfasst, wobei „X“ eine beliebige Aminosäure sein kann. In bestimmten Ausführungsformen ist X A.
  • In verschiedenen anderen Ausführungsformen können die hierin beschriebenen Multi- Flap-Prime-Editoren (mit RT, die entweder als Fusionspartner oder in trans bereitgestellt wird) eine RT-Variante beinhalten, die eine D200X-Mutation in der Wildtyp-M-MLV-RT von SEQ- ID-NR: 89 oder an einer entsprechenden Aminosäureposition in einer anderen Wildtyp-RT- Polypeptidsequenz umfasst, wobei „X“ eine beliebige Aminosäure sein kann. In bestimmten Ausführungsformen ist X N.
  • In verschiedenen anderen Ausführungsformen können die hierin beschriebenen Multi- Flap-Prime-Editoren (mit RT, die entweder als Fusionspartner oder in trans bereitgestellt wird) eine RT-Variante beinhalten, die eine H204X-Mutation in der Wildtyp-M-MLV-RT von SEQ- ID-NR: 89 oder an einer entsprechenden Aminosäureposition in einer anderen Wildtyp-RT- Polypeptidsequenz umfasst, wobei „X“ eine beliebige Aminosäure sein kann. In bestimmten Ausführungsformen ist X R.
  • In verschiedenen anderen Ausführungsformen können die hierin beschriebenen Multi- Flap-Prime-Editoren (mit RT, die entweder als Fusionspartner oder in trans bereitgestellt wird) eine RT-Variante beinhalten, die eine F209X-Mutation in der Wildtyp-M-MLV-RT von SEQ- ID-NR: 89 oder an einer entsprechenden Aminosäureposition in einer anderen Wildtyp-RT- Polypeptidsequenz umfasst, wobei „X“ eine beliebige Aminosäure sein kann. In bestimmten Ausführungsformen ist X N.
  • In verschiedenen anderen Ausführungsformen können die hierin beschriebenen Multi- Flap-Prime-Editoren (mit RT, die entweder als Fusionspartner oder in trans bereitgestellt wird) eine RT-Variante beinhalten, die eine E302X-Mutation in der Wildtyp-M-MLV-RT von SEQ- ID-NR: 89 oder an einer entsprechenden Aminosäureposition in einer anderen Wildtyp-RT- Polypeptidsequenz umfasst, wobei „X“ eine beliebige Aminosäure sein kann. In bestimmten Ausführungsformen ist X K.
  • In verschiedenen anderen Ausführungsformen können die hierin beschriebenen Multi- Flap-Prime-Editoren (mit RT, die entweder als Fusionspartner oder in trans bereitgestellt wird) eine RT-Variante beinhalten, die eine E302X-Mutation in der Wildtyp-M-MLV-RT von SEQ- ID-NR: 89 oder an einer entsprechenden Aminosäureposition in einer anderen Wildtyp-RT- Polypeptidsequenz umfasst, wobei „X“ eine beliebige Aminosäure sein kann. In bestimmten Ausführungsformen ist X R.
  • In verschiedenen anderen Ausführungsformen können die hierin beschriebenen Multi- Flap-Prime-Editoren (mit RT, die entweder als Fusionspartner oder in trans bereitgestellt wird) eine RT-Variante beinhalten, die eine T306X-Mutation in der Wildtyp-M-MLV-RT von SEQ- ID-NR: 89 oder an einer entsprechenden Aminosäureposition in einer anderen Wildtyp-RT- Polypeptidsequenz umfasst, wobei „X“ eine beliebige Aminosäure sein kann. In bestimmten Ausführungsformen ist X K.
  • In verschiedenen anderen Ausführungsformen können die hierin beschriebenen Multi- Flap-Prime-Editoren (mit RT, die entweder als Fusionspartner oder in trans bereitgestellt wird) eine RT-Variante beinhalten, die eine F309X-Mutation in der Wildtyp-M-MLV-RT von SEQ- ID-NR: 89 oder an einer entsprechenden Aminosäureposition in einer anderen Wildtyp-RT- Polypeptidsequenz umfasst, wobei „X“ eine beliebige Aminosäure sein kann. In bestimmten Ausführungsformen ist X N.
  • In verschiedenen anderen Ausführungsformen können die hierin beschriebenen Multi- Flap-Prime-Editoren (mit RT, die entweder als Fusionspartner oder in trans bereitgestellt wird) eine RT-Variante beinhalten, die eine W313X-Mutation in der Wildtyp-M-MLV-RT von SEQ- ID-NR: 89 oder an einer entsprechenden Aminosäureposition in einer anderen Wildtyp-RT- Polypeptidsequenz umfasst, wobei „X“ eine beliebige Aminosäure sein kann. In bestimmten Ausführungsformen ist X F.
  • In verschiedenen anderen Ausführungsformen können die hierin beschriebenen Multi- Flap-Prime-Editoren (mit RT, die entweder als Fusionspartner oder in trans bereitgestellt wird) eine RT-Variante beinhalten, die eine T330X-Mutation in der Wildtyp-M-MLV-RT von SEQ- ID-NR: 89 oder an einer entsprechenden Aminosäureposition in einer anderen Wildtyp-RT- Polypeptidsequenz umfasst, wobei „X“ eine beliebige Aminosäure sein kann. In bestimmten Ausführungsformen ist X P.
  • In verschiedenen anderen Ausführungsformen können die hierin beschriebenen Multi- Flap-Prime-Editoren (mit RT, die entweder als Fusionspartner oder in trans bereitgestellt wird) eine RT-Variante beinhalten, die eine L345X-Mutation in der Wildtyp-M-MLV-RT von SEQ- ID-NR: 89 oder an einer entsprechenden Aminosäureposition in einer anderen Wildtyp-RT- Polypeptidsequenz umfasst, wobei „X“ eine beliebige Aminosäure sein kann. In bestimmten Ausführungsformen ist X G.
  • In verschiedenen anderen Ausführungsformen können die hierin beschriebenen Multi- Flap-Prime-Editoren (mit RT, die entweder als Fusionspartner oder in trans bereitgestellt wird) eine RT-Variante beinhalten, die eine L435X-Mutation in der Wildtyp-M-MLV-RT von SEQ- ID-NR: 89 oder an einer entsprechenden Aminosäureposition in einer anderen Wildtyp-RT- Polypeptidsequenz umfasst, wobei „X“ eine beliebige Aminosäure sein kann. In bestimmten Ausführungsformen ist X G.
  • In verschiedenen anderen Ausführungsformen können die hierin beschriebenen Multi- Flap-Prime-Editoren (mit RT, die entweder als Fusionspartner oder in trans bereitgestellt wird) eine RT-Variante beinhalten, die eine N454X-Mutation in der Wildtyp-M-MLV-RT von SEQ- ID-NR: 89 oder an einer entsprechenden Aminosäureposition in einer anderen Wildtyp-RT- Polypeptidsequenz umfasst, wobei „X“ eine beliebige Aminosäure sein kann. In bestimmten Ausführungsformen ist X K.
  • In verschiedenen anderen Ausführungsformen können die hierin beschriebenen Multi- Flap-Prime-Editoren (mit RT, die entweder als Fusionspartner oder in trans bereitgestellt wird) eine RT-Variante beinhalten, die eine D524X-Mutation in der Wildtyp-M-MLV-RT von SEQ- ID-NR: 89 oder an einer entsprechenden Aminosäureposition in einer anderen Wildtyp-RT- Polypeptidsequenz umfasst, wobei „X“ eine beliebige Aminosäure sein kann. In bestimmten Ausführungsformen ist X G.
  • In verschiedenen anderen Ausführungsformen können die hierin beschriebenen Multi- Flap-Prime-Editoren (mit RT, die entweder als Fusionspartner oder in trans bereitgestellt wird) eine RT-Variante beinhalten, die eine E562X-Mutation in der Wildtyp-M-MLV-RT von SEQ- ID-NR: 89 oder an einer entsprechenden Aminosäureposition in einer anderen Wildtyp-RT- Polypeptidsequenz umfasst, wobei „X“ eine beliebige Aminosäure sein kann. In bestimmten Ausführungsformen ist X Q.
  • In verschiedenen anderen Ausführungsformen können die hierin beschriebenen Multi- Flap-Prime-Editoren (mit RT, die entweder als Fusionspartner oder in trans bereitgestellt wird) eine RT-Variante beinhalten, die eine D583X-Mutation in der Wildtyp-M-MLV-RT von SEQ- ID-NR: 89 oder an einer entsprechenden Aminosäureposition in einer anderen Wildtyp-RT- Polypeptidsequenz umfasst, wobei „X“ eine beliebige Aminosäure sein kann. In bestimmten Ausführungsformen ist X N.
  • In verschiedenen anderen Ausführungsformen können die hierin beschriebenen Multi- Flap-Prime-Editoren (mit RT, die entweder als Fusionspartner oder in trans bereitgestellt wird) eine RT-Variante beinhalten, die eine H594X-Mutation in der Wildtyp-M-MLV-RT von SEQ- ID-NR: 89 oder an einer entsprechenden Aminosäureposition in einer anderen Wildtyp-RT- Polypeptidsequenz umfasst, wobei „X“ eine beliebige Aminosäure sein kann. In bestimmten Ausführungsformen ist X Q.
  • In verschiedenen anderen Ausführungsformen können die hierin beschriebenen Multi- Flap-Prime-Editoren (mit RT, die entweder als Fusionspartner oder in trans bereitgestellt wird) eine RT-Variante beinhalten, die eine L603X-Mutation in der Wildtyp-M-MLV-RT von SEQ- ID-NR: 89 oder an einer entsprechenden Aminosäureposition in einer anderen Wildtyp-RT- Polypeptidsequenz umfasst, wobei „X“ eine beliebige Aminosäure sein kann. In bestimmten Ausführungsformen ist X W.
  • In verschiedenen anderen Ausführungsformen können die hierin beschriebenen Multi- Flap-Prime-Editoren (mit RT, die entweder als Fusionspartner oder in trans bereitgestellt wird) eine RT-Variante beinhalten, die eine E607X-Mutation in der Wildtyp-M-MLV-RT von SEQ- ID-NR: 89 oder an einer entsprechenden Aminosäureposition in einer anderen Wildtyp-RT- Polypeptidsequenz umfasst, wobei „X“ eine beliebige Aminosäure sein kann. In bestimmten Ausführungsformen ist X K.
  • In verschiedenen anderen Ausführungsformen können die hierin beschriebenen Multi- Flap-Prime-Editoren (mit RT, die entweder als Fusionspartner oder in trans bereitgestellt wird) eine RT-Variante beinhalten, die eine D653X-Mutation in der Wildtyp-M-MLV-RT von SEQ- ID-NR: 89 oder an einer entsprechenden Aminosäureposition in einer anderen Wildtyp-RT- Polypeptidsequenz umfasst, wobei „X“ eine beliebige Aminosäure sein kann. In bestimmten Ausführungsformen ist X N.
  • Einige beispielhafte reverse Transkriptasen, die gemäß verschiedener Ausführungsformen dieser Offenbarung an napDNAbp-Proteine fusioniert oder als einzelne Proteine bereitgestellt werden können, werden im Folgenden bereitgestellt. Beispielhafte reverse Transkriptasen beinhalten Varianten mit mindestens 80 %, mindestens 85 %, mindestens 90 %, mindestens 95 % oder mindestens 99 % Sequenzidentität zu den folgenden Wildtyp-Enzymen oder Teilenzymen:
    BESCHREIBUNG SEQUENZ (VARIANTEN-SUBSTITUTIONEN IM VERGLEICH ZUM WILDTYP)
    REVERSE TRANSKRIPTASE (M- MLV RT) WILDTYP
    Figure DE112021002672T5_0137
    MOLONEY MURINES LEUKÄMIE- VIRUS
    VERWENDET IN PE1 (PRIME- EDITOR 1 FUSIONSPROTEIN, HIERIN OFFENBART)
    M-MLV RT D200N
    Figure DE112021002672T5_0138
    M-MLV RT D200N T330P
    Figure DE112021002672T5_0139
    M-MLV RT D200N T330P L603W
    Figure DE112021002672T5_0140
    M-MLV RT E69K D200N T330P L603W
    Figure DE112021002672T5_0141
    M-MLV RT D200N T330P L603W E302R
    Figure DE112021002672T5_0142
    M-MLV RT D200N T330P L603W E607K
    Figure DE112021002672T5_0143
    M-MLV RT D200N T330P L603W L139P
    Figure DE112021002672T5_0144
    M-MLV RT D200N T330P L603W L435G
    Figure DE112021002672T5_0145
    M-MLV RT D200N T330P L603W N454K
    Figure DE112021002672T5_0146
    M-MLV RT D200N T330P L603W T306K
    Figure DE112021002672T5_0147
    Figure DE112021002672T5_0148
    M-MLV RT D200N T330P L603W W313F
    Figure DE112021002672T5_0149
    M-MLV RT D200N T330P L603W D524G E562Q D583N
    Figure DE112021002672T5_0150
    M-MLV RT D200N T330P L603W E302R W313F
    Figure DE112021002672T5_0151
    Figure DE112021002672T5_0152
    M-MLV RT D200N T330P L603W E607K L139P
    Figure DE112021002672T5_0153
    M-MLV RT P51L S67K T197A H204R E302K F309N W313F T330P L435G N454K D524G D583N H594Q D653N
    Figure DE112021002672T5_0154
    M-MLV RT P51L S67K T197A D200N H204R E302K F309N W313F T330P L345G N454K D524G D583N H594Q D653N
    Figure DE112021002672T5_0155
    M-MLV RT D200N T330P L603 W T306K W313F
    Figure DE112021002672T5_0156
    IN PE2
  • Das hier beschriebene Multi-Flap-Prime-Editor-System kommt für jede beliebige öffentlich verfügbare reverse Transkriptase in Betracht, die in einem der folgenden US-Patente beschrieben oder offenbart ist (die in ihrer Gesamtheit durch Bezugnahme einbezogen sind): US-Patent-Nr: 10,202,658; 10,189,831; 10,150,955; 9,932,567; 9,783,791; 9,580,698; 9,534,201; und 9,458,484, sowie jede beliebige Variante davon, die mit bekannten Verfahren zum Einbauen von Mutationen oder bekannten Verfahren zur Entwicklung von Proteinen hergestellt werden kann. Die folgenden Referenzen beschreiben reverse Transkriptasen in der Technik. Jede ihrer Offenbarungen ist durch Bezugnahme in vollem Umfang hierin aufgenommen.
    • Herzig, E., Voronin, N., Kucherenko, N. & Hizi, A. A Novel Leu92 Mutant of HIV-1 Reverse Transcriptase with a Selective Deficiency in Strand Transfer Causes a Loss of Viral Replication. J. Virol. 89,8119-8129 (2015).
    • Mohr, G. et al. A Reverse Transcriptase-Cas1 Fusion Protein Contains a Cas6 Domain Required for Both CRISPR RNA Biogenesis and RNA Spacer Acquisition. Mol. Cell 72, 700-714.e8 (2018).
    • Zhao, C., Liu, F. & Pyle, A. M. An ultraprocessive, accurate reverse transcriptase encoded by a metazoan group II intron. RNA 24, 183-195 (2018).
    • Zimmerly, S. & Wu, L. An Unexplored Diversity of Reverse Transcriptases in Bacteria. Microbiol Spectr 3, MDNA3-0058-2014 (2015).
    • Ostertag, E. M. & Kazazian Jr, H. H. Biology of Mammalian L1 Retrotransposons. Annual Review of Genetics 35, 501-538 (2001).
    • Perach, M. & Hizi, A. Catalytic Features of the Recombinant Reverse Transcriptase of Bovine Leukemia Virus Expressed in Bacteria. Virology 259, 176-189 (1999).
    • Lim, D. et al. Crystal structure of the moloney murine leukemia virus RNase H domain. J. Virol. 80, 8379-8389 (2006).
    • Zhao, C. & Pyle, A. M. Crystal structures of a group II intron maturase reveal a missing link in spliceosome evolution. Nature Structural & Molecular Biology 23, 558-565 (2016).
    • Griffiths, D. J. Endogenous retroviruses in the human genome sequence. Genome Biol. 2, REVIEWS1017 (2001).
    • Baranauskas, A. et al. Generation and characterization of new highly thermostable and processive M-MuLV reverse transcriptase variants. Protein Eng Des Sei 25, 657-668 (2012).
    • Zimmerly, S., Guo, H., Perlman, P. S. & Lambowitz, A. M. Group II intron mobility occurs by target DNA-primed reverse transcription. Cell 82, 545-554 (1995).
    • Feng, Q., Moran, J. V., Kazazian, H. H. & Boeke, J. D. Human L1 retrotransposon encodes a conserved endonuclease required for retrotransposition. Cell 87, 905-916 (1996).
    • Berkhout, B., Jebbink, M. & Zsiros, J. Identification of an Active Reverse Transcriptase Enzyme Encoded by a Human Endogenous HERV-K Retrovirus. Journal of Virology 73, 2365-2375 (1999).
    • Kotewicz, M. L., Sampson, C. M., D'Alessio, J. M. & Gerard, G. F. Isolation of cloned Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase lacking ribonuclease H activity. Nucleic Acids Res 16, 265-277 (1988).
    • Arezi, B. & Hogrefe, H. Novel mutations in Moloney Murine Leukemia Virus reverse transcriptase increase thermostability through tighter binding to template-primer. Nucleic Acids Res 37, 473-481 (2009).
    • Blain, S. W. & Goff, S. P. Nuclease activities of Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase. Mutants with altered substrate specificities. J. Biol. Chem. 268, 23585-23592 (1993).
    • Xiong, Y. & Eickbush, T. H. Origin and evolution of retroelements based upon their reverse transcriptase sequences. EMBO J 9, 3353-3362 (1990).
    • Herschhorn, A. & Hizi, A. Retroviral reverse transcriptases. Cell. Mol. Life Sci. 67, 2717- 2747 (2010).
    • Taube, R., Loya, S., Avidan, O., Perach, M. & Hizi, A. Reverse transcriptase of mouse mammary tumour virus: expression in bacteria, purification and biochemical characterization. Biochem. J. 329 (Pt 3), 579-587 (1998).
    • Liu, M. et al. Reverse Transcriptase-Mediated Tropism Switching in Bordetella Bacteriophage. Science 295, 2091-2094 (2002).
    • Luan, D. D., Korman, M. H., Jakubczak, J. L. & Eickbush, T. H. Reverse transcription of R2Bm RNA is primed by a nick at the chromosomal target site: a mechanism for non-LTR retrotransposition. Cell72, 595-605 (1993).
    • Nottingham, R. M. et al. RNA-seq of human reference RNA samples using a thermostable group II intron reverse transcriptase. RNA 22, 597-613 (2016).
    • Telesnitsky, A. & Goff, S. P. RNase H domain mutations affect the interaction between Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase and its primer-template. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 1276-1280 (1993).
    • Halvas, E. K., Svarovskaia, E. S. & Pathak, V. K. Role of Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase Deoxyribonucleoside Triphosphate-Binding Site in Retroviral Replication and In Vivo Fidelity. Journal of Virology 74, 10349-10358 (2000).
    • Nowak, E. et al. Structural analysis of monomeric retroviral reverse transcriptase in complex with an RNA/DNA hybrid. Nucleic Acids Res 41, 3874-3887 (2013).
    • Stamos, J. L., Lentzsch, A. M. & Lambowitz, A. M. Structure of a Thermostable Group II Intron Reverse Transcriptase with Template-Primer and Its Functional and Evolutionary Implications. Molecular Cell 68, 926-939.e4 (2017).
    • Das, D. & Georgiadis, M. M. The Crystal Structure of the Monomeric Reverse Transcriptase from Moloney Murine Leukemia Virus. Structure 12, 819-829 (2004).
    • Avidan, O., Meer, M. E., Oz, I. & Hizi, A. The processivity and fidelity of DNA synthesis exhibited by the reverse transcriptase of bovine leukemia virus. European Journal of Biochemistry 269, 859-867 (2002).
    • Gerard, G. F. et al. The role of template-primer in protection of reverse transcriptase from thermal inactivation. Nucleic Acids Res 30, 3118-3129 (2002).
    • Monot, C. et al. The Specificity and Flexibility of L1 Reverse Transcription Priming at Imperfect T-Tracts. PLOS Genetics 9, e1003499 (2013).
    • Mohr, S. et al. Thermostable group II intron reverse transcriptase fusion proteins and their use in cDNA synthesis and next-generation RNA sequencing. RNA 19, 958-970 (2013).
  • Alle oben genannten Referenzen, die sich auf reverse Transkriptasen beziehen, werden hiermit in ihrer Gesamtheit in Bezug genommen, sofern dies nicht bereits angegeben ist.
  • [4] Prime-Editoren
  • Die Offenbarung stellt Systeme bereit, die Prime-Editoren umfassen. In einem Aspekt stellt diese Offenbarung Systeme für gleichzeitiges Editieren beider Stränge einer doppelsträngigen DNA-Sequenz an einer zu editierenden Zielstelle bereit, die einen ersten Prime-Editor-Komplex und einen zweiten Prime-Editor-Komplex umfassen, wobei jeder der ersten und zweiten Prime-Editor-Komplexe Folgendes umfasst: (1) einen Prime-Editor, der (i) ein Nukleinsäure-programmierbares DNA-Bindungsprotein (napDNAbp) und (ii) ein Polypeptid mit einer RNA-abhängigen DNA-Polymerase-Aktivität umfasst; und (2) eine pegRNA, umfassend eine Spacer-Sequenz, einen gRNA-Kern, ein DNA-Synthese-Templat und eine Primer-Bindungsstelle, wobei das DNA-Synthese-Templat der pegRNA des ersten Prime-Editor-Komplexes für eine erste einzelsträngige DNA-Sequenz kodiert und das DNA- Synthese-Templat der pegRNA des zweiten Prime-Editor-Komplexes für eine zweite einzelsträngige DNA-Sequenz kodiert, wobei die erste einzelsträngige DNA-Sequenz und die zweite einzelsträngige DNA-Sequenz jeweils eine Region der Komplementarität zur anderen umfassen, und wobei die erste einzelsträngige DNA-Sequenz und die zweite einzelsträngige DNA-Sequenz einen Duplex bilden, der einen editierten Abschnitt im Vergleich zur DNA- Sequenz an der zu editierenden Zielstelle umfasst, der sich in die zu editierende Zielstelle integriert.
  • In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Offenbarung Systeme für das Editieren einer oder mehrerer doppelsträngiger DNA-Sequenzen bereit, wobei das System Folgendes umfasst:
    1. a) einen ersten Prime-Editor-Komplex, umfassend:
      1. i. einen ersten Prime-Editor, umfassend ein erstes Nukleinsäure-programmierbares DNA- Bindeprotein (erstes napDNAbp) und ein erstes Polypeptid, das eine RNA-abhängige DNA-Polymerase-Aktivität umfasst; und
      2. ii. eine erste Prime-Editing-Leit-RNA (erste PEgRNA), die an eine erste Bindungsstelle auf einem ersten Strang einer ersten doppelsträngigen DNA-Sequenz an einer ersten zu editierenden Zielstelle bindet;
    2. b) einen zweiten Prime-Editor-Komplex, umfassend:
      1. i. einen zweiten Prime-Editor, umfassend ein zweites Nukleinsäure-programmierbares DNA- Bindeprotein (zweites napDNAbp) und ein zweites Polypeptid, das eine RNA-abhängige DNA-Polymerase-Aktivität aufweist; und
      2. ii. eine zweite Prime-Editing-Leit-RNA (zweite PEgRNA), die an eine zweite Bindungsstelle auf einem zweiten Strang der ersten doppelsträngigen DNA-Sequenz an der ersten zu editierenden Zielstelle bindet;
    3. c) einen dritten Prime-Editor-Komplex, umfassend:
      1. i. einen dritten Prime-Editor, umfassend ein drittes Nukleinsäure-programmierbares DNA- Bindeprotein (drittes napDNAbp) und ein drittes Polypeptid, das eine RNA-abhängige DNA-Polymerase-Aktivität aufweist; und
      2. ii. eine dritte Prime-Editing-Leit-RNA (dritte PEgRNA), die an eine erste Bindungsstelle auf einem ersten Strang einer zweiten doppelsträngigen DNA-Sequenz an einer zweiten zu editierenden Zielstelle bindet;
    4. d) einen vierten Prime-Editor-Komplex, umfassend:
      1. i. einen vierten Prime-Editor, umfassend ein viertes Nukleinsäure-programmierbares DNA- Bindeprotein (viertes napDNAbp) und ein viertes Polypeptid, das eine RNA-abhängige DNA-Polymerase-Aktivität aufweist; und
      2. ii. eine vierte Prime-Editing Leit-RNA (vierte PEgRNA), die an eine zweite Bindungsstelle auf einem zweiten Strang der zweiten doppelsträngigen DNA-Sequenz an der zweiten zu editierenden Zielstelle bindet;
    wobei die erste PEgRNA ein erstes DNA-Synthese-Templat umfasst, das eine erste einzelsträngige DNA-Sequenz kodiert, die zweite PEgRNA ein zweites DNA-Synthese- Templat umfasst, das eine zweite einzelsträngige DNA-Sequenz kodiert, die dritte PEgRNA ein drittes DNA-Synthese-Templat umfasst, das eine dritte einzelsträngige DNA-Sequenz kodiert, und die vierte PEgRNA ein viertes DNA-Synthese-Templat umfasst, das eine vierte einzelsträngige DNA-Sequenz kodiert;
    wobei die erste und die dritte einzelsträngige DNA-Sequenz jeweils eine Region der Komplementarität zur anderen umfassen; und wobei die zweite und die vierte einzelsträngige DNA-Sequenz jeweils eine Region der Komplementarität zur anderen umfassen.
  • In einigen Ausführungsformen sind die in den hierin beschriebenen Systemen verwendeten Prime-Editoren (z. B. der erste Prime-Editor, der zweite Prime-Editor, der dritte Prime-Editor und/oder der vierte Prime-Editor in den oben beschriebenen Systemen) als Fusionsproteine bereitgestellt. In einigen Ausführungsformen umfassen die Prime-Editor- Fusionsproteine ein napDNAbp und eine Polymerase (z. B. eine DNA-abhängige DNA- Polymerase oder eine RNA-abhängige DNA-Polymerase, wie etwa eine reverse Transkriptase). In einigen Ausführungsformen sind das napDNAbp und die Polymerase optional durch einen Linker verbunden, um das Fusionsprotein zu bilden. Verschiedene Konfigurationen der Prime-Editor-Fusionsproteine und zusätzliche Domänen der Fusionsproteine werden ferner hierin beschrieben. In verschiedenen Ausführungsformen ziehen die durch die vorliegende Offenbarung bereitgestellten Systeme und Verfahren die Verwendung beliebiger der hierin beschriebenen Prime-Editor-Fusionsproteine in Betracht.
  • In einigen Ausführungsformen umfassen die in den hierin beschriebenen Systemen verwendeten Prime-Editor-Komplexe einen Prime-Editor (z. B. den ersten Prime-Editor, den zweiten Prime-Editor, den dritten Prime-Editor und/oder den vierten Prime-Editor in den oben beschriebenen Systemen), wobei die Komponenten eines oder mehrerer Prime-Editoren in trans bereitgestellt werden, wie dies in der vorliegenden Spezifikation im Detail beschrieben ist. In einigen Ausführungsformen umfasst der Prime-Editor ein napDNAbp und eine in trans exprimierte Polymerase. In einigen Ausführungsformen werden das napDNAbp und die Polymerase von einem oder mehreren Vektoren exprimiert (z. B. werden beide Komponenten von demselben Vektor exprimiert, oder jede Komponente wird von einem anderen Vektor exprimiert). In bestimmten Ausführungsformen umfassen die Prime-Editoren zusätzliche Komponenten, wie hierin beschrieben, die in trans exprimiert werden. In einigen Ausführungsformen können die Prime-Editoren, die in den hierin beschriebenen Systemen verwendet werden, sowohl einen oder mehrere Prime-Editoren umfassen, die als Fusionsproteine bereitgestellt werden, als auch einen oder mehrere Prime-Editoren, deren Komponenten in trans bereitgestellt werden.
  • In einigen Ausführungsformen umfassen die hierin beschriebenen Multi-Flap-Prime- Editor-Systeme Fusionsproteine, die ein napDNAbp und eine Polymerase (z. B. DNA- abhängige DNA-Polymerase oder RNA-abhängige DNA-Polymerase, wie etwa reverse Transkriptase) umfassen und gegebenenfalls durch einen Linker verbunden sind. Der Antrag sieht vor, dass jede geeignete napDNAbp und Polymerase (z. B. DNA-abhängige DNA- Polymerase oder RNA-abhängige DNA-Polymerase, wie etwa reverse Transkriptase) in einem einzigen Fusionsprotein kombiniert werden. Beispiele für napDNAbps und Polymerasen (z. B. DNA-abhängige DNA-Polymerase oder RNA-abhängige DNA-Polymerase, wie etwa reverse Transkriptase) sind hierin jeweils definiert. Da Polymerasen in der Technik bekannt sind und die Aminosäuresequenzen leicht verfügbar sind, soll diese Offenbarung in keiner Weise auf die hierin genannten spezifischen Polymerasen beschränkt sein.
  • In verschiedenen Ausführungsformen können die Fusionsproteine jede beliebige geeignete strukturelle Konfiguration umfassen. Zum Beispiel kann das Fusionsprotein vom N- Terminus bis zum C-Terminus ein napDNAbp umfassen, das an eine Polymerase (z. B. DNA- abhängige DNA-Polymerase oder RNA-abhängige DNA-Polymerase, wie etwa reverse Transkriptase) fusioniert ist. In anderen Ausführungsformen kann das Fusionsprotein vom N- Terminus bis zum C-Terminus eine Polymerase (z. B. eine reverse Transkriptase) umfassen, die mit einem napDNAbp fusioniert ist. Die fusionierte Domäne kann gegebenenfalls durch einen Linker, z. B. eine Aminosäuresequenz, verbunden sein. In anderen Ausführungsformen können die Fusionsproteine die Struktur NH2-[napDNAbp]-[ Polymerase]-COOH; oder NH2- [Polymerase]-[napDNAbp]-COOH umfassen, wobei jedes „]-[" das Vorhandensein einer optionalen Linker-Sequenz anzeigt. In Ausführungsformen, in denen die Polymerase eine reverse Transkriptase ist, können die Fusionsproteine die Struktur NH2-[napDNAbp]-[RT]- COOH; oder NH2-[RT]-[napDNAbp]-COOH umfassen, wobei jedes „]-[" das Vorhandensein einer optionalen Linker-Sequenz anzeigt.
  • Ein beispielhaftes Fusionsprotein ist in 14 dargestellt, das ein Fusionsprotein zeigt, das eine MLV-reverse Transkriptase („MLV-RT“) umfasst, die über eine Linker- Sequenz mit einer Nickase-Cas9 („Cas9(H840A)“) fusioniert ist. Dieses Beispiel soll den Umfang der Fusionsproteine, die für das hierin beschriebene Prime-Editor (PE)-System verwendet werden können, nicht einschränken.
  • In verschiedenen Ausführungsformen kann das Multi-Flap-Prime-Editor- Fusionsprotein die folgende Aminosäuresequenz aufweisen (hierin als „PE1“ bezeichnet), die eine Cas9-Variante umfassend eine H840A-Mutation (d. h. eine Cas9-Nickase) und einen M- MLV-RT-Wildtyp sowie eine N-terminale NLS-Sequenz (19 Aminosäuren) und einen Aminosäure-Linker (32 Aminosäuren), der den C-Terminus der Cas9-Nickase-Domäne mit dem N-Terminus der RT-Domäne verbindet, beinhaltet. Das PE1-Fusionsprotein weist die folgende Struktur auf [NLS]-[Cas9(H840A)]-[Linker]-[MMLV_RT(wt)]. Die Aminosäuresequenz von PE1 und seiner einzelnen Komponenten ist wie folgt:
    BESCHREIBUNG SEQUENZ
    PE1- FUSIONSPROTEIN
    Figure DE112021002672T5_0157
    CAS9(H840A)- MMLV_RT(WT) KEY: NUCLEAR LOCALIZATION SEQUENCE (NLS) TOP:(SEQ ID NO: 124), BOTTOM: (SEQ ID NO: 133) CAS9(H840A) (SEQ ID NO:126) 33-AMINO ACID LINKER (SEQ ID NO: 127) M-MLV REVERSE TRANSCRIPTASE (SEQ ID NO: 128)
    PE1 -N- TERMINALE NLS MKRTADGSEFESPKKKRKV (SEQ ID NO: 124)
    BESCHREIBUNG SEQUENZ
    PE1 -CAS9 (H840A) (MET MINUS)
    Figure DE112021002672T5_0158
    PE1 - LINKER ZWISCHEN CAS9- DOMÄNE UND RT- DOMÄNE (33 AMINOSÄUREN) SGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGSS (SEQ ID NO: 127)
    PE1 - M-MLV RT
    Figure DE112021002672T5_0159
    PE1 -C- TERMINALE NLS SGGSKRTADGSEFEPKKKRKV (SEQ ID NO: 133)
  • In einer anderen Ausführungsform kann das Fusionsprotein des Multi-Flap-Prime- Editors die folgende Aminosäuresequenz aufweisen (hierin als „PE2“ bezeichnet), die eine Cas9-Variante umfassend eine H840A-Mutation (d. h., eine Cas9-Nickase) und eine M-MLV- RT, die die Mutationen D200N, T330P, L603W, T306K und W313F umfasst, sowie eine N- terminale NLS-Sequenz (19 Aminosäuren) und einen Aminosäure-Linker (33 Aminosäuren), der den C-Terminus der Cas9-Nickasedomäne mit dem N-Terminus der RT-Domäne verbindet, beinhaltet. Das PE2-Fusionsprotein weist die folgende Struktur auf: [NLS]- [Cas9(H840A)]-[Linker]-[MMLV_RT(D200N)(T330P)(L603W)(T306K)(W313F)]. Die Aminosäuresequenz von PE2 ist wie folgt:
    Figure DE112021002672T5_0160
    Figure DE112021002672T5_0161
  • In noch anderen Ausführungsformen kann das Prime-Editor-Fusionsprotein die folgenden Aminosäuresequenzen aufweisen:
    PE- FUSIONSPROTEIN
    Figure DE112021002672T5_0162
    MMLV_RT(WT)- 32AA- CAS9(H840A) KEY: NUCLEAR LOCALIZATION SEQUENCE (NLS) TOP:(SEQ ID NO: 124), BOTTOM: (SEQ ID NO: 133) CAS9(H840A) (SEQ ID NO:147) 33-AMINO ACID LINKER (SEQ ID NO: 127) M-MLV REVERSE TRANSCRIPTASE (SEQ ID NO: 149)
    PE- FUSIONSPROTEIN
    Figure DE112021002672T5_0163
    MMLV_RT(WT)- 60AA- CAS9(H840A) KEY: NUCLEAR LOCALIZATION SEQUENCE (NLS) TOP:(SEQ ID NO: 124), BOTTOM: (SEQ ID NO: 133) CAS9(H840A) (SEQ ID NO:153) 33-AMINO ACID LINKER (SEQ ID NO: 175) M-MLV REVERSE TRANSCRIPTASE (SEQ ID NO: 149)
    PE- FUSIONSPROTEIN
    Figure DE112021002672T5_0164
    CAS9(H840A)- FEN1-MMLV_RT D200N T330P L603W T306K W313F KEY: NUCLEAR LOCALIZATION SEQUENCE (NLS) TOP:(SEQ ID NO: 124), BOTTOM: (SEQ ID NO: 133) CAS9(H840A) (SEQ ID NO:157) 33-AMINO ACID LINKER 1 (SEQ ID NO: 127) M-MLV REVERSE TRANSCRIPTASE (SEQ ID NO: 159) 33-AMINO ACID LINKER 2 (SEQ ID NO: 127) FEN1 (SEQ ID NO: 161)
  • In anderen Ausführungsformen können die Fusionsproteine des Multi-Flap-Prime- Editors auf SaCas9 oder auf SpCas9-Nickasen mit veränderten PAM-Spezifitäten basieren, wie etwa die folgenden beispielhaften Sequenzen:
    SACAS9-M-MLV RT PRIME- EDITOR
    Figure DE112021002672T5_0165
    SPCAS9(H840A)- VRQR-MALONEY MURINES LEUKÄMIE- VIRUS REVERSE TRANSKRIPTASE- PRIME-EDITOR
    Figure DE112021002672T5_0166
    SPCAS9(H840A)- VRER-MALONEY MURINES LEUKÄMIE- VIRUS REVERSE TRANSKRIPTASE- PRIME-EDITOR
    Figure DE112021002672T5_0167
  • In noch weiteren Ausführungsformen können die hierin in Betracht gezogenen Multi- Flap-Prime-Editor-Fusionsproteine eine Cas9-Nickase (z. B. Cas9 (H840A)) beinhalten, die mit einer trunkierten Version der M-MLV-Reverse-Transkriptase fusioniert ist. In dieser Ausführungsform enthält die reverse Transkriptase ebenfalls 4 Mutationen (D200N, T306K, W313F, T330P; wobei zu beachten ist, dass die in PE2 vorhandene L603W-Mutation aufgrund des Trunkierens nicht mehr vorhanden ist). Die DNA-Sequenz, die diesen trunkierten Editor kodiert, ist 522 bp kleiner als PE2 und eignet sich daher für Anwendungen, bei denen die Übertragung der DNA-Sequenz aufgrund ihrer Größe eine Herausforderung darstellt (z. B. bei der Übertragung von Adeno-assoziierten Viren und Lentiviren). Diese Ausführungsform wird als Cas9(H840A)-MMLV-RT(trunc) oder „PE2-short“ oder „PE2-Trunc“ bezeichnet und weist die folgende Aminosäuresequenz auf
    CAS9(H840A)- MMLV- RT(TRUNC) ODER PE2-SHORT
    Figure DE112021002672T5_0168
    KEY: NUCLEAR LOCALIZATION SEQUENCE (NLS) TOP:(SEQ ID NO: 124), BOTTOM: (SEQ ID NO: 133) CAS9(H840A) (SEQ ID NO:157) 33-AMINO ACID LINKER 1 (SEQ ID NO: 127) M-MLV TRUNCATED REVERSE TRANSCRIPTASE (SEQ ID NO: 766)
  • Siehe 75, die ein Balkendiagramm bereitstellt, in dem die Effizienz (d.h. „% der gesamten Sequenzierungsauslesungen mit der angegebenen Editierung oder Indels“) von PE2, PE2-Trunc, PE3 und PE3-Trunc über verschiedene Zielstellen in verschiedenen Zelllinien verglichen wird. Die Daten zeigen, dass die Prime-Editoren, die die trunkierten RT-Varianten umfassen, etwa genauso effizient waren wie die Prime-Editoren, die die nicht trunkierten RT- Proteine umfassen.
  • In verschiedenen Ausführungsformen können die hierin in Betracht gezogenen Multi- Flap-Prime-Editor-Fusionsproteine auch beliebige Varianten der oben offenbarten Sequenzen beinhalten, die eine Aminosäuresequenz aufweisen, die zu mindestens etwa 70 % identisch, zu mindestens etwa 80 % identisch, zu mindestens etwa 90 % identisch, zu mindestens etwa 95 % identisch, zu mindestens etwa 96 % identisch, zu mindestens etwa 97 % identisch, zu mindestens etwa 98 % identisch, zu mindestens etwa 99,5 % identisch oder zu mindestens etwa 99,9 % identisch mit PE1, PE2 oder einer der oben angegebenen Prime-Editor- Fusionssequenzen ist.
  • In bestimmten Ausführungsformen können Linker verwendet werden, um eines der Peptide oder Peptiddomänen oder -teile der Erfindung zu verknüpfen (z. B. ein napDNAbp, das mit einer reversen Transkriptase verknüpft oder fusioniert ist).
  • [5] Linker und andere Domänen
  • Die PE-Fusionsproteine können neben dem napDNAbp (z. B. Cas9-Domäne) und der Polymerase-Domäne (z. B. RT-Domäne) verschiedene andere Domänen umfassen. Zum Beispiel können die PE-Fusionsproteine einen oder mehrere Linker umfassen, die die Cas9- Domäne mit der RT-Domäne verbinden, wenn das napDNAbp ein Cas9 und die Polymerase eine RT ist. Die Linker können auch andere funktionelle Domänen, wie etwa Kemlokalisierungssequenzen (NLS) oder eine FEN1 (oder andere Flap-Endonuklease) mit den PE-Fusionsproteinen oder einer Domäne davon verbinden.
  • Darüber hinaus können in Ausführungsformen, die ein Trans-Prime-Editing beinhalten, Linker verwendet werden, um das tPERT-Rekrutierungsprotein mit einem Prime-Editor zu verbinden, z. B. zwischen dem tPERT-Rekrutierungsprotein und dem napDNAbp. Siehe z. B. 3G für ein beispielhaftes Schema eines Trans-Prime-Editors (tPE), der Linker beinhaltet, um eine Polymerase-Domäne und eine Rekrutierungsprotein-Domäne getrennt an ein napDNAbp zu fusionieren.
  • A. Linker
  • Wie oben definiert, bezieht sich der Begriff „Linker“, wie hierin verwendet, auf eine chemische Gruppe oder ein Molekül, das zwei Moleküle oder Einheiten verbindet, z. B. eine Bindungsdomäne und eine Spaltungsdomäne einer Nuklease. In einigen Ausführungsformen verbindet ein Linker eine gRNA-Bindungsdomäne einer RNA-programmierbaren Nuklease und die katalytische Domäne einer Polymerase (z. B. einer reversen Transkriptase). In einigen Ausführungsformen verbindet ein Linker ein dCas9 und eine reverse Transkriptase. In der Regel befindet sich der Linker zwischen zwei Gruppen, Molekülen oder anderen Einheiten oder wird von diesen flankiert und ist mit diesen über eine kovalente Bindung verbunden, wodurch die beiden miteinander verbunden werden. In einigen Ausführungsformen ist der Linker eine Aminosäure oder eine Vielzahl von Aminosäuren (z. B. ein Peptid oder Protein). In einigen Ausführungsformen ist der Linker ein organisches Molekül, eine Gruppe, ein Polymer oder eine chemische Einheit. In einigen Ausführungsformen hat der Linker eine Länge von 5-100 Aminosäuren, zum Beispiel 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 30-35, 35-40, 40-45, 45-50, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 90-100, 100-150 oder eine Länge von 150-200 Aminosäuren. Längere oder kürzere Linker sind ebenfalls denkbar.
  • Bei dem Linker kann es sich um eine einfache kovalente Bindung oder um einen polymeren Linker mit einer Länge von vielen Atomen handeln. In bestimmten Ausführungsformen ist der Linker ein Polpeptid oder basiert auf Aminosäuren. In anderen Ausführungsformen ist der Linker nicht peptidähnlich. In bestimmten Ausführungsformen ist der Linker eine kovalente Bindung (z. B. eine Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindung, Disulfidbindung, Kohlenstoff-Heteroatom-Bindung usw.). In bestimmten Ausführungsformen ist der Linker eine Kohlenstoff-Stickstoff-Bindung einer Amidbindung. In bestimmten Ausführungsformen ist der Linker ein cyclischer oder acyclischer, substituierter oder unsubstituierter, verzweigter oder unverzweigter aliphatischer oder heteroaliphatischer Linker. In bestimmten Ausführungsformen ist der Linker ein Polymer (z. B. Polyethylen, Polyethylenglykol, Polyamid, Polyester usw.). In bestimmten Ausführungsformen umfasst der Linker ein Monomer, Dimer oder Polymer der Aminoalkansäure. In bestimmten Ausführungsformen umfasst der Linker eine Aminoalkansäure (z. B. Glycin, Ethansäure, Alanin, Beta-Alanin, 3-Aminopropansäure, 4-Aminobutansäure, 5-Pentansäure, usw.). In bestimmten Ausführungsformen umfasst der Linker ein Monomer, Dimer oder Polymer der Aminohexansäure (Ahx). In bestimmten Ausführungsformen basiert der Linker auf einer carbocyclischen Einheit (z. B. Cyclopentan, Cyclohexan). In anderen Ausführungsformen umfasst der Linker einen Polyethylenglykol-Anteil (PEG). In anderen Ausführungsformen umfasst der Linker Aminosäuren. In bestimmten Ausführungsformen umfasst der Linker ein Peptid. In bestimmten Ausführungsformen umfasst der Linker eine Aryl- oder Heteroarylgruppe. In bestimmten Ausführungsformen basiert der Linker auf einem Phenylring. Der Linker kann funktionalisierte Einheiten beinhalten, um die Bindung eines Nukleophils (z. B. Thiol, Amino) aus dem Peptid an den Linker zu erleichtern. Jedes beliebige Elektrophil kann als Teil des Linkers verwendet werden. Beispielhafte Elektrophile beinhalten unter anderem aktivierte Ester, aktivierte Amide, Michael-Akzeptoren, Alkylhalogenide, Arylhalogenide, Acylhalogenide und Isothiocyanate.
  • In einigen anderen Ausführungsformen umfasst der Linker die Aminosäuresequenz (GGGGS)n (SEQ-ID-NR: 165), (G)n (SEQ-ID-NR: 166), (EAAAK) n (SEQ-ID-NR: 167), (GGS)n (SEQ-ID-NR: 168), (SGGS)n (SEQ-ID-NR: 169), (XP)n (SEQ-ID-NR: 170), oder eine beliebige Kombination davon, wobei n unabhängig eine ganze Zahl zwischen 1 und 30 ist und wobei X eine beliebige Aminosäure ist. In einigen Ausführungsformen umfasst der Linker die Aminosäuresequenz (GGS)N (SEQ-ID-NR: 176), wobei n 1, 3, or 7 ist. In einigen Ausführungsformen umfasst der Linker die Aminosäuresequenz SGSETPGTSESATPES (SEQ-ID-NR: 171). In einigen Ausführungsformen umfasst der Linker die Aminosäuresequenz SGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGS (SEQ-ID-NR: 172). In einigen Ausführungsformen umfasst der Linker die Aminosäuresequenz SGGSGGSGGS (SEQ-ID- NR: 173). In einigen Ausführungsformen umfasst der Linker die Aminosäuresequenz SGGS (SEQ-ID-NR: 174). In anderen Ausführungsformen umfasst der Linker die Aminosäuresequenz SGGSSGGSSGSETPGTSESATPESAGSYPYDVPDYAGSAAPAAKKKKLDGSGSGGSSG GS (SEQ-ID-NR: 175, 60AA).
  • In bestimmten Ausführungsformen können Linker verwendet werden, um eines der Peptide oder Peptiddomänen oder -einheiten der Erfindung zu verknüpfen (z. B. ein napDNAbp, das mit einer reversen Transkriptase verknüpft oder fusioniert ist).
  • Wie oben definiert, bezieht sich der Begriff „Linker“, wie hierin verwendet, auf eine chemische Gruppe oder ein Molekül, das zwei Moleküle oder Einheiten verbindet, z. B. eine Bindungsdomäne und eine Spaltungsdomäne einer Nuklease. In einigen Ausführungsformen verbindet ein Linker eine gRNA-Bindungsdomäne einer RNA-programmierbaren Nuklease und die katalytische Domäne einer Rekombinase. In einigen Ausführungsformen verbindet ein Linker ein dCas9 und eine reverse Transkriptase. In der Regel befindet sich der Linker zwischen zwei Gruppen, Molekülen oder anderen Einheiten oder wird von diesen flankiert und ist mit diesen über eine kovalente Bindung verbunden, wodurch die beiden miteinander verbunden werden. In einigen Ausführungsformen ist der Linker eine Aminosäure oder eine Vielzahl von Aminosäuren (z. B. ein Peptid oder Protein). In einigen Ausführungsformen ist der Linker ein organisches Molekül, eine Gruppe, ein Polymer oder eine chemische Einheit. In einigen Ausführungsformen hat der Linker eine Länge von 5-100 Aminosäuren, zum Beispiel 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 30- 35, 35-40, 40-45, 45-50, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 90-100, 100-150 oder eine Länge von 150-200 Aminosäuren. Längere oder kürzere Linker sind ebenfalls denkbar.
  • Bei dem Linker kann es sich um eine einfache kovalente Bindung oder um einen polymeren Linker mit einer Länge von vielen Atomen handeln. In bestimmten Ausführungsformen ist der Linker ein Polypeptid oder basiert auf Aminosäuren. In anderen Ausführungsformen ist der Linker nicht peptidähnlich. In bestimmten Ausführungsformen ist der Linker eine kovalente Bindung (z. B. eine Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindung, Disulfidbindung, Kohlenstoff-Heteroatom-Bindung usw.). In bestimmten Ausführungsformen ist der Linker eine Kohlenstoff-Stickstoff-Bindung einer Amidbindung. In bestimmten Ausführungsformen ist der Linker ein cyclischer oder acyclischer, substituierter oder unsubstituierter, verzweigter oder unverzweigter aliphatischer oder heteroaliphatischer Linker. In bestimmten Ausführungsformen ist der Linker ein Polymer (z. B. Polyethylen, Polyethylenglykol, Polyamid, Polyester usw.). In bestimmten Ausführungsformen umfasst der Linker ein Monomer, Dimer oder Polymer der Aminoalkansäure. In bestimmten Ausführungsformen umfasst der Linker eine Aminoalkansäure (z. B. Glycin, Ethansäure, Alanin, Beta-Alanin, 3-Aminopropansäure, 4-Aminobutansäure, 5-Pentansäure, usw.). In bestimmten Ausführungsformen umfasst der Linker ein Monomer, Dimer oder Polymer von AminoHEXAnoesäure (Ahx). In bestimmten Ausführungsformen basiert der Linker auf einer carbocyclischen Einheit (z. B. Cyclopentan, CycloHEXAn). In anderen Ausführungsformen umfasst der Linker einen Polyethylenglykol-Anteil (PEG). In anderen Ausführungsformen umfasst der Linker Aminosäuren. In bestimmten Ausführungsformen umfasst der Linker ein Peptid. In bestimmten Ausführungsformen umfasst der Linker eine Aryl- oder Heteroarylgruppe. In bestimmten Ausführungsformen basiert der Linker auf einem Phenylring. Der Linker kann funktionalisierte Einheiten beinhalten, um die Bindung eines Nukleophils (z. B. Thiol, Amino) aus dem Peptid an den Linker zu erleichtern. Jedes Elektrophil kann als Teil des Linkers verwendet werden. Beispielhafte Elektrophile beinhalten unter anderem aktivierte Ester, aktivierte Amide, Michael-Akzeptoren, Alkylhalogenide, Arylhalogenide, Acylhalogenide und Isothiocyanate.
  • In einigen anderen Ausführungsformen umfasst der Linker die Aminosäuresequenz (GGGGS)n (SEQ-ID-NR: 165), (G)n (SEQ-ID-NR: 166), (EAAAK)n (SEQ-ID-NR: 167), (GGS)n (SEQ-ID-NR: 168), (SGGS)n (SEQ-ID-NR: 169), (XP)n (SEQ-ID-NR: 170), oder eine beliebige Kombination davon, wobei n unabhängig eine ganze Zahl zwischen 1 und 30 ist und wobei X eine beliebige Aminosäure ist. In einigen Ausführungsformen umfasst der Linker die Aminosäuresequenz (GGS)N (SEQ-ID-NR: 176), wobei n 1, 3, or 7 ist. In einigen Ausführungsformen umfasst der Linker die Aminosäuresequenz SGSETPGTSESATPES (SEQ-ID-NR: 171). In einigen Ausführungsformen umfasst der Linker die Aminosäuresequenz SGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGS (SEQ-ID-NR: 172). In einigen Ausführungsformen umfasst der Linker die Aminosäuresequenz SGGSGGSGGS (SEQ-ID- NR: 173). In einigen Ausführungsformen umfasst der Linker die Aminosäuresequenz SGGS (SEQ-ID-NR: 174).
  • Insbesondere die folgenden Linker können in verschiedenen Ausführungsformen verwendet werden, um Prime-Editor-Domänen miteinander zu verbinden:
    • GGS (SEQ ID NO: 767);
    • GGSGGS (SEQ ID NO: 768);
    • GGSGGSGGS (SEQ ID NO: 769);
    • SGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGSS (SEQ ID NO: 127);
    • SGSETPGTSESATPES (SEQ ID NO: 171);
    • SGGSSGGSSGSETPGTSESATPESACSYPYDVPDYAGSAAPAAKKKKLDGSGSGGTSSGS (SEQ ID NO: 175).
  • B. Kernlokalisierungssequenz (NLS)
  • In verschiedenen Ausführungsformen können die PE-Fusionsproteine eine oder mehrere Kemlokalisierungssequenzen (NLS) umfassen, die die Translokation eines Proteins in den Zellkern unterstützen. Solche Sequenzen sind in der Technik bekannt und können die folgenden Beispiele beinhalten:
    BESCHREIBUNG SEQUENZ SEQ-ID- NR:
    NLS VON SV40 GROß T-AG PKKKRKV SEQ-ID- NR: 16
    NLS MKRTADGSEFESPKKKRKV SEQ-ID- NR: 124
    NLS MDSLLMNRRKFLYQFKNVRWAKGRRETYLC SEQ-ID- NR: 17
    NLS VON NUKLEOPLASMIN AVKRPAATKKAGQAKKKKLD SEQ-ID- NR: 190
    NLS VON EGL-13 MSRRRKANPTKLSENAKLAKEVEN SEQ-ID-NR: 191
    NLS VON C-MYC PAAKRVKLD SEQ-ID- NR: 192
    NLS DES TUS- PROTEINS KLKIKRPVK SEQ-ID- NR: 193
    NLS DES POLYOMA GROß TAG VSRKRPRP SEQ-ID- NR: 194
    NLS DES HEPATITIS-D- VIRUS-ANTIGENS EGAPPAKRAR SEQ-ID- NR: 195
    NLS DES MURINEN P53 PPQPKKKPLDGE SEQ-ID- NR: 196
    NLS VON PE1 UND PE2 SGGSKRTADGSEFEPKKKRKV SEQ-ID- NR: 133
  • Die oben genannten NLS-Beispiele sind nicht einschränkend. Die PE-Fusionsproteine können jede beliebige bekannte NLS-Sequenz beinhalten, einschließlich derjenigen, die in Cokol et al. „Finding nuclear localization signals“, EMBO Rep. 2000, 1(5): 411-415 und Freitas et al. „Mechanisms and Signals for the Nuclear Import of Proteins“, Current Genomics, 2009, 10(8): 550-7 beschrieben sind, die hierin jeweils durch Bezugnahme aufgenommen sind.
  • In verschiedenen Ausführungsformen umfassen die hierin offenbarten Multi-Flap- Prime-Editoren und Konstrukte, die die Prime-Editoren kodieren, ferner ein oder mehrere, vorzugsweise mindestens zwei Kemlokalisierungssignale. In bestimmten Ausführungsformen umfassen die Multi-Flap-Prime-Editoren mindestens zwei NLS. In Ausführungsformen mit mindestens zwei NLS können die NLS dieselben NLS sein oder sie können unterschiedliche NLS sein. Darüber hinaus können die NLS als Teil eines Fusionsproteins mit den übrigen Abschnitten der Multi-Flap-Prime-Editoren exprimiert werden. In einigen Ausführungsformen sind eine oder mehrere der NLS bipartite NLS („bpNLS“). In bestimmten Ausführungsformen umfassen die offenbaren Fusionsproteine zwei bipartite NLS. In einigen Ausführungsformen umfassen die offenbaren Fusionsproteine mehr als zwei bipartite NLS.
  • Die Stelle der NLS-Fusion kann am N-Terminus, am C-Terminus oder innerhalb einer Sequenz eines Prime-Editors (z. B. eingefügt zwischen der kodierten napDNAbp-Komponente (z. B. Cas9) und einer Polymerase-Domäne (z. B. einer reversen Transkriptase-Domäne) liegen.
  • Bei den NLS kann es sich um jede beliebige in der Technik bekannte NLS-Sequenz handeln. Bei den NLS kann es sich auch um beliebige, in der Zukunft entdeckte NLS für die Kernlokalisierung handeln. Bei den NLS kann es sich auch um jede beliebige natürlich vorkommende NLS oder eine beliebige nicht natürlich vorkommende NLS (z. B. eine NLS mit einer oder mehreren gewünschten Mutationen) handeln.
  • Der Begriff „Kemlokalisierungssequenz“ oder „NLS“ bezieht sich auf eine Aminosäuresequenz, die den Import eines Proteins in den Zellkern fördert, zum Beispiel durch Kerntransport. Kernlokalisierungssequenzen sind in der Fachwelt bekannt und für den Fachmann offensichtlich. Zum Beispiel sind NLS-Sequenzen in der internationalen PCT- Anmeldung PCT/ EP2000/011690 von Plank et al. beschrieben, die am 23. November 2000 eingereicht und am 31. Mai 2001 als WO/2001/038547 veröffentlicht wurde und deren Inhalt hierin durch Bezugnahme aufgenommen ist. In einigen Ausführungsformen umfasst ein NLS die Aminosäuresequenz PKKKRKV (SEQ-ID-NR: 16), MDSLLMNRRKFLYQFKNVRWAKGRRETYLC (SEQ-ID-NR: 17), KRTADGSEFESPKKKRKV (SEQ-ID-NR: 3864), oder KRTADGSEFEPKKKRKV (SEQ- ID-NR: 125). In anderen Ausführungsformen umfasst NLS die Aminosäuresequenzen NLSKRPAAIKKAGQAKKKK (SEQ-ID-NR: 136), PAAKRVKLD (SEQ-ID-NR 192), RQRRNELKRSF (SEQ-ID-NR: 3934), NQSSNFGPMKGGNFGGRSSGPYGGGGQYFAKPRNQGGY (SEQ-ID-NR: 3935).
  • In einem Aspekt der Offenbarung kann ein Multi-Flap-Prime-Editor mit einem oder mehreren Kemlokalisierungssignalen (NLS) modifiziert werden, vorzugsweise mit mindestens zwei NLS. In bestimmten Ausführungsformen sind die Multi-Flap-Prime-Editoren mit zwei oder mehr NLS modifiziert. Die Offenbarung sieht die Verwendung jedes beliebigen Kemlokalisierungssignals vor, das zum Zeitpunkt der Offenbarung in der Technik bekannt ist, oder jedes beliebigen Kernlokalisierungssignals, das nach dem Zeitpunkt der Einreichung der vorliegenden Anmeldung identifiziert oder auf andere Weise im Stand der Technik verfügbar gemacht wird. Ein repräsentatives Kernlokalisierungssignal ist eine Peptidsequenz, die das Protein in den Kern der Zelle lenkt, in der die Sequenz exprimiert wird. Ein Kernlokalisierungssignal ist überwiegend basisch, kann fast überall in der Aminosäuresequenz eines Proteins positioniert werden und umfasst im Allgemeinen eine kurze Sequenz von vier Aminosäuren (Autieri & Agrawal, (1998) J. Biol. Chem. 273: 14731-37, hierin aufgenommen durch Bezugnahme) bis acht Aminosäuren und ist typischerweise reich an Lysin- und Argininresten (Magin et al. (2000) Virology 274: 11-16, hierin aufgenommen durch Bezugnahme). Kemlokalisierungssignale umfassen häufig Prolinreste. Es wurde eine Vielzahl von Kemlokalisierungssignalen identifiziert, die für den Transport biologischer Moleküle aus dem Zytoplasma in den Zellkern verwendet werden. Siehe z. B. Tinland et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:7442-46; Moede et al. (1999) FEBS Lett. 461: 229-34, das durch Bezugnahme aufgenommen ist. Derzeit geht man davon aus, dass an der Translokation Kemporenproteine beteiligt sind.
  • Die meisten NLS lassen sich in drei allgemeine Gruppen einteilen: (i) ein monopartites NLS, wie das NLS des SV40 Large T Antigens (PKKKRKV (SEQ-ID-NR: 16)); (ii) ein bipartites Motiv, das aus zwei Basisdomänen besteht, die durch eine variable Anzahl von Spacer-Aminosäuren getrennt sind, und das durch das Xenopus-Nukleoplasmin-NLS (KRXXXXXXXXXXKKKL (SEQ-ID-NR: 3936)); und (iii) nicht-kanonische Sequenzen wie M9 des hnRNP Al-Proteins, das Influenza-Virus-Nukleoprotein NLS und das Hefe-Gal4- Protein NLS (Dingwall und Laskey 1991).
  • Kemlokalisierungssignale treten an verschiedenen Stellen in den Aminosäuresequenzen von Proteinen auf. NLS wurden am N-Terminus, am C-Terminus und in der zentralen Region von Proteinen identifiziert. Daher stellt die Offenbarung Multi-Flap- Prime-Editoren bereit, die mit einem oder mehreren NLS am C-Terminus, am N-Terminus sowie in einer internen Region des Multi-Flap-Prime-Editors modifiziert werden können. Die Reste einer längeren Sequenz, die nicht als Komponenten-NLS-Reste fungieren, sollten so ausgewählt werden, dass sie nicht mit dem eigentlichen Kernlokalisierungssignal interferieren, zum Beispiel tonisch oder sterisch. Daher kann eine solche Sequenz, auch wenn es keine strengen Grenzen für die Zusammensetzung einer NLS-umfassenden Sequenz gibt, in der Praxis in ihrer Länge und Zusammensetzung funktionell begrenzt sein.
  • Die vorliegende Offenbarung zieht jedes beliebige geeignete Mittel in Betracht, um einen Multi-Flap-Prime-Editor so zu modifizieren, dass er ein oder mehrere NLS beinhaltet. In einem Aspekt können die Multi-Flap-Prime-Editoren so manipuliert werden, dass sie ein Prime-Editor-Protein exprimieren, das an seinem N-Terminus oder seinem C-Terminus (oder an beiden) translational mit einem oder mehreren NLS fusioniert ist, d. h. ein Prime-Editor- NLS-Fusionskonstrukt bildet. In anderen Ausführungsformen kann die für den Prime-Editor kodierende Nukleotidsequenz genetisch modifiziert werden, um einen Reading Frame einzubauen, der einen oder mehrere NLS in einer internen Region des kodierten Prime-Editors kodiert. Darüber hinaus können die NLS verschiedene Aminosäure-Linker oder Spacer- Regionen beinhalten, die zwischen dem Prime-Editor und der N-terminalen, C-terminalen oder intern angebrachten NLS-Aminosäuresequenz kodiert werden, z. B. und in der zentralen Region von Proteinen. Somit stellt die vorliegende Offenbarung auch Nukleotidkonstrukte, Vektoren und Wirtszellen zur Exprimierung von Fusionsproteinen bereit, die einen Prime- Editor und eine oder mehrere NLS umfassen.
  • Die hierin beschriebenen Multi-Flap-Prime-Editoren können auch Kernlokalisierungssignale umfassen, die über einen oder mehrere Linker, z. B. ein polymeres, Aminosäure-, Nukleinsäure-, Polysaccharid-, chemisches oder Nukleinsäure-Linkerelement, mit einem Prime-Editor verknüpft sind. Die Linker im Rahmen der Offenbarung sollen keine Einschränkungen aufweisen und können jede beliebige geeignete Art von Molekül sein (z. B. Polymer, Aminosäure, Polysaccharid, Nukleinsäure, Lipid oder eine beliebige synthetische chemische Linker-Domäne) und mit dem Prime-Editor durch eine geeignete Strategie verbunden werden, die die Bildung einer Bindung (z. B. kovalente Bindung, Wasserstoffbrückenbindung) zwischen dem Prime-Editor und der einen oder mehreren NLS bewirkt.
  • C. Flap-Endonukleasen (z. B. FEN1)
  • In verschiedenen Ausführungsformen können die PE-Fusionsproteine eine oder mehrere Flap-Endonulceasen (z. B. FEN1) umfassen, d. h. ein Enzym, das die Entfernung von 5'-Einzelstrang-DNA-Flaps katalysiert. Dabei handelt es sich um natürlich vorkommende Enzyme, die die Entfernung von 5'-Flaps, die während zellulärer Prozesse, einschließlich der DNA-Replikation, gebildet werden, verarbeiten. Die hierin beschriebenen Verfahren zum Multi-Flap-Prime-Editing können endogen bereitgestellte Flap-Endonukleasen oder solche, die in trans bereitgestellt werden, verwenden, um den 5'-Flap der endogenen DNA zu entfernen, der während des Multi-Flap-Prime-Editing an der Zielstelle gebildet wird. Flap-Endonukleasen sind in der Technik bekannt und sind bei Patel et al. „Flap endonucleases pass 5'-flaps through a flexible arch using a disorder-thread-order mechanism to confer specificity for free 5'-ends“, Nucleic Acids Research, 2012, 40(10): 4507-4519, und Tsutakawa et al. „Human flap endonuclease structures, DNA double-base flipping, and a unified understanding of the FEN1 superfamily“, Cell, 2011, 145(2): 198-211, beschrieben (die hierin jeweils durch Bezugnahme aufgenommen sind). Eine beispielhafte Flap-Endonuklease ist FEN1, die durch die folgende Aminosäuresequenz dargestellt werden kann:
    Beschreibung Sequenz SEQ-ID-Nr:
    FEN1 Wildtyp (wt)
    Figure DE112021002672T5_0169
    		 SEQ ID NO: 198
  • Die Flap-Endonukleasen können auch eine beliebige FEN1-Variante, -Mutante oder ein anderes Ortholog, Homolog oder eine Variante der Flap-Endonuklease beinhalten. Nicht einschränkende Beispiele für FEN1-Varianten sind die folgenden:
    Beschreibung Sequenz SEQ-ID-Nr:
    FEN1 K168R (relativ zu FEN1 wt)
    Figure DE112021002672T5_0170
    		 SEQ ID NO: 199
    FEN1 S187A (relativ zu FEN1 wt)
    Figure DE112021002672T5_0171
    		 SEQ ID NO: 200
    FEN1 K354R (relativ zu FEN1 wt)
    Figure DE112021002672T5_0172
    		 SEQ ID NO: 201
    GEN1
    Figure DE112021002672T5_0173
    		 SEQ ID NO: 202
    ERCC5
    Figure DE112021002672T5_0174
    		 SEQ ID NO: 203
  • In verschiedenen Ausführungsformen können die hierin in Betracht gezogenen Multi- Flap-Prime-Editor-Fusionsproteine jede beliebige Flap-Endonuklease-Variante der oben offenbarten Sequenzen beinhalten, die eine Aminosäuresequenz aufweisen, die zu mindestens etwa 70 % identisch, zu mindestens etwa 80 % identisch, zu mindestens etwa 90 % identisch, zu mindestens etwa 95 % identisch, zu mindestens etwa 96 % identisch, zu mindestens etwa 97 % identisch, zu mindestens etwa 98 % identisch, zu mindestens etwa 99,5 % identisch oder zu mindestens etwa 99,9 % identisch mit einer beliebigen der oben genannten Sequenzen ist.
  • Andere Endonukleasen, die in den vorliegenden Verfahren zur Erleichterung der Entfernung des 5'-Einzelstrang-DNA-Flaps verwendet werden können, beinhalten unter anderem (1) trex 2, (2) exo1-Endonuklease (z. B. Keijzers et al. Biosci Rep. 2015, 35(3): e00206)
  • Trex 2
  • 3'-Drei-Prime-Reparatur-Exonuklease 2 (TREX2) - Mensch
  • Zugriffs-Nr. NM_080701
    Figure DE112021002672T5_0175
  • 3'-Drei-Prime-Reparatur-Exonuklease 2 (TREX2) - Maus
  • Zugriffs-Nr. NM_011907
    Figure DE112021002672T5_0176
  • 3'- Drei-Prime-Reparatur-Exonuklease 2 (TREX2) - Ratte
  • Zugriffs-Nr. NM_001107580
    Figure DE112021002672T5_0177
  • ExoI
  • Die humane Exonuklease 1 (EXO1) ist an vielen verschiedenen DNA- Stoffwechselprozessen beteiligt, die die Reparatur von DNA-Diskrepanzen (MMR), die mikrovermittelte Endverbindung, die homologe Rekombination (HR) und die Replikation beinhalten. Das humane EXO1 gehört zu einer Familie von eukaryotischen Nukleasen, Rad2/XPG, die auch FEN1 und GEN1 beinhaltet. Die Rad2/XPG-Familie ist in der Nuklease- Domäne über alle Spezies hinweg konserviert, vom Phagen bis zum Menschen. Das EXO1- Genprodukt weist sowohl 5'-Exonuklease- als auch 5'-Flap-Aktivität auf. Außerdem enthält EXO1 eine intrinsische 5'-RNase-H-Aktivität. Humanes EXO1 weist eine hohe Affinität für die Verarbeitung von doppelsträngiger DNA (dsDNA), Nicks, Lücken und Pseudo-Y- Strukturen auf und kann Holliday-Strukturen mit Hilfe seiner angeborenen Flap-Aktivität auflösen. Das humane EXO1 ist an der MMR beteiligt und enthält konservierte Bindungsdomänen, die direkt mit MLH1 und MSH2 interagieren. Die nukleolytische Aktivität von EXO1 wird durch PCNA, MutSa (MSH2/MSH6-Komplex), 14-3-3, MRN und 9-1-1- Komplex positiv stimuliert.
  • Exonuklease 1 (EXO1) Zugriffs-Nr. NM_003686 (Homo sapiens Exonuklease 1 (EXO1), Transkriptvariante 3) - Isoform A
    Figure DE112021002672T5_0178
  • Exonuklease 1 (EXO1) Zugriffs-Nr. NM_006027 (Homo sapiens Exonuklease 1 (EXO1), Transkriptvariante 3) - Isoform B
    Figure DE112021002672T5_0179
    Figure DE112021002672T5_0180
  • Exonuklease 1 (EXO1) Zugriffs-Nr. NM_001319224 (Homo sapiens Exonuklease 1 (EXO1), Transkriptvariante 4) - Isoform C
    Figure DE112021002672T5_0181
  • D. Inteine und Split-Inteine
  • Es versteht sich, dass es in einigen Ausführungsformen (z. B. Einschleusung eines Multi-Flap-Prime-Editors in vivo unter Verwendung von AAV-Partikeln) von Vorteil sein kann, ein Polypeptid (z. B. eine Deaminase oder ein napDNAbp) oder ein Fusionsprotein (z. B. einen Multi-Flap-Prime-Editor) in eine N-terminale und eine C-terminale Hälfte zu splitten, sie separat einzuschleusen und dann ihre Kolokalisierung zuzulassen, um das vollständige Protein (bzw. Fusionsprotein) in der Zelle neu zu bilden. Separate Hälften eines Proteins oder eines Fusionsproteins können jeweils ein Split-Intein-Tag umfassen, um die Neubildung des vollständigen Proteins oder Fusionsproteins durch den Mechanismus des Protein-Trans- Splicing zu erleichtern.
  • Das Trans-Splicing von Proteinen, das durch Split-Inteine katalysiert wird, stellt ein rein enzymatisches Verfahren zur Proteinbindung bereit. Bei einem Split-Intein handelt es sich im Wesentlichen um ein zusammenhängendes Intein (z. B. ein Mini-Intein), das in zwei Teile, das N-Intein und das C-Intein, gesplittet wird. Das N-Intein und das C-Intein eines Split-Inteins können sich nicht-kovalent verbinden, um ein aktives Intein zu bilden und die Spleißreaktion im Wesentlichen auf die gleiche Weise zu katalysieren wie ein zusammenhängendes Intein. Split-Inteine wurden in der Natur gefunden und auch in Labors hergestellt. Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „Split-Intein“ auf jedes Intein, bei dem eine oder mehrere Peptidbindungen zwischen den N-terminalen und C-terminalen Aminosäuresequenzen unterbrochen sind, so dass die N-terminalen und C-terminalen Sequenzen zu separaten Molekülen werden, die sich nicht-kovalent reassoziieren oder zu einem Intein rekonstituieren können, das für Trans-Splicing-Reaktionen funktional ist. Jedes katalytisch aktive Intein oder Fragment davon kann verwendet werden, um ein Split-Intein zur Verwendung in den erfindungsgemäßen Verfahren abzuleiten. Zum Beispiel kann in einem Aspekt das Split-Intein von einem eukaryotischen Intein abgeleitet sein. In einem anderen Aspekt kann das Split-Intein von einem bakteriellen Intein abgeleitet sein. In einem anderen Aspekt kann das Split-Intein von einem Archaeen-Intein abgeleitet sein. Vorzugsweise besitzt das so gewonnene Split- Intein nur die Aminosäuresequenzen, die für die Katalyse von Trans-Splicing-Reaktionen wesentlich sind.
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich das „N-terminale Split-Intein (In)“ auf jede Intein- Sequenz, die eine N-terminale Aminosäuresequenz umfasst, die für Trans-Splicing-Reaktionen funktionell ist. Ein In umfasst also auch eine Sequenz, die beim Trans-Splicing ausgespleißt wird. Ein In kann eine Sequenz umfassen, die eine Modifikation des N-terminalen Abschnitts einer natürlich vorkommenden Intein-Sequenz ist. Zum Beispiel kann ein In zusätzliche Aminosäurereste und/oder mutierte Reste umfassen, solange die Aufnahme solcher zusätzlichen und/oder mutierten Reste das In beim Trans-Splicing nicht funktionsunfähig macht. Vorzugsweise verbessert oder steigert die Aufnahme der zusätzlichen und/oder mutierten Reste die Trans-Splicing-Aktivität des In.
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich das „C-terminale Split-Intein (Ic)“ auf jede Intein- Sequenz, die eine C-terminale Aminosäuresequenz umfasst, die für Trans-Splicing-Reaktionen funktionell ist. In einem Aspekt umfasst das Ic 4 bis 7 zusammenhängende Aminosäurereste, von denen mindestens 4 Aminosäuren aus dem letzten β-Strang des Inteins stammen, von dem es abgeleitet wurde. Ein Ic umfasst also auch eine Sequenz, die beim Trans-Splicing ausgespleißt wird. Ein Ic kann eine Sequenz umfassen, die eine Modifikation des C terminalen Abschnitts einer natürlich vorkommenden Intein-Sequenz ist. Zum Beispiel kann ein Ic zusätzliche Aminosäurereste und/oder mutierte Reste umfassen, solange die Aufnahme solcher zusätzlichen und/oder mutierten Reste das In beim Trans-Splicing nicht funktionsunfähig macht. Vorzugsweise verbessert oder steigert die Aufnahme der zusätzlichen und/oder mutierten Reste die Trans-Splicing-Aktivität des Ic.
  • In einigen Ausführungsformen der Erfindung kann ein mit einem Ic oder einem In verknüpftes Peptid eine zusätzliche chemische Einheit umfassen, die unter anderem Fluoreszenzgruppen, Biotin, Polyethylenglykol (PEG), Aminosäureanaloga, unnatürliche Aminosäuren, Phosphatgruppen, Glycosylgruppen, Radioisotopenmarker und pharmazeutische Moleküle beinhaltet. In anderen Ausführungsformen kann ein mit einem Ic verknüpftes Peptid eine oder mehrere chemisch reaktive Gruppen umfassen, die u. a. Keton, Aldehyd, Cys-Reste und Lys-Reste beinhalten. Das N-Intein und das C-Intein eines Split- Inteins können sich nicht-kovalent verbinden, um ein aktives Intein zu bilden und die Spleißreaktion zu katalysieren, wenn ein „Intein-Splicing-Polypeptid (ISP)“ vorhanden ist. Wie hierin verwendet, bezieht sich „Intein-Splicing-Polypeptid (ISP)“ auf den Abschnitt der Aminosäuresequenz eines Split-Inteins, der übrig bleibt, wenn das Ic, das In oder beide aus dem Split-Intein entfernt werden. In bestimmten Ausführungsformen umfasst das In das ISP. In einer anderen Ausführungsform umfasst das Ic das ISP. In einer weiteren Ausführungsform ist das ISP ein separates Peptid, das weder mit In noch mit Ic kovalent verknüpft ist.
  • Split-Inteine können aus zusammenhängenden Inteinen gebildet werden, indem eine oder mehrere Splitstellen in die unstrukturierte Schleife oder die dazwischen liegende Aminosäuresequenz zwischen den -12 konservierten Betasträngen, die in der Struktur der Mini-Inteine zu finden sind, eingebaut werden. Eine gewisse Flexibilität bei der Position der Splitstellen in den Regionen zwischen den Betasträngen ist möglich, vorausgesetzt, dass die Struktur des Inteins, insbesondere die strukturierten Betastränge, durch die Schaffung der Splitstelle nicht so stark gestört wird, dass die Proteinspleißaktivität verloren geht.
  • Beim Trans-Splicing von Proteinen besteht ein Vorläuferprotein aus einem N-Extein- Teil, auf den das N-Intein folgt, ein anderes Vorläuferprotein besteht aus dem C-Intein, auf das ein C-Extein-Teil folgt, und eine Trans-Splicing-Reaktion (die von den N- und C-Inteinen gemeinsam katalysiert wird) schneidet die beiden Intein-Sequenzen heraus und verknüpft die beiden Extein-Sequenzen mit einer Peptidbindung. Protein-Trans-Splicing ist eine enzymatische Reaktion, die mit sehr niedrigen (z. B. mikromolaren) Proteinkonzentrationen arbeiten kann und unter physiologischen Bedingungen durchgeführt werden kann.
  • Beispielhafte-Sequenzen sind wie folgt:
    NAME SEQUENZ DES LIGANDENABHÄNGIGEN INTEINS
    2-4-INTEIN:
    Figure DE112021002672T5_0182
    3-2-INTEIN
    Figure DE112021002672T5_0183
    30R3-1-INTEIN
    Figure DE112021002672T5_0184
    30R3-2-INTEIN
    Figure DE112021002672T5_0185
    30R3-3-INTEIN
    Figure DE112021002672T5_0186
    37R3-1-INTEIN
    Figure DE112021002672T5_0187
    37R3-2-INTEIN
    Figure DE112021002672T5_0188
    37R3-3-INTEIN
    Figure DE112021002672T5_0189
  • Obwohl Inteine am häufigsten als zusammenhängende Domäne vorkommen, gibt es auch einige, die von Natur aus in gesplitteter Form vorliegen. In diesem Fall werden die beiden Fragmente als getrennte Polypeptide exprimiert und müssen sich vor dem Spleißen verbinden, das so genannte Protein-Trans-Splicing.
  • Ein beispielhaftes Split-Intein ist das Ssp-DnaE-Intein, das zwei Untereinheiten umfasst, nämlich DnaE-N und DnaE-C. Die beiden unterschiedlichen Untereinheiten werden von separaten Genen kodiert, nämlich dnaE-n und dnaE-c, die für die Untereinheiten DnaE-N bzw. DnaE-C kodieren. DnaE ist ein natürlich vorkommendes Split-Intein in Synechocytis sp. PCC6803 und ist in der Lage, das Trans-Splicing von zwei separaten Proteinen zu steuern, die jeweils eine Fusion mit DnaE-N oder DnaE-C umfassen.
  • Weitere natürlich vorkommende oder künstlich hergestellte Split-Intein-Sequenzen sind bekannt oder können aus den hierin beschriebenen oder in der Fachwelt verfügbaren Ganz- Intein-Sequenzen hergestellt werden. Beispiele für Split-Intein-Sequenzen sind zu finden in Stevens et al. „A promiscuous split intein with expanded protein engineering applications“, PNAS, 2017, Vol.114: 8538-8543; Iwai et al. „Highly efficient protein trans-splicing by a naturally split DnaE intein from Nostc punctiforme“, FEBS Lett, 580: 1853-1858, die hierin jeweils durch Bezugnahme aufgenommen sind. Weitere Split-Intein-Sequenzen finden sich beispielsweise in WO 2013/045632 , WO 2014/055782 , WO 2016/069774 und EP2877490 , deren Inhalte hierin jeweils durch Bezugnahme aufgenommen sind.
  • Darüber hinaus wurde das Proteinspleißen in trans in vivo und in vitro beschrieben (Shingledecker, et al., Gene 207:187 (1998), Southworth, et al., EMBOJ. 17:918 (1998); Mills, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:3543-3548 (1998); Lew, et al., J. Biol. Chem., 273:15887- 15890 (1998); Wu, et al., Biochim. Biophys. Acta 35732:1 (1998b), Yamazaki, et al., J. Am. Chem. Soc. 120:5591 (1998), Evans, et al., J. Biol. Chem. 275:9091 (2000); Otomo, et al., Biochemistry 38:16040-16044 (1999); Otomo, et al., J. Biolmol. NMR 14:105-114 (1999); Scott, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:13638-13643 (1999)) und stellt die Möglichkeit bereit, ein Protein in zwei inaktiven Fragmenten zu exprimieren, die anschließend durch Ligation ein funktionelles Produkt bilden, z. B. wie in 66 und 67 im Hinblick auf die Bildung eines vollständigen PE-Fusionsproteins aus zwei getrennt exprimierten Hälften gezeigt.
  • E. RNA-Protein-Interaktionsdomäne
  • In verschiedenen Ausführungsformen können zwei separate Proteindomänen (z. B. eine Cas9-Domäne und eine Polymerase-Domäne) miteinander kolokalisiert werden, um einen funktionellen Komplex zu bilden (ähnlich der Funktion eines Fusionsproteins, das die beiden separaten Proteindomänen umfasst), indem ein „RNA-Protein-Rekrutierungssystem“ wie die „MS2-Tagging-Technik“ verwendet wird. Bei solchen Systemen wird in der Regel eine Proteindomäne mit einer „RNA-Protein-Interaktionsdomäne“ (auch „RNA-Protein- Rekrutierungsdomäne“ genannt) und die andere mit einem „RNA-bindenden Protein“ markiert, das die RNA-Protein-Interaktionsdomäne spezifisch erkennt und an sie bindet, z. B. eine spezifische Haarnadelstruktur. Diese Arten von Systemen können zur Kolokalisierung der Domänen eines Multi-Flap-Prime-Editors sowie zur Rekrutierung zusätzlicher Funktionalitäten für einen Multi-Flap-Prime-Editor, wie z. B. eine UGI-Domäne, genutzt werden. In einem Beispiel basiert die MS2-Tagging-Technik auf der natürlichen Wechselwirkung des MS2-Bakteriophagen-Hüllproteins („MCP“ oder „MS2cp“) mit einer im Genom des Phagen vorhandenen Stielschleifen- oder Haarnadelstruktur, d. h. der „MS2- Haarnadel“. Im Falle der MS2-Haarnadel wird sie vom MS2-Bakteriophagen-Hüllprotein (MCP) erkannt und gebunden. So kann in einem Beispielszenario eine Deaminase-MS2-Fusion eine Cas9-MCP-Fusion rekrutieren.
  • Eine Übersicht über andere modulare RNA-Protein-Interaktionsdomänen ist in der Fachliteratur beschrieben, zum Beispiel in Johansson et al. „RNA recognition by the MS2 phage coat protein", Sein Virol, 1997, Vol. 8(3): 176-185; Delebecque et al. „Organization of intracellular reactions with rationally designed RNA assemblies," Science, 2011, Vol. 333: 470-474; Mali et al. „Cas9 transcriptional activators for target specificity screening and paired nickases for cooperative genome engineering", Nat. Biotechnol., 2013, Vol.31: 833-838; und Zalatan et al. „Engineering complex synthetic transcriptional programs with CRISPR RNA scaffolds", Cell, 2015, Vol. 160: 339-350, die hierin jeweils in ihrer Gesamtheit durch Bezugnahme aufgenommen sind. Andere Systeme beinhalten die PP7-Haarnadel, die speziell das PCP-Protein rekrutiert, und die „Com“-Haamadel, die speziell das Com-Protein rekrutiert. Siehe Zalatan et al.
  • Die Nukleotidsequenz der MS2-Haarnadel (oder gleichwertig als „MS2-Aptamer“ bezeichnet) ist: GCCAACATGAGGATCACCCATGTCTGCAGGGCC (SEQ-ID-NR: 763).
  • Die Aminosäuresequenz des MCP oder MS2cp ist:
    Figure DE112021002672T5_0190
  • F. UGI-Domäne
  • In anderen Ausführungsformen können die hierin beschriebenen Multi-Flap-Prime- Editoren eine oder mehrere Uracil-Glycosylase-Inhibitor-Domänen umfassen. Der Begriff „Uracil-Glykosylase-Inhibitor (UGI)“ oder „UGI-Domäne“, wie hierin verwendet, bezieht sich auf ein Protein, das in der Lage ist, ein Uracil-DNA-Glykosylase-Basenausschneide- Reparaturenzym zu hemmen. In einigen Ausführungsformen umfasst eine UGI-Domäne ein Wildtyp-UGI oder ein UGI, wie dargelegt in SEQ-ID-NR: 3873. In einigen Ausführungsformen beinhalten die hierin bereitgestellten UGI-Proteine Fragmente von UGI und Proteine, die zu einem UGI oder einem UGI-Fragment homolog sind. Zum Beispiel umfasst in einigen Beispielen eine UGI-Domäne ein Fragment der Aminosäuresequenz, die in SEQ-ID-NR: 3873 dargelegt ist. In einigen Ausführungsformen umfasst ein UGI-Fragment eine Aminosäuresequenz, die mindestens 60 %, mindestens 65 %, mindestens 70 %, mindestens 75 %, mindestens 80 %, mindestens 85 %, mindestens 90 %, mindestens 95 %, mindestens 96 %, mindestens 97 %, mindestens 98 %, mindestens 99 % oder mindestens 99,5 % der Aminosäuresequenz umfasst, wie dargelegt in SEQ-ID-NR: 3873. In einigen Ausführungsformen umfasst ein UGI eine Aminosäuresequenz, die homolog zu der in SEQ- ID-NR: 3873 dargelegten Aminosäuresequenz ist, oder eine Aminosäuresequenz, die zu einem Fragment der in SEQ-ID-NR: 3873 dargelegten Aminosäuresequenz homolog ist. In einigen Ausführungsformen werden Proteine, die UGI oder Fragmente von UGI oder Homologe von UGI oder UGI-Fragmenten umfassen, als „UGI-Varianten“ bezeichnet. Eine UGI-Variante weist eine Homologie zu UGI oder einem Fragment davon auf. Zum Beispiel ist eine UGI- Variante zu mindestens 70 % identisch, zu mindestens 75 % identisch, zu mindestens 80 % identisch, zu mindestens 85 % identisch, zu mindestens 90 % identisch, zu mindestens 95 % identisch, zu mindestens 96 % identisch, zu mindestens 97 % identisch, zu mindestens 98 % identisch, zu mindestens 99 % identisch, zu mindestens 99,5 % identisch oder zu mindestens 99,9 % identisch mit einem Wildtyp UGI oder einem UGI, wie dargelegt in SEQ-ID-NR: 3873. In einigen Ausführungsformen umfasst die UGI-Variante ein Fragment von UGI, so dass das Fragment zu mindestens 70 % identisch, zu mindestens 80 % identisch, zu mindestens 90 % identisch, zu mindestens 95 % identisch, zu mindestens 96 % identisch, zu mindestens 97 % identisch, zu mindestens 98 % identisch, zu mindestens 99 % identisch, zu mindestens 99,5 % identisch oder zu mindestens 99,9 % identisch mit dem entsprechenden Fragment von Wildtyp UGI oder einem UGI ist, wie dargelegt in SEQ ID-NR: 3873. In einigen Ausführungsformen umfasst der UGI die folgende Aminosäuresequenz:
    • Uracil-DNA-Glycosylase-Inhibitor:
      • >sp|P14739|UNGI_BPPB2
        Figure DE112021002672T5_0191
  • Die hierin beschriebenen Multi-Flap-Prime-Editoren können mehr als eine UGI- Domäne umfassen, die durch einen oder mehrere Linker, wie hierin beschrieben, getrennt sein können.
  • G. Zusätzliche PE-Elemente
  • In bestimmten Ausführungsformen können die hierin beschriebenen Multi-Flap-Prime- Editoren einen Inhibitor der Basenreparatur umfassen. Der Begriff „Inhibitor der Basenreparatur“ oder „IBR“ bezieht sich auf ein Protein, das in der Lage ist, die Aktivität eines Nukleinsäure-Reparaturenzyms, zum Beispiel eines Basen-Exzisions-Reparaturenzyms, zu hemmen. In einigen Ausführungsformen ist der IBR ein Inhibitor der OGG-Basen- Exzisionsreparatur. In einigen Ausführungsformen ist der IBR ein Inhibitor der Basen- Exzisionsreparatur („iBER“). Beispielhafte Inhibitoren der Basen-Exzisionsreparatur beinhalten Inhibitoren von APE1, Endo III, Endo IV, Endo V, Endo VIII, Fpg, hOGG1, hNEIL1, T7 EndoI, T4PDG, UDG, hSMUG1, und hAAG. In einigen Ausführungsformen ist der IBR ein Inhibitor von Endo V oder hAAG. In einigen Ausführungsformen ist der IBR ein iBER, bei dem es sich um eine katalytisch inaktive Glykosylase oder katalytisch inaktive Dioxygenase oder um einen niedermolekularen oder peptidischen Inhibitor einer Oxidase oder Varianten davon handeln kann. In einigen Ausführungsformen ist der IBR ein iBER, der ein TDG-Inhibitor, MBD4-Inhibitor oder ein Inhibitor eines AlkBH-Enzyms sein kann. In einigen Ausführungsformen ist der IBR ein iBER, der ein katalytisch inaktives TDG oder ein katalytisch inaktives MBD4 umfasst. Ein beispielhaftes katalytisch inaktives TDG ist eine N140A-Mutante von SEQ-ID-NR: 3872 (humanes TDG).
  • Im Folgenden werden einige beispielhafte Glykosylasen bereitgestellt. Die katalytisch inaktivierten Varianten dieser Glykosylase-Domänen sind iBERs, die mit der napDNAbp- oder Polymerase-Domäne der in dieser Offenbarung bereitgestellten Multi-Flap-Prime-Editoren fusioniert werden können.
  • OGG (human)
    Figure DE112021002672T5_0192
    Figure DE112021002672T5_0193
  • MBD4 (human)
    Figure DE112021002672T5_0194
  • TDG (human)
    Figure DE112021002672T5_0195
  • In einigen Ausführungsformen können die hierin beschriebenen Fusionsproteine eine oder mehrere heterologe Proteindomänen umfassen (z. B. etwa oder mehr als etwa 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 oder mehr Domänen zusätzlich zu den Prime-Editor-Komponenten). Ein Fusionsprotein kann eine beliebige zusätzliche Proteinsequenz und gegebenenfalls eine Linker-Sequenz zwischen zwei beliebigen Domänen umfassen. Andere beispielhafte Merkmale, die vorhanden sein können, sind Lokalisierungssequenzen, wie z.B. zytoplasmatische Lokalisierungssequenzen, Exportsequenzen, wie z. B. Kernexportsequenzen, oder andere Lokalisierungssequenzen, sowie Sequenz-Tags, die für die Solubilisierung, Reinigung oder Erkennung der Fusionsproteine nützlich sind.
  • Beispiele von Proteindomänen, die mit einem Multi-Flap-Prime-Editor oder einer Komponente davon (z. B. der napDNAbp-Domäne, der Polymerase-Domäne oder der NLS- Domäne) fusioniert werden können, beinhalten ohne Einschränkung Epitop-Markierungen und Reportergen-Sequenzen. Nicht einschränkende Beispiele für Epitop-Tags beinhalten Histidin (His)-Tags, V5-Tags, FLAG-Tags, Influenza-Hämagglutinin (HA)-Tags, Myc-Tags, VSV-G- Tags und Thioredoxin (Trx)-Tags. Beispiele für Reportergene beinhalten unter anderem Glutathion-5-Transferase (GST), Meerrettichperoxidase (HRP), Chloramphenicol- Acetyltransferase (CAT), Beta-Galaktosidase, Beta-Glucuronidase, Luciferase, grün fluoreszierendes Protein (GFP), HcRed, DsRed, cyan fluoreszierendes Protein (CFP), gelb fluoreszierendes Protein (YFP) und autofluoreszierende Proteine, die blau fluoreszierendes Protein (BFP) beinhalten. Ein Multi-Flap-Prime-Editor kann mit einer Gensequenz fusioniert werden, die ein Protein oder ein Fragment eines Proteins kodiert, das DNA-Moleküle bindet oder andere zelluläre Moleküle bindet, einschließlich unter anderem Maltose-Bindungsprotein (MBP), S-Tag, Lex-A-DNA-Bindungsdomänen (DBD)-Fusionen, GAL4-DNA- Bindungsdomänen-Fusionen und Herpes-Simplex-Virus (HSV)-BP16-Protein-Fusionen. Zusätzliche Domänen, die Teil eines Prime-Editors sein können, sind in der US- Patentveröffentlichung Nr. 2011/0059502 beschrieben, die am 10. März 2011 veröffentlicht wurde und durch Bezugnahme hierin vollständig aufgenommen ist.
  • In einem Aspekt der Offenbarung kann ein Reportergen beinhaltend unter anderem Glutathion-5-Transferase (GST), Meerrettichperoxidase (HRP), Chloramphenicol- Acetyltransferase (CAT), beta-Galactosidase, beta-Glucuronidase, Luciferase, grün fluoreszierendes Protein (GFP), HcRed, DsRed, cyan fluoreszierendes Protein (CFP), gelb fluoreszierendes Protein (YFP) und autofluoreszierende Proteine, die blau fluoreszierendes Protein (BFP) beinhalten, in eine Zelle eingebracht werden, um ein Genprodukt zu kodieren, das als Marker dient, um die Veränderung oder Modifikation der Exprimierung des Genprodukts zu messen. In bestimmten Ausführungsformen der Offenbarung ist das Genprodukt Luciferase. In einer weiteren Ausführungsform der Offenbarung ist die Exprimierung des Genprodukts vermindert.
  • Geeignete, hierin bereitgestellte Protein-Tags beinhalten unter anderem Biotin- Carboxylase-Trägerprotein (BCCP)-Tags, Myc-Tags, Calmodulin-Tags, FLAG-Tags, Hämagglutinin (HA)-Tags, Polyhistidin-Tags, auch Histidin-Tags oder His-Tags genannt, Maltose-Bindungsprotein (MBP)-Tags, Nus-Tags, Glutathion-S-Transferase (GST)-Tags, grün fluoreszierendes Protein (GFP)-Tags, Thioredoxin-Tags, S-Tags, Softags (z. g., Softag 1, Softag 3), Strep-Tags, Biotin-Ligase-Tags, FlAsH-Tags, V5-Tags und SBP-Tags. Weitere geeignete Sequenzen sind für den Fachmann offensichtlich. In einigen Ausführungsformen umfasst das Fusionsprotein einen oder mehrere His-Tags.
  • In einigen Ausführungsformen der vorliegenden Offenbarung kann die Aktivität des Multi-Flap-Prime-Editing-Systems zeitlich reguliert werden, indem die Verweilzeit, die Menge und/oder die Aktivität der exprimierten Komponenten des PE-Systems angepasst werden. Zum Beispiel kann, wie hierin beschrieben, das PE mit einer Proteindomäne fusioniert werden, die in der Lage ist, die intrazelluläre Halbwertszeit des PE zu modifizieren. In bestimmten Ausführungsformen, die zwei oder mehr Vektoren umfassen (z. B. ein Vektorsystem, in dem die hierin beschriebenen Komponenten auf zwei oder mehr separaten Vektoren kodiert sind), kann die Aktivität des PE-Systems zeitlich reguliert werden, indem der Zeitpunkt, zu dem die Vektoren geliefert werden, gesteuert wird. Zum Beispiel kann in einigen Ausführungsformen ein Vektor, der das Nuklease-System kodiert, das PE vor dem Vektor liefern, der das Templat kodiert. In anderen Ausführungsformen kann der Vektor, der die PEgRNA kodiert, den Guide vor dem Vektor liefern, der das PE-System kodiert. In einigen Ausführungsformen werden die Vektoren, die das PE-System und die PEgRNA kodieren, gleichzeitig bereitgestellt. In bestimmten Ausführungsformen liefern die gleichzeitig eingeschleusten Vektoren vorübergehend z. B. die PE-, PEgRNA- und/oder Zweitstrang-Leit- RNA-Komponenten. In weiteren Ausführungsformen kann die von der Codierung auf den Vektoren transkribierte RNA (wie z. B. das Nuklease-Transkript) ferner mindestens ein Element umfassen, das in der Lage ist, die intrazelluläre Halbwertszeit der RNA zu modifizieren und/oder die Translationskontrolle zu modulieren. In einigen Ausführungsformen kann die Halbwertszeit der RNA erhöht werden. In einigen Ausführungsformen kann die Halbwertszeit der RNA verringert werden. In einigen Ausführungsformen kann das Element in der Lage sein, die Stabilität der RNA zu erhöhen. In einigen Ausführungsformen kann das Element in der Lage sein, die Stabilität der RNA zu verringern In einigen Ausführungsformen kann sich das Element innerhalb der 3'-UTR der RNA befinden. In einigen Ausführungsformen kann das Element ein Polyadenylierungssignal (PA) beinhalten. In einigen Ausführungsformen kann das Element eine Kappe beinhalten, z. B. ein vorgelagertes mRNA- oder PEgRNA-Ende. In einigen Ausführungsformen kann die RNA kein PA umfassen, so dass sie nach der Transkription einem schnelleren FIGau in der Zelle unterliegt. In einigen Ausführungsformen kann das Element mindestens ein AU-reiches Element (ARE) beinhalten. Die AREs können von ARE-Bindungsproteinen (ARE-BPs) in einer Weise gebunden werden, die vom Gewebetyp, Zelltyp, Zeitpunkt, der zellulären Lokalisierung und der Umgebung abhängt. In einigen Ausführungsformen kann das destabilisierende Element den RNA-Zerfall fördern, die RNA-Stabilität beeinflussen oder die Translation aktivieren. In einigen Ausführungsformen kann das ARE eine Länge von 50 bis 150 Nukleotiden umfassen. In einigen Ausführungsformen kann das ARE mindestens eine Kopie der Sequenz AUUUA umfassen. In einigen Ausführungsformen kann mindestens ein ARE an die 3'-UTR der RNA angefügt werden. In einigen Ausführungsformen kann das Element ein Woodchuck-Hepatitis-sVirus (WHP) sein.
  • Posttranskriptionelles regulatorisches Element (WPRE), das eine Tertiärstruktur zur Verstärkung der Exprimierung des Transkripts erzeugt. In weiteren Ausführungsformen ist das Element eine modifizierte und/oder trunkierte WPRE-Sequenz, die in der Lage ist, die Exprimierung des Transkripts zu verstärken, wie zum Beispiel in Zufferey et al., J Virol, 73(4): 2886-92 (1999) und Flajolet et al., J Virol, 72(7): 6175-80 (1998). In einigen Ausführungsformen kann das WPRE oder ein gleichwertiges Element der 3'-UTR der RNA hinzugefügt werden. In einigen Ausführungsformen kann das Element aus anderen RNA- Sequenzmotiven ausgewählt werden, die entweder in schnell oder langsam abklingenden Transkripten angereichert sind.
  • In einigen Ausführungsformen kann der Vektor, der den PE oder die PEgRNA kodiert, durch Spaltung einer auf dem Vektor vorhandenen Zielsequenz durch das PE-System selbst zerstört werden. Die Spaltung kann die weitere Transkription eines PE oder einer PEgRNA aus dem Vektor verhindern. Obwohl die Transkription auf dem linearisierten Vektor für eine gewisse Zeit erfolgen kann, werden die exprimierten Transkripte oder Proteine, die dem intrazellulären FIGau unterliegen, weniger Zeit haben, um Off-Target-Effekte zu erzeugen, wenn die Exprimierung der kodierenden Vektoren nicht fortgesetzt wird.
  • [61] PEgRNAs
  • Für das hierin beschriebene Multi-Flap-Prime-Editing-System können alle beliebigen geeigneten PEgRNAs verwendet werden. Der Mechanismus der Target-primed Reverse Transcription (TPRT) kann für die Durchführung von präzisem und vielseitigem CRISPR/Casbasiertem Genom-Editing genutzt oder angepasst werden, indem eine speziell konfigurierte Leit-RNA verwendet wird, die eine Templat-Sequenz für die Reverse Transkription (RT) umfasst, die für die gewünschte Nukleotidänderung kodiert. Die Anmeldung bezeichnet diese speziell konfigurierte Leit-RNA als „verlängerte Leit-RNA“ oder „PEgRNA“, da die RT- Templat-Sequenz als Verlängerung eines Standard- oder herkömmlichen Leit-RNA-Moleküls bereitgestellt werden kann. Die Anmeldung sieht jede beliebige geeignete Konfiguration oder Anordnung für die verlängerten Leit-RNAs zur Verwendung im Dual-Flap- und Quadruple- Flap-Prime-Editing vor.
  • Die allgemeinen Ausgestaltungen von pegRNAs, die für Dual-Flap- und Multi-Flap- Prime-Editing verwendet werden, werden in 92 gezeigt. pegRNAs, die für das Dual-Flap- und Multi-Flap-Prime-Editing verwendet werden, haben eine ähnliche Ausgestaltung wie diejenigen, die für das klassische Prime-Editing verwendet werden, jedoch ist es nicht erforderlich, dass die RT-Templat-Region eine Homologie zum Ziel-Locus aufweist. Stattdessen können die beiden pegRNAs in verschiedenen Ausführungsformen RT-Template enthalten, die die Synthese von 3'-Flaps kodieren, deren 3'-Enden zueinander komplementäre Sequenzen sind. Diese Komplementarität zwischen den 3'-Flaps fördert deren Hybridisierung und den Austausch der endogenen DNA-Sequenz durch die beabsichtigte neue DNA-Sequenz. Dies setzt voraus, dass die 5'-Regionen der RT-Template in den beiden pegRNAs zueinander umgekehrt komplementäre Sequenzen sind, und dieser Grad der Komplementarität kann variieren (92).
  • PEgRNA-Architektur
  • 3A zeigt eine Ausführungsform einer verlängerten Leit-RNA, die in dem hier offenbarten Multi-Flap-Prime-Editing-System verwendet werden kann, wobei eine herkömmliche Leit-RNA (der grüne Abschnitt) eine ~20 nt Protospacer-Sequenz und eine gRNA-Kernregion beinhaltet, die sich mit dem napDNAbp verbindet. In dieser Ausführungsform beinhaltet die Leit-RNA ein verlängertes RNA-Segment am 5'-Ende, d. h. eine 5'- Verlängerung. In dieser Ausführungsform beinhaltet die 5'-Verlängerung eine Templat-Sequenz für die reverse Transkription, eine Bindungsstelle für den Primer für die reverse Transkription und eine optionale 5-20 Nukleotid-Linkersequenz. Wie in den 1A- 1B gezeigt, hybrisiert die RT-Primer-Bindungsstelle an das freie 3'-Ende, das nach der Bildung eines Nicks im Nicht-Zielstrang der R-Schleife gebildet wird, wodurch die reverse Transkriptase für die DNA-Polymerisation in 5'-3'-Richtung geprimt wird.
  • 3B zeigt eine weitere Ausführungsform einer verlängerten Leit-RNA, die in dem hier offenbarten-Prime-Editing-System verwendet werden kann, wobei eine herkömmliche Leit-RNA (der grüne Abschnitt) eine -20 nt Protospacer-Sequenz und einen gRNA-Kern beinhaltet, der sich mit dem napDNAbp verbindet. In dieser Ausführungsform beinhaltet die Leit-RNA ein verlängertes RNA-Segment am 3'-Ende, d. h. eine 3'- Verlängerung. In dieser Ausführungsform beinhaltet die 3'-Verlängerung eine Templat-Sequenz für die reverse Transkription und eine Primer-Bindungsstelle für die reverse Transkription. Wie in den 1C-1D gezeigt, hybrisiert die RT-Primer-Bindungsstelle an das freie 3'-Ende, das nach der Bildung eines Nicks im Nicht-Zielstrang der R-Schleife gebildet wird, wodurch die reverse Transkriptase für die DNA-Polymerisation in 5'-3'-Richtung geprimt wird.
  • 3C zeigt eine weitere Ausführungsform einer verlängerten Leit-RNA, die in dem hier offenbarten-Prime-Editing-System verwendet werden kann, wobei eine herkömmliche Leit-RNA (der grüne Abschnitt) eine -20 nt Protospacer-Sequenz und einen gRNA-Kern beinhaltet, der sich mit dem napDNAbp verbindet. In dieser Ausführungsform beinhaltet die Leit-RNA ein verlängertes RNA-Segment an einer intermolekularen Position innerhalb des gRNA-Kerns, d. h. eine intramolekulare Verlängerung. In dieser Ausführungsform beinhaltet die intramolekulare Verlängerung eine Templat-Sequenz für die reverse Transkription und eine Primer-Bindungsstelle für die reverse Transkription. Die RT-Primer-Bindungsstelle hybrisiert an das freie 3'-Ende, das nach der Bildung eines Nicks im Nicht-Zielstrang der R-Schleife gebildet wird, wodurch die reverse Transkriptase für die DNA-Polymerisation in 5'-3'- Richtung geprimt wird.
  • In einer Ausführungsform befindet sich die Position der intermolekularen RNA- Verlängerung nicht in der Protospacer-Sequenz der Leit-RNA. In einer anderen Ausführungsform befindet sich die Position der intermolekularen RNA- Verlängerung im gRNA-Kern. In einer weiteren Ausführungsform befindet sich die Position der intermolekularen RNA-Verlängerung an einer beliebigen Stelle des Leit-RNA-Moleküls, außer innerhalb der Protospacer-Sequenz, oder an einer Stelle, die die Protospacer-Sequenz unterbricht.
  • In einer Ausführungsform ist die intermolekulare RNA-Verlängerung stromabwärts vom 3'-Ende der Protospacer-Sequenz eingefügt. In einer anderen Ausführungsform ist die intermolekulare RNA-Verlängerung mindestens 1 Nukleotid, mindestens 2 Nukleotide, mindestens 3 Nukleotide, mindestens 4 Nukleotide, mindestens 5 Nukleotide, mindestens 6 Nukleotide, mindestens 7 Nukleotide, mindestens 8 Nukleotide, mindestens 9 Nukleotide, mindestens 10 Nukleotide, mindestens 11 Nukleotide, mindestens 12 Nukleotide, mindestens 13 Nukleotide, mindestens 14 Nukleotide, mindestens 15 Nukleotide, mindestens 16 Nukleotide, mindestens 17 Nukleotide, mindestens 18 Nukleotide, mindestens 19 Nukleotide, mindestens 20 Nukleotide, mindestens 21 Nukleotide, mindestens 22 Nukleotide, mindestens 23 Nukleotide, mindestens 24 Nukleotide, mindestens 25 Nukleotide stromabwärts vom 3'- Ende der Protospacer-Sequenz eingefügt.
  • In anderen Ausführungsformen wird die intermolekulare RNA-Verlängerung in die gRNA eingefügt, was sich auf den Abschnitt der Leit-RNA bezieht, der der tracrRNA entspricht oder diese umfasst, die an das Cas9-Protein oder ein Äquivalent davon bindet und/oder mit diesem interagiert (d. h. ein anderes napDNAbp). Vorzugsweise wird durch das Einfügen der intermolekularen RNA-Verlängerung die Wechselwirkung zwischen dem tracrRNA-Abschnitt und dem napDNAbp nicht oder nur minimal gestört.
  • Die Länge der RNA-Verlängerung (die mindestens das RT-Templat und die Primer- Bindungsstelle beinhaltet, z. B. siehe 92) kann eine beliebige nützliche Länge haben. In verschiedenen Ausführungsformen beträgt die RNA-Verlängerung mindestens 5 Nukleotide, mindestens 6 Nukleotide, mindestens 7 Nukleotide, mindestens 8 Nukleotide, mindestens 9 Nukleotide, mindestens 10 Nukleotide, mindestens 11 Nukleotide, mindestens 12 Nukleotide, mindestens 13 Nukleotide, mindestens 14 Nukleotide, mindestens 15 Nukleotide, mindestens 16 Nukleotide, mindestens 17 Nukleotide, mindestens 18 Nukleotide, mindestens 19 Nukleotide, mindestens 20 Nukleotide, mindestens 21 Nukleotide, mindestens 22 Nukleotide, mindestens 23 Nukleotide, mindestens 24 Nukleotide, mindestens 25 Nukleotide, mindestens 30 Nukleotide, mindestens 40 Nukleotide, mindestens 50 Nukleotide, mindestens 60 Nukleotide, mindestens 70 Nukleotide, mindestens 80 Nukleotide, mindestens 90 Nukleotide, mindestens 100 Nukleotide, mindestens 200 Nukleotide, mindestens 300 Nukleotide, mindestens 400 Nukleotide oder mindestens 500 Nukleotide in Länge.
  • Die Sequenz des RT-Templats kann auch jede beliebige andere geeignete Länge haben. Zum Beispiel kann die RT-Templat-Sequenz mindestens 3 Nukleotide, mindestens 4 Nukleotide, mindestens 5 Nukleotide, mindestens 6 Nukleotide, mindestens 7 Nukleotide, mindestens 8 Nukleotide, mindestens 9 Nukleotide, mindestens 10 Nukleotide, mindestens 11 Nukleotide, mindestens 12 Nukleotide, mindestens 13 Nukleotide, mindestens 14 Nukleotide, mindestens 15 Nukleotide, mindestens 16 Nukleotide, mindestens 17 Nukleotide, mindestens 18 Nukleotide, mindestens 19 Nukleotide, mindestens 20 Nukleotide, mindestens 30 Nukleotide, mindestens 40 Nukleotide, mindestens 50 Nukleotide, mindestens 60 Nukleotide, mindestens 70 Nukleotide, mindestens 80 Nukleotide, mindestens 90 Nukleotide, mindestens 100 Nukleotide, mindestens 200 Nukleotide, mindestens 300 Nukleotide, mindestens 400 Nukleotide oder mindestens 500 Nukleotide in Länge betragen.
  • In noch anderen Ausführungsformen, wobei die Sequenz der Bindungsstelle des Primers für die reverse Transkription mindestens 3 Nukleotide, mindestens 4 Nukleotide, mindestens 5 Nukleotide, mindestens 6 Nukleotide, mindestens 7 Nukleotide, mindestens 8 Nukleotide, mindestens 9 Nukleotide, mindestens 10 Nukleotide, mindestens 11 Nukleotide, mindestens 12 Nukleotide, mindestens 13 Nukleotide, mindestens 14 Nukleotide, mindestens 15 Nukleotide, mindestens 16 Nukleotide, mindestens 17 Nukleotide, mindestens 18 Nukleotide, mindestens 19 Nukleotide, mindestens 20 Nukleotide, mindestens 30 Nukleotide, mindestens 40 Nukleotide, mindestens 50 Nukleotide, mindestens 60 Nukleotide, mindestens 70 Nukleotide, mindestens 80 Nukleotide, mindestens 90 Nukleotide, mindestens 100 Nukleotide, mindestens 200 Nukleotide, mindestens 300 Nukleotide, mindestens 400 Nukleotide oder mindestens 500 Nukleotide in Länge beträgt.
  • In anderen Ausführungsformen beträgt die optionale Linker- oder Spacer-Sequenz mindestens 3 Nukleotide, mindestens 4 Nukleotide, mindestens 5 Nukleotide, mindestens 6 Nukleotide, mindestens 7 Nukleotide, mindestens 8 Nukleotide, mindestens 9 Nukleotide, mindestens 10 Nukleotide, mindestens 11 Nukleotide, mindestens 12 Nukleotide, mindestens 13 Nukleotide, mindestens 14 Nukleotide, mindestens 15 Nukleotide, mindestens 16 Nukleotide, mindestens 17 Nukleotide, mindestens 18 Nukleotide, mindestens 19 Nukleotide, mindestens 20 Nukleotide, mindestens 30 Nukleotide, mindestens 40 Nukleotide, mindestens 50 Nukleotide, mindestens 60 Nukleotide, mindestens 70 Nukleotide, mindestens 80 Nukleotide, mindestens 90 Nukleotide, mindestens 100 Nukleotide, mindestens 200 Nukleotide, mindestens 300 Nukleotide, mindestens 400 Nukleotide oder mindestens 500 Nukleotide in Länge.
  • In bestimmten Ausführungsformen kodiert die RT-Templatmolekül-Sequenz ein einzelsträngiges DNA-Molekül, das zum Nicht-Zielstrang homolog (und damit komplementär zur entsprechenden Stelle des Ziel-Strangs) ist, aber eine oder mehrere Nukleotidänderungen beinhaltet. Die mindestens eine Nukleotidveränderung kann eine oder mehrere einbasige Nukleotidveränderungen, eine oder mehrere Deletionen und eine oder mehrere Insertionen beinhalten.
  • Wie in 1G dargestellt, ist das synthetisierte einzelsträngige DNA-Produkt der RT- Templat-Sequenz homolog zum Nicht-Ziel-Strang und enthält eine oder mehrere Nukleotidveränderungen. Das einzelsträngige DNA-Produkt der RT-Templat-Sequenz hybridisiert im Gleichgewicht mit der komplementären Sequenz des Zielstrangs und verdrängt dabei die homologe endogene Sequenz des Zielstrangs. Der verdrängte endogene Strang kann in einigen Ausführungsformen als eine 5'-endogene DNA-Flap-Spezies bezeichnet werden (siehe z. B. 1E). Diese 5'-endogene DNA-Flap-Spezies kann durch eine 5'-Flap- Endonuklease (z. B. FEN1) entfernt werden, und das einzelsträngige DNA-Produkt, das nun mit dem endogenen Zielstrang hybridisiert, kann ligiert werden, wodurch eine Diskrepanz zwischen der endogenen Sequenz und dem neu synthetisierten Strang entsteht. Die Diskrepanz kann durch zelleigene DNA-Reparatur- und/oder Replikationsprozesse gelöst werden.
  • In verschiedenen Ausführungsformen entspricht die Nukleotidsequenz der RT- Templat-Sequenz der Nukleotidsequenz des Nicht-Zielstrangs, der als 5'-Flap-Spezies verdrängt wird und sich mit der zu editierenden Stelle überlappt.
  • In verschiedenen Ausführungsformen der verlängerten Leit-RNAs kann die Templat- Sequenz für die reverse Transkription einen einzelsträngigen DNA-Flap kodieren, der komplementär zu einer endogenen DNA-Sequenz neben einer Nickstelle ist, wobei der einzelsträngige DNA-Flap eine gewünschte Nukleotidänderung umfasst. Der einzelsträngige DNA-Flap kann eine endogene einzelsträngige DNA an der Nickstelle verdrängen. Die verdrängte endogene Einzelstrang-DNA an der Nickstelle kann ein 5'-Ende aufweisen und einen endogenen Flap bilden, der von der Zelle abgeschnitten werden kann. In verschiedenen Ausführungsformen kann die Exzision des endogenen 5'-Endlappens dazu beitragen, die Produktbildung voranzutreiben, da die Entfernung des endogenen 5'-Endlappens die Hybridisierung des 3'-Einzelstrang-DNA-Flaps mit dem entsprechenden komplementären DNA-Strang und den Einbau oder die Assimilation der gewünschten Nukleotidänderung, die von dem 3'-Einzelstrang-DNA-Flap getragen wird, in die Ziel-DNA fördert.
  • In verschiedenen Ausführungsformen der verlängerten Leit-RNAs führt die zelluläre Reparatur des einzelsträngigen DNA-Flaps zum Einbau der gewünschten Nukleotidveränderung, wodurch ein gewünschtes Produkt entsteht.
  • In noch anderen Ausführungsformen wird die gewünschte Nukleotidänderung in ein Editing-Fenster eingebaut, das zwischen etwa -5 bis +5 der Nickstelle, oder zwischen etwa -10 bis +10 der Nickstelle, oder zwischen etwa -20 bis +20 der Nickstelle, oder zwischen etwa -30 bis +30 der Nickstelle, oder zwischen etwa -40 bis + 40 der Nickstelle, oder zwischen etwa - 50 bis +50 der Nickstelle, oder zwischen etwa -60 bis +60 der Nickstelle, oder zwischen etwa -70 bis +70 der Nickstelle, oder zwischen etwa -80 bis +80 der Nickstelle, oder zwischen etwa -90 bis +90 der Nickstelle, oder zwischen etwa -100 bis +100 der Nickstelle, oder zwischen etwa -200 bis +200 der Nickstelle liegt. In anderen Ausführungsformen wird die gewünschte Nukleotidänderung in ein Editing-Fenster eingebaut, das zwischen etwa +1 bis +2 von der Nickstelle liegt, oder etwa +1 bis +3,+1bis +4,+1 bis +5,+1bis +6,+1bis +7,+1 bis +8,+1 bis +9,+1 bis +10, +1 bis +11,+1 bis +12,+1 bis +13,+1 bis +14,+1 bis +15,+1 bis +16,+1 bis +17,+1 bis +18,+1 bis +19,+1 bis +20,+1 bis +21,+1 bis +22,+1 bis +23,+1 bis +24, +1 bis +25,+1 bis +26,+1 bis +27,+1 bis +28,+1 bis +29,+1 bis +30,+1 bis +31,+1 bis +32, +1 bis +33,+1 bis +34,+1 bis +35,+1 bis +36,+1 bis +37,+1 bis +38,+1 bis +39,+1 bis +40, +1 bis +41,+1 bis +42, +1 bis +43,+1 bis +44,+1 bis +45,+1 bis +46,+1 bis +47,+1 bis +48, +1 bis +49,+1 bis +50,+1 bis +51,+1 bis +52,+1 bis +53,+1 bis +54,+1 bis +55,+1 bis +56, +1 bis +57,+1 bis +58,+1 bis +59,+1 bis +60,+1 bis +61,+1 bis +62,+1 bis +63,+1 bis +64, +1 bis +65,+1 bis +66,+1 bis +67,+1 bis +68,+1 bis +69,+1 bis +70,+1 bis +71,+1 bis +72, +1 bis +73,+1 bis +74,+1 bis +75,+1 bis +76,+1 bis +77,+1 bis +78,+1 bis +79,+1 bis +80, +1 bis +81,+1 bis +82,+1 bis +83,+1 bis +84,+1 bis +85,+1 bis +86,+1 bis +87,+1 bis +88, +1 bis +89,+1 bis +90,+1 bis +90,+1 bis +91,+1 bis +92,+1 bis +93,+1 bis +94,+1 bis +95, +1 bis +96,+1 bis +97,+1 bis +98,+1 bis +99,+1 bis +100,+1 bis +101,+1 bis +102,+1 bis +103,+1 bis +104,+1 bis +105,+1 bis +106,+1 bis +107,+1 bis +108,+1 bis +109,+1 bis +110,+1 bis +111,+1 bis +112,+1 bis +113,+1 bis +114,+1 bis +115,+1 bis +116,+1 bis +117,+1 bis +118,+1 bis +119,+1 bis +120,+1 bis +121,+1 bis +122,+1 bis +123,+1 bis +124 oder +1 bis +125 von der Nickstelle.
  • In noch anderen Ausführungsformen wird die gewünschte Nukleotidänderung in ein Editing-Fenster eingebaut, das zwischen etwa +1 bis +2 von der Nickstelle oder etwa +1 bis +5,+1 bis +10,+1 bis +15,+1 bis +20,+1 bis +25,+1 bis +30,+1 bis +35,+1 bis +40,+1 bis +45,+1 bis +50,+1 bis +55,+1 bis +100,+1 bis +105,+1 bis +110,+1 bis +115,+1 bis +120, +1 bis +125,+1 bis +130,+1 bis +135,+1 bis +140,+1 bis +145,+1 bis +150,+1 bis +155, +1 bis +160, +1 bis +165,+1 bis +170,+1 bis +175,+1 bis +180,+1 bis +185,+1 bis +190, +1 bis +195 oder +1 bis +200 von der Nickstelle liegt.
  • In verschiedenen Aspekten sind die verlängerten Leit-RNAs modifizierte Versionen einer Leit-RNA. Leit-RNAs können natürlich vorkommen, von einer kodierenden Nukleinsäure exprimiert oder chemisch synthetisiert werden. Verfahren zur Gewinnung oder anderweitigen Synthese von Leit-RNAs und zur Bestimmung der geeigneten Sequenz der Leit- RNA, einschließlich der Protospacer-Sequenz, die mit dem Zielstrang einer genomischen Zielstelle von Interesse interagiert und hybridisiert, sind in der Technik wohlbekannt.
  • In verschiedenen Ausführungsformen hängen die besonderen Ausgestaltungsaspekte einer Leit-RNA-Sequenz von der Nukleotidsequenz einer genomischen Zielstelle von Interesse (d. h. der gewünschten zu editierenden Stelle) und dem Typ des napDNAbp (z. B. Cas9- Protein) ab, der in den hierin beschriebenen Multi-Flap-Prime-Editing-Systemen vorhanden ist, neben anderen Faktoren wie PAM-Sequenzpositionen, prozentualem G/C-Gehalt in der Zielsequenz, dem Grad der Mikrohomologieregionen, Sekundärstrukturen usw.
  • Im Allgemeinen ist eine Leitsequenz eine beliebige Polynukleotidsequenz, die eine ausreichende Komplementarität mit einer Ziel-Polynukleotidsequenz aufweist, um mit der Zielsequenz zu hybridisieren und eine sequenzspezifische Bindung eines napDNAbp (z. B. eines Cas9, Cas9-Homologs oder einer Cas9-Variante) an die Zielsequenz zu ermöglichen. In einigen Ausführungsformen beträgt der Grad der Komplementarität zwischen einer Leitsequenz und ihrer entsprechenden Zielsequenz bei optimaler Ausrichtung mit einem geeigneten Alignment-Algorithmus etwa 50 %, 60 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97,5 %, 99 % oder mehr. Die optimale Ausrichtung kann mit jedem geeigneten Algorithmus zum Ausrichten von Sequenzen bestimmt werden, wobei nicht einschränkende Beispiele den Smith- Waterman-Algorithmus, den Needleman-Wunsch-Algorithmus, Algorithmen basierend auf der Burrows-Wheeler-Transformation (z. B, Burrows Wheeler Aligner), ClustalW, Clustal X, BLAT, Novoalign (Novocraft Technologies), ELAND (Illumina, San Diego, Calif.), SOAP (verfügbar unter soap.genomics.org.cn) und Maq (verfügbar unter maq.sourceforge.net) beinhalten. In einigen Ausführungsformen ist eine Leitsequenz etwa 5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,35,40,45,50, 75 oder mehr Nukleotide lang.
  • In einigen Ausführungsformen ist eine Leitsequenz weniger als etwa 75, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 12 oder weniger Nukleotide lang. Die Fähigkeit einer Leitsequenz, die sequenzspezifische Bindung eines Multi-Flap-Prime-Editors an eine Zielsequenz zu steuern, kann durch jeden geeigneten Test beurteilt werden. Zum Beispiel können die Komponenten eines Multi-Flap-Prime-Editors, einschließlich der zu prüfenden Leitsequenz, einer Wirtszelle bereitgestellt werden, die die entsprechende Zielsequenz aufweist, wie z. B. durch Transfektion mit Vektoren, die die hierin offenbarten Komponenten eines Multi-Flap-Prime-Editors kodieren, gefolgt von einer Bewertung der bevorzugten Spaltung innerhalb der Zielsequenz, wie z. B. durch einen Surveyor-Test, wie hierin beschrieben. In ähnlicher Weise kann die Spaltung einer Ziel-Polynukleotidsequenz in einem Reagenzglas bewertet werden, indem die Zielsequenz, Komponenten eines Multi-Flap-Prime-Editors, einschließlich der zu testenden Leitsequenz und einer Kontroll-Leitsequenz, die sich von der Test-Leitsequenz unterscheidet, bereitgestellt werden und die Bindung oder Rate der Spaltung an der Zielsequenz zwischen den Test- und Kontroll-Leitsequenz-Reaktionen verglichen wird. Andere Tests sind möglich und werden sich dem Fachmann erschließen.
  • Eine Leitsequenz kann so ausgewählt werden, dass sie eine beliebige Zielsequenz anspricht. In einigen Ausführungsformen ist die Zielsequenz eine Sequenz innerhalb des Genoms einer Zelle. Exemplarische Zielsequenzen beinhalten solche, die im Zielgenom einzigartig sind. Zum Beispiel kann für S. pyogenes Cas9 eine einzigartige Zielsequenz in einem Genom eine Cas9-Zielstelle der Form MMMMMMMMNNNNNNNNNNNNXGG (SEQ-ID-NR: 204) beinhalten, wobei NNNNNNNNNNNNXGG (SEQ-ID-NR: 205) (N ist A, G, T, oder C; und X kann alles Beliebige sein. Eine einzigartige Zielsequenz in einem Genom kann eine S. pyogenes Cas9-Zielstelle der Form MMMMMMMMMNNNNNNNNNNNNXGG (SEQ-ID-NR: 206) beinhalten, wobei NNNNNNNNNNNXGG (SEQ-ID-NR: 207) (N ist A, G, T, oder C; und X kann alles Beliebige sein. Für S. thermophilus CRISPR1Cas9 kann eine einzigartige Zielsequenz in einem Genom eine Cas9-Zielstelle der Form MMMMMMMMNNNNNNNNNNNNXXAGAAW (SEQ-ID- NR: 208) beinhalten, wobei NNNNNNNNNNNNXXAGAAW (SEQ-ID-NR: 209) (N ist A, G, T, oder C; X kann alles Beliebige sein; und W ist A oder T). Eine einzigartige Zielsequenz in einem Genom kann eine S. thermophilus CRISPR 1 Cas9-Zielstelle der Form MMMMMMMMMNNNNNNNNNNNXXAGAAW (SEQ-ID-NR: 210) beinhalten, wobei NNNNNNNNNNNXXAGAAW (SEQ-ID-NR: 211) (N ist A, G, T, oder C; X kann alles Beliebige sein; und W ist A oder T). Für S. pyogenes Cas9 kann eine eindeutige Zielsequenz in einem Genom eine Cas9-Zielstelle der Form MMMMMMMMNNNNNNNNNNNNXGGXG (SEQ-ID-NR: 212) beinhalten, wobei NNNNNNNNNNNNXGGXG (SEQ-ID-NR: 213) (N ist A, G, T, oder C; und X kann alles Beliebige sein. Eine einzigartige Zielsequenz in einem Genom kann eine S. pyogenes Cas9- Zielstelle der Form MMMMMMMMMNNNNNNNNNNNXGGXG (SEQ-ID-NR: 214) beinhalten, wobei NNNNNNNNNNNXGGXG (SEQ-ID-NR: 215) (N ist A, G, T, oder C; und X kann alles Beliebige sein. In jeder dieser Sequenzen kann „M“ A, G, T oder C sein und muss bei der Identifizierung einer Sequenz als einzigartig nicht berücksichtigt werden.
  • Wie hierin in einer PEgRNA- oder Leit-RNA-Sequenz verwendet, sollte, sofern nicht anders angegeben, davon ausgegangen werden, dass der Buchstabe „T“ oder „Thymin“ eine Nukleobase in einer DNA-Sequenz bezeichnet, die die PEgRNA- oder Leit-RNA-Sequenz kodiert, und sich auf eine Uracil (U)-Nukleobase der PEgRNA oder Leit-RNA oder eine beliebige chemisch modifizierte Uracil-Nukleobase bezieht, die in der Technik bekannt ist, wie etwa 5-Methoxyuracil.
  • In einigen Ausführungsformen wird eine Leitsequenz ausgewählt, um den Grad der Sekundärstruktur innerhalb der Leitsequenz zu reduzieren. Die Sekundärstruktur kann durch jeden geeigneten Polynukleotidfaltungsalgorithmus bestimmt werden. Einige Programme basieren auf der Berechnung der minimalen freien Gibbs-Energie. Ein Beispiel für einen solchen Algorithmus ist mFold, wie von Zuker und Stiegler beschrieben (Nucleic Acids Res. 9 (1981), 133-148). Ein weiteres Beispiel für einen Faltungsalgorithmus ist der Online- Webserver RNAfold, der am Institut für Theoretische Chemie der Universität Wien entwickelt wurde und den Algorithmus zur Vorhersage der Zentroidstruktur verwendet (siehe z. B. A. R. Gruber et al., 2008, Cell 106(1): 23-24; und PA Carr und GM Church, 2009, Nature Biotechnology 27(12): 1151-62). Weitere Algorithmen finden sich in der US-Anmeldung Ser. Nr. 61/836,080 ; Broad Reference BI-2013/004A), die hierin durch Bezugnahme aufgenommen ist.
  • Im Allgemeinen beinhaltet eine Tracr-Mate-Sequenz jede Sequenz, die eine ausreichende Komplementarität mit einer Tracr-Sequenz aufweist, um eine oder mehrere der folgenden Aktionen zu fördern: (1) Exzision einer Leitsequenz, die von Tracr-Mate-Sequenzen flankiert wird, in einer Zelle, die die entsprechende Tracr-Sequenz enthält; und (2) Bildung eines Komplexes an einer Zielsequenz, wobei der Komplex die an die Tracr-Sequenz hybridisierte Tracr-Mate-Sequenz umfasst. Im Allgemeinen bezieht sich der Grad der Komplementarität auf die optimale Ausrichtung der Tracr-Mate-Sequenz und der Tracr- Sequenz entlang der Länge der kürzeren der beiden Sequenzen. Die optimale Ausrichtung kann durch jeden geeigneten Ausrichtungsalgorithmus bestimmt werden und kann ferner Sekundärstrukturen berücksichtigen, wie z. B. die Selbstkomplementarität innerhalb der Tracr- Sequenz oder der Tracr-Mate-Sequenz. In einigen Ausführungsformen beträgt der Grad der Komplementarität zwischen der Tracr-Sequenz und der Tracr-Mate-Sequenz entlang der Länge der kürzeren der beiden Sequenzen bei optimaler Ausrichtung etwa oder mehr als etwa 25 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 97,5 %, 99 % oder höher. In einigen Ausführungsformen beträgt die Länge der Tracr-Sequenz etwa oder mehr als etwa 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 50 oder mehr Nukleotide. In einigen Ausführungsformen sind die Tracr-Sequenz und die Tracr-Mate-Sequenz in einem einzigen Transkript enthalten, so dass die Hybridisierung zwischen den beiden ein Transkript ergibt, das eine Sekundärstruktur, wie z. B. eine Haarnadel, aufweist. Bevorzugte schleifenbildende Sequenzen zur Verwendung in Haarnadelstrukturen sind vier Nukleotide lang und weisen vorzugsweise die Sequenz GAAA auf. Es können jedoch auch längere oder kürzere Sequenzen verwendet werden, ebenso wie alternative Sequenzen. Die Sequenzen beinhalten vorzugsweise ein Nukleotid-Triplett (zum Beispiel AAA) und ein zusätzliches Nukleotid (zum Beispiel C oder G). Beispiele für schleifenbildende Sequenzen beinhalten CAAA und AAAG. In einer Ausführungsform der Erfindung weist das Transkript oder die transkribierte Polynukleotidsequenz mindestens zwei oder mehr Haarnadeln auf. In bevorzugten Ausführungsformen weist das Transkript zwei, drei, vier oder fünf Haarnadeln auf. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung weist das Transkript höchstens fünf Haarnadeln auf. In einigen Ausführungsformen beinhaltet das Einzeltranskript ferner eine Transkriptionsterminationssequenz; vorzugsweise ist dies eine polyT-Sequenz, zum Beispiel sechs T-Nukleotide. Weitere nicht einschränkende Beispiele für einzelne Polynukleotide, die eine Leitsequenz, eine Tracr-Mate-Sequenz und eine Tracr-Sequenz umfassen, sind die folgenden (aufgelistet von 5' bis 3'), wobei „N“ eine Base einer Leitsequenz darstellt, der erste Block von Kleinbuchstaben die Tracr-Mate-Sequenz und der zweite Block von Kleinbuchstaben die Tracr-Sequenz darstellt und die letzte poly-T-Sequenz den Transkriptionsterminator darstellt:
    1. (1)
      Figure DE112021002672T5_0196
      Figure DE112021002672T5_0197
    2. (2)
      Figure DE112021002672T5_0198
      Figure DE112021002672T5_0199
    3. (3)
      Figure DE112021002672T5_0200
      Figure DE112021002672T5_0201
    4. (4)
      Figure DE112021002672T5_0202
      Figure DE112021002672T5_0203
    5. (5)
      Figure DE112021002672T5_0204
      Figure DE112021002672T5_0205
      AND
    6. (6)
      Figure DE112021002672T5_0206
  • In einigen Ausführungsformen werden die Sequenzen (1) bis (3) in Kombination mit Cas9 aus S. thermophilus CRISPR1 verwendet. In einigen Ausführungsformen werden die Sequenzen (4) bis (6) in Kombination mit Cas9 von S. pyogenes verwendet. In einigen Ausführungsformen ist die Tracr-Sequenz ein von einem Transkript, das die Tracr-Mate- Sequenz umfasst, getrenntes Transkript.
  • Fachleuten wird klar sein, dass es zur Ausrichtung eines der Fusionsproteine, die eine Cas9-Domäne und ein Einzelstrang-DNA-Bindungsprotein umfassen, wie hierin offenbart, auf eine Zielstelle, z. B. eine Stelle, die eine zu editierende Punktmutation umfasst, typischerweise erforderlich ist, das Fusionsprotein zusammen mit einer Leit-RNA, z. B. einer sgRNA, zu exprimieren. Wie an anderer Stelle hierin näher erläutert, umfasst eine Leit-RNA typischerweise ein tracrRNA-Framework, das die Bindung von Cas9 ermöglicht, und eine Leitsequenz, die dem Cas9:Nukleinsäure-Editing-Enzym/Domänen-Fusionsprotein Sequenzspezifität verleiht.
  • In einigen Ausführungsformen umfasst die Leit-RNA eine Struktur 5'-[Leitsequenz]- GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAA AAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUU-3' (SEQ ID NO: 222), wobei die Leitsequenz eine Sequenz umfasst, die komplementär zur Zielsequenz ist. Die Leitsequenz ist in der Regel 20 Nukleotide lang. Die Sequenzen geeigneter Leit-RNAs für die Ausrichtung von Cas9:Nukleinsäure-Editing-Enzym/Domänen-Fusionsproteinen auf spezifische genomische Zielstellen werden für Fachleute basierend auf der vorliegenden Offenbarung offensichtlich sein. Solche geeigneten Leit-RNA-Sequenzen umfassen typischerweise Leitsequenzen, die komplementär zu einer Nukleinsequenz innerhalb von 50 Nukleotiden stromaufwärts oder stromabwärts des zu editierenden Zielnukleotids sind. Hierin werden einige beispielhafte Leit- RNA-Sequenzen bereitgestellt, die für die Ausrichtung eines der bereitgestellten Fusionsproteine auf spezifische Zielsequenzen geeignet sind. Weitere Leitsequenzen sind in der Technik wohlbekannt und können mit dem hierin beschriebenen Multi-Flap-Prime-Editor verwendet werden.
  • In anderen Ausführungsformen beinhalten die PEgRNAs die in 3D abgebildeten.
  • In wieder anderen Ausführungsformen können die PEgRNAs die in 3E abgebildeten beinhalten.
  • 3D stellt die Struktur einer Ausführungsform einer hierin betrachteten PEgRNA bereit, die gemäß der in Beispiel 2 definierten Methodik ausgestaltet werden kann. Die PEgRNA umfasst drei Hauptkomponenten, die in 5'-zu-3'-Richtung angeordnet sind, nämlich: einen Spacer, einen gRNA-Kern und einen Verlängerungsarm am 3'-Ende. Der Verlängerungsarm kann ferner in die folgenden Strukturelemente in 5'-zu-3'-Richtung unterteilt sein, nämlich: eine Primer-Bindungsstelle (A), ein Edit-Templat (B) und einen Homologiearm (C). Darüber hinaus kann die PEgRNA eine optionale 3'- Endmodifizierungsregion (e1) und eine optionale 5'-Endmodifizierungsregion (e2) umfassen. Darüber hinaus kann die PEgRNA ein Transkriptionsterminationssignal am 3'-Ende der PEgRNA umfassen (nicht abgebildet). Diese Strukturelemente sind ferner hierin definiert. Die Darstellung der Struktur der PEgRNA ist nicht als einschränkend zu verstehen und schließt Variationen in der Anordnung der Elemente mit ein. Zum Beispiel könnten die fakultativen Sequenz-Modifikatoren (e1) und (e2) innerhalb oder zwischen einer der anderen dargestellten Regionen positioniert sein und sind nicht darauf beschränkt, sich an den 3'- und 5'-Enden zu befinden.
  • 3E stellt die Struktur einer anderen Ausführungsform einer hierin betrachteten PEgRNA bereit, die gemäß der in Beispiel 2 definierten Methodik ausgestaltet werden kann. Die PEgRNA umfasst drei Hauptkomponenten, die in 5'-zu-3'-Richtung angeordnet sind, nämlich: einen Spacer, einen gRNA-Kern und einen Verlängerungsarm am 3'-Ende. Der Verlängerungsarm kann ferner in die folgenden Strukturelemente in 5'-zu-3'-Richtung unterteilt sein, nämlich: eine Primerbindungsstelle (A), ein Edit-Templat (B) und einen Homologiearm (C). Darüber hinaus kann die PEgRNA eine optionale 3'- Endmodifizierungsregion (e1) und eine optionale 5'-Endmodifizierungsregion (e2) umfassen. Darüber hinaus kann die PEgRNA ein Transkriptionsterminationssignal am 3'-Ende der PEgRNA umfassen (nicht abgebildet). Diese Strukturelemente sind ferner hierin definiert. Die Darstellung der Struktur der PEgRNA ist nicht als einschränkend zu verstehen und schließt Variationen in der Anordnung der Elemente mit ein. Zum Beispiel könnten die fakultativen Sequenz-Modifikatoren (e1) und (e2) innerhalb oder zwischen einem der anderen dargestellten Bereiche positioniert sein und sind nicht darauf beschränkt, sich an den 3'- und 5'-Enden zu befinden.
  • PEgRNA-Verbesserungen
  • Die PEgRNAs können außerdem zusätzliche Ausgestaltungsverbesserungen beinhalten, die die Eigenschaften und/oder Eigenschaften von PEgRNAs modifizieren können, wodurch die Wirksamkeit des Prime-Editing verbessert wird. In verschiedenen Ausführungsformen können diese Verbesserungen zu einer oder mehreren einer Reihe verschiedener Kategorien gehören, einschließlich unter anderem: (1) Ausgestaltungen, um eine effiziente Expression funktioneller PEgRNAs von Nicht-Polymerase III (Pol III)-Promotoren zu ermöglichen, was die Expression längerer PEgRNAs ohne lästige Sequenzerfordernisse ermöglichen würde; (2) Verbesserungen am Kern, dem Cas9-bindenden PEgRNA-Gerüst, was die Wirksamkeit verbessern könnte; (3) Modifikationen an der PEgRNA, um die RT- Prozessivität zu verbessern, wodurch die Insertion längerer Sequenzen an gezielten genomischen Loci ermöglicht wird; und (4) Hinzufügen von RNA-Motiven an die 5'- oder 3'- Termini der PEgRNA, die die PEgRNA-Stabilität verbessern, die RT-Prozessivität erhöhen, eine Fehlfaltung der PEgRNA verhindern oder zusätzliche Faktoren rekrutieren, die für das Genom-Editing wichtig sind.
  • In einer Ausführungsform könnte PEgRNA mit Pol-III-Promotoren ausgestaltet werden, um die Exprimierung längerer PEgRNA mit größeren Verlängerungsarmen zu verbessern. sgRNAs werden typischerweise vom U6-snRNA-Promotor exprimiert. Dieser Promotor rekrutiert Pol III, um die assoziierte RNA zu exprimieren, und ist nützlich für die Exprimierung von kurzen RNAs, die im Kern zurückgehalten werden. Pol III ist jedoch nicht hoch prozessiv und ist nicht in der Lage, RNAs mit einer Länge von mehr als einigen hundert Nukleotiden in dem für ein effizientes Genom-Editing erforderlichen Niveau zu exprimieren. Darüber hinaus kann Pol III an Abschnitten von U anhalten oder terminieren, was möglicherweise die Sequenzdiversität begrenzt, die mit einer PEgRNA eingefügt werden könnte. Andere Promotoren, die Polymerase II (wie pCMV) oder Polymerase I (wie der U1- snRNA-Promotor) rekrutieren, wurden auf ihre Fähigkeit untersucht, längere sgRNAs zu exprimieren. Diese Promotoren werden jedoch typischerweise teilweise transkribiert, was zu einer zusätzlichen Sequenz 5' des Spacers in der exprimierten PEgRNA führen würde, was nachweislich zu einer deutlich reduzierten Cas9:sgRNA-Aktivität in einer ortsabhängigen Weise führt. Während Pol-III-transkribierte PEgRNAs einfach in einem Lauf von 6-7 U terminieren können, benötigen PEgRNAs, die von Pol II oder Pol I transkribiert wurden, ein anderes Terminationssignal. Häufig führen solche Signale auch zu einer Polyadenylierung, die zu einem unerwünschten Transport der PEgRNA aus dem Zellkern führen würde. In ähnlicher Weise sind RNAs, die von Pol-II-Promotoren wie pCMV exprimiert werden, typischerweise 5'-verkappt, was ebenfalls zu ihrem Kernexport führt.
  • Zuvor haben Rinn und Mitarbeiter eine Vielzahl von Exprimierungsplattformen für die Produktion von langen, nicht kodierenden RNA(IncRNA)-markierten sgRNAs gescreent183. Diese Plattformen umfassen RNAs, die von pCMV exprimiert werden und die im ENE- Element der MALAT1-ncRNA von Menschen184, dem PAN-ENE-Element von KSHV185 oder der 3'-Box von U1-snRNA186 enden. Bemerkenswerterweise bilden die MALATl-ncRNA und die PAN-ENE Tripelhelices, die den PolyA-Schwanz schützen184, 187. Diese Konstrukte könnten auch die RNA-Stabilität erhöhen. Es wird erwogen, dass diese Exprimierungssysteme auch die Exprimierung längerer PEgRNAs ermöglichen.
  • Darüber hinaus wurde eine Reihe von Verfahren für die Spaltung des Teils des Pol-II- Promotors entwickelt, der als Teil der PEgRNA transkribiert werden würde, indem entweder ein selbstspaltendes Ribozym wie Hammerhead188, Pistol189, Hatchet189, Hairpin190, VS191, Twister192- oder Twister-Sister192-Ribozyme oder andere selbstspaltende Elemente hinzugefügt werden, um den transkribierten Guide zu verarbeiten, oder eine Haarnadel, die von Csy4193 erkannt wird und ebenfalls zur Verarbeitung des Guides führt. Es wird auch vermutet, dass der Einbau mehrerer ENE-Motive zu einer verbesserten PEgRNA-Exprimierung und - Stabilität führen könnte, wie zuvor für die KSHV PAN-RNA und das Element gezeigt185. Es wird auch erwartet, dass die Zirkularisierung der PEgRNA in Form einer zirkulären intronischen RNA (ciRNA) auch zu einer verbesserten RNA-Exprimierung und -Stabilität sowie zu einer Kernlokalisation führen könnte194.
  • In verschiedenen Ausführungsformen kann die PEgRNA verschiedene obige Elemente umfassen, wie durch die folgende Sequenz beispielhaft dargestellt.
    • Nicht einschränkendes Beispiel 1 - PEgRNA-Expressionsplattform bestehend aus pCMV, Csy4-Haarnadel, der PEgRNA und MALAT1 ENE
      Figure DE112021002672T5_0207
    • Nicht einschränkendes Beispiel 2 - PEgRNA-Expressionsplattform bestehend aus pCMV, Csy4-Haarnadel, der PEgRNA und PAN ENE
      Figure DE112021002672T5_0208
      Figure DE112021002672T5_0209
    • Nicht einschränkendes Beispiel 3 - PEgRNA-Expressionsplattform bestehend aus pCMV, Csy4-Haarnadel, der PEgRNA und 3xPAN ENE
      Figure DE112021002672T5_0210
    • Nicht einschränkendes Beispiel 4 - PEgRNA-Expressionsplattform bestehend aus pCMV, Csy4-Haarnadel, der PEgRNA und 3'-Box
      Figure DE112021002672T5_0211
    • Nicht einschränkendes Beispiel 5 -PEgRNA-Expressionsplattform bestehend aus pU1, Csy4-Haarnadel, der PEgRNA und 3'-Box
      Figure DE112021002672T5_0212
      Figure DE112021002672T5_0213
  • In verschiedenen anderen Ausführungsformen kann die PEgRNA verbessert werden, indem Verbesserungen an den Gerüst- oder Kernsequenzen eingeführt werden. Dies kann durch die Einführung von Bekanntem erfolgen
  • Der Kern, das Cas9-bindende PEgRNA-Gerüst, kann wahrscheinlich verbessert werden, um die PE-Aktivität zu erhöhen. Mehrere solcher Ansätze wurden bereits demonstriert. Zum Beispiel enthält das erste Paarungselement des Gerüsts (P1) ein GTTTT- AAAAC (SEQ-ID-NR: 3939) als Paarungselement. Es wurde gezeigt, dass solche Durchläufe von Ts zu einer Pol-III-Pausierung und einer vorzeitigen Beendigung des RNA-Transkripts führen. Es wurde gezeigt, dass die rationale Mutation eines der T-A-Paare zu einem G-C-Paar in diesem Teil von P1 die sgRNA-Aktivität erhöht, was darauf hindeutet, dass dieser Ansatz auch für PEgRNAs möglich wäre195. Darüber hinaus wurde auch gezeigt, dass die Verlängerung der P1-Länge die sgRNA-Faltung verbessert und zu einer verbesserten Aktivität führt195, was darauf hindeutet, dass dies ein weiterer Weg zur Verbesserung der PEgRNA- Aktivität ist. Beispiele für Verbesserungen am Kern können Folgendes beinhalten:
    • PEgRNA mit einer 6 nt-Verlängerung zu P1
      Figure DE112021002672T5_0214
    • PEgRNA mit einer T-A-zu-G-C-Mutation innerhalb von P1
      Figure DE112021002672T5_0215
  • In verschiedenen anderen Ausführungsformen kann die PEgRNA durch Modifikationen in der Edit-Templat-Region verbessert werden. Da die Größe des durch die PEgRNA erzeugten Templats zunimmt, ist es wahrscheinlicher, dass es durch Endonukleasen abgebaut wird, spontan hydrolysiert wird oder sich zu Sekundärstrukturen faltet, die von der RT nicht rücktranskribiert werden können oder die die Faltung des PEgRNA-Gerüsts und die anschließende Cas9-RT-Bindung stören. Dementsprechend ist es wahrscheinlich, dass eine Modifikation des Templats der PEgRNA notwendig sein könnte, um große Insertionen, wie die Insertion ganzer Gene, zu beeinflussen. Einige Strategien dazu umfassen den Einbau modifizierter Nukleotide in eine synthetische oder halbsynthetische PEgRNA, die die RNA resistenter gegen FIGau oder Hydrolyse machen oder inhibitorische Sekundärstrukturen weniger wahrscheinlich annehmen196. Solche Modifikationen könnten 8-Aza-7- Deazaguanosin einschließen, das die RNA-Sekundärstruktur in G-reichen Sequenzen reduzieren würde; Locked-Nucleinsäuren (LNA), die den FIGau reduzieren und bestimmte Arten der RNA-Sekundärstruktur verbessern; 2'-O-Methyl-, 2'-Fluor- oder 2'-O- Methoxyethoxy-Modifikationen, die die RNA-Stabilität erhöhen. Solche Modifikationen könnten auch an anderer Stelle in die PEgRNA aufgenommen werden, um die Stabilität und Aktivität zu erhöhen. Alternativ oder zusätzlich könnte das Templat der PEgRNA so ausgestaltet werden, dass es sowohl für ein gewünschtes Proteinprodukt kodiert als auch eher einfache Sekundärstrukturen annimmt, die durch die RT entfaltet werden können. Solche einfachen Strukturen würden als thermodynamische Senke wirken, was es weniger wahrscheinlich macht, dass kompliziertere Strukturen auftreten, die eine reverse Transkription verhindern würden. Schließlich könnte man das Templat auch in zwei separate PEgRNAs aufteilen. In einer solchen Ausgestaltung würde ein PE verwendet, um die Transkription zu initiieren und auch eine separate Templat-RNA über ein RNA-bindendes Protein, das an Cas9 fusioniert ist, oder ein RNA-Erkennungselement auf der PEgRNA selbst, wie das MS2- Aptamer, an die Zielstelle zu rekrutieren. Die RT könnte entweder direkt an diese separate Templat-RNA binden oder die Reverse Transkription auf der ursprünglichen PEgRNA initiieren, bevor sie zum zweiten Templat wechselt. Ein solcher Ansatz könnte lange Insertionen ermöglichen, indem er sowohl eine Fehlfaltung der PEgRNA bei Zugabe des langen Templats verhindert als auch keine Dissoziation von Cas9 vom Genom für lange Insertionen erfordert, was möglicherweise PE-basierte lange Insertionen hemmt.
  • In noch anderen Ausführungsformen kann die PEgRNA durch Einführung zusätzlicher RNA-Motive an den 5'- und 3'-Termini der PEgRNAs oder sogar an Positionen dazwischen (z. B. in der gRNA-Kernregion oder im Spacer) verbessert werden. Mehrere solcher Motive - wie das PAN ENE von KSHV und das ENE von MALAT1 wurden oben als mögliche Mittel erörtert, um die Exprimierung längerer PEgRNAs von Nicht-Pol-III-Promotoren zu beenden. Diese Elemente bilden RNA-Tripelhelices, die den PolyA-Schwanz umhüllen, was dazu führt, dass sie im Kern verbleiben184, 187. Durch die Bildung komplexer Strukturen am 3'-Terminus der PEgRNA, die das terminale Nukleotid verschließen, würden diese Strukturen jedoch wahrscheinlich auch dazu beitragen, den Exonuklease-vermittelten FIGau von PEgRNAs zu verhindern.
  • Andere am 3'-Terminus inserierte Strukturelemente könnten ebenfalls die RNA- Stabilität erhöhen, jedoch ohne die Termination von Nicht-Pol-III-Promotoren zu ermöglichen. Solche Motive könnten Haarnadeln oder RNA-Quadruplexe umfassen, die den 3'-Terminus verschließen197, oder selbstspaltende Ribozyme wie HDV, die zur Bildung eines 2'-3' cyclischen Phosphats am 3'-Terminus führen und möglicherweise auch dazu führen, dass die PEgRNA weniger wahrscheinlich durch Exonukleasen abgebaut wird198. Das Induzieren der PEgRNA durch unvollständiges Spleißen zur Cyclisierung - um eine ciRNA zu bilden - könnte auch die PEgRNA-Stabilität erhöhen und dazu führen, dass die PEgRNA im Zellkern verbleibt194.
  • Zusätzliche RNA-Motive könnten auch die RT-Prozessivität verbessern oder die PEgRNA-Aktivität steigern, indem sie die RT-Bindung an den DNA-RNA-Duplex verstärken. Die Zugabe der nativen Sequenz, die von der RT in ihrem verwandten retroviralen Genom gebunden wird, könnte die RT-Aktivität erhöhen199. Dies könnte die native Primer- Bindungsstelle (PBS), den Polypurintrakt („polypurine tract“ - PPT) oder Kissing Loops umfassen, die an der retroviralen Genomdimerisierung und Transkriptionsinitiation beteiligt sind199.
  • Das Hinzufügen von Dimerisierungsmotiven - wie Kissing Loops oder einem GNRA- Tetraloop/Tetraloop-Rezeptorpaar200 - an den 5'- und 3'-Termini der PEgRNA könnte auch zu einer effektiven Zirkularisierung der PEgRNA führen, was die Stabilität verbessert. Darüber hinaus wird in Betracht gezogen, dass die Zugabe dieser Motive die physikalische Trennung des PEgRNA-Spacers und des Primers ermöglichen könnte, wodurch eine Okklusion des Spacers verhindert wird, die die PE-Aktivität behindern würde. Kurze 5'-Verlängerungen oder 3'-Verlängerungen der PEgRNA, die eine kleine Haarnadel in der Spacer-Region oder entlang der Primer-Bindungsstelle bilden, könnten ebenfalls günstig mit der Hybridisierung intrakomplementärer Regionen entlang der Länge der PEgRNA konkurrieren, z. B. mit der Interaktion zwischen dem Spacer und der Primer-Bindungsstelle, die auftreten kann. Schließlich könnten Kissing Loops auch dazu verwendet werden, andere Templat-RNAs an die genomische Stelle zu rekrutieren und ein Swapping der RT-Aktivität von einer RNA zur anderen zu ermöglichen. Als beispielhafte Ausführungsformen für verschiedene Sekundärstrukturen führen die in 3D und 3E gezeigte PEgRNA eine Anzahl sekundärer RNA-Strukturen auf, die in jede beliebige Region der PEgRNA eingebaut werden können, einschließlich der terminalen Abschnitte des Verlängerungsarms (d. h. e1 und e2), wie gezeigt.
  • Beispiele für Verbesserungen beinhalten unter anderem:
    • PEgRNA-HDV-Fusion
      Figure DE112021002672T5_0216
    • PEgRNA-MMLV-Kissing Loop
      Figure DE112021002672T5_0217
    • PEgRNA-VS-Ribozym-Kissing Loop
      Figure DE112021002672T5_0218
    • PEgRNA-GNRA-Tetraloop/Tetraloop-Rezeptor
      Figure DE112021002672T5_0219
    • PEgRNA-Templat-Switching sekundäre RNA-HDV-Fusion
      Figure DE112021002672T5_0220
  • PEgRNA-Gerüste könnte durch gerichtete Evolution weiter verbessert werden, ähnlich wie SpCas9 und Prime-Editoren (PE) verbessert wurden. Die gerichtete Evolution könnte die Erkennung von PEgRNA durch Cas9 oder evoluierte Cas9-Varianten verbessern. Darüber hinaus ist es wahrscheinlich, dass unterschiedliche PEgRNA-Gerüstsequenzen an unterschiedlichen genomischen Loci optimal wären, indem sie entweder die PE-Aktivität an der fraglichen Stelle erhöhen, Off-Target-Aktivitäten reduzieren oder beides. Schließlich würde die Evolution von PEgRNA-Gerüsten, denen andere RNA-Motive hinzugefügt wurden, mit ziemlicher Sicherheit die Aktivität der fusionierten PEgRNA im Vergleich zur nicht evoluierten Fusions-RNA verbessern. Beispielsweise führte die Evolution allosterischer Ribozyme, die aus c-di-GMP-I-Aptameren und Hammerhead-Ribozymen bestehen, zu einer dramatisch verbesserten Aktivität202, was darauf hindeutet, dass die Evolution auch die Aktivität von Hammerhead-PEgRNA-Fusionen verbessern würde. Darüber hinaus wird, während Cas9 derzeit im Allgemeinen keine 5'-Verlängerung der sgRNA toleriert, die gerichtete Evolution wahrscheinlich Mutationen erzeugen, die diese Intoleranz mildern und die Verwendung zusätzlicher RNA-Motive ermöglichen.
  • Die vorliegende Offenbarung erwägt alle derartigen Möglichkeiten, die Wirksamkeit der hier offenbarten Multi-Flap-Prime-Editing-Systeme weiter zu verbessern.
  • In verschiedenen Ausführungsformen kann es vorteilhaft sein, das Auftreten von aufeinanderfolgenden Sequenzen von Ts aus dem Verlängerungsarm zu begrenzen, da aufeinanderfolgende Reihen von Ts die Fähigkeit der PEgRNA, transkribiert zu werden, begrenzen können. Zum Beispiel sollten Strings von mindestens drei aufeinanderfolgenden Ts, mindestens vier aufeinanderfolgenden Ts, mindestens fünf aufeinanderfolgenden Ts, mindestens sechs aufeinanderfolgenden Ts, mindestens sieben aufeinanderfolgenden Ts, mindestens acht aufeinanderfolgenden Ts, mindestens neun aufeinanderfolgenden Ts, mindestens zehn aufeinanderfolgenden Ts, mindestens elf aufeinanderfolgenden Ts, mindestens zwölf aufeinanderfolgenden Ts, mindestens dreizehn aufeinanderfolgenden Ts, mindestens vierzehn aufeinanderfolgenden Ts oder mindestens fünfzehn aufeinanderfolgenden Ts bei der Ausgestaltung der PEgRNA vermieden werden oder zumindest aus der endgültigen Sequenz entfernt werden. In einer Ausführungsform kann man vermeiden, dass unerwünschte Strings von aufeinanderfolgenden Ts in PEgRNA-Verlängerungsarmen enthalten sind, indem man Zielstellen vermeidet, die reich an aufeinanderfolgenden A:T-Nukleobasenpaaren sind.
  • Split-PEgRNA-Ausgestaltungen für trans-Prime-Editing
  • Die vorliegende Offenbarung bezieht sich auch auf das trans-Prime-Editing, d. h. eine modifizierte Version des Prime-Editing, bei der die PEgRNA in zwei unterschiedliche Moleküle aufgeteilt wird: eine Leit-RNA und ein tPERT-Molekül. Das tPERT-Molekül ist so programmiert, dass es mit dem Prime-Editor-Komplex an einer Ziel-DNA-Stelle kolokalisiert und die Primer-Bindungsstelle und das DNA-Synthese-Templat zum Prime-Editor in trans bringt. Zum Beispiel, siehe 3G für eine Ausführungsform eines trans-Prime-Editors (tPE), die ein Zwei-Komponenten-System zeigt, das (1) einen Rekrutierungsprotein (RP)-PE:gRNA- Komplex und (2) ein tPERT beinhaltet, das eine Primer-Bindungsstelle und ein DNA- Synthese-Templat, das mit einer RNA-Protein-Rekrutierungsdomäne (z. B. Stammschleife oder Haarnadel) verbunden ist, wobei die rekrutierende Proteinkomponente des RP-PE:gRNA- Komplexes das tPERT zu einer zu editierenden Zielstelle rekrutiert, wodurch die PBS und das DNA-Synthese-Templat mit dem Prime-Editor in trans assoziiert werden. Anders ausgedrückt ist das tPERT so konstruiert, dass es (ganz oder teilweise) den Verlängerungsarm einer PEgRNA enthält, der die Primer-Bindungsstelle und das DNA-Synthesemuster beinhaltet. Ein Vorteil dieses Ansatzes besteht darin, dass der Verlängerungsarm einer PEgRNA von der Leit- RNA getrennt wird, wodurch Hybridisierungswechselwirkungen minimiert werden, die zwischen der PBS des Verlängerungsarms und der Spacer-Sequenz der Leit-RNA auftreten können.
  • Ein wesentliches Merkmal des trans-Prime-Editing ist die Fähigkeit des trans-Prime- Editors, das tPERT an die Stelle des DNA-Editings zu rekrutieren, wodurch alle Funktionen einer PEgRNA an der Stelle des Prime-Editing effektiv kolokalisiert werden. Die Rekrutierung kann erreicht werden, indem eine RNA-Protein-Rekrutierungsdomäne, wie z. B. ein MS2- Aptamer, in das tPERT eingebaut wird und ein entsprechendes Rekrutierungsprotein an den Prime-Editor fusioniert wird (z. B. über einen Linker an das napDNAbp oder über einen Linker an die Polymerase), das in der Lage ist, spezifisch an die RNA-Protein-Rekrutierungsdomäne zu binden, wodurch das tPERT-Molekül an den Prime-Editor-Komplex rekrutiert wird. Wie in dem in 3H beschriebenen Verfahren abgebildet ist, bindet der RP-PE:gRNA-Komplex an die Ziel-DNA-Sequenz und kerbt („nickt“) sie. Dann rekrutiert das Rekrutierungsprotein (RP) ein tPERT, damit es an den Prime-Editor-Komplex, der an die DNA-Zielstelle gebunden ist, kolokalisiert, wodurch die Primer-Bindungsstelle, die sich auf dem tPERT befindet, an die Primer-Sequenz auf dem genickten Strang binden kann, und anschließend die Polymerase (z. B. RT) einen einzelnen DNA-Strang gegen das DNA-Synthese-Templat, das sich auf dem tPERT befindet, bis zum 5'-Ende des tPERT synthetisieren kann.
  • Während das tPERT in 3G und 3H so dargestellt ist, dass er das PBS- und DNA-Synthese-Templat am 5'-Ende der RNA-Protein-Rekrutierungsdomäne umfasst, kann das tPERT in anderen Konfigurationen so ausgestaltet werden, dass sich das PBS- und DNA- Synthese-Templat am 3'-Ende der RNA-Protein-Rekrutierungsdomäne befindet. Das tPERT mit der 5'-Verlängerung weist jedoch den Vorteil auf, dass die Synthese des DNA- Einzelstrangs auf natürliche Weise am 5'-Ende des tPERT endet und somit nicht die Gefahr besteht, dass irgendein Abschnitt der RNA-Protein-Rekrutierungsdomäne während der DNA- Synthesestufe des Prime-Editing als Templat verwendet wird.
  • Verfahren zur Ausgestaltung von PEgRNAs
  • Die vorliegende Offenbarung betrifft auch Verfahren für die Ausgestaltung von PEgRNAs.
  • Bei einem Aspekt der Ausgestaltung kann der Ausgestaltungsansatz die spezielle Anwendung berücksichtigen, für die Prime-Editing verwendet wird. Beispielsweise kann, wie hierin beschrieben und erörtert, Prime-Editing ohne Einschränkung verwendet werden, um (a) mutationskorrigierende Änderungen in eine Nukleotidsequenz einzubauen, (b) Protein- und RNA-Tags einzubauen, (c) Immunepitope auf Proteinen von Interesse einzubauen, (d) induzierbare Dimerisierungsdomänen in Proteine einzubauen, (e) Sequenzen einzubauen oder zu entfernen, um diese Aktivität eines Biomoleküls zu verändern, (f) Rekombinase-Zielstellen einzubauen, um spezifische genetische Veränderungen zu steuern, und (g) zur Mutagenese einer Zielsequenz unter Verwendung einer fehleranfälligen RT. Neben diesen Verfahren, bei denen im Allgemeinen Nukleotidsequenzen an Zielstellen von Interesse eingefügt, verändert oder gelöscht werden, können Prime-Editoren auch zum Aufbau hochgradig programmierbarer Bibliotheken sowie zur Aufzeichnung von Zelldaten und zur Untersuchung der Abstammung verwendet werden. Bei diesen verschiedenen Anwendungen kann es, wie hierin beschrieben, besondere Ausgestaltungsaspekte in Bezug auf die Herstellung einer PEgRNA geben, die für jede dieser Anwendungen besonders nützlich ist.
  • Beim Ausgestalten einer PEgRNA für eine bestimmte Anwendung oder Verwendung von Prime-Editing kann eine Reihe von Überlegungen berücksichtigt werden, die unter anderem Folgendes beinhalten:
    1. (a) die Zielsequenz, d. h. die Nukleotidsequenz, in der eine oder mehrere Nukleobasenmodifikationen durch den Prime-Editor eingebaut werden sollen;
    2. (b) die Position der Schnittstelle innerhalb der Zielsequenz, d. h. die spezifische Nukleobasenposition, an der der Prime-Editor einen Single-Stand-Nick induziert, um eine 3'- Ende-RT-Primersequenz auf einer Seite des Nicks und den 5'-Ende-endogenen Flap auf der anderen Seite des Nicks (der schließlich durch FEN1 oder ein Äquivalent dazu entfernt und durch den 3'-ssDNA-Flap ersetzt wird. Die Schnittstelle ist analog zum „Edit-Ort“, da hier die 3'-endogene RT-Primersequenz entsteht, die von der RT während der RNA-abhängigen DNA- Polymerisation verlängert wird, um den 3'-ssDNA-Flap zu erzeugen, der den gewünschten Edit enthält, der dann den 5'-endogenen DNA-Flap in der Zielsequenz ersetzt.
    3. (c) die verfügbaren PAM-Sequenzen (einschließlich der kanonischen SpCas9-PAM-Stellen sowie nicht-kanonischer PAM-Stellen, die von Cas9-Varianten und Äquivalenten mit erweiterten oder unterschiedlichen PAM-Spezifitäten erkannt werden);
    4. (d) den Abstand zwischen den verfügbaren PAM-Sequenzen und die Lage der Schnittstelle in der Zielsequenz;
    5. (e) das jeweilige Cas9, die Cas9-Variante oder das Cas9-Äquivalent des verwendeten Prime- Editors;
    6. (f) die Sequenz und Länge der Primer-Bindungsstelle;
    7. (g) die Sequenz und Länge des Edit-Templats;
    8. (h) die Sequenz und Länge des Homologiearms;
    9. (i) die Spacer-Sequenz und -Länge; und
    10. (j) die Kernsequenz.
  • In der vorliegenden Offenbarung werden diese Aspekte erörtert.
  • In einer Ausführungsform wird hiermit ein Ansatz für das Ausgestalten einer geeigneten PEgRNA und optional eine Anleitung für die Ausgestaltung einer Nicking-sgRNA für das Nicking an der zweiten Stelle bereitgestellt. Diese Ausführungsform stellt einen schrittweisen Anweisungssatz für das Ausgestalten von PEgRNAs und Nicking-sgRNAs für Prime-Editing bereit, der eine oder mehrere der oben genannten Überlegungen berücksichtigt. Die Schritte beziehen sich auf die in den 70A-70I gezeigten Beispiele.
    1. 1. Definieren der Zielsequenz und des Edits. Man rufe die Sequenz der Ziel-DNA- Region (∼200 bp) ab, die um den Ort des gewünschten Edits (Punktmutation, Insertion, Deletion oder Kombination davon) zentriert ist. Siehe 70A.
    2. 2. Lokalisieren der Ziel-PAMs. Man identifiziere die PAMs in der Nähe des gewünschten Edit-Orts. PAMs können auf jedem DNA-Strang in der Nähe des gewünschten Edit-Ortes identifiziert werden. Während PAMs in der Nähe der Edit-Position bevorzugt werden (d. h. bei denen die Nickstelle weniger als 30 nt von der Edit-Position entfernt ist oder weniger als 29 nt, 28 nt, 27 nt, 26 nt, 25 nt, 24 nt, 23 nt, 22 nt, 21 nt, 20 nt, 19 nt, 18 nt, 17 nt, 16 nt, 15 nt, 14 nt, 13 nt, 12 nt, 11 nt, 10 nt, 9 nt, 8 nt, 7 nt, 6 nt, 5 nt, 4 nt, 3 nt, oder 2 nt von der Edit-Position zur Nickstelle), ist es möglich, Edits mit Protospacern und PAMs einzubauen, die den Nick ≥ 30 nt von der Edit-Position entfernt platzieren. Siehe 70B.
    3. 3. Lokalisieren der Nickstellen. Für jede in Betracht gezogene PAM identifiziere man die entsprechende Nickstelle und auf welchem Strang. Für Sp-Cas9-H840A-Nickase erfolgt die Spaltung im PAM enthaltenden Strang zwischen der 3. und 4. Base 5' zur NGG PAM. Alle editierten Nukleotide müssen 3' von der Nickstelle existieren, daher müssen geeignete PAMs den Nick 5' zum Ziel-Edit auf dem PAM-enthaltenden Strang platzieren. Im unten gezeigten Beispiel gibt es zwei mögliche PAMs. Der Einfachheit halber demonstrieren die verbleibenden Schritte die Ausgestaltung einer PEgRNA, die nur PAM 1 verwendet. Siehe 70C.
    4. 4. Ausgestalten der Spacer-Sequenz. Der Protospacer von Sp Cas9 entspricht den 20 Nukleotiden 5' zum NGG-PAM auf dem PAM-enthaltenden Strang. Eine effiziente Pol-III- Transkriptionsinitiation erfordert, dass das erste transkribierte Nukleotid ein G ist. Wenn das erste Nukleotid des Protospacers ein G ist, ist die Spacer-Sequenz für die PEgRNA einfach die Protospacersequenz. Wenn das erste Nukleotid des Protospacers kein G ist, ist die Spacer- Sequenz der PEgRNA G gefolgt von der Protospacersequenz. Siehe 70D.
    5. 5. Ausgestalten einer Primer-Bindungsstelle (PBS). Man identifiziere den DNA-Primer auf dem PAM-enthaltenden Strang mithilfe der Allel-Startsequenz. Das 3'-Ende des DNA- Primers ist das Nukleotid direkt stromaufwärts der Nickstelle (d. h. die 4. Base 5' von der NGG- PAM für Sp-Cas9). Als allgemeines Ausgestaltungsprinzip für die Verwendung mit PE2 und PE3 kann eine PEgRNA-Primer-Bindungsstelle (PBS) mit 12 bis 13 Nukleotiden komplementär zum DNA-Primer für Sequenzen verwendet werden, die -40-60 % GC-Gehalt enthalten. Bei Sequenzen mit geringem GC-Gehalt sollten längere (14- bis 15-nt) PBSs getestet werden. Bei Sequenzen mit höherem GC-Gehalt sollten kürzere (8- bis 11-nt) PBSs getestet werden. Optimale PBS-Sequenzen sollten unabhängig vom GC-Gehalt empirisch bestimmt werden. Um eine PBS-Sequenz der Länge p auszugestalten, nehme man das reverse Komplement der ersten p-Nukleotide 5' von der Nickstelle in dem PAM-enthaltenden Strang unter Verwendung der Allel-Startsequenz. Siehe 70E.
    6. 6. Ausgestalten eines RT-Templats (oder DNA-Synthese-Templats). Das RT-Templat (oder DNA-Synthese-Templat, bei der die Polymerase keine reverse Transkriptase ist) kodiert das ausgestaltete Edit und die Homologie zu der Sequenz neben dem Edit. In einer Ausführungsform entsprechen diese Regionen dem DNA-Synthese-Templat von 3D und 3E, wobei das DNA-Synthese-Templat das „Edit-Templat“ und den „Homologiearm“ umfasst. Die optimale Länge des RT-Templats variiert je nach Zielstelle. Für Short-Range- Edits (Positionen +1 bis +6) wird empfohlen, ein kurzes (9 bis 12 nt), ein mittleres (13 bis 16 nt) und ein langes (17 bis 20 nt) RT-Templat zu testen. Für Long-Range-Edits (Positionen +7 und darüber hinaus) wird empfohlen, RT-Template zu verwenden, die sich mindestens 5 nt (vorzugsweise 10 oder mehr nt) über die Position des Edits hinaus erstrecken, um eine ausreichende 3'-DNA-Flap-Homologie zu ermöglichen. Für Long-Range-Edits sollten mehrere RT-Template überprüft werden, um funktionale Ausgestaltungen zu identifizieren. Für größere Insertionen und Deletionen (≥5 nt) wird der Einbau einer größeren 3'-Homologie (∼20 nt oder mehr) in das RT-Templat empfohlen. Die Editing-Effizienz wird typischerweise beeinträchtigt, wenn das RT-Templat die Synthese eines G als letztes Nukleotid im revers transkribierten DNA-Produkt kodiert (entsprechend einem C im RT-Tamplate der PEgRNA). Da viele RT- Template ein effizientes Prime-Editing unterstützen, wird bei der Ausgestaltung von RT- Templaten empfohlen, G als das endgültig synthetisierte Nukleotid zu vermeiden. Um eine RT- Templat-Sequenz der Länge r auszugestalten, verwende man die gewünschte Allelsequenz und nehme man das reverse Komplement der ersten r-Nukleotide 3' von der Nickstelle in dem Strang, der ursprünglich die PAM enthielt. Man beachte, dass im Vergleich zu SNP-Edits Insertions- oder Deletions-Edits unter Verwendung von RT-Templaten derselben Länge keine identische Homologie enthalten. Siehe 70F.
    7. 7. Zusammenbauen der vollständigen PEgRNA-Sequenz. Man verkette die PEgRNA- Komponenten in der folgenden Reihenfolge (5' bis 3'): Spacer, Gerüst, RT-Templat und PBS. Siehe 70G.
    8. 8. Ausgestalten von Nicking-sgRNAs für PE3. Man identifiziere PAMs auf dem nicht- editierten Strang stromaufwärts und stromabwärts des Edits. Optimale Nicking-Positionen sind stark ortsabhängig und sollten empirisch bestimmt werden. Im Allgemeinen führen Nicks, die 40 bis 90 Nukleotide 5' von der Position gegenüber dem PEgRNA-induzierten Nick platziert werden, zu höheren Editing-Ausbeuten und weniger Indels. Eine Nicking-sgRNA hat eine Spacer-Sequenz, die mit dem 20-nt-Protospacer im Startallel übereinstimmt, mit dem Zusatz eines 5'-G, wenn der Protospacer nicht mit einem G beginnt. Siehe 70H.
    9. 9. Ausgestalten von PE3b Nicking-sgRNAs. Wenn eine PAM im komplementären Strang existiert und ihr entsprechender Protospacer mit der für das Editing anvisierten Sequenz überlappt, könnte dieses Editing ein Kandidat für das PE3b-System sein. Im PE3b-System stimmt die Spacer-Sequenz der Nicking-sgRNA mit der Sequenz des gewünschten editierten Allels überein, jedoch nicht mit dem Startallel. Das PE3b-System arbeitet effizient, wenn das (die) editierte(n) Nukleotid(e) in die Saatregion (~10 nt neben der PAM) des Nicking-sgRNA- Protospacers fällt. Dies verhindert das Nicken des komplementären Strangs bis nach dem Einbau des editierten Strangs, wodurch Konkurrenz zwischen der PEgRNA und der sgRNA um die Bindung der Ziel-DNA verhindert wird. PE3b vermeidet auch die Erzeugung simultaner Nicks auf beiden Strängen, wodurch die Informationsbildung erheblich reduziert wird, während eine hohe Editing-Effizienz beibehalten wird. PE3b-sgRNAs sollten eine Spacer- Sequenz aufweisen, die mit dem 20-nt-Protospacer im gewünschten Allel übereinstimmt, gegebenenfalls unter Hinzufügung eines 5'-G. Siehe 70I.
  • Das obige schrittweise Verfahren zum Ausgestalten einer geeigneten PEgRNA und einer Zweitstellen-Nicking-sgRNA soll in keiner Weise einschränkend sein. Die Offenbarung sieht Variationen des oben beschriebenen Schritt-für-Schritt-Verfahrens vor, die von einem Durchschnittsfachmann daraus abgeleitet werden können.
  • [7] Anwendungen für das Multi-Flap-Prime-Editing
  • Das Dual-Flap und Quadruple-Flap-Prime-Editing (d. h. das Multi-Flap-Prime- Editing) weist viele potenzielle Anwendungen auf, wie z. B. das Einbauen von Peptid-Tags, RNA-Tags, Immunoepitopen, Dimerisierungsdomänen und Rekombinase-Zielstellen. Eine solche Anwendung des Dual-Flap-Prime-Editing ist der Einbau von Rekombinase- oder Integrase-Sequenzen an benutzerdefinierten Stellen im Genom. 93 veranschaulicht den Einbau der Bxb 1-Rekombinasesequenzen attB (38 bp) und attP (50 bp) in eine Zielregion des humanen Genoms (HEK293T site 3 oder HEK3) bei gleichzeitiger Deletion von 90 bp dazwischenliegender Sequenz zwischen den beiden Nickstellen. Verschiedene Grade der Komplementarität zwischen den 3'-Flaps ermöglichen ein erfolgreiches Editing, wobei längere Sequenzen mit Komplementarität ein günstigeres Verhältnis von gewünschten Edits zu Indels ergeben. Weitere Anwendungen des Dual-Flap-Prime-Editing beinhalten das endogene Tagging von Genen mit Peptid- oder Proteinsequenzen oder den Austausch von Exons durch neue DNA-Sequenzen, die das Potenzial aufweisen, mehrere Varianten zu ersetzen, bei denen die Mutation innerhalb der Exon-Sequenz liegt.
  • Mit dem Dual-Flap-Prime-Editing können eine oder zwei Rekombinasestellen an den Zielpositionen im humanen Genom eingeführt werden. Werden einzelne Rekombinasestellen eingefügt, können diese als Landeplätze für eine rekombinasevermittelte Reaktion zwischen der genomischen Rekombinasestelle und einer zweiten Rekombinasestelle innerhalb einer von außen zugeführten DNA, wie z. B. einem Plasmid, genutzt werden. Dies ermöglicht die gezielte Integration von DNA-Fracht. Werden zwei Rekombinasestellen in benachbarte DNA- Regionen eingefügt, können diese je nach Ausrichtung der Rekombinasestellen für die rekombinasevermittelte Exzision oder Inversion der dazwischenliegenden Sequenz oder für den rekombinasevermittelten Kassettenaustausch mit exogener DNA zur Integration der Fracht genutzt werden. Die Integration kompatibler Rekombinasestellen auf verschiedenen Chromosomen ermöglicht eine gezielte und gerichtete chromosomale Translokation. Mit Dual- Flap-Prime-Editing lassen sich Rekombinasestellen an einer Reihe von Loci im humanen Genom effizient einfügen (94). Die Kopplung der Integration von Rekombinasestellen durch Dual-Flap-Prime-Editing mit DNA-Rekombinase-Enzymen ist somit ein leistungsfähiger Ansatz für viele Arten von SV-Editings und die Zielintegration von DNA- Fracht.
  • Die Multi-Flap-Prime-Editoren (z. B. die in 90 dargestellte Ausführungsform) können hierin für die präzise Insertion einer neuen DNA-Sequenz, die präzise Deletion einer endogenen genomischen DNA-Sequenz oder den Austausch einer endogenen genomischen DNA-Sequenz durch eine neue DNA-Sequenz verwendet werden.
  • Zum Beispiel und wie hierin beispielhaft dargestellt und erörtert, kann das Dual-Prime- Editing dazu verwendet werden, (a) mutationskorrigierende Veränderungen in eine Nukleotidsequenz einzubauen, (b) Protein- und RNA-Tags einzubauen, (c) Immunoepitope auf Proteinen von Interesse einzubauen, (d) induzierbare Dimerisierungsdomänen in Proteine einzubauen, (e) Rekombinase-Zielstellen einzubauen, um spezifische genetische Veränderungen zu steuern. Neben diesen Verfahren, bei denen im Allgemeinen Nukleotidsequenzen an Zielstellen von Interesse eingefügt, verändert oder gelöscht werden, können Dual-Prime-Editoren auch zum Aufbau hochgradig programmierbarer Bibliotheken sowie zur Aufzeichnung von Zelldaten und zur Untersuchung der Abstammung verwendet werden.
  • Diese spezifischen beispielhaften Anwendungen des Dual-Prime-Editings sind in keiner Weise als einschränkend zu verstehen. In der vorliegenden Anmeldung wird jede Anwendung des Dual-Prime-Editings erwogen, die im Allgemeinen eine Form der Insertion, der Deletion und/oder des Austauschs einer oder mehrerer Nukleobasen an einer Zielstelle in einer Nukleotidsequenz, z. B. einer genomischen DNA, umfasst.
  • Für jede der beispielhaften Verwendungen des Dual-Prime-Editings kann jeder hierin offengelegte Prime-Editor verwendet werden, einschließlich PE1, PE2, PE3 und PE3b oder PE-short.
  • A. Prime-Editing versus Mulit-Flap-Prime-Editing
  • Klassisches Prime-Editing
  • In verschiedenen Ausführungsformen erfolgt das Prime-Editing (oder „Prime-Editing“) durch den Kontakt eines Ziel-DNA-Moleküls (bei dem eine Änderung der Nukleotidsequenz eingeführt werden soll) mit einem Nukleinsäure-programmierbaren DNA-bindenden Protein (napDNAbp), das mit einer verlängerten Leit-RNA komplexiert ist. Bezugnehmend auf 1G umfasst die verlängerte Leit-RNA eine Verlängerung am 3'- oder 5'-Ende der Leit- RNA oder an einer intramolekularen Stelle in der Leit-RNA und kodiert die gewünschte Nukleotidänderung (z. B. eine einzelne Nukleotidänderung, Insertion oder Deletion). In Schritt (a) kontaktiert das napDNAbp / der verlängerte gRNA-Komplex das DNA-Molekül, und die verlängerte gRNA leitet das napDNAbp zur Bindung an einen Ziel-Locus. In Schritt (b) wird (z. B. durch eine Nuklease oder einen chemischen Wirkstoff) ein Nick in einen der DNA- Stränge des Ziel-Locus eingeführt, wodurch ein verfügbares 3'-Ende in einem der Stränge des Ziel-Locus entsteht. In bestimmten Ausführungsformen wird der Nick in dem DNA-Strang erzeugt, der dem R-Loop-Strang entspricht, d. h. dem Strang, der nicht mit der Leit-RNA- Sequenz hybridisiert ist, d. h. dem „Nicht-Ziel-Strang“. Der Nick kann jedoch in jeden der beiden Stränge eingeführt werden. Das heißt, der Nick könnte in den „Zielstrang“ der R- Schleife (d. h. den Strang, der mit der Protospacer-Sequenz der verlängerten gRNA hybridisiert ist) oder in den „Nicht-Zielstrang“ (d. h. den Strang, der den einzelsträngigen Abschnitt der R- Schleife bildet und der komplementär zum Zielstrang ist) eingeführt werden. In Schritt (c) interagiert das 3'-Ende des DNA-Strangs (gebildet durch den Nick) mit dem verlängerten Abschnitt der Leit-RNA, um die reverse Transkription zu primen (d. h. „Ziel-geprimte RT“). In bestimmten Ausführungsformen hybridisiert der DNA-Strang am 3'-Ende mit einer spezifischen RT-Priming-Sequenz auf dem verlängerten Abschnitt der Leit-RNA, d. h. der „Priming-Sequenz für die reverse Transkriptase“. In Schritt (d) wird eine reverse Transkriptase eingeführt (als Fusionsprotein mit dem napDNAbp oder in trans), die einen einzelnen DNA- Strang vom 3'-Ende der geprimten Stelle in Richtung des 5'-Endes der verlängerten Leit-RNA synthetisiert. Dadurch wird ein einzelsträngiger DNA-Flap gebildet, der die gewünschte Nukleotidänderung umfasst (z. B. die Änderung einer einzelnen Base, die Insertion oder die Deletion oder eine Kombination davon) und der ansonsten homolog zur endogenen DNA an oder neben der Nickstelle ist. In Schritt (e) werden das napDNAbp und die Leit-RNA freigesetzt. Die Schritte (f) und (g) beziehen sich auf die Auflösung des einzelsträngigen DNA- Flap, so dass die gewünschte Nukleotidänderung in den Ziel-Locus eingebaut wird. Dieser Prozess kann in Richtung der gewünschten Produktbildung vorangetrieben werden, indem der entsprechende endogene 5'-DNA-Flap entfernt wird (z. B. durch FEN1 oder ein ähnliches Enzym, das in trans, als Fusion mit dem Prime-Editor oder endogen bereitgestellt wird), der sich bildet, sobald der 3'-Einzelstrang-DNA-Flap in die endogene DNA-Sequenz eindringt und mit ihr hybridisiert. Ohne an eine Theorie gebunden zu sein, lösen die zelleigenen DNA- Reparatur- und Replikationsprozesse die Diskrepanz in der DNA auf, um die Nukleotidveränderung(en) einzubauen und das gewünschte veränderte Produkt zu bilden. Der Prozess kann auch durch „Zweitstrang-Nicking“ zur Produktbildung getrieben werden, wie in 1G beispielhaft verdeutlicht wird, oder mit „termporalem Zweitstrang-Nicking“, wie in 11 beispielhaft verdeutlicht und hierin erörtert wird.
  • Beim Prime-Editing können mindestens eine oder mehrere der folgenden genetischen Veränderungen vorgenommen werden: Transversionen, Transitionen, Deletionen und Insertionen. Darüber hinaus kann das Prime-Editing für bestimmte Anwendungen eingesetzt werden. Beispielsweise kann, wie hierin beschrieben und erörtert, Prime-Editing verwendet werden, um (a) mutationskorrigierende Änderungen in eine Nukleotidsequenz einzubauen, (b) Protein- und RNA-Tags einzubauen, (c) Einbauen von Immunepitopen auf Proteinen von Interesse, (d) induzierbare Dimerisierungsdomänen in Proteine einzubauen, (e) Sequenzen einzubauen oder zu entfernen, um diese Aktivität eines Biomoleküls zu verändern, (f) Rekombinase-Zielstellen einzubauen, um spezifische genetische Veränderungen zu steuern, und (g) zur Mutagenese einer Zielsequenz unter Verwendung einer fehleranfälligen RT. Neben diesen Verfahren, bei denen im Allgemeinen Nukleotidsequenzen an Zielstellen von Interesse eingefügt, verändert oder gelöscht werden, können Prime-Editoren auch zum Aufbau hochgradig programmierbarer Bibliotheken sowie zur Aufzeichnung von Zelldaten und zur Untersuchung der Abstammung verwendet werden. Die Erfinder haben auch zusätzliche Ausgestaltungen von PEgRNAs in Betracht gezogen, die darauf abzielen, die Wirksamkeit des Prime-Editing zu verbessern. Ferner haben die Erfinder Verfahren für die erfolgreiche Einschleusung von Prime-Editoren unter Verwendung von Vektoreinschleusungssystemen aufgezeigt, die ein Splitting des napDNAbp unter Verwendung von Intein-Domänen beinhalten.
  • Der Begriff „Prime-Editing System“ oder „Prime-Editor (PE)“ bezieht sich auf die Zusammensetzungen, die in dem hierin beschriebenen Verfahren des Genom-Editings unter Verwendung der Ziel-geprimten reversen Transkription (TPRT) verwendet werden, einschließlich unter anderem die napDNAbps, reverse Transkriptasen, Fusionsproteine (z. B. napDNAbps und reverse Transkriptasen umfassend), verlängerte Leit-RNAs und Komplexe, die Fusionsproteine und verlängerte Leit-RNAs umfassen, sowie Zusatzelemente, wie z. B. Zweitstrang-Nicking-Komponenten und Endonukleasen zur Entfernung von 5'-endogenen DNA-Flaps (z. B. FEN1), die dazu beitragen, den Prime-Editing-Prozess zur Bildung des editierten Produkts zu führen.
  • In einer anderen Ausführungsform stellt die schematische Darstellung in 3F die Interaktion einer typischen PEgRNA mit einer Zielstelle einer doppelsträngigen DNA und die gleichzeitige Produktion eines einzelsträngigen 3'-DNA-Flaps dar, der die gewünschte genetische Veränderung enthält. Die Doppelstrang-DNA ist so dargestellt, dass sich der obere Strang in der 3'-zu-5'-Ausrichtung und der untere Strang in der 5'-zu-3'-Richtung befindet. Der obere Strang umfasst den „Protospacer“ und die PAM-Sequenz und wird als „Zielstrang“ bezeichnet. Der komplementäre untere Strang wird als „Nicht-Zielstrang“ bezeichnet. Die abgebildete PEgRNA ist zwar nicht dargestellt, würde aber mit einem Cas9 oder einem Äquivalent komplexiert werden. Wie im Schema dargestellt, bindet der Spacer der PEgRNA an eine komplementäre Region auf dem Zielstrang, die als Protospacer bezeichnet wird und sich unmittelbar stromabwärts der PAM-Sequenz befindet und etwa 20 Nukleotide lang ist. Diese Wechselwirkung bildet ein DNA/RNA-Hybrid zwischen der Spacer-RNA und der Protospacer-DNA und führt zur Bildung einer R-Schleife in der Region gegenüber dem Protospacer. Wie an anderer Stelle hierin gelehrt, induziert das Cas9-Protein (nicht gezeigt) dann eine Einkerbung („Nick“) im Nicht-Zielstrang, wie gezeigt. Dies führt dann zur Bildung der 3' ssDNA-Flap-Region, die gemäß *z* mit dem 3'-Ende der PEgRNA an der Primer- Bindungsstelle interagiert. Das 3'-Ende des ssDNA-Flaps (d. h. die Primer-Sequenz der reversen Transkriptase) bindet an die Primer-Bindungsstelle (A) auf der PEgRNA, wodurch die reverse Transkriptase geprimt wird. Anschließend polymerisiert die reverse Transkriptase (z. B. in trans oder cis als Fusionsprotein bereitgestellt und an das Cas9-Konstrukt angehängt) einen einzelnen DNA-Strang, der durch das Edit-Templat (B) und den Homologiearm (C) kodiert wird. Die Polymerisation setzt sich zum 5'-Ende des Verlängerungsarms hin fort. Der polymerisierte ssDNA-Strang bildet einen ssDNA-3'-End-Flap, der, wie an anderer Stelle beschrieben (z. B. wie in 1G), in die endogene DNA eindringt, den entsprechenden endogenen Strang verdrängt (der als 5'-DNA-Flap von der endogenen DNA entfernt wird) und das gewünschte Nukleotid-Editing (Änderung einzelner Nukleotid-Basenpaare, Deletionen, Insertionen (die ganze Gene beinhalten)) durch natürlich auftretende DNA-Reparatur- /Replikationsrunden einbaut.
  • Diese Anwendung des Prime-Editing kann in Beispiel 1 weiter beschrieben werden.
  • Dual-Prime-Editing
  • Diese Spezifikation beschreibt ein Dual-Prime-Editing-System (oder ein Dual-Flap- Prime-Editing-System), das die Herausforderungen im Zusammenhang mit der Flap- Equilibrierung und dem anschließenden Einbau des Edits in den nicht-editierten komplementären genomischen DNA-Strang durch gleichzeitiges Editing beider DNA-Stränge löst. Beim Dual-Flap-Prime-Editing werden zwei pegRNAs verwendet, die auf entgegengesetzte Stränge einer genomischen Stelle abzielen und die Synthese von zwei komplementären 3'-Flaps ansteuern, die die editierte DNA-Sequenz enthalten (91). Im Gegensatz zum klassischen Prime-Editing muss das Paar der editierten DNA-Stränge (3'-Flaps) nicht direkt mit den 5'-Flaps der endogenen genomischen DNA konkurrieren, da stattdessen der komplementäre editierte Strang für die Hybridisierung zur Verfügung steht. Da beide Stränge des Duplex als editierte DNA synthetisiert werden, erübrigt sich beim Dual-Flap- Prime-Editing der Austausch des nicht-editierten komplementären DNA-Strangs, der beim klassischen Prime-Editing erforderlich ist. Stattdessen muss die zelluläre DNA- Reparaturmaschinerie nur die gepaarten 5'-Flaps (ursprüngliche genomische DNA) herausschneiden und die gepaarten 3'-Flaps (editierte DNA) in den Locus ligieren. Daher müssen die neu synthetisierten DNA-Stränge keine Sequenzen enthalten, die mit der genomischen DNA homolog sind, was eine selektive Hybridisierung der neuen Stränge ermöglicht und Editing mit minimaler genomischer Homologie erleichtert. Nuklease-aktive Versionen von Prime-Editoren, die beide DNA-Stränge schneiden, könnten auch verwendet werden, um die Entfernung der ursprünglichen DNA-Sequenz zu beschleunigen. Gemäß bestimmten Ausführungsformen umfasst ein Dual-Flap-Prime-Editing-System ein Paar neu synthetisierter DNA-Stränge (z. B. 3'-Flaps), die mit der endogenen DNA-Sequenz an einer zu editierenden Zielstelle homolog sind. In einigen Ausführungsformen umfasst ein Dual-Flap- Prime-Editing-System ein Paar neu synthetisierter DNA-Stränge, wobei mindestens einer der neu synthetisierten DNA-Stränge keine Homologie mit der endogenen DNA-Sequenz an der zu editierenden Zielstelle aufweist. In einigen Ausführungsformen umfasst einer der neu synthetisierten DNA-Stränge eine Homologie mit der endogenen DNA-Sequenz an der Zielstelle und nicht mit dem anderen neu synthetisierten DNA-Strang. In einigen Ausführungsformen umfasst jeder der neu synthetisierten DNA-Stränge eine Homologie mit der endogenen DNA-Sequenz an der Zielstelle und nicht mit dem anderen neu synthetisierten DNA-Strang. Zum Beispiel kann ein neu synthetisierter 3'-Flap, der von einer der Dual-Flap- pegRNAs kodiert wird, eine Region der Komplementarität zu einer Protospacer-Sequenz der anderen Dual-Flap-pegRNA umfassen. Dementsprechend kann in einigen Ausführungsformen ein Paar Dual-Flap-pegRNAs, die jeweils Komplementarität zu einer Spacer-Sequenz der anderen pegRNA aufweisen, zu einer Deletion der endogenen DNA-Sequenz führen, die zwischen den Protospacer-Sequenzen des Paares von Dual-Flap-pegRNAs liegt. In einigen Ausführungsformen umfasst ein Dual-Flap-Prime-Editing-System ein Paar neu synthetisierter DNA-Stränge, wobei keiner der neu synthetisierten DNA-Stränge eine Homologie mit der endogenen DNA-Sequenz an der zu editierenden Zielstelle aufweist. Vielmehr umfassen die beiden neu synthetisierten DNA-Stränge (z. B. 3'-Flaps) jeweils eine Region der Komplementarität zueinander und können durch die Komplementarität einen Duplex bilden. An der Zielstelle des Duplex kann dann ein gewünschter editierter Abschnitt gegenüber der zu editierenden endogenen Sequenz der DNA eingebaut werden. Wie das klassische Prime- Editing ist das Dual-Prime-Editing ein vielseitiges und präzises Verfahren zum Genom- Editing, bei dem neue genetische Informationen direkt in eine bestimmte DNA-Stelle geschrieben werden, und zwar mit Hilfe eines programmierbaren DNA-Bindungsproteins („napDNAbp“), das in Assoziation mit einer Polymerase (d. h, in Form eines Fusionsproteins oder anderweitig in trans mit dem napDNAbp bereitgestellt) funktioniert, wobei das Prime- Editing-System mit einer Prime-Editing (PE)-Leit-RNA („PEgRNA“) programmiert ist, die sowohl die Zielstelle spezifiziert als auch die Synthese des gewünschten Edits in Form eines Austausch-DNA-Strangs mittels einer auf eine Leit-RNA (z. B. am 5'- oder 3'-Ende oder an einem internen Abschnitt einer Leit-RNA) aufgebrachten Verlängerung (entweder DNA oder RNA) als Templat bereitstellt. Der Austauschstrang, der den gewünschten Edit enthält (z. B. eine einzelne Nukleobasensubstitution), weist dieselbe Sequenz auf wie der endogene Strang der zu editierenden Zielstelle (mit der Ausnahme, dass er den gewünschten Edit beinhaltet). Durch die DNA-Reparatur- und/oder Replikationsmaschinerie wird der endogene Strang der Zielstelle durch den neu synthetisierten Austauschstrang ersetzt, der den gewünschten Edit enthält. In einigen Fällen kann das Prime-Editing als eine „Suchen-und-Ersetzen“-Technologie für das Genom-Editing angesehen werden, da die Prime-Editoren, wie hierin beschrieben, nicht nur die gewünschte zu editierende Zielstelle suchen und lokalisieren, sondern gleichzeitig einen Austauschstrang kodieren, der den gewünschten Edit enthält und anstelle des entsprechenden endogenen DNA-Strangs der Zielstelle eingebaut wird.
  • B. Verwendung von Prime-Editing für Peptid-Tagging
  • In einem weiteren Aspekt stellt die Offenbarung ein Verfahren zur Verwendung der hierin beschriebenen Dual-Prime-Editoren zum genetischen Pfropfen eines oder mehrerer Peptid-Tags auf ein Protein mittels Prime-Editing bereit (wie etwa die in 90 gezeigte Ausführungsform). Insbesondere stellt die Offenbarung ein Verfahren zum genetischen Einbauen eines oder mehrerer Peptid-Tags an ein Protein bereit, das Folgendes umfasst: Inkontaktbringen einer Ziel-Nukleotidsequenz, die das Protein kodiert, mit einem Prime- Editor, der dazu konfiguriert ist, eine zweite Nukleotidsequenz, die das eine oder die mehreren Peptid-Tags kodiert, einzufügen, um eine rekombinante Nukleotidsequenz zu erhalten, die ein Fusionsprotein kodiert, das das mit dem Protein-Tag fusionierte Protein umfasst.
  • In anderen Ausführungsformen stellt die Offenbarung ein Verfahren zur Herstellung eines Fusionsproteins bereit, das ein Peptid von Interesse und eines oder mehrere Peptid-Tags umfasst, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: Inkontaktbringen einer Ziel- Nukleotidsequenz, die für das Protein kodiert, mit einem Prime-Editor, der dazu konfiguriert ist, eine zweite Nukleotidsequenz, die für den einen oder die mehreren Peptid-Tags kodiert, einzufügen, um eine rekombinante Nukleotidsequenz zu erhalten, die für das Fusionsprotein kodiert, das das mit dem Protein-Tag fusionierte Protein umfasst.
  • In verschiedenen Ausführungsformen ist die Ziel-Nukleotidsequenz ein spezifisches Gen von Interesse in einer genomischen DNA. Das Gen von Interesse kann ein Protein von Interesse kodieren (z. B. einen Rezeptor, ein Enzym, ein therapeutisches Protein, ein Membranprotein, ein Transportprotein, ein Signalübertragungsprotein oder ein immunologisches Protein usw.). Das betreffende Gen kann auch für ein RNA-Molekül kodieren, was unter anderem Boten-RNA (mRNA), Transfer-RNA (tRNA), ribosomale RNA (rRNA), kleine Kern-RNA (snRNA), Antisense-RNA, Leit-RNA, microRNA (miRNA), small interfering RNA (siRNA) und zellfreie RNA (cfRNA) beinhaltet.
  • Bei dem Peptid-Tag kann es sich um ein beliebiges Peptid-Tag oder eine Variante davon handeln, das einem Protein eine oder mehrere Funktionen verleiht, z. B. für die Trennung, Reinigung, Visualisierung, Solubilisierung oder Erkennung. Die Peptid-Tags können „Affinitäts-Tags“ (zur Erleichterung der Proteinreinigung), „Solubilisierungs-Tags“ (zur Unterstützung der richtigen Faltung von Proteinen), „Chromatographie-Tags“ (zur Veränderung der chromatographischen Eigenschaften von Proteinen), „Epitop-Tags“ (zur Bindung an hochaffine Antikörper) und „Fluoreszenz-Tags“ (zur Erleichterung der Visualisierung von Proteinen in einer Zelle oder in vitro) beinhalten. Beispiele für Peptid-Tags beinhalten unter anderem die folgenden Tags:
    NAME AMINOSÄURE-SEQUENZ SEQ-ID-NR:
    AVITAG™ GLNDIFEAQKIEWHE SEQ-ID-NR: 245
    C-TAG EPEA SEQ-ID-NR: 246
    CALMODULIN-TAG KRRWKKNFIKISAANRFKKISSSGAL SEQ-ID-NR: 247
    POLYGLUTAMAT-TAG EEEEEE SEQ-ID-NR: 248
    E-TAG GAPVPYPDPLEPR SEQ-ID-NR: 249
    FLAG-TAG DYKDDDDK SEQ-ID-NR: 250
    HA-TAG YPYDVPDYA SEQ-ID-NR: 251
    HIS-TAG H (HIS1) SEQ ID NO: 252
    HH (HIS2) SEQ ID NO: 253
    HHH (HiS3) SEQ ID NO: 254
    HHHH (HIS4) SEQ ID NO: 255
    HHHHH (HIS5) SEQ ID NO: 256
    HHHHHH (HIS6) SEQ ID NO: 257
    HHHHHHH (HIS7) SEQ ID NO: 258
    HHHHHHHH (HIS8) SEQ ID NO: 259
    HHHHHHHHH (H1S9) SEQ ID NO: 260
    HHHHHHHHHH (HIS10) SEQ ID NO: 261
    HHHHHHHHHH...H...(HISN, WHEREIN N = 1-25) SEQ ID NO: 262
    MYC-TAG EQKLISEEDL SEQ-ID-NR: 263
    NE-TAG TKENPRSNOEESYDDNES SEQ-ID-NR: 264
    RHO1D4-TAG TETSQVAPA SEQ-ID-NR: 265
    S-TAG KETAAAKFLROHMDS SEQ-ID-NR: 266
    SBP-TAG
    Figure DE112021002672T5_0221
    		 SEQ ID NO: 267
    SOFTAG-1 SLAELLNAGLGGS SEQ ID NO: 268
    SOFTAG-2 TQDPSRVG SEQ ID NO: 269
    SPOT-TAG PDRVRAVSHWSS SEQ ID NO: 270
    STREP-TAG WSHPQFEK SEQ ID NO: 271
    TC-TAG CCPGCC SEQ-ID-NR: 272
    TY-TAG EVHTNQDPLD SEQ-ID-NR: 273
    V5-TAG GKPIPNPLLGLDST SEQ-ID-NR: 274
    VSV-TAG YTDIEMNRLGK SEQ-ID-NR: 275
    XPRESS-TAG DLYDDDDK SEQ ID NO: 276
  • Bei den Peptid-Tags kann es sich auch um die folgenden Affinitäts-Tags (für die Trennung und/oder Reinigung von Proteinen) handeln (wie in Tabelle 9.9.1 von Kimple et al. „Overview of Affinity Tags for Protein Purification“, Curr Protoc Protein Sci, 2013, 73: Unit- 9.9, beschrieben, die hierin durch Bezugnahme aufgenommen ist).
    NAME AMINOSÄURE-SEQUENZ
    AU 1-EPITOP DTYRYI SEQ-ID-NR: 278
    AUS-EPITOP TDFYLK SEQ-ID-NR: 279
    BAKTERIOPHAGEN-T7- EPITOP (T7-TAG) MASMTGGQQMG SEQ-ID-NR: 280
    BLUETONGUE-VIRUS-TAG (B-TAG) QYPALT SEQ-ID-NR: 281
    E2-EPITOP SSTSSDFRDR SEQ-ID-NR: 282
    HISTIDIN-AFFINITÄTS- TAG (HAT) KDHLIHNVHKEFHAHAHNK SEQ-ID-NR: 283
    HSV-EPITOP OPELAPED SEQ-ID-NR: 284
    POLYARGININ (ARG-TAG) RRRRR SEQ-ID-NR: 285
    POLYASPARTAT (ASP-TAG) CCCC SEQ-ID-NR: 286
    POLYPHENYLALANIN (PHE-TAG) FFFFFFFFFFF SEQ-ID-NR: 287
    S1-TAG NANNPDWDF SEQ-ID-NR: 288
    S-TAG KETAAAKFERQHMDS SEQ-ID-NR: 289
    VSV-G YTDIEMNRLGK SEQ-ID-NR: 290
  • In bestimmten Ausführungsformen können die Peptid-Tags einen His6-Tag, FLAG- Tag, V5-Tag, GCN4-Tag, HA-Tag, Myc-Tag, FIAsH/ReAsH-Tag, ein Sortase-Substrat, eine pi-Klemme beinhalten.
  • In verschiedenen Ausführungsformen können die Peptid-Tags für Anwendungen verwendet werden, die Protein-Fluoreszenzmarkierung, Immunpräzipitation, Immunoblotting, Immunhistochemie, Proteinrekrutierung, induzierbare Proteindegradierung und genomweites Screening beinhalten.
  • In verschiedenen anderen Ausführungsformen kann das Peptid-Tag eine Intein- Sequenz beinhalten, um die Selbstspleißfunktion des Proteins einzubauen. Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „Intein“ auf selbstverarbeitende Polypeptiddomänen, die in Organismen aus allen Domänen des Lebens vorkommen. Ein Intein (intervenierendes Protein) führt ein einzigartiges Selbstverarbeitungsereignis durch, das als Proteinspleißen bekannt ist, bei dem es sich selbst aus einem größeren Vorläuferpolypeptid durch die Spaltung von zwei Peptidbindungen herausschneidet und dabei die flankierenden Extein-Sequenzen (externe Proteine) durch die Bildung einer neuen Peptidbindung ligiert. Diese Umlagerung erfolgt posttranslational (oder möglicherweise co-translational), da Intein-Gene in Frames innerhalb anderer proteincodierender Gene eingebettet sind. Außerdem erfolgt das Inteinvermittelte Proteinspleißen spontan; es erfordert keinen externen Faktor oder eine Energiequelle, sondern lediglich die Faltung der Intein-Domäne. Dieser Prozess wird auch als Cis-Protein-Spleißen bezeichnet, im Gegensatz zum natürlichen Prozess des Trans-Protein- Spleißens mit „Split-Inteins“. Inteins sind das Proteinäquivalent zu den selbstspleißenden RNA-Introns (siehe Perler et al., Nucleic Acids Res. Inteins sind das Proteinäquivalent zu den selbstspleißenden RNA-Introns (siehe Perler et al., Nucleic Acids Res. 22:1125-1127 (1994)), die ihre eigene Abspaltung von einem Vorläuferprotein mit der gleichzeitigen Fusion der flankierenden Proteinsequenzen, den so genannten Exteinen, katalysieren (Übersicht in Perler et al., Curr. Opin. Chem. Biol. 1 :292-299 (1997); Perler, F. B. Cell92(1):1-4 (1998); Xu et al., EMBO J. 15(19):5146-5153 (1996)).
  • Der Mechanismus des Proteinspleißprozesses ist sehr detailliert untersucht worden (Chong, et al., J. Biol. Chem. 1996, 271, 22159-22168; Xu, M-Q & Perler, F. B. EMBO Journal, 1996, 15, 5146-5153) und es wurden konservierte Aminosäuren an den Intein- und Extein-Spleißstellen gefunden (Xu, et al., EMBO Journal, 1994, 13 5517-522).
  • Inteine können auch als zwei Fragmente vorliegen, die von zwei getrennt transkribierten und übersetzten Genen kodiert werden. Diese so genannten Split-Inteine assoziieren sich selbst und katalysieren die Proteinspleißaktivität in trans. Split-Inteine wurden in verschiedenen Cyanobakterien und Archaeen nachgewiesen (Caspi et al, Mol Microbiol. 50: 1569-1577 (2003); Choi J. Et al, J Mol Biol. 556: 1093-1106 (2006.); Dassa B. Et al, Biochemistry. 46:322-330 (2007.); Liu X. Und Yang J., J Biol Chem. 275:26315-26318 (2003); WuH. Et al. Proc Natl Acad Sei USA. £5:9226-9231 (1998.); und Zettler J. Et al, FEBS Letters. 553:909-914 (2009)), wurden aber bisher noch nicht in Eukaryoten gefunden. Kürzlich wurden bei einer bioinformatischen Analyse von Umwelt-Metagenomdaten 26 verschiedene Loci mit einer neuartigen genomischen Anordnung entdeckt. An jedem Locus ist eine konservierte Enzymkodierungsregion durch ein Split-Intein unterbrochen, wobei zwischen den Abschnitten, die für Intein-Subdomänen kodieren, ein freistehendes Endonuklease-Gen eingefügt ist. Von diesen wurden fünf Loci vollständig zusammengefügt: DNA-Helikasen (gp41-1, gp41-8); Inosin- 5' Monophosphat-Dehydrogenase (IMPDH-1); und katalytische Untereinheiten der Ribonukleotid-Reduktase (NrdA-2 und NrdJ-1). Diese zersplitterte Genorganisation scheint hauptsächlich bei Phagen aufzutreten (Dassa et al, Nucleic Acids Research. 57:2560-2573 (2009)). 57:2560-2573 (2009)).
  • In bestimmten Ausführungsformen können die hierin beschriebenen Prime-Editoren dazu verwendet werden, Split-Intein-Tags in zwei verschiedene Proteine einzufügen, die bei gemeinsamer Exprimierung zur Bildung eines Fusionsproteins intrazellulär ligiert werden. Beim Trans-Splicing von Proteinen besteht ein Vorläuferprotein aus einem N-Extein-Teil, auf den das N-Intein folgt, ein anderes Vorläuferprotein besteht aus dem C-Intein, auf das ein C- Extein-Teil folgt, und eine Trans-Splicing-Reaktion (die von den N- und C-Inteinen gemeinsam katalysiert wird) schneidet die beiden Intein-Sequenzen heraus und verknüpft die beiden Extein-Sequenzen mit einer Peptidbindung. Protein-Trans-Splicing ist eine enzymatische Reaktion, die mit sehr niedrigen (z. B. Mikromolaren) Proteinkonzentrationen arbeiten kann und unter physiologischen Bedingungen durchgeführt werden kann.
  • Das Split-Intein Npu DnaE wurde als das mit der höchsten Rate charakterisiert, die für die Protein-Trans-Splicing-Reaktion berichtet wurde. Darüber hinaus gilt die Npu DnaE- Proteinspleißreaktion als robust und ertragreich in Bezug auf verschiedene Extein-Sequenzen, Temperaturen von 6 bis 37 °C und die Anwesenheit von bis zu 6 M Harnstoff (Zettler J. Et al, FEBS Letters. 553:909-914 (2009); Iwai I. Et al, FEBS Letters 550: 1853-1858 (2006)). Wie erwartet, wurde bei Einführung der Cysl-Ala-Mutation in der N-Domäne dieser Inteine die anfängliche N- zu S-Acylverschiebung und damit das Proteinspleißen blockiert. Leider wurde auch die C-terminale Spaltreaktion fast vollständig gehemmt. Die Abhängigkeit der Asparagin- Cyclisierung an der C-terminalen Spleißstelle von der Acylverschiebung an der N-terminalen spaltbaren Peptidbindung scheint eine einzigartige Eigenschaft zu sein, die den natürlich gesplitteten DnaE-Intein-Allelen gemeinsam ist (Zettler J. Et al. FEBS Letters. 555:909-914 (2009)).
  • Das Trans-Splicing von Proteinen, das durch Split-Inteine katalysiert wird, stellt ein rein enzymatisches Verfahren zur Proteinbindung bereit. Bei einem Split-Intein handelt es sich im Wesentlichen um ein zusammenhängendes Intein (z. B. Ein Mini-Intein), das in zwei Teile, das N-Intein und das C-Intein, gesplittet wird. Das N-Intein und das C-Intein eines Split-Inteins können sich nicht-kovalent verbinden, um ein aktives Intein zu bilden und die Spleißreaktion im Wesentlichen auf die gleiche Weise zu katalysieren wie ein zusammenhängendes Intein. Split-Inteine wurden in der Natur gefunden und auch in Labors hergestellt. Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „Split-Intein“ auf jedes Intein, bei dem eine oder mehrere Peptidbindungen zwischen den N-terminalen und C-terminalen Aminosäuresequenzen unterbrochen sind, so dass die N-terminalen und C-terminalen Sequenzen zu separaten Molekülen werden, die sich nicht-kovalent reassoziieren oder zu einem Intein rekonstituieren können, das für Trans-Splicing-Reaktionen funktional ist. Jedes katalytisch aktive Intein oder Fragment davon kann verwendet werden, um ein Split-Intein zur Verwendung in den erfindungsgemäßen Verfahren abzuleiten. Zum Beispiel kann in einem Aspekt das Split-Intein von einem eukaryotischen Intein abgeleitet sein. In einem anderen Aspekt kann das Split-Intein von einem bakteriellen Intein abgeleitet sein. In einem anderen Aspekt kann das Split-Intein von einem Archaeen-Intein abgeleitet sein. Vorzugsweise besitzt das so gewonnene Split- Intein nur die Aminosäuresequenzen, die für die Katalyse von Trans-Splicing-Reaktionen wesentlich sind.
  • Split-Inteine können aus zusammenhängenden Inteinen gebildet werden, indem eine oder mehrere Splitstellen in die unstrukturierte Schleife oder die dazwischen liegende Aminosäuresequenz zwischen den -12 konservierten Betasträngen, die in der Struktur der Mini-Inteine zu finden sind, eingebaut werden. Eine gewisse Flexibilität bei der Position der Spaltstellen in den Regionen zwischen den Betasträngen ist möglich, vorausgesetzt, dass die Struktur des Inteins, insbesondere die strukturierten Betastränge, durch die Schaffung der Spaltstelle nicht so stark gestört wird, dass die Proteinspleißaktivität verloren geht.
  • Die hierin beschriebenen Prime-Editoren können Peptid-Tags (einschließlich Inteins) in das C-terminale Ende eines Proteins von Interesse einbauen. In anderen Ausführungsformen können die Peptid-Tags (einschließlich Inteins) in das N-terminale Ende eines Proteins von Interesse eingebaut werden. Die Peptid-Tags können auch in das Innere eines Proteins von Interesse eingebaut werden. Die resultierenden Fusionsproteine, die mit den hierin beschriebenen Prime-Editoren hergestellt werden, können die folgenden Strukturen aufweisen:
    • [Protein von Interesse] - [Peptid-Tag];
    • [Peptid-Tag] - [Protein von Interesse]; oder
    • [Protein von Interesse - N-terminale Region] - [Peptid-Tag] - [Protein von Interesse - C-terminale Region].
  • Die Grundsätze der Ausgestaltung von Leit-RNA zur Verwendung bei der Peptidmarkierung können auch auf das Peptid-Tagging angewendet werden. Zum Beispiel kann in einer Ausführungsform die PEgRNA-Struktur für das Peptid-Tagging die folgende Struktur aufweisen: 5'-[Spacer-Sequenz]-[gRNA-Kern oder -Gerüst]-[Verlängerungsarm]-3', wobei der Verlängerungsarm in der 5'-zu-3'-Richtung einen Homologiearm, ein Edit-Templat (das die Sequenz umfasst, die das Peptid-Tag kodiert) und eine Primer-Bindungsstelle umfasst. Diese Konfiguration ist in 3D und in 24 veranschaulicht.
  • In einer anderen Ausführungsform kann die PEgRNA-Struktur für das Peptid-Tagging die folgende Struktur aufweisen: 5'-[Verlängerungsarm]-[Spacer-Sequenz]-[gRNA-Kern oder -Gerüst]-3', wobei der Verlängerungsarm in der 5'-zu-3'-Richtung einen Homologiearm, ein Edit-Templat (das die Sequenz umfasst, die den Peptid-Tag kodiert) und eine Primer- Bindungsstelle umfasst. Diese Konfiguration ist in 3E veranschaulicht.
  • Ausführungsformen des Peptid-Taggings durch Prime-Editing sind in 25 und 26 dargestellt und in Beispiel 4 beschrieben.
  • B. Verwendung von Dual-Prime-Editing für RNA-Tagging
  • Dual-Prime-Editing kann auch verwendet werden, um die Sequenzen von DNA, die RNA-Funktionen durch RNA-Tagging kodiert, zu manipulieren, zu verändern und anderweitig zu modifizieren, und stellt auf diese Weise ein Mittel bereit, um die Struktur und Funktion von RNA indirekt zu modifizieren. Dual-PE kann zum Beispiel verwendet werden, um Motive einzufügen, die auf RNA-Ebene funktionell sind (im Folgenden RNA-Motive), um nichtkodierende RNAs oder mRNAs zu markieren oder anderweitig zu manipulieren. Diese Motive könnten dazu dienen, die Genexprimierung zu erhöhen, die Genexprimierung zu verringern, das Spleißen zu verändern, die posttranskriptionelle Modifikation zu verändern, die subzelluläre Lage der RNA zu beeinflussen, die Isolierung oder Bestimmung der intra- oder extrazellulären Lage der RNA zu ermöglichen (z. B. Durch Verwendung fluoreszierender RNA-Aptamere wie Spinat, Spinat2, Baby-Spinat oder Brokkoli), endogene oder exogene Protein- oder RNA-Binder zu rekrutieren, sgRNAs einzuführen oder die Verarbeitung der RNA entweder durch Selbstspaltung oder RNAsen zu induzieren (siehe 28B und Beispiel 6 für weitere Details).
  • Die folgenden RNA-Tags oder -Motive können durch Dual-Prime-Editing (z. B. Mit dem Dual-PE-Verfahren aus 90) mit einer geeigneten PEgRNA (die nach den hierin gegebenen Anleitungen ausgestaltet wurde) in ein Gen von Interesse eingefügt werden, um verschiedene RNA-Eigenschaften zu beeinflussen, einschließlich RNA-Transport, Exprimierung, Spleißen und Erkennung.
    RNA-MOTIV SEQUENZ DES RNA-MOTIVS FUNKTION/ WIRKUNG BEISPIELHAFTE PEGRNA FÜR DIE PRIME-EDITING- INSTERTION DES RNA-MOTIVS IN DAS BEISPIELHAFTE HEXA-GEN*
    POLYOMAVIRUS AFFENVIRUS 40 (SV40) TYP1
    Figure DE112021002672T5_0222
    		 BEENDUNG DER TRANSKRIPTION DES MARKIERTEN GENS; TRANSPORT VON MRNA INS CYTOSOL; ERHÖHTE RNA- STABILITÄT UND EXPRIMIERUNG VON KODIERTEM PROTEIN
    Figure DE112021002672T5_0223
    POLYOMAVIRUS AFFENVIRUS 40 (SV40) TYP2
    Figure DE112021002672T5_0224
    		 BEENDUNG DER TRANSKRIPTION DES MARKIERTEN GENS; TRANSPORT VON MRNA INS CYTOSOL; ERHÖHTE RNA- STABILITÄT UND EXPRIMIERUNG VON KODIERTEM PROTEIN
    Figure DE112021002672T5_0225
    POLYOMAVIRUS AFFENVIRUS 40 (SV40) TYP3
    Figure DE112021002672T5_0226
    		 BEENDUNG DER TRANSKRIPTION DES MARKIERTEN GENS; TRANSPORT VON MRNA INS CYTOSOL; ERHÖHTE RNA- STABILITÄT UND EXPRIMIERUNG VON KODIERTEM PROTEIN
    Figure DE112021002672T5_0227
    Figure DE112021002672T5_0228
    HUMANES WACHSTUMSHORMON (HUMAN GROWTH HORMONE - HGH)
    Figure DE112021002672T5_0229
    		 TRANSPORT VON RNA IN DAS ZYTOPLASMA; VERBESSERTE RNA-STABILITÄT UND EXPRIMIERUNG DES KODIERTEN PROTEINS
    Figure DE112021002672T5_0230
    RINDERWACHSTUMSHORMON (BOVINE GROWTH HORMONE - BGH)
    Figure DE112021002672T5_0231
    		 TRANSPORT VON RNA IN DAS ZYTOPLASMA; VERBESSERTE RNA-STABILITÄT UND EXPRIMIERUNG DES KODIERTEN PROTEINS
    Figure DE112021002672T5_0232
    KANINCHEN- BETA-GLOBIN (RBGLOB)
    Figure DE112021002672T5_0233
    		 TRANSPORT VON RNA IN DAS ZYTOPLASMA; VERBESSERTE RNA-STABILITÄT UND EXPRIMIERUNG DES KODIERTEN PROTEINS
    Figure DE112021002672T5_0234
    Figure DE112021002672T5_0235
    THYMIDINKINASE (TK)
    Figure DE112021002672T5_0236
    		 TRANSPORT VON RNA IN DAS ZYTOPLASMA; VERBESSERTE RNA-STABILITÄT UND EXPRIMIERUNG DES KODIERTEN PROTEINS
    Figure DE112021002672T5_0237
    MALAT1 ENE- MASCRNA
    Figure DE112021002672T5_0238
    		 FÜHRT ZUR RETENTION VON RNA IM ZELLKERN, TRANSKRIPTTER MINATION UND STABILISIERUNG
    Figure DE112021002672T5_0239
    KSHV PAN ENE
    Figure DE112021002672T5_0240
    		 FÜHRT ZUR RETENTION VON RNA IM ZELLKERN, TRANSKRIPTTER MINATION UND STABILISIERUNG
    Figure DE112021002672T5_0241
    Figure DE112021002672T5_0242
    DREI SEQUENTIELLE KSHV PAN ENES MIT KURZEN, NICHT KONSERVIERTEN RNA- LINKERN
    Figure DE112021002672T5_0243
    		 FÜHRT ZUR RETENTION VON RNA IM NUKLEUS, TRANSKRIPTTER MINATION UND - STABILISIERUNG, VORAUSSICHTLIC H GRÖßER ALS EIN EINZELNES PAN ENE
    Figure DE112021002672T5_0244
    Figure DE112021002672T5_0245
    SMBOX/U1 SNRNA BOX
    Figure DE112021002672T5_0246
    		 FÜHRT ZUR RETENTION VON RNA IM NUKLEUS UND TRANSKRIPTTER MINATION
    Figure DE112021002672T5_0247
    U1 SNRNA 3' BOX
    Figure DE112021002672T5_0248
    		 FÜHRT ZUR RETENTION VON RNA IM NUKLEUS UND TRANSKRIPTTER MINATION
    Figure DE112021002672T5_0249
    TRNA-LYSIN
    Figure DE112021002672T5_0250
    		 ERMÖGLICHT BERICHTEN ZUFOLGE DEN TRANSPORT VON RNA ZU MITOCHONDRIEN
    Figure DE112021002672T5_0251
    BROKKOLI- APTAMER
    Figure DE112021002672T5_0252
    		 VISUALISIERUNG (FLUORESZENZ)
    Figure DE112021002672T5_0253
    SPINAT- APTAMER
    Figure DE112021002672T5_0254
    		 VISUALISIERUNG (FLUORESZENZ)
    Figure DE112021002672T5_0255
    SPINAT2- APTAMER
    Figure DE112021002672T5_0256
    		 VISUALISIERUNG (FLUORESZENZ)
    Figure DE112021002672T5_0257
    MANGO- APTAMER
    Figure DE112021002672T5_0258
    		 VISUALISIERUNG (FLUORESZENZ)
    Figure DE112021002672T5_0259
    HDV-RIBOZYM
    Figure DE112021002672T5_0260
    		 3'-ENDE-RNA- VERARBEITUNG
    Figure DE112021002672T5_0261
    N6- METHYLADEN OSIN-MARKER (M6A)
    Figure DE112021002672T5_0262
    		 ZIEL FÜR DIE METHYLIERUNG (UNTERSTRICHENE A SIND METHYLIERT). DIE M6A- METHYLIERUNG KANN ZU EINER VERBESSERTEN RNA-STABILITÄT UND - EXPRIMIERUNG FÜHREN, IST JEDOCH NOCH NICHT VOLLSTÄNDIG VERSTANDEN
    Figure DE112021002672T5_0263

    * jede PEgRNA ist in 5'-zu-3'-Richtung gezeigt und weist die folgenden Strukturelemente von 3F, wie nach Schriftart angegeben, wie folgt auf: 5' - Spacer-Sequenz (normale Schriftart) - gRNA-Kern (unterstrichene Sequenz) - Homologiearm (kursiv) - RT-Templat (fett gedruckt) - Primer-Bindungsstelle (kursiv) - 3'.
  • Die PEgRNAs der obigen Tabelle sind ausgestaltet, um ortsspezifisch Beispiele der obigen Motive in das HEXA-Gen (defekt bei Tay-Sachs-Krankheit) einzufügen (z. B. GenBank Nr. KR710351.1 (SEQ-ID-Nr: 369), was jedoch nur der Veranschaulichung dient. Die Verwendung von Prime-Editing beim RNA-Tagging ist nicht auf das HEXA-Gen beschränkt und kann tatsächlich beliebig sein. Die HEXA-mRNA hat die folgende Nukleotidsequenz:
    Figure DE112021002672T5_0264
  • Das entsprechende HEXA-Protein hat folgende Aminosäuresequenz:
    Figure DE112021002672T5_0265
  • Bemerkenswerterweise würden die resultierenden RNA-Motive innerhalb der translatierten Region des HEXA-Gens enthalten sein, wodurch die Funktion des Proteinkodierenden Gens unterbrochen würde. Eingefügte Polyadenylierungsmotive würden zu einer vorzeitigen Transkripttermination führen. Diese Stelle ist lediglich illustrativ für die potenziellen PEgRNAs, die zur Insertion der aufgelisteten RNA-Motive der obigen Tabelle innerhalb einer genomischen Stelle führen könnten, die transkribiert wird und somit ein RNA- Produkt produzieren würde.
  • PEgRNAs zur Verwendung mit PE zum RNA-Tagging könnten von einem U6- Promotor exprimiert werden (in diesem Fall würde ein einzelnes Guanosin an das 5'-Ende der PEgRNA für Guides hinzugefügt, die Protospacer enthalten, die nicht mit einem G und 6-7 Thymin beginnen, am 3'-Ende angefügt) oder ein Pol II-Promotor wie pCMV (in diesem Fall könnte es notwendig sein, die intrinsisch transkribierte Sequenz dieses Promotors vom 5'-Ende der RNA über ein selbstspaltendes Element oder Csy4-Motiv zu entfernen, und ein Terminationsmotiv müsste an das 3'-Ende der RNA angefügt werden, das nicht zum Export der RNA aus dem Kern führt, wie das oben aufgeführte 3'-Box-Motiv. Man beachte, dass dieses Motiv aufgrund von PE nicht in das Genom eingefügt würde, da es 3' der Hybridisierungsregion wäre). Das Kern-PEgRNA-Gerüst ist unterstrichen, die Homologie- und Hybridisierungsregionen sind kursiv gedruckt und die eingefügte Sequenz ist fett gedruckt. Man beachte, dass die eingefügte Sequenz das reverse Komplement der obigen Beispiele ist - wie unten beschrieben, weshalb diese PEgRNAs auf den kodierenden Strang gerichtet werden müssten.
  • Außerdem ist zu beachten, dass andere selbstspaltende Ribozyme als HDV in einigen Ausführungsformen auf die gegebene Zielstelle zugeschnitten werden müssen; das heißt, während HDV das kodierte Transkript sofort 5' zu sich selbst spaltet, befinden sich die Schnittstellen für alle anderen selbstspaltenden Ribozyme innerhalb des Ribozyms selbst. Daher wären die ersten und letzten ungefähr 5-10 Nukleotide (und in einigen Fällen möglicherweise mehr als 10) tatsächlich ein Teil der kodierten Sequenz. Beispielsweise würde, um die Sequenz 5'NNNNNTCATCCTGATAAACTGCAAA3' (SEQ-ID-NR: 371) nach den 5 Ns zu spalten, wobei N ein beliebiges Nukleotid ist, unter Verwendung eines selbstspaltenden Hammerhead-Ribozyms die folgende Sequenz eingefügt werden, wobei die unterstrichenen Sequenzen ein unvollkommenes RNA-Paarungselement bilden.
    Figure DE112021002672T5_0266
  • Hinsichtlich der Länge und Art dieses Paarungselements besteht eine erhebliche Flexibilität, und dies würde für jedes der in der ursprünglichen Einreichung aufgeführten selbstspaltenden Nicht-HDV-Ribozyme zutreffen. Um ein Hammerhead-Ribozym einzubauen, um die hexA-mRNA unter Verwendung einer PEgRNA mit dem gleichen Protospacer wie die oben aufgeführten Konstrukte zu spalten, könnte die folgende PEgRNA- Sequenz verwendet werden (Markierungen wie oben):
    Figure DE112021002672T5_0267
    (wobei das PEgRNA-Kerngerüst unterstrichen ist, die Homologie- und Hybridisierungsregionen kursiv und die eingefügte Sequenz fett gedruckt sind) (SEQ-ID-NR: 373).
  • Das Ausgestalten anderer PEgRNA zur Insertion von RNA-Motiven kann dem hierin beschriebenen allgemeinen Prinzip folgen. Es ist jedoch anzumerken, dass viele der RNA- Motive potenziell stark strukturiert sind, was ihre Reverse-Transkribierung und Insertion in das Genom erschweren könnte. Obwohl für einige RNA-Sequenzen, wie beispielsweise einfache Haarnadeln, sowohl die RNA-Sequenz selbst als auch ihr Komplement strukturiert sind. Es ist jedoch unwahrscheinlich, dass dies für die oben genannten Sequenzen zutrifft. Daher wäre es beim Einfügen dieser Motive höchstwahrscheinlich am besten, wenn die PEgRNA das reverse Komplement dieser Sequenzen kodiert, was dazu führt, dass die DNA-Sequenz, die das Motiv tatsächlich kodiert, in das Genom eingefügt wird. In ähnlicher Weise würde die Aufnahme eines selbstspaltenden Ribozyms in die PEgRNA-Templat-Region zu einer Verarbeitung und ineffizienter Aktivität führen, während die Aufnahme seines reversen Komplements dies nicht würde. Somit müssen diese PEgRNAs wahrscheinlich auf den kodierenden Strang abzielen, wohingegen PEgRNAs, die andere Arten von Insertionen (wie therapeutische Korrektur) kodieren, theoretisch auf jeden Strang abzielen könnten.
  • Man beachte auch, dass für viele der eingefügten Motive die resultierende PEgRNA möglicherweise nicht vom U6-Promotor transkribiert werden kann, was die Verwendung anderer Promotoren wie pCMV erfordert. In ähnlicher Weise könnten auch längere PEgRNAs weniger stabil sein. Kürzere Motive wie m6A-Marker hätten diese Herausforderung nicht.
  • D. Verwendung von Dual-Prime-Editing zum Einfügen von Immunepitopen
  • Dual-Prime-Editing (z. B. wie in der Ausführungsform in 90) kann auch als Mittel verwendet werden, um bekannte Immunogenitäts-Epitope in endogene oder fremde genomische DNA einzufügen, was zu einer Modifikation der entsprechenden Proteine für therapeutische oder biotechnologische Anwendungen führt (siehe 31 und 32) Vor der Erfindung des klassischen Prime-Editings oder Dual-Prime-Editings konnten solche Einfügungen nur ineffizient und mit hohen Informationsraten von DSBs erreicht werden. Prime-Editing löst das Problem der hohen Informationsdichte bei Insert-Edits und bietet im Allgemeinen eine höhere Effizienz als HDR. Diese niedrigere Rate der Indel-Bildung stellt einen Hauptvorteil des Prime-Editing gegenüber HDR als Verfahren für gezielte DNA- Insertionen dar, insbesondere bei der beschriebenen Anwendung der Insertion von Immunogenitätsepitopen. Die Länge der Epitope liegt im Bereich von wenigen Basen bis zu Hunderten von Basen. Prime-Editing ist ein effizienter Ansatz, um solche gezielten Insertionen in Säugetierzellen zu erreichen.
  • Das Schlüsselkonzept der Erfindung ist die Verwendung von Dual-Prime-Editoren, um eine Nukleotidsequenz, die zuvor beschriebene Immunogenitätsepitope enthält, in endogene oder fremde genomische DNA zur Herunterregulierung und/oder Zerstörung ihrer Proteinprodukte und/oder exprimierenden Zelltypen einzufügen. Nukleotidsequenzen für die immunogene Epitopinsertion würden in einer Weise auf Gene gezielt werden, um Fusionsproteine des kodierten Proteins des Ziel-Gens und der entsprechenden Proteintranslation des eingefügten immunogenen Epitops zu produzieren. Das Immunsystem des Patienten wurde zuvor darauf trainiert, diese Epitope als Ergebnis einer vorherigen Standardimmunisierung von einer routinemäßigen Impfung beispielsweise gegen Tetanus oder Diphtherie oder Masern zu erkennen. Aufgrund der immunogenen Natur der fusionierten Epitope würde erwartet, dass das Immunsystem des Patienten das prime-editierte Protein (nicht nur das eingefügte Epitop) und möglicherweise die Zellen, aus denen es exprimiert wurde, erkennt und deaktiviert.
  • Präzise Genom-Targeting-Technologien unter Verwendung des CRISPR/Cas-Systems wurden kürzlich in einer Vielzahl von Anwendungen untersucht, einschließlich der Insertion von gentechnisch veränderten DNA-Sequenzen in gezielte genomische Loci. Zuvor wurde für diese Anwendung die homologiegerichtete Reparatur (homology-directed repair - HDR) verwendet, die ein ssDNA-Donor-Templat und eine Reparaturinitiation mittels eines doppelsträngigen DNA-Bruchs (double-stranded DNA break - DSB) erforderte. Diese Strategie bietet das breiteste Spektrum möglicher Veränderungen in Zellen und ist das einzige verfügbare Verfahren, um große DNA-Sequenzen in Säugerzellen einzufügen. HDR wird jedoch durch unerwünschte zelluläre Nebenwirkungen behindert, die von seinem initiierenden DSB herrühren, wie z. B. hohe Indel-Bildung, DNA-Translokationen, große Deletionen und P53-Aktivierung. Zusätzlich zu diesen Nachteilen ist HDR in vielen Zelltypen durch eine geringe Effizienz eingeschränkt (T-Zellen sind eine bemerkenswerte Ausnahme von dieser Beobachtung). Zu den jüngsten Bemühungen, diese Nachteile zu überwinden, gehört die Fusion humaner Rad51-Mutanten mit einer Cas9-D10A-Nickase (RDN), was zu einem DSBfreien HDR-System führt, das verbesserte HDR-Produkt:Indel-Verhältnisse und ein geringeres Off-Target-Editing aufweist, aber immer noch durch Zelltyp-Abhängigkeiten und nur bescheidene HDR-Editing-Effizienz behindert wird.
  • Kürzlich entwickelte Fusionen von Cas9 mit reversen Transkriptasen („Prime- Editoren“) gekoppelt mit PEgRNAs stellen eine neuartige Genom-Editing-Technologie dar, die eine Reihe von Vorteilen gegenüber bestehenden Genom-Editing-Verfahren bietet, einschließlich der Möglichkeit, jede einzelne Nukleotid-Substitution einzubauen und jeden kurzen Abschnitt von Nukleotiden (bis zu mindestens mehreren Dutzend Basen) auf ortsspezifische Weise einzufügen oder zu löschen. Bemerkenswerterweise werden PE-Edits mit im Allgemeinen geringen Raten unbeabsichtigter Indels erreicht. Als solches ermöglicht PE gezielte, einfügebasierte Editingsanwendungen, die zuvor unmöglich oder unpraktisch waren.
  • Dieser besondere Aspekt beschreibt ein Verfahren zur Verwendung von Prime-Editing als Mittel zum Einfügen bekannter Immunogenitätsepitope in endogene oder fremde genomische DNA, was zu einer Modifikation der entsprechenden Proteine für therapeutische oder biotechnologische Anwendungen führt (siehe 31 und 32) Vor der Erfindung des Prime-Editing konnten solche Einfügungen nur ineffizient und mit hohen Informationsraten von DSBs erreicht werden. Prime-Editing löst das Problem der hohen Informationsdichte bei Insert-Edits und bietet im Allgemeinen eine höhere Effizienz als HDR. Diese niedrigere Rate der Indel-Bildung stellt einen Hauptvorteil des Prime-Editing gegenüber HDR als Verfahren für gezielte DNA-Insertionen dar, insbesondere bei der beschriebenen Anwendung der Insertion von Immunogenitätsepitopen. Die Länge der Epitope liegt im Bereich von wenigen Basen bis zu Hunderten von Basen. Prime-Editing ist die effizienteste und sauberste Technologie, um solche gezielten Insertionen in Säugetierzellen zu erreichen.
  • Das Schlüsselkonzept dieses Aspekts ist die Verwendung von Prime-Editoren, um eine Nukleotidsequenz, die zuvor beschriebene Immunogenitätsepitope enthält, in endogene oder fremde genomische DNA zur Herunterregulierung und/oder Zerstörung ihrer Proteinprodukte und/oder exprimierenden Zelltypen einzufügen. Nukleotidsequenzen für die immunogene Epitopinsertion würden in einer Weise auf Gene gezielt werden, um Fusionsproteine des kodierten Proteins des Ziel-Gens und der entsprechenden Proteintranslation des eingefügten immunogenen Epitops zu produzieren. Das Immunsystem des Patienten wurde zuvor darauf trainiert, diese Epitope als Ergebnis einer vorherigen Standardimmunisierung von einer routinemäßigen Impfung beispielsweise gegen Tetanus oder Diphtherie oder Masern zu erkennen. Aufgrund der immunogenen Natur der fusionierten Epitope würde erwartet, dass das Immunsystem des Patienten das prime-editierte Protein (nicht nur das eingefügte Epitop) und möglicherweise die Zellen, aus denen es exprimiert wurde, erkennt und deaktiviert.
  • Fusionen mit Ziel-Genen würden nach Bedarf manipuliert, um sicherzustellen, dass die Translation des inserierten Epitopproteins für die Erkennung des Immunsystems exponiert wird. Dies könnte gezielte Nukleotidinsertionen umfassen, die zu Proteintranslationen führen, die C-terminale Fusionen von Immunogenitätsepitopen mit Ziel-Genen, N-terminale Fusionen von Immunogenitätsepitopen mit Zielgenen oder die Insertion von Nukleotiden in Gene ergeben, so dass Immunogenitätsepitope innerhalb oberflächenexponierter Regionen der Proteinstruktur kodiert werden.
  • Protein-Linker, die als Nukleotide kodiert werden, die zwischen der Zielgensequenz und der eingefügten Immunogenitätsepitop-Nukleotidsequenz eingefügt sind, müssen möglicherweise als Teil dieser Erfindung konstruiert werden, um die Erkennung des Immunsystems, den Zelltransport, die Proteinfunktion oder die Proteinfaltung des Zielgens zu erleichtern. Diese inserierten Nukleotid-kodierten Protein-Linker können (unter anderem) variable Längen und Sequenzen des XTEN-Linkers oder variable Längen und Sequenzen von Glycin-Serin-Linkern umfassen. Diese konstruierten Linker wurden früher verwendet, um Proteinfusionen erfolgreich zu erleichtern. Beispielhafte Linker können jeden der hierin beschriebenen umfassen, einschließlich der Aminosäuresequenz (GGGGS)n (SEQ-ID-NR: 165), (G)n (SEQ-ID-NR: 166), (EAAAK)n (SEQ-ID-NR: 167), (GGS)n (SEQ-ID-NR: 168), (SGGS)n (SEQ-ID-NR: 169), (XP)n (SEQ-ID-NR: 170), oder eine beliebige Kombination davon, wobei n unabhängig eine ganze Zahl zwischen 1 und 30 ist und wobei X eine beliebige Aminosäure ist. In einigen Ausführungsformen umfasst der Linker die Aminosäuresequenz (GGS)n (SEQ-ID-NR: 176), wobei n 1, 3, or 7 ist. In einigen Ausführungsformen umfasst der Linker die Aminosäuresequenz SGSETPGTSESATPES (SEQ-ID-NR: 171). In einigen Ausführungsformen umfasst der Linker die Aminosäuresequenz SGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGS (SEQ-ID-NR: 172). In einigen Ausführungsformen umfasst der Linker die Aminosäuresequenz SGGSGGSGGS (SEQ-ID- NR: 173). In einigen Ausführungsformen umfasst der Linker die Aminosäuresequenz SGGS (SEQ-ID-NR: 174).
  • Unterscheidungsmerkmale dieses Aspekts schließen die Fähigkeit ein, zuvor erworbene Immunantworten auf spezifische Aminosäuresequenzen als Mittel zu verwenden, um eine Immunantwort gegen ansonsten nicht immunogene Proteine zu induzieren. Ein weiteres Unterscheidungsmerkmal ist die Fähigkeit, die Nukleotidsequenzen dieser immunogenen Epitope zielgerichtet einzufügen, so dass kein hohes Maß an unerwünschten Indels als Nebenprodukt des Editings entsteht und die Einfügung effizient erfolgt. Diese spezifische Anwendung von PE hat die Fähigkeit, zelltypspezifische Einschleusungsverfahren (wie AAV-Serotypen) zu kombinieren, um Epitope in Zelltypen zu inserieren, die für die Auslösung einer Immunantwort von Interesse sind.
  • Prime-Editing als Mittel zum Einfügen immunogener Epitope in pathogene Gene könnte verwendet werden, um das Immunsystem des Patienten so zu programmieren, dass es eine Vielzahl von Krankheiten bekämpft (nicht beschränkt auf Krebs wie bei immunonkologischen Strategien). Eine unmittelbar relevante Anwendung dieser Technologie wäre als Krebstherapeutikum, da sie den Immunfluchtmechanismus eines Tumors untergraben könnte, indem sie eine Immunantwort auf ein relevantes Onkogen wie HER2 oder Wachstumsfaktoren wie EGFR auslöst. Ein solcher Ansatz könnte dem T-Zell-Engineering ähnlich erscheinen, aber ein neuer Fortschritt dieses Ansatzes besteht darin, dass er in vielen Zelltypen und bei Krankheiten jenseits von Krebs eingesetzt werden kann, ohne dass manipulierte T-Zellen erzeugt und in Patienten eingeführt werden müssen.
  • Verwendung von PE zum Einfügen eines Immunogenitätsepitops, gegen das die meisten Menschen bereits geimpft sind (Tetanus, Keuchhusten, Diphtherie, Masern, Mumps, Röteln usw.) in ein fremdes oder endogenes Gen, das eine Krankheit verursacht, damit das Immunsystem des Patienten lernt, dieses Protein zu deaktivieren.
  • Krankheiten, die einen potenziellen therapeutischen Nutzen aus der oben genannten Strategie haben könnten, beinhalten solche, die durch Aggregation toxischer Proteine verursacht werden, wie etwa bei tödlicher familiärer Schlaflosigkeit. Andere Krankheiten, die davon profitieren könnten, beinhalten solche, die durch eine pathogene Überexprimierung eines ansonsten ungiftigen endogenen Proteins verursacht werden, und solche, die durch fremde Pathogene verursacht werden.
  • Zu den primären therapeutischen Indikationen gehören die oben erwähnten, wie Therapeutika für Krebs-, Prionen- und andere neurodegenerative Erkrankungen, Infektionskrankheiten und Präventivmedizin. Sekundäre therapeutische Indikationen können die vorbeugende Behandlung von Patienten mit spät einsetzenden genetischen Erkrankungen sein. Es wird erwartet, dass die aktuellen Standardmedikamente in Verbindung mit der Erstbehandlung bei einigen Krankheiten wie besonders aggressiven Krebsarten oder in Fällen verwendet werden, in denen Medikamente zur Linderung der Krankheitssymptome beitragen, bis die Krankheit vollständig geheilt ist. Nachfolgend Beispiele für Immunepitope, die durch die hierin offenbarten Prime-Editoren in Gene eingefügt werden können:
    VAKZIN ERKRANKUNG EPITOPE AMINOSÄURESEQUENZ BEISPIEL NUKLEINSÄURESEQUENZ (8)
    1 TETANUS TOXOID
    Figure DE112021002672T5_0268
    Figure DE112021002672T5_0269
    2 DIPHTHERI A TOXIN MUTANT CRM197
    Figure DE112021002672T5_0270
    Figure DE112021002672T5_0271
    Figure DE112021002672T5_0272
    Figure DE112021002672T5_0273
    3 MUMPS IMMUNOEPITOPE 1
    Figure DE112021002672T5_0274
    Figure DE112021002672T5_0275
    4 MUMPS IMMUNOEPITOPE 2 MUMPS IMMUNOEPITOPE 1
    Figure DE112021002672T5_0276
    Figure DE112021002672T5_0277
    SELECTED EXAMPLES FROM HEMAGGLUTININ-NEURAMINIDASE (HN) DIVERSITY AMONG OUTBREAK STRAINS (TABLE1) DIVERGENCE BETWEEN VACCINE STRAIN JL5 AND OUTBREAK STRAINS (TABLE2)
    5 RUBELLA VIRUS (RV)
    Figure DE112021002672T5_0278
    Figure DE112021002672T5_0279
    6 HEMAGGLUTININ
    Figure DE112021002672T5_0280
    Figure DE112021002672T5_0281
    7 NEURAMINIDASE
    Figure DE112021002672T5_0282
    Figure DE112021002672T5_0283
    8 TAPI (TRANSPORT ANTIGEN PRESENTATION) ON H5N1 VIRUS HEMAGGLUTININ
    Figure DE112021002672T5_0284
    Figure DE112021002672T5_0285
    9 TAP2
    Figure DE112021002672T5_0286
    Figure DE112021002672T5_0287
    (TRANSPORT ANTIGEN PRESENTATION) ON H5N1 VIRUS NEURAMINIDASE
    Figure DE112021002672T5_0288
    Figure DE112021002672T5_0289
    10 HEMAGGLUTININ EPITOPES TOWARD CLASS I HLA
    Figure DE112021002672T5_0290
    Figure DE112021002672T5_0291
    11 NEURAMINIDASE EPITOPES TOWARD CLASS I HLA
    Figure DE112021002672T5_0292
    Figure DE112021002672T5_0293
    12 HEMAGGLUTININ EPITOPES TOWARD CLASS II HLA
    Figure DE112021002672T5_0294
    Figure DE112021002672T5_0295
    13 NEURAMINIDASE EPITOPES TOWARD CLASS II HLA
    Figure DE112021002672T5_0296
    Figure DE112021002672T5_0297
    14 HEMAGGLUTININ EPITOPE H5N1- BOUND CLASS I AND CLASS II HLA
    Figure DE112021002672T5_0298
    Figure DE112021002672T5_0299
    15 NEURAMIN IDASE EPITOPE H5N1- BOUND CLASS I AND CLASS II HLA
    Figure DE112021002672T5_0300
    Figure DE112021002672T5_0301
  • Es können auch zusätzliche Immunepitope eingebaut werden, die dem Fachmann bekannt sind. Jedes der Immunepitope, die von der Immune Epitope Database and Analysis Resource (iedb.org/epitopedetails_v3.php) (deren Inhalt hierin durch Bezugnahme aufgenommen wird) verfügbar sind, kann von den hierin offenbarten Prime-Editoren eingebaut werden.
  • In einigen Ausführungsformen können die Immunepitope, die von den hierin offenbarten Prime-Editoren eingebaut werden können, eines der folgenden Epitope beinhalten:
    NR. ERKRANKUNG EPITOPE AMINOSÄURESEQUENZ SEQ -ID- NR ZUGRIFF NR.
    1 TETANUS TOXOID QYIKANSKFIGITEL 396 NA
    2 DIPHTHERIA TOXIN MUTANT CRM197
    Figure DE112021002672T5_0302
    		 428 NA
    3 MUMPS GTYRLIPNARANLTA 400 NA
    4 MUMPS PSKFFTISDSATFAPGPVSNA; PSKLFIMLDNATFAPGPVVNA 402; 404 NA
    5 RUBELLA VIRUS (RV) TPPPYQVSCGGESDRASARVIDPAAQS 406 NA
    6 HEMAGGLUTININ
    Figure DE112021002672T5_0303
    		 408 NA
    7 NEURAMINIDASE
    Figure DE112021002672T5_0304
    		 410 NA
    Figure DE112021002672T5_0305
    8 TAP (TRANSPORT ANTIGEN PRESENTATION) ON H5N1 VIRUS HEMAGGLUTININ
    Figure DE112021002672T5_0306
    		 412 NA
    9 TAP (TRANSPORT ANTIGEN PRESENTATION) ON H5N1 VIRUS NEURAMINIDASE
    Figure DE112021002672T5_0307
    		 414 NA
    10 HEMAGGLUTININ EPITOPES TOWARD CLASS I HLA
    Figure DE112021002672T5_0308
    		 416 NA
    11 NEURAMINIDASE EPITOPES TOWARD CLASS I HLA
    Figure DE112021002672T5_0309
    		 418 NA
    12 HEMAGGLUTININ EPITOPES TOWARD CLASS II HLA MVSLVKSDQIGTSTLNQR 420 NA
    13 NEURAMINIDASE EPITOPES TOWARD CLASS II HLA YNGIITDTI 422 NA
    14 HEMAGGLUTININ EPITOPE HSN1- BOUND CLASS I AND CLASS II HLA
    Figure DE112021002672T5_0310
    		 424 NA
    15 NEURAMINIDASE EPITOPE H5N1- BOUND CLASS I AND CLASS II HLA
    Figure DE112021002672T5_0311
    		 426 NA
    16 CORYNEBACTERIUM DIPHTHERIAE AACAGNRVRRSVGSSLKC 899 SRC280292
    17 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON AADHCPVVEVNGVTI 900 P69353.1
    18 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON AAHLPTGTPLD1D 901 P04851.1
    19 BORDETELLA PERTUSSIS AALAVWAGLAVQ 902 Q00879.1
    20 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON AALGVATAAQITAGI 903 P69353.1
    21 RUBELLA VIRUS STRAIN THERIEN AALLNTPPPYQVSCGGESDRATAR 904 P07566.1
    22 RUBELLA VIRUS AAQSFTGVVYGTHTT 905 BAA28178.1
    23 RUBELLA VIRUS ACEVEPAFGHSDAAC 906 BAA28178.1
    24 RUBELLA VIRUS ACTFWAVNAYSSGGY 907 BAA28178.1
    25 RUBELLA VIRUS ADDPLLR 908 BAA19893.1
    26 RUBELLA VIRUS ADDPLLRT 909 CAJ88851.1
    27 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON AEMICDIDTYIVEAG 910 P04851.1
    28 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON AEMICDIDTYIVEAGLASFI 911 P04851.1
    29 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON AEPLLSC 912 P04851.1
    30 BORDETELLA PERTUSSIS AFVSTSSSRRYTEVY 913 CAD44970.1
    31 BORDETELLA PERTUSSIS
    Figure DE112021002672T5_0312
    		 914 P04979.1
    32 RUBELLA VIRUS AGLLACCAKCLYYLR 915 BAA28178.1
    33 RUBELLA VIRUS AHTTSDPWHPPG 916 BAA19893.1
    34 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON AIAKLEDAKELLESS 917 P69353.1
    35 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON AIDNLRASLETTNQA 918 P69353.1
    36 BORDETELLA PERTUSSIS AKGVEFR 919 AC116088.1
    37 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON AKWAVPTTRTDDKLR 920 P08362.1
    38 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON ALAEVLKKPV 921 ABO69699.1
    39 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON ALGVINTLEWIPRFK 922 P08362.1
    40 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON ALHQSMLNSQAIDNL 923 P69353.1
    41 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON ALIGILSLFV 924 ABI54110.1
    42 RUBELLA VIRUS ALLNTPPPYQVSCGGESDRA 925 CAJ88851.1
    43 RUBELLA VIRUS STRAIN M33 ALLNTPPPYQVSCGGESDRASARV 926 CAJ88851.1
    44 RUBELLA VIRUS ALVEGLAPGGGNCHL 927 BAA28178.1
    45 BORDETELLA PERTUSSIS AMAAWSERAGEA 928 P04977.1
    46 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON ANCASILCKCYTTGT 929 P69353.1
    47 BORDETELLA PERTUSSIS ANPNPYTSRRSV 930 P04977.1
    48 RUBELLA VIRUS APGPGEVW 931 CAJ88851.1
    49 RUBELLA VIRUS APLPPHTTERIETRSARHPWRIR 932 ABD64214.1
    50 RUBELLA VIRUS VACCINE STRAIN RA27/3 APPMPPQPPRAHGQHYGHHHHQLPFLG 933 CAA33016.1
    51 RUBELLA VIRUS STRAIN THERIEN APPTLPQPPCAHGQHYGHHHHQLPFLG 934 P07566.1
    52 RUBELLA VIRUS APPTLPQPPRAHGQHYGHHHHQLPFLG 935 ABD64214.1
    53 BORDETELLA PERTUSSIS APQPGPQPPQPPQPQPEAPAPQ 936 P14283.3
    54 RUBELLA VIRUS AQLASYFNPGGSYYK 937 BAA28178.1
    55 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON ARAAHLPTGTPLD 938 P04851.1
    56 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON ARLVSEIAMHTTEDK 939 P04851.1
    57 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON ARLVSEIAMHTTEDKISRAV 940 P04851.1
    58 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON-B ASDVETAEGGEIHELLR 941 P03422.1
    59 MEASLES MORBILLIVIRUS ASDVETAEGGEIHELLRLQ 942 AB069699.1
    60 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON-B ASDVETAEGGEIHELLRLQSR 943 P03422.1
    61 MEASLES MORBILLIVIRUS ASDVETAEGGEIHKLLRLQ 944 AAA63285.1
    62 RUBELLA VIRUS STRAIN M33 ASDVLPGHWLQG 945 NP_740663.1
    63 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON ASELGITAEDARLVS 946 P04851.1
    64 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON ASELGITAEDARLVSEIAMH 947 P04851.1
    65 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON ASESSQDPQDSRR 948 P04851.1
    66 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON ASILCKCYTTGTIIN 949 P69353.1
    67 RUBELLA VIRUS ASPVCQRHSPDCSRL 950 BAA28178.1
    68 BORDETELLA PERTUSSIS ASQARWTGATRA 951 BAF35031.1
    69 RUBELLA VIRUS STRAIN THERIEN ASYFNPGGSYYKQYHPTACEVEPAFGHS 952 P07566.1
    70 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON ASYKVMTRSSHQSLV 953 P69353.1
    71 BORDETELLA PERTUSSIS ASYVKKPKEDVD 954 ACI16088.1
    72 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON ATAAQITAGIALHQS 955 P69353.1
    73 RUBELLA VIRUS ATPERPRL 956 CAJ88851.1
    74 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON AVCLGGLIGIPALIC 957 P69353.1
    75 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON AVGPRQAQVSF 958 P04851.1
    76 RUBELLA VIRUS AVNAYSSGGYAQLAS 959 BAA28178.1
    77 RUBELLA VIRUS AVSETRQTWAEWAAA 960 BAA28178.1
    78 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON AVTAPDTAADSELRR 961 P04851.1
    79 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON AVTAPDTAADSELRRWIKYT 962 P04851.1
    80 BORDETELLA PERTUSSIS AYGGIIKDAPPGAGFIYRETFC 963 P04979.1
    81 RUBELLA VIRUS CALPLAGLLACCAKC 964 BAA28178.1
    82 RUBELLA VIRUS CARIWNGTQRACTFW 965 BAA28178.1
    83 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON CARTLVSGSFGNRFI 966 P69353.1
    84 BORDETELLA PERTUSSIS CASPYEGRYRDMYDALRBRLLY 967 SRC280066
    85 BORDETELLA PERTUSSIS CAVFVRSGQPVIGA 968 AAA83981.1
    86 RUBELLA VIRUS CCAKCLYYLRGAIAPR 969 BAA28178.1
    87 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON CCRGRCNKKGEQVGM 970 P69353.1
    88 RUBELLA VIRUS CEIPTDVSCEGLGAW 971 BAA28178.1
    89 BORDETELLA PERTUSSIS CFGKDLKRPGSSPMEV 972 P0A3R5.1
    90 MEASLES MORBILLIVIRUS CFQQACKGK1QALCE 973 P06830.1
    91 MEASLES MORBILLIVIRUS
    Figure DE112021002672T5_0313
    		 974 AAR89413.1
    92 RUBELLA VIRUS CGGESDRASARVIDP 975 BAA28178.1
    93 BORDETELLA PERTUSSIS CITTIYKTGQPAADHYYSKVTA 976 P04979.1
    94 MEASLES MORBILLIVIRUS CKGKIQALCENPEWA 977 AAR89413.1
    95 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON CKPWQESRKNKAQ 978 P04851.1
    96 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON CNKKGEQVGMSRPGL 979 P69353.1
    97 RUBELLA VIRUS CNVTTEHPFCNTPHG 980 BAA28178.1
    98 BORDETELLA PERTUSSIS CQVGSSNSAF 981 P04977.1
    99 MEASLES MORBILLIVIRUS CSGPTTIRGQFS 982 P08362.1
    100 BORDETELLA PERTUSSIS CTSPYDGKYWSMYSRL 983 AAA83981.1
    101 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON CVLADSESGGHITHS 984 P08362.1
    102 MEASLES MORBILLIVIRUS CYTTGTIINQDPDKILTYIAADHC 985 AAF02706.1
    103 RUBELLA VIRUS DADDPLLR 986 CAJ88851.1
    104 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON DARAAHLPTGTPLDI 987 P04851.1
    105 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON DARAAHLPTGTPLDIDTASE 988 P04851.1
    106 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON DCHAPTYLPAEVDGD 989 P08362.1
    107 RUBELLA VIRUS DCSRLVGATPERPRL 990 BAA28178.1
    108 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON DDKLRMETCFQQACK 991 P08362.1
    109 RUBELLA VIRUS DDPLLRTA 992 CAJ88851.1
    110 RUBELLA VIRUS DDPLLRTAPGPGEVW 993 BAA28178.1
    111 BORDETELLA PERTUSSIS DDPPATVYRYD 994 P04977.1
    112 BORDETELLA PERTUSSIS DDPPATVYRYDSRPPED 995 CAD44970.1
    113 BORDETELLA PERTUSSIS DDPPATVYRYDSRPPEDV 996 ACI04548.1
    114 MEASLES MORBILLIVIRUS DEVGLRTPQRFTDLV 997 P06830.1
    115 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON DHCPVVEVNGVTIQV 998 P69353.1
    116 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON DIDTASESSQDPQ 999 P04851.1
    117 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON DINKVLEKLGYSGGD 1000 P69353.1
    118 BORDETELLA PERTUSSIS DLIAYKQ 1001 ACI16088.1
    119 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON DLIGQKLGLKLLRYY 1002 P69353.1
    120 RUBELLA VIRUS DLQKALEAQSRALRAELAA 1003 P07566.1
    121 MEASLES MORBILLIVIRUS DLQYVLATYDTSRVE 1004 P06830.1
    122 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON DLSLRRFMV 1005 P04851.1
    123 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON DLSNCMVALGELKLA 1006 P08362.1
    124 RUBELLA VIRUS DLVEYIMNYTGNQQSRWGLGSPNC 1007 CAJ88851.1
    125 MEASLES MORBILLIVIRUS DLVKFISDKIKFLNP 1008 AAR89413.1
    126 MEASLES MORBILLIVIRUS DLVKFISTKIKFLNP 1009 SRC280117
    127 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON DLYKSNHNNV 1010 P08362.1
    128 BORDETELLA PERTUSSIS DNVLDHLTGR 1011 ACI04548.1
    129 BORDETELLA PERTUSSIS DNVLDHLTGRSC 1012 P04977.1
    130 BORDETELLA PERTUSSIS DNVLDHLTGRSCQ 1013 P04977.1
    131 MEASLES MORBILLIVIRUS DPDKILTYIAA 1014 AAF02706.1
    132 RUBELLA VIRUS STRAIN THERIEN DPGDLVEYIMNYTGNQQSR 1015 P07566.1
    133 RUBELLA VIRUS DPLLRTAP 1016 CAJ88851.1
    134 RUBELLA VIRUS DPLLRTAPGPGEVWVTPVIGSQ 1017 CAJ88851.1
    135 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON DPQDSRRSAEPLL 1018 P04851.1
    136 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON DPVIDRLYLSSHRGV 1019 P08362.1
    137 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON DQILRSMKGLSSTSI 1020 P69353.1
    138 MEASLES MORBILLIVIRUS DQYCADVAAEELMNA 1021 P06830.1
    139 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON DSESGGHITH 1022 P08362.1
    140 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON DTASESSQDPQDS 1023 P04851.1
    141 RUBELLA VIRUS DTVMSVFALASYVQH 1024 BAA28178.1
    142 BORDETELLA PERTUSSIS DVFQNGFTAWGNND 1025 P04977.1
    143 RUBELLA VIRUS DVGAVPPGKFVTAAL 1026 BAA28178.1
    144 CORYNEBACTERIUM DIPHTHERIAE DVNKSKTHISVNGRKI 1027 CAE11230.1
    145 RUBELLA VIRUS DVSCEGLGAWVPAAP 1028 BAA28178.1
    146 RUBELLA VIRUS STRAIN THERIEN DWASPVCQRHSPDCSRLVGATPERPRL 1029 P07566.1
    147 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON EARESYRETGPSR 1030 P04851.1
    148 BORDETELLA PERTUSSIS EAVEAERAGRGTG 1031 ACI04548.1
    149 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON EDAKELLESSDQILR 1032 P69353.1
    150 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON EDRRVKQSRGEAR 1033 P04851.1
    151 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON EDSITIPYQGSGKGV 1034 P08362.1
    152 RUBELLA VIRUS EEAFTYLCTAPGCAT 1035 BAA28178.1
    153 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON EGFNMILGTILAQIW 1036 P04851.1
    154 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON EGFNMILGTILAQIWVLLAK 1037 P04851.1
    155 RUBELLA VIRUS EHPFCNTPHGQLEVQ 1038 BAA28178.1
    156 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON EISDIEVQDPEGFNM 1039 P04851.1
    157 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON EISDIEVQDPEGFNMILGTI 1040 P04851.1
    158 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON EKPNLSSKRSE 1041 P08362.1
    159 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON ELKLAALCHGEDSIT 1042 P08362.1
    160 MEASLES MORBILLIVIRUS ELMNALVNSTLLETR 1043 P06830.1
    161 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON ELPRL 1044 P04851.1
    162 MEASLES MORBILLIVIRUS ENPEWAPLKDNRIPSYGVLSVDL 1045 AAR89413.1
    163 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON EPIRDALNAMTQNIR 1046 P69353.1
    164 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON EQVGMSRPGLKPDLT 1047 P69353.1
    165 RUBELLA VIRUS ERPRLRLV 1048 CAJ88851.1
    166 RUBELLA VIRUS ERPRLRLVDADDPLL 1049 BAA28178.1
    167 MEASLES VIRUS CAM/RB ESPGQLIQRITDDPDVS 1050 P04851.1
    168 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON ESRGIKARITHVDTE 1051 P69353.1
    169 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON ESSCTFMPEGTVCSQ 1052 P69353.1
    170 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON ESSQDPQDSRRSA 1053 P04851.1
    171 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON ETRTTNQFLAVSKGN 1054 P08362.1
    172 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON EVDGDVKLSSNLVIL 1055 P08362.1
    173 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON-B EVNGVTIQV 1056 P26031.1
    174 RUBELLA VIRUS EVWVTPVI 1057 CAJ88851.1
    175 RUBELLA VIRUS EVWVTPVIGSQA 1058 BAA19893.1
    176 RUBELLA VIRUS EWAAAHWWQLTLGAT 1059 BAA28178.1
    177 MEASLES MORBILLIVIRUS EWIPRFKVSPYLFTV 1060 P06830.1
    178 BORDETELLA PERTUSSIS FEYVDTYGDNAG 1061 P04977.1
    179 MEASLES MORBILLIVIRUS FGPLITHGSGMDLYK 1062 P06830.1
    180 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON FIFDALAEV 1063 ABK40531.1
    181 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON FISDKIKFL 1064 P08362.1
    182 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON FKRNKDKPPITSGSG 1065 P04851.1
    183 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON FKRNKDKPPITSGSGGAIRG 1066 P04851.1
    184 RUBELLA VIRUS FKTVRPVALPRTLAP 1067 BAA28178.1
    185 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON FLMDRHIIV 1068 ABK40531.1
    186 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON FMAVLLTLQTPTGQI 1069 P69353.1
    187 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON FMPEGTVCSQNALYP 1070 P69353.1
    188 MEASLES MORBILLIVIRUS FMYMSLLGV 1071 AAN09804.1
    189 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON FNVPIKEAGEDCHAP 1072 P08362.1
    190 MEASLES MORBILLIVIRUS FRDLTWCINPPERIK 1073 AAC35876.2
    191 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON FSHDDPISSDQSRFG 1074 P04851.1
    192 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON FSHDDPISSDQSRFGWFENK 1075 P04851.1
    193 MEASLES MORBILLIVIRUS FTDLVKFISDKIKFL 1076 P06830.1
    194 MEASLES MORBILLIVIRUS FTWDQKLWCRHFCVL 1077 P06830.1
    195 BORDETELLA PERTUSSIS
    Figure DE112021002672T5_0314
    		 1078 SRC280066
    196 BORDETELLA PERTUSSIS
    Figure DE112021002672T5_0315
    		 1079 SRC280066
    197 MEASLES MORBILLIVIRUS FYKDNPHPKGSRIVI 1080 P06830.1
    198 BORDETELLA PERTUSSIS GAASSYFEYVDTYG 1081 ACI04548.1
    199 BORDETELLA PERTUSSIS GAFDLKTTFCIMTTRNTGQPA 1082 AAA83981.1
    200 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON GALIGILSLFVESPG 1083 P04851.1
    201 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON GALIGILSLFVESPGQLIQR 1084 P04851.1
    202 RUBELLA VIRUS GATPERPR 1085 CAJ88851.1
    203 BORDETELLA PERTUSSIS GAYGRCPNGTRALTVAELRGNAEL 1086 P04979.1
    204 RUBELLA VIRUS GCFAPWDLEATGACI 1087 BAA28178.1
    205 MEASLES MORBILLIVIRUS GDINKVLEKLGYS 1088 BAB60865.1
    206 MEASLES MORBILLIVIRUS GDINKVLEKLGYSGGDLLG 1089 AAL29688.1
    207 RUBELLA VIRUS GDLRAVHHRPVPA 1090 CAA28880.1
    208 RUBELLA VIRUS GDLVEYIMNYTGNQQ 1091 BAA28178.1
    209 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON GDSSITTRSRLLDRL 1092 P04851.1
    210 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON GDSSITTRSRLLDRLVRLIG 1093 P04851.1
    211 MEASLES MORBILLIVIRUS GEDCHAPTYLPAEVD 1094 P06830.1
    212 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON GELSTLESLMNLYQQ 1095 P04851.1
    213 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON GELSTLESLMNLYQQMGKPA 1096 P04851.1
    214 MUMPS RUBULAVIRUS GEQARYLALLEA 1097 P21186.1
    215 RUBELLA VIRUS GEVWVT 1098 BAA19893.1
    216 RUBELLA VIRUS GEVWVTPV 1099 CAJ88851.1
    217 RUBELLA VIRUS GEVWVTPVIGSQAR 1100 BAA19893.1
    218 BORDETELLA PERTUSSIS GEYGGVIKDGTPGGA 1101 AAA83981.1
    219 RUBELLA VIRUS GFLSGVGPMRLRHGADT 1102 SRC265968
    220 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON-B GFRASDVETAEGGEIHELLRLQ 1103 P03422.1
    221 BORDETELLA PERTUSSIS GGAVPGGAVPGGAVPGGFGPGGFGP 1104 P14283.3
    222 BORDETELLA PERTUSSIS GGAVPGGAVPGGFGPGGFGPGGFGP 1105 CAA09475.1
    223 BORDETELLA PERTUSSIS
    Figure DE112021002672T5_0316
    		 1106 CAA09474.1
    224 MEASLES MORBILLIVIRUS GGHITHSGMVGMGVS 1107 P06830.1
    225 MEASLES MORBILLIVIRUS GILESRGIKARITHVDTESY 1108 P26032.1
    226 BORDETELLA PERTUSSIS GITGETTTTEYSNARYV 1109 CAD44970.1
    227 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON GKEDRRVKQSRGE 1110 P04851.1
    228 BORDETELLA PERTUSSIS GKVTNGS 1111 ACI16088.1
    229 RUBELLA VIRUS GLGAWVPAAPCARIW 1112 BAA28178.1
    230 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON GL1G1PAL1CCCRGR 1113 P69353.1
    231 RUBELLA VIRUS STRAIN THERIEN GLLACCAKCLYYLRGAIAPR 1114 P07566.1
    232 MEASLES MORBILLIVIRUS GLLAIAGIRLHRAAI 1115 P06830.1
    233 RUBELLA VIRUS GLQPRADMAAPPTLPQ 1116 NP_740663.1
    234 MEASLES MORBILLIVIRUS GMGVSCTVTREDGTNRR 1117 AAR89413.1
    235 MEASLES MORBILLIVIRUS GMYGGTYLVEKP 1118 AAR89413.1
    236 BORDETELLA PERTUSSIS GNAELQTYLRQITPGWSIYGLYDGTYLG 1119 P04979.1
    237 RUBELLA VIRUS GNCHLTVNGEDVGAV 1120 BAA28178.1
    238 BORDETELLA PERTUSSIS GNNDNVLDHLTGR 1121 P04977.1
    239 BORDETELLA PERTUSSIS GNNDNVLDHLTGRSC 1122 P04977.1
    240 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON GNRFILSQGNLIANC 1123 P69353.1
    241 RUBELLA VIRUS
    Figure DE112021002672T5_0317
    		 1124 P07566.1
    242 RUBELLA VIRUS GPGEVWVT 1125 CAJ88851.1
    243 RUBELLA VIRUS STRAIN THERIEN GPMRLRHGADTRCGRLI 1126 P07566.1
    244 BORDETELLA PERTUSSIS GPNHTKV 1127 ACI16083.1
    245 MEASLES VIRUS STRAIN HALLE GPRQAQVSF 1128 P10050.1
    246 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON GPRQAQVSFLQGDQS 1129 P04851.1
    247 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON GPRQAQVSFLQGDQSENELP 1130 P04851.1
    248 MEASLES MORBILLIVIRUS GRGYNVSSIVTMTSQ 1131 P06830.1
    249 BORDETELLA PERTUSSIS GRTPFII 1132 ACI16083.1
    250 RUBELLA VIRUS GSPNCHGPDWASPVC 1133 BAA28178.1
    251 RUBELLA VIRUS GSQARKCGLHIRAGP 1134 BAA28178.1
    252 BORDETELLA PERTUSSIS GSSNSAFVSTSSSRR 1135 P04977.1
    253 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON GSTKSCARTLVSGSF 1136 P69353.1
    254 RUBELLA VIRUS GSYYKQYHPTACEVE 1137 BAA28178.1
    255 RUBELLA VIRUS GTHTTAVSETRQTWA 1138 BAA28178.1
    256 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON GTIINQDPDKILTYI 1139 P69353.1
    257 BORDETELLA PERTUSSIS GTLVRMAPVIG 1140 ADA85124.1
    258 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON GTPLDIDTASESS 1141 P04851.1
    259 BORDETELLA PERTUSSIS GTYLGQAYGGIIKDAPPGAGFIYRETFC 1142 P04979.1
    260 BORDETELLA PERTUSSIS GVATKGLGVHAKSSDWG 1143 P15318.2
    261 CORYNEBACTERIUM DIPHTHERIAE GVLLPTIPGKLDVNKSKTHI 1144 AAV70486.1
    262 MEASLES MORBILLIVIRUS GVLSVDLSLTVELKI 1145 P06830.1
    263 MEASLES MORBILLIVIRUS GVPIELQVECFTWDQ 1146 P06830.1
    264 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON GVSCTVTREDGTNRR 1147 P08362.1
    265 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON GVSYNIGSQEWYTTV 1148 P69353.1
    266 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON GYNVSSIVTMTSQGM 1149 P08362.1
    267 MEASLES MORBILLIVIRUS HFCVLADSESGGHIT 1150 P06830.1
    268 MEASLES MORBILLIVIRUS HGEDSITIPYQGSGK 1151 P06830.1
    269 RUBELLA VIRUS HGPDWASP 1152 BAA19893.1
    270 RUBELLA VIRUS HGPDWASPVCQRHSP 1153 BAA28178.1
    271 RUBELLA VIRUS HGPDWASPVCQRHSPDCSRLVG 1154 CAJ88851.1
    272 RUBELLA VIRUS STRAIN M33
    Figure DE112021002672T5_0318
    		 1155 CAJ88851.1
    273 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON HITHSGMEGMGVSCT 1156 P08362.1
    274 MEASLES MORBILLIVIRUS HKSLSTNLDVTNSIE 1157 P06830.1
    275 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON HLMIDRPYV 1158 P08362.1
    276 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON HLPTGTPLDIDTA 1159 P04851.1
    277 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON-B HLPTGTPLDIDTATESSQDPQDSR 1160 Q77M43.1
    278 MEASLES MORBILLIVIRUS HMTNYLEQPVSNDLS 1161 P06830.1
    279 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON HQSLVIKLMPNITLL 1162 P69353.1
    280 MEASLES MORBILLIVIRUS HRAAIYTAEIHKSLS 1163 P06830.1
    281 BORDETELLA PERTUSSIS HRMQEAVEAERAGRGTGH 1164 P04977.1
    282 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON HVDTESYFIVLSIAY 1165 P69353.1
    283 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON HWGNLSKIGVVGIGS 1166 P69353.1
    284 RUBELLA VIRUS HWWQLTLGATCALPL 1167 BAA28178.1
    285 RUBELLA VIRUS HYRNASDVLPGHWLQGGWGCYNL 1168 NP_740663.1
    286 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON IDLGPPISLERLDVG 1169 P69353.1
    287 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON IEAIRQAGQEMILAV 1170 P69353.1
    288 RUBELLA VIRUS STRAIN M33 IETRSARHP 1171 CAA28880.1
    289 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON IGSQEWYTTVPKYVA 1172 P69353.1
    290 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON IKGVIVHRLEGVSYN 1173 P69353.1
    291 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON IKHIIIVPIPGDSSI 1174 P04851.1
    292 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON IKHIIIVPIPGDSSITTRSR 1175 P04851.1
    293 BORDETELLA PERTUSSIS IKLKDCP 1176 ACI16083.1
    294 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON IKLMPNITLLNNCTR 1177 P69353.1
    295 MEASLES MORBILLIVIRUS ILLERLDVGT 1178 AAF85664.1
    296 MEASLES MORBILLIVIRUS ILPGQDLQYV 1179 P08362.1
    297 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON ILTYIAADHCPVVEV 1180 P69353.1
    298 MEASLES MORBILLIVIRUS INQDPDKILTY 1181 AAL29688.1
    299 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON IPRFKVSPYLFNVPI 1182 P08362.1
    300 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON IQALSYALGGDINKV 1183 P69353.1
    301 RUBELLA VIRUS IRAGPYGHATVEMPE 1184 BAA28178.1
    302 BORDETELLA PERTUSSIS IRMGTDK 1185 ACI16088.1
    303 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON ISNFDESSCTFMPEG 1186 P69353.1
    304 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON ITAGIALHQSMLNSQ 1187 P69353.1
    305 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON ITDDPDVSIRLLEVV 1188 P04851.1
    306 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON ITDDPDVSIRLLEVVQSDQS 1189 P04851.1
    307 BORDETELLA PERTUSSIS ITTYV 1190 ACI16083.1
    308 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON IVEAGLASFILTIKF 1191 P04851.1
    309 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON IVEAGLASFILTIKFGIETM 1192 P04851.1
    310 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON IVEAGLASFILTIKFGIETMYPALG 1193 P04851.1
    311 RUBELLA VIRUS KALEAQSRALRAELAA 1194 P07566.1
    312 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON KARITHVDTESYFIV 1195 P69353.1
    313 RUBELLA VIRUS KCGLHIRAGPYGHAT 1196 BAA28178.1
    314 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON KCYTTGTIINQDPDK 1197 P69353.1
    315 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON KDNPHPKGSR 1198 P08362.1
    316 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON KDNRIPSYGVLSVDL 1199 P08362.1
    317 MEASLES MORBILLIVIRUS KFLNPDREYDFRDLT 1200 AAC35876.2
    318 RUBELLA VIRUS KFVTAALLN 1201 BAA28178.1
    319 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON KGNCSGPTTIR 1202 P08362.1
    320 MEASLES MORBILLIVIRUS KIKFLNPDREYDFRD 1203 P06830.1
    321 RUBELLA VIRUS KIVDGGCFAPWDLEA 1204 BAA28178.1
    322 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON KLGLKLLRYYTEILS 1205 P69353.1
    323 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON KLGVWKSPTDMQSWV 1206 P08362.1
    324 BORDETELLA PERTUSSIS KLKECPQ 1207 ACI16088.1
    325 MEASLES MORBILLIVIRUS KLLRYYTEI 1208 P26031.1
    326 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON KLMPFSGDFV 1209 ABK40531.1
    327 MEASLES MORBILLIVIRUS KLMPNITLL 1210 P26031.1
    328 MEASLES MORBILLIVIRUS KLRMETCFQQACKGKIQALCENPEWA 1211 AAR89413.1
    329 MEASLES MORBILLIVIRUS KLWCRHFCV 1212 P08362.1
    330 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON KLWCRHFCVL 1213 P08362.1
    331 MEASLES MORBILLIVIRUS KLWESPQEI 1214 BAB60863.1
    332 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON KMSSAVGFV 1215 ABO69699.1
    333 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON-B KMSSAVGFVPDTGPASR 1216 P03422.1
    334 BORDETELLA PERTUSSIS KMVYATN 1217 ACI16083.1
    335 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON KPDLTGTSKSYVRSL 1218 P69353.1
    336 MEASLES MORBILLIVIRUS KPNLSSKRSELSQLS 1219 P08362.1
    337 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON KPNLSSKRSELSQLSMYRVF 1220 P08362.1
    338 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON KQSRGEARESYRETG 1221 P04851.1
    339 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON KQSRGEARESYRETGPSRAS 1222 P04851.1
    340 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON KRFAGVVLAGAALGV 1223 P69353.1
    341 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON KRTPGNKPRIAEMIC 1224 P04851.1
    342 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON KRTPGNKPRIAEMICDIDTY 1225 P04851.1
    343 MEASLES MORBILLIVIRUS KSNHNNVYWLTIPPMKNLALGVINTL 1226 AAR89413.1
    344 MEASLES MORBILLIVIRUS KVSPYLFNV 1227 P08362.1
    345 BORDETELLA PERTUSSIS KVVQLPKISKNALKANG 1228 ACI16083.1
    346 BORDETELLA PERTUSSIS KWQLPKISKNALRNDG 1229 ACI16087.1
    347 BORDETELLA PERTUSSIS LAHRRIPPENIR 1230 P04977.1
    348 BORDETELLA PERTUSSIS LALALWAGFALS 1231 P11092.1
    349 RUBELLA VIRUS LAPGGGNCHLTVNGE 1232 BAA28178.1
    350 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON LAQIWVLLAKAVTAP 1233 P04851.1
    351 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON LAQIWVLLAKAVTAPDTAAD 1234 P04851.1
    352 RUBELLA VIRUS
    Figure DE112021002672T5_0319
    		 1235 BAA19893.1
    353 MEASLES MORBILLIVIRUS LAVSKGNCSGPTTIR 1236 P06830.1
    354 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON LCENPEWAPLKDNRI 1237 P08362.1
    355 MEASLES MORBILLIVIRUS LDRLVRLIG 1238 ABI54110.1
    356 CORYNEBACTERIUM DIPHTHERIAE LEEEGVTPL 1239 P33120.2
    357 BORDETELLA PERTUSSIS LEHRMQEAVEAERAGRGTGHFI 1240 CAD44970.1
    358 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON LEKLGYSGGDLLGIL 1241 P69353.1
    359 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON LEQPVSNDLS 1242 P08362.1
    360 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON LERKWLDVVRNIIAE 1243 P04851.1
    361 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON LERKWLDVVRNIIAEDLSLR 1244 P04851.1
    362 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON LFGPSLRDPISAEIS 1245 P69353.1
    363 MEASLES MORBILLIVIRUS LGELKLAALCHGEDS 1246 P06830.1
    364 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON LGGKEDRRVKQSR 1247 P04851.1
    365 RUBELLA VIRUS LGHDGHHGGTLRVGQHHRNASDVL 1248 ABD64214.1
    366 RUBELLA VIRUS STRAIN THERIEN LGSPNCHGPDWASPVCQRHS 1249 P07566.1
    367 RUBELLA VIRUS STRAIN THERIEN LGSPNCHGPDWASPVCQRHSPDCSRLV 1250 P07566.1
    368 RUBELLA VIRUS LHDPDTEAPTEACVTSWL 1251 ABD64214.1
    369 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON LIANCASILCKCYTT 1252 P69353.1
    370 MEASLES MORBILLIVIRUS LIGLLAIAGIRLHRAAIYTAEIHK 1253 AAR89413.1
    371 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON LIPSMNQLSCDLIGQ 1254 P69353.1
    372 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON LKIKIASGFGPLITH 1255 P08362.1
    373 MEASLES MORBILLIVIRUS LKIKIASGFGPLITHGSGMDLYK 1256 AAR89413.1
    374 BORDETELLA PERTUSSIS LKLYFEP 1257 ACI16088.1
    375 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON LLAVLFVMFL 1258 P08362.1
    376 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON LLDRLVRLIGNPDVS 1259 P04851.1
    377 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON LLDRLVRLIGNPDVSGPKLT 1260 P04851.1
    378 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON LLESSDQILRSMKGL 1261 P69353.1
    379 MEASLES MORBILLIVIRUS LLETRTTNQFLAVSK 1262 P06830.1
    380 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON LLEWQSDQSQSGLT 1263 P04851.1
    381 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON LLEVVQSDQSQSGLTFASR 1264 P04851.1
    382 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON LLEVVQSDQSQSGLTFASRG 1265 P04851.1
    383 MEASLES MORBILLIVIRUS LLGILESRGIKARIT 1266 AAL29688.1
    384 RUBELLA VIRUS LLRTAPGP 1267 CAJ88851.1
    385 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON LLRYYTEILSLFGPS 1268 P69353.1
    386 RUBELLA VIRUS STRAIN THERIEN LLVPWVLIFMVCRRACRRRG 1269 P07566.1
    387 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON LLWRSRCKIV 1270 ABK40528.1
    388 MEASLES MORBILLIVIRUS LLWSYAMGV 1271 P04851.1
    389 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON LLWSYAMGVGVELEN 1272 P04851.1
    390 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON LLWSYAMGVGVELENSMGGL 1273 P04851.1
    391 MEASLES MORBILLIVIRUS LMIDRPYVL 1274 P08362.1
    392 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON LNAMTQNIRPVQSVA 1275 P69353.1
    393 RUBELLA VIRUS LNTPPPYQVSCGGES 1276 BAA28178.1
    394 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON LRDPISAEISIQALS 1277 P69353.1
    395 BORDETELLA PERTUSSIS LRGSGDLQEYLRHVTR 1278 AAA83981.1
    396 RUBELLA VIRUS LRLVDADD 1279 CAJ88851.1
    397 RUBELLA VIRUS LRLVDADDPLLR 1280 BAA19893.1
    398 RUBELLA VIRUS
    Figure DE112021002672T5_0320
    		 1281 BAA19893.1
    399 BORDETELLA PERTUSSIS
    Figure DE112021002672T5_0321
    		 1282 P04979.1
    400 RUBELLA VIRUS LRTAPGPG 1283 CAJ88851.1
    401 RUBELLA VIRUS LRVGQHYRNASDVLPGHWLQ 1284 NP_740663.1
    402 BORDETELLA PERTUSSIS LRYLA 1285 ACI16088.1
    403 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON LSCKPWQESRKNK 1286 P04851.1
    404 MEASLES MORBILLIVIRUS LSEIKGVIVHRLEGV 1287 AAL29688.1
    405 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON LSIAYPTLSEIKGVI 1288 P69353.1
    406 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON LSLLDLYLGRGYNVS 1289 P08362.1
    407 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON LSQGNLIANCASILC 1290 P69353.1
    408 MEASLES MORBILLIVIRUS LSSHRGVIADNQAKW 1291 P06830.1
    409 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON LSVDLSLTVELKIKI 1292 P08362.1
    410 BORDETELLA PERTUSSIS LTGISICNPGSSLC 1293 AAA83981.1
    411 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON LTIKFGIETMYPALG 1294 P04851.1
    412 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON LTIKFGIETMYPALGLHEFA 1295 P04851.1
    413 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON LTLQTPTGQIHWGNL 1296 P69353.1
    414 RUBELLA VIRUS LVDADDPL 1297 CAJ88851.1
    415 RUBELLA VIRUS LVDADDPLLR 1298 BAA19893.1
    416 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON LVEKPNLSSKRSELS 1299 P08362.1
    417 RUBELLA VIRUS LVGATPE 1300 BAA19893.1
    418 RUBELLA VIRUS LVGATPER 1301 CAJ88851.1
    419 MEASLES MORBILLIVIRUS LVKLGVWKSPTGMQS 1302 P06830.1
    420 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON-B LVSGSFGNRFILSQGNLI 1303 P26031.1
    421 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON LYKSNHNNVYWLTIP 1304 P08362.1
    422 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON LYPMSPLLQECLRGSTKSCARTLVS 1305 P69353.1
    423 RUBELLA VIRUS MASTTPITMEDLQKALEA 1306 P07566.1
    424 RUBELLA VIRUS MASTTPITMEDLQKALEAQSR 1307 ABD64200.1
    425 RUBELLA VIRUS STRAIN THERIEN
    Figure DE112021002672T5_0322
    		 1308 P07566.1
    426 RUBELLA VIRUS
    Figure DE112021002672T5_0323
    		 1309 ABD64200.1
    427 RUBELLA VIRUS VACCINE STRAIN RA27/3
    Figure DE112021002672T5_0324
    		 1310 CAA33016.1
    428 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON MATLLRSLALFKRNK 1311 P04851.1
    429 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON MATLLRSLALFKRNKDKPPI 1312 P04851.1
    430 MEASLES MORBILLIVIRUS MDLYKSNHNNVYWLT 1313 P06830.1
    431 RUBELLA VIRUS MEDLQKALEAQSRA 1314 P07566.1
    432 RUBELLA VIRUS MEDLQKALEAQSRALRAELAA 1315 P07566.1
    433 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON MGLKVNVSAIFMAVL 1316 P69353.1
    434 MEASLES MORBILLIVIRUS MIDRPYVLLAVLFVM 1317 P06830.1
    435 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON MILAVQGVQDYINNE 1318 P69353.1
    436 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON MLNSQAIDNLRASLE 1319 P69353.1
    437 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON MNALVNSTLLETRTT 1320 P08362.1
    438 RUBELLA VIRUS
    Figure DE112021002672T5_0325
    		 1321 BAA19893.1
    439 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON MQSWVPLSTDDPVID 1322 P08362.1
    440 MEASLES MORBILLIVIRUS MSLSLLDLYLGRGYN 1323 P06830.1
    441 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON MSPLLQECLRGSTKS 1324 P69353.1
    442 MEASLES MORBILLIVIRUS MSPQRDRINAFYKDN 1325 P06830.1
    443 MEASLES MORBILLIVIRUS MYRVFEVSVIRNPGL 1326 P06830.1
    444 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON NALYPMSPLLQECLR 1327 P69353.1
    445 RUBELLA VIRUS STRAIN THERIEN NCHGPDWASPVCQRHSPDCSRLVGAT 1328 P07566.1
    446 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON NFGRSYFDPAYFRLG 1329 P04851.1
    447 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON NFGRSYFDPAYFRLGQEMVR 1330 P04851.1
    448 RUBELLA VIRUS NGTQRACTFWAVNAY 1331 BAA28178.1
    449 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON NGVTIQVGSRRYPDA 1332 P69353.1
    450 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON NIIAEDLSLRRFMVA 1333 P04851.1
    451 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON NIIAEDLSLRRFMVALILDI 1334 P04851.1
    452 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON NITLLNNCTRVEIAE 1335 P69353.1
    453 MEASLES MORBILLIVIRUS NLALGVINTLEWIPR 1336 P06830.1
    454 CORYNEBACTERIU M DIPHTHERIAE NLFQVVHWSYNRPAYSPG 1337 SRC280292
    455 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON NLVILPGQDLQYVLA 1338 P08362.1
    456 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON NLYQQMGKPAPYMVN 1339 P04851.1
    457 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON NLYQQMGKPAPYMVNLENSI 1340 P04851.1
    458 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON NNCTRVEIAEYRRLL 1341 P69353.1
    459 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON NPDREYDFRD 1342 P08362.1
    460 MEASLES VIRUS STRAIN HALLE NPDVSGPKL 1343 P10050.1
    461 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON NPDVSGPKLTGALIG 1344 P04851.1
    462 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON NPDVSGPKLTGALIGILSLF 1345 P04851.1
    463 MEASLES MORBILLIVIRUS NPPERIKLDYDQYCA 1346 P06830.1
    464 MEASLES MORBILLIVIRUS NQAKWAVPTTRTDDK 1347 P06830.1
    465 MEASLES MORBILLIVIRUS NQDPDKILTYIAADH 1348 AAF02706.1
    466 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON NQLSCDLIGQKLGLK 1349 P69353.1
    467 RUBELLA VIRUS NQQSRWGLGSPNCHGPDWASPVCQRHS 1350 ABD64214.1
    468 MUMPS RUBULAVIRUS NSTLGVKSAREF 1351 ABP48111.1
    469 RUBELLA VIRUS NTPHGQLEVQVPPDP 1352 BAA28178.1
    470 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON NVSAIFMAVLLTLQT 1353 P69353.1
    471 MEASLES MORBILLIVIRUS PAEVDGDVKLSSNLV 1354 P06830.1
    472 RUBELLA VIRUS PAFGHSDAACWGFPT 1355 BAA28178.1
    473 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON PALICCCRGRCNKKG 1356 P69353.1
    474 MEASLES MORBILLIVIRUS PDKILTYIAADHC 1357 AAF02706.1
    475 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON PERIKLDYDQYCADV 1358 P08362.1
    476 RUBELLA VIRUS PERPRLRL 1359 CAJ88851.1
    477 RUBELLA VIRUS PGCATQAPVPVRLAG 1360 BAA28178.1
    478 RUBELLA VIRUS VACCINE STRAIN RA27/3
    Figure DE112021002672T5_0326
    		 1361 CAJ88851.1
    479 RUBELLA VIRUS PGEVWVTP 1362 CAJ88851.1
    480 RUBELLA VIRUS PGEVWVTPVIGSQAR 1363 BAA28178.1
    481 CORYNEBACTERIUM DIPHTHERIAE PGKLDVNKSKTHISVN 1364 CAE11230.1
    482 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON PGLGAPVFHMTNYLE 1365 P08362.1
    483 RUBELLA VIRUS PGPGEVWV 1366 CAJ88851.1
    484 RUBELLA VIRUS PHKTVRVKFHTETRT 1367 BAA28178.1
    485 MEASLES MORBILLIVIRUS PIELQVECFTWDQKL 1368 AAR89413.1
    486 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON-B PISLERLDVG 1369 P26031.1
    487 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON PISLERLDVGTNLGN 1370 P69353.1
    488 BORDETELLA PERTUSSIS PKALFTQQGGAYGRC 1371 P04979.1
    489 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON PKYVATQGYLISNFD 1372 P69353.1
    490 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON PLDIDTASESSQD 1373 P04851.1
    491 RUBELLA VIRUS PLGLKFKTVRPVALP 1374 BAA28178.1
    492 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON PLITHGSGMDLYKSN 1375 P08362.1
    493 MEASLES MORBILLIVIRUS PLKDNRIPSYGVLSV 1376 P06830.1
    494 RUBELLA VIRUS PLLRTAPG 1377 CAJ88851.1
    495 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON PLLSCKPWQESRK 1378 P04851.1
    496 BORDETELLA PERTUSSIS PPATVYRYDSRPPE 1379 P04977.1
    497 MEASLES MORBILLIVIRUS PPISLERLDVGT 1380 AAL29688.1
    498 RUBELLA VIRUS PPPPEERQETRSQTPAPKPS 1381 P07566.1
    499 BORDETELLA PERTUSSIS PQEQITQHGSPYGRC 1382 AAA83981.1
    500 BORDETELLA PERTUSSIS PQEQITQHGSPYGRCANK 1383 AAA83981.1
    501 BORDETELLA PERTUSSIS PQPGPQPPQPPQPQPEAPAPQPPAG 1384 P14283.3
    502 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON PRLGGKEDRRVKQ 1385 P04851.1
    503 RUBELLA VIRUS PRLRLVDA 1386 CAJ88851.1
    504 RUBELLA VIRUS PRNVRVTGCYQCGTP 1387 BAA28178.1
    505 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON PSRASDARAAHLP 1388 P04851.1
    506 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON PTGQIHWGNLSKIGV 1389 P69353.1
    507 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON PTGTPLDIDTASE 1390 P04851.1
    508 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON PTLSEIKGVIVHRLE 1391 P69353.1
    509 MEASLES MORBILLIVIRUS PTTIRGQFSNMSLSL 1392 P06830.1
    510 MEASLES MORBILLIVIRUS PTTRTDDKLR 1393 AAR89413.1
    511 MEASLES MORBILLIVIRUS PTTRTDDKLRMETCFQQACKG 1394 AAR89413.1
    512 RUBELLA VIRUS PVALPRTLAPPRNVR 1395 BAA28178.1
    513 CORYNEBACTERIUM DIPHTHERIAE PVFAGANYAAWAVNVAQVI 1396 AAV70486.1
    514 RUBELLA VIRUS PVTGSQAR 1397 CAJ88851.1
    515 MEASLES MORBILLIVIRUS PVVEVNGVTIQVGSR 1398 AAL29688.1
    516 RUBELLA VIRUS STRAIN THERIEN PWELV VLTARPEDGWTCRGV 1399 P07566.1
    517 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON PWQESRKNKAQTR 1400 P04851.1
    518 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON PYMVNLENSIQNKFS 1401 P04851.1
    519 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON PYMVNLENSIQNKFSAGSYP 1402 P04851.1
    520 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON PYQGSGKGVS 1403 P08362.1
    521 RUBELLA VIRUS PYQVSCGGESDRASA 1404 BAA28178.1
    522 MEASLES MORBILLIVIRUS QACKGKIQALCEN 1405 P08362.1
    523 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON QAGQEMILAVQGVQD 1406 P69353.1
    524 MEASLES MORBILLIVIRUS QALCENPECVPLKDN 1407 P06830.1
    525 BORDETELLA PERTUSSIS QALGALK 1408 ACI16088.1
    526 RUBELLA VIRUS QAPVPVRLAGVRFES 1409 BAA28178.1
    527 RUBELLA VIRUS QCGTPALVEGLAPGG 1410 BAA28178.1
    528 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON QDPDKILTYIAADHC 1411 P69353.1
    529 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON QECLRGSTKSCARTL 1412 P69353.1
    530 BORDETELLA PERTUSSIS QEQITQHGSPYGRC 1413 AAA83981.1
    531 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON QESRKNKAQTRTP 1414 P04851.1
    532 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON QGDQSENELPRLGGK 1415 P04851.1
    533 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON QGDQSENELPRLGGKEDRRV 1416 P04851.1
    534 CORYNEBACTERIUM DIPHTHERIAE QGESGHDIKITAENTPLPIA 1417 AAV70486.1
    535 MEASLES MORBILLIVIRUS QGSGKGVSFQLVKLG 1418 P06830.1
    536 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON QGVQDY1NNEL1PSM 1419 P69353.1
    537 RUBELLA VIRUS QLEVQVPPDPGDLVE 1420 BAA28178.1
    538 MEASLES MORBILLIVIRUS QLPEATFMV 1421 ABK40528.1
    539 RUBELLA VIRUS QLPFLGHDGHHGGTLRVGQHYRNAS 1422 NP_740663.1
    540 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON QLSMYRVFEV 1423 P08362.1
    541 BORDETELLA PERTUSSIS QLSNIT 1424 ACI16083.1
    542 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON QNIRPVQSVASSRRH 1425 P69353.1
    543 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON QNKFSAGSYPLLWSY 1426 P04851.1
    544 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON QNKFSAGSYPLLWSYAMGVG 1427 P04851.1
    545 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON QNKFSAGSYPLLWSYAMGVGVELEN 1428 P04851.1
    546 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON QQACKGKIQALCENP 1429 P08362.1
    547 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON QQRRVVGEFRLERKW 1430 P04851.1
    548 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON QQRRVVGEFRLERKWLDVVR 1431 P04851.1
    549 BORDETELLA PERTUSSIS QQTRANPNPYTSRRSVAS 1432 P04977.1
    550 RUBELLA VIRUS QRHSPDCSRLVGATP 1433 BAA28178.1
    551 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON QSGLTFASRGTNMED 1434 P04851.1
    552 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON QSGLTFASRGTNMEDEADQY 1435 P04851.1
    553 CORYNEBACTERIUM DIPHTHERIAE QSIALSSLMVAQAIPLVGEL 1436 AAV70486.1
    554 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON QSRFGWFENKEISDI 1437 P04851.1
    555 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON QSRFGWFENKEISDIEVQDP 1438 P04851.1
    556 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON QSRGEAR 1439 P04851.1
    557 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON QSRGEARESYRETGPSRA 1440 P04851.1
    558 RUBELLA VIRUS STRAIN THERIEN QTGRGGSAPRPELGPPTN 1441 P07566.1
    559 RUBELLA VIRUS STRAIN THERIEN QTPAPKPSRAPPQQPQPPRMQTGRG 1442 P07566.1
    560 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON QVGSRRYPDAVYLHR 1443 P69353.1
    561 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON QVSFLQGDQSENE 1444 P04851.1
    562 RUBELLA VIRUS QYHPTACEVEPAFGH 1445 BAA28178.1
    563 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON QYVLATYDTSRVEHA 1446 P08362.1
    564 BORDETELLA PERTUSSIS RANPNPYTSRRSV 1447 ACI04548.1
    565 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON RASDARAAHLPTG 1448 P04851.1
    566 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON RASLETTNQAIEAIR 1449 P69353.1
    567 RUBELLA VIRUS STRAIN THERIEN RCGRLICGLSTTAQYPPTRF 1450 P07566.1
    568 BORDETELLA PERTUSSIS RDGQSVIGACASPYEGRYR 1451 P04979.1
    569 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON RESYRETGPSRAS 1452 P04851.1
    570 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON RETGPSRASDARA 1453 P04851.1
    571 MUMPS RUBULAVIRUS RFAKYQQQGRLEAR 1454 P21186.1
    572 RUBELLA VIRUS STRAIN THERIEN RFGAPQAFLAGLLLATVAVGTARA 1455 P07566.1
    573 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON RFMVALILDIKRTPG 1456 P04851.1
    574 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON RFMVALILDIKRTPGNKPRI 1457 P04851.1
    575 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON RGEARESYRETGP 1458 P04851.1
    576 RUBELLA VIRUS RGTTPPAYG 1459 CAA28880.1
    577 RUBELLA VIRUS STRAIN M33 RIETRSARH 1460 ABD64214.1
    578 BORDETELLA PERTUSSIS RILAGALATYQ 1461 P04977.1
    579 BORDETELLA PERTUSSIS RIPPENIRRVT 1462 ACI04548.1
    580 BORDETELLA PERTUSSIS RISNLND 1463 ACI16083.1
    581 BORDETELLA PERTUSSIS RLANLNG 1464 ACI16088.1
    582 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON RLDVGTNLGNAIAKL 1465 P69353.1
    583 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON RLERKWLDV 1466 P04851.1
    584 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON RLGGKEDRRVKQSRG 1467 P04851.1
    585 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON RLGGKEDRRVKQSRGEARES 1468 P04851.1
    586 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON RLLDRLVRL 1469 ABI54110.1
    587 RUBELLA VIRUS RLRLVDAD 1470 CAJ88851.1
    588 RUBELLA VIRUS RLRLVDADDPLLR 1471 BAA19893.1
    589 RUBELLA VIRUS
    Figure DE112021002672T5_0327
    		 1472 BAA19893.1
    590 RUBELLA VIRUS
    Figure DE112021002672T5_0328
    		 1473 SRC265968
    591 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON RLSDNGYYTV 1474 ABK40528.1
    592 RUBELLA VIRUS RLVDADDP 1475 CAJ88851.1
    593 RUBELLA VIRUS RLVDADDPLLRTAPG 1476 BAA28178.1
    594 RUBELLA VIRUS RLVGATPE 1477 CAJ88851.1
    595 RUBELLA VIRUS RMQTGRGGSAPRPELGPPTNPFQAAVA 1478 ABD64216.1
    596 MEASLES MORBILLIVIRUS RMSKGVFKV 1479 ABY21184.1
    597 MEASLES MORBILLIVIRUS RNPGLGAPVFHMTNY 1480 P06830.1
    598 RUBELLA VIRUS RPRLRLVD 1481 CAJ88851.1
    599 BORDETELLA PERTUSSIS RQAESSEAMAAWSERAGEA 1482 P04977.1
    600 RUBELLA VIRUS RQTWAEWAAAHWWQL 1483 BAA28178.1
    601 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON RRVKQSRGEARES 1484 P04851.1
    602 MEASLES MORBILLIVIRUS RRYPDAVYL 1485 ACA09725.1
    603 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON RRYPDAVYLHRIDLG 1486 P69353.1
    604 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON RSAGKVSSTLASELG 1487 P04851.1
    605 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON RSAGKVSSTLASELGITAED 1488 P04851.1
    606 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON RSELSQLS 1489 P08362.1
    607 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON RSELSQLSMYRVFEV 1490 P08362.1
    608 RUBELLA VIRUS RSQTPAPKPSRAPPQQPQPPRMQT 1491 ABD64214.1
    609 RUBELLA VIRUS RTAPGPGE 1492 CAJ88851.1
    610 RUBELLA VIRUS RTAPGPGEVWVTPVI 1493 BAA28178.1
    611 MEASLES MORBILLIVIRUS RTDDKLRMETCFQQA 1494 P06830.1
    612 RUBELLA VIRUS RTLAPPRNVRVTGCY 1495 BAA28178.1
    613 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON RTVLEPIRDALNAMT 1496 P69353.1
    614 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON RVEHAVVYYVYSPSR 1497 P08362.1
    615 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON RVFEVGVIRNPGLGA 1498 P08362.1
    616 BORDETELLA PERTUSSIS RVHVSKEEQYYDYEDATFE 1499 P04978.2
    617 RUBELLA VIRUS RVIDPAAQ 1500 BAA28178.1
    618 RUBELLA VIRUS RVKFHTETRTVWQLS 1501 BAA28178.1
    619 BORDETELLA PERTUSSIS RVYHNGITGET 1502 ACI04548.1
    620 BORDETELLA PERTUSSIS RYDSRPPEDVF 1503 ACI04548.1
    621 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON RYPDAVYLHRIDLGP 1504 P69353.1
    622 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON SAEIS1QALSYALGG 1505 P69353.1
    623 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON SAEPLLSCKPWQESR 1506 P04851.1
    624 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON SAEPLLSCKPWQESRKNKAQ 1507 P04851.1
    625 MEASLES MORBILLIVIRUS SAGKVSSTLASELG 1508 P04851.1
    626 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON SAGKVSSTLASELGITAEDARLVS 1509 P04851.1
    627 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON SCTVTREDGT 1510 P08362.1
    628 RUBELLA VIRUS SDAACWGFPTDTVMS 1511 BAA28178.1
    629 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON SDARAAHLPTGTP 1512 P04851.1
    630 RUBELLA VIRUS STRAIN THERIEN SDWHQGTHVCHTKHMDFWCVEHD 1513 P07566.1
    631 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON SELRRWIKYTQQRRV 1514 P04851.1
    632 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON SELRRWIKYTQQRRVVGEFR 1515 P04851.1
    633 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON SELSQL 1516 P08362.1
    634 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON SELSQLS 1517 P08362.1
    635 BORDETELLA PERTUSSIS SEYLAHRRIPPENIRRVTRV 1518 CAD44970.1
    636 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON SFLQGDQSENELP 1519 P04851.1
    637 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON SGKGVSFQLVKLGVW 1520 P08362.1
    638 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON SHRGVIADNQAKWAV 1521 P08362.1
    639 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON SIEHQVKDVLTPLFK 1522 P08362.1
    640 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON SKIGVVGIGSASYKV 1523 P69353.1
    641 MEASLES MORBILLIVIRUS SKRSELSQLSMYRVF 1524 P06830.1
    642 MEASLES MORBILLIVIRUS SLFVESPGQLIQRITDDPDVS 1525 ABI54110.1
    643 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON SLSTNLDVTNSIEHQ 1526 P08362.1
    644 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON SLSTNLDVTNSIEHQVKDVLTPLFK 1527 P08362.1
    645 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON SLWGSGLLML 1528 BAE98296.1
    646 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON SMKGLSSTSIVYILI 1529 P69353.1
    647 MEASLES MORBILLIVIRUS SMYRVFEVGV 1530 P08362.1
    648 MEASLES MORBILLIVIRUS SNDLSNCMVALGELK 1531 P06830.1
    649 MEASLES VIRUS STRAIN HALLE SPGQLIQR 1532 P10050.1
    650 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON SQDPQDSRRSAEP 1533 P04851.1
    651 MEASLES MORBILLIVIRUS SRIVINREHLMIDRP 1534 P06830.1
    652 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON SRKNKAQTRTPLQ 1535 P04851.1
    653 RUBELLA VIRUS SRLVGATP 1536 CAJ88851.1
    654 RUBELLA VIRUS SRLVGATPERPRLRLVDADDPLLR 1537 CAJ88851.1
    655 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON SRPGLKPDLTGTSKS 1538 P69353.1
    656 BORDETELLA PERTUSSIS SRRSVASIVGTLVRM 1539 CAD44970.1
    657 RUBELLA VIRUS SRWGLGSPNCHGPDW 1540 BAA28178.1
    658 BORDETELLA PERTUSSIS SSATK 1541 ACI16088.1
    659 RUBELLA VIRUS SSGGYAQLASYFNPG 1542 BAA28178.1
    660 BORDETELLA PERTUSSIS SSLGNGV 1543 ACI16083.1
    661 MEASLES MORBILLIVIRUS SSNLUILPGQDLQYV 1544 P06830.1
    662 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON SSQDPQDSRRSAEPL 1545 P04851.1
    663 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON SSQDPQDSRRSAEPLLSCKP 1546 P04851.1
    664 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON SSRRHKRFAGVVLAG 1547 P69353.1
    665 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON SSTSIVYILIAVCLG 1548 P69353.1
    666 BORDETELLA PERTUSSIS STPGIVI 1549 AAA83981.1
    667 BORDETELLA PERTUSSIS STPGIVIPPQEQITQHGSPYGRC 1550 AAA83981.1
    668 BORDETELLA PERTUSSIS STSSSRRYTEVY 1551 P04977.1
    669 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON SYFIVLSIAYPTLSE 1552 P69353.1
    670 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON SYRETGPSRASDA 1553 P04851.1
    671 BORDETELLA PERTUSSIS SYVK 1554 ACI16083.1
    672 RUBELLA VIRUS SYVQHPHKTVRVKFH 1555 BAA28178.1
    673 RUBELLA VIRUS TAPGPGEV 1556 CAJ88851.1
    674 BORDETELLA PERTUSSIS TATRLLSSTNSRLC 1557 AAA83981.1
    675 MEASLES MORBILLIVIRUS TDDPVIDRLYLSSHR 1558 P06830.1
    676 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON TEILSLFGPSLRDPI 1559 P69353.1
    677 RUBELLA VIRUS TETRTVWQLSVAGVS 1560 BAA28178.1
    678 BORDETELLA PERTUSSIS TEVYLEHRMQEAVE 1561 P04977.1
    679 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON TFMPEGTVCSQNALY 1562 P69353.1
    680 RUBELLA VIRUS TGACICEIPTDVSCE 1563 BAA28178.1
    681 BORDETELLA PERTUSSIS TGDLRAY 1564 AC116083.1
    682 MEASLES MORBILLIVIRUS TGMQSWVPLSTDDPV 1565 P06830.1
    683 RUBELLA VIRUS TGNQQSRWGLGSPNC 1566 BAA28178.1
    684 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON TGPSRASDARAAH 1567 P04851.1
    685 MEASLES MORBILLIVIRUS TGTIINQDPDKILTY 1568 AAF02706.1
    686 RUBELLA VIRUS TGVVYGTHTTAVSET 1569 BAA28178.1
    687 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON TIRGQFSNMSLSLLD 1570 P08362.1
    688 RUBELLA VIRUS TLGATCALPLAGLLA 1571 BAA28178.1
    689 MEASLES MORBILLIVIRUS TLLNNCTRV 1572 P26031.1
    690 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON-B TLNVPPPPDPGR 1573 P03422.1
    691 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON-B TLNVPPPPDPGRASTSGTPIKK 1574 P03422.1
    692 MEASLES MORBILLIVIRUS TMTSQGMYGGTYPVE 1575 P06830.1
    693 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON TNLGNAIAKLEDAKE 1576 P69353.1
    694 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON TNMEDEADQYFSHDD 1577 P04851.1
    695 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON TNMEDEADQYFSHDDPISSD 1578 P04851.1
    696 RUBELLA VIRUS STRAIN M33 TNPFQAAVARGLRPP 1579 CAA28880.1
    697 MEASLES MORBILLIVIRUS TNSIEHQVKDVLTPL 1580 P06830.1
    698 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON TNYLEQPVSNDLSNC 1581 P08362.1
    699 MEASLES MORBILLIVIRUS TNYLEQPVSNDLSNCMVALGELKLAAL 1582 AAR89413.1
    700 RUBELLA VIRUS TPERPRLR 1583 CAJ88851.1
    701 RUBELLA VIRUS STRAIN THERIEN TPERPRLRLVDADDPLLRTA 1584 P07566.1
    702 MEASLES VIRUS STRAIN HALLE TPGNKPRIA 1585 P10050.1
    703 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON TPLDIDTASESSQDP 1586 P04851.1
    704 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON TPLDIDTASESSQDPQDSRR 1587 P04851.1
    705 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON TPLFKTTGDEVGLRT 1588 P08362.1
    706 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON TPLQCTM 1589 P04851.1
    707 RUBELLA VIRUS TPVIGSQA 1590 CAJ88851.1
    708 RUBELLA VIRUS TPVIGSQARK 1591 BAA19893.1
    709 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON TQGYLISNFDESSCT 1592 P69353.1
    710 BORDETELLA PERTUSSIS TRANPNPYTSRRSVASIVGTLVRM 1593 P04977.1
    711 RUBELLA VIRUS TRFGCAMRWGLPP 1594 NP_740663.1
    712 BORDETELLA PERTUSSIS TRNTGQPATDHYYSNV 1595 AAA83981.1
    713 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON TRTPLQCTMTEIF 1596 P04851.1
    714 RUBELLA VIRUS TRWHRLLRMPVR 1597 ABD64216.1
    715 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON TSGSGGAIRGIKHII 1598 P04851.1
    716 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON TSGSGGAIRGIKHIIIVPIP 1599 P04851.1
    717 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON TSQGMYGGTYLVEKP 1600 P08362.1
    718 MEASLES MORBILLIVIRUS TSRVEHAVVYYVYSP 1601 P06830.1
    719 BORDETELLA PERTUSSIS TSSSRRYTEVYL 1602 ACI04548.1
    720 BORDETELLA PERTUSSIS TSYVG 1603 ACI16088.1
    721 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON TTEDKISRAVGPRQA 1604 P04851.1
    722 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON TTEDKISRAVGPRQAQVSFL 1605 P04851.1
    723 RUBELLA VIRUS STRAIN M33 TTERIETRSARHP 1606 ABD64214.1
    724 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON TTNQAIEAIRQAGQE 1607 P69353.1
    725 RUBELLA VIRUS TTSDPWHPPGPLGLK 1608 BAA28178.1
    726 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON TVCSQNALYPMSPLL 1609 P69353.1
    727 RUBELLA VIRUS TVNGEDVGAVPPGKF 1610 BAA28178.1
    728 MEASLES MORBILLIVIRUS TYPVEKPNLSSKRSE 1611 P06830.1
    729 RUBELLA VIRUS VAGVSCNVTTEHPFC 1612 BAA28178.1
    730 BORDETELLA PERTUSSIS VAPGIVIPPKALFTQQGGAYGRC 1613 P04979.1
    731 RUBELLA VIRUS VCHTKHMDFWCVEHDRPPPATPTPL 1614 NP_740663.1
    732 RUBELLA VIRUS VCQRHSPDCSRLVGATPER 1615 BAA19893.1
    733 RUBELLA VIRUS VDADDPLL 1616 CAJ88851.1
    734 RUBELLA VIRUS VDADDPLLRTAPGPGEVWVT 1617 BAA19893.1
    735 CORYNEBACTERIUM DIPHTHERIAE VDIGFAAYNFVESIINLFQV 1618 AAV70486.1
    736 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON VEIAEYRRLLRTVLE 1619 P69353.1
    737 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON VELENSMGGLNFGRS 1620 P04851.1
    738 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON VELENSMGGLNFGRSYFDPA 1621 P04851.1
    739 MEASLES MORBILLIVIRUS VELKIKIASGFGPLI 1622 P06830.1
    740 RUBELLA VIRUS VEMDEWIHAHTTSD 1623 SRC265968
    741 RUBELLA VIRUS VEMPEWIHAHTTSDP 1624 BAA28178.1
    742 CORYNEBACTERIUM DIPHTHERIAE VERRLVKVL 1625 P33120.2
    743 MEASLES MORBILLIVIRUS VESPGQLI 1626 ABI54110.1
    744 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON VESPGQLIQRITDDP 1627 P04851.1
    745 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON VESPGQLIQRITDDPDVSIR 1628 P04851.1
    746 RUBELLA VIRUS VFALASYVQHPHKTV 1629 BAA28178.1
    747 RUBELLA VIRUS VGATPERP 1630 CAJ88851.1
    748 RUBELLA VIRUS VGATPERPRL 1631 BAA19893.1
    749 RUBELLA VIRUS VGATPERPRLRLVDA 1632 BAA28178.1
    750 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON VGIGSASYKVMTRSS 1633 P69353.1
    751 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON VGLRTPQRFTDLVKF 1634 P08362.1
    752 CORYNEBACTERIUM DIPHTHERIAE VHHNTEEIVAQSIALSSLMV 1635 AAV70486.1
    753 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON VHRLEGVSYNIGSQE 1636 P69353.1
    754 RUBELLA VIRUS VIGSQARK 1637 CAJ88851.1
    755 BORDETELLA PERTUSSIS VITGSI 1638 ACI16088.1
    756 BORDETELLA PERTUSSIS VITGTI 1639 ACI16083.1
    757 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON VKQSRGEA 1640 P04851.1
    758 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON VLFVMFLSLI 1641 P08362.1
    759 MEASLES MORBILLIVIRUS VLFVMFLSLIGLLAI 1642 P06830.1
    760 MEASLES MORBILLIVIRUS VLTPLFKIIGDEVGL 1643 P06830.1
    761 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON VMTRSSHQSLVIKLM 1644 P69353.1
    762 RUBELLA VIRUS VPAAPCARIWNGTQR 1645 BAA28178.1
    763 RUBELLA VIRUS VPPDPGDLVEYIMNY 1646 BAA28178.1
    764 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON VQSVASSRRHKRFAG 1647 P69353.1
    765 BORDETELLA PERTUSSIS VQTGGTSRTVTMRYLAS 1648 ACI16083.1
    766 BORDETELLA PERTUSSIS VQVRI 1649 ACI16083.1
    767 RUBELLA VIRUS VRAYNQPAGDV 1650 NP_740662.1
    768 RUBELLA VIRUS VRFESKIVDGGCFAP 1651 BAA28178.1
    769 RUBELLA VIRUS VRLAGVRFESKIVDG 1652 BAA28178.1
    770 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON VSGSFGNRFILSQGN 1653 P69353.1
    771 BORDETELLA PERTUSSIS VSKEEQYYDYEDAT 1654 AAA83981.1
    772 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON VSKGNCSGPTTIRGQ 1655 P08362.1
    773 RUBELLA VIRUS VTAALLNTPPPYQVS 1656 BAA28178.1
    774 RUBELLA VIRUS VTGCYQCGTPALVEG 1657 BAA28178.1
    775 RUBELLA VIRUS VTPVIGSQ 1658 CAJ88851.1
    776 RUBELLA VIRUS STRAIN THERIEN VTTEHPFCNTPHGQLEVQVPPD 1659 P07566.1
    777 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON VVLAGAALGVATAAQ 1660 P69353.1
    778 RUBELLA VIRUS VWQLSVAGVSCNVTT 1661 BAA28178.1
    779 RUBELLA VIRUS VWVTPVIG 1662 CAJ88851.1
    780 RUBELLA VIRUS VWVTPVIGSQAR 1663 BAA19893.1
    781 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON VYILIAVCLGGLIGI 1664 P69353.1
    782 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON VYLHRIDLGPPISLE 1665 P69353.1
    783 BORDETELLA PERTUSSIS VYRYDSRP 1666 P04977.1
    784 BORDETELLA PERTUSSIS VYRYDSRPPEDV 1667 P04977.1
    785 MEASLES MORBILLIVIRUS VYWLTIPPMKNLALG 1668 P06830.1
    786 RUBELLA VIRUS WDLEATGACICEIPT 1669 BAA28178.1
    787 MEASLES MORBILLIVIRUS WDQKLWCRHFCVLAD 1670 AAR89413.1
    788 RUBELLA VIRUS WGFPTDTVMSVFALA 1671 BAA28178.1
    789 RUBELLA VIRUS WHPPGPLGLKFKTVR 1672 BAA28178.1
    790 RUBELLA VIRUS WIHAHTTSDPWHPPG 1673 BAA28178.1
    791 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON WLTIPPMKNLALGVI 1674 P08362.1
    792 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON WQESRKNKAQTRTPLQCTMT 1675 P04851.1
    793 RUBELLA VIRUS WVCIFMVCRRACR 1676 SRC265968
    794 RUBELLA VIRUS WVTPVIGS 1677 CAJ88851.1
    795 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON WYTTVPKYVATQGYL 1678 P69353.1
    796 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON YALGGDINKVLEKLG 1679 P69353.1
    797 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON YAMGVGVELE 1680 P04851.1
    798 MEASLES MORBILLIVIRUS YAMGVGVELEN 1681 ABI54110.1
    799 MEASLES MORBILLIVIRUS YCADVAAEELMNALV 1682 AAR89413.1
    800 MEASLES MORBILLIVIRUS YDFRDLTWCINPPER 1683 P06830.1
    801 BORDETELLA PERTUSSIS YFEPGPT 1684 ACI16083.1
    802 RUBELLA VIRUS YFNPGGSYYKQYHPT 1685 BAA28178.1
    803 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON YFRLGQEMVRRSAGK 1686 P04851.1
    804 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON YFRLGQEMVRRSAGKVSSTL 1687 P04851.1
    805 MEASLES MORBILLIVIRUS YFYPFRLPIKGVPIE 1688 P06830.1
    806 BORDETELLA PERTUSSIS YGDNAGRILAGALAT 1689 P04977.1
    807 RUBELLA VIRUS YGHATVEMPEWIHAH 1690 BAA28178.1
    808 RUBELLA VIRUS Y1MNYTGNQQSRWGL 1691 BAA28178.1
    809 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON YINNELIPSMNQLSC 1692 P69353.1
    810 RUBELLA VIRUS YLCTAPGCATQAPVP 1693 BAA28178.1
    811 MEASLES MORBILLIVIRUS YLFTVPIKEAGEDCH 1694 P06830.1
    812 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON YLHDPEFNL 1695 ABK40531.1
    813 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON YLNMSRLFV 1696 ABK40531.1
    814 MEASLES VIRUS STRAIN HALLE YPALGLHEF 1697 P10050.1
    815 MEASLES MORBILLIVIRUS YPALGLHEFA 1698 ABI54110.1
    816 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON YPALGLHEFAGELST 1699 P04851.1
    817 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON YPALGLHEFAGELSTLESLM 1700 P04851.1
    818 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON YPFRLPIKGVPIELQ 1701 P08362.1
    819 MEASLES VIRUS STRAIN HALLE YPLLWSYAM 1702 P10050.1
    820 MUMPS RUBULAVIRUS YQQQGRL 1703 P21186.1
    821 BORDETELLA PERTUSSIS YQSEYLAHRR 1704 P04977.1
    822 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON YRETGPSRASDARAA 1705 P04851.1
    823 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON YRETGPSRASDARAAHLPTG 1706 P04851.1
    824 RUBELLA VIRUS YRNASDVLPGHWLQGGWGCYNLSDW 1707 NP_740663.1
    825 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON YRRLLRTVLEPIRDA 1708 P69353.1
    826 BORDETELLA PERTUSSIS YRYDSRPP 1709 P04977.1
    827 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON YSGGDLLGILESRGI 1710 P69353.1
    828 BORDETELLA PERTUSSIS YSKVTATBLLASTNSRLCAVFVRDG 1711 SRC280066
    829 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON YSPSRSFSYFYPFRL 1712 P08362.1
    830 RUBELLA VIRUS STRAIN THERIEN YTGNQQSRWGLGSPNCHGPDWASPV 1713 P07566.1
    831 MEASLES MORBILLIVIRUS YVLLAVLFV 1714 P08362.1
    832 MEASLES MORBILLIVIRUS YVYSPGRSFSYFYPF 1715 P06830.1
    833 BORDETELLA PERTUSSIS YYDYEDATFQTYALTGISLCNPAASIC 1716 P04979.1
    834 MEASLES MORBILLIVIRUS GDLLGILESRGIKAR 1717 AAF02706.1
    835 MEASLES MORBILLIVIRUS TVPKYVATQGYLISN 1718 AAL29688.1
    836 MEASLES MORBILLIVIRUS KPWDSPQEI 1719 P26035.1
    837 MEASLES MORBILLIVIRUS KPWESPQEI 1720 CAA34579.1
    838 BORDETELLA PERTUSSIS ATYQSEYLAHRRIPP 1721 ACI04548.1
    839 BORDETELLA PERTUSSIS CMARQAESSEAMAAWSERAGEAMVLV YYESIAYSF 1722 ACI04548.1
    840 BORDETELLA PERTUSSIS CQVGSSNSAFVSTSSSRRYTEVYL 1723 ACI04548.1
    841 BORDETELLA PERTUSSIS DDPPATVYRYDSRPP 1724 ACI04548.1
    842 BORDETELLA PERTUSSIS GALATYQSEYLAHRRIPP 1725 ACI04548.1
    843 BORDETELLA PERTUSSIS MAAWSERAGEAMVLVYYESIAYSF 1726 ACI04548.1
    844 BORDETELLA PERTUSSIS MVLVYYESIAYSF 1727 ACI04548.1
    845 BORDETELLA PERTUSSIS PATVYRYDSRPPEDV 1728 AC104548.1
    846 BORDETELLA PERTUSSIS YDSRPPEDV 1729 ACI04548.1
    847 BORDETELLA PERTUSSIS EPGITTNYDT 1730 ACI16087.1
    848 BORDETELLA PERTUSSIS GDLRAYKMVYATNPQTQLSN 1731 ACI16083.1
    849 BORDETELLA PERTUSSIS KNGDVEASAITTYVGFSVVYP 1732 ACI16083.1
    850 BORDETELLA PERTUSSIS KVTNGSKSYTLRYLASYVK 1733 ACI16088.1
    851 BORDETELLA PERTUSSIS
    Figure DE112021002672T5_0329
    		 1734 ACI16088.1
    852 BORDETELLA PERTUSSIS YATNPQTQLS 1735 ACI16083.1
    853 CORYNEBACTERIUM DIPHTHERIAE DNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKV 1736 AAV70486.1
    854 CORYNEBACTERIUM DIPHTHERIAE ENFSSYHGTKPGYVDSI 1737 AAV70486.1
    855 CORYNEBACTERIUM DIPHTHERIAE KVDNAETIKKELGLSLTEP 1738 AAV70486.1
    856 RUBELLA VIRUS STRAIN M33 MEDLQKALEAQSRALRAGLAA 1739 CAA28880.1
    857 CORYNEBACTERIUM DIPHTHERIAE QKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFY 1740 AAV70486.1
    858 RUBELLA VIRUS STRAIN M33
    Figure DE112021002672T5_0330
    		 1741 CAA28880.1
    859 RUBELLA VIRUS
    Figure DE112021002672T5_0331
    		 1742 SRC265968
    860 RUBELLA VIRUS CVTSWLWSEGEGAVFYRVDLHFINLGTP 1743 CAA28880.1
    861 RUBELLA VIRUS FRVGGTRWHRLLRMPVRGLDGDTAPLP 1744 CAA28880.1
    862 CORYNEBACTERIUM DIPHTHERIAE GRKIRMRCRAIDGDVTFCRPKSPVYVGN 1745 1007216A
    863 RUBELLA VIRUS GTPPLDEDGRWDPALMYNPCGPEPPAHV 1746 CAA28880.1
    864 CORYNEBACTERIUM DIPHTHERIAE
    Figure DE112021002672T5_0332
    		 1747 AAV70486.1
    865 RUBELLA VIRUS
    Figure DE112021002672T5_0333
    		 1748 ABD64200.1
    866 RUBELLA VIRUS
    Figure DE112021002672T5_0334
    		 1749 CAA28880.1
    867 RUBELLA VIRUS PLPPHTTERIETRSARHPWRIRFGAP 1750 CAA28880.1
    868 RUBELLA VIRUS SRAPPPPEERQESRSQTPAPKPSRAPP 1751 CAA28880.1
    869 RUBELLA VIRUS SRAPPQQPQPPRMQTGRGGSAPRPELGP 1752 CAA28880.1
    870 RUBELLA VIRUS TPAVTPEGPAPPRTGAWQRKDWSRAPP 1753 CAA28880.1
    871 RUBELLA VIRUS
    Figure DE112021002672T5_0335
    		 1754 CAA28880.1
    872 RUBELLA VIRUS AFGHSDAACWGFPTDTVMSV 1755 CAA28880.1
    873 RUBELLA VIRUS CARIWNGTQRACTFWAVNAYS 1756 CAA28880.1
    874 RUBELLA VIRUS EEAFTYLCTAPGCATQTPVPVR 1757 CAA28880.1
    875 RUBELLA VIRUS FAPWDLEATGACICEIPTDV 1758 CAA28880.1
    876 RUBELLA VIRUS GEDVGAFPPGKFVTAAL 1759 CAA28880.1
    877 RUBELLA VIRUS GEVWVTPVIGSQARKCGLHI 1760 CAA28880.1
    878 RUBELLA VIRUS GQLEVQVPPDPGDLVEYIMN 1761 CAA28880.1
    879 RUBELLA VIRUS GSYYKQYHPTACEVEPAFGH 1762 CAA28880.1
    880 RUBELLA VIRUS IHAHTTSDPWHPPGPLGLKF 1763 CAA28880.1
    881 RUBELLA VIRUS IMNYTGNQQSRWGLGSPNCH 1764 CAA28880.1
    882 RUBELLA VIRUS LHIRAGPYGHATVEMPEWIH 1765 CAA28880.1
    883 RUBELLA VIRUS LKFKTVRPVALPRALAPPRN 1766 CAA28880.1
    884 RUBELLA VIRUS LNTPPPYQVSCGGESDRASAGH 1767 CAA28880.1
    885 RUBELLA VIRUS NCHGPDWASPVCQRHSPDCS 1768 CAA28880.1
    886 RUBELLA VIRUS PDCSRLVGATPERPRLRLVD 1769 CAA28880.1
    887 RUBELLA VIRUS PRNVRVTGCYQCGTPALVEG 1770 CAA28880.1
    888 RUBELLA VIRUS PTDVSCEGLGAWVPTAPCARI 1771 CAA28880.1
    889 RUBELLA VIRUS RLVDADDPLLRTAPGPGEVW 1772 CAA28880.1
    890 RUBELLA VIRUS SVFALASYVQHPHKTVRVKF 1773 CAA28880.1
    891 RUBELLA VIRUS VEGLAPGGGNCHLTVNGEDV 1774 CAA28880.1
    892 RUBELLA VIRUS VKEHIELRIVWQLSVAGVSC 1775 CAA28880.1
    893 RUBELLA VIRUS VPVRLAGVGFESKIVDGGCF 1776 CAA28880.1
    894 RUBELLA VIRUS VSCNVTTEHPFCNTPHGQLE 1777 CAA28880.1
    895 BORDETELLA PERTUSSIS AAASSPDAHVPF 1778 AAA22983.1
    896 BORDETELLA PERTUSSIS AASSPDA 1779 AAA22983.1
    897 BORDETELLA PERTUSSIS AKLGAAASSPDA 1780 AAA22983.1
    898 BORDETELLA PERTUSSIS AMKPYEVTPTRM 1781 AAA22983.1
    899 BORDETELLA PERTUSSIS AMTHLSPALADVPYVLVKTNMVVTS 1782 AAA22983.1
    900 BORDETELLA PERTUSSIS ASSPDAHVPFCF 1783 AAA22983.1
    901 BORDETELLA PERTUSSIS ASSPDAHVPFCFGKDLKRPGSSPME 1784 AAA22983.1
    902 BORDETELLA PERTUSSIS CFGKDLKRPGSS 1785 AAA22983.1
    903 BORDETELLA PERTUSSIS CFGKDLKRPGSSPMEVMLRAVFMQQ 1786 AAA22983.1
    904 BORDETELLA PERTUSSIS CGIAAKLGAAAS 1787 AAA22983.1
    905 BORDETELLA PERTUSSIS CGIAAKLGAAASSPDAHVPFCFGKD 1788 AAA22983.1
    906 BORDETELLA PERTUSSIS DAHVPFCFGKDL 1789 AAA22983.1
    907 BORDETELLA PERTUSSIS DLKRPGSSPMEV 1790 AAA22983.1
    908 BORDETELLA PERTUSSIS DVPYVLVKTNMV 1791 AAA22983.1
    909 BORDETELLA PERTUSSIS DVPYVLVKTNMVVTSVAMKPYEVTPT 1792 AAA22983.1
    910 BORDETELLA PERTUSSIS EVMLRAVFMQQR 1793 AAA22983.1
    911 BORDETELLA PERTUSSIS FEGKPALELIRM 1794 AAA22983.1
    912 BORDETELLA PERTUSSIS FLGPKQLTFEGK 1795 AAA22983.1
    913 BORDETELLA PERTUSSIS FLGPKQLTFEGKPALELIRMVECSG 1796 AAA22983.1
    914 BORDETELLA PERTUSSIS FMQQRPLRMFLGPKQLT 1797 AAA22983.1
    915 BORDETELLA PERTUSSIS GKDLKRPGSSPM 1798 AAA22983.1
    916 BORDETELLA PERTUSSIS GKDLKRPGSSPME 1799 AAA22983.1
    917 BORDETELLA PERTUSSIS GKPALELIRMVE 1800 AAA22983.1
    918 BORDETELLA PERTUSSIS GPKQLTFEGKPA 1801 AAA22983.1
    919 BORDETELLA PERTUSSIS HVPFCFGKDLKR 1802 AAA22983.1
    920 BORDETELLA PERTUSSIS IAAKLGAAASSP 1803 AAA22983.1
    921 BORDETELLA PERTUSSIS KPYEVTPTRMLV 1804 AAA22983.1
    922 BORDETELLA PERTUSSIS KQLTFEGKPALE 1805 AAA22983.1
    923 BORDETELLA PERTUSSIS KRPGSSPMEVML 1806 AAA22983.1
    924 BORDETELLA PERTUSSIS LELIRMVECSGK 1807 AAA22983.1
    925 BORDETELLA PERTUSSIS LGAAASSPDAHV 1808 AAA22983.1
    926 BORDETELLA PERTUSSIS LIRMVECSGKQD 1809 AAA22983.1
    927 BORDETELLA PERTUSSIS LVCGIAAKLGAA 1810 AAA22983.1
    928 BORDETELLA PERTUSSIS MKPYEVTPTRM 1811 AAA22983.1
    929 BORDETELLA PERTUSSIS MLRAVFMQQRPL 1812 AAA22983.1
    930 BORDETELLA PERTUSSIS MQQRPLRM 1813 AAA22983.1
    931 BORDETELLA PERTUSSIS MQQRPLRMFLGP 1814 AAA22983.1
    932 BORDETELLA PERTUSSIS MVVTSVAMKPYE 1815 AAA22983.1
    933 BORDETELLA PERTUSSIS MVVTSVAMKPYEVTPTRMLVCGIAA 1816 AAA22983.1
    934 BORDETELLA PERTUSSIS PALELIRMVECS 1817 AAA22983.1
    935 BORDETELLA PERTUSSIS PALELIRMVECSGK 1818 AAA22983.1
    936 BORDETELLA PERTUSSIS PFCFGKDLKRPG 1819 AAA22983.1
    937 BORDETELLA PERTUSSIS PGSSPMEVMLRA 1820 AAA22983.1
    938 BORDETELLA PERTUSSIS PGSSPMEVMLRAVF 1821 AAA22983.1
    939 BORDETELLA PERTUSSIS PKQLTFEGK 1822 AAA22983.1
    940 BORDETELLA PERTUSSIS PLRMFLGPKQLT 1823 AAA22983.1
    941 BORDETELLA PERTUSSIS PTRMLVCGIAAK 1824 AAA22983.1
    942 BORDETELLA PERTUSSIS PYVLVKTNMVVT 1825 AAA22983.1
    943 BORDETELLA PERTUSSIS QLTFEGKPALELIRMVECSGKQDCP 1826 AAA22983.1
    944 BORDETELLA PERTUSSIS QRPLRMFLGPKQ 1827 AAA22983.1
    945 BORDETELLA PERTUSSIS RAVFMQQRPLRM 1828 AAA22983.1
    946 BORDETELLA PERTUSSIS RMFLGPKQLTFE 1829 AAA22983.1
    947 BORDETELLA PERTUSSIS RMLVCGIAAKLG 1830 AAA22983.1
    948 BORDETELLA PERTUSSIS RMVECSGKQDCP 1831 AAA22983.1
    949 BORDETELLA PERTUSSIS SPDAHVPFCFGK 1832 AAA22983.1
    950 BORDETELLA PERTUSSIS SSPMEVMLRAVF 1833 AAA22983.1
    951 BORDETELLA PERTUSSIS SSPMEVMLRAVFMQQRPLRMFLGPK 1834 AAA22983.1
    952 BORDETELLA PERTUSSIS SVAMKPYEVTPT 1835 AAA22983.1
    953 BORDETELLA PERTUSSIS VECSGKQDCP 1836 AAA22983.1
    954 BORDETELLA PERTUSSIS VFMQQRPLRMFL 1837 AAA22983.1
    955 BORDETELLA PERTUSSIS VFMQQRPLRMFLGPKQLTFEGKPAL 1838 AAA22983.1
    956 BORDETELLA PERTUSSIS VKTNMVVTSVAM 1839 AAA22983.1
    957 BORDETELLA PERTUSSIS VLVKTNMVVTSV 1840 AAA22983.1
    958 BORDETELLA PERTUSSIS VTPTRMLVCGIA 1841 AAA22983.1
    959 BORDETELLA PERTUSSIS VTSVAMKPYEVT 1842 AAA22983.1
    960 BORDETELLA PERTUSSIS YEVTPTRMLVCG 1843 AAA22983.1
    961 BORDETELLA PERTUSSIS YEVTPTRMLVCGIAAKLGAAASSPD 1844 AAA22983.1
    962 BORDETELLA PERTUSSIS CASPYEGRYRDMYDALR 1845 P04979.1
    963 BORDETELLA PERTUSSIS CAVFVRDGQSV 1846 P04979.1
    964 BORDETELLA PERTUSSIS CITTIYKTG 1847 P04979.1
    965 BORDETELLA PERTUSSIS CPNGTRALTV 1848 P04979.1
    966 BORDETELLA PERTUSSIS DALRRLLYMIYMSG 1849 P04979.1
    967 RUBELLA VIRUS STRAIN THERIEN GNRGRGQRRDWSRAPPPPEERQETRS 1850 P07566.1
    968 BORDETELLA PERTUSSIS GQPAADHYYSKVT 1851 P04979.1
    969 RUBELLA VIRUS GSPNCHGPDWASPVCQRHS 1852 ABD64214.1
    970 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON HKSLSTNLDVTNSIEHQ 1853 P08362.1
    971 BORDETELLA PERTUSSIS LFTQQGGAYGRC 1854 P04979.1
    972 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON LIGLLAIAGIRLHRAAIYTAEI 1855 P08362.1
    973 MEASLES MORBILLIVIRUS PDTAADSELRRWIKY 1856 ABI54110.1
    974 RUBELLA VIRUS STRAIN THERIEN PNCHGPDWASPVCQRHS 1857 P07566.1
    975 RUBELLA VIRUS QTPAPKPSRAPPQQPQPPRMQTGR 1858 ABD64216.1
    976 RUBELLA VIRUS VACCINE STRAIN RA27/3 RAGLTAGASQSRRPRPPR 1859 CAA33016.1
    977 RUBELLA VIRUS VACCINE STRAIN RA27/3 RFGAPQAFLAGLLLAAVAVGTARA 1860 ABD64214.1
    978 BORDETELLA PERTUSSIS RGNAELQTYLRQITPG 1861 P04979.1
    979 BORDETELLA PERTUSSIS RVHVSKEEQYYDYED 1862 P04979.1
    980 BORDETELLA PERTUSSIS SIYGLYDGTYL 1863 P04979.1
    981 BORDETELLA PERTUSSIS SKVTATRLLASTNS 1864 P04979.1
    982 BORDETELLA PERTUSSIS TQQGGAYGRCPNGTRA 1865 P04979.1
    983 BORDETELLA PERTUSSIS VAPGIVIPPKAL 1866 P04979.1
    984 BORDETELLA PERTUSSIS DSRPPEDVFQNGFTAWG 1867 ACI04548.1
    985 BORDETELLA PERTUSSIS EHRMQEAVEAERAGR 1868 ACI04548.1
    986 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON ETCFQQACKGKIQALCENPEWA 1869 P08362.1
    987 BORDETELLA PERTUSSIS EYVDTYGDNAGRILAGALATYQ 1870 ACI04548.1
    988 BORDETELLA PERTUSSIS HRRIPPENIRRVTR 1871 ACI04548.1
    989 BORDETELLA PERTUSSIS MARQAESSE 1872 ACI04548.1
    990 BORDETELLA PERTUSSIS MQEAVEAERAGR 1873 ACI04548.1
    991 BORDETELLA PERTUSSIS SQQTRANPNPYTSRR 1874 ACI04548.1
    992 BORDETELLA PERTUSSIS TRANPNPYTSRRSVAS1VGTLVHG 1875 SRC280066
    993 BORDETELLA PERTUSSIS TVYRYDSRPPED 1876 ACI04548.1
    994 MEASLES MORBILLIVIRUS NDRNLLD 1877 P10050.1
    995 MEASLES MORBILLIVIRUS
    Figure DE112021002672T5_0336
    		 1878 P04851.1
    996 MEASLES MORBILLIVIRUS SRASDARAAHLPTGTPLDID 1879 P04851.1
    997 BORDETELLA PERTUSSIS EDVFQNGFTAW 1880 ACI04548.1
    998 CORYNEBACTERIUM DIPHTHERIAE AEGSSSVEYINNWEQAK 1881 AAV70486.1
    999 CORYNEBACTERIUM DIPHTHERIAE GPIKNKMSESPNKT 1882 AAV70486.1
    1000 MEASLES VIRUS STRAIN HALLE
    Figure DE112021002672T5_0337
    		 1883 P10050.1
    1001 CORYNEBACTERIUM DIPHTHERIAE GYQKTVDHTKVNSK 1884 AAV70486.1
    1002 CORYNEBACTERIUM DIPHTHERIAE KTVDH 1885 AAV70486.1
    1003 CORYNEBACTERIUM DIPHTHERIAE SESPNK 1886 AAV70486.1
    1004 CORYNEBACTERIUM DIPHTHERIAE AEGSSSVEYINNWEQAKALS 1887 AAV70486.1
    1005 CORYNEBACTERIUM DIPHTHERIAE AQAIPLVGELVDIGFAAYNF 1888 AAV70486.1
    1006 CORYNEBACTERIUM DIPHTHERIAE ASRVVLSLPFAEGSSSVEYI 1889 AAV70486.1
    1007 CORYNEBACTERIUM DIPHTHERIAE CINLDWDVIRDKTKTKIESL 1890 AAV70486.1
    1008 CORYNEBACTERIUM DIPHTHERIAE CRAIDGDVTFCRPKSPVYVG 1891 AAV70486.1
    1009 CORYNEBACTERIUM DIPHTHERIAE CRPKSPVYVGNGVHANLHVA 1892 AAV70486.1
    1010 CORYNEBACTERIUM DIPHTHERIAE DAAGYSVDNENPLSGKAGGV 1893 AAV70486.1
    1011 CORYNEBACTERIUM DIPHTHERIAE DKTKTKIESLKEHGPIKNKM 1894 AAV70486.1
    1012 CORYNEBACTERIUM DIPHTHERIAE EEFIKRFGDGASRVVLSLPF 1895 AAV70486.1
    1013 CORYNEBACTERIUM DIPHTHERIAE EKAKQYLEEFHQTALEHPEL 1896 AAV70486.1
    1014 CORYNEBACTERIUM DIPHTHERIAE FHRSSSEKIHSNEISSDSIG 1897 AAV70486.1
    1015 CORYNEBACTERIUM DIPHTHERIAE GADDVVDSSKSFVMENFSSY 1898 CAE11230.1
    1016 CORYNEBACTERIUM DIPHTHERIAE GKRGQDAMYEYMAQACAGΓ1R 1899 AAV70486.1
    1017 CORYNEBACTERIUM DIPHTHERIAE GSVMGIADGAVHHNTEEIVA 1900 AAV70486.1
    1018 CORYNEBACTERIUM DIPHTHERIAE GTQGNYDDDWKGFYSTDNKY 1901 AAV70486.1
    1019 CORYNEBACTERIUM DIPHTHERIAE HDGYAVSWNTVEDSIIRTGF 1902 AAV70486.1
    1020 CORYNEBACTERIUM DIPHTHERIAE HGTKPGYVDSIQKGIQKPKS 1903 AAV70486.1
    1021 CORYNEBACTERIUM DIPHTHERIAE HQTALEHPELSELKTVTGTN 1904 AAV70486.1
    1022 CORYNEBACTERIUM DIPHTHERIAE IQKGIQKPKSGTQGNYDDDW 1905 AAV70486.1
    1023 CORYNEBACTERIUM DIPHTHERIAE KEHGPIKNKMSESPNKTVSE 1906 AAV70486.1
    1024 CORYNEBACTERIUM DIPHTHERIAE KGFYSTDNKYDAAGYSVDNE 1907 AAV70486.1
    1025 CORYNEBACTERIUM DIPHTHERIAE LDVNKSKTHISVNGRKIRMR 1908 AAV70486.1
    1026 RUBELLA VIRUS MASTIPITMEDLQKALEA 1909 SRC265968
    1027 CORYNEBACTERIUM DIPHTHERIAE NGVHANLHVAFHRSSSEKIH 1910 AAV70486.1
    1028 CORYNEBACTERIUM DIPHTHERIAE NNWEQAKALSVELEINFETR 1911 AAV70486.1
    1029 CORYNEBACTERIUM DIPHTHERIAE NPLSGKAGGVVKVTYPGLTK 1912 AAV70486.1
    1030 CORYNEBACTERIUM DIPHTHERIAE PVFAGANYAAWAVNVAQVID 1913 AAV70486.1
    1031 CORYNEBACTERIUM DIPHTHERIAE SELKTVTGTNPVFAGANYAA 1914 AAV70486.1
    1032 CORYNEBACTERIUM DIPHTHERIAE SESPNKTVSEEKAKQYLEEF 1915 AAV70486.1
    1033 CORYNEBACTERIUM DIPHTHERIAE SETADNLEKTTAALSILPGI 1916 AAV70486.1
    1034 CORYNEBACTERIUM DIPHTHERIAE SFVMENFSSYHGTKPGYVDS 1917 AAV70486.1
    1035 CORYNEBACTERIUM DIPHTHERIAE SNEISSDSIGVLGYQKTVDH 1918 AAV70486.1
    1036 CORYNEBACTERIUM DIPHTHERIAE SPGHKTQPFLHDGYAVSWNT 1919 AAV70486.1
    1037 CORYNEBACTERIUM DIPHTHERIAE SVNGRKIRMRCRAIDGDVTF 1920 AAV70486.1
    1038 CORYNEBACTERIUM DIPHTHERIAE TAALSILPGIGSVMGIADGA 1921 AAV70486.1
    1039 CORYNEBACTERIUM DIPHTHERIAE TAENTPLPIAGVLLPTIPGK 1922 AAV70486.1
    1040 CORYNEBACTERIUM DIPHTHERIAE TEPLMEQVGTEEFIKRFGDG 1923 AAV70486.1
    1041 CORYNEBACTERIUM DIPHTHERIAE TIKKELGLSLTEPLMEQVGT 1924 AAV70486.1
    1042 CORYNEBACTERIUM DIPHTHERIAE TKVNSKLSLFFEIKS 1925 AAV70486.1
    1043 CORYNEBACTERIUM DIPHTHERIAE VEDSIIRTGFQGESGHDIKI 1926 AAV70486.1
    1044 CORYNEBACTERIUM DIPHTHERIAE VELEINFETRGKRGQDAMYE 1927 AAV70486.1
    1045 CORYNEBACTERIUM DIPHTHERIAE VESIINLFQVVHNSYNRPAY 1928 AAV70486.1
    1046 CORYNEBACTERIUM DIPHTHERIAE VHNSYNRPAYSPGHKTQPFL 1929 AAV70486.1
    1047 CORYNEBACTERIUM DIPHTHERIAE VKVTYPGLTKVLALKVDNAE 1930 AAV70486.1
    1048 CORYNEBACTERIUM DIPHTHERIAE VLALKVDNAETIKKELGLSL 1931 AAV70486.1
    1049 CORYNEBACTERIUM DIPHTHERIAE VLGYQKTVDHTKVNSKLSLF 1932 AAV70486.1
    1050 CORYNEBACTERIUM DIPHTHERIAE VRRSVGSSLSCINLDWDVIR 1933 AAV70486.1
    1051 CORYNEBACTERIUM DIPHTHERIAE WAVNVAQVIDSETADNLEKT 1934 AAV70486.1
    1052 CORYNEBACTERIUM DIPHTHERIAE YMAQACAGNRVRRSVGSSLS 1935 AAV70486.1
    1053 BORDETELLA PERTUSSIS AKAPPAPKPAPQPGP 1936 ABO77783.1
    1054 BORDETELLA PERTUSSIS APKPAPQPGP 1937 ABO77783.1
    1055 BORDETELLA PERTUSSIS APKPAPQPGPQPPQP 1938 ABO77783.1
    1056 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON AQTRTPLQCTMTEIF 1939 P04851.1
    1057 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON ASRGTNMEDEADQYFSHDD 1940 P04851.1
    1058 BORDETELLA PERTUSSIS ATIRR 1941 ABO77783.1
    1059 BORDETELLA PERTUSSIS DNRAG 1942 ABO77783.1
    1060 BORDETELLA PERTUSSIS EAPAPQPPAGRELSA 1943 ABO77783.1
    1061 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON EMVRRSAGKVSSTLASELGI 1944 P04851.1
    1062 BORDETELLA PERTUSSIS GASEL 1945 ABO77783.1
    1063 BORDETELLA PERTUSSIS GDALAGGAVP 1946 AAA22980.1
    1064 BORDETELLA PERTUSSIS GDAPAGGAVP 1947 ABO77783.1
    1065 BORDETELLA PERTUSSIS GDTWDDD 1948 ABO77783.1
    1066 BORDETELLA PERTUSSIS GERQH 1949 ABO77783.1
    1067 BORDETELLA PERTUSSIS GGAVP 1950 ABO77783.1
    1068 BORDETELLA PERTUSSIS GGFGP 1951 P14283.3
    1069 BORDETELLA PERTUSSIS GGFGPGGFGP 1952 BAF35031.1
    1070 BORDETELLA PERTUSSIS GGFGPVLDGW 1953 ABO77783.1
    1071 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON GGKEDRRVKQSRGEARESYR 1954 P04851.1
    1072 BORDETELLA PERTUSSIS GILLEN 1955 ABO77783.1
    1073 BORDETELLA PERTUSSIS GIRRFL 1956 ABO77783.1
    1074 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON HDDPISSDQSRFGWFENKEI 1957 P04851.1
    1075 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON HEFAGELSTLESLMNLY 1958 P04851.1
    1076 BORDETELLA PERTUSSIS HLGGLAGY 1959 ABO77783.1
    1077 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON HTTEDKISRAVGPRQAQVSFL 1960 P04851.1
    1078 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON ICDIDTYIVEAGLASFILTI 1961 P04851.1
    1079 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON IIIVPIPGDSSITTRSRLLD 1962 P04851.1
    1080 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON ILDIKRTPGNKPRIAEMICD 1963 P04851.1
    1081 BORDETELLA PERTUSSIS KALLYR 1964 ABO77783.1
    1082 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON KPPITSGSGGAIRGIKHIII 1965 P04851.1
    1083 BORDETELLA PERTUSSIS LAGSGL 1966 ABO77783.1
    1084 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON LGTTAEDARLVSEIAMHTTE 1967 P04851.1
    1085 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON LGTILAQIWVLLAKAVTA 1968 P04851.1
    1086 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON LPTGTPLDIDTASESSQD 1969 P04851.1
    1087 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON MATLLRSLALFKRNKDK 1970 P04851.1
    1088 BORDETELLA PERTUSSIS PAPQPP 1971 ABO77783.1
    1089 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON PDTAADSELRRWIKYTQQRR 1972 P04851.1
    1090 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON PKLTGALIGILSLFVESPGQ 1973 P04851.1
    1091 BORDETELLA PERTUSSIS PQP 1974 ABO77783.1
    1092 BORDETELLA PERTUSSIS PQPGP 1975 ABO77783.1
    1093 BORDETELLA PERTUSSIS PQPGPQPPQPPQPQP 1976 ABO77783.1
    1094 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON QDPQDSRRSAEPLLSCKPWQ 1977 P04851.1
    1095 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON QRRVVGEFRLERKWLDVVR 1978 P04851.1
    1096 BORDETELLA PERTUSSIS RELSA 1979 ABO77783.1
    1097 BORDETELLA PERTUSSIS RFAPQ 1980 ABO77783.1
    1098 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON SIQNKFSAGSYPLLWSYAMG 1981 P04851.1
    1099 BORDETELLA PERTUSSIS SITLQAGAH 1982 ABO77783.1
    1100 BORDETELLA PERTUSSIS SLQPED 1983 ABO77783.1
    1101 BORDETELLA PERTUSSIS SNALSKRL 1984 ABO77783.1
    1102 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON SPGQLIQRITDDPDVSIRLL 1985 P04851.1
    1103 BORDETELLA PERTUSSIS TELPSIPG 1986 ABO77783.1
    1104 BORDETELLA PERTUSSIS TFTLANK 1987 ABO77783.1
    1105 BORDETELLA PERTUSSIS TWDDD 1988 ABO77783.1
    1106 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON VSFLQGDQSENELPRLGGKE 1989 P04851.1
    1107 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON WQESRKNKAQTRTPLQC 1990 P04851.1
    1108 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON YAMGVGVELENSMGGLNFGR 1991 P04851.1
    1109 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON YQQMGKPAPYMVNLENSI 1992 P04851.1
    1110 MEASLES VIRUS STRAIN HALLE MTRSSHQSLVIKLMP 1993 P69355.1
    1111 MEASLES VIRUS STRAIN HALLE PIRDALNAMTQNIRP 1994 P69355.1
    1112 RUBELLA VIRUS STRAIN M33 ALLNTPPPYQVSCGGESDRASAGH 1995 CAA28880.1
    1113 RUBELLA VIRUS STRAIN THERIEN GLGSPNCHGPDWASPVCQRHS 1996 P07566.1
    1114 RUBELLA VIRUS STRAIN THERIEN GLGSPNCHGPDWASPVCQRHSPDCSRLV 1997 P07566.1
    1115 RUBELLA VIRUS STRAIN THERIEN NYTGNQQSRWGLGSPNCHGPDWASPV 1998 P07566.1
    1116 RUBELLA VIRUS STRAIN THERIEN TLPQPPCAHGQHYGHHHHQL 1999 P07566.1
    1117 RUBELLA VIRUS STRAIN THERIEN TVRVKFHTETRTVWQLSVAGVSCNVT 2000 P07566.1
    1118 RUBELLA VIRUS ASYFNPGGSYYKQYH 2001 BAA28178.1
    1119 RUBELLA VIRUS FALASYVQHPHKTVR 2002 BAA28178.1
    1120 RUBELLA VIRUS GGESDRASARVIDPAAQSFIG 2003 BAA28178.1
    1121 RUBELLA VIRUS GPGEVWVTPVIGSQARKC 2004 BAA28178.1
    1122 RUBELLA VIRUS GSQARKCGLHIRAG 2005 BAA28178.1
    1123 RUBELLA VIRUS LVGATPERPRLRLVDADDPLLRTAP 2006 BAA28178.1
    1124 RUBELLA VIRUS TAPGPGEVWVTPVI 2007 BAA28178.1
    1125 MEASLES MORBILLIVIRUS FIVLSIAYPTLSEIK 2008 AAL29688.1
    1126 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON- ZAGREB
    Figure DE112021002672T5_0338
    		 2009 P08362.1
    1127 MEASLES MORBILLIVIRUS LPRLGGKEDR 2010 P04851.1
    1128 MEASLES MORBILLIVIRUS MSKTEWNASQ 2011 SRC280080
    1129 MEASLES MORBILLIVIRUS SRFGWFENKE 2012 P04851.1
    1130 RUBELLA VIRUS
    Figure DE112021002672T5_0339
    		 2013 CAA28880.1
    1131 RUBELLA VIRUS MDFWCVEHDRPPPATPTSLTT 2014 CAA33016.1
    1132 RUBELLA VIRUS PFLGHDGHHGGTLRVGQHHRNASDV 2015 CAA33016.1
    1133 RUBELLA VIRUS RVKFHTETRTVWQLSVAGVSC 2016 BAA19893.1
    1134 MEASLES MORBILLIVIRUS AEEQARHVKNGLE 2017 ABO69699.1
    1135 MEASLES MORBILLIVIRUS ESPQEISKHQALG 2018 SRC280080
    1136 MEASLES MORBILLIVIRUS GVGVELENSMGGLNF 2019 ABI54110.1
    1137 MEASLES MORBILLIVIRUS IKGANDLAKFHQMLMKIIMK 2020 ABO69699.1
    1138 MEASLES MORBILLIVIRUS MSKTLHAQLGFKKT 2021 ABK40528.1
    1139 MEASLES MORBILLIVIRUS NASGLSRPSPSAH 2022 BAE98296.1
    1140 MEASLES MORBILLIVIRUS VRVIDPSLGDRKDE 2023 SRC280148
    1141 BORDETELLA PERTUSSIS DLSDGDLLV 2024 AAC31207.1
    1142 BORDETELLA PERTUSSIS EAERAGRGTG 2025 ACI04548.1
    1143 BORDETELLA PERTUSSIS YRYDSRPPEDV 2026 ACI04548.1
    1144 BORDETELLA PERTUSSIS YVDTYGDNAG 2027 ACI04548.1
    1145 MEASLES MORBILLIVIRUS SFSYFYPFR 2028 CAB43772.1
    1146 MUMPS RUBULAVIRUS DIFIVSPR 2029 ADF49557.1
    1147 MEASLES MORBILLIVIRUS
    Figure DE112021002672T5_0340
    		 2030 CAA59302.1
    1148 MEASLES MORBILLIVIRUS SAEALLRLQA 2031 BAH22350.1
    1149 MEASLES MORBILLIVIRUS RIVINREHL 2032 BAB39835.1
    1150 MEASLES VIRUS GENOTYPE A IPRFK 2033 BAB39848.1
    1151 BORDETELLA PERTUSSIS AAALSPMEI 2034 P15318.2
    1152 BORDETELLA PERTUSSIS AAASVVGAPV 2035 P15318.2
    1153 BORDETELLA PERTUSSIS AALGRQDSI 2036 P15318.2
    1154 BORDETELLA PERTUSSIS AAQRLVHA1A 2037 P15318.2
    1155 BORDETELLA PERTUSSIS AAVEAAEL 2038 P15318.2
    1156 BORDETELLA PERTUSSIS AGANVLNGL 2039 P15318.2
    1157 BORDETELLA PERTUSSIS AGYANAAD 2040 P15318.2
    1158 BORDETELLA PERTUSSIS AGYEQFEFRV 2041 P15318.2
    1159 BORDETELLA PERTUSSIS AITGNADNL 2042 P15318.2
    1160 BORDETELLA PERTUSSIS AKEKNATLM 2043 P15318.2
    1161 BORDETELLA PERTUSSIS AKGVFLSL 2044 P15318.2
    1162 BORDETELLA PERTUSSIS APHEYGFGI 2045 P15318.2
    1163 BORDETELLA PERTUSSIS ARQGNDLEI 2046 P15318.2
    1164 BORDETELLA PERTUSSIS ASVVGAPV 2047 P15318.2
    1165 BORDETELLA PERTUSSIS ATLMFRLV 2048 P15318.2
    1166 BORDETELLA PERTUSSIS AVAAAQRL 2049 P15318.2
    1167 BORDETELLA PERTUSSIS DAGANVLNGL 2050 P15318.2
    1168 BORDETELLA PERTUSSIS DALLAQLYR 2051 P15318.2
    1169 BORDETELLA PERTUSSIS DANGVLKHSI 2052 P15318.2
    1170 BORDETELLA PERTUSSIS DGDMNIGVI 2053 P15318.2
    1171 BORDETELLA PERTUSSIS DHVKNlENL 2054 P15318.2
    1172 BORDETELLA PERTUSSIS DIDMFAIM 2055 P15318.2
    1173 BORDETELLA PERTUSSIS DMFAIMPHL 2056 P15318.2
    1174 BORDETELLA PERTUSSIS DNVRNVENV 2057 P15318.2
    1175 BORDETELLA PERTUSSIS DNVRNVENVI 2058 P15318.2
    1176 BORDETELLA PERTUSSIS DTVDYSAM 2059 P15318.2
    1177 BORDETELLA PERTUSSIS DTVDYSAMI 2060 P15318.2
    1178 BORDETELLA PERTUSSIS DYLRQAGL 2061 P15318.2
    1179 BORDETELLA PERTUSSIS DYYDNVRNV 2062 P15318.2
    1180 BORDETELLA PERTUSSIS EFTTFVEI 2063 P15318.2
    1181 BORDETELLA PERTUSSIS EFTTFVEIV 2064 P15318.2
    1182 BORDETELLA PERTUSSIS EGYVFYEN 2065 P15318.2
    1183 BORDETELLA PERTUSSIS ENVQYRHV 2066 P15318.2
    1184 BORDETELLA PERTUSSIS EQLANSDGL 2067 P15318.2
    1185 BORDETELLA PERTUSSIS FGVGYGHDTI 2068 P15318.2
    1186 BORDETELLA PERTUSSIS FSPDVLETVP 2069 P15318.2
    1187 BORDETELLA PERTUSSIS FSVDHVKNI 2070 P15318.2
    1188 BORDETELLA PERTUSSIS GDDTYLFGV 2071 P15318.2
    1189 BORDETELLA PERTUSSIS GDDVFLQDL 2072 P15318.2
    1190 BORDETELLA PERTUSSIS GEDGNDIFL 2073 P15318.2
    1191 BORDETELLA PERTUSSIS GERFNVRKQL 2074 P15318.2
    1192 BORDETELLA PERTUSSIS GGAGNDTLV 2075 P15318.2
    1193 BORDETELLA PERTUSSIS GGDDFEAV 2076 P15318.2
    1194 BORDETELLA PERTUSSIS GKSEFTTFV 2077 P15318.2
    1195 BORDETELLA PERTUSSIS GKSLFDDGL 2078 P15318.2
    1196 BORDETELLA PERTUSSIS GNADNLKSV 2079 P15318.2
    1197 BORDETELLA PERTUSSIS GQLVEVDTL 2080 P15318.2
    1198 BORDETELLA PERTUSSIS GRSKFSPDV 2081 P15318.2
    1199 BORDETELLA PERTUSSIS GSSAYDTV 2082 P15318.2
    1200 BORDETELLA PERTUSSIS GTVEKWPAL 2083 P15318.2
    1201 BORDETELLA PERTUSSIS GVDYYDNV 2084 P15318.2
    1202 BORDETELLA PERTUSSIS GYEQFEFRV 2085 P15318.2
    1203 BORDETELLA PERTUSSIS HAVGAQDVV 2086 P15318.2
    1204 BORDETELLA PERTUSSIS IAAGRIGLG1 2087 P15318.2
    1205 BORDETELLA PERTUSSIS IGDAQANTL 2088 P15318.2
    1206 BORDETELLA PERTUSSIS IGLGILADL 2089 P15318.2
    1207 BORDETELLA PERTUSSIS IGNAAGIPL 2090 P15318.2
    1208 BORDETELLA PERTUSSIS IGTSMKDVL 2091 P15318.2
    1209 BORDETELLA PERTUSSIS IGVITDFEL 2092 P15318.2
    1210 BORDETELLA PERTUSSIS IPLTADIDM 2093 P15318.2
    1211 BORDETELLA PERTUSSIS ISKSALEL 2094 P15318.2
    1212 BORDETELLA PERTUSSIS ITGNADNL 2095 P15318.2
    1213 BORDETELLA PERTUSSIS KIFVVSAT 2096 P15318.2
    1214 BORDETELLA PERTUSSIS KQLNNANVYR 2097 P15318.2
    1215 BORDETELLA PERTUSSIS KVIGNAAGI 2098 P15318.2
    1216 BORDETELLA PERTUSSIS LAKVVSQL 2099 P15318.2
    1217 BORDETELLA PERTUSSIS LANDYARKI 2100 P15318.2
    1218 BORDETELLA PERTUSSIS LDYLRQAGL 2101 P15318.2
    1219 BORDETELLA PERTUSSIS LGKGFASL 2102 P15318.2
    1220 BORDETELLA PERTUSSIS LGKGFASLM 2103 P15318.2
    1221 BORDETELLA PERTUSSIS LGVDYYDN 2104 P15318.2
    1222 BORDETELLA PERTUSSIS LGVDYYDNV 2105 P15318.2
    1223 BORDETELLA PERTUSSIS LKHSIKLDVI 2106 P15318.2
    1224 BORDETELLA PERTUSSIS LQAGYIPV 2107 P15318.2
    1225 BORDETELLA PERTUSSIS LQLTGGTVE 2108 P15318.2
    1226 BORDETELLA PERTUSSIS LSAAVFGL 2109 P15318.2
    1227 BORDETELLA PERTUSSIS LSLGKGFASL 2110 P15318.2
    1228 BORDETELLA PERTUSSIS LSPMEIYGL 2111 P15318.2
    1229 BORDETELLA PERTUSSIS NAHDNFLAGG 2112 P15318.2
    1230 BORDETELLA PERTUSSIS NANVYREGV 2113 P15318.2
    1231 BORDETELLA PERTUSSIS NDTLYGGL 2114 P15318.2
    1232 BORDETELLA PERTUSSIS NGLAGNDVL 2115 P15318.2
    1233 BORDETELLA PERTUSSIS NNANVYREGV 2116 P15318.2
    1234 BORDETELLA PERTUSSIS NTVSYAAL 2117 P15318.2
    1235 BORDETELLA PERTUSSIS NVLRNIENAV 2118 P15318.2
    1236 BORDETELLA PERTUSSIS PALTFITPL 2119 P15318.2
    1237 BORDETELLA PERTUSSIS PETSNVLRNI 2120 P15318.2
    1238 BORDETELLA PERTUSSIS PMEIYGLV 2121 P15318.2
    1239 BORDETELLA PERTUSSIS PQAYFEKNL 2122 P15318.2
    1240 BORDETELLA PERTUSSIS PVNPNLSKL 2123 P15318.2
    1241 BORDETELLA PERTUSSIS QAGWNASSV 2124 P15318.2
    1242 BORDETELLA PERTUSSIS QAGWNASSVI 2125 P15318.2
    1243 BORDETELLA PERTUSSIS QDAANAGNL 2126 P15318.2
    1244 BORDETELLA PERTUSSIS QDAANAGNLL 2127 P15318.2
    1245 BORDETELLA PERTUSSIS QDSGYDSL 2128 P15318.2
    1246 BORDETELLA PERTUSSIS QQSHYADQL 2129 P15318.2
    1247 BORDETELLA PERTUSSIS RALQGAQAV 2130 P15318.2
    1248 BORDETELLA PERTUSSIS RGGLGLDTL 2131 P15318.2
    1249 BORDETELLA PERTUSSIS RKQLNNANV 2132 P15318.2
    1250 BORDETELLA PERTUSSIS RQDSGYDSL 2133 P15318.2
    1251 BORDETELLA PERTUSSIS RQFRYDGDM 2134 P15318.2
    1252 BORDETELLA PERTUSSIS RSKFSPDVL 2135 P15318.2
    1253 BORDETELLA PERTUSSIS SAGAAAGAL 2136 P15318.2
    1254 BORDETELLA PERTUSSIS SAHWGQRAL 2137 P15318.2
    1255 BORDETELLA PERTUSSIS SAMIHPGRI 2138 P15318.2
    1256 BORDETELLA PERTUSSIS SAMIHPGRIV 2139 P15318.2
    1257 BORDETELLA PERTUSSIS SAYDTVSGI 2140 P15318.2
    1258 BORDETELLA PERTUSSIS SAYGYEGD 2141 P15318.2
    1259 BORDETELLA PERTUSSIS SGGAGDDVL 2142 P15318.2
    1260 BORDETELLA PERTUSSIS SGLQVAGA 2143 P15318.2
    1261 BORDETELLA PERTUSSIS SGYDSLDGV 2144 P15318.2
    1262 BORDETELLA PERTUSSIS SLLTGALNGI 2145 P15318.2
    1263 BORDETELLA PERTUSSIS SPMEIYGL 2146 P15318.2
    1264 BORDETELLA PERTUSSIS SQMLTRGQL 2147 P15318.2
    1265 BORDETELLA PERTUSSIS SSAYDTVSGI 2148 P15318.2
    1266 BORDETELLA PERTUSSIS SSLAHGHTA 2149 P15318.2
    1267 BORDETELLA PERTUSSIS SSVTSGDSV 2150 P15318.2
    1268 BORDETELLA PERTUSSIS SVIGVQTTEI 2151 P15318.2
    1269 BORDETELLA PERTUSSIS TNTVSYAAL 2152 P15318.2
    1270 BORDETELLA PERTUSSIS TSLIAEGV 2153 P15318.2
    1271 BORDETELLA PERTUSSIS TSLLTGAL 2154 P15318.2
    1272 BORDETELLA PERTUSSIS TVPASPGL 2155 P15318.2
    1273 BORDETELLA PERTUSSIS VAKEKNATL 2156 P15318.2
    1274 BORDETELLA PERTUSSIS VAPHEYGFGI 2157 P15318.2
    1275 BORDETELLA PERTUSSIS VAVVTSLL 2158 P15318.2
    1276 BORDETELLA PERTUSSIS VFYENRAYG 2159 P15318.2
    1277 BORDETELLA PERTUSSIS VFYENRAYGV 2160 P15318.2
    1278 BORDETELLA PERTUSSIS VITDFELEV 2161 P15318.2
    1279 BORDETELLA PERTUSSIS VNPHSTSL 2162 P15318.2
    1280 BORDETELLA PERTUSSIS VNPHSTSLI 2163 P15318.2
    1281 BORDETELLA PERTUSSIS VNPNLSKL 2164 P15318.2
    1282 BORDETELLA PERTUSSIS VNPNLSKLF 2165 P15318.2
    1283 BORDETELLA PERTUSSIS VQQPIIEKL 2166 P15318.2
    1284 BORDETELLA PERTUSSIS VQYRHVEL 2167 P15318.2
    1285 BORDETELLA PERTUSSIS VSIAAAASV 2168 P15318.2
    1286 BORDETELLA PERTUSSIS VSIAAAASVV 2169 P15318.2
    1287 BORDETELLA PERTUSSIS VTSLLTGAL 2170 P15318.2
    1288 BORDETELLA PERTUSSIS VVLANASRI 2171 P15318.2
    1289 BORDETELLA PERTUSSIS WPALNLFSV 2172 P15318.2
    1290 BORDETELLA PERTUSSIS WVRKASAL 2173 P15318.2
    1291 BORDETELLA PERTUSSIS YAVQYRRKGG 2174 P15318.2
    1292 BORDETELLA PERTUSSIS YGGLGDDTL 2175 P15318.2
    1293 BORDETELLA PERTUSSIS YGLVQQSHYA 2176 P15318.2
    1294 BORDETELLA PERTUSSIS YGYEGDALL 2177 P15318.2
    1295 BORDETELLA PERTUSSIS YIPVNPNL 2178 P15318.2
    1296 BORDETELLA PERTUSSIS YSAMIHPGRI 2179 P15318.2
    1297 BORDETELLA PERTUSSIS YSQTGAHAGI 2180 P15318.2
    1298 CORYNEBACTERIU M DIPHTHERIAE AYNFVESIINLFQVVHNSYN 2181 CAE11230.1
    1299 BORDETELLA PERTUSSIS SGTTIK 2182 BAF35031.1
    1300 BORDETELLA PERTUSSIS RGHTLESAEGRKIFG 2183 AAA22974.1
    1301 BORDETELLA PERTUSSIS AGAMTVRDVAAAADLALQAGDA 2184 AAA22974.1
    1302 BORDETELLA PERTUSSIS AGAMTVRDVAAAADLALQAGDAL 2185 AAA22974.1
    1303 BORDETELLA PERTUSSIS
    Figure DE112021002672T5_0341
    		 2186 AAA22974.1
    1304 BORDETELLA PERTUSSIS ALSIDSMTALGA 2187 AAA22974.1
    1305 BORDETELLA PERTUSSIS DLSAARGADISGEGR 2188 AAA22974.1
    1306 BORDETELLA PERTUSSIS DQNRYEYIWGLY 2189 AAA22974.1
    1307 BORDETELLA PERTUSSIS DYTVSADAIALA 2190 AAA22974.1
    1308 BORDETELLA PERTUSSIS GPIVVEAGELVSHAGG 2191 AAA22974.1
    1309 BORDETELLA PERTUSSIS GRPEGLKIGAHSATSVSGSFDAL 2192 AAA22974.1
    1310 BORDETELLA PERTUSSIS ITVTSRGGFDNEGKMESNK 2193 AAA22974.1
    1311 BORDETELLA PERTUSSIS LDQNRYEYIWGLYP 2194 AAA22974.1
    1312 BORDETELLA PERTUSSIS LSAARGADISG 2195 AAA22974.1
    1313 BORDETELLA PERTUSSIS NKIRLMGPLQ 2196 AAA22974.1
    1314 BORDETELLA PERTUSSIS NKLGRIRAGEDM 2197 AAA22974.1
    1315 BORDETELLA PERTUSSIS NKLGRIRAGEDMHLDAPRIE 2198 AAA22974.1
    1316 BORDETELLA PERTUSSIS PHLRNTGQVVAG 2199 AAA22974.1
    1317 BORDETELLA PERTUSSIS QVDLHDLSAARGADISG 2200 AAA22974.1
    1318 BORDETELLA PERTUSSIS RDVAAAADLALQ 2201 AAA22974.1
    1319 BORDETELLA PERTUSSIS SAARGADISGEG 2202 AAA22974.1
    1320 BORDETELLA PERTUSSIS TKGEMQIAGKGGGSP 2203 AAA22974.1
    1321 BORDETELLA PERTUSSIS TVSADAIALAAQ 2204 AAA22974.1
    1322 BORDETELLA PERTUSSIS VVAGHDIHI 2205 AAA22974.1
    1323 BORDETELLA PERTUSSIS PSGPNHTKVVQLPKISKNALKANG 2206 CAD12823.1
    1324 RUBELLA VIRUS
    Figure DE112021002672T5_0342
    		 2207 BAA19902.1
    1325 RUBELLA VIRUS QQSRWGLGSPNCHGPDWASPVCQRHSP 2208 BAA19902.1
    1326 BORDETELLA PERTUSSIS AGEAMVLVYYESIAYSF 2209 ACI04548.1
    1327 BORDETELLA PERTUSSIS GGVGLASTLWYAESNALSKRLGEL 2210 AAZ74322.1
    1328 BORDETELLA PERTUSSIS GTLVRIAPVIGACMARQA 2211 ACI04548.1
    1329 BORDETELLA PERTUSSIS IRRVTRVYHNGITGETTT 2212 ACI04548.1
    1330 BORDETELLA PERTUSSIS IVKTGERQHGIHIQGSDP 2213 AAZ74322.1
    1331 BORDETELLA PERTUSSIS IVKTGERQHGIHIQGSDPGGVRTA 2214 AAZ74338.1
    1332 BORDETELLA PERTUSSIS LRDTNVTAVPASGAPAAVSVLGAS 2215 AAZ74338.1
    1333 BORDETELLA PERTUSSIS PEAPAPQPPAGRELSAAANAAVNT 2216 AAZ74322.1
    1334 BORDETELLA PERTUSSIS AAADFAHAE 2217 WP_019247158.1
    1335 BORDETELLA PERTUSSIS AAAEVAGAL 2218 WP_019249248.1
    1336 BORDETELLA PERTUSSIS AAESTFESY 2219 WP_019247158.1
    1337 BORDETELLA PERTUSSIS AAGFDPEVQ 2220 WP_019248145.1
    1338 BORDETELLA PERTUSSIS AALGRGHSL 2221 AGS56996.1
    1339 BORDETELLA PERTUSSIS AAMQGAVVH 2222 AGT50936.1
    1340 BORDETELLA PERTUSSIS AAPAAHADW 2223 AGS56996.1
    1341 BORDETELLA PERTUSSIS AAQATVVQR 2224 WP_019247158.1
    1342 BORDETELLA PERTUSSIS AARVAGDNY 2225 WP_019249248.1
    1343 BORDETELLA PERTUSSIS AAVALLNKL 2226 WP_019249248.1
    1344 BORDETELLA PERTUSSIS ADDPPATVY 2227 AAW72734.1
    1345 BORDETELLA PERTUSSIS AEAGRFKVL 2228 AGS56996.1
    1346 BORDETELLA PERTUSSIS AEATQLVTA 2229 WP_019247158.1
    1347 BORDETELLA PERTUSSIS AEGGATLGA 2230 WP_019249248.1
    1348 BORDETELLA PERTUSSIS AEHGEVSIQ 2231 WP_019249248.1
    1349 BORDETELLA PERTUSSIS AEIAFYPKE 2232 WP_019249248.1
    1350 BORDETELLA PERTUSSIS AEKVTTPAV 2233 WP_019247158.1
    1351 BORDETELLA PERTUSSIS AELQTYLRQ 2234 1BCP_C
    1352 BORDETELLA PERTUSSIS AEQSLIEVG 2235 WP_019249248.1
    1353 BORDETELLA PERTUSSIS AESNALSKR 2236 AGS56996.1
    1354 BORDETELLA PERTUSSIS AESSEAMAA 2237 AFK26302.1
    1355 BORDETELLA PERTUSSIS AEVKVGYRA 2238 WP_019247158.1
    1356 BORDETELLA PERTUSSIS AEVTDTSPS 2239 WP_019249248.1
    1357 BORDETELLA PERTUSSIS AGKSLKKKN 2240 WP_019247158.1
    1358 BORDETELLA PERTUSSIS AGLAGPSAV 2241 WP_019249248.1
    1359 BORDETELLA PERTUSSIS AIRVGRGAR 2242 AGT50936.1
    1360 BORDETELLA PERTUSSIS ALAAIASAA 2243 WP_019248145.1
    1361 BORDETELLA PERTUSSIS ALADVPYVL 2244 AAA22983.1
    1362 BORDETELLA PERTUSSIS ALANDGTIV 2245 WP_019248658.1
    1363 BORDETELLA PERTUSSIS ALGRGHSLY 2246 AGS56996.1
    1364 BORDETELLA PERTUSSIS ALILAASPV 2247 WP_019248658.1
    1365 BORDETELLA PERTUSSIS ALMLACTGL 2248 AAA22974.1
    1366 BORDETELLA PERTUSSIS AMQGAVVHL 2249 AGT50936.1
    1367 BORDETELLA PERTUSSIS AMTHLSPAL 2250 AAA22983.1
    1368 BORDETELLA PERTUSSIS AMYGKHITL 2251 WP_019249248.1
    1369 BORDETELLA PERTUSSIS ANEANALLW 2252 WP_019249248.1
    1370 BORDETELLA PERTUSSIS APLSITLQA 2253 AGT50936.1
    1371 BORDETELLA PERTUSSIS APNALAWAL 2254 AAA22974.1
    1372 BORDETELLA PERTUSSIS APPAPKPAP 2255 AGS56996.1
    1373 BORDETELLA PERTUSSIS APPGAGFIY 2256 1BCP_C
    1374 BORDETELLA PERTUSSIS APQAAPLSI 2257 AGT50936.1
    1375 BORDETELLA PERTUSSIS APRIENTAK 2258 WP_019249248.1
    1376 BORDETELLA PERTUSSIS AQGKALLYR 2259 AGT50936.1
    1377 BORDETELLA PERTUSSIS AQITSYVGF 2260 WP_019248658.1
    1378 BORDETELLA PERTUSSIS AQLEVRGQR 2261 WP_019249248.1
    1379 BORDETELLA PERTUSSIS AQQLKQADR 2262 WP_019247699.1
    1380 BORDETELLA PERTUSSIS AQVTVAGRY 2263 WP_019249248.1
    1381 BORDETELLA PERTUSSIS ARRSRVRAL 2264 NP_882284.1
    1382 BORDETELLA PERTUSSIS ASPRRARRA 2265 WP_019249248.1
    1383 BORDETELLA PERTUSSIS ASSPDAHVP 2266 AAA22983.1
    1384 BORDETELLA PERTUSSIS ASVSNPGTF 2267 WP_019249248.1
    1385 BORDETELLA PERTUSSIS ATWNFQSTY 2268 WP_019249248.1
    1386 BORDETELLA PERTUSSIS ATYIADSGF 2269 AGS56996.1
    1387 BORDETELLA PERTUSSIS AVAAPAVGA 2270 WP_019249248.1
    1388 BORDETELLA PERTUSSIS AVFMQQRPL 2271 AAA22983.1
    1389 BORDETELLA PERTUSSIS AVLVNPHIF 2272 WP_019249248.1
    1390 BORDETELLA PERTUSSIS CFGKDLKRP 2273 AAA22983.1
    1391 BORDETELLA PERTUSSIS CPSSLGNGV 2274 WP_019248145.1
    1392 BORDETELLA PERTUSSIS DAGHEHDTW 2275 AAA22984.1
    1393 BORDETELLA PERTUSSIS DAKHDLTVT 2276 WP_019249248.1
    1394 BORDETELLA PERTUSSIS DASGQHRLW 2277 AGS56996.1
    1395 BORDETELLA PERTUSSIS DATFETYAL 2278 YP_006628018.1
    1396 BORDETELLA PERTUSSIS DATFQTYAL 2279 1BCP_C
    1397 BORDETELLA PERTUSSIS DATLVGAKF 2280 WP_019247158.1
    1398 BORDETELLA PERTUSSIS DDEVDVSGR 2281 AAA22974.1
    1399 BORDETELLA PERTUSSIS DENGKPQTY 2282 WP_019247158.1
    1400 BORDETELLA PERTUSSIS DGPPSRPTT 2283 WP_019247158.1
    1401 BORDETELLA PERTUSSIS DHLTGRSCQ 2284 AAW72734.1
    1402 BORDETELLA PERTUSSIS DNEGKMESN 2285 WP_019249248.1
    1403 BORDETELLA PERTUSSIS DPPATVYRY 2286 AAW72734.1
    1404 BORDETELLA PERTUSSIS EATEGDATL 2287 WP_019247158.1
    1405 BORDETELLA PERTUSSIS EATQQAAGF 2288 WP_019248145.1
    1406 BORDETELLA PERTUSSIS ECSGKQDCP 2289 AAA22983.1
    1407 BORDETELLA PERTUSSIS EGGKLRGKD 2290 AAA22974.1
    1408 BORDETELLA PERTUSSIS EGKMESNKD 2291 WP_019249248.1
    1409 BORDETELLA PERTUSSIS EHRMQEAVE 2292 AAW72734.1
    1410 BORDETELLA PERTUSSIS EKRLDIDDA 2293 WP_019249248.1
    1411 BORDETELLA PERTUSSIS EPASANTLL 2294 AGS56996.1
    1412 BORDETELLA PERTUSSIS EPQAELAVF 2295 AGS56996.1
    1413 BORDETELLA PERTUSSIS EPVKLTLTG 2296 AGT50936.1
    1414 BORDETELLA PERTUSSIS ESAEGRKIF 2297 WP_019249248.1
    1415 BORDETELLA PERTUSSIS ESYSESHNF 2298 WP_019247158.1
    1416 BORDETELLA PERTUSSIS ETFCITTIY 2299 1BCP_C
    1417 BORDETELLA PERTUSSIS EVAGALELS 2300 WP_019249248.1
    1418 BORDETELLA PERTUSSIS EVAKVEVVP 2301 WP_019247158.1
    1419 BORDETELLA PERTUSSIS EVDGIIQEF 2302 WP_019249248.1
    1420 BORDETELLA PERTUSSIS EVRADNNFY 2303 WP_019248344.1
    1421 BORDETELLA PERTUSSIS FAILSSTTE 2304 WP_019247158.1
    1422 BORDETELLA PERTUSSIS FAISAYALK 2305 AAA22984.1
    1423 BORDETELLA PERTUSSIS FALYDGTYL 2306 AFK26303.1
    1424 BORDETELLA PERTUSSIS FDTMLGFAI 2307 AAA22984.1
    1425 BORDETELLA PERTUSSIS FEGKPALEL 2308 AAA22983.1
    1426 BORDETELLA PERTUSSIS FELGADHAV 2309 AGS56996.1
    1427 BORDETELLA PERTUSSIS FEPGITTNY 2310 WP_019248658.1
    1428 BORDETELLA PERTUSSIS FETYALTGI 2311 YP_006628018.1
    1429 BORDETELLA PERTUSSIS F1YRETFC1 2312 1BCP_C
    1430 BORDETELLA PERTUSSIS FPTRTTAPG 2313 NP_882284.1
    1431 BORDETELLA PERTUSSIS FQTYALTGI 2314 1BCP_C
    1432 BORDETELLA PERTUSSIS FTHADGWFL 2315 AGS56996.1
    1433 BORDETELLA PERTUSSIS FVRDGQSVI 2316 1BCP_C
    1434 BORDETELLA PERTUSSIS FVRSGQPVI 2317 YP_006628018.1
    1435 BORDETELLA PERTUSSIS FVWYVDTVI 2318 WP_019248866.1
    1436 BORDETELLA PERTUSSIS GAASSRQAL 2319 WP_019249248.1
    1437 BORDETELLA PERTUSSIS GAASSYFEY 2320 AAW72734.1
    1438 BORDETELLA PERTUSSIS GAFDLKTTF 2321 AFK26303.1
    1439 BORDETELLA PERTUSSIS GAPAAVSVL 2322 AGS56996.1
    1440 BORDETELLA PERTUSSIS GATRAVDSL 2323 AGS56996.1
    1441 BORDETELLA PERTUSSIS GAVPGGAVP 2324 AGT50936.1
    1442 BORDETELLA PERTUSSIS GEAMVLVYY 2325 AFK26302.1
    1443 BORDETELLA PERTUSSIS GEIALGDAT 2326 WP_019249248.1
    1444 BORDETELLA PERTUSSIS GELMAAQVA 2327 WP_019247158.1
    1445 BORDETELLA PERTUSSIS GGVPGGAVP 2328 AAZ74338.1
    1446 BORDETELLA PERTUSSIS GHEHDTWFD 2329 AAA22984.1
    1447 BORDETELLA PERTUSSIS GIGALKAGA 2330 WP_019249248.1
    1448 BORDETELLA PERTUSSIS GIVIPPKAL 2331 1BCP_C
    1449 BORDETELLA PERTUSSIS GKDLKRPGS 2332 AAA22983.1
    1450 BORDETELLA PERTUSSIS GKLPKPVTV 2333 WP_019247158.1
    1451 BORDETELLA PERTUSSIS GKSLKKKNQ 2334 WP_019247158.1
    1452 BORDETELLA PERTUSSIS GLDVQQGTV 2335 WP_019249248.1
    1453 BORDETELLA PERTUSSIS GLTDGVSRI 2336 WP_019249248.1
    1454 BORDETELLA PERTUSSIS GLYPTYTEW 2337 WP_019249248.1
    1455 BORDETELLA PERTUSSIS GLYQTYTEW 2338 YP_006626470.1
    1456 BORDETELLA PERTUSSIS GPPSRPTTP 2339 WP_019247158.1
    1457 BORDETELLA PERTUSSIS GPSAVAAPA 2340 WP_019249248.1
    1458 BORDETELLA PERTUSSIS GVAPTAQQL 2341 WP_019248866.1
    1459 BORDETELLA PERTUSSIS GVGLASTLW 2342 AGS56996.1
    1460 BORDETELLA PERTUSSIS GYEAGFSLG 2343 WP_019247158.1
    1461 BORDETELLA PERTUSSIS HADDGTIVI 2344 WP_019248145.1
    1462 BORDETELLA PERTUSSIS HADWNNQSI 2345 AGS56996.1
    1463 BORDETELLA PERTUSSIS HAEHEKDVR 2346 WP_019247158.1
    1464 BORDETELLA PERTUSSIS HANHYGTRI 2347 WP_019247158.1
    1465 BORDETELLA PERTUSSIS HAQGKALLY 2348 AGT50936.1
    1466 BORDETELLA PERTUSSIS HFIGYIYEV 2349 AAW72734.1
    1467 BORDETELLA PERTUSSIS HLSPALADV 2350 AAA22983.1
    1468 BORDETELLA PERTUSSIS HSLYASYEY 2351 AGS56996.1
    1469 BORDETELLA PERTUSSIS HVRGMLVPV 2352 AAA22974.1
    1470 BORDETELLA PERTUSSIS HVSKEEQYY 2353 YP_006628018.1
    1471 BORDETELLA PERTUSSIS HVTRGWSIF 2354 AFK26303.1
    1472 BORDETELLA PERTUSSIS IADSGFYLD 2355 AGS56996.1
    1473 BORDETELLA PERTUSSIS IAHRTELRG 2356 AGS56996.1
    1474 BORDETELLA PERTUSSIS IENTAKLSG 2357 WP_019249248.1
    1475 BORDETELLA PERTUSSIS IESKISQSV 2358 WP_019249248.1
    1476 BORDETELLA PERTUSSIS IETGGARRF 2359 AGT50936.1
    1477 BORDETELLA PERTUSSIS IIKDAPPGA 2360 1BCP_C
    1478 BORDETELLA PERTUSSIS IIQEFAADL 2361 WP_019249248.1
    1479 BORDETELLA PERTUSSIS ILAGALATY 2362 AAW72734.1
    1480 BORDETELLA PERTUSSIS ILLENPAAE 2363 AGS56996.1
    1481 BORDETELLA PERTUSSIS ILPILVLAL 2364 NP_882286.1
    1482 BORDETELLA PERTUSSIS IPFQRALRL 2365 WP_019248145.1
    1483 BORDETELLA PERTUSSIS ISVRVHVSK 2366 YP_006628018.1
    1484 BORDETELLA PERTUSSIS ITNETGKTY 2367 WP_019247158.1
    1485 BORDETELLA PERTUSSIS ITNKRAALI 2368 WP_019249248.1
    1486 BORDETELLA PERTUSSIS ITSYVGFSV 2369 WP_019248658.1
    1487 BORDETELLA PERTUSSIS ITVTSRGGF 2370 WP_019249248.1
    1488 BORDETELLA PERTUSSIS IVIPPKALF 2371 1BCP_C
    1489 BORDETELLA PERTUSSIS IVVEAGELV 2372 WP_019249248.1
    1490 BORDETELLA PERTUSSIS KAAKSVNLM 2373 WP_019247158.1
    1491 BORDETELLA PERTUSSIS KAAPLRRTT 2374 AGS56996.1
    1492 BORDETELLA PERTUSSIS KAGKLSATG 2375 WP_019249248.1
    1493 BORDETELLA PERTUSSIS KAGTIAAPW 2376 WP_019249248.1
    1494 BORDETELLA PERTUSSIS KAKSLTTEI 2377 WP_019249248.1
    1495 BORDETELLA PERTUSSIS KATVTTVQV 2378 WP_019247158.1
    1496 BORDETELLA PERTUSSIS KDYRDKDGG 2379 WP_019247158.1
    1497 BORDETELLA PERTUSSIS KEAATIVAA 2380 WP_019249248.1
    1498 BORDETELLA PERTUSSIS KEDVDAAQI 2381 WP_019248658.1
    1499 BORDETELLA PERTUSSIS KEVDGIIQE 2382 WP_019249248.1
    1500 BORDETELLA PERTUSSIS KGPKLAMPW 2383 AGS56996.1
    1501 BORDETELLA PERTUSSIS KLASGGGAV 2384 WP_019249248.1
    1502 BORDETELLA PERTUSSIS KLKGKNQEF 2385 AAA22984.1
    1503 BORDETELLA PERTUSSIS KLLHHILPI 2386 NP_882286.1
    1504 BORDETELLA PERTUSSIS KPAPQPGPQ 2387 AGS56996.1
    1505 BORDETELLA PERTUSSIS KPAPTAPPM 2388 WP_019249248.1
    1506 BORDETELLA PERTUSSIS KPAVSVKVA 2389 WP_019249248.1
    1507 BORDETELLA PERTUSSIS KPDRAARVA 2390 WP_019249248.1
    1508 BORDETELLA PERTUSSIS KPLADIAVI 2391 YP_006626470.1
    1509 BORDETELLA PERTUSSIS KPLADIAVV 2392 WP_019249248.1
    1510 BORDETELLA PERTUSSIS KPLPKPLPV 2393 WP_019247158.1
    1511 BORDETELLA PERTUSSIS KQADRDFVW 2394 WP_019247699.1
    1512 BORDETELLA PERTUSSIS KSLPGGKLP 2395 WP_019247158.1
    1513 BORDETELLA PERTUSSIS KSYTLRYLA 2396 WP_019248658.1
    1514 BORDETELLA PERTUSSIS KTNMVVTSV 2397 AAA22983.1
    1515 BORDETELLA PERTUSSIS KVLAPRLYL 2398 AAA22974.1
    1516 BORDETELLA PERTUSSIS KVLSTKTTL 2399 WP_019247158.1
    1517 BORDETELLA PERTUSSIS LAAGAGLTL 2400 WP_019249248.1
    1518 BORDETELLA PERTUSSIS LAAIASAAH 2401 WP_019248145.1
    1519 BORDETELLA PERTUSSIS LAANGNGQW 2402 AGS56996.1
    1520 BORDETELLA PERTUSSIS LAAQVTQRG 2403 WP_019249248.1
    1521 BORDETELLA PERTUSSIS LAARGDGAL 2404 AAA22974.1
    1522 BORDETELLA PERTUSSIS LAAVLVNPH 2405 WP_019249248.1
    1523 BORDETELLA PERTUSSIS LAGSGLFRM 2406 AGS56996.1
    1524 BORDETELLA PERTUSSIS LAKALSAAL 2407 WP_019249248.1
    1525 BORDETELLA PERTUSSIS LALQAGDAL 2408 WP_019249248.1
    1526 BORDETELLA PERTUSSIS LAMPWTFHA 2409 AGS56996.1
    1527 BORDETELLA PERTUSSIS LANDGTIVI 2410 WP_019248658.1
    1528 BORDETELLA PERTUSSIS LAPTVGVAF 2411 WP_019247158.1
    1529 BORDETELLA PERTUSSIS LASDGSVDF 2412 AGS56996.1
    1530 BORDETELLA PERTUSSIS LATYQSEYL 2413 AAW72734.1
    1531 BORDETELLA PERTUSSIS LAWALMLAC 2414 AAA22974.1
    1532 BORDETELLA PERTUSSIS LEAGRRFTH 2415 AGS56996.1
    1533 BORDETELLA PERTUSSIS LFTQQGGAY 2416 1BCP_C
    1534 BORDETELLA PERTUSSIS LKRPGSSPM 2417 AAA22983.1
    1535 BORDETELLA PERTUSSIS LLGSHVARA 2418 AFK26303.1
    1536 BORDETELLA PERTUSSIS LLHHILPIL 2419 NP_882286.1
    1537 BORDETELLA PERTUSSIS LLNAGGTLL 2420 WP_019249248.1
    1538 BORDETELLA PERTUSSIS LMGPLQVNA 2421 WP_019249248.1
    1539 BORDETELLA PERTUSSIS LNDSKITMG 2422 WP_019248145.1
    1540 BORDETELLA PERTUSSIS LPEPVKLTL 2423 AGT50936.1
    1541 BORDETELLA PERTUSSIS LPILVLALL 2424 NP_882286.1
    1542 BORDETELLA PERTUSSIS LPKISKNAL 2425 WP_019248145.1
    1543 BORDETELLA PERTUSSIS LPKPVTVKL 2426 WP_019247158.1
    1544 BORDETELLA PERTUSSIS LPLKANPMH 2427 NP_882285.1
    1545 BORDETELLA PERTUSSIS LPPRPVVAE 2428 WP_019247158.1
    1546 BORDETELLA PERTUSSIS LPSIPGTSI 2429 AGS56996.1
    1547 BORDETELLA PERTUSSIS LPTHLYKNF 2430 AAA22984.1
    1548 BORDETELLA PERTUSSIS LPVRGVALV 2431 WP_019249248.1
    1549 BORDETELLA PERTUSSIS LPVSLTALD 2432 WP_019249248.1
    1550 BORDETELLA PERTUSSIS LQGGNKVPV 2433 WP_019249248.1
    1551 BORDETELLA PERTUSSIS LSAALGADW 2434 WP_019249248.1
    1552 BORDETELLA PERTUSSIS LSDAGHEHD 2435 AAA22984.1
    1553 BORDETELLA PERTUSSIS LSGEVQRKG 2436 WP_019249248.1
    1554 BORDETELLA PERTUSSIS LSSPSAITV 2437 WP_019249248.1
    1555 BORDETELLA PERTUSSIS LTWLAILAV 2438 AAW72734.1
    1556 BORDETELLA PERTUSSIS LVFSHVRGM 2439 AAA22974.1
    1557 BORDETELLA PERTUSSIS LVSDAGADL 2440 WP_019249248.1
    1558 BORDETELLA PERTUSSIS LVYYESIAY 2441 AFK26302.1
    1559 BORDETELLA PERTUSSIS MAAESTFES 2442 WP_019247158.1
    1560 BORDETELLA PERTUSSIS MAAGHDATL 2443 WP_019249248.1
    1561 BORDETELLA PERTUSSIS MAAWSERAG 2444 AFK26302.1
    1562 BORDETELLA PERTUSSIS MALGALGAA 2445 AGS56996.1
    1563 BORDETELLA PERTUSSIS MAPVMGACM 2446 ADA85123.1
    1564 BORDETELLA PERTUSSIS MATKGEMQI 2447 WP_019249248.1
    1565 BORDETELLA PERTUSSIS MDAKGGTLL 2448 WP_019249248.1
    1566 BORDETELLA PERTUSSIS MESNKDIVI 2449 WP_019249248.1
    1567 BORDETELLA PERTUSSIS MEVMLRAVF 2450 AAA22983.1
    1568 BORDETELLA PERTUSSIS MEYFKTPLP 2451 WP_019249248.1
    1569 BORDETELLA PERTUSSIS MHTIASILL 2452 AAA22984.1
    1570 BORDETELLA PERTUSSIS MIYMSGLAV 2453 1BCP_C
    1571 BORDETELLA PERTUSSIS MLACTGLPL 2454 AAA22974.1
    1572 BORDETELLA PERTUSSIS MPIDRKTLC 2455 AFK26303.1
    1573 BORDETELLA PERTUSSIS MPKAPELDL 2456 WP_019249248.1
    1574 BORDETELLA PERTUSSIS MQRQAGLPL 2457 NP _882285.1
    1575 BORDETELLA PERTUSSIS NALAWALML 2458 AAA22974.1
    1576 BORDETELLA PERTUSSIS NITNKRAAL 2459 WP_019249248.1
    1577 BORDETELLA PERTUSSIS NLMAAESTF 2460 WP_019247158.1
    1578 BORDETELLA PERTUSSIS NNETMSGRQ 2461 WP_019249248.1
    1579 BORDETELLA PERTUSSIS NPGSLlAEV 2462 WP_019249248.1
    1580 BORDETELLA PERTUSSIS NPMHTIASI 2463 NP_882285.1
    1581 BORDETELLA PERTUSSIS NPQTQLSNI 2464 WP_019248145.1
    1582 BORDETELLA PERTUSSIS NPYTSRRSV 2465 AFK26302.1
    1583 BORDETELLA PERTUSSIS PAPTAPPMP 2466 WP_019249248.1
    1584 BORDETELLA PERTUSSIS PASANTLLL 2467 AGS56996.1
    1585 BORDETELLA PERTUSSIS PAVALPRPL 2468 WP_019249248.1
    1586 BORDETELLA PERTUSSIS PDAHVPFCF 2469 AAA22983.1
    1587 BORDETELLA PERTUSSIS PELGAAIRV 2470 AGT50936.1
    1588 BORDETELLA PERTUSSIS PFIIKLKDC 2471 WP_019248145.1
    1589 BORDETELLA PERTUSSIS PGPQPPQPP 2472 AGS56996.1
    1590 BORDETELLA PERTUSSIS PGPQPPQPQ 2473 AAZ74338.1
    1591 BORDETELLA PERTUSSIS PGPTTDYST 2474 WP_019248145.1
    1592 BORDETELLA PERTUSSIS PGTFTAGKD 2475 WP_019249248.1
    1593 BORDETELLA PERTUSSIS PGTPGDLLE 2476 AAA22984.1
    1594 BORDETELLA PERTUSSIS PKPKPKAER 2477 WP_019247158.1
    1595 BORDETELLA PERTUSSIS PKPKPKPKA 2478 WP_019247158.1
    1596 BORDETELLA PERTUSSIS PKPKPKPKP 2479 WP_019247158.1
    1597 BORDETELLA PERTUSSIS PLPPRPVVA 2480 WP_019247158.1
    1598 BORDETELLA PERTUSSIS PPAPKPAPQ 2481 AGS56996.1
    1599 BORDETELLA PERTUSSIS PPKPAPVAK 2482 WP_019247158.1
    1600 BORDETELLA PERTUSSIS PPRPVAAQV 2483 WP_019247158.1
    1601 BORDETELLA PERTUSSIS PPRPVVAEK 2484 WP_019247158.1
    1602 BORDETELLA PERTUSSIS PPSRPTTPP 2485 WP_019247158.1
    1603 BORDETELLA PERTUSSIS PRRARRALR 2486 WP_019249248.1
    1604 BORDETELLA PERTUSSIS QAAPLSITL 2487 AGT50936.1
    1605 BORDETELLA PERTUSSIS QADRDFVWY 2488 WP_019247699.1
    1606 BORDETELLA PERTUSSIS QAIVVGKDL 2489 WP_019249248.1
    1607 BORDETELLA PERTUSSIS QALGALKLY 2490 ACI16088.1
    1608 BORDETELLA PERTUSSIS QELALKLKG 2491 AAA22984.1
    1609 BORDETELLA PERTUSSIS QITQHGGPY 2492 NP_882283.1
    1610 BORDETELLA PERTUSSIS QITQHGSPY 2493 AFK26303.1
    1611 BORDETELLA PERTUSSIS QPLPPRPVA 2494 WP_019247158.1
    1612 BORDETELLA PERTUSSIS QPPAGRELS 2495 AGS56996.1
    1613 BORDETELLA PERTUSSIS QQLKQADRD 2496 WP_019247699.1
    1614 BORDETELLA PERTUSSIS QQVQVLQRQ 2497 WP_019247158.1
    1615 BORDETELLA PERTUSSIS QSIVEAPEL 2498 AGT50936.1
    1616 BORDETELLA PERTUSSIS QVGSSNSAF 2499 AAW72734.1
    1617 BORDETELLA PERTUSSIS RAGLSPATW 2500 WP_019249248.1
    1618 BORDETELLA PERTUSSIS RARRALRQD 2501 WP_019249248.1
    1619 BORDETELLA PERTUSSIS RASASRARI 2502 WP_019249248.1
    1620 BORDETELLA PERTUSSIS RELSAAANA 2503 AGS56996.1
    1621 BORDETELLA PERTUSSIS RETFCITTI 2504 1BCP_C
    1622 BORDETELLA PERTUSSIS RGFAQRQQL 2505 AGS56996.1
    1623 BORDETELLA PERTUSSIS RGSAATFTL 2506 WP_019248295.1
    1624 BORDETELLA PERTUSSIS RGWSIFALY 2507 AFK26303.1
    1625 BORDETELLA PERTUSSIS RKMLYLIYV 2508 YP_006628018.1
    1626 BORDETELLA PERTUSSIS RLRKMLYLI 2509 YP_006628018.1
    1627 BORDETELLA PERTUSSIS RPQITDAVT 2510 WP_019249248.1
    1628 BORDETELLA PERTUSSIS RPSVNGGRI 2511 WP_019249248.1
    1629 BORDETELLA PERTUSSIS RRFTHADGW 2512 AGS56996.1
    1630 BORDETELLA PERTUSSIS RSGARATSL 2513 AAA22974.1
    1631 BORDETELLA PERTUSSIS RSRVRALAW 2514 NP_882284.1
    1632 BORDETELLA PERTUSSIS RSRVRALSW 2515 YP_006628019.1
    1633 BORDETELLA PERTUSSIS RTHGVGASL 2516 AGS56996.1
    1634 BORDETELLA PERTUSSIS RTRGQARSG 2517 AAA22974.1
    1635 BORDETELLA PERTUSSIS RVAPPAVAL 2518 WP_019249248.1
    1636 BORDETELLA PERTUSSIS RVLPEPVKL 2519 AGT50936.1
    1637 BORDETELLA PERTUSSIS RVRALAWLL 2520 NP_882284.1
    1638 BORDETELLA PERTUSSIS RVRALSWLL 2521 YP_006628019.1
    1639 BORDETELLA PERTUSSIS RVTVSGGSL 2522 AGT50936.1
    1640 BORDETELLA PERTUSSIS SEAMAAWSE 2523 AFK26302.1
    1641 BORDETELLA PERTUSSIS SESHNFHAS 2524 WP_019247158.1
    1642 BORDETELLA PERTUSSIS SGEGRVNIG 2525 WP_019249248.1
    1643 BORDETELLA PERTUSSIS SGLAVRVHV 2526 1BCP_C
    1644 BORDETELLA PERTUSSIS SLADISLGA 2527 WP_019249248.1
    1645 BORDETELLA PERTUSSIS SLFAILSST 2528 WP_019247158.1
    1646 BORDETELLA PERTUSSIS SLFAPHGNV 2529 AAZ74338.1
    1647 BORDETELLA PERTUSSIS SLSIDNATW 2530 AGS56996.1
    1648 BORDETELLA PERTUSSIS SPMEVMLRA 2531 AAA22983.1
    1649 BORDETELLA PERTUSSIS SPQPIRATV 2532 WP_019247158.1
    1650 BORDETELLA PERTUSSIS SPRRARRAL 2533 WP_019249248.1
    1651 BORDETELLA PERTUSSIS SPSRLAGTL 2534 WP_019249248.1
    1652 BORDETELLA PERTUSSIS SSTPLGSLF 2535 WP_019247158.1
    1653 BORDETELLA PERTUSSIS STYELLDYL 2536 WP_019249248.1
    1654 BORDETELLA PERTUSSIS SVAMKPYEV 2537 AAA22983.1
    1655 BORDETELLA PERTUSSIS SVAPNALAW 2538 AAA22974.1
    1656 BORDETELLA PERTUSSIS SVKVAKKLF 2539 WP_019249248.1
    1657 BORDETELLA PERTUSSIS TAFMSGRSL 2540 AAA22984.1
    1658 BORDETELLA PERTUSSIS TAGATPFDI 2541 WP_019248658.1
    1659 BORDETELLA PERTUSSIS TAPVTSPAW 2542 AAW72734.1
    1660 BORDETELLA PERTUSSIS TARTGWLTW 2543 AAW72734.1
    1661 BORDETELLA PERTUSSIS TEAQGVQVR 2544 WP_019248145.1
    1662 BORDETELLA PERTUSSIS TEVYLEHRM 2545 AAW72734.1
    1663 BORDETELLA PERTUSSIS TFEGKPALE 2546 AAA22983.1
    1664 BORDETELLA PERTUSSIS TFTGKVTNG 2547 WP_019248658.1
    1665 BORDETELLA PERTUSSIS TGDGGGHTD 2548 AGS56996.1
    1666 BORDETELLA PERTUSSIS TLAKALSAA 2549 WP_019249248.1
    1667 BORDETELLA PERTUSSIS TLANVGDTW 2550 AGS56996.1
    1668 BORDETELLA PERTUSSIS TLNASNLTL 2551 WP_019249248.1
    1669 BORDETELLA PERTUSSIS TLSSAHGNV 2552 WP_019249248.1
    1670 BORDETELLA PERTUSSIS TPFDIKLKE 2553 WP_019248658.1
    1671 BORDETELLA PERTUSSIS TPFIIKLKD 2554 WP_019248145.1
    1672 BORDETELLA PERTUSSIS TPGWSIYGL 2555 1BCP_C
    1673 BORDETELLA PERTUSSIS TPLGSAATF 2556 AGS56996.1
    1674 BORDETELLA PERTUSSIS TPLGSLFAI 2557 WP_019247158.1
    1675 BORDETELLA PERTUSSIS TPLPVSLTA 2558 WP_019249248.1
    1676 BORDETELLA PERTUSSIS TRQGIMDQY 2559 YP_006626873.1
    1677 BORDETELLA PERTUSSIS TSKQDERNY 2560 WP_019247158.1
    1678 BORDETELLA PERTUSSIS TSPYDGKYW 2561 YP_006628018.1
    1679 BORDETELLA PERTUSSIS TSRRSVASI 2562 AFK26302.1
    1680 BORDETELLA PERTUSSIS TSRTVTMRY 2563 NP_879898.1
    1681 BORDETELLA PERTUSSIS TTEYPNARY 2564 ADA85123.1
    1682 BORDETELLA PERTUSSIS TTEYSNARY 2565 AFK26302.1
    1683 BORDETELLA PERTUSSIS TTLGLEQTF 2566 WP_019247158.1
    1684 BORDETELLA PERTUSSIS TVLAAGAGL 2567 WP_019249248.1
    1685 BORDETELLA PERTUSSIS TVQELALKL 2568 AAA22984.1
    1686 BORDETELLA PERTUSSIS TWQRNKHW 2569 WP_019247158.1
    1687 BORDETELLA PERTUSSIS VAAAADLAL 2570 WP_019249248.1
    1688 BORDETELLA PERTUSSIS VALASQARW 2571 AGS56996.1
    1689 BORDETELLA PERTUSSIS VAMKPYEVT 2572 AAA22983.1
    1690 BORDETELLA PERTUSSIS VARLVKLQG 2573 WP_019249248.1
    1691 BORDETELLA PERTUSSIS VAVAGGRWH 2574 AGS56996.1
    1692 BORDETELLA PERTUSSIS VEASAITTY 2575 WP_019248145.1
    1693 BORDETELLA PERTUSSIS VEDIGGKNY 2576 WP_019247158.1
    1694 BORDETELLA PERTUSSIS VEVSSPPPV 2577 WP_019247158.1
    1695 BORDETELLA PERTUSSIS VGAGGYEAG 2578 WP_019247158.1
    1696 BORDETELLA PERTUSSIS VGGGEHGRW 2579 WP_019249248.1
    1697 BORDETELLA PERTUSSIS VHVSKEEQY 2580 YP_006628018.1
    1698 BORDETELLA PERTUSSIS VIDGQKVLA 2581 AAA22974.1
    1699 BORDETELLA PERTUSSIS VIGACTSPY 2582 YP_006628018.1
    1700 BORDETELLA PERTUSSIS VKLGGVYEA 2583 AAA22974.1
    1701 BORDETELLA PERTUSSIS VLAPRLYLT 2584 AAA22974.1
    1702 BORDETELLA PERTUSSIS VLVKTNMVV 2585 AAA22983.1
    1703 BORDETELLA PERTUSSIS VPASGAPAA 2586 AGS56996.1
    1704 BORDETELLA PERTUSSIS VPFCFGKDL 2587 AAA22983.1
    1705 BORDETELLA PERTUSSIS VPVSEHCTV 2588 AAA22974.1
    1706 BORDETELLA PERTUSSIS VPVTPPKVE 2589 WP_019247158.1
    1707 BORDETELLA PERTUSSIS VRTVSAMEY 2590 WP_019249248.1
    1708 BORDETELLA PERTUSSIS VSGGSLSAP 2591 AGT50936.1
    1709 BORDETELLA PERTUSSIS VSSATKAKG 2592 WP_019248658.1
    1710 BORDETELLA PERTUSSIS VSSPPPVSV 2593 WP_019247158.1
    1711 BORDETELLA PERTUSSIS VSVKVAKKL 2594 WP_019249248.1
    1712 BORDETELLA PERTUSSIS VTMRYLASY 2595 WP_019248145.1
    1713 BORDETELLA PERTUSSIS VTSVAMKPY 2596 AAA22983.1
    1714 BORDETELLA PERTUSSIS VVAEKVTTP 2597 WP_019247158.1
    1715 BORDETELLA PERTUSSIS VVDGPPSRP 2598 WP_019247158.1
    1716 BORDETELLA PERTUSSIS VVETAQPLP 2599 WP_019247158.1
    1717 BORDETELLA PERTUSSIS WLTWLAILA 2600 AAW72734.1
    1718 BORDETELLA PERTUSSIS WTFHAGYRY 2601 AGS56996.1
    1719 BORDETELLA PERTUSSIS WVMTDNSNV 2602 AGS56996.1
    1720 BORDETELLA PERTUSSIS YAEHGEVSI 2603 WP_019249248.1
    1721 BORDETELLA PERTUSSIS YAIDGTAAG 2604 WP_019249248.1
    1722 BORDETELLA PERTUSSIS YALKSRIAL 2605 AAA22984.1
    1723 BORDETELLA PERTUSSIS YATNPQTQL 2606 WP_019248145.1
    1724 BORDETELLA PERTUSSIS YDTGDLIAY 2607 WP_019248658.1
    1725 BORDETELLA PERTUSSIS YEAGFSLGS 2608 WP_019247158.1
    1726 BORDETELLA PERTUSSIS YEDATFETY 2609 YP_006628018.1
    1727 BORDETELLA PERTUSSIS YENKSSTPL 2610 WP_019247158.1
    1728 BORDETELLA PERTUSSIS YEVTPTRML 2611 AAA22983.1
    1729 BORDETELLA PERTUSSIS YEYIWGLYP 2612 WP_019249248.1
    1730 BORDETELLA PERTUSSIS YEYIWGLYQ 2613 YP_006626470.1
    1731 BORDETELLA PERTUSSIS YEYSKGPKL 2614 AGS56996.1
    1732 BORDETELLA PERTUSSIS YFEPGPTTD 2615 WP_019248145.1
    1733 BORDETELLA PERTUSSIS YIWGLYPTY 2616 WP_019249248.1
    1734 BORDETELLA PERTUSSIS YIWGLYQTY 2617 YP_006626470.1
    1735 BORDETELLA PERTUSSIS YLRQITPGW 2618 1BCP_C
    1736 BORDETELLA PERTUSSIS YMIYMSGLA 2619 1BCP_C
    1737 BORDETELLA PERTUSSIS YPALRAALI 2620 WP_019248658.1
    1738 BORDETELLA PERTUSSIS YPGTPGDLL 2621 AAA22984.1
    1739 BORDETELLA PERTUSSIS YPTYTEWSV 2622 WP_019249248.1
    1740 BORDETELLA PERTUSSIS YQTYTEWSV 2623 YP_006626470.1
    1741 BORDETELLA PERTUSSIS YSTGDLRAY 2624 WP_019248145.1
    1742 BORDETELLA PERTUSSIS YTLRYLASY 2625 WP_019248658.1
    1743 BORDETELLA PERTUSSIS YVLVKTNMV 2626 AAA22983.1
    1744 BORDETELLA PERTUSSIS YYDYEDATF 2627 YP_006628018.1
    1745 BORDETELLA PERTUSSIS 509 AAFIALYPNSQLAPT 2628 Q7VU05
    1746 BORDETELLA PERTUSSIS 509 GGAEYNLALGQRRA 2629 Q7VU04
    1747 BORDETELLA PERTUSSIS 509 GGAEYNLALGQRRADA 2630 Q7VU04
    1748 BORDETELLA PERTUSSIS 509 IALYPNSQLAPT 2631 Q7VU05
    1749 BORDETELLA PERTUSSIS 509 KPDQGEVVAVGPGKKTED 2632 P0A339.1
    1750 BORDETELLA PERTUSSIS 509 KPDQGEVVAVGPGKKTEDG 2633 P0A339.1
    1751 BORDETELLA PERTUSSIS 509 LAEVLDYHNFVLTQ 2634 Q7VWM1.1
    1752 CORYNEBACTERIUM DIPHTHERIAE QSIALSSLMVAQAIP 2635 AAV70486.1
    1753 CORYNEBACTERIUM DIPHTHERIAE SIGVLGYQKTVDHTKVNSKLSLF 2636 AAV70486.1
    1754 BORDETELLA PERTUSSIS AAHADWNNQSIVKT 2637 ABO77783.1
    1755 BORDETELLA PERTUSSIS AALGRG 2638 ABO77783.1
    1756 BORDETELLA PERTUSSIS AALGRGHSLYASYE 2639 ABO77783.1
    1757 BORDETELLA PERTUSSIS AAPLRRTTLAMALG 2640 ABO77783.1
    1758 BORDETELLA PERTUSSIS AAPLSITLQAGAHA 2641 ABO77783.1
    1759 BORDETELLA PERTUSSIS ADAQGDIVATELPS 2642 ABO77783.1
    1760 BORDETELLA PERTUSSIS ADSGFYLDATLRAS 2643 ABO77783.1
    1761 BORDETELLA PERTUSSIS AELA 2644 ABO77783.1
    1762 BORDETELLA PERTUSSIS AELAVFRAGGGAYR 2645 ABO77783.1
    1763 BORDETELLA PERTUSSIS AELQFRNGSVTSSG 2646 ABO77783.1
    1764 BORDETELLA PERTUSSIS AGGRWHLGGLAGYT 2647 ABO77783.1
    1765 BORDETELLA PERTUSSIS AGVAAMQGAVVHLQ 2648 ABO77783.1
    1766 BORDETELLA PERTUSSIS AGYTRGDRGFTGDG 2649 ABO77783.1
    1767 BORDETELLA PERTUSSIS ALASQARWTGATRA 2650 ABO77783.1
    1768 BORDETELLA PERTUSSIS AMPWTFHAGYRYSW 2651 ABO77783.1
    1769 BORDETELLA PERTUSSIS AMQGAVVHLQRATIRRGDAP 2652 ABO77783.1
    1770 BORDETELLA PERTUSSIS ANGLRVRDE 2653 ABO77783.1
    1771 BORDETELLA PERTUSSIS ANGLRVRDEGGSSV 2654 ABO77783.1
    1772 BORDETELLA PERTUSSIS ANKDGKVDIGTYRY 2655 ABO77783.1
    1773 BORDETELLA PERTUSSIS APAAVSVLGASELT 2656 ABO77783.1
    1774 BORDETELLA PERTUSSIS APPAPKPAPQPGPQ 2657 ABO77783.1
    1775 BORDETELLA PERTUSSIS AQGILLENPAAELQ 2658 ABO77783.1
    1776 BORDETELLA PERTUSSIS ARWTGATRAVDSLS 2659 ABO77783.1
    1777 BORDETELLA PERTUSSIS ASLEAGRRFTHADG 2660 ABO77783.1
    1778 BORDETELLA PERTUSSIS ASYEYSKGPKLAMP 2661 ABO77783.1
    1779 BORDETELLA PERTUSSIS ATFTLANKD 2662 ABO77783.1
    1780 BORDETELLA PERTUSSIS ATFTLANKDGKVDI 2663 ABO77783.1
    1781 BORDETELLA PERTUSSIS ATRAVDSLSIDNAT 2664 ABO77783.1
    1782 BORDETELLA PERTUSSIS DDDGIALYVAGEQAQ 2665 ABO77783.1
    1783 BORDETELLA PERTUSSIS DDGIALYVAGEQAQ 2666 ABO77783.1
    1784 BORDETELLA PERTUSSIS DGGHITGGRAAGVA 2667 ABO77783.1
    1785 BORDETELLA PERTUSSIS DGIRRFLGTVTVKAGK 2668 ABO77783.1
    1786 BORDETELLA PERTUSSIS DGSVDFQQPAEAGR 2669 ABO77783.1
    1787 BORDETELLA PERTUSSIS DGYAVKGKYRTHGV 2670 ABO77783.1
    1788 BORDETELLA PERTUSSIS DIVATELPSIPGTS 2671 ABO77783.1
    1789 BORDETELLA PERTUSSIS DKLVVMQDASGQHR 2672 ABO77783.1
    1790 BORDETELLA PERTUSSIS DLGLSDKLVVMQDA 2673 ABO77783.1
    1791 BORDETELLA PERTUSSIS DNATWVMTDNSNVGA 2674 ABO77783.1
    1792 BORDETELLA PERTUSSIS DNATWVMTDNSNVGALRLA 2675 ABO77783.1
    1793 BORDETELLA PERTUSSIS DNRAGRRFDQKVAG 2676 ABO77783.1
    1794 BORDETELLA PERTUSSIS EAGRFKVLTVNTLA 2677 ABO77783.1
    1795 BORDETELLA PERTUSSIS ELAQSIVEAPELGA 2678 ABO77783.1
    1796 BORDETELLA PERTUSSIS ELGAAIRVGRGARV 2679 ABO77783.1
    1797 BORDETELLA PERTUSSIS ELGADHAVAVAGGR 2680 ABO77783.1
    1798 BORDETELLA PERTUSSIS ELPSIPGTSIGPLD 2681 ABO77783.1
    1799 BORDETELLA PERTUSSIS EPVKLTLTGGADAQ 2682 ABO77783.1
    1800 BORDETELLA PERTUSSIS EQAQASIADSTLQG 2683 ABO77783.1
    1801 BORDETELLA PERTUSSIS ERGANVTVQRSAIV 2684 ABO77783.1
    1802 BORDETELLA PERTUSSIS ERQHGIHIQGSDPG 2685 ABO77783.1
    1803 BORDETELLA PERTUSSIS EVGKRIELAGGRQV 2686 ABO77783.1
    1804 BORDETELLA PERTUSSIS FDGAGTVHTNGIAH 2687 ABO77783.1
    1805 BORDETELLA PERTUSSIS FQQPAEAGRFKVLT 2688 ABO77783.1
    1806 BORDETELLA PERTUSSIS FRAGGGAYRAANGL 2689 ABO77783.1
    1807 BORDETELLA PERTUSSIS GAHAQGKALLYRVL 2690 ABO77783.1
    1808 BORDETELLA PERTUSSIS GARVTVSGGSLSAP 2691 ABO77783.1
    1809 BORDETELLA PERTUSSIS GAYRAANGLRVRDE 2692 ABO77783.1
    1810 BORDETELLA PERTUSSIS GDAPAGGAVPGGAV 2693 ABO77783.1
    1811 BORDETELLA PERTUSSIS GGAVPGGAVPGGFG 2694 ABO77783.1
    1812 BORDETELLA PERTUSSIS GGAVPGGFGPVLDG 2695 ABO77783.1
    1813 BORDETELLA PERTUSSIS GGFGPVLDGWYGVD 2696 ABO77783.1
    1814 BORDETELLA PERTUSSIS GGLHIGALQSLQPE 2697 ABO77783.1
    1815 BORDETELLA PERTUSSIS GGVQIERGANVTVQ 2698 ABO77783.1
    1816 BORDETELLA PERTUSSIS GHSLYASYEYSKGP 2699 ABO77783.1
    1817 BORDETELLA PERTUSSIS GHTDSVHVGGYATY 2700 ABO77783.1
    1818 BORDETELLA PERTUSSIS GIAHRTELRGTRAE 2701 ABO77783.1
    1819 BORDETELLA PERTUSSIS GKALLYRVLPEPVK 2702 ABO77783.1
    1820 BORDETELLA PERTUSSIS GLGMAAALGRGHSL 2703 ABO77783.1
    1821 BORDETELLA PERTUSSIS GNVIETGGARRHAP 2704 ABO77783.1
    1822 BORDETELLA PERTUSSIS GPLDVALASQARWT 2705 ABO77783.1
    1823 BORDETELLA PERTUSSIS GQHRLWVRN 2706 ABO77783.1
    1824 BORDETELLA PERTUSSIS GRGFAQRQQLDNRA 2707 ABO77783.1
    1825 BORDETELLA PERTUSSIS GRLGLEVGKRIELA 2708 ABO77783.1
    1826 BORDETELLA PERTUSSIS GRQVQPYIKASVLQ 2709 ABO77783.1
    1827 BORDETELLA PERTUSSIS GRRFTHADGWFLEPQAELA 2710 ABO77783.1
    1828 BORDETELLA PERTUSSIS GSEPASANTLLLVQ 2711 ABO77783.1
    1829 BORDETELLA PERTUSSIS GSSVLGRLGLEVGK 2712 ABO77783.1
    1830 BORDETELLA PERTUSSIS GTTIKVSGRQAQGI 2713 ABO77783.1
    1831 BORDETELLA PERTUSSIS GTVTVKAGKLVADH 2714 ABO77783.1
    1832 BORDETELLA PERTUSSIS HAVAVAGGRWHLGG 2715 ABO77783.1
    1833 BORDETELLA PERTUSSIS IELAGGRQVQPYIK 2716 ABO77783.1
    1834 BORDETELLA PERTUSSIS IHIQGSDPGGVRTA 2717 ABO77783.1
    1835 BORDETELLA PERTUSSIS IRRFLGTVTVKAGK 2718 ABO77783.1
    1836 BORDETELLA PERTUSSIS IRVGRGARVTVSGG 2719 ABO77783.1
    1837 BORDETELLA PERTUSSIS ITLQAGAHA 2720 ABO77783.1
    1838 BORDETELLA PERTUSSIS ITLQAGAHAQGKAL 2721 ABO77783.1
    1839 BORDETELLA PERTUSSIS IVEAPELGAAIRVG 2722 ABO77783.1
    1840 BORDETELLA PERTUSSIS IVKTGERQHGIHIQ 2723 ABO77783.1
    1841 BORDETELLA PERTUSSIS KAGKLVADHATLAN 2724 ABO77783.1
    1842 BORDETELLA PERTUSSIS KGKYRTHGVGASLE 2725 ABO77783.1
    1843 BORDETELLA PERTUSSIS KPAPQPGPQPPQPP 2726 ABO77783.1
    1844 BORDETELLA PERTUSSIS KVAGFELGADHAVA 2727 ABO77783.1
    1845 BORDETELLA PERTUSSIS KVAGSDGYAVKGKY 2728 ABO77783.1
    1846 BORDETELLA PERTUSSIS KVDIGTYRYRLAAN 2729 ABO77783.1
    1847 BORDETELLA PERTUSSIS KVLTVNTLAGSGLF 2730 ABO77783.1
    1848 BORDETELLA PERTUSSIS LAANGNGQWSLVGA 2731 ABO77783.1
    1849 BORDETELLA PERTUSSIS LAMPWTFHAGYRYS 2732 ABO77783.1
    1850 BORDETELLA PERTUSSIS LASTLWYAESNALS 2733 ABO77783.1
    1851 BORDETELLA PERTUSSIS LENDFKVAGSDGYA 2734 ABO77783.1
    1852 BORDETELLA PERTUSSIS LENPAAELQFRNGS 2735 ABO77783.1
    1853 BORDETELLA PERTUSSIS LGAAPAAHADWNNQ 2736 ABO77783.1
    1854 BORDETELLA PERTUSSIS LGGLAGYTRGDRGPTGDG 2737 ABO77783.1
    1855 BORDETELLA PERTUSSIS LLENP 2738 ABO77783.1
    1856 BORDETELLA PERTUSSIS LLVQTPLGSAATFT 2739 ABO77783.1
    1857 BORDETELLA PERTUSSIS LPPSRVVLRDTNVT 2740 ABO77783.1
    1858 BORDETELLA PERTUSSIS LQPEDLPPS 2741 ABO77783.1
    1859 BORDETELLA PERTUSSIS LQPEDLPPSRVVLR 2742 ABO77783.1
    1860 BORDETELLA PERTUSSIS LRASRLENDFKVAG 2743 ABO77783.1
    1861 BORDETELLA PERTUSSIS LRLASDGSVDFQQP 2744 ABO77783.1
    1862 BORDETELLA PERTUSSIS LSAAANAAVNTGGV 2745 ABO77783.1
    1863 BORDETELLA PERTUSSIS LSAPHGNVIETGGA 2746 ABO77783.1
    1864 BORDETELLA PERTUSSIS LSDDGIRRFLGTVT 2747 ABO77783.1
    1865 BORDETELLA PERTUSSIS LVGAKAPPAPKPAP 2748 ABO77783.1
    1866 BORDETELLA PERTUSSIS LYVAGEQAQASIAD 2749 ABO77783.1
    1867 BORDETELLA PERTUSSIS MALGALGAAPAAHA 2750 ABO77783.1
    1868 BORDETELLA PERTUSSIS MNMSLSRIVKAAPL 2751 ABO77783.1
    1869 BORDETELLA PERTUSSIS MQDASGQHR 2752 ABO77783.1
    1870 BORDETELLA PERTUSSIS MQGAVVHLQRATIR 2753 ABO77783.1
    1871 BORDETELLA PERTUSSIS NAAVNTGGVGLAST 2754 ABO77783.1
    1872 BORDETELLA PERTUSSIS NALSKRLGELRLNP 2755 ABO77783.1
    1873 BORDETELLA PERTUSSIS NGQWSLVGAKAPPA 2756 ABO77783.1
    1874 BORDETELLA PERTUSSIS NTLAGSGLFRMNVF 2757 ABO77783.1
    1875 BORDETELLA PERTUSSIS PAGRELSAAANAAV 2758 ABO77783.1
    1876 BORDETELLA PERTUSSIS PAPQPPAGRELSAA 2759 ABO77783.1
    1877 BORDETELLA PERTUSSIS PGPQPPQPPQPQPE 2760 ABO77783.1
    1878 BORDETELLA PERTUSSIS PGTSIGPLDVALAS 2761 ABO77783.1
    1879 BORDETELLA PERTUSSIS PLGSAATFTLANKD 2762 ABO77783.1
    1880 BORDETELLA PERTUSSIS PQPEAPAPQPPAGR 2763 ABO77783.1
    1881 BORDETELLA PERTUSSIS PQPPQPQPEAPAPQ 2764 ABO77783.1
    1882 BORDETELLA PERTUSSIS PYIKASVLQEFDGA 2765 ABO77783.1
    1883 BORDETELLA PERTUSSIS RFAPQAAPLSITLQ 2766 ABO77783.1
    1884 BORDETELLA PERTUSSIS RLGELRLNPDAGGA 2767 ABO77783.1
    1885 BORDETELLA PERTUSSIS RLNPDAGGAWGRGF 2768 ABO77783.1
    1886 BORDETELLA PERTUSSIS RNGSVTSSGQLSDD 2769 ABO77783.1
    1887 BORDETELLA PERTUSSIS RRFDQKVAGFELGA 2770 ABO77783.1
    1888 BORDETELLA PERTUSSIS RTTLAMALGALGAA 2771 ABO77783.1
    1889 BORDETELLA PERTUSSIS SAIVDGGLHIGALQ 2772 ABO77783.1
    1890 BORDETELLA PERTUSSIS SANTLLLVQTPLGS 2773 ABO77783.1
    1891 BORDETELLA PERTUSSIS SDPGGVRTASGTTI 2774 ABO77783.1
    1892 BORDETELLA PERTUSSIS SELTLDGGHITGGR 2775 ABO77783.1
    1893 BORDETELLA PERTUSSIS SGLFRMNVF 2776 ABO77783.1
    1894 BORDETELLA PERTUSSIS SGLFRMNVFADLGL 2777 ABO77783.1
    1895 BORDETELLA PERTUSSIS SGSSVELAQSIVEA 2778 ABO77783.1
    1896 BORDETELLA PERTUSSIS SIADSTLQGAGGVQ 2779 ABO77783.1
    1897 BORDETELLA PERTUSSIS SKGPKLAMPWTFHA 2780 ABO77783.1
    1898 BORDETELLA PERTUSSIS SNVGALRLASDGSV 2781 ABO77783.1
    1899 BORDETELLA PERTUSSIS SRIVKAAPLRRTTL 2782 ABO77783.1
    1900 BORDETELLA PERTUSSIS SVLGASELTLDGGH 2783 ABO77783.1
    1901 BORDETELLA PERTUSSIS SVLQEFDGA 2784 ABO77783.1
    1902 BORDETELLA PERTUSSIS SVLQEFDGAGTVHT 2785 ABO77783.1
    1903 BORDETELLA PERTUSSIS TELR 2786 ABO77783.1
    1904 BORDETELLA PERTUSSIS TELRGTRAELGLGM 2787 ABO77783.1
    1905 BORDETELLA PERTUSSIS TGDGGGHTDSVHVG 2788 ABO77783.1
    1906 BORDETELLA PERTUSSIS TGGARRFAPQAAPL 2789 ABO77783.1
    1907 BORDETELLA PERTUSSIS TGGRAAGVAAMQGA 2790 ABO77783.1
    1908 BORDETELLA PERTUSSIS TGGVGLASTLWYAE 2791 ABO77783.1
    1909 BORDETELLA PERTUSSIS THGVGASLEAGRRF 2792 ABO77783.1
    1910 BORDETELLA PERTUSSIS TIRRGDAPA 2793 ABO77783.1
    1911 BORDETELLA PERTUSSIS TLANVGDTWDDDGI 2794 ABO77783.1
    1912 BORDETELLA PERTUSSIS TLQGAGGVQIERGA 2795 ABO77783.1
    1913 BORDETELLA PERTUSSIS TLTGGADAQGDIVA 2796 ABO77783.1
    1914 BORDETELLA PERTUSSIS TNVTAVPASGAPAA 2797 ABO77783.1
    1915 BORDETELLA PERTUSSIS TRAELGLGMAAALG 2798 ABO77783.1
    1916 BORDETELLA PERTUSSIS TSSGQLSDDGIRRF 2799 ABO77783.1
    1917 BORDETELLA PERTUSSIS TVHTNGIAHRTELR 2800 ABO77783.1
    1918 BORDETELLA PERTUSSIS TYRYRLAANGNGQW 2801 ABO77783.1
    1919 BORDETELLA PERTUSSIS VADHATLANVGDTW 2802 ABO77783.1
    1920 BORDETELLA PERTUSSIS VHVGGYATYIADSG 2803 ABO77783.1
    1921 BORDETELLA PERTUSSIS VLDGWYGVD 2804 ABO77783.1
    1922 BORDETELLA PERTUSSIS VPASGAPAAVSVLG 2805 ABO77783.1
    1923 BORDETELLA PERTUSSIS VRDEGGSSVLGRLG 2806 ABO77783.1
    1924 BORDETELLA PERTUSSIS VRTASGTTIKVSGR 2807 ABO77783.1
    1925 BORDETELLA PERTUSSIS VSGGSLSAPHGNVI 2808 ABO77783.1
    1926 BORDETELLA PERTUSSIS VSGRQAQGILLENP 2809 ABO77783.1
    1927 BORDETELLA PERTUSSIS VTVQRSAIVDGGLH 2810 ABO77783.1
    1928 BORDETELLA PERTUSSIS VVLRDTNVTAVPAS 2811 ABO77783.1
    1929 BORDETELLA PERTUSSIS WNNQSIVKTGERQH 2812 ABO77783.1
    1930 BORDETELLA PERTUSSIS WVRNSGSEPASANT 2813 ABO77783.1
    1931 BORDETELLA PERTUSSIS WYAESNALSKRLGE 2814 ABO77783.1
    1932 BORDETELLA PERTUSSIS YATYIADSGFYLDA 2815 ABO77783.1
    1933 BORDETELLA PERTUSSIS YGVDVSGSS 2816 ABO77783.1
    1934 BORDETELLA PERTUSSIS YGVDVSGSSVELAQ 2817 ABO77783.1
    1935 BORDETELLA PERTUSSIS YLDATLRASRLEND 2818 ABO77783.1
    1936 BORDETELLA PERTUSSIS YRVLPEPVKLTLTG 2819 ABO77783.1
    1937 BORDETELLA PERTUSSIS VKAQNITNKRAALIEA 2820 AAA22974.1
    1938 BORDETELLA PERTUSSIS YYSNVTATRLLSSTNS 2821 AAA83981.1
    1939 BORDETELLA PERTUSSIS SPNLTDERAAQAGVT 2822 CPP72976.1
    1940 MEASLES MORBILLIVIRUS SSRASDERAAHLPTS 2823 BAA33867.1
    1941 CORYNEBACTERIUM DIPHTHERIAE QWHNSYNRPAYSPG 2824 1007216A
    1942 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON-B AEGGEIHEL 2825 AAF85692 .1
    1943 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON-B AENLISNGIGKY 2826 AAF85698.1
    1944 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON-B AEVDGDVKL 2827 CAB43772.1
    1945 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON-B AIYTAEIHK 2828 AAF85697.1
    1946 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON-B APVFHMTNY 2829 CAB43772.1
    1947 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON-B APVFHMTNYLEQPVSN 2830 AAR89413.1
    1948 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON-B AQRLNEIY 2831 AAF85698.1
    1949 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON-B ARVPHAYSL 2832 AAF85698.1
    1950 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON-B AVRDLERAM 2833 P03424.1
    1951 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON-B AVRDLERAMTTLK 2834 P03424.1
    1952 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON-B DALLRLQAM 2835 Q89933.1
    1953 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON-B DIKEKVINL 2836 AAF85698.1
    1954 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON-B DQGLFKVL 2837 AAF85695.1
    1955 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON-B DTGVDTRIW 2838 Q9EMA9.1
    1956 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON-B EPIGSLATEEAM 2839 AAF85692.1
    1957 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON-B EPIRDALNAM 2840 P69354.1
    1958 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON-B FPKLGKTL 2841 AAF85692.1
    1959 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON-B FRSVNAVAF 2842 AAF85695.1
    1960 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON-B GHIIDNTEQL 2843 AAF85695.1
    1961 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON-B GLNEKLVFY 2844 AAF85695.1
    1962 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON-B GMYGGTYLVEK 2845 AAC35876.2
    1963 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON-B GPPISLERLDVGTN 2846 P69354.1
    1964 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON-B GPRQAQVSFL 2847 Q89933.1
    1965 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON-B GRLVPQVRVID 2848 AAF85695.1
    1966 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON-B GSAPISMGFR 2849 AAF85692.1
    1967 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON-B HILAKSTAL 2850 AAF85698.1
    1968 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON-B HYREVNLVY 2851 AAF85698.1
    1969 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON-B IPPMKNLAL 2852 AAC35876.2
    1970 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON-B IPYQGSGKGVSF 2853 CAB43772.1
    1971 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON-B ISKESQHVY 2854 AAF85698.1
    1972 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON-B IVSSHFFVY 2855 AAF85698.1
    1973 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON-B KEIKETGRLF 2856 AAF85698.1
    1974 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON-B KESQHVYYL 2857 AAF85698.1
    1975 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON-B KIIDNTEQL 2858 AAF85695.1
    1976 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON-B KKQINRQN 2859 AAA63285.1
    1977 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON-B KKVDTNFIYQ 2860 AAF85698.1
    1978 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON-B KLIDGFFPA 2861 AAF85698.1
    1979 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON-B KPNLSSKRSEL 2862 BAB39848.1
    1980 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON-B KVSPYLFTV 2863 AAR89413.1
    1981 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON-B LETRTTNQFL 2864 CAB43772.1
    1982 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON-B LLKEATEL 2865 AAF85695.1
    1983 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON-B LLKKGNSLY 2866 AAF85698.1
    1984 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON-B LPAPIGGMNY 2867 AAF85698.1
    1985 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON-B MPEETLHQVM 2868 AAF85698.1
    1986 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON-B PTTIRGQFS 2869 CAB43772.1
    1987 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON-B QEISRHQALGY 2870 P03424.1
    1988 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON-B RITHVDTESY 2871 P69354.1
    1989 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON-B RPGLKPDL 2872 P69354.1
    1990 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON-B RPIYGLEV 2873 AAF85698.1
    1991 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON-B RQAGQEMILAV 2874 P69354.1
    1992 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON-B SAVRIATVY 2875 AAF85698.1
    1993 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON-B SLMPEETLHQV 2876 AAF85698.1
    1994 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON-B SMIDLVTKF 2877 AAF85698.1
    1995 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON-B SMLNSQAIDNLRA 2878 P69354.1
    1996 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON-B SMYRVFEV 2879 CAB43772.1
    1997 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON-B SQQGMFHAY 2880 AAF85698.1
    1998 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON-B TDTPIVYNDRNLLD 2881 Q89933.1
    1999 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON-B VIINDDQGLFKV 2882 AAF85695.1
    2000 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON-B YESGVRIASL 2883 AAF85698.1
    2001 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON-B YLKDKALA 2884 AAF85698.1
    2002 MEASLES VIRUS STRAIN EDMONSTON-B YVYDHSGEAVK 2885 AAF85692.1
    2003 RUBELLA VIRUS ARVIDPAAQSFTGVV 2886 BAA28178.1
    2004 RUBELLA VIRUS SDRASARVIDPAAQS 2887 BAA28178.1
    2005 RUBELLA VIRUS VPPGKFVTAALLNTP 2888 BAA28178.1
    2006 RUBELLA VIRUS WVTPVIGSQARKCGL 2889 BAA28178.1
    2007 MUMPS RUBULAVIRUS GTYRLIPNARANLTA 400 AGC97176.1
  • E. Einschleusung von Multi-Flap-Prime-Editoren
  • In einem anderen Aspekt sieht die vorliegende Offenbarung die Einschleusung von Multi-Flap-Prime-Editoren in vitro und in vivo unter Verwendung verschiedener Strategien vor, einschließlich auf getrennten Vektoren unter Verwendung von gesplitteten Inteinen und sowie direkter Einschleusungsstrategien des Ribonukleoproteinkomplexes (d. h. des Prime- Editors komplexiert mit dem PEgRNA und/oder der Zweitstellen-gRNA) unter Verwendung von Techniken wie Elektroporation, Verwendung von kationischen Lipid-vermittelten Formulierungen und induzierten Endocytose-Verfahren unter Verwendung von Rezeptorliganden, die an die Ribonukleotproteinkomplexe fusioniert sind. Alle derartigen Verfahren werden hierin in Betracht gezogen.
  • Übersicht der Einschleusungsoptionen
  • In einigen Aspekten stellt die Erfindung Verfahren bereit, umfassend die Einschleusung eines oder mehrerer Multi-Flap-Prime-Editor-kodierender Polynukleotide, wie etwa eines oder mehrerer Vektoren, wie hierin beschrieben, die eine oder mehrere Komponenten des hierin beschriebenen Multi-Flap-Prime-Editing-Systems kodieren, eines oder mehrere Transkripte davon, und/oder eines oder davon transkribierte Proteine in eine Wirtszelle. In einigen Aspekten stellt die Erfindung ferner Zellen bereit, die durch solche Verfahren hergestellt werden, und Organismen (wie Tiere, Pflanzen oder Pilze), die solche Zellen umfassen oder daraus hergestellt werden. In einigen Ausführungsformen wird ein Multi-Flap-Prime-Editor, wie hierin beschrieben, in Kombination mit (und optional komplexiert mit) einer Leitsequenz in eine Zelle eingeschleust. Herkömmliche Gentransferverfahren auf viraler und nicht-viraler Basis können verwendet werden, um Nukleinsäuren in Säugetierzellen oder Ziel-Gewebe einzuführen. Solche Verfahren können verwendet werden, um Nukleinsäuren, die Komponenten eines Multi-Flap-Prime-Editor-Systems kodieren, an Zellen in Kultur oder in einem Wirtsorganismus einzuschleusen. Nicht-virale Vektoreinschleusungssysteme umfassen DNA-Plasmide, RNA (z. B. ein Transkript eines hierin beschriebenen Vektors), nackte Nukleinsäure und Nukleinsäure, die mit einem Einschleusungsvehikel, wie einem Liposom, komplexiert ist. Virale Vektoreinschleusungssysteme umfassen DNA- und RNA-Viren, die nach Einschleusung in die Zelle entweder episomale oder integrierte Genome aufweisen. Eine Übersicht über Gentherapieverfahren ist zu finden unter Anderson, Science 256:808-813 (1992); Nabel & Felgner, TIBTECH 11:211-217 (1993); Mitani & Caskey, TIBTECH 11:162- 166 (1993); Dillon, TIBTECH 11:167-175 (1993); Miller, Nature 357:455-460 (1992); Van Brunt, Biotechnology 6(10):1149-1154 (1988); Vigne, Restorative Neurology and Neuroscience 8:35-36 (1995); Kremer & Perricaudet, British Medical Bulletin 51(1):31-44 (1995); Haddada et al., in Current Topics in Microbiology and Immunology Doerfler and Bihm (eds) (1995); and Yu et al., Gene Therapy 1 :13-26 (1994).
  • Verfahren zur nicht-viralen Einschleusung von Nukleinsäuren umfassen Lipofektion, Nukleofektion, Mikroinjektion, Biolistik, Virosomen, Liposomen, Immunoliposomen, Polykation oder Lipid:Nukleinsäure-Konjugate, nackte DNA, künstliche Virionen und Wirkstoff-verstärkte Aufnahme von DNA. Die Lipofektion ist z. B. in US-Pat. Nr. 5,049,386 , 4,946,787 und 4,897,355 ) beschrieben und Lipofektionsreagenzien werden kommerziell verkauft (z. B. Transfectam™ und Lipofectin™). Kationische und neutrale Lipide, die für eine effiziente Rezeptor-Erkennungs-Lipofektion von Polynukleotiden geeignet sind, umfassen die von Feigner, WO 91/17424 ; WO 91/16024 . Die Einschleusung kann in Zellen (z. B. In-vitro- oder Ex-vivo-Verabreichung) oder Ziel-Gewebe (z. B. In-vivo-Verabreichung) erfolgen.
  • Die Herstellung von Lipid:Nukleinsäure-Komplexen, einschließlich zielgerichteter Liposomen, wie Immunlipid-Komplexe, ist dem Fachmann gut bekannt (siehe z. B. Crystal, Science 270:404-410 (1995); Blaese et al., Cancer Gen Ther. 2:291-297 (1995); Behr et al., Bioconjugate Chem. 5:382-389 (1994); Remy et al., Bioconjugate Chem. 5:647-654 (1994); Gao et al., Gene Therapy 2:710-722 (1995); Ahmad et al., Cancer Res. 52:4817-4820 (1992); US-Pat. Nr. 4,186,183 , 4,217,344 , 4,235,871 , 4,261,975 , 4,485,054 , 4,501,728 , 4,774,085 , 4,837,028 und 4,946,787 ).
  • Die Verwendung von auf RNA- oder DNA-Viren basierenden Systemen zur Einschleusung von Nukleinsäuren nutzt hochentwickelte Prozesse, um ein Virus auf spezifische Zellen im Körper zu richten und die virale Nutzlast zum Zellkern zu transportieren. Virale Vektoren können Patienten direkt (in vivo) verabreicht werden oder sie können verwendet werden, um Zellen in vitro zu behandeln, und die modifizierten Zellen können gegebenenfalls Patienten (ex vivo) verabreicht werden. Herkömmliche auf Viren basierende Systeme könnten retrovirale, Lentivirus-, adenovirale, adenoassoziierte und Herpes-simplex- Virusvektoren für den Gentransfer beinhalten. Die Integration in das Wirtsgenom ist mit den Retrovirus-, Lentivirus- und Adeno-assoziierten Virus-Gentransferverfahren möglich, was oft zu einer Langzeitexprimierung des eingefügten Transgens führt. Darüber hinaus wurden in vielen verschiedenen Zelltypen und Ziel-Geweben hohe Transduktionseffizienzen beobachtet.
  • Der Tropismus eines Virus kann durch den Einbau fremder Hüllproteine verändert werden, wodurch die potenzielle Ziel-Population von Ziel-Zellen erweitert wird. Lentivirale Vektoren sind retrovirale Vektoren, die sich nicht teilende Zellen transduzieren oder infizieren können und typischerweise hohe Virustiter produzieren. Die Auswahl eines retroviralen Gentransfersystems würde daher vom Ziel-Gewebe abhängen. Retrovirale Vektoren bestehen aus cis-wirkenden langen terminalen Wiederholungen mit einer Verpackungskapazität für bis zu 6-10 kb Fremdsequenz. Die minimalen cis-wirkenden LTRs (long terminal repeats - LTR) reichen für die Replikation und Verpackung der Vektoren aus, die dann verwendet werden, um das therapeutische Gen in die Ziel-Zelle zu integrieren, um eine permanente Transgenexprimierung bereitzustellen. Weit verbreitete retrovirale Vektoren umfassen solche, die auf dem Murinen Leukämievirus (murine leukemia virus - MuLV), dem Gibbonaffen- Leukämievirus (gibbon ape leukemia virus - GaLV), dem Affen-Immundefizienzvirus (Simian Immuno deficiency virus - SIV), dem Humanen Immundefizienzvirus (human immuno deficiency virus - HIV) und Kombinationen davon basieren (siehe z. B. Buchscher et al ., J. Virol. 66:2731-2739 (1992); Johann et al., J. Virol. 66:1635-1640 (1992); Sommnerfelt et al., Virol. 176:58-59 (1990); Wilson et al., J. Virol. 63:2374-2378 (1989); Miller et al., J. Virol. 65:2220-2224 (1991); PCT/US94/05700). Bei Anwendungen, bei denen eine vorübergehende Exprimierung bevorzugt wird, können auf Adenovirus basierende Systeme verwendet werden. Vektoren auf Adenovirusbasis sind in vielen Zelltypen zu einer sehr hohen Transduktionseffizienz fähig und erfordern keine Zellteilung. Mit solchen Vektoren wurden hohe Titer und Exprimierungsniveaus erhalten. Dieser Vektor kann in einem relativ einfachen System in großen Mengen hergestellt werden. Adeno-assoziierte Virus-(„AAV“)-Vektoren können auch verwendet werden, um Zellen mit Ziel-Nukleinsäuren zu transduzieren, z. B. in der In-vitro-Produktion von Nukleinsäuren und Peptiden, und für in vivo und ex vivo Gentherapie-Verfahren (siehe z. B. West et al., Virology 160:38-47 (1987); US-Pat. Nr. 4,797,368 ; WO 93/24641 ; Kotin, Human Gene Therapy 5:793-801 (1994); Muzyczka, J. Clin. Invest. 94:1351 (1994). Die Konstruktion rekombinanter AAV-Vektoren wird in einer Reihe von Veröffentlichungen beschrieben, einschließlich US-Pat. Nr. 5,173,414 ; Tratschin et al., Mol. Cell. Biol. 5:3251-3260 (1985); Tratschin et al., Mol. Cell. Biol. 4:2072-2081 (1984); Hermonat & Muzyczka, PNAS 81:6466-6470 (1984); und Samulski et al., J. Virol. 63:03822- 3828 (1989).
  • Verpackungszellen werden typischerweise verwendet, um Viruspartikel zu bilden, die eine Wirtszelle infizieren können. Solche Zellen umfassen 293-Zellen, die Adenoviren verpacken, und ψ2-Zellen oder PA317-Zellen, die Retroviren verpacken. Virale Vektoren, die in der Gentherapie verwendet werden, werden normalerweise durch die Herstellung einer Zelllinie erzeugt, die einen Nukleinsäurevektor in ein virales Partikel verpackt. Die Vektoren enthalten typischerweise die minimalen viralen Sequenzen, die für die Verpackung und die anschließende Integration in einen Wirt erforderlich sind, wobei andere virale Sequenzen durch eine Exprimierungskassette für das/die zu exprimierende(n) Polynukleotid(e) ersetzt werden. Die fehlenden viralen Funktionen werden typischerweise in trans von der Verpackungszellinie geliefert. Beispielsweise besitzen in der Gentherapie verwendete AAV-Vektoren typischerweise nur ITR-Sequenzen aus dem AAV-Genom, die für die Verpackung und Integration in das Wirtsgenom benötigt werden. Virale DNA wird in eine Zelllinie verpackt, die ein Helferplasmid enthält, das für die anderen AAV-Gene, nämlich rep und cap, kodiert, denen jedoch ITR-Sequenzen fehlen. Die Zelllinie kann auch mit dem Adenovirus als Helfer infiziert werden. Das Helfervirus fördert die Replikation des AAV-Vektors und die Exprimierung von AAV-Genen aus dem Helferplasmid. Das Helferplasmid wird aufgrund fehlender ITR-Sequenzen nicht in signifikanten Mengen verpackt. Die Kontamination mit dem Adenovirus kann z. B. durch Hitzebehandlung, auf die Adenoviren empfindlicher sind als AAV, reduziert werden. Dem Fachmann sind zusätzliche Verfahren zur Einschleusung von Nukleinsäuren in Zellen bekannt. Siehe zum Beispiel US20030087817 , das hierin durch Bezugnahme aufgenommen ist.
  • In verschiedenen Ausführungsformen können die Dual-PE-Konstrukte (einschließlich der Split-Konstrukte) zur Einschleusung in einen oder mehrere rAAV-Vektoren konstruiert werden. Ein rAAV in Bezug auf eines der hierin bereitgestellten Verfahren und Zusammensetzungen kann jeden beliebigen Serotyp, einschließlich alle beliebigen Derivate oder Pseudotypen (z. B. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 2/1, 2/5, 2/8, 2/9, 3/1, 3/5, 3/8 oder 3/9) aufweisen. Ein rAAV kann eine genetische Ladung umfassen (d. h. einen rekombinanten Nukleinsäurevektor, der ein Gen von Interesse exprimiert, wie etwa ein ganzes oder gesplittetes PE-Fusionsprotein, das von dem rAAV in eine Zelle getragen wird), die in eine Zelle eingeschleust werden soll. Ein rAAV kann chimär sein.
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich der Serotyp eines rAAV auf den Serotyp der Kapsidproteine des rekombinanten Virus. Nicht einschränkende Beispiele für Derivate und Pseudotypen beinhalten rAAV2/1, rAAV2/5, rAAV2/8, rAAV2/9, AAV2-AAV3-Hybrid, AAVrh.10, AAVhu.14, AAV3a/3b, AAVrh32.33, AAV-HSC15, AAV-HSC17, AAVhu.37, AAVrh.8, CHt-P6, AAV2.5, AAV6.2, AAV2i8, AAV-HSC15/17, AAVM41, AAV9.45, AAV6(Y445F/Y731F), AAV2.5T, AAV-HAE1/2, AAV-Klon 32/83, AAVShH10, AAV2 (Y- >F), AAV8 (Y733F), AAV2.15, AAV2.4, AAVM41 und AAVr3.45. Ein nicht einschränkendes Beispiel für Derivate und Pseudotypen, die chimäre VP1-Proteine aufweisen, ist rAAV2/5-1VP1u, das das Genom von AAV2, das Kapsid-Rückgrat von AAV5 und VPlu von AAV1 aufweist. Andere nicht einschränkende Beispiele für Derivate und Pseudotypen, die chimäre VP1-Proteine aufweisen, sind rAAV2/5-8VP1u, rAAV2/9-1VP1u und rAAV2/9- 8 VP1u.
  • AAV-Derivate/Pseudotypen und Verfahren zur Herstellung solcher Derivate/Pseudotypen sind im Stand der Technik bekannt (siehe z. B. Mol Ther. 2012 Apr; 20(4):699-708. doi: 10.1038/mt.2011.287. Epub 24. Jan 2012. The AAV vector toolkit: poised at the clinical crossroads. Asokan A1, Schaffer DV, Samulski RJ.). Verfahren zur Herstellung und Verwendung pseudotypisierter rAAV-Vektoren sind im Stand der Technik bekannt (siehe, e.g., Duan et al., J. Virol., 75:7662-7671, 2001; Halbert et al., J. Virol., 74:1524-1532, 2000; Zolotukhin et al., Methods, 28:158-167, 2002; und Auricchio et al., Hum. Molec. Genet., 10:3075-3081, 2001).
  • Verfahren zur Herstellung oder Verpackung von rAAV-Partikeln sind im Stand der Technik bekannt und Reagenzien sind im Handel erhältlich (siehe z. B. Zolotukhin et al. Production and purification of serotype 1, 2, and 5 recombinant adeno-associated viral vectors. Methods 28 (2002) 158-167; und US-Patentveröffentlichungsnummern US20070015238 und US20120322861 , die hierin durch Bezugnahme aufgenommen sind; und Plasmide und Kits, erhältlich von ATCC und Cell Biolabs, Inc.). Beispielsweise kann ein Plasmid, das ein Gen von Interesse beinhaltet, mit einem oder mehreren Helferplasmiden kombiniert werden, die beispielsweise ein rep-Gen (das beispielsweise Rep78, Rep68, Rep52 und Rep40 kodiert) und ein cap-Gen (das VP1, VP2 und VP3 kodiert, einschließlich einer modifizierten VP2-Region, wie hierin beschrieben) enthalten und in rekombinante Zellen transfiziert werden, so dass das rAAV-Partikel verpackt und anschließend gereinigt werden kann.
  • Rekombinantes AAV kann einen Nukleinsäurevektor umfassen, der mindestens Folgendes umfassen kann: (a) eine oder mehrere heterologe Nukleinsäureregionen, die eine Sequenz umfassen, die ein Protein oder Polypeptid von Interesse oder eine RNA von Interesse (z. B. eine siRNA oder microRNA) kodiert, und (b) eine oder mehrere Regionen, die Inverted Terminal Repeat (ITR)-Sequenzen umfassen (z. B. Wildtyp-ITR-Sequenzen oder manipulierte ITR-Sequenzen), die die eine oder mehreren Nukleinsäureregionen (z. B. heterologe Nukleinsäureregionen) flankieren. Hierin werden heterologe Nukleinsäureregionen, die eine Sequenz umfassen, die ein Protein von Interesse oder eine RNA von Interesse kodiert, als Gene von Interesse bezeichnet.
  • Jedes beliebige der hierin bereitgestellten rAAV-Partikel kann Kapsidproteine aufweisen, die Aminosäuren unterschiedlicher Serotypen außerhalb der VP1u-Region aufweisen. In einigen Ausführungsformen unterscheidet sich der Serotyp des Rückgrats des VP1-Proteins vom Serotyp der ITRs und/oder des Rep-Gens. In einigen Ausführungsformen ist der Serotyp des Rückgrats des VP1-Kapsidproteins eines Partikels derselbe wie der Serotyp der ITRs. In einigen Ausführungsformen ist der Serotyp des Rückgrats des VP1- Kapsidproteins eines Partikels derselbe wie der Serotyp des Rep-Gens. In einigen Ausführungsformen umfassen Kapsidproteine von rAAV-Partikeln Aminosäuremutationen, die zu einer verbesserten Transduktionseffizienz führen.
  • In einigen Ausführungsformen umfasst der Nukleinsäurevektor eine oder mehrere Regionen, die eine Sequenz umfassen, die die Exprimierung der Nukleinsäure (z. B. der heterologen Nukleinsäure) erleichtert, z. B. Exprimierungskontrollsequenzen, die operativ mit der Nukleinsäure verbunden sind. Im Stand der Technik sind zahlreiche solcher Sequenzen bekannt. Nicht einschränkende Beispiele für Exprimierungskontrollsequenzen umfassen Promotoren, Isolatoren, Silencer, Response-Elemente, Introns, Enhancer, Initiationsstellen, Terminationssignale und Poly(A)-Schwänze. Jede Kombination solcher Kontrollsequenzen wird hierin in Betracht gezogen (z. B. ein Promotor und ein Enhancer).
  • Endgültige AAV-Konstrukte können eine Sequenz enthalten, die für die PEgRNA kodiert. In anderen Ausführungsformen können die AAV-Konstrukte eine Sequenz enthalten, die die Zweitstellen-Nicking-Leit-RNA kodiert. In noch anderen Ausführungsformen können die AAV-Konstrukte eine Sequenz enthalten, die die Zweitstellen-Nicking-Leit-RNA kodiert, und eine Sequenz, die die PEgRNA kodiert.
  • In verschiedenen Ausführungsformen können die PEgRNAs und die Zweitstellen- Nicking-Leit-RNAs von einem geeigneten Promotor exprimiert werden, wie beispielsweise einem humanen U6 (hU6)-Promotor, einem Maus-U6 (mU6)-Promotor oder einem anderen geeigneten Promotor. Die PEgRNAs und die Zweitstellen-Nicking-Leit-RNAs können von denselben Promotoren oder unterschiedlichen Promotoren getrieben werden.
  • In einigen Ausführungsformen werden rAAV-Konstrukte oder die hierin beschriebenen Zusammensetzungen einem Patienten enteral verabreicht. In einigen Ausführungsformen werden rAAV-Konstrukte oder die hierin beschriebenen Zusammensetzungen dem Patienten parenteral verabreicht. In einigen Ausführungsformen werden ein rAAV-Partikel oder die hierin beschriebenen Zusammensetzungen einem Patienten subkutan, intraokular, intravitreal, subretinal, intravenös (IV), intracerebroventrikulär, intramuskulär, intrathekal (IT), intrazisternal, intraperitoneal, durch Inhalation, topisch oder durch direkte Injektion in eine oder mehrere Zellen, Gewebe oder Organe verabreicht. In einigen Ausführungsformen werden ein rAAV-Partikel oder die hierin beschriebenen Zusammensetzungen dem Patienten durch Injektion in die Leberarterie oder Pfortader verabreicht.
  • Gesplittete Multi-Flap-PE-Vektor-basierte Strategien
  • In diesem Aspekt können die Multi-Flap-Prime-Editoren an einer Splitstelle geteilt werden und als zwei Hälften eines ganzen/kompletten Prime-Editors bereitgestellt werden. Die beiden Hälften können in Zellen eingeschleust werden (z. B. als exprimierte Proteine oder auf separaten Exprimierungsvektoren) und sobald sie in der Zelle in Kontakt sind, bilden die beiden Hälften den vollständigen Prime-Editor durch die selbstspleißende Wirkung der Inteine auf jeder Prime-Editor-Hälfte. Gesplittete Inteinsequenzen können in jede der Hälften des kodierten Prime-Editors eingebaut werden, um ihr Trans-Spleißen innerhalb der Zelle und die gleichzeitige Wiederherstellung des vollständigen, funktionsfähigen PE zu erleichtern.
  • Diese Split-Intein-basierten Verfahren überwinden mehrere Barrieren für die In-vivo- Einschleusung. Zum Beispiel ist die DNA, die Prime-Editoren kodiert, größer als die rAAV- Verpackungsgrenze und erfordert daher spezielle Lösungen. Eine solche Lösung besteht darin, den Editor zu formulieren, der fusioniert ist, um Intein-Paare zu splitten, die in zwei separate rAAV-Partikel verpackt sind, die, wenn sie gemeinsam in eine Zelle eingeschleust werden, das funktionelle Editor-Protein rekonstituieren. Es werden einige weitere spezielle Überlegungen zur Berücksichtigung der einzigartigen Merkmale des Mulit-Flap-Prime-Editing beschrieben, die die Optimierung von Zweit-Nickstellen-Zielen und die richtige Verpackung von Multi- Flap-Prime-Editoren in Virusvektoren, einschließlich Lentiviren und rAAV, beinhalten.
  • In diesem Aspekt können die Multi-Flap-Prime-Editoren an einer Splitstelle geteilt werden und als zwei Hälften eines ganzen/kompletten Prime-Editors bereitgestellt werden. Die beiden Hälften können in Zellen eingeschleust werden (z. B. als exprimierte Proteine oder auf separaten Exprimierungsvektoren) und sobald sie in der Zelle in Kontakt sind, bilden die beiden Hälften den vollständigen Prime-Editor durch die selbstspleißende Wirkung der Inteine auf jeder Prime-Editor-Hälfte. Split-Intein-Sequenzen können in jede der Hälften des kodierten Prime-Editors eingebaut werden, um ihr Trans-Spleißen innerhalb der Zelle und die gleichzeitige Wiederherstellung des vollständigen, funktionsfähigen PE zu erleichtern.
  • 66 stellt eine Ausführungsform eines Prime-Editors dar, der als zwei PE- Halbproteine bereitgestellt wird, die als ganzer Prime-Editor durch die selbstspleißende Wirkung der Split-Intein-Hälften, die sich am Ende oder Anfang jedes der Prime-Editor- Halbproteins befinden, regenerieren. Die hierin beschriebenen Multi-Flap-Prime-Editoren können ebenfalls auf die gleiche Weise bereitgestellt werden. Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „PE N-terminale Hälfte“ auf die N-terminale Hälfte eines vollständigen Prime- Editors und umfasst das „N-Intein“ am C-terminalen Ende der PE-N-terminalen Hälfte (d. h. des N-terminalen Exteins) des kompletten Prime-Editors. Das „N-Intein“ bezieht sich auf die N-terminale Hälfte einer vollständigen, voll ausgebildeten Split-Intein-Einheit. Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „PE-C-terminale Hälfte“ auf die C-terminale Hälfte eines vollständigen Prime-Editors und umfasst das „C-Intein“ am N-terminalen Ende der C- terminalen Hälfte (d. h. des C-terminalen Exteins) des kompletten Prime-Editors. Wenn die beiden Halbproteine, d. h. die N-terminale Hälfte von PE und die C-terminale Hälfte von PE, miteinander in Kontakt kommen, z. B. innerhalb der Zelle, durchlaufen das N-Intein und das C-Intein den gleichzeitigen Prozess der Selbstexzision und die Bildung einer Peptidbindung zwischen dem C-terminalen Ende der N-terminalen Hälfte von PE und dem N-terminalen Ende der C-terminalen Hälfte von PE, um das vollständige Prime-Editor-Protein, das die vollständige napDNAbp-Domäne umfasst (z. B. Cas9-Nickase ) und die RT-Domäne zu reformieren. Obwohl in der Zeichnung nicht gezeigt, kann der Prime-Editor auch zusätzliche Sequenzen umfassen, einschließlich NLS am N-Terminus und/oder C-Terminus, sowie Aminosäure-Linker-Sequenzen, die jede Domäne verbinden.
  • In verschiedenen Ausführungsformen können die Multi-Flap-Prime-Editoren als zwei Halbproteine (d. h. eine PE N-terminale Hälfte und eine PE C-terminale Hälfte) durch „Splitting“ des gesamten Prime-Editors als „Splitstelle“ hergestellt werden. Die „Splitstelle“ bezieht sich auf die Stelle der Insertion von Split-Intein-Sequenzen (d. h. das N-Intein und das C-Intein) zwischen zwei benachbarten Aminosäureresten im Prime-Editor. Genauer gesagt bezieht sich die „Splitstelle“ auf die Stelle, an der der gesamte Prime-Editor in zwei separate Hälften geteilt wird, wobei er in jeder Hälfte an der Splitstelle entweder mit dem N-Intein- oder dem C-Intein-Motiv fusioniert ist. Die Splitstelle kann sich an jeder geeigneten Stelle im Prime-Editor-Fusionsprotein befinden, aber vorzugsweise befindet sich die Splitstelle an einer Position, die die Bildung von zwei Halbproteinen ermöglicht, die für die Einschleusung (z. B. durch einen Exprimierungsvektor) geeignet bemessen sind und wobei die Inteine, die an den Splitstellen-Termini mit jeder Proteinhälfte fusioniert sind, zur Verfügung stehen, um ausreichend miteinander zu interagieren, wenn eine Proteinhälfte mit der anderen Proteinhälfte in der Zelle in Kontakt kommt.
  • In einigen Ausführungsformen befindet sich die Splitstelle in der napDNAbp-Domäne. In anderen Ausführungsformen befindet sich die Splitstelle in der RT-Domäne. In anderen Ausführungsformen befindet sich die Splitstelle in einem Linker, der die napDNAbp-Domäne und die RT-Domäne verbindet.
  • In verschiedenen Ausführungsformen erfordert die Ausgestaltung von Splittstellen die Suche nach Stellen zum Splitten und Einfügen eines N- und C-terminalen Inteins, die beide strukturell zulässig sind, um die beiden halben Prime-Editor-Domänen in zwei verschiedene AAV-Genome zu verpacken. Darüber hinaus können Inteinreste, die für das Trans-Spleißen notwendig sind, eingebaut werden, indem Reste am N-Terminus des C-terminalen Exteins mutiert werden oder Reste eingefügt werden, die eine Intein-„Narbe“ hinterlassen.
  • Beispielhafte Split-Konfigurationen von Split-Prime-Editoren, die entweder die SpCas9-Nickase oder die SaCas9-Nickase umfassen, sind wie folgt.
    S. PYOGENES PE, SPLIT AT LINKER, N TERMINAL PORTION
    STRUCTURE: [N EXTEIN]-[N INTEIN]
    Figure DE112021002672T5_0343
    KEY: NLS (SEQ ID NO: 124, 125) CAS9 (SEQ ID NO: 445) LINKER (SEQ ID NO: 446) NPUN INTEIN (SEQ ID NO: 447)
    S. PYOGENES PE, SPLIT AT LINKER, C TERMINAL PORTION
    STRUCTURE: [C INTEIN]-[C EXTEIN]
    Figure DE112021002672T5_0344
    KEY: NLS (SEQ ID NO: 124, 125) LINKER 1 (SEQ ID NO: 453) LINKER 2 (SEQ ID NO: 174)
    NPUC INTEIN (SEQ ID NO: 452) RT (SEQ ID NO: 454)
    S. AUREUS PE, SPLIT BETWEEN RESIDUES 740/741, N TERMINAL PORTION
    STRUCTURE: [N EXTEIN]-[N INTEIN]
    Figure DE112021002672T5_0345
    KEY: NLS (SEQ ID NO: 124, 125) CAS9 (SEQ ID NO: 460) LINKER (SEQ ID NO: 174) NPUN INTEIN (SEQ ID NO: 462)
    S. AUREUS PE, SPLIT BETWEEN RESIDUES 740/741, C TERMINAL PORTION
    STRUCTURE: [C INTEIN]-[C EXTEIN]
    Figure DE112021002672T5_0346
    KEY: NLS (SEQ ID NO: 124, 125) CAS9 (SEQ ID NO: 467) LINKER 1 (SEQ ID NO: 127) LINKER 2 (SEQ ID NO: 174) NPUC INTEIN (SEQ ID NO: 452) RT (SEQ ID NO: 471)
  • In verschiedenen Ausführungsformen unter Verwendung von SpCas9-Nickase (SEQ- ID-Nr: 18, 1368 Aminosäuren) kann, als ein Beispiel, das Splitting zwischen zwei beliebigen Aminosäuren zwischen 1 und 1368 erfolgen. Bevorzugte Splittings befinden sich jedoch zwischen der zentralen Region des Proteins, z. B. von den Aminosäuren 50-1250 oder von 100- 1200 oder von 150-1150 oder von 200-1100 oder von 250-1050 oder von 300-1000 oder von 350-950 oder von 400-900 oder von 450-850 oder von 500-800 oder von 550-750 oder von 600-700 von SEQ-ID-Nr: 18. In bestimmten beispielhaften Ausführungsformen kann die Splitstelle zwischen 740/741 oder 801/802 oder 1010/1011 oder 1041/1042 liegen. In anderen Ausführungsformen kann die Splitstelle zwischen 1/2, 2/3, 3/4, 4/5, 5/6, 6/7, 7/8, 8/9, 9/10, 10/11, 12/13, 14/15, 15/16, 17/18, 19/20, 20/21, 21/22, 22/23, 23/24, 24125, 25/26, 26/27, 27/28 , 28/29, 29/30, 30/31, 31/32, 32/33, 33/34, 34/35, 35/36, 36/37, 38/39, 39/40, 41/42, 42 /43, 43/44, 44/45, 45/46, 46/47, 47/48, 48/49, 49/50, 51/52, 52/53, 53/54, 54/55, 55/56 , 56/57, 57/58, 58/59, 59/60, 61/62, 62/63, 63/64, 64/65, 65/66, 66/67, 67/68, 68/69, 69 /70, 71/72, 72/73, 73/74, 74/75, 75/76, 76/77, 77/78, 78/79, 79/80, 81/82, 82/83, 83/84 , 84/85, 85/86, 86/87, 87/88, 88/89, 89/90 oder zwischen zwei beliebigen Paaren benachbarter Reste zwischen 90-100, 100-150, 150-200, 200-250, 250-300, 300-350, 350-400, 450-500, 500-550, 550-600, 600-650, 650-700, 700-750, 750-800, 800-850, 850-900, 900- 950, 950-1000, 1000-1050, 1050-1100, 1100-1150, 1150-1200, 1200-1250, 1250-1300, 1300-1350 und 1350-1368, bezogen auf SpCas9 von SEQ-ID-Nr: 18 liegen, zwischen zwei beliebigen entsprechenden Resten in einer Aminosäuresequenz mit mindestens 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % oder 99,9 % Sequenzidentität mit SEQ-ID-Nr: 18, oder zwischen zwei beliebigen entsprechenden Resten in einer Variante oder einem Äquivalent von SpCas9 einer der Aminosäuresequenzen SEQ-ID-Nr. 19-88, oder einer Aminosäuresequenz mit mindestens 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % oder 99,9 % Sequenzidentität mit einer der SEQ-ID-Nm: 19-88.
  • In verschiedenen Ausführungsformen können die geteilten Inteinsequenzen durch die folgenden Inteinsequenzen konstruiert werden.
    NAME SEQUENZ VON LIGANDENABHÄNGIGEM INTEIN
    2-4 INTEIN:
    Figure DE112021002672T5_0347
    3-2 INTEIN
    Figure DE112021002672T5_0348
    30R3-1 INTEIN
    Figure DE112021002672T5_0349
    30R3-2 INTEIN
    Figure DE112021002672T5_0350
    30R3-3 INTEIN
    Figure DE112021002672T5_0351
    Figure DE112021002672T5_0352
    37R3-1 INTEIN
    Figure DE112021002672T5_0353
    37R3-2 INTEIN
    Figure DE112021002672T5_0354
    37R3-3 INTEIN
    Figure DE112021002672T5_0355
  • In verschiedenen anderen Ausführungsformen können die geteilten Inteinsequenzen wie folgt verwendet werden:
    INTEIN-N INTEIN-C
    NPU-N
    Figure DE112021002672T5_0356
    		 NPU-C
    Figure DE112021002672T5_0357
  • In verschiedenen Ausführungsformen können die gesplitteten Inteine verwendet werden, um getrennte Teile eines vollständigen PE-Fusionsproteins separat in eine Zelle einzuschleusen, die bei Exprimierung in einer Zelle durch das Trans-Spleißen als vollständiges PE-Fusionsprotein rekonstituiert werden.
  • In einigen Ausführungsformen stellt die Offenbarung ein Verfahren zur Einschleusung eines PE-Fusionsproteins in eine Zelle bereit, umfassend:
    1. (a) Konstruieren eines ersten Exprimierungsvektors, der ein N-terminales Fragment des PE- Fusionsproteins kodiert, das an eine erste geteilte Inteinsequenz fusioniert ist;
    2. (b) Konstruieren eines zweiten Exprimierungsvektors, der ein C-terminales Fragment des PE- Fusionsproteins kodiert, das an eine zweite geteilte Inteinsequenz fusioniert ist;
    3. (c) Einschleusen des ersten und zweiten Exprimierungsvektors in eine Zelle,
    wobei das N-terminale und das C-terminale Fragment als das PE-Fusionsprotein in der Zelle rekonstituiert werden als Ergebnis der Trans-Splicing-Aktivität, die eine Selbstexzision der ersten und zweiten gesplitteten Inteinsequenzen verursacht.
  • Die Splitstelle kann sich in einigen Ausführungsformen an beliebiger Stelle in der Prime-Editor-Fusion befinden, einschließlich der napDNAbp-Domäne, des Linkers oder der Reverse-Transkriptase-Domäne.
  • In anderen Ausführungsformen befindet sich die Splitstelle in der napDNAbp-Domäne.
  • In noch anderen Ausführungsformen befindet sich die Splitstelle in der reversen Transkriptase- oder Polymerase-Domäne.
  • In noch anderen Ausführungsformen befindet sich die Splitstelle im Linker.
  • In verschiedenen Ausführungsformen stellt die vorliegende Offenbarung Multi-Flap- Prime-Editoren bereit, die einen napDNAbp (z. B. eine Cas9-Domäne) und eine reverse Transkriptase umfassen, wobei einer oder beide von napDNAbp und/oder der reversen Transkriptase ein Intein umfassen, beispielsweise ein ligandenabhängiges Intein. Typischerweise ist das Intein ein ligandenabhängiges Intein, das in Abwesenheit eines Liganden (z. B. kleine Moleküle wie 4-Hydroxytamoxifen, Peptide, Proteine, Polynukleotide, Aminosäuren und Nukleotide) keine oder nur eine minimale Proteinspleißaktivität zeigt. Ligandenabhängige Inteine sind bekannt und umfassen diejenigen, die in der US- Patentanmeldung U.S.S.N. 14/004,280, veröffentlicht als US 2014/0065711 A1, beschrieben ist, deren gesamter Inhalt hierin durch Bezugnahme aufgenommen ist. Darüber hinaus umfasst das Intein bei der Verwendung der Split-Cas9-Architektur in einigen Ausführungsformen eine Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ-ID-Nm: 8-15, 447, 452, 462, und 472-479.
  • In verschiedenen Ausführungsformen sind die napDNAbp-Domänen kleinere napDNAbp-Domänen im Vergleich zur kanonischen SpCas9-Domäne von Seq- ID-Nr: 18.
  • Das kanonische SpCas9-Protein ist 1368 Aminosäuren lang und hat ein vorhergesagtes Molekulargewicht von 158 Kilodalton. Der Begriff „kleine Cas9-Variante“, wie hierin verwendet, bezieht sich auf jede Cas9-Variante - natürlich vorkommend, technisch hergestellt oder anderweitig - die weniger als mindestens 1300 Aminosäuren oder mindestens weniger als 1290 Aminosäuren oder weniger als 1280 Aminosäuren oder weniger als 1270 Aminosäuren oder weniger als 1260 Aminosäuren oder weniger als 1250 Aminosäuren oder weniger als 1240 Aminosäuren oder weniger als 1230 Aminosäuren oder weniger als 1220 Aminosäuren oder weniger als 1210 Aminosäuren oder weniger als 1200 Aminosäuren oder weniger als 1190 Aminosäuren oder weniger als 1180 Aminosäuren oder weniger als 1170 Aminosäuren oder weniger als 1160 Aminosäuren oder weniger als 1150 Aminosäuren oder weniger als 1140 Aminosäuren oder weniger als 1130 Aminosäuren oder weniger als 1120 Aminosäuren oder weniger als 1110 Aminosäuren oder weniger als 1100 Aminosäuren oder weniger als 1050 Aminosäuren oder weniger als 1000 Aminosäuren oder weniger als 950 Aminosäuren oder weniger als 900 Aminosäuren oder weniger als 850 Aminosäuren oder weniger als 800 Aminosäuren oder weniger als 750 Aminosäuren oder weniger als 700 Aminosäuren oder weniger als 650 Aminosäuren oder weniger als 600 Aminosäuren oder weniger als 550 Aminosäuren oder weniger als 500 Aminosäuren, aber mindestens mehr als etwa 400 Aminosäuren beträgt und die erforderlichen Funktionen des Cas9-Proteins beibehält.
  • In einer Ausführungsform, wie in Beispiel 20 dargestellt, umfasst die Spezifikation die folgenden Split-Intein-PE-Konstrukte, die zwischen den Resten 1024 und 1025 des kanonischen SpCas9 (SEQ-ID-Nr: 18) gesplittet sind (oder die als Reste 1023 bzw. 1024 bezeichnet werden können bezogen auf eine Met-Minus-SEQ-ID-Nr: 18).
  • Zunächst wird die Aminosäuresequenz von SEQ-ID-NR: 18 wie folgt dargestellt, wobei die Lage der Splittstelle zwischen 1024 („K“) und 1025 („S“) Resten angezeigt wird:
    Beschreibung Sequenz SEQ-ID-Nr:
    SpCas9 Streptococcus pyogenes M1 SwissProt Zugriff Nr. Q99ZW2 Wildtyp
    Figure DE112021002672T5_0358
    		 SEQ-ID-Nr: 18, gekennzeichnet mit Splitstelle 1024/1025 in Fettdruck Das M an Position 1 ist in bestimmten Ausführung sformen nicht notwendiger weise im PE- Fusionsprotein vorhanden. Somit ist die Nummerierung der Splitstelle 1023/1024 für den Fall, dass die Aminosäure sequenz Met an Position 1 ausschließt.
  • In dieser Konfiguration ist die Aminosäuresequenz der N-terminalen Hälfte (Aminosäuren 1-1024) wie folgt:
    Figure DE112021002672T5_0359
  • In dieser Konfiguration ist die Aminosäuresequenz der N-terminalen Hälfte (Aminosäuren 1-1023) (wobei das Protein Met-Minus an Position 1 ist) wie folgt:
    Figure DE112021002672T5_0360
  • In dieser Konfiguration ist die Aminosäuresequenz der C-terminalen Hälfte (Aminosäuren 1024-1368 (oder gezählt als Aminosäuren 1023-1367 in einem Met-Minus- Cas9) wie folgt:
    Figure DE112021002672T5_0361
  • Wie in Beispiel 20 gezeigt, ist das PE2-Konstrukt (basierend auf SpCas9 von SEQ-ID- Nr: 18) an Position 1023/1024 (relativ zu einer Met-Minus SEQ-ID-Nr 18) in zwei separate Konstrukte gesplittet, wie folgt:
    • SpPE2-Split bei 1023/1024 N-terminale Hälfte
      Figure DE112021002672T5_0362
  • Legende: NLS, Cas9, mutierte Reste, Linker, NpuNIntein, NpuC-Intein, RT
  • SpPE2-Split bei 1023/1024, C-terminale Hälfte
    Figure DE112021002672T5_0363
    Figure DE112021002672T5_0364
  • Legende: NLS, Cas9, mutierte Reste. Linker, NpuIntein, NpuC-Intein, RT
  • Die vorliegende Offenbarung erwägt auch Verfahren zum Einschleusen von Split- Intein-Multi-Flap-Prime-Editoren in Zellen und/oder zum Behandeln von Zellen mit Split- Intein-Multi-Flap-Prime-Editoren.
  • In einigen Ausführungsformen stellt die Offenbarung ein Verfahren zur Einschleusung eines PE-Fusionsproteins in eine Zelle bereit, umfassend:
    1. (a) Konstruieren eines ersten Exprimierungsvektors, der ein N-terminales Fragment des PE-Fusionsproteins kodiert, das an eine erste geteilte Inteinsequenz fusioniert ist;
    2. (b) Konstruieren eines zweiten Exprimierungsvektors, der ein C-terminales Fragment des PE-Fusionsproteins kodiert, das an eine zweite geteilte Inteinsequenz fusioniert ist;
    3. (c) Einschleusen des ersten und zweiten Exprimierungsvektors in eine Zelle,
    wobei das N-terminale und das C-terminale Fragment als das PE-Fusionsprotein in der Zelle rekonstituiert werden als Ergebnis der Trans-Splicing-Aktivität, die eine Selbstexzision der ersten und zweiten geteilten Inteinsequenzen verursacht.
  • In bestimmten Ausführungsformen ist das N-terminale Fragment des PE- Fusionsproteins, das an eine erste geteilte Inteinsequenz fusioniert ist, SEQ-ID-Nr: 3875, oder eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80 %, mindestens 85 %, mindestens 90 %, mindestens 95 %, mindestens 98 % oder mindestens 99,9 % Sequenzidentität mit SEQ-ID-Nr: 3875.
  • In anderen Ausführungsformen ist das C-terminale Fragment des PE-Fusionsproteins, das an eine erste geteilte Inteinsequenz fusioniert ist, SEQ-ID-Nr: 3876, oder eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80 %, mindestens 85 %, mindestens 90 %, mindestens 95 %, mindestens 98 % oder mindestens 99,9 % Sequenzidentität mit SEQ-ID-Nr: 3876.
  • In anderen Ausführungsformen stellt die Offenbarung ein Verfahren für das Editing einer DNA-Sequenz innerhalb einer Zelle bereit, umfassend:
    1. (a) Konstruieren eines ersten Exprimierungsvektors, der ein N-terminales Fragment des PE-Fusionsproteins kodiert, das an eine erste geteilte Inteinsequenz fusioniert ist;
    2. (b) Konstruieren eines zweiten Exprimierungsvektors, der ein C-terminales Fragment des PE-Fusionsproteins kodiert, das an eine zweite geteilte Inteinsequenz fusioniert ist;
    3. (c) Einschleusen des ersten und zweiten Exprimierungsvektors in eine Zelle,
    wobei das N-terminale und das C-terminale Fragment als das PE-Fusionsprotein in der Zelle rekonstituiert werden als Ergebnis der Trans-Splicing-Aktivität, die eine Selbstexzision der ersten und zweiten geteilten Inteinsequenzen verursacht.
  • In bestimmten Ausführungsformen ist das N-terminale Fragment des PE- Fusionsproteins, das an eine erste geteilte Inteinsequenz fusioniert ist, SEQ-ID-Nr: 3875, oder eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80 %, mindestens 85 %, mindestens 90 %, mindestens 95 %, mindestens 98 % oder mindestens 99,9 % Sequenzidentität mit SEQ-ID-Nr: 3875.
  • In anderen Ausführungsformen ist das C-terminale Fragment des PE-Fusionsproteins, das an eine erste geteilte Inteinsequenz fusioniert ist, SEQ-ID-Nr: 3876, oder eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80 %, mindestens 85 %, mindestens 90 %, mindestens 95 %, mindestens 98 % oder mindestens 99,9 % Sequenzidentität mit SEQ-ID-Nr: 3876.
  • Einschleusung von PE-Ribonukleoprotein-Komplexen
  • In diesem Aspekt können die Multi-Flap-Prime-Editoren durch nicht-virale Einschleusungsstrategien eingeschleust werden, die die Einschleusung eines mit PEgRNA (d. h. einem PE-Ribonukleoprotein-Komplex) komplexierten Multi-Flap-Prime-Editors durch verschiedene Verfahren beinhalten, einschließlich Elektroporation und Lipid-Nanopartikel. Verfahren zur nicht-viralen Einschleusung von Nukleinsäuren umfassen Lipofektion, Nukleofektion, Mikroinjektion, Biolistik, Virosomen, Liposomen, Immunoliposomen, Polykation oder Lipid:Nukleinsäure-Konjugate, nackte DNA, künstliche Virionen und Wirkstoff-verstärkte Aufnahme von DNA. Die Lipofektion ist z. B. in US-Pat. Nr. 5,049,386 , 4,946,787 und 4,897,355 ) beschrieben und Lipofektionsreagenzien werden kommerziell verkauft (z. B. Transfectam™ und Lipofectin™). Kationische und neutrale Lipide, die für eine effiziente Rezeptor-Erkennungs-Lipofektion von Polynukleotiden geeignet sind, umfassen die von Feigner, WO 91/17424 ; WO 91/16024 . Die Einschleusung kann in Zellen (z. B. In-vitro- oder Ex-vivo-Verabreichung) oder Ziel-Geweben (z. B. In-vivo-Verabreichung) erfolgen.
  • Die Herstellung von Lipid:Nukleinsäure-Komplexen, einschließlich zielgerichteter Liposomen, wie Immunlipid-Komplexe, ist dem Fachmann gut bekannt (siehe z. B. Crystal, Science 270:404-410 (1995); Blaese et al., Cancer Gen Ther. 2:291-297 (1995); Behr et al., Bioconjugate Chem. 5:382-389 (1994); Remy et al., Bioconjugate Chem. 5:647-654 (1994); Gao et al., Gene Therapy 2:710-722 (1995); Ahmad et al., Cancer Res. 52:4817-4820 (1992); US-Pat. Nr. 4,186,183 , 4,217,344 , 4,235,871 , 4,261,975 , 4,485,054 , 4,501,728 , 4,774,085 , 4,837,028 , and 4,946,787 ).
  • Zusätzlich kann auf die folgenden Referenzen verwiesen werden, die Ansätze für die nicht-virale Verabreichung von Ribonukleoproteinkomplexen erörtern, von denen jede hierin durch Bezugnahme aufgenommen ist.
  • Chen, Sean, et al. „Highly efficient mouse genome editing by CRISPR ribonucleoprotein electroporation of zygotes.“ Journal of Biological Chemistry (2016): jbc- M116. PubMed
  • Zuris, John A., et al. „Cationic lipid-mediated delivery of proteins enables efficient protein-based genome editing in vitro and in vivo.“ Nature biotechnology 33.1 (2015): 73. PubMed
  • Rouet, Romain, et al. „Receptor-Mediated Delivery of CRISPR-Cas9 Endonuclease for Cell-Type-Specific Gene Editing.“ Journal of the American Chemical Society 140.21 (2018): 6596-6603. PubMed.
  • 68C stellt Daten bereit, die zeigen, dass verschiedene offenbarte PE- Ribonukleoproteinkomplexe (PE2 bei hoher Konzentration, PE3 bei hoher Konzentration und PE3 bei niedriger Konzentration) auf diese Weise eingeschleust werden können.
  • Einschleusung von PE durch mRNA
  • Ein weiteres Verfahren, das verwendet werden kann, um Multi-Flap-Prime-Editoren und/oder PEgRNAs in Zellen einzuschleusen, in denen eine auf Multi-Flap-Prime-Editingbasierende Genom-Editing erwünscht ist, besteht in der Verwendung von Boten-RNA- (mRNA)-Einschleusungsverfahren und -technologien. Beispiele für mRNA- Einschleusungsverfahren und -Zusammensetzungen, die in der vorliegenden Offenbarung verwendet werden können, beinhalten beispielsweise PCT/ US2014/028330 , US8822663B2 , NZ700688A, ES2740248T3 , EP2755693A4 , EP2755986A4 , WO2014152940A1 , EP3450553B1 , BR112016030852A2 und EP3362461A1 , die hierin jeweils durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit aufgenommen sind. Eine zusätzliche Offenbarung, die hiermit durch Bezugnahme aufgenommen ist, findet sich in Kowalski et al., „Delivering the Messenger: Advances in Technologies for Therapeutic mRNA Delivery,“ Mol Therap., 2019; 27(4): 710-728.
  • Im Gegensatz zu DNA-Vektoren, die Multi-Flap-Prime-Editoren kodieren, hat die Verwendung von RNA als Einschleusungsmittel für Multi-Flap-Prime-Editoren den Vorteil, dass das genetische Material nicht in den Zellkern eindringen muss, um seine Funktion zu erfüllen. Die eingeschleuste mRNA kann direkt im Zytoplasma in das gewünschte Protein (z. B. Prime-Editor-Fusionsprotein) und Nukleinsäureprodukte (z. B. PEgRNA) translatiert werden. Um jedoch stabiler zu sein (z. B. RNA-FIGauenden Enzymen im Zytoplasma zu widerstehen), ist es in einigen Ausführungsformen notwendig, die mRNA zu stabilisieren, um die Einschleusungseffizienz zu verbessern. Bestimmte Einschleusungsträger wie kationische Lipide oder polymere Einschleusungsträger können auch dazu beitragen, die transfizierte mRNA vor endogenen RNase-Enzymen zu schützen, die andernfalls die therapeutische mRNA FIGauen könnten, die die gewünschten Prime-Editor-Fusionsproteine kodiert. Darüber hinaus bleibt trotz der erhöhten Stabilität der modifizierten mRNA die Einschleusung von mRNA, insbesondere von mRNA, die Protein in voller Länge kodiert, in Zellen in vivo auf eine Weise, die therapeutische Mengen an Proteinproduktion ermöglicht, eine Herausforderung.
  • Mit einigen Ausnahmen ist der intrazelluläre Transport von mRNA im Allgemeinen schwieriger als der von kleinen Oligonukleotiden und erfordert die Einkapselung in ein Transport-Nanopartikel, teilweise aufgrund der deutlich größeren Größe der mRNA-Moleküle (300-5.000 kDa, ~1-15 kb) im Vergleich zu anderen RNA-Typen (kleine interferierende RNAs [siRNAs], ~14 kDa; Antisense-Oligonukleotide [ASOs], 4-10 kDa).
  • mRNA muss die Zellmembran passieren, um das Zytoplasma zu erreichen. Die Zellmembran ist eine dynamische und gewaltige Barriere für die intrazelluläre Einschleusung. Sie besteht hauptsächlich aus einer Lipiddoppelschicht aus zwitterionischen und negativ geladenen Phospholipiden, wobei die polaren Köpfe der Phospholipide zur wässrigen Umgebung zeigen und die hydrophoben Schwänze einen hydrophoben Kern bilden.
  • In einigen Ausführungsformen umfassen die mRNA-Zusammensetzungen der Offenbarung mRNA (die einen Prime-Editor und/oder PEgRNA kodiert), ein Transportvehikel und optional ein Mittel, das den Kontakt mit der Ziel-Zelle und die anschließende Transfektion erleichtert.
  • In einigen Ausführungsformen kann die mRNA eine oder mehrere Modifikationen beinhalten, die der mRNA Stabilität verleihen (z. B. im Vergleich zur Wildtyp- oder nativen Version der mRNA) und an der damit verbundenen abnormalen Exprimierung des Proteins beteiligt sind. Eine oder mehrere Modifikationen des Wildtyps, die den Defekt korrigieren, können ebenfalls beinhaltet sein. Zum Beispiel können die Nukleinsäuren der Erfindung Modifikationen einer oder beider einer 5'-untranslatierten Region oder einer 3'-untranslatierten Region beinhalten. Solche Modifikationen können den Einschluss von Sequenzen beinhalten, die eine Teilsequenz des Immediate-Early-1-(IE1)-Gens des Cytomegalovirus (CMV), des Poly-A-Schwanzes, der Cap1-Struktur oder des humanen Wachstumshormons (hGH) kodieren. In einigen Ausführungsformen wird die mRNA modifiziert, um die mRNA- Immunogenität zu reduzieren.
  • In einer Ausführungsform kann die Multi-Flap-Prime-Editor-mRNA in der Zusammensetzung der Erfindung in einem Liposomen-Transfervehikel formuliert sein, um die Einschleusung in Ziel-Zellen zu erleichtern. In Betracht gezogene Transfervehikel können ein oder mehrere kationische Lipide, nicht-kationische Lipide und/oder PEG-modifizierte Lipide umfassen. Zum Beispiel kann das Transfervehikel mindestens eines der folgenden kationischen Lipide beinhalten: C12-200, DLin-KC2-DMA, DODAP, HGT4003, ICE, HGT5000 oder HGT5001. In Ausführungsformen umfasst das Transfervehikel Cholesterin (Chol) und/oder PEG-modifizierte Lipide. In einigen Ausführungsformen umfasst das Transfervehikel DMG- PEG2K. In bestimmten Ausführungsformen weist das Transfervehikel die folgende Lipidformulierung auf: C12-200, DOPE, chol, DMG-PEG2K; DODAP, DOPE, Cholesterin, DMG-PEG2K; HGT5000, DOPE, Chol, DMG-PEG2K, HGT5001, DOPE, Chol, eines von DMG-PEG2K.
  • Die vorliegende Offenbarung stellt auch Zusammensetzungen und Verfahren bereit, die zum Erleichtern der Transfektion von Ziel-Zellen mit einem oder mehreren PE-kodierenden mRNA-Molekülen nützlich sind. Zum Beispiel erwägen die Zusammensetzungen und Verfahren der vorliegenden Erfindung die Verwendung von Targeting-Liganden, die die Affinität der Zusammensetzung für eine oder mehrere Ziel-Zellen erhöhen können. In einer Ausführungsform ist der Targeting-Ligand Apolipoprotein B oder Apolipoprotein E und die entsprechenden Ziel-Zellen exprimieren Lipoproteinrezeptoren niedriger Dichte und fördern somit die Erkennung des Targeting-Liganden. Unter Verwendung der Verfahren und Zusammensetzungen der vorliegenden Offenbarung kann auf eine große Anzahl von Ziel- Zellen bevorzugt abgezielt werden. Zu den in Betracht gezogenen Ziel-Zellen gehören beispielsweise Hepatozyten, Epithelzellen, hämatopoetische Zellen, Epithelzellen, Endothelzellen, Lungenzellen, Knochenzellen, Stammzellen, Mesenchymzellen, Nervenzellen, Herzzellen, Adipozyten, vaskuläre, glatte Muskelzellen, Kardiomyozyten, Skelettmuskelzellen, Betazellen, Hypophysenzellen, Synovialschleimhautzellen, Eierstockzellen, Hodenzellen, Fibroblasten, B-Zellen, T-Zellen, Retikulozyten, Leukozyten, Granulozyten und Tumorzellen. Dies ist jedoch nicht darauf beschränkt.
  • In einigen Ausführungsformen kann die PE-kodierende mRNA optional chemische oder biologische Modifikationen aufweisen, die beispielsweise die Stabilität und/oder Halbwertszeit einer solchen mRNA verbessern oder die Proteinproduktion verbessern oder anderweitig erleichtern. Bei der Transfektion kann eine natürliche mRNA in den Zusammensetzungen der Erfindung mit einer Halbwertszeit zwischen 30 Minuten und mehreren Tagen zerfallen. Die mRNAs in den Zusammensetzungen der Offenbarung können zumindest eine gewisse Fähigkeit zur Translation beibehalten, wodurch ein funktionelles Protein oder Enzym hergestellt wird. Dementsprechend stellt die Erfindung Zusammensetzungen bereit, die eine stabilisierte mRNA umfassen und Verfahren zu ihrer Verabreichung. In einigen Ausführungsformen wird die Aktivität der mRNA über einen längeren Zeitraum verlängert. Zum Beispiel kann die Aktivität der mRNA verlängert werden, so dass die Zusammensetzungen der vorliegenden Offenbarung einem Patienten halbwöchentlich oder zweiwöchentlich oder bevorzugterweise monatlich, zweimonatlich, vierteljährlich oder jährlich verabreicht werden. Die verlängerte oder verlängerte Aktivität der mRNA der vorliegenden Erfindung steht in direktem Zusammenhang mit der Menge an Protein oder Enzym, die aus einer solchen mRNA produziert wird. In ähnlicher Weise kann die Aktivität der Zusammensetzungen der vorliegenden Offenbarung durch Modifikationen, die dazu gedacht sind, die Translation der mRNA zu verbessern oder zu verstärken, weiter verlängert oder erweitert werden. Darüber hinaus ist die Menge an funktionellem Protein oder Enzym, die von der Ziel-Zelle produziert wird, eine Funktion der Menge der in die Ziel-Zellen eingeschleusten mRNA und der Stabilität einer solchen mRNA. Soweit die Stabilität der mRNA der vorliegenden Erfindung verbessert oder erhöht werden kann, können die Halbwertszeit, die Aktivität des produzierten Proteins oder Enzyms und die Dosierungshäufigkeit der Zusammensetzung weiter verlängert werden.
  • Dementsprechend umfasst die mRNA in den Zusammensetzungen der Offenbarung in einigen Ausführungsformen mindestens eine Modifikation, die der Nukleinsäure eine erhöhte oder verbesserte Stabilität verleiht, einschließlich beispielsweise einer verbesserten Resistenz gegenüber Nukleaseverdauung in vivo. Wie hierin verwendet, umfassen die Begriffe „Modifikation“ und „modifiziert“, da sich diese Begriffe auf die hierin bereitgestellten Nukleinsäuren beziehen, mindestens eine Änderung, die vorzugsweise die Stabilität erhöht und die mRNA stabiler macht (z. B. resistenter gegen Nukleaseverdauung) als die Wildtyp- oder natürlich vorkommende Version der mRNA. Wie hierin verwendet, beziehen sich die Begriffe „stabil“ und „Stabilität“ als solche Begriffe auf die Nukleinsäuren der vorliegenden Erfindung, und beziehen sich insbesondere in Bezug auf die mRNA auf eine erhöhte oder verstärkte Widerstandsfähigkeit gegenüber einem FIGau durch beispielsweise Nukleasen (d. h. Endonukleasen oder Exonukleasen), die normalerweise in der Lage sind, solche mRNA abzubauen. Erhöhte Stabilität kann beispielsweise eine geringere Empfindlichkeit gegenüber Hydrolyse oder anderer Zerstörung durch endogene Enzyme (z. B. Endonukleasen oder Exonukleasen) oder Bedingungen innerhalb der Ziel-Zelle oder des Ziel-Gewebes umfassen, wodurch die Verweildauer solcher mRNA in der Ziel-Zelle, dem Gewebe, Patienten und/oder Zytoplasma erhöht oder verbessert wird. Die hier bereitgestellten stabilisierten mRNA- Moleküle zeigen längere Halbwertszeiten im Vergleich zu ihren natürlich vorkommenden, unmodifizierten Gegenstücken (z. B. der Wildtyp-Version der mRNA). Von den Begriffen „Modifikation“ und „modifiziert“ als solche Begriffe, die sich auf die mRNA der vorliegenden Erfindung beziehen, werden auch Veränderungen in Betracht gezogen, die die Translation von mRNA-Nukleinsäuren verbessern oder verstärken, einschließlich beispielsweise der Aufnahme von Sequenzen, die bei der Initiation von Proteintranslation wirken (z. B. die Kozak-Konsensussequenz). (Kozak, M., Nucleic Acids Res 15 (20): 8125-48 (1987)).
  • In einigen Ausführungsformen wurden die in den Zusammensetzungen der Offenbarung verwendeten mRNAs einer chemischen oder biologischen Modifikation unterzogen, um sie stabiler zu machen. Beispielhafte Modifikationen an einer mRNA beinhalten die Verarmung einer Base (z. B. durch Deletion oder durch die Substitution eines Nukleotids durch ein anderes) oder die Modifikation einer Base, z. B. die chemische Modifikation einer Base. Der Ausdruck „chemische Modifikationen“, wie er hier verwendet wird, schließt Modifikationen ein, die Chemien einführen, die sich von denen in natürlich vorkommender mRNA unterscheiden, zum Beispiel kovalente Modifikationen wie die Einführung modifizierter Nukleotide (z. B. Nukleotidanaloga oder die Aufnahme von Seitengruppen, die in solchen mRNA-Molekülen nicht natürlich vorkommen).
  • Andere geeignete Polynukleotid-Modifikationen, die in die PE-kodierende mRNA eingebaut werden können, die in den Zusammensetzungen der Offenbarung verwendet wird, beinhalten unter anderem 4'-Thio-modifizierte Basen: 4'-Thio-Adenosin, 4'-Thio-Guanosin, 4'- Thio-Cytidin, 4'-Thio-Uridin, 4'-Thio-5-Methyl-Cytidin, 4'-Thio-Pseudouridin und 4'- Thio-2- Thiouridin, Pyridin-4-on-Ribonukleosid, 5-Aza-Uridin, 2-Thio-5-Aza-Uridin, 2-Thiouridin, 4- Thio-Pseudouridin, 2-Thio-Pseudouridin, 5-Hydroxyuridin, 3-Methyluridin, 5- Carboxymethyl-Uridin, 1-Carboxymethyl-Pseudouridin, 5-Propinyl-Uridin, 1-Propinyl- Pseudouridin, 5-Taurinomethyluridin, 1-Taurinomethyl-Pseudouridin, 5-Taurinomethyl-2- Thio-Uridin, 1-Taurinomethyl-4-Thio-Uridin, 5-Methyl-Uridin, 1-Methyl-Pseudouridin, 4- Thio-1 -Methyl-Pseudouridin, 2-Thio-1 -Methyl-Pseudouridin, 1-Methyl-1-Deaza- Pseudouridin, 2-Thio-1-methyl-1-Deaza-Pseudouridin, Dihydrouridin, Dihydropseudouridin, 2-Thio-Dihydrouridin, 2-Thio-Dihydropseudouridin, 2-Methoxyuridin, 2-Methoxy-4-Thio- Uridin, 4-Methoxy-Pseudouridin, 4-Methoxy-2-Thio-Pseudouridin, 5-Aza-Cytidin, Pseudoisocytidin, 3-Methyl-Cytidin, N4-Acetylcytidin, 5-Formylcytidin, N4-Methylcy Tidin, 5-Hydroxymethylcytidin, 1-Methyl-Pseudoisocytidin, Pyrrolo-Cytidin, Pyrrolo- Pseudoisocytidin, 2-Thio-Cytidin, 2-Thio-5-Methyl-Cytidin, 4-Thio-Pseudoisocytidin, 4- Thio-1-Methyl-Pseudoisocytidin, 4-Thio-1-Methyl-1-Deaza-Pseudoisocytidin, 1-Methyl-1- Deaza-Pseudoisocytidin, Zebularin, 5-Aza-Zebularin, 5-Methyl-Zebularin, 5-Aza-2-Thio- Zebularin, 2-Thio-Zebularin, 2-Methoxy-Cytidin, 2-Methoxy-5-Methyl-Cytidin, 4-Methoxy- Pseudoisocytidin, 4-Methoxy-1-Methyl-Pseudoisocytidin, 2-Aminopurin, 2,6-Diaminopurin, 7-Deaza-Adenin, 7-Deaza-8-Aza-Adenin, 7-Deaza-2-Aminopurin, 7-Deaza-8-Aza-2- Aminopurin, 7-Deaza-2,6-Diaminopurin, 7-Deaza-8-Aza-2,6-Diaminopurin, 1- Methyladenosin, N6-Methyladenosin, N6-Isopentenyladenosin, N6-(cis-Hydroxyisopentenyl- )Adenosin, 2-Methylthio-N6-(cis-Hydroxyisopentenyl-)Adenosin, N6- Glycinylcarbamoyladenosin, N6-Threonyl, 2-Methylthio-N6-Threonylcarbamoyladenosin, N6,N6-Dimethyladenosin, 7-Methyladenin, 2-Methylthio-Adenin und 2-Methoxy-Adenin, Inosin, 1-Methyl-Inosin, Wyosin, Wybutosin, 7-Deaza-Guanosin, 7-Deaza-8-Aza-Guanosin, 6-Thio-Guanosin, 6-Thio-7-Deaza-Guanosin, 6-Thio-7-Deaza-8-Aza-Guanosin, 7-MethylGuanosin, 6-Thio-7-Methyl-Guanosin, 7-Methylinosin, 6-Methoxy-Guanosin, 1- Methylguanosin, N2-Methylguanosin, N2,N2-Dimethylguanosin, 8-Oxo-Guanosin, 7-Methyl- 8-Oxo-Guanosin, 1-Methyl-6-Thio-Guanosin, N2-Methyl-6-Thio-Guanosin und N2,N2- Dimethyl-6-Thioguanosin und Kombinationen davon. Der Begriff Modifikation umfasst beispielsweise auch den Einbau von Nicht-Nukleotid-Bindungen oder modifizierten Nukleotiden in die mRNA-Sequenzen der vorliegenden Erfindung (z. B. Modifikationen an einem oder beiden der 3'- und 5'-Enden eines mRNA-Moleküls, das ein funktionelles Protein oder Enzym kodiert). Solche Modifikationen umfassen das Hinzufügen von Basen zu einer mRNA-Sequenz (z. B. die Aufnahme eines Poly-A-Schwanzes oder eines längeren Poly-A- Schwanzes), die Veränderung der 3'-UTR oder der 5'-UTR, die Komplexierung der mRNA mit einem Agent (z. B. ein Protein oder ein komplementäres Nukleinsäuremolekül) und der Einschluss von Elementen, die die Struktur eines mRNA-Moleküls verändern (z. B. die Sekundärstrukturen bilden).
  • In einigen Ausführungsformen umfassen PE-kodierende mRNAs eine 5'-Kappen- Struktur. Ein 5'-Kappe wird typischerweise wie folgt hinzugefügt: Zuerst entfernt eine RNAterminale Phosphatase eine der terminalen Phosphatgruppen vom 5'-Nukleotid, wodurch zwei terminale Phosphate zurückbleiben; Guanosintriphosphat (GTP) wird dann über eine Guanylyltransferase zu den terminalen Phosphaten hinzugefügt, wodurch eine 5'5'5- Triphosphatbindung erzeugt wird; und der 7-Stickstoff von Guanin wird dann durch eine Methyltransferase methyliert. Beispiele für Kappenstrukturen umfassen, aber sind nicht beschränkt auf m7G(5')ppp (5'(A,G(5')ppp(5')A und G(5')ppp(5')G. Natürlich vorkommende Kappen-Strukturen umfassen ein 7-Methylguanosin, das über eine Triphosphatbrücke mit dem 5'-Ende des ersten transkribierten Nukleotids verbunden ist, was zu einem Dinukleotid-Cap von m7G(5')ppp(5')N führt, wobei N ein beliebiges Nukleosid ist. In vivo wird die Kappe enzymatisch hinzugefügt. Die Kappe wird im Zellkern hinzugefügt und durch das Enzym Guanylyltransferase katalysiert. Die Anfügung der Kappe an das 5'-terminale Ende der RNA erfolgt unmittelbar nach Initiation der Transkription. Das terminale Nukleosid ist typischerweise ein Guanosin und ist umgekehrt zu allen anderen Nukleotiden ausgerichtet, d. h. G(5')ppp(5')GpNpNp.
  • Zusätzliche Kappen-Analoga umfassen, sind unter anderem chemische Strukturen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus m7GpppG, m7GpppA, m7GpppC; unmethylierte Kappen-Analoga (z. B. GpppG); dimethyliertes Kappen-Analogon (z. B. m2,7GpppG), trimethyliertes Kappen-Analogon (z. B. m2,2,7GpppG), dimethylierte symmetrische Kappen- Analoga (z. B. m7Gpppm7G) oder Anti-Reverse- Kappen-Analoga (z. B. ARCA; m7,2'OmeGpppG, m72'dGpppG, m7,3'OmeGpppG, m7,3'dGpppG und deren Tetraphosphat- Derivate) (siehe z. B. Jemieliity, J. et al., „Novel ‚anti-reverse‘ cap analogs with superior translational properties“, RNA, 9: 1108-1122 (2003)).
  • Typischerweise dient die Anwesenheit eines „Schwanzes“ dazu, die mRNA vor dem FIGau durch Exonuklease zu schützen. Es wird angenommen, dass ein Poly-A- oder Poly-U- Schwanz natürliche Botenstoffe und synthetische Sense-RNA stabilisiert. Daher kann in bestimmten Ausführungsformen ein langer Poly-A- oder Poly-U-Schwanz zu einem mRNA- Molekül hinzugefügt werden, wodurch die RNA stabiler wird. Poly-A- oder Poly-U-Schwänze können mit einer Vielzahl von anerkannten Techniken hinzugefügt werden. Zum Beispiel können lange Poly-A-Schwänze an synthetische oder in vitro transkribierte RNA unter Verwendung von Poly-A-Polymerase hinzugefügt werden (Yokoe et al. Nature Biotechnology. 1996; 14; 1252-1256). Ein Transkriptionsvektor kann auch lange Poly-A-Schwänze kodieren. Außerdem können Poly-A-Schwänze durch Transkription direkt aus PCR-Produkten hinzugefügt werden. Poly-A kann auch mit RNA-Ligase an das 3'-Ende einer Sense-RNA ligiert werden (siehe z. B. Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Ed., ed. by Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1991 edition)).
  • Typischerweise kann die Länge eines Poly-A- oder Poly-U-Schwanzes mindestens etwa 10, 50, 100, 200, 300, 400 oder mindestens 500 Nukleotide betragen. In einigen Ausführungsformen beinhaltet ein Poly-A-Schwanz am 3'-Terminus von mRNA typischerweise etwa 10 bis 300 Adenosinnukleotide (z. B. etwa 10 bis 200 Adenosinnukleotide, etwa 10 bis 150 Adenosinnukleotide, etwa 10 bis 100 Adenosinnukleotide, etwa 20 bis 70 Adenosinnukleotide oder etwa 20 bis 60 Adenosinnukleotide). In einigen Ausführungsformen umfassen mRNAs eine 3'-Poly(C)- Schwanzstruktur. Ein geeigneter Poly-C-Schwanz am 3'-Terminus der mRNA beinhaltet typischerweise etwa 10 bis 200 Cytosinnukleotide (z. B. etwa 10 bis 150 Cytosinnukleotide, etwa 10 bis 100 Cytosinnukleotide, etwa 20 bis 70 Cytosinnukleotide, etwa 20 bis 60 Cytosin Nukleotide oder etwa 10 bis 40 Cytosinnukleotide). Der Poly-C-Schwanz kann dem Poly-A- oder Poly-U-Schwanz hinzugefügt werden oder kann den Poly-A- oder Poly-U-Schwanz ersetzen.
  • PE-kodierende mRNAs gemäß der vorliegenden Offenbarung können gemäß einer Vielzahl bekannter Verfahren synthetisiert werden. Beispielsweise können mRNAs gemäß der vorliegenden Erfindung über In-vitro-Transkription (IVT) synthetisiert werden. Kurz gesagt wird IVT typischerweise mit einem linearen oder zirkulären DNA-Templat durchgeführt, die einen Promotor, einen Pool von Ribonukleotidtriphosphaten, ein Puffersystem, das DTT und Magnesiumionen enthalten kann, und eine geeignete RNA-Polymerase (z. B. T3-, T7- oder SP6-RNA-Polymerase), DNAse I, Pyrophosphatase und/oder RNAse-Inhibitor enthält. Die genauen Bedingungen variieren je nach spezifischer Anwendung.
  • In Ausführungsformen, die die mRNA-Einschleusung beinhalten, kann das Verhältnis der mRNA, die das PE-Fusionsprotein kodiert, zu der PEgRNA für ein effizientes Editing wichtig sein. In bestimmten Ausführungsformen beträgt das Gewichtsverhältnis von mRNA (die das PE-Fusionsprotein kodiert) zu PEgRNA 1:1. In bestimmten anderen Ausführungsformen beträgt das Gewichtsverhältnis von mRNA (die das PE-Fusionsprotein kodiert) zu PEgRNA 2:1. In noch anderen Ausführungsformen beträgt das Gewichtsverhältnis von mRNA (die das PE-Fusionsprotein kodiert) zu PEgRNA 1:2. In noch weiteren Ausführungsformen wird das Gewichtsverhältnis von mRNA (die das PE-Fusionsprotein kodiert) zu PEgRNA ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus etwa 1:1000, 1:900; 1:800; 1:700; 1:600; 1:500; 1:400; 1:300; 1:200; 1:100; 1:90; 1:80; 1:70; 1:60; 1:50; 1:40; 1:30; 1:20; 1:10 und 1:1. In anderen Ausführungsformen wird das Gewichtsverhältnis von mRNA (die das PE-Fusionsprotein kodiert) zu PEgRNA ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus etwa 1:1000, 1:900; 800:1; 700:1; 600:1; 500:1; 400:1; 300:1; 200:1; 100:1; 90:1; 80:1; 70:1; 60:1; 50:1; 40:1; 30:1; 20:1; 10:1 und 1:1.
  • F. Verwendung von Multi-Flap-Prime-Editing zur Insertion induzierbarer Dimerisierungsdomänen
  • Die hier beschriebenen Multi-Flap-Prime-Editoren (wie in 90, 95, 97A, 98A dargestellt), können auch verwendet werden, um Dimerisierungsdomänen in ein oder mehrere Zielproteine einzubauen. Die Dimerisierungsdomänen können die induzierbare Regulierung der Aktivität erleichtern, die mit der Dimerisierung des einen oder der mehreren Protein-Ziele über eine verbindende Einheit (z. B. ein kleines Molekül, Peptid oder Protein) verbunden ist, die auf bispezifische Weise bindet. In verschiedenen Aspekten binden die Dimerisierungsdomänen, wenn sie auf unterschiedlichen Proteinen (z. B. dem gleichen Typ oder unterschiedlichen Proteinen) eingebaut sind, jeweils an dieselbe bispezifische Einheit (z. B. ein bispezifisches kleines Molekül, Peptid oder Polypeptid mit mindestens zwei Regionen, die getrennt an die Dimerisierungsdomänen binden), wodurch die Dimerisierung der Proteine durch ihre gemeinsame Wechselwirkung mit dem bispezifischen Liganden verursacht wird. Auf diese Weise fungiert der bispezifische Ligand als „Induktor“ der Dimerisierung zweier Proteine. In einigen Fällen weist der bispezifische Ligand oder die bispezifische Verbindung zwei gleiche Targeting-Einheiten auf. In anderen Ausfürungsformen weist der bispezifische Ligand oder die bispezifische Verbindung Targeting-Einheiten auf, die sich voneinander unterscheiden. Der bispezifische Ligand oder die bispezifische Verbindung mit den gleichen zwei Targeting-Einheiten wird in der Lage sein, auf die gleiche Dimerisierungsdomäne abzuzielen, die auf verschiedenen Protein-Ziele eingebaut ist. Der bispezifische Ligand oder die bispezifische Verbindung mit unterschiedlichen Targeting- Einheiten wird in der Lage sein, auf unterschiedliche Dimerisierungsdomänen abzuzielen, die auf verschiedenen Protein-Zielen eingebaut sind.
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „Dimerisierungsdomäne“ auf eine ligandenbindende Domäne, die an eine Bindungseinheit eines bispezifischen Liganden bindet. Eine „erste“ Dimerisierungsdomäne bindet an eine erste Bindungseinheit eines bispezifischen Liganden und eine „zweite“ Dimerisierungsdomäne bindet an eine zweite Bindungseinheit desselben bispezifischen Liganden. Wenn die erste Dimerisierungsdomäne an ein erstes Protein fusioniert wird (z. B. über PE, wie hierin erörtert) und die zweite Dimerisierungsdomäne (z. B. über PE, wie hierin erörtert) an ein zweites Protein fusioniert wird, so dimerisieren das erste und das zweite Protein in Anwesenheit eines bispezifischen Liganden, wobei der bispezifische Ligand mindestens eine Einheit aufweist, die an die erste Dimerisierungsdomäne bindet, und mindestens eine andere Einheit, die an die zweite Dimerisierungsdomäne bindet.
  • Der Begriff „bispezifischer Ligand“ oder „bispezifische Einheit“, wie hierin verwendet, bezieht sich auf einen Liganden, der an zwei verschiedene Ligandenbindungsdomänen bindet. In verschiedenen Ausführungsformen ist die bispezifische Einheit selbst ein Dimer von zwei gleichen oder zwei unterschiedlichen chemischen Einheiten, wobei jede Einheit spezifisch und fest an eine Dimerisierungsdomäne bindet. In bestimmten Ausführungsformen ist der Ligand eine kleine Molekülverbindung oder ein Peptid oder ein Polypeptid. In anderen Ausführungsformen ist die Ligandenbindungsdomäne eine „Dimerisierungsdomäne“, die als Peptid-Tag auf einem Protein eingebaut werden kann. In verschiedenen Ausführungsformen können zwei Proteine, die jeweils die gleichen oder unterschiedliche Dimerisierungsdomänen umfassen, durch die Bindung jeder Dimerisierungsdomäne an den bispezifischen Liganden zur Dimerisierung induziert werden. Diese Moleküle können auch als „chemische Induktoren der Dimerisierung“ oder CIDs bezeichnet werden. Außerdem können die bispezifischen Liganden durch Koppeln (z. B. durch standardisierte chemische Bindungen) von zwei gleichen Einheiten oder zwei verschiedenen Einheiten zusammen hergestellt werden, wobei jede Einheit fest und spezifisch an eine Dimerisierungsdomäne bindet.
  • In verschiedenen Aspekten können die von Multi-Flap-PE eingebauten Dimerisierungsdomänen gleich oder unterschiedlich sein.
  • Die Dimerisierungsdomänen können beispielsweise FKBP12 sein, das die folgende Aminosäuresequenz aufweist:
    FKBP12
    Figure DE112021002672T5_0365
  • In einem anderen Beispiel kann die Dimerisierungsdomäne eine Mutante von FKBP12 sein, die als FKBP12-F36V bezeichnet wird, eine Mutante von FKBP12 mit einem konstruierten Loch, das ein synthetisches FK506-Mimetikum mit Höckern bindet (2, 3)107:
    FK13P12-F36V
    Figure DE112021002672T5_0366
  • In einem anderen Beispiel kann die Dimerisierungsdomäne wie folgt Cyclophilin sein:
    CYCLOPHILIN
    Figure DE112021002672T5_0367
  • In verschiedenen Ausführungsformen können die Aminosäuresequenzen dieser Dimerisierungsdomänen verändert werden, um die Bindung zu optimieren oder die Bindungsorthogonalität zu nativen Ziele zu verbessern. Die Nukleinsäuresequenzen der Gene, die für niedermolekulare Bindungsproteine kodieren, können verändert werden, um die Effizienz des PE-Prozesses zu optimieren, beispielsweise durch Reduzieren der PEgRNA- Sekundärstruktur.
  • Andere Beispiele für geeignete Dimerisierungsdomänen und eine verwandte kleine Molekülverbindung, die daran bindet, werden wie folgt bereitgestellt. Man beachte, dass die verwandte Kleinmolekülverbindung (z. B. über einen chemischen Linker) an eine zweite Kleinmolekülverbindung (entweder die gleiche Verbindung oder eine unterschiedliche Verbindung) gekoppelt werden könnte, um einen bispezifischen Liganden zu bilden, der zwei Dimerisierungsdomänen binden kann. In einigen Fällen, wie FK506 und Cyclosporin A, reduziert oder eliminiert die Dimerisierung von jedem (z. B. FK506-FK506 oder Cyclosporin A-Cyclosporin A) die immunsuppressive Aktivität der monomeren Verbindungen.
    KLEINMOLEKÜL - BINDET AN DIE DIMERISIERUNGSDOMÄNE - EIN DIMER DIESER MOLEKÜLE WÜRDE EINEN BISPEZIFISCHEN LIGANDEN BILDEN, DER ZWEI DIMERISIERUNGSDOMÄNEN BINDEN WÜRDE DIMERISIERUNGSDOMÄNE(N)
    FK506
    Figure DE112021002672T5_0368
         		AMINOSÄURESEQUENZ VON FKBP12:
    Figure DE112021002672T5_0369
    CALCINEURIN:
    ZIELE: FKBP12 + CALCINEURIN
    CYCLOSPORIN A AMINOSÄURESEQUENZ VON HUMANEM CYCLOPHILIN A:
    Figure DE112021002672T5_0370
    Figure DE112021002672T5_0371
    AMINOSÄURESEQUENZ VON HUMANEM CYCLOPHILIN B:
    ZIELE: CYCLOPHILIN + CALCINEURIN
    Figure DE112021002672T5_0372
    AMINOSÄURESEQUENZ VON HUMANEM CYCLOPHILIN C:
    Figure DE112021002672T5_0373
    AP1867
    Figure DE112021002672T5_0374
         		AMINOSÄURESEQUENZ VON FKBP12-F36V
    Figure DE112021002672T5_0375
    ZIEL(E): FKBP12
    METHOTREXAT AMINOSÄURESEQUENZ VON HUMANER DIHYDROFOLATREDUKTASE
    Figure DE112021002672T5_0376
    Figure DE112021002672T5_0377
    ZIEL(E): DIHYDROFOLATREDUKTASE
    TRIMETHOPRIM AMINOSÄURESEQUENZ FÜR E. COLI DIHYDROFOLATREDUKTASE
    Figure DE112021002672T5_0378
    Figure DE112021002672T5_0379
    ZIEL(E): DIHYDROFOLATREDUKTASE
    DEXAMETHASON AMINOSÄURESEQUENZ FÜR HUMANEN GLUCOCORTICOID- REZEPTOR
    Figure DE112021002672T5_0380
    Figure DE112021002672T5_0381
    Figure DE112021002672T5_0382
         		AMINOSÄURESEQUENZ VON FKBP12:
    Figure DE112021002672T5_0383
    RAPAMYCIN
  • Andere Beispiele für natürlich vorkommende bifunktionelle Moleküle und ihre dualen Ziel-Rezeptoren sind wie folgt. Prime-Editing kann verwendet werden, um die dualen Ziel- Rezeptoren in verschiedene Proteine einzubauen. Sobald die verschiedenen Proteine durch PE modifiziert sind, um einen bifunktionellen Molekülrezeptor zu enthalten, können die bifunktionellen Moleküle eingeführt werden, wodurch die Dimerisierung der modifizierten Proteine bewirkt wird, um die verschiedenen Dimerisierungsdomänen zu umfassen. Beispiele für Kopplungen von (1) einem biofunktionellen Molekül und (2) ihren dualen Ziel-Rezeptoren sind wie folgt:
    NATÜRLICH VORKOMMENDE BIOFUNKTIONELLE MOLEKÜLE ZIEL-REZEPTOREN DES BIOFUNKTIONELLEN MOLEKÜLS
    Figure DE112021002672T5_0384
         		Ziel-Rezeptor 1: Auxinrezeptor
    Ziel-Rezeptor 2: TIR1 E3-Ligase
    Auxin
    Figure DE112021002672T5_0385
         		Ziel-Rezeptor 1: JAZ-Rezeptor
    Ziel-Rezeptor 2: Coll E3-Ligase
    Methyljasmonat
    Brefeldin A Ziel-Rezeptor 1: GBF1
    Figure DE112021002672T5_0386
         		Target-Rezeptor 2: GTPase Arflp
    Abscisinsäure Ziel-Rezeptor 1: PYR-Rezeptor
    Ziel-Rezeptor 2: Phosphoproteinphosphatase 2C
    Figure DE112021002672T5_0387
    Forskolin Ziel-Rezeptor 1: Adenylylcyclase- Monomere
    Figure DE112021002672T5_0388
    Ziel-Rezeptor 2: Adenylylcyclase- Monomere
    Fusicoccin A Ziel-Rezeptor 1: 14-3-3-Proteine
    Figure DE112021002672T5_0389
         		Ziel-Rezeptor 2: H+-ATPase
    Rapamycin Ziel-Rezeptor 1: FKBP12
    Ziel-Rezeptor 2: mTOR
    Figure DE112021002672T5_0390
    Sanglifehrin A
    Figure DE112021002672T5_0391
         		Ziel-Rezeptor 1: Cyclophilin Ziel-Rezeptor 2: IMP Dehydrogenase 2
    Cyclosporin A Ziel-Rezeptor 1: Cyclophilin
    Figure DE112021002672T5_0392
         		Ziel-Rezeptor 2: Calcineurin
  • Beispiele für andere bifunktionelle Moleküle, die mit diesem Aspekt des Prime- Editing verwendet werden können, sind wie folgt:
    • Synstab A:
      Figure DE112021002672T5_0393
    • Paclitaxel:
      Figure DE112021002672T5_0394
    • Discodermolid:
      Figure DE112021002672T5_0395
    • GNE-0011
      Figure DE112021002672T5_0396
    • ARV-825 und
      Figure DE112021002672T5_0397
    • dBET1
      Figure DE112021002672T5_0398
  • Synstab A, Paclitaxel und Discodermolid sind Mikrotubuli-Stabilisatoren. Somit könnten diese Verbindungen verwendet werden, um durch PE modifizierte Proteine zu dimerisieren, um Mikrotubuli-Proteine zu umfassen. GNE-0011, ARV-825 und dBET1 umfassen ein BRD4-Bindungsmotiv und ein CRBN-Bindungsmotiv. Somit könnten diese Verbindungen verwendet werden, um Proteine zu dimerisieren, die durch PE modifiziert wurden, um diese Targeting-Domänen zu umfassen.
  • Die PEgRNAs zum Einbauen von Dimerisierungsdomänen können die folgenden Strukturen umfassen (in Bezug auf 3D):
    • 5'-[Spacer]-[gRNA-Kern]-[Verlängerungsarm]-3', wobei der Verlängerungsarm 5'- [Homologiearm]-[Edit-Templat]-[Primer-Bindungsstelle]-3' umfasst; oder
    • 5'-[Verlängerungsarm]-[Spacer]-[gRNA-Kern]-3', wobei der Verlängerungsarm 5'- [Homologiearm]-[ Edit-Templat]-[Primer-Bindungsstelle]-3' umfasst, und wobei bei jeder Konfiguration das „Edit-Templat“ eine Nukleotidsequenz einer Dimerisierungsdomäne umfasst.
  • In einem Beispiel die PEgRNA zur Insertion der FKBP12-Dimerisierungsdomäne am C-terminalen Ende des Humaninsulinrezeptors (Spacer unterstrichen, gRNA-Kern in Normalschrift, Flap-Homologie fett, FKBP12-Insertion kursiv, Hybridisierungsregion fett kursiv):
    PEGRNA ZUM EINBAUEN VON FKBP12 IN HUMANEN INSULINREZEPTOREN
    Figure DE112021002672T5_0399
  • In einem anderen Beispiel die PEgRNA zur Insertion der FKBP12- Dimerisierungsdomäne am HEK3-Locus (zur Optimierung):
    PEGRNA ZUM EINBAUEN VON FKBP12 IN HEK3
    Figure DE112021002672T5_0400
  • Die Ziel-Proteine zum Einbauen von Dimerisierungsdomänen sind nicht besonders beschränkt; es ist jedoch von Vorteil, dass ihre Dimerisierung (einmal durch PE modifiziert) in Gegenwart eines bispezifischen Liganden eine vorteilhafte biologische Wirkung hervorruft, z. B. einen Signalweg, eine verminderte Immunantwort usw. In verschiedenen Aspekten können die Ziel-Proteine, die durch den PE-abhängigen Einbau von Dimerisierungsdomänen dimerisiert werden sollen, das gleiche Protein oder verschiedene Proteine sein. Vorzugsweise lösen die Proteine, wenn sie dimerisiert sind, eine oder mehrere stromabwärtige biologische Kaskaden aus, z. B. eine Signaltransduktionskaskade, Phosphorylierung usw. Beispielhafte Ziel-Proteine, in welchen PE verwendet werden kann, um Dimerisierungsdomänen einzubauen, beinhalten unter anderem:
    MEMBRANGEBUNDENER REZEPTOR KINASEDOMÄNE FUSIONIERT MIT EINGESETZTES CID SIGNALKASKADE REFERENZ
    T-ZELLEN- REZEPTOR FKBP12 FK1012 (FK506- DIMER) T-ZELL- REZEPTOR- SIGNALISIERUNG SCIENCE 262, 1019- 24 (1993)
    CHEM. BIOL. 1, 163- 172 (1994).
    FAS-RECEPTOR MURINES CYCLOPHILIN C CYCLOSPORIN A- DIMER FAS-WEG ZUR APOPTOSE CHEM. BIOL. 3, 731- 738 (1996).
    INSULINREZEPTOR FKBP12 FK1012 (FK506- DIMER) INSULIN- SIGNALISIERUNG CURR. BIOL. 8, 11-18 (1998).
    THROMBOZYTEN- ABGELEITETER WACHSTUMSFAKTOR (PLATELET- DERIVED GROWTH FACTOR - PDGF) BETA FKBP12 FK1012 (FK506- DIMER) SIGNALISIERUNG DER PDGF- MESODERM BILDUNG CURR. BIOL. 8, 11-18 (1998).
    ERYTHROPOIETIN-REZEPTOR (EPOR) FKBP12 FK1012 (FK506- DIMER) EPOR- VERMITTELTE PROLIFERATIVE SIGNALÜBERTRAGUNG PROC. NATL. ACAD. SCI. 94, 3076-3081 (2002).
  • In einem Aspekt können die hierin beschriebenen Multi-Flap-Prime-Editor-Systeme verwendet werden, um Sequenzen, die Dimerisierungsdomänen kodieren, in ein oder mehrere Gene einzubauen, die für Ziel-Proteine von Interesse in einer lebenden Zelle oder einem Patienten kodieren. Dies kann als „Prime-Editing-CID-System“ bezeichnet werden, wobei das CID der bispezifische Ligand ist, der die Dimerisierung von Ziel-Proteinen induzierte, die jeweils an eine durch Multi-Flap-PE eingebaute Dimerisierungsdomäne fusioniert sind. Das Editing allein sollte keine physiologische Wirkung haben. Nach Verabreichung eines bispezifischen Liganden, bei dem es sich in der Regel um ein dimeres Kleinmolekül handelt, das gleichzeitig an zwei Dimerisierungsdomänen binden kann, von denen jede mit einer Kopie des Zielproteins fusioniert ist, bewirkt der bispezifische Ligand die Dimerisierung des anvisierten Proteins. Dieses Ziel-Protein-Dimerisierungsereignis induziert dann ein biologisches Signalereignis, wie beispielsweise Erythropoese oder Insulinsignalisierung. Ein neues Verfahren, um dimerisierungsinduzierte biologische Prozesse, wie beispielsweise die Rezeptorsignalisierung, unter die Kontrolle eines geeigneten niedermolekularen Arzneimittels (d. h. der bispezifische Ligand) durch die genomische Integration von Genen, die niedermolekulare Bindungsproteine (d. h. die Dimerisierungsdomänen) mit Multi-Flap-Prime- Editing kodieren, zu stellen, wird hierin beschrieben.
  • Proteindimerisierung ist ein allgegenwärtiger biologischer Prozess. Insbesondere ist bekannt, dass die Homodimerisierung vieler membrangebundener Rezeptoren Signalkaskaden mit oft tiefgreifenden biologischen Konsequenzen in Gang setzt. Eine Reihe von niedermolekularen Naturstoffen, die als Arzneimittel zugelassen sind, wirken als Teil ihres Wirkmechanismus als chemischer Induktor der Proteindimerisierung.92 Beispielsweise bindet FK506 fest an FKBP12, und der resultierende niedermolekulare Proteinkomplex bindet dann die Phosphatase Calcineurin, wodurch ein Schritt in der T-Zellen-Rezeptor-Signalisierung gehemmt wird.93 Ebenso induziert Cyclosporin A die Dimerisierung von Cyclophilin und Calcineurin, und Rapamycin induziert die Dimerisierung von FKBP und mTOR.93,94
  • In einer Ausführungsform wurden unter Nutzung der selektiven, hochaffinen Bindung der FK506:FKBP12- und Cyclosporin A:Cyclophilin-Kleinmolekül:Protein- Bindungsinteraktion auch synthetische chemische Induktoren der Dimerisierung entwickelt. In einem Beispiel wurde gezeigt, dass ein aus zwei Einheiten von FK506 bestehendes kleines Molekül, das als FK1012 bezeichnet wird, die Signalübertragung bewirkt, wenn die zytoplasmatischen Domänen von Signalrezeptoren mit FKBP12 markiert wurden.95 Chemische Dimerisierungsinduktoren (inducers of dimerization - CIDs) werden seitdem verwendet, um eine Anzahl der Signalwegen zu kontrollieren.96-103
  • Synthetische CIDs sind zwar nützliche Werkzeuge zur Untersuchung biologischer Prozesse, eine Herausforderung für ihre therapeutische Anwendungen besteht jedoch darin, dass die Einführung der FKBP12- oder Cyclophilin-Ziel-Proteinchimären in Patienten eine Herausforderung darstellt.
  • Die vorliegende Offenbarung führt mehrere Konzepte zusammen, um einen zuvor unzugänglichen therapeutischen Prozess zu schaffen. Das erste Konzept ist das hierin beschriebene Mulit-Flap-Prime-Editing (z. B. Dual-Flap- oder Quadruple-Flap-Prime- Editing), das ein präzises Genom-Editing, einschließlich gezielter Einfügungen, in lebenden Zellen ermöglicht. Das zweite Konzept ist die chemisch induzierte Dimerisierung, ein leistungsstarkes Werkzeug, das die Kontrolle über Signal- und Oligomerisierungsprozesse in Zellkulturen durch kleine Moleküle ermöglicht hat.
  • Es wurden spezifische Fälle identifiziert, in denen die chemische Kontrolle der Proteindimerisierung eine vorteilhafte therapeutische Wirkung gehabt haben könnte.
  • Der Insulinrezeptor ist ein heterotetrameres Transmembranprotein, das auf die Insulinbindung an die extrazelluläre Domäne durch Phosphorylierung der zytoplasmatischen Kinasedomäne reagiert.104 Ein konstruiertes chimäres Protein bestehend aus einer Membranlokalisierungskomponente, der C-terminalen Kinasedomäne des Insulinrezeptors, und drei Kopien von FKBP12 reagieren auf FK1012 und initiieren die Insulinreaktion in Zellkulturen.99 In ähnlicher Weise wird erwartet, dass die Fusion von FKBP12 an das C- terminale Ende der Kinasedomäne des nativen Insulinrezeptors in Patientenzellen eine FK1012- abhängige Phosphorylierung und Initiierung der Insulin-Signalkaskade erlaubt. Dieses System könnte die Insulinanwendung bei Patienten ersetzen oder ergänzen, die kein Insulin herstellen können (z. B. Typ-1-Diabetiker) oder die schwach auf Insulin ansprechen (z. B. Typ-2-Diabetiker).
  • Darüber hinaus stimuliert Erythropoietin die Erythrozytenproliferation durch Bindung an den Erythropoietin-Rezeptor (EpoR), was entweder eine Dimerisierung oder eine Konformationsänderung in einem vorgebildeten Rezeptordimer induziert, was zur Aktivierung der Jak/STAT-Signalkaskade führt.105 Es wurde gezeigt, dass eine FK1012-induzierte Oligomerisierung der membranverankerten zytoplasmatischen Domäne von EpoR, die mit FKBP12 markiert ist, ausreicht, um die Jak/STAT-Signalkaskade zu initiieren und die Zellproliferation zu fördern.106 Es wird erwartet, dass die Fusion von FKBP12 mit nativem EpoR durch Prime-Editing in Patientenzellen die FK1012-induzierte Kontrolle der Erythrozytenproliferation erlaubt (Erythropoese). Dieses System könnte verwendet werden, um das Wachstum von roten Blutkörperchen bei anämischen Patienten auszulösen. FK1012- induzierbarer EpoR könnte auch als ein in vivo-selektierbarer Marker für Blutzellen verwendet werden, die einer Ex-vivo-Entwicklung unterzogen wurden.
  • Im Prinzip könnte jede Rezeptor-Tyrosin-Kinase ein brauchbares Ziel für ein Prime- Editing-CID-Therapeutikum sein. Die folgende Tabelle enthält eine Liste aller Rezeptor- Tyrosin-Kinasen im humanen Genom.110
    Familie Rezeptor Synonyme NT-Zugriff PROT- Zugriff Chromosom
    ALK familv ALK Ki1 NM_004304 NP_004295 2p23
    LTK TYK1 NM_002344 NP_002335 15q15.1-q21.1
    AXL family AXL UFO, Tyro7(r) Ark(m) NM_001699 NP_001690 19q 13.1
    MER MERTK, NYK, Eyk(ch) NM_006343 NP_006334 2q14.1
    TYRO3 RSE, SKY, BRT, DTK, TIF NM_006293 NP_006284 15q15.1-q21.1
    DDR family DDR1 CAK, TRKE, NEP NTRK4, EDDR1, PTK3 NM_013993 NP_001945 6p21.3
    DDR2 TKT, TYRO10, NTRKR3 NM_006182 NP_006173 1q21-q22
    EGFR family EGFR ERBB, ERBB1 NM_005228 NP_005219 7p12
    ERBB2 HER2, Neu(r), NGL NM_004448 NP_004439 17q 11.2-q 12
    ERBB3 HER3 NM_001982 NP_001973 12q13
    ERBB4 HER4 NM_005235 NP_005226 2q33.3-q34
    EPH family EPHA 1 EPH, EPHT NM_005232 NP_005223 7q32-q36
    EPHA2 ECK, Sek(m), Mvk2(m) NM_004431 NP_004422 1p34
    EPHA3 HEK, ETK1, Tyro4(r), Mek4(m), Cek4(ch) NM_005233 NP_005224 3p11.2
    EPHA4 HEK8, Tyro1(r), Sek1(m), Cek8(ch) NM_004438 NP_004429 2q36qter
    EPHA5 HEK7, Ehk(r), Bsk(r), Cek7(ch) L36644 P54756
    EPHA6 DKFZp434C1418, Ehk2(r) AL133666
    EPHA7 HEK11, Mdk1(m), Ebk(m), Ehk3(r), Cek11(ch) NM_004440 NP_004431 6q21
    EPHA8 HEK3, KIAA1459, Eek(r), Cek10(ch) AB040892 CAB81612 1q23-q24
    EPHB1 NET, EPHT2, HEK6, Elk(r), Cek6(ch) NM_004441 NP_004432 3q21-q23
    EPHB2 HEK5, ERK, DRT, EPHT3, Tyro5(r), Nuk(m), Sek3(m), Cek5(ch) AF025304 AAB94602 1p36.1-p35
    EPHB3 HEK2, Tyro6, Mdk5(m), Sek4(m) NM_004443 NP_004434 3q21-qter
    EPHB4 HTK, Tyro11(r), Mdk2(m), Mvkl(m) NM_004444 NP_004435
    EPHB6 HEP, Mep(m), Cek1(ch) NM_004445 NP_004436 7q33-q35
    FGFR family FGFR1 FLT2, bFGFR, FLG, N- SAM M34641 AAA35835 8p11.2
    FGFR2 KGFR, K-SAM, Bek(m), CFD1, JWS, Cek3(ch) NM_000141 NP_000132 10q26
    FGFR3 HBGFR, ACH, Cek2(ch) NM_000142 NP_000133 4p16.3
    FGFR4 NM_002011 NP_002002 5q35.1-qter
    INSR family IGF1R JTK13 NM_000875 NP_000866 15q25-q26
    INSR IR NM_000208 NP_000199 19p13.3-p13.2
    INSRR IRR J05046 AAC31759 1q21-q23
    MET Family MET HGFR NM_000245 NP_000236 7q31
    RON MST1R, CDw136, Fv2(m), STK(m), SEA(ch) NM_002447 NP_002438 3p21.3
    MUSK family MUSK Nsk2(m), Mlk1(m), Mk2(m) NM_005592 NP_005583 9q31.3-q32
    PDGFR CSF1R FMS, C-FMS, CD115 NM_005211 NP_005202 5q31-q32
    family FLT3 FLK2, STK1, CD135 NM_004119 NP_0041110 13q12
    KIT Sfr(m), CKIT NM_000222 NP_000213 4q11-q12
    PDGFRA NM_006206 NP_006197 4q11-q13
    PDGFRB PDGFR, JTK12 NM_002609 NP_002600 5q31-q32
    PTK7 familv PTK7 CCK4, KLG(ch) NM_002821 NP_002812 6p21.2-p12.2
    RET family RET MEN2A/B, HSCR1, MTC1 X12949 P07949 10q11.2
    ROR family ROR1 NTRKR1 NM_005012 NP_005003 1p32-p31
    ROR2 NTRKR2 NM_004560 NP_004551
    ROS familv ROS1 MCF3 NM_002944 NP_002935 6q22
    RYK family RYK Vlk(m), Mrk(m) S59184 AAB263411 3q22
    TIE family TEK TIE2 NM_000459 NP_000450 9p21
    TIE TIE1, JTK14 NM_005424 NP_005415 1p34-p33
    TRK family NTRK1 TRK, TRKA NM_002529 NP_002520 1q21-q22
    NTRK2 TRKB NM_006180 NP_006171 9q22.1
    NTRK3 TRKC NM_002530 NP_002521 15q25
    VEGFR family VEGFR1 FLT1 NM_002019 NP_002010 13q12
    VEGFR2 KDR, FLK1 AAB88005 4q11-q12
    VEGFR3 FLT4, PCL NM_002020 NP_002011 5q34-q35
    AATYK family AATYK AATK, KIAA0641 NM_004920 NP_004911 17q25.3
    AATYK2 KIAA 1079 NM_014916 NP_055731 7q21-q22
    AATYK3 19q13.2-q13.3
  • Das Mulit-Flap-Prime-Editing-CID-System bietet zahlreiche Vorteile. Ein solcher Vorteil besteht darin, dass es endogene Liganden, bei denen es sich typischerweise um Proteine handelt, die bei Herstellung, Kosten, Lieferung, Produktion oder Lagerung Komplikationen verursachen, durch arzneimittelähnliche kleine Moleküle ersetzen kann, die oral verabreicht werden können, anstatt sie durch IV oder Injektion zu verabreichen, sich leicht aus von der FDA zugelassenen Arzneimitteln herstellen lassen (oder selbst bereits Arzneimittel sind) und keine besonderen Produktions- oder Lagerkosten, die typischerweise mit Proteinarzneimitteln verbunden sind, verursachen. Ein weiterer Vorteil ist, dass das Editing allein keine physiologische Wirkung haben sollte. Das Ausmaß der Dimerisierung des Ziel-Proteins kann durch Dosierung des niedermolekularen CID kontrolliert werden. Außerdem ist die Dimerisierung des Ziel-Proteins durch Zugabe der monomeren Form des CID leicht und schnell reversibel. Ein weiterer Vorteil besteht darin, dass in Fällen, in denen ein einzelner Ligand auf mehrere Rezeptoren abzielt, Selektivität durch Prime-Editing nur eines Rezeptors erreicht werden kann. Schließlich kann es in Abhängigkeit von dem für das Prime-Editing verwendeten Einschleusungsverfahren auch möglich sein, das Editing auf ein lokalisiertes Gewebe oder Organ zu beschränken, wodurch eine induzierbare Rezeptoraktivierung nur in bestimmten Bereichen ermöglicht wird.
  • Wenn die Editing-Effizienz beim Multi-Flap-Prime-Editing hoch genug ist, dass zwei separate Editing-Ereignisse auf hohem Niveau auftreten könnten, wäre es auch möglich, zwei Proteine von Interesse mit unterschiedlichen niedermolekularen Bindungsdomänen (wie FKBP und Cyclophilin) zu markieren und Heterodimerisierungen mit kleinen Molekülheterodimeren (wie ein FK506-Cyclosporin-A-Dimer) zu induzieren.
  • Die Fusion von FKBP12 oder anderen niedermolekularen Bindungsproteinen mit nativen Proteinen wurde im Allgemeinen durch Überexprimierung von Plasmid in Gewebekultur erreicht. Es wurde gezeigt, dass die anschließende chemisch induzierte Dimerisierung phänotypische Veränderungen an Zellen induziert, die die Fusionsproteine produzieren.
  • Die folgenden Referenzen werden im obigen Abschnitt zitiert und sind hierin durch Bezugnahme aufgenommen.
    1. 1. Crabtree, G. R. & Schreiber, S. L. Three-part inventions: intracellular signaling and induced proximity. Trends Biochem. Sci. 21, 418-22 (1996).
    2. 2. Liu, J. et al. Calcineurin Is a Common Target of A and FKBP-FK506 Complexes. Cell 66, 807-815 (1991).
    3. 3. Keith, C. T. et al. A mammalian protein targeted by Gl-arresting rapamycin-receptor complex. Nature 369, 756-758 (2003).
    4. 4. Spencer, D. M., Wandless, T. J., Schreiber, S. L. S. & Crabtree, G. R. Controlling signal transduction with synthetic ligands. Science 262, 1019-24 (1993).
    5. 5. Pruschy, M. N. et al. Mechanistic studies of a signaling pathway activated by the organic dimerizer FK1012. Chem. Biol. 1, 163-172 (1994).
    6. 6. Spencer, D. M. et al. Functional analysis of Fas signaling in vivo using synthetic inducers of dimerization. Curr. Biol. 6, 839-847 (1996).
    7. 7. Belshaw, P. J., Spencer, D. M., Crabtree, G. R. & Schreiber, S. L. Controlling programmed cell death with a cyclophilin-cyclosporin-based chemical inducer of dimerization. Chem. Biol. 3, 731-738 (1996).
    8. 8. Yang, J. X., Symes, K., Mercola, M. & Schreiber, S. L. Small-molecule control of insulin and PDGF receptor signaling and the role of membrane attachment. Curr. Biol. 8, 11-18 (1998).
    9. 9. Belshaw, P. J., Ho, S. N., Crabtree, G. R. & Schreiber, S. L. Controlling protein association and subcellular localization with a synthetic ligand that induces heterodimerization of proteins. Proc.Natl. Acad. Sci. 93, 4604-4607 (2002).
    10. 10. Stockwell, B. R. & Schreiber, S. L. Probing the role of homomeric and heteromeric receptor interactions in TGF-β signaling using small molecule dimerizers. Curr. Biol. 8, 761-773 (2004).
    11. 11. Spencer, D. M., Graef, I., Austin, D. J., Schreiber, S. L. & Crabtree, G. R. A general strategy for producing conditional alleles of Src-like tyrosine kinases. Proc. Natl. Acad. Sci. 92, 9805-9809 (2006).
    12. 12. Holsinger, L. J., Spencer, D. M., Austin, D. J., Schreiber, S. L. & Crabtree, G. R. Signal transduction in T lymphocytes using a conditional allele of Sos. Proc. Natl. Acad. Sci. 92, 9810-9814 (2006).
    13. 13. Myers, M. G. Insulin Signal Transduction and the IRS Proteins. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 36, 615-658 (1996).
    14. 14. Watowich, S. S. The erythropoietin receptor: Molecular structure and hematopoietic signaling pathways. J. Investig. Med. 59, 1067-1072 (2011).
    15. 15. Blau, C. A., Peterson, K. R., Drachman, J. G. & Spencer, D. M. A proliferation switch for genetically modified cells. Proc. Natl. Acad. Sci. 94, 3076-3081 (2002).
    16. 16. Clackson, T. et al. Redesigning an FKBP-ligand interface to generate chemical dimerizers with novel specificity. Proc. Natl. Acad. Sci. 95, 10437-10442 (1998).
    17. 17. Diver, S. T. & Schreiber, S. L. Single-step synthesis of cell-permeable protein dimerizers that activate signal transduction and gene expression. J. Am. Chem. Soc. 119, 5106-5109 (1997).
    18. 18. Guo, Z. F., Zhang, R. & Liang, F. Sen. Facile functionalization of FK506 for biological studies by the thiol-ene ‚dick‘ reaction. RSC Adv. 4, 11400-11403 (2014).
    19. 19. Robinson, D. R., Wu, Y.-M. & Lin, S.-F. The protein tyrosine kinase family of the human genome. Oncogene 19, 5548-5557 (2000).
  • G. Verwendung von Mulit-Flap-Prime-Editing zum Einfügen von Rekombinase- Zielstellen
  • In einem anderen Aspekt kann das Mulit-Flap-Prime-Editing (z. B. wie in 90, 95, 97A, 98A dargestellt) zum Einfügen von Rekombinasestellen (oder „Rekombinase- Erkennungssequenzen“) in eine gewünschte genomische Stelle verwendet werden. Die Insertion von Rekombinasestellen stellt eine programmierte Stelle bereit, um ortsspezifische genetische Veränderungen in einem Genom zu bewirken. Solche genetischen Veränderungen können beispielsweise genomische Integration eines Plasmids, genomische Deletion oder Insertion, chromosomale Translokationen und Kassettenaustausch neben anderen genetischen Veränderungen umfassen. Diese beispielhaften Typen genetischer Veränderungen sind in 64(b)-64(f) dargestellt. Die eingebauten Rekombinase-Erkennungssequenzen können dann verwendet werden, um eine ortsspezifische Rekombination an dieser Stelle durchzuführen, um eine Vielzahl von Rekombinationsergebnissen zu bewirken, wie beispielsweise Exzision, Integration, Inversion oder Austausch von DNA-Fragmenten. Zum Beispiel veranschaulicht 65 den Einbau einer Rekombinasestelle, die dann verwendet werden kann, um ein DNA- Donor-Templat zu integrieren, das einen GFP-Exprimierungsmarker umfasst. Zellen, die das integrierte GFP-Exprimierungssystem in der Rekombinasestelle enthalten, werden fluoreszieren.
  • Der Mechanismus des Einbaus einer Rekombinasestelle in das Genom ist analog zum Einbau anderer Sequenzen, wie etwa Peptid-/Protein- und RNA-Tags, in das Genom. Ein Schema, das den Einbau einer Rekombinase-Zielsequenz beispielhaft darstellt, ist in 64(a) gezeigt. Das Verfahren beginnt mit der Auswahl eines gewünschten Ziel-Locus, in den die Rekombinase-Zielsequenz eingeführt wird. Als nächstes wird eine Prime-Editor-Fusion bereitgestellt („RT-Cas9:gRNA“). Hier bezieht sich die „gRNA“ auf eine PEgRNA, die unter Verwendung der hierin beschriebenen Prinzipien ausgestaltet werden kann. Die PEgRNA umfasst in verschiedenen Ausführungsformen eine Architektur entsprechend 3D (5'- [~20-NT-Spacer]-[gRNA-Kem]-[Verlängerungsarm]-3', wobei der Verlängerungsarm in 3'- zu-5'-Richtung eine Primer-Bindungsstelle („A“), ein Edit-Templat („B“) und einen Homologiearm („C“) umfasst. Das Edit-Templat („B“) umfasst eine Sequenz, die einer Rekombinasestelle entspricht, d. h. eine Einzelstrang-RNA der PEgRNA, die eine komplementäre Einzelstrang-DNA kodiert, die entweder der Sense- oder der Antisense-Strang der Rekombinasestelle ist und die durch den Multi-Flap-Prime-Editing-Prozess in den genomischen DNA-Ziel-Locus eingebaut wird.
  • In verschiedenen Aspekten sieht die vorliegende Offenbarung die Verwendung eines Multi-Flap-PE vor, um Rekombinase-Erkennungssequenzen an hochwertige Loci in humanen oder anderen Genomen einzuführen, die nach Exposition gegenüber ortsspezifischer Rekombinase(n) präzise und effiziente genomische Modifikationen lenken (64). In verschiedenen in 64 gezeigten Ausführungsformen kann PE verwendet werden, um (b) ein einzelnes SSR-Ziel zur Verwendung als Stelle für die genomische Integration eines DNA- Donor-Templats zu inserieren. (c) zu zeigen, wie eine Tandem-Insertion von SSR-Zielstellen verwendet werden kann, um einen Teil des Genoms zu löschen, (d) zu zeigen, wie eine Tandem-Insertion von SSR-Zielstellen verwendet werden kann, um einen Teil des Genoms zu invertieren, (e) zu zeigen, wie die Insertion von zwei SSR-Zielstellen an zwei distalen chromosomalen Regionen zu einer chromosomalen Translokation führen kann. (f) zu zeigen, wie die Insertion von zwei verschiedenen SSR-Zielstellen im Genom verwendet werden kann, um eine Kassette von einem DNA-Donor-Templat auszutauschen. Jede der Arten von Genommodifikationen wird durch die Verwendung von PE zum Einfügen von SSR-Tagets ins Auge gefasst, aber diese Liste soll auch nicht einschränkend sein.
  • Die Multi-Flap-PE-vermittelte Einführung von Rekombinase-Erkennungssequenzen könnte besonders nützlich für die Behandlung genetischer Erkrankungen sein, die durch großräumige Genomdefekte verursacht werden, wie etwa Genverlust, Inversion oder Duplikation oder chromosomale Translokation1-7 (Tabelle 6). Das Williams-Beuren-Syndrom ist beispielsweise eine Entwicklungsstörung, die durch eine Deletion von 24 auf Chromosom 721 verursacht wird. Es gibt derzeit keine Technologie für die effiziente und gezielte Insertion mehrerer vollständiger Gene in lebende Zellen (das Potenzial von PE für eine solche vollständige Geninsertion wird derzeit untersucht, ist aber noch nicht festgestellt); jedoch bietet die rekombinasevermittelte Integration an einem durch PE inserierten Ziel einen Ansatz zur dauerhaften Heilung dieser und anderer Krankheiten. Darüber hinaus könnte die gezielte Einführung von Rekombinase-Erkennungssequenzen für Anwendungen, einschließlich der Erzeugung von transgenen Pflanzen, Tierforschungsmodellen, Bioproduktionszelllinien oder anderen kundenspezifischen eukaryotischen Zelllinien, sehr hilfreich sein. Beispielsweise könnte die rekombinasevermittelte genomische Umlagerung in transgenen Pflanzen an Multi- Flap-PE-spezifischen Zielen einen der Engpässe bei der Erzeugung von Nutzpflanzen mit verbesserten Eigenschaften überwinden8,9.
  • Tabelle 6. Beispiele für genetische Erkrankungen im Zusammenhang mit groß angelegten genomischen Veränderungen, die durch den Multi-Flap-PE-basierten Einbau von Rekombinase-Erkennungssequenzen repariert werden könnten.
    ERKRANKUNG URSACHE
    TRISOMIE 17P GENDUPLIKATION
    CHARCOT-MARIE-TOOTH- KRANKHEIT TYP I GENDUPLIKATION
    SMITH-MAGENIS-SYNDROM GENLÖSCHUNG
    WILLIAMS-BEUREN-SYNDROM GENLÖSCHUNG
    DE LA CHAPELLE-SYNDROM CHROMOSOMALE TRANSLOKATION
    DOWN-SYNDROM (EINIGE FORMEN) CHROMOSOMALE TRANSLOKATION
    HÄMOPHILIE A GENINVERSION
    HUNTER-SYNDROM GENINVERSION
  • Eine Reihe von Mitgliedern der SSR-Familie wurden charakterisiert und ihre Rekombinase-Erkennungssequenzen beschrieben, einschließlich natürlicher und manipulierter Tyrosin-Rekombinasen (Tabelle 7), große Serin-Integrasen (Tabelle 8), Serin-Resolvasen (Tabelle 9) und Tyrosin-Integrasen (Tabelle 10). Modifizierte Zielsequenzen, die erhöhte Raten der genomischen Integration zeigen, wurden auch für mehrere SSRs22-30 beschrieben. Zusätzlich zu natürlichen Rekombinasen wurden programmierbare Rekombinasen mit unterschiedlichen Spezifitäten entwickelt31-40. Unter Verwendung von PE könnten eine oder mehrere dieser Erkennungssequenzen in Abhängigkeit von der gewünschten Anwendung an einer bestimmten Stelle in das Genom eingeführt werden, wie zum Beispiel an einem Safe- Harbor-Locus 41-43.
  • Zum Beispiel würde die Einführung einer einzelnen Rekombinase-Erkennungssequenz in das Genom durch Prime-Editing zu einer integrativen Rekombination mit einem DNA- Donor-Templat führen (64b). Serinintegrasen, die in humanen Zellen robust funktionieren, können für die Genintegration besonders gut geeignet sein44,45.
  • Außerdem könnte die Einführung von zwei Rekombinase-Erkennungssequenzen in Abhängigkeit von der Identität und Orientierung der Ziele zu einer Deletion der intervenierenden Sequenz, einer Inversion der intervenierenden Sequenz, einer chromosomalen Translokation oder einem Kassettenaustausch führen (64c-f). Durch die Wahl endogener Sequenzen, die bereits Rekombinase-Zielen sehr ähnlich sind, würde der Umfang des Editings, der erforderlich ist, um das vollständige Rekombinase-Ziel einzuführen, reduziert werden.
  • Schließlich wurde für mehrere Rekombinasen gezeigt, dass sie sich an nativ vorkommenden Pseudostellen46-64 in humane oder eukaryotische Genome integrieren. Multi- Flap-Prime-Editing könnte verwendet werden, um diese Loci zu modifizieren, um die Integrationsraten an diesen natürlichen Pseudostellen zu erhöhen, oder alternativ, um Pseudostellen zu eliminieren, die als unerwünschte Off-Target-Sequenzen dienen können.
  • Diese Offenbarung beschreibt eine allgemeine Methodik zum Einführen von Rekombinase-Zielsequenzen in eukaryontische Genome unter Verwendung von Multi-Flap- PE, deren Anwendungen nahezu unbegrenzt sind. Die Genom-Editing-Reaktionen sind für die Verwendung mit „Prime-Editoren“ vorgesehen, einer chimären Fusion eines CRISPR/Cas9- Proteins und einer Reverse-Transkriptase-Domäne, die eine benutzerdefinierte Prime-Editing- Guide-RNA (PEgRNA) verwendet. Als Erweiterung können Cas9-Werkzeuge und Homologie-gerichtete Reparatur (HDR)-Wege auch genutzt werden, um Rekombinase- Erkennungssequenzen durch DNA-Template einzuführen, indem die Indel-Raten unter Verwendung verschiedener Techniken gesenkt werden65-67. Ein Proof-of-Concept-Experiment in humaner Zellkultur ist in 65 gezeigt. In einigen Ausführungsformen handelt es sich bei den Prime-Editoren um Multi-Flap-Prime-Editoren.
  • Die folgenden mehreren Tabellen werden in der obigen Beschreibung bezüglich des PE-gerichteten Einbaus von Rekombinase-Erkennungssequenzen zitiert und stellen eine Auflistung beispielhafter Rekombinasen, die verwendet werden können, und ihrer verwandten Rekombinase-Erkennungssequenzen, die von Multi-Flap-PE eingebaut werden können, bereit. Tabelle 7. Tyrosin-Rekombinasen und SSR-Zielsequenzen.
    Recombinase Recombinase recognition sequence Name
    Cre
    Figure DE112021002672T5_0401
    		 loxP
    Dre
    Figure DE112021002672T5_0402
    		 rox
    VCre
    Figure DE112021002672T5_0403
    		 loxV
    SCre
    Figure DE112021002672T5_0404
    		 loxS
    Flp
    Figure DE112021002672T5_0405
    		 FRT
    B2
    Figure DE112021002672T5_0406
    		 loxB
    B3
    Figure DE112021002672T5_0407
    		 IoxB3
    Kw
    Figure DE112021002672T5_0408
    R
    Figure DE112021002672T5_0409
    		 RS
    TD1-40
    Figure DE112021002672T5_0410
    		 TDRS
    Vika
    Figure DE112021002672T5_0411
    		 vox
    Nigri
    Figure DE112021002672T5_0412
    		 nox
    Panto
    Figure DE112021002672T5_0413
    		 pox
    Kd
    Figure DE112021002672T5_0414
    		 loxK
    Fre
    Figure DE112021002672T5_0415
    		 loxH
    CreALSHG
    Figure DE112021002672T5_0416
    		 loxM7
    Tre
    Figure DE112021002672T5_0417
    		 loxLTR
    Brec1
    Figure DE112021002672T5_0418
    		 loxBTR
    Cre-R3M3
    Figure DE112021002672T5_0419
    		 loxK2
    Tabelle 8. Große Serinintegrasen und SSR-Zielsequenzen.
    Rekombinase Rekombinase-Erkennungssequen links Rekombinase-Erkennungssequenz rechts
    Bxb1
    Figure DE112021002672T5_0420
    Figure DE112021002672T5_0421
    phiC31
    Figure DE112021002672T5_0422
    Figure DE112021002672T5_0423
    R4
    Figure DE112021002672T5_0424
    Figure DE112021002672T5_0425
    phiBT1
    Figure DE112021002672T5_0426
    Figure DE112021002672T5_0427
    MJ1 (phiFC1)
    Figure DE112021002672T5_0428
    Figure DE112021002672T5_0429
    MR11
    Figure DE112021002672T5_0430
    Figure DE112021002672T5_0431
    TP901-1
    Figure DE112021002672T5_0432
    Figure DE112021002672T5_0433
    A118
    Figure DE112021002672T5_0434
    Figure DE112021002672T5_0435
    U153
    Figure DE112021002672T5_0436
    Figure DE112021002672T5_0437
    phiRV1
    Figure DE112021002672T5_0438
    Figure DE112021002672T5_0439
    phi370.1
    Figure DE112021002672T5_0440
    Figure DE112021002672T5_0441
    TG1
    Figure DE112021002672T5_0442
    Figure DE112021002672T5_0443
    WB
    Figure DE112021002672T5_0444
    Figure DE112021002672T5_0445
    BL3
    Figure DE112021002672T5_0446
    Figure DE112021002672T5_0447
    SprA
    Figure DE112021002672T5_0448
    Figure DE112021002672T5_0449
    Figure DE112021002672T5_0450
    Figure DE112021002672T5_0451
    phiJoe
    Figure DE112021002672T5_0452
    Figure DE112021002672T5_0453
    -- --
    Figure DE112021002672T5_0454
    phiK38
    Figure DE112021002672T5_0455
    Figure DE112021002672T5_0456
    Int2
    Figure DE112021002672T5_0457
    Figure DE112021002672T5_0458
    Int3
    Figure DE112021002672T5_0459
    Figure DE112021002672T5_0460
    Int4
    Figure DE112021002672T5_0461
    Figure DE112021002672T5_0462
    Int7
    Figure DE112021002672T5_0463
    Figure DE112021002672T5_0464
    Int8
    Figure DE112021002672T5_0465
    Figure DE112021002672T5_0466
    Int9
    Figure DE112021002672T5_0467
    Figure DE112021002672T5_0468
    Int10
    Figure DE112021002672T5_0469
    Figure DE112021002672T5_0470
    Int11
    Figure DE112021002672T5_0471
    Figure DE112021002672T5_0472
    Int12
    Figure DE112021002672T5_0473
    Figure DE112021002672T5_0474
    Int13
    Figure DE112021002672T5_0475
    Figure DE112021002672T5_0476
    LI
    Figure DE112021002672T5_0477
    Figure DE112021002672T5_0478
    Peaches
    Figure DE112021002672T5_0479
    Figure DE112021002672T5_0480
    Bxz2
    Figure DE112021002672T5_0481
    Figure DE112021002672T5_0482
    SV1
    Figure DE112021002672T5_0483
    Figure DE112021002672T5_0484
    Tabelle 9. Serinresolvasen und SSR-Zielsequenzen.
    Resolvasen Rekombinase-Erkennungssequenz Links Rekombinase-Erkennungssequenz Rechts
    Gin
    Figure DE112021002672T5_0485
    Figure DE112021002672T5_0486
    Cin
    Figure DE112021002672T5_0487
    Figure DE112021002672T5_0488
    Hin
    Figure DE112021002672T5_0489
    Figure DE112021002672T5_0490
    Min
    Figure DE112021002672T5_0491
    Figure DE112021002672T5_0492
    Sin
    Figure DE112021002672T5_0493
    		 CGTATGATTAGGGTGTATATTAATTT (SEQ ID NO: 608)
    Tabelle 10. Tyrosin-Integrasen und-Zielsequenzen.
    Integrase attP attB
    HK022
    Figure DE112021002672T5_0494
    		 GCACTTTAGGTGAAAAAGGTT (SEQ ID NO: 610)
    Figure DE112021002672T5_0495
    Figure DE112021002672T5_0496
    P22
    Figure DE112021002672T5_0497
    Figure DE112021002672T5_0498
    L5
    Figure DE112021002672T5_0499
    Figure DE112021002672T5_0500
  • In verschiedenen anderen Aspekten betrifft die vorliegende Offenbarung Verfahren zur Verwendung von Multi-Flap-PE, um eine oder mehrere Rekombinase-Erkennungssequenzen einzubauen, und ihre Verwendung bei der stellenspezifischen Rekombination.
  • In einigen Ausführungsformen kann die stellenspezifische Rekombination eine Vielzahl von Rekombinationsergebnissen bewirken, wie beispielsweise Exzision, Integration, Inversion oder Austausch von DNA-Fragmenten.
  • In einigen Ausführungsformen sind die Verfahren zum Induzieren einer Rekombination von oder zwischen zwei oder mehr Regionen von zwei oder mehr Nukleinsäure- (z. B. DNA)-Molekülen nützlich. In anderen Ausführungsformen sind die Verfahren zum Induzieren einer Rekombination von oder zwischen zwei oder mehr Regionen in einem einzelnen Nukleinsäuremolekül (z. B. DNA) nützlich.
  • In einigen Ausführungsformen stellt die Offenbarung ein Verfahren zum Integrieren eines Donor-DNA-Templats durch ortsspezifische Rekombination bereit, umfassend: (a) Einbauen einer Rekombinase-Erkennungssequenz an einem genomischen Locus durch Multi- Flap-Prime-Editing; (b) Kontaktieren des genomischen Locus mit einem DNA-Donor- Templat, das auch die Rekombinase-Erkennungssequenz in Gegenwart einer Rekombinase umfasst.
  • In anderen Ausführungsformen stellt die Offenbarung ein Verfahren zum Deletieren einer genomischen Region durch stellenspezifische Rekombination bereit, umfassend: (a) Einbauen eines Paares von Rekombinase-Erkennungssequenzen an einem genomischen Locus durch Multi-Flap-Prime-Editing; (b) Kontaktieren des genomischen Locus mit einer Rekombinase, wodurch die Deletion der genomischen Region zwischen dem Paar von Rekombinase-Erkennungssequenzen katalysiert wird.
  • In noch anderen Ausführungsformen stellt die Offenbarung ein Verfahren zum Invertieren einer genomischen Region durch stellenspezifische Rekombination bereit, umfassend: (a) Einbauen einer Rekombinase-Erkennungssequenz an einem genomischen Locus durch Multi-Flap-Prime-Editing; (b) Kontaktieren des genomischen Locus mit einer Rekombinase, wodurch die Inversion der genomischen Region zwischen dem Paar von Rekombinase-Erkennungssequenzen katalysiert wird.
  • In noch anderen Ausführungsformen stellt die Offenbarung ein Verfahren zum Induzieren einer chromosomalen Translokation zwischen einer ersten genomischen Stelle und einer zweiten genomischen Stelle bereit, umfassend: (a) Einbauen einer ersten Rekombinase- Erkennungssequenz an einem ersten genomischen Locus durch Prime-Editing; (b) Einbauen einer zweiten Rekombinase-Erkennungssequenz an einem zweiten genomischen Locus durch Multi-Flap-Prime-Editing; (c) Kontaktieren des ersten und des zweiten genomischen Locus mit einer Rekombinase, wodurch die chromosomale Translokation des ersten und zweiten genomischen Locus katalysiert wird.
  • In anderen Ausführungsformen stellt die Offenbarung ein Verfahren zum Induzieren eines Kassettenaustauschs zwischen einem genomischen Locus und einer Donor-DNA bereit, die eine Kassette umfasst, umfassend: (a) Einbauen einer ersten Rekombinase- Erkennungssequenz an einem ersten genomischen Locus durch Multi-Flap-Prime-Editing; (b) Einbauen einer zweiten Rekombinase-Erkennungssequenz an einem zweiten genomischen Locus durch Multi-Flap-Prime-Editing; (c) Kontaktieren des ersten und des zweiten genomischen Locus mit einer Donor-DNA, umfassend eine Kassette, die von der ersten und zweiten Rekombinase-Erkennungssequenz und einer Rekombinase flankiert wird, wodurch der Austausch des flankierten genomischen Locus und der Kassette im DNA-Donor katalysiert wird.
  • In verschiedenen Ausführungsformen, die die Insertion von mehr als einer Rekombinase-Erkennungssequenz in das Genom beinhalten, können die Rekombinase- Erkennungssequenzen gleich oder unterschiedlich sein. In einigen Ausführungsformen sind die Rekombinase-Erkennungssequenzen gleich. In anderen Ausführungsformen sind diese Rekombinase-Erkennungssequenzen unterschiedlich.
  • In verschiedenen Ausführungsformen kann die Rekombinase eine Tyrosinrekombinase sein, wie Cre, Dre, Vcre, Scre, Flp, B2, B3, Kw, R, TD1-40, Vika, Nigri, Panto, Kd, Fre, Cre(ALSHG), Tre, Brec1, oder Cre-R3M3, wie in Tabelle 7 gezeigt. In solchen Ausführungsformen kann die Rekombinase-Erkennungssequenz ein RRS aus Tabelle 7 sein, das der verwendeten Rekombinase entspricht.
  • In verschiedenen anderen Ausführungsformen kann die Rekombinase eine große Serin- Rekombinase sein, wie Bxb1, PhiC31, R4, phiBT1, MJ1, MR11, TP901-1, A118, V153, phiRV1, phi370.1, TG1, WB, BL3, SprA, phiJoe, phiK38, Int2, Int3, Int4, Int7, Int8, Int9, Int10, Int11, Int12, Int13, L1, peaches, Bxz2, oder SV1, wie in Tabelle 8 gezeigt. In solchen Ausführungsformen kann die Rekombinase-Erkennungssequenz ein RRS aus Tabelle 8 sein, das der verwendeten Rekombinase entspricht.
  • In noch verschiedenen anderen Ausführungsformen kann die Rekombinase eine Serin- Rekombinase sein, wie Bxb1, PhiC31, R4, phiBT1, MJ1, MR11, TP901-1, A118, V153, phiRV1, phi370.1, TG1, WB, BL3, SprA, phiJoe, phiK38, Int2, Int3, Int4, Int7, Int8, Int9, Int10, Int11, Int12, Int13, L1, peaches, Bxz2, oder SV1, wie in Tabelle 8 gezeigt. In solchen Ausführungsformen kann die Rekombinase-Erkennungssequenz ein RRS aus Tabelle 8 sein, das der verwendeten Rekombinase entspricht.
  • In anderen Ausführungsformen kann die Rekombinase eine Serinresolvase sein, wie Gin, Cin, Hin, Min oder Sin, wie in Tabelle 9 gezeigt. In solchen Ausführungsformen kann die Rekombinase-Erkennungssequenz ein RRS aus Tabelle 9 sein, das der verwendeten Rekombinase entspricht.
  • In verschiedenen anderen Ausführungsformen kann die Rekombinase eine Tyrosin- Integrase sein, wie beispielsweise HK022, P22 oder L5, wie in Tabelle 10 gezeigt. In solchen Ausführungsformen kann die Rekombinase-Erkennungssequenz ein RRS aus Tabelle 10 sein, das der verwendeten Rekombinase entspricht.
  • In einigen Ausführungsformen kann jedes der Verfahren zur stellenspezifischen Rekombination mit Multi-Flap-PE in vivo oder in vitro durchgeführt werden. In einigen Ausführungsformen wird jedes der Verfahren zur stellenspezifischen Rekombination in einer Zelle durchgeführt (z. B. rekombinieren genomischer DNA in einer Zelle). Die Zelle kann prokaryotisch oder eukaryotisch sein. Die Zelle, wie beispielsweise eine eukaryotische Zelle, kann sich in einem Individuum, wie beispielsweise einem Probanden, wie hierin beschrieben, befinden (z. B. einem humanen Probanden). Die hierin beschriebenen Verfahren sind nützlich für die genetische Modifikation von Zellen in vitro und in vivo, beispielsweise im Zusammenhang mit der Erzeugung transgener Zellen, Zelllinien oder Tieren, oder bei der Veränderung der genomischen Sequenz, z. B. der Korrektur eines genetischen Defekts in einer Zelle eines Probanden.
  • 181 Ausführungsformen der hierin beschriebenen Multi-Flap-Prime-Editoren
  • Die folgenden nicht-einschränkenden Ausführungsformen beschreiben Aspekte der Dual-Prime-Editoren und deren Verwendung, wie sie in dieser Anmeldung beschrieben sind.
    1. 1. Ein System für gleichzeitiges Editieren beider Stränge einer doppelsträngigen DNA- Sequenz an einer zu editierenden Zielstelle, wobei das System einen ersten Prime-Editor- Komplex und einen zweiten Prime-Editor-Komplex umfasst, wobei jeder der ersten und zweiten Prime-Editor-Komplexe Folgendes umfasst: (1) einen Prime-Editor, der (i) ein Nukleinsäure-programmierbares DNA-Bindungsprotein (napDNAbp) und (ii) ein Polypeptid mit einer RNA-abhängigen DNA-Polymerase-Aktivität umfasst; und (2) eine pegRNA, umfassend eine Spacer-Sequenz, einen gRNA-Kern, ein DNA-Synthese-Templat und eine Primer-Bindungsstelle, wobei das DNA-Synthese-Templat der pegRNA des ersten Prime- Editor-Komplexes für eine erste einzelsträngige DNA-Sequenz kodiert und das DNA- Synthese-Templat der pegRNA des zweiten Prime-Editor-Komplexes für eine zweite einzelsträngige DNA-Sequenz kodiert, wobei die erste einzelsträngige DNA-Sequenz und die zweite einzelsträngige DNA-Sequenz jeweils eine Region der Komplementarität zur anderen umfassen, und wobei die erste einzelsträngige DNA-Sequenz und die zweite einzelsträngige DNA-Sequenz einen Duplex bilden, der einen editierten Abschnitt im Vergleich zur DNA- Sequenz an der zu editierenden Zielstelle umfasst, der in die zu editierende Zielstelle integriert wird.
    2. 2. Das System nach Ausführungsform 1, wobei der Prime-Editor des ersten Prime-Editor- Komplexes, des zweiten Prime-Editor-Komplexes oder sowohl des ersten Prime-Editor- Komplexes als auch des zweiten Prime-Editor-Komplexes ein Fusionsprotein ist, das das napDNAbp und das Polypeptid umfasst, das eine RNA-abhängige DNA-Polymerase-Aktivität aufweist.
    3. 3. Das System nach Ausführungsform 1 oder 2, wobei der erste Prime-Editor-Komplex und der zweite Prime-Editor-Komplex denselben Prime-Editor umfassen.
    4. 4. Das System nach Ausführungsform 1 oder 2, wobei der erste Prime-Editor-Komplex und der zweite Prime-Editor-Komplex unterschiedliche Prime-Editoren umfassen.
    5. 5. Das System nach einer der Ausführungsformen 1-4, wobei das napDNAbp eine Cas9- Domäne oder eine Variante davon ist.
    6. 6. Das System nach einer der Ausführungsformen 1-5, wobei das napDNAbp eine nukleaseaktive Cas9-Domäne, eine nuklease-inaktive Cas9-Domäne, eine Cas9-Nickase- Domäne oder eine Variante davon ist.
    7. 7. Das System nach einer der Ausführungsformen 1-4, wobei das napDNAbp ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Cas9, Cas12e, Cas12d, Cas12a, Cas12b1, Cas13a, Cas12c, CasX, CasY und Argonaut.
    8. 8. Das System nach einer der Ausführungsformen 1-7, wobei das napDNAbp eine Nickase-Aktivität aufweist.
    9. 9. Das System nach einer der Ausführungsformen 1-4, wobei das napDNAbp eine Aminosäuresequenz einer der SEQ-ID-NR: 18-88 umfasst, oder eine Aminosäuresequenz, die mindestens 80 %, 85 %, 90 %, 95 % oder 99 % Sequenzidentität mit einer der SEQ-ID-NR: 18-88 aufweist.
    10. 10. Das System nach einer der Ausführungsformen 1-9, wobei das Polypeptid, das eine RNA-abhängige DNA-Polymerase-Aktivität aufweist, eine reverse Transkriptase ist.
    11. 11. Das System nach einer der Ausführungsformen 1-10, wobei das Polypeptid mit einer RNA-abhängigen DNA-Polymerase-Aktivität eine Aminosäuresequenz einer der SEQ-ID-NR: 89-100, 105-122, 128-129, 132, 139, 143, 149, 154, 159 und 700-766 umfasst, oder eine Aminosäuresequenz, die mindestens 80 %, 85 %, 90 %, 95 % oder 99 % Sequenzidentität mit einer beliebigen der SEQ-ID-NR: 89-100, 105-122, 128-129 und 132 aufweist.
    12. 12. Das System nach einer der Ausführungsformen 1-11, wobei der Prime-Editor ferner einen Linker umfasst, der das napDNAbp und das Polypeptid mit der RNA-abhängigen DNA- Polymerase-Aktivität verbindet.
    13. 13. Das System nach Ausführungsform 12, wobei der Linker eine Aminosäuresequenz einer der SEQ-ID-NR: 166-177 umfasst, oder eine Aminosäuresequenz, die mindestens 80 %, 85 %, 90 %, 95 % oder 99 % Sequenzidentität mit einer der SEQ-ID-NR: 166-177 aufweist.
    14. 14. Das System nach Ausführungsform 12 oder 13, wobei der Linker 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 38, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 oder 50 Aminosäuren in Länge beträgt.
    15. 15. Das System nach einer der Ausführungsformen 1-14, wobei die pegRNA eine Nukleotidsequenz einer der SEQ-ID-NR: 325-330, 499-505, 101-104, 181-183 und 223-244 umfasst, oder eine Nukleotidsequenz, die mindestens 80 %, 85 %, 90 %, 95 % oder 99 % Sequenzidentität mit einer der SEQ-ID-NR: 325-330, 499-505, 101-104, 181-183 und 223- 244 aufweist.
    16. 16. Das System nach einer der Ausführungsformen 1-15, wobei die Spacer-Sequenz der PegRNA des ersten Prime-Editor-Komplexes an eine erste Bindungsstelle auf einem ersten Strang der doppelsträngigen DNA-Sequenz stromaufwärts von der zu editierenden Zielstelle bindet.
    17. 17. Das System nach einer der Ausführungsformen 1-16, wobei die Spacer-Sequenz der PegRNA des zweiten Prime-Editor-Komplexes an eine zweite Bindungsstelle auf einem zweiten Strang der doppelsträngigen DNA-Sequenz stromabwärts von der zu editierenden Zielstelle bindet.
    18. 18. Das System nach Ausführungsform 17, wobei das Binden der Spacer-Sequenz der pegRNAs des ersten und zweiten Prime-Editor-Komplexes in Gegenwart einer PAM-Sequenz zum Nicking des ersten bzw. zweiten Stranges an einer Nickstelle proximal zu den PAM- Sequenzen auf jedem Strang durch die napDNAbps des ersten und zweiten Prime-Editor- Komplexes führt.
    19. 19. Das System nach Ausführungsform 18, wobei die erste und die zweite Bindungsstelle zwei Enden einer zusammenhängenden Region doppelsträngiger DNA definieren, die die zu editierende Zielstelle umfasst.
    20. 20. Das System nach Ausführungsform 19, wobei die zusammenhängende Region zwischen der ersten und der zweiten Bindungsstelle mindestens 10 Nukleobasenpaare, mindestens 11 Nukleobasenpaare, mindestens 12 Nukleobasenpaare, mindestens 13 Nukleobasenpaare, mindestens 14 Nukleobasenpaare, mindestens 15 Nukleobasenpaare, mindestens 16 Nukleobasenpaare, mindestens 17 Nukleobasenpaare, mindestens 18 Nukleobasenpaare, mindestens 19 Nukleobasenpaare, mindestens 20 Nukleobasenpaare, mindestens 21 Nukleobasenpaare, mindestens 22 Nukleobasenpaare, mindestens 23 Nukleobasenpaare, mindestens 24 Nukleobasenpaare, mindestens 25 Nukleobasenpaare, mindestens 26 Nukleobasenpaare, mindestens 27 Nukleobasenpaare, mindestens 28 Nukleobasenpaare, mindestens 29 Nukleobasenpaare, mindestens 30 Nukleobasenpaare, mindestens 31 Nukleobasenpaare, mindestens 32 Nukleobasenpaare, mindestens 33 Nukleobasenpaare, mindestens 34 Nukleobasenpaare, mindestens 35 Nukleobasenpaare, mindestens 36 Nukleobasenpaare, mindestens 37 Nukleobasenpaare, mindestens 37 Nukleobasenpaare, mindestens 38 Nukleobasenpaare, mindestens 39 Nukleobasenpaare oder mindestens 40 Nukleobasenpaare, mindestens 41 Nukleotide, mindestens 42 Nukleotide, mindestens 43 Nukleotide, mindestens 44 Nukleotide, mindestens 45 Nukleotide, mindestens 46 Nukleotide, mindestens 47 Nukleotide, mindestens 48 Nukleotide, mindestens 49 Nukleotide, mindestens 50 Nukleotide, mindestens 51 Nukleotide, mindestens 52 Nukleotide, mindestens 53 Nukleotide, mindestens 54 Nukleotide, mindestens 55 Nukleotide, mindestens 56 Nukleotide, mindestens 57 Nukleotide, mindestens 58 Nukleotide, mindestens 59 Nukleotide, mindestens 60 Nukleotide, mindestens 61 Nukleotide, mindestens 62 Nukleotide, mindestens 63 Nukleotide, mindestens 64 Nukleotide, mindestens 65 Nukleotide, mindestens 66 Nukleotide, mindestens 67 Nukleotide, mindestens 68 Nukleotide, mindestens 69 Nukleotide, mindestens 70 Nukleotide, mindestens 71 Nukleotide, mindestens 72 Nukleotide, mindestens 73 Nukleotide, mindestens 74 Nukleotide, mindestens 75 Nukleotide, mindestens 76 Nukleotide, mindestens 77 Nukleotide, mindestens 78 Nukleotide, mindestens 79 Nukleotide, mindestens 80 Nukleotide, mindestens 81 Nukleotide, mindestens 82 Nukleotide mindestens 83 Nukleotide, mindestens 84 Nukleotide, mindestens 85 Nukleotide, mindestens 86 Nukleotide, mindestens 87 Nukleotide, mindestens 88 Nukleotide, mindestens 89 Nukleotide, mindestens 90 Nukleotide, mindestens 91 Nukleotide, mindestens 92 Nukleotide, mindestens 93 Nukleotide, mindestens 94 Nukleotide, mindestens 95 Nukleotide, mindestens 96 Nukleotide, mindestens 97 Nukleotide, mindestens 98 Nukleotide, mindestens 99 Nukleotide, mindestens 100 Nukleotide, mindestens 101 Nukleotide, mindestens 102 Nukleotide, mindestens 103 Nukleotide, mindestens 104 Nukleotide, mindestens 105 Nukleotide, mindestens 106 Nukleotide, mindestens 107 Nukleotide, mindestens 108 Nukleotide, mindestens 109 Nukleotide oder mindestens 110 Nukleotide in Länge beträgt.
    21. 21. Das System nach Ausführungsform 19, wobei die zusammenhängende Region durch das Duplex ersetzt wird, das den editierten Abschnitt umfasst.
    22. 22. Das System nach einer der Ausführungsformen 1-21, wobei das DNA-Synthese- Templat mindestens 1 Nukleotid, mindestens 2 Nukleotide, mindestens 3 Nukleotide, mindestens 4 Nukleotide, mindestens 5 Nukleotide, mindestens 6 Nukleotide, mindestens 7 Nukleotide, mindestens 8 Nukleotide, mindestens 9 Nukleotide, mindestens 10 Nukleotide, mindestens 11 Nukleotide, mindestens 12 Nukleotide ist, mindestens 13 Nukleotide, mindestens 14 Nukleotide, mindestens 15 Nukleotide, mindestens 16 Nukleotide, mindestens 17 Nukleotide, mindestens 18 Nukleotide, mindestens 19 Nukleotide, mindestens 20 Nukleotide, mindestens 21 Nukleotide, mindestens 22 Nukleotide, mindestens 23 Nukleotide, mindestens 24 Nukleotide, mindestens 25 Nukleotide, mindestens 26 Nukleotide mindestens 27 Nukleotide, mindestens 28 Nukleotide, mindestens 29 Nukleotide, mindestens 30 Nukleotide, mindestens 31 Nukleotide, mindestens 32 Nukleotide, mindestens 33 Nukleotide, mindestens 34 Nukleotide, mindestens 35 Nukleotide, mindestens 36 Nukleotide, mindestens 37 Nukleotide, mindestens 38 Nukleotide, mindestens 39 Nukleotide, mindestens 40 Nukleotide mindestens 41 Nukleotide, mindestens 42 Nukleotide, mindestens 43 Nukleotide, mindestens 44 Nukleotide, mindestens 45 Nukleotide, mindestens 46 Nukleotide, mindestens 47 Nukleotide, mindestens 48 Nukleotide, mindestens 49 Nukleotide, mindestens 50 Nukleotide, mindestens 51 Nukleotide, mindestens 52 Nukleotide, mindestens 53 Nukleotide, mindestens 54 Nukleotide mindestens 55 Nukleotide, mindestens 56 Nukleotide, mindestens 57 Nukleotide, mindestens 58 Nukleotide, mindestens 59 Nukleotide, mindestens 60 Nukleotide, mindestens 61 Nukleotide, mindestens 62 Nukleotide, mindestens 63 Nukleotide, mindestens 64 Nukleotide, mindestens 65 Nukleotide, mindestens 66 Nukleotide, mindestens 67 Nukleotide, mindestens 68 Nukleotide, mindestens 69 Nukleotide, mindestens 70 Nukleotide, mindestens 71 Nukleotide, mindestens 72 Nukleotide, mindestens 73 Nukleotide, mindestens 74 Nukleotide, mindestens 75 Nukleotide, mindestens 76 Nukleotide, mindestens 77 Nukleotide, mindestens 78 Nukleotide, mindestens 79 Nukleotide, mindestens 80 Nukleotide, mindestens 81 Nukleotide, mindestens 82 Nukleotide mindestens 83 Nukleotide, mindestens 84 Nukleotide, mindestens 85 Nukleotide, mindestens 86 Nukleotide, mindestens 87 Nukleotide, mindestens 88 Nukleotide, mindestens 89 Nukleotide, mindestens 90 Nukleotide, mindestens 91 Nukleotide, mindestens 92 Nukleotide, mindestens 93 Nukleotide, mindestens 94 Nukleotide, mindestens 95 Nukleotide, mindestens 96 Nukleotide, mindestens 97 Nukleotide, mindestens 98 Nukleotide, mindestens 99 Nukleotide, mindestens 100 Nukleotide, mindestens 101 Nukleotide, mindestens 102 Nukleotide, mindestens 103 Nukleotide, mindestens 104 Nukleotide, mindestens 105 Nukleotide, mindestens 106 Nukleotide, mindestens 107 Nukleotide, mindestens 108 Nukleotide, mindestens 109 Nukleotide oder mindestens 110 Nukleotide in Länge beträgt.
    23. 23. Das System nach einer der Ausführungsformen 1-22, wobei die erste einzelsträngige DNA-Sequenz und die zweite einzelsträngige DNA-Sequenz die gleichen Längen aufweisen.
    24. 24. Das System nach einer der Ausführungsformen 1-22, wobei die erste einzelsträngige DNA-Sequenz und die zweite einzelsträngige DNA-Sequenz unterschiedliche Längen aufweisen.
    25. 25. Das System nach einer der Ausführungsformen 1-24, wobei die Region der Komplementarität mindestens 99 %, mindestens 95 %, mindestens 90 %, mindestens 85 %, mindestens 80 %, mindestens 75 %, mindestens 70 %, mindestens 65 %, mindestens 60 %, mindestens 55 %, mindestens 50 %, mindestens 45 %, mindestens 40 %, mindestens 35 %, mindestens 30 %, mindestens 25 %, mindestens 20 %, mindestens 15 % oder mindestens 10 % der Gesamtlänge der ersten einzelsträngigen DNA-Sequenz oder der zweiten einzelsträngigen DNA-Sequenz beträgt.
    26. 26. Das System nach Ausführungsform 25, wobei die Region der Komplementarität mindestens 5 Nukleotide, mindestens 6 Nukleotide, mindestens 7 Nukleotide, mindestens 8 Nukleotide, mindestens 9 Nukleotide, mindestens 10 Nukleotide, mindestens 11 Nukleotide, mindestens 12 Nukleotide, mindestens 13 Nukleotide, mindestens 14 Nukleotide, mindestens 15 Nukleotide, mindestens 16 Nukleotide, mindestens 17 Nukleotide, mindestens 18 Nukleotide, mindestens 19 Nukleotide, mindestens 20 Nukleotide, mindestens 21 Nukleotide, mindestens 22 Nukleotide, mindestens 23 Nukleotide, mindestens 24 Nukleotide, mindestens 25 Nukleotide, mindestens 26 Nukleotide, mindestens 27 Nukleotide, mindestens 28 Nukleotide, mindestens 29 Nukleotide, mindestens 30 Nukleotide mindestens 31 Nukleotide, mindestens 32 Nukleotide, mindestens 33 Nukleotide, mindestens 34 Nukleotide, mindestens 35 Nukleotide, mindestens 36 Nukleotide, mindestens 37 Nukleotide, mindestens 38 Nukleotide, mindestens 39 Nukleotide, mindestens 40 Nukleotide, mindestens 41 Nukleotide, mindestens 42 Nukleotide, mindestens 43 Nukleotide, mindestens 44 Nukleotide mindestens 45 Nukleotide, mindestens 46 Nukleotide, mindestens 47 Nukleotide, mindestens 48 Nukleotide, mindestens 49 Nukleotide, mindestens 50 Nukleotide, mindestens 51 Nukleotide, mindestens 52 Nukleotide, mindestens 53 Nukleotide, mindestens 54 Nukleotide, mindestens 55 Nukleotide, mindestens 56 Nukleotide, mindestens 57 Nukleotide, mindestens 58 Nukleotide, mindestens 59 Nukleotide, mindestens 60 Nukleotide, mindestens 61 Nukleotide, mindestens 62 Nukleotide, mindestens 63 Nukleotide, mindestens 64 Nukleotide, mindestens 65 Nukleotide, mindestens 66 Nukleotide, mindestens 67 Nukleotide, mindestens 68 Nukleotide, mindestens 69 Nukleotide, mindestens 70 Nukleotide, mindestens 71 Nukleotide, mindestens 72 Nukleotide, mindestens 73 Nukleotide, mindestens 74 Nukleotide, mindestens 75 Nukleotide, mindestens 76 Nukleotide, mindestens 77 Nukleotide, mindestens 78 Nukleotide, mindestens 79 Nukleotide, mindestens 80 Nukleotide, mindestens 81 Nukleotide, mindestens 82 Nukleotide, mindestens 83 Nukleotide, mindestens 84 Nukleotide, mindestens 85 Nukleotide, mindestens 86 Nukleotide, mindestens 87 Nukleotide, mindestens 88 Nukleotide, mindestens 89 Nukleotide, mindestens 90 Nukleotide, mindestens 91 Nukleotide, mindestens 92 Nukleotide, mindestens 93 Nukleotide, mindestens 94 Nukleotide, mindestens 95 Nukleotide, mindestens 96 Nukleotide, mindestens 97 Nukleotide, mindestens 98 Nukleotide, mindestens 99 Nukleotide, mindestens 100 Nukleotide, mindestens 101 Nukleotide, mindestens 102 Nukleotide, mindestens 103 Nukleotide, mindestens 104 Nukleotide, mindestens 105 Nukleotide, mindestens 106 Nukleotide, mindestens 107 Nukleotide, mindestens 108 Nukleotide, mindestens 109 Nukleotide oder mindestens 110 Nukleotide in Länge beträgt und entweder kleiner oder gleich der Länge der gewünschten DNA-Sequenz und deren Komplement ist.
    27. 27. Das System nach Ausführungsform 25, wobei die Region der Komplementarität der ersten einzelsträngigen DNA-Sequenz und der zweiten einzelsträngigen DNA-Sequenz den Duplex bilden, der den editierten Abschnitt umfasst.
    28. 28. Das System nach einer der Ausführungsformen 1-27, wobei die erste einzelsträngige DNA-Sequenz und die zweite einzelsträngige DNA-Sequenz jeweils einzelsträngige DNA- Stränge sind, die 3'-Enden aufweisen.
    29. 29. Das System nach Ausführungsform 21, wobei der Austausch der zusammenhängenden Region durch den Duplex, der den editierten Abschnitt umfasst, zu einer Insertion, Deletion oder einem Austausch der DNA an der Zielstelle führt.
    30. 30. Ein System für gleichzeitiges Editieren beider Stränge einer doppelsträngigen DNA- Sequenz an einer zu editierenden Zielstelle, wobei das System Folgendes umfasst:
      1. (a) einen ersten Prime-Editor-Komplex, umfassend:
        1. i. einen ersten Prime-Editor, umfassend ein erstes Nukleinsäure-programmierbares DNA- Bindungsprotein (erstes napDNAbp) und ein erstes Polypeptid, das eine RNA-abhängige DNA-Polymerase-Aktivität umfasst; und
        2. ii. eine erste Prime-Editing-Leit-RNA (erste PEgRNA), die an eine erste Bindungsstelle auf einem ersten Strang der doppelsträngigen DNA-Sequenz stromaufwärts von der zu editierenden Zielstelle bindet;
      2. (b) einen zweiten Prime-Editor-Komplex, umfassend:
        1. i. einen zweiten Prime-Editor, umfassend ein zweites Nukleinsäure-programmierbares DNA- Bindeprotein (zweites napDNAbp) und ein zweites Polypeptid, das eine RNA-abhängige DNA-Polymerase-Aktivität umfasst; und
        2. ii. eine zweite Prime-Editing-Leit-RNA (zweite PEgRNA), die an eine zweite Bindungsstelle auf einem zweiten Strang der doppelsträngigen DNA-Sequenz stromabwärts von der zu editierenden Zielstelle bindet;
      wobei die erste PEgRNA eine erstes DNA-Synthese-Templat umfasst, das eine erste einzelsträngige DNA-Sequenz kodiert, und die zweite PEgRNA ein zweites DNA-Synthese- Templat umfasst, das eine zweite einzelsträngige DNA-Sequenz kodiert, und wobei der erste Strang und der zweite Strang der doppelsträngigen DNA-Sequenz komplementär zueinander sind.
    31. 31. Das System nach Ausführungsform 30, wobei der Prime-Editor des ersten Prime- Editor-Komplexes, des zweiten Prime-Editor-Komplexes oder sowohl des ersten Prime- Editor-Komplexes als auch des zweiten Prime-Editor-Komplexes ein Fusionsprotein ist, das das napDNAbp und das Polypeptid umfasst, das eine RNA-abhängige DNA-Polymerase- Aktivität aufweist.
    32. 32. Das System nach Ausführungsform 30, wobei die erste und die zweite einzelsträngige DNA-Sequenz jeweils eine Region der Komplementarität zur anderen umfassen.
    33. 33. Das System nach Ausführungsform 30, wobei die erste einzelsträngige DNA-Sequenz und die zweite einzelsträngige DNA-Sequenz einen Duplex bilden, der den editierten Abschnitt umfasst, der in die zu editierende Zielstelle integriert wird.
    34. 34. Das System nach Ausführungsform 30, wobei die erste einzelsträngige DNA-Sequenz und/oder die zweite einzelsträngige Sequenz keine Sequenzhomologie im Vergleich zur DNA- Sequenz an der Zielstelle umfasst.
    35. 35. Das System nach Ausführungsform 30, wobei die erste PEgRNA ferner eine erste Spacer-Sequenz, einen ersten gRNA-Kern und eine erste Primer-Bindungsstelle umfasst, und die zweite PEgRNA ferner eine zweite Spacer-Sequenz, einen zweiten gRNA-Kern und eine zweite Primer-Bindungsstelle umfasst.
    36. 36. Das System nach einer der Ausführungsformen 30-35, wobei der erste Prime-Editor- Komplex und der zweite Prime-Editor-Komplex denselben Prime-Editor umfassen.
    37. 37. Das System nach einer der Ausführungsformen 30-35, wobei das erste Polypeptid, das eine RNA-abhängige DNA-Polymerase-Aktivität umfasst, und das zweite Polypeptid, das eine RNA-abhängige DNA-Polymerase-Aktivität umfasst, das gleiche sind.
    38. 38. Das System nach einer der Ausführungsformen 30-37, wobei das erste und/oder zweite napDNAbp eine Cas9-Domäne oder eine Variante davon ist.
    39. 39. Das System nach einer der Ausführungsformen 30-38, wobei das erste und/oder zweite napDNAbp eine nukleaseaktive Cas9-Domäne, eine nuklease-inaktive Cas9-Domäne, eine Cas9-Nickase-Domäne oder eine Variante davon ist.
    40. 40. Das System nach einer der Ausführungsformen 30-39, wobei das erste und/oder zweite napDNAbp ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Cas9, Cas12e, Cas12d, Cas12a, Cas12b1, Cas13a, Cas12c, CasX, CasY und Argonaut.
    41. 41. Das System nach einer der Ausführungsformen 30-40, wobei das napDNAbp eine Nickase-Aktivität aufweist.
    42. 42. Das System nach einer der Ausführungsformen 30-41, wobei das das erste und/oder zweite napDNAbp eine Aminosäuresequenz einer der SEQ-ID-NR: 18-88 umfasst, oder eine Aminosäuresequenz, die mindestens 80 %, 85 %, 90 %, 95 % oder 99 % Sequenzidentität mit einer der SEQ-ID-NR: 18-88 aufweist.
    43. 43. Das System nach einer der Ausführungsformen 30-42, wobei das das erste und/oder zweite Polypeptid, das eine RNA-abhängige DNA-Polymerase-Aktivität aufweist, eine reverse Transkriptase ist.
    44. 44. Das System nach einer der Ausführungsformen 30-43, wobei das das erste und/oder zweite Polypeptid mit einer RNA-abhängigen DNA-Polymerase-Aktivität eine Aminosäuresequenz einer der SEQ-ID-NR: 89-100, 105-122, 128-129, 132, 139, 143, 149, 154, 159 und 700-766 umfasst, oder eine Aminosäuresequenz, die mindestens 80 %, 85 %, 90 %, 95 % oder 99 % Sequenzidentität mit einer der SEQ-ID-NR: 89-100, 105-122, 128-129 und 132 aufweist.
    45. 45. Das System nach einer der Ausführungsformen 30-44, wobei der erste Prime-Editor ferner einen Linker umfasst, der das erste napDNAbp und das erste Polypeptid mit der RNA- abhängigen DNA-Polymerase-Aktivität verbindet; und/oder der zweite Prime-Editor ferner einen Linker umfasst, der das zweite napDNAbp und das zweite Polypeptid mit der RNA- abhängigen DNA-Polymerase-Aktivität verbindet.
    46. 46. Das System nach Ausführungsform 45, wobei der Linker eine Aminosäuresequenz einer der SEQ-ID-NR: 166-177 umfasst, oder eine Aminosäuresequenz, die mindestens 80 %, 85 %, 90 %, 95 % oder 99 % Sequenzidentität mit einer der SEQ-ID-NR: 166-177 aufweist.
    47. 47. Das System nach Ausführungsform 45 oder 46, wobei der Linker 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 38, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 oder 50 Aminosäuren in Länge beträgt.
    48. 48. Das System nach einer der Ausführungsformen 30-47, wobei das das erste und/oder zweite pegRNA eine Nukleotidsequenz einer der SEQ-ID-NR: 325-330, 499-505, 101-104, 181-183 und 223-244 umfasst, oder eine Nukleotidsequenz, die mindestens 80 %, 85 %, 90 %, 95 % oder 99 % Sequenzidentität mit einer der SEQ-ID-NR: 325-330, 499-505, 101-104, 181-183 und 223-244 aufweist.
    49. 49. Das System nach einer der Ausführungsformen 30-48, wobei die erste Spacer-Sequenz an eine erste Bindungsstelle auf einem ersten Strang der doppelsträngigen DNA-Sequenz stromaufwärts von der zu editierenden Zielstelle bindet.
    50. 50. Das System nach Ausführungsform 49, wobei die zweite Spacer-Sequenz des zweiten Prime-Editor-Komplexes an eine zweite Bindungsstelle auf einem zweiten Strang der doppelsträngigen DNA-Sequenz stromabwärts von der zu editierenden Zielstelle bindet.
    51. 51. Das System nach Ausführungsform 50, wobei die Bindung der Spacer-Sequenz des ersten und zweiten Prime-Editor-Komplexes in Gegenwart einer PAM-Sequenz zum Nicking des ersten bzw. zweiten Stranges an einer Nickstelle proximal zu den PAM-Sequenzen auf jedem Strang durch die ersten und/oder zweiten napDNAbps jedes der ersten und zweiten Prime-Editor-Komplexe führt.
    52. 52. Das System nach Ausführungsform 51, wobei die erste und die zweite Bindungsstelle zwei Enden einer zusammenhängenden Region doppelsträngiger DNA definieren, die die zu editierende Zielstelle umfasst.
    53. 53. Das System nach Ausführungsform 52, wobei die zusammenhängende Region zwischen der ersten und der zweiten Bindungsstelle mindestens 10 Nukleobasenpaare, mindestens 11 Nukleobasenpaare, mindestens 12 Nukleobasenpaare, mindestens 13 Nukleobasenpaare, mindestens 14 Nukleobasenpaare, mindestens 15 Nukleobasenpaare, mindestens 16 Nukleobasenpaare, mindestens 17 Nukleobasenpaare, mindestens 18 Nukleobasenpaare, mindestens 19 Nukleobasenpaare, mindestens 20 Nukleobasenpaare, mindestens 21 Nukleobasenpaare, mindestens 22 Nukleobasenpaare, mindestens 23 Nukleobasenpaare, mindestens 24 Nukleobasenpaare, mindestens 25 Nukleobasenpaare, mindestens 26 Nukleobasenpaare, mindestens 27 Nukleobasenpaare, mindestens 28 Nukleobasenpaare, mindestens 29 Nukleobasenpaare, mindestens 30 Nukleobasenpaare, mindestens 31 Nukleobasenpaare, mindestens 32 Nukleobasenpaare, mindestens 33 Nukleobasenpaare, mindestens 34 Nukleobasenpaare, mindestens 35 Nukleobasenpaare, mindestens 36 Nukleobasenpaare, mindestens 37 Nukleobasenpaare, mindestens 37 Nukleobasenpaare, mindestens 38 Nukleobasenpaare, mindestens 39 Nukleobasenpaare oder mindestens 40 Nukleobasenpaare, mindestens 41 Nukleotide, mindestens 42 Nukleotide, mindestens 43 Nukleotide, mindestens 44 Nukleotide, mindestens 45 Nukleotide, mindestens 46 Nukleotide, mindestens 47 Nukleotide, mindestens 48 Nukleotide, mindestens 49 Nukleotide, mindestens 50 Nukleotide, mindestens 51 Nukleotide, mindestens 52 Nukleotide, mindestens 53 Nukleotide, mindestens 54 Nukleotide, mindestens 55 Nukleotide, mindestens 56 Nukleotide, mindestens 57 Nukleotide, mindestens 58 Nukleotide, mindestens 59 Nukleotide, mindestens 60 Nukleotide, mindestens 61 Nukleotide, mindestens 62 Nukleotide, mindestens 63 Nukleotide, mindestens 64 Nukleotide, mindestens 65 Nukleotide, mindestens 66 Nukleotide, mindestens 67 Nukleotide, mindestens 68 Nukleotide, mindestens 69 Nukleotide, mindestens 70 Nukleotide, mindestens 71 Nukleotide, mindestens 72 Nukleotide, mindestens 73 Nukleotide, mindestens 74 Nukleotide, mindestens 75 Nukleotide, mindestens 76 Nukleotide, mindestens 77 Nukleotide, mindestens 78 Nukleotide, mindestens 79 Nukleotide, mindestens 80 Nukleotide, mindestens 81 Nukleotide, mindestens 82 Nukleotide mindestens 83 Nukleotide, mindestens 84 Nukleotide, mindestens 85 Nukleotide, mindestens 86 Nukleotide, mindestens 87 Nukleotide, mindestens 88 Nukleotide, mindestens 89 Nukleotide, mindestens 90 Nukleotide, mindestens 91 Nukleotide, mindestens 92 Nukleotide, mindestens 93 Nukleotide, mindestens 94 Nukleotide, mindestens 95 Nukleotide, mindestens 96 Nukleotide, mindestens 97 Nukleotide, mindestens 98 Nukleotide, mindestens 99 Nukleotide, mindestens 100 Nukleotide, mindestens 101 Nukleotide, mindestens 102 Nukleotide, mindestens 103 Nukleotide, mindestens 104 Nukleotide, mindestens 105 Nukleotide, mindestens 106 Nukleotide, mindestens 107 Nukleotide, mindestens 108 Nukleotide, mindestens 109 Nukleotide oder mindestens 110 Nukleotide in Länge beträgt.
    54. 54. Das System nach Ausführungsform 53, wobei die zusammenhängende Region durch das Duplex ersetzt wird, das den editierten Abschnitt umfasst.
    55. 55. System nach einer der Ausführungsformen 30-54, wobei das erste und/oder zweite DNA-Synthese-Templat mindestens 1 Nukleotid, mindestens 2 Nukleotide, mindestens 3 Nukleotide, mindestens 4 Nukleotide, mindestens 5 Nukleotide, mindestens 6 Nukleotide, mindestens 7 Nukleotide, mindestens 8 Nukleotide, mindestens 9 Nukleotide, mindestens 10 Nukleotide, mindestens 11 Nukleotide, mindestens 12 Nukleotide ist, mindestens 13 Nukleotide, mindestens 14 Nukleotide, mindestens 15 Nukleotide, mindestens 16 Nukleotide, mindestens 17 Nukleotide, mindestens 18 Nukleotide, mindestens 19 Nukleotide, mindestens 20 Nukleotide, mindestens 21 Nukleotide, mindestens 22 Nukleotide, mindestens 23 Nukleotide, mindestens 24 Nukleotide, mindestens 25 Nukleotide, mindestens 26 Nukleotide mindestens 27 Nukleotide, mindestens 28 Nukleotide, mindestens 29 Nukleotide, mindestens 30 Nukleotide, mindestens 31 Nukleotide, mindestens 32 Nukleotide, mindestens 33 Nukleotide, mindestens 34 Nukleotide, mindestens 35 Nukleotide, mindestens 36 Nukleotide, mindestens 37 Nukleotide, mindestens 38 Nukleotide, mindestens 39 Nukleotide, mindestens 40 Nukleotide mindestens 41 Nukleotide, mindestens 42 Nukleotide, mindestens 43 Nukleotide, mindestens 44 Nukleotide, mindestens 45 Nukleotide, mindestens 46 Nukleotide, mindestens 47 Nukleotide, mindestens 48 Nukleotide, mindestens 49 Nukleotide, mindestens 50 Nukleotide, mindestens 51 Nukleotide, mindestens 52 Nukleotide, mindestens 53 Nukleotide, mindestens 54 Nukleotide mindestens 55 Nukleotide, mindestens 56 Nukleotide, mindestens 57 Nukleotide, mindestens 58 Nukleotide, mindestens 59 Nukleotide, mindestens 60 Nukleotide, mindestens 61 Nukleotide, mindestens 62 Nukleotide, mindestens 63 Nukleotide, mindestens 64 Nukleotide, mindestens 65 Nukleotide, mindestens 66 Nukleotide, mindestens 67 Nukleotide, mindestens 68 Nukleotide, mindestens 69 Nukleotide, mindestens 70 Nukleotide, mindestens 71 Nukleotide, mindestens 72 Nukleotide, mindestens 73 Nukleotide, mindestens 74 Nukleotide, mindestens 75 Nukleotide, mindestens 76 Nukleotide, mindestens 77 Nukleotide, mindestens 78 Nukleotide, mindestens 79 Nukleotide, mindestens 80 Nukleotide, mindestens 81 Nukleotide, mindestens 82 Nukleotide mindestens 83 Nukleotide, mindestens 84 Nukleotide, mindestens 85 Nukleotide, mindestens 86 Nukleotide, mindestens 87 Nukleotide, mindestens 88 Nukleotide, mindestens 89 Nukleotide, mindestens 90 Nukleotide, mindestens 91 Nukleotide, mindestens 92 Nukleotide, mindestens 93 Nukleotide, mindestens 94 Nukleotide, mindestens 95 Nukleotide, mindestens 96 Nukleotide, mindestens 97 Nukleotide, mindestens 98 Nukleotide, mindestens 99 Nukleotide, mindestens 100 Nukleotide, mindestens 101 Nukleotide, mindestens 102 Nukleotide, mindestens 103 Nukleotide, mindestens 104 Nukleotide, mindestens 105 Nukleotide, mindestens 106 Nukleotide, mindestens 107 Nukleotide, mindestens 108 Nukleotide, mindestens 109 Nukleotide oder mindestens 110 Nukleotide in Länge beträgt.
    56. 56. Das System nach einer der Ausführungsformen 30-55, wobei die erste einzelsträngige DNA-Sequenz und die zweite einzelsträngige DNA-Sequenz die gleichen Längen aufweisen.
    57. 57. Das System nach einer der Ausführungsformen 30-55, wobei die erste einzelsträngige DNA-Sequenz und die zweite einzelsträngige DNA-Sequenz unterschiedliche Längen aufweisen.
    58. 58. Das System nach einer der Ausführungsformen 30-57, wobei die Region der Komplementarität mindestens 99 %, mindestens 95 %, mindestens 90 %, mindestens 85 %, mindestens 80 %, mindestens 75 %, mindestens 70 %, mindestens 65 %, mindestens 60 %, mindestens 55 %, mindestens 50 %, mindestens 45 %, mindestens 40 %, mindestens 35 %, mindestens 30 %, mindestens 25 %, mindestens 20 %, mindestens 15 % oder mindestens 10 % der Gesamtlänge der ersten einzelsträngigen DNA-Sequenz oder der zweiten einzelsträngigen DNA-Sequenz beträgt.
    59. 59. Das System nach einer der Ausführungsformen 30-58, wobei die Region der Komplementarität mindestens 5 Nukleotide, mindestens 6 Nukleotide, mindestens 7 Nukleotide, mindestens 8 Nukleotide, mindestens 9 Nukleotide, mindestens 10 Nukleotide, mindestens 11 Nukleotide, mindestens 12 Nukleotide ist, mindestens 13 Nukleotide, mindestens 14 Nukleotide, mindestens 15 Nukleotide, mindestens 16 Nukleotide, mindestens 17 Nukleotide, mindestens 18 Nukleotide, mindestens 19 Nukleotide, mindestens 20 Nukleotide, mindestens 21 Nukleotide, mindestens 22 Nukleotide, mindestens 23 Nukleotide, mindestens 24 Nukleotide, mindestens 25 Nukleotide, mindestens 26 Nukleotide mindestens 27 Nukleotide, mindestens 28 Nukleotide, mindestens 29 Nukleotide, mindestens 30 Nukleotide, mindestens 31 Nukleotide, mindestens 32 Nukleotide, mindestens 33 Nukleotide, mindestens 34 Nukleotide, mindestens 35 Nukleotide, mindestens 36 Nukleotide, mindestens 37 Nukleotide, mindestens 38 Nukleotide, mindestens 39 Nukleotide, mindestens 40 Nukleotide mindestens 41 Nukleotide, mindestens 42 Nukleotide, mindestens 43 Nukleotide, mindestens 44 Nukleotide, mindestens 45 Nukleotide, mindestens 46 Nukleotide, mindestens 47 Nukleotide, mindestens 48 Nukleotide, mindestens 49 Nukleotide, mindestens 50 Nukleotide, mindestens 51 Nukleotide, mindestens 52 Nukleotide, mindestens 53 Nukleotide, mindestens 54 Nukleotide mindestens 55 Nukleotide, mindestens 56 Nukleotide, mindestens 57 Nukleotide, mindestens 58 Nukleotide, mindestens 59 Nukleotide, mindestens 60 Nukleotide, mindestens 61 Nukleotide, mindestens 62 Nukleotide, mindestens 63 Nukleotide, mindestens 64 Nukleotide, mindestens 65 Nukleotide, mindestens 66 Nukleotide, mindestens 67 Nukleotide, mindestens 68 Nukleotide, mindestens 69 Nukleotide, mindestens 70 Nukleotide, mindestens 71 Nukleotide, mindestens 72 Nukleotide, mindestens 73 Nukleotide, mindestens 74 Nukleotide, mindestens 75 Nukleotide, mindestens 76 Nukleotide, mindestens 77 Nukleotide, mindestens 78 Nukleotide, mindestens 79 Nukleotide, mindestens 80 Nukleotide, mindestens 81 Nukleotide, mindestens 82 Nukleotide mindestens 83 Nukleotide, mindestens 84 Nukleotide, mindestens 85 Nukleotide, mindestens 86 Nukleotide, mindestens 87 Nukleotide, mindestens 88 Nukleotide, mindestens 89 Nukleotide, mindestens 90 Nukleotide, mindestens 91 Nukleotide, mindestens 92 Nukleotide, mindestens 93 Nukleotide, mindestens 94 Nukleotide, mindestens 95 Nukleotide, mindestens 96 Nukleotide, mindestens 97 Nukleotide, mindestens 98 Nukleotide, mindestens 99 Nukleotide, mindestens 100 Nukleotide, mindestens 101 Nukleotide, mindestens 102 Nukleotide, mindestens 103 Nukleotide, mindestens 104 Nukleotide, mindestens 105 Nukleotide, mindestens 106 Nukleotide, mindestens 107 Nukleotide, mindestens 108 Nukleotide, mindestens 109 Nukleotide oder mindestens 110 Nukleotide in Länge beträgt.
    60. 60. Das System nach einer der Ausführungsformen 30-59, wobei die Region der Komplementarität der ersten einzelsträngigen DNA-Sequenz und der zweiten einzelsträngigen DNA-Sequenz einen Duplex bilden.
    61. 61. Das System nach einer der Ausführungsformen 30-60, wobei die erste einzelsträngige DNA-Sequenz und die zweite einzelsträngige DNA-Sequenz jeweils einzelsträngige DNA- Stränge sind, die 3'-Enden aufweisen.
    62. 62. Das System nach Ausführungsform 54, wobei der Austausch der zusammenhängenden Region durch den Duplex, der den editierten Abschnitt umfasst, zu einer Insertion, Deletion oder einem Austausch der DNA an der Zielstelle führt.
    63. 63. Ein Polynukleotid, das das System von einer der Ausführungsformen 1-62 kodiert.
    64. 64. Ein Polynukleotid, das den ersten und zweiten Prime-Editor einer der Ausführungsformen 1-62 kodiert.
    65. 65. Ein Polynukleotid, das die erste und/oder zweite PegRNA einer der Ausführungsformen 1-29 kodiert.
    66. 66. Ein Polynukleotid, das die erste und/oder zweite PegRNA einer der Ausführungsformen 30-62 kodiert.
    67. 67. Ein Polynukleotid, das die erste und zweite pegRNA einer der Ausführungsformen 1- 29 kodiert.
    68. 68. Ein Polynukleotid, das die erste und zweite pegRNA einer der Ausführungsformen 30- 62 kodiert.
    69. 69. Ein Vektor, der ein Polynukleotid einer der Ausführungsformen 63-68 umfasst.
    70. 70. Eine Zelle, die ein Polynukleotid einer der Ausführungsformen 63-69 oder einen Vektor der Ausführungsform 64 umfasst.
    71. 71. Eine pharmazeutische Zusammensetzung, die ein Polynukleotid nach einer der Ausführungsformen 63-68, einen Vektor nach Ausführungsform 69 oder eine Zelle nach Ausführungsform 70 und einen pharmazeutischen Hilfsstoff umfasst.
    72. 72. Ein Kit, umfassend ein Polynukleotid nach einer der Ausführungsformen 63-69 oder einen Vektor nach Ausführungsform 70 und Anweisungen für gleichzeitiges Editieren beider Stränge einer doppelsträngigen DNA-Sequenz an einer zu editierenden Zielstelle.
    73. 73. Ein Verfahren für gleichzeitiges Editieren eines ersten und eines zweiten komplementären Strangs einer doppelsträngigen DNA-Sequenz an einer Zielstelle, wobei das Verfahren das Inkontaktbringen der doppelsträngigen DNA-Sequenz mit einem Paar von Prime-Editor-Komplexen umfasst, wobei das Paar Folgendes umfasst:
      1. a. einen ersten Prime-Editor-Komplex, umfassend:
        1. i. einen ersten Prime-Editor, umfassend ein erstes Nukleinsäure-programmierbares DNA- Bindungsprotein (napDNAbp) und ein erstes Polypeptid, das eine RNA-abhängige DNA- Polymerase-Aktivität umfasst; und
        2. ii. eine erste Prime-Editing-Leit-RNA (erste PEgRNA), die an eine erste Bindungsstelle auf dem ersten Strang der genomischen DNA-Sequenz stromaufwärts von der Zielstelle bindet;
      2. b. einen zweiten Prime-Editor-Komplex, umfassend:
        • i. einen zweiten Prime-Editor, umfassend ein zweites Nukleinsäure-programmierbares DNA- Bindeprotein (zweites napDNAbp) und ein zweites Polypeptid, das eine RNA-abhängige DNA-Polymerase-Aktivität umfasst; und
        • ii. eine zweite Prime-Editing-Leit-RNA (zweite PEgRNA), die an eine zweite Bindungsstelle auf dem zweiten Strang der genomischen DNA-Sequenz stromabwärts der Zielstelle bindet;
      wobei der erste Prime-Editor-Komplex einen ersten Nick an einer Sequenz, die komplementär zu der ersten Bindungsstelle ist, und die anschließende Polymerisation einer ersten einzelsträngigen DNA-Sequenz, die ein 3'-Ende von dem verfügbaren 5'-Ende aufweist, das durch den ersten Nick gebildet wird, bewirkt; wobei der zweite Prime-Editor-Komplex einen zweiten Nick an einer Sequenz, die komplementär zu der zweiten Bindungsstelle ist, und die anschließende Polymerisation einer zweiten einzelsträngigen DNA-Sequenz, die ein 3'-Ende von dem verfügbaren 5'-Ende aufweist, das durch den zweiten Nick gebildet wird, bewirkt; wobei die erste einzelsträngige DNA-Sequenz und die zweite einzelsträngige DNA-Sequenz über mindestens eine Region der Komplementarität umgekehrt komplementär sind und einen Duplex bilden, der ein Editing umfasst; und wobei der Duplex den genickten ersten und zweiten komplementären Strang der doppelsträngigen DNA-Sequenz ersetzt.
    74. 74. Das Verfahren nach Ausführungsform 73, wobei der Prime-Editor des ersten Prime- Editor-Komplexes, des zweiten Prime-Editor-Komplexes oder sowohl des ersten Prime- Editor-Komplexes als auch des zweiten Prime-Editor-Komplexes ein Fusionsprotein ist, das das napDNAbp und das Polypeptid umfasst, das eine RNA-abhängige DNA-Polymerase- Aktivität aufweist.
    75. 75. Das Verfahren nach Ausführungsform 73, wobei der erste Prime-Editor-Komplex und der zweite Prime-Editor-Komplex denselben Prime-Editor umfassen.
    76. 76. Das Verfahren nach Ausführungsform 73, wobei der erste Prime-Editor-Komplex und der zweite Prime-Editor-Komplex unterschiedliche Prime-Editoren umfassen.
    77. 77. Das Verfahren nach einer der Ausführungsformen 73-76, wobei das erste und/oder zweite napDNAbp eine Cas9-Domäne oder eine Variante davon ist.
    78. 78. Das Verfahren nach einer der Ausführungsformen 73-77, wobei das erste und/oder zweite napDNAbp eine nukleaseaktive Cas9-Domäne, eine nuklease-inaktive Cas9-Domäne, eine Cas9-Nickase-Domäne oder eine Variante davon ist.
    79. 79. Das Verfahren nach einer der Ausführungsformen 73-76, wobei das erste und/oder zweite napDNAbp ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Cas9, Cas12e, Cas12d, Cas12a, Cas12b1, Cas13a, Cas12c, CasX, CasY und Argonaut.
    80. 80. Das Verfahren nach einer der Ausführungsformen 73-79, wobei das erste und/oder zweite napDNAbp eine Nickase-Aktivität aufweist.
    81. 81. Das Verfahren nach einer der Ausführungsformen 73-80, wobei das das erste und/oder zweite napDNAbp eine Aminosäuresequenz einer der SEQ-ID-NR: 18-88 umfasst, oder eine Aminosäuresequenz, die mindestens 80 %, 85 %, 90 %, 95 % oder 99 % Sequenzidentität mit einer der SEQ-ID-NR: 18-88 aufweist.
    82. 82. Das Verfahren nach einer der Ausführungsformen 73-81, wobei das das erste und/oder zweite Polypeptid, das eine RNA-abhängige DNA-Polymerase-Aktivität aufweist, eine reverse Transkriptase ist.
    83. 83. Das Verfahren nach einer der Ausführungsformen 73-82, wobei das das erste und/oder zweite Polypeptid mit einer RNA-abhängigen DNA-Polymerase-Aktivität eine Aminosäuresequenz einer der SEQ-ID-NR: 89-100, 105-122, 128-129, 132, 139, 143, 149, 154, 159 und 700-766 umfasst, oder eine Aminosäuresequenz, die mindestens 80 %, 85 %, 90 %, 95 % oder 99 % Sequenzidentität mit einer der SEQ-ID-NR: 89-100, 105-122, 128-129 und 132 aufweist.
    84. 84. Das Verfahren nach einer der Ausführungsformen 73-83, wobei der erste Prime-Editor ferner einen Linker umfasst, der das erste napDNAbp und das erste Polypeptid mit der RNA- abhängigen DNA-Polymerase-Aktivität verbindet, und/oder der zweite Prime-Editor ferner einen Linker umfasst, der das zweite napDNAbp und das zweite Polypeptid mit der RNA- abhängigen DNA-Polymerase-Aktivität verbindet.
    85. 85. Das Verfahren nach Ausführungsform 84, wobei der Linker eine Aminosäuresequenz einer der SEQ-ID-NR: 166-177 umfasst, oder eine Aminosäuresequenz, die mindestens 80 %, 85 %, 90 %, 95 % oder 99 % Sequenzidentität mit einer der SEQ-ID-NR: 166-177 aufweist.
    86. 86. Das Verfahren nach Ausführungsform 84 oder 85, wobei der Linker 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 38, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 oder 50 Aminosäuren in Länge beträgt.
    87. 87. Das Verfahren nach einer der Ausführungsformen 73-86, wobei das das erste und/oder zweite pegRNA eine Nukleotidsequenz einer der SEQ-ID-NR: 325-330, 499-505, 101-104, 181-183 und 223-244 umfasst, oder eine Nukleotidsequenz, die mindestens 80 %, 85 %, 90 %, 95 % oder 99 % Sequenzidentität mit einer der SEQ-ID-NR: 325-330, 499-505, 101-104, 181-183 und 223-244 aufweist.
    88. 88. Das Verfahren nach einer der Ausführungsformen 73-87, wobei das das erste und/oder zweite PEgRNA eine Nukleotidsequenz einer der SEQ-ID-NR: 325-330, 499-505, 101-104, 181-183 und 223-244 umfasst, oder eine Nukleotidsequenz, die mindestens 80 %, 85 %, 90 %, 95 % oder 99 % Sequenzidentität mit einer der SEQ-ID-NR: 325-330, 499-505, 101-104, 181-183 und 223-244 aufweist.
    89. 89. Das Verfahren nach einer der Ausführungsformen 73-88, wobei die erste Spacer- Sequenz des ersten Prime-Editor-Komplexes an eine erste Bindungsstelle auf einem ersten Strang der doppelsträngigen DNA-Sequenz stromaufwärts von der zu editierenden Zielstelle bindet.
    90. 90. Das Verfahren nach einer der Ausführungsformen 73-89, wobei die zweite Spacer- Sequenz des zweiten Prime-Editor-Komplexes an eine zweite Bindungsstelle auf einem zweiten Strang der doppelsträngigen DNA-Sequenz stromabwärts von der zu editierenden Zielstelle bindet.
    91. 91. Das Verfahren nach Ausführungsform 90, wobei die Bindung der ersten und zweiten Spacer-Sequenzen des ersten und zweiten Prime-Editor-Komplexes in Gegenwart einer PAM- Sequenz zum Nicking des ersten bzw. zweiten Stranges an einer Nickstelle proximal zur PAM- Sequenz auf jedem Strang durch die napDNAbps jedes ersten und zweiten Prime-Editor- Komplexes führt.
    92. 92. Das Verfahren nach Ausführungsform 91, wobei die erste und die zweite Bindungsstelle zwei Enden einer zusammenhängenden Region doppelsträngiger DNA definieren, die die zu editierende Zielstelle umfasst.
    93. 93. Das Verfahren nach Ausführungsform 92, wobei die zusammenhängende Region zwischen der ersten und der zweiten Bindungsstelle mindestens 10 Nukleobasenpaare, mindestens 11 Nukleobasenpaare, mindestens 12 Nukleobasenpaare, mindestens 13 Nukleobasenpaare, mindestens 14 Nukleobasenpaare, mindestens 15 Nukleobasenpaare, mindestens 16 Nukleobasenpaare, mindestens 17 Nukleobasenpaare, mindestens 18 Nukleobasenpaare, mindestens 19 Nukleobasenpaare, mindestens 20 Nukleobasenpaare, mindestens 21 Nukleobasenpaare, mindestens 22 Nukleobasenpaare, mindestens 23 Nukleobasenpaare, mindestens 24 Nukleobasenpaare, mindestens 25 Nukleobasenpaare, mindestens 26 Nukleobasenpaare, mindestens 27 Nukleobasenpaare, mindestens 28 Nukleobasenpaare, mindestens 29 Nukleobasenpaare, mindestens 30 Nukleobasenpaare, mindestens 31 Nukleobasenpaare, mindestens 32 Nukleobasenpaare, mindestens 33 Nukleobasenpaare, mindestens 34 Nukleobasenpaare, mindestens 35 Nukleobasenpaare, mindestens 36 Nukleobasenpaare, mindestens 37 Nukleobasenpaare, mindestens 37 Nukleobasenpaare, mindestens 38 Nukleobasenpaare, mindestens 39 Nukleobasenpaare oder mindestens 40 Nukleobasenpaare, mindestens 41 Nukleotide, mindestens 42 Nukleotide, mindestens 43 Nukleotide, mindestens 44 Nukleotide, mindestens 45 Nukleotide, mindestens 46 Nukleotide, mindestens 47 Nukleotide, mindestens 48 Nukleotide, mindestens 49 Nukleotide, mindestens 50 Nukleotide, mindestens 51 Nukleotide, mindestens 52 Nukleotide, mindestens 53 Nukleotide, mindestens 54 Nukleotide, mindestens 55 Nukleotide, mindestens 56 Nukleotide, mindestens 57 Nukleotide, mindestens 58 Nukleotide, mindestens 59 Nukleotide, mindestens 60 Nukleotide, mindestens 61 Nukleotide, mindestens 62 Nukleotide, mindestens 63 Nukleotide, mindestens 64 Nukleotide, mindestens 65 Nukleotide, mindestens 66 Nukleotide, mindestens 67 Nukleotide, mindestens 68 Nukleotide, mindestens 69 Nukleotide, mindestens 70 Nukleotide, mindestens 71 Nukleotide, mindestens 72 Nukleotide, mindestens 73 Nukleotide, mindestens 74 Nukleotide, mindestens 75 Nukleotide, mindestens 76 Nukleotide, mindestens 77 Nukleotide, mindestens 78 Nukleotide, mindestens 79 Nukleotide, mindestens 80 Nukleotide, mindestens 81 Nukleotide, mindestens 82 Nukleotide mindestens 83 Nukleotide, mindestens 84 Nukleotide, mindestens 85 Nukleotide, mindestens 86 Nukleotide, mindestens 87 Nukleotide, mindestens 88 Nukleotide, mindestens 89 Nukleotide, mindestens 90 Nukleotide, mindestens 91 Nukleotide, mindestens 92 Nukleotide, mindestens 93 Nukleotide, mindestens 94 Nukleotide, mindestens 95 Nukleotide, mindestens 96 Nukleotide, mindestens 97 Nukleotide, mindestens 98 Nukleotide, mindestens 99 Nukleotide, mindestens 100 Nukleotide, mindestens 101 Nukleotide, mindestens 102 Nukleotide, mindestens 103 Nukleotide, mindestens 104 Nukleotide, mindestens 105 Nukleotide, mindestens 106 Nukleotide, mindestens 107 Nukleotide, mindestens 108 Nukleotide, mindestens 109 Nukleotide oder mindestens 110 Nukleotide in Länge beträgt.
    94. 94. Das Verfahren nach Ausführungsform 92 oder 93, wobei die zusammenhängende Region durch das Duplex ersetzt wird, das den editierten Abschnitt umfasst.
    95. 95. Das Verfahren nach einer der Ausführungsformen 73-94, wobei das erste und/oder zweite DNA-Synthese-Templat mindestens 1 Nukleotid, mindestens 2 Nukleotide, mindestens 3 Nukleotide, mindestens 4 Nukleotide, mindestens 5 Nukleotide, mindestens 6 Nukleotide, mindestens 7 Nukleotide, mindestens 8 Nukleotide, mindestens 9 Nukleotide, mindestens 10 Nukleotide, mindestens 11 Nukleotide, mindestens 12 Nukleotide, mindestens 13 Nukleotide, mindestens 14 Nukleotide, mindestens 15 Nukleotide, mindestens 16 Nukleotide, mindestens 17 Nukleotide, mindestens 18 Nukleotide, mindestens 19 Nukleotide, mindestens 20 Nukleotide, mindestens 21 Nukleotide, mindestens 22 Nukleotide, mindestens 23 Nukleotide, mindestens 24 Nukleotide, mindestens 25 Nukleotide, mindestens 26 Nukleotide mindestens 27 Nukleotide, mindestens 28 Nukleotide, mindestens 29 Nukleotide, mindestens 30 Nukleotide, mindestens 31 Nukleotide, mindestens 32 Nukleotide, mindestens 33 Nukleotide, mindestens 34 Nukleotide, mindestens 35 Nukleotide, mindestens 36 Nukleotide, mindestens 37 Nukleotide, mindestens 38 Nukleotide, mindestens 39 Nukleotide, mindestens 40 Nukleotide mindestens 41 Nukleotide, mindestens 42 Nukleotide, mindestens 43 Nukleotide, mindestens 44 Nukleotide, mindestens 45 Nukleotide, mindestens 46 Nukleotide, mindestens 47 Nukleotide, mindestens 48 Nukleotide, mindestens 49 Nukleotide, mindestens 50 Nukleotide, mindestens 51 Nukleotide, mindestens 52 Nukleotide, mindestens 53 Nukleotide, mindestens 54 Nukleotide mindestens 55 Nukleotide, mindestens 56 Nukleotide, mindestens 57 Nukleotide, mindestens 58 Nukleotide, mindestens 59 Nukleotide, mindestens 60 Nukleotide, mindestens 61 Nukleotide, mindestens 62 Nukleotide, mindestens 63 Nukleotide, mindestens 64 Nukleotide, mindestens 65 Nukleotide, mindestens 66 Nukleotide, mindestens 67 Nukleotide, mindestens 68 Nukleotide, mindestens 69 Nukleotide, mindestens 70 Nukleotide, mindestens 71 Nukleotide, mindestens 72 Nukleotide, mindestens 73 Nukleotide, mindestens 74 Nukleotide, mindestens 75 Nukleotide, mindestens 76 Nukleotide, mindestens 77 Nukleotide, mindestens 78 Nukleotide, mindestens 79 Nukleotide, mindestens 80 Nukleotide, mindestens 81 Nukleotide, mindestens 82 Nukleotide mindestens 83 Nukleotide, mindestens 84 Nukleotide, mindestens 85 Nukleotide, mindestens 86 Nukleotide, mindestens 87 Nukleotide, mindestens 88 Nukleotide, mindestens 89 Nukleotide, mindestens 90 Nukleotide, mindestens 91 Nukleotide, mindestens 92 Nukleotide, mindestens 93 Nukleotide, mindestens 94 Nukleotide, mindestens 95 Nukleotide, mindestens 96 Nukleotide, mindestens 97 Nukleotide, mindestens 98 Nukleotide, mindestens 99 Nukleotide, mindestens 100 Nukleotide, mindestens 101 Nukleotide, mindestens 102 Nukleotide, mindestens 103 Nukleotide, mindestens 104 Nukleotide, mindestens 105 Nukleotide, mindestens 106 Nukleotide, mindestens 107 Nukleotide, mindestens 108 Nukleotide, mindestens 109 Nukleotide oder mindestens 110 Nukleotide in Länge beträgt.
    96. 96. Das Verfahren nach einer der Ausführungsformen 73-95, wobei die erste einzelsträngige DNA-Sequenz und die zweite einzelsträngige DNA-Sequenz die gleichen Längen aufweisen.
    97. 97. Das Verfahren nach einer der Ausführungsformen 73-95, wobei die erste einzelsträngige DNA-Sequenz und die zweite einzelsträngige DNA-Sequenz unterschiedliche Längen aufweisen.
    98. 98. Das Verfahren nach einer der Ausführungsformen 73-97, wobei die Region der Komplementarität mindestens 99 %, mindestens 95 %, mindestens 90 %, mindestens 85 %, mindestens 80 %, mindestens 75 %, mindestens 70 %, mindestens 65 %, mindestens 60 %, mindestens 55 %, mindestens 50 %, mindestens 45 %, mindestens 40 %, mindestens 35 %, mindestens 30 %, mindestens 25 %, mindestens 20 %, mindestens 15 % oder mindestens 10 % der Gesamtlänge der ersten einzelsträngigen DNA-Sequenz oder der zweiten einzelsträngigen DNA-Sequenz beträgt.
    99. 99. Das Verfahren nach einer der Ausführungsformen 73-98, wobei die Region der Komplementarität mindestens 5 Nukleotide, mindestens 6 Nukleotide, mindestens 7 Nukleotide, mindestens 8 Nukleotide, mindestens 9 Nukleotide, mindestens 10 Nukleotide, mindestens 11 Nukleotide, mindestens 12 Nukleotide, mindestens 13 Nukleotide, mindestens 14 Nukleotide, mindestens 15 Nukleotide, mindestens 16 Nukleotide, mindestens 17 Nukleotide, mindestens 18 Nukleotide, mindestens 19 Nukleotide, mindestens 20 Nukleotide, mindestens 21 Nukleotide, mindestens 22 Nukleotide, mindestens 23 Nukleotide, mindestens 24 Nukleotide, mindestens 25 Nukleotide, mindestens 26 Nukleotide, mindestens 27 Nukleotide, mindestens 28 Nukleotide, mindestens 29 Nukleotide, mindestens 30 Nukleotide mindestens 31 Nukleotide, mindestens 32 Nukleotide, mindestens 33 Nukleotide, mindestens 34 Nukleotide, mindestens 35 Nukleotide, mindestens 36 Nukleotide, mindestens 37 Nukleotide, mindestens 38 Nukleotide, mindestens 39 Nukleotide, mindestens 40 Nukleotide, mindestens 41 Nukleotide, mindestens 42 Nukleotide, mindestens 43 Nukleotide, mindestens 44 Nukleotide mindestens 45 Nukleotide, mindestens 46 Nukleotide, mindestens 47 Nukleotide, mindestens 48 Nukleotide, mindestens 49 Nukleotide, mindestens 50 Nukleotide, mindestens 51 Nukleotide, mindestens 52 Nukleotide, mindestens 53 Nukleotide, mindestens 54 Nukleotide, mindestens 55 Nukleotide, mindestens 56 Nukleotide, mindestens 57 Nukleotide, mindestens 58 Nukleotide, mindestens 59 Nukleotide, mindestens 60 Nukleotide, mindestens 61 Nukleotide, mindestens 62 Nukleotide, mindestens 63 Nukleotide, mindestens 64 Nukleotide, mindestens 65 Nukleotide, mindestens 66 Nukleotide, mindestens 67 Nukleotide, mindestens 68 Nukleotide, mindestens 69 Nukleotide, mindestens 70 Nukleotide, mindestens 71 Nukleotide, mindestens 72 Nukleotide, mindestens 73 Nukleotide, mindestens 74 Nukleotide, mindestens 75 Nukleotide, mindestens 76 Nukleotide, mindestens 77 Nukleotide, mindestens 78 Nukleotide, mindestens 79 Nukleotide, mindestens 80 Nukleotide, mindestens 81 Nukleotide, mindestens 82 Nukleotide, mindestens 83 Nukleotide, mindestens 84 Nukleotide, mindestens 85 Nukleotide, mindestens 86 Nukleotide, mindestens 87 Nukleotide, mindestens 88 Nukleotide, mindestens 89 Nukleotide, mindestens 90 Nukleotide, mindestens 91 Nukleotide, mindestens 92 Nukleotide, mindestens 93 Nukleotide, mindestens 94 Nukleotide, mindestens 95 Nukleotide, mindestens 96 Nukleotide, mindestens 97 Nukleotide, mindestens 98 Nukleotide, mindestens 99 Nukleotide, mindestens 100 Nukleotide, mindestens 101 Nukleotide, mindestens 102 Nukleotide, mindestens 103 Nukleotide, mindestens 104 Nukleotide, mindestens 105 Nukleotide, mindestens 106 Nukleotide, mindestens 107 Nukleotide, mindestens 108 Nukleotide, mindestens 109 Nukleotide oder mindestens 110 Nukleotide in Länge beträgt und entweder kleiner oder gleich der Länge der gewünschten DNA-Sequenz und deren Komplement ist.
    100. 100. Das Verfahren nach einer der Ausführungsformen 73-99, wobei die Region der Komplementarität der ersten einzelsträngigen DNA-Sequenz und der zweiten einzelsträngigen DNA-Sequenz den Duplex bilden.
    101. 101. Das Verfahren nach einer der Ausführungsformen 73-100, wobei die erste einzelsträngige DNA-Sequenz und die zweite einzelsträngige DNA-Sequenz jeweils einzelsträngige DNA-Stränge sind, die 3'-Enden aufweisen.
    102. 102. Das Verfahren nach Ausführungsform 94, wobei der Austausch der zusammenhängenden Region durch den Duplex, der den editierten Abschnitt umfasst, zu einer Insertion, Deletion oder einem Austausch der DNA an der Zielstelle führt.
    103. 103. Das Verfahren nach einer der Ausführungsformen 73-102, wobei der Duplex ein Editing umfasst, das eine oder mehrere Rekombinasestellen umfasst.
    104. 104. Das Verfahren nach Ausführungsform 103, ferner umfassend das Bereitstellen einer Rekombinase zur Förderung des rekombinasevermittelten Editings der DNA-Sequenz an der zu editierenden Zielstelle.
    105. 105. Ein Paar von pegRNAs zur Verwendung beim Dual-Prime-Editing, wobei das Paar Folgendes umfasst:
      1. a. eine erste Prime-Editing-Leit-RNA (erste PEgRNA), die an eine erste Bindungsstelle auf einem ersten Strang einer doppelsträngigen DNA-Sequenz stromaufwärts einer zu editierenden Zielstelle bindet, wobei die erste PEgRNA eine erste Spacer-Sequenz, einen ersten gRNA-Kern, ein erstes DNA-Synthese-Templat und eine erste Primer-Bindungsstelle umfasst, wobei das erste DNA-Synthese-Templat eine erste einzelsträngige DNA-Sequenz kodiert, die einen editierten Abschnitt umfasst;
      2. b. eine zweite Prime-Editing-Leit-RNA (zweite PEgRNA), die an eine zweite Bindungsstelle auf einem zweiten Strang der doppelsträngigen DNA-Sequenz stromabwärts von der zu editierenden Zielstelle bindet, wobei die zweite PEgRNA eine zweite Spacer- Sequenz, einen zweiten gRNA-Kern, ein zweites DNA-Synthese-Templat und eine zweite Primer-Bindungsstelle umfasst, wobei das zweite DNA-Synthese-Templat eine zweite einzelsträngige DNA-Sequenz kodiert, die den editierten Abschnitt umfasst, wobei die zweite einzelsträngige DNA-Sequenz eine Region der Komplementarität zur ersten einzelsträngigen DNA-Sequenz umfasst.
    106. 106. Das pegRNA-Paar nach Ausführungsform 105, wobei die erste PEgRNA die folgende Struktur umfasst:
      • 5'-[erste gRNA-Spacer-Sequenz]-[erster gRNA-Kern]-[erstes DNA-Synthese-Templat]-[erste Primer-Bindungsstelle]-3'; und
      wobei die zweite PEgRNA die folgende Struktur umfasst:
      • 5'-[zweite gRNA-Spacer-Sequenz]-[zweiter gRNA-Kern]-[zweites DNA-Synthese-Templat]- [zweite Primer-Bindungsstelle]-3'.
    107. 107. Das pegRNA-Paar nach Ausführungsform 105 oder 106, wobei die erste einzelsträngige DNA-Sequenz und die zweite einzelsträngige DNA-Sequenz einen Duplex bilden, der an der zu editierenden Zielstelle in die doppelsträngige DNA-Sequenz integriert wird.
    108. 108. Das pegRNA-Paar nach Ausführungsform 107, wobei die Integration des Duplex zu einer Insertion, Deletion oder einem Austausch von DNA an der Zielstelle führt.
    109. 109. Das Paar von pegRNAs nach Ausführungsform 108, wobei die Insertion mindestens 1 Nukleotid, mindestens 2 Nukleotide, mindestens 3 Nukleotide, mindestens 4 Nukleotide, mindestens 5 Nukleotide, mindestens 6 Nukleotide, mindestens 7 Nukleotide, mindestens 8 Nukleotide, mindestens 9 Nukleotide, mindestens 10 Nukleotide, mindestens 11 Nukleotide, mindestens 12 Nukleotide ist, mindestens 13 Nukleotide, mindestens 14 Nukleotide, mindestens 15 Nukleotide, mindestens 16 Nukleotide, mindestens 17 Nukleotide, mindestens 18 Nukleotide, mindestens 19 Nukleotide, mindestens 20 Nukleotide, mindestens 21 Nukleotide, mindestens 22 Nukleotide, mindestens 23 Nukleotide, mindestens 24 Nukleotide, mindestens 25 Nukleotide, mindestens 26 Nukleotide mindestens 27 Nukleotide, mindestens 28 Nukleotide, mindestens 29 Nukleotide, mindestens 30 Nukleotide, mindestens 31 Nukleotide, mindestens 32 Nukleotide, mindestens 33 Nukleotide, mindestens 34 Nukleotide, mindestens 35 Nukleotide, mindestens 36 Nukleotide, mindestens 37 Nukleotide, mindestens 38 Nukleotide, mindestens 39 Nukleotide, mindestens 40 Nukleotide mindestens 41 Nukleotide, mindestens 42 Nukleotide, mindestens 43 Nukleotide, mindestens 44 Nukleotide, mindestens 45 Nukleotide, mindestens 46 Nukleotide, mindestens 47 Nukleotide, mindestens 48 Nukleotide, mindestens 49 Nukleotide, mindestens 50 Nukleotide, mindestens 51 Nukleotide, mindestens 52 Nukleotide, mindestens 53 Nukleotide, mindestens 54 Nukleotide mindestens 55 Nukleotide, mindestens 56 Nukleotide, mindestens 57 Nukleotide, mindestens 58 Nukleotide, mindestens 59 Nukleotide, mindestens 60 Nukleotide, mindestens 61 Nukleotide, mindestens 62 Nukleotide, mindestens 63 Nukleotide, mindestens 64 Nukleotide, mindestens 65 Nukleotide, mindestens 66 Nukleotide, mindestens 67 Nukleotide, mindestens 68 Nukleotide, mindestens 69 Nukleotide, mindestens 70 Nukleotide, mindestens 71 Nukleotide, mindestens 72 Nukleotide, mindestens 73 Nukleotide, mindestens 74 Nukleotide, mindestens 75 Nukleotide, mindestens 76 Nukleotide, mindestens 77 Nukleotide, mindestens 78 Nukleotide, mindestens 79 Nukleotide, mindestens 80 Nukleotide, mindestens 81 Nukleotide, mindestens 82 Nukleotide mindestens 83 Nukleotide, mindestens 84 Nukleotide, mindestens 85 Nukleotide, mindestens 86 Nukleotide, mindestens 87 Nukleotide, mindestens 88 Nukleotide, mindestens 89 Nukleotide, mindestens 90 Nukleotide, mindestens 91 Nukleotide, mindestens 92 Nukleotide, mindestens 93 Nukleotide, mindestens 94 Nukleotide, mindestens 95 Nukleotide, mindestens 96 Nukleotide, mindestens 97 Nukleotide, mindestens 98 Nukleotide, mindestens 99 Nukleotide, mindestens 100 Nukleotide, mindestens 101 Nukleotide, mindestens 102 Nukleotide, mindestens 103 Nukleotide, mindestens 104 Nukleotide, mindestens 105 Nukleotide, mindestens 106 Nukleotide, mindestens 107 Nukleotide, mindestens 108 Nukleotide, mindestens 109 Nukleotide oder mindestens 110 Nukleotide in Länge beträgt.
    110. 110. Das Paar von pegRNAs nach Ausführungsform 109, wobei die Deletion mindestens 1 Nukleotid, mindestens 2 Nukleotide, mindestens 3 Nukleotide, mindestens 4 Nukleotide, mindestens 5 Nukleotide, mindestens 6 Nukleotide, mindestens 7 Nukleotide, mindestens 8 Nukleotide, mindestens 9 Nukleotide, mindestens 10 Nukleotide, mindestens 11 Nukleotide, mindestens 12 Nukleotide ist, mindestens 13 Nukleotide, mindestens 14 Nukleotide, mindestens 15 Nukleotide, mindestens 16 Nukleotide, mindestens 17 Nukleotide, mindestens 18 Nukleotide, mindestens 19 Nukleotide, mindestens 20 Nukleotide, mindestens 21 Nukleotide, mindestens 22 Nukleotide, mindestens 23 Nukleotide, mindestens 24 Nukleotide, mindestens 25 Nukleotide, mindestens 26 Nukleotide mindestens 27 Nukleotide, mindestens 28 Nukleotide, mindestens 29 Nukleotide, mindestens 30 Nukleotide, mindestens 31 Nukleotide, mindestens 32 Nukleotide, mindestens 33 Nukleotide, mindestens 34 Nukleotide, mindestens 35 Nukleotide, mindestens 36 Nukleotide, mindestens 37 Nukleotide, mindestens 38 Nukleotide, mindestens 39 Nukleotide, mindestens 40 Nukleotide mindestens 41 Nukleotide, mindestens 42 Nukleotide, mindestens 43 Nukleotide, mindestens 44 Nukleotide, mindestens 45 Nukleotide, mindestens 46 Nukleotide, mindestens 47 Nukleotide, mindestens 48 Nukleotide, mindestens 49 Nukleotide, mindestens 50 Nukleotide, mindestens 51 Nukleotide, mindestens 52 Nukleotide, mindestens 53 Nukleotide, mindestens 54 Nukleotide mindestens 55 Nukleotide, mindestens 56 Nukleotide, mindestens 57 Nukleotide, mindestens 58 Nukleotide, mindestens 59 Nukleotide, mindestens 60 Nukleotide, mindestens 61 Nukleotide, mindestens 62 Nukleotide, mindestens 63 Nukleotide, mindestens 64 Nukleotide, mindestens 65 Nukleotide, mindestens 66 Nukleotide, mindestens 67 Nukleotide, mindestens 68 Nukleotide, mindestens 69 Nukleotide, mindestens 70 Nukleotide, mindestens 71 Nukleotide, mindestens 72 Nukleotide, mindestens 73 Nukleotide, mindestens 74 Nukleotide, mindestens 75 Nukleotide, mindestens 76 Nukleotide, mindestens 77 Nukleotide, mindestens 78 Nukleotide, mindestens 79 Nukleotide, mindestens 80 Nukleotide, mindestens 81 Nukleotide, mindestens 82 Nukleotide mindestens 83 Nukleotide, mindestens 84 Nukleotide, mindestens 85 Nukleotide, mindestens 86 Nukleotide, mindestens 87 Nukleotide, mindestens 88 Nukleotide, mindestens 89 Nukleotide, mindestens 90 Nukleotide, mindestens 91 Nukleotide, mindestens 92 Nukleotide, mindestens 93 Nukleotide, mindestens 94 Nukleotide, mindestens 95 Nukleotide, mindestens 96 Nukleotide, mindestens 97 Nukleotide, mindestens 98 Nukleotide, mindestens 99 Nukleotide, mindestens 100 Nukleotide, mindestens 101 Nukleotide, mindestens 102 Nukleotide, mindestens 103 Nukleotide, mindestens 104 Nukleotide, mindestens 105 Nukleotide, mindestens 106 Nukleotide, mindestens 107 Nukleotide, mindestens 108 Nukleotide, mindestens 109 Nukleotide oder mindestens 110 Nukleotide oder mehr in Länge beträgt.
    111. 111. Das Paar von pegRNAs nach Ausführungsform 110, wobei der Austausch mindestens 1 Nukleotid, mindestens 2 Nukleotide, mindestens 3 Nukleotide, mindestens 4 Nukleotide, mindestens 5 Nukleotide, mindestens 6 Nukleotide, mindestens 7 Nukleotide, mindestens 8 Nukleotide, mindestens 9 Nukleotide, mindestens 10 Nukleotide, mindestens 11 Nukleotide, mindestens 12 Nukleotide ist, mindestens 13 Nukleotide, mindestens 14 Nukleotide, mindestens 15 Nukleotide, mindestens 16 Nukleotide, mindestens 17 Nukleotide, mindestens 18 Nukleotide, mindestens 19 Nukleotide, mindestens 20 Nukleotide, mindestens 21 Nukleotide, mindestens 22 Nukleotide, mindestens 23 Nukleotide, mindestens 24 Nukleotide, mindestens 25 Nukleotide, mindestens 26 Nukleotide mindestens 27 Nukleotide, mindestens 28 Nukleotide, mindestens 29 Nukleotide, mindestens 30 Nukleotide, mindestens 31 Nukleotide, mindestens 32 Nukleotide, mindestens 33 Nukleotide, mindestens 34 Nukleotide, mindestens 35 Nukleotide, mindestens 36 Nukleotide, mindestens 37 Nukleotide, mindestens 38 Nukleotide, mindestens 39 Nukleotide, mindestens 40 Nukleotide mindestens 41 Nukleotide, mindestens 42 Nukleotide, mindestens 43 Nukleotide, mindestens 44 Nukleotide, mindestens 45 Nukleotide, mindestens 46 Nukleotide, mindestens 47 Nukleotide, mindestens 48 Nukleotide, mindestens 49 Nukleotide, mindestens 50 Nukleotide, mindestens 51 Nukleotide, mindestens 52 Nukleotide, mindestens 53 Nukleotide, mindestens 54 Nukleotide mindestens 55 Nukleotide, mindestens 56 Nukleotide, mindestens 57 Nukleotide, mindestens 58 Nukleotide, mindestens 59 Nukleotide, mindestens 60 Nukleotide, mindestens 61 Nukleotide, mindestens 62 Nukleotide, mindestens 63 Nukleotide, mindestens 64 Nukleotide, mindestens 65 Nukleotide, mindestens 66 Nukleotide, mindestens 67 Nukleotide, mindestens 68 Nukleotide, mindestens 69 Nukleotide, mindestens 70 Nukleotide, mindestens 71 Nukleotide, mindestens 72 Nukleotide, mindestens 73 Nukleotide, mindestens 74 Nukleotide, mindestens 75 Nukleotide, mindestens 76 Nukleotide, mindestens 77 Nukleotide, mindestens 78 Nukleotide, mindestens 79 Nukleotide, mindestens 80 Nukleotide, mindestens 81 Nukleotide, mindestens 82 Nukleotide mindestens 83 Nukleotide, mindestens 84 Nukleotide, mindestens 85 Nukleotide, mindestens 86 Nukleotide, mindestens 87 Nukleotide, mindestens 88 Nukleotide, mindestens 89 Nukleotide, mindestens 90 Nukleotide, mindestens 91 Nukleotide, mindestens 92 Nukleotide, mindestens 93 Nukleotide, mindestens 94 Nukleotide, mindestens 95 Nukleotide, mindestens 96 Nukleotide, mindestens 97 Nukleotide, mindestens 98 Nukleotide, mindestens 99 Nukleotide, mindestens 100 Nukleotide, mindestens 101 Nukleotide, mindestens 102 Nukleotide, mindestens 103 Nukleotide, mindestens 104 Nukleotide, mindestens 105 Nukleotide, mindestens 106 Nukleotide, mindestens 107 Nukleotide, mindestens 108 Nukleotide, mindestens 109 Nukleotide oder mindestens 110 Nukleotide oder mehr in Länge beträgt.
    112. 112. Ein Polynukleotid, das ein Paar von pegRNAs nach einer der Ausführungsformen 105- 111 kodiert.
    113. 113. Ein Vektor, der das Polynukleotid nach Ausführungsform 112 zur Exprimierung des Paares von pegRNAs in einer Zelle umfasst.
    114. 114. Eine Zelle, umfassend den Vektor nach Ausführungsform 113.
    115. 115. Eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein Paar von pegRNAs nach einer der Ausführungsformen 105-111, einen Vektor nach Ausführungsform 113 oder eine Zelle nach Ausführungsform 114 und einen pharmazeutischen Hilfsstoff.
    116. 116. Ein Paar von Prime-Editor Komplexen, wobei das Paar Folgendes umfasst:
      1. a. einen ersten Prime-Editor-Komplex, umfassend:
        1. i. einen ersten Prime-Editor, umfassend ein erstes Nukleinsäure-programmierbares DNA- Bindungsprotein (napDNAbp) und ein erstes Polypeptid, das eine RNA-abhängige DNA- Polymerase-Aktivität umfasst; und
        2. ii. eine erste Prime-Editing-Leit-RNA (erste PEgRNA), die an eine erste Zielsequenz auf dem Strang der genomischen DNA-Sequenz stromaufwärts der Zielstelle bindet;
      2. b. einen zweiten Prime-Editor-Komplex, umfassend:
        1. i. einen zweiten Prime-Editor, umfassend ein zweites Nukleinsäure-programmierbares DNA- Bindeprotein (zweites napDNAbp) und ein zweites Polypeptid, das eine RNA-abhängige DNA-Polymerase-Aktivität umfasst; und
        2. ii. eine zweite Prime-Editing-Leit-RNA (zweite PEgRNA), die an eine zweite Zielsequenz auf dem zweiten Strang der genomischen DNA-Sequenz stromabwärts der Zielstelle bindet.
    117. 117. Das Paar von Prime-Editor-Komplexen nach Ausführungsform 116, wobei der Prime- Editor des ersten Prime-Editor-Komplexes, des zweiten Prime-Editor-Komplexes oder sowohl des ersten Prime-Editor-Komplexes als auch des zweiten Prime-Editor-Komplexes ein Fusionsprotein ist, das das napDNAbp und das Polypeptid umfasst, das eine RNA-abhängige DNA-Polymerase-Aktivität aufweist.
    118. 118. Ein Polynukleotid, das ein Paar von Prime-Editor Komplexen nach Ausführungsform 116 oder 117 kodiert.
    119. 119. Ein Vektor, der das Polynukleotid nach Ausführungsform 118 zur Exprimierung des Paares von Prime-Editor-Komplexen in einer Zelle umfasst.
    120. 120. Eine Zelle, umfassend den Vektor nach Ausführungsform 119.
    121. 121. Eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein Paar von Prime-Editor- Komplexen nach Ausführungsform 116 oder 117, einen Vektor nach Ausführungsform 119 oder eine Zelle nach Ausführungsform 120, und einen pharmazeutischen Hilfsstoff.
    122. 122. Das System nach einer der Ausführungsformen 1-62 oder das Verfahren nach einer der Ausführungsformen 68-98, wobei die Integration des Duplexes, der den editierten Abschnitt umfasst, zu einer Insertion, Deletion oder einem Austausch von DNA an der Zielstelle führt.
    123. 123. Das System oder Verfahren nach Ausführungsform 122, wobei die Insertion ein Peptid- Tag ist.
    124. 124. Das System oder Verfahren nach Ausführungsform 123, wobei das Peptid-Tag ein Polyhistidin (z. B. HHHHHH) (SEQ-ID-NR: 252-262), FLAG (z. B. DYKDDDDK) (SEQ- ID-NR: 2), V5 (z. B. GKPIPNPLLGLDST) (SEQ-ID-NR: 3), GCN4, HA (z. B. YPYDVPDYA) (SEQ-ID-NR: 5), Myc (z. B. EQKLISEED) (SEQ-ID-NR: 6) oder GST ist.
    125. 125. Das System oder Verfahren nach Ausführungsform 123, wobei das Peptid-Tag eine Aminosäuresequenz aufweist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ-ID-NR: 1-6, 245-249, 252-262, 264-273, 275-276, 281, 278-288 und 622.
    126. 126. Das System oder Verfahren nach Ausführungsform 122, wobei die Insertion ein Immunoepitop-Tag ist.
    127. 127. Das System oder Verfahren nach Ausführungsform 126, wobei das Immunoepitop-Tag ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Tetanustoxoid (SEQ-ID-NR: 396); Diphtherietoxin-Mutante CRM197 (SEQ-ID-NR: 630); Mumps-Immunoepitop 1 (SEQ-ID- NR: 400); Mumps-Immunoepitop 2 (SEQ-ID-NR: 402); Mumps-Immunoepitop 3 (SEQ-ID- NR: 404); Rötelnvirus (SEQ-ID-NR: 406); Hämagglutinin (SEQ-ID-NR: 408); Neuraminidase (SEQ-ID-NR: 410); TAP1 (SEQ-ID-NR: 412); TAP2 (SEQ-ID-NR: 414); Hämagglutinin- Epitope gegenüber Klasse I HLA (SEQ-ID-NR: 416); Neuraminidase-Epitope gegen Klasse I HLA (SEQ-ID-NR: 418); Hämagglutinin-Epitope gegen Klasse II HLA (SEQ-ID-NR: 420); Neuraminidase-Epitope gegen Klasse II HLA (SEQ-ID-NR: 422); Hämagglutinin-Epitop H5N1-gebundene Klasse I und Klasse II HLA (SEQ-ID-NR: 424); und Neuraminidase-Epitop H5N1-gebundene Klasse I und Klasse II HLA (SEQ-ID-NR: 426).
    128. 128. Das System oder Verfahren nach Ausführungsform 122, wobei die Insertion eine Dimerisierungsdomäne ist.
    129. 129. Das System oder Verfahren nach Ausführungsform 128, wobei die Dimerisierungsdomäne eine Bindungsdomäne für kleine Moleküle von FKBP12 der SEQ-ID- NR: 488, FKBP12-F36V von SEQ-ID-NR: 489, oder Cyclophilin der SEQ-ID-NR: 490 oder 493-494 ist.
    130. 130. Ein System für gleichzeitiges Editieren beider Stränge einer doppelsträngigen DNA- Sequenz an einer zu editierenden Zielstelle, wobei das System Folgendes umfasst:
      1. a) einen ersten Prime-Editor-Komplex, umfassend:
        • i.einen ersten Prime-Editor, umfassend ein erstes Nukleinsäure-programmierbares DNA- Bindungsprotein (erstes napDNAbp) und ein erstes Polypeptid, das eine RNA-abhängige DNA-Polymerase-Aktivität umfasst; und
        • ii.eine erste Prime-Editing-Leit-RNA (erste PEgRNA), die an eine erste Bindungsstelle auf einem ersten Strang der doppelsträngigen DNA-Sequenz stromaufwärts von der zu editierenden Zielstelle bindet;
      2. b) einen zweiten Prime-Editor-Komplex, umfassend:
        • iii.einen zweiten Prime-Editor, umfassend ein zweites Nukleinsäure-programmierbares DNA- Bindeprotein (zweites napDNAbp) und ein zweites Polypeptid, das eine RNA-abhängige DNA-Polymerase-Aktivität umfasst; und
        • iv.eine zweite Prime-Editing-Leit-RNA (zweite PEgRNA), die an eine zweite Bindungsstelle auf einem zweiten Strang der doppelsträngigen DNA-Sequenz stromaufwärts von der zu editierenden Zielstelle bindet;
      3. c) einen dritten Prime-Editor-Komplex, umfassend:
        • iii.einen dritten Prime-Editor, umfassend ein drittes Nukleinsäure-programmierbares DNA- Bindeprotein (drittes napDNAbp) und ein drittes Polypeptid, das eine RNA-abhängige DNA-Polymerase-Aktivität umfasst; und
        • iv.eine dritte Prime-Editing-Leit-RNA (dritte PEgRNA), die an eine dritte Bindungsstelle auf einem ersten Strang der doppelsträngigen DNA-Sequenz stromabwärts von der zu editierenden Zielstelle bindet;
      4. d) einen vierten Prime-Editor-Komplex, umfassend:
        • iii. einen vierten Prime-Editor, umfassend ein viertes Nukleinsäure-programmierbares DNA- Bindeprotein (viertes napDNAbp) und ein viertes Polypeptid, das eine RNA-abhängige DNA-Polymerase-Aktivität umfasst; und
        • iv. eine vierte Prime-Editing-Leit-RNA (vierte PEgRNA), die an eine vierte Bindungsstelle auf einem zweiten Strang der doppelsträngigen DNA-Sequenz stromabwärts von der zu editierenden Zielstelle bindet;
          • wobei die erste PEgRNA ein erstes DNA-Synthese-Templat umfasst, die eine erste einzelsträngige DNA-Sequenz kodiert, die zweite PEgRNA ein zweites DNA-Synthese- Templat umfasst, die eine zweite einzelsträngige DNA-Sequenz kodiert, die dritte PEgRNA ein drittes DNA-Synthese-Templat umfasst, die eine dritte einzelsträngige DNA-Sequenz kodiert, und die vierte PEgRNA ein viertes DNA-Synthese-Templat umfasst, die eine vierte einzelsträngige DNA-Sequenz kodiert;
          • wobei die erste und die dritte einzelsträngige DNA-Sequenz jeweils eine Region der Komplementarität zur anderen umfassen; und wobei die zweite und die vierte einzelsträngige DNA-Sequenz jeweils eine Region der Komplementarität zur anderen umfassen.
    131. 131. Ein System für das Editieren einer oder mehrerer doppelsträngiger DNA-Sequenzen, wobei das System Folgendes umfasst:
      • e) einen ersten Prime-Editor-Komplex, umfassend:
        • iii. einen ersten Prime-Editor, umfassend ein erstes Nukleinsäure-programmierbares DNA- Bindungsprotein (erstes napDNAbp) und ein erstes Polypeptid, das eine RNA-abhängige DNA-Polymerase-Aktivität umfasst; und
        • iv. eine erste Prime-Editing-Leit-RNA (erste PEgRNA), die an eine erste Bindungsstelle auf einem ersten Strang einer ersten doppelsträngigen DNA-Sequenz an einer ersten zu editierenden Zielstelle bindet;
      • f) einen zweiten Prime-Editor-Komplex, umfassend:
        • v. einen zweiten Prime-Editor, umfassend ein zweites Nukleinsäure-programmierbares DNA- Bindeprotein (zweites napDNAbp) und ein zweites Polypeptid, das eine RNA-abhängige DNA-Polymerase-Aktivität umfasst; und
        • vi. eine zweite Prime-Editing-Leit-RNA (zweite PEgRNA), die an eine zweite Bindungsstelle auf einem zweiten Strang der ersten doppelsträngigen DNA-Sequenz an der ersten zu editierenden Zielstelle bindet;
      • g) einen dritten Prime-Editor-Komplex, umfassend:
        • v. einen dritten Prime-Editor, umfassend ein drittes Nukleinsäure-programmierbares DNA- Bindeprotein (drittes napDNAbp) und ein drittes Polypeptid, das eine RNA-abhängige DNA-Polymerase-Aktivität umfasst; und
        • vi. eine dritte Prime-Editing-Leit-RNA (dritte PEgRNA), die an eine erste Bindungsstelle auf einem ersten Strang einer zweiten doppelsträngigen DNA-Sequenz an einer zweiten zu editierenden Zielstelle bindet;
      • h) einen vierten Prime-Editor-Komplex, umfassend:
        • v. einen vierten Prime-Editor, umfassend ein viertes Nukleinsäure-programmierbares DNA- Bindeprotein (viertes napDNAbp) und ein viertes Polypeptid, das eine RNA-abhängige DNA-Polymerase-Aktivität umfasst; und
        • vi. eine vierte Prime-Editing Leit-RNA (vierte PEgRNA), die sich an eine zweite Bindungsstelle auf einem zweiten Strang der zweiten doppelsträngigen DNA-Sequenz an der zweiten zu editierenden Zielstelle bindet;
          • wobei die erste PEgRNA ein erstes DNA-Synthese-Templat umfasst, die eine erste einzelsträngige DNA-Sequenz kodiert, die zweite PEgRNA ein zweites DNA-Synthese- Templat umfasst, die eine zweite einzelsträngige DNA-Sequenz kodiert, die dritte PEgRNA ein drittes DNA-Synthese-Templat umfasst, die eine dritte einzelsträngige DNA-Sequenz kodiert, und die vierte PEgRNA ein viertes DNA-Synthese-Templat umfasst, die eine vierte einzelsträngige DNA-Sequenz kodiert;
          • wobei die erste und die dritte einzelsträngige DNA-Sequenz jeweils eine Region der Komplementarität zur anderen umfassen; und wobei die zweite und die vierte einzelsträngige DNA-Sequenz jeweils eine Region der Komplementarität zur anderen umfassen.
    132. 132. Das System nach Ausführungsform 130 oder 131, wobei der Prime-Editor des ersten Prime-Editor-Komplexes, des zweiten Prime-Editor-Komplexes, des dritten Prime-Editor- Komplexes und/oder des vierten Prime-Editor-Komplexes ein Fusionsprotein ist, das das napDNAbp und das Polypeptid mit einer RNA-abhängigen DNA-Polymerase-Aktivität umfasst.
    133. 133. Das System nach einer der Ausführungsformen 129-132, wobei
      1. (i) die erste PEgRNA ferner eine erste Spacer-Sequenz, einen ersten gRNA-Kern und eine erste Primer-Bindungsstelle umfasst;
      2. (ii) die zweite PEgRNA ferner eine zweite Spacer-Sequenz, einen zweiten gRNA-Kern und eine zweite Primer-Bindungsstelle umfasst;
      3. (iii) die dritte PEgRNA ferner eine dritte Spacer-Sequenz, einen dritten gRNA-Kern und eine dritte Primer-Bindungsstelle umfasst; und
      4. (iv) die vierte PEgRNA eine vierte Spacer-Sequenz, einen vierten gRNA-Kern, ein viertes DNA-Synthese-Templat und eine vierte Primer-Bindungsstelle umfasst.
    134. 134. Das System nach Ausführungsform 131, wobei die Region der Komplementarität der ersten und dritten einzelsträngigen DNA-Sequenz und/oder die Region der Komplementarität der zweiten und vierten einzelsträngigen DNA-Sequenz einen Duplex bilden.
    135. 135. Das System nach Ausführungsform 134, wobei die erste Spacer-Sequenz an die erste Bindungsstelle der ersten doppelsträngigen DNA-Sequenz stromaufwärts von der ersten zu editierenden Zielstelle bindet und die zweite Spacer-Sequenz an die zweite Bindungsstelle auf der ersten doppelsträngigen DNA-Sequenz stromabwärts von der ersten zu editierenden Zielstelle bindet.
    136. 136. Das System nach Ausführungsform 134 oder 135, wobei die dritte Spacer-Sequenz an die erste Bindungsstelle der zweiten doppelsträngigen DNA-Sequenz stromaufwärts von der zweiten zu editierenden Zielstelle bindet und die vierte Spacer-Sequenz an die zweite Bindungsstelle auf der zweiten doppelsträngigen DNA-Sequenz stromabwärts von der zweiten zu editierenden Zielstelle bindet.
    137. 137. Das System nach einer der Ausführungsformen 134-136, wobei die erste und zweite Bindungsstelle zwei Enden einer ersten zusammenhängenden Region der ersten doppelsträngigen DNA definieren.
    138. 138. Das System nach einer der Ausführungsformen 134-137, wobei die dritte und vierte Bindungsstelle zwei Enden einer zweiten zusammenhängenden Region der zweiten doppelsträngigen DNA definieren.
    139. 139. Das System nach Ausführungsform 138, wobei die zusammenhängende Region zwischen der ersten und zweiten Bindungsstelle oder der dritten und vierten Bindungsstelle mindestens 10 Nukleobasenpaare, mindestens 11 Nukleobasenpaare, mindestens 12 Nukleobasenpaare, mindestens 13 Nukleobasenpaare, mindestens 14 Nukleobasenpaare, mindestens 15 Nukleobasenpaare, mindestens 16 Nukleobasenpaare, mindestens 17 Nukleobasenpaare, mindestens 18 Nukleobasenpaare, mindestens 19 Nukleobasenpaare, mindestens 20 Nukleobasenpaare, mindestens 21 Nukleobasenpaare, mindestens 22 Nukleobasenpaare, mindestens 23 Nukleobasenpaare, mindestens 24 Nukleobasenpaare, mindestens 25 Nukleobasenpaare, mindestens 26 Nukleobasenpaare, mindestens 27 Nukleobasenpaare, mindestens 28 Nukleobasenpaare, mindestens 29 Nukleobasenpaare, mindestens 30 Nukleobasenpaare, mindestens 31 Nukleobasenpaare, mindestens 32 Nukleobasenpaare, mindestens 33 Nukleobasenpaare, mindestens 34 Nukleobasenpaare, mindestens 35 Nukleobasenpaare, mindestens 36 Nukleobasenpaare, mindestens 37 Nukleobasenpaare, mindestens 37 Nukleobasenpaare, mindestens 38 Nukleobasenpaare, mindestens 39 Nukleobasenpaare oder mindestens 40 Nukleobasenpaare, mindestens 41 Nukleotide, mindestens 42 Nukleotide, mindestens 43 Nukleotide, mindestens 44 Nukleotide, mindestens 45 Nukleotide, mindestens 46 Nukleotide, mindestens 47 Nukleotide, mindestens 48 Nukleotide, mindestens 49 Nukleotide, mindestens 50 Nukleotide, mindestens 51 Nukleotide, mindestens 52 Nukleotide, mindestens 53 Nukleotide, mindestens 54 Nukleotide, mindestens 55 Nukleotide, mindestens 56 Nukleotide, mindestens 57 Nukleotide, mindestens 58 Nukleotide, mindestens 59 Nukleotide, mindestens 60 Nukleotide, mindestens 61 Nukleotide, mindestens 62 Nukleotide, mindestens 63 Nukleotide, mindestens 64 Nukleotide, mindestens 65 Nukleotide, mindestens 66 Nukleotide, mindestens 67 Nukleotide, mindestens 68 Nukleotide, mindestens 69 Nukleotide, mindestens 70 Nukleotide, mindestens 71 Nukleotide, mindestens 72 Nukleotide, mindestens 73 Nukleotide, mindestens 74 Nukleotide, mindestens 75 Nukleotide, mindestens 76 Nukleotide, mindestens 77 Nukleotide, mindestens 78 Nukleotide, mindestens 79 Nukleotide, mindestens 80 Nukleotide, mindestens 81 Nukleotide, mindestens 82 Nukleotide mindestens 83 Nukleotide, mindestens 84 Nukleotide, mindestens 85 Nukleotide, mindestens 86 Nukleotide, mindestens 87 Nukleotide, mindestens 88 Nukleotide, mindestens 89 Nukleotide, mindestens 90 Nukleotide, mindestens 91 Nukleotide, mindestens 92 Nukleotide, mindestens 93 Nukleotide, mindestens 94 Nukleotide, mindestens 95 Nukleotide, mindestens 96 Nukleotide, mindestens 97 Nukleotide, mindestens 98 Nukleotide, mindestens 99 Nukleotide, mindestens 100 Nukleotide, mindestens 101 Nukleotide, mindestens 102 Nukleotide, mindestens 103 Nukleotide, mindestens 104 Nukleotide, mindestens 105 Nukleotide, mindestens 106 Nukleotide, mindestens 107 Nukleotide, mindestens 108 Nukleotide, mindestens 109 Nukleotide oder mindestens 110 Nukleotide in Länge beträgt.
    140. 140. Das System nach einer der Ausführungsformen 134-140, wobei die Region der Komplementarität der ersten einzelsträngigen DNA-Sequenz und der zweiten einzelsträngigen DNA-Sequenz und/oder die Region der Komplementarität der zweiten einzelsträngigen DNA- Sequenz und der vierten einzelsträngigen DNA-Sequenz einen Duplex bilden.
    141. 141. Das System nach Ausführungsform 140, wobei der Duplex in die erste doppelsträngige DNA und/oder die zweite doppelsträngige DNA eingebaut ist.
    142. 142. Das System nach einer der Ausführungsformen 134-141, wobei das System zu einem Austausch der ersten zusammenhängenden Region durch die zweite zusammenhängende Region in der ersten doppelsträngigen DNA führt.
    143. 143. Das System nach einer der Ausführungsformen 134-141, wobei das System zu einem Austausch der ersten zusammenhängenden Region und der zweiten zusammenhängenden Region zwischen der ersten doppelsträngigen DNA und der zweiten doppelsträngigen DNA führt.
    144. 144. Das System nach einer der Ausführungsformen 130-143, wobei der erste Prime-Editor- Komplex, der zweite Prime-Editor-Komplex, der dritte Prime-Editor-Komplex und der vierte Prime-Editor-Komplex denselben Prime-Editor umfassen.
    145. 145. Das System nach einer der Ausführungsformen 130-144, wobei das erste, zweite, dritte und vierte Polypeptid, das eine RNA-abhängige DNA-Polymerase-Aktivität umfasst, dasselbe ist.
    146. 146. Das System nach einer der Ausführungsformen 130-145, wobei das erste, zweite, dritte und/oder vierte napDNAbp eine Cas9-Domäne oder eine Variante davon ist.
    147. 147. Das System nach einer der Ausführungsformen 130-146, wobei das erste, zweite, dritte und/oder vierte napDNAbp eine nukleaseaktive Cas9-Domäne, eine nuklease-inaktive Cas9- Domäne oder eine Cas9-Nickase-Domäne oder eine Variante davon ist.
    148. 148. Das System nach einer der Ausführungsformen 130-147, wobei das erste, zweite, dritte und/oder vierte napDNAbp ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Cas9, Cas12e, Cas12d, Cas12a, Cas12b1, Cas13a, Cas12c und Argonaut.
    149. 149. Das System nach einer der Ausführungsformen 130-148, wobei das erste, zweite, dritte und/oder vierte napDNAbp eine Nickase-Aktivität aufweist.
    150. 150. Das System nach einer der Ausführungsformen 130-149, wobei das erste, zweite, dritte und/oder vierte napDNAbp eine Aminosäuresequenz einer der SEQ-ID-NR: 2-65 umfasst, oder eine Aminosäuresequenz, die mindestens 80 %, 85 %, 90 %, 95 % oder 99 % Sequenzidentität mit einer der SEQ-ID-NR: 2-65 aufweist.
    151. 151. Das System nach einer der Ausführungsformen 130-150, wobei das das erste, zweite, dritte und/oder vierte Polypeptid, das eine RNA-abhängige DNA-Polymerase-Aktivität aufweist, eine reverse Transkriptase ist.
    152. 152. Das System nach einer der Ausführungsformen 130-151, wobei das erste, zweite, dritte und/oder vierte Polypeptid mit einer RNA-abhängigen DNA-Polymerase-Aktivität eine Aminosäuresequenz einer der SEQ-ID-NR: 37, 68-79, 82-98, 81, 98 und 110 umfasst, oder eine Nukleotidsequenz, die mindestens 80 %, 85 %, 90 %, 95 % oder 99 % Sequenzidentität mit einer der SEQ-ID-NR: 37, 68-79, 82-98, 81, 98 und 110 aufweist.
    153. 153. Das System nach einer der Ausführungsformen 130-152, wobei
      • (i) der erste Prime-Editor ferner einen Linker umfasst, der das erste napDNAbp und das erste Polypeptid, das die RNA-abhängige DNA-Polymerase-Aktivität aufweist, miteinander verbindet;
      • (ii) der zweite Prime-Editor ferner einen Linker umfasst, der das zweite napDNAbp und das zweite Polypeptid, das die RNA-abhängige DNA-Polymerase-Aktivität aufweist, miteinander verbindet;
      • (iii) der dritte Prime-Editor ferner einen Linker umfasst, der das dritte napDNAbp und das dritte Polypeptid, das die RNA-abhängige DNA-Polymerase-Aktivität aufweist, miteinander verbindet; und/oder
      • (iv) der vierte Prime-Editor ferner einen Linker umfasst, der das vierte napDNAbp und das vierte Polypeptid, das die RNA-abhängige DNA-Polymerase-Aktivität aufweist, miteinander verbindet.
    154. 154. Das System nach Ausführungsform 153, wobei der Linker eine Aminosäuresequenz einer der SEQ-ID-NR: 119-128 umfasst, oder eine Aminosäuresequenz, die mindestens 80 %, 85 %, 90 %, 95 % oder 99 % Sequenzidentität mit einer der SEQ-ID-NR: 119-128 aufweist.
    155. 155. Das System nach Ausführungsform 153 oder 154, wobei der Linker 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 38, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 oder 50 Aminosäuren in Länge beträgt.
    156. 156. Das System nach einer der Ausführungsformen 130-155, wobei die erste, zweite, dritte und/oder vierte PEgRNA eine Nukleotidsequenz mit einer der SEQ-ID-NR: 192-203 umfasst, oder eine Aminosäuresequenz, die mindestens 80 %, 85 %, 90 %, 95 % oder 99 % Sequenzidentität mit einer der SEQ-ID-NR: 192-203 aufweist.
    157. 157. Das System nach einer der Ausführungsformen 130-156, wobei die erste Spacer- Sequenz an eine erste Bindungsstelle auf einem ersten Strang der doppelsträngigen DNA- Sequenz stromaufwärts von der zu editierenden Zielstelle bindet.
    158. 158. Das System nach einer der Ausführungsformen 130-157, wobei die zweite Spacer- Sequenz des zweiten Prime-Editor-Komplexes an eine zweite Bindungsstelle auf einem zweiten Strang der doppelsträngigen DNA-Sequenz stromaufwärts von der zu editierenden Zielstelle bindet.
    159. 159. Das System nach einer der Ausführungsformen 130-158, wobei die dritte Spacer- Sequenz an eine dritte Bindungsstelle auf einem ersten Strang der doppelsträngigen DNA- Sequenz stromabwärts von der zu editierenden Zielstelle bindet.
    160. 160. Das System nach einer der Ausführungsformen 130-159, wobei die vierte Spacer- Sequenz des vierten Prime-Editor-Komplexes an eine vierte Bindungsstelle auf einem zweiten Strang der doppelsträngigen DNA-Sequenz stromabwärts von der zu editierenden Zielstelle bindet.
    161. 161. Das System nach Ausführungsform 160, wobei die Bindung der Spacer-Sequenz des ersten und zweiten Prime-Editor-Komplexes in Gegenwart einer PAM-Sequenz zum Nicking des ersten bzw. zweiten Stranges an einer Nickstelle proximal zu den PAM-Sequenzen auf jedem Strang durch die ersten und/oder zweiten napDNAbps jedes ersten und zweiten Prime- Editor-Komplexes führt.
    162. 162. Das System nach Ausführungsform 161, wobei die Bindung der Spacer-Sequenz der dritten und vierten Prime-Editor-Komplexe in Gegenwart einer PAM-Sequenz zum Nicking des ersten bzw. zweiten Strangs an einer Nickstelle proximal zu den PAM-Sequenzen auf jedem Strang durch die dritten und/oder vierten napDNAbps jedes dritten und vierten Prime- Editor-Komplexes führt.
    163. 163. Das System nach Ausführungsform 160 oder 162, wobei die ersten und dritten Bindungsstellen oder die zweiten und vierten Bindungsstellen zwei Enden einer zusammenhängenden Region doppelsträngiger DNA definieren.
    164. 164. Das System nach Ausführungsform 163, wobei die zusammenhängende Region zwischen der ersten und dritten Bindungsstelle oder der zweiten und vierten Bindungsstelle mindestens 10 Nukleobasenpaare, mindestens 11 Nukleobasenpaare, mindestens 12 Nukleobasenpaare, mindestens 13 Nukleobasenpaare, mindestens 14 Nukleobasenpaare, mindestens 15 Nukleobasenpaare, mindestens 16 Nukleobasenpaare, mindestens 17 Nukleobasenpaare, mindestens 18 Nukleobasenpaare, mindestens 19 Nukleobasenpaare, mindestens 20 Nukleobasenpaare, mindestens 21 Nukleobasenpaare, mindestens 22 Nukleobasenpaare, mindestens 23 Nukleobasenpaare, mindestens 24 Nukleobasenpaare, mindestens 25 Nukleobasenpaare, mindestens 26 Nukleobasenpaare, mindestens 27 Nukleobasenpaare, mindestens 28 Nukleobasenpaare, mindestens 29 Nukleobasenpaare, mindestens 30 Nukleobasenpaare, mindestens 31 Nukleobasenpaare, mindestens 32 Nukleobasenpaare, mindestens 33 Nukleobasenpaare, mindestens 34 Nukleobasenpaare, mindestens 35 Nukleobasenpaare, mindestens 36 Nukleobasenpaare, mindestens 37 Nukleobasenpaare, mindestens 37 Nukleobasenpaare, mindestens 38 Nukleobasenpaare, mindestens 39 Nukleobasenpaare oder mindestens 40 Nukleobasenpaare, mindestens 41 Nukleotide, mindestens 42 Nukleotide, mindestens 43 Nukleotide, mindestens 44 Nukleotide, mindestens 45 Nukleotide, mindestens 46 Nukleotide, mindestens 47 Nukleotide, mindestens 48 Nukleotide, mindestens 49 Nukleotide, mindestens 50 Nukleotide, mindestens 51 Nukleotide, mindestens 52 Nukleotide, mindestens 53 Nukleotide, mindestens 54 Nukleotide, mindestens 55 Nukleotide, mindestens 56 Nukleotide, mindestens 57 Nukleotide, mindestens 58 Nukleotide, mindestens 59 Nukleotide, mindestens 60 Nukleotide, mindestens 61 Nukleotide, mindestens 62 Nukleotide, mindestens 63 Nukleotide, mindestens 64 Nukleotide, mindestens 65 Nukleotide, mindestens 66 Nukleotide, mindestens 67 Nukleotide, mindestens 68 Nukleotide, mindestens 69 Nukleotide, mindestens 70 Nukleotide, mindestens 71 Nukleotide, mindestens 72 Nukleotide, mindestens 73 Nukleotide, mindestens 74 Nukleotide, mindestens 75 Nukleotide, mindestens 76 Nukleotide, mindestens 77 Nukleotide, mindestens 78 Nukleotide, mindestens 79 Nukleotide, mindestens 80 Nukleotide, mindestens 81 Nukleotide, mindestens 82 Nukleotide mindestens 83 Nukleotide, mindestens 84 Nukleotide, mindestens 85 Nukleotide, mindestens 86 Nukleotide, mindestens 87 Nukleotide, mindestens 88 Nukleotide, mindestens 89 Nukleotide, mindestens 90 Nukleotide, mindestens 91 Nukleotide, mindestens 92 Nukleotide, mindestens 93 Nukleotide, mindestens 94 Nukleotide, mindestens 95 Nukleotide, mindestens 96 Nukleotide, mindestens 97 Nukleotide, mindestens 98 Nukleotide, mindestens 99 Nukleotide, mindestens 100 Nukleotide, mindestens 101 Nukleotide, mindestens 102 Nukleotide, mindestens 103 Nukleotide, mindestens 104 Nukleotide, mindestens 105 Nukleotide, mindestens 106 Nukleotide, mindestens 107 Nukleotide, mindestens 108 Nukleotide, mindestens 109 Nukleotide oder mindestens 110 Nukleotide in Länge beträgt.
    165. 165. Das System nach einer der Ausführungsformen 130-164, wobei die Region der Komplementarität der ersten einzelsträngigen DNA-Sequenz und der dritten einzelsträngigen DNA-Sequenz und/oder die Region der Komplementarität der zweiten einzelsträngigen DNA- Sequenz und der vierten einzelsträngigen DNA-Sequenz einen Duplex bilden.
    166. 166. Das System nach Ausführungsform 164 oder 165, wobei die zusammenhängende Region durch den Duplex ausgetauscht wird.
    167. 167. Das System nach Ausführungsform 164 oder 165, wobei der Duplex in die doppelsträngige DNA an der Zielstelle eingebaut ist.
    168. 168. Das System nach einer Ausführungsform der Ausführungsformen 130-167, wobei das erste, zweite, dritte und/oder vierte DNA-Synthese-Templat mindestens 1 Nukleotid, mindestens 2 Nukleotide, mindestens 3 Nukleotide, mindestens 4 Nukleotide, mindestens 5 Nukleotide, mindestens 6 Nukleotide, mindestens 7 Nukleotide, mindestens 8 Nukleotide, mindestens 9 Nukleotide, mindestens 10 Nukleotide, mindestens 11 Nukleotide, mindestens 12 Nukleotide ist, mindestens 13 Nukleotide, mindestens 14 Nukleotide, mindestens 15 Nukleotide, mindestens 16 Nukleotide, mindestens 17 Nukleotide, mindestens 18 Nukleotide, mindestens 19 Nukleotide, mindestens 20 Nukleotide, mindestens 21 Nukleotide, mindestens 22 Nukleotide, mindestens 23 Nukleotide, mindestens 24 Nukleotide, mindestens 25 Nukleotide, mindestens 26 Nukleotide mindestens 27 Nukleotide, mindestens 28 Nukleotide, mindestens 29 Nukleotide, mindestens 30 Nukleotide, mindestens 31 Nukleotide, mindestens 32 Nukleotide, mindestens 33 Nukleotide, mindestens 34 Nukleotide, mindestens 35 Nukleotide, mindestens 36 Nukleotide, mindestens 37 Nukleotide, mindestens 38 Nukleotide, mindestens 39 Nukleotide, mindestens 40 Nukleotide mindestens 41 Nukleotide, mindestens 42 Nukleotide, mindestens 43 Nukleotide, mindestens 44 Nukleotide, mindestens 45 Nukleotide, mindestens 46 Nukleotide, mindestens 47 Nukleotide, mindestens 48 Nukleotide, mindestens 49 Nukleotide, mindestens 50 Nukleotide, mindestens 51 Nukleotide, mindestens 52 Nukleotide, mindestens 53 Nukleotide, mindestens 54 Nukleotide mindestens 55 Nukleotide, mindestens 56 Nukleotide, mindestens 57 Nukleotide, mindestens 58 Nukleotide, mindestens 59 Nukleotide, mindestens 60 Nukleotide, mindestens 61 Nukleotide, mindestens 62 Nukleotide, mindestens 63 Nukleotide, mindestens 64 Nukleotide, mindestens 65 Nukleotide, mindestens 66 Nukleotide, mindestens 67 Nukleotide, mindestens 68 Nukleotide, mindestens 69 Nukleotide, mindestens 70 Nukleotide, mindestens 71 Nukleotide, mindestens 72 Nukleotide, mindestens 73 Nukleotide, mindestens 74 Nukleotide, mindestens 75 Nukleotide, mindestens 76 Nukleotide, mindestens 77 Nukleotide, mindestens 78 Nukleotide, mindestens 79 Nukleotide, mindestens 80 Nukleotide, mindestens 81 Nukleotide, mindestens 82 Nukleotide mindestens 83 Nukleotide, mindestens 84 Nukleotide, mindestens 85 Nukleotide, mindestens 86 Nukleotide, mindestens 87 Nukleotide, mindestens 88 Nukleotide, mindestens 89 Nukleotide, mindestens 90 Nukleotide, mindestens 91 Nukleotide, mindestens 92 Nukleotide, mindestens 93 Nukleotide, mindestens 94 Nukleotide, mindestens 95 Nukleotide, mindestens 96 Nukleotide, mindestens 97 Nukleotide, mindestens 98 Nukleotide, mindestens 99 Nukleotide, mindestens 100 Nukleotide, mindestens 101 Nukleotide, mindestens 102 Nukleotide, mindestens 103 Nukleotide, mindestens 104 Nukleotide, mindestens 105 Nukleotide, mindestens 106 Nukleotide, mindestens 107 Nukleotide, mindestens 108 Nukleotide, mindestens 109 Nukleotide oder mindestens 110 Nukleotide in Länge beträgt.
    169. 169. Das System nach einer der Ausführungsformen 130-168, wobei die erste einzelsträngige DNA-Sequenz und die zweite einzelsträngige DNA-Sequenz und/oder die dritte einzelsträngige DNA-Sequenz und die vierte einzelsträngige DNA-Sequenz die gleichen Längen aufweisen.
    170. 170. Das System nach einer der Ausführungsformen 130-168, wobei die erste einzelsträngige DNA-Sequenz und die zweite einzelsträngige DNA-Sequenz und/oder die dritte einzelsträngige DNA-Sequenz und die vierte einzelsträngige DNA-Sequenz unterschiedliche Längen aufweisen.
    171. 171. Das System nach einer der Ausführungsformen 130-170, wobei die Region der Komplementarität der ersten, zweiten, dritten und/oder vierten einzelsträngigen DNA-Sequenz mindestens 99 %, mindestens 95 %, mindestens 90 %, mindestens 85 %, mindestens 80 %, mindestens 75 %, mindestens 70 %, mindestens 65 %, mindestens 60 %, mindestens 55 %, mindestens 50 %, mindestens 45 %, mindestens 40 %, mindestens 35 %, mindestens 30 %, mindestens 25 %, mindestens 20 %, mindestens 15 % oder mindestens 10 % der Gesamtlänge der ersten einzelsträngigen DNA-Sequenz und der dritten einzelsträngigen DNA-Sequenz oder der zweiten einzelsträngigen DNA-Sequenz und der vierten einzelsträngigen DNA-Sequenz beträgt.
    172. 172. Das System nach einer der Ausführungsformen 130-171, wobei die Region der Komplementarität der ersten, zweiten, dritten und/oder vierten einzelsträngigen DNA-Sequenz mindestens 5 Nukleotide, mindestens 6 Nukleotide, mindestens 7 Nukleotide, mindestens 8 Nukleotide, mindestens 9 Nukleotide, mindestens 10 Nukleotide, mindestens 11 Nukleotide, mindestens 12 Nukleotide, mindestens 13 Nukleotide, mindestens 14 Nukleotide, mindestens 15 Nukleotide, mindestens 16 Nukleotide, mindestens 17 Nukleotide, mindestens 18 Nukleotide, mindestens 19 Nukleotide, mindestens 20 Nukleotide, mindestens 21 Nukleotide, mindestens 22 Nukleotide, mindestens 23 Nukleotide, mindestens 24 Nukleotide, mindestens 25 Nukleotide, mindestens 26 Nukleotide, mindestens 27 Nukleotide, mindestens 28 Nukleotide, mindestens 29 Nukleotide, mindestens 30 Nukleotide mindestens 31 Nukleotide, mindestens 32 Nukleotide, mindestens 33 Nukleotide, mindestens 34 Nukleotide, mindestens 35 Nukleotide, mindestens 36 Nukleotide, mindestens 37 Nukleotide, mindestens 38 Nukleotide, mindestens 39 Nukleotide, mindestens 40 Nukleotide, mindestens 41 Nukleotide, mindestens 42 Nukleotide, mindestens 43 Nukleotide, mindestens 44 Nukleotide mindestens 45 Nukleotide, mindestens 46 Nukleotide, mindestens 47 Nukleotide, mindestens 48 Nukleotide, mindestens 49 Nukleotide, mindestens 50 Nukleotide, mindestens 51 Nukleotide, mindestens 52 Nukleotide, mindestens 53 Nukleotide, mindestens 54 Nukleotide, mindestens 55 Nukleotide, mindestens 56 Nukleotide, mindestens 57 Nukleotide, mindestens 58 Nukleotide, mindestens 59 Nukleotide, mindestens 60 Nukleotide, mindestens 61 Nukleotide, mindestens 62 Nukleotide, mindestens 63 Nukleotide, mindestens 64 Nukleotide, mindestens 65 Nukleotide, mindestens 66 Nukleotide, mindestens 67 Nukleotide, mindestens 68 Nukleotide, mindestens 69 Nukleotide, mindestens 70 Nukleotide, mindestens 71 Nukleotide, mindestens 72 Nukleotide, mindestens 73 Nukleotide, mindestens 74 Nukleotide, mindestens 75 Nukleotide, mindestens 76 Nukleotide, mindestens 77 Nukleotide, mindestens 78 Nukleotide, mindestens 79 Nukleotide, mindestens 80 Nukleotide, mindestens 81 Nukleotide, mindestens 82 Nukleotide, mindestens 83 Nukleotide, mindestens 84 Nukleotide, mindestens 85 Nukleotide, mindestens 86 Nukleotide, mindestens 87 Nukleotide, mindestens 88 Nukleotide, mindestens 89 Nukleotide, mindestens 90 Nukleotide, mindestens 91 Nukleotide, mindestens 92 Nukleotide, mindestens 93 Nukleotide, mindestens 94 Nukleotide, mindestens 95 Nukleotide, mindestens 96 Nukleotide, mindestens 97 Nukleotide, mindestens 98 Nukleotide, mindestens 99 Nukleotide, mindestens 100 Nukleotide, mindestens 101 Nukleotide, mindestens 102 Nukleotide, mindestens 103 Nukleotide, mindestens 104 Nukleotide, mindestens 105 Nukleotide, mindestens 106 Nukleotide, mindestens 107 Nukleotide, mindestens 108 Nukleotide, mindestens 109 Nukleotide oder mindestens 110 Nukleotide in Länge beträgt und entweder kleiner oder gleich der Länge der ersten einzelsträngigen DNA-Sequenz und der dritten einzelsträngigen DNA-Sequenz und der zweiten einzelsträngigen DNA-Sequenz und der vierten einzelsträngigen DNA-Sequenz ist.
    173. 173. Das System nach einer der Ausführungsformen 130-172, wobei die erste, zweite, dritte und vierte einzelsträngige DNA-Sequenz jeweils einzelsträngige DNA-Stränge sind, die 3'- Enden aufweisen.
    174. 174. Das System nach Ausführungsform 167, wobei der Einbau des Duplex, der den editierten Abschnitt umfasst, zu einer Insertion, Deletion oder einem Austausch von DNA an der Zielstelle führt.
    175. 175. Ein Polynukleotid, das den ersten, zweiten, dritten und vierten Prime-Editor nach einer der Ausführungsformen 130-174 kodiert.
    176. 176. Ein Polynukleotid, das die erste, zweite, dritte und vierte PEgRNA nach einer der Ausführungsformen 130-174 kodiert.
    177. 177. Ein Vektor, der ein Polynukleotid nach Ausführungsform 175 oder 176 umfasst.
    178. 178. Eine Zelle, die ein Polynukleotid nach Ausführungsform 175 oder 176 oder einen Vektor nach Ausführungsform 177 umfasst.
    179. 179. Eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein Polynukleotid nach Ausführungsform 175 oder 176, einen Vektor nach Ausführungsform 177 oder eine Zelle nach Ausführungsform 178 und einen pharmazeutischen Hilfsstoff.
    180. 180. Ein Kit, umfassend ein Polynukleotid nach Ausführungsform 175 oder 176 oder einen Vektor nach Ausführungsform 177 und Anweisungen für gleichzeitiges Editieren beider Stränge einer doppelsträngigen DNA-Sequenz an einer zu editierenden Zielstelle.
    181. 181. Ein Verfahren für gleichzeitiges Editieren eines ersten und eines zweiten komplementären Strangs einer doppelsträngigen DNA-Sequenz an einer Zielstelle, wobei das Verfahren das Inkontaktbringen der doppelsträngigen DNA-Sequenz mit einem Paar von Prime-Editor-Komplexen umfasst, wobei das Paar Folgendes umfasst:
      • (a) einen ersten Prime-Editor-Komplex, umfassend:
        1. i. einen ersten Prime-Editor, umfassend ein erstes Nukleinsäure-programmierbares DNA- Bindungsprotein (erstes napDNAbp) und ein erstes Polypeptid, das eine RNA-abhängige DNA-Polymerase-Aktivität umfasst; und
        2. ii. eine erste Prime-Editing-Leit-RNA (erste PEgRNA), die an eine erste Zielsequenz auf dem ersten Strang der genomischen DNA-Sequenz stromaufwärts der Zielstelle bindet;
      • (b) einen zweiten Prime-Editor-Komplex, umfassend:
        1. i. einen zweiten Prime-Editor, umfassend ein zweites Nukleinsäure-programmierbares DNA- Bindeprotein (zweites napDNAbp) und ein zweites Polypeptid, das eine RNA-abhängige DNA-Polymerase-Aktivität umfasst; und
        2. ii. eine zweite Prime-Editing-Leit-RNA (zweite PEgRNA), die an eine zweite Zielsequenz auf dem zweiten Strang der genomischen DNA-Sequenz stromaufwärts der;
      • (c) einen dritten Prime-Editor-Komplex, umfassend:
        1. i. einen dritten Prime-Editor, umfassend ein drittes Nukleinsäure-programmierbares DNA- Bindeprotein (drittes napDNAbp) und ein drittes Polypeptid, das eine RNA-abhängige DNA-Polymerase-Aktivität umfasst; und
        2. ii. eine dritte Prime-Editing-Leit-RNA (dritte PEgRNA), die an eine erste Zielsequenz auf dem dritten Strang der genomischen DNA-Sequenz stromabwärts der Zielstelle bindet;
      • (d) einen vierten Prime-Editor-Komplex, umfassend:
        1. i. einen vierten Prime-Editor, umfassend ein zweites Nukleinsäure-programmierbares DNA- Bindeprotein (viertes napDNAbp) und ein viertes Polypeptid, das eine RNA-abhängige DNA-Polymerase-Aktivität umfasst; und
        2. ii. eine vierte Prime-Editing-Leit-RNA (vierte PEgRNA), die an eine zweite Zielsequenz auf dem vierten Strang der genomischen DNA-Sequenz stromabwärts der Zielstelle bindet; wobei der erste Prime-Editor-Komplex einen ersten Nick an der ersten Zielsequenz und die anschließende Polymerisation einer ersten einzelsträngigen DNA-Sequenz verursacht, die ein 3'-Ende von dem verfügbaren 5'-Ende aufweist, das durch den ersten Nick gebildet wird;
      wobei der zweite Prime-Editor-Komplex einen zweiten Nick an der zweiten Zielsequenz und die anschließende Polymerisation einer zweiten einzelsträngigen DNA-Sequenz verursacht, die ein 3'-Ende von dem verfügbaren 5'-Ende aufweist, das durch den zweiten Nick gebildet wird; wobei der dritte Prime-Editor-Komplex einen dritten Nick an der dritten Zielsequenz und die anschließende Polymerisation einer dritten einzelsträngigen DNA-Sequenz verursacht, die ein 3'-Ende von dem verfügbaren 5'-Ende aufweist, das durch den dritten Nick gebildet wird; wobei der vierte Prime-Editor-Komplex einen vierten Nick an der vierten Zielsequenz und die anschließende Polymerisation einer vierten einzelsträngigen DNA-Sequenz verursacht, die ein 3'-Ende von dem verfügbaren 5'-Ende aufweist, das durch den vierten Nick gebildet wird; wobei die erste einzelsträngige DNA-Sequenz und die zweite einzelsträngige DNA-Sequenz über mindestens eine Region der Komplementarität umgekehrt komplementär sind und einen Duplex bilden, wobei der Duplex die genickten ersten und zweiten komplementären Stränge der doppelsträngigen DNA-Sequenz ersetzt; und wobei die dritte einzelsträngige DNA-Sequenz und die vierte einzelsträngige DNA-Sequenz über mindestens eine Region der Komplementarität umgekehrt komplementär sind und einen Duplex bilden, wobei der Duplex die genickten ersten und zweiten komplementären Stränge der doppelsträngigen DNA-Sequenz ersetzt.
    182. 182. Das Verfahren nach Ausführungsform 181, wobei der Prime-Editor des ersten Prime- Editor-Komplexes, des zweiten Prime-Editor-Komplexes, des dritten Prime-Editor- Komplexes und/oder des vierten Prime-Editor-Komplexes ein Fusionsprotein ist, das das napDNAbp und das Polypeptid mit einer RNA-abhängigen DNA-Polymerase-Aktivität umfasst.
    183. 183. Das Verfahren nach Ausführungsform 181 oder 182, wobei der erste Prime-Editor- Komplex, der zweite Prime-Editor-Komplex, der dritte Prime-Editor-Komplex und der vierte Prime-Editor-Komplex denselben Prime-Editor umfassen.
    184. 184. Das Verfahren nach Ausführungsform 181 oder 182, wobei der erste, zweite, dritte und/oder vierte Prime-Editor-Komplex einen unterschiedlichen Prime-Editor umfasst.
    185. 185. Das Verfahren nach einer der Ausführungsformen 181-184, wobei das erste, zweite, dritte und/oder vierte napDNAbp eine Cas9-Domäne oder eine Variante davon ist.
    186. 186. Das Verfahren nach einer der Ausführungsformen 181-185, wobei das erste, zweite, dritte und/oder vierte napDNAbp eine nukleaseaktive Cas9-Domäne, eine nuklease-inaktive Cas9-Domäne oder eine Cas9-Nickase-Domäne oder Variante davon ist.
    187. 187. Das Verfahren nach einer der Ausführungsformen 181-184, wobei das erste, zweite, dritte und/oder vierte napDNAbp ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Cas9, Cas12e, Cas12d, Cas12a, Cas12b1, Cas13a, Cas12c.
    188. 188. Das Verfahren nach einer der Ausführungsformen 181-187, wobei das erste, zweite, dritte und/oder vierte napDNAbp eine Nickase-Aktivität aufweist.
    189. 189. Das Verfahren nach einer der Ausführungsformen 181-188, wobei das erste, zweite, dritte und/oder vierte napDNAbp eine Aminosäuresequenz einer der SEQ-ID-NR: 2-65 umfasst, oder eine Aminosäuresequenz, die mindestens 80 %, 85 %, 90 %, 95 % oder 99 % Sequenzidentität mit einer der SEQ-ID-NR: 2-65 aufweist.
    190. 190. Das Verfahren nach einer der Ausführungsformen 181-189, wobei das das erste, zweite, dritte und/oder vierte Polypeptid, das eine RNA-abhängige DNA-Polymerase-Aktivität aufweist, eine reverse Transkriptase ist.
    191. 191. Das Verfahren nach einer der Ausführungsformen 181-190, wobei das erste, zweite, dritte und/oder vierte Polypeptid mit einer RNA-abhängigen DNA-Polymerase-Aktivität eine Aminosäuresequenz einer der SEQ-ID-NR: 37, 68-79, 82-98, 81, 98 und 110 umfasst, oder eine Nukleotidsequenz, die mindestens 80 %, 85 %, 90 %, 95 % oder 99 % Sequenzidentität mit einer der SEQ-ID-NR: 37, 68-79, 82-98, 81, 98, und 110 aufweist.
    192. 192. Das Verfahren nach einer der Ausführungsformen 181-191, wobei
      • (i) der erste Prime-Editor ferner einen Linker umfasst, der das erste napDNAbp und das erste Polypeptid, das die RNA-abhängige DNA-Polymerase-Aktivität aufweist, miteinander verbindet;
      • (ii) der zweite Prime-Editor ferner einen Linker umfasst, der das zweite napDNAbp und das zweite Polypeptid, das die RNA-abhängige DNA-Polymerase-Aktivität aufweist, miteinander verbindet;
      • (iii) der dritte Prime-Editor ferner einen Linker umfasst, der das dritte napDNAbp und das dritte Polypeptid, das die RNA-abhängige DNA-Polymerase-Aktivität aufweist, miteinander verbindet; und/oder
      • (iv) der vierte Prime-Editor ferner einen Linker umfasst, der das vierte napDNAbp und das vierte Polypeptid, das die RNA-abhängige DNA-Polymerase-Aktivität aufweist, miteinander verbindet.
    193. 193. Das Verfahren nach Ausführungsform 192, wobei der Linker eine Aminosäuresequenz einer der SEQ-ID-NR: 119-128 umfasst, oder eine Aminosäuresequenz, die mindestens 80 %, 85 %, 90 %, 95 % oder 99 % Sequenzidentität mit einer der SEQ-ID-NR: 119-128 aufweist.
    194. 194. Das Verfahren nach Ausführungsform 192 oder 193, wobei der Linker 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 38, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 oder 50 Aminosäuren in Länge beträgt.
    195. 195. Das Verfahren nach einer der Ausführungsformen 181-191, wobei die erste, zweite, dritte und/oder vierte PEgRNA eine Nukleotidsequenz mit einer der SEQ-ID-NR: 192-203 umfasst, oder eine Aminosäuresequenz, die mindestens 80 %, 85 %, 90 %, 95 % oder 99 % Sequenzidentität mit einer der SEQ-ID-NR: 192-203 aufweist.
    196. 196. Das Verfahren nach einer der Ausführungsformen 181-195, wobei die erste Spacer- Sequenz des ersten Prime-Editor-Komplexes an eine erste Bindungsstelle auf einem ersten Strang der doppelsträngigen DNA-Sequenz stromaufwärts von der zu editierenden Zielstelle bindet.
    197. 197. Das Verfahren nach einer der Ausführungsformen 181-196, wobei die zweite Spacer- Sequenz des zweiten Prime-Editor-Komplexes an eine zweite Bindungsstelle auf einem zweiten Strang der doppelsträngigen DNA-Sequenz stromabwärts von der zu editierenden Zielstelle bindet.
    198. 198. Das Verfahren nach einer der Ausführungsformen 181-197, wobei die dritte Spacer- Sequenz des dritten Prime-Editor-Komplexes an eine dritte Bindungsstelle auf einem ersten Strang der doppelsträngigen DNA-Sequenz stromaufwärts von der zu editierenden Zielstelle bindet.
    199. 199. Das Verfahren nach einer der Ausführungsformen 181-198, wobei die vierte Spacer- Sequenz des vierten Prime-Editor-Komplexes an eine vierte Bindungsstelle auf einem zweiten Strang der doppelsträngigen DNA-Sequenz stromabwärts von der zu editierenden Zielstelle bindet.
    200. 200. Das Verfahren nach Ausführungsform 197, wobei die Bindung der ersten und zweiten Spacer-Sequenzen des ersten und zweiten Prime-Editor-Komplexes in Gegenwart einer PAM- Sequenz zum Nicking des ersten bzw. zweiten Stranges an einer Nickstelle proximal zur PAM- Sequenz auf jedem Strang durch die napDNAbps jedes ersten und zweiten Prime-Editor- Komplexes führt.
    201. 201. Das Verfahren nach Ausführungsform 199, wobei die Bindung der dritten und vierten Spacer-Sequenzen des dritten und vierten Prime-Editor-Komplexes in Gegenwart einer PAM- Sequenz zum Nicking des ersten bzw. zweiten Stranges an einer Nickstelle proximal zur PAM- Sequenz auf jedem Strang durch die napDNAbps jedes dritten und vierten Prime-Editor- Komplexes führt.
    202. 202. Das Verfahren nach Ausführungsform 200 oder 201, wobei die erste und zweite Bindungsstelle und/oder die dritte und vierte Bindungsstelle zwei Enden einer zusammenhängenden Region doppelsträngiger DNA definieren, die die zu editierende Zielstelle umfasst.
    203. 203. Das Verfahren nach Ausführungsform 202, wobei die zusammenhängende Region zwischen der ersten und zweiten Bindungsstelle und/oder die zusammenhängende Region zwischen der dritten und vierten Bindungsstelle mindestens 10 Nukleobasenpaare, mindestens 11 Nukleobasenpaare, mindestens 12 Nukleobasenpaare, mindestens 13 Nukleobasenpaare, mindestens 14 Nukleobasenpaare, mindestens 15 Nukleobasenpaare, mindestens 16 Nukleobasenpaare, mindestens 17 Nukleobasenpaare, mindestens 18 Nukleobasenpaare, mindestens 19 Nukleobasenpaare, mindestens 20 Nukleobasenpaare, mindestens 21 Nukleobasenpaare, mindestens 22 Nukleobasenpaare, mindestens 23 Nukleobasenpaare, mindestens 24 Nukleobasenpaare, mindestens 25 Nukleobasenpaare, mindestens 26 Nukleobasenpaare, mindestens 27 Nukleobasenpaare, mindestens 28 Nukleobasenpaare, mindestens 29 Nukleobasenpaare, mindestens 30 Nukleobasenpaare, mindestens 31 Nukleobasenpaare, mindestens 32 Nukleobasenpaare, mindestens 33 Nukleobasenpaare, mindestens 34 Nukleobasenpaare, mindestens 35 Nukleobasenpaare, mindestens 36 Nukleobasenpaare, mindestens 37 Nukleobasenpaare, mindestens 37 Nukleobasenpaare, mindestens 38 Nukleobasenpaare, mindestens 39 Nukleobasenpaare oder mindestens 40 Nukleobasenpaare, mindestens 41 Nukleotide, mindestens 42 Nukleotide, mindestens 43 Nukleotide, mindestens 44 Nukleotide, mindestens 45 Nukleotide, mindestens 46 Nukleotide, mindestens 47 Nukleotide, mindestens 48 Nukleotide, mindestens 49 Nukleotide, mindestens 50 Nukleotide, mindestens 51 Nukleotide, mindestens 52 Nukleotide, mindestens 53 Nukleotide, mindestens 54 Nukleotide, mindestens 55 Nukleotide, mindestens 56 Nukleotide, mindestens 57 Nukleotide, mindestens 58 Nukleotide, mindestens 59 Nukleotide, mindestens 60 Nukleotide, mindestens 61 Nukleotide, mindestens 62 Nukleotide, mindestens 63 Nukleotide, mindestens 64 Nukleotide, mindestens 65 Nukleotide, mindestens 66 Nukleotide, mindestens 67 Nukleotide, mindestens 68 Nukleotide, mindestens 69 Nukleotide, mindestens 70 Nukleotide, mindestens 71 Nukleotide, mindestens 72 Nukleotide, mindestens 73 Nukleotide, mindestens 74 Nukleotide, mindestens 75 Nukleotide, mindestens 76 Nukleotide, mindestens 77 Nukleotide, mindestens 78 Nukleotide, mindestens 79 Nukleotide, mindestens 80 Nukleotide, mindestens 81 Nukleotide, mindestens 82 Nukleotide mindestens 83 Nukleotide, mindestens 84 Nukleotide, mindestens 85 Nukleotide, mindestens 86 Nukleotide, mindestens 87 Nukleotide, mindestens 88 Nukleotide, mindestens 89 Nukleotide, mindestens 90 Nukleotide, mindestens 91 Nukleotide, mindestens 92 Nukleotide, mindestens 93 Nukleotide, mindestens 94 Nukleotide, mindestens 95 Nukleotide, mindestens 96 Nukleotide, mindestens 97 Nukleotide, mindestens 98 Nukleotide, mindestens 99 Nukleotide, mindestens 100 Nukleotide, mindestens 101 Nukleotide, mindestens 102 Nukleotide, mindestens 103 Nukleotide, mindestens 104 Nukleotide, mindestens 105 Nukleotide, mindestens 106 Nukleotide, mindestens 107 Nukleotide, mindestens 108 Nukleotide, mindestens 109 Nukleotide oder mindestens 110 Nukleotide in Länge beträgt.
    204. 204. Das Verfahren nach Ausführungsform 202 oder 203, wobei die zusammenhängende Region durch den Duplex ausgetauscht wird.
    205. 205. Das Verfahren nach einer der Ausführungsformen 181-204, wobei das erste, zweite, dritte und/oder vierte DNA-Synthese-Templat mindestens 1 Nukleotid, mindestens 2 Nukleotide, mindestens 3 Nukleotide, mindestens 4 Nukleotide, mindestens 5 Nukleotide, mindestens 6 Nukleotide, mindestens 7 Nukleotide, mindestens 8 Nukleotide, mindestens 9 Nukleotide, mindestens 10 Nukleotide, mindestens 11 Nukleotide, mindestens 12 Nukleotide ist, mindestens 13 Nukleotide, mindestens 14 Nukleotide, mindestens 15 Nukleotide, mindestens 16 Nukleotide, mindestens 17 Nukleotide, mindestens 18 Nukleotide, mindestens 19 Nukleotide, mindestens 20 Nukleotide, mindestens 21 Nukleotide, mindestens 22 Nukleotide, mindestens 23 Nukleotide, mindestens 24 Nukleotide, mindestens 25 Nukleotide, mindestens 26 Nukleotide mindestens 27 Nukleotide, mindestens 28 Nukleotide, mindestens 29 Nukleotide, mindestens 30 Nukleotide, mindestens 31 Nukleotide, mindestens 32 Nukleotide, mindestens 33 Nukleotide, mindestens 34 Nukleotide, mindestens 35 Nukleotide, mindestens 36 Nukleotide, mindestens 37 Nukleotide, mindestens 38 Nukleotide, mindestens 39 Nukleotide, mindestens 40 Nukleotide mindestens 41 Nukleotide, mindestens 42 Nukleotide, mindestens 43 Nukleotide, mindestens 44 Nukleotide, mindestens 45 Nukleotide, mindestens 46 Nukleotide, mindestens 47 Nukleotide, mindestens 48 Nukleotide, mindestens 49 Nukleotide, mindestens 50 Nukleotide, mindestens 51 Nukleotide, mindestens 52 Nukleotide, mindestens 53 Nukleotide, mindestens 54 Nukleotide mindestens 55 Nukleotide, mindestens 56 Nukleotide, mindestens 57 Nukleotide, mindestens 58 Nukleotide, mindestens 59 Nukleotide, mindestens 60 Nukleotide, mindestens 61 Nukleotide, mindestens 62 Nukleotide, mindestens 63 Nukleotide, mindestens 64 Nukleotide, mindestens 65 Nukleotide, mindestens 66 Nukleotide, mindestens 67 Nukleotide, mindestens 68 Nukleotide, mindestens 69 Nukleotide, mindestens 70 Nukleotide, mindestens 71 Nukleotide, mindestens 72 Nukleotide, mindestens 73 Nukleotide, mindestens 74 Nukleotide, mindestens 75 Nukleotide, mindestens 76 Nukleotide, mindestens 77 Nukleotide, mindestens 78 Nukleotide, mindestens 79 Nukleotide, mindestens 80 Nukleotide, mindestens 81 Nukleotide, mindestens 82 Nukleotide mindestens 83 Nukleotide, mindestens 84 Nukleotide, mindestens 85 Nukleotide, mindestens 86 Nukleotide, mindestens 87 Nukleotide, mindestens 88 Nukleotide, mindestens 89 Nukleotide, mindestens 90 Nukleotide, mindestens 91 Nukleotide, mindestens 92 Nukleotide, mindestens 93 Nukleotide, mindestens 94 Nukleotide, mindestens 95 Nukleotide, mindestens 96 Nukleotide, mindestens 97 Nukleotide, mindestens 98 Nukleotide, mindestens 99 Nukleotide, mindestens 100 Nukleotide, mindestens 101 Nukleotide, mindestens 102 Nukleotide, mindestens 103 Nukleotide, mindestens 104 Nukleotide, mindestens 105 Nukleotide, mindestens 106 Nukleotide, mindestens 107 Nukleotide, mindestens 108 Nukleotide, mindestens 109 Nukleotide oder mindestens 110 Nukleotide in Länge beträgt.
    206. 206. Das Verfahren nach einer der Ausführungsformen 181-205, wobei die erste einzelsträngige DNA-Sequenz und die zweite einzelsträngige DNA-Sequenz und/oder die dritte einzelsträngige DNA-Sequenz und die vierte einzelsträngige DNA-Sequenz die gleichen Längen aufweisen.
    207. 207. Das Verfahren nach einer der Ausführungsformen 181-206, wobei die erste einzelsträngige DNA-Sequenz und die zweite einzelsträngige DNA-Sequenz und/oder die dritte einzelsträngige DNA-Sequenz und die vierte einzelsträngige DNA-Sequenz unterschiedliche Längen aufweisen.
    208. 208. Das Verfahren nach einer der Ausführungsformen 181-207, wobei die Region der Komplementarität mindestens 99%, mindestens 95%, mindestens 90%, mindestens 85%, mindestens 80%, mindestens 75%, mindestens 70%, mindestens 65%, mindestens 60%, mindestens 55%, mindestens 50% beträgt, mindestens 45 %, mindestens 40 %, mindestens 35 %, mindestens 30 %, mindestens 25 %, mindestens 20 %, mindestens 15 % oder mindestens 10 % der Gesamtlänge der ersten einzelsträngigen DNA-Sequenz und der zweiten einzelsträngigen DNA-Sequenz oder der dritten einzelsträngigen DNA-Sequenz und der vierten einzelsträngigen DNA-Sequenz beträgt.
    209. 209. Das Verfahren nach einer der Ausführungsformen 181-208, wobei die Region der Komplementarität mindestens 5 Nukleotide, mindestens 6 Nukleotide, mindestens 7 Nukleotide, mindestens 8 Nukleotide, mindestens 9 Nukleotide, mindestens 10 Nukleotide, mindestens 11 Nukleotide, mindestens 12 Nukleotide ist, mindestens 13 Nukleotide, mindestens 14 Nukleotide, mindestens 15 Nukleotide, mindestens 16 Nukleotide, mindestens 17 Nukleotide, mindestens 18 Nukleotide, mindestens 19 Nukleotide, mindestens 20 Nukleotide, mindestens 21 Nukleotide, mindestens 22 Nukleotide, mindestens 23 Nukleotide, mindestens 24 Nukleotide, mindestens 25 Nukleotide, mindestens 26 Nukleotide mindestens 27 Nukleotide, mindestens 28 Nukleotide, mindestens 29 Nukleotide, mindestens 30 Nukleotide, mindestens 31 Nukleotide, mindestens 32 Nukleotide, mindestens 33 Nukleotide, mindestens 34 Nukleotide, mindestens 35 Nukleotide, mindestens 36 Nukleotide, mindestens 37 Nukleotide, mindestens 38 Nukleotide, mindestens 39 Nukleotide, mindestens 40 Nukleotide mindestens 41 Nukleotide, mindestens 42 Nukleotide, mindestens 43 Nukleotide, mindestens 44 Nukleotide, mindestens 45 Nukleotide, mindestens 46 Nukleotide, mindestens 47 Nukleotide, mindestens 48 Nukleotide, mindestens 49 Nukleotide, mindestens 50 Nukleotide, mindestens 51 Nukleotide, mindestens 52 Nukleotide, mindestens 53 Nukleotide, mindestens 54 Nukleotide mindestens 55 Nukleotide, mindestens 56 Nukleotide, mindestens 57 Nukleotide, mindestens 58 Nukleotide, mindestens 59 Nukleotide, mindestens 60 Nukleotide, mindestens 61 Nukleotide, mindestens 62 Nukleotide, mindestens 63 Nukleotide, mindestens 64 Nukleotide, mindestens 65 Nukleotide, mindestens 66 Nukleotide, mindestens 67 Nukleotide, mindestens 68 Nukleotide, mindestens 69 Nukleotide, mindestens 70 Nukleotide, mindestens 71 Nukleotide, mindestens 72 Nukleotide, mindestens 73 Nukleotide, mindestens 74 Nukleotide, mindestens 75 Nukleotide, mindestens 76 Nukleotide, mindestens 77 Nukleotide, mindestens 78 Nukleotide, mindestens 79 Nukleotide, mindestens 80 Nukleotide, mindestens 81 Nukleotide, mindestens 82 Nukleotide mindestens 83 Nukleotide, mindestens 84 Nukleotide, mindestens 85 Nukleotide, mindestens 86 Nukleotide, mindestens 87 Nukleotide, mindestens 88 Nukleotide, mindestens 89 Nukleotide, mindestens 90 Nukleotide, mindestens 91 Nukleotide, mindestens 92 Nukleotide, mindestens 93 Nukleotide, mindestens 94 Nukleotide, mindestens 95 Nukleotide, mindestens 96 Nukleotide, mindestens 97 Nukleotide, mindestens 98 Nukleotide, mindestens 99 Nukleotide, mindestens 100 Nukleotide, mindestens 101 Nukleotide, mindestens 102 Nukleotide, mindestens 103 Nukleotide, mindestens 104 Nukleotide, mindestens 105 Nukleotide, mindestens 106 Nukleotide, mindestens 107 Nukleotide, mindestens 108 Nukleotide, mindestens 109 Nukleotide oder mindestens 110 Nukleotide in Länge beträgt.
    210. 210. Das Verfahren nach einer der Ausführungsformen 181-209, wobei die Region der Komplementarität der ersten einzelsträngigen DNA-Sequenz und der zweiten einzelsträngigen DNA-Sequenz und/oder der dritten einzelsträngigen DNA-Sequenz und der vierten einzelsträngigen DNA-Sequenz den Duplex bilden.
    211. 211. Das Verfahren nach einer der Ausführungsformen 181-210, wobei die erste einzelsträngige DNA-Sequenz und die zweite einzelsträngige DNA-Sequenz und/oder die dritte einzelsträngige DNA-Sequenz und die vierte einzelsträngige DNA-Sequenz jeweils einzelsträngige DNA-Stränge sind, die 3'-Enden aufweisen.
    212. 212. Das Verfahren nach Ausführungsform 204, wobei der Austausch der zusammenhängenden Region durch den Duplex, der den editierten Abschnitt umfasst, zu einer Insertion, Deletion oder einem Austausch der DNA an der Zielstelle führt.
    213. 213. Das Verfahren nach einer der Ausführungsformen 181-212, wobei die erste einzelsträngige DNA-Sequenz und die zweite einzelsträngige DNA-Sequenz an Enden einer Ziel-DNA-Sequenz liegen und wobei die dritte einzelsträngige DNA-Sequenz und die vierte einzelsträngige DNA-Sequenz an entgegengesetzten Enden derselben Ziel-DNA-Sequenz liegen.
    214. 214. Das Verfahren nach Ausführungsform 213, wobei die Ziel-DNA-Sequenz invertiert ist.
    215. 215. Das Verfahren nach einer der Ausführungsformen 181-214, ferner umfassend Bereitstellen eines zirkulären DNA-Donors.
    216. 216. Das Verfahren nach Ausführungsform 215, wobei die erste einzelsträngige DNA- Sequenz und die dritte einzelsträngige DNA-Sequenz an entgegengesetzten Enden der Ziel- DNA-Sequenz liegen und wobei die zweite einzelsträngige DNA-Sequenz und die vierte einzelsträngige DNA-Sequenz auf dem zirkulären DNA-Donor liegen.
    217. 217. Das Verfahren nach Ausführungsform 216, wobei ein Abschnitt des zirkulären DNA- Donors zwischen der zweiten einzelsträngigen DNA-Sequenz und der vierten einzelsträngigen DNA-Sequenz die Zielsequenz zwischen der ersten einzelsträngigen DNA-Sequenz und der dritten einzelsträngigen DNA-Sequenz austauscht.
    218. 218. Das Verfahren nach einer der Ausführungsformen 181-214, wobei sich die erste einzelsträngige DNA-Sequenz und die dritte einzelsträngige DNA-Sequenz auf einem ersten Nukleinsäuremolekül befinden, und wobei sich die zweite einzelsträngige DNA-Sequenz und die vierte einzelsträngige DNA-Sequenz auf einem zweiten Nukleinsäuremolekül befinden.
    219. 219. Das Verfahren nach Ausführungsform 218, wobei ein Abschnitt des ersten Nukleinsäuremoleküls zwischen der ersten einzelsträngigen DNA-Sequenz und der dritten einzelsträngigen DNA-Sequenz in das zweite Nukleinsäuremolekül eingebaut wird, und wobei ein Abschnitt des zweiten Nukleinsäuremoleküls zwischen der zweiten einzelsträngigen DNA- Sequenz und der vierten einzelsträngigen DNA-Sequenz in das erste Nukleinsäuremolekül eingebaut wird.
    220. 220. Das Verfahren nach Ausführungsform 218 oder 219, wobei das erste Nukleinsäuremolekül ein erstes Chromosom und das zweite Nukleinsäuremolekül ein zweites Chromosom ist.
    221. 221. Ein Satz von PEgRNAs zur Verwendung beim Mulit-Flap-Prime-Editing, wobei die PEgRNAs Folgendes umfassen:
      1. (a) eine erste Prime-Editing-Leit-RNA (erste PEgRNA), die an eine erste Bindungsstelle auf einem ersten Strang einer doppelsträngigen DNA-Sequenz stromaufwärts einer zu editierenden Zielstelle bindet, wobei die erste PEgRNA eine erste Spacer-Sequenz, einen ersten gRNA- Kern, ein erstes DNA-Synthese-Templat und eine erste Primer-Bindungsstelle umfasst, wobei das erste DNA-Synthese-Templat eine erste einzelsträngige DNA-Sequenz kodiert;
      2. (b) eine zweite Prime-Editing-Leit-RNA (zweite PEgRNA), die an eine zweite Bindungsstelle auf einem zweiten Strang der doppelsträngigen DNA-Sequenz stromaufwärts von der zu editierenden Zielstelle bindet, wobei die zweite PEgRNA eine zweite Spacer-Sequenz, einen zweiten gRNA-Kern, ein zweites DNA-Synthese-Templat und eine zweite Primer- Bindungsstelle umfasst, wobei das zweite DNA-Synthese-Templat eine zweite einzelsträngige DNA-Sequenz kodiert, die den editierten Abschnitt umfasst, wobei die zweite einzelsträngige DNA-Sequenz komplementär zu der ersten einzelsträngigen DNA-Sequenz ist.
      3. (c) eine erste Prime-Editing-Leit-RNA (erste PEgRNA), die an eine erste Bindungsstelle auf einem ersten Strang einer doppelsträngigen DNA-Sequenz stromaufwärts einer zu editierenden Zielstelle bindet, wobei die erste PEgRNA eine erste Spacer-Sequenz, einen ersten gRNA- Kern, ein erstes DNA-Synthese-Templat und eine erste Primer-Bindungsstelle umfasst, wobei das erste DNA-Synthese-Templat eine erste einzelsträngige DNA-Sequenz kodiert, die einen editierten Abschnitt umfasst;
      4. (d) eine vierte Prime-Editing-Leit-RNA (vierte PEgRNA), die an eine vierte Bindungsstelle auf einem zweiten Strang der doppelsträngigen DNA-Sequenz stromabwärts der zu editierenden Zielstelle bindet, wobei die vierte PEgRNA eine vierte Spacer-Sequenz, einen vierten gRNA-Kern, ein viertes DNA-Synthese-Templat und eine vierte Primer-Bindungsstelle umfasst, wobei das vierte DNA-Synthese-Templat eine vierte einzelsträngige DNA-Sequenz kodiert, wobei die vierte einzelsträngige DNA-Sequenz eine Region der Komplementarität zur dritten einzelsträngigen DNA-Sequenz umfasst.
    222. 222. Der Satz von PEgRNAs nach Ausführungsform 221, wobei die erste PEgRNA die folgende Struktur umfasst:
      • 5'-[erste gRNA-Spacer-Sequenz]-[erster gRNA-Kern]-[erstes DNA-Synthese-Templat]-[erste Primer-Bindungsstelle]-3';
      die zweite PEgRNA die folgende Struktur umfasst:
      • 5'-[zweite gRNA-Spacer-Sequenz]-[zweiter gRNA-Kem]-[zweites DNA-Synthese-Templat]- [zweite Primer-Bindungsstelle]-3';
      • die dritte PEgRNA die folgende Struktur umfasst:
        • 5'-[dritte gRNA-Spacer-Sequenz]-[dritter gRNA-Kern]-[drittes DNA-Synthese-Templat]- [dritte Primer-Bindungsstelle]-3'; und
      • die vierte PEgRNA die folgende Struktur umfasst:
        • 5'-[vierte gRNA-Spacer-Sequenz]-[vierter gRNA-Kern]-[viertes DNA-Synthese-Templat]- [vierte Primer-Bindungsstelle]-3'.
    223. 223. Der Satz von PEgRNAs nach Ausführungsform 221 oder 222, wobei die erste einzelsträngige DNA-Sequenz und die zweite einzelsträngige DNA-Sequenz und/oder die dritte einzelsträngige DNA-Sequenz und die vierte einzelsträngige DNA-Sequenz einen Duplex bilden, der in die doppelsträngige DNA-Sequenz an der zu editierenden Zielstelle integriert wird.
    224. 224. Der Satz von PEgRNAs nach einer der Ausführungsformen 221-223, wobei die Integration des Duplexes zu einer Insertion, Deletion oder einem Austausch von DNA an der Zielstelle führt.
    225. 225. Der Satz von PEgRNAs nach Ausführungsform 224, wobei die Insertion mindestens 1 Nukleotid, mindestens 2 Nukleotide, mindestens 3 Nukleotide, mindestens 4 Nukleotide, mindestens 5 Nukleotide, mindestens 6 Nukleotide, mindestens 7 Nukleotide, mindestens 8 Nukleotide, mindestens 9 Nukleotide, mindestens 10 Nukleotide, mindestens 11 Nukleotide, mindestens 12 Nukleotide ist, mindestens 13 Nukleotide, mindestens 14 Nukleotide, mindestens 15 Nukleotide, mindestens 16 Nukleotide, mindestens 17 Nukleotide, mindestens 18 Nukleotide, mindestens 19 Nukleotide, mindestens 20 Nukleotide, mindestens 21 Nukleotide, mindestens 22 Nukleotide, mindestens 23 Nukleotide, mindestens 24 Nukleotide, mindestens 25 Nukleotide, mindestens 26 Nukleotide mindestens 27 Nukleotide, mindestens 28 Nukleotide, mindestens 29 Nukleotide, mindestens 30 Nukleotide, mindestens 31 Nukleotide, mindestens 32 Nukleotide, mindestens 33 Nukleotide, mindestens 34 Nukleotide, mindestens 35 Nukleotide, mindestens 36 Nukleotide, mindestens 37 Nukleotide, mindestens 38 Nukleotide, mindestens 39 Nukleotide, mindestens 40 Nukleotide mindestens 41 Nukleotide, mindestens 42 Nukleotide, mindestens 43 Nukleotide, mindestens 44 Nukleotide, mindestens 45 Nukleotide, mindestens 46 Nukleotide, mindestens 47 Nukleotide, mindestens 48 Nukleotide, mindestens 49 Nukleotide, mindestens 50 Nukleotide, mindestens 51 Nukleotide, mindestens 52 Nukleotide, mindestens 53 Nukleotide, mindestens 54 Nukleotide mindestens 55 Nukleotide, mindestens 56 Nukleotide, mindestens 57 Nukleotide, mindestens 58 Nukleotide, mindestens 59 Nukleotide, mindestens 60 Nukleotide, mindestens 61 Nukleotide, mindestens 62 Nukleotide, mindestens 63 Nukleotide, mindestens 64 Nukleotide, mindestens 65 Nukleotide, mindestens 66 Nukleotide, mindestens 67 Nukleotide, mindestens 68 Nukleotide, mindestens 69 Nukleotide, mindestens 70 Nukleotide, mindestens 71 Nukleotide, mindestens 72 Nukleotide, mindestens 73 Nukleotide, mindestens 74 Nukleotide, mindestens 75 Nukleotide, mindestens 76 Nukleotide, mindestens 77 Nukleotide, mindestens 78 Nukleotide, mindestens 79 Nukleotide, mindestens 80 Nukleotide, mindestens 81 Nukleotide, mindestens 82 Nukleotide mindestens 83 Nukleotide, mindestens 84 Nukleotide, mindestens 85 Nukleotide, mindestens 86 Nukleotide, mindestens 87 Nukleotide, mindestens 88 Nukleotide, mindestens 89 Nukleotide, mindestens 90 Nukleotide, mindestens 91 Nukleotide, mindestens 92 Nukleotide, mindestens 93 Nukleotide, mindestens 94 Nukleotide, mindestens 95 Nukleotide, mindestens 96 Nukleotide, mindestens 97 Nukleotide, mindestens 98 Nukleotide, mindestens 99 Nukleotide, mindestens 100 Nukleotide, mindestens 101 Nukleotide, mindestens 102 Nukleotide, mindestens 103 Nukleotide, mindestens 104 Nukleotide, mindestens 105 Nukleotide, mindestens 106 Nukleotide, mindestens 107 Nukleotide, mindestens 108 Nukleotide, mindestens 109 Nukleotide oder mindestens 110 Nukleotide in Länge beträgt.
    226. 226. Der Satz von PEgRNAs nach Ausführungsform 224, wobei die Deletion mindestens 1 Nukleotid, mindestens 2 Nukleotide, mindestens 3 Nukleotide, mindestens 4 Nukleotide, mindestens 5 Nukleotide, mindestens 6 Nukleotide, mindestens 7 Nukleotide, mindestens 8 Nukleotide, mindestens 9 Nukleotide, mindestens 10 Nukleotide, mindestens 11 Nukleotide, mindestens 12 Nukleotide ist, mindestens 13 Nukleotide, mindestens 14 Nukleotide, mindestens 15 Nukleotide, mindestens 16 Nukleotide, mindestens 17 Nukleotide, mindestens 18 Nukleotide, mindestens 19 Nukleotide, mindestens 20 Nukleotide, mindestens 21 Nukleotide, mindestens 22 Nukleotide, mindestens 23 Nukleotide, mindestens 24 Nukleotide, mindestens 25 Nukleotide, mindestens 26 Nukleotide mindestens 27 Nukleotide, mindestens 28 Nukleotide, mindestens 29 Nukleotide, mindestens 30 Nukleotide, mindestens 31 Nukleotide, mindestens 32 Nukleotide, mindestens 33 Nukleotide, mindestens 34 Nukleotide, mindestens 35 Nukleotide, mindestens 36 Nukleotide, mindestens 37 Nukleotide, mindestens 38 Nukleotide, mindestens 39 Nukleotide, mindestens 40 Nukleotide mindestens 41 Nukleotide, mindestens 42 Nukleotide, mindestens 43 Nukleotide, mindestens 44 Nukleotide, mindestens 45 Nukleotide, mindestens 46 Nukleotide, mindestens 47 Nukleotide, mindestens 48 Nukleotide, mindestens 49 Nukleotide, mindestens 50 Nukleotide, mindestens 51 Nukleotide, mindestens 52 Nukleotide, mindestens 53 Nukleotide, mindestens 54 Nukleotide mindestens 55 Nukleotide, mindestens 56 Nukleotide, mindestens 57 Nukleotide, mindestens 58 Nukleotide, mindestens 59 Nukleotide, mindestens 60 Nukleotide, mindestens 61 Nukleotide, mindestens 62 Nukleotide, mindestens 63 Nukleotide, mindestens 64 Nukleotide, mindestens 65 Nukleotide, mindestens 66 Nukleotide, mindestens 67 Nukleotide, mindestens 68 Nukleotide, mindestens 69 Nukleotide, mindestens 70 Nukleotide, mindestens 71 Nukleotide, mindestens 72 Nukleotide, mindestens 73 Nukleotide, mindestens 74 Nukleotide, mindestens 75 Nukleotide, mindestens 76 Nukleotide, mindestens 77 Nukleotide, mindestens 78 Nukleotide, mindestens 79 Nukleotide, mindestens 80 Nukleotide, mindestens 81 Nukleotide, mindestens 82 Nukleotide mindestens 83 Nukleotide, mindestens 84 Nukleotide, mindestens 85 Nukleotide, mindestens 86 Nukleotide, mindestens 87 Nukleotide, mindestens 88 Nukleotide, mindestens 89 Nukleotide, mindestens 90 Nukleotide, mindestens 91 Nukleotide, mindestens 92 Nukleotide, mindestens 93 Nukleotide, mindestens 94 Nukleotide, mindestens 95 Nukleotide, mindestens 96 Nukleotide, mindestens 97 Nukleotide, mindestens 98 Nukleotide, mindestens 99 Nukleotide, mindestens 100 Nukleotide, mindestens 101 Nukleotide, mindestens 102 Nukleotide, mindestens 103 Nukleotide, mindestens 104 Nukleotide, mindestens 105 Nukleotide, mindestens 106 Nukleotide, mindestens 107 Nukleotide, mindestens 108 Nukleotide, mindestens 109 Nukleotide oder mindestens 110 Nukleotide oder mehr in Länge beträgt.
    227. 227. Der Satz von PEgRNAs nach Ausführungsform 224, wobei der Austausch mindestens 1 Nukleotid, mindestens 2 Nukleotide, mindestens 3 Nukleotide, mindestens 4 Nukleotide, mindestens 5 Nukleotide, mindestens 6 Nukleotide, mindestens 7 Nukleotide, mindestens 8 Nukleotide, mindestens 9 Nukleotide, mindestens 10 Nukleotide, mindestens 11 Nukleotide, mindestens 12 Nukleotide ist, mindestens 13 Nukleotide, mindestens 14 Nukleotide, mindestens 15 Nukleotide, mindestens 16 Nukleotide, mindestens 17 Nukleotide, mindestens 18 Nukleotide, mindestens 19 Nukleotide, mindestens 20 Nukleotide, mindestens 21 Nukleotide, mindestens 22 Nukleotide, mindestens 23 Nukleotide, mindestens 24 Nukleotide, mindestens 25 Nukleotide, mindestens 26 Nukleotide mindestens 27 Nukleotide, mindestens 28 Nukleotide, mindestens 29 Nukleotide, mindestens 30 Nukleotide, mindestens 31 Nukleotide, mindestens 32 Nukleotide, mindestens 33 Nukleotide, mindestens 34 Nukleotide, mindestens 35 Nukleotide, mindestens 36 Nukleotide, mindestens 37 Nukleotide, mindestens 38 Nukleotide, mindestens 39 Nukleotide, mindestens 40 Nukleotide mindestens 41 Nukleotide, mindestens 42 Nukleotide, mindestens 43 Nukleotide, mindestens 44 Nukleotide, mindestens 45 Nukleotide, mindestens 46 Nukleotide, mindestens 47 Nukleotide, mindestens 48 Nukleotide, mindestens 49 Nukleotide, mindestens 50 Nukleotide, mindestens 51 Nukleotide, mindestens 52 Nukleotide, mindestens 53 Nukleotide, mindestens 54 Nukleotide mindestens 55 Nukleotide, mindestens 56 Nukleotide, mindestens 57 Nukleotide, mindestens 58 Nukleotide, mindestens 59 Nukleotide, mindestens 60 Nukleotide, mindestens 61 Nukleotide, mindestens 62 Nukleotide, mindestens 63 Nukleotide, mindestens 64 Nukleotide, mindestens 65 Nukleotide, mindestens 66 Nukleotide, mindestens 67 Nukleotide, mindestens 68 Nukleotide, mindestens 69 Nukleotide, mindestens 70 Nukleotide, mindestens 71 Nukleotide, mindestens 72 Nukleotide, mindestens 73 Nukleotide, mindestens 74 Nukleotide, mindestens 75 Nukleotide, mindestens 76 Nukleotide, mindestens 77 Nukleotide, mindestens 78 Nukleotide, mindestens 79 Nukleotide, mindestens 80 Nukleotide, mindestens 81 Nukleotide, mindestens 82 Nukleotide mindestens 83 Nukleotide, mindestens 84 Nukleotide, mindestens 85 Nukleotide, mindestens 86 Nukleotide, mindestens 87 Nukleotide, mindestens 88 Nukleotide, mindestens 89 Nukleotide, mindestens 90 Nukleotide, mindestens 91 Nukleotide, mindestens 92 Nukleotide, mindestens 93 Nukleotide, mindestens 94 Nukleotide, mindestens 95 Nukleotide, mindestens 96 Nukleotide, mindestens 97 Nukleotide, mindestens 98 Nukleotide, mindestens 99 Nukleotide, mindestens 100 Nukleotide, mindestens 101 Nukleotide, mindestens 102 Nukleotide, mindestens 103 Nukleotide, mindestens 104 Nukleotide, mindestens 105 Nukleotide, mindestens 106 Nukleotide, mindestens 107 Nukleotide, mindestens 108 Nukleotide, mindestens 109 Nukleotide oder mindestens 110 Nukleotide oder mehr in Länge beträgt.
    228. 228. Ein Polynukleotid, das einen Satz von PEgRNAs nach einer der Ausführungsformen 221-227 kodiert.
    229. 229. Ein Vektor, der das Polynukleotid nach Ausführungsform 228 umfasst, um die Vielzahl von PEgRNAs in einer Zelle zu exprimieren.
    230. 230. Eine Zelle, umfassend den Vektor nach Ausführungsform 229.
    231. 231. Eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend die Vielzahl von PEgRNAs aus einer der Ausführungsformen 221-227, einen Vektor aus Ausführungsform 229 oder eine Zelle aus Ausführungsform 230 und einen pharmazeutischen Hilfsstoff.
    232. 232. Ein Verfahren zum Modifizieren eines Genoms in einer Zelle, Folgendes umfassend:
      • (i) Inkontaktbringen eines Genoms mit einem Dual-Flap-pegRNA-Editing-System, wobei das System einen ersten Prime-Editor/pegRNA-Komplex umfasst, der in der Lage ist, einen ersten 3'-Nukleinsäure-Flap an einer ersten Nickstelle an einem ersten Strang einer Zielstelle einzubauen, und einen zweiten Prime-Editor/pegRNA-Komplex, der in der Lage ist, einen zweiten 3'-Nukleinsäure-Flap an einer zweiten Nickstelle an einem zweiten Strang einer Zielstelle einzubauen, wobei der erste 3'-Nukleinsäure-Flap und der zweite 3'-Nukleinsäure-Flap revers komplementäre Sequenzen sind, die einen Duplex bilden, und wobei der Duplex eine erste Rekombinasestelle umfasst, und wobei die Zelle den Duplex, der die erste Rekombinasestelle umfasst, an der Zielstelle anstelle eines endogenen Duplex einbaut, der zwischen der ersten und der zweiten Nickstelle positioniert ist;
      • (ii) Inkontaktbringen der ersten Rekombinasestelle mit einer Donor-Nukleinsäure, die eine zweite Rekombinasestelle umfasst; und
      • (iii) Inkontaktbringen des Genoms mit einer Rekombinase, die zur Rekombination zwischen der ersten und der zweiten Rekombinasestelle fähig ist, wodurch die Donor-Nukleinsäure an der Zielstelle in das Genom integriert wird.
  • [9] Verfahren
  • Verfahren für Mulit-Flap-Prime-Editing
  • In einem Aspekt stellt die vorliegende Offenbarung Verfahren für gleichzeitiges Editieren eines ersten und eines zweiten komplementären Strangs einer doppelsträngigen DNA-Sequenz an einer Zielstelle bereit, wobei das Verfahren das Inkontaktbringen der doppelsträngigen DNA-Sequenz mit einem Paar von Prime-Editor-Komplexen umfasst, wobei das Paar Folgendes umfasst:
    1. a. einen ersten Prime-Editor-Komplex, umfassend:
      1. i. einen ersten Prime-Editor, umfassend ein erstes Nukleinsäure-programmierbares DNA- Bindeprotein (napDNAbp) und ein erstes Polypeptid, das eine RNA-abhängige DNA- Polymerase-Aktivität umfasst; und
      2. ii. eine erste Prime-Editing-Leit-RNA (erste PEgRNA), die an eine erste Bindungsstelle auf dem ersten Strang der genomischen DNA-Sequenz stromaufwärts von der Zielstelle bindet;
    2. b. einen zweiten Prime-Editor-Komplex, umfassend:
      1. i. einen zweiten Prime-Editor, umfassend ein zweites Nukleinsäure-programmierbares DNA- Bindeprotein (zweites napDNAbp) und ein zweites Polypeptid, das eine RNA-abhängige DNA-Polymerase-Aktivität umfasst; und
      2. ii. eine zweite Prime-Editing-Leit-RNA (zweite PEgRNA), die an eine zweite Bindungsstelle auf dem zweiten Strang der genomischen DNA-Sequenz stromabwärts der Zielstelle bindet; wobei der erste Prime-Editor-Komplex einen ersten Nick an einer Sequenz, die komplementär zu der ersten Bindungsstelle ist, und die anschließende Polymerisation einer ersten einzelsträngigen DNA-Sequenz, die ein 3'-Ende von dem verfügbaren 5'-Ende aufweist, das durch den ersten Nick gebildet wird, bewirkt; wobei der zweite Prime-Editor-Komplex einen zweiten Nick an einer Sequenz, die komplementär zu der zweiten Bindungsstelle ist, und die anschließende Polymerisation einer zweiten einzelsträngigen DNA-Sequenz, die ein 3'-Ende von dem verfügbaren 5'-Ende aufweist, das durch den zweiten Nick gebildet wird, bewirkt; wobei die erste einzelsträngige DNA-Sequenz und die zweite einzelsträngige DNA-Sequenz über mindestens eine Region der Komplementarität umgekehrt komplementär sind und einen Duplex bilden, der ein Editing umfasst; und wobei der Duplex den genickten ersten und zweiten komplementären Strang der doppelsträngigen DNA-Sequenz ersetzt.
  • In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Offenbarung Verfahren für gleichzeitiges Editieren erster und zweiter komplementärer Stränge einer doppelsträngigen DNA-Sequenz an einer Zielstelle bereit, wobei das Verfahren Inkontaktbringen der doppelsträngigen DNA-Sequenz mit einem Paar von Prime-Editor-Komplexen umfasst, wobei das Paar Folgendes umfasst:
    1. (a) einen ersten Prime-Editor-Komplex, umfassend:
      1. i. einen ersten Prime-Editor, umfassend ein erstes Nukleinsäure-programmierbares DNA- Bindungsprotein (erstes napDNAbp) und ein erstes Polypeptid, das eine RNA-abhängige DNA-Polymerase-Aktivität umfasst; und
      2. ii. eine erste Prime-Editing-Leit-RNA (erste PEgRNA), die an eine erste Zielsequenz auf dem ersten Strang der genomischen DNA-Sequenz stromaufwärts der Zielstelle bindet;
    2. (b) einen zweiten Prime-Editor-Komplex, umfassend:
      1. i. einen zweiten Prime-Editor, umfassend ein zweites Nukleinsäure-programmierbares DNA- Bindeprotein (zweites napDNAbp) und ein zweites Polypeptid, das eine RNA-abhängige DNA-Polymerase-Aktivität umfasst; und
      2. ii. eine zweite Prime-Editing-Leit-RNA (zweite PEgRNA), die an eine zweite Zielsequenz auf dem zweiten Strang der genomischen DNA-Sequenz stromaufwärts der Zielstelle bindet;
    3. (c) einen dritten Prime-Editor-Komplex, umfassend:
      1. i. einen dritten Prime-Editor, umfassend ein drittes Nukleinsäure-programmierbares DNA- Bindeprotein (drittes napDNAbp) und ein drittes Polypeptid, das eine RNA-abhängige DNA- Polymerase-Aktivität umfasst; und
      2. ii. eine dritte Prime-Editing-Leit-RNA (dritte PEgRNA), die an eine erste Zielsequenz auf dem dritten Strang der genomischen DNA-Sequenz stromabwärts der Zielstelle bindet;
    4. (d) einen vierten Prime-Editor-Komplex, umfassend:
      1. i. einen vierten Prime-Editor, umfassend ein zweites Nukleinsäure-programmierbares DNA- Bindeprotein (viertes napDNAbp) und ein viertes Polypeptid, das eine RNA-abhängige DNA- Polymerase-Aktivität umfasst; und
      2. ii. eine vierte Prime-Editing-Leit-RNA (vierte PEgRNA), die an eine zweite Zielsequenz auf dem vierten Strang der genomischen DNA-Sequenz stromabwärts der Zielstelle bindet; wobei der erste Prime-Editor-Komplex einen ersten Nick an der ersten Zielsequenz und die anschließende Polymerisation einer ersten einzelsträngigen DNA-Sequenz bewirkt, die ein 3'- Ende von dem verfügbaren 5'-Ende aufweist, das durch den ersten Nick gebildet wird; wobei der zweite Prime-Editor-Komplex einen zweiten Nick an der zweiten Zielsequenz und die anschließende Polymerisation einer zweiten einzelsträngigen DNA-Sequenz bewirkt, die ein 3'-Ende von dem verfügbaren 5'-Ende aufweist, das durch den zweiten Nick gebildet wird; wobei der dritte Prime-Editor-Komplex einen dritten Nick an der dritten Zielsequenz und die anschließende Polymerisation einer dritten einzelsträngigen DNA-Sequenz bewirkt, die ein 3'- Ende von dem verfügbaren 5'-Ende aufweist, das durch den dritten Nick gebildet wird; wobei der vierte Prime-Editor-Komplex einen vierten Nick an der vierten Zielsequenz und die anschließende Polymerisation einer vierten einzelsträngigen DNA-Sequenz bewirkt, die ein 3'- Ende von dem verfügbaren 5'-Ende aufweist, das durch den vierten Nick gebildet wird; wobei die erste einzelsträngige DNA-Sequenz und die zweite einzelsträngige DNA-Sequenz über mindestens eine Region der Komplementarität umgekehrt komplementär sind und einen Duplex bilden, wobei der Duplex die genickten ersten und zweiten komplementären Stränge der doppelsträngigen DNA-Sequenz ersetzt; und wobei die dritte einzelsträngige DNA-Sequenz und die vierte einzelsträngige DNA-Sequenz über mindestens eine Region der Komplementarität umgekehrt komplementär sind und einen Duplex bilden, wobei der Duplex die genickten ersten und zweiten komplementären Stränge der doppelsträngigen DNA-Sequenz ersetzt.
  • Diese Spezifikation beschreibt Mulit-Flap-Prime-Editing-Systeme (zum Beispiel ein Dual-Flap-Prime-Editing-System und ein Quadruple-Flap-Prime-Editing-System beinhaltend), die die mit der Flap-Equilibrierung und dem anschließenden Einbau des Edits in den nicht-editierten komplementären genomischen DNA-Strang verbundenen Herausforderungen durch gleichzeitiges Editieren beider DNA-Stränge lösen. Beim Dual- Flap-Prime-Editing werden zwei PEgRNAs verwendet, die auf entgegengesetzte Stränge einer genomischen Stelle abzielen und die Synthese von zwei komplementären 3'-Flaps ansteuern, die die editierte DNA-Sequenz enthalten (90). Im Quadruple-Flap-Prime-Editing-System werden vier PEgRNAs verwendet, die die Synthese von vier 3'-Flaps steuern, von denen zwei zueinander komplementär sind und die anderen beiden zueinander komplementär sind (95, 96A und 98A). Im Gegensatz zum klassischen Prime-Editing muss das Paar der editierten DNA-Stränge (3'-Flaps) nicht direkt mit den 5'-Flaps der endogenen genomischen DNA konkurrieren, da stattdessen der komplementäre editierte Strang für die Hybridisierung zur Verfügung steht. Da beide Stränge des Duplex als editierte DNA synthetisiert werden, erübrigt sich beim Multi-Flap-Prime-Editing der Austausch des nicht- editierten komplementären DNA-Strangs, der beim klassischen Prime-Editing erforderlich ist. Stattdessen muss die zelluläre DNA-Reparaturmaschinerie nur die gepaarten 5'-Flaps (ursprüngliche genomische DNA) herausschneiden und die gepaarten 3'-Flaps (editierte DNA) in den Locus ligieren. Daher müssen die neu synthetisierten DNA-Stränge keine Sequenzen enthalten, die mit der genomischen DNA homolog sind, was eine selektive Hybridisierung der neuen Stränge ermöglicht und ein Editieren mit minimaler genomischer Homologie erleichtert. Nuklease-aktive Versionen von Multi-Flap Prime-Editoren, die beide DNA-Stränge schneiden, könnten auch verwendet werden, um die Entfernung der ursprünglichen DNA-Sequenz zu beschleunigen.
  • Wie das klassische Prime-Editing ist das Multi-Flap-Prime-Editing ein vielseitiges und präzises Verfahren zum Genom-Editing, bei dem neue genetische Informationen direkt in eine bestimmte DNA-Stelle geschrieben werden, und zwar mit Hilfe eines programmierbaren DNA- Bindungsproteins („napDNAbp“), das mit einer Polymerase (d. h. in Form eines Fusionsproteins oder anderweitig in trans mit dem napDNAbp bereitgestellt), wobei das Prime- Editing-System mit einer Prime-Editing (PE)-Leit-RNA („PEgRNA“) programmiert ist, die sowohl die Zielstelle spezifiziert als auch die Synthese des gewünschten Edits in Form eines Austausch-DNA-Strangs mittels einer auf eine Leit-RNA (z. B. am 5'- oder 3'-Ende oder an einem internen Abschnitt einer Leit-RNA) aufgebrachten Verlängerung (entweder DNA oder RNA) als Templat bereitstellt. Der Austauschstrang, der den gewünschten Edit enthält (z. B. eine einzelne Nukleobasensubstitution), weist dieselbe Sequenz auf wie der endogene Strang der zu editierenden Zielstelle (mit der Ausnahme, dass er den gewünschten Edit beinhaltet). Durch die DNA-Reparatur- und/oder Replikationsmaschinerie wird der endogene Strang der Zielstelle durch den neu synthetisierten Austauschstrang ersetzt, der den gewünschten Edit enthält. In einigen Fällen kann das Prime-Editing als eine „Suchen-und-Ersetzen“-Technologie für das Genom-Editing angesehen werden, da die Dual-Prime-Editoren, wie hierin beschrieben, nicht nur die gewünschte zu editierende Zielstelle suchen und lokalisieren, sondern gleichzeitig einen Austauschstrang kodieren, der den gewünschten Edit enthält und anstelle des entsprechenden endogenen DNA-Strangs der Zielstelle eingebaut wird.
  • Beim Dual-Flap Prime-Editing wird eine doppelsträngige DNA-Sequenz an einer Zielstelle mit einem ersten und einem zweiten Prime-Editor-Komplex in Kontakt gebracht. Jeder Komplex umfasst ein Fusionsprotein und eine PEgRNA. In einigen Ausführungsformen umfasst jedes Fusionsprotein ein Nukleinsäure-programmierbares DNA-Bindungsprotein (napDNAbp) und ein Polypeptid mit einer RNA-abhängigen DNA-Polymerase-Aktivität (z. B. eine reverse Transkriptase), und jede PEgRNA weist eine Spacer-Sequenz, einen gRNA-Kern, ein DNA-Synthese-Templat und eine Primer-Bindungsstelle auf. Jedes DNA-Synthese- Templat kann eine einzelsträngige DNA-Sequenz kodieren, die einen editierten Abschnitt von einem oder mehreren Nukleotiden umfassen kann. Die beiden kodierten einzelsträngigen DNA-Sequenzen können komplementär zueinander sein und einen Duplex bilden, der in die zu editierende Zielstelle integriert werden kann. Die verschiedenen Elemente der Prime-Editor- Komplexe (z. B. Fusionsproteine, napDNAbp, Polymerase, PEgRNAs usw.) können jede beliebige der Ausführungsformen der hierin offengelegten Systeme umfassen.
  • Beim Quadruple-Flap Prime-Editing wird eine doppelsträngige DNA-Sequenz an einer Zielstelle mit einem ersten, einem zweiten, einem dritten und einem vierten Prime-Editor- Komplex in Kontakt gebracht. Jeder Komplex umfasst ein Fusionsprotein und eine PEgRNA. In einigen Ausführungsformen umfasst jedes Fusionsprotein ein Nukleinsäure- programmierbares DNA-Bindungsprotein (napDNAbp) und ein Polypeptid mit einer RNA- abhängigen DNA-Polymerase-Aktivität (z. B. eine reverse Transkriptase), und jede PEgRNA weist eine Spacer-Sequenz, einen gRNA-Kern, ein DNA-Synthese-Templat und eine Primer- Bindungsstelle auf. Jedes DNA-Synthese-Templat kodiert eine einzelsträngige DNA-Sequenz. Die beiden kodierten einzelsträngigen DNA-Sequenzen können komplementär zueinander sein und einen Duplex bilden, der in die zu editierende Zielstelle integriert werden kann. Die verschiedenen Elemente der Prime-Editor-Komplexe (z. B. Fusionsproteine, napDNAbp, Polymerase, PEgRNAs usw.) können jede der Ausführungsformen der hierin offengelegten Systeme umfassen.
  • Die hierin bereitgestellten Verfahren für Mulit-Flap-Prime-Editing können für zahlreiche Anwendungen genutzt werden. Zum Beispiel können sie verwendet werden, um die Inversion einer Ziel-DNA-Sequenz zu erleichtern. In dieser Anwendung befinden sich eine erste einzelsträngige DNA-Sequenz, die durch das DNA-Synthese-Templat der ersten PEgRNA kodiert wird, und eine zweite einzelsträngige DNA-Sequenz, die durch das DNA- Synthese-Templat der zweiten PEgRNA kodiert wird, an entgegengesetzten Enden einer Ziel- DNA-Sequenz, und eine dritte einzelsträngige DNA-Sequenz, die durch das DNA-Synthese- Templat der dritten PEgRNA kodiert wird, und befinden sich eine vierte einzelsträngige DNA- Sequenz, die durch das DNA-Synthese-Templat einer vierten PEgRNA kodiert wird, an entgegengesetzten Enden derselben Ziel-DNA-Sequenz.
  • In einigen Ausführungsformen umfassen die hierin bereitgestellten Verfahren zum Mulit-Flap-Prime-Editing ferner das Bereitstellen eines zirkulären DNA-Donors, von dem ein Teil an einer Zielstelle in eine doppelsträngige Nukleinsäure integriert werden kann. In dieser Anwendung befinden sich eine erste einzelsträngige DNA-Sequenz, die durch das DNA- Synthese-Templat der ersten PEgRNA kodiert wird, und eine dritte einzelsträngige DNA- Sequenz, die durch das DNA-Synthese-Templat der dritten PEgRNA kodiert wird, an entgegengesetzten Enden der Ziel-DNA-Sequenz, und befinden sich eine zweite einzelsträngige DNA-Sequenz, die durch das DNA-Synthese-Templat der zweiten PEgRNA kodiert wird, und eine vierte einzelsträngige DNA-Sequenz, die durch das DNA-Synthese- Templat der vierten PEgRNA kodiert wird, auf dem zirkulären DNA-Donor. Der Abschnitt des zirkulären DNA-Donors zwischen der zweiten einzelsträngigen DNA-Sequenz und der vierten einzelsträngigen DNA-Sequenz kann einen Duplex bilden, der die Ziel-DNA-Sequenz zwischen der ersten einzelsträngigen DNA-Sequenz und der dritten einzelsträngigen DNA- Sequenz ersetzt.
  • In einer anderen Anwendung ermöglichen die hierin bereitgestellten Verfahren zum Mulit-Flap-Prime-Editing die Translokation einer Ziel-DNA-Sequenz von einem ersten Nukleinsäuremolekül (z. B. einem ersten Chromosom) zu einem zweiten Nukleinsäuremolekül (z. B. einem zweiten Chromosom). In dieser Anwendung befinden sich eine erste einzelsträngige DNA-Sequenz, die durch das DNA-Synthese-Templat der ersten PEgRNA kodiert wird, und eine dritte einzelsträngige DNA-Sequenz, die durch das DNA-Synthese- Templat der dritten PEgRNA kodiert wird, auf einem ersten Nukleinsäuremolekül, und befinden sich eine zweite einzelsträngige DNA-Sequenz, die durch das DNA-Synthese- Templat der zweiten PEgRNA kodiert wird, und eine vierte einzelsträngige DNA-Sequenz, die durch das DNA-Synthese-Templat der vierten PEgRNA kodiert wird, auf einem zweiten Nukleinsäuremolekül. Der Abschnitt des ersten Nukleinsäuremoleküls zwischen der ersten einzelsträngigen DNA-Sequenz und der dritten einzelsträngigen DNA-Sequenz kann in das zweite Nukleinsäuremolekül eingebaut werden, und der Abschnitt des zweiten Nukleinsäuremoleküls zwischen der zweiten einzelsträngigen DNA-Sequenz und der vierten einzelsträngigen DNA-Sequenz wird in das erste Nukleinsäuremolekül eingebaut.
  • Andere Verfahren
  • Die vorliegende Offenbarung stellt Verfahren zur Behandlung eines Patienten bereit, bei dem eine Krankheit diagnostiziert wurde, die mit einer Punktmutation oder anderen Mutationen (z. B. Deletion, Insertion, Inversion, Duplikation usw.) assoziiert ist, die durch das hierin bereitgestellte Mulit-Flap-Prime-Editing-System korrigiert werden können, wie z. B. unter anderem die Prionenkrankheit (z. B. Beispiel 5 hierin), die Trinukleotid-Repeat- Expansionskrankheit (z. B. Beispiel 3 hierin) oder die CDKL5-Mangelerkrankung (CDD) (z. B. Beispiel 23 hierin).
  • Praktisch jeder krankheitsverursachende genetische Defekt kann durch Multi-Flap- Prime-Editing repariert werden, was die Auswahl eines geeigneten Prime-Editor- Fusionsproteins (einschließlich eines napDNAbp und einer Polymerase (z. B. einer reversen Transkriptase) und das Ausgestalten einer geeigneten PEgRNA beinhaltet, die dazu ausgestaltet ist, (a) auf die geeignete, eine Editstelle enthaltende Ziel-DNA abzuzielen und (b) ein Templat für die Synthese eines DNA-Einzelstrangs vom 3'-Ende der die gewünschte Editstelle beinhaltenden Nickstelle bereitzustellen, die den endogenen Strang sofort stromabwärts der Nickstelle verdrängt und ersetzt. Multi-Flap-Prime-Editing kann ohne Einschränkung verwendet werden, um (a) mutationskorrigierende Änderungen an einer Nukleotidsequenz einzubauen, (b) Protein- und RNA-Tags einzubauen, (c) Immunepitope auf Proteinen von Interesse einzubauen, (d) induzierbare Dimerisierungsdomänen in Proteine einzubauen, (e) Sequenzen einzubauen oder zu entfernen, um diese Aktivität eines Biomoleküls zu verändern, (f) Rekombinase-Zielstellen einzubauen, um spezifische genetische Veränderungen zu steuern, und (g) zur Mutagenese einer Zielsequenz unter Verwendung einer fehleranfälligen RT.
  • Das Verfahren zur Behandlung einer Störung kann in einem frühen Schritt die Ausgestaltung einer geeigneten PEgRNA und eines geeigneten Prime-Editor-Fusionsproteins gemäß den hierin beschriebenen Verfahren beinhalten, die eine Reihe von Überlegungen beinhalten, die berücksichtigt werden können, wie zum Beispiel:
    1. (a) die Zielsequenz, d. h. die Nukleotidsequenz, in der eine oder mehrere Nukleobasenmodifikationen durch den Prime-Editor eingebaut werden sollen;
    2. (b) die Position der Schnittstelle innerhalb der Zielsequenz, d. h. die spezifische Nukleobasenposition, an der der Prime-Editor einen Single-Stand-Nick induziert, um eine 3'- Ende-RT-Primersequenz auf einer Seite des Nicks und den 5'-Ende-endogenen Flap auf der anderen Seite des Nicks zu erzeugen (der schließlich durch FEN1 oder ein Äquivalent dazu entfernt und durch den 3'-ssDNA-Flap ersetzt wird. Die Schnittstelle erzeugt die 3'-End- Primersequenz, die während der RNA-abhängigen DNA-Polymerisation durch die Polymerase des PE-Fusionsproteins (z. B. ein RT-Enzym) verlängert wird, um den 3'-ssDNA-Flap mit dem gewünschten Edit zu erzeugen, der dann den 5'-endogenen DNA-Flap in der Zielsequenz erzeugt.
    3. (c) die verfügbaren PAM-Sequenzen (einschließlich der kanonischen SpCas9-PAM-Stellen sowie nicht-kanonischer PAM-Stellen, die von Cas9-Varianten und Äquivalenten mit erweiterten oder unterschiedlichen PAM-Spezifitäten erkannt werden);
    4. (d) den Abstand zwischen den verfügbaren PAM-Sequenzen und die Lage der Schnittstelle im PAM-Strang;
    5. (e) das jeweilige Cas9, die Cas9-Variante oder das Cas9-Äquivalent des zur Verwendung verfügbaren Prime-Editors (was teilweise durch das verfügbare PAM diktiert wird);
    6. (f) die Sequenz und Länge der Primer-Bindungsstelle;
    7. (g) die Reihenfolge und Länge des Edit-Templats;
    8. (h) die Sequenz und Länge des Homologiearms;
    9. (i) die Spacer-Sequenz und -Länge; und
    10. (j) die gRNA-Kernsequenz.
  • Eine geeignete PEgRNA und optional ein Nicking-sgRNA-Ausgestaltungs-Guide für Zweitstellen-Nicking kann mit Hilfe der folgenden beispielhaften Schritt-für-Schritt-Anleitung ausgestaltet werden, die eine oder mehrere der obigen Überlegungen berücksichtigt. Die Schritte beziehen sich auf die in den 70A-70I gezeigten Beispiele.
    1. 1. Definieren der Zielsequenz und des Edits. Man rufe die Sequenz der Ziel-DNA- Region (-200 bp) ab, die um den Ort des gewünschten Edits (Punktmutation, Insertion, Deletion oder Kombination davon) zentriert ist. Siehe 70A.
    2. 2. Lokalisieren der Ziel-PAMs. Man identifiziere die PAMs in der Nähe der gewünschten Edit-Ortes. PAMs können auf jedem DNA-Strang in der Nähe des gewünschten Edit-Ortes identifiziert werden. Während PAMs in der Nähe der Edit-Position bevorzugt werden (d. h. bei denen die Nickstelle weniger als 30 nt von der Edit-Position entfernt ist oder weniger als 29 nt, 28 nt, 27 nt, 26 nt, 25 nt, 24 nt, 23 nt, 22 nt, 21 nt, 20 nt, 19 nt, 18 nt, 17 nt, 16 nt, 15 nt, 14 nt, 13 nt, 12 nt, 11 nt, 10 nt, 9 nt, 8 nt, 7 nt, 6 nt, 5 nt, 4 nt, 3 nt oder 2 nt von der Edit-Position zur Nickstelle), ist es möglich, Edits mit Protospacern und PAMs einzubauen, die den Nick ≥ 30 nt von der Edit-Position entfernt platzieren. Siehe 70B.
    3. 3. Lokalisieren der Nickstellen. Für jede in Betracht gezogene PAMM identifiziere man die entsprechende Nickstelle und auf welchem Strang. Für Sp-Cas9-H840A-Nickase erfolgt die Spaltung im PAM enthaltenden Strang zwischen der 3. und 4. Base 5' zur NGG PAM. Alle editierten Nukleotide müssen 3' von der Nickstelle existieren, daher müssen geeignete PAMs den Nick 5' zum Ziel-Edit auf dem PAM-enthaltenden Strang platzieren. Im unten gezeigten Beispiel gibt es zwei mögliche PAMs. Der Einfachheit halber demonstrieren die verbleibenden Schritte die Ausgestaltung einer PEgRNA, die nur PAM 1 verwendet. Siehe 70C.
    4. 4. Ausgestalten der Spacer-Sequenz. Der Protospacer von SpCas9 entspricht den 20 Nukleotiden 5' zum NGG-PAM auf dem PAM-enthaltenden Strang. Eine effiziente Pol-III- Transkriptionsinitiation erfordert, dass das erste transkribierte Nukleotid ein G ist. Wenn das erste Nukleotid des Protospacers ein G ist, ist die Spacer-Sequenz für die PEgRNA einfach die Protospacersequenz. Wenn das erste Nukleotid des Protospacers kein G ist, ist die Spacer- Sequenz der PEgRNA G gefolgt von der Protospacersequenz. Siehe 70D.
    5. 5. Ausgestalten einer Primer-Bindungsstelle (PBS). Man identifiziere das DNA- Primers auf dem PAM-enthaltenden Strang mithilfe der Allel-Startsequenz. Das 3'-Ende des DNA-Primers ist das Nukleotid direkt stromaufwärts der Nickstelle (d. h. die 4. Base 5' von der NGG-PAM für Sp-Cas9). Als allgemeines Ausgestaltungsprinzip für die Verwendung mit PE2 und PE3 kann eine PEgRNA-Primer-Bindungsstelle (PBS) mit 12 bis 13 Nukleotiden komplementär zum DNA-Primer für Sequenzen verwendet werden, die -40-60 % GC-Gehalt enthalten. Bei Sequenzen mit geringem GC-Gehalt sollten längere (14- bis 15-nt)-PBSs getestet werden. Bei Sequenzen mit höherem GC-Gehalt sollten kürzere (8- bis 11-nt)-PBSs getestet werden. Optimale PBS-Sequenzen sollten unabhängig vom GC-Gehalt empirisch bestimmt werden. Um eine PBS-Sequenz der Länger auszugestalten, nehme man das reverse Komplement der ersten p-Nukleotide 5' von der Nickstelle in dem PAM-enthaltenden Strang unter Verwendung der Allel-Startsequenz. Siehe 70E.
    6. 6. Ausgestalten eines RT-Templats (oder DNA-Synthese-Templats). Das RT-Templat (oder DNA-Synthese-Templat, bei der die Polymerase keine Reverse Transkriptase ist) kodiert das ausgestaltete Edit und die Homologie zu der Sequenz neben dem Edit. In einer Ausführungsform entsprechen diese Regionen dem DNA-Synthese-Templat von 3D und 3E, wobei das DNA-Synthese-Templat das „Edit-Templat“ und den „Homologiearm“ umfasst. Die optimale Länge des RT-Templats variiert je nach Zielstelle. Für Short-Range- Edits (Positionen +1 bis +6) wird empfohlen, ein kurzes (9 bis 12 nt), ein mittleres (13 bis 16 nt) und ein langes (17 bis 20 nt) RT-Template zu testen. Für Long-Range-Edits (Positionen +7 und darüber hinaus) wird empfohlen, RT-Template zu verwenden, die sich mindestens 5 nt (vorzugsweise 10 oder mehr nt) über die Position des Edits hinaus erstrecken, um eine ausreichende 3'-DNA-Flap-Homologie zu ermöglichen. Für Long-Range-Edits sollten mehrere RT-Template überprüft werden, um funktionale Ausgestaltungen zu identifizieren. Für größere Insertionen und Deletionen (≥5 nt) wird der Einbau einer größeren 3'-Homologie (-20 nt oder mehr) in das RT-Templat empfohlen. Die Editing-Effizienz wird typischerweise beeinträchtigt, wenn das RT-Templat die Synthese eines G als letztes Nukleotid im revers transkribierten DNA-Produkt kodiert (entsprechend einem C im RT-Templat der PEgRNA). Da viele RT- Template ein effizientes Prime-Editing unterstützen, wird bei der Ausgestaltung von RT- Templaten empfohlen, G als das endgültig synthetisierte Nukleotid zu vermeiden. Um eine RT- Templat-Sequenz der Länge r auszugestalten, verwende man die gewünschte Allelsequenz und nehme man das reverse Komplement der ersten r-Nukleotide 3' von der Nickstelle in dem Strang, der ursprünglich die PAM enthielt. Man beachte, dass im Vergleich zu SNP-Edits Insertions- oder Deletions-Edits unter Verwendung von RT-Templaten derselben Länge keine identische Homologie enthalten. Siehe 70F.
    7. 7. Zusammenbauen der vollständigen PEgRNA-Sequenz. Man verkette die PEgRNA- Komponenten in der folgenden Reihenfolge (5' bis 3'): Spacer, Gerüst, RT-Template und PBS. Siehe 70G.
    8. 8. Ausgestalten von Nicking-sgRNAs für PE3. Man identifiziere PAMs auf dem nicht- editierten Strang stromaufwärts und stromabwärts des Edits. Optimale Nicking-Positionen sind stark ortsabhängig und sollten empirisch bestimmt werden. Im Allgemeinen führen Nicks, die 40 bis 90 Nukleotide 5' von der Position gegenüber dem PEgRNA-induzierten Nick platziert werden, zu höheren Editing-Ausbeuten und weniger Indels. Eine Nicking-sgRNA hat eine Spacer-Sequenz, die mit dem 20-nt-Protospacer im Startallel übereinstimmt, mit dem Zusatz eines 5'-G, wenn der Protospacer nicht mit einem G beginnt. Siehe 70H.
    9. 9. Ausgestalten von PE3b Nicking-sgRNAs. Wenn eine PAM im komplementären Strang existiert und ihr entsprechender Protospacer mit der für das Editing anvisierten Sequenz überlappt, könnte dieses Edit ein Kandidat für das PE3b-System sein. Im PE3b-System stimmt die Spacer-Sequenz der Nicking-sgRNA mit der Sequenz des gewünschten editierten Allels überein, jedoch nicht mit dem Startallel. Das PE3b-System arbeitet effizient, wenn das (die) editierte(n) Nukleotid(e) in die Saatregion (~10 nt neben der PAM) des Nicking-sgRNA- Protospacers fällt. Dies verhindert das Nicken des komplementären Strangs bis nach dem Einbau des editierten Strangs, wodurch Konkurrenz zwischen der PEgRNA und der sgRNA um die Bindung der Ziel-DNA verhindert wird. PE3b vermeidet auch die Erzeugung simultaner Nicks auf beiden Strängen, wodurch die Informationsbildung erheblich reduziert wird, während eine hohe Editing-Effizienz beibehalten wird. PE3b-sgRNAs sollten eine Spacer- Sequenz aufweisen, die mit dem 20-nt-Protospacer im gewünschten Allel übereinstimmt, gegebenenfalls unter Hinzufügung eines 5'-G. Siehe 70I.
  • Das obige schrittweise Verfahren zum Ausgestalten einer geeigneten PEgRNA und einer Zweitstellen-Nicking-sgRNA soll in keiner Weise einschränkend sein. Die Offenbarung sieht Variationen des oben beschriebenen Schritt-für-Schritt-Verfahrens vor, die von einem Durchschnittsfachmann daraus abgeleitet werden können.
  • Sobald eine geeignete PEgRNA und ein geeignetes PE-Fusionsprotein ausgewählt/ausgestaltet sind, können sie durch eine geeignete Methodik eingeschleust werden, wie etwa durch vektorbasierte Transfektion (bei der ein oder mehrere Vektoren, die DNA umfassen, die für die PEgRNA und das PE-Fusionsprotein kodiert und innerhalb einer Zelle nach Transfektion mit den Vektoren exprimiert werden), direkte Einschleusung des mit der PEgRNA komplexierten PE-Fusionsproteins (z. B. RNP-Verabreichung) in einem Einschleusungsformat (z. B. Lipidpartikel, Nanopartikel) oder durch ein mRNA-basiertes Einschleusungssystem. Solche Verfahren werden hierin in der vorliegenden Offenbarung beschrieben und jedes bekannte Verfahren kann verwendet werden.
  • Die PEgRNA und das PE-Fusionsprotein (oder zusammen als PE-Komplex bezeichnet) können in einer therapeutisch wirksamen Menge in eine Zelle eingeschleust werden, so dass bei Kontakt mit der Ziel-DNA von Interesse das gewünschte Edit darin eingebaut wird.
  • Es ist vorstellbar, dass jede Krankheit durch solche Verfahren behandelbar ist, solange die Einschleusung in die geeigneten Zellen durchführbar ist. Der Durchschnittsfachmann wird in der Lage sein, eine PE-Einschleusungsmethodik zu wählen und/oder zu selektieren, die dem beabsichtigten Zweck und den beabsichtigten Ziel-Zellen entspricht.
  • Beispielsweise wird in einigen Ausführungsformen ein Verfahren bereitgestellt, das die Verabreichung einer wirksamen Menge des hierin beschriebenen Multi-Flap Prime-Editing- Systems, das die Punktmutation korrigiert, an einen Patienten mit einer solchen Krankheit umfasst, z. B. einen Krebs, der mit einer Punktmutation wie oben beschrieben verbunden ist, oder eine desaktivierende Mutation in ein krankheitsassoziiertes Gen einführt, wie durch homologiegerichtete Reparatur in Gegenwart eines Donor-DNA-Moleküls, das die gewünschte genetische Veränderung umfasst, vermittelt wird. In einigen Ausführungsformen wird ein Verfahren bereitgestellt, das die Verabreichung einer wirksamen Menge des hierin beschriebenen Mulit-Flap-Prime-Editing-Systems, das die Punktmutation korrigiert oder eine deaktivierende Mutation in ein krankheitsassoziiertes Gen einführt, an einen Patienten mit einer solchen Krankheit umfasst, z. B. einen Krebs, der mit einer Punktmutation wie oben beschrieben verbunden ist. In einigen Ausführungsformen ist die Krankheit eine proliferative Krankheit. In einigen Ausführungsformen ist die Krankheit eine genetische Krankheit. In einigen Ausführungsformen ist die Krankheit eine neoplastische Krankheit. In einigen Ausführungsformen ist die Krankheit eine metabolische Krankheit. In einigen Ausführungsformen ist die Krankheit eine lysosomale Speicherkrankheit. Andere Krankheiten, die durch Korrigieren einer Punktmutation oder Einführen einer deaktivierenden Mutation in ein krankheitsassoziiertes Gen behandelt werden können, sind dem Fachmann bekannt und die Offenbarung ist diesbezüglich nicht beschränkt.
  • Die vorliegende Offenbarung stellt Verfahren zur Behandlung zusätzlicher Krankheiten oder Störungen bereit, z. B. Krankheiten oder Störungen, die mit einer Punktmutation assoziiert sind oder dadurch verursacht werden, die durch TPRT-vermitteltes Gen-Editing korrigiert werden können. Einige dieser Krankheiten werden hierin beschrieben, und zusätzliche geeignete Krankheiten, die mit den hierin bereitgestellten Strategien und Fusionsproteinen behandelt werden können, werden Fachleuten auf der Grundlage der vorliegenden Offenbarung offensichtlich sein. Beispielhafte geeignete Krankheiten und Störungen sind unten aufgeführt. Es versteht sich, dass die Numerierung der spezifischen Positionen oder Reste in den jeweiligen Sequenzen von dem jeweiligen verwendeten Protein und Numerierungsschema abhängt. Die Nummerierung kann unterschiedlich sein, z. B. bei Vorläufern eines reifen Proteins und dem reifen Protein selbst, und Unterschiede in den Sequenzen von Spezies zu Spezies können die Nummerierung beeinflussen. Ein Fachmann wird in der Lage sein, den jeweiligen Rest in jedem homologen Protein und in der jeweiligen kodierenden Nukleinsäure durch im Fachgebiet wohlbekannte Verfahren zu identifizieren, z. B. durch Sequenz-Alignment und Bestimmung von homologen Resten. Beispielhafte geeignete Krankheiten und Störungen umfassen ohne Einschränkung: 2-Methyl-3- Hydroxybuttersäureurie; 3-Beta-Hydroxysteroid-Dehydrogenase-Mangel; 3- Methylglutaconsäureurie; 3-Oxo-5-Alpha-Steroid-Delta-4-Dehydrogenase-Mangel; 46,XY- Geschlechtsumkehr, Typ 1, 3 und 5; 5-Oxoprolinase-Mangel; 6-Pyruvoyl-Tetrahydropterin- Synthase-Mangel; Aarskog-Syndrom; Aase-Syndrom; Achondrogenese Typ 2; Achromatopsie 2 und 7; Erworbenes Long-QT-Syndrom; Akrokallosales Syndrom, Schinzel-Typ; Akrokapitofemorale Dysplasie; Akrodysostose 2, mit oder ohne Hormonresistenz; Akroerythrokeratodermie; Akromikrische Dysplasie; Acth-unabhängige makronoduläre Nebennierenhyperplasie 2; Aktiviertes PI3K-Delta-Syndrom; Akute intermittierende Porphyrie; Mangel an Acyl-CoA-Dehydrogenase-Familie, Mitglied 9; Adams-Oliver- Syndrom 5 und 6; Adenin-Phosphoribosyltransferase-Mangel; Adenylatkinase-Mangel; hämolytische Anämie aufgrund von Adenylosuccinat-Lyase-Mangel; jugendliche Nephronophthise; renal-hepatisch-pankreatische Dysplasie; Meckel-Syndrom Typ 7; Adrenoleukodystrophie; junktionale Epidermolysis bullosa im Erwachsenenalter; Epidermolysis bullosa junctionalis, Variante localisata; Neuronale Ceroidlipofuszinose im Erwachsenenalter; Neuronale Ceroidlipofuszinose im Erwachsenenalter; Ataxie im Erwachsenenalter mit okulomotorischer Apraxie; ADULT-Syndrom; Afibrinogenämie und kongenitale Afibrinogenämie; autosomal rezessive Agammaglobulinämie 2; altersbedingte Makuladegeneration 3, 6, 11 und 12; Aicardi-Goutieres-Syndrome 1, 4 und 5; Chilbain-Lupus 1; Alagille-Syndrome 1 und 2; Alexander-Krankheit; Alkaptonurie; Allan-Hemdon-Dudley- Syndrom; Kongenitale Alopecia universalis; Alpers-Enzephalopathie; Alpha-1-Antitrypsin- Mangel; autosomal dominante, autosomal rezessive und X-chromosomal rezessive Alport- Syndrome; Alzheimer-Krankheit, familiär, 3, mit spastischer Paraparese und Apraxie; Alzheimer-Krankheit, Typen, 1, 3 und 4; Hypokalzifizierungstyp und Hypomaturationstyp, IIA1 Amelogenesis imperfecta; Aminoacylase-1-Mangel; Amish infantile epilepsy syndrome; Amyloidogene Transthyretin-Amyloidose; Amyloid-Kardiomyopathie, Transthyretinbezogen; Kardiomyopathie; Amyotrophe Lateralsklerose Typ 1, 6, 15 (mit oder ohne frontotemporaler Demenz), 22 (mit oder ohne Frontotemporaler Demenz) und 10; Frontotemporale Demenz mit TDP43-Einschlüssen, TARDBP-bezogen; Andermann- Syndrom; Andersen-Tawil-Syndrom; Kongenitales Long-QT-Syndrom; Anämie, nichtsphärozytäre hämolytische, aufgrund von G6PD-Mangel; Angelman-Syndrom; Schwere neonatale Enzephalopathie mit Mikrozephalie; Anfälligkeit für Autismus, X-chromosomal 3; Angiopathie, erblich, mit Nephropathie, Aneurysmen und Muskelkrämpfen; Angiotensin i- konvertierendes Enzym, gutartige Serumerhöhung; Aniridie, zerebelläre Ataxie und geistige Retardierung; Anonychie; Antithrombin-III-Mangel; Antley-Bixler-Syndrom mit genitalen Anomalien und gestörter Steroidogenese; Aortenaneurysma, familiäres thorakales 4, 6 und 9; Thorakale Aortenaneurysmen und Aortendissektionen; Multisystemisches Syndrom der Dysfunktion der glatten Muskulatur; Moyamoya-Krankheit 5; Aplastische Anämie; Offensichtlicher Mineralokortikoidüberschuss; Arginase-Mangel; Argininosuccinat-Lyase- Mangel; Aromatase-Mangel; Arrhythmogene rechtsventrikuläre Kardiomyopathie Typ 5, 8 und 10; Primäre familiäre hypertrophe Kardiomyopathie; Arthrogryposis multiplex congenita, distal, X-chromosomal; Arthrogrypose-Nierenfunktionsstörung-Cholestase-Syndrom; Arthrogrypose, Nierenfunktionsstörung und Cholestase 2; Asparagin-Synthetase-Mangel; Abnormalität der neuronalen Migration; Ataxie mit Vitamin-E-Mangel; Ataxie, sensorisch, autosomal-dominant; Ataxie-Telangiektasie-Syndrom; Hereditäres Krebs-prädisponierendes Syndrom; Atransferrinämie; Vorhofflimmern, familiär, 11, 12, 13 und 16; Vorhofseptumdefekte 2, 4 und 7 (mit oder ohne atrioventrikuläre Erregungsleitungsstörungen); Vorhofstillstand 2; Atrioventrikulärer Septumdefekt 4; Atrophia bulborum hereditaria; ATR- X-Syndrom; Auriculocondylar-Syndrom 2; Autoimmunerkrankung, Multisystem, mit Beginn im Kindesalter; Autoimmunes lymphoproliferatives Syndrom, Typ 1a; Autosomal dominante hypohidrotische ektodermale Dysplasie; Autosomal dominante progressive externe Ophthalmoplegie mit mitochondrialen DNA-Deletionen 1 und 3; Autosomal dominante Torsionsdystonie 4; Autosomal rezessive zentronukleäre Myopathie; Autosomal rezessive kongenitale Ichthyose 1, 2, 3, 4A und 4B; Autosomal rezessive Cutis Laxa Typ IA und 1B; Autosomal rezessives hypohidrotisches ektodermales Dysplasie-Syndrom; Ektodermale Dysplasie 11b; Hypohidrotischer/Haar/Zahn-Typ, autosomal rezessiv; Autosomal rezessive hypophosphatämische Knochenkrankheit; Axenfeld-Rieger-Syndrom Typ 3; Bainbridge- Ropers-Syndrom; Bannayan-Riley-Ruvalcaba-Syndrom; PTEN-Hamartom-Tumorsyndrom; Baraitser-Winter-Syndrome 1 und 2; Barakat-Syndrom; Bardet-Biedl-Syndrome 1, 11, 16 und 19; Bare-Lymphozyten-Syndrom Typ 2, Komplementgruppe E; Bartter-Syndrom vorgeburtlicher Typ 2; Bartter-Syndrom Typ 3, 3 mit Hypocalciurie und 4; Basalganglienverkalkung, idiopathisch, 4; Spindelhaare; gutartige familiäre Hämaturie; gutartige familiäre neonatale Anfälle 1 und 2; Anfälle, gutartige familiäre neonatale, 1, und/oder Myokymie; Anfälle, frühkindliche epileptische Enzephalopathie 7; gutartige familiäre neonatale-infantile Anfälle; Benigne hereditäre Chorea; Benigne skapuloperoneale Muskeldystrophie mit Kardiomyopathie; Bernard-Soulier-Syndrom, Typ A1 und A2 (autosomal dominant); Bestrophinopathie, autosomal rezessiv; Beta-Thalassämie; Bethlem- Myopathie und Bethlem-Myopathie 2; Bietti kristalline korneoretinale Dystrophie; Gallensäure-Synthesedefekt, kongenital, 2; Biotinidase-Mangel; Birk-Barel-Syndrom der mentalen Retardierung; Blepharophimose, Ptosis und Epikanthus inversus; Bloom-Syndrom; Borjeson-Forssman-Lehmann-Syndrom; Boucher-Neuhauser-Syndrom; Brachydaktylie Typ A1 und A2; Brachydaktylie mit Bluthochdruck; Erkrankung der kleinen Hirngefäße mit Blutungen; Mangel an verzweigtkettiger Keto-Säure-Dehydrogenase-Kinase; Branchiootische Syndrome 2 und 3; Brustkrebs, frühes Auftreten; Brust- und Eierstockkrebs, familiäres 1, 2 und 4; Hornhautbrüchigkeitssyndrom 2; Brody-Myopathie; Bronchiektasie mit oder ohne erhöhtem Schweißchlorid 3; Brown-Vialetto-Van Laere-Syndrom und Brown-Vialetto-Van Laere-Syndrom 2; Brugada-Syndrom; Brugada-Syndrom 1; Kammerflimmern; Paroxysmales familiäres Kammerflimmern; Brugada-Syndrom und Brugada-Syndrom 4; Langes QT- Syndrom; Plötzlicher Herztod; Stieraugen-Makuladystrophie; Stargardt-Krankheit 4; Zapfen- Stäbchen-Dystrophie 12; Bulöse ichthyosiforme Erythrodermie; Burn-Mckeown-Syndrom; Candidiasis, familiär, 2, 5, 6 und 8; Kohlenhydratdefizit-Glykoprotein-Syndrom Typ I und II; Kohlensäureanhydrase-VA-Mangel, Hyperammonämie aufgrund von; Kolonkarzinom; Herzrhythmusstörungen; Long-QT-Syndrom, LQT1-Subtyp; Kardioenzephalomyopathie, tödlich infantil, aufgrund von Cytochrom-c-Oxidase-Mangel; kardiofaziokutanes Syndrom; Kardiomyopathie; Danon-Krankheit; hypertrophe Kardiomyopathie; Linksventrikuläre Nichtkompaktions-Kardiomyopathie; Carnevale-Syndrom; Carney-Komplex, Typ 1; Carnitin- Acylcamitin-Translokase-Mangel; Carnitin-Palmitoyltransferase I, II, II (spät einsetzender) und II (kindlicher) Mangel; Katarakt 1, 4, autosomal-dominant, autosomal-dominant, multiple Typen, mit Mikrokornea, kupferartig, juvenil, mit Mikrokornea und Glukosurie, und nukleär diffus, nicht-progressiv; katecholaminerge polymorphe ventrikuläre Tachykardie; kaudales Regressionssyndrom; Cd8-Mangel, familiär; Zentrale Kernkrankheit; zentromerische Instabilität der Chromosomen 1, 9 und 16 und Immunschwäche; zerebelläre Ataxie infantil mit progressiver externer Ophthalmoplegie und zerebelläre Ataxie, geistige Retardierung und Dysequilibrium-Syndrom 2; Zerebrale Amyloid-Angiopathie, APP-bezogen; zerebrale autosomal dominante und rezessive Arteriopathie mit subkortikalen Infarkten und Leukoenzephalopathie; zerebrale kavernöse Malformationen 2; zerebro-okulofazioskeletales Syndrom 2; zerebro-okulo-fazioskeletales Syndrom; Zerebroretinale Mikroangiopathie mit Verkalkungen und Zysten; Ceroidlipofuszinose neuronal 2, 6, 7 und 10; Ch\xc3\xa9diak- Higashi-Syndrom , Chediak-Higashi-Syndrom, Erwachsenentyp; Charcot-Marie-Tooth- Krankheit Typ 1B, 2B2, 2C, 2F, 21, 2U (axonal), 1C (demyelinisierend), dominant intermediär C, rezessiv intermediär A, 2A2, 4C, 4D, 4H, IF, IVF und X; Skapuloperoneale spinale Muskelatrophie; Distale spinale Muskelatrophie, kongenital nicht-progressiv; Spinale Muskelatrophie, distal, autosomal rezessiv, 5; CHARGE-Assoziation; Hypophosphatasie im Kindesalter; Hypophosphatasie im Erwachsenenalter; Cholezystitis; Progressive familiäre intrahepatische Cholestase 3; Cholestase, intrahepatisch, in der Schwangerschaft 3; Cholesterinspeicherkrankheit; Cholesterinmonooxygenasemangel (Seitenkettenspaltung); Chondrodysplasie Blomstrand-Typ; Chondrodysplasia punctata 1, X-chromosomal rezessiv und 2 X-chromosomal dominant; CHOPS-Syndrom; Chronische granulomatöse Erkrankung, autosomal rezessiv, Cytochrom b-positiv, Typ 1 und 2; Chudley-McCullough-Syndrom; Ziliardyskinesie, primär, 7, 11, 15, 20 und 22; Citrullinämie Typ I; Citrullinämie Typ I und II; Cleidocraniale Dysostose; C-like-Syndrom; Cockayne-Syndrom Typ A; Coenzym-Q10- Mangel, primär 1, 4 und 7; Coffin Siris/Intellektuelle Behinderung; Coffin-Lowry-Syndrom; Cohen-Syndrom, ; Kälteinduziertes Schwitzsyndrom 1; COLE-CARPENTER-SYNDROM 2; Kombinierte zelluläre und humorale Immundefekte mit Granulomen; Kombinierte d-2- und 1- 2-Hydroxyglutarsäureurie; Kombinierte Malon- und Methylmalonsäureurie; Kombinierte oxidative Phosphorylierungsdefekte 1, 3, 4, 12, 15 und 25; Kombinierter partieller und vollständiger 17-alpha-Hydroxylase/17,20-Lyase-Mangel; Allgemeiner variabler Immundefekt 9; Komplementkomponente 4, partieller Mangel aufgrund eines dysfunktionalen c1-Inhibitors; Komplementfaktor-B-Mangel; Zapfen-Monochromatismus; Zapfen-Stäbchen- Dystrophie 2 und 6; Zapfen-Stäbchen-Dystrophie Amelogenesis imperfecta; kongenitale Nebennierenhyperplasie und kongenitale Nebennierenhypoplasie, X-chromosomal; Kongenitale amegakaryozytäre Thrombozytopenie; kongenitale Aniridie; kongenitale zentrale Hypoventilation; Morbus Hirschsprung 3; kongenitale kontraktale Arachnodaktylie; kongenitale Kontrakturen der Gliedmaßen und des Gesichts, Hypotonie und Entwicklungsverzögerung; Kongenitale Glykosylierungsstörung Typ 1B, 1D, 1G, 1H, 1J, 1K, 1N, 1P, 2C, 2J, 2K, IIm; kongenitale dyserythropoetische Anämie, Typ I und II; kongenitale ektodermale Dysplasie des Gesichts; kongenitale erythropoetische Porphyrie; kongenitale generalisierte Lipodystrophie Typ 2; Kongenitale Herzerkrankung, mehrere Typen, 2; Kongenitale Herzerkrankung; Unterbrochener Aortenbogen; Kongenitale lipomatöse Überwucherung, vaskuläre Fehlbildungen und epidermale Nävi; Nicht-kleinzelliger Lungenkrebs; Neoplasma des Eierstocks; Herzleitungsstörung, unspezifisch; Kongenitale mikrovillöse Atrophie; Kongenitale Muskeldystrophie; Kongenitale Muskeldystrophie aufgrund eines partiellen LAMA2-Mangels; Kongenitale Muskeldystrophie- Dystroglykanopathie mit Gehirn- und Augenanomalien, Typen A2, A7, A8, A11 und A14; Kongenitale Muskeldystrophie-Dystroglykanopathie mit mentaler Retardierung, Typen B2, B3, B5 und B15; Kongenitale Muskeldystrophie-Dystroglykanopathie ohne mentale Retardierung, Typ B5; Kongenitales Muskelhypertrophie-Zerebralsyndrom; Kongenitales myasthenisches Syndrom, Acetazolamid-empfindlich; Kongenitale Myopathie mit Fasertyp- Disproportion; Kongenitales Augenkolobom; Kongenitale stationäre Nachtblindheit, Typ 1A, 1B, 1C, 1E, 1F und 2A; Koproporphyrie; Cornea plana 2; Hornhautdystrophie, Fuchs endothelial, 4; Hornhautendotheldystrophie Typ 2; Hornhautfragilität Keratoglobus, blaue Skleren und Gelenkhypermobilität; Cornelia de Lange Syndrome 1 und 5; Koronare Herzkrankheit, autosomal dominant 2; Koronare Herzkrankheit; Hyperalphalipoproteinämie 2; Kortikale Dysplasie, komplex, mit anderen Hirnfehlbildungen 5 und 6; Kortikale Fehlbildungen, okzipital; Kortikosteroid-bindendes Globulin-Mangel; Corticosteron- Methyloxidase-Mangel Typ 2; Costello-Syndrom; Cowden-Syndrom 1; Coxa plana; Kraniodiaphysen-Dysplasie, autosomal dominant; Kraniosynostose 1 und 4; Kraniosynostose und Zahnanomalien; Kreatin-Mangel, X-chromosomal; Crouzon-Syndrom; Kryptophthalmus- Syndrom; Kryptorchismus, ein- oder beidseitig; Cushing-Symphalangismus; kutanes malignes Melanom 1; Cutis laxa mit Osteodystrophie und mit schweren pulmonalen, gastrointestinalen und urinären Anomalien; Zyanose, transiente neonatale und atypische Nephropathie; Zystische Fibrose; Cystinurie; Cytochrom-c-Oxidase i-Mangel; Cytochrom-c-Oxidase-Mangel; D-2- Hydroxyglutarsäureurie 2; Darier-Krankheit, segmental; Taubheit mit Labyrinth-Aplasie- Mikrotie und Mikrodontie (LAMM); Taubheit, autosomal dominant 3a, 4, 12, 13, 15, autosomal dominant nicht-syndromal sensorineural 17, 20 und 65; Taubheit, autosomal rezessiv 1A, 2, 3, 6, 8, 9, 12, 15, 16, 18b, 22, 28, 31, 44, 49, 63, 77, 86 und 89; Taubheit, cochleär, mit Myopie und intellektueller Beeinträchtigung, ohne vestibuläre Beteiligung, autosomal dominant, X-chromosomal 2; Mangel an 2-Methylbutyryl-CoA-Dehydrogenase; Mangel an 3-Hydroxyacyl-CoA-Dehydrogenase; Mangel an alpha-Mannosidase; Mangel an aromatischer L-Aminosäure-Decarboxylase; Mangel an Bisphosphoglyceratmutase; Mangel an Butyryl-CoA-Dehydrogenase; Mangel an Ferroxidase; Mangel an Galactokinase; Mangel an Guanidinoacetat-Methyltransferase; Mangel an Hyaluronoglucosaminidase; Mangel an Ribose-5-Phosphat-Isomerase; Mangel an Steroid-11-beta-Monooxygenase; Mangel an UDP- Glucose-Hexose-1-Phosphat-Uridylyltransferase; Mangel an Xanthinoxidase; Dejerine- Sottas-Krankheit; Charcot-Marie-Tooth-Krankheit, Typen ID und IVF; Dejerine-Sottas- Syndrom, autosomal dominant; Mangel an dendritischen Zellen, Monozyten, B-Lymphozyten und natürlichen Killer-Lymphozyten; Desbuquois-Dysplasie 2; Desbuquois-Syndrom; DFNA 2 Nicht-syndromale Schwerhörigkeit; Diabetes mellitus und Insipidus mit Optikusatrophie und Taubheit; Diabetes mellitus, Typ 2, und insulinabhängig, 20; Diamond-Blackfan-Anämie 1, 5, 8 und 10; Diarrhöe 3 (sekretorisches Natrium, kongenital, syndromisch) und 5 (mit Tufting- Enteropathie, kongenital); Dicarbonsäureaminoazidurie; Diffuses palmoplantares Keratoderma, Bothnian-Typ; Digitorenozerebrales Syndrom; Dihydropteridin-Reduktase- Mangel; Dilatative Kardiomyopathie 1A, 1AA, 1C, 1G, 1BB, 1DD, 1FF, 1HH, 11, 1KK, 1N, 1 S, 1Y und 3B; Linksventrikuläre Nichtkompaktion 3; Gestörte Steroidogenese aufgrund eines Mangels an Cytochrom-p450-Oxidoreduktase; Distale Arthrogrypose Typ 2B; Distale hereditäre motorische Neuronopathie Typ 2B; Distale Myopathie Typ Markesbery-Griggs; Distale spinale Muskelatrophie, X-chromosomal 3; Distichiasis-Lymphödem-Syndrom; Dominante dystrophe Epidermolysis bullosa mit Fehlen der Haut; Dominante hereditäre Optikusatrophie; Donnai-Barrow-Syndrom; Dopamin-Beta-Hydroxylase-Mangel; Dopaminrezeptor d2, reduzierte Hirndichte von; Dowling-Degos-Krankheit 4; Doyne-Waben- Netzhautdystrophie; Malattia leventinese; Duane-Syndrom Typ 2; Dubin-Johnson-Syndrom; Duchenne-Muskeldystrophie; Becker-Muskeldystrophie; Dysfibrinogenämie; Dyskeratosis congenita autosomal dominant und autosomal dominant, 3; Dyskeratosis congenita, autosomal rezessiv, 1, 3, 4 und 5; Dyskeratosis congenita X-linked; Dyskinesie, familiär, mit Gesichtsmyokymie; Dysplasminogenämie; Dystonie 2 (Torsion, autosomal rezessiv), 3 (Torsion, X-chromosomal), 5 (Dopa-responsiver Typ ), 10, 12, 16, 25, 26 (myoklonisch); Krampfanfälle, benigne familiäre infantile, 2; Frühkindliche epileptische Enzephalopathie 2, 4, 7, 9, 10, 11, 13 und 14; Atypisches Rett-Syndrom; Frühe akute lymphoblastische T-Zell- Progenitor-Leukämie; Ektodermale Dysplasie-Hautfragilitätssyndrom; Ektodermale Dysplasie-Syndaktylie-Syndrom 1; Ektopia lentis, isoliert autosomal rezessiv und dominant; Ektrodaktylie, ektodermale Dysplasie und Lippen-Gaumenspalte-Syndrom 3; Ehlers-Danlos- Syndrom Typ 7 (autosomal rezessiv), klassischer Typ, Typ 2 (progeroid), Hydroxylysindefizient, Typ 4, Typ 4-Variante und aufgrund von Tenascin-X-Mangel; kongenitale Muskeldystrophie vom Eichsfeld-Typ; endokrin-zerebroosteodysplasie; erweitertes S-Zapfen- Syndrom; Syndrom des vergrößerten vestibulären Aquädukts; Enterokinase-Mangel; Epidermodysplasia verruciformis; Epidermolysa bullosa simplex und GliedergürtelMuskeldystrophie, simplex mit gesprenkelter Pigmentierung, simplex mit Pylorusatresie, simplex, autosomal rezessiv, und mit Pylorusatresie; Epidermolytische palmoplantare Keratodermie; Familiäre Fieberkrämpfe 8; Epilepsie, kindliche Absence 2, 12 (idiopathisch generalisiert, Anfälligkeit für) 5 (nächtlicher Frontallappen), nächtlicher Frontallappen Typ 1, partiell, mit variablen Herden, progressiv myoklonisch 3, und X-chromosomal, mit variablen Lernbehinderungen und Verhaltensstörungen; Epileptische Enzephalopathie im Kindesalter, frühkindlich, 1, 19, 23, 25, 30 und 32; Epiphyseale Dysplasie, multiple, mit Myopie und konduktiver Taubheit; Episodische Ataxie Typ 2; Episodisches Schmerzsyndrom, familiär, 3; Epstein-Syndrom; Fechtner-Syndrom; Erythropoetische Protoporphyrie; Östrogenresistenz; Exsudative Vitreoretinopathie 6; Morbus Fabry und Morbus Fabry, kardiale Variante; Faktor H, VII, X, v und Faktor viii, kombinierter Mangel an 2, xiii, a-Untereinheit, Mangel; Familiäre adenomatöse Polyposis 1 und 3; Familiäre Amyloid-Nephropathie mit Urtikaria und Taubheit; Familiäre kalte Urtikaria; Familiäre Aplasie des Vermis; Familiärer benigner Pemphigus; Familiärer Brustkrebs; Brustkrebs, Anfälligkeit für; Osteosarkom; Bauchspeicheldrüsenkrebs 3; Familiäre Kardiomyopathie; Familiäres kaltes autoinflammatorisches Syndrom 2; Familiärer kolorektaler Krebs; Familiäre exsudative Vitreoretinopathie, X-chromosomal; Familiäre hemiplegische Migräne Typ 1 und 2; Familiäre Hypercholesterinämie; Familiäre hypertrophe Kardiomyopathie 1, 2, 3, 4, 7, 10, 23 und 24; Familiäre Hypokaliämie- Hypomagnesiämie; Familiäre hypoplastische, glomerulozystische Niere; Familiäre infantile Myasthenie; Familiäre juvenile Gicht; Familiäres Mittelmeerfieber und Familiäres Mittelmeerfieber, autosomal dominant; Familiäre Porencephalie; Familiäre Porphyria cutanea tarda; Familiäre pulmonale kapillare Hämangiomatose; Familiäre renale Glukosurie; Familiäre renale Hypourikämie; Familiäre restriktive Kardiomyopathie 1; Familiäre Hyperlipoproteinämie Typ 1 und 3; Fanconi-Anämie, Komplementationsgruppe E, I, N und O; Fanconi-Bickel-Syndrom; Favismus, Anfälligkeit für; Fieberkrämpfe, familiär, 11; Feingold- Syndrom 1; Fötales Hämoglobin, quantitativer Trait-Locus 1; FG-Syndrom und FG-Syndrom 4; Fibrose der extraokularen Muskeln, angeboren, 1, 2, 3a (mit oder ohne extraokulare Beteiligung), 3b; Fischaugenkrankheit; Fleck-Hornhautdystrophie; Floating-Harbor-Syndrom; Fokale Epilepsie mit Sprachstörung mit oder ohne geistige Retardierung; Fokale segmentale Glomerulosklerose 5; Vorderhirndefekte; Frank-Ter-Haar-Syndrom; Borrone Di Rocco Crovato-Syndrom; Frasier-Syndrom; Wilms-Tumor 1; Freeman-Sheldon-Syndrom; Frontometaphysäre Dysplasie 1 und 3; Frontotemporale Demenz; Frontotemporale Demenz und/oder Amyotrophe Lateralsklerose 3 und 4; Frontotemporale Demenz Chromosom 3- Linked und Frontotemporale Demenz Ubiquitin-positiv; Fructose-Biphosphatase-Mangel; Fuhrmann-Syndrom; Gamma-Aminobuttersäure-Transaminase-Mangel; Gamstorp-Wohlfart- Syndrom; Gaucher-Krankheit Typ 1 und Subakute Neuronopathie; Blicklähmung, familiär horizontal, mit progressiver Skoliose; Generalisierte dominante dystrophische Epidermolysis bullosa; Generalisierte Epilepsie mit fiebrigen Anfällen plus 3, Typ 1, Typ 2; Epileptische Enzephalopathie Typ Lennox-Gastaut; Riesenaxonale Neuropathie; Glanzmann- Thrombasthenie; Glaukom 1, offener Winkel, e, F und G; Glaukom 3, primär kongenital, d; Glaukom, kongenital und Glaukom, kongenital, Kolobom; Glaukom, primär offener Winkel,
    juvenil; Gliom-Suszeptibilität 1; Glukose-Transporter-Typ-1-Mangelsyndrom; Glukose-6- Phosphat-Transportdefekt; GLUT1-Mangelsyndrom 2; Epilepsie, idiopathisch generalisiert, Anfälligkeit für, 12; Glutamat-Formiminotransferase-Mangel; Glutarsäureanämie IIA und IIB; Glutarsäureurie, Typ 1; Gluthathion-Synthetase-Mangel; Glykogenspeicherkrankheit 0 (Muskel), II (Erwachsenenform), IXa2, IXc, Typ 1A; Typ II, Typ IV, IV (kombiniert hepatisch und myopathisch), Typ V und Typ VI; Goldmann-Favre-Syndrom; Gordon-Syndrom; Gorlin- Syndrom; Holoprosencephalie-Sequenz; Holoprosencephalie 7; Granulomatöse Erkrankung, chronisch, X-chromosomal, Variante; Granulosazelltumor des Eierstocks; Gray-Plättchen- Syndrom; Griscelli-Syndrom Typ 3; Groenouw-Hornhautdystrophie Typ I; Wachstums- und geistige Retardierung, mandibulofaziale Dysostose, Mikrozephalie und Gaumenspalte; Wachstumshormonmangel mit Hypophysenanomalien; Wachstumshormoninsensitivität mit Immundefizienz; GTP-Cyclohydrolase-I-Mangel; Hajdu-Cheney-Syndrom; Hand-Fuß- Uterus-Syndrom; Schwerhörigkeit; Hämangiom, kapillär infantil; hämatologische Neoplasie; Hämochromatose Typ 1, 2B und 3; mikrovaskuläre Komplikationen bei Diabetes 7; Transferrin-Serumspiegel quantitativer Trait-Locus 2; Hämoglobin-H-Krankheit, nicht deletionär; Hämolytische Anämie, nicht sphärozytär, aufgrund eines Glucosephosphat- Isomerase-Mangels; Hämophagozytische Lymphohistiozytose, familiär, 2; Hämophagozytische Lymphohistiozytose, familiär, 3; Heparin-Cofaktor-II-Mangel; Hereditäre Acrodermatitis enteropathica; Hereditäres Brust- und Eierstockkrebssyndrom; Ataxie-Telangiektasie-ähnliche Störung; Hereditärer diffuser Magenkrebs; Hereditäre diffuse Leukoenzephalopathie mit Sphäroiden; Hereditäre Faktor II, IX, VIII-Mangelerkrankung; Hereditäre hämorrhagische Teleangiektasie Typ 2; Hereditäre Schmerzunempfindlichkeit mit Anhidrose; Hereditäres Lymphödem Typ I; Hereditäre motorische und sensorische Neuropathie mit Optikusatrophie; Hereditäre Myopathie mit frühem Atemversagen; Hereditäre neuralgische Amyotrophie; Hereditäre nichtpolypöse kolorektale Neoplasmen; Lynch- Syndrom I und II; Hereditäre Pankreatitis; Pankreatitis, chronisch, Anfälligkeit dafür; Hereditäre sensorische und autonome Neuropathie Typ IIB und IIA; Hereditäre sideroblastische Anämie; Hermansky-Pudlak-Syndrom 1, 3, 4 und 6; Heterotaxie, viszeral, 2, 4 und 6, autosomal; Heterotaxie, viszeral, X-chromosomal; Heterotopie; Histiozytäre medulläre Retikulose; Histiozytose-Lymphadenopathie plus-Syndrom; Holocarboxylase- Synthetase-Mangel; Holoprosencephalie 2, 3, 7 und 9; Holt-Oram-Syndrom; Homocysteinämie aufgrund von MTHFR-Mangel, CBS-Mangel und Homocystinurie, Pyridoxin-responsiv; Homocystinurie-Megaloblastenanämie aufgrund eines Defekts im Cobalamin-Stoffwechsel, cblE-Komplementationstyp; Howel-Evans-Syndrom; Hurler- Syndrom; Hutchinson-Gilford-Syndrom; Hydrozephalus; Hyperammonämie, Typ III; Hypercholesterinämie und Hypercholesterinämie, autosomal rezessiv; Hyperekplexie 2 und Hyperekplexie hereditär; Hyperferritinämie-Katarakt-Syndrom; Hyperglycinurie; Hyperimmunglobulin D mit periodischem Fieber; Mevalonsäureurie; Hyperimmunglobulin E- Syndrom; Hyperinsulinämische Hypoglykämie familiär 3, 4 und 5; Hyperinsulinismus- Hyperammonämie-Syndrom; Hyperlysinämie; Hypermanganämie mit Dystonie, Polyzythämie und Zirrhose; Hyperornithinämie-Hγperammonämie-Homocitrullinurie- Syndrom; Hyperparathyreoidismus 1 und 2; Hyperparathyreoidismus, neonatal schwer; Hyperphenylalaninämie, bh4-defizient, a, aufgrund von partiellem pts-Mangel, BH4-defizient, D, und non-pku; Hyperphosphatasie mit mentaler Retardierung Syndrom 2, 3 und 4; Hypertrichotische Osteochondrodysplasie; Hypobetalipoproteinämie, familiär, assoziiert mit apob32; Hypokalzämie, autosomal dominant 1; Hypokalziurische Hyperkalzämie, familiär, Typ 1 und 3; Hypochondrogenese; Hypochrome mikrozytäre Anämie mit Eisenüberladung; Hypoglykämie mit Mangel an Glykogensynthetase in der Leber; Hypogonadotroper Hypogonadismus 11 mit oder ohne Anosmie; Hypohidrotische ektodermale Dysplasie mit Immunschwäche; Hypohidrotische X-chromosomale ektodermale Dysplasie; Hypokaliämische periodische Paralyse 1 und 2; Hypomagnesiämie 1, intestinal; Hypomagnesiämie, Krampfanfälle und geistige Retardierung; Hypomyelinisierende Leukodystrophie 7; Hypoplastisches Linksherzsyndrom; Atrioventrikulärer Septumdefekt und gemeinsame atrioventrikuläre Verbindung; Hypospadie 1 und 2, X-chromosomal; Hypothyreose, kongenital, nicht-zitronisch, 1; Hypotrichose 8 und 12; Hypotrichose- Lymphödem-Telangiektasie-Syndrom; 1-Blutgruppensystem; Ichthyosis bullosa von Siemens; Ichthyosis exfoliativa; Ichthyosis-Prämaturitätssyndrom; Idiopathische Basalganglienverkalkung 5; Idiopathische fibrosierende Alveolitis, chronische Form; Dyskeratosis congenita, autosomal dominant, 2 und 5; Idiopathische Hyperkalzämie des Kindesalters; Immunstörung mit T-Zell-Inaktivierung aufgrund eines Kalzium-Eintrittsdefekts 2; Immundefizienz 15, 16, 19, 30, 31C, 38, 40, 8, aufgrund eines Defekts von cd3-zeta, mit Hyper-IgM Typ 1 und 2, und X-gebunden, mit Magnesiumdefekt, Epstein-Barr-VirusInfektion und Neoplasie; Immundefizienz-Zentromerische Instabilität-Gesichtsanomalien- Syndrom 2; Einschlusskörper-Myopathie 2 und 3; Nonaka-Myopathie; Infantile Krämpfe und paroxysmale Choreoathetose, familiär; Infantile kortikale Hyperostose; Infantile GM1- Gangliosidose; Infantile Hypophosphatasie; Infantile Nephronophthisis; Infantiler Nystagmus, X-chromosomal; Infantiler Parkinsonismus-Dystonie; Unfruchtbarkeit in Verbindung mit mehrschwänzigen Spermien und übermäßiger DNA; Insulinresistenz; Insulinresistenter Diabetes mellitus und Acanthosis nigricans; Insulinabhängiger Diabetes mellitus, sekretorisches Diarrhöesyndrom; Interstitielle Nephritis, karyomegal; Intrauterine Wachstumsretardierung, metaphysäre Dysplasie, adrenale Hypoplasia congenita und genitale Anomalien; Iodotyrosyl-Kopplungsdefekt; IRAK4-Mangel; Iridogoniodysgenese dominanter Typ und Typ 1; Eisenakkumulation im Gehirn; Ischiopatellare Dysplasie; Inselzellhyperplasie; Isolierter 17,20-Lyase-Mangel; Isolierter Lutropinmangel; Isovaleryl-CoA-Dehydrogenase- Mangel; Jankovic-Rivera-Syndrom; Jervell- und Lange-Nielsen-Syndrom 2; Joubert-Syndrom 1, 6, 7, 9/15 (digenisch), 14, 16 und 17 und Orofaciodigital-Syndrom xiv; Junktionale Epidermolysis bullosa gravis von Herlitz; Juvenile GM>1<-Gangliosidose; Juveniles Polyposis-Syndrom; Juveniles Polyposis/Hämorrhagisches Teleangiektasie-Syndrom; Juvenile Retinoschisis; Kabuki-Make-up-Syndrom; Kallmann-Syndrom 1, 2 und 6; Verzögerte Pubertät; Kanzak-Krankheit; Karak-Syndrom; Kartagener-Syndrom; Kenny-Caffey-Syndrom Typ 2; Keppen-Lubinsky-Syndrom; Keratokonus 1; Keratosis follicularis; Keratosis palmoplantaris striata 1; Kindler-Syndrom; L-2-Hydroxyglutarsäureurie; Larsen-Syndrom, dominanter Typ; Gitter-Hornhautdystrophie Typ III; Leber-Amaurose; Zellweger-Syndrom; Peroxisom-Biogenese-Störungen; Zellweger-Syndrom-Spektrum; Lebersche kongenitale Amaurose 11, 12, 13, 16, 4, 7 und 9; Lebersche Optikusatrophie; Aminoglykosid-induzierte Taubheit; Taubheit, nicht-syndromale sensorineurale, mitochondriale Taubheit; Linksventrikuläre Nichtkompaktion 5; Fehlbildungen der Links-Rechts-Achse; Leigh- Syndrom; Mitochondrialer kurzkettiger Enoyl-CoA-Hydratase-1-Mangel; Leigh-Syndrom aufgrund eines mitochondrialen Komplex-I-Mangels; Leiner-Krankheit; Leri-Weill- Dyschondrosteose; Letales kongenitales Kontraktursyndrom 6; Leukozytenadhäsionsmangel Typ I und III; Leukodystrophie, hypomyelinisierend, 11 und 6; Leukoenzephalopathie mit Ataxie, mit Hirnstamm- und Rückenmarksbeteiligung und Laktaterhöhung, mit verschwindender weißer Substanz und progressiv, mit Ovarialinsuffizienz; Leukonychia totalis; Lewy-Körper-Demenz; Lichtenstein-Knorr-Syndrom; Li-Fraumeni-Syndrom 1; Lig4- Syndrom; Gliedergürtelmuskeldystrophie, Typ 1B, 2A, 2B, 2D, C1, C5, C9, C14; Kongenitale Muskeldystrophie-Dystroglykanopathie mit Gehirn- und Augenanomalien, Typ A14 und B14; Lipasemangel kombiniert; Lipidproteinose; Lipodystrophie, familiär partiell, Typ 2 und 3; Lissencephalie 1, 2 (X-chromosomal), 3, 6 (mit Mikrozephalie), X-chromosomal; Subkortikale laminare Heterotopie, X-chromosomal; Akutes kindliches Leberversagen; Loeys-Dietz- Syndrom 1, 2, 3; Langes QT-Syndrom 1, 2, 2/9, 2/5, (digenisch), 3, 5 und 5, erworben, Anfälligkeit für; Lungenkrebs; Lymphödem, erblich, id; Lymphödem, primär, mit Myelodysplasie; Lymphoproliferatives Syndrom 1, 1 (X-chromosomal) und 2; Lysosomaler saurer Lipasemangel; Makrozephalie, Makrosomie, Syndrom des Gesichtsdysmorphismus; Makuladystrophie, vitelliform, bei Erwachsenen; Maligne Hyperthermie-Suszeptibilität Typ 1; Malignes Lymphom, Non-Hodgkin; Malignes Melanom; Bösartiger Prostatatumor; Mandibuloakrale Dysostose; Mandibuloakrale Dysplasie mit Lipodystrophie Typ A oder B, atypisch; Mandibulofaziale Dysostose, Treacher-Collins-Typ, autosomal rezessiv; Mannose- Bindungsprotein-Mangel; Ahornsirup-Urin-Krankheit Typ 1A und Typ 3; Marden-Walkerähnliches Syndrom; Marfan-Syndrom; Marinesco-Sj\xc3\xb6gren-Syndrom; Martsolf- Syndrom; Reifungsdiabetes bei Jugendlichen, Typ 1, Typ 2, Typ 11, Typ 3 und Typ 9; May- Hegglin-Anomalie; MYH9-verwandte Störungen; Sebastian-Syndrom; McCune-Albright- Syndrom; Somatotropes Adenom; Geschlechtsstrang-Stromatumor; Cushing-Syndrom; McKusick-Kaufman-Syndrom; McLeod-Neuroakanthozytose-Syndrom; Meckel-Gruber- Syndrom; Mangel an mittelkettiger Acyl-Coenzym-A-Dehydrogenase; Medulloblastom; megalencephale Leukoenzephalopathie mit subkortikalen Zysten 1 und 2a; Megalencephaly cutis marmorata telangiectatica congenital; PIK3CA Related Overgrowth Spectrum; Megalencephaly-polymicrogyria-polydactyly-hydrocephalus-Syndrom 2; Megaloblastische Anämie, thiaminempfindlich, mit Diabetes mellitus und sensorineuraler Taubheit; Meier- Gorlin-Syndrome 1 und 4; Melnick-Needles-Syndrom; Meningiom; Mentale Retardierung, X- chromosomal, 3, 21, 30 und 72; Mentale Retardierung und Mikrozephalie mit pontiner und zerebellarer Hypoplasie; Mentale Retardierung, X-chromosomal, syndromal 5; Mentale Retardierung, anteriore Maxillarprotrusion und Strabismus; Mentale Retardierung, autosomal dominant 12, 13, 15, 24, 3, 30, 4, 5, 6 und 9; Mentale Retardierung, autosomal rezessiv 15, 44, 46 und 5; Geistige Retardierung, stereotype Bewegungen, Epilepsie und/oder zerebrale Fehlbildungen; Geistige Retardierung, syndromaler Claes-Jensen-Typ, X-chromosomal; Geistige Retardierung, X-chromosomal, unspezifisch, syndromaler Hedera-Typ und syndromaler Wu-Typ; Merosin-defiziente kongenitale Muskeldystrophie; Metachromatische Leukodystrophie juveniler, spätinfantiler und erwachsener Typ; Metachromatische Leukodystrophie; Metatrophische Dysplasie; Methämoglobinämie Typ I und 2; Methionin- Adenosyltransferase-Mangel, autosomal dominant; Methylmalonsäureanämie mit Homocystinurie; Methylmalonsäureanämie cblB-Typ; Methylmalonsäureanämie aufgrund eines Methylmalonyl-CoA-Mutasemangels; METHYLMALONSÄURE, mut(0)-Typ; Mikrozephaler osteodysplastischer primordialer Zwergwuchs Typ 2; Mikrozephalie mit oder ohne Chorioretinopathie, Lymphödem oder mentaler Retardierung; Mikrozephalie, Hiatushemie und nephrotisches Syndrom; Mikrozephalie; Hypoplasie des Corpus callosum; Spastische Paraplegie 50, autosomal rezessiv; Globale Entwicklungsverzögerung; ZNS- Hypomyelinisierung; Himatrophie; Mikrozephalie, normale Intelligenz und Immunschwäche; Mikrozephalie-Kapillarmissbildungssyndrom; Mikrozytäre Anämie; Mikrophthalmie syndromisch 5, 7 und 9; Mikrophthalmie, isoliert 3, 5, 6, 8 und mit Kolobom 6; Mikrospherophakie; Migräne, familiäre basilare; Miller-Syndrom; Minicore-Myopathie mit externer Ophthalmoplegie; Myopathie, kongenital mit Kernen; Mitchell-Riley-Syndrom; mitochondrialer 3-Hydroxy-3-methylglutaryl-CoA-Synthase-Mangel; Mitochondrialer Komplex I, II, III, III (Kerntyp 2, 4 oder 8) Mangel; Mitochondriales DNA-Depletionssyndrom 11, 12 (kardiomyopathischer Typ), 2, 4B (MNGIE-Typ), 8B (MNGIE-Typ); Mitochondriales DNA-Depletionssyndrom 3 und 7, hepatozerebrale Typen, und 13 (enzephalomyopathischer Typ); Mitochondrialer Phosphatträger- und Pyruvatträger-Mangel; Mitochondrialer trifunktionaler Proteinmangel; Langkettiger 3-Hydroxyacyl-CoA-Dehydrogenase-Mangel; Miyoshi-Muskeldystrophie 1; Myopathie, distal, mit anteriorem tibialen Beginn; Mohr- Tranebjaerg-Syndrom; Molybdän-Cofaktor-Mangel, Komplementationsgruppe A; Mowat- Wilson-Syndrom; Mukolipidose III Gamma; Mukopolysaccharidose Typ VI, Typ VI (schwer) und Typ VII; Mukopolysaccharidose, MPS-I-H/S, MPS-II, MPS-III-A, MPS-III-B, MPS-III- C, MPS-IV-A, MPS-IV-B; Retinitis Pigmentosa 73; Gangliosidose GM1 Typ 1 (mit Herzbeteiligung) 3; Multizentrische Osteolyse-Nephropathie; Multizentrische Osteolyse, Nodulose und Arthropathie; Multiple kongenitale Anomalien; Vorhofseptumdefekt 2; Multiple kongenitale Anomalien-Hypotonie-Anfalls-Syndrom 3; Multiple kutane und mukosale Venenfehlbildungen; Multiple endokrine Neoplasien, Typ 1 und 4; Multiple epiphysäre Dysplasie 5 oder dominant; Multiple gastrointestinale Atresien; Multiples Pterygium-Syndrom vom Escobar-Typ; Multipler Sulfatase-Mangel; Multiples Synostose-Syndrom 3; Muskel- AMP-Guanin-Oxidase-Mangel; Muskel-Augen-Hirn-Krankheit; Muskeldystrophie, kongenital, Megakolon-Typ; Myasthenie, familiär infantil, 1; Myasthenisches Syndrom, kongenital, 11, assoziiert mit Acetylcholin-Rezeptor-Mangel; Myasthenisches Syndrom, kongenital, 17, 2A (langsamer Kanal), 4B (schneller Kanal), und ohne tubuläre Aggregate; Myeloperoxidase-Mangel; MYH-assoziierte Polyposis; Endometriumkarzinom; Myokardinfarkt 1; Myoklonische Dystonie; Myoklonisch-ottonische Epilepsie; Myoklonus mit Epilepsie mit gezackten roten Fasern; Myofibrilläre Myopathie 1 und ZASP-bezogen; Myoglobinurie, akut rezidivierend, autosomal rezessiv; Myoneurales gastrointestinales Enzephalopathiesyndrom; Zerebelläre Ataxie infantil mit progressiver externer Ophthalmoplegie; Mitochondriales DNA-Depletionssyndrom 4B, MNGIE-Typ; Myopathie, zentronukleär, 1, kongenital, mit Überschuss an Muskelspindeln, distal, 1, Laktatazidose und sideroblastischer Anämie 1, mitochondrial progressiv mit kongenitalem Katarakt, Hörverlust und Entwicklungsverzögerung, und tubulärem Aggregat, 2; Myopie 6; Myosklerose, autosomal rezessiv; Myotonie kongenital; Kongenitale Myotonie, autosomal dominante und rezessive Formen; Nagel-Patella-Syndrom; Nance-Horan-Syndrom; Nanophthalmus 2; Navajo-Neurohepatopathie; Nemaline Myopathie 3 und 9; Neonatale Hypotonie; Geistige Behinderung; Krampfanfälle; Verzögerte Sprachentwicklung; Mentale Retardierung, autosomal dominant 31; Neonatale intrahepatische Cholestase durch Citrin-Mangel; Nephrogener Diabetes insipidus, Nephrogener Diabetes insipidus, X-chromosomal; Nephrolithiasis/Osteoporose, hypophosphatämisch, 2; Nephronophthisis 13, 15 und 4; Unfruchtbarkeit; Cerebello-okulo-renales Syndrom (Nephronophthisis, okulomotorische Apraxie und Kleinhirnanomalien); Nephrotisches Syndrom, Typ 3, Typ 5, mit oder ohne Augenanomalien, Typ 7 und Typ 9; Nestor-Guillermo-Progerie-Syndrom; Neu-Laxova- Syndrom 1; Neurodegeneration mit Eisenanreicherung im Gehirn 4 und 6; Neuroferntinopathie; Neurofibromatose, Typ 1 und Typ 2; Neurofibrosarkom; Neurohypophysärer Diabetes insipidus; Hereditäre sensorische Neuropathie, Typ IC; Neutraler 1-Aminosäure-Transportdefekt; Neutrale Lipidspeicherkrankheit mit Myopathie; Neutrophiles Immundefektsyndrom; Nicolaides-Baraitser-Syndrom; Niemann-Pick-Krankheit Typ C1, C2, Typ A und Typ C1, Erwachsenenform; Nicht-ketotische Hyperglyzinämie; Noonan-Syndrom 1 und 4, LEOPARD-Syndrom 1; Noonan-Syndrom-ähnliche Störung mit oder ohne juvenile myelomonozytäre Leukämie; Normokalämische periodische Paralyse, kaliumempfindlich; Norum-Krankheit; Epilepsie, Hörverlust und Syndrom der geistigen Behinderung; Geistige Behinderung, X-chromosomal 102 und syndromal 13; Fettleibigkeit; Okulärer Albinismus, Typ I; Okulokutaner Albinismus Typ 1B, Typ 3 und Typ 4; Okulodentodigitale Dysplasie; Odontohypophosphatasie; Odontotrichomelie-Syndrom; Oguchi-Krankheit; Oligodontie- Kolorektalkarzinom-Syndrom; Opitz G/BBB-Syndrom; Optikusatrophie 9; Oral-fazialdigitales Syndrom; Ornithin-Aminotransferase-Mangel; Orofaziale Spaltbildung 11 und 7, Lippen-Kiefer-Gaumendysplasie-Syndrom; Orstavik-Lindemann-Solberg-Syndrom; Osteoarthritis mit leichter Chondrodysplasie; Osteochondritis dissecans; Osteogenesis imperfecta Typ 12, Typ 5, Typ 7, Typ 8, Typ I, Typ III, mit normalen Skleren, dominante Form, rezessive perinatale Letalität; Osteopathia striata mit kranialer Sklerose; Osteopetrose autosomal dominant Typ 1 und 2, rezessiv 4, rezessiv 1, rezessiv 6; Osteoporose mit Pseudogliom; Oto-palato-digitales Syndrom, Typ I und II; Ovarialdysgenese 1; Ovarioleukodystrophie; Pachyonychia congenita 4 und Typ 2; Paget-Krankheit der Knochen, familiär; Pallister-Hall-Syndrom; Palmoplantar-Keratodermie, nicht epidermolytisch, fokal oder diffus; Pankreas-Agenesie und kongenitale Herzerkrankung; Papillon-Leflxc3\xa8vre- Syndrom; Paragangliome 3; Paramyotonia congenita von Eulenburg; Nebenschilddrüsenkarzinom; Parkinson-Krankheit 14, 15, 19 (juveniles Auftreten), 2, 20 (frühes Auftreten), 6 (autosomal rezessives frühes Auftreten) und 9; partieller Albinismus; partieller Hypoxanthin-Guaninphosphoribosyltransferase-Mangel; gemusterte Dystrophie des retinalen Pigmentepithels; PC-K6a; Pelizaeus-Merzbacher-Krankheit; Pendred-Syndrom; Periphere demyelinisierende Neuropathie, zentrale Dysmyelinisierung; Hirschsprung- Krankheit; Permanenter neonataler Diabetes mellitus; Diabetes mellitus, permanenter neonataler, mit neurologischen Merkmalen; Neonataler insulinabhängiger Diabetes mellitus; Reifungsdiabetes bei Jugendlichen, Typ 2; Peroxisom-Biogenesestörung 14B, 2A, 4A, 5B, 6A, 7A und 7B; Perrault-Syndrom 4; Perry-Syndrom; Persistierende hyperinsulinämische Hypoglykämie im Kindesalter; familiärer Hyperinsulinismus; Phänotypen; Phenylketonurie; Phäochromozytom; Hereditäre Paragangliom-Pheochromozytom-Syndrome; Paragangliome 1; Karzinoid-Tumor des Darms; Cowden-Syndrom 3; Phosphoglycerat-Dehydrogenase- Mangel; Phosphoglycerat-Kinase-1-Mangel; Photosensitive Trichothiodystrophie; Phytansäurespeicherkrankheit; Pick-Krankheit; Pierson-Syndrom; Pigmentäre Netzhautdystrophie; Pigmentierte noduläre adrenokortikale Erkrankung, primär, 1; Pilomatrixom; Pitt-Hopkins-Syndrom; Hypophysenabhängiger Hyperkortisolismus; Hypophysärer Hormonmangel, kombiniert 1, 2, 3 und 4; Plasminogen-Aktivator-Inhibitor- Typ-1-Mangel; Plasminogen-Mangel, Typ I; Blutungsstörung vom Plättchen-Typ 15 und 8; Poikiloderma, hereditäre Fibrose, mit Sehnenkontrakturen, Myopathie und Lungenfibrose; Polyzystische Nierenerkrankung 2, Erwachsenentyp und infantiler Typ; Polyzystische lipomembranöse Osteodysplasie mit sklerosierender Leukoenzephalopathie; Polyglucosan- Körperchen-Myopathie 1 mit oder ohne Immundefizienz; Polymikrogyrie, asymmetrisch, bilateral frontoparietal; Polyneuropathie, Schwerhörigkeit, Ataxie, Retinitis pigmentosa und Katarakt; Pontocerebelläre Hypoplasie Typ 4; Popliteales Pterygium-Syndrom; Porencephalie 2; Porokeratose 8, disseminierter oberflächlicher aktinischer Typ; Porphobilinogen-Synthase- Mangel; Porphyria cutanea tarda; Posteriore Säulenataxie mit Retinitis pigmentosa; Posteriore polare Katarakt Typ 2; Prader-Willi-Syndrom; Vorzeitige Ovarialinsuffizienz 4, 5, 7 und 9; Primäre autosomal rezessive Mikrozephalie 10, 2, 3 und 5; Primäre ziliare Dyskinesie 24; Primäre dilatative Kardiomyopathie; linksventrikuläre Nichtkompaktion 6; 4, linksventrikuläre Nichtkompaktion 10; paroxysmales Vorhofflimmern; primäre Hyperoxalurie, Typ I, Typ und Typ III; primäre hypertrophe Osteoarthropathie, autosomal rezessiv 2; primäre Hypomagnesiämie; Primäres Offenwinkelglaukom juveniler Beginn 1; Primrose-Syndrom; Progressiver familiärer Herzblock Typ 1B; Progressive familiäre intrahepatische Cholestase 2 und 3; Progressive intrahepatische Cholestase; Progressive Myoklonus-Epilepsie mit Ataxie; Progressive pseudorheumatoide Dysplasie; Progressive sklerosierende Poliodystrophie; Prolidase-Mangel; Prolin-Dehydrogenase-Mangel; Schizophrenie 4; Properdin-Mangel, X- chromosomal; Propionsäure-Akademie; Proprotein-Convertase 1/3-Mangel; Prostatakrebs, erblich, 2; Protan-Defekt; Proteinurie; Finnisches kongenitales nephrotisches Syndrom; Proteus-Syndrom; Brust-Adenokarzinom; Pseudoachondroplastisches spondyloepiphyseales Dysplasie-Syndrom; Pseudohypoaldosteronismus Typ 1 autosomal dominant und rezessiv und Typ 2; Pseudohypoparathyreoidismus Typ 1A, Pseudopseudohypoparathyreoidismus; Pseudoneonatale Adrenoleukodystrophie; Pseudoprimärer Hyperaldosteronismus; Pseudoxanthoma elasticum; Generalisierte arterielle Verkalkung im Kindesalter 2; Pseudoxanthoma elasticum-ähnliche Störung mit Mangel an multiplen Gerinnungsfaktoren; Psoriasis-Suszeptibilität 2; PTEN-Hamartom-Tumor-Syndrom; Pulmonale arterielle Hypertonie im Zusammenhang mit hereditärer hämorrhagischer Teleangiektasie; Pulmonale Fibrose und / oder Knochenmarkversagen, Telomer-bezogen, 1 und 3; Pulmonale Hypertonie, primär, 1, mit hereditärer hämorrhagischer Teleangiektasie; Purin-Nukleosid-Phosphorylase- Mangel; Pyruvat-Carboxylase-Mangel; Pyruvat-Dehydrogenase-El-alpha-Mangel; Pyruvat- Kinase-Mangel der roten Zellen; Raine-Syndrom; Rasopathie; Rezessive dystrophe Epidermolysis bullosa; Nagelstörung, nicht-syndromal kongenital, 8; Reifenstein-Syndrom; Nierenadysplasie; Nieren-Carnitin-Transportdefekt; Nierenkolobom-Syndrom; Nierendysplasie; Nierendysplasie, retinale Pigmentdystrophie, Kleinhimataxie und Skelettdysplasie; Renale tubuläre Azidose, distal, autosomal rezessiv, mit spät einsetzender Innenohrschwerhörigkeit oder mit hämolytischer Anämie; Renale tubuläre Azidose, proximal, mit Augenanomalien und geistiger Retardierung; Retinale Zapfendystrophie 3B; Retinitis pigmentosa; Retinitis pigmentosa 10, 11, 12, 14, 15, 17 und 19; Retinitis pigmentosa 2, 20, 25, 35, 36, 38, 39, 4, 40, 43, 45, 48, 66, 7, 70, 72; Retinoblastom; Rett-Störung; Rhabdoidtumor- Prädisposition-Syndrom 2; Rhegmatogene Netzhautablösung, autosomal dominant; Rhizomelische Chondrodysplasie punctata Typ 2 und Typ 3; Roberts-SC-Phokomelie- Syndrom; Robinow-Sorauf-Syndrom; Robinow-Syndrom, autosomal rezessiv, autosomal rezessiv, mit Brachy-Synpolydaktylie; Rothmund-Thomson-Syndrom; Rapadilino-Syndrom; RRM2B-verwandte mitochondriale Erkrankung; Rubinstein-Taybi-Syndrom; Salla-Krankheit; Sandhoff-Krankheit, adulter und infantiler Typ; Sarkoidose, früh einsetzende; Blau-Syndrom; Schindler-Krankheit, Typ 1; Schizencephalie; Schizophrenie 15; Schneckenbecken-Dysplasie; Schwannomatose 2; Schwartz-Jampel-Syndrom Typ 1; Sklerokornea, autosomal rezessiv; Sklerosteose; sekundäre Hypothyreose; Segawa-Syndrom, autosomal rezessiv; Senior-Loken- Syndrom 4 und 5, ; sensorische ataktische Neuropathie, Dysarthrie und Ophthalmoparese; Sepiapterin-Reduktase-Mangel; SeSAME-Syndrom; Schwere kombinierte Immunschwäche aufgrund von ADA-Mangel, mit Mikrozephalie, Wachstumsretardierung und Empfindlichkeit gegenüber ionisierender Strahlung, atypisch, autosomal rezessiv, T-Zellen-negativ, B-Zellenpositiv, NK-Zellen-negativ oder NK-positiv; Schwere kongenitale Neutropenie; Schwere kongenitale Neutropenie 3, autosomal rezessiv oder dominant; Schwere kongenitale Neutropenie und 6, autosomal rezessiv; Schwere myoklonische Epilepsie im Säuglingsalter; Generalisierte Epilepsie mit Fieberkrämpfen plus, Typ 1 und 2; Schwere X-chromosomale myotubuläre Myopathie; Kurz-QT-Syndrom 3; Kleinwuchs mit unspezifischen Skelettanomalien; Kleinwuchs, Gehörgangsatresie, Unterkieferhypoplasie, Skelettanomalien; Kleinwuchs, Onychodysplasie, Gesichtsdysmorphie und Hypotrichose; Primordialer Zwergwuchs; Kurzrippen-Thoraxdysplasie 11 oder 3 mit oder ohne Polydaktylie; Sialidose Typ 1 und II; Silbernes spastisches Paraplegie-Syndrom; Verlangsamte Nervenleitgeschwindigkeit, autosomal dominant; Smith-Lemli-Opitz-Syndrom; Snyder- Robinson-Syndrom; Somatotropes Adenom; Prolaktinom; familiär, Hypophysenadenom- Prädisposition; Sotos-Syndrom 1 oder 2; Spastische Ataxie 5, autosomal rezessiv, Charlevoix- Saguenay-Typ, 1, 10 oder 11, autosomal rezessiv; Amyotrophe Lateralsklerose Typ 5; Spastische Paraplegie 15, 2, 3, 35, 39, 4, autosomal dominant, 55, autosomal rezessiv, und 5A; Gallensäuresynthesedefekt, angeboren, 3; Spermatogenes Versagen 11, 3, und 8; Sphärozytose Typ 4 und 5; Sphärokörper-Myopathie; Spinale Muskelatrophie, vorwiegend der unteren Extremitäten 2, autosomal dominant; Spinale Muskelatrophie, Typ II; Spinozerebelläre Ataxie 14, 21, 35, 40 und 6; Spinozerebelläre Ataxie autosomal rezessiv 1 und 16; Milzhypoplasie; Spondylocarpotarsal-Synostose-Syndrom; Spondylocheirodysplasie, Ehlers-Danlos- Syndrom-ähnlich, mit Immundysregulation, Aggrecan-Typ, mit kongenitalen Gelenkverrenkungen, Kurzhandtyp, Sedaghatian-Typ, mit Zapfenstäbchendystrophie, und Kozlowski-Typ; Parastrematischer Zwergwuchs; Stargardt-Krankheit 1; Zapfen-Stäbchen- Dystrophie 3; Stickler-Syndrom Typ 1; Kniest-Dysplasie; Stickler-Syndrom, Typ 1 (nicht syndromal okulär) und 4; Sting-assoziierte Vaskulopathie, infantil; Stormorken-Syndrom; Sturge-Weber-Syndrom, Kapillarfehlbildungen, kongenital, 1; Succinyl-CoA-Acetoacetat- Transferase-Mangel; Sucrase-Isomaltase-Mangel; Plötzlicher Kindstod; Sulfitoxidase- Mangel, isoliert; Supravalväre Aortenstenose; Surfactant-Stoffwechselstörung, pulmonal, 2 und 3; Symphalangismus, proximal, 1b; Syndaktylie Typ Cenani Lenz; Syndaktylie Typ 3; Syndromische X-chromosomale mentale Retardierung 16; Talipes equinovarus; Tanger- Krankheit; TARP-Syndrom; Tay-Sachs-Krankheit, B1-Variante, Gm2-Gangliosidose (adult), Gm2-Gangliosidose (adult-onset); Temtamy-Syndrom; Tenorio-Syndrom; Endständige Knochendysplasie; Testosteron-17-beta-Dehydrogenase-Mangel; Tetraamelie, autosomal rezessiv; Tetralogie von Fallot; Hypoplastisches Linksherzsyndrom 2; Truncus arteriosus; Fehlbildung des Herzens und der großen Gefäße; Ventrikelseptumdefekt 1; Thiel-Behnke- Hornhautdystrophie; Thorakale Aortenaneurysmen und Aortendissektionen; Marfanoider Habitus; Three-M-Syndrom 2; Thrombozytopenie, Thrombozytenfunktionsstörung, Hämolyse und unausgewogene Globinsynthese; Thrombozytopenie, X-chromosomal; Thrombophilie, erblich, aufgrund von Protein-C-Mangel, autosomal dominant und rezessiv; Schilddrüsenagenesie; Schilddrüsenkrebs, follikulär; Schilddrüsenhormonstoffwechsel, abnormal; Schilddrüsenhormonresistenz, generalisiert, autosomal dominant; Thyreotoxische periodische Lähmung und Thyreotoxische periodische Lähmung 2; Thyreotropin-Releasing- Hormon-Resistenz, generalisiert; Timothy-Syndrom; TNF-Rezeptor-assoziiertes periodisches Fieber-Syndrom (TRAPS); Zahn-Agenesie, selektiv, 3 und 4; Torsades de pointes; Townes- Brocks-Branchiootorenal-ähnliches Syndrom; Transiente bullöse Dermolyse des Neugeborenen; Treacher-Collins-Syndrom 1; Trichomegalie mit geistiger Retardierung, Zwergwuchs und Pigmentdegeneration der Netzhaut; Trichorhinophalangeale Dysplasie Typ I; Trichorhinophalangeales Syndrom Typ 3; Trimethylaminurie; Tuberöse Sklerose; Lymphangiomyomatose; Tuberöse Sklerose 1 und 2; Tyrosinase-negativer okulokutaner Albinismus; Tyrosinase-positiver okulokutaner Albinismus; Tyrosinämie Typ I; UDP- Glucose-4-Epimerase-Mangel; Ullrich kongenitale Muskeldystrophie; Fehlen von Ulna und Fibula mit schwerem Gliedmaßenmangel; Upshaw-Schulman-Syndrom; Urocanat-Hydratase- Mangel; Usher-Syndrom, Typen 1, 1B, 1D, 1G, 2A, 2C und 2D; Retinitis pigmentosa 39; UVempfindliches Syndrom; Van-der-Woude-Syndrom; Van-Maldergem-Syndrom 2; Hennekam- Lymphangiektasie-Lymphödem-Syndrom 2; Variegate-Porphyrie; Ventrikulomegalie mit zystischer Nierenerkrankung; Verheij-Syndrom; Mangel an sehr langkettiger Acyl-CoA- Dehydrogenase; Vesikoureteraler Reflux 8; Viszerale Heterotaxie 5, autosomal; Viszerale Myopathie; Vitamin-D-abhängige Rachitis, Typ 1 und 2; Vitelliforme Dystrophie ; von- Willebrand-Krankheit Typ 2M und Typ 3; Waardenburg-Syndrom Typ 1, 4C und 2E (mit neurologischer Beteiligung); Klein-Waardenberg-Syndrom; Walker-Warburg kongenitale Muskeldystrophie; Warburg-Mikro-Syndrom 2 und 4; Warzen, Hypogammaglobulinämie, Infektionen und Myelokathexis; Weaver-Syndrom; Weill-Marchesani-Syndrom 1 und 3; Weill-Marchesani-Syndrom; Weissenbacher-Zweymüller-Syndrom; Werdnig-Hoffmann- Krankheit; Charcot-Marie-Tooth-Krankheit; Werner-Syndrom; WFS1-verwandte Störungen; Wiedemann-Steiner-Syndrom; Wilson-Krankheit; Wolfram-ähnliches Syndrom, autosomal dominant; Worth-Krankheit; Van-Buchem-Krankheit Typ 2; Xeroderma pigmentosum, Komplementationsgruppe b, Gruppe D, Gruppe E und Gruppe G; X-chromosomale Agammaglobulinämie; X-chromosomale hereditäre motorische und sensorische Neuropathie; X-chromosomale Ichthyose mit Sterylsulfatase-Mangel; X-chromosomale periventrikuläre Heterotopie; Oto-palato-digitales Syndrom, Typ I; X-chromosomale schwere kombinierte Immundefizienz; Zimmermann-Laband-Syndrom und Zimmermann-Laband-Syndrom 2; und Zonulärer pulverförmiger Katarakt 3.
  • Die Ziel-Nukleotidsequenz kann eine Zielsequenz (z. B. eine Punktmutation) umfassen, die mit einer Krankheit, Störung oder einem Zustand verbunden ist. Die Zielsequenz kann eine T zu C- (oder A zu G-) Punktmutation umfassen, die mit einer Krankheit, Störung oder einem Zustand verbunden ist, und wobei die Desaminierung der mutierten C-Base zu einer durch Fehlpaarungsreparatur vermittelten Korrektur einer Sequenz führt, die nicht assoziiert ist mit einer Krankheit, Störung oder einem Zustand. Die Zielsequenz kann eine G zu A- (oder C zu T-) Punktmutation umfassen, die mit einer Krankheit, Störung oder einem Zustand verbunden ist, und wobei die Desaminierung der mutierten A-Base zu einer durch Fehlpaarungsreparatur vermittelten Korrektur einer Sequenz führt, die nicht assoziiert ist mit einer Krankheit, Störung oder einem Zustand. Die Zielsequenz kann ein Protein kodieren, und wobei die Punktmutation in einem Codon ist und zu einer Änderung der Aminosäure führt, die durch das mutierte Codon im Vergleich zu einem Wildtyp-Codon kodiert wird. Die Zielsequenz kann sich auch an einer Spleißstelle befinden und die Punktmutation zu einer Änderung beim Spleißen eines mRNA-Transkripts im Vergleich zu einem Wildtyp-Transkript führen. Außerdem kann sich das Ziel an einer nicht-kodierenden Sequenz eines Gens befinden, wie beispielsweise einem Promotor, und die Punktmutation zu einer erhöhten oder verringerten Exprimierung des Gens führen.
  • Somit führt in einigen Aspekten die Desaminierung einer Mutante C zu einer Änderung der Aminosäure, die durch das mutierte Codon kodiert wird, was in einigen Fällen zur Exprimierung einer Wildtyp-Aminosäure führen kann. In anderen Aspekten führt die Desaminierung einer Mutante A zu einer Änderung der Aminosäure, die durch das mutierte Codon kodiert wird, was in einigen Fällen zur Exprimierung einer Wildtyp-Aminosäure führen kann.
  • Die hierin beschriebenen Verfahren, die das Kontaktieren einer Zelle mit einer Zusammensetzung oder einem rAAV-Partikel beinhalten, können in vitro, ex vivo oder in vivo erfolgen. In bestimmten Ausführungsformen erfolgt der Schritt des Kontaktierens in einem Patienten. In bestimmten Ausführungsformen wurde bei dem Patienten eine Krankheit, Störung oder ein Zustand diagnostiziert.
  • In einigen Ausführungsformen beinhalten die hierin offenbarten Verfahren das Kontaktieren einer Säugetierzelle mit einer Zusammensetzung oder einem rAAV-Partikel. In bestimmten Ausführungsformen beinhalten die Verfahren das Kontaktieren einer Netzhautzelle, Kortikaliszelle oder Kleinhirnzelle.
  • Das Split-Cas9-Protein oder der Split-Prime-Editor, der unter Verwendung der hierin beschriebenen Verfahren geliefert wird, weist vorzugsweise eine vergleichbare Aktivität im Vergleich zum ursprünglichen Cas9-Protein oder Prime-Editor auf (d. h. ungeteiltes Protein, das an eine Zelle geliefert oder in einer Zelle als Ganzes exprimiert wird). Zum Beispiel erhält das Split-Cas9-Protein oder der Split-Prime-Editor mindestens 50 % (z. B. mindestens 50 %, mindestens 60 %, mindestens 70 %, mindestens 80 %, mindestens 90 %, mindestens 95 %, mindestens 98 %, mindestens 99 % oder 100 %) der Aktivität des ursprünglichen Cas9- Proteins oder Prime-Editors. In einigen Ausführungsformen ist das Split-Cas9-Protein oder der Split-Prime-Editor aktiver (z. B. 2-fach, 5-fach, 10-fach, 100-fach, 1000-fach oder mehr) als das eines ursprünglichen Cas9-Proteins oder -Prime-Editors.
  • Die hierin beschriebenen Zusammensetzungen können einem Patienten, der diese benötigt, in einer therapeutisch wirksamen Menge verabreicht werden, um eine Krankheit oder Störung zu behandeln und/oder zu verhindern, an der der Patient leidet. Jede Krankheit oder Störung, die mit CRISPR/Cas9-basierter Genom Editing-Technologie behandelt und/oder verhindert werden kann, kann durch das hier beschriebene Split-Cas9-Protein oder den Split- Multi-Flap Prime-Editor behandelt werden. Es versteht sich, dass, wenn die Nukleotidsequenzen, die das Split-Cas9-Protein oder den Multi-Flap Prime-Editor kodieren, nicht weiter eine gRNA kodieren, ein separater Nukleinsäurevektor, der die gRNA kodiert, zusammen mit den hierin beschriebenen Zusammensetzungen eingeschleust werden kann.
  • Beispielhafte geeignete Krankheiten, Störungen oder Zustände umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, die Krankheit oder Störung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Mukoviszidose, Phenylketonurie, epidermolytische Hyperkeratose (EHK), chronisch obstruktive Lungenerkrankung (chronic obstructive pulmonary disease - COPD), Charcot- Marie-Toot-Krankheit Typ 4J , Neuroblastom (NB), von Willebrand-Krankheit (von Willebrand disease - vWD), angeborene Myotonie, hereditäre renale Amyloidose, dilatative Kardiomyopathie, hereditäres Lymphödem, familiäre Alzheimer-Krankheit, Prionenerkrankung, chronisches infantiles neurologisches kutanes Gelenksyndrom (chronic infantile neurologic cutaneous articular syndrome - CINCA), angeborene Taubheit, Niemann- Pick-Krankheit Typ C (NPC) und Desmin-bedingte Myopathie (desmin-related myopathy - DRM). In bestimmten Ausführungsformen handelt es sich bei der Krankheit oder dem Zustand um die Niemann-Pick-Krankheit Typ C (NPC).
  • In einigen Ausführungsformen ist die Krankheit, Störung oder der Zustand mit einer Punktmutation in einem NPC-Gen, einem DNMTI-Gen, einem PCSK9-Gen oder einem TMC1-Gen verbunden. In bestimmten Ausführungsformen ist die Punktmutation eine T3182C- Mutation in NPC, die zu einer I1061T-Aminosäuresubstitution führt.
  • In bestimmten Ausführungsformen ist die Punktmutation eine A545G-Mutation in TMC1, die zu einer Y182C-Aminosäuresubstitution führt. TMCI kodiert ein Protein, das mechanosensitive Ionenkanäle in sensorischen Haarzellen des Innenohrs bildet und für eine normale Hörfunktion benötigt wird. Die Aminosäuresubstitution Y182C ist mit angeborener Taubheit verbunden.
  • In einigen Ausführungsformen ist die Krankheit, Störung oder Erkrankung mit einer Punktmutation verbunden, die ein Stopcodon erzeugt, beispielsweise ein vorzeitiges Stopcodon innerhalb der kodierenden Region eines Gens.
  • Zu weiteren beispielhaften Kranheiten, Störungen und Erkrankungen gehören Mukoviszidose (siehe z. B. Schwank et al., Functional Repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients. Cell stem cell. 2013; 13: 653-658; und Wu et. al., Correction of a genetic disease in mouse via use of CRISPR-Cas9. Cell stem cell. 2013; 13: 659-662, von denen keiner ein Desaminase-Fusionsprotein verwendet, um den genetischen Defekt zu korrigieren); Phenylketonurie - z. B. Phenylalanin-Serin-Mutation an Position 835 (Maus) oder 240 (Mensch) oder ein homologer Rest im Phenylalanin- Hydroxylase-Gen (T>C-Mutation) - siehe z. B. McDonald et al., Genomics. 1997; 39:402- 405; Bernard-Soulier syndrome (BSS) - z. B. Mutation von Phenylalanin zu Serin an Position 55 oder einem homologen Rest oder Cystein zu Arginin an Rest 24 oder einem homologen Rest im Thrombozytenmembran-Glykoprotein IX (T>C-Mutation) - siehe z. B. Noris et al., British Journal of Haematology. 1997; 97: 312-320, und Ali et al., Hematol. 2014; 93: 381- 384; epidermolytische Hyperkeratose (EHK) - z. B. Leucin-zu-Prolin-Mutation an Position 160 oder 161 (bei Zählung des Initiator-Methionins) oder ein homologer Rest in Keratin 1 (T>C-Mutation) - siehe z. B. Chipev et al., Cell. 1992; 70: 821-828, siehe auch Zugangsnummer P04264 in der UNIPROT-Datenbank unter www[dot]uniprot[dot]org; Chronisch obstruktive Lungenerkrankung (COPD) - z. B. Mutation von Leucin zu Prolin an Position 54 oder 55 (wenn das Initiator-Methionin gezählt wird) oder ein homologer Rest in prozessierter Form von α1-Antitrypsin oder Rest 78 in unprozessierter Form oder ein homologer Rest (T>C-Mutation) - siehe z. B. Poller et al., Genomics. 1993; 17: 740-743, siehe auch Zugangsnummer P01011 in der UNIPROT-Datenbank; Charcot-Marie-Toot-Krankheit Typ 4J - z. B. Isoleucin-Threonin-Mutation an Position 41 oder ein homologer Rest in 4 (T>C-Mutation) - siehe z. B. Lenk et al., PLoS Genetics. 2011; 7: e1002104; Neuroblastom (NB) - z. B. Leucin-zu-Prolin-Mutation an Position 197 oder ein homologer Rest in Caspase- 9 (T>C-Mutation) - siehe z. B. Kundu et al., 3 Biotech. 2013, 3:225-234; von-Willebrand- Krankheit (vWD) - z. B. Cystein-Arginin-Mutation an Position 509 oder ein homologer Rest in der prozessierten Form des von-Willebrand-Faktors oder an Position 1272 oder ein homologer Rest in der unprozessierten Form des von-Willebrand-Faktors (T>C-Mutation) - siehe z. B. Lavergne et al., Br. J. Haematol. 1992, siehe auch Zugangsnummer P04275 in der UNIPROT-Datenbank; 82: 66-72; Angeborene Myotonie - z. B. Cystein-Arginin-Mutation an Position 277 oder ein homologer Rest im Muskelchloridkanal-Gen CLCN1 (T>C-Mutation) - siehe z. B. Weinberger et al., The J. of Physiology. 2012; 590: 3449-3464; hereditäre renale Amyloidose - z. B. Stoppcodon-zu-Arginin-Mutation an Position 78 oder ein homologer Rest in der prozessierten Form von Apolipoprotein AII oder an Position 101 oder ein homologer Rest in der nicht prozessierten Form (T>C-Mutation) - siehe z. B. Yazaki et al., Kidney Int. 2003; 64: 11-16; dilatative Kardiomyopathie (DCM) - z. B. Tryptophan-Arginin-Mutation an Position 148 oder ein homologer Rest im FOXD4-Gen (T>C-Mutation), siehe z. B. Minoretti et. al., Int. J. of Mol. Med. 2007; 19: 369-372; hereditäres Lymphödem - z. B. Histidin- Arginin-Mutation an Position 1035 oder ein homologer Rest in der VEGFR3-Tyrosinkinase (A>G-Mutation), siehe z. B. Irrthum et al., Am. J. Hum. Genet. 2000; 67: 295-301; familiäre Alzheimer-Krankheit - z. B. Isoleucin-zu-Valin-Mutation an Position 143 oder ein homologer Rest in Presenilin1 (A>G-Mutation), siehe z. B. Gallo et. al., J. Alzheimer's disease. 2011; 25: 425-431; Prionenerkrankung - z. B. Methionin-zu-Valin-Mutation an Position 129 oder ein homologer Rest im Prionprotein (A>G-Mutation) - siehe z. B. Lewis et. al., J. of General Virology. 2006; 87: 2443-2449; Chronisches infantiles neurologisches kutanes Gelenksyndrom (CINCA) - z. B. Tyrosin-Cystein-Mutation an Position 570 oder ein homologer Rest in Cryopyrin (A>G-Mutation) - siehe z. B. Fujisawa et. al. Blood. 2007; 109: 2903-2911; und Desmin-bedingte Myopathie (DRM) - z. B. Arginin-zu-Glycin-Mutation an Position 120 oder ein homologer Rest in αβ-Kristallin (A>G-Mutation) - siehe z. B. Kumar et al., J. Biol. Chem. 1999; 274: 24137-24141. Der gesamte Inhalt aller Referenzen und Datenbankeinträge ist hierin durch Bezugnahme aufgenommen.
  • Trinukleotid-Repeat-Expansion-Krankheit
  • Die Trinukleotid-Repeat-Expansion wird mit einer Reihe humaner Krankheiten in Verbindung gebracht, die unter anderem die Huntington-Krankheit, das Fragile-X-Syndrom und die Friedreich-Ataxie beinhalten. Das häufigste Trinukleotid-Repeat enthält CAG- Tripletts, obwohl auch GAA-Tripletts (Friedreich-Ataxie) und CGG-Tripletts (Fragile-X- Syndrom) vorkommen. Die Vererbung einer Veranlagung zur Expansion oder der Erwerb eines bereits expandierten elterlichen Allels erhöht die Wahrscheinlichkeit, die Krankheit zu erwerben. Pathogene Expansionen von Trinukleotid-Wiederholungen könnten hypothetisch unter Verwendung von Multi-Flap-Prime-Editing korrigiert werden.
  • Eine Region stromaufwärts der Repeat-Region kann von einer RNA-gesteuerten Nuklease gesplittet und dann verwendet werden, um die Synthese eines neuen DNA-Strangs zu starten, der eine gesunde Anzahl von Repeats enthält (die von dem jeweiligen Gen und der jeweiligen Krankheit abhängt), in Übereinstimmung mit den allgemeinen Mechanismus, der in 1G oder 22 umrissen ist. Nach der Wiederholungssequenz wird ein kurzer Homologieabschnitt hinzugefügt, der mit der Identität der Sequenz neben dem anderen Ende der Wiederholung (roter Strang) übereinstimmt. Die Invasion des neu synthetisierten Strangs durch das TPRT-System und der anschließende Austausch der endogenen DNA durch den neu synthetisierten Flap führt zu einem kontrahierten Repeat-Allel. Der Begriff „kontrahiert“ bezieht sich auf eine Verkürzung der Länge der Nukleotid-Wiederholungsregion, was zu einer Reparatur der Trinukleotid-Wiederholungsregion führt.
  • Die hierin beschriebenen Mulit-Flap-Prime-Editing-Systeme (z. B. Dual-Flap- und Quadruple-Flap-Prime-Editing-Systeme) können verwendet werden, um Trinukleotid-Repeat- Mutationen (oder „Triplett-Expansions-Krankheiten“) zu kontrahieren und Krankheiten wie Chorea Huntington und andere Trinukleotid-Repeat-Krankheiten zu behandeln. Trinukleotid- Repeat-Expansionsstörungen sind komplexe, fortschreitende Störungen, die die Entwicklungsneurobiologie betreffen und häufig die Kognition sowie sensomotorische Funktionen beeinträchtigen. Die Störungen zeigen eine genetische Antizipation (d. h. eine Zunahme des Schweregrades mit jeder Generation). Die DNA-Erweiterungen oder - Kontraktionen erfolgen normalerweise meiotisch (d. h. während der Gametogenese oder früh in der Embryonalentwicklung) und haben oft einen Sex-Bias, was bedeutet, dass einige Gene nur durch das Weibchen, andere nur durch das Männchen vererbt werden. Beim Menschen können Trinukleotid-Repeat-Expansionsstörungen entweder auf Transkriptions- oder Translationsebene Gen-Silencing verursachen, was die Genfunktion im Wesentlichen ausschaltet. Alternativ können Trinukleotid-Repeat-Expansionsstörungen veränderte Proteine verursachen, die mit großen repetitiven Aminosäuresequenzen erzeugt werden, die die Proteinfunktion entweder aufheben oder verändern, oft auf dominant-negative Weise (z. B. Polyglutamin-Erkrankungen).
  • Ohne an eine Theorie gebunden sein zu wollen, wird die Triplettexpansion durch Schlupf während der DNA-Replikation oder während der DNA-Reparatursynthese verursacht. Da die Tandem-Repeats untereinander identische Sequenzen aufweisen, kann die Basenpaarung zwischen zwei DNA-Strängen an mehreren Stellen entlang der Sequenz stattfinden. Dies kann zur Bildung von „Loop-out“-Strukturen während der DNA-Replikation oder DNA-Reparatursynthese führen. Dies kann zu einem wiederholten Kopieren der wiederholten Sequenz führen, wodurch die Anzahl der Wiederholungen erhöht wird. Zusätzliche Mechanismen, die hybride RNA:DNA-Zwischenprodukte beinhalten, wurden vorgeschlagen. Multi-Flap-Prime-Editing kann verwendet werden, um diese Triplett- Expansionsregionen durch Deletion eines oder mehrerer der problematischen Wiederholungscodontripletts zu reduzieren oder zu eliminieren. In einer Ausführungsform dieser Verwendung stellt 23 ein Schema einer PEgRNA-Ausgestaltung zum Kontrahieren oder Reduzieren von Trinukleotid-Wiederholungssequenzen mit Prime-Editing bereit.
  • Multi-Flap-Prime-Editing kann implementiert werden, um Triplett- Expansionsregionen zu kontrahieren, indem man eine Region stromaufwärts der Triplett- Repeat-Region mit dem Prime-Editor schneidet, der eine PEgRNA umfasst, die auf die Schnittstelle ausgerichtet ist. Der Prime-Editor synthetisiert dann einen neuen DNA-Strang (ssDNA-Flap) basierend auf der PEgRNA als Templat (d. h. das Edit-Templat davon), das eine gesunde Anzahl von Triplett-Wiederholungen kodiert (was von dem jeweiligen Gen und der jeweiligen Krankheit abhängt). Der neu synthetisierte ssDNA-Strang, der die gesunde Triplett- Wiederholungssequenz umfasst, wird auch so synthetisiert, dass er einen kurzen Homologieabschnitt (d. h. den Homologiearm) umfasst, der mit der Sequenz neben dem anderen Ende der Wiederholung (roter Strang) übereinstimmt. Die Invasion des neu synthetisierten Strangs und der anschließende Austausch der endogenen DNA durch den neu synthetisierten ssDNA-Flap führt zu einem kontrahierten Repeat-Allel.
  • Abhängig von der jeweiligen Trinukleotid-Expansionsstörung können die defektinduzierenden Triplett-Expansionen in „Trinukleotid-Repeat-Expansionsproteinen“ auftreten. Trinukleotid-Repeat-Expansionsproteine sind ein vielfältiger Satz von Proteinen, die mit der Anfälligkeit für die Entwicklung einer Trinukleotid-Repeat-Expansionsstörung, dem Vorliegen einer Trinukleotid-Repeat-Expansionsstörung, der Schwere einer Trinukleotid- Repeat-Expansionsstörung oder einer beliebigen Kombination davon verbunden sind. Trinukleotid-Repeat-Expansionsstörungen werden in zwei Kategorien unterteilt, die durch die Art der Wiederholung bestimmt werden. Die häufigste Wiederholung ist das Triplett CAG, das, wenn es in der kodierenden Region eines Gens vorhanden ist, die Aminosäure Glutamin (Q) kodiert. Daher werden diese Störungen als Polyglutamin (polyQ)-Störungen bezeichnet und umfassen die folgenden Krankheiten: Huntington-Krankheit (Huntington Disease - HD); Spinobulbäre Muskelatrophie (Spinobulbar Muscular Atrophy - SBMA); Spinozerebelläre Ataxien (Spinocerebellar Ataxias - SCA-Typen 1, 2, 3, 6, 7 und 17); und Dentatorubro- Pallidoluysian Atrophie (DRPLA). Die verbleibenden Trinukleotid-Repeat- Expansionsstörungen betreffen entweder nicht das CAG-Triplett oder das CAG-Triplett befindet sich nicht in der kodierenden Region des Gens und werden daher als Nicht- Polyglutamin-Störungen bezeichnet. Die Nicht-Polyglutamin-Störungen umfassen das Fragile- X-Syndrom (FRAXA); Fragile XE Mental Retardation (FRAXE); Friedreich-Ataxie (FRDA); Myotone Dystrophie (DM); und Spinozerebelläre Ataxien (SCA-Typen 8 und 12).
  • Die Proteine, die mit Trinukleotid-Repeat-Expansionsstörungen assoziiert sind, können basierend auf einer experimentellen Assoziation des Proteins, das mit einer Trinukleotid- Repeat-Expansionsstörung assoziiert ist, zu einer Trinukleotid-Repeat-Expansionsstörung ausgewählt werden. Zum Beispiel kann die Produktionsrate oder zirkulierende Konzentration eines Proteins, das mit einer Trinukleotid-Repeat-Expansionsstörung assoziiert ist, in einer Population mit einer Trinukleotid-Repeat-Expansionsstörung relativ zu einer Population, der die Trinukleotid-Repeat-Expansionsstörung fehlt, erhöht oder erniedrigt sein. Unterschiede in den Proteinspiegeln können unter Verwendung proteomischer Techniken bewertet werden, einschließlich unter anderem Western Blot, immunhistochemische Färbung, Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) und Massenspektrometrie. Alternativ können die Proteine, die mit Trinukleotid-Repeat-Expansionsstörungen assoziiert sind, identifiziert werden, indem Genexprimierungsprofile der Gene, die die Proteine kodieren, unter Verwendung genomischer Techniken erhalten werden, einschließlich unter anderem DNA-Mikroarray-Analyse, serielle Analyse der Genexprimierung (SAGE) und quantitative Echtzeit Polymerase-Kettenreaktion (Q-PCR).
  • Nicht einschränkende Beispiele für Proteine, die mit Trinukleotid-Repeat- Expansionsstörungen assoziiert sind und durch Multi-Flap-Prime-Editing korrigiert werden können, beinhalten AR (Androgenrezeptor), FMR1 (fragile X mentale Retardation 1), HTT (Huntingtin), DMPK (Dystrophia myotonica-Proteinkinase), FXN (Frataxin), ATXN2 (Ataxin 2), ATN1 (Atrophin 1). FEN1 (Flap struktur-spezifische Endonuklease 1), TNRC6A (Trinukleotidwiederholung enthaltend 6A), PABPNa (Poly(A) bindendes Protein, Nuklear 1), JPH3 (Junctophilin 3), MED15 (Mediatorkomplex-Untereinheit 15), ATXN1 (Ataxin 1), ATXN3 (Ataxin 3), TBP (TATA-Box-Bindungsprotein), CACNA1A (Calciumkanal, spannungsabhängig, P/Q-Typ, alpha 1A-Untereinheit), ATXN80S (ATXN8-Gegenstrang (nicht proteinkodierend)), PPP2R2B (Proteinphosphatase 2, regulatorische Untereinheit B, Beta), ATXN7 (Ataxin 7), TNRC6B (Trinukleotid-Wiederholung mit 6B), TNRC6C (Trinukleotid-Wiederholung mit 6C), CELF3 (CUGBP, Elav-ähnliches Familienmitglied 3), MAB21L1 (mab-21-like 1 (C. elegans)), MSH2 (mutS-Homolog 2, Dickdarmkrebs, nonpo Lyposis Typ 1 (E. coli)), TMEM185A (Transmembranprotein 185A), SIX5 (SIX Homöobox 5), CNPY3 (Canopy 3-Homolog (Zebrafisch)), FRAXE (fragile Stelle, Folsäuretyp, selten, fra(X)(q28) E), GNB2 (Guaninnukleotid-bindendes Protein (G-Protein), Beta-Polypeptid 2), RPL14 (ribosomales Protein L14), ATXN8 (Ataxin 8), INSR (Insulinrezeptor), TTR (Transthyretin), EP400 (E1A-bindendes Protein p400), GIGYF2 (GRB10 interagierendes GYF-Protein 2), OGG1 (8-Oxoguanin-DNA-Glykosylase), STC1 (Stanniocalcin 1), CNDP1 (Carnosindipeptidase 1 (Metallopeptidase M20-Familie)), C10orf2 (Chromosom 10 offener Leseraster 2), MAML3 Mastermind-like 3 (Drosophila.)), DKC1 (Dyskeratosis congenita 1, Dyskerin), PAXIP1 (PAX interagierendes (mit Transkriptions-Aktivierungsdomäne) Protein 1), CASK (Calcium/Calmodulin-abhängige Serinproteinkinase (MAGUK-Familie)), MAPT (Mikrotubuli-assoziiertes Protein Tau) , SP1 (Sp1-Transkriptionsfaktor), POLG (Polymerase (DNA-gerichtet), Gamma), AFF2 (AF4/FMR2-Familie, Mitglied 2), THBS1 (Thrombospondin 1), TP53 (Tumo r-Protein p53), ESR1 (Östrogenrezeptor 1), CGGBP1 (CGG-Triplett-Repeat-Bindungsprotein 1), ABT1 (Aktivator der basalen Transkription 1), KLK3 (Kallikrein-related Peptidase 3), PRNP (Prionprotein), JUN (Jun Onkogen), KCNN3 (Kalium-Intermediat/Kalzium-aktivierter Kanal mit geringer Leitfähigkeit, Unterfamilie N, Mitglied 3), BAX (BCL2-assoziiertes X-Protein), FRAXA (fragile Stelle, Folsäure-Typ, selten, fra(X)(q27.3) A (Makroorchismus, geistige Behinderung)), KTBBD10 (Kelch-Repeat und BTB (POZ)-Domäne mit 10), MBNL1 (muskelblindartig (Drosophila)), RAD51 (RAD51- Homolog (RecA-Homolog, E. coli) (S. cerevisiae)), NCOA3 (Kernrezeptor-Koaktivator 3), ERDA1 (erweiterte Wiederholungsdomäne, CAG/CTG 1), TSC1 (tuberöse Sklerose 1), COMP (Oligomeres Matrixprotein des Knorpels), GCLC (Glutamat-Cystein-Ligase, katalytische Untereinheit), RRAD (Ras-verwandt mit Diabetes), MSH3 (mutS-Homolog 3 (E. coli)), DRD2 (Dopaminrezeptor D2), CD44 (CD44-Molekül (indische Blutgruppe)), CTCF (CCCTC-bindender Faktor (Zinkfingerprotein))), CCND1 (Cyclin D1), CLSPN (Claspin- Homolog (Xenopus laevis)), MEF2A (Myozyten-Enhancer-Faktor 2A), PTPRU (Protein- Tyrosin-Phosphatase, Rezeptortyp, U), GAPDH (Glyceraldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase), TRIM22 (dreiteiliges Motiv-enthaltend 22), WT1 (Wilms-Tumor 1), AHR (Aryl- Kohlenwasserstoff-Rezeptor), GPX1 (Glutathionperoxidase 1), TPMT (Thiopurin-S- Methyltransferase), NDP (Norrie-Krankheit (Pseudogliom)), ARX (aristaless related .) Homöobox), MUS81 (MUS81 Endonuklease-Homolog (S. cerevisiae)), TYR (Tyrosinase (okulokutaner Albinismus IA)), EGR1 (frühe Wachstumsreaktion 1), UNG (Uracil-DNA- Glykosylase), NUMBL (taubes Homolog (Drosophila)-like), FABP2 (Fettsäurebindendes Protein 2, intestinal), EN2 (engrailed homeobox 2), CRYGC (Crystallin, Gamma C), SRP14 (Signalerkennungspartikel 14 kDa (homologes Alu-RNA-Bindungsprotein)), CRYGB (Crystallin, Gamma B), PDCD1 (programmierter Zelltod 1), HOXA1 (Homöobox A1), ATXN2L (Ataxin 2-like), PMS2 (PMS2 postmeiotische Segregation erhöht 2 (S. cerevisiae)), GLA (Galactosidase, alpha), CBL (Cas-Br-M (murin) ecotropic retroviral transforming sequence), FTH1 (Ferritin, schweres Polypeptid 1), IL12RB2 (Interleukin-12-Rezeptor, Beta 2), OTX2 (Orthodentikel-Homöobox 2), HOXA5 (Homöobox A5), POLG2 (Polymerase (DNA-gerichtet), Gamma 2, akzessorische Untereinheit), DLX2 (distallose Homöobox 2), SIRPA (signalregulatorisches Protein alpha), OTX1 (orthodentikuläre Homöobox 1), AHRR (Aryl-Kohlenwasserstoff-Rezeptor-Repressor), MANF (Mesencephalic Astrocyte-derived neurotrophic factor), TMEM158 (Transmembranprotein 158 (Gen/Pseudogen)) und ENSG00000078687.
  • In einem besonderen Aspekt stellt die vorliegende Offenbarung TPRT-basierte Verfahren zur Behandlung eines Patienten bereit, bei dem eine Expansions-Repeat-Störung diagnostiziert wurde (auch bekannt als eine Repeat-Expansions-Störung oder eine Trinukleotid-Repeat-Störung). Expansions-Wiederholungsstörungen treten auf, wenn Mikrosatelliten-Wiederholungen über einen Schwellenwert hinaus expandieren. Derzeit wird angenommen, dass mindestens 30 genetische Krankheiten durch wiederholte Ausbreitung verursacht werden. Das wissenschaftliche Verständnis dieser vielfältigen Gruppe von Erkrankungen kam in den frühen 1990er Jahren mit der Entdeckung ans Licht, dass Trinukleotid-Wiederholungen mehreren bedeutenden Erbkrankheiten zugrunde liegen, darunter Fragiles X, Spinale und Bulbäre Muskelatrophie, Myotone Dystrophie und Chorea Huntington (Nelson et al. „The unstable repeats - three evolving faces of neurological disease“, Neuron, March 6, 2013, Vol.77; 825-843, die hierin durch Bezugnahme aufgenommen ist), sowie Haw-River-Syndrom, Jacobsen-Syndrom, Dentatorubral-Pallidoluysian-Atrophie (DRPLA), Machado-Joseph-Krankheit, Synpolydaktylie (SPD II), Hand-Fuß-Genitalsyndrom (HFGS), Kleidokranielle Dysplasie (CCD), Holoprosenzephalie-Erkrankung (HPE), Angeborenes zentrales Hypventilationssyndrom (CCHS), ARX-nicht-syndromale X- chromosomale geistige Behinderung (XLMR) und okulopharyngeale Muskeldystrophie (OPMD) (siehe. Es wurde festgestellt, dass die wiederholte Instabilität von Mikrosatelliten ein Kennzeichen dieser Bedingungen ist, ebenso wie die Antizipation - das Phänomen, bei dem mit jeder nachfolgenden Generation eine Wiederholungsexpansion auftreten kann, was zu einem schwereren Phänotyp und einem früheren Erkrankungsalter bei den Nachkommen führt. Es wird angenommen, dass wiederholte Expansionen über verschiedene Mechanismen Krankheiten verursachen. Expansionen können nämlich die zelluläre Funktion auf der Ebene des Gens, des mRNA-Transkripts und/oder des kodierten Proteins beeinträchtigen. Unter einigen Bedingungen wirken Mutationen über einen Funktionsverlustmechanismus, indem sie Wiederholungsgene stummschalten. In anderen Fällen resultieren die Erkrankungen aus Gainof-Function-Mechanismen, bei denen entweder das mRNA-Transkript oder das Protein neue, abweichende Funktionen übernimmt.
  • In einer Ausführungsform ist ein Verfahren zur Behandlung einer Trinukleotid- Repeat-Störung in 23 dargestellt. Im Allgemeinen beinhaltet der Ansatz die Verwendung von TPRT Genom Editing (d. h. Multi-Flap-Prime-Editing) in Kombination mit einer verlängerten gRNA, die eine Region umfasst, die eine gewünschte und gesunde Austausch- Trinukleotid-Wiederholungssequenz kodiert, die die endogene kranke Trinukleotid- Wiederholungssequenz durch den Mechanismus des Hauptbearbeitungsprozesses ersetzen soll. Ein Schema einer beispielhaften gRNA-Ausgestaltung zum Kontrahieren von Trinukleotid- Repeat-Sequenzen und Trinukleotid-Repeat-Kontraktion mit TPRT-Genom-Editing (d. h. Multi-Flap-Prime-Editing) ist in 23 gezeigt.
  • Prionenerkrankung
  • Multi-Flap-Prime-Editing kann auch verwendet werden, um das Fortschreiten der Prionenerkrankung zu verhindern oder zu stoppen, indem eine oder mehrere schützende Mutationen in Prionenproteine (PRNP) eingebaut werden, die im Verlauf der Krankheit fehlgefaltet werden. Prionenerkrankungen oder übertragbare spongiforme Enzephalopathien (transmissible spongiform encephalopathies - TSE) sind eine Familie seltener progressiver neurodegenerativer Erkrankungen, die sowohl Menschen als auch Tiere betreffen. Sie zeichnen sich durch lange Inkubationszeiten, charakteristische spongiforme Veränderungen, die mit neuronalem Verlust verbunden sind, und ein Versagen, eine Entzündungsreaktion auszulösen, aus.
  • Beim Menschen umfasst die Prionerkrankung die Creutzfeldt-Jakob-Krankheit (Creutzfeldt-Jakob Disease - CJD), die Variante der Creutzfeldt-Jakob-Krankheit (Variant Creutzfeldt-Jakob Disease - vCJD), das Gerstmann-Straussler-Scheinker-Syndrom, die tödliche familiäre Schlaflosigkeit und Kuru. Bei Tieren umfasst die Prionenerkrankung die bovine spongiforme Enzephalopathie (BSE oder „Rinderwahnsinn“), die chronische Auszehrungskrankheit (Chronic Wasting Disease - CWD), Scrapie, die übertragbare Nerz- Enzephalopathie, die feline spongiforme Enzephalopathie und die spongiforme Enzephalopathie bei Huftieren. Multi-Flap-Prime-Editing kann verwendet werden, um schützende Punktmutationen in ein Prionenprotein einzubauen, um das Fortschreiten einer dieser Prionenkrankheiten zu verhindern oder zu stoppen.
  • Die klassische CJD ist eine humane Prionenerkrankung. Es handelt sich um eine neurodegenerative Erkrankung mit charakteristischen klinischen und diagnostischen Merkmalen. Diese Krankheit ist schnell fortschreitend und immer tödlich. Eine Infektion mit dieser Krankheit führt in der Regel innerhalb von 1 Jahr nach Krankheitsbeginn zum Tod. CJD ist eine schnell fortschreitende, ausnahmslos tödliche neurodegenerative Erkrankung, von der angenommen wird, dass sie durch eine abnormale Isoform eines zellulären Glykoproteins, das als Prionprotein bekannt ist, verursacht wird. CJD tritt weltweit auf und die geschätzte jährliche Inzidenz in vielen Ländern, einschließlich der Vereinigten Staaten, wird mit etwa einem Fall pro Million Einwohner angegeben. Die überwiegende Mehrheit der CJD-Patienten stirbt normalerweise innerhalb eines Jahres nach Krankheitsbeginn. CJD wird zusammen mit anderen Prionenerkrankungen, die bei Mensch und Tier vorkommen, als übertragbare spongiforme Enzephalopathie (TSE) klassifiziert. Bei etwa 85 % der Patienten tritt CJD als sporadische Erkrankung ohne erkennbares Übertragungsmuster auf. Ein geringerer Anteil der Patienten (5 bis 15 %) entwickelt CJD aufgrund von vererbten Mutationen des Prionprotein- Gens. Zu diesen Erbformen gehören das Gerstmann-Straussler-Scheinker-Syndrom und die tödliche familiäre Schlaflosigkeit. Derzeit ist keine Behandlung für CJD bekannt.
  • Die Variante Creutzfeldt-Jakob-Krankheit (vCJD) ist eine Prionenerkrankung, die erstmals 1996 im Vereinigten Königreich beschrieben wurde. Es gibt inzwischen starke wissenschaftliche Beweise dafür, dass der Erreger, der für den Ausbruch der Prionenerkrankung bei Kühen, der bovinen spongiformen Enzephalopathie (BSE oder „Rinderwahn“), derselbe Erreger ist, der für den Ausbruch der vCJD beim Menschen verantwortlich ist. Die variante CJD (vCJD) ist nicht dieselbe Krankheit wie die klassische CJD (oft einfach CJD genannt). Sie hat andere klinische und pathologische Merkmale als die klassische CJD. Jede Erkrankung weist ebenso ein bestimmtes genetisches Profil des Prionprotein-Gens auf. Beide Erkrankungen sind ausnahmslos tödliche Hirnerkrankungen mit ungewöhnlich langen Inkubationszeiten, gemessen in Jahren, und werden durch einen unkonventionellen übertragbaren Erreger namens Prion verursacht. Derzeit ist keine Behandlung für vCJD bekannt.
  • BSE (bovine spongiforme Enzephalopathie oder „Rinderwahnsinn“) ist eine fortschreitende neurologische Erkrankung von Rindern, die aus einer Infektion mit einem ungewöhnlichen übertragbaren Erreger namens Prion resultiert. Die Natur des übertragbaren Mittels ist noch nicht richtig verstanden. Derzeit ist die am meisten akzeptierte Theorie, dass der Erreger eine modifizierte Form eines normalen Proteins ist, das als Prionprotein bekannt ist. Aus noch nicht verstandenen Gründen geht das normale Prionprotein in eine pathogene (schädliche) Form über, die dann das Zentralnervensystem von Rindern schädigt. Es gibt zunehmend Hinweise darauf, dass es verschiedene BSE-Stämme gibt: den typischen oder klassischen BSE-Stamm, der für den Ausbruch im Vereinigten Königreich verantwortlich ist, und zwei atypische Stämme (H- und L-Stämme). Derzeit ist keine Behandlung für BSE bekannt.
  • Die chronische Auszehrungskrankheit (Chronic Wasting Disease - CWD) ist eine Prionenkrankheit, die Hirsche, Elche, Rentiere, Sikahirsche und Elentiere befällt. Sie wurde in einigen Gebieten Nordamerikas entdeckt, darunter Kanada und die Vereinigten Staaten, Norwegen und Südkorea. Es kann über ein Jahr dauern, bis ein infiziertes Tier Symptome entwickelt, die drastischen Gewichtsverlust (Auszehrung), Stolpern, Antriebslosigkeit und andere neurologische Symptome beinhalten können. CWD kann Tiere jeden Alters betreffen und einige infizierte Tiere können sterben, ohne die Krankheit jemals zu entwickeln. CWD ist für Tiere tödlich und es gibt keine Behandlungen oder Impfstoffe.
  • Als Erreger von TSE gelten Prionen. Der Begriff „Prionen“ bezieht sich auf abnormale, pathogene Erreger, die übertragbar und in der Lage sind, eine abnormale Faltung bestimmter normaler zellulärer Proteine, genannt Prionenproteine, die am häufigsten im Gehirn vorkommen, zu induzieren. Die Funktionen dieser normalen Prionenproteine sind noch nicht vollständig verstanden. Die abnormale Faltung der Prionenproteine führt zu Hirnschäden und den charakteristischen Anzeichen und Symptomen der Krankheit. Prionenerkrankungen sind gewöhnlich schnell fortschreitend und immer tödlich.
  • Wie hier verwendet, soll der Begriff „Prion“ ein infektiöses Partikel bedeuten, von dem bekannt ist, dass es bei Menschen und Tieren Krankheiten (spongiforme Enzephalopathien) verursacht. Der Begriff „Prion“ ist eine Kontraktion der Wörter „Protein“ und „Infektion“, und die Partikel bestehen größtenteils, wenn nicht ausschließlich, aus PRNPSc-Molekülen, die von einem PRNP-Gen kodiert werden, das PRNPC exprimiert, das seine Konformation ändert, um zu PRNPSc zu werden. Prionen unterscheiden sich von Bakterien, Viren und Viroiden. Bekannte Prionen umfassen solche, die Tiere infizieren, um Scrapie zu verursachen, eine übertragbare degenerative Erkrankung des Nervensystems von Schafen und Ziegen, sowie bovine spongiforme Enzephalopathien (BSE) oder Rinderwahn und feline spongiforme Enzephalopathien bei Katzen. Vier Prionenerkrankungen, wie oben erörtert, die bekanntermaßen den Menschen betreffen, sind (1) Kuru, (2) Creutzfeldt-Jakob-Krankheit (CJD), (3) Gerstmann-Strassler-Scheinker-Krankheit (GSS) und (4) tödliche familiäre Schlaflosigkeit (FFI). Wie hierin verwendet, schließt Prion alle Formen von Prionen ein, die alle oder eine beliebige dieser Krankheiten oder andere bei allen verwendeten Tieren verursachen - und insbesondere bei Menschen und in domestizierten Nutztieren.
  • Im Allgemeinen und ohne an eine Theorie gebunden sein zu wollen, werden Vorerkrankungen durch Fehlfaltung von Prionenproteinen verursacht. Bei solchen Krankheiten - oft auch Ablagerungskrankheiten genannt - kann die Fehlfaltung der Prionenproteine wie folgt erklärt werden. Wenn A das normalerweise synthetisierte Genprodukt ist, das eine beabsichtigte physiologische Rolle in einem monomeren oder oligomeren Zustand ausübt, ist A* eine konformativ aktivierte Form von A, die kompetent ist, eine dramatische Konformationsänderung einzugehen, B ist der konformativ veränderte Zustand, der multimere Anordnungen (d. h. die fehlgefaltete Form, die Ablagerungen bildet) bevorzugt und Bn ist das multimere Material, das pathogen und relativ schwer zu recyceln ist. Bei den Prionenerkrankungen entsprechen PRNPC und PRNPSc den Zuständen A und Bn, wobei A weitgehend helixförmig und monomer und Bn β-reich und multimer ist.
  • Es ist bekannt, dass bestimmte Mutationen in Prionenproteinen mit einem erhöhten Risiko einer Vorerkrankung verbunden sein können. Umgekehrt können bestimmte Mutationen in Prionenproteinen schützender Natur sein. Siehe Bagynszky et al. „Characterization of mutations in PRNP (prion) gene and their possible roles in neurodegenerative disease", Neuropsychiatr Dis Treat., 2018; 14: 2067-2085, deren Inhalt hierin durch Bezugnahme aufgenommen ist.
  • PRNP (NCBI RefSeq Nr. NP_000302.1 (SEQ-ID-NR: 291)) - das humane Prionprotein - wird von einem 16 kb langen Gen kodiert, das sich auf Chromosom 20 (4686151-4701588) befindet. Es enthält zwei Exons, und das Exon 2 trägt den offenen Leserahmen, der das 253 Aminosäuren (AA) lange PrP-Protein codiert. Exon 1 ist ein nicht-kodierendes Exon, das als Transkriptionsinitiationsstelle dienen kann. Die posttranslationalen Modifikationen führen zur Entfernung des ersten 22 AA N-terminalen Fragments (NTF) und des letzten 23 AA C- terminalen Fragments (CTF). Das NTF wird nach dem Transport von PrP zum endoplasmatischen Retikulum (ER) gespalten, während das CTF (Glycosylphosphatidylinositol [GPI]-Signalpeptid [GPI-SP]) durch den GPI-Anker gespalten wird. GPI-Anker könnten am PrP-Proteintransport beteiligt sein. Sie können auch eine Rolle bei der Anheftung von Prionenprotein an die äußere Oberfläche der Zellmembran spielen. Normales PrP besteht aus einer langen N-terminalen Schleife (die die Octapeptid- Wiederholungsregion enthält), zwei kurzen β-Faltblättern, drei α-Helices und einer C- terminalen Region (die den GPI-Anker enthält). Die Spaltung von PrP führt zu einem 208 AA langen Glykoprotein, das in der Zellmembran verankert ist.
  • Die 253-Aminosäuresequenz von PRNP (NP_000302.1) ist wie folgt:
    Figure DE112021002672T5_0501
  • Die 253-Aminosäuresequenz von PRNP (NP_000302.1) wird durch die folgende Nukleotidsequenz (NCBI Ref. Seq Nr. NM_000311.5, „Homo Sapiens Prionenprotein (PRNP), Transkriptvariante 1, mRNA) wie folgt kodiert:
    Figure DE112021002672T5_0502
    Figure DE112021002672T5_0503
  • Mutationsstellenn relativ zu PRNP (NP_000302.1), die mit CJD und FFI verknüpft sind, werden wie folgt beschrieben. Diese Mutationen können unter Verwendung der hierin offenbarten Multi-Flap-Prime-Editoren entfernt oder eingebaut werden.
    MUTATION AMINOSÄURESEQUENZ VON MUTIERTEM PRNP IN VERBINDUNG MIT CJD-PRIONERKRANKUNG (SIEHE TABELLE 1 VON BAGYNSZKY ET AL., 2018) (RELATIV ZU SEQ-ID-NR: 291 VON PRNP NP_00302.1)
    D178N
    Figure DE112021002672T5_0504
    T188K
    Figure DE112021002672T5_0505
    E196K
    Figure DE112021002672T5_0506
    E196A
    Figure DE112021002672T5_0507
    E200K
    Figure DE112021002672T5_0508
    E200G
    Figure DE112021002672T5_0509
    V203I
    Figure DE112021002672T5_0510
    R208H
    Figure DE112021002672T5_0511
    V210I
    Figure DE112021002672T5_0512
    E211Q
    Figure DE112021002672T5_0513
    M232R
    Figure DE112021002672T5_0514
  • Es wird über Mutationsstellen relativ zu PRNP (NP_000302.1) (SEQ-ID-Nr: 291) berichtet, die mit GSS verknüpft sind, wie folgt:
    MUTATION AMINOSÄURESEQUENZ VON MUTIERTEM PRNP IN VERBINDUNG MIT GSS-PRIONERKRANKUNG (SIEHE TABELLE 2 VON BAGYNSZKY ETAL., 2018) (RELATIV ZU SEQ-ID-NR: 291 VON PRNP NP_00302. 1)
    P102L
    Figure DE112021002672T5_0515
    P105L
    Figure DE112021002672T5_0516
    A117V
    Figure DE112021002672T5_0517
    G131V
    Figure DE112021002672T5_0518
    V176G
    Figure DE112021002672T5_0519
    H187R
    Figure DE112021002672T5_0520
    Figure DE112021002672T5_0521
    F198S
    Figure DE112021002672T5_0522
    D202N
    Figure DE112021002672T5_0523
    Q212P
    Figure DE112021002672T5_0524
    Q217R
    Figure DE112021002672T5_0525
    M232T
    Figure DE112021002672T5_0526
  • Mutationsstellen relativ zu PRNP (NP_000302.1) (SEQ-ID-Nr: 291), die mit einem möglichen Schutzcharakter gegen Prionenerkrankungen verbunden sind, wie folgt:
    MUTATION AMINOSÄURESEQUENZ VON MUTIERTEM PRNP IN VERBINDUNG MIT EINER SCHÜTZENDEN NATUR GEGEN PRIONERKRANKUNGEN (SIEHE TABELLE 4 VON BAGYNSZKY ET AL., 2018) (RELATIV ZU SEQ-ID-NR: 291 VON PRNP NP_00302.1)
    MUTATION
    Figure DE112021002672T5_0527
    G127S
    Figure DE112021002672T5_0528
    G127V
    Figure DE112021002672T5_0529
    M129V
    Figure DE112021002672T5_0530
    D167G
    Figure DE112021002672T5_0531
    D167N
    Figure DE112021002672T5_0532
    N171S
    Figure DE112021002672T5_0533
    E219K
    Figure DE112021002672T5_0534
    P238S
    Figure DE112021002672T5_0535
  • Somit kann in verschiedenen Ausführungsformen ein Multi-Flap-Prime-Editing verwendet werden, um eine Mutation in PRNP zu entfernen, die mit einer Prionenerkrankung verbunden ist, oder eine Mutation in PRNP einzubauen, die als Schutz gegen eine Prionenerkrankung angesehen wird. Multi-Flap-Prime-Editing kann beispielsweise verwendet werden, um eine D178N-, V180I-, T188K-, E196K-, E196A-, E200K-, E200G-, V203I-, R208H-, V210I-, E211Q-, I215V- oder M232R-Mutation im PRNP-Protein (relativ zu PRNP von NP_000302.1) zu entfernen oder wiederherzustellen (Seq-ID-NR: 291). In weiteren Ausführungen kann Multi-Flap-Prime-Editing beispielsweise verwendet werden, um eine P102L-, P105L-, A117V-, G131V-, V176G-, H187R-, F198S-, D202N-, Q212P-, Q217R- oder M232R-Mutation im PRNP-Protein (relativ zu PRNP von NP_000302.1) zu entfernen oder wiederherzustellen (Seq-ID-NR: 291). Durch Entfernen oder Korrigieren des Vorhandenseins solcher Mutationen in PRNP unter Verwendung von Prime-Editing kann das Risiko einer Prionenerkrankung verringert oder eliminiert werden.
  • In anderen Ausführungsformen kann Multi-Flap-Prime-Editing verwendet werden, um eine schützende Mutation in PRNP einzubauen, die mit einer schützenden Wirkung gegen eine oder mehrere Prionenerkrankungen verbunden ist. Beispielsweise kann Multi-Flap-Prime- Editing verwendet werden, um eine schützende G127S-, G127V-, M129V-, D167G-, D167N- , N171S-, E219K oder P238S-Mutation im PRNP (relativ zu PRNP von NP_000302.1) einzubauen (Seq-ID-NR: 291). In noch anderen Ausführungsformen kann die schützende Mutation eine beliebige alternative Aminosäure sein, die bei G127, G127, M129, D167, D167, N171, E219 oder P238 im PRNP eingebaut ist (relativ zu PRNP von NP_000302.1) (SEQ-ID- NR: 291).
  • In bestimmten Ausführungsformen kann Multi-Flap-Prime-Editing verwendet werden, um eine G127V-Schutzmutation in PRNP einzubauen, wie in 27 dargestellt und in Beispiel 5 erörtert.
  • In einer anderen Ausführungsformen kann Prime-Editing verwendet werden, um eine E219K-Schutzmutation in PRNP einzubauen.
  • Das PRNP-Protein und die schützende Mutationsstelle sind bei Säugetieren konserviert, so dass es neben der Behandlung von Krankheiten beim Menschen auch dazu verwendet werden könnte, Kühe und Schafe zu erzeugen, die gegen Prionenerkrankungen immun sind, oder sogar zur Heilung von Wildpopulationen von Tieren, die an Prionenerkrankungen leiden. Prime-Editing wurde bereits eingesetzt, um -25 % eines natürlich vorkommenden schützenden Allels in humane Zellen einzubauen, und frühere Mausexperimente deuten darauf hin, dass dieser Grad des Einbaus ausreicht, um Immunität gegen die meisten Prionenerkrankungen zu bewirken. Dieses Verfahren ist die erste und möglicherweise einzige gegenwärtige Möglichkeit, dieses Allel mit so hoher Effizienz in den meisten Zelltypen einzubauen. Eine andere mögliche Behandlungsstrategie besteht darin, Prime-Editing oder Multi-Flap-Prime-Editing zu verwenden, um die Expression von PRNP zu reduzieren oder zu eliminieren, indem ein frühes Stoppcodon in das Gen eingebaut wird.
  • Unter Verwendung der hierin beschriebenen Prinzipien für die PEgRNA-Ausgestaltung können geeignete PEgRNAs zum Einbauen gewünschter schützender Mutationen oder zum Entfernen von Prionenerkrankung-assoziierten Mutationen aus PRNP ausgestaltet werden. Beispielsweise kann die folgende Liste von PEgRNAs verwendet werden, um das G127V- Schutzallel und das E219K-Schutzallel in humanem PRNP sowie das G127V-Schutzallel in PRNP verschiedener Tiere einzubauen.
  • [10] Pharmazeutische Zusammensetzungen
  • Andere Aspekte der vorliegenden Offenbarung beziehen sich auf pharmazeutische Zusammensetzungen, die eine der verschiedenen Komponenten des hierin beschriebenen Multi-Flap-Prime-Editing-Systems umfassen (z. B. einschließlich unter anderem die napDNAbps, Reverse Transkriptasen, Fusionsproteine (z. B. umfassend napDNAbps und reverse Transkriptasen), verlängerte Leit-RNAs und Komplexe, die Fusionsproteine und Extended-Guide-RNAs umfassen, sowie akzessorische Elemente, wie z. B. Zweitstrang- Nicking-Komponenten und endogene 5'-DNA-Flap-Entfernungsendonukleasen, um den Multi-Flap-Prime-Editing-Prozess in Richtung der editierten Produktbildung zu treiben).
  • Der Begriff „pharmazeutische Zusammensetzung“, wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf eine Zusammensetzung, die zur pharmazeutischen Verwendung formuliert ist. In einigen Ausführungsformen umfasst die pharmazeutische Zusammensetzung ferner einen pharmazeutisch annehmbaren Träger. In einigen Ausführungsformen umfasst die pharmazeutische Zusammensetzung zusätzliche Mittel (z. B. zur spezifischen Einschleusung, Erhöhung der Halbwertszeit oder andere therapeutische Verbindungen).
  • Wie hier verwendet, bedeutet der Begriff „pharmazeutisch annehmbarer Träger“ ein pharmazeutisch annehmbares Material, eine Zusammensetzung oder ein pharmazeutisch annehmbares Vehikel, wie ein flüssiger oder fester Füllstoff, ein Verdünnungsmittel, ein Hilfsstoff, ein Herstellungshilfsmittel (z. B. Schmiermittel, Talkum Magnesium, Calcium- oder Zinkstearat, oder Sterinsäure) oder lösungsmittelverkapselndes Material, das am Tragen oder Transportieren der Verbindung von einer Stelle (z. B. der Einschleusungsstelle) des Körpers zu einer anderen Stelle (z. B. Organ, Gewebe oder Körperteil) beteiligt ist. Ein pharmazeutisch annehmbarer Träger ist „annehmbar“ in dem Sinne, dass er mit den anderen Bestandteilen der Formulierung kompatibel ist und das Gewebe des Patienten nicht schädigt (z. B. physiologisch kompatibel, steril, physiologischer pH-Wert usw.). Einige Beispiele für Materialien, die als pharmazeutisch verträgliche Träger dienen können, beinhalten: (1) Zucker, wie Lactose, Glucose und Saccharose; (2) Stärken, wie Maisstärke und Kartoffelstärke; (3) Zellulose und deren Derivate, wie Natriumcarboxymethylzellulose, Methylzellulose, Ethylzellulose, mikrokristalline Zellulose und Zelluloseacetat; (4) pulverisierter Traganth; (5) Malz; (6) Gelatine; (7) Schmiermittel, wie Magnesiumstearat, Natriumlaurylsulfat und Talk; (8) Hilfsstoffe, wie Kakaobutter und Zäpfchenwachse; (9) Öle, wie Erdnussöl, Baumwollsamenöl, Distelöl, Sesamöl, Olivenöl, Maisöl und Sojabohnenöl; (10) Glykole, wie Propylenglykol; (11) Polyole, wie Glycerin, Sorbit, Mannit und Polyethylenglycol (PEG); (12) Ester, wie Ethyloleat und Ethyllaurat; (13) Agar; (14) Puffermittel, wie Magnesiumhydroxid und Aluminiumhydroxid; (15) Alginsäure; (16) pyrogenfreies Wasser; (17) isotonische Kochsalzlösung; (18) Ringer-Lösung; (19) Ethylalkohol; (20) pH-gepufferte Lösungen; (21) Polyester, Polycarbonate und/oder Polyanhydride; (22) Füllstoffe wie Polypeptide und Aminosäuren (23) Serumkomponente wie Serumalbumin, HDL und LDL; (22) C2-C12- Alkohole, wie Ethanol; und (23) andere nicht-toxische kompatible Substanzen, die in pharmazeutischen Rezepturen verwendet werden. Benetzungsmittel, Färbemittel, Trennmittel, Beschichtungsmittel, Süßungsmittel, Geschmacksstoffe, Duftstoffe, Konservierungsmittel und Antioxidantien können auch in der Rezeptur enthalten sein. Die Begriffe wie „Hilfsstoff“, „Träger“, „pharmazeutisch annehmbarer Träger“ oder dergleichen werden hier austauschbar verwendet.
  • In einigen Ausführungsformen wird die pharmazeutische Zusammensetzung zur Verabreichung an einen Patienten formuliert, z. B. für Gen Editing. Geeignete Verabreichungswege der hierin beschriebenen pharmazeutischen Zusammensetzung beinhalten unter anderem: topische, subkutane, transdermale, intradermale, intraläsionale, intraartikuläre, intraperitoneale, intravesikale, transmukosale, gingivale, intradentale, intracochleare, transtympanale, intraorganische, epidurale, intrathekale, intramuskuläre, intravenöse, intravaskuläre, intraossäre, periokuläre, intratumorale, intrazerebrale und intrazerebroventrikuläre Verabreichung.
  • In einigen Ausführungsformen wird die hierin beschriebene pharmazeutische Zusammensetzung lokal an eine erkrankte Stelle (z. B. eine Tumorstelle) verabreicht. In einigen Ausführungsformen wird die hierin beschriebene pharmazeutische Zusammensetzung einem Patienten durch Injektion, mittels eines Katheters, mittels eines Zäpfchens oder mittels eines Implantats verabreicht, wobei das Implantat aus einem porösen, nicht porösen oder gelatineartigen Material besteht, einschließlich einer Membran, wie einer sialastischen Membran, oder einer Faser.
  • In anderen Ausführungsformen wird die hierin beschriebene pharmazeutische Zusammensetzung in einem kontrollierten Freisetzungssystem eingeschleust. In einer Ausführungsform kann eine Pumpe verwendet werden (siehe z. B. Langer, 1990, Science 249:1527-1533; Sefton, 1989, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201; Buchwald et al., 1980, Surgery 88:507; Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321 :574). In einer anderen Ausführungsform können Polymermaterialien verwendet werden. (Siehe z. B. Medical Applications of Controlled Release (Langer and Wise eds., CRC Press, Boca Raton, Fla., 1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance (Smolen and Ball eds., Wiley, New York, 1984); Ranger and Peppas, 1983, Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61. Siehe auch Levy et al., 1985, Science 228:190; During et al., 1989, Ann. Neurol. 25:351; Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 71:105). Andere kontrollierte Freisetzungssysteme werden beispielsweise bei Langer, supra, erörtert.
  • In einigen Ausführungsformen wird die pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Routineverfahren als Zusammensetzung formuliert, die zur intravenösen oder subkutanen Verabreichung an einen Probanden, z. B. einen Menschen, angepasst ist. In einigen Ausführungsformen sind pharmazeutische Zusammensetzungen zur Verabreichung durch Injektion Lösungen in sterilem isotonischem wässrigem Puffer. Falls erforderlich, kann das Arzneimittel auch ein Solubilisierungsmittel und ein Lokalanästhetikum wie Lignocain enthalten, um Schmerzen an der Injektionsstelle zu lindern. Im Allgemeinen werden die Inhaltsstoffe entweder getrennt oder zusammengemischt in Einheitsdosierungsform geliefert, zum Beispiel als trockenes lyophilisiertes Pulver oder wasserfreies Konzentrat in einem hermetisch verschlossenen Behälter, wie einer Ampulle oder einem Beutel, der die Wirkstoffmenge anzeigt. Wenn das Arzneimittel durch Infusion verabreicht werden soll, kann es mit einer Infusionsflasche abgegeben werden, die steriles Wasser oder Kochsalzlösung pharmazeutischer Qualität enthält. Wenn die pharmazeutische Zusammensetzung durch Injektion verabreicht wird, kann eine Ampulle mit sterilem Wasser zur Injektion oder Kochsalzlösung bereitgestellt werden, so dass die Inhaltsstoffe vor der Verabreichung gemischt werden können.
  • Eine pharmazeutische Zusammensetzung zur systemischen Verabreichung kann eine Flüssigkeit sein, z. B. sterile Kochsalzlösung, Ringer-Laktat- oder Hank-Lösung. Außerdem kann die pharmazeutische Zusammensetzung in fester Form vorliegen und unmittelbar vor der Verwendung wieder aufgelöst oder suspendiert werden. Lyophilisierte Formen werden ebenfalls in Betracht gezogen.
  • Die pharmazeutische Zusammensetzung kann in einem Lipidpartikel oder Vesikel enthalten sein, wie einem Liposom oder Mikrokristall, das auch für die parenterale Verabreichung geeignet ist. Die Partikel können jede geeignete Struktur aufweisen, wie unilamellar oder plurilamellar, solange Zusammensetzungen darin enthalten sind. Verbindungen können in „stabilisierten Plasmid-Lipid-Partikeln“ (SPLP) eingeschlossen werden, die das fusogene Lipid Dioleoylphosphatidylethanolamin (DOPE), geringe Mengen (5-10 Mol-%) an kationischem Lipid enthalten und durch eine Polyethylenglycol (PEG)- Beschichtung stabilisiert werden (Zhang YP et al., Gene Ther. 1999, 6:1438-47). Besonders bevorzugt für solche Partikel und Vesikel sind positiv geladene Lipide wie N-[1-(2,3- Dioleoyloxi)propyl]-N,N,N-Trimethyl-Amoniummethylsulfat oder „DOTAP“. Die Herstellung solcher Lipidpartikel ist gut bekannt. Siehe z. B. US-Patent Nr. 4,880,635 ; 4.906.477 ; 4.911.928 ; 4.917.951 ; 4.920.016 und 4.921.757 ; die jeweils durch Bezugnahme hierin aufgenommen sind.
  • Die hierin beschriebene pharmazeutische Zusammensetzung kann beispielsweise als Einheitsdosis verabreicht oder verpackt werden. Der Begriff „Einheitsdosis“, wenn er in Bezug auf eine pharmazeutische Zusammensetzung der vorliegenden Offenbarung verwendet wird, bezieht sich auf physikalisch diskrete Einheiten, die als Einheitsdosis für den Patienten geeignet sind, wobei jede Einheit eine vorbestimmte Menge an aktivem Material enthält, die berechnet wird, um die gewünschte therapeutische Wirkung in Verbindung mit dem erforderlichen Verdünnungsmittel zu produzieren; d. h. Träger oder Vehikel.
  • Ferner kann die pharmazeutische Zusammensetzung als pharmazeutischer Kit bereitgestellt werden, umfassend (a) einen Behälter, der eine Verbindung der Erfindung in lyophilisierter Form enthält, und (b) einen zweiten Behälter, der ein pharmazeutisch annehmbares Verdünnungsmittel (z. B. steriles Wasser) zur Injektion enthält. Das pharmazeutisch annehmbares Verdünnungsmittel kann zur Rekonstitution oder Verdünnung der lyophilisierten Verbindung der Erfindung verwendet werden. Optional mit einem oder mehreren solchen Behältern verbunden sein kann eine Mitteilung in der Form, wie sie von einer Regierungsbehörde vorgeschrieben ist, die die Herstellung, Verwendung oder den Verkauf von Arzneimitteln oder biologischen Produkten regelt, wobei die Mitteilung die Genehmigung der Herstellungs-, Verwendungs- oder Verkaufsstelle für die humane Verabreichung wiedergibt.
  • In einem anderen Aspekt ist ein Herstellungsartikel enthalten, der Materialien enthält, die für die Behandlung der oben beschriebenen Krankheiten nützlich sind. In einigen Ausführungsformen umfasst der Herstellungsartikel einen Behälter und ein Etikett. Geeignete Behälter umfassen beispielsweise Flaschen, Ampullen, Spritzen und Teströhrchen. Die Behälter können aus einer Vielzahl von Materialien wie Glas oder Kunststoff gebildet sein. In einigen Ausführungsformen enthält der Behälter eine Zusammensetzung, die zur Behandlung einer hierin beschriebenen Krankheit wirksam ist und eine sterile Zugangsöffnung aufweisen kann. Zum Beispiel kann der Behälter ein Beutel mit intravenöser Lösung oder ein Fläschchen mit einem Stopfen sein, der mit einer Injektionsnadel durchstechbar ist. Der Wirkstoff in der Zusammensetzung ist eine erfindungsgemäße Verbindung. In einigen Ausführungsformen zeigt das Etikett auf oder in Verbindung mit dem Behälter an, dass die Zusammensetzung zur Behandlung der Krankheit der Wahl verwendet wird. Der Herstellungsartikel kann ferner einen zweiten Behälter umfassen, der einen pharmazeutisch annehmbaren Puffer umfasst, wie beispielsweise phosphatgepufferte Kochsalzlösung, Ringer-Lösung oder Dextroselösung. Es kann ferner andere Materialien umfassen, die aus kommerzieller Sicht und vom Standpunkt des Benutzers wünschenswert sind, einschließlich anderer Puffer, Verdünnungsmittel, Filter, Nadeln, Spritzen und Packungsbeilagen mit Gebrauchsanweisungen.
  • [11] Kits, Zellen, Vektoren und Einschleusung
  • Kits
  • Die Zusammensetzungen der vorliegenden Offenbarung können zu Kits zusammengestellt werden. In einigen Ausführungsformen umfasst der Kit NukleinsäureVektoren für die Exprimierung der hierin beschriebenen Multi-Flap-Prime-Editoren. In anderen Ausführungsformen umfasst der Kit ferner geeignete Leitnukleotidsequenzen (z. B. PEgRNAs und gRNAs der zweiten Stelle) oder Nukleinsäurevektoren für die Exprimierung solcher Leitnukleotidsequenzen, um das Cas9-Protein oder den Prime-Editor auf die gewünschte Zielsequenz auszurichten.
  • Der hierin beschriebene Kit kann einen oder mehrere Behälter beinhalten, die Komponenten zum Ausführen der hierin beschriebenen Verfahren und gegebenenfalls Anweisungen für den Gebrauch enthalten. Jeder der hierin beschriebenen Kits kann ferner Komponenten umfassen, die zum Ausführen der Verfahren benötigt werden. Jede Komponente der Kits kann gegebenenfalls in flüssiger Form (z. B. in Lösung) oder in fester Form (z. B. als Trockenpulver) bereitgestellt werden. In bestimmten Fällen können einige der Komponenten rekonstituierbar oder anderweitig verarbeitbar sein (z. B. in eine aktive Form), z. B. durch Zugabe eines geeigneten Lösungsmittels oder einer anderen Substanz (z. B. Wasser), die mit dem Kit bereitgestellt werden kann oder auch nicht.
  • In einigen Ausführungsformen können die Kits optional Anweisungen und/oder Werbung für die Verwendung der bereitgestellten Komponenten beinhalten. Wie hierin verwendet, kann der Begriff „Anweisungen“ eine Komponente der Anweisung und/oder Werbung bezeichnen und umfasst in der Regel schriftliche Anweisungen auf oder in Verbindung mit der Verpackung der Offenbarung. Anweisungen können auch mündliche oder elektronische Anweisungen beinhalten, die auf eine Art und Weise bereitgestellt werden, bei der der Benutzer klar erkennen kann, dass die Anweisungen mit dem Kit verbunden sind, z. B. audiovisuelle (z. B. Videokassette, DVD usw.), internet- und/oder webbasierte Kommunikation usw. Die schriftlichen Anweisungen können in einer Form vorliegen, die von einer staatlichen Behörde, die die Herstellung, die Verwendung oder den Verkauf von Arzneimitteln oder biologischen Produkten regelt, vorgeschrieben ist und die auch die Genehmigung der Behörde für die Herstellung, die Verwendung oder den Verkauf zur Verabreichung an Tiere wiedergeben kann. Wie hierin verwendet, beinhaltet der Begriff „beworben“ alle Verfahren der Geschäftstätigkeit, einschließlich Verfahren der Ausbildung, der klinischen Anweisung, der wissenschaftlichen Untersuchung, der Entdeckung oder Entwicklung von Arzneimitteln, der akademischen Forschung, der Tätigkeit der pharmazeutischen Industrie, einschließlich des Verkaufs von Arzneimitteln, und jeder Werbung oder sonstigen verkaufsfördernden Tätigkeit, einschließlich schriftlicher, mündlicher und elektronischer Kommunikation in jeder Form, die mit der Offenbarung verbunden ist. Darüber hinaus können die Kits je nach spezifischer Anwendung weitere Komponenten beinhalten, wie hierin beschrieben.
  • Die Kits können eine oder mehrere der hierin beschriebenen Komponenten in einem oder mehreren Behältern enthalten. Die Komponenten können steril aufbereitet, in einer Spritze verpackt und gekühlt versandt werden. Alternativ können sie in einem Fläschchen oder einem anderen Behälter zur Lagerung abgefüllt werden. Ein zweiter Behälter kann weitere steril aufbereitete Komponenten aufweisen. Alternativ können die Kits die Wirkstoffe vorgemischt enthalten und in einer Ampulle, einem Röhrchen oder einem anderen Behältnis versandt werden.
  • Die Kits können eine Vielzahl von Formen aufweisen, wie z. B. einen Blisterbeutel, einen eingeschweißten Beutel, einen vakuumversiegelbaren Beutel, eine versiegelbare, tiefgezogene Schale oder eine ähnliche Beutel- oder Schalenform, wobei das Zubehör lose im Beutel, in einer oder mehreren Tuben, Behältern, einer Schachtel oder einem Beutel verpackt ist. Die Kits können sterilisiert werden, nachdem die Zubehörteile hinzugefügt wurden, so dass die einzelnen Zubehörteile im Behälter anderweitig verpackt werden können. Die Kits können mit allen geeigneten Sterilisationsverfahren sterilisiert werden, wie z. B. Strahlensterilisation, Hitzesterilisation oder anderen in der Technik bekannten Sterilisationsverfahren. Die Kits können auch andere Komponenten beinhalten, je nach spezifischer Anwendung, zum Beispiel Behälter, Zellmedien, Salze, Puffer, Reagenzien, Spritzen, Nadeln, ein Gewebe, wie z. B. Gaze, zum Auftragen oder Entfernen eines Desinfektionsmittels, Einweghandschuhe, eine Halterung für die Mittel vor der Verabreichung, usw. Einige Aspekte dieser Offenbarung stellen Kits bereit, die ein Nukleinsäurekonstrukt umfassen, das eine Nukleotidsequenz kodiert, die die verschiedenen Komponenten der hierin beschriebenen Mulit-Flap-Prime-Editing- Systeme (z. B. Dual-Prime-Editing- und Quadruple-Prime-Editing-Systeme) kodiert (z. B. beinhaltend unter anderem die napDNAbps, reverse Transkriptasen, Polymerasen, Fusionsproteine (z. B. napDNAbps und reverse Transkriptasen (oder im weiteren Sinne Polymerasen) umfassend), verlängerte Leit-RNAs und Komplexe, die Fusionsproteine und verlängerte Leit-RNAs umfassen, sowie Zusatzelemente, wie z. B. Zweitstrang-Nicking- Komponenten (z. B. Zweitstrang-Nicking-gRNA) und endogene 5'-DNA-Flap- Entfernungsendonukleasen, um den Mulit-Flap-Prime-Editing-Prozess zur Bildung des editierten Produkts zu unterstützen). In einigen Ausführungsformen umfasst die Nukleotidsequenz(en) einen heterologen Promotor (oder mehr als einen einzigen Promotor), der die Exprimierung der Komponenten des Mulit-Flap-Prime-Editing-Systems antreibt.
  • Andere Aspekte dieser Offenbarung stellen Kits bereit, die ein oder mehrere Nukleinsäurekonstrukte umfassen, die die verschiedenen Komponenten der hierin beschriebenen Mulit-Flap-Prime-Editing-Systeme kodieren, z. B. umfassend eine Nukleotidsequenz, die die Komponenten des Mulit-Flap-Prime-Editing-Systems kodiert, das in der Lage ist, eine Ziel-DNA-Sequenz zu modifizieren. In einigen Ausführungsformen umfasst die Nukleotidsequenz einen heterologen Promotor, der die Exprimierung der Komponenten des Mulit-Flap-Prime-Editing Systems antreibt.
  • Einige Aspekte dieser Offenbarung stellen Kits bereit, die ein Nukleinsäurekonstrukt umfassen, das (a) eine Nukleotidsequenz, die ein napDNAbp (z. B. eine Cas9-Domäne) kodiert, fusioniert mit einer reversen Transkriptase und (b) einen heterologen Promotor, der die Exprimierung der Sequenz von (a) antreibt, umfasst.
  • Zellen
  • Zellen, die eine der hierin beschriebenen Zusammensetzungen enthalten können, beinhalten prokaryotische Zellen und eukaryotische Zellen. Die hierin beschriebenen Verfahren werden verwendet, um ein Cas9-Protein oder einen Multi-Flap-Prime-Editor in eine eukaryotische Zelle (z. B. eine Säugetierzelle, wie eine humane Zelle) einzuschleusen. In einigen Ausführungsformen ist die Zelle in vitro (z. B. in einer Zellkultur). In einigen Ausführungsformen ist die Zelle in vivo (z. B. in einem Probanden, wie etwa einem humanen Probanden). In einigen Ausführungsformen ist die Zelle ex vivo (z. B. isoliert von einem Probanden und kann wieder demselben oder einem anderen Probanden verabreicht werden).
  • Säugetierzellen im Sinne der vorliegenden Offenbarung beinhalten humane Zellen, Primatenzellen (z. B. Vero-Zellen), Rattenzellen (z. B. GH3-Zellen, OC23-Zellen) oder Mauszellen (z. B. MC3T3-Zellen). Es gibt eine Vielzahl humaner Zelllinien, die unter anderem humane embryonale Nierenzellen (HEK), HeLa-Zellen, Krebszellen aus den 60 Krebszelllinien des National Cancer Institute (NCI60), DU145-Zellen (Prostatakrebs), Lncap- Zellen (Prostatakrebs), MCF-7 (Brustkrebs)-Zellen, MDA-MB-438 (Brustkrebs)-Zellen, PC3 (Prostatakrebs)-Zellen, T47D (Brustkrebs)-Zellen, THP-1 (akute myeloische Leukämie)- Zellen, U87 (Glioblastom)-Zellen, SHSY5Y humane Neuroblastomzellen (geklont aus einem Myelom) und Saos-2 (Knochenkrebs)-Zellen beinhalten. In einigen Ausführungsformen werden rAAV-Vektoren in humane embryonale Nierenzellen (HEK-Zellen, z. B. HEK 293 oder HEK 293T-Zellen) eingeschleust. In einigen Ausführungsformen werden rAAV- Vektoren in Stammzellen (z. B. humane Stammzellen) wie zum Beispiel pluripotente Stammzellen (z. B. humane pluripotente Stammzellen, einschließlich humaner induzierter pluripotenter Stammzellen (hiPSCs)) eingeschleust. Eine Stammzelle ist eine Zelle, die die Fähigkeit besitzt, sich in Kultur auf unbestimmte Zeit zu teilen und spezialisierte Zellen hervorzubringen. Eine pluripotente Stammzelle bezieht sich auf einen Stammzellentyp, der in der Lage ist, sich in alle Gewebeformen eines Organismus zu differenzieren, aber nicht allein in der Lage ist, eine vollständige organismische Entwicklung zu durchlaufen. Eine humane induzierte pluripotente Stammzelle bezieht sich auf eine somatische (z. B. reife oder erwachsene) Zelle, die in einen embryonalen stammzellähnlichen Zustand umprogrammiert wurde, indem sie gezwungen wurde, Gene und Faktoren zu exprimieren, die für die Aufrechterhaltung der definierenden Eigenschaften embryonaler Stammzellen wichtig sind (siehe z. B. Takahashi und Yamanaka, Cell 126 (4): 663-76, 2006, hierin durch Bezugnahme aufgenommen). Humane induzierte pluripotente Stammzellen exprimieren Stammzellmarker und sind in der Lage, Zellen zu erzeugen, die für alle drei Keimschichten (Ektoderm, Endoderm, Mesoderm) charakteristisch sind.
  • Weitere nicht einschränkende Beispiele für Zelllinien, die gemäß der vorliegenden Offenbarung verwendet werden können, beinhalten 293-T, 293-T, 3T3, 4T1, 721, 9L, A-549, A172, A20, A253, A2780, A2780ADR, A2780cis, A431, ALC, B16, B35, BCP-1, BEAS-2B, bEnd.3, BHK-21, BR 293, BxPC3, C2C12, C3H-10T1/2, C6, C6/36, Cal-27, CGR8, CHO, CML T1, CMT, COR-L23, COR-L23/5010, COR-L23/CPR, COR-L23/R23, COS-7, COV- 434, CT26, D17, DH82, DU145, DuCaP, E14Tg2a, EL4, EM2, EM3, EMT6/AR1, EMT6/AR10. 0, FM3, H1299, H69, HB54, HB55, HCA2, Hepalclc7, High Five-Zellen, HL- 60, HMEC, HT-29, HUVEC, J558L-Zellen, Jurkat, JY-Zellen, K562-Zellen, KCL22, KG1, Ku812, KYO1, LNCap, Ma-Mel 1, 2, 3.... 48, MC-38, MCF-10A, MCF-7, MDA-MB-231, MDA-MB-435, MDA-MB-468, MDCK II, MG63, MONO-MAC 6, MOR/0. 2R, MRC5, MTD-1A, MyEnd, NALM-1, NCI-H69/CPR, NCI-H69/LX10, NCI-H69/LX20, NCI- H69/LX4, NIH-3T3, NW-145, OPCN/OPCT Peer, PNT-1A/PNT 2, PTK2, Raji, RBL-Zellen, RenCa, RIN-5F, RMA/RMAS, S2, Saos-2-Zellen, Sf21, Sf9, SiHa, SKBR3, SKOV-3, T-47D, T2, T84, THP1, U373, U87, U937, VCaP, WM39, WT-49, X63, YAC-1 und YAR-Zellen.
  • Einige Aspekte dieser Offenbarung stellen Zellen bereit, die eines der hierin offenbarten Konstrukte umfassen. In einigen Ausführungsformen wird eine Wirtszelle transient oder nicht-transient mit einem oder mehreren hierin beschriebenen Vektoren transfiziert. In einigen Ausführungsformen wird eine Zelle so transfiziert, wie sie natürlicherweise in einem Probanden vorkommt. In einigen Ausführungsformen wird eine Zelle, die transfiziert wird, einem Individuum entnommen. In einigen Ausführungsformen wird die Zelle von Zellen abgeleitet, die einem Individuum entnommen wurden, wie zum Beispiel von einer Zelllinie. Eine große Vielzahl von Zelllinien für die Gewebekultur ist in der Technik bekannt. Beispiele für Zelllinien beinhalten unter anderem C8161, CCRF-CEM, MOLT, mIMCD-3, NHDF, HeLa-S3, Huh1, Huh4, Huh7, HUVEC, HASMC, HEKn, HEKa, MiaPaCell, Panel, PC-3, TF1, CTLL-2, C1R, Rat6, CV1, RPTE, A10, T24, J82, A375, ARH- 77, Calu1, SW480, SW620, SKOV3, SK-UT, CaCo2, P388D1, SEM-K2, WEHI-231, HB56, TIB55, Jurkat, J45. 01, LRMB, Bcl-1, BC-3, IC21, DLD2, Raw264. 7, NRK, NRK-52E, MRC5, MEF, Hep G2, HeLa B, HeLa T4, COS, COS-1, COS-6, COS-M6A, BS-C-1 Affennierenepithel, BALB/3T3 Mausembryo-Fibroblasten, 3T3 Swiss, 3T3-L1, 132-d5 humane fetale Fibroblasten; 10. 1 Mausfibroblasten, 293-T, 3T3, 721, 9L, A2780, A2780ADR, A2780cis, A 172, A20, A253, A431, A-549, ALC, B16, B35, BCP-1-Zellen, BEAS-2B, bEnd.3, BHK-21, BR 293. BxPC3. C3H-10T1/2, C6/36, Cal-27, CHO, CHO-7, CHO-IR, CHO-K1, CHO-K2, CHO-T, CHO Dhfr -/-, COR-L23, COR-L23/CPR, COR-L23/5010, COR- L23/R23, COS-7, COV-434, CML T1, CMT, CT26, D17, DH82, DU145, DuCaP, EL4, EM2, EM3, EMT6/AR1, EMT6/AR10. 0, FM3, H1299, H69, HB54, HB55, HCA2, HEK-293, HeLa, Hepalclc7, HL-60, HMEC, HT-29, Jurkat, JY-Zellen, K562-Zellen, Ku812, KCL22, KG1, KYO1, LNCap, Ma-Mel 1-48, MC-38, MCF-7, MCF-10A, MDA-MB-231, MDA-MB-468, MDA-MB-435, MDCK II, MDCK 11, MOR/0. 2R, MONO-MAC 6, MTD-1A, MyEnd, NCI- H69/CPR, NCI-H69/LX10, NCI-H69/LX20, NCI-H69/LX4, NIH-3T3, NALM-1, NW-145, OPCN/OPCT Zelllinien, Peer, PNT-1 A/PNT 2, RenCa, RIN-5F, RMA/RMAS, Saos-2-Zellen, Sf-9, SkBr3, T2, T-47D, T84, THP1-Zelllinie, U373, U87, U937, VCaP, Vero-Zellen, WM39, WT-49, X63, YAC-1, YAR und transgene Varianten davon.
  • Zelllinien sind von einer Vielzahl von Quellen erhältlich, die den Fachleuten bekannt sind (siehe z. B. die American Type Culture Collection (ATCC) (Manassus, Va.)). In einigen Ausführungsformen wird eine Zelle, die mit einem oder mehreren hierin beschriebenen Vektoren transfiziert wurde, zur Etablierung einer neuen Zelllinie verwendet, die eine oder mehrere vom Vektor abgeleitete Sequenzen umfasst. In einigen Ausführungsformen wird eine Zelle, die mit den hierin beschriebenen Komponenten eines CRISPR-Systems transient transfiziert wurde (wie durch transiente Transfektion eines oder mehrerer Vektoren oder Transfektion mit RNA) und durch die Aktivität eines CRISPR-Komplexes modifiziert wurde, verwendet, um eine neue Zelllinie zu etablieren, die Zellen umfasst, die die Modifikation enthalten, denen jedoch eine beliebige andere exogene Sequenz fehlt. In einigen Ausführungsformen werden Zellen, die mit einem oder mehreren hierin beschriebenen Vektoren transient oder nicht transient transfiziert wurden, oder von solchen Zellen abgeleitete Zelllinien zur Bewertung einer oder mehrerer Testverbindungen verwendet.
  • Vektoren
  • Einige Aspekte der vorliegenden Offenbarung beziehen sich auf die Verwendung rekombinanter Virusvektoren (z. B. Adeno-assoziierte Virusvektoren, Adenovirus-Vektoren oder Herpes-Simplex-Virus-Vektoren) für die Einschleusung der hierin beschriebenen Multi- Flap-Prime-Editoren oder Komponenten davon, z. B. des Split-Cas9-Proteins oder eines Split- Nukleobasen-Multi-Flap-Prime-Editors, in eine Zelle. Im Falle eines Split-PE-Ansatzes werden der N-terminale Abschnitt eines PE-Fusionsproteins und der C-terminale Abschnitt einer PE-Fusion durch separate rekombinante Virusvektoren (z. B. Adeno-assoziierte Virusvektoren, Adenovirus-Vektoren oder Herpes-Simplex-Virus-Vektoren) in dieselbe Zelle eingeschleust, da das Cas9-Protein in voller Länge oder Multi-Flap-Prime-Editoren die Packungsgrenze verschiedener Virusvektoren, z. B. rAAV (~4,9 kb), überschreiten.
  • In einer Ausführungsform werden daher Vektoren in Betracht gezogen, die in der Lage sind, aufgeteilte Multi-Flap-Prime-Editor-Fusionsproteine oder aufgeteilte Komponenten davon einzuschleusen. In einigen Ausführungsformen wird eine Zusammensetzung zum Einschleusen des Split Cas9-Proteins oder des Split-Prime-Editors in eine Zelle (z. B. eine Säugetierzelle, eine humane Zelle) bereitgestellt. In einigen Ausführungsformen umfasst die Zusammensetzung der vorliegenden Offenbarung: (i) ein erstes rekombinantes Adeno- assoziiertes Virus (rAAV)-Partikel, umfassend eine erste Nukleotidsequenz, die einen N- terminalen Abschnitt eines Cas9-Proteins oder Prime-Editors kodiert, der an seinem C- Terminus an ein Intein-N fusioniert ist; und (ii) ein zweites rekombinantes Adeno-assoziiertes Virus (rAAV)-Partikel, umfassend eine zweite Nukleotidsequenz, die ein Intein-C kodiert, das an den N-Terminus eines C-terminalen Abschnitts des Cas9-Proteins oder Prime-Editors fusioniert ist. Die rAAV-Partikel der vorliegenden Offenbarung umfassen einen rAAV-Vektor (d. h. ein rekombinantes Genom des rAAV), der in die viralen Kapsidproteine eingekapselt ist.
  • In einigen Ausführungsformen umfasst der rAAV-Vektor: (1) eine heterologe Nukleinsäure-Region, umfassend die erste oder zweite Nukleotidsequenz, die den N- terminalen Abschnitt oder den C-terminalen Abschnitt eines Split-Cas9-Proteins oder eines Split-Multi-Flap-Prime-Editors in einer beliebigen hierin beschriebenen Form kodiert, (2) eine oder mehrere Nukleotidsequenzen, umfassend eine Sequenz, die die Exprimierung der heterologen Nukleinsäure-Region erleichtert (z. B. einen Promotor), und (3) eine oder mehrere Nukleinsäureregionen, die eine Sequenz umfassen, die die Integration der heterologen Nukleinsäureregion (gegebenenfalls mit der einen oder mehreren Nukleinsäureregionen, die eine Sequenz umfassen, die die Expression erleichtert) in das Genom einer Zelle erleichtert. In einigen Ausführungsformen umfassen die viralen Sequenzen, die die Integration erleichtern, Inverted Terminal Repeat (ITR)-Sequenzen. In einigen Ausführungsformen wird die erste oder zweite Nukleotidsequenz, die den N-terminalen Abschnitt oder den C-terminalen Abschnitt eines Split-Cas9-Proteins oder eines Split-Multi-Flap-Prime-Editors kodiert, auf jeder Seite von einer ITR-Sequenz flankiert. In einigen Ausführungsformen umfasst der Nukleinsäurevektor ferner eine Region, die ein AAV-Rep-Protein, wie hierin beschrieben, kodiert, das entweder innerhalb der von ITRs flankierten Region oder außerhalb der Region enthalten ist. Die ITR-Sequenzen können von einem beliebigen AAV-Serotyp (z. B. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10) oder von mehr als einem Serotyp abgeleitet sein. In einigen Ausführungsformen sind die ITR-Sequenzen von AAV2 oder AAV6 abgeleitet.
  • In einigen Ausführungsformen umfassen die hierin offenbarten rAAV-Partikel also mindestens ein rAAV2-Partikel, rAAV6-Partikel, rAAV8-Partikel, rPHP.B-Partikel, rPHP.eB- Partikel oder rAAV9-Partikel oder eine Variante davon. In besonderen Ausführungsformen sind die offenbaren rAAV-Partikel rPHP.B-Partikel, rPHP.eB-Partikel, rAAV9-Partikel.
  • ITR-Sequenzen und Plasmide, die ITR-Sequenzen enthalten, sind in der Fachwelt bekannt und im Handel erhältlich (siehe z. B. Produkte und Dienstleistungen von Vector Biolabs, Philadelphia, PA; Cellbiolabs, San Diego, CA; Agilent Technologies, Santa Clara, Ca; und Addgene, Cambridge, MA; und „Gene delivery to skeletal muscle results in sustained expression and systemic delivery of a therapeutic protein". Kessler PD, Podsakoff GM, Chen X, McQuiston SA, Colosi PC, Matelis LA, Kurtzman GJ, Byme BJ. Proc Natl Acad Sei USA. 1996 Nov 26;93(24):14082-7; und Curtis A. Machida. „Methods in Molecular Medicine™. Viral Vectors for Gene Therapy Methods and Protocols." 10.1385/1-59259-304-6:201 © Humana Press Inc. 2003. Kapitel 10. „Targeted Integration by Adeno-Associated Virus.“ Matthew D. Weitzman, Samuel M. Young Jr., Toni Cathomen und Richard Jude Samulski; US-Pat. Nr. 5,139,941 und 5,962,313 , die alle hierin durch Bezugnahme aufgenommen sind).
  • In einigen Ausführungsformen umfasst der rAAV-Vektor der vorliegenden Offenbarung ein oder mehrere regulatorische Elemente zur Kontrolle der Exprimierung der heterologen Nukleinsäure-Region (z. B. Promotoren, Transkriptionsterminatoren und/oder andere regulatorische Elemente). In einigen Ausführungsformen ist die erste und/oder zweite Nukleotidsequenz operativ mit einem oder mehreren (z. B. 1, 2, 3, 4, 5 oder mehr) Transkriptionsterminatoren verbunden. Nicht einschränkende Beispiele für Transkriptionsterminatoren, die gemäß der vorliegenden Offenbarung verwendet werden können, beinhalten Transkriptionsterminatoren des bovinen Wachstumshormon-Gens (bGH), des humanen Wachstumshormon-Gens (hGH), SV40, CW3, ϕ oder Kombinationen davon. Die Wirksamkeit verschiedener Transkriptionsterminatoren wurde getestet, um ihre jeweiligen Auswirkungen auf die Exprimierung des Split-Cas9-Proteins oder des Split-Multi-Flap-Prime- Editors zu bestimmen. In einigen Ausführungsformen ist der in der vorliegenden Offenbarung verwendete Transkriptionsterminator ein bGH-Transkriptionsterminator. In einigen Ausführungsformen umfasst der rAAV-Vektor ferner ein posttranskriptionales regulatorisches Element (WPRE) des Woodchuck-Hepatitis-Virus. In bestimmten Ausführungsformen ist das WPRE eine trunkierte WPRE-Sequenz, wie etwa „W3“. In einigen Ausführungsformen ist das WPRE 5' vom Transkriptionsterminator eingefügt. Solche Sequenzen bilden bei der Transkription eine Tertiärstruktur, die die Exprimierung, insbesondere durch virale Vektoren, verstärkt.
  • In einigen Ausführungsformen können die hierin verwendeten Vektoren die PE- Fusionsproteine oder eine ihrer Komponenten kodieren (z. B. napDNAbp, Linker oder Polymerasen). Darüber hinaus können die hierin verwendeten Vektoren die PEgRNAs und/oder die zusätzliche gRNA für das Zweitstrang-Nicking kodieren. Die Vektoren können in der Lage sein, die Exprimierung einer oder mehrerer kodierender Sequenzen in einer Zelle zu steuern. In einigen Ausführungsformen kann die Zelle eine prokaryotische Zelle sein, wie z. B. eine Bakterienzelle. In einigen Ausführungsformen kann die Zelle eine eukaryotische Zelle sein, wie z. B. eine Hefe-, Pflanzen-, Insekten- oder Säugetierzelle. In einigen Ausführungsformen kann es sich bei der eukaryotischen Zelle um eine Säugetierzelle handeln. In einigen Ausführungsformen kann es sich bei der eukaryotischen Zelle um eine Nagetierzelle handeln. In einigen Ausführungsformen kann es sich bei der eukaryotischen Zelle um eine humane Zelle handeln. Geeignete Promotoren für die Exprimierung in verschiedenen Zelltypen sind im Stand der Technik bekannt. In einigen Ausführungsformen kann der Promotor vom Wildtyp sein. In anderen Ausführungsformen kann der Promotor modifiziert sein, um eine effizientere oder wirksamere Exprimierung zu erreichen. In wieder anderen Ausführungsformen kann der Promotor trunkiert sein, aber seine Funktion beibehalten. Zum Beispiel kann der Promotor eine normale Größe oder eine reduzierte Größe aufweisen, die für die richtige Verpackung des Vektors in ein Virus geeignet ist.
  • In einigen Ausführungsformen können die Promotoren, die in den Vektoren des Prime- Editors verwendet werden, konstitutiv, induzierbar oder gewebespezifisch sein. In einigen Ausführungsformen kann es sich bei den Promotoren um konstitutive Promotoren handeln. Nicht einschränkende beispielhafte konstitutive Promotoren beinhalten den unmittelbaren frühen Promotor des Cytomegalovirus (CMV), den Promotor des Affenvirus (SV40), den Hauptpromotor des Adenovirus (MLP), den Promotor des Rous-Sarkom-Virus (RSV), den Promotor des Maus-Mammartumor-Virus (MMTV), Phosphoglyceratkinase (PGK)-Promotor, Elongationsfaktor-alpha (EFla)-Promotor, Ubiquitin-Promotoren, Aktin-Promotoren, Tubulin- Promotoren, Immunglobulin-Promotoren, ein funktionelles Fragment davon oder eine Kombination aus beliebigen der Vorgenannten. In einigen Ausführungsformen kann der Promotor ein CMV-Promotor sein. In einigen Ausführungsformen kann der Promotor ein trunkierter CMV-Promotor sein. In anderen Ausführungsformen kann der Promotor ein EFla- Promotor sein. In einigen Ausführungsformen kann der Promotor ein induzierbarer Promotor sein. Nicht einschränkende beispielhafte induzierbare Promotoren beinhalten solche, die durch Hitzeschock, Licht, Chemikalien, Peptide, Metalle, Steroide, Antibiotika oder Alkohol induzierbar sind. In einigen Ausführungsformen kann der induzierbare Promotor ein Promotor sein, der eine geringe basale (nicht induzierte) Exprimierung aufweist, wie z. B. der Tet-On®- Promotor (Clontech). In einigen Ausführungsformen kann der Promotor ein gewebespezifischer Promotor sein. In einigen Ausführungsformen wird der gewebespezifische Promotor ausschließlich oder überwiegend in Lebergewebe exprimiert. Nicht einschränkende beispielhafte gewebespezifische Promotoren beinhalten den B29-Promotor, CD14-Promotor, CD43-Promotor, CD45-Promotor, CD68-Promotor, Desmin-Promotor, Elastase-1-Promotor, Endoglin-Promotor, Fibronectin-Promotor, Fit-1-Promotor, GFAP-Promotor, GPIIb- Promotor, ICAM-2-Promotor, INF-ß-Promotor, Mb-Promotor, Nphsl-Promotor, OG-2- Promotor, SP-B-Promotor, SYN1-Promotor und WASP-Promotor.
  • In einigen Ausführungsformen können die Prime-Editor-Vektoren (z. B. einschließlich aller Vektoren, die das Prime-Editor-Fusionsprotein und/oder die PEgRNAs und/oder die akzessorischen Zweitstrang-Nicking-gRNAs kodieren) induzierbare Promotoren umfassen, um die Exprimierung erst zu starten, nachdem er in eine Zielzelle eingeschleust wurde. Nicht einschränkende beispielhafte induzierbare Promotoren beinhalten solche, die durch Hitzeschock, Licht, Chemikalien, Peptide, Metalle, Steroide, Antibiotika oder Alkohol induzierbar sind. In einigen Ausführungsformen kann der induzierbare Promotor ein Promotor sein, der eine geringe basale (nicht induzierte) Exprimierung aufweist, wie z. B. der Tet-On®- Promotor (Clontech).
  • In weiteren Ausführungsformen können die Prime-Editor-Vektoren (z. B. einschließlich aller Vektoren, die das Prime-Editor-Fusionsprotein und/oder die PEgRNAs und/oder die zusätzlichen Zweitstrang-Nicking-gRNAs kodieren) gewebespezifische Promotoren umfassen, damit die Exprimierung erst nach der Einschleusung in ein spezifisches Gewebe beginnt. Nicht einschränkende beispielhafte gewebespezifische Promotoren beinhalten den B29-Promotor, CD14-Promotor, CD43-Promotor, CD45-Promotor, CD68- Promotor, Desmin-Promotor, Elastase-1-Promotor, Endoglin-Promotor, Fibronectin- Promotor, Flt-1-Promotor, GFAP-Promotor, GPIIb-Promotor, ICAM-2-Promotor, INF-(3- Promotor, Mb-Promotor, Nphsl-Promotor, OG-2-Promotor, SP-B-Promotor, SYN 1 -Promotor und WASP-Promotor.
  • In einigen Ausführungsformen kann die Nukleotidsequenz, die die PEgRNA kodiert (oder andere Leit-RNAs, die in Verbindung mit Mulit-Flap-Prime-Editing verwendet werden), mit mindestens einer Transkriptions- oder Translationskontrollsequenz operativ verknüpft sein. In einigen Ausführungsformen kann die Nukleotidsequenz, die für die Leit-RNA kodiert, operativ mit mindestens einem Promotor verknüpft sein. In einigen Ausführungsformen kann der Promotor von der RNA-Polymerase III (Pol III) erkannt werden. Nicht einschränkende Beispiele für Pol-III-Promotoren beinhalten U6-, HI- und tRNA-Promotoren. In einigen Ausführungsformen kann die Nukleotidsequenz, die die Leit-RNA kodiert, operativ mit einem Maus- oder humanen U6-Promotor verknüpft sein. In anderen Ausführungsformen kann die Nukleotidsequenz, die die Leit-RNA kodiert, operativ mit einem Maus- oder humanen HI- Promotor verknüpft sein. In einigen Ausführungsformen kann die Nukleotidsequenz, die die Leit-RNA kodiert, operativ mit einem tRNA-Promotor der Maus oder des Menschen verknüpft sein. In Ausführungsformen mit mehr als einer Leit-RNA können die für die Exprimierung verwendeten Promotoren gleich oder unterschiedlich sein. In einigen Ausführungsformen können das Nukleotid, das für die crRNA der Leit-RNA kodiert, und das Nukleotid, das für die tracr-RNA der Leit-RNA kodiert, auf demselben Vektor bereitgestellt werden. In einigen Ausführungsformen können das Nukleotid, das für die crRNA kodiert, und das Nukleotid, das für die tracr-RNA kodiert, von demselben Promotor angetrieben werden. In einigen Ausführungsformen können die crRNA und die tracr-RNA in ein einziges Transkript transkribiert werden. Zum Beispiel können die crRNA und die tracr-RNA aus einem einzigen Transkript zu einer Doppelmolekül-Leit-RNA verarbeitet werden. Alternativ dazu können die crRNA und die tracr-RNA in eine Einzelmolekül-Leit-RNA transkribiert werden.
  • In einigen Ausführungsformen kann sich die Nukleotidsequenz, die für die Leit-RNA kodiert, auf demselben Vektor befinden, der die Nukleotidsequenz umfasst, die für das PE- Fusionsprotein kodiert. In einigen Ausführungsformen kann die Exprimierung der Leit-RNA und des PE-Fusionsproteins durch ihre entsprechenden Promotoren angetrieben werden. In einigen Ausführungsformen kann die Expression der Leit-RNA durch denselben Promotor angetrieben werden, der auch die Exprimierung des PE-Fusionsproteins antreibt. In einigen Ausführungsformen können die Leit-RNA und das PE-Fusionsprotein-Transkript in einem einzigen Transkript enthalten sein. Zum Beispiel kann sich die Leit-RNA in einer nichttranslatierten Region (UTR) des Cas9-Protein-Transkripts befinden. In einigen Ausführungsformen kann sich die Leit-RNA innerhalb der 5'-UTR des PE-Fusionsprotein- Transkripts befinden. In anderen Ausführungsformen kann sich die Leit-RNA innerhalb der 3'- UTR des PE-Fusionsprotein-Transkripts befinden. In einigen Ausführungsformen kann die intrazelluläre Halbwertszeit des PE-Fusionsprotein-Transkripts reduziert werden, indem die Leit-RNA in seiner 3'-UTR enthalten ist und dadurch die Länge seiner 3'-UTR verkürzt wird. In weiteren Ausführungsformen kann sich die Leit-RNA innerhalb eines Introns des PE- Fusionsprotein-Transkripts befinden. In einigen Ausführungsformen können geeignete Spleißstellen an dem Intron, in dem sich die Leit-RNA befindet, hinzugefügt werden, so dass die Leit-RNA ordnungsgemäß aus dem Transkript herausgespleißt wird. In einigen Ausführungsformen kann die Exprimierung des Cas9-Proteins und der Leit-RNA in unmittelbarer Nähe auf demselben Vektor die effizientere Bildung des CRISPR-Komplexes erleichtern.
  • Das Vektorsystem des Multi-Flap-Prime-Editors kann einen Vektor, zwei Vektoren, drei Vektoren, vier Vektoren, fünf Vektoren oder mehr umfassen. In einigen Ausführungsformen kann das Vektorsystem einen einzigen Vektor umfassen, der sowohl das PE-Fusionsprotein als auch die PEgRNA kodiert. In anderen Ausführungsformen kann das Vektorsystem zwei Vektoren umfassen, wobei ein Vektor für das PE-Fusionsprotein und der andere für die PEgRNA kodiert. In weiteren Ausführungsformen kann das Vektorsystem drei Vektoren umfassen, wobei der dritte Vektor die in den hierin beschriebenen Verfahren verwendete Zweitstrang-Nicking-gRNA kodiert.
  • In einigen Ausführungsformen umfasst die Zusammensetzung, die das rAAV-Partikel (in jeder hierin in Betracht gezogenen Form) umfasst, ferner einen pharmazeutisch annehmbaren Träger. In einigen Ausführungsformen wird die Zusammensetzung in geeigneten pharmazeutischen Vehikeln zur Verabreichung an humane oder tierische Probanden formuliert.
  • Einige Beispiele für Materialien, die als pharmazeutisch annehmbare Träger dienen können, beinhalten: (1) Zucker, wie Lactose, Glucose und Saccharose; (2) Stärken, wie Maisstärke und Kartoffelstärke; (3) Zellulose und deren Derivate, wie Natriumcarboxymethylzellulose, Methylzellulose, Ethylzellulose, mikrokristalline Zellulose und Zelluloseacetat; (4) pulverisierter Traganth; (5) Malz; (6) Gelatine; (7) Schmiermittel, wie Magnesiumstearat, Natriumlaurylsulfat und Talk; (8) Hilfsstoffe, wie Kakaobutter und Zäpfchenwachse; (9) Öle, wie Erdnussöl, Baumwollsamenöl, Distelöl, Sesamöl, Olivenöl, Maisöl und Sojabohnenöl; (10) Glykole, wie Propylenglykol; (11) Polyole, wie Glycerin, Sorbit, Mannit und Polyethylenglycol (PEG); (12) Ester, wie Ethyloleat und Ethyllaurat; (13) Agar; (14) Puffermittel, wie Magnesiumhydroxid und Aluminiumhydroxid; (15) Alginsäure; (16) pyrogenfreies Wasser; (17) isotonische Kochsalzlösung; (18) Ringer-Lösung; (19) Ethylalkohol; (20) pH-gepufferte Lösungen; (21) Polyester, Polycarbonate und/oder Polyanhydride; (22) Füllstoffe wie Polypeptide und Aminosäuren (23) Serumkomponente wie Serumalbumin, HDL und LDL; (22) C2-C12-Alkohole, wie Ethanol; und (23) andere nicht- toxische kompatible Substanzen, die in pharmazeutischen Rezepturen verwendet werden. Benetzungsmittel, Färbemittel, Trennmittel, Beschichtungsmittel, Süßungsmittel, Geschmacksstoffe, Duftstoffe, Konservierungsmittel und Antioxidantien können auch in der Rezeptur enthalten sein. Die Begriffe wie etwa „Hilfsstoff“, „Träger“, „pharmazeutisch annehmbarer Träger“ oder dergleichen werden hier austauschbar verwendet.
  • Einschleusungsverfahren
  • In einigen Aspekten stellt die Erfindung Verfahren bereit, die das Einschleusen eines oder mehrerer Polynukleotide, die die verschiedenen Komponenten der hierin beschriebenen Multi-Flap-Prime-Editoren kodieren, wie zum Beispiel einen oder mehrere Vektoren, wie hierin beschrieben, ein oder mehrere Transkripte davon und/oder ein oder mehrere davon transkribierte Proteine, in eine Wirtszelle umfassen. In einigen Aspekten stellt die Erfindung ferner Zellen bereit, die durch solche Verfahren hergestellt werden, und Organismen (wie Tiere, Pflanzen oder Pilze), die solche Zellen umfassen oder daraus hergestellt werden. In einigen Ausführungsformen wird ein hierin beschriebener Basen-Editor in Kombination mit (und gegebenenfalls komplexiert mit) einer Leitsequenz in eine Zelle eingeschleust.
  • Beispielhafte Verabreichungsstrategien sind an anderer Stelle beschrieben, darunter vektorbasierte Strategien, PE-Ribonukleoprotein-Komplex-Verabreichung und Verabreichung von PE durch mRNA-Verfahren.
  • In einigen Ausführungsformen umfasst das vorgesehene Einschleusungsverfahren Nukleoinfektion, Mikroinjektion, Biologistik, Virosomen, Liposomen, Immunoliposomen, Polykation- oder Lipid-Nukleinsäure-Konjugate, nackte DNA, künstliche Virionen und die durch Wirkstoffe verstärkte Aufnahme von DNA.
  • Beispielhafte Verfahren zur Einschleusung von Nukleinsäuren umfassen Lipofektion, Nukleofektion, Elektroporation, stabile Genomintegration (z. B. Piggybac), Mikroinjektion, Biologistik, Virosomen, Liposomen, Immunoliposomen, Polykation- oder Lipid- Nukleinsäure-Konjugate, nackte DNA, künstliche Virionen und die durch ein Mittel verstärkte Aufnahme von DNA. Die Lipofektion ist z. B. im US-Pat. Nr. 5,049,386 , 4,946,787 und 4,897,355 beschrieben und Lipofektionsreagenzien sind im Handel erhältlich (z. B. Transfectam™, Lipofectin™ und SF Cell Line 4D-Nucleofector X Kit™ (Lonza)). Kationische und neutrale Lipide, die für eine effiziente Rezeptor-Erkennungs-Lipofektion von Polynukleotiden geeignet sind, beinhalten jene von Feigner, WO 91/17424 ; WO 91/16024 . Die Einschleusung kann in Zellen (z. B. In-vitro- oder Ex-vivo-Verabreichung) oder Ziel-Gewebe (z. B. In-vivo-Verabreichung) erfolgen. Die Einschleusung kann durch die Verwendung von RNP-Komplexen erfolgen.
  • Die Herstellung von Lipid:Nukleinsäure-Komplexen, einschließlich zielgerichteter Liposomen, wie etwa Immunlipid-Komplexe, ist dem Fachmann gut bekannt (siehe z. B. Crystal, Science 270:404-410 (1995); Blaese et al., Cancer Gen Ther. 2:291-297 (1995); Behr et al., Bioconjugate Chem. 5:382-389 (1994); Remy et al., Bioconjugate Chem. 5:647-654 (1994); Gao et al., Gene Therapy 2:710-722 (1995); Ahmad et al., Cancer Res. 52:4817-4820 (1992); US-Pat. Nr. 4,186,183 , 4,217,344 , 4,235,871 , 4,261,975 , 4,485,054 , 4,501,728 , 4,774,085 , 4,837,028 und 4,946,787 ).
  • In anderen Ausführungsformen ist das hierin bereitgestellte Einschleusungsverfahren und der hierin bereitgestellte Vektor ein RNP-Komplex. Die RNP-Einschleusung von Fusionsproteinen erhöht die DNA-Spezifität der Basenbearbeitung deutlich. Die RNP- Einschleusung von Fusionsproteinen führt zu einer Entkopplung von On- und Off-Target- DNA-Editing. Die RNP-Einschleusung vermindert das Off-Target-Editing an nicht repetitiven Stellen, während es ein On-Target-Editing vergleichbar mit der Plasmid-Einschleusung beibehält und das Off-Target-DNA-Editing sogar an der hoch repetitiven VEGFA-Stelle 2 stark reduziert. Siehe Rees, H.A. et al. „Improving the DNA specificity and applicability of base editing through protein engineering and protein delivery", Nat. Commun. 8, 15790 (2017), US-Patent Nr. 9,526,784 , ausgestellt am 27. Dezember 2016, und US-Patent Nr. 9,737,604 , ausgestellt am 22. August 2017, die jeweils durch Bezugnahme hierin aufgenommen sind.
  • Dem Fachmann sind zusätzliche Verfahren zur Einschleusung von Nukleinsäuren in Zellen bekannt. Siehe zum Beispiel US 2003/0087817 , hierin durch Bezugnahme aufgenommen.
  • Andere Aspekte der vorliegenden Offenbarung stellen Verfahren zur Einschleusung der Multi-Flap-Prime-Editor-Konstrukte in eine Zelle bereit, um einen vollständigen und funktionellen Prime-Editor in einer Zelle zu bilden. Zum Beispiel wird in einigen Beispielen eine Zelle mit einer hierin beschriebenen Zusammensetzung in Kontakt gebracht (z. B. Zusammensetzungen, die Nukleotidsequenzen umfassen, die das Split Cas9 oder den Split Prime-Editor kodieren, oder AAV-Partikel, die Nukleinsäurevektoren enthalten, die solche Nukleotidsequenzen umfassen). In einigen Ausführungsformen führt das Inkontaktbringen zur Einschleusung solcher Nukleotidsequenzen in eine Zelle, wobei der N-terminale Abschnitt des Cas9-Proteins oder des Prime-Editors und der C-terminale Abschnitt des Cas9-Proteins oder des Prime-Editors in der Zelle exprimiert und zusammengefügt werden, um einen vollständigen Cas9-Protein oder einem vollständigen Prime-Editor zu bilden.
  • Es sollte gewürdigt werden, dass jedes hierin bereitgestellte rAAV-Partikel, Nukleinsäuremolekül oder jede Zusammensetzung auf jede beliebige geeignete Weise in die Zelle eingeführt werden kann, entweder stabil oder transient. In einigen Ausführungsformen können die offenbaren Proteine in die Zelle transfiziert werden. In einigen Ausführungsformen kann die Zelle mit einem Nukleinsäuremolekül transduziert oder transfiziert werden. Zum Beispiel kann eine Zelle transduziert (z. B. mit einem Virus, das für ein Splitting-Protein kodiert) oder transfiziert (z. B. mit einem Plasmid, das für ein Splitting-Protein kodiert) werden mit einem Nukleinsäuremolekül, das für ein Splitting-Protein kodiert, oder mit einem rAAV- Partikel, der ein virales Genom enthält, das für ein oder mehrere Nukleinsäuremoleküle kodiert. Eine solche Transduktion kann eine stabile oder transiente Transduktion sein. In einigen Ausführungsformen können Zellen, die ein Splitting-Protein exprimieren oder ein Splitting- Protein enthalten, mit einer oder mehreren Leit-RNA-Sequenzen transduziert oder transfiziert werden, z. B. bei der Einschleusung eines Split-Cas9 (z. B. nCas9) -Proteins. In einigen Ausführungsformen kann ein Plasmid, das ein Split-Protein exprimiert, durch Elektroporation, transiente (z. B. Lipofektion) und stabile Genomintegration (z. B. Piggybac) und virale Transduktion oder andere Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, in Zellen eingebracht werden.
  • In bestimmten Ausführungsformen umfassen die hierin bereitgestellten Zusammensetzungen ein Lipid und/oder ein Polymer. In bestimmten Ausführungsformen ist das Lipid und/oder Polymer kationisch. Die Herstellung solcher Lipidpartikel ist gut bekannt. Siehe z. B. die US-Patentnummern 4,880,635; 4,906,477; 4,911,928; 4,917,951; 4,920,016; 4,921,757 und 9,737,604, die hierin jeweils durch Bezugnahme aufgenommen sind.
  • Die Leit-RNA-Sequenz kann 15-100 Nukleotide lang sein und eine Sequenz von mindestens 10, mindestens 15 oder mindestens 20 zusammenhängenden Nukleotiden umfassen, die komplementär zu einer Zielnukleotidsequenz ist. Die Leit-RNA kann eine Sequenz von 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 oder 40 zusammenhängenden Nukleotiden umfassen, die komplementär zu einer Ziel-Nukleotidsequenz ist. Die Leit-RNA kann 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 oder 50 Nukleotide in der Länge betragen.
  • In einigen Ausführungsformen ist die Ziel-Nukleotidsequenz eine DNA-Sequenz in einem Genom, z. B. einem eukaryotischen Genom. In bestimmten Ausführungsformen befindet sich die Ziel-Nukleotidsequenz in einem Säugetier- (z. B. einem humanen) Genom.
  • Die Zusammensetzungen dieser Offenbarung können zum Beispiel als Einheitsdosis verabreicht oder verpackt werden. Der Begriff „Einheitsdosis“, wenn er in Bezug auf eine pharmazeutische Zusammensetzung der vorliegenden Offenbarung verwendet wird, bezieht sich auf physikalisch diskrete Einheiten, die als Einheitsdosis für den Probanden geeignet sind, wobei jede Einheit eine vorbestimmte Menge an aktivem Material enthält, die berechnet wird, um die gewünschte therapeutische Wirkung in Verbindung mit dem erforderlichen Verdünnungsmittel, d. h. einem Träger oder Vehikel, zu produzieren.
  • Die Behandlung einer Krankheit oder Störung beinhaltet das Verzögern der Entwicklung oder des Fortschreitens der Krankheit oder das Reduzieren des Schweregrads der Krankheit. Die Behandlung der Krankheit erfordert nicht unbedingt heilende Ergebnisse.
  • In diesem Zusammenhang bedeutet „Verzögern“ der Entwicklung einer Krankheit, dass das Fortschreiten der Krankheit aufgeschoben, verhindert, verlangsamt, verzögert, stabilisiert und/oder hinausgezögert wird. Diese Verzögerung kann je nach Verlauf der Krankheit und/oder dem zu behandelnden Individuums unterschiedlich lang sein. Ein Verfahren, das die Entwicklung einer Krankheit „verzögert“ oder lindert oder den Ausbruch der Krankheit verzögert, ist ein Verfahren, das die Wahrscheinlichkeit der Entwicklung eines oder mehrerer Krankheitssymptome in einem bestimmten Rahmen reduziert und/oder das Ausmaß der Symptome in einem bestimmten Rahmen reduziert, verglichen mit der Nichtanwendung des Verfahrens. Solche Vergleiche basieren in der Regel auf klinischen Studien mit einer ausreichenden Anzahl von Probanden, um ein statistisch signifikantes Ergebnis zu erzielen.
  • „Entwicklung“ oder „Fortschreiten“ einer Krankheit bedeutet erste Manifestationen und/oder das anschließende Fortschreiten der Krankheit. Die Entwicklung der Krankheit kann mit klinischen Standardtechniken, die in der Fachwelt bekannt sind, erkannt und bewertet werden. Der Begriff Entwicklung bezieht sich jedoch auch auf ein Fortschreiten, das möglicherweise nicht nachweisbar sein kann. Für die Zwecke dieser Offenbarung bezieht sich die Entwicklung oder das Fortschreiten auf den biologischen Verlauf der Symptome. „Entwicklung“ beinhaltet Auftreten, Wiederauftreten und Ausbruch.
  • Wie hierin verwendet, beinhaltet der Begriff „Ausbruch“ oder „Auftreten“ einer Krankheit den erstmaligen Ausbruch und/oder das erneute Auftreten. Zur Verabreichung des isolierten Polypeptids oder der pharmazeutischen Zusammensetzung an den Probanden können je nach Art der zu behandelnden Krankheit oder des Krankheitsherdes herkömmliche, dem medizinischen Fachmann bekannte Verfahren verwendet werden.
  • Ohne weitere Vertiefung wird davon ausgegangen, dass ein Fachmann basierend auf der obigen Beschreibung die vorliegende Offenbarung in vollem Umfang nutzen kann. Die folgenden spezifischen Ausführungsformen sind daher lediglich als veranschaulichend zu verstehen und schränken die übrige Offenbarung in keiner Weise ein. Alle hierin zitierten Veröffentlichungen sind für die Zwecke oder den Gegenstand, auf den hierin verwiesen wird, durch Bezugnahme aufgenommen.
  • BEISPIELE
  • BEISPIEL 1. PRIME-EDITING (PE) FÜR DEN EINBAU PRÄZISER NUKLEOTIDVERÄNDERUNGEN IN DAS GENOM
  • Das Ziel ist die Entwicklung einer transformativen Genom-Editing-Technologie für den präzisen und allgemeinen Einbau einzelner Nukleotidveränderungen in Säugetiergenomen. Diese Technologie würde es Forschern ermöglichen, die Auswirkungen einzelner Nukleotidvariationen in praktisch jedem Säugetiergen zu untersuchen und möglicherweise therapeutische Eingriffe zur Korrektur pathogener Punktmutationen bei menschlichen Patienten zu ermöglichen.
  • Die Einführung des CRISPR-Systems (clustered regularly interspaced short palindromic repeat) zum Genom-Editing hat die Biowissenschaften revolutioniert1-3. Obwohl die Unterbrechung von Genen mithilfe von CRISPR inzwischen Routine ist, bleibt der präzise Einbau einzelner Nukleotid-Edits eine große Herausforderung, obzwar sie für die Untersuchung oder Korrektur einer großen Anzahl von krankheitsverursachenden Mutationen notwendig ist. Mit der homologiegeleiteten Reparatur (homology-directed repair - HDR) können solche Edits durchgeführt werden, aber sie leidet unter der geringen Effizienz (oft <5 %), der Notwendigkeit von Donor-DNA-Reparatur-Templaten und den nachteiligen Auswirkungen der Bildung von doppelsträngigen DNA-Brüchen (double-stranded DNA break - DSB). Kürzlich hat das Liu-Labor das Basen-Editing entwickelt, mit dem ein effizientes Editing einzelner Nukleotide ohne DSBs erreicht werden kann. Basen-Editoren (BEs) kombinieren das CRISPR-System mit basenmodifizierenden Deaminase-Enzymen, um die Zielbasenpaare C·G oder A·T in A·T bzw. G·C umzuwandeln4-6. Obwohl sie von Forschern weltweit bereits in großem Umfang genutzt werden (> 5.000 Liu-Labor-BE-Konstrukte werden von Addgene vertrieben), ermöglichen die derzeitigen BEs nur vier der zwölf möglichen Basenpaarumwandlungen und sind nicht in der Lage, kleine Insertionen oder Deletionen zu korrigieren. Darüber hinaus wird das Editing von Basen durch das Editieren von C- oder A- Basen, die nicht zur Zielbase gehören („Bystander Editing“), und durch die Anforderung, dass eine PAM-Sequenz 15±2 bp von der Zielbase entfernt sein muss, eingeschränkt. Die Überwindung dieser Einschränkungen würde daher die Grundlagenforschung und die therapeutischen Anwendungen des Genom-Editings erheblich erweitern.
  • Hier wird vorgeschlagen, einen neuen Ansatz für das Precision Editing zu entwickeln, der viele der Vorteile des Basen-Editing bietet - nämlich die Vermeidung von Doppelstrangbrüchen und Donor-DNA-Reparatur-Templaten - und gleichzeitig dessen größte Einschränkungen überwindet. Um dieses ehrgeizige Ziel zu erreichen, sollen die editierten DNA-Stränge mithilfe der Ziel-geprimten reversen Transkription (target-primed reverse transcription - TPRT) direkt an den genomischen Zielstellen eingebaut werden. In der hierin erörterten Ausgestaltung wird die CRISPR-Leit-RNA (gRNA) so konstruiert, dass sie ein Templat trägt, das die Synthese des mutagenen DNA-Strangs kodiert und von einem zugehörigen Reverse-Transkriptase (RT)-Enzym ausgeführt wird. Die DNA der CRISPR- Nuklease (Cas9) an der Zielstelle dient als Primer für die reverse Transkription, so dass jeder gewünschte Nukleotid-Edit direkt eingebaut werden kann.
  • Abschnitt 1
  • Etablierung einer Leit-RNA-Templat-templierten reversen Transkription mutagener DNA-Stränge. Frühere Studien haben gezeigt, dass Cas9 nach der DNA-Spaltung, aber vor der Dissoziation des Komplexes, den Nicht-Ziel-DNA-Strang freisetzt, um einen freien 3'- Terminus freizulegen. Es wird angenommen, dass dieser DNA-Strang für die Verlängerung durch Polymeraseenzyme zugänglich ist und dass gRNAs durch Verlängerung ihres 5'- oder 3'-Terminus so verändert werden können, dass sie als Templat für die DNA-Synthese dienen. In vorläufigen In-vitro-Studien wurde festgestellt, dass genickte DNA-Stränge in Cas9:gRNAgebundenen Komplexen tatsächlich die reverse Transkription unter Verwendung der gebundenen gRNA als Templat (RT-Enzym in trans) in Gang setzen können. Als Nächstes werden verschiedene gRNA-Linker, Primer-Bindungsstellen und Synthese-Template untersucht, um optimale Regeln für die Ausgestaltung in vitro zu bestimmen. Anschließend werden verschiedene RT-Enzyme, die in trans oder als Fusionen mit Cas9 agieren, in vitro bewertet. Schließlich werden konstruierte gRNA-Ausgestaltungen identifiziert, die eine effiziente Bindung und Schneideaktivität in den Zellen beibehalten. Die erfolgreiche Demonstration dieses Ziels wird eine Grundlage für die Durchführung der mutagenen Strangsynthese in Zellen bereitstellen.
  • Abschnitt 2
  • Etablierung von-Prime-Editing in humanen Zellen. Basierend auf den Mechanismen der DNA-Verarbeitung und -Reparatur wird angenommen, dass mutagene DNA-Stränge (einzelsträngige Flaps) zum gezielten und effizienten Editieren von Zielnukleotiden verwendet werden können. In ermutigenden Vorstudien wurde die Durchführbarkeit dieser Strategie nachgewiesen, indem das Editing mit Modellplasmidsubstraten, die mutagene Flaps enthalten, demonstriert wurde. In Verbindung mit Ziel 1 werden die Reparaturergebnisse ferner durch systematische Variation der Länge, der Sequenzzusammensetzung, der Identität der Zielnukleotide und des 3'-Terminus des mutagenen Flap bewertet. Kleine Insertionen und Deletionen von 1 bis 3 Nukleotiden werden ebenfalls getestet. Parallel dazu werden, aufbauend auf Ziel 1, Cas9-RT-Architekturen bewertet, die Fusionsproteine und nicht-kovalente Rekrutierungsstrategien beinhalten. Cas9-RT-Architekturen und verlängerte gRNAs werden für das zelluläre Editing an mehreren Zielstellen im humanen Genom getestet und anschließend auf hohe Effizienz optimiert. Im Erfolgsfall würde dieses Ziel das TPRT-Genom-Editing (d. h. Prime-Editing) sofort für grundlegende wissenschaftliche Anwendungen etablieren.
  • Abschnitt 3
  • Erreichen des stellenspezifischen Editing pathogener Mutationen in kultivierten humanen Zellen. Die potenzielle Allgemeingültigkeit dieser Technologie könnte das Editing von Transversionsmutationen und Indels ermöglichen, die derzeit nicht durch BEs korrigierbar sind. Auf der Grundlage der Ergebnisse von Ziel 1 und Ziel 2 sollen pathogene Transversionsmutationen in kultivierten humanen Zellen gezielt bearbeitet werden, einschließlich der Sichelzellkrankheit-Gründermutation in Betaglobin (die zur Korrektur eine A·T-zu-T·A-Transversion beinhaltet) und der am weitesten verbreiteten Wilson-Mutation in ATP7B (die zur Korrektur eine G·C-zu-T·A-Transversion erfordert). Die Korrektur kleiner Insertions- und Deletionsmutationen wird ebenfalls untersucht werden, einschließlich der 3- Nukleotid ΔF508 Deletion in CFTR, die zystische Fibrose verursacht. Im Erfolgsfall würde dies die Grundlage für die Entwicklung leistungsfähiger therapeutischer Ansätze zur Bekämpfung dieser bedeutenden humanen Krankheiten bilden.
  • Ansatz
  • Ziel ist die Entwicklung einer Genom-Editing-Strategie, die Punktmutationen direkt an den Zielstellen im Genom einbaut. In der Phase der Technologieentwicklung werden sich die Bemühungen auf die Entwicklung von Proteinen und RNA konzentrieren, um die TPRT- Funktionalität in das CRISPR/Cas-System zu integrieren. Mithilfe von In-vitro-Tests soll die Funktion jedes TPRT-Schrittes sorgfältig untersucht werden, wobei von Grund auf neu aufgebaut wird (Ziel 1). Als zweiter Fokusbereich werden die Ergebnisse des Editing in Säugetierzellen unter Verwendung einer Kombination von Modellsubstraten und konstruierten CRISPR/Cas-Systemen bewertet (Ziel 2). In der Anwendungsphase schließlich wird die Technologie eingesetzt, um Mutationen zu korrigieren, die mit anderen Verfahren des Genom- Editing nicht zu beheben sind (Ziel 3).
  • Die allgemeine Editing-Ausgestaltung wird in den 1A-1B gezeigt. Cas9-Nickasen enthalten inaktivierende Mutationen in der HNH-Nuklease-Domäne (Spy Cas9 H840A oder N863A), wodurch die DNA-Spaltung auf den PAM-haltigen Strang (Nicht-Zielstrang) beschränkt wird. Leit-RNAs (gRNAs) sind so konstruiert, dass sie ein Templat für die reverse Transkription enthalten (Ausgestaltungen siehe Folie 5). Abgebildet ist eine 5'-Erweiterung der gRNA, es können aber auch 3'-Verlängerungen umgesetzt werden. Die Cas9-Nickase ist entweder über den C-Terminus oder den N-Terminus mit einem Reverse-Transkriptase (RT)- Enzym fusioniert. Der gRNA:Cas9-RT-Komplex zielt auf die DNA-Region von Interesse und bildet eine R-Schleife, nachdem er den Nicht-Zielstrang verdrängt hat. Cas9 nickt den Nicht- Zielstrang der DNA ein. Durch die Freisetzung des genickten Strangs wird ein freier 3'-OH- Terminus freigelegt, der in der Lage ist, die reverse Transkription unter Verwendung der verlängerten gRNA als Templat zu starten. Diese DNA-Synthesereaktion wird von dem fusionierten RT-Enzym durchgeführt. Das gRNA-Templat kodiert eine DNA-Sequenz, die homolog zum ursprünglichen DNA-Duplex ist, mit Ausnahme des Nukleotids, das für das Editing anvisiert ist. Das Produkt der reversen Transkription ist ein einzelsträngiger DNA-Flap, der den gewünschten Edit kodiert. Dieser Flap, der einen freien 3'-Terminus enthält, kann sich mit dem benachbarten DNA-Strang abgleichen, was zu einer 5'-Flap-Spezies führt. Es wird angenommen, dass diese Spezies als effizientes Substrat für FEN1 (Flap-Endonuklease 1) dient, ein Enzym, das auf natürliche Weise 5'-Flaps aus Okazaki-Fragmenten während der DNA-Synthese des zurückbleibenden Strangs herausschneidet und 5'-Flaps nach der Strangverschiebungssynthese entfernt, die während der Long-Patch-Basen-Exzisionsreparatur stattfindet. Bei der Ligation der genickten DNA entsteht ein nicht zusammenpassendes Basenpaar. Dieses Zwischenprodukt kann entweder in das ursprüngliche Basenpaar zurückverwandelt oder durch Mismatch-Repair (MMR)-Prozesse in das gewünschte editierte Basenpaar umgewandelt werden. Alternativ könnte die semikonservative DNA-Replikation zu je einer Kopie der Reversion und des Edits führen.
  • BEISPIEL 2 - PRIME-EDITING: HOCHFLEXIBLES UND PRÄZISES SUCHEN- UND-ERSETZEN-GENOM-EDITING IN HUMANEN ZELLEN OHNE DOPPELSTRÄNGIGE DNA-BRÜCHE
  • Die derzeitigen Verfahren des Genom-Editing können mithilfe programmierbarer Nukleasen Zielgene mit den begleitenden Nebenprodukten doppelsträngiger DNA-Brüche unterbrechen, löschen oder einfügen und mithilfe von Basen-Editoren die vier Transversionspunktmutationen an den Ziel-Loci einbauen. Kleine Insertionen, kleine Deletionen und die acht Transversionspunktmutationen stellen jedoch zusammengenommen die meisten pathogenen genetischen Varianten dar, können aber in den meisten Zelltypen nicht effizient und ohne ein Übermaß an Nebenprodukten korrigiert werden. Hierin wird das Prime- Editing beschrieben, ein äußerst vielseitiges und präzises Verfahren zum Genom-Editing, bei dem neue genetische Informationen direkt in eine bestimmte DNA-Stelle eingeschrieben werden, und zwar mithilfe eines katalytisch beeinträchtigten Cas9, der mit einer manipulierten reversen Transkriptase fusioniert und mit einer manipulierten Leit-RNA (PEgRNA) programmiert ist, die sowohl die Zielstelle spezifiziert als auch den gewünschte Edit kodiert. Es wurden mehr als 175 verschiedene Edits in humanen Zellen ausgeführt, um nachzuweisen, dass Prime-Editing gezielte Insertionen, Deletionen, alle 12 möglichen Arten von Punktmutationen und Kombinationen davon effizient (typischerweise 20-60 %, bis zu 77 % in unsortierten Zellen) und mit geringen Nebenprodukten (typischerweise 1-10 %) durchführen kann, ohne dass doppelsträngige Brüche oder Donor-DNA-Template erforderlich sind. Prime- Editing wurde in humanen Zellen angewandt, um die primären genetischen Ursachen der Sichelzellenkrankheit (die eine A·T-zu-T·A-Transversion in HBB erfordert) und der Tay- Sachs-Krankheit (die eine 4-Basen-Deletion in HEXA erfordert) zu korrigieren, wobei in beiden Fällen die pathogenen genomischen Allele mit minimalen Nebenprodukten effizient in den Wildtyp zurückverwandelt wurden. Prime-Editing wurde auch eingesetzt, um humane Zelllinien mit diesen pathogenen HBB-Transversionen und HEXA-Insertionsmutationen zu erzeugen, um die G127V-Mutation in PRNP einzubauen, die eine Resistenz gegen die Prionenkrankheit verleiht (was eine G·C-zu-T·A-Transversion erfordert), und um einen His6- Tag, einen FLAG-Epitop-Tag und eine verlängerte LoxP-Stelle effizient in Ziel-Loci in humanen Zellen einzufügen. Prime-Editing bietet gegenüber HDR Vorteile in Bezug auf Effizienz und Produktreinheit sowie komplementäre Stärken und Schwächen im Vergleich zum Basen-Editing. In Übereinstimmung mit seinem Such- und Ersetzungsmechanismus, der drei verschiedene Basenpaarungsereignisse erfordert, ist Prime-Editing viel weniger anfällig für die Modifikation der DNA an bekannten Cas9-Zielstellen als Cas9. Prime-Editing erweitert den Umfang und die Möglichkeiten des Genom-Editings erheblich und kann im Prinzip ~89 % der bekannten pathogenen humanen genetischen Varianten korrigieren.
  • Die Fähigkeit, praktisch jede beliebige gezielte Veränderung im Genom jeder beliebigen lebenden Zelle oder jedes beliebigen Organismus vorzunehmen, ist ein lang gehegter Wunsch der Biowissenschaften. Trotz der rasanten Fortschritte bei den Genom- Editing-Technologien kann die Mehrzahl der >75.000 bekannten humanen genetischen Varianten, die mit Krankheiten in Verbindung gebracht werden111, nicht korrigiert oder in den meisten therapeutisch relevanten Zellen eingebaut werden (38A). Programmierbare Nukleasen wie CRISPR-Cas9 erzeugen doppelsträngige DNA-Brüche (DSBs), die Gene unterbrechen können, indem sie an den Zielstellen eine Mischung aus Insertionen und Deletionen (Indels) induzieren112-114. Nukleasen können auch zur Deletion von Zielgenen115,116 oder zum Insertion von exogenen Genen117-119 durch homologieunabhängige Prozesse verwendet werden. Doppelsträngige DNA-Brüche sind jedoch auch mit unerwünschten Ergebnissen verbunden, die komplexe Produktmischungen, Translokationen120 und die Aktivierung von p53 beinhalten121,122. Darüber hinaus unterscheidet sich die überwiegende Mehrheit der pathogenen Allele von ihren nicht-pathogenen Gegenstücken durch kleine Insertionen, Deletionen oder Basensubstitutionen, die zu ihrer Korrektur wesentlich präzisere Editing-Technologien erfordern (38A). Die durch Nuklease-induzierte DSBs123 stimulierte homologiegeleitete Reparatur (HDR) ist weit verbreitet, um eine Vielzahl von präzisen DNA-Veränderungen einzubauen. HDR ist jedoch auf exogene Donor-DNA- Reparatur-Template angewiesen, erzeugt in der Regel einen Überschuss an Indel- Nebenprodukten aus der End-Join-Reparatur von DSBs und ist in den meisten therapeutisch relevanten Zelltypen ineffizient (T-Zellen und einige Stammzellen sind wichtige Ausnahmen)124,121. Während die Verbesserung der Effizienz und Präzision des DSBvermittelten Genom-Editings nach wie vor im Mittelpunkt vielversprechender Bemühungen steht126-130, erfordern diese Herausforderungen die Erforschung alternativer Strategien für das Genom-Editing mit Präzision.
  • Durch Basen-Editing können die vier Arten von Übergangsmutationen (C zu T, G zu A, A zu G und T zu C) effizient eingebaut oder korrigiert werden, ohne dass DSBs in einer Vielzahl von Zelltypen und Organismen, einschließlich Säugetieren, erforderlich sind128-131, kann aber derzeit keine der acht Transversionsmutationen (C zu A, C zu G, G zu C, G zu T, A zu C, A zu T, T zu A und T zu G) erreichen, wie z. B. die T·A-zu-A·T-Mutation, die für die direkte Korrektur der häufigsten Ursache der Sichelzellenkrankheit (HBB E6V) erforderlich ist132. Darüber hinaus ist kein DSB-freies Verfahren zur Durchführung von gezielten Deletionen, wie der Entfernung der 4-Basen-Duplikation, die die Tay-Sachs-Krankheit (HEXA 1278+TATC)133 verursacht, oder von gezielten Insertionen, wie der präzisen 3-Basen- Insertion, die zur direkten Korrektur der häufigsten Ursache der zystischen Fibrose (CFTR ΔF508)134 erforderlich ist, ausgewiesen. Gezielte Transversionspunktmutationen, Insertionen und Deletionen sind daher in den meisten Zelltypen nur schwer effizient und ohne überschüssige Nebenprodukte einzubauen oder zu korrigieren, auch wenn sie zusammengenommen die meisten bekannten pathogenen Allele ausmachen (38A).
  • Hierin wird die Entwicklung des Prime-Editing beschrieben, einer neuen „Suchen-und- Ersetzen“-Technologie für das Genom-Editing, die gezielte Insertionen, Deletionen und alle 12 möglichen Basen-zu-Basen-Umwandlungen an Ziel-Loci in humanen Zellen vermittelt, ohne dass doppelsträngige DNA-Brüche oder Donor-DNA-Template erforderlich sind. Prime- Editoren, deren erstes Beispiel PE1 ist, verwenden eine reverse Transkriptase, die mit einer programmierbaren Nickase und einer verlängerten Leit-RNA (PEgRNA) für das Prime-Editing fusioniert ist, um die genetische Information von der Verlängerung der PEgRNA direkt in den Ziel-Locus zu kopieren. Ein Prime-Editor der zweiten Generation (PE2) verwendet eine gentechnisch veränderte reverse Transkriptase, um die Editing-Effizienz bei minimaler (typischerweise <2 %) Indel-Bildung erheblich zu steigern, während ein PE3-System der dritten Generation eine zweite Leit-RNA hinzufügt, um den nicht-editierten Strang zu nicken und dadurch den Austausch des nicht-editierten Strangs zu begünstigen und die Editing- Effizienz weiter zu steigern, typischerweise auf etwa 20-50 % in humanen Zellen bei etwa 1- 10 % Indel-Bildung. PE3 bietet weit weniger Nebenprodukte und eine höhere oder ähnliche Effizienz im Vergleich zur optimierten Cas9-Nuklease-initiierten HDR und bietet komplementäre Stärken und Schwächen im Vergleich zu den Basen-Editoren der aktuellen Generation.
  • PE3 wurde an genomischen Loci in humanen HEK293T-Zellen angewandt, um eine effiziente Umwandlung von HBB E6V in Wildtyp-HBB, eine Deletion des eingefügten TATC zur Wiederherstellung von HEXA 1278+TATC in Wildtyp-HEXA, einen Einbau der G127V- Mutation in PRNP, die eine Resistenz gegen die Prionenkrankheit verleiht135 (was eine G-C- zu-T-A-Transversion erfordert), und eine gezielte Einfügung eines His6-Tags (18 bp), eines FLAG-Epitop-Tags (24 bp) und einer verlängerten LoxP-Stelle für die Cre-vermittelte Rekombination (44 bp) zu erreichen. Prime-Editing war auch in drei anderen humanen Zelllinien sowie in post-mitotischen primären kortikalen Neuronen der Maus erfolgreich, allerdings mit unterschiedlicher Effizienz. Aufgrund des hohen Maßes an Flexibilität in Bezug auf den Abstand zwischen dem anfänglichen Nick und dem Edit-Ort wird das Prime-Editing nicht wesentlich durch die PAM-Anforderungen von Cas9 eingeschränkt und kann im Prinzip die große Mehrheit der genomischen Loci anvisieren. Off-Target-Prime-Editing ist sehr viel seltener als Off-Target Cas9 Editing an bekannten Cas9 Off-Target-Loci, was wahrscheinlich darauf zurückzuführen ist, dass für ein produktives Prime-Editing drei verschiedene DNA- Basenpaarungen erforderlich sind. Durch die Möglichkeit der präzisen gezielten Insertion, Deletion und aller 12 möglichen Klassen von Punktmutationen an einer Vielzahl von genomischen Loci, ohne dass DSBs oder Donor-DNA-Template erforderlich sind, weist das Prime-Editing das Potenzial auf, die Untersuchung und Korrektur vieler Genvarianten voranzutreiben.
  • Ergebnisse
  • Strategie zur Übertragung von Informationen von einer verlängerten Leit-RNA in einen Ziel- Locus der DNA
  • Cas9 zielt auf DNA mithilfe einer Leit-RNA ab, die eine Spacer-Sequenz enthält, die an die Ziel-DNA hybridisiert112-114,136,137. Ziel war es, Leit-RNAs zu entwickeln, die sowohl das DNA-Ziel spezifizieren, wie dies bei natürlichen CRISPR-Systemen138,139 der Fall ist, als auch neue genetische Informationen enthalten, die die entsprechenden DNA-Nukleotide am Ziel-Locus austauschen. Die direkte Übertragung genetischer Informationen von einer verlängerten Leit-RNA in eine bestimmte DNA-Stelle und der anschließende Austausch der ursprünglichen, nicht editierten DNA könnte im Prinzip ein allgemeines Mittel zum Einbau gezielter Änderungen der DNA-Sequenz in lebenden Zellen bereitstellen, ohne dass DSBs oder Donor-DNA-Template erforderlich sind. Um diesen direkten Informationstransfer zu erreichen, sollte genomische DNA verwendet werden, die an der Zielstelle genickt wurde, um eine 3'-Hydroxylgruppe freizulegen, um die reverse Transkription der genetischen Information von einer Verlängerung der manipulierten Leit-RNA (im Folgenden als Prime-Editing Leit- RNA oder PEgRNA bezeichnet) direkt in die Zielstelle zu veranlassen (38A).
  • Diese einleitenden Schritte des Nicking und der reversen Transkription, die den Mechanismen ähneln, die von einigen natürlichen mobilen genetischen Elementen 140 verwendet werden, führen zu einem verzweigten Zwischenprodukt mit zwei redundanten einzelsträngigen DNA-Flaps auf einem Strang: einem 5'-Flap, der die uneditierte DNA- Sequenz enthält, und einem 3'-Flap, der die von der PEgRNA kopierte editierte Sequenz enthält (38B). Um ein erfolgreiches Editing zu erreichen, muss dieses verzweigte Zwischenprodukt aufgelöst werden, so dass der editierte 3'-Flap den uneditierten 5'-Flap austauscht. Während die Hybridisierung des 5'-Flaps mit dem uneditierten Strang wahrscheinlich thermodynamisch begünstigt wird, da der editierte 3'-Flap weniger Basenpaare mit dem uneditierten Strang bilden kann, sind 5'-Flaps das bevorzugte Substrat für strukturspezifische Endonukleasen wie FEN1141, die 5'-Flaps, die während der Lagging-Strand-DNA- Synthese und der Long-Patch-Base-Excision-Reparatur erzeugt werden, ausschneiden. Es wurde angenommen, dass die bevorzugte 5'-Flap-Exzision und 3'-Flap-Ligation den Einbau des editierten DNA-Strangs vorantreiben könnte, wodurch eine Heteroduplex-DNA entsteht, die einen editierten und einen uneditierten Strang enthält (38B).
  • Der dauerhafte Einbau des Edits könnte durch eine anschließende DNA-Reparatur erfolgen, die die Diskrepanz zwischen den beiden DNA-Strängen so auflöst, dass die Information des editierten Strangs in den komplementären DNA-Strang kopiert wird (38C). Basierend auf einer ähnlichen Strategie, die entwickelt wurde, um die Effizienz des DNA-Basen-Editings zu maximieren131-133, wurde davon ausgegangen, dass die Verzerrung des nicht-editierten DNA-Strangs, die weit genug von der Stelle des anfänglichen Nicks entfernt ist, um die Bildung von Doppelstrangbrüchen zu minimieren, die DNA- Reparatur so beeinflussen könnte, dass der nicht-editierte Strang bevorzugt ausgetauscht wird. Validierung der Schritte des Prime-Editing in vitro und in Hefezellen
  • Nach der Spaltung des PAM-enthaltenden DNA-Strangs durch die RuvC-Nuklease- Domäne von Cas9 kann das PAM-distale Fragment dieses Strangs von ansonsten stabilen Cas9:sgRNA:DNA-Komplexen dissoziieren143. Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass das 3'-Ende dieses freigesetzten Strangs ausreichend zugänglich sein könnte, um die DNA- Polymerisation zu starten. Leit-RNA-Engineering-Bemühungen144 146 und Kristallstrukturen von Cas9:sgRNA:DNA-Komplexen141-149 legen nahe, dass die 5'- und 3'-Enden der sgRNA verlängert werden können, ohne die Cas9:sgRNA-Aktivität einzubüßen. PEgRNAs wurden entworfen, indem sgRNAs so verlängert wurden, dass sie zwei entscheidende Komponenten enthalten: eine Primer-Bindungsstelle (PBS), die es dem 3'-Ende des genickten DNA-Strangs ermöglicht, an die PEgRNA zu hybridisieren, und ein Reverse-Transkriptase-(RT)-Templat, das den gewünschten Edit enthält, der direkt in die genomische DNA-Stelle kopiert wird, wenn das 3'-Ende des genickten DNA-Strangs durch eine Polymerase über das RNA-Templat verlängert wird (38C).
  • Diese Hypothesen wurden in vitro mit gereinigtem S. pyogenes Cas9-Protein getestet. Es wurde eine Reihe von PEgRNA-Kandidaten konstruiert, indem sgRNAs an einem beliebigen der beiden Termini mit einer PBS-Sequenz (5 bis 6 Nukleotide, nt) und einem RT- Templat (7 bis 22 nt) verlängert wurden. Es wurde bestätigt, dass 5'-verlängerte PEgRNAs Cas9 direkt an die Ziel-DNA binden, und dass sowohl 5'-verlängerte PEgRNAs als auch 3'verlängerte PEgRNAs die Cas9-vermittelten Ziel-Nicking-in vitro- und DNA- Spaltungsaktivitäten in Säugetierzellen unterstützen (44A-44C). Diese Ausgestaltungen von PEgRNA-Kandidaten wurden unter Verwendung von vorgenickten 5'-Cy5-markierten dsDNA-Substraten, katalytisch totem Cas9 (dCas9) und einer kommerziellen Variante der reversen Transkriptase des Moloney-Mausleukämie-Virus (M-MLV) getestet (44D). Wenn alle Komponenten vorhanden waren, wurde eine effiziente Umwandlung des fluoreszenzmarkierten DNA-Strangs in längere DNA-Produkte mit Gelmobilitäten, die mit der reversen Transkription entlang des RT-Templats übereinstimmten (38D, 44D-44E) beobachtet. Produkte der gewünschten Länge wurden entweder mit 5'-verlängerten oder 3'verlängerten PEgRNAs gebildet (38D-38E). Der Verzicht auf dCas9 führte zu Nick- Translationsprodukten, die durch reverse Transkriptase-vermittelte DNA-Polymerisation auf dem DNA-Templat entstanden, ohne dass PEgRNA-Informationen übertragen wurden (38D). Es wurden keine DNA-Polymerisationsprodukte beobachtet, wenn die PEgRNA durch eine herkömmliche sgRNA ausgetauscht wurde, was die Notwendigkeit der Komponenten PBS und RT-Templat der PEgRNA bestätigt (38D). Diese Ergebnisse zeigen, dass das Cas9-vermittelte Schmelzen der DNA eine einzelsträngige R-Schleife freilegt, die, wenn sie genickt wird, in der Lage ist, die reverse Transkription entweder von einer 5'verlängerten oder 3'-verlängerten PEgRNA zu starten.
  • Als Nächstes wurden nicht-vernetzte dsDNA-Substrate mit einer Cas9-Nickase (H840A-Mutante) getestet, die ausschließlich den PAM-haltigen Strang nickt112. In diesen Reaktionen erzeugten 5'-verlängerte PEgRNAs ineffiziente Produkte der reversen Transkription, was möglicherweise auf eine beeinträchtigte Cas9-Nickase-Aktivität zurückzuführen ist (44F). 3'-verlängerte PEgRNAs ermöglichten jedoch ein robustes Cas9-Nicking und eine effiziente reverse Transkription (38E). Die Verwendung von 3'verlängerten PEgRNAs erzeugte nur ein einziges offensichtliches Produkt, obwohl die reverse Transkription prinzipiell an jeder beliebigen Stelle innerhalb des Rests der PEgRNA enden kann. Die DNA-Sequenzierung der Produkte von Reaktionen mit Cas9-Nickase, RT und 3'verlängerten PEgRNAs ergab, dass die komplette RT-Templat-Sequenz in das DNA-Substrat revers transkribiert wurde (44G). Mit diesen Experimenten wurde nachgewiesen, dass 3'verlängerte PEgRNAs die reverse Transkription neuer DNA-Stränge templieren können und gleichzeitig die Fähigkeit behalten, die Cas9-Nickase-Aktivität zu steuern.
  • Um die DNA-Reparaturergebnisse von 3'-Flaps, die durch PEgRNA-programmierte reverse Transkription in vitro erzeugt wurden, in eukaryontischen Zellen zu bewerten, wurden DNA-Nicking und reverse Transkription unter Verwendung von PEgRNAs, Cas9-Nickase und RT in vitro auf Reporterplasmid-Substraten ausgeführt, und die Reaktionsprodukte wurden dann in Hefezellen (S. cerevisiae) transformiert (45A). Erfreulicherweise exprimierten 37 % der Hefetransformanten sowohl GFP- als auch mCherry-Proteine, wenn die Plasmide in vitro mit 3'-verlängerten PEgRNAs editiert wurden, die eine T·A-zu-A·T-Transversion kodieren, die das vorzeitige Stoppcodon korrigiert (38F, 45C). In Übereinstimmung mit den Ergebnissen in 38E und 44F, ergaben in vitro durchgeführte Editing- Reaktionen mit 5'-verlängerten PEgRNAs weniger GFP- und mCherry-Doppel-positive Kolonien (9 %) als solche mit 3'-verlängerten PEgRNAs (38F und 45D). Produktives Editing wurde auch bei Verwendung von 3'- verlängerten PEgRNAs beobachtet, die ein einzelnes Nukleotid einfügen (15 % doppelpositive Transformanten) oder ein einzelnes Nukleotid löschen (29 % doppelpositive Transformanten), um Frameshift-Mutationen zu korrigieren (38F und 45E-45F). Die DNA-Sequenzierung der editierten Plasmide, die aus doppelt positiven Hefekolonien gewonnen wurden, bestätigte, dass der kodierte Edit an der gewünschten Sequenzposition stattfand (45G). Diese Ergebnisse zeigen, dass die DNA-Reparatur in eukaryontischen Zellen 3' DNA-Flaps auflösen kann, die durch Prime- Editing entstehen, um präzise DNA-Edits einzubauen, die Transversionen, Insertionen und Deletionen beinhalten.
  • Ausgestaltung von Prime-Editor 1 (PE1)
  • Ermutigt durch die Ergebnisse in vitro und in Hefe wurde nach einem Prime-Editing- System mit einer minimalen Anzahl von Komponenten gesucht, das in der Lage ist, genomische DNA in Säugetierzellen zu editieren. Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass 3'verlängerte PEgRNAs (im Folgenden einfach als PEgRNAs bezeichnet, 39A) und direkte Fusionen von Cas9 H840A mit der reversen Transkriptase über einen flexiblen Linker ein funktionelles Prime-Editing-System mit zwei Komponenten bilden könnten. HEK293T-Zellen (immortalisierte humane embryonale Nieren) wurden mit einem Plasmid transfiziert, das eine Fusion von Wildtyp-M-MLV-Reverse-Transkriptase mit einem beliebigen der beiden Termini von Cas9 H840A-Nickase kodiert, sowie mit einem zweiten Plasmid, das eine PEgRNA kodiert. Erste Versuche führten zu keiner nachweisbaren T·A-zu-A·T-Umwandlung am HEK3 Ziel-Locus.
  • Die Verlängerung der PBS in der PEgRNA auf 8-15 Basen (39A) führte jedoch zu nachweisbarem T·A-zu-A·T-Editing an der HEK3-Zielstelle (39B), wobei die Effizienz bei Prime-Editor-Konstrukten, bei denen die RT mit dem C-Terminus der Cas9- Nickase fusioniert war, höher war (3,7 % maximale T·A-zu-A·T-Umwandlung bei PBS- Längen von 8-15 nt) als bei N-terminalen RT-Cas9-Nickase-Fusionen (1,3 % maximale T·A- zu-A·T-Umwandlung) (39B; alle Säugetierzelldaten hierin beziehen sich auf die gesamte behandelte Zellpopulation, ohne Selektion oder Sortierung, sofern nicht anders angegeben). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die mit Cas9 fusionierte Wildtyp-M-MLV-RT für das Genom-Editing in humanen Zellen längere PBS-Sequenzen benötigt, als dies in vitro bei Verwendung der kommerziellen Variante der M-MLV-RT der Fall ist. Diese Wildtyp-M- MLV-Reverse-Transkriptase der ersten Generation, die mit dem C-Terminus der Cas9 H840A- Nickase fusioniert ist, wurde als PE1 bezeichnet.
  • Die Fähigkeit von PE1 zur präzisen Einführung von Transversionspunktmutationen an vier weiteren genomischen Zielstellen, die durch die PEgRNA spezifiziert wurden (39C), wurde getestet. Ähnlich wie beim Editing am HEK3-Locus war die Effizienz an diesen genomischen Stellen von der PBS-Länge abhängig, wobei die maximale Editing-Effizienz zwischen 0,7 und 5,5 % lag (39C). Die Indels von PE1 waren gering und betrugen im Durchschnitt 0,2±0,1 % für die fünf Stellen unter Bedingungen, die die Editing-Effizienz jeder Stelle maximierten (46A). PE1 war auch in der Lage, gezielte Insertionen und Deletionen einzubauen, z. B. eine Ein-Nukleotid-Deletion (4,0 % Effizienz), eine Ein-Nukleotid-Insertion (9,7 %) und eine Drei-Nukleotid-Insertion (17 %) am HEK3-Locus (39C). Diese Ergebnisse belegen die Fähigkeit von PE1, gezielte Transversionen, Insertionen und Deletionen direkt einzubauen, ohne dass doppelsträngige DNA-Brüche oder DNA-Template erforderlich sind.
  • Ausgestaltung von Prime-Editor 2 (PE2)
  • Während PE1 eine Vielzahl von Edits an verschiedenen Loci in HEK293T-Zellen einbauen kann, war die Editing-Effizienz im Allgemeinen gering (typischerweise ≤5 %) (39C). Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass eine Veränderung der reversen Transkriptase in PE1 die Effizienz der DNA-Synthese innerhalb der einzigartigen konformationellen Beschränkungen des Prime-Editing-Komplexes verbessern könnte, was zu einer höheren Ausbeute beim Genom-Editing führen würde. M-MLV-RT-Mutationen, die die Thermostabilität des Enzyms150,151, die Prozessivität150 und die DNA:RNA-Heteroduplex- Substrataffinität152 erhöhen und die RNaseH-Aktivität153 inaktivieren, sind bereits bekannt. Es wurden 19 PE1-Varianten konstruiert, die verschiedene Reverse-Transkriptase-Mutationen enthalten, um ihre Prime-Editing-Effizienz in humanen Zellen zu bewerten.
  • Zunächst wurde eine Reihe von M-MLV-RT-Varianten untersucht, die zuvor in der Laborevolution aufgrund ihrer Fähigkeit zur Unterstützung der reversen Transkription bei erhöhten Temperaturen150 entstanden waren. Die sukzessive Einführung von drei dieser Aminosäuresubstitutionen (D200N, L603W und T330P) in M-MLV RT, im Folgenden als M3 bezeichnet, führte zu einer 6,8-fachen durchschnittlichen Steigerung der Effizienz des Transversions- und Insertions-Editings an fünf genomischen Loci in HEK293T-Zellen im Vergleich zu PE1 (47A-47S).
  • Als Nächstes wurden in Kombination mit M3 zusätzliche Reverse-Transkriptase- Mutationen getestet, die nachweislich die Bindung an den Templat:PBS-Komplex, die Prozessivität des Enzyms und die Thermostabilität152 verbessern. Unter den 14 zusätzlich analysierten Mutanten verbesserte eine Variante mit den Substitutionen T306K und W313F zusätzlich zu den M3-Mutationen die Editing-Effizienz um das 1,3- bis 3,0-fache im Vergleich zu M3 bei sechs Transversions- oder Insertions-Edits an fünf Genomstellen in humanen Zellen (47A-47S). Diese Pentamutante der M-MLV-Reverse-Transkriptase, die in die PE1- Architektur integriert ist (Cas9 H840A-M-MLV RT (D200N L603W T330P T306K W313F)), wird im Folgenden als PE2 bezeichnet.
  • PE2 baut Einzelnukleotid-Transversions-, Insertions- und Deletionsmutationen mit wesentlich höherer Effizienz ein als PE1 (39C) und ist kompatibel mit kürzeren PBS PEgRNA Sequenzen (39C), was mit einer verbesserten Fähigkeit zum produktiven Ineingriffbringen von transienten genomischen DNA:PBS-Komplexen einhergeht. Im Durchschnitt führte PE2 zu einer 1,6- bis 5,1-fachen Verbesserung der Prime-Editing- Punktmutationseffizienz gegenüber PE1 (39C) und in einigen Fällen zu einer dramatischen Verbesserung der Editing-Ausbeute um das bis zu 46-fache (47F und 47I). PE2 führte auch gezielte Insertionen und Deletionen effizienter durch als PE1 und erreichte die gezielte Insertion des 24-bp-FLAG-Epitop-Tags am HEK3-Locus mit einer Effizienz von 4,5 %, was eine 15-fache Verbesserung gegenüber der Effizienz des Einbaus dieser Insertion mit PE1 darstellt (47D), und vermittelte eine 1-bp-Deletion in HEK3 mit einer Effizienz von 8,6 %, 2,1 mal höher als die von PE1 (39C). Diese Ergebnisse belegen, dass PE2 ein effizienterer Prime-Editor als PE1 ist.
  • Optimierung der PEgRNA-Merkmale
  • Die Beziehung zwischen der PEgRNA-Architektur und Prime-Editing-Effizienz wurde systematisch an fünf genomischen Loci in HEK293T-Zellen mit PE2 untersucht (39C). Im Allgemeinen erforderten Priming-Stellen mit geringerem GC-Gehalt längere PBS- Sequenzen (EMX1 und RNF2, die 40 % bzw. 30 % GC-Gehalt in den ersten 10 nt stromaufwärts des Nicks enthielten), während solche mit höherem GC-Gehalt Prime-Editing mit kürzeren PBS-Sequenzen unterstützten (HEK4 und FANCF, die 80 % bzw. 60 % GC- Gehalt in den ersten 10 nt stromaufwärts des Nicks enthielten) (39C), was mit den energetischen Anforderungen für die Hybridisierung des genickten DNA-Strangs an die PEgRNA-PBS übereinstimmt. Weder die PBS-Länge noch die Höhe des GC-Inhalts waren für die Prime-Editing-Effizienz ausschlaggebend, und andere Faktoren wie die Sekundärstruktur des DNA-Primers oder die PEgRNA-Verlängerung können die Editing-Aktivität ebenfalls beeinflussen. Es wird empfohlen, mit einer PBS-Länge von ~13 nt für eine typische Zielsequenz zu beginnen und andere PBS-Längen zu untersuchen, wenn die Sequenz von ~40- 60 % GC-Inhalt abweicht. Falls erforderlich, sollten optimale PBS-Sequenzen empirisch bestimmt werden.
  • Als nächstes wurden die leistungsbestimmenden Faktoren des RT-Templat-Abschnitts der PEgRNA untersucht. PEgRNAs mit RT-Templaten von 10-20 nt Länge wurden systematisch an fünf genomischen Zielstellen mit PE2 (39D) und mit längeren RT- Templaten von bis zu 31 nt Länge an drei genomischen Stellen bewertet (48A-48C). Wie bei der PBS-Länge konnte auch die RT-Templat-Länge variiert werden, um die Prime-Editing- Effizienz zu maximieren, obwohl im Allgemeinen viele RT-Templat-Längen von ≥10 nt ein effizienteres Prime-Editing unterstützen (39D). Da einige Zielstellen längere RT- Template (>15 nt) bevorzugten, um eine höhere Editing-Effizienz zu erreichen (FANCF, EMX1), während andere Loci kurze RT-Template bevorzugten (HEK3, HEK4) (39D), empfiehlt es sich, bei der Optimierung einer PEgRNA sowohl kurze als auch lange RT- Template zu testen, beginnend mit ~10-16 nt.
  • Wichtig ist, dass RT-Template, die ein C als Nukleotid neben der terminalen Haarnadel des sgRNA-Gerüsts platzieren, im Allgemeinen zu einer geringeren Editing-Effizienz im Vergleich zu anderen PEgRNAs mit RT-Templaten ähnlicher Länge führen (48A-48C). Basierend auf der Struktur von sgRNAs, die an Cas9148,149 gebunden sind, wurde spekuliert, dass das Vorhandensein eines C als erstes Nukleotid der 3'-Verlängerung einer kanonischen sgRNA die sgRNA-Gerüstfaltung durch Paarung mit G81, einem Nukleotid, das nativ einen pi-Stapel mit Tyr 1356 in Cas9 und ein nicht-kanonisches Basenpaar mit sgRNA A68 bildet, unterbrechen kann. Da viele RT-Templat-Längen das Prime-Editing unterstützen, wird empfohlen, PEgRNAs zu wählen, bei denen die erste Base der 3'-Erweiterung (die letzte revers transkribierte Base des RT-Templats) nicht C ist.
  • Ausgestaltung von Prime-Editor-3-Systemen (PE3 und PE3b)
  • Während PE2 die genetische Information von der PEgRNA effizienter auf den Ziel- Locus übertragen kann als PE1, bestimmt die Art und Weise, wie die Zelle die entstehende Heteroduplex-DNA auflöst, die aus einem editierten und einem uneditierten Strang besteht, ob der Edit dauerhaft ist. Eine frühere Entwicklung des Basen-Editing stand vor einer ähnlichen Herausforderung, da das Ausgangsprodukt der Cytosin- oder Adenin-Desaminierung eine Heteroduplex-DNA ist, die einen editierten und einen nicht-editierten Strang enthält. Um die Basen-Editing-Effizienz zu erhöhen, wurde eine Cas9 D10A-Nickase verwendet, um einen Nick in den nicht editierten Strang einzuführen und die DNA-Reparatur auf diesen Strang zu lenken, wobei der editierte Strang als Templat diente129,130,142. Um dieses Prinzip zur Steigerung der Prime-Editing-Effizienz zu nutzen, wurde eine ähnliche Strategie getestet, bei der der nicht-editierte Strang mithilfe der bereits in PE2 vorhandenen Cas9 H840A-Nickase und einer einfachen sgRNA genickt wird, um einen bevorzugten Austausch des nicht-editierten Strangs durch die Zelle zu induzieren (40A). Da der editierte DNA-Strang ebenfalls genickt wurde, um das Prime-Editing einzuleiten, wurden verschiedene sgRNA-programmierte Nick-Orte auf dem nicht-editierten Strang getestet, um die Produktion von doppelsträngigen DNA-Brüchen, die zu Indels führen, zu minimieren.
  • Diese PE3-Strategie wurde zunächst an fünf genomischen Stellen in HEK293T-Zellen getestet, indem sgRNAs gescreent wurden, die 14 bis 116 Basen von der Stelle der PEgRNA- induzierten Nickstelle entfernt liegen, entweder 5' oder 3' vom PAM. An vier der fünf getesteten Stellen erhöhte das Nicking des nicht-editierten Strangs die Menge an indel-freien Prime-Editing-Produkten im Vergleich zum PE2-System um das 1,5- bis 4,2-fache, und zwar auf bis zu 55 % (40B). Während die optimale Nicking-Position je nach Genomstelle variierte, führten Nicks, die 3' von der PAM (positive Abstände in 40B) etwa 40-90 bp von dem PEgRNA-induzierten Nick positioniert sind, im Allgemeinen zu einer günstigen Steigerung der Prime-Editing-Effizienz (durchschnittlich 41 %) ohne übermäßige Indelbildung (durchschnittlich 6,8 % Indels für die sgRNA, die für jede der fünf getesteten Stellen die höchste Editiereffizienz ergab) (40B). Wie erwartet, führte die Platzierung des nicht- editierten Strang-Nicks innerhalb von 40 bp des PEgRNA-induzierten Nicks an einigen Stellen zu einem starken Anstieg der Indel-Bildung um bis zu 22 % (40B), was vermutlich auf die Bildung eines Doppelstrangbruchs durch das Nicking beider Stränge dicht nebeneinander zurückzuführen ist. An anderen Stellen hingegen führte ein Nicking, das nur 14 bp von dem PEgRNA-induzierten Nicking entfernt war, zu nur 5 % Indels (40B), was darauf hindeutet, dass ortsabhängige Faktoren die Umwandlung von proximalen dualen Nicks in Doppelstrang-DNA-Brüche kontrollieren. An einer getesteten Stelle (HEK4) stellten komplementäre Strang-Nicks entweder keinen Nutzen bereit oder führten zu Indel-Werten, die die Editing-Effizienz übertrafen (bis zu 26 %), selbst wenn sie in Abständen von >70 bp vom PEgRNA-induzierten Nick platziert wurden, was auf eine ungewöhnliche Neigung des editierten Strangs an dieser Stelle zurückzuführen ist, von der Zelle genickt zu werden oder ineffizient ligiert zu werden. Es wird empfohlen, mit nicht-editierten Strang-Knicks zu beginnen, die etwa 50 bp vom PEgRNA-vermittelten Nick entfernt sind, und alternative Nick- Orte zu testen, wenn die Indel-Häufigkeit akzeptable Werte überschreitet.
  • Dieses Modell zur Verbesserung der Prime-Editing-Effizienz durch Nicking des komplementären Strangs (40A) sagte voraus, dass das Nicking des nicht-editierten Strangs erst nach der Auflösung des editierten Strangs das Vorhandensein von gleichzeitigen Nicks minimieren könnte, wodurch die Häufigkeit von Doppelstrangbrüchen, die zur Bildung von Indels führen, verringert würde. Um eine vorübergehende Kontrolle über das Nicking des nicht-editierten Strangs zu erreichen, wurden sgRNAs mit Spacer-Sequenzen entworfen, die mit dem editierten Strang, aber nicht mit dem ursprünglichen Allel übereinstimmen. Bei dieser Strategie, die im Folgenden als PE3b bezeichnet wird, sollten Diskrepanzen zwischen dem Spacer und dem nicht-editierten Allel das Nicking durch die sgRNA so lange behindern, bis das Editing auf dem PAM-Strang stattgefunden hat. Dieser PE3b-Ansatz wurde mit fünf verschiedenen Edits an drei genomischen Stellen in HEK293T-Zellen getestet und die Ergebnisse mit denen der PE2- und PE3-Systeme verglichen. In allen Fällen war PE3b im Vergleich zu PE3 mit wesentlich weniger Indels verbunden (3,5- bis 30-fach, im Durchschnitt 12-fach weniger Indels oder 0,85 %), ohne dass die Gesamteffizienz des Editing im Vergleich zu PE3 deutlich abnahm (40C). Wenn der Edit innerhalb eines zweiten Protospacers lag, konnte das PE3b-System also die Zahl der Indels verringern und gleichzeitig die Editing- Effizienz im Vergleich zu PE2 verbessern, oft auf ein Niveau, das dem von PE3 ähnelt (40C).
  • Zusammengenommen ergaben diese Ergebnisse, dass PE3-Systeme (Cas9-Nickaseoptimierte reverse Transkriptase + PEgRNA + sgRNA) die Editing-Effizienz im Vergleich zu PE2 um das ~3-fache verbesserten (40B-40C). Wie angesichts der zusätzlichen Nicking- Aktivität von PE3 zu erwarten war, wurde PE3 von einer größeren Bandbreite an Indels begleitet als PE2. Die Verwendung von PE3 wird empfohlen, wenn die Prime-Editing- Effizienz im Vordergrund steht. Wenn die Minimierung von Indels entscheidend ist, bietet PE2 eine ~10-fach niedrigere Indel-Häufigkeit. Wenn es möglich ist, eine sgRNA zu verwenden, die den eingebauten Edit erkennt, um den nicht-editierten Strang zu nicken, kann das PE3b- System ein PE3-ähnliches Editing-Niveau erreichen und gleichzeitig die Indel-Bildung stark reduzieren.
  • Um die Reichweite und Vielseitigkeit des Prime-Editing mit PE3 zu demonstrieren, wurde der Einbau aller möglichen Einzelnukleotid-Substitutionen an den Positionen +1 bis +8 (wobei die erste Base 3' von dem PEgRNA-induzierten Nick als Position +1 gezählt wird) von der HEK3-Zielstelle unter Verwendung von PE3 und PEgRNAs mit 10-Nukleotid-RT- Templaten (41A) untersucht. Insgesamt decken diese 24 verschiedenen Edits alle vier Übergangsmutationen und alle acht Transversionsmutationen ab und führen zu einer Editing- Effizienz (die keine Indels enthält) von durchschnittlich 33±7,9 % (zwischen 14 % und 48 %), mit einem Durchschnitt von 7,5±1,8 % Indels.
  • Wichtig ist, dass auch RT-Template mit großer Entfernung zu einem effizienten Prime- Editing mit PE3 führen können. Zum Beispiel wurden unter Verwendung von PE3 mit einem 34-nt-RT-Templat Punktmutationen an den Positionen +12, +14,+17,+20,+23,+24,+26,+30 und +33 (12 bis 33 Basen vom PEgRNA-induzierten Nick) im HEK3-Locus mit einer durchschnittlichen Effizienz von 36±8,7% und 8,6±2,0% Indels (41B) eingebaut. Obwohl Edits jenseits der +10-Position an anderen Loci nicht versucht wurden, unterstützen andere RT- Template ≥30 nt an drei alternativen Stellen ebenfalls ein effizientes Editing (48A-C). Die Lebensfähigkeit langer RT-Template ermöglichte effizientes Prime-Editing für Dutzende von Nukleotiden ab der ersten Nickstelle. Da eine NGG-PAM auf jedem DNA-Strang im Durchschnitt alle ~8 bp vorkommt, weit weniger als die maximalen Abstände zwischen dem Edit und der PAM, die ein effizientes Prime-Editing unterstützen, wird das Prime-Editing im Gegensatz zu anderen Verfahren des Präzisions-Genom-Editing nicht wesentlich durch die Verfügbarkeit einer nahe gelegenen PAM-Sequenz eingeschränkt125,142,154. In Anbetracht der vermuteten Beziehung zwischen RNA-Sekundärstruktur und Prime-Editing-Effizienz ist es bei der Ausgestaltung von PEgRNAs für Long-Range-Edits ratsam, RT-Template verschiedener Längen und ggf. Sequenzzusammensetzungen (z. B. synonyme Codons) zu testen, um die Editing-Effizienz zu optimieren.
  • Um ferner den Umfang und die Grenzen des PE3-Systems bei der Einführung von Übergangs- und Transversionspunktmutationen zu testen, wurden 72 zusätzliche Edits, die alle 12 möglichen Arten von Punktmutationen an sechs zusätzlichen genomischen Zielstellen abdecken (41C-41H) getestet. Insgesamt lag die Indel-freie Editing-Effizienz bei durchschnittlich 25±14 %, während die Indel-Bildung durchschnittlich 8,3±7,5 % betrug. Da das PEgRNA-RT-Templat die PAM-Sequenz beinhaltete, konnte das Prime-Editing Veränderungen in der PAM-Sequenz hervorrufen. In diesen Fällen wurden eine höhere Editing-Effizienz (durchschnittlich 39±9,7 %) und eine geringere Indel-Bildung (durchschnittlich 5,0±2,9 %) beobachtet (41A-41K, Punktmutationen an den Positionen +5 oder +6). Diese höhere Effizienz und geringere Indelbildung bei PAM-Edits könnte darauf zurückzuführen sein, dass die Cas9-Nickase den editierten Strang vor der Reparatur des komplementären Strangs nicht erneut binden und nicken kann. Da das Prime-Editing Kombinations-Edits ohne offensichtlichen Verlust an Editing-Effizienz unterstützt, wird das Editieren der PAM, wenn möglich, zusätzlich zu anderen gewünschten Änderungen empfohlen.
  • Als nächstes wurden 14 gezielte kleine Insertionen und 14 gezielte kleine Deletionen an sieben genomischen Stellen mit PE3 (41I) ausgeführt. Gezielte 1-bp-Insertionen erfolgten mit einer durchschnittlichen Effizienz von 32±9,8 %, während 3-bp-Insertionen mit einer durchschnittlichen Effizienz von 39±16 % eingebaut wurden. Gezielte 1-bp- und 3-bp- Deletionen waren ebenfalls effizient und erfolgten mit einer durchschnittlichen Ausbeute von 29±14 % bzw. 32±11 %. Die Erzeugung von Indel (jenseits der gezielten Insertion oder Deletion) betrug im Durchschnitt 6,8±5,4 %. Da Insertionen und Deletionen, die zwischen den Positionen +1 und +6 eingeführt werden, die Position oder die Struktur der PAM verändern, wurde spekuliert, dass Insertions- und Deletions-Edits in diesem Bereich typischerweise effizienter ist, da Cas9-Nickase den editierten DNA-Strang vor der Reparatur des komplementären Strangs nicht erneut binden und nicken kann, ähnlich wie bei Punktmutationen, die die PAM editieren.
  • PE3 wurde auch auf seine Fähigkeit getestet, größere präzise Deletionen von 5 bp bis 80 bp an der HEK3-Stelle zu vermitteln (41J). Bei Verwendung eines 13-nt-PBS- und eines RT-Templats, das 29, 24 bzw. 19 bp Homologie zum Ziel-Locus enthielt, wurden sehr hohe Editing-Effizienzen (52 bis 78 %) für 5-, 10- und 15-bp-Deletionen beobachtet. Die Verwendung eines RT-Templats mit 26 nt ermöglichte eine größere Deletion von 25 bp mit einer Effizienz von 72±4,2 %, während ein RT-Templat mit 20 nt eine Deletion von 80 bp mit einer Effizienz von 52±3,8 % ermöglichte. Diese gezielten Deletionen gingen mit Indel- Frequenzen von durchschnittlich 11±4,8 % einher (41J).
  • Schließlich wurde die Fähigkeit von PE3 getestet, 12 Kombinationen von multiplen Edits am selben Ziel-Locus zu vermitteln, die aus Insertionen und Deletionen, Insertionen und Punktmutationen, Deletionen und Punktmutationen oder zwei Punktmutationen an drei Genomstellen bestehen. Diese kombinierten Edits waren sehr effizient und erreichten im Durchschnitt 55 % des Ziel-Edits mit 6,4 % Indels (41K) und zeigen, dass Prime-Editing in der Lage ist, Kombinationen von Präzisions-Insertionen, Deletionen und Punktmutationen an einzelnen Zielstellen mit hoher Effizienz und geringer Indel-Häufigkeit durchzuführen.
  • Zusammengenommen stellen die Beispiele in 41A-41K 156 verschiedene Transitions-, Transversions-, Insertions-, Deletions- und Kombinations-Edits an sieben humanen genomischen Loci. dar. Diese Ergebnisse belegen die Vielseitigkeit, Präzision und Zielflexibilität des Prime-Editing.
  • Prime-Editing im Vergleich zum Basen-Editing
  • Cytidinbasen-Editoren (CBEs) und Adeninbasen-Editoren (ABEs) der aktuellen Generation können C·G-zu-T·A- und A-T-zu-G-C-Übergangsmutationen mit hoher Effizienz und geringen Indels einbauen129,130,142. Die Anwendung des Basen-Editing kann durch das Vorhandensein mehrerer Cytidin- oder Adeninbasen innerhalb des Aktivitätsfensters für das Basen-Editing (typischerweise ~5 bp breit) eingeschränkt werden, was zu unerwünschten Bystander-Edits führt129,130,142,155, oder durch das Fehlen einer PAM, die etwa 15±2 nt vom Zielnukleotid entfernt ist142,156. Es wurde erwartet, dass das Prime-Editing besonders nützlich sein könnte, wenn es um den präzisen Einbau von Übergangsmutationen ohne Bystander-Edits geht oder wenn das Fehlen von geeignet positionierten PAMs eine günstige Positionierung des Zielnukleotids innerhalb des CBE- oder ABE-Aktivitätsfensters ausschließt.
  • Prime-Editing und Cytosin-Basen-Editing wurden verglichen, indem drei genomische Loci, die mehrere Ziel-Cytidine im kanonischen Basen-Editing-Fenster (Protospacer- Positionen 4-8, wobei die PAM als Positionen 21-23 gezählt werden) enthalten, mit optimierten CBEs157 ohne Nickase-Aktivität (BE2max) oder mit Nickase-Aktivität (BE4max) oder mit den analogen PE2- und PE3-Prime-Editing-Systemen editiert wurden. Unter den insgesamt neun Ziel-Cytosinen innerhalb der Basen-Editing-Fenster der drei Stellen ergab BE4max eine 2,2-fach höhere durchschnittliche C·G-zu-T·A-Umwandlung als PE3 für Basen in der Mitte des Basen-Editing-Fensters (Protospacer-Positionen 5-7, 42A). Ebenso übertraf BE2max ohne Nicking PE2 bei diesen gut positionierten Basen im Durchschnitt um das 1,4-fache (42A). PE3 übertraf jedoch BE4max um das 2,7-fache und PE2 übertraf BE2max um das 2,0-fache bei Cytosinen jenseits des Zentrums des Basen-Editierfensters (durchschnittliches Editing von 40±17 % für PE3 gegenüber 15±18 % für BE4max und 22±11 % für PE2 gegenüber 11±13 % für BE2max). Insgesamt waren die Indel-Häufigkeiten bei PE2 sehr niedrig (durchschnittlich 0,86±0,47 %) und bei PE3 ähnlich oder leicht höher als bei BE4max (BE4max-Bereich: 2,5 % bis 14 %; PE3-Bereich: 2,5 % bis 21 %) (42B).
  • Beim Vergleich der Effizienz des Basen-Editing mit dem Prime-Editing für den Einbau präziser C·G-zu-T·A-Edits (ohne Bystander-Editing) übertraf die Effizienz des Prime-Editing die des Basen-Editing an den oben genannten Stellen, die wie die meisten genomischen DNA- Stellen mehrere Cytosine innerhalb des -5-bp-Basen-Editing-Fensters enthalten, bei weitem (42C). An diesen Stellen, wie EMX1, die Cytosine an den Protospacer-Positionen C5, C6 und C7 enthält, erzeugte BE4max nur wenige Produkte, die nur die Umwandlung des einzelnen Zielbasenpaares enthielten, ohne Bystander-Edits. Im Gegensatz dazu konnte Prime-Editing an dieser Stelle dazu verwendet werden, selektiv einen C·G-zu-T·A-Edit an einer beliebigen Position oder Kombination von Positionen (C5, C6, C7, C5+C6, C6+C7, C5+C7 oder C5+C6+C7) einzubauen (42C). Alle präzisen Edits mit einer oder zwei Basen (d. h. Edits, die keine anderen Basen in der Nähe modifizieren) waren mit PE3 oder PE2 wesentlich effizienter als mit BE4max bzw. BE2, während der dreibasige C·G-zu-T·A-Edit mit BE4max effizienter war (42C), was die Neigung der Editoren widerspiegelt, alle Zielbasen innerhalb des Aktivitätsfensters zu editieren. Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass Cytosin-Basen-Editoren bei optimal positionierten Zielbasen ein höheres Maß an Editing erreichen können als PE2 oder PE3, dass aber Prime-Editing das Editing von Basen bei nicht optimal positionierten Zielbasen übertreffen kann und bei mehreren editierbaren Basen eine viel höhere Präzision erreicht.
  • Das A·T-zu-G·C-Editing wurde an zwei genomischen Loci durch eine optimierte Nicht-Nicking-ABE (ABEmax152 mit einer dCas9- statt einer Cas9-Nickase, im Folgenden ABEdmax genannt) im Vergleich zu PE2 und durch den optimierten Nicking-Adeninbasen- Editor ABEmax im Vergleich zu PE3 verglichen. An einer Stelle, die zwei Zieladenine im Basen-Editing-Fenster enthält (HEK3), waren ABEs effizienter als PE2 oder PE3 für die Umwandlung von A5, aber PE3 war effizienter für die Umwandlung von A8, das am Rand des Editing-Fensters von ABEmax liegt (42D). Beim Vergleich der Effizienz von Präzisions- Edits, bei denen nur ein einziges Adenin umgewandelt wird, schnitt PE3 sowohl bei A5 als auch bei A8 besser ab als ABEmax (42E). Insgesamt produzierten ABEs bei HEK3 weit weniger Indels als Prime-Editoren (0,19±0,02 % für ABEdmax gegenüber 1,5±0,46 % für PE2 und 0,53±0,16 % für ABEmax gegenüber 11±2,3 % für PE3, 42F). Bei FANCF, bei dem nur ein einziges A innerhalb des Basen-Editing-Fensters vorhanden ist, übertrafen ABE2 und ABEmax ihre Prime-Editing-Pendants bei der Gesamtumwandlung der Zielbasenpaare um das 1,8- bis 2,9-fache, wobei praktisch alle editierten Produkte sowohl aus dem Basen-Editing als auch aus dem Prime-Editing nur den präzisen Edit enthielten (42D-42E). Wie bei der HEK3-Stelle erzeugten die ABEs auch an der FANCF-Stelle weit weniger Indels (42F).
  • Insgesamt deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass Basen-Editing und Prime-Editing komplementäre Stärken und Schwächen bei der Durchführung gezielter Übergangsmutationen aufweisen. In Fällen, in denen ein einzelnes Zielnukleotid innerhalb des Basen-Editing- Fensters vorhanden ist, oder wenn Bystander-Edits akzeptabel sind, sind die aktuellen Basen- Editoren in der Regel effizienter und führen zu weniger Indels als Prime-Editoren. Wenn mehrere Cytosine oder Adenine vorhanden sind und Bystander-Editing unerwünscht ist, oder wenn die Zielbasen für das Basen-Editing im Vergleich zu den verfügbaren PAMs schlecht positioniert sind, bieten Prime-Editoren erhebliche Vorteile.
  • Off-Target-Prime-Editing
  • Für ein produktives Editing erfordert Prime-Editing eine Komplementarität von Ziel- Locus:PEgRNA-Spacer, damit die Cas9-Domäne binden kann, eine Komplementarität von Ziel-Locus:PEgRNA-PBS, damit die PEgRNA-geprimte reverse Transkription initiiert werden kann, und eine Komplementarität von Ziel-Locus:Produkt der reversen Transkriptase für die Flap-Auflösung. Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass diese drei unterschiedlichen Anforderungen an die DNA-Hybridisierung das Off-Target-Prime-Editing im Vergleich zu anderen Verfahren des Genom-Editing minimieren könnten. Um diese Möglichkeit zu testen, wurden HEK293T-Zellen mit PE3 oder PE2 und insgesamt 16 PEgRNAs behandelt, die so ausgestaltet wurden, dass sie auf vier genomische Ziel-Loci zielen, mit Cas9 und den vier entsprechenden sgRNAs, die auf dieselben Protospacer zielen, oder mit Cas9 und denselben 16 PEgRNAs. Diese vier Ziel-Loci wurden ausgewählt, weil jeder mindestens vier gut charakterisierte Off-Target-Stellen aufweist, für die Cas9 und die entsprechende On-TargetsgRNA in HEK293T-Zellen bekanntermaßen erhebliche Off-Target-DNA-Veränderungen verursachen118,159. Nach der Behandlung wurden die vier On-Target-Loci und die vier bekanntesten Off-Target-Stellen von Cas9 für jeden On-Target-Spacer sequenziert, was insgesamt 16 Off-Target-Stellen ergibt (Tabelle 1).
  • In Übereinstimmung mit früheren Studien118 modifizierten Cas9 und die vier ZielsgRNAs alle 16 der zuvor berichteten Off-Target-Loci (42G). Die Effizienz der Cas9- Off-Target-Modifikation an den vier Off-Target-Stellen für den HEK3-Ziel-Locus lag bei durchschnittlich 16 %. Cas9 und die auf HEK4 abzielende sgRNA führten zu einer durchschnittlichen Modifikation von 60 % der vier getesteten bekannten Off-Target-Stellen. Ebenso wurden die Off-Target-Stellen für EMX1 und FANCF durch Cas9:sgRNA mit einer durchschnittlichen Häufigkeit von 48 % bzw. 4,3 % modifiziert (42G). Es wurde festgestellt, dass PEgRNAs mit Cas9-Nuklease im Vergleich zu sgRNAs im Durchschnitt On- Target-Stellen mit ähnlicher (1- bis 1,5-fach geringerer) Effizienz modifizierten, während PEgRNAs mit Cas9-Nuklease Off-Target-Stellen mit einer ~4-fach geringeren durchschnittlichen Effizienz als sgRNAs modifizierten.
  • Auffallend ist, dass PE3 oder PE2 mit denselben 16 getesteten PEgRNAs, die diese vier Zielspacer enthalten, zu einem wesentlich geringeren Off-Target-Editing führten (42H). Von den 16 Stellen, von denen bekannt ist, dass sie durch Cas9+sgRNA einem Off-Target- Editing unterzogen werden, führten PE3+PEgRNAs oder PE2+PEgRNAs nur an 3 von 16 Off- Target-Stellen zu einem nachweisbaren Off-Target-Prime-Editing, wobei nur 1 von 16 Stellen eine Off-Target-Editing-Effizienz von ≥1 % aufwies (42H). Das durchschnittliche Off- Target-Prime-Editing für die PEgRNAs, die auf HEK3, HEK4, EMX1 und FANCF an diesen 16 bekannten Cas9-Off-Target-Stellen abzielten, betrug <0,1 %, <2,2±5,2 %, <0,1 % bzw. <0,13±0,11 % (42H). Bemerkenswerterweise führt PE2+PEgRNAl an der HEK4 Off- Target-3-Stelle, die Cas9+PEgRNA1 mit 97 % Effizienz editiert, zu einem Off-Target-Editing von nur 0,7 %, obwohl sie dieselbe Spacer-Sequenz teilen was zeigt, wie die zwei zusätzlichen DNA-Hybridisierungsereignisse, die für das Prime-Editing im Vergleich zum Cas9-Editing erforderlich sind, das Off-Target-Editing erheblich reduzieren können. Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass PE3 und PEgRNAs ein viel geringeres Off-Target- DNA-Editing in humanen Zellen induzieren als Cas9 und sgRNAs, die auf dieselben Protospacer abzielen.
  • Die reverse Transkription von 3'-verlängerten PEgRNAs kann im Prinzip in das Leit- RNA-Gerüst erfolgen. Wenn der resultierende 3'-Flap trotz fehlender Komplementarität an seinem 3'-Ende mit dem uneditierten DNA-Strang in den Ziel-Locus eingebaut wird, führt dies zum Einfügen von PEgRNA-Gerüstnukleotiden, die zur Indel-Häufigkeit beitragen. Wir analysierten die Sequenzierungsdaten von 66 PE3-vermittelten Editing-Experimenten an vier Loci in HEK293T-Zellen und beobachteten eine geringe Häufigkeit der PEgRNA- Gerüstinsertion, im Durchschnitt 1,7±1,5 % Gesamtinsertion einer beliebigen Anzahl von PEgRNA-Gerüstnukleotiden (56A-56D). Es wird spekuliert, dass die Unzugänglichkeit des Leit-RNA-Gerüsts für die reverse Transkriptase aufgrund der Bindung der Cas9-Domäne sowie die zelluläre Exzision während der Flap-Auflösung des fehlangepassten 3'-Endes des 3'- Flaps, die aus der reversen Transkription des PEgRNA-Gerüsts resultiert, Produkte minimiert, die PEgRNA-Gerüstnukleotide einschließen. Obwohl solche Ereignisse selten sind, könnten künftige Bemühungen um die Entwicklung von PEgRNAs oder Prime-Editor-Proteinen, die den Einbau von PEgRNA-Gerüsten minimieren, die Häufigkeit von Indels weiter verringern.
  • Deaminasen in einigen Basen-Editoren können Cas9-unabhängig agieren, was zu geringem, aber weit verbreitetem Off-Target-DNA-Editing bei CBEs der ersten Generation (aber nicht bei ABEs)160-162 und Off-Target-RNA-Editing bei CBEs und ABEs der ersten Generation163-165 führt, obwohl neuere CBE- und ABE-Varianten mit konstruierten Deaminasen das Cas9-unabhängige Off-Target-DNA- und RNA-Editing stark reduzieren163-165. Prime-Editoren verfügen nicht über Enzyme zur Basenmodifikation wie Deaminasen und weisen daher keine inhärente Fähigkeit auf, DNA- oder RNA-Basen auf eine Cas9- unabhängige Weise zu modifizieren.
  • Während die Reverse-Transkriptase-Domäne in Prime-Editoren prinzipiell in der Lage wäre, ordnungsgemäß geprimte RNA- oder DNA-Template in Zellen zu verarbeiten, wurde festgestellt, dass Retrotransposons wie die der LINE-1-Familie166, endogene Retroviren167,168 und die humane Telomerase alle aktive endogene humane reverse Transkriptasen bereitstellen. Ihr natürliches Vorhandensein in humanen Zellen lässt darauf schließen, dass die Aktivität der reversen Transkriptase selbst nicht wesentlich toxisch ist. In der Tat wurden keine PE3- abhängigen Unterschiede in der Lebensfähigkeit von HEK293T-Zellen im Vergleich zu Kontrollen beobachtet, die dCas9, Cas9-H840A-Nickase oder PE2 mit R110S+K103L (PE2- dRT) Mutationen exprimieren, die die reverse Transkriptase inaktivieren169 (49A-49B).
  • Ungeachtet der oben genannten Daten und Analysen sind weitere Studien erforderlich, um Off-Target-Prime-Editing auf unvoreingenommene, genomweite Weise zu bewerten und das Ausmaß zu charakterisieren, in dem die Varianten der reversen Transkriptase in Prime- Editoren oder Prime-Editing-Zwischenprodukten Zellen beeinträchtigen können.
  • Prime-Editing-pathogene Transversions-, Insertions- und Deletionsmutationen in humanen Zellen
  • Die Fähigkeit von PE3, in humanen Zellen Transversions-, kleine Insertions- und kleine Deletionsmutationen, die genetische Krankheiten verursachen, direkt einzubauen oder zu korrigieren, wurde getestet. Die Sichelzellenkrankheit wird am häufigsten durch eine A·T-zu- T·A-Transversionsmutation in HBB verursacht, die zu der Mutation Glu6->Val in Beta-Globin führt. Die Behandlung hämatopoetischer Stammzellen ex vivo mit Cas9-Nuklease und eines Donor-DNA-Templats für HDR, gefolgt von der Anreicherung der editierten Zellen, Transplantation und Verpflanzung ist eine vielversprechende potenzielle Strategie für die Behandlung der Sichelzellkrankheit170. Allerdings werden bei diesem Ansatz neben dem korrekt editierten HBB-Allel immer noch viele Indel-haltige Nebenprodukte erzeugt170-171. Obwohl Editoren im Allgemeinen weit weniger Indels erzeugen, können sie derzeit nicht die T·A-zu-A·T-Transversionsmutation durchführen, die zur direkten Wiederherstellung der normalen Sequenz von HBB erforderlich ist.
  • PE3 wurde verwendet, um die HBB-E6V-Mutation in HEK293T-Zellen mit 44 % Effizienz und 4,8 % Indels einzubauen (43A). Aus der Mischung der PE3-behandelten Zellen isolierten wir sechs HEK293T-Zelllinien, die homozygot (triploid) für das HBB E6V- Allel sind (53A-53D), was die Fähigkeit des Prime-Editing zur Erzeugung von humanen Zelllinien mit pathogenen Mutationen belegt. Um das HBB E6V-Allel zu Wildtyp-HBB zu korrigieren, behandelten wir homozygote HBB E6V HEK293T-Zellen mit PE3 und einer PEgRNA, die so programmiert ist, dass sie die HBB E6V-Mutation direkt in Wildtyp-HBB umwandelt. Insgesamt wurden 14 PEgRNA-Ausgestaltungen getestet. Nach drei Tagen ergab die DNA-Sequenzierung, dass alle 14 PEgRNAs in Kombination mit PE3 zu einer effizienten Korrektur von HBB E6V zu Wildtyp-HBB führten (≥26 % Wildtyp-HBB ohne Indels), wobei die Indel-Werte im Durchschnitt 2,8±0,70 % betrugen (50A). Die beste PEgRNA führte zu einer 52%igen Korrektur von HBB E6V zu Wildtyp bei 2,4 % Indels (43A). Die Einführung einer stillen Mutation, die die von der PEgRNA erkannte PAM modifiziert, verbesserte die Editing-Effizienz und die Produktreinheit geringfügig auf 58 % Korrektur bei 1,4 % Indels (43A). Diese Ergebnisse belegen, dass durch Prime-Editing eine pathogene Transversionspunktmutation in einer humanen Zelllinie mit hoher Effizienz und minimalen Nebenprodukten eingebaut und korrigiert werden kann.
  • Die Tay-Sachs-Krankheit wird am häufigsten durch eine 4-bp-Insertion in das HEXA- Gen (HEXA 1278+TATC)136 verursacht. PE3 wurde verwendet, um diese 4-bp-Insertion mit 31 % Effizienz und 0,8 % Indels in HEK293T-Zellen einzubauen (43B) und isolierte zwei HEK293T-Zelllinien, die homozygot für das HEXA 1278+TATC-Allel sind (53A-53D). Diese Zellen wurden verwendet, um 43 PEgRNAs und drei Nicking-sgRNAs mit PE3- oder PE3b-Systemen zur Korrektur der pathogenen Insertion in HEXA zu testen (50B), entweder durch perfekte Reversion zum Wildtyp-Allel oder durch eine verschobene 4-bp- Deletion, die die PAM unterbricht und eine stille Mutation einführt. Neunzehn der 43 getesteten PEgRNAs führten zu einem Editing von ≥20 %. Die perfekte Korrektur zu Wildtyp- HEXA mit PE3 oder PE3b und der besten PEgRNA verlief mit ähnlichen durchschnittlichen Effizienzen (30 % für PE3 gegenüber 33 % für PE3b), jedoch ging das PE3b-System mit 5,3- mal weniger Indel-Produkten einher (1,7 % für PE3 gegenüber 0,32 % für PE3b) (43B und 50B). Diese Ergebnisse zeigen, dass das Prime-Editing in der Lage ist, präzise kleine Insertionen und Deletionen vorzunehmen, die ein pathogenes Allel in Säugetierzellen effizient und mit einem Minimum an Nebenprodukten einbauen oder korrigieren.
  • Schließlich wurde der Einbau eines schützenden SNP in PRNP, das Gen, das das humane Prionprotein (PrP) kodiert, getestet. Die Fehlfaltung von PrP verursacht eine fortschreitende und tödliche neurodegenerative Prionenkrankheit, die spontan durch vererbte dominante Mutationen im PRNP-Gen oder durch Exposition gegenüber fehlgefaltetem PrP172 entstehen kann. Ein natürlich vorkommendes PRNP-G127V-Mutationsallel verleiht Menschen138 und Mäusen173 eine Resistenz gegen die Prionenkrankheit. PE3 wurde verwendet, um G127V in das humane PRNP-Allel in HEK293T-Zellen einzubauen, was eine G·C-zu- T·A-Transversion erfordert. Vier PEgRNAs und drei Nicking-sgRNAs wurden mit dem PE3- System bewertet. Nach dreitägiger Exposition mit der effektivsten PE3- und PEgRNA zeigte die DNA-Sequenzierung eine Effizienz von 53±11 % bei dem Einbau der G127V-Mutation und Indel-Werte von 1,7±0,7 % (43C). Zusammengenommen belegen diese Ergebnisse die Fähigkeit des Prime-Editing in humanen Zellen, Transversions-, Insertions- oder Deletionsmutationen, die eine Krankheit verursachen oder eine Resistenz gegen diese verleihen, effizient und mit einem Minimum an Nebenprodukten einzubauen oder zu korrigieren.
  • Prime-Editing in verschiedenen humanen Zelllinien und primären Mausneuronen
  • Als nächstes wurde das Prime-Editing auf seine Fähigkeit zum Editieren endogener Stellen in drei weiteren humanen Zelllinien getestet. In K562-Zellen (leukämisches Knochenmark) wurde PE3 verwendet, um Edits mit Transversionen an den HEK3-, EMX1- und FANCF-Stellen auszuführen, ebenso wie die 18-bp-Insertion eines 6xHis-Tags in HEK3. Bei jedem dieser vier PE3-vermittelten Edits wurde eine durchschnittliche Editing-Effizienz von 15-30 % beobachtet, wobei die Indels im Durchschnitt 0,85-2,2 % betrugen (43A). In U2OS-Zellen (Osteosarkom) wurden Transversionsmutationen in HEK3 und FANCF sowie eine 3-bp-Insertion und eine 6xHis-Tag-Insertion in HEK3 mit einer Editing-Effizienz von 7,9-22 % eingebaut, die die Indel-Bildung um das 10- bis 76-fache überstieg (43A). Schließlich wurde in HeLa-Zellen (Gebärmutterhalskrebs) eine 3-bp-Insertion in HEK3 mit einer durchschnittlichen Effizienz von 12 % und 1,3 % Indels ausgeführt (43A). Insgesamt deuten diese Daten darauf hin, dass mehrere Zelllinien über HEK293T-Zellen hinaus das Prime-Editing unterstützen, obwohl die Editing-Effizienzen je nach Zelltyp variieren und im Allgemeinen weniger effizient sind als in HEK293T-Zellen. Das Editing:Indel-Verhältnis blieb in allen getesteten humanen Zelllinien hoch.
  • Um zu bestimmen, ob Prime-Editing in post-mitotischen, terminal differenzierten primären Zellen möglich ist, wurden primäre kortikale Neuronen aus E18,5-Mäusen mit einem Dual-Split-PE3-Lentiviralverabreichungssystem transduziert, bei dem Split-Intein-Splicing203 das PE2-Protein aus N-terminalen und C-terminalen Hälften rekonstituiert, die jeweils von einem separaten Virus eingeschleust werden. Um das Editing auf post-mitotische Neuronen zu beschränken, wurde der humane Synapsin-Promotor, der hochspezifisch für reife Neuronen204 ist, für die Exprimierung beider PE2-Protein-Komponenten verwendet. GFP wurde durch ein selbstspaltendes P2A-Peptid205 mit der N-terminalen Hälfte von PE2 fusioniert. Kerne von Neuronen wurden zwei Wochen nach der dualen viralen Transduktion isoliert und direkt sequenziert oder vor der Sequenzierung für GFP-Exprimierung sortiert. Ein durchschnittliches Prime-Editing von 7,1±1,2 % zum Einbau einer Transversion am DNMT1-Locus mit durchschnittlich 0,58±0,14 % Indels in sortierten Kernen (43D) wurde beobachtet. Die Cas9-Nuklease in demselben Split-Intein-Dual-Lentivirus-System führte zu 31±5,5 % Indels in sortierten kortikalen Neuronenkernen (43D). Diese Daten weisen darauf hin, dass post- mitotische, terminal differenzierte Primärzellen Prime-Editing unterstützen können, und belegen somit, dass Prime-Editing keine Zellreplikation erfordert.
  • Prime-Editing im Vergleich zu Cas9-initiiertem HDR
  • Die Leistung von PE3 wurde mit der des optimierten Cas9-initiierten HDR128,125 in mitotischen Zelllinien, die HDR128 unterstützen, verglichen. HEK293T-, HeLa-, K562- und U2OS-Zellen wurden mit Cas9-Nuklease, einer sgRNA und einem ssDNA-Donor- Oligonukleotid-Templat behandelt, das so entworfen wurde, dass es eine Vielzahl von Transversions- und Insertions-Editings ermöglicht (43E-43G und 51A-51F). Cas9- initiierte HDR führte in allen Fällen erfolgreich das gewünschte Editing durch, allerdings mit einem weitaus höheren Anteil an Nebenprodukten (vorwiegend Indels), wie bei Behandlungen, die doppelsträngige Brüche verursachen, zu erwarten. Bei der Verwendung von PE3 in HEK293T-Zellen verlief der Einbau und die Korrektur von HBB E6V mit einer durchschnittlichen Editing-Effizienz von 42 % bzw. 58 % bei durchschnittlich 2,6 % bzw. 1,4 % Indels (43E und 43G). Im Gegensatz dazu führten die gleichen Edits mit der Cas9-Nuklease und einem HDR-Templat zu einer durchschnittlichen Editing-Effizienz von 5,2 % und 6,7 % bei einer durchschnittlichen Indel-Häufigkeit von 79 % und 51 % (43E und 43G). In ähnlicher Weise baute PE3 PRNP-G127V mit 53 % Effizienz und 1,7 % Indels ein, während Cas9-initiierte HDR diese Mutation mit 6,9 % Effizienz und 53 % Indels einbaute (43E und 43G). So war das Verhältnis von Editing:Indels für den Einbau von HBB-E6V, die Korrektur von HBB-E6V und den Einbau von PRNP-G127V im Durchschnitt 270-mal höher für PE3 als für Cas9-initiierte HDR.
  • Vergleiche zwischen PE3 und HDR in anderen humanen Zelllinien als HEK293T zeigten ähnliche Ergebnisse, wenn auch mit niedrigeren PE3-Editing-Effizienzen. Zum Beispiel verlief in K562-Zellen die PE3-vermittelte 3-bp-Insertion in HEK3 mit 25 % Effizienz und 2,8 % Indels, verglichen mit 17 % Editing und 72 % Indels bei Cas9-initiierter HDR, ein 40-faches Editing:Indel-Verhältnis zugunsten von PE3 (43F-43G). In U2OS-Zellen führte PE3 diese 3-bp-Insertion mit 22 % Effizienz und 2,2 % Indels aus, während Cas9- initiierte HDR zu 15 % Editing und 74 % Indels führte, was einem 49-fach niedrigeren Editing:Indel-Verhältnis entspricht (43F-43G). In HeLa-Zellen führte PE3 diese Insertion mit einer Effizienz von 12 % und 1,3 % Indels durch, gegenüber 3,0 % Editing und 69 % Indels bei Cas9-initiierter HDR, was einem 210-fachen Unterschied im Editing:Indel-Verhältnis entspricht (43F-43G). Insgesamt zeigten diese Daten, dass HDR in den vier getesteten Zelllinien typischerweise zu ähnlichen oder niedrigeren Editing-Effizienzen und weit höheren Indels als PE3 führt (51A-51F).
  • Erörterung und zukünftige Richtungen
  • Die Fähigkeit, DNA-Sequenzen mit einer Präzision von einem einzigen Nukleotid einzufügen, ist eine besonders wichtige Fähigkeit des Prime-Editing. Zum Beispiel wurde PE3 verwendet, um in HEK293T-Zellen ein His6-Tag (18 bp, 65 % durchschnittliche Effizienz), ein FLAG-Epitop-Tag (24 bp, 18 % durchschnittliche Effizienz) und eine verlängerte LoxP-Stelle (44 bp, 23 % durchschnittliche Effizienz), die das native Substrat für die Cre-Rekombinase ist, präzise in den HEK3-Locus einzufügen. Die durchschnittlichen Indels lagen bei diesen Beispielen zwischen 3,0 % und 5,9 % (43H). Die Fähigkeit, neue DNA-Sequenzen effizient und präzise in die Zielstellen von Interesse in lebenden Zellen einzubringen, wird voraussichtlich zahlreiche biotechnologische, synthetische biologische und therapeutische Anwendungen ermöglichen.
  • Insgesamt wurden bei den hierin beschriebenen Prime-Editing-Experimenten 18 Insertionen bis zu 44 bp, 22 Deletionen bis zu 80 bp, 113 Punktmutationen, einschließlich 77 Transversionen, und 18 kombinierte Edits an 12 endogenen Loci im Human- und Mausgenom an Stellen zwischen 3 bp stromaufwärts und 29 bp stromabwärts vom Beginn einer PAM durchgeführt, ohne dass dabei explizite doppelsträngige DNA-Brüche entstanden. Diese Ergebnisse machen das Prime-Editing zu einem bemerkenswert vielseitigen Verfahren des Genom-Editing. Da die überwältigende Mehrheit (85-99 %) der Insertionen, Deletionen, Indels und Duplikationen in ClinVar ≤30 bp sind (52A-52D), kann Prime-Editing im Prinzip bis zu ~89 % der 75.122 derzeit bekannten pathogenen humanen genetischen Varianten in ClinVar korrigieren (Transitionen, Transversionen, Insertionen, Deletionen, Indels und Duplikationen in 38A), mit zusätzlichem Potenzial zur Verbesserung von Krankheiten, die durch Kopienzahlzuwachs oder -verlust verursacht werden.
  • Wie hierin ausführlich dargelegt, bietet die Flexibilität des Prime-Editing für jeden gewünschten Edit viele Wahlmöglichkeiten in Bezug auf PEgRNA-induzierte Nick-Orte, sgRNA-induzierte Zweitstrang-Nick-Orte, PBS-Längen, RT-Templat-Längen und den zuerst zu editierenden Strang. Diese Flexibilität, die im Gegensatz zu den begrenzteren Optionen steht, die typischerweise für andere Präzisions-Genom-Editing-Verfahren125,142,154 zur Verfügung stehen, ermöglicht es, die Editing-Effizienz, die Produktreinheit, die DNA- Spezifität oder andere Parameter zu optimieren, um den Bedürfnissen einer bestimmten Anwendung gerecht zu werden, wie in 50A-50B gezeigt, in denen das Testen von 14 und 43 PEgRNAs, die eine Reihe von Prime-Editing-Strategien abdecken, die Korrektur von pathogenen HBB- bzw. HEXA-Allelen optimiert.
  • Um das Prime-Editing weiter zu verstehen und zu verbessern, sind noch viel zusätzliche Forschung erforderlich. Zusätzliche Modifikationen von Prime-Editor-Systemen könnten erforderlich sein, um ihre Kompatibilität auf andere Zelltypen, wie post-mitotische Zellen, zu erweitern. Die Verknüpfung von Prime-Editing mit viralen und nicht-viralen In-vitro- und Invivo-Einschleusungsstrategien ist erforderlich, um das Potenzial von Prime-Editing für eine breite Palette von Anwendungen, die die Erforschung und Behandlung genetischer Krankheiten beinhalten, voll auszuschöpfen. Durch das Ermöglichen hochpräziser gezielter Übergänge, Transversionen, kleiner Insertionen und kleiner Deletionen im Genom von Säugetierzellen ohne Doppelstrangbrüche oder HDR stellt das Prime-Editing jedoch eine neue „Suchen-und Ersetzen“-Funktion bereit, die den Anwendungsbereich des Genom-Editings erheblich erweitert.
  • Verfahren
  • Allgemeine Verfahren
  • Die DNA-Amplifikation erfolgte durch PCR unter Verwendung von Phusion U Green Multiplex PCR Master Mix (ThermoFisher Scientific) oder Q5 Hot Start High-Fidelity 2x Master Mix (New England BioLabs), sofern nicht anders angegeben. DNA-Oligonukleotide, einschließlich Cy5-markierter DNA-Oligonukleotide, dCas9-Protein und Cas9 H840A-Protein wurden von Integrated DNA Technologies bezogen. Die Hefe-Reporterplasmide wurden von zuvor beschriebenen Plasmiden64 abgeleitet und nach dem Gibson-Assembly-Verfahren kloniert. Alle hierin verwendeten Editoren-Plasmide für Säugetiere wurden mit dem USER- Klonierungsverfahren wie zuvor beschrieben175 zusammengebaut. Plasmide, die sgRNAs exprimieren, wurden durch Ligation von annealisierten Oligonukleotiden in einen BsmBIverdauten Akzeptor-Vektor konstruiert. Plasmide, die PEgRNAs exprimieren, wurden nach Gibson-Assembly oder Golden-Gate-Assembly unter Verwendung eines benutzerdefinierten Akzeptor-Plasmids konstruiert (siehe ergänzende Skizze „Golden-Gate-Assembly“). Die Sequenzen der hierin verwendeten sgRNA- und PEgRNA-Konstrukte sind in den Tabellen 2A- 2C und 3A-3R aufgeführt. Alle Vektoren für Experimente mit Säugetierzellen wurden mit Plasmid-Plus-Midiprep-Kits (Qiagen) oder PureYield-Plasmid-Miniprep-Kits (Promega) gereinigt, die Schritte zur Endotoxinentfernung beinhalten. Alle Experimente, bei denen lebende Tiere verwendet wurden, wurden vom Broad Institute Institutional and Animal Care and Use Committees genehmigt. Wildtyp-C57BL/6-Mäuse wurden von Charles River (Nr. 027) bezogen.
  • Biochemische In-vitro-Tests
  • PEgRNAs und sgRNAs wurden in vitro mit dem HiScribe-T7-in-vitro- Transkriptionskit (New England Biolabs) aus PCR-amplifizierten Templaten, die eine T7- Promotorsequenz enthalten, transkribiert. Die RNA wurde durch denaturierende Hamstoff- PAGE gereinigt und die Qualität vor der Verwendung durch ein analytisches Gel bestätigt. 5'- Cy5-markierte DNA-Duplex-Substrate wurden unter Verwendung von zwei Oligonukleotiden (Cy5-AVA024 und AVA025; Verhältnis 1:1,1) für das nicht genickte Substrat oder von drei Oligonukleotiden (Cy5-AVA023, AVA025 und AVA026; Verhältnis 1:1,1:1,1) für das vorgenickte Substrat annealisiert, indem sie 3 Minuten lang auf 95 °C erhitzt und anschließend langsam auf Raumtemperatur abgekühlt wurden (Tabellen 2A-2C). Die Cas9-Spaltung und die Reaktionen zur reversen Transkription wurden in 1x-Spaltungspuffer205 mit dNTPs (20 mM HEPES-K, pH 7,5; 100 mM KCl; 5 % Glycerin; 0,2 mM EDTA, pH 8,0; 3 mM MgCl2; 0,5 mM dNTP-Mix; 5 mM DTT) durchgeführt. dCas9 oder Cas9 H840A (5 µM final) und die sgRNA oder PEgRNA (5 µM final) wurden vor der Zugabe von Duplex-DNA-Substrat (400 nM final) 10 Minuten lang bei Raumtemperatur in einer 5-µl-Reaktionsmischung inkubiert, gefolgt von der Zugabe von Superscript-III-Reverse-Transkriptase (ThermoFisher Scientific), gegebenenfalls einer nicht angegebenen M-MLV-RT-Variante. Die Reaktionen wurden 1 Stunde lang bei 37 °C durchgeführt, dann mit Wasser auf ein Volumen von 10 µl verdünnt, mit 0,2 µl Proteinase-K-Lösung (20 mg/ml, ThermoFisher Scientific) behandelt und 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Nach einer 10-minütigen Hitzeinaktivierung bei 95 °C wurden die Reaktionsprodukte mit 2x Formamid-Gel-Ladepuffer (90 % Formamid; 10 % Glycerin; 0,01 % Bromphenolblau) versetzt, 5 Minuten lang bei 95 °C denaturiert und durch ein denaturierendes Hamstoff-PAGE-Gel (15 % TBE-Harnstoff, 55 °C, 200 V) getrennt. Die DNA-Produkte wurden durch ein Cy5-Fluoreszenzsignal mit einem Typhoon-FLA-7000- Biomolekularimager sichtbar gemacht.
  • Elektrophoretische Mobilitätsverschiebungstests wurden in 1x Bindungspuffer (1x Spaltpuffer + 10 µg/ml Heparin) mit vorinkubierten dCas9:sgRNA- oder dCas9:PEgRNA- Komplexen (Konzentrationsbereich zwischen 5 nM und 1 µM final) und Cy5-markierter Duplex-DNA (Cy5- AVA024 und AVA025; 20 nM final) durchgeführt. Nach einer 15- minütigen Inkubation bei 37 °C wurden die Samples mittels nativem PAGE-Gel (10 % TBE) analysiert und auf Cy5-Fluoreszenz abgebildet.
  • Für die DNA-Sequenzierung der Produkte der reversen Transkription wurden die fluoreszierenden Gruppen aus den Hamstoff-PAGE-Gelen herausgeschnitten und gereinigt und dann gemäß dem Herstellerprotokoll mit terminaler Transferase (TdT; New England Biolabs) in Gegenwart von dGTP oder dATP 3'-verkettet. Die verkürzten DNA-Produkte wurden 10-fach mit Bindungspuffer (40 % gesättigtes wässriges Guanidiniumchlorid + 60 % Isopropanol) verdünnt und mit der QIAquick-Spin-Säule (Qiagen) gereinigt. Anschließend wurden sie als Templat für die Primerverlängerung mit Klenow-Fragment (New England Biolabs) unter Verwendung des Primers AVA134 (A-verkettete Produkte) oder AVA135 (G- verkettete Produkte) verwendet (Tabellen 2A-2C). Die Verlängerungen wurden durch PCR für 10 Zyklen mit den Primern AVA110 und AVA122 amplifiziert und dann mit AVA037 nach dem Sanger-Verfahren sequenziert (Tabellen 2A-2C).
  • Hefe-Fluoreszenz-Reporter-Tests
  • Dual-fluoreszierende Reporterplasmide, die ein In-Frame-Stopcodon, einen +1 Frameshift oder einen -1 Frameshift enthielten, wurden in vitro wie oben beschrieben 5'- verlängerten PEgRNA- oder 3'-verlängerten PEgRNA Prime-Editing-Reaktionen unterzogen. Nach einstündiger Inkubation bei 37 °C wurden die Reaktionen mit Wasser verdünnt und die Plasmid-DNA mit 0,3 M Natriumacetat und 70 % Ethanol ausgefällt. Die resuspendierte DNA wurde wie zuvor beschrieben67 durch Elektroporation in S. cerevisiae transformiert und auf synthetischen Komplettmedien ohne Leucin (SC(Glucose), L-) ausgebracht. Die GFP- und mCherry-Fluoreszenzsignale wurden von den Kolonien mit dem biomolekularen Imager Typhoon FLA 7000 sichtbar gemacht.
  • Allgemeine Säugetier-Zellkulturbedingungen
  • HEK293T- (ATCC CRL-3216), U2OS- (ATTC HTB-96), K562- (CCL-243) und HeLa- (CCL-2) Zellen wurden von ATCC erworben und in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) plus GlutaMAX (ThermoFisher Scientific), McCoy's 5A-Medium (Gibco), RPMI-Medium-1640 plus GlutaMAX (Gibco) oder Eagle's Minimal-Essential-Medium (EMEM, ATCC) kultiviert und weitergegeben, jeweils ergänzt mit 10 % (v/v) fötalem Rinderserum (Gibco, qualifiziert) und 1x Penicillin-Streptomycin (Corning). Alle Zelltypen wurden bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert, gehalten und kultiviert. Die Zelllinien wurden von ihren jeweiligen Lieferanten authentifiziert und negativ auf Mykoplasmen getestet.
  • HEK293T-Transfektionsprotokoll für Gewebekulturen und Präparation genomischer DNA
  • Gezüchtete HEK293T-Zellen wurden auf mit Poly-D-Lysin beschichteten 48-Well- Platten (Corning) ausgesät. 16 bis 24 Stunden nach der Aussaat wurden die Zellen bei etwa 60 % Konfluenz mit 1 µl Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher Scientific) gemäß den Herstellerprotokollen und 750 ng PE-Plasmid, 250 ng PEgRNA-Plasmid und 83 ng sgRNA- Plasmid (für PE3 und PE3b) transfiziert. Sofern nicht anders angegeben, wurden die Zellen drei Tage nach der Transfektion kultiviert. Danach wurde das Medium entfernt, die Zellen wurden mit 1x PBS-Lösung (Thermo Fisher Scientific) gewaschen, und die genomische DNA wurde durch Zugabe von 150 µl frisch hergestelltem Lysepuffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,5; 0,05 % SDS; 25 µg/ml Proteinase K (Thermo Fisher Scientific)) direkt in jedes Well der Gewebekulturplatte extrahiert. Die genomische DNA-Mischung wurde 1 bis 2 Stunden lang bei 37 °C inkubiert, gefolgt von einem 30-minütigen Enzym-Inaktivierungsschritt bei 80 °C. Die für die Amplifikation genomischer Säugetierzell-DNA verwendeten Primer sind in Tabelle 4 aufgeführt. Für HDR-Experimente in HEK293T-Zellen wurden 231 ng Nuklease- Exprimierungsplasmid, 69 ng sgRNA-Exprimierungsplasmid, 50 ng (1,51 pmol) 100-nt ssDNA-Donor-Templat (PAGE-gereinigt; Integrated DNA Technologies) mit 1,4 µl Lipofectamine 2000 (ThermoFisher) pro Well lipofiziert. Genomische DNA aus allen HDR- Experimenten wurde gemäß dem Herstellerprotokoll mit dem Agencourt-DNAdvance-Kit (Beckman Coulter) aufgereinigt.
  • Hochdurchsatz-DNA-Sequenzierung von genomischen DNA-Samples
  • Genomische Stellen von Interesse wurden aus genomischen DNA-Samples amplifiziert und auf einem Illumina MiSeq sequenziert, wie zuvor mit den folgenden Änderungen beschrieben129,130. Kurz gesagt, Amplifikationsprimer, die Illumina-Vorwärts- und Rückwärtsadapter (Tabelle 4) enthalten, wurden für eine erste Runde der PCR (PCR 1) verwendet, die die genomische Region von Interesse amplifiziert. 25 µl PCR 1-Reaktionen wurden mit 0,5 µM von jedem Vorwärts- und Rückwärtsprimer, 1 µl genomischem DNA- Extrakt und 12,5 µl Phusion-U-Green-Multiplex-PCR-Master-Mix ausgeführt. Die PCR- Reaktionen wurden wie folgt durchgeführt: 98 °C für 2 Minuten, dann 30 Zyklen [98 °C für 10 Sekunden, 61 °C für 20 Sekunden und 72 °C für 30 Sekunden], gefolgt von einer abschließenden 72 °C-Verlängerung für 2 Minuten. Jedes Sample wurde in einer sekundären PCR-Reaktion (PCR 2) mit eindeutigen Illumina-Barcoding-Primerpaaren versetzt. Konkret enthielten 25 µl einer gegebenen PCR 2-Reaktion 0,5 µM jedes eindeutigen Vorwärts- und Rückwärts-Illumina-Barcoding-Primerpaares, 1 µl der ungereinigten PCR 1- Reaktionsmischung und 12,5 µl des Phusion-U-Green-Multiplex-PCR-2x-Master-Mix. Die Barcoding PCR 2-Reaktionen wurden wie folgt durchgeführt: 98 °C für 2 Minuten, dann 12 Zyklen [98 °C für 10 Sekunden, 61 °C für 20 Sekunden und 72 °C für 30 Sekunden], gefolgt von einer abschließenden 72 °C-Verlängerung für 2 Minuten. Die PCR-Produkte wurden analytisch durch Elektrophorese in einem 1,5%igen Agarosegel ausgewertet. PCR-2-Produkte (gepoolt nach gemeinsamen Amplicons) wurden durch Elektrophorese mit einem 1,5%igen Agarosegel unter Verwendung eines QIAquick-Gelextraktionskits (Qiagen) gereinigt und mit 40 µl Wasser eluiert. Die DNA-Konzentration wurde mittels fluorometrischer Quantifizierung (Qubit, ThermoFisher Scientific) oder qPCR (KAPA-Library-Quantification-Kit-Illumina, KAPA Biosystems) gemessen und auf einem Illumina MiSeq-Instrument gemäß den Herstellerprotokollen sequenziert.
  • Die Sequenzierungs-Reads wurden mit MiSeq-Reporter (Illumina) demultiplexiert. Das Alignment der Amplikon-Sequenzen auf eine Referenzsequenz wurde mit CRISPResso2178 ausgeführt. Zur Quantifizierung des Punktmutations-Editings wurde CRISPResso2 im Standardmodus mit eingeschalteter Funktion „discard_indel_reads“ ausgeführt. Die Editing-Effizienz wurde wie folgt berechnet: (Häufigkeit der spezifizierten Punktmutation in nicht verworfenen Reads) x (Anzahl der nicht verworfenen Reads) ÷ Gesamt- Reads. Für Insertion- oder Deletion-Edits wurde CRISPResso2 im HDR-Modus mit dem gewünschten Allel als erwartetem Allel (e-Flag) und mit „discard_indel_reads“ ON ausgeführt. Die Editing-Ausbeute wurde berechnet als die Anzahl der HDR-ausgerichteten Reads geteilt durch die Gesamtanzahl der Reads. Für alle Edits wurde die Indel-Ausbeute als die Anzahl der verworfenen Reads geteilt durch die Gesamtzahl der Reads berechnet.
  • Nukleofektion von U2OS-, K562- und HeLa-Zellen
  • Die Nukleofektion wurde in allen Experimenten mit K562-, HeLa- und U2OS-Zellen ausgeführt. Für PE-Bedingungen in diesen Zelltypen wurden 800 ng Prime-Editor- Exprimierungsplasmid, 200 ng PEgRNA-Exprimierungsplasmid und 83 ng Nicking-Plasmid in einem Endvolumen von 20 µl in einem 16-Well-Nukleoküvettenstreifen (Lonza) nukleoinfiziert. Für HDR-Bedingungen in diesen drei Zelltypen wurden 350 ng Nuklease- Exprimierungsplasmid, 150 ng sgRNA-Exprimierungsplasmid und 200 pmol (6,6 µg) 100-nt ssDNA-Donor-Templat (PAGE-gereinigt; Integrated DNA Technologies) in einem Endvolumen von 20 µl pro Sample in einem 16-Well-Nukleoküvettenstreifen (Lonza) nukleoinfiziert. K562-Zellen wurden gemäß dem Herstellerprotokoll mit dem SF Cell Line 4D- Nucleofector X Kit (Lonza) mit 5 × 105 Zellen pro Sample (Programm FF-120) nukleofiziert. U2OS-Zellen wurden gemäß dem Herstellerprotokoll mit dem SE Cell Line 4D-Nucleofector X Kit (Lonza) mit 3-4 × 105 Zellen pro Sample (Programm DN-100) nukleofiziert. HeLa- Zellen wurden gemäß dem Herstellerprotokoll mit dem SE Cell Line 4D-Nucleofector X Kit (Lonza) mit 2 × 105 Zellen pro Sample (Programm CN-114) nukleofiziert. Die Zellen wurden 72 Stunden nach der Nukleofektion für die Extraktion genomischer DNA geerntet.
  • Extraktion genomischer DNA für HDR-Experimente
  • Genomische DNA aus allen HDR-Vergleichsexperimenten in HEK293T-, HEK293T HBB E6V-, K562-, U2OS- und HeLa-Zellen wurde gemäß dem Herstellerprotokoll mit dem Agencourt DNAdvance Kit (Beckman Coulter) gereinigt.
  • Vergleich zwischen PE2, PE3, BE2, BE4max, ABEdmax und ABEmax
  • HEK293T-Zellen wurden auf mit Poly-D-Lysin beschichteten 48-Well-Platten (Corning) ausgesät. Nach 16 bis 24 Stunden wurden die Zellen bei etwa 60 % Konfluenz transfiziert. Für das Editing von Basen mit CBE- oder ABE-Konstrukten wurden die Zellen mit 750 ng des Basen-Editor-Plasmids, 250 ng des sgRNA-Exprimierungsplasmids und 1 µl Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher Scientific) transfiziert. PE-Transfektionen wurden wie oben beschrieben ausgeführt. Die Extraktion genomischer DNA für PE und BE wurde wie oben beschrieben ausgeführt.
  • Bestimmung der PE3-Aktivität an bekannten Cas9-Off-Target-Stellen
  • Um die Editing-Aktivität von PE3 an bekannten Cas9-Off-Target-Stellen zu bewerten, wurde genomische DNA, die drei Tage nach der Transfektion mit PE3 aus HEK293T-Zellen extrahiert wurde, als Templat für die PCR-Amplifikation von 16 zuvor berichteten genomischen Cas9-Off-Target-Stellen118,159 verwendet (die vier wichtigsten Off-Target- Stellen jeweils für die HEK3-, EMX1-, FANCF- und HEK4-Spacer; Primer-Sequenzen sind in Tabelle 4 aufgeführt). Diese genomischen DNA-Samples waren identisch mit denen, die für die Quantifizierung der On-Target-PE3-Editing-Aktivitäten in den 41A-41K; PEgRNA und Nicking-sgRNA-Sequenzen sind in den Tabellen 3A-3R aufgeführt. Nach der PCR- Amplifikation der Off-Target-Stellen wurden die Amplikons auf der Illumina MiSeq-Plattform wie oben beschrieben sequenziert (HTS-Analyse). Um die On-Target- und Off-Target-Editing- Aktivität von Cas9-Nuklease, Cas9 H840A-Nickase, dCas9 und PE2-dRT zu bestimmen, wurden HEK293T-Zellen mit 750 ng Editor-Plasmid (Cas9-Nuklease, Cas9 H840A-Nickase, dCas9 oder PE2-dRT), 250 ng PEgRNA- oder sgRNA-Plasmid und 1 µl Lipofectamine 2000 transfiziert. Genomische DNA wurde 3 Tage nach der Transfektion wie oben beschrieben aus den Zellen isoliert. Die genomischen On-Target- und Off-Target-Loci wurden mittels PCR unter Verwendung der Primer-Sequenzen in Tabelle 4 amplifiziert und auf einem Illumina MiSeq sequenziert.
  • Die HTS-Datenanalyse wurde mit CRISPResso2178 ausgeführt. Die Editing-Effizienz von Cas9-Nuklease, Cas9 H840A-Nickase und dCas9 wurde als Prozentsatz der gesamten Sequenz-Reads, die Indels enthalten, quantifiziert. Zur Quantifizierung der PE3- und PE3- dRT-Off-Targets wurden die alignierten Sequenzierungs-Reads auf Punktmutationen, Insertionen oder Deletionen untersucht, die mit dem erwarteten Produkt der an der Cas9- Nickstelle initiierten reversen PEgRNA-Transkription übereinstimmen. Einzelne Nukleotidvariationen, die mit einer Gesamthäufigkeit von <0,1 % unter den gesamten Reads innerhalb eines Samples auftraten, wurden von der Analyse ausgeschlossen. Für Reads, die einzelne Nukleotidvariationen enthielten, die beide mit Häufigkeiten ≥ 0,1 % auftraten und teilweise mit dem PEgRNA-kodierten Edit übereinstimmten, wurden t-Tests (ungepaart, einseitig, α = 0,5) verwendet, um zu bestimmen, ob die Varianten im Vergleich zu Samples, die mit PEgRNAs behandelt wurden, die denselben Spacer enthielten, aber andere Edits kodierten, signifikant häufiger auftraten. Um Unterschiede bei den Sequenzierungsfehlern zu vermeiden, wurden Vergleiche zwischen Samples durchgeführt, die gleichzeitig im selben MiSeq-Lauf sequenziert wurden. Varianten, die das Kriterium eines p-Wertes > 0,05 nicht erfüllten, wurden ausgeschlossen. Off-Target-PE3-Editing-Aktivität wurde dann als Prozentsatz der gesamten Sequenzierungs-Reads berechnet, die die oben genannten Kriterien erfüllten.
  • Erzeugung einer HEK293T-Zelllinie, die die HBB E6V-Mutation unter Verwendung von Cas9-initiierter HDR enthält
  • HEK293T-Zellen wurden in einer 48-Well-Platte ausgesät und bei etwa 60 % Konfluenz mit 1,5 µl Lipofectamine 2000, 300 ng Cas9 D10A-Nickase-Plasmid, 100 ng sgRNA-Plasmid und 200 ng 100-mer ssDNA-Donor-Templat transfiziert (Tabelle 5). Drei Tage nach der Transfektion wurde das Medium gegen frisches Medium ausgetauscht. Vier Tage nach der Transfektion wurden die Zellen mit 30 µl TrypLE-Lösung dissoziiert und in 1,5 ml Medium suspendiert. Einzelne Zellen wurden durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) (Beckman-Coulter Astrios) in einzelne Wells von zwei 96-Well-Platten isoliert. Siehe 53A-53B für repräsentative Beispiele für die FACS-Sortierung. Die Zellen wurden 14 Tage lang expandiert, bevor die genomische DNA-Sequenzierung wie oben beschrieben durchgeführt wurde. Von den isolierten klonalen Populationen erwies sich keine als homozygot für die HBB E6V-Mutation, so dass eine zweite Runde des Editings durch Lipofektion, Sortierung und Auswuchs in einer teilweise editierten Zelllinie wiederholt wurde, um eine Zelllinie zu erhalten, die homozygot für das E6V-Allel ist.
  • Erzeugung einer HEK293T-Zelllinie, die die HBB E6V-Mutation enthält, unter Verwendung von PE3
  • 2,5 × 104 HEK293T-Zellen, die in Abwesenheit von Antibiotika gezüchtet wurden, wurden auf mit Poly-D-Lysin beschichtete 48-Well-Platten (Corning) ausgesät. 16 bis 24 Stunden nach der Aussaat wurden die Zellen bei etwa 70 % Konfluenz mit 1 µl Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher Scientific) gemäß den Herstellerprotokollen und 750 ng PE2-P2A-GFP- Plasmid, 250 ng PEgRNA-Plasmid und 83 ng sgRNA-Plasmid transfiziert. Nach 3 Tagen nach der Transfektion wurden die Zellen mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (Gibco) gewaschen und mit TrypLE Express (Gibco) dissoziiert. Die Zellen wurden dann mit DMEM plus GlutaMax (Thermo Fisher Scientific), ergänzt mit 10 % (v/v) FBS (Gibco), verdünnt und vor der Sortierung durch ein 35-µm-Zellsieb (Corning) gegeben. Die Durchflusszytometrie wurde mit einem LE-MA900 Zellsortierer (Sony) durchgeführt. Die Zellen wurden 15 Minuten vor der Sortierung mit 3 nM DAPI (BioLegend) behandelt. Nach dem Ausschluss von Doubletten wurden einzelne DAPI-negative Zellen mit einer GFP-Fluoreszenz, die über der einer GFP-negativen Kontrollpopulation lag, in 96-Well-Flachboden-Zellkulturplatten (Corning) sortiert, die mit vorgekühlter DMEM mit GlutaMax, ergänzt mit 10 % FBS, gefüllt waren. Siehe 53A-53B für repräsentative Beispiele für die FACS-Sortierung. Die Zellen wurden 10 Tage lang kultiviert, bevor die genomische DNA extrahiert und mittels HTS charakterisiert wurde, wie oben beschrieben. Es wurden insgesamt sechs klonale Zelllinien identifiziert, die homozygot für die E6V-Mutation in HBB sind.
  • Erzeugung einer HEK293T-Zelllinie, die die HEXA 1278+ TATC-Insertion enthält, unter Verwendung von PE3
  • HEK293T-Zellen, die das HEXA 1278+TATC-Allel enthalten, wurden nach dem oben beschriebenen Protokoll zur Erzeugung der HBB-E6V-Zelllinie erzeugt; die PEgRNA- und sgRNA-Sequenzen sind in den Tabellen 2A-2C unter den 43A-43H aufgeführt. Nach der Transfektion und Sortierung wurden die Zellen 10 Tage lang kultiviert, bevor die genomische DNA extrahiert und mittels HTS charakterisiert wurde, wie oben beschrieben. Es wurden zwei heterozygote Zelllinien isoliert, die 50 % HEXA 1278+TATC-Allele enthielten, und es wurden zwei homozygote Zelllinien gewonnen, die 100 % HEXA 1278+TATC-Allele enthielten.
  • Tests zur Lebensfähigkeit der Zellen
  • HEK293T-Zellen wurden in 48-Well-Platten ausgesät und bei etwa 70 % Konfluenz mit 750 ng Editor-Plasmid (PE3, PE3 R110S K103L, Cas9 H840A Nickase oder dCas9), 250 ng HEK3-Ziel-PEgRNA-Plasmid und 1 µl Lipofectamine 2000 transfiziert, wie oben beschrieben. Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde alle 24 Stunden nach der Transfektion für 3 Tage mit dem CellTiter-Glo 2.0-Test (Promega) gemäß dem Herstellerprotokoll gemessen. Die Lumineszenz wurde in 96-Well-Flachboden-Polystyrol-Mikroplatten (Corning) mit einem M1000 Pro Mikroplatten-Lesegerät (Tecan) mit einer Integrationszeit von 1 Sekunde gemessen.
  • Lentivirus-Herstellung
  • Das Lentivirus wurde wie zuvor beschrieben hergestellt206. T-75-Kolben mit sich schnell teilenden HEK293T-Zellen (ATCC; Manassas, VA, USA) wurden mit den Lentivirus- Produktionshelferplasmiden pVSV-G und psPAX2 in Kombination mit modifizierten lentiCRISPR_v2-Genomen transfiziert, die einen Intein-split PE2-Editor tragen, wobei FuGENE HD (Promega, Madison, WI, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet wurde. Es wurden vier Split-Intein-Editor-Konstrukte ausgestaltet: 1) ein virales Genom, das eine U6-PEgRNA-Exprimierungskassette und den N-terminalen Abschnitt (1- 573) der Cas9 H840A-Nickase kodiert, die mit dem Npu N-Intein, einem selbstspaltenden P2A-Peptid und GFP-KASH fusioniert ist; 2) ein virales Genom, das für das Npu C-Intein kodiert, das mit dem C-terminalen Rest von PE2 fusioniert ist; 3) ein virales Genom, das für das Npu C-Intein kodiert, das mit dem C-terminalen Rest von Cas9 für die Cas9-Kontrolle fusioniert ist; und 4) eine Nicking-sgRNA für DNMT1. Das Split-Intein vermittelt das Trans- Splitting, um die beiden Hälften von PE2 oder Cas9 zu verbinden, während das P2A GFP- KASH die co-translationale Produktion eines an die Kernmembran gebundenen GFP ermöglicht. Nach 48 Stunden wurde der Überstand gesammelt, 5 Minuten lang bei 500 g zentrifugiert, um Zelltrümmer zu entfernen, und mit einem 0,45-µm-Filter filtriert. Der gefilterte Überstand wurde mit der PEG-it Virus Precipitation Solution (System Biosciences, Palo Alto, CA, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers konzentriert. Das resultierende Pellet wurde in Opti-MEM (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) mit 1 % des ursprünglichen Medienvolumens resuspendiert. Das resuspendierte Pellet wurde tiefgefroren und bis zur Verwendung bei -80 °C gelagert.
  • Dissektion und Kultur primärer kortikaler Neuronen der Maus
  • E18.5 dissoziierte kortikale Kulturen wurden von trächtigen, zeitlich bestimmten C57BL/6-Mäusen (Charles River) geerntet. Die Embryonen wurden den trächtigen Mäusen nach Euthanasie durch CO2 und anschließender Enthauptung entnommen. Die Kortikalkappen wurden in eiskaltem Hibernate-E mit Penicillin/Streptomycin-Zusatz (Life Technologies) seziert. Nach einer Spülung mit eiskaltem Hibemate-E wurde das Gewebe bei 37 °C 8 Minuten lang in Papain/DNase (Worthington/Sigma) aufgeschlossen. Das Gewebe wurde in NBActiv4 (BrainBits), ergänzt mit DNase, trituriert. Die Zellen wurden gezählt und in 24-Well-Platten mit 100.000 Zellen pro Well ausgebracht. Die Hälfte des Mediums wurde zweimal pro Woche gewechselt.
  • Prime-Editing in primären Neuronen und Isolierung der Zellkerne
  • Bei DIV 1 wurden 15 µl Lentivirus im Verhältnis 10:10:1 von N-terminal:C- terminal:Nicking-sgRNA hinzugefügt. Bei DIV 14 wurden neuronale Kerne unter Verwendung des EZ-PREP-Puffers (Sigma D8938) nach dem Protokoll des Herstellers isoliert. Alle Schritte wurden auf Eis oder bei 4 °C ausgeführt. Medien wurden aus den dissoziierten Kulturen entfernt, und die Kulturen wurden mit eiskaltem PBS gewaschen. PBS wurde abgesaugt und durch 200 µl EZ-PREP-Lösung ausgetauscht. Nach einer 5-minütigen Inkubation auf Eis wurde EZ-PREP über die Oberfläche des Wells pipettiert, um die verbleibenden Zellen zu lösen. Das Sample wurde 5 Minuten lang bei 500 g zentrifugiert, und der Überstand wurde entfernt. Die Samples wurden mit 200 µl EZ-PREP gewaschen und erneut 5 Minuten lang bei 500 g zentrifugiert. Die Samples wurden durch vorsichtiges Pipettieren in 200 µl eiskaltem Nuclei Suspension Buffer (NSB), bestehend aus 100 µg/ml BSA und 3,33 µM Vybrant DyeCycle Ruby (Thermo Fisher) in 1xPBS, resuspendiert und anschließend bei 500 g 5 Minuten lang zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt und die Kerne wurden in 100 µl NSB resuspendiert und in 100 µl Agencourt DNAdvance Lysepuffer mit einem MoFlo Astrios (Beckman Coulter) in der Durchflusszytometrie-Einrichtung des Broad Institute sortiert. Die genomische DNA wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers von Agencourt DNAdvance aufgereinigt.
  • RNA-Sequenzierung und Datenanalyse
  • HEK293T-Zellen wurden mit PRNP-Targeting- oder HEXA-Targeting-PEgRNAs und PE2, PE2-dRT oder Cas9-H840A-Nickase kotransfiziert. 72 Stunden nach der Transfektion wurde die Gesamt-RNA mit TRIzol-Reagenz (Thermo Fisher) aus den Zellen gewonnen und mit dem RNeasy Mini Kit (Qiagen) gereinigt, was eine DNaseI-Behandlung auf der Säule beinhaltete. Ribosomen wurden mit dem rRNA-Entfernungsprotokoll des TruSeq-Stranded- Total-RNA-Library-Prep-Kits (Illumina) von der Gesamt-RNA abgetrennt und anschließend mit RNAClean-XP-Beads (Beckman Coulter) gewaschen. Sequenzierungsbibliotheken wurden unter Verwendung von ribo-depletierter RNA auf einem SMARTer-PrepX-Apollo- NGS-Library-Prep-System (Takara) gemäß dem Herstellerprotokoll vorbereitet. Die resultierenden Bibliotheken wurden auf einer 2200 TapeStation (Agilent Technologies) visualisiert, mit einem Qubit-dsDNA-HS-Test (Thermo Fisher) normalisiert und auf einem NextSeq 550 mit einer High Output-v2-Fließzelle (Illumina) als 75-bp paired-end-reads sequenziert. Fastq-Dateien wurden mit bcl2fastq2 Version 2.20 erzeugt und mit TrimGalore Version 0.6.2 (github.com/FelixKrueger/TrimGalore) getrimmt, um Basen geringer Qualität, ungepaarte Sequenzen und Adaptorsequenzen zu entfernen. Die getrimmten Reads wurden mithilfe von RSEM Version 1.3.1207 an eine Homo-Sapiens-Genom-Assembly GRCh148 mit einem benutzerdefinierten Cas9-H840A-Geneintrag ausgerichtet. Das limma-voom208-Paket wurde verwendet, um das Niveau der Genexprimierung zu normalisieren und eine Analyse der differentiellen Exprimierung mit Batch-Effekt-Korrektur auszuführen. Differentiell exprimierte Gene wurden mit FDR-korrigiertem p-Wert < 0,05 und Fold-change > 2 Cutoffs aufgerufen, und die Ergebnisse wurden in R visualisiert.
  • ClinVar-Analyse
  • Die ClinVar-Variantenzusammenfassung wurde vom NCBI heruntergeladen (Zugriff am 15. Juli 2019), und die darin enthaltenen Informationen wurden für alle nachgeschalteten Analysen verwendet. Die Liste aller gemeldeten Varianten wurde nach Allel-ID gefiltert, um Duplikate zu entfernen, und nach klinischer Bedeutung, um die Analyse auf pathogene Varianten zu beschränken. Die Liste der pathogenen Varianten wurde sequenziell nach dem Variantentyp gefiltert, um den Anteil der pathogenen Varianten zu berechnen, bei denen es sich um Insertionen, Deletionen usw. handelt. Einzelnukleotidvarianten (SNVs) wurden basierend auf den gemeldeten Referenz- und alternativen Allelen in zwei Kategorien unterteilt (Transitionen und Transversionen). SNVs, für die keine Referenz- oder alternativen Allele gemeldet wurden, wurden von der Analyse ausgeschlossen.
  • Die Längen der gemeldeten Insertionen, Deletionen und Duplikationen wurden anhand der Referenz-/Alternativallele, der Start-/Stopp-Positionen der Variante oder der entsprechenden identifizierenden Informationen im Variantennamen berechnet. Varianten, die keine der oben genannten Informationen enthielten, wurden von der Analyse ausgeschlossen. Die Längen der gemeldeten Indels (einzelne Varianten, die sowohl Insertionen als auch Deletionen im Vergleich zum Referenzgenom beinhalten) wurden berechnet, indem die Anzahl der Diskrepanzen oder Lücken im besten paarweisen Alignment zwischen dem Referenz- und dem alternativen Allel bestimmt wurde. Die Häufigkeitsverteilungen der Variantenlängen wurden mit GraphPad Prism 8 berechnet.
  • Datenverfügbarkeit
  • Daten der Hochdurchsatz-Sequenzierung sind in der Datenbank des NCBI Sequence Read Archive hinterlegt. Plasmide, die PE1-, PE2-/PE3- und PEgRNA-Exprimierungsvektoren kodieren, sind bei Addgene erhältlich.
  • Code-Verfügbarkeit
  • Das Skript, das zur Quantifizierung der PEgRNA-Gerüstinsertion verwendet wird, ist in 60A-60B veranschaulicht.
  • Ergänzende Informationen: Tabellen und Sequenzen
  • Tabelle 1: Aktivitäten der Prime-Editoren, Cas9-Nuklease, Cas9 H840A-Nickase und PE2-dRT an HEK3-, HEK4-, EMX1- und FANCF-On-Target- und Off-Target-Stellen. PE2/PE3-Editing wird als % Prime-Editing neben % Indels (in Klammern) angezeigt. % Indels werden für Cas9, Cas9-H840A-Nickase (nCas9) und PE2-dRT an den ersten vier zuvor charakterisierten Off-Target-Stellen gezeigt179,180. sgRNA- und PEgRNA-Sequenzen können in den Tabellen 3A-3R unter der Überschrift der 42A-42H gefunden werden. Alle Werte sind der Durchschnitt von drei unabhängigen biologischen Wiederholungen.
    Figure DE112021002672T5_0536
  • Tabellen 2A-2C: Sequenzen der für die In-vitro-Experimente verwendeten DNA- Oligonukleotide, PEgRNAs und sgRNAs. Tabelle 2A: DNA-Oligonukleotide
    OLIGONUKLEOTID SEQUENZ
    AVA023
    Figure DE112021002672T5_0537
    AVA024
    Figure DE112021002672T5_0538
    AVA025
    Figure DE112021002672T5_0539
    AVA026 5PHOS-TGATGGCAGAGGAAAGG (SEQ ID NO: 377)
    AVA037 GCAGGCTTTAAAGGAACCAATTC (SEQ ID NO: 378)
    AVA110
    Figure DE112021002672T5_0540
    AVA122 CTCTGGAGGATCTAGCGGAG (SEQ ID NO: 380)
    AVA134
    Figure DE112021002672T5_0541
    AVA135
    Figure DE112021002672T5_0542
  • Tabelle 2B: 5'-verlängerte PEgRNAs
    PEGRNA SPACER- SEQUENZ 5'- VERLÄNGERUNGSSEQUENZ LINKER- LÄNGE (NT) PBS- LÄNGE (NT) RT- TEMPLAT- LÄNGE (NT)
    PEGRNA 1
    Figure DE112021002672T5_0543
    Figure DE112021002672T5_0544
    		 15 7 7
    PEGRNA 2
    Figure DE112021002672T5_0545
    Figure DE112021002672T5_0546
    		 15 5 7
    PEGRNA 3
    Figure DE112021002672T5_0547
    Figure DE112021002672T5_0548
    		 15 5 8
    PEGRNA 4
    Figure DE112021002672T5_0549
    Figure DE112021002672T5_0550
    		 15 5 15
    PEGRNA 5
    Figure DE112021002672T5_0551
    Figure DE112021002672T5_0552
    		 15 5 22
    5'- PEGRNA_R T_7_A
    Figure DE112021002672T5_0553
    Figure DE112021002672T5_0554
    		 15 5 7
    5'- PEGRNA_R T_7_B
    Figure DE112021002672T5_0555
    Figure DE112021002672T5_0556
    		 15 5 7
    5'- PEGRNA_R T_8
    Figure DE112021002672T5_0557
    Figure DE112021002672T5_0558
    		 15 5 8
    5'- PEGRNA_R T_15
    Figure DE112021002672T5_0559
    Figure DE112021002672T5_0560
    		 15 5 15
    5'- PEGRNA_R T_22
    Figure DE112021002672T5_0561
    Figure DE112021002672T5_0562
    		 15 5 22
  • Tabelle 2C: 3'-verlängerte PEgRNAs
    PEGRNA SPACER-SEQUENZ 3'- VERLÄNGERUNGS SEQUENZ PBS- LÄNGE (NT) RT- TEMPLAT- LÄNGE (NT)
    3'- PEGRNA_10
    Figure DE112021002672T5_0563
    Figure DE112021002672T5_0564
    		 7 10
    3'- PEGRNA_H EFE_TTOA
    Figure DE112021002672T5_0565
    Figure DE112021002672T5_0566
    		 7 10
    3'- PEGRNA_H EFE_+1AINS
    Figure DE112021002672T5_0567
    Figure DE112021002672T5_0568
    		 7 11
    3'- PEGRNA_H EFE_+1TDEL
    Figure DE112021002672T5_0569
    Figure DE112021002672T5_0570
    		 7 9
  • Tabellen 3A-3R: Sequenzen von PEgRNAs und sgRNAs, die in Experimenten mit Säugetierzellen verwendet wurden. Alle Sequenzen sind in 5'- bis 3'-Ausrichtung dargestellt. Zur Konstruktion von PEgRNAs wurden die unten aufgeführten Spacer-Sequenzen an das 5'- Ende des sgRNA-Gerüsts und die unten aufgeführten 3'-Verlängerungen, die die Primer- Bindungsstelle und das RT-Templat enthalten, an das 3'-Ende des sgRNA-Gerüsts angefügt. Die Sequenz des sgRNA-Gerüsts lautet
    Figure DE112021002672T5_0571
    Figure DE112021002672T5_0572
    Figure DE112021002672T5_0573
    Figure DE112021002672T5_0574
    Figure DE112021002672T5_0575
    Figure DE112021002672T5_0576
    Figure DE112021002672T5_0577
    Figure DE112021002672T5_0578
    Figure DE112021002672T5_0579
    Tabelle 3B: FIG. 40A-40C PEgRNA
    PEGRNA SPACER-SEQUENZ (SEQ-ID-NR: 3104- 3112) 3'-VERLÄNGERUNG (SEQ- ID-NR: 3113-3121) PBS- LÄNGE (NT) RT- TEMPLAT- LÄNGE (NT)
    RNF2_3B
    Figure DE112021002672T5_0580
    Figure DE112021002672T5_0581
    		 15 14
    EMX1_38
    Figure DE112021002672T5_0582
    Figure DE112021002672T5_0583
    		 15 13
    FANCF_3B
    Figure DE112021002672T5_0584
    Figure DE112021002672T5_0585
    		 15 17
    HE3_3B
    Figure DE112021002672T5_0586
    Figure DE112021002672T5_0587
    		 13 10
    HEK4_3B
    Figure DE112021002672T5_0588
    		 TTAACCCCAACCTCCAGCC 9 10
    RNF2_3C_4A TOC
    Figure DE112021002672T5_0589
    Figure DE112021002672T5_0590
    		 15 14
    RNF2_3C_4A TOG
    Figure DE112021002672T5_0591
    Figure DE112021002672T5_0592
    		 15 14
    FANCF_3C_5 GTOT
    Figure DE112021002672T5_0593
    Figure DE112021002672T5_0594
    		 13 17
    FANCF_3C_7 ATOC
    Figure DE112021002672T5_0595
    Figure DE112021002672T5_0596
    		 14 17
    Tabelle 3C: FIG. 40A-40C Nicking-sgRNA-Sequenzen
    NICKING-SGRNA SPACER-SEQUENZ SEQ-ID-NR:
    RNF2_2B_t41 GTCAACCATTAAGCAAAACAT 3122
    RNF2_2B_+67 GTCTCAGGCTGTGCAGACAAA 3123
    EMX1_2B_-116 GGGGCACAGATG AGAAACTC 3124
    EMX1_2B_-57 GCCGTTTGTACTTTGTCCTC 3125
    EMX1_2B_+14 GCGCCACCGGTTGATGTGAT 3126
    EMX1_2B_+27 GCTTCGTGGCAATGCGCCAC 3127
    EMX1_2B_+53 GACATCGATGTCCTCCCCAT 3128
    EMX1_2B_+80 GTGGTTGCCCACCCTAGTCAT 3129
    FANCF_2B_-78 GCGACTCTCTGCGTACTGAT 3130
    FANCF_2B_-50 GCCCTACTTCCGCTTTCACCT 3131
    FANCF_2B_-27 GGATTCC ATG AGGTGCGCGA 3132
    FANCF_2B_-17 GCTGCAGAAGGGATTCCATG 3133
    FANCF_2B_+21 GCTTGAGACCGCCAGAAGCT 3134
    FANCF_2B_+48 GGGGTCCCAGGTGCTGACGT 3135
    HEK3_2B_-108 GCAGAAATAGACTAATTGCA 3136
    HEK3_2B_-38 GGATTGACCCAGGCCAGGGC 3137
    HEK3_2B_+26 GACGCCCTCTGGAGGAAGCA 3138
    HEK3_2B_+37 GCTGTCCTGCGACGCCCTC 3139
    HEK3_2B_+63 GCACATACTAGCCCCTGTCT 3140
    HEK3_2B_+90 GTCAACCAGTATCCCGGTGC 3141
    HEK4_2B_-95 TCCCTTCCTTCCACCCAGCC 3142
    HEK4_2B_-51 CCCTGCCTGTCATCCTGCTT 3143
    HEK4_2B_-26 GCAGTGCCACCGGGGCGCCG 3144
    HEK4_2B_+52 GCGGGGGCTCAGAGAGGGCA 3145
    HEK4_2B_+14 GAGACACACACACAGGCCTGG 3146
    RNF2_2C_+41 GTCAACCATTAAGCAAAACAT 3147
    RNF2_2C_4ATOC_+5 GTGAGTTACAACGAACACCGC 3148
    RNF2_2C_4ATOG_+5 GTGAGTTACAACGAACACCCC 3149
    FANCF_2C_+48 GGGGTCCCAGGTGCTGACGT 3150
    FANCF_2C_5GTOT_+7 GAAGCTCGGAAAAGCGATCA 3151
    FANCF_2C_7ATOC_+7 GAAGCTCGGAAAAGCGAGCC 3152
    HEK3_2C_+90 GTCAACCAGTATCCCGGTGC 3153
    Tabelle 3D: FIG. 41A-41K PEgRNA
    PEGRNA SPACER-SEQUENZ (SEQ-ID-NR: 3154- 3304) 3'-VERLÄNGERUNG (SEQ- ID-NR: 3305-3455) PBS - LÄNGE (NT) RT- TEMPLAT- LÄNGE (NT)
    HEK3_4A_1TTOA
    Figure DE112021002672T5_0597
    Figure DE112021002672T5_0598
    		 13 10
    HEK3_4A_1TTOC
    Figure DE112021002672T5_0599
    Figure DE112021002672T5_0600
    		 13 10
    HEK3_4A_1TTOG
    Figure DE112021002672T5_0601
    Figure DE112021002672T5_0602
    		 13 10
    HEK3_4A_2GTOA
    Figure DE112021002672T5_0603
    Figure DE112021002672T5_0604
    		 13 10
    HEK3_4A_2GTOC
    Figure DE112021002672T5_0605
    Figure DE112021002672T5_0606
    		 13 10
    HEK3_4A_2GTOT
    Figure DE112021002672T5_0607
    Figure DE112021002672T5_0608
    		 13 10
    HEK3_4A_3ATOC
    Figure DE112021002672T5_0609
    Figure DE112021002672T5_0610
    		 13 10
    HEK3_4A_3ATOG
    Figure DE112021002672T5_0611
    Figure DE112021002672T5_0612
    		 13 10
    HEK3_4A_3ATOT
    Figure DE112021002672T5_0613
    Figure DE112021002672T5_0614
    		 13 10
    HEK3_4A_4TTOA
    Figure DE112021002672T5_0615
    Figure DE112021002672T5_0616
    		 13 10
    HEK3_4A_4TTOC
    Figure DE112021002672T5_0617
    Figure DE112021002672T5_0618
    		 13 10
    HEK3_4A_4TTOG
    Figure DE112021002672T5_0619
    Figure DE112021002672T5_0620
    		 13 10
    HEK3_4A_5GTOA
    Figure DE112021002672T5_0621
    Figure DE112021002672T5_0622
    		 13 10
    HEK3_4A_5GTOC
    Figure DE112021002672T5_0623
    Figure DE112021002672T5_0624
    		 13 10
    HEK3_4A_5GTOT
    Figure DE112021002672T5_0625
    Figure DE112021002672T5_0626
    		 13 10
    HEK3_4A_6GTOA
    Figure DE112021002672T5_0627
    Figure DE112021002672T5_0628
    		 13 10
    HEK3_4A_6GTOC
    Figure DE112021002672T5_0629
    Figure DE112021002672T5_0630
    		 13 10
    HEK3_4A_6GTOT
    Figure DE112021002672T5_0631
    Figure DE112021002672T5_0632
    		 13 10
    HEK3_4A_7CTOA
    Figure DE112021002672T5_0633
    Figure DE112021002672T5_0634
    		 13 10
    HEK3_4A_7CTOG
    Figure DE112021002672T5_0635
    Figure DE112021002672T5_0636
    		 13 10
    HEK3_4A_7CTOT
    Figure DE112021002672T5_0637
    Figure DE112021002672T5_0638
    		 13 10
    HEK3_4A_8ATOC
    Figure DE112021002672T5_0639
    Figure DE112021002672T5_0640
    		 13 10
    HEK3_4A_8ATOG
    Figure DE112021002672T5_0641
    Figure DE112021002672T5_0642
    		 13 10
    HEK3_4A_8ATOT
    Figure DE112021002672T5_0643
    Figure DE112021002672T5_0644
    		 13 10
    HEK3_4B_1TTOA
    Figure DE112021002672T5_0645
    Figure DE112021002672T5_0646
    		 13 34
    HEK3_4B_12GTOC
    Figure DE112021002672T5_0647
    Figure DE112021002672T5_0648
    		 13 34
    HEK3_4B_14ATOT
    Figure DE112021002672T5_0649
    Figure DE112021002672T5_0650
    		 13 34
    HEK3_4B_17GTOC
    Figure DE112021002672T5_0651
    Figure DE112021002672T5_0652
    		 13 34
    HEK3_4B_2OGTOC
    Figure DE112021002672T5_0653
    Figure DE112021002672T5_0654
    		 13 34
    HEK3_4B_23CTOG
    Figure DE112021002672T5_0655
    Figure DE112021002672T5_0656
    		 13 34
    HEK3_4B_24TTOA
    Figure DE112021002672T5_0657
    Figure DE112021002672T5_0658
    		 13 34
    HEK3_4B_26CTOG
    Figure DE112021002672T5_0659
    Figure DE112021002672T5_0660
    		 13 34
    HEK3_4B_30CTOG
    Figure DE112021002672T5_0661
    Figure DE112021002672T5_0662
    		 13 34
    HEK3_4B_33CTOG
    Figure DE112021002672T5_0663
    Figure DE112021002672T5_0664
    		 13 34
    RNF2_4C_1CTOA
    Figure DE112021002672T5_0665
    Figure DE112021002672T5_0666
    		 15 14
    RNF2_4C_1CTOG
    Figure DE112021002672T5_0667
    Figure DE112021002672T5_0668
    		 15 14
    RNF2_4C_1CTOT
    Figure DE112021002672T5_0669
    Figure DE112021002672T5_0670
    		 15 14
    RNF2_4C_2TTOA
    Figure DE112021002672T5_0671
    Figure DE112021002672T5_0672
    		 15 14
    RNF2_4C_2TTOG
    Figure DE112021002672T5_0673
    Figure DE112021002672T5_0674
    		 15 14
    RNF2_4C_3GTOC
    Figure DE112021002672T5_0675
    Figure DE112021002672T5_0676
    		 15 14
    RNF2_4C_4ATOC
    Figure DE112021002672T5_0677
    Figure DE112021002672T5_0678
    		 15 14
    RNF2_4C_4ATOT
    Figure DE112021002672T5_0679
    Figure DE112021002672T5_0680
    		 15 14
    RNF2_4C_4ATOG
    Figure DE112021002672T5_0681
    Figure DE112021002672T5_0682
    		 15 14
    RNF2_4C_5GTOT
    Figure DE112021002672T5_0683
    Figure DE112021002672T5_0684
    		 15 14
    RNF2_4C_6GTOA
    Figure DE112021002672T5_0685
    Figure DE112021002672T5_0686
    		 15 14
    RNF2_4C_7TTOC
    Figure DE112021002672T5_0687
    Figure DE112021002672T5_0688
    		 15 14
    FANCF_4D_1ATOG
    Figure DE112021002672T5_0689
    Figure DE112021002672T5_0690
    		 14 17
    FANCF_4D_1ATOT
    Figure DE112021002672T5_0691
    Figure DE112021002672T5_0692
    		 14 17
    FANCF_4D_2CTOA
    Figure DE112021002672T5_0693
    Figure DE112021002672T5_0694
    		 14 17
    FANCF_4D_3CTOG
    Figure DE112021002672T5_0695
    Figure DE112021002672T5_0696
    		 14 17
    FANCF_4D_3CTOT
    Figure DE112021002672T5_0697
    Figure DE112021002672T5_0698
    		 14 17
    FANCF_4D_4TTOA
    Figure DE112021002672T5_0699
    Figure DE112021002672T5_0700
    		 14 17
    FANCF_4D_4TTOG
    Figure DE112021002672T5_0701
    Figure DE112021002672T5_0702
    		 14 17
    FANCF_4D_5GTOA
    Figure DE112021002672T5_0703
    Figure DE112021002672T5_0704
    		 14 17
    FANCF_4D_6GTOC
    Figure DE112021002672T5_0705
    Figure DE112021002672T5_0706
    		 14 17
    FANCF_4D_7ATOC
    Figure DE112021002672T5_0707
    Figure DE112021002672T5_0708
    		 14 17
    FANCF_4D_8TTOC
    Figure DE112021002672T5_0709
    Figure DE112021002672T5_0710
    		 14 17
    FANCF_4D_10GTOT
    Figure DE112021002672T5_0711
    Figure DE112021002672T5_0712
    		 14 17
    EMX1_4E_2ATOC
    Figure DE112021002672T5_0713
    Figure DE112021002672T5_0714
    		 14 16
    EMX1_4E_2ATOT
    Figure DE112021002672T5_0715
    Figure DE112021002672T5_0716
    		 14 16
    EMX1_4E_3ATOG
    Figure DE112021002672T5_0717
    Figure DE112021002672T5_0718
    		 14 16
    EMX1_4E_4GTOC
    Figure DE112021002672T5_0719
    Figure DE112021002672T5_0720
    		 14 16
    EMX1_4E_5GTOA
    Figure DE112021002672T5_0721
    Figure DE112021002672T5_0722
    		 14 16
    EMX1_4E_5GTOT
    Figure DE112021002672T5_0723
    Figure DE112021002672T5_0724
    		 14 16
    EMX1_4E_7CTOA
    Figure DE112021002672T5_0725
    Figure DE112021002672T5_0726
    		 14 16
    EMX1_4E_8TTOA
    Figure DE112021002672T5_0727
    Figure DE112021002672T5_0728
    		 14 16
    EMX1_4E_8TTOC
    Figure DE112021002672T5_0729
    Figure DE112021002672T5_0730
    		 14 16
    EMX1_4E_8TTOG
    Figure DE112021002672T5_0731
    Figure DE112021002672T5_0732
    		 14 16
    EMX1_4E_9CTOG
    Figure DE112021002672T5_0733
    Figure DE112021002672T5_0734
    		 14 16
    EMX1_4E_9CTOT
    Figure DE112021002672T5_0735
    Figure DE112021002672T5_0736
    		 14 16
    RUNX1_4F_1CTOA
    Figure DE112021002672T5_0737
    Figure DE112021002672T5_0738
    		 15 15
    RUNX1_4F_1CTOG
    Figure DE112021002672T5_0739
    Figure DE112021002672T5_0740
    		 15 15
    RUNX1_4F_1CTOT
    Figure DE112021002672T5_0741
    Figure DE112021002672T5_0742
    		 15 15
    RUNX1_4F_2GTOA
    Figure DE112021002672T5_0743
    Figure DE112021002672T5_0744
    		 15 15
    RUNX1 _4F_3ATOC
    Figure DE112021002672T5_0745
    Figure DE112021002672T5_0746
    		 15 15
    RUNX1_4F_3ATOG
    Figure DE112021002672T5_0747
    Figure DE112021002672T5_0748
    		 15 15
    RUNX1_4F_3ATOT
    Figure DE112021002672T5_0749
    Figure DE112021002672T5_0750
    		 15 15
    RUNX1_4F_4TTOA
    Figure DE112021002672T5_0751
    Figure DE112021002672T5_0752
    		 15 15
    RUNX1_4F_4TTOC
    Figure DE112021002672T5_0753
    Figure DE112021002672T5_0754
    		 15 15
    RUNX1_4F_4TTOG
    Figure DE112021002672T5_0755
    Figure DE112021002672T5_0756
    		 15 15
    RUNX1_4F_SGTOT
    Figure DE112021002672T5_0757
    Figure DE112021002672T5_0758
    		 15 15
    RUNX1_4F_6GTOC
    Figure DE112021002672T5_0759
    Figure DE112021002672T5_0760
    		 15 15
    VEGFA_4G_1TTOA
    Figure DE112021002672T5_0761
    Figure DE112021002672T5_0762
    		 13 22
    VEGFA_4G_1TTOC
    Figure DE112021002672T5_0763
    Figure DE112021002672T5_0764
    		 13 22
    VEGFA_4G_1TTOG
    Figure DE112021002672T5_0765
    Figure DE112021002672T5_0766
    		 13 22
    VEGFA_4G_2GTOA
    Figure DE112021002672T5_0767
    Figure DE112021002672T5_0768
    		 13 22
    VEGFA_4G_3ATOC
    Figure DE112021002672T5_0769
    Figure DE112021002672T5_0770
    		 13 22
    VEGFA_4G_3ATOG
    Figure DE112021002672T5_0771
    Figure DE112021002672T5_0772
    		 13 22
    VEGFA_4G_3ATOT
    Figure DE112021002672T5_0773
    Figure DE112021002672T5_0774
    		 13 22
    VEGFA_4G_5GTOT
    Figure DE112021002672T5_0775
    Figure DE112021002672T5_0776
    		 13 22
    VEGFA_4G_6GTOC
    Figure DE112021002672T5_0777
    Figure DE112021002672T5_0778
    		 13 22
    VEGFA_4G_7CTOA
    Figure DE112021002672T5_0779
    Figure DE112021002672T5_0780
    		 13 22
    VEGFA_4G_7CTOT
    Figure DE112021002672T5_0781
    Figure DE112021002672T5_0782
    		 13 22
    VEGFA_4G_9CTOG
    Figure DE112021002672T5_0783
    Figure DE112021002672T5_0784
    		 13 22
    DNMT1_4H_1ATOC
    Figure DE112021002672T5_0785
    Figure DE112021002672T5_0786
    		 13 11
    DNMT1_4H_1ATOG
    Figure DE112021002672T5_0787
    Figure DE112021002672T5_0788
    		 13 11
    DNMT1_4H_2CTOA
    Figure DE112021002672T5_0789
    Figure DE112021002672T5_0790
    		 13 11
    DNMT1_4H_2CTOG
    Figure DE112021002672T5_0791
    Figure DE112021002672T5_0792
    		 13 11
    DNMT1_4H_2CTOT
    Figure DE112021002672T5_0793
    Figure DE112021002672T5_0794
    		 13 11
    DNMT1_4H_3ATOT
    Figure DE112021002672T5_0795
    Figure DE112021002672T5_0796
    		 13 11
    DNMT1_4H_4GTOA
    Figure DE112021002672T5_0797
    Figure DE112021002672T5_0798
    		 13 11
    DNMT1_4H_5GTOT
    Figure DE112021002672T5_0799
    Figure DE112021002672T5_0800
    		 13 11
    DNMT1_4H_6GTOC
    Figure DE112021002672T5_0801
    Figure DE112021002672T5_0802
    		 13 11
    DNMT1_4H_8TTOA
    Figure DE112021002672T5_0803
    Figure DE112021002672T5_0804
    		 13 19
    DNMT1_4H_8TTOC
    Figure DE112021002672T5_0805
    Figure DE112021002672T5_0806
    		 13 19
    DNMT1_4H_8TTOG
    Figure DE112021002672T5_0807
    Figure DE112021002672T5_0808
    		 13 19
    HEK3_4J_DEL1-5
    Figure DE112021002672T5_0809
    Figure DE112021002672T5_0810
    		 13 29
    HEK3_4J_DEL1-10
    Figure DE112021002672T5_0811
    Figure DE112021002672T5_0812
    		 13 24
    HEK3_4J_DEL1-15
    Figure DE112021002672T5_0813
    Figure DE112021002672T5_0814
    		 13 19
    HEK3_4J_DEL1-25
    Figure DE112021002672T5_0815
    Figure DE112021002672T5_0816
    		 13 26
    HEK3_4J_DEL1-30
    Figure DE112021002672T5_0817
    Figure DE112021002672T5_0818
    		 13 21
    HEK3_4J_DEL1-80
    Figure DE112021002672T5_0819
    Figure DE112021002672T5_0820
    		 13 20
    HEK3_4I_1AINS
    Figure DE112021002672T5_0821
    Figure DE112021002672T5_0822
    		 13 11
    HEK3_4I_1CTTINS
    Figure DE112021002672T5_0823
    Figure DE112021002672T5_0824
    		 13 13
    HEK3_4I_1TDEL
    Figure DE112021002672T5_0825
    Figure DE112021002672T5_0826
    		 13 9
    HEK3_4I_1- 3TGADEL
    Figure DE112021002672T5_0827
    Figure DE112021002672T5_0828
    		 13 31
    RNF2_4I_1TINS
    Figure DE112021002672T5_0829
    Figure DE112021002672T5_0830
    		 15 15
    RNF2_4I_1GTAINS
    Figure DE112021002672T5_0831
    Figure DE112021002672T5_0832
    		 15 17
    RNF2_4I_4ADEL
    Figure DE112021002672T5_0833
    Figure DE112021002672T5_0834
    		 15 13
    RNF2_4I_3- 5GAGDEL
    Figure DE112021002672T5_0835
    Figure DE112021002672T5_0836
    		 15 11
    FANCF_4I_3CINS
    Figure DE112021002672T5_0837
    Figure DE112021002672T5_0838
    		 14 18
    FANCF_4I_4GATINS
    Figure DE112021002672T5_0839
    Figure DE112021002672T5_0840
    		 14 20
    FANCF_4I_6GDEL
    Figure DE112021002672T5_0841
    Figure DE112021002672T5_0842
    		 14 16
    FANCF_4I_5-7GGADEL
    Figure DE112021002672T5_0843
    Figure DE112021002672T5_0844
    		 14 14
    EMX1_4I_6TINS
    Figure DE112021002672T5_0845
    Figure DE112021002672T5_0846
    		 14 17
    EMX1_4I_1TGCINS
    Figure DE112021002672T5_0847
    Figure DE112021002672T5_0848
    		 14 19
    EMX1_4I_5GDEL
    Figure DE112021002672T5_0849
    Figure DE112021002672T5_0850
    		 14 15
    EMX1_4I_4- 6GGGDEL
    Figure DE112021002672T5_0851
    Figure DE112021002672T5_0852
    		 14 13
    RUNX1_4I_1CINS
    Figure DE112021002672T5_0853
    Figure DE112021002672T5_0854
    		 15 16
    RUNX1_4I_1ATGINS
    Figure DE112021002672T5_0855
    Figure DE112021002672T5_0856
    		 15 18
    RUNX1 _4I_2GDEL
    Figure DE112021002672T5_0857
    Figure DE112021002672T5_0858
    		 15 14
    RUNX1_4I_2-4GATDEL
    Figure DE112021002672T5_0859
    Figure DE112021002672T5_0860
    		 15 12
    VEGFA_4I_4CINS
    Figure DE112021002672T5_0861
    Figure DE112021002672T5_0862
    		 13 23
    VEGFA_4I_2ACAINS
    Figure DE112021002672T5_0863
    Figure DE112021002672T5_0864
    		 13 25
    VEGFA_4I_3ADEL
    Figure DE112021002672T5_0865
    Figure DE112021002672T5_0866
    		 13 21
    VEGFA_4I_2-4GAGDEL
    Figure DE112021002672T5_0867
    Figure DE112021002672T5_0868
    		 13 19
    DNMT1_4I_4CINS
    Figure DE112021002672T5_0869
    Figure DE112021002672T5_0870
    		 13 16
    DNMT1_4I_1TCAINS
    Figure DE112021002672T5_0871
    Figure DE112021002672T5_0872
    		 13 18
    DNMT1_4I_3ADEL
    Figure DE112021002672T5_0873
    Figure DE112021002672T5_0874
    		 13 14
    DNMT1_4I_3-5AGGDEL
    Figure DE112021002672T5_0875
    Figure DE112021002672T5_0876
    		 13 12
    HEK3_4K_1CTTINS_5GDEL
    Figure DE112021002672T5_0877
    Figure DE112021002672T5_0878
    		 13 36
    HEK3_4K_1CTTINS_2GTOC
    Figure DE112021002672T5_0879
    Figure DE112021002672T5_0880
    		 13 37
    HEK3_4K_3TDEL_5GTOC
    Figure DE112021002672T5_0881
    Figure DE112021002672T5_0882
    		 13 33
    HEK3_4K_3GTOC_6GTOT
    Figure DE112021002672T5_0883
    Figure DE112021002672T5_0884
    		 13 34
    RNF2_4K_2AAINS_3- 4GADEL
    Figure DE112021002672T5_0885
    Figure DE112021002672T5_0886
    		 15 14
    RNF2_4K_1AINS_5GTOC
    Figure DE112021002672T5_0887
    Figure DE112021002672T5_0888
    		 15 15
    RNF2_4K_1- 2CTDEL_6GTOT
    Figure DE112021002672T5_0889
    Figure DE112021002672T5_0890
    		 15 12
    RNF2_4K_1CTOA_5GTOT
    Figure DE112021002672T5_0891
    Figure DE112021002672T5_0892
    		 15 14
    FANCF_4K_1TINS_3- 4TGDEL
    Figure DE112021002672T5_0893
    Figure DE112021002672T5_0894
    		 14 16
    FANCF_ 4K_1TINS_6GTOA
    Figure DE112021002672T5_0895
    Figure DE112021002672T5_0896
    		 14 18
    FANCF_4K_2CDEL_5GTOT
    Figure DE112021002672T5_0897
    Figure DE112021002672T5_0898
    		 14 16
    Tabelle 3E: FIG. 41A-41K Nicking-sgRNA
    NICKING-SGRNA SPACER-SEQUENZ (SEQ-ID-NR: 3456-3463)
    HEK3_4A_+90 GTCAACCAGTATCCCGGTGC
    HEK3_4B_+90 GTCAACCAGTATCCCGGTGC
    RNF2_4C_+41 GTCAACCATTAAGCAAAACAT
    FANCF_4D_+48 GGGGTCCCAGGTGCTGACGT
    EMX1_4E_+53 GACATCGATGTCCTCCCCAT
    RUNX1_4F_+38 GATGAAGCACTGTGGGTACGA
    VEGFA_4G_+57 GATGTACAGAGAGCCCAGGGC
    DNMT1_4H_+49 GCCCTTCAGCTAAAATAAAGG
    Tabelle 3F: FIG. 42A-42H PEgRNA
    PEGRNA SPACER- SEQUENZ (SEQ-ID-NR: 3464- 3478) 3'-VERLÄNGERUNG (SEQ-ID- NR: 3479-3493) PBS- LÄNGE (NT) RT- TEMPLAT- LÄNGE (NT)
    HEK3_5A_C3
    Figure DE112021002672T5_0899
    Figure DE112021002672T5_0900
    		 13 10
    HEK3_5A_C4
    Figure DE112021002672T5_0901
    Figure DE112021002672T5_0902
    		 13 10
    HEK3_5A_C7
    Figure DE112021002672T5_0903
    Figure DE112021002672T5_0904
    		 13 10
    FANCF_5A_C3
    Figure DE112021002672T5_0905
    Figure DE112021002672T5_0906
    		 14 17
    FANCF_5A_C7
    Figure DE112021002672T5_0907
    Figure DE112021002672T5_0908
    		 14 17
    FANCF_5A_C8
    Figure DE112021002672T5_0909
    Figure DE112021002672T5_0910
    		 14 17
    EMX1_5A_C5
    Figure DE112021002672T5_0911
    Figure DE112021002672T5_0912
    		 14 16
    EMX1_5A_C6
    Figure DE112021002672T5_0913
    Figure DE112021002672T5_0914
    		 14 16
    EMX1_5A_C7
    Figure DE112021002672T5_0915
    Figure DE112021002672T5_0916
    		 14 16
    EMX1_5C_C5_6
    Figure DE112021002672T5_0917
    Figure DE112021002672T5_0918
    		 14 16
    EMX1_5C_C5_7
    Figure DE112021002672T5_0919
    Figure DE112021002672T5_0920
    		 14 16
    EMXJ_5C_C6_7
    Figure DE112021002672T5_0921
    Figure DE112021002672T5_0922
    		 14 16
    EMX1_5C_C5_6_7
    Figure DE112021002672T5_0923
    Figure DE112021002672T5_0924
    		 14 16
    HEK3_5D_A5
    Figure DE112021002672T5_0925
    Figure DE112021002672T5_0926
    		 13 10
    HEK3_5D_A8
    Figure DE112021002672T5_0927
    Figure DE112021002672T5_0928
    		 13 10
    Tabelle 3G: FIG. 42A-42H Nicking-sgRNA
    NICKING- SGRNA MÖGLICHE SPACER- SEQUENZ (SEQ-ID-NR: 616- 618) MÖGLICHE SPACER- SEQUENZ (SEQ-ID-NR: 619- 621)
    HEK3_5A-F_+90 GTCAACCAGTATCCCGGTGC GTCAACCAGTATCCCGGTGC
    PANCF_5A-F_+48 GGGGTCCCAGGTGCTGACGT GATGTACAGAGAGCCCAGGGC
    EMX1_5A-F_+57 GATGTACAGAGAGCCCAGGGC GGGGTCCCAGGTCGTGACGT
    Tabelle 3H: FIG. 42A-42H Basen-Editing von sgRNA
    BASEN-EDITING VON SGRNA SPACER-SEQUENZ
    HEK3_5A-F_BE GTGCCATCACGTGCTCAGTCT (SEQ ID NO: 455)
    FANCF_5A-F_BE GAGCGATCCAGGTGCTGCAGA (SEQ ID NO: 456)
    EMX1_5A-F_BE GGAGCCCTTCTTCTTCTGCT (SEQ ID NO: 457)
    Tabelle 3I: FIG. 42A-42H On-Target-sgRNA
    ON-TARGET- SGRNA SPACER-SEQUENZ
    HEK3_5G GGCCCAGACTGAGCACGTGA (SEQ ID NO: 510)
    HEK4_5G GGCACTGCGGCTGGAGGTGG (SEQ ID NO: 511)
    EMX1_5G GAGTCCGAGCAGAAGAAGAA (SEQ ID NO: 512)
    FANCF_5G GGAATCCCTTCTGCAGCACC (SEQ ID NO: 513)
    Tabelle 3J: FIG. 42A-42H On-Target-PEgRNA
    ON-TARGET- PEGRNA SPACER-SEQUENZ (SEQ-ID-NR: 663-677) 3'-VERLÄNGERUNG (SEQ-ID-NR: 678-692) PBS - LÄNGE (NT) RT- TEMPLAT- LÄNGE (NT)
    HEK3_5G- H_PEGRNA_1
    Figure DE112021002672T5_0929
    Figure DE112021002672T5_0930
    		 13 10
    HEK3_5G- H_PEGRNA_2
    Figure DE112021002672T5_0931
    Figure DE112021002672T5_0932
    		 13 13
    HEK3_5G- H_PEGRNA_3
    Figure DE112021002672T5_0933
    Figure DE112021002672T5_0934
    		 13 9
    HEK3_5G- H_PEGRNA_4
    Figure DE112021002672T5_0935
    Figure DE112021002672T5_0936
    		 13 10
    HEK4_5G- H_PEGRNA_J
    Figure DE112021002672T5_0937
    		 TTAACGCCCACCTCCAGCC 9 10
    HEK4_5G- H_PEGRNA_2
    Figure DE112021002672T5_0938
    		 TTAACCCCCCCCTCCAGCC 9 10
    HEK4_5G- H_PEGRNA_3
    Figure DE112021002672T5_0939
    Figure DE112021002672T5_0940
    		 9 13
    HEK4_5G- H_PEGRNA_4
    Figure DE112021002672T5_0941
    		 TTAACCCCCCCTCCAGCC 9 9
    EMX1_5G- H_PEGRNA_1
    Figure DE112021002672T5_0942
    Figure DE112021002672T5_0943
    		 14 16
    EMX1_5G- H_PEGRNA_2
    Figure DE112021002672T5_0944
    Figure DE112021002672T5_0945
    		 14 16
    EMX1_5G- H_PEGRNA_3
    Figure DE112021002672T5_0946
    Figure DE112021002672T5_0947
    		 14 19
    EMX1_5G- H_PEGRNA_4
    Figure DE112021002672T5_0948
    Figure DE112021002672T5_0949
    		 14 13
    FANCF_5G- H_PEGRNA_1
    Figure DE112021002672T5_0950
    Figure DE112021002672T5_0951
    		 14 17
    FANCF_5G- H_PEGRNA_2
    Figure DE112021002672T5_0952
    Figure DE112021002672T5_0953
    		 14 17
    FANCF_5G- H_PEGRNA_3
    Figure DE112021002672T5_0954
    Figure DE112021002672T5_0955
    		 14 20
    Tabelle 3K: FIG. 49A-49B PEgRNA
    PEGRNA SPACER- SEQUENZ (SEQ- ID-NR: 3494- 3521) 3'-VERLÄNGERUNG (SEQ- ID-NR: 3522-3540) PBS- LÄNGE (NT) RT- TEMPLAT- LÄNGE (NT)
    HEK3_6A_2GTOC
    Figure DE112021002672T5_0956
    Figure DE112021002672T5_0957
    		 13 10
    HEK3_6A_2GTOC
    Figure DE112021002672T5_0958
    EMX1_6A_3GTOC
    Figure DE112021002672T5_0959
    Figure DE112021002672T5_0960
    		 13 13
    EMX1_6A_3GTOC
    Figure DE112021002672T5_0961
    FANCF_6A_5GTOT
    Figure DE112021002672T5_0962
    Figure DE112021002672T5_0963
    		 13 15
    FANCF_6A_5GTOT
    Figure DE112021002672T5_0964
    HEK3_6A_1HIS6INS
    Figure DE112021002672T5_0965
    Figure DE112021002672T5_0966
    		 13 52
    HEK3_6A_1HIS6INS
    Figure DE112021002672T5_0967
    HEK3_6A_5GTOT
    Figure DE112021002672T5_0968
    Figure DE112021002672T5_0969
    		 13 10
    HEK3_6A_5GTOT
    Figure DE112021002672T5_0970
    HEK3_6A_1CTTINS
    Figure DE112021002672T5_0971
    Figure DE112021002672T5_0972
    		 13 10
    HEK3_6A_1CTTINS
    Figure DE112021002672T5_0973
    HBB_6B_INSALL
    Figure DE112021002672T5_0974
    Figure DE112021002672T5_0975
    		 13 14
    HBB_6B_INSALL
    Figure DE112021002672T5_0976
    HBB_6B_CORRECT
    Figure DE112021002672T5_0977
    Figure DE112021002672T5_0978
    		 13 14
    HBB_6B_CORRECT
    Figure DE112021002672T5_0979
    HBB_6B_CORRECT_W_SILENT
    Figure DE112021002672T5_0980
    Figure DE112021002672T5_0981
    		 13 14
    HBB_6B_CORRECT_W_SILENT
    Figure DE112021002672T5_0982
    HEXA_6B_INSTALL
    Figure DE112021002672T5_0983
    Figure DE112021002672T5_0984
    		 12 14
    HEXA_6B_CORRECT
    Figure DE112021002672T5_0985
    Figure DE112021002672T5_0986
    		 10 21
    HEXA_6B_CORRECT_W_SIL.ENT
    Figure DE112021002672T5_0987
    Figure DE112021002672T5_0988
    		 9 27
    PRNP_6C
    Figure DE112021002672T5_0989
    Figure DE112021002672T5_0990
    		 12 12
    HEK3_6EG_1TTOG
    Figure DE112021002672T5_0991
    Figure DE112021002672T5_0992
    		 13 10
    HEK3_6EG_1CTTINS
    Figure DE112021002672T5_0993
    Figure DE112021002672T5_0994
    		 13 10
    RNF2_6EG_1CTOC
    Figure DE112021002672T5_0995
    Figure DE112021002672T5_0996
    		 15 14
    HBB_6EG_4ATOT
    Figure DE112021002672T5_0997
    Figure DE112021002672T5_0998
    		 13 14
    HEK3_6H_1HIS6INS
    Figure DE112021002672T5_0999
    Figure DE112021002672T5_1000
    		 13 52
    HEK3_6H_1FLAGINS
    Figure DE112021002672T5_1001
    Figure DE112021002672T5_1002
    		 13 58
    Tabelle 3L: FIG. 47A-74D PEgRNA
    PEGRNA SPACER-SEQUENZ (SEQ-ID-NR: 3541- 3547) 3'- VERLÄNGERUNGSSEQ UENZ (SEQ-ID-NR: 3549- 3556) PBS- LÄNGE (NT) RT- TEMPLAT LÄNGE (NT)
    HEK3_ED4B_1 T DEL
    Figure DE112021002672T5_1003
    Figure DE112021002672T5_1004
    		 13 9
    HEK3_ED4B_1A INS
    Figure DE112021002672T5_1005
    Figure DE112021002672T5_1006
    		 13 11
    HEK3_ED4B_1C TTINS
    Figure DE112021002672T5_1007
    Figure DE112021002672T5_1008
    		 13 13
    HEK3_ED4C_2G TOC
    Figure DE112021002672T5_1009
    Figure DE112021002672T5_1010
    		 13 10
    HEK3_ED4D_1F LAGINS
    Figure DE112021002672T5_1011
    Figure DE112021002672T5_1012
    		 13 58
    RNF2_ED4E_1C TOA
    Figure DE112021002672T5_1013
    Figure DE112021002672T5_1014
    		 15 14
    EMX1_ED4F_1G TOC
    Figure DE112021002672T5_1015
    Figure DE112021002672T5_1016
    		 13 13
    HBB_ED4G_2TT OA
    Figure DE112021002672T5_1017
    Figure DE112021002672T5_1018
    		 12 14
    Tabelle 3M: FIG. 48A-48C PEgRNA
    PEGRNA SPACER- SEQUENZ (SEQ-ID-NR: 3557-3627) 3'- VERLÄNGERUNGSSEQUENZ (SEQ-ID-NR: 3628-3698) PBS- LÄNGE (NT) RT- TEMPLAT- LÄNGE (NT)
    VEGFA_ED5 A_31
    Figure DE112021002672T5_1019
    Figure DE112021002672T5_1020
    		 13 31
    VEGFA_ED5 A_30
    Figure DE112021002672T5_1021
    Figure DE112021002672T5_1022
    		 13 30
    VEGFA_ED5 A_29
    Figure DE112021002672T5_1023
    Figure DE112021002672T5_1024
    		 13 29
    VEGFA_ED5 A_28
    Figure DE112021002672T5_1025
    Figure DE112021002672T5_1026
    		 13 28
    VEGFA_ED5 A_27
    Figure DE112021002672T5_1027
    Figure DE112021002672T5_1028
    		 13 27
    VEGFA_ED5 A_26
    Figure DE112021002672T5_1029
    Figure DE112021002672T5_1030
    		 13 26
    VEGFA_ED5 A_25
    Figure DE112021002672T5_1031
    Figure DE112021002672T5_1032
    		 13 25
    VEGFA_ED5 A_24
    Figure DE112021002672T5_1033
    Figure DE112021002672T5_1034
    		 13 24
    VEGFA_ED5 A_23
    Figure DE112021002672T5_1035
    Figure DE112021002672T5_1036
    		 13 23
    VEGFA_ED5 A_22
    Figure DE112021002672T5_1037
    Figure DE112021002672T5_1038
    		 13 22
    VEGFA_ED5 A_21
    Figure DE112021002672T5_1039
    Figure DE112021002672T5_1040
    		 13 21
    VEGFA_ED5 A_20
    Figure DE112021002672T5_1041
    Figure DE112021002672T5_1042
    		 13 20
    VEGFA_ED5 A_19
    Figure DE112021002672T5_1043
    Figure DE112021002672T5_1044
    		 13 19
    VEGFA_ED5 A_18
    Figure DE112021002672T5_1045
    Figure DE112021002672T5_1046
    		 13 18
    VEGFA_ED5 A_17
    Figure DE112021002672T5_1047
    Figure DE112021002672T5_1048
    		 13 17
    VEGFA_ED5 A_16
    Figure DE112021002672T5_1049
    Figure DE112021002672T5_1050
    		 13 16
    VEGFA_ED5 A_15
    Figure DE112021002672T5_1051
    Figure DE112021002672T5_1052
    		 13 15
    VEGFA_ED5 A_14
    Figure DE112021002672T5_1053
    Figure DE112021002672T5_1054
    		 13 14
    VEGFA_ED5 A_13
    Figure DE112021002672T5_1055
    Figure DE112021002672T5_1056
    		 13 13
    VEGFA_ED5 A_12
    Figure DE112021002672T5_1057
    Figure DE112021002672T5_1058
    		 13 12
    VEGFA_ED5 A_11
    Figure DE112021002672T5_1059
    Figure DE112021002672T5_1060
    		 13 11
    VEGFA_ED5 A_10
    Figure DE112021002672T5_1061
    Figure DE112021002672T5_1062
    		 13 10
    VEGFA_ED5 A_9
    Figure DE112021002672T5_1063
    Figure DE112021002672T5_1064
    		 13 9
    VEGFA_ED5 A_8
    Figure DE112021002672T5_1065
    		 AGCACTCATCTGGCCTGCAGA 13 8
    DNMT1_ED5 B_31
    Figure DE112021002672T5_1066
    Figure DE112021002672T5_1067
    		 13 31
    DNMT1_ED5 B_30
    Figure DE112021002672T5_1068
    Figure DE112021002672T5_1069
    		 13 30
    DNMT1_ED5 B_29
    Figure DE112021002672T5_1070
    Figure DE112021002672T5_1071
    		 13 29
    DNMT1_ED5 B_28
    Figure DE112021002672T5_1072
    Figure DE112021002672T5_1073
    		 13 28
    DNMT1_ED5 B_27
    Figure DE112021002672T5_1074
    Figure DE112021002672T5_1075
    		 13 27
    DNMT1_ED5 B_26
    Figure DE112021002672T5_1076
    Figure DE112021002672T5_1077
    		 13 26
    DNMT1_ED5 B_25
    Figure DE112021002672T5_1078
    Figure DE112021002672T5_1079
    		 13 25
    DNMT1_ED5 B_24
    Figure DE112021002672T5_1080
    Figure DE112021002672T5_1081
    		 13 24
    DNMT1_ED5 B_23
    Figure DE112021002672T5_1082
    Figure DE112021002672T5_1083
    		 13 23
    DNMT1_ED5 B_22
    Figure DE112021002672T5_1084
    Figure DE112021002672T5_1085
    		 13 22
    DNMT1_ED5 B_21
    Figure DE112021002672T5_1086
    Figure DE112021002672T5_1087
    		 13 21
    DNMT1_ED5 B_20
    Figure DE112021002672T5_1088
    Figure DE112021002672T5_1089
    		 13 20
    DNMT1_ED5 B_19
    Figure DE112021002672T5_1090
    Figure DE112021002672T5_1091
    		 13 19
    DNMT1_ED5 B_18
    Figure DE112021002672T5_1092
    Figure DE112021002672T5_1093
    		 13 18
    DNMT1_ED5 B_17
    Figure DE112021002672T5_1094
    Figure DE112021002672T5_1095
    		 13 17
    DNMT1_ED5 B_16
    Figure DE112021002672T5_1096
    Figure DE112021002672T5_1097
    		 13 16
    DNMT1_ED5 B_15
    Figure DE112021002672T5_1098
    Figure DE112021002672T5_1099
    		 13 15
    DNMT1_ED5 B_14
    Figure DE112021002672T5_1100
    Figure DE112021002672T5_1101
    		 13 14
    DNMT1_ED5 B_13
    Figure DE112021002672T5_1102
    Figure DE112021002672T5_1103
    		 13 13
    DNMT1_ED5 B_12
    Figure DE112021002672T5_1104
    Figure DE112021002672T5_1105
    		 13 12
    DNMT1_ED5 B_11
    Figure DE112021002672T5_1106
    Figure DE112021002672T5_1107
    		 13 11
    DNMT1_ED5 B_10
    Figure DE112021002672T5_1108
    Figure DE112021002672T5_1109
    		 13 10
    DNMT1_ED5 B_9
    Figure DE112021002672T5_1110
    		 CACCACTGTTTCTGGCACCAGG 13 9
    DNMT1_ED5 B_8
    Figure DE112021002672T5_1111
    		 ACCACTGTTTCTGGCACCAGG 13 8
    RUNX1_ED5 C_31
    Figure DE112021002672T5_1112
    Figure DE112021002672T5_1113
    		 15 31
    RUNX1_ED5 C_30
    Figure DE112021002672T5_1114
    Figure DE112021002672T5_1115
    		 15 30
    RUNX1_ED5 C_29
    Figure DE112021002672T5_1116
    Figure DE112021002672T5_1117
    		 15 29
    RUNX1_ED5 C_28
    Figure DE112021002672T5_1118
    Figure DE112021002672T5_1119
    		 15 28
    RUNX1_ED5 C_27
    Figure DE112021002672T5_1120
    Figure DE112021002672T5_1121
    		 15 27
    RUNX1 ED5 C_26
    Figure DE112021002672T5_1122
    Figure DE112021002672T5_1123
    		 15 26
    RUNX1_ED5 C_25
    Figure DE112021002672T5_1124
    Figure DE112021002672T5_1125
    		 15 25
    RUNX1_ED5 C_24
    Figure DE112021002672T5_1126
    Figure DE112021002672T5_1127
    		 15 24
    RUNX1_ED5 C_23
    Figure DE112021002672T5_1128
    Figure DE112021002672T5_1129
    		 15 23
    RUNX1_ED5 C_22
    Figure DE112021002672T5_1130
    Figure DE112021002672T5_1131
    		 15 22
    RUNX1_ED5 C_21
    Figure DE112021002672T5_1132
    Figure DE112021002672T5_1133
    		 15 21
    RUNX1_ED5 C_20
    Figure DE112021002672T5_1134
    Figure DE112021002672T5_1135
    		 15 20
    RUNX1_ED5 C_19
    Figure DE112021002672T5_1136
    Figure DE112021002672T5_1137
    		 15 19
    RUNX1_ED5 C_18
    Figure DE112021002672T5_1138
    Figure DE112021002672T5_1139
    		 15 18
    RUNX1_ED5 C_17
    Figure DE112021002672T5_1140
    Figure DE112021002672T5_1141
    		 15 17
    RUNX1_EO5 C_16
    Figure DE112021002672T5_1142
    Figure DE112021002672T5_1143
    		 15 16
    RUNX1_ED5 C_15
    Figure DE112021002672T5_1144
    Figure DE112021002672T5_1145
    		 15 15
    RUNX1_ED5 C_14
    Figure DE112021002672T5_1146
    Figure DE112021002672T5_1147
    		 15 14
    RUNX1_ED5 C_13
    Figure DE112021002672T5_1148
    Figure DE112021002672T5_1149
    		 15 13
    RUNX1_ED5 C_12
    Figure DE112021002672T5_1150
    Figure DE112021002672T5_1151
    		 15 12
    RUNX1_ED5 C_11
    Figure DE112021002672T5_1152
    Figure DE112021002672T5_1153
    		 15 11
    RUNX1_ED5 C_10
    Figure DE112021002672T5_1154
    Figure DE112021002672T5_1155
    		 15 10
    RUNX1_ED5 C_9
    Figure DE112021002672T5_1156
    Figure DE112021002672T5_1157
    		 15 9
    Tabelle 3N: FIG. 48A-48C PEgRNA
    PEGRNA SPACER-SEQUENZ 3'- VERLÄNGERUNGSSEQUENZ PBS- LÄNGE (NT) RT- TEMPLAT- LÄNGE (NT)
    HEK3_ED6_5GTOA
    Figure DE112021002672T5_1158
    Figure DE112021002672T5_1159
    		 13 10
    Tabelle 3O: FIG. 48A-48C Nicking-sgRNA
    NICKING-SGRNA SPACER-SEQUENZ
    HEK3_ED6_+63 GCACATACTAGCCCCTGTCT (SEQ ID NO: 395)
    Tabelle 3P: FIG. 50A-50B PEgRNA
    PEGRNA SPACER (SEQ-ID-NR: 3699-3754) 3'-VERLÄNGERUNG (5' BIS 3')(SEQ-ID-NR: 3755-3810) PBS- LÄNGE (NT) RT- TEMPLAT- LÄNGE (NT)
    HBB 3.5
    Figure DE112021002672T5_1160
    Figure DE112021002672T5_1161
    		 12 14
    HBB 3.7
    Figure DE112021002672T5_1162
    Figure DE112021002672T5_1163
    		 13 14
    HBB 5.2
    Figure DE112021002672T5_1164
    Figure DE112021002672T5_1165
    		 13 19
    HBB 5.3
    Figure DE112021002672T5_1166
    Figure DE112021002672T5_1167
    		 13 17
    HBB 5.4
    Figure DE112021002672T5_1168
    Figure DE112021002672T5_1169
    		 13 16
    HBB 5.5
    Figure DE112021002672T5_1170
    Figure DE112021002672T5_1171
    		 13 13
    HBB 5.6
    Figure DE112021002672T5_1172
    Figure DE112021002672T5_1173
    		 13 12
    HBB 5.7
    Figure DE112021002672T5_1174
    		 ACTTCTCCTCAGGAGTCAGGTGCAC 13 21
    HBB 5.8
    Figure DE112021002672T5_1175
    Figure DE112021002672T5_1176
    		 12 19
    HBB 5.9
    Figure DE112021002672T5_1177
    Figure DE112021002672T5_1178
    		 12 17
    HBB 5.10
    Figure DE112021002672T5_1179
    Figure DE112021002672T5_1180
    		 12 16
    HBB 5.11
    Figure DE112021002672T5_1181
    Figure DE112021002672T5_1182
    		 12 13
    HBB 5.12
    Figure DE112021002672T5_1183
    		 GACTTCTCCTCAGGAGTCAGGTGCA 12 12
    HBB 5.13
    Figure DE112021002672T5_1184
    		 ACTTCTCCTCAGGAGTCAGGTGCA 12 14
    HEXA S1
    Figure DE112021002672T5_1185
    		 ATATCTTATGGCCCTGACTGGAA 13 14
    HEXA S2
    Figure DE112021002672T5_1186
    		 TATATCTTATGGCCCTGACTGGAA 13 15
    HEXA S3
    Figure DE112021002672T5_1187
    		 GTATATCTTATGGCCCTGACTGGAA 13 16
    HEXA S4
    Figure DE112021002672T5_1188
    Figure DE112021002672T5_1189
    		 13 19
    HEXA S5
    Figure DE112021002672T5_1190
    Figure DE112021002672T5_1191
    		 13 20
    HEXA S6
    Figure DE112021002672T5_1192
    Figure DE112021002672T5_1193
    		 13 21
    HEXA S7
    Figure DE112021002672T5_1194
    Figure DE112021002672T5_1195
    		 13 22
    HEXA S8
    Figure DE112021002672T5_1196
    		 ATATCTTATGGCCCTGACT 9 14
    HEXA S9
    Figure DE112021002672T5_1197
    		 TATATCTTATGGCCCTGACT 9 15
    HEXA S 10
    Figure DE112021002672T5_1198
    		 GTATATCTTATGGCCCTGACT 9 16
    HEXA S 11
    Figure DE112021002672T5_1199
    		 ACCGTATATCTTATGGCCCTGACT 9 19
    HEXA S 12
    Figure DE112021002672T5_1200
    		 AACCGTATATCTTATGGCCCTGACT 9 20
    HEXA S 13
    Figure DE112021002672T5_1201
    		 GAACCGTATATCTTATGGCCCTGACT 9 21
    HEXA S 14
    Figure DE112021002672T5_1202
    Figure DE112021002672T5_1203
    		 9 22
    HEXA S 15
    Figure DE112021002672T5_1204
    		 TGAACCGTATATCTTATGGCCCTGAC 8 22
    HEXA S 16
    Figure DE112021002672T5_1205
    Figure DE112021002672T5_1206
    		 10 22
    HEXA S 17
    Figure DE112021002672T5_1207
    Figure DE112021002672T5_1208
    		 11 22
    HEXA S 18
    Figure DE112021002672T5_1209
    Figure DE112021002672T5_1210
    		 12 22
    HEXA S 19
    Figure DE112021002672T5_1211
    Figure DE112021002672T5_1212
    		 13 22
    HEXA S 20
    Figure DE112021002672T5_1213
    Figure DE112021002672T5_1214
    		 14 22
    HEXA S 21
    Figure DE112021002672T5_1215
    Figure DE112021002672T5_1216
    		 15 22
    HEXA S 22
    Figure DE112021002672T5_1217
    Figure DE112021002672T5_1218
    		 9 25
    HEXA S 23
    Figure DE112021002672T5_1219
    Figure DE112021002672T5_1220
    		 9 26
    HEXA S24
    Figure DE112021002672T5_1221
    Figure DE112021002672T5_1222
    		 9 27
    HEXA S 25
    Figure DE112021002672T5_1223
    Figure DE112021002672T5_1224
    		 9 28
    HEXA S 26
    Figure DE112021002672T5_1225
    Figure DE112021002672T5_1226
    		 9 29
    HEXA 5
    Figure DE112021002672T5_1227
    Figure DE112021002672T5_1228
    		 13 21
    HEXA 6
    Figure DE112021002672T5_1229
    Figure DE112021002672T5_1230
    		 13 15
    HEXA 7
    Figure DE112021002672T5_1231
    Figure DE112021002672T5_1232
    		 15 21
    HEXA 8
    Figure DE112021002672T5_1233
    Figure DE112021002672T5_1234
    		 14 21
    HEXA 9
    Figure DE112021002672T5_1235
    Figure DE112021002672T5_1236
    		 12 21
    HEXA 10
    Figure DE112021002672T5_1237
    Figure DE112021002672T5_1238
    		 11 21
    HEXA 11
    Figure DE112021002672T5_1239
    Figure DE112021002672T5_1240
    		 10 21
    HEXA 12
    Figure DE112021002672T5_1241
    Figure DE112021002672T5_1242
    		 13 16
    HEXA 13
    Figure DE112021002672T5_1243
    Figure DE112021002672T5_1244
    		 13 18
    HEXA 14
    Figure DE112021002672T5_1245
    Figure DE112021002672T5_1246
    		 13 22
    HEXA 15
    Figure DE112021002672T5_1247
    Figure DE112021002672T5_1248
    		 13 25
    HEXA 16
    Figure DE112021002672T5_1249
    Figure DE112021002672T5_1250
    		 13 23
    HEXA 17
    Figure DE112021002672T5_1251
    		 AACCGTATATCCTATGGCCCTGACTG 10 16
    HEXA 18
    Figure DE112021002672T5_1252
    Figure DE112021002672T5_1253
    		 10 18
    HEXA 19
    Figure DE112021002672T5_1254
    Figure DE112021002672T5_1255
    		 10 22
    HEXA 20
    Figure DE112021002672T5_1256
    Figure DE112021002672T5_1257
    		 10 25
    Tabelle 3Q: FIG. 50A-50B Nicking-sgRNA
    NICKING-SGRNA SPACER-SEQUENZ
    HBB_ED7A_+72 GCCTTGATACCAACCTGCCCA (SEQ ID NO: 626)
    HEXA_ED7B_+60 GCTGGAACTGGTCACCAAGGC (SEQ ID NO: 627)
    HEXA_ED7B_CORRECT_WT_PE3B GTACCTGAACCGTATATCCTA (SEQ ID NO: 628)
    HEXA_ED7B_CORRECT_SILENT_PE3B GTACCTGAACCGTATATCTTA (SEQ ID NO: 629)
    Tabelle 3R: FIG. 51A-51G PEgRNA
    PEGRNA SPACER-SEQUENZ (SEQ-ID-NR: 632-640) 3'-VERLÄNGERUNG (SEQ- ID-NR: 641-649) PBS- LÄNGE (NT) RT- TEMPLAT- LÄNGE (NT)
    HEK3_ED8_1 T TOG
    Figure DE112021002672T5_1258
    Figure DE112021002672T5_1259
    		 13 10
    HEK3_ED8_3 A TOC
    Figure DE112021002672T5_1260
    Figure DE112021002672T5_1261
    		 13 10
    HEK3_ED8_3 A TOT
    Figure DE112021002672T5_1262
    Figure DE112021002672T5_1263
    		 13 10
    HEK3_ED8_3 A TOT_5- 6GGTOTT
    Figure DE112021002672T5_1264
    Figure DE112021002672T5_1265
    		 13 34
    HEK3_ED8 _1C TTINS
    Figure DE112021002672T5_1266
    Figure DE112021002672T5_1267
    		 13 10
    RNF2_E08_1 C TOA
    Figure DE112021002672T5_1268
    Figure DE112021002672T5_1269
    		 15 14
    RNF2_ED8_1 C TOG
    Figure DE112021002672T5_1270
    Figure DE112021002672T5_1271
    		 15 14
    RNF2_ED8_1 G TAINS
    Figure DE112021002672T5_1272
    Figure DE112021002672T5_1273
    		 15 17
    HBB_ED8_ 4AT OT
    Figure DE112021002672T5_1274
    Figure DE112021002672T5_1275
    		 13 14
    Tabelle 4: Sequenzen der Primer, die für die Amplifikation genomischer Säugetierzell- DNA und HTS181 verwendet wurden.
    BESCHREIBUNG SPACER (SEQ-ID-NR: 3811-3863)
    HEK3 FWD
    Figure DE112021002672T5_1276
    HEK3 REV
    Figure DE112021002672T5_1277
    RNF2 FWD
    Figure DE112021002672T5_1278
    RNF2 REV
    Figure DE112021002672T5_1279
    HEK4 FWD
    Figure DE112021002672T5_1280
    HEK4 REV
    Figure DE112021002672T5_1281
    EMX1 FWD
    Figure DE112021002672T5_1282
    EMX1 REV
    Figure DE112021002672T5_1283
    FANCF FWD
    Figure DE112021002672T5_1284
    FANCF REV
    Figure DE112021002672T5_1285
    HBB FWD
    Figure DE112021002672T5_1286
    HBB REV
    Figure DE112021002672T5_1287
    PRNP FWD
    Figure DE112021002672T5_1288
    PRNP REV
    Figure DE112021002672T5_1289
    HEXA FWD
    Figure DE112021002672T5_1290
    HEXA REV
    Figure DE112021002672T5_1291
    RUNX1 FWD
    Figure DE112021002672T5_1292
    RUNX1 REV
    Figure DE112021002672T5_1293
    VEGFA FWD
    Figure DE112021002672T5_1294
    VEGFA REV
    Figure DE112021002672T5_1295
    DNMT FWD
    Figure DE112021002672T5_1296
    DNMT REV
    Figure DE112021002672T5_1297
    HEK3 OFF- TARGET SITE 1 FWD
    Figure DE112021002672T5_1298
    HEK3 OFF- TARGET SITE 1 REV
    Figure DE112021002672T5_1299
    HEK3 OFF- TARGET SITE 2 FWD
    Figure DE112021002672T5_1300
    HEK3 OFF- TARGET SITE 2 REV
    Figure DE112021002672T5_1301
    HEK3 OFF- TARGET SITE 3 FWD
    Figure DE112021002672T5_1302
    HEK3 OFF- TARGET SITE 3 REV
    Figure DE112021002672T5_1303
    HEK3 OFF- TARGET SITE 4 FWD
    Figure DE112021002672T5_1304
    HEK3 OFF- TARGET SITE 4 REV
    Figure DE112021002672T5_1305
    HEK4 OFF- TARGET SITE 1 FWD
    Figure DE112021002672T5_1306
    HEK4 OFF- TARGET SITE 1 REV
    Figure DE112021002672T5_1307
    HEK4 OFF- TARGET SITE 2 FWD
    Figure DE112021002672T5_1308
    HEK4 OFF- TARGET SITE 2 REV
    Figure DE112021002672T5_1309
    HEK4 OFF- TARGET SITE 3 FWD
    Figure DE112021002672T5_1310
    HEK4 OFF- TARGET SITE 3 REV
    Figure DE112021002672T5_1311
    HEK4 OFF- TARGET SITE 4 FWD
    Figure DE112021002672T5_1312
    HEK4 OFF- TARGET SITE 4REV
    Figure DE112021002672T5_1313
    EMX1 OFF- TARGET SITE 1 FWD
    Figure DE112021002672T5_1314
    EMX1 OFF- TARGET SITE 1 REV
    Figure DE112021002672T5_1315
    EMX1 OFF- TARGET SITE 2 FWD
    Figure DE112021002672T5_1316
    EMX1 OFF- TARGET SITE 2 REV
    Figure DE112021002672T5_1317
    EMX1 OFF- TARGET SITE 3FWD
    Figure DE112021002672T5_1318
    EMX1 OFF- TARGET SITE 3 REV
    Figure DE112021002672T5_1319
    EMX1 OFF- TARGET SITE 4 FWD
    Figure DE112021002672T5_1320
    EMX1 OFF- TARGET SITE 4 REV
    Figure DE112021002672T5_1321
    FANCF OFF- TARGET SITE 1 FWD
    Figure DE112021002672T5_1322
    FANCF OFF- TARGET SITE 1 REV
    Figure DE112021002672T5_1323
    FANCF OFF- TARGET SITE 2 FWD
    Figure DE112021002672T5_1324
    FANCF OFF- TARGET SITE 2 REV
    Figure DE112021002672T5_1325
    FANCF OFF- TARGET SITE 3 FWD
    Figure DE112021002672T5_1326
    FANCF OFF- TARGET SITE 3 REV
    Figure DE112021002672T5_1327
    FANCF OFF- TARGET SITE 4 FWD
    Figure DE112021002672T5_1328
  • Tabelle 5: Sequenzen von 100-mer einzelsträngigen DNA-Oligonukleotid-Donor- Templaten, die in HDR-Experimenten und bei der Herstellung der HBB-E6V-HEK293T- Zelllinie verwendet wurden. Die Oligonukleotide haben eine Länge von 100-103 nt mit Homologiearmen, die um die Stelle des Edits zentriert sind. Die Oligonukleotide stammen von Integrated DNA Technologies, gereinigt durch PAGE.
    HEK3 +3 A TO T
    Figure DE112021002672T5_1329
    HEK3 +3 A TO T, +5,6 GG TO TT
    Figure DE112021002672T5_1330
    HEK3 +1 T T OG
    Figure DE112021002672T5_1331
    HEK3 +3 A T OC
    Figure DE112021002672T5_1332
    HEK3+1 CTT INSERTION
    Figure DE112021002672T5_1333
    RNF2 +1 C TO A
    Figure DE112021002672T5_1334
    RNF2 +1 C TO G
    Figure DE112021002672T5_1335
    RNF2 +1 GTA INSERTION
    Figure DE112021002672T5_1336
    HBB E6V INSTALLATION (ALSO USED FOR CREATION OF THE HBB E6V HEK293T CELL LINE)
    Figure DE112021002672T5_1337
    HBB E6V CORRECTION PROTOSPACER A
    Figure DE112021002672T5_1338
    HBB E6V CORRECTION PROTOSPACER B
    Figure DE112021002672T5_1339
    HBB E6V CORRECTION PROTOSPACER B, SILENT PAM MUTATION
    Figure DE112021002672T5_1340
    PRNP G127V
    Figure DE112021002672T5_1341
  • Zusätzliche Sequenzen
  • Sequenzen der hierin verwendeten dual-fluoreszierenden Hefe-Reporterplasmide
    p425-GFP_stop_mCherry:
    Figure DE112021002672T5_1342
    Figure DE112021002672T5_1343
    Figure DE112021002672T5_1344
    Figure DE112021002672T5_1345

    p425-GFP_+1fs_mCherry.
    Figure DE112021002672T5_1346
    Figure DE112021002672T5_1347
    Figure DE112021002672T5_1348
    Figure DE112021002672T5_1349

    p425-GFP_-lfs_mCherry:
    Figure DE112021002672T5_1350
    Figure DE112021002672T5_1351
    Figure DE112021002672T5_1352
    Figure DE112021002672T5_1353
  • LEGENDE:
    • GFP offener Leserahmen
    • Linker, enthaltend Stopcodon +1 Frameshift, oder -1 Frameshift
    • mCherry offener Leserahmen
    • Plasmid-Rückgrat (enthält den GPD-Promotor, Leu2-Marker und AmpR)
  • Protospacer (unterstrichen)
  • PAM (fettgedruckt)
  • DNA-Sequenzen von Prime-Editor-Plasmiden von Säugetieren und beispielhaftes PEgRNA-Plasmid
    pCMV PEI:
    Figure DE112021002672T5_1354
    Figure DE112021002672T5_1355
    Figure DE112021002672T5_1356
    Figure DE112021002672T5_1357

    pCMV-PE2:
    Figure DE112021002672T5_1358
    Figure DE112021002672T5_1359
    Figure DE112021002672T5_1360
    Figure DE112021002672T5_1361

    N-terminale NLS + Cas9 H840A
    Flexibler Linker
  • M-MLV reverse Transkriptase + C-terminale NLS
  • Plasmid-Rückgrat (enthaltend CMV-Promotor und AmpR)
    pU6-HEK3_PEgRNA_CTTins:
    Figure DE112021002672T5_1362
    Figure DE112021002672T5_1363
    U6-Promotorsequenz
  • Spacer-Sequenz
  • sgRNA-Gerüst
  • 3'-Verlängerung (enthält PBS und RT-Templat)
  • Rückgrat (enthält AmpR)
    pLenti-hSyn-N-PE2-NpuN-P2A-GFP-KASH_U6-DNMTI-PEgRNA:
    Figure DE112021002672T5_1364
    Figure DE112021002672T5_1365
    Figure DE112021002672T5_1366
    Figure DE112021002672T5_1367
  • U6-Promotor
  • PEgRNA
  • hSynpromotor
    N-termPE2
    N-termNpu
  • P2A-GFP-KASH
  • pLenti-hSyn-C-PE2-NpuC:
    Figure DE112021002672T5_1368
    Figure DE112021002672T5_1369
    Figure DE112021002672T5_1370
    Figure DE112021002672T5_1371

    hSynpromotor
    C-termNpu
  • C-termwtCas9
  • pLenti-U6-DNMTI_nicking_sgRNA:
    Figure DE112021002672T5_1372
    Figure DE112021002672T5_1373
    Figure DE112021002672T5_1374
    U6Promoter
  • sgRNA
  • Aminosäuresequenzen der hierin verwendeten Varianten der reversen Transkriptase des Maloney-Mausleukämievirus (M-MLV RT).
    PE1 M-MLV RT:
    Figure DE112021002672T5_1375
    M3 M-ML VRT (D200N, T330P, L603W) (siehe Baranauskas et al.181):
    Figure DE112021002672T5_1376
    PE2 M-MLVRT (D200N, T306K, W313F, T330P, L603W):
    Figure DE112021002672T5_1377
    M3-deadRT M-MLV RT:
    Figure DE112021002672T5_1378
  • Referenzen für Beispiel 2
  • Jede der folgenden Referenzen wird in Beispiel 12 zitiert, von denen jede hierin durch Bezugnahme aufgenommen wird
    • 1. Landrum, M. J. et al. ClinVar: public archive of interpretations of clinically relevant variants. Nucleic Acids Res. 44, D862-D868 (2016).
    • 2. Jinek, M. et al. A Programmable Dual-RNA-Guided DNA Endonucluse in Adaptive Bacterial Immunity. Science 337, 816-821 (2012).
    • 3. Cong, L. et al. Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems. Science 339, 819- 823 (2013).
    • 4. Mali, P. et al. RNA-Guided Human Genome Engineering via Cas9. Science 339, 823-826 (2013).
    • 5. Yang, H. et al. One-Stcp Generation of Mice Carrying Reporter and Conditional Alleles by CRISPR/Cas-Mediated Genome Engineering. Cell 154, 1370-1379 (2013).
    • 6. Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J. & Kim, J.-S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonuclcoprotcins. Genome Res. 24, 1012-1019 (2014).
    • 7. Orlando, S. J. et al. Zinc-finger nuclease-driven targeted integration into mammalian genomεs using donors with limited chromosomal homology. Nucleic Acids Res. 38, el52-el52 (2010).
    • 8. Tsai, S. Q. et al. GUlDE-seq enables genome-wide profiling of off-target cleavage by CRISPRCas nucleases. Nat. Biotechnol. 33, 187-197 (2015).
    • 9. Suzuki, K. et al. In vivo genome editing via CRISPR/Cas9 mediated homology-independent targeted integration. Nature 540, 144-149 (2016).
    • 10. Kosicki, M., Tomberg, K. & Bradley, A. Repair of double-strand breaks induced by CRISPRCas9 leads to large deletions and complex rearrangements. Nat. Biotechnol. 36,765-771 (2018).
    • 11. Haapanicmi, E., Botla, S., Persson, J., Schmierer, B. & Taipale, J. CRISPR-Cas9 genome editing induces a p53-medialed DNA damage response. Nat. Med. 24, 927-930 (2018).
    • 12. Ihry, R. J. et al. p53 inhibits CRISPR-Cas9 engineering in human pluripotent stem cells. Nat. Metd. 24,939-946 (2018).
    • 13. Rouet, P., Smih, F. & Jasin, M. Expression of a sile-specific endonuclease stimulates homologous recombination in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sei. 91, 6064-6068 (1994).
    • 14. Chapman, J. R., Taylor, M. R. G. & Boulton, S. J. Playing the end game: DNA double-strand break repair pathway choice. Mol. Cell 47, 497-510 (2012).
    • 15. Cox, D. B. T., Platt, R. J. & Zhang, F. Therapeutic genome editing: prospects and challenges. Nat. Med. 21, 121-131 (2015).
    • 16. Paquet. D. et al. Efficient introduction of specific homozygous and heterozygous mutations using CRISPR/Cas9. Nature 533,125-129 (2016).
    • 17. Chu, V. T. et al. Increasing the efficiency of homology-directed repair for CRISPR-Cas9-induccd precise gene editing in mammalian cells. Nat. Biotechnol. 33, 543-548 (2015).
    • 18. Maruyama, T. et al. Increasing the efficiency of precise genome editing with CRISPR-Cas9 by inhibition of nonhomologous end joining. Nat. Biotechnol. 33, 538-542 (2015).
    • 19. Rees, H. A., Yεh, W.-H. & Liu, D. R. Development of hRad51-Cas9 nickase fusions that mediale HDR without doublc-strandcd breaks. Nat. Commun. 10.1-12 (2019).
    • 20. Shen, M. W. et al. Predictable and precise template-free CRISPR editing of pathogenic variants. Nature 563, 646-651 (2018).
    • 21. Rees, H. A. & Liu, D. R. Base editing: precision chemistry on the genome and transcriptome of living cells. Nat. Rev. Genet. 19,770 (2018).
    • 22. Komor, A. C., Kim, Y. B., Packer, M. S., Zuris, J. A. & Liu, D. R. Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature 533, 420-424 (2016).
    • 23. Gaudelli, N. M. et al. Programmable base editing of A·T to G·C in genomic DNA without DNA cleavage. Nature 551, 464-471 (2017).
    • 24. Gao, X. et al. Treatment of autosomal dominant Hearing loss by in vivo delivery of genome editing agents. Nature 553, 217-221 (2018).
    • 25. Ingram, V. M. A specific chemical difference between the globins of normal human and sicklecell anaemia haemoglobin. Nature 178, 792-794 (1956).
    • 26. Mycrowitz, R. & Costigan, F. C. The major defect in Ashkenazi Jews with Tay-Sachs disease is an insertion in the gene für the alpha-chain of beta-hexosaminidase. J. Biol. Chem. 263, 18587-18589 (1988).
    • 27. Zielenski, J. Genotype and Phenotype in Cystic Fibrosis. Respiration 67, 117-133 (2000).
    • 28. Mead, S. et al. A Novel Protective Prion Protein Variant that Colocalizes with Kuru Exposure. N. Engl. J. Med. 361, 2056-2065 (2009).
    • 29. Marraffini, L. A. & Sontheimer, E. J. CRISPR interference limits horizontal gene transfer in staphylococci by targeting DNA. Science 322, 1843-1845 (2008).
    • 30. Ban angou, R. et al. CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes. Science 315, 1709-1712 (2007).
    • 31. Jiang, F. & Doudna, J. A. CRISPR-Cas9 Structures and Mechanisms. Anna. Rev. Biophys. 46, 505-529 (2017).
    • 32. Hille, F. et al. The Biology of CRISPR-Cas: Backward and Forward. Cell 172, 1239-1259 (2018).
    • 33. Luan, D. D., Korman, M. H., Jakubczak, J. L. & Eickbush, T. H. Reverse transcription of R2Bm RNA is primed by a nick at the chromosomal target site: a mechanism for non-LTR retrotransposition. Cell 72, 595-605 (1993).
    • 34. Liu, Y., Kao, H.-1. & Bambara, R. A. Flap endonuclease 1: a central component of DNA metabolism. Annu. Rev. Biochem. 73,589-615 (2004).
    • 35. Richardson, C. D., Ray, G. J., DeWitt, M. A., Curie, G. L. & Corn, J.E. Enhancing homology directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetric donor DNA. Nat. Biotechnol. 34, 339-344 (2016).
    • 36. Qi, L. S. et al. Repurposing CRISPR as an RNA-Guided Platfonn for Sequence-Specific Control of Gene Expression. Cell 152, 1173-1183 (2013).
    • 37. Shechner, D. M., Hacisuleyman, E., Younger, S. T. & Rinn, J. L. Multiplexable, locus-specific targeting of long RNAs with CRISPR-Display. Nat. Methods 12,664-670 (2015).
    • 38. Tang, W., Hu, J. H. & Liu, D. R. Aptazyme-embedded guide RNAs enablc ligand-responsive genome editing and transcriptional activation. Nat. Commun. 8,15939 (2017).
    • 39. Jinck, M. et al. Structures of Cas9 Endonucleases Revcal RNA-Mediated Conformational Activation. Science 343, 1247997 (2014).
    • 40. Nishimasu, H. et al. Crystal Structure of Cas9 in Complex with Guide RNA and Target DNA. Cell 155, 935-949 (2014).
    • 41. Jiang, F., Zhou, K., Ma, L., Gressel, S. & Doudna, J. A. A Cas9-guide RNA complex preorgatiized for target DNA recognition. Science 348, 1477-1481 (2015).
    • 42. Baranauskas, A. et al. Generation and characterization of new highly thermostable and processive M-MuLV reverse transcriptase variants. Protein Eng. Des. Sei. 25, 657-668 (2012).
    • 43. Gerard, G. F. et al. The role of template-primer in protection of reverse transcriptase from thermal inactivation. Nucleic Acids Res. 30, 3118-3129 (2002).
    • 44. Arezi, B. & Hogrefe, H. Novel mutations in Moloney Murine Leukemia Virus reverse transcriptase increase thermostability through tighter binding to template-primer. Nucleic Acids Res. 37. 473-481 (2009).
    • 45. Kotewicz, M. L., Sampson, C. M., D'Alessio, J. M. & Gerard, G. F. Isolation of cloned Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase lacking ribonuclease H activity. Nucleic Acids Res. 16, 265-277 (1988).
    • 46. Thuronyi, B. W. et al. Continuous evolution of base editors with expanded target compatibility and improved activity. Nat. Biotechnol. (2019). doi:10.1038/s41587-019-0193-0
    • 47. Kim, Y. B. et al. Increasing the genome-targeting scope and precision of base editing with engineered Cas9-cytidine deaminase fusions. Nat. Biotechnol. 35, 371-376 (2017).
    • 48. Koblan, L. W. et al. Improving cytidine and adenine base editors by expression optimization and anccstral reconstruction. Nat. Biotechnol. (2018). doi:10.1038/nbt.4172
    • 49. Kleinstiver, B. P. et al. High-fidelity CRISPR-Cas9 nucleases with no detectable genome-wide off target effects. Nature 529, 490-495 (2016).
    • 50. Zuo, E. et al. Cytosine base editor generates substantial off-target single-nucleotide variants in mouse embryos. Science 364, 289-292 (2019).
    • 51. Jin, S. et al. Cytosine, but not adenine, base editors induce genome-wide off-target mutations in rice. Science 364, 292-295 (2019).
    • 52. Kim, D., Kim, D., Lee, G., Cho, S.-I. & Kim, J.-S. Genome-wide target specificity of CRISPR RNA guided adenine base editors. Nat. Biotechnol. 37, 430-435 (2019).
    • 53. Grunewald, J. et al. Transcriptome-wide off-target RNA editing induced by CRISPR-guided DNA base editors. Nature 569, 433-437 (2019).
    • 54. Zhou, C. et al. Off-target RNA mutation induced by DNA base editing and its elimination by mutagenesis. Nature 571, 275-278 (2019).
    • 55. Rees, H. A., Wilson, C., Doman, J. L. & Liu, D. R. Analysis and minimization of cellular RNA editing by DNA adenine base editors. Sei. Adv. 5, eaax5717 (2019).
    • 56. Osteitag, L. M. & Kazazian Jr, H. H. Biology of Mammalian L1 Retrotransposons. Annu. Rev. Genet. 35,501-538 (2001).
    • 57. Griffiths, D. J. Endogenous retroviruses in the human genome sequence. Genome Biol. 2, REVJEWS1017 (2001).
    • 58. Berkhout, B., Jebbink, M. & Zsiros, J. Identification of an Active Reverse Transcriptase Enzyme Encoded by a Human Endogenous HERV-K Retrovirus. J. Virol. 73, 2365-2375 (1999).
    • 59. Halvas, E. K., Svarovskaia, E. S. & Pathak, V. K. Role of Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase Deoxyribonucleoside Triphosphate-Binding Site in Retroviral Replication and in Vivo Fidelity. J. Virol. 74, 10349-10358 (2000).
    • 60. Dever, D. P. et al. CRISPR/Cas9 Beta-globin Gene Targeting in Human Hematopoietic Stern Cells. Nature 539, 384-389 (2016).
    • 61. Park, S. H. et al. Highly efficient editing of the β-globin gene in patient-derived hematopoietic stem and progenitor cells to treat sickle cell disease. Nucleic Acids Res. doi:10.1093/nar/gkz475
    • 62. Collinge, J. Prion diseases of humans and animals: their causes and molecular basis. Annu. Rev. Neurosci. 24, 519-550 (2001).
    • 63. Asante, E. A. et al. A naturally occurring variant of the human prion protein completely prevents prion disease. Nature 522, 478-481 (2015).
    • 64. Zettler, J., Schutz, V. & Mootz, H. D. The naturally split Npu DnaE intein exhibits an extraordinarily high rate in the protein trans-splicing reaction. FEBS Leu. 583, 909-914 (2009).
    • 65. Kugler, S., Kilic, E. & Bahr, M. Human synapsin 1 gene promoter confers highly neuron-specific long-term transgene expression from an adenoviral vector in the adult rat brain depending on the transduced area. Gene Ther. 10. 337-347 (2003).
    • 66. de Felipe, P., Hughes, L. E., Ryan, M. D. & Brown, J. D. Co-translational, intraribosomal cleavageof polypeptides by the foot-and-mouth disease virus 2A peptide. J. Biol. Chem. 278, 11441- 11448 (2003).
  • 1. Etablierung einer Leit-RNA-templierten reversen Transkription von mutagenen DNA-Strängen.
  • Hintergrund und Argumentation
  • Bei der vorgeschlagenen Genom-Editing-Strategie fungiert der mit Cas9 genickte Nicht-Ziel-DNA-Strang (PAM-haltiger Strang, der die R-Schleife bildet) als Primer für die DNA-Synthese. Die Hypothese, dass dies möglich ist, basiert auf mehreren biochemischen und strukturellen Daten. Nuklease-Schutz-Experimente32, kristallografische Studien33 und Basen- Editing-Fenster4,24 haben ein hohes Maß an Flexibilität und Unordnung für die Nicht- Zielstrang-Nukleotide -20 bis -10 innerhalb der sogenannten R-Schleife des Cas9-gebundenen Komplexes (die Nummerierung gibt den Abstand 5' vom ersten PAM-Nukleotid an) gezeigt. Darüber hinaus kann der PAM-distale Abschnitt des gespaltenen Nicht-Zielstrangs aus den fest gebundenen ternären Komplexen verdrängt werden, wenn komplementäre ssDNA in trans20 hinzugefügt wird. Diese Studien belegen, dass der Nicht-Zielstrang hochflexibel und für Enzyme zugänglich ist und dass nach dem Nicking der 3'-Terminus des PAM-distalen Fragments vor der Dissoziation von Cas9 freigesetzt wird. Außerdem wird angenommen, dass gRNAs auf die Templat-DNA-Synthese verlängert werden können. Frühere Studien haben gezeigt, dass gRNAs für SpCas9, SaCas9 und LbCas12a (ehemals Cpfl) gRNA- Verlängerungen mit RNA-Aptameren34, Liganden-induzierbaren selbstspaltenden Ribozymen35 und langen nicht-kodierenden RNAs36 tolerieren. In dieser Literatur finden sich Hinweise auf zwei wichtige Merkmale, die genutzt werden sollen. Bei der Bewertung dieser Strategie werden mehrere CRISPR-Cas-Systeme in Verbindung mit 5'- und 3'-verlängerten gRNA-Ausgestaltungen unter Verwendung einer Kombination von In vitro- und zellulären Tests bewertet (2A-2C).
  • Ausgestaltungen für gRNAs, die für das TRT-Editing entwickelt wurden, werden in 3A-3B gezeigt. Die DNA-Synthese verläuft von 5' nach 3' und kopiert somit das RNA- Templat in der Richtung 3' nach 5'. Die Ausgestaltung für die 5'-Verlängerung enthält eine Linker-Region, eine Primer-Bindungsstelle, an der der genickte DNA-Strang annealisiert, und ein Templat für die DNA-Synthese durch reverse Transkription. Die 3'-verlängerte gRNA enthält eine Primer-Bindungsstelle und ein Templat für die reverse Transkription. In einigen Fällen wird die 3'-RNA-Haarnadel des gRNA-Kerns so modifiziert, dass sie mit der DNA- Zielsequenz übereinstimmt, da In-vitro-Experimente gezeigt haben, dass die reverse Transkription den gRNA-Kern für die 3'-verlängerten gRNA-Konstrukte um ~3 Nukleotide verlängert (die Modifikation der Haarnadelsequenz scheint gut toleriert zu werden, solange kompensatorische Änderungen vorgenommen werden, die die Haarnadel-RNA-Struktur erhalten). Die DNA-Synthese verläuft von 5' bis 3', wobei die Nukleotide an das 3' OH des wachsenden DNA-Strangs angefügt werden.
  • Vorläufige Ergebnisse
  • Cas9-genickte DNA stimuliert die reverse Transkription von gRNA-Templaten. Um die Zugänglichkeit des genickten Nicht-Ziel-DNA-Strangs zu bewerten, wurden biochemische In-vitro-Tests mit der Cas9-Nuklease aus S. Pyogenes (SpCas9) und Cy5- fluoreszenzmarkierten Duplex-DNA-Substraten (51 Basenpaare) ausgeführt. Zunächst wurde eine Reihe von gRNAs, die 5'-Verlängerungen mit unterschiedlichen Längen des Synthese- Templats enthielten, durch In-vitro-Transkription hergestellt (die Gesamtausgestaltung wird in 2B gezeigt). Elektrophoretische Mobilitätsverschiebungstests (EMSA) mit nukleasefreiem Cas9 (dCas9) ergaben, dass 5'-verlängerte gRNAs die Zielbindungsaffinität aufrechterhalten (Daten nicht gezeigt). Als Nächstes wurde die TPRT-Aktivität an vorgenickten Cy5-markierten Duplex-DNA-Substraten unter Verwendung von dCas9, 5'verlängerten gRNAs und reverser Transkriptase des Molony-Mausleukämie-Virus (M-MLV) (Superscript III) getestet. Nach einer einstündigen Inkubation bei 37 °C wurden die Produkte mittels denaturierender Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) ausgewertet und mit Cy5- Fluoreszenz abgebildet (4A). Jede 5'-verlängerte gRNA-Variante führte zu einer signifikanten Produktbildung, wobei die beobachteten DNA-Produktgrößen mit der Länge des Templats für die Verlängerung übereinstimmten (4B). Wichtig ist, dass in Abwesenheit von dCas9 die vorgenickten Substrate auf die volle Länge von 51 bp des DNA-Substrats verlängert wurden, was stark darauf hindeutet, dass der komplementäre DNA-Strang und nicht die gRNA als Templat für die DNA-Synthese verwendet wurde, wenn dCas9 nicht vorhanden war (4C). Bemerkenswert ist, dass das System so ausgestaltet wurde, dass der neu synthetisierte DNA-Strang das Produkt widerspiegelt, das für das Editieren der Zielstelle erforderlich wäre (ein homologer Strang mit einer einzigen Nukleotidänderung). Dieses Ergebnis belegt, dass die Cas9:gRNA-Bindung das 3'-Ende des genickten Nicht-Zielstrangs freilegt und dass der Nicht-Zielstrang für die reverse Transkription zugänglich ist.
  • Als Nächstes wurden nicht genickte dsDNA-Substrate unter Verwendung der Cas9(H840A)-Mutante untersucht, die den Nicht-Ziel-DNA-Strang genickt hat. Um die Nickase-Aktivität von Cas9(H840A) mit 5'-verlängerten gRNAs zu testen, wurden zunächst In-vitro-Spaltungstests ausgeführt, wie zuvor beschrieben37. Obwohl das Nicking im Vergleich zur Standard-gRNA beeinträchtigt war, wurden nennenswerte Spaltprodukte gebildet (4D). Wichtig ist, dass RT-Produkte auch beobachtet wurden, wenn TPRT-Reaktionen mit 5'-verlängerten gRNAs und Cas9(H840A) durchgeführt wurden, wenn auch mit geringeren Erträgen, die sich wahrscheinlich durch die verminderte Nicking-Aktivität erklären lassen (4D). Dieses Ergebnis belegt, dass 5'-verlängerte gRNA:Cas9(H840A)-Komplexe DNA nicken und Templat-Reverse-Transkription durchführen können.
  • Schließlich wurden 3'-gRNA-Verlängerungen auf Cas9(H840A)-Nicking und TPRT untersucht. Im Vergleich zu 5'-verlängerten gRNAs war die DNA-Spaltung durch 3'verlängerte gRNAs im Vergleich zu den Standard-gRNAs nicht in nennenswertem Umfang beeinträchtigt. Bezeichnenderweise unterstützten 3'-verlängerte gRNA-Template auch eine effiziente reverse Transkription mit sowohl genickten als auch intakten Duplex-DNA- Substraten, wenn M-MLV RT in trans zugeführt wurde (4E). Überraschenderweise wurde bei 3'-verlängerten Templaten nur ein einziges Produkt beobachtet, was darauf hinweist, dass die reverse Transkription an einer bestimmten Stelle entlang des gRNA-Gerüsts endet. Das Homopolymer-Tailing des Produkts mit terminaler Transferase, gefolgt von Klenow- Verlängerung und Sanger-Sequenzierung, ergab, dass das gesamte gRNA-Synthese-Templat zusätzlich zu den terminalen 3 Nukleotiden des gRNA-Kerns kopiert wurde. In Zukunft wird der Flap-Terminus durch Modifizieren der terminalen gRNA-Sequenz umprogrammiert38,39. Dieses Ergebnis zeigt, dass 3'-verlängerte gRNAs als effiziente Nuklease-Targeting-Guides dienen und als Templat für die reverse Transkription dienen können.
  • Cas9-TPRT verwendet genickte DNA und gRNA in cis. Mithilfe von Zweifarb- Experimenten wurde bestimmt, ob die RT-Reaktion vorzugsweise mit der gRNA in cis (im selben Komplex gebunden) abläuft (siehe 8). Es wurden zwei separate Experimente für 5'-verlängerte und 3'-verlängerte gRNAs durchgeführt. Für ein bestimmtes Experiment wurden ternäre Komplexe aus dCas9, gRNA und DNA-Substrat in separaten Röhrchen gebildet. In einem Röhrchen kodiert die gRNA ein langes RT-Produkt und das DNA-Substrat ist mit Cy3 (rot) markiert; im anderen kodiert die gRNA ein kurzes RT-Produkt und das DNA-Substrat ist mit Cy5 (blau) markiert. Nach kurzen Inkubationen wurden die Komplexe gemischt und anschließend mit RT-Enzym und dNTPs behandelt. Die Produkte wurden durch Harnstoffdenaturierende PAGE aufgetrennt und durch Fluoreszenz im Cy3- und Cy5-Kanal sichtbar gemacht. Es wurde festgestellt, dass die Reaktionsprodukte bevorzugt unter Verwendung des gRNA-Templats gebildet werden, das mit dem DNA-Substrat vorkomplexiert wurde, was darauf hindeutet, dass die RT-Reaktion wahrscheinlich in cis stattfinden kann. Diese Ergebnisse belegen, dass ein einzelner Cas9:gRNA-Komplex eine DNA-Stelle anvisieren und die reverse Transkription eines mutagenen DNA-Strangs einleiten kann.
  • Testen von TPRT mit anderen Cas-Systemen
  • Ähnliche Experimente wie in den vorangegangenen Abschnitten werden mit anderen Cas-Systemen durchgeführt, einschließlich Cas9 von S. Aureus und Cas12a von L. Bacterium (siehe 2A-2C). Wenn TRPT auch für diese Cas-Varianten nachgewiesen werden kann, würden sich der potenzielle Umfang des Editing und die Wahrscheinlichkeit eines Gesamterfolgs in Zellen erhöhen.
  • Testen von TPRT mit RT-Cas9-Fusionsproteinen
  • Eine Reihe von kommerziell erhältlichen oder reinigbaren RT-Enzymen wird zunächst in trans auf TPRT-Aktivität untersucht. Neben der bereits getesteten RT aus M-MLV werden die RT aus dem Avian Myeloblastosis Virus (AMV), das Geobacillus stearothermophilus Group II Intron (GsI-IIC)41,42 und das Eubacterium rectale Group II Intron (Eu.re.I2)43,44 untersucht. Bezeichnenderweise führen die beiden letztgenannten RTs die TPRT in ihrem natürlichen biologischen Kontext aus. Gegebenenfalls werden RNAse inaktivierende Mutationen und andere potenziell nützliche Modifikationen des RT-Enzyms getestet. Sobald funktionsfähige RTs bei In-Trans-Zuführung identifiziert sind, wird jede als Fusionsprotein zu Cas9-Varianten bewertet. Es werden sowohl die N-Terminus- als auch die C-Terminus- Fusionsausrichtung sowie verschiedene Linkerlängen und -architekturen getestet. Kinetische Zeitverlaufsexperimente sollen bestimmen, ob TPRT unter Verwendung des RT-Enzyms in cis stattfinden kann. Wenn eine RT-Cas9-Fusionsarchitektur konstruiert werden kann, die eine effiziente TPRT-Chemie ermöglicht, wird dies die Wahrscheinlichkeit eines funktionellen Editings im Kontext einer Zelle erheblich erhöhen.
  • Cas9-Targeting mit konstruierten gRNAs in Zellen
  • Die konstruierten Kandidaten-gRNAs, die in den vorangegangenen Unterzielen entwickelt wurden, werden in humanen Zellkulturexperimenten (HEK293) evaluiert, um die Effizienz des Cas9-Targetings zu bestätigen. Mithilfe etablierter Indel-Bildungstests unter Verwendung von Wildtyp-SpCas945 werden die entwickelten gRNAs Seite an Seite mit Standard-gRNAs an 5 oder mehr Stellen im humanen Genom verglichen. Die Effizienz des Genom-Editings wird durch Amplikon-Sequenzierung im Multiplexverfahren mit der im Labor befindlichen Illumina MiSeq-Plattform charakterisiert. Es wird erwartet, dass die Ergebnisse aus diesem und den vorangegangenen Abschnitten Erkenntnisse erzeugen, die in die nachfolgenden Iterationen des Ausgestaltungs-Bau-Test-Zyklus einfließen, in denen gRNAs sowohl für das Templating der reversen Transkription als auch für die effiziente Cas9- Zielsteuerung in Zellen optimiert werden können.
  • Die Ergebnisse der In-vitro-Validierungen werden in den 5-7 gezeigt. In-vitro- Experimente haben gezeigt, dass der genickte Nicht-Ziel-DNA-Strang flexibel und für das Priming der DNA-Synthese verfügbar ist, und dass die gRNA-Verlängerung als Templat für die reverse Transkription dienen kann (siehe 5). In diesem Satz von Experimenten wurden 5'-verlängerte gRNAs (Ausgestaltung wie in 3A-3B) mit Synthese-Templaten unterschiedlicher Länge (links aufgeführt) verwendet. Als Substrate wurden fluoreszierend markierte (Cy5) DNA-Ziele verwendet, die in diesem Satz von Experimenten vorgenickt wurden. Bei dem in diesen Experimenten verwendeten Cas9 handelt es sich um katalytisch totes Cas9 (dCas9), das keine DNA schneiden, aber dennoch effizient binden kann. Superscript III, ein kommerzielles RT, das aus dem Moloney-Mausleukämie-Virus (M-MLV) abgeleitet ist, wurde in trans zugeführt. Zunächst wurden aus den gereinigten Komponenten dCas9:gRNA-Komplexe gebildet. Dann wurde das fluoreszenzmarkierte DNA-Substrat zusammen mit dNTPs und dem RT-Enzym zugegeben. Nach einer einstündigen Inkubation bei 37 °C wurden die Reaktionsprodukte durch denaturierende Harnstoff-Polyacrylamid- Gelelektrophorese (PAGE) analysiert. Das Gelbild zeigt die Verlängerung des ursprünglichen DNA-Strangs auf Längen, die mit der Länge des Templats für die reverse Transkription übereinstimmen. Bemerkenswert ist, dass Reaktionen, die in Abwesenheit von dCas9 durchgeführt wurden, unabhängig von der verwendeten gRNA DNA-Produkte mit einer Länge von 51 Nukleotiden erzeugten. Dieses Produkt entspricht der Verwendung des komplementären DNA-Strangs als Templat für die DNA-Synthese und nicht der RNA (Daten nicht gezeigt). Die Cas9-Bindung ist also erforderlich, um die DNA-Synthese auf das RNA- Templat zu lenken. Dieser Satz von In vitro-Experimenten weist enge Parallelen zu denen in 5 auf, außer, dass das DNA-Substrat nicht genickt ist und eine Cas9-Nickase (SpyCas9 H840A-Mutante) verwendet wird. Wie im Gel gezeigt, spaltet die Nickase den DNA-Strang effizient, wenn die Standard-gRNA verwendet wird (gRNA_0, Spur 3). Es werden mehrere Spaltprodukte beobachtet, was mit früheren biochemischen Untersuchungen von SpyCas9 übereinstimmt. Die 5'-Verlängerung beeinträchtigt die Nicking-Aktivität (Spuren 4-8), aber es wird immer noch ein RT-Produkt beobachtet. 7 zeigt, dass 3'-Verlängerungen die DNA- Synthese unterstützen und die Cas9-Nickase-Aktivität nicht signifikant beeinflussen. Vorgenickte Substrate (schwarzer Pfeil) werden nahezu quantitativ in RT-Produkte umgewandelt, wenn entweder dCas9 oder Cas9-Nickase verwendet werden (Spuren 4 und 5). Mehr als 50 % Umwandlung in das RT-Produkt (roter Pfeil) wird mit vollen Substraten (Spur 3) beobachtet. Um die Länge und Sequenz des RT-Produkts zu bestimmen, wurde die Produktgruppe aus dem Gel herausgeschnitten, extrahiert und sequenziert. Dies ergab, dass die RT 3 Nukleotide in die 3'-terminale Haarnadel des gRNA-Kerns verlängert. Anschließende Experimente (nicht gezeigt) zeigten, dass diese drei Nukleotide so verändert werden können, dass sie mit den Sequenzen der Ziel-DNA übereinstimmen, solange komplementäre Änderungen vorgenommen werden, die die Haarnadel-RNA-Struktur erhalten.
  • Potenzielle Schwierigkeiten und Alternativen
  • (1) RT funktioniert nicht als Fusion: Molekulares Gedränge und/oder ungünstige Geometrien könnten die Polymeraseverlängerung durch Cas9-fusionierte RT-Enzyme behindern. Zunächst kann eine Optimierung des Linkers getestet werden. Es werden zirkulär permutierte Varianten von Cas9 untersucht, die die räumliche Beziehung zwischen DNA- Primer, gRNA und RT-Enzym neu ausrichten könnten. Nicht-kovalente RT- Rekrutierungsstrategien, wie in Ziel 2 beschrieben, können getestet werden. (2) Verminderte Cas-Targeting-Effizienz durch verlängerte gRNA-Varianten: Dies ist am ehesten ein Problem für 5'-verlängerte gRNAs. Basierend auf Strukturdaten24 können Cas9-Mutanten entworfen und gescreent werden, um Varianten mit größerer Toleranz gegenüber gRNA-Verlängerung zu identifizieren. Darüber hinaus Signifikanzkönnten gRNA-Bibliotheken in Zellen auf Linker gescreent werden, die die Targeting-Aktivität verbessern.
  • Signifikanz
  • Diese vorläufigen Ergebnisse belegen, dass Cas9-Nickasen und verlängerte gRNAs eine gezielte reverse Transkription an gebundenen DNA-Zielen mithilfe einer in trans zugeführten reversen Transkriptase einleiten können. Wichtig ist, dass sich die Cas9-Bindung als entscheidend für die Produktbildung erwiesen hat. Auch wenn dies vielleicht keine absolute Voraussetzung für das Genom-Editing in Zellen ist, würde eine weitere Entwicklung des Systems, die die Funktion des RT-Enzyms in cis einbezieht, die Erfolgswahrscheinlichkeit bei zellbasierten Anwendungen deutlich erhöhen. Die Verwirklichung der verbleibenden Aspekte dieses Ziels würde eine molekulare Grundlage für die Durchführung des Präzisions-Genom- Editing im Kontext des humanen Genoms bereitstellen.
  • 2. Etablierung von Prime-Editing in humanen Zellen.
  • Hintergrund und Argumentation
  • Die vorgeschlagene Strategie sieht vor, dass ein künstlich hergestellter RT- Cas9:gRNA-Komplex mutagene 3'-DNA-Flaps an genomischen Zielstellen einführt. Es wird angenommen, dass mutagene 3'-Flaps, die eine einzelne Diskrepanz enthalten, von der DNA- Reparaturmaschinerie durch energetisch zugängliche Äquilibrierung mit benachbarten 5'-Flaps inkorporiert werden, die dann bevorzugt entfernt werden (1C-1D). Die DNA- Replikations- und -Reparaturmaschinerie stößt bei der Verarbeitung von Okazaki- Fragmenten46 und während der Long-Patch-Base-Excision-Repair (LP-BER)47 auf 5'-ssDNA- Flaps. 5'-Flaps sind die bevorzugten Substrate für die weithin exprimierte Flap-Endonuklease FEN1, die durch den homotrimeren Gleitklemmenkomplex PCNA48 an DNA-Reparaturstellen rekrutiert wird. PCNA dient auch als Gerüst für die gleichzeitige Rekrutierung anderer Reparaturfaktoren, einschließlich der DNA-Ligase Lig149. Als „Werkzeuggürtel“ beschleunigt PCNA die serielle Flap-Spaltung und -Ligierung, die für die Verarbeitung der Millionen von Okazaki-Fragmenten, die bei jeder Zellteilung erzeugt werden, unerlässlich ist50,51. Basierend auf der Ähnlichkeit mit diesen natürlichen DNA-Zwischenprodukten wird angenommen, dass mutagene Stränge durch Gleichgewicht mit 5'-Flaps eingebaut werden, gefolgt von koordinierter 5'-Flap-Exzision und Ligation. Die Diskrepanz-Reparatur (MMR) sollte dann auf beiden Strängen mit gleicher Wahrscheinlichkeit stattfinden, was zu Editing oder Reversion führt (1C-1D). Alternativ könnte die DNA-Replikation zuerst stattfinden und direkt zum Einbau des Editing in den neu synthetisierten Tochterstrang führen. Während der höchste zu erwartende Wirkungsgrad dieses Prozesses bei 50 % liegt, könnten mehrere Versuche des Editings von Substraten die Reaktion aufgrund der Unumkehrbarkeit der Reparatur durch Editing zum Abschluss bringen.
  • Vorläufiges Ergebnis
  • DNA-Flaps induzieren stellenspezifische Mutagenese in Plasmid-Modellsubstraten in Hefe und HEK-Zellen. Um die vorgeschlagene Editing-Strategie zu testen, wurden Studien mit Modellplasmid-Substraten begonnen, die mutagene 3'-Flaps enthalten, die dem Produkt von TPRT ähneln. Es wurde ein dual-fluoreszierender Protein-Reporter entwickelt, der ein Stoppcodon zwischen GFP und mCherry kodiert. Mutagene Flaps kodieren eine Korrektur des Stoppcodons (9A), was die Synthese von mCherry ermöglicht. Somit kann die Effizienz der Mutagenese anhand des Verhältnisses GFP mCherry quantifiziert werden. Die Plasmidsubstrate wurden in vitro hergestellt und in Hefe- (S.Cerevisiae) oder humane Zellen (HEK293) eingebracht. In beiden Systemen wurde eine hochfrequente Mutagenese beobachtet (9B), und isolierte Hefekolonien enthielten entweder die umgewandelte Base, die mutierte Base oder eine Mischung aus beiden Produkten (9C). Die Erkennung des letzteren lässt darauf schließen, dass die Plasmidreplikation in diesen Fällen vor der MMR stattfand, und legt ferner nahe, dass die Flap-Exzision und -Ligation der MMR vorausgehen. Dieses Ergebnis belegt die Durchführbarkeit des DNA-Editings mit 3' mutagenen Strängen.
  • • Systematische Studien mit Modell-Flap-Substraten
  • Basierend auf den oben beschriebenen vorläufigen Ergebnissen soll ein breiteres Spektrum von Flap-Substraten in HEK-Zellen untersucht werden, um die Prinzipien des effizienten Editings zu ermitteln. 3' ssDNA-Flaps werden systematisch variiert, um den Einfluss von Diskrepanz-Paarungen, die Position des mutagenen Nukleotids entlang des Flaps und die Identität des terminalen Nukleotids zu bestimmen (9D). Einzelne Nukleotidinsertionen und -deletionen werden ebenfalls getestet. Zur Analyse der Präzision des Editing wird die Sequenzierung von Amplikons verwendet. Diese Ergebnisse werden in die Ausgestaltung von Templaten für die reverse Transkription von gRNA einfließen.
  • In-vitro-TPRT auf Plasmidsubstraten führt zu effizienten Editing-Ergebnissen. Die in Ziel 1 entwickelten TPRT-Reaktionen wurden verwendet, um Mutagenese in einem Plasmidsubstrat zu induzieren. Die Reaktion wurde mit zirkulären DNA-Plasmidsubstraten durchgeführt (siehe 10). Dies schließt die Möglichkeit einer DNA-Strangdissoziation als Mechanismus für die RT-Verlängerung in den vorherigen In-vitro-Experimenten aus. Außerdem konnte so die DNA-Reparatur von Flap-Substraten in Zellen getestet werden. Für die Exprimierung in Hefe (S. Cerevisiae) wurde ein dual-fluoreszierendes Reporterplasmid konstruiert. Dieses Plasmid kodiert GFP (grünes fluoreszierendes Protein) und mCherry (rot fluoreszierendes Protein) mit einem dazwischenliegenden Stoppcodon (TGA). Die Exprimierung dieses Konstrukts in Hefe erzeugt nur GFP. Das Plasmid wurde als Substrat für In-vitro-TRT verwendet [Cas9(H840A) Nickase, manipulierte gRNA, MLV RT-Enzym, dNTPS]. Die gRNA-Verlängerung kodiert eine Mutation zum Stoppcodon. Der Flap-Strang wird für die Reparatur des Stoppcodons verwendet, und es wird erwartet, dass ein Plasmid entsteht, das sowohl GFP als auch mCherry als Fusionsprotein exprimiert. Die Hefe-Dual-FP- Plasmid-Transformanten werden in 10 gezeigt. Die Transformation des Elternplasmids oder eines In-vitro-Cas9(H840A)-genickten Plasmids führt nur zu Kolonien, die grünes GFP exprimieren. Die TRT-Reaktion mit 5'-verlängerten oder 3'-verlängerten gRNAs erzeugt eine Mischung aus grünen und gelben Kolonien. Letztere exprimieren sowohl GFP als auch mCherry. Mit der 3'-verlängerten gRNA werden mehr gelbe Kolonien beobachtet. Eine positive Kontrolle, die kein Stoppcodon enthält, ist ebenfalls abgebildet.
  • Dieses Ergebnis belegt, dass lange doppelsträngige Substrate TPRT unterzogen werden können und dass TPRT-Produkte in eukaryontischen Zellen Editing induzieren.
  • Ein weiteres Experiment, das dem vorangegangenen Prime-Editing-Experiment ähnelt, wurde durchgeführt. Anstatt jedoch eine Punktmutation in das Stoppcodon einzubauen, wird beim TRT-Editing eine einzelne Nukleotid-Insertion (links) oder -Deletion (rechts) eingebaut, die eine Frameshift-Mutation repariert und die Synthese von nachgeschaltetem mCherry ermöglicht (siehe 11). In beiden Experimenten wurden 3'-verlängerte gRNAs verwendet. Einzelne Kolonien aus den TRT-Transformationen wurden ausgewählt und mittels Sanger- Sequenzierung analysiert (siehe 12). Grüne Kolonien enthielten Plasmide mit der ursprünglichen DNA-Sequenz, während gelbe Kolonien die präzise Mutation enthielten, die durch die TRT-Editing-gRNA ausgestaltet wurde. Andere Punktmutationen oder Indels wurden nicht beobachtet.
  • Etablieren von Prime-Editing in HEK-Zellen unter Verwendung von RT-Cas9- Architekturen
  • Die optimierten Konstrukte aus den vorangegangenen Zielen werden für die Exprimierung in Säugetieren und das Editing an Zielstellen im humanen Genom angepasst. Es werden mehrere RT-Enzyme und Fusionsarchitekturen getestet, zusätzlich zum benachbarten Targeting mit sekundären gRNAs (trunkiert, um Nicking zu verhindern). Die nicht-kovalente RT-Rekrutierung wird auch unter Verwendung des Sun-Tag-Systems52 und des MS2-Aptamer- Systems53 bewertet. Indel-Bildungstests werden zur Bewertung der Targeting-Effizienz mit Standard-gRNAs und RT-Cas9-Fusionen (wie oben) verwendet. Anschließend werden für jede genomische Stelle verlängerte gRNAs und RT-Cas9-Paare auf das Editing einzelner Nukleotide getestet. Die Editing-Ergebnisse werden mit MiSeq ausgewertet.
  • Erste Experimente in HEK-Zellen wurden mit Cas9-RT-Fusionen ausgeführt. Für das Editing durch Komponenten, die in Zellen exprimiert werden, sind eine Cas9(H840A)- Nickase, eine reverse Transkriptase (als Fusion exprimiert oder in trans zugeführt) und eine konstruierte gRNA mit einer 3'-Verlängerung erforderlich (siehe 14). Vorläufige Studien deuteten darauf hin, dass die Länge der Primer-Bindungsstelle innerhalb der gRNA- Verlängerung für die Steigerung der Editing-Effizienz in humanen Zellen wichtig war (siehe 15).
  • Optimieren der Parameter für das Prime-Editing in HEK-Zellen
  • Nach dem Identifizieren von Cas9-RT-Architekturen, die Prime-Editing in Zellen ausführen können, werden die Komponenten und die Ausgestaltung optimiert, um ein hocheffizientes Editing zu erreichen. Der Ort und die Nukleotid-Identität der kodierten Punktmutation sowie die Gesamtlänge des neu synthetisierten DNA-Strangs werden variiert, um den Umfang des Editing und mögliche Einschränkungen zu bewerten. Kurze Insertions- und Deletionsmutationen werden ebenfalls untersucht. Die Konstrukte für die Proteinexprimierung werden kodonoptimiert. Im Erfolgsfall würde dies zu einem effizienten Prime-Editing in Säugetierzellen führen.
  • Vorläufiges Ergebnis. Es wurden zusätzliche gRNAs ausgestaltet, um das RT-Enzym auf eine höhere lokale Konzentration am Editing-Locus zu bringen, falls eine intramolekulare reverse Transkription durch das fusionierte RT-Enzym nicht möglich wäre. Diese Hilfs-Guides sind am 5'-Ende (14-15-nt-Spacer) trunkiert, von dem zuvor gezeigt wurde, dass es das Schneiden durch Cas9 verhindert, aber die Bindung aufrechterhält (siehe 16). Der HEK3- Locus wurde ausgewählt, um diese Strategie zu erforschen.
  • Potenzielle Schwierigkeiten und Alternativen
  • 1) gRNA-FIGau in Zellen: Wenn verlängerte gRNA-Termini in Zellen trunkiert werden, könnten stabilisierende Sekundärstrukturen eingebaut oder synthetische gRNAs mit stabilisierenden Modifikationen getestet werden. (2) Kein beobachtetes Editing in humanen Zellen: Es werden zusätzliche Strategien erforscht, die eine sekundäre Ausrichtung von RT- Cas9-Fusionen auf benachbarte genomische Stellen beinhalten54. Darüber hinaus könnten potenzielle Strategien der gerichteten Evolution in E. Coli oder S. Cerevisiae erforscht werden.
  • Signifikanz
  • Wenn Prime-Editing in experimentellen Zelllinien etabliert werden könnte, hätte dies unmittelbare Auswirkungen auf die biomedizinische Grundlagenforschung, da es die rasche Erzeugung und Charakterisierung einer großen Anzahl von Punktmutationen in humanen Genen ermöglichen würde. Die Allgemeingültigkeit des Verfahrens und sein orthogonales Editing-Fenster in Bezug auf die Editoren von Basen würde einen Ansatz zum Einbau vieler derzeit unzugänglicher Mutationen bereitstellen. Wenn das Prime-Editing für eine hohe Effizienz und Produktreinheit optimiert werden könnte, wäre seine potenzielle Anwendbarkeit für die Korrektur von Krankheitsmutationen in anderen humanen Zelltypen von Bedeutung.
  • 3. Erreichen von stellenspezifischem Editing pathogener Mutationen in kultivierten humanen Zellen.
  • Hintergrund und Argumentation.
  • Eine große Anzahl pathogener Mutationen kann von den derzeitigen Editoren nicht korrigiert werden, da PAM-Beschränkungen bestehen oder eine Korrektur von Transversionen oder Indel-Mutationen erforderlich ist. Mit Prime-Editing sind theoretisch alle Transitionen und Transversionen möglich, ebenso wie kleine Insertionen und Deletionen. Außerdem unterscheidet sich das Prime-Editing-Fenster (voraussichtlich -3 bis +4) in Bezug auf die PAM von dem der Basen-Editoren (-18 bis -12) (13). Mendelsche Erkrankungen, die derzeit nicht durch Editoren korrigiert werden können, beinhalten: (1) die Sichelzellenkrankheit Glu6Val-Gründermutation in Hämoglobin beta (erfordert eine A·T-T·A-Transversion); (2) die häufigste Variante der Wilson-Krankheit His1069G1n in ATP7B (erfordert eine G·C-T·A- Transversion); und (3) die ΔPhe508-Mutation in CFTR, die zystische Fibrose verursacht (erfordert eine 3-Nukleotid-Insertion). Jedes dieser Ziele enthält eine entsprechend positionierte PAM für SpCas9-Targeting und Prime-Editing.
  • Vorläufige Ergebnisse.
  • • Das T-zu-A-Editing in HEK3-Zellen ist nicht durch das aktuelle Basen-Editing erreichbar, aber erreichbar durch das TRPT-Editing (siehe FIG. 17A-17C).
  • 17A zeigt einen Graph, der die prozentuale Umwandlung von T zu A am Zielnukleotid nach Transfektion von Komponenten in humanen embryonalen Nieren(HEK)- Zellen darstellt. Diese Daten zeigen Ergebnisse unter Verwendung einer N-terminalen Fusion von reverser Transkriptase des Wildtyps von MLV mit Cas9(H840A)-Nickase (32- Aminosäure-Linker). Die Editing-Effizienz wurde drastisch verbessert, wenn die Länge der Primer-Bindungsstelle von 7 Nukleotiden auf 11 oder 12 Nukleotide verlängert wird. Darüber hinaus verbessert der Hilfs-Guide A, der unmittelbar vor dem Editing-Locus angeordnet ist (siehe 16), die Editing-Aktivität erheblich, insbesondere für Primer-Bindungsstellen kürzerer Länge. Die Editing-Effizienz wurde durch Amplikon-Sequenzierung mit der Illumina MiSeq-Plattform quantifiziert. 17B zeigt ebenfalls die prozentuale Umwandlung von T zu A am Zielnukleotid nach der Transfektion von Komponenten in humanen embryonalen Nieren(HEK)-Zellen, wobei diese Daten jedoch Ergebnisse unter Verwendung einer C- terminalen Fusion des RT-Enzyms zeigen. In diesem Fall weist der Hilfs-Guide A keine so große Wirkung auf, und die Editing-Effizienz ist insgesamt höher. 17C zeigt Daten, die Ergebnisse unter Verwendung einer N-terminalen Fusion von reverser Transkriptase des Wildtyps von MLV mit Cas9(H840A)-Nickase ähnlich der in 17A darstellen; allerdings ist der Linker zwischen der MLV-RT und Cas9 60 Aminosäuren lang statt 32 Aminosäuren.
  • • Das T-zu-A-Editing an der HEK3-Stelle durch TRPT-Editing ergibt eine hohe Reinheit
  • 18 zeigt die Ausgabe der Sequenzierungsanalyse durch Hochdurchsatz- Amplikon-Sequenzierung. Die Ausgabe zeigt die am häufigsten vorkommenden Genotypen der editierten Zellen. Bemerkenswert ist, dass keine größeren Indel-Produkte erhalten werden und die gewünschte Punktmutation (T zu A) sauber und ohne Bystander-Editings eingebaut wird. Die erste Sequenz zeigt den Referenzgenotyp. Die beiden oberen Produkte sind der Ausgangsgenotyp, der einen endogenen Polymorphismus (G oder A) enthält. Die beiden unteren Produkte stellen die korrekt editierten Genotypen dar.
  • • MLV-RT-Mutanten verbessern das Editing.
  • Die mutante reverse Transkriptase, die in Baranauskas et al. (doi:10.1093/protein/gzs034) beschrieben ist, wurde als C-terminale Fusion mit der Cas9(H840A)-Nickase für das Editing von Zielnukleotiden in humanen embryonalen Nieren(HEK)-Zellen getestet. Das Cas9-RT-Editor-Plasmid wurde mit einem Plasmid co- transfiziert, das für eine 3'-Prime-Editing Leit-RNA kodiert, die die reverse Transkription kodiert. Die Editing-Effizienz am Zielnukleotid (blaue Balken) wird neben den Indel-Raten (orangefarbene Balken) in 19 gezeigt. WT bezieht sich auf das Wildtyp-MLV-RT- Enzym. Die mutierten Enzyme (M1 bis M4) enthalten die rechts aufgeführten Mutationen. Die Editing-Raten wurden durch Hochdurchsatz-Sequenzierung von genomischen DNA- Amplikonen quantifiziert.
  • Komplementäres Strang-Nicking mit einer zweiten gRNA verbessert das Editing.
  • In diesem Experiment wird die Editing-Effizienz des Zielnukleotids bewertet, wenn ein einzelsträngiges Nicking in den komplementären DNA-Strang in der Nähe des Zielnukleotids eingeführt wird, wobei die Hypothese lautet, dass dies die Diskrepanzreparatur dazu veranlasst, das ursprüngliche Nukleotid bevorzugt zu entfernen und das Basenpaar in den gewünschten Edit umzuwandeln. Das Cas9(H840A)-RT-Editing-Konstrukt wurde mit zwei Leit-RNA kodierenden Plasmiden co-transfiziert, von denen eines die reverse Transkription kodiert, während das andere den komplementären DNA-Strang für das Nicking kodiert. Es wurde Nicking in verschiedenen Abständen vom Zielnukleotid getestet (orangefarbene Dreiecke) (siehe 20). Die Editing-Effizienz am Zielbasenpaar (blaue Balken) ist zusammen mit der Indel-Bildungsrate (orangefarbene Balken) dargestellt. Das „Null“-Beispiel enthält keine Leit- RNA mit komplementärem Nicking. Die Editing-Raten wurden durch Hochdurchsatz- Sequenzierung von genomischen DNA-Amplikonen quantifiziert.
  • 21 zeigt verarbeitete Hochdurchsatz-Sequenzierungsdaten, die die gewünschte T- zu-A-Transversionsmutation und das generelle Fehlen anderer wichtiger Nebenprodukte des Genom-Editing zeigen.
  • Anwendungsbereich. Der mögliche Anwendungsbereich der neuen Editing- Technologie ist in 13 dargestellt und wird mit Deaminase-vermittelten Editoren- Technologien für Basen verglichen. Bisherige Editoren zielen auf eine Region ~15 ± 2 bp stromaufwärts der PAM ab. Durch die Umwandlung der Zielnukleotide C oder A zu T bzw. G ermöglichen die bisher entwickelten Basen-Editoren alle Übergangsmutationen (Umwandlung von A:T zu G:C). Die bisher entwickelten Basen-Editoren sind jedoch nicht in der Lage, Transversionsmutationen (A zu T, A zu C, G zu T, G zu C, T zu A, T zu G, C zu A, C zu G) einzubauen. Wenn sich außerdem mehrere Zielnukleotide im Editing-Fenster befinden, kann es zu zusätzlichen unerwünschten Edits kommen.
  • Mit der neuen Prime-Editing-Technologie könnten theoretisch alle Nukleotid- und Basenpaarumwandlungen und möglicherweise auch kleine Insertions- und Deletions-Edits vorgenommen werden. In Bezug auf die PAM beginnen die Prime-Editing-Fenster an der Stelle des DNA-Nickings (3 Basen stromaufwärts der PAM) und enden an einer noch unbestimmten Position stromabwärts der PAM. Dieses Editing-Fenster unterscheidet sich übrigens von dem der Deaminase-Editoren. Da das TPRT-System das Editing mithilfe von DNA-Polymerase- Enzymen ausführt, weist es potenziell alle ihre Vorteile auf, einschließlich Allgemeinheit, Präzision und Verlässlichkeit.
  • Korrigieren pathogener Mutationen in von Patienten stammenden Zelllinien.
  • Zelllinien mit den entsprechenden Mutationen (Sichelzellenkrankheit: CD34+ hämatopoetische Stammzellen; Morbus Wilson: kultivierte Fibroblasten; zystische Fibrose: kultivierte Bronchialepithelien) werden von ATCC, der Coriell Biobank oder kooperierenden Harvard/Broad-Partnerlabors bezogen. Die Editing-Effizienz wird durch Hochdurchsatz- Sequenzierung bewertet, und die Wirksamkeit des korrigierten Genotyps wird mit phänotypischen Tests (Hämoglobin-HPLC, ATP7B-Immunfärbung und CFTR- Membranpotenzial-Tests) getestet.
  • Charakterisieren der Off-Target-Editing-Aktivität.
  • Potenzielles Off-Target-Editing wird mit etablierten Verfahren wie GUIDE-seq55 und CIRCLE-seq56 unter Verwendung von Ziel-gRNAs gepaart mit Wildtyp-Cas9 untersucht. Wenn potenzielle Off-Targets identifiziert werden, werden diese Loci in TPRT-editierten Zellen untersucht, um echte Off-Target-Editing-Ereignisse zu identifizieren.
  • Potenzielle Schwierigkeiten und Alternativen.
  • (1) Geringe Editing-Effizienz: Prime-Editoren (PE) müssen möglicherweise für jedes Ziel optimiert werden. In diesem Fall können gRNA-Bibliotheken getestet werden, um die am besten funktionierenden Varianten für bestimmte Anwendungen zu ermitteln. Die Exprimierung der RT-Cas-Fusion und die Nuklearlokalisierung können optimiert werden. Liposomale RNP können eingesetzt werden, um Off-Target Editing zu begrenzen.
  • Kommende Experimente.
  • Die Optimierung der gRNA-Ausgestaltungen kann durch die weitere Erforschung der Länge der Primer-Bindungsstelle und der Verlängerung des Synthese-Templats erreicht werden. Die Tests werden verschiedene Nukleotidumwandlungen, kleine Insertionen und Deletionen sowie verschiedene Editing-Positionen in Bezug auf PAM und mehrere Stellen im humanen Genom beinhalten. Die Optimierung der RT-Komponente beinhaltet die Erforschung von Mutationen in der MLV-RT zur Steigerung der Aktivität (Inaktivierung von Rnase H, Erhöhung der Bindungsaffinität zwischen Primer und Templat, Anpassungen der Prozessivität) sowie von neuen RT-Enzymen (Intro-RTs der Gruppe II, andere retrovirale RTs).
  • Signifikanz
  • Unzählige genetische Erkrankungen sind auf Veränderungen einzelner Nukleotide in einzelnen Genen zurückzuführen. Die Entwicklung der hier beschriebenen Genom-Editing- Technologie und ihre Anwendung in krankheitsrelevanten Zelltypen würde eine Grundlage für die Umsetzung in die Klinik schaffen. Bei einigen Krankheiten wie der Sichelzellkrankheit stellt eine einzelne Punktmutation den in der gesamten Bevölkerung domanten Genotyp dar. Bei vielen anderen genetischen Erkrankungen wird jedoch in der gesamten Patientenpopulation eine große Heterogenität verschiedener Punktmutationen innerhalb eines einzigen Gens beobachtet, von denen jede zu einem ähnlichen Krankheitsphänotyp führt. Als allgemeines Verfahren des Genom-Editing, das theoretisch eine große Zahl solcher Mutationen angreifen könnte, könnte diese Technologie daher einen enormen potenziellen Nutzen für viele dieser Patienten und ihre Familien bereitstellen. Wenn der Grundsatzbeweis für diese Anwendungen in Zellen erbracht werden könnte, würde dies die Grundlage für Studien an Tiermodellen für Krankheiten bilden.
  • Vorteile
  • Präzision: der gewünschte Edit wird gezielt in der Sequenz der Nukleinsäure kodiert. Allgemeingültigkeit: Theoretisch können alle Basenpaarumwandlungen, einschließlich Transversions-Edits, sowie kleine Insertionen oder Deletionen vorgenommen werden. Es gibt ein eindeutiges Editing-Fenster, das sich von dem der Basen-Editoren in Bezug auf die Cas9- Protospacer-Attachment-Motiv(PAM) -Sequenz unterscheidet. Mit diesem Verfahren werden viele der Editing-Funktionen von HDR (homology-directed repair) erreicht, jedoch ohne die großen Einschränkungen von HDR (ineffizient bei den meisten Zelltypen und in der Regel mit einem Übermaß an unerwünschten Nebenprodukten wie etwa Indels verbunden). Außerdem werden keine doppelsträngigen DNA-Brüche (DSBs) erzeugt, so dass nur wenige Indels, Translokationen, große Deletionen, p53-Aktivierungen usw. Auftreten.
  • BEISPIEL 3 - PEPTID-TAGGING MITHILFE VON PE
  • Die hierin beschriebenen Prime-Editing-Systeme (d. H. PE-Systeme) können auch verwendet werden, um verschiedene Peptid-Tags in proteincodierende Gene einzuführen. Solche Tags können HEXAhistidin-Tags, FLAG-Tags, V5-Tags, GCN4-Tags, HA-Tags, Myc- Tags und andere beinhalten. Dieser Ansatz kann für Anwendungen wie Protein- Fluoreszenzmarkierung, Immunpräzipitation, Immunblotting, Immunhistochemie, Proteinrekrutierung, induzierbare Protein-Degrons und genomweites Screening nützlich sein. Ausführungsformen sind in 25 und 26 dargestellt.
  • 25 zeigt schematisch die gRNA-Ausgestaltung für das Peptid-Tagging von Genen an endogenen genomischen Loci und das Peptid-Tagging mit TPRT-Genom-Editing (d. H. Prime-Editing). Die FlAsH- und ReAsH-Tagging-Systeme umfassen zwei Teile: (1) eine fluorophor-biarsenische Sonde und (2) ein genetisch kodiertes Peptid, das ein Tetracystein- Motiv enthält, z. B. Die Sequenz FLNCCPGCCMEP (SEQ-ID-NR: 1). Wenn sie in Zellen exprimiert werden, können Proteine, die das Tetracystein-Motiv enthalten, mit fluoreszierenden Sonden markiert werden (siehe Ref: J. Am. Chem. Soc., 2002, 124 (21), S. 6063-6076. DOI: 10.1021/ja017687n). Beim „Sortagging“-System (werden bakterielle Sortase-Enzyme eingesetzt, die markierte Peptidsonden kovalent an Proteine konjugieren, die geeignete Peptidsubstrate enthalten (siehe Ref: Nat. Chem. Biol. 2007 Nov;3(11):707-8. DOI: 10.1038/nchembio.2007.31). Das FLAG-Tag (DYKDDDDK (SEQ-ID-NR: 2)), V5-Tag (GKPIPNPLLGLDST (SEQ-ID-NR: 3)), GCN4-Tag (EELLSKNYHLENEVARLKK (SEQ- ID-NR: 4)), HA-Tag (YPYDVPDYA (SEQ-ID-NR: 5)), und Myc-Tag (EQKLISEEDL (SEQ- ID-NR: 6)) werden üblicherweise als Epitop-Tags für Immuntests verwendet. Die pi-Klemme kodiert eine Peptidsequenz (FCPF) (SEQ-ID-NR: 622), die mit einem pentafluoroaromatischen Substrat markiert werden kann (Ref: Nat. Chem. 2016 Feb;8(2):120-8. Doi: 10.1038/nchem.2413).
  • 26 zeigt den präzisen Einbau eines His6-Tags und eines FLAG-Tags in genomische DNA. Eine Leit-RNA, die auf den HEK3 Locus abzielt, wurde mit einem Templat für die reverse Transkription ausgestaltet, das entweder eine 18-nt-His-Tag-Insertion oder eine 24-nt-FLAG-Tag-Insertion kodiert. Die Editing-Effizienz in transfizierten HEK-Zellen wurde mithilfe der Amplikon-Sequenzierung bewertet. Man beachte, dass die vollständige 24-nt- Sequenz des FLAG-Tags außerhalb des sichtbaren Frames liegt (die Sequenzierung bestätigte die vollständige und präzise Insertion).
  • BEISPIEL 4 - RNA-TAGGING UND MANIPULATION MITHILFE VON PE
  • Hierin wird ein neues Verfahren zum Einfügen von Motiven in genetische Sequenzen beschrieben, die RNA in Säugetier-, eukaryontischen und bakteriellen Zellen markieren oder anderweitig manipulieren. Obgleich schätzungsweise nur 1 % des humanen Genoms für Proteine kodiert, wird praktisch das gesamte Genom auf irgendeiner Ebene transkribiert. Es ist eine offene Frage, wie viel der daraus resultierenden nicht-kodierenden RNA (ncRNA) eine funktionelle Rolle spielt, geschweige denn, welche Aufgaben die meisten dieser mutmaßlichen RNAs haben. Das „Tagging“ dieser RNA-Moleküle durch das Einfügen einer neuartigen RNAkodierenden Sequenz mit einer nützlichen Eigenschaft in Gene von Interesse ist ein nützliches Verfahren zur Untersuchung der biologischen Funktionen von RNA-Molekülen in Zellen. Es kann auch nützlich sein, Tags an Protein-kodierende mRNAs anzubringen, um zu verstehen, wie sich Modifikationen der mRNA auf die Zellfunktionen auswirken können. So wird beispielsweise ein allgegenwärtiges natürliches RNA-Tag - die Polyadenylierung - von Zellen verwendet, um den Transport von mRNA in das Zytoplasma zu beeinflussen. Verschiedene Arten von Polyadenylierungssignalen führen zu unterschiedlichen Transportraten und unterschiedlichen Lebensdauern der mRNA und damit zu Unterschieden in der Exprimierung des kodierten Proteins.
  • Ein gängiger Ansatz für das Exprimieren von markierten RNAs in Zellen ist die exogene Einführung eines synthetischen Konstrukts, entweder durch (i) transiente Plasmid- Transfektion, die einen kurzfristigen Ausbruch von Genexprimierung erzeugt, oft auf supraphysiologischem Niveau; oder (ii) permanente Integration des markierten RNA-Gens in das Genom (an zufälligen Stellen) durch lentivirale Integration oder Transposons, was eine verlängerte Exprimierung ermöglicht. Beide Ansätze sind durch die Erzeugung veränderter Exprimierungsniveaus und durch das Fehlen natürlicher Mechanismen zur Regulierung der Exprimierung oder Aktivität des Gens begrenzt. Eine alternative Strategie besteht darin, ein gewünschtes Gen direkt an seinem endogenen Locus zu markieren, indem man die durch Cas9 oder andere gezielte DNA-Nukleasen induzierten doppelsträngigen DNA-Brüche mithilfe der homologiegeleiteten Reparatur (HDR) repariert. Während dieser Ansatz die Erzeugung eines breiten Spektrums von endogen markierten Genen ermöglicht, ist HDR ausgesprochen ineffizient und erfordert daher ein umfangreiches Screening, um die gewünschte klonale Zellpopulation zu identifizieren, die erfolgreich markiert ist. Darüber hinaus ist HDR bei einer Vielzahl von Zelltypen, insbesondere bei post-mitotischen Zellen, in der Regel sehr ineffizient oder völlig inaktiv. Die geringe Effizienz der HDR wird ferner durch die Erzeugung unerwünschter Indel-Produkte erschwert, was im Falle von RNA-Genen besonders problematisch sein könnte, da sie zur Produktion einer RNA führen könnten, deren Aktivitäten die Funktion normaler Allele beeinträchtigen. Schließlich müssen Forscher häufig verschiedene Tagging-Positionen innerhalb eines RNA-Moleküls untersuchen, um eine optimale Leistung zu erzielen. Zusammengenommen machen diese Nachteile HDR zu einem weniger wünschenswerten Verfahren für den Einbau von Tags in RNA.
  • Prime-Editing ist eine neue Genom-Editing-Technologie, die das gezielte Editieren genomischer Loci durch die Übertragung genetischer Informationen von RNA auf DNA ermöglicht. Beim Prime-Editing können RNA-Gene mit einer Vielzahl von Komponenten wie RNA-Aptameren, Ribozymen oder anderen RNA-Motiven markiert werden. Prime-Editing weist im Vergleich zu HDR-Strategien das Potenzial auf, schneller, kostengünstiger und bei einer größeren Anzahl von Zelltypen wirksam zu sein. Damit stellt die beschriebene Erfindung ein neuartiges, nützliches und nicht-offensichtliches Werkzeug zur Erforschung der Biologie von RNA-Genen in Gesundheit und Krankheit dar. Hierin wird ein neues Verfahren zum Einfügen von RNA-Motiven in genetische Sequenzen beschrieben, die RNA markieren oder anderweitig manipulieren, indem Prime-Editoren (Pes) verwendet werden. Pes sind in der Lage, mehrere Nukleotide an einem gewünschten genomischen Locus, der von einem CRISPR/Cas-System anvisiert werden kann, stellenspezifisch einzufügen, zu mutieren und/oder zu deletieren. Pes bestehen aus Fusionen zwischen Cas9-Nuklease-Domänen und Reversen Transkriptase-Domänen. Sie werden mithilfe von PEgRNAs (Prime-Editing-Leit- RNAs), die einen Spacer-Abschnitt für das DNA-Targeting sowie ein Templat für die reverse Transkription enthalten, die das gewünschte Genom-Editing kodiert, zu ihrem genomischen Ziel geführt (siehe 28A). Es ist vorgesehen, dass PE verwendet werden, um Motive einzufügen, die auf RNA-Ebene funktionell sind (im Folgenden RNA-Motive), um nichtkodierende RNAs oder mRNAs zu markieren oder anderweitig zu manipulieren. Diese Motive könnten dazu dienen, die Genexprimierung zu erhöhen, die Genexprimierung zu verringern, das Spleißen zu verändern, die posttranskriptionelle Modifikation zu verändern, die subzelluläre Lage der RNA zu beeinflussen, die Isolierung oder Bestimmung der intra- oder extrazellulären Lage der RNA zu ermöglichen (z. B. Durch Verwendung fluoreszierender RNA-Aptamere wie Spinat, Spinat2, Baby-Spinat oder Brokkoli), endogene oder exogene Protein- oder RNA-Binder zu rekrutieren, sgRNAs einzuführen oder die Verarbeitung der RNA entweder durch Selbstspaltung oder RNAsen zu induzieren (siehe 28B). Aufgrund der Flexibilität des Prime-Editing ist es nicht möglich, eine umfassende Liste von RNA- Motiven bereitzustellen, die im Genom eingebaut werden können. Es werden hier eine Reihe von Beispielen gezeigt, die den voraussichtlichen Umfang der PE-eingebauten RNA-Motive veranschaulichen, die verwendet werden könnten, um RNA-Gene zu markieren. Derzeit ist es nicht möglich, diese Veränderungen in den meisten Zelltypen (einschließlich der vielen, die HDR nicht unterstützen) mit einem anderen Verfahren des Genom-Editings als PE effizient und relativ sauber durchzuführen.
  • Die Genexprimierung könnte durch das Kodieren einer 3' untranslatierten Region (UTR) beeinflusst werden, was zu Veränderungen des Nukleartransports, der Retention oder der Lebensdauer der mRNA führt. So weist beispielsweise der PolyA-Schwanz des Polyomavirus Simian Virus 40 (SV40) zusätzliche Hilfssequenzen auf, die eine effiziente Transkriptionstermination ermöglichen und die Genexprimierung im Vergleich zu anderen 3' UTRs57, 58 steigern können. Beispielhafte Sequenz des SV40-PolyA-Schwanzes von:
    SV40- POLYA- SCHWANZ
    Figure DE112021002672T5_1379
  • Neben Polyadenylierungssignalen können auch posttranslationale Modifikationssignale durch PE kodiert werden. Diese beinhalten Signale, die N6- Methyladenosin-, N1-Methyladenosin-, 5-Methylcytosin- und Pseudouridin-Modifikationen einschließen59. Durch die Verwendung von PE, das Sequenzen beinhaltet, die von Enzymen gebunden werden, die diese Modifikationen in ein RNA-Transkript schreiben oder entfernen, wäre es möglich, deren Schreiben oder Löschen zu veranlassen. Dies könnte als Instrument verwendet werden, um die Auswirkungen dieser Marker zu untersuchen, die Zelldifferenzierung zu induzieren, die Stressreaktionen zu beeinflussen oder, da die Funktion dieser Marker noch nicht erforscht ist, die Zielzellen auf andere Weise zu beeinflussen.
  • PE könnte Mutationen kodieren, die die subzelluläre Lokalisierung beeinflussen. Beispielsweise kann der Einbau von tRNA-Lys in eine mRNA theoretisch zu einem Transport in die Mitochondrien führen60, während verschiedene 3'-UTRs zu Retention oder Transport im Kern führen können61.
  • Beispiele:
  • Das SV40-PolyA-Signal führt zum Transport.
    SV40- POLYA- SCHWANZ
    Figure DE112021002672T5_1380
  • U1 snRNA 3'-Box führt zu Retention.
    U1 SNRNA 3'-BOX
    Figure DE112021002672T5_1381
  • Das Bestimmen der subzellulären Lokalisierung endogener RNA kann eine Herausforderung sein und erfordert die Zugabe exogener, fluoreszenzmarkierter Nukleotidsonden, wie im Falle von FISH, oder eine zeitaufwändige und möglicherweise ungenaue Zellfraktionierung mit anschließender RNA-Erkennung. Das Kodieren einer Sonde in der endogenen RNA würde viele dieser Probleme ausräumen. Ein Beispiel wäre die Kodierung eines fluoreszierenden RNA-Aptamers wie Spinat62 oder Brokkoli in einer endogenen RNA, wodurch das Vorhandensein dieser RNA durch Zugabe eines niedermolekularen Proto-Fluorophors sichtbar gemacht würde.
  • Brokkoli-Aptamer:
    BROKKOLI- APTAMER
    Figure DE112021002672T5_1382
  • PE könnte Sequenzen einfügen oder entfernen, die RNA kodieren, die von RNAbindenden Proteinen erkannt werden, was sich auf die Stabilität, Exprimierung, Lokalisierung oder Modifikation der RNA auswirkt (siehe z. B. die aufgeführten Proteine63).
  • PE könnte Sequenzen, die sgRNAs kodieren, in das Genom einfügen, um Viren oder Krebs zu bekämpfen. In ähnlicher Weise könnte sie zum Einfügen von microRNAs (z. B. premicroRNAs) verwendet werden, um gezielte Gene zum Schweigen zu bringen.
  • PE könnte Sequenzen einfügen, die zu einer Verarbeitung der RNA führen, entweder durch sich selbst oder durch externe Faktoren, entweder als Therapie oder als Werkzeug zur Untersuchung der Funktion verschiedener Abschnitte der RNA. Beispielsweise führt das HDV-Ribozym64, wenn es in einer RNA-Sequenz enthalten ist, zu einer Verarbeitung der RNA unmittelbar 5' vom Ribozym, während das Hammerhead-Ribozym vor dem dritten Stamm innerhalb des Ribozyms spaltet65. Andere selbstspaltende Ribozyme beinhalten Pistole66, Bei166, Haarnadel67, Neuropora-Varkud-Satellit68, glmS69, Twister70 und Twister-Sister66. Diese Sequenzen können Wildtypen oder manipulierte oder weiterentwickelte Versionen von Ribozymen beinhalten. Die Mehrzahl dieser Ribozyme könnte unterschiedliche Sequenzen aufweisen, je nachdem, in welche Region der RNA sie eingebaut wurden, je nachdem, wo sich die Ribozymschnittstelle befindet. Auch Sequenzen, die die Verarbeitung der RNA durch externe Faktoren lenken würden, wie sequenzspezifische RNAsen71, RNAsen, die bestimmte Strukturen erkennen72 - wie etwa Dicer73 und Drosha74 - könnten erreicht werden.
  • HDV-Ribozym:
    HDV- RIBOZYM
    Figure DE112021002672T5_1383
  • Referenzen für Beispiel 4
  • Die folgenden Referenzen sind durch Bezugnahme hierin vollumfänglich aufgenommen.
    1. 1. Schek N, Cooke C, Alwine JC. Molecular and Cellular Biology. 1992.
    2. 2. Gil A, Proudfoot NJ. Cell. 1987.
    3. 3. Zhao, B.S., Roundtree, I.A., He, C. Nat Rev Mol Cell Biol. 2017.
    4. 4. Rubio, M.A.T., Hopper, A.K. Wiley Interdiscip Rev RNA 2011.
    5. 5. Shechner, D.M., Hacisuleyman E., Younger, S.T., Rinn, J.L. Nat Methods. 2015.
    6. 6. Paige, J.S., Wu, K.Y., Jaffrey, S.R. Science 2011.
    7. 7. Ray D., ... Hughes TR. Nature 2013.
    8. 8. Chadalavada, D. M., Cerrone-Szakal, A. L., Bevilacqua, P.C. RNA 2007.
    9. 9. Forster AC, Symons RH. Cell. 1987.
    10. 10. Weinberg Z, Kim PB, Chen TH, Li S, Harris KA, Lünse CE, Breaker RR. Nat. Chem. Biol. 2015.
    11. 11. Feldstein PA, Buzayan JM, Bruening G. Gene 1989.
    12. 12. Saville BJ, Collins RA. Cell. 1990.
    13. 13. Winkler WC, Nahvi A, Roth A, Collins JA, Breaker RR. Nature 2004.
    14. 14. Roth A, Weinberg Z, Chen AG, Kim PG, Ames TD, Breaker RR. Nat Chem Biol. 2013.
    15. 15. Choudhury R, Tsai YS, Dominguez D, Wang Y, Wang Z. Nat Commun. 2012.
    16. 16. MacRac IJ, Doudna JA. Curr Opin Struct Biol. 2007.
    17. 17. Bernstein F, Caudy AA, Hammond SM, Hannon GJ Nature 2001.
    18. 18. Filippov V, Solovyev V, Filippova M, Gill SS. Gene 2000.
  • BEISPIEL 5 - IMMUNOEPITOP-INSERTION DURCH PE
  • Präzise Genom-Targeting-Technologien unter Verwendung des CRISPR/Cas-Systems wurden kürzlich in einer Vielzahl von Anwendungen untersucht, einschließlich der Insertion von gentechnisch veränderten DNA-Sequenzen in gezielte genomische Loci. Zuvor wurde für diese Anwendung die homologiegerichtete Reparatur (homology-directed repair - HDR) verwendet, die ein ssDNA-Donor-Templat und eine Reparaturinitiation mittels eines doppelsträngigen DNA-Bruchs (double-stranded DNA break - DSB) erforderte. Diese Strategie bietet das breiteste Spektrum möglicher Veränderungen in Zellen und ist das einzige verfügbare Verfahren, um große DNA-Sequenzen in Säugerzellen einzufügen. HDR wird jedoch durch unerwünschte zelluläre Nebenwirkungen behindert, die von seinem initiierenden DSB herrühren, wie z. B. hohe Indel-Bildung, DNA-Translokationen, große Deletionen und P53-Aktivierung. Zusätzlich zu diesen Nachteilen ist HDR in vielen Zelltypen durch eine geringe Effizienz eingeschränkt (T-Zellen sind eine bemerkenswerte Ausnahme von dieser Beobachtung). Zu den jüngsten Bemühungen, diese Nachteile zu überwinden, gehört die Fusion humaner Rad51-Mutanten mit einer Cas9-D10A-Nickase (RDN), was zu einem DSBfreien HDR-System führt, das verbesserte HDR-Produkt:Indel-Verhältnisse und ein geringeres Off-Target-Editing aufweist, aber immer noch durch Zelltyp-Abhängigkeiten und nur bescheidene HDR-Editing-Effizienz behindert wird.
  • Kürzlich entwickelte Fusionen von Cas9 mit reversen Transkriptasen („Prime- Editoren“) gekoppelt mit PEgRNAs stellen eine neuartige Genom-Editing-Technologie dar, die eine Reihe von Vorteilen gegenüber bestehenden Genom-Editing-Verfahren bietet, einschließlich der Möglichkeit, jede einzelne Nukleotid-Substitution einzubauen und zu inserieren oder jeden kurzen Abschnitt von Nukleotiden (bis zu mindestens mehreren Dutzend Basen) auf stellenspezifische Weise zu löschen. Bemerkenswerterweise werden PE-Edits mit im Allgemeinen geringen Raten unbeabsichtigter Indels erreicht. So ermöglicht PE gezielte, auf Insertion basierende Editing-Anwendungen, die bisher unmöglich oder unpraktisch waren.
  • Die vorliegende Erfindung beschreibt ein Verfahren zur Verwendung von Prime- Editing als Mittel zum Einfügen bekannter Immunogenitätsepitope in endogene oder fremde genomische DNA, was zu einer Modifikation der entsprechenden Proteine für therapeutische oder biotechnologische Anwendungen führt (siehe 31 und 32). Vor der Erfindung des Prime-Editing konnten solche Insertionen nur ineffizient und mit hohen Informationsraten von DSBs erreicht werden. Prime-Editing löst das Problem der hohen Informationsdichte bei Insert-Edits und bietet im Allgemeinen eine höhere Effizienz als HDR. Diese niedrigere Rate der Indel-Bildung stellt einen Hauptvorteil des Prime-Editing gegenüber HDR als Verfahren für gezielte DNA-Insertionen dar, insbesondere bei der beschriebenen Anwendung der Insertion von Immunogenitätsepitopen. Die Länge der Epitope liegt im Bereich von wenigen Basen bis zu Hunderten von Basen. Prime-Editing ist die effizienteste und sauberste Technologie, um solche gezielten Insertionen in Säugetierzellen zu erreichen.
  • Das Schlüsselkonzept der Erfindung ist die Verwendung von Prime-Editoren, um eine Nukleotidsequenz, die zuvor beschriebene Immunogenitätsepitope enthält, in endogene oder fremde genomische DNA zur Herunterregulierung und/oder Zerstörung ihrer Proteinprodukte und/oder exprimierenden Zelltypen einzufügen. Nukleotidsequenzen für die immunogene Epitopinsertion würden auf Gene in einer Weise angesetzt werden, um Fusionsproteine des kodierten Proteins des anvisierten Gens und der entsprechenden Proteintranslation des eingefügten immunogenen Epitops zu produzieren. Das Immunsystem des Patienten wurde zuvor darauf trainiert, diese Epitope infolge einer vorherigen Standardimmunisierung aus einer routinemäßigen Impfung beispielsweise gegen Tetanus oder Diphtherie oder Masern zu erkennen. Aufgrund der immunogenen Natur der fusionierten Epitope würde erwartet, dass das Immunsystem des Patienten das prime-editierte Protein (nicht nur das eingefügte Epitop) und möglicherweise die Zellen, aus denen es exprimiert wurde, erkennt und deaktiviert.
  • Fusionen mit anvisierten Genen würden nach Bedarf manipuliert, um sicherzustellen, dass die Proteintranslation des eingefügten Epitops für die Erkennung des Immunsystems exponiert wird. Dies könnte gezielte Nukleotidinsertionen umfassen, die zu Proteintranslationen führen, die C-terminale Fusionen von Immunogenitätsepitopen mit anvisierten Genen, N-terminale Fusionen von Immunogenitätsepitopen mit anvisierten Genen oder die Insertion von Nukleotiden in Gene ergeben, so dass Immunogenitätsepitope innerhalb oberflächenexponierter Regionen der Proteinstruktur kodiert werden.
  • Protein-Linker, die als Nukleotide kodiert werden, die zwischen der Zielgensequenz und der eingefügten Immunogenitätsepitop-Nukleotidsequenz eingefügt sind, müssen möglicherweise als Teil dieser Erfindung konstruiert werden, um die Erkennung des Immunsystems, den Zelltransport, die Proteinfunktion oder die Proteinfaltung des Zielgens zu erleichtern. Diese eingefügten Nukleotid-kodierten Protein-Linker können (unter anderem) variable Längen und Sequenzen des XTEN-Linkers oder variable Längen und Sequenzen von Glycin-Serin-Linkern beinhalten. Diese konstruierten Linker wurden früher verwendet, um Proteinfusionen erfolgreich zu erleichtern.
  • Unterscheidungsmerkmale dieser Erfindung schließen die Fähigkeit ein, zuvor erworbene Immunantworten auf spezifische Aminosäuresequenzen als Mittel zu verwenden, um eine Immunantwort gegen ansonsten nicht immunogene Proteine zu induzieren. Ein weiteres Unterscheidungsmerkmal ist die Fähigkeit, die Nukleotidsequenzen dieser immunogenen Epitope gezielt einzufügen, so dass kein hohes Maß an unerwünschten Indels als Nebenprodukt des Editings entsteht und die Insertion effizient erfolgt. Die hierin erörterte Erfindung weist die Fähigkeit auf, zelltypspezifische Einschleusungsverfahren (wie AAV- Serotypen) zu kombinieren, um Epitope in Zelltypen einzufügen, die für die Auslösung einer Immunantwort von Interesse sind.
  • Prime-Editing als Mittel zum Einfügen immunogener Epitope in pathogene Gene könnte verwendet werden, um das Immunsystem des Patienten so zu programmieren, dass es eine Vielzahl von Krankheiten bekämpft (nicht beschränkt auf Krebs wie bei immunonkologischen Strategien). Eine unmittelbar relevante Anwendung dieser Technologie wäre als Krebstherapeutikum, da sie den Immunfluchtmechanismus eines Tumors untergraben könnte, indem sie eine Immunantwort auf ein relevantes Onkogen wie HER2 oder Wachstumsfaktoren wie EGFR auslöst. Ein solcher Ansatz könnte dem T-Zell-Engineering ähnlich erscheinen, aber ein neuer Fortschritt dieses Ansatzes besteht darin, dass er in vielen Zelltypen und für Krankheiten jenseits von Krebs eingesetzt werden kann, ohne dass manipulierte T-Zellen erzeugt und in Patienten eingeführt werden müssen.
  • Verwendung von PE zum Einfügen eines Immunogenitätsepitops, gegen das die meisten Menschen bereits geimpft sind (Tetanus, Keuchhusten, Diphtherie, Masern, Mumps, Röteln usw.) in ein fremdes oder endogenes Gen, das eine Krankheit verursacht, damit das Immunsystem des Patienten lernt, dieses Protein zu deaktivieren.
  • Krankheiten, die einen potenziellen therapeutischen Nutzen aus der oben genannten Strategie haben könnten, beinhalten solche, die durch Aggregation toxischer Proteine verursacht werden, wie etwa bei tödlicher familiärer Schlaflosigkeit. Andere Krankheiten, die davon profitieren könnten, beinhalten solche, die durch eine pathogene Überexprimierung eines ansonsten ungiftigen endogenen Proteins verursacht werden, und solche, die durch fremde Pathogene verursacht werden.
  • Zu den primären therapeutischen Indikationen gehören die oben erwähnten, wie Therapeutika für Krebs-, Prionen- und andere neurodegenerative Erkrankungen, Infektionskrankheiten und Präventivmedizin. Sekundäre therapeutische Indikationen können die vorbeugende Behandlung von Patienten mit spät einsetzenden genetischen Erkrankungen sein. Es wird erwartet, dass die aktuellen Standardmedikamente in Verbindung mit Prime- Editing bei einigen Krankheiten, wie besonders aggressiven Krebsarten, oder in Fällen verwendet werden, in denen Medikamente zur Linderung der Krankheitssymptome beitragen, bis die Krankheit vollständig geheilt ist.
    Nachstehend sind Beispiele für immunogene Epitope aufgeführt, die durch Prime-Editing eingefügt werden können:
    Vakzin Erkrankung Epitope Aminosäuresequenz Beispielhafte Nukleinsäuresequenz (8)
    1 Tetanustoxoid QYIKANSKFIGITEL (SEQ ID NO: 396)
    Figure DE112021002672T5_1384
    2 Diphtherie- Toxin-Mutante CRM 197
    Figure DE112021002672T5_1385
    Figure DE112021002672T5_1386
    Figure DE112021002672T5_1387
    3 Mumps
    Figure DE112021002672T5_1388
    Figure DE112021002672T5_1389
    4 Mumps
    Figure DE112021002672T5_1390
    Figure DE112021002672T5_1391
    Figure DE112021002672T5_1392
    Ausgewählte Beispiele aus der Hämagglutinin-Neuraminidase (HN)- Diversität zwischen Ausbruchsstämmen (Tabelle 1) Divergenz zwischen Impfstamm JL5 und Ausbruchsstämmen (Tabelle 2)
    5 Rötelnvirus (RV)
    Figure DE112021002672T5_1393
    Figure DE112021002672T5_1394
    6 Hämagglutinin
    Figure DE112021002672T5_1395
    Figure DE112021002672T5_1396
    7 Neuraminidase
    Figure DE112021002672T5_1397
    Figure DE112021002672T5_1398
    8 TAP (Transportantig enpräsentation) auf H5N1- Virus- Hämagglutinin
    Figure DE112021002672T5_1399
    Figure DE112021002672T5_1400
    9 TAP (Transportantig enpräsentation) auf H5N1- Virus- Neuraminidase
    Figure DE112021002672T5_1401
    Figure DE112021002672T5_1402
    10 Hämagglutinin -Epitope zu Klasse I HLA
    Figure DE112021002672T5_1403
    Figure DE112021002672T5_1404
    11 Neuraminidase -Epitope zu Klasse I HLA
    Figure DE112021002672T5_1405
    Figure DE112021002672T5_1406
    12 Hämagglutinin -Epitope zu Klasse II HLA
    Figure DE112021002672T5_1407
    Figure DE112021002672T5_1408
    13 Neuraminidase -Epitope zu Klasse II HLA YNGIITDTI (SEQ ID NO: 422) TACAACGGCATCATCACCGACACCATC (SEQ ID NO: 423)
    14 Hämagglutinin -Epitop H5N1- gebundene Klasse I und Klasse II HLA
    Figure DE112021002672T5_1409
    Figure DE112021002672T5_1410
    15 Neuraminidase -Epitop H5N1- gebundene Klasse I und Klasse II HLA
    Figure DE112021002672T5_1411
    Figure DE112021002672T5_1412
  • Im Folgenden sind weitere Beispiele für Epitope aufgeführt, die in ein Zielgen für das Immunoepitop-Tagging integriert werden können:
  • Zitierte Referenzen in Beispiel 5
  • Die folgenden Referenzen sind durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit aufgenommen.
    • 1. X. Wen, K. Wen, D. Cao, G. Li, R. W. Jones, J. Li, S. Szu, Y. Hoshino, L. Yuan, Inclusion of a universal tetanus toxoid CD4(+) T cell epitope P2 significantly enhanced the immunogenicity of recombinant rotavirus ΔVP8* subunit parenteral vaccines. Vaccine 32, 4420-4427 (2014).
    • 2. G. Ada, D. Isaacs, Carbohydrate-protein conjugate vaccines. Clin Microbiol Infect 9, 79-85 (2003).
    • 3. E. Malito, B. Bursulaya, C. Chen, P. L. Surdo, M. Picchianti, E. Balducci, M. Biancucci, A. Brock, F. Bern, M. J. Bottomley, M. Nissum, P. Costantino, R. Rappuoli, G. Spraggon, Structural basis for lack of toxicity of die diphtheria toxin mutant CRM197. Proceedings of the National Academy of Sciences 109, 5229 (2012).
    • 4. J. de Wit, M. E. Emmelot, M. C. M. Poelen. J. Lanfermeijer, W. G. H. Han. C. van Els, P. Kaaijk, The Human CD4(+) T Cell Response against Mumps Virus Targets a Broadly Recognized Nucleoprotein Epitope. J Virol 93, (2019).
    • 5. M. May, C. A. Rieder, R. J. Rowe, Emergent lineages of mumps virus suggest the need for a polyvalent vaccine. Int J Infect Dis 66, 1-4 (2018).
    • 6. M. Ramumurthy, P. Rajendiran, N. Saravanan, S. Sankar, S. Gopalan, B. Nandagopal, Identification of immunogenic B-cell epitope peptides of rubella virus E1 glycoprotein towards development of highly specific immunoassays and/or vaccine. Conference Abstract, (2019).
    • 7. U. S. F. Tambunan, F. R. P. Sipahutar, A. A. Parikesit, D. Kerami, Vaccine Design for H5N1 Based on B- und T-cell Epitope Predictions. Bioinform Biol Insights 10, 27-35 (2016).
  • BEISPIEL 6 - VERWENDUNG VON PE ZUM ERMÖGLICHEN EINER CHEMISCH INDUZIERTEN DIMERISIERUNG VON ZIELPROTEINEN IN VIVO
  • Die hierin beschriebenen Prime-Editoren können auch verwendet werden, um durch Dimerisierung induzierte biologische Prozesse, wie etwa die Signalisierung von Rezeptoren, unter die Kontrolle eines geeigneten niedermolekularen Medikaments zu stellen, indem Gene, die niedermolekulare Bindungsproteine kodieren, durch Prime-Editing in das Genom integriert werden. Unter Verwendung der hierin beschriebenen Prime-Editoren kann die Gensequenz, die ein niedermolekulares Bindungsprotein kodiert, in ein Gen eingefügt werden, das ein Ziel- Protein von Interesse in einer lebenden Zelle oder einem Patienten kodiert. Dieser Edit allein sollte keine physiologische Wirkung haben. Nach Verabreichung des niedermolekularen Arzneimittels, bei dem es sich in der Regel um ein dimeres niedermolekulares Molekül handelt, das gleichzeitig an zwei arzneimittelbindende Proteindomänen binden kann, von denen jede an eine Kopie des Ziel-Proteins fusioniert ist, induziert das niedermolekulare Molekül die Dimerisierung des Ziel-Proteins. Dieses Ziel-Protein-Dimerisierungsereignis induziert dann ein biologisches Signalereignis, wie beispielsweise Erythropoese oder Insulinsignalisierung.
  • BEISPIEL 7 - DNA-SEQUENZ-INSERTION, DELETION UND AUSTAUSCH MIT DUAL-PRIME-EDITOREN
  • Dieses Beispiel beschreibt die Verwendung von Multi-Flap-Prime-Editing, insbesondere unter Verwendung von Dual-Prime-Editoren, für die präzise Insertion neuer DNA-Sequenzen, die präzise Deletion endogener genomischer DNA-Sequenzen oder den Austausch einer endogenen genomischen DNA-Sequenz durch eine neue DNA-Sequenz. Siehe 90. Diese Erfindung betrifft ein seit langem bestehendes Ziel des Genom-Engineering: die programmierbare Insertion, Deletion oder den Austausch von DNA-Sequenzen in den Genomen lebender Zellen. Diese Technologie kann zum Modifizieren oder Editieren des Genoms jeder beliebigen lebenden Zelle zu Forschungs-, Therapie- oder Industriezwecken eingesetzt werden.
  • Bisher wurde die homologiegeleitete Reparatur (HDR) von Nuklease-induzierten DNA-Doppelstrangbrüchen (DSBs) eingesetzt, um DNA-Sequenzen in das Genom lebender Zellen einzufügen, zu löschen oder auszutauschen. Trotz ihrer Vielseitigkeit schränkt die geringe Effizienz der HDR ihre Anwendung bei vielen Säugetierzelltypen ein, insbesondere bei therapeutisch relevanten humanen Zelltypen1-4. Darüber hinaus führt die Erzeugung von DSBs zu einer bevorzugten Reparatur durch fehleranfällige Endjoining-Mechanismen, die Insertions- und Deletions- (Indel-) Reparaturprodukte erzeugen, die anschließend nicht in die gewünschte editierte DNA-Sequenz umgewandelt werden können5-10. Infolgedessen stellen Indels typischerweise die Mehrheit der modifizierten genomischen DNA-Produkte dar, wenn Nukleasen in Säugetierzellen verwendet werden. Außerdem können durch Nukleasen erzeugte DSBs zu unerwünschten genomischen Veränderungen wie großen Deletionen und chromosomalen Translokationen11, sowie zur Aktivierung von p5312,13 führen. Strukturelle Varianten (SVs) können auch mithilfe programmierbarer Nukleasen erzeugt oder korrigiert werden, ohne auf homologe Rekombination angewiesen zu sein, obwohl nukleasebasierte Strategien für diese Anwendungen ähnliche Nachteile aufweisen. Zum Beispiel können Dual- Cutting-Strategien verwendet werden, um eine genomische DNA-Zielsequenz zu invertieren, aber die meisten Produktallele enthalten große Deletionen zwischen den Schnittstellen anstelle der gewünschten invertierten Sequenz oder Indels an den einzelnen Schnittstellen.
  • Prime-Editing ist eine kürzlich vorgestellte Genom-Editing-Technologie, die die Insertion, Deletion oder den Austausch genomischer DNA-Sequenzen ermöglicht, ohne dass fehleranfällige doppelsträngige DANN-Brüche erforderlich sind14. Prime-Editing verwendet ein gentechnisch verändertes Cas9-Nickase-Reverse-Transkriptase-Fusionsprotein (PE1 oder PE2), das mit einer gentechnisch veränderten Leit-RNA (pegRNA) gepaart ist, die sowohl Cas9 zur genomischen Zielstelle leitet als auch die Informationen für die Durchführung des gewünschten Edits kodiert. Prime-Editing erfolgt in einem mehrstufigen Editing-Prozess: 1) Die Cas9-Domäne bindet an die genomische DNA-Zielstelle, die durch die Spacer-Sequenz der pegRNA spezifiziert ist, und nickt sie; 2) die Reverse-Transkriptase-Domäne verwendet die genomische DNA, die genickt wurde, als Primer, um die Synthese eines editierten DNA- Strangs einzuleiten, wobei eine konstruierte Verlängerung der pegRNA als Templat für die reverse Transkription verwendet wird - dadurch wird ein einzelsträngiger 3'-Flap erzeugt, der die editierte DNA-Sequenz enthält; 3) die zelluläre DNA-Reparatur löst das 3'-Flap- Zwischenprodukt durch die Verdrängung einer 5'-Flap-Spezies auf, die durch die Invasion des editierten 3'-Flaps, die Exzision des 5'-Flaps, der die ursprüngliche DNA-Sequenz enthält, und die Ligation des neuen 3'-Flaps erfolgt, um den editierten DNA-Strang einzubauen, wodurch ein Heteroduplex aus einem editierten und einem uneditierten Strang gebildet wird; und 4) die zelluläre DNA-Reparatur tauscht den uneditierten Strang innerhalb des Heteroduplex unter Verwendung des editierten Strangs als Templat für die Reparatur aus, wodurch der Editing- Prozess abgeschlossen wird.
  • Ein effizienter Einbau des gewünschten Edits erfordert, dass der neu synthetisierte 3'- Flap einen Abschnitt der Sequenz enthält, der homolog zur genomischen DNA-Stelle ist. Diese Homologie ermöglicht es dem editierten 3'-Flap, mit dem endogenen DNA-Strang (dem entsprechenden 5'-Flap) um den Einbau in den DNA-Duplex zu konkurrieren. Da der editierte 3'-Flap weniger Sequenzhomologie enthält als der endogene 5'-Flap, ist zu erwarten, dass der Wettbewerb zugunsten des 5'-Flap-Strangs ausgeht. Daher kann es sein, dass der 3'-Flap, der das Edit enthält, nicht effektiv in den 5'-Flap-Strang eindringt und ihn verdrängt. Außerdem wird bei erfolgreicher Invasion des 3'-Flaps und Entfernung des 5'-Flaps der Edit nur auf einem Strang des doppelsträngigen DNA-Genoms eingebaut. Der permanente Einbau des Edits erfordert eine zelluläre DNA-Reparatur, um den uneditierten komplementären DNA-Strang unter Verwendung des editierten Strangs als Templat auszutauschen. Zwar kann die Zelle dazu gebracht werden, den Austausch des uneditierten Strangs gegenüber dem editierten Strang zu bevorzugen (Schritt 4 oben), indem mit einer sekundären sgRNA (dem PE3-System) ein Nicking in den uneditierten Strang neben dem Edit eingeführt wird, doch ist dieser Prozess immer noch auf eine zweite Stufe der DNA-Reparatur angewiesen. Diese DNA- Reparaturschritte können besonders ineffizient für Edits sein, die eine Equilibrierung von langen 5'- und 3'-Flap-Intermediaten erfordern oder lange nicht-homologe Regionen enthalten, wie etwa lange Insertionen oder lange Deletionen.
  • Dieses Beispiel beschreibt ein Dual-Prime-Editing-System (oder ein Dual-Flap-Prime- Editing-System), das die Herausforderungen im Zusammenhang mit der Flap-Equilibrierung und dem anschließenden Einbau des Edits in den nicht-editierten komplementären genomischen DNA-Strang durch gleichzeitiges Editing beider DNA-Stränge angeht. Beim Dual-Flap-Prime-Editing werden zwei pegRNAs verwendet, die auf entgegengesetzte Stränge einer genomischen Stelle abzielen und die Synthese von zwei komplementären 3'-Flaps ansteuern, die die editierte DNA-Sequenz enthalten (91). Im Gegensatz zum klassischen Prime-Editing muss das Paar der editierten DNA-Stränge (3'-Flaps) nicht direkt mit den 5'- Flaps der endogenen genomischen DNA konkurrieren, da stattdessen der komplementäre editierte Strang für die Hybridisierung zur Verfügung steht. Da beide Stränge des Duplex als editierte DNA synthetisiert werden, erübrigt sich beim Dual-Flap-Prime-Editing der Austausch des nicht-editierten komplementären DNA-Strangs, der beim klassischen Prime-Editing erforderlich ist. Stattdessen muss die zelluläre DNA-Reparaturmaschinerie nur die gepaarten 5'-Flaps (ursprüngliche genomische DNA) herausschneiden und die gepaarten 3'-Flaps (editierte DNA) in den Locus ligieren. Daher müssen die neu synthetisierten DNA-Stränge keine Sequenzen enthalten, die mit der genomischen DNA homolog sind, was eine selektive Hybridisierung der neuen Stränge ermöglicht und Edits mit minimaler genomischer Homologie erleichtert. Nuklease-aktive Versionen von Prime-Editoren, die beide DNA-Stränge schneiden, könnten auch verwendet werden, um die Entfernung der ursprünglichen DNA-Sequenz zu beschleunigen.
  • Je nach Ausrichtung der von den Dual-Prime-Editoren erzeugten gestaffelten DNA- Nicks kann das System entweder die Sequenz zwischen den beiden Nicks durch eine neue gewünschte Sequenz austauschen (gestaffelte Ausrichtung mit 5'-Überhang) oder eine neue DNA-Sequenz mit gleichzeitiger Zielstellenduplikation einfügen (gestaffelte Ausrichtung mit 3'-Überhang). 90 zeigt eine Orientierung (5'-verschobene Nicks), bei der die Sequenz zwischen den Nicks ausgetauscht wird. Bemerkenswert ist, dass die neuen 3'-Flaps nicht über die gesamte Länge der neuen DNA-Sequenz überlappen müssen, sondern nur in einem Abschnitt der neuen Sequenz komplementär sein können. Auf diese Weise kann jeder Flap kürzer sein als die gesamte Länge der neuen DNA-Sequenz.
  • Dual-Flap-Prime-Editing am HEK293-Stelle 3-Locus
  • Dual-Flap-Prime-Editing am HEK293-Stelle 3-Locus in humanen Zellen (HEK293T) wurde verwendet, um eine hocheffiziente Einführung heterologer Sequenzen zu erreichen. Zum Beispiel erfolgte der Austausch einer 90-bp-Sequenz im Locus durch eine neue 22-bp- Sequenz, die einen 6xHis-Tag kodiert, mit mehr als 80 % Effizienz (92 Allel-Tabelle). In ähnlicher Weise wurde beim Austausch derselben 90-bp-Sequenz durch eine GFP-11- Peptidsequenz (52 bp) ein Wirkungsgrad von >60 % erzielt. Die GFP-11-Tag-Insertion wurde auch am C-Terminus des MVC-Gens mit einer Effizienz von >20 % ausgeführt, was mit einer gleichzeitigen programmierten Deletion eines Abschnitts der Myc 3' UTR Sequenz einherging.
  • Dual-Flap-Prime-Editing-pegRNAs
  • Die allgemeinen Ausgestaltungen von pegRNAs, die für Dual-Flap-Prime-Editing verwendet werden, werden in 93 gezeigt. pegRNAs, die für das Dual-Flap-Prime-Editing verwendet werden, haben eine ähnliche Ausgestaltung wie diejenigen, die für das klassische Prime-Editing verwendet werden, jedoch ist es nicht erforderlich, dass die RT-Templat-Region eine Homologie zum Ziel-Locus aufweist. Stattdessen können die beiden pegRNAs RT- Template enthalten, die die Synthese von 3'-Flaps kodieren, deren 3'-Enden zueinander komplementäre Sequenzen sind. Diese Komplementarität zwischen den 3'-Flaps fördert deren Annealing und den Austausch der endogenen DNA-Sequenz durch die beabsichtigte neue DNA-Sequenz. Dies setzt voraus, dass die 5'-Regionen der RT-Template in den beiden pegRNAs zueinander umgekehrt komplementäre Sequenzen sind, und dieser Grad der Komplementarität kann variieren (93).
  • Verwendung von Dual-Flap-Prime-Editing zum Einbau von Rekombinationsstellen
  • Dual-Flap-Prime-Editing weist viele Anwendungsmöglichkeiten auf, wie z. B. das Einbauen von Peptid-Tags, RNA-Tags, Immunoepitopen, Dimerisierungsdomänen und Rekombinase-Zielstellen.
  • Eine solche Anwendung ist der Einbau von Rekombinase- oder Integrase-Sequenzen an benutzerdefinierten Stellen im Genom. 94 veranschaulicht den Einbau der Bxb1 - Rekombinasesequenzen attB (38 bp) und attP (50 bp) in eine Zielregion des humanen Genoms (HEK293T-Stelle 3 oder HEK3) bei gleichzeitiger Deletion von 90 bp dazwischenliegender Sequenz zwischen den beiden Nickstellen. Verschiedene Grade der Komplementarität zwischen den 3'-Flaps ermöglichen ein erfolgreiches Editing, wobei längere Sequenzen mit Komplementarität ein günstigeres Verhältnis von gewünschten Edits zu Indels ergeben. Weitere Anwendungen des Dual-Flap-Prime-Editing beinhalten das endogene Tagging von Genen mit Peptid- oder Proteinsequenzen oder den Austausch von Exons durch neue DNA- Sequenzen, die das Potenzial aufweisen, mehrere Varianten zu ersetzen, bei denen die Mutation innerhalb der Exon-Sequenz liegt.
  • Mit dem Dual-Flap-Prime-Editing können eine oder zwei Rekombinasestellen an den Zielpositionen im humanen Genom eingeführt werden. Werden einzelne Rekombinasestellen eingefügt, können diese als Landeplätze für eine rekombinasevermittelte Reaktion zwischen der genomischen Rekombinasestelle und einer zweiten Rekombinasestelle innerhalb einer von außen zugeführten DNA, wie z. B. einem Plasmid, genutzt werden. Dies ermöglicht die gezielte Integration von DNA-Fracht. Werden zwei Rekombinasestellen in benachbarte DNA- Regionen eingefügt, können diese je nach Ausrichtung der Rekombinasestellen für die rekombinasevermittelte Exzision oder Inversion der dazwischenliegenden Sequenz oder für den rekombinasevermittelten Kassettenaustausch mit exogener DNA zur Integration der Fracht genutzt werden. Die Integration kompatibler Rekombinasestellen auf verschiedenen Chromosomen ermöglicht eine gezielte und gerichtete chromosomale Translokation. Mit Dual- Flap-Prime-Editing lassen sich Rekombinasestellen an einer Reihe von Loci im humanen Genom effizient einfügen (94). Die Kopplung der Integration von Rekombinasestellen durch Dual-Flap-Prime-Editing mit DNA-Rekombinase-Enzymen ist somit ein leistungsfähiger Ansatz für viele Arten von SV-Edits und die Zielintegration von DNA-Fracht.
  • BEISPIEL 8 - DNA-SEQUENZ-INSERTION, DELETION, INVERSION, TRANSLOKATION UND INTEGRATION UNTER VERWENDUNG VON QUADRUPLE-FLAP-PRIME-EDITING
  • Dieses Beispiel beschreibt die Verwendung des Multi-Flap-Prime-Editing, insbesondere des Quadruple-Flap-Prime-Editing, für die gezielte Insertion, Deletion, Duplikation und den Austausch endogener genomischer DNA-Sequenzen sowie für die gezielte Inversion genomischer DNA-Sequenzen, die gezielte chromosomale Translokation und die gezielte Integration exogener DNA. Diese Technologie weist das Potenzial auf, seit langem bestehende Ziele des Genom-Engineering in Angriff zu nehmen: den programmierbaren Einbau oder die Korrektur struktureller Varianten (im Allgemeinen definiert als eine Veränderung der genomischen Sequenz von mehr als 50 bp, häufig in Form von großen Deletionen, Insertionen/Duplikationen, Inversionen und Translokationen) und die gezielte Integration von DNA-Fracht an einer bestimmten Stelle im humanen Genom. Letzteres könnte therapeutische Strategien zur Genaugmentation und andere biotechnologische Anwendungen ermöglichen. Diese Technologie könnte potenziell zum Modifizieren oder Editieren des Genoms jeder beliebigen lebenden Zelle zu Forschungs-, Therapie- oder Industriezwecken eingesetzt werden.
  • Diese Erfindung beschreibt ein Multi-Flap-Prime-Editing-System, das die Herausforderungen im Zusammenhang mit der Flap-Equilibrierung und dem anschließenden Einbau des Edits in den nicht-editierten komplementären genomischen DNA-Strang durch gleichzeitiges Editing beider DNA-Stränge angeht. Es erweitert außerdem die Möglichkeiten des traditionellen Prime-Editing, indem es den neu synthetisierten 3'-Flaps erlaubt, größere Sequenzumstellungen vorzunehmen.
  • Es wurde ein Quadruple-Flap-Prime-Editing-Ansatz entwickelt, mit dem die gewünschten Sequenzveränderungen direkt durchgeführt werden können, ohne dass ein Rekombinase-Enzym (wie beim Dual-Flap-Prime-Editing) benötigt wird, aber mit ähnlicher Vielseitigkeit. Beim Quadruple-Flap-Prime-Editing werden den Zellen zusammen mit dem PE2-Editor vier verschiedene pegRNA-Sequenzen zugeführt. Ein Paar pegRNAs ist das Templat für die Synthese komplementärer DNA-Flaps, wie beim Dual-Flap-Prime-Editing, während das andere Paar pegRNAs das Templat für die Synthese eines orthogonalen Paares komplementärer DNA-Flaps ist. Die Lage dieser Flaps, ihre relative Ausrichtung und die Paarung der Komplementarität bestimmen, welche Art der Umlagerung stattfindet. Die Verbindungsstellen der umgelagerten DNA enthalten die von den pegRNA-templierten 3'- Flaps kodierte Sequenz, die die Ausrichtung der Umlagerung bestimmt und als nützliche DNA- Sequenz für nachgeschaltete Prozesse dienen kann. Die gezielte Inversion der genomischen Sequenz wurde mit der Quadruple-Flap-Prime-Editing-Strategie ausgeführt (95). Eine Inversion einer 2,7-kb-Sequenz am AAVS1-Locus in HEK293T-Zellen wurde mit vier pegRNAs erreicht, die Bxb1-attB- und attP-Sequenzen an den Inversionskreuzungen platzieren. Die Überprüfung der erwarteten Kreuzungen wurde mithilfe der AmplikonSequenzierung ausgeführt, die zeigte, dass die korrekten Kreuzungen die attB- oder attP- Stellen-Sequenzen in ≥90 % der Sequenzierungs-Reads enthalten (96).
  • Die gezielte Integration von exogenen DNA-Plasmiden wurde auch mit Quadruple- Flap-Prime-Editing erreicht. Bei diesem Ansatz zielen zwei pegRNAs auf die endogene genomische DNA-Stelle und zwei pegRNAs auf eine Region auf dem Frachtplasmid. 3'-DNA- Flaps werden sowohl auf der genomischen DNA als auch auf der Plasmid-DNA synthetisiert, so dass sowohl die Plasmid- als auch die genomische DNA durch hybridisierte 3'-Flaps überbrückt werden (97A). Die Exzision von 5'-Überhängen und die Ligation der Nicks führen zu einem integrierten Plasmidprodukt. Die Ausrichtung der Integration kann durch die Paarung von pegRNA-Sequenzen des Templats gesteuert werden.
  • Ein Plasmid, das für die Exprimierung eines H2B-GFP-Fusionsproteins kodiert, wurde durch Quadruple-Flap-Prime-Editing in HEK293T-Zellen am AAVS1-Locus integriert. Dies führte dazu, dass 1,6 % der Zellen eine lang anhaltende, kernlokalisierte GFP-Fluoreszenz aufwiesen, die mittels Durchflusszytometrie gemessen wurde. Die PCR einer vorhergesagten Kreuzung zeigte das erwartete Produkt, das die pegRNA-templierte BxB1-attP-Sequenz enthielt (97B).
  • Chromosomentranslokationen wurden auch durch Quadruple Flap-Prime-Editing ausgeführt (98A), um eine chromosomale Translokation zwischen dem MYC-Locus auf Chromosom 8 und dem TIMM44-Locus auf Chromosom 19 zu erzeugen (98B).
  • Dual-Flap-Prime-Editing am IDS-Locus wurde mit 12 Paaren von pegRNAs und PE2 ausgeführt. HEK293T-Zellen wurden mit PE2 und verschiedenen Paaren von pegRNAs transfiziert (z. B. in der ersten Spalte pegRNA Al_a und pegRNA B2_amit Templaten für den Einbau der attP-Stelle in Vorwärtsrichtung). Die Effizienz wurde mittels HTS gemessen. Diese Daten zeigten, dass das Dual-Flap-Editing die gewünschte Sequenz mit einer Effizienz von bis zu 80 % erfolgreich in den IDS-Locus einfügen kann (99).
  • Die Dual-Flap-vermittelte Duplikation wurde auch am AAVS1-Locus in 293T-Zellen ausgeführt (100A). Dual-Flap-pegRNA mit PE2 wurde verwendet, um die Duplikation der genetischen Sequenzen von AAVS1 zu induzieren (100B).
  • Multi-Flap-Prime-Editing, das die Translokation von MYC-CCR5 induziert, wurde ebenfalls ausgeführt (101). Die MYC-CCRS-Translokation wurde durch Quad-Flap- pegRNAs und PE2 induziert. MYC-CCR5-Translokationsereignisse wurden durch QuadrupelpegRNAs ausgelöst. Vier verschiedene Sätze von pegRNAs wurden in HEK293T-Zellen getestet. Die Translokationskreuzungsprodukte zwischen abgeleiteten chr8 und chr3 wurden mit Kreuzungsprimem amplifiziert. Der Graph zeigt den Prozentsatz der Reads, die mit den erwarteten Kreuzungsallelen ausgerichtet sind. Dies zeigt, dass Quadruple-Flap-Prime-Editing die Translokation des MYC- und des CCRS-Gens mit einer Produktreinheit von nahezu 100 % an Knotenpunkt 1 und ~50 % an Knotenpunkt 2 vermitteln kann. Ein repräsentativer Allelplot zeigt die Sequenzen, die an den erwarteten Allelsequenzen an Knotenpunkt 1 ausgerichtet sind.
  • Dual-Flap- und Quadruple-Flap-Prime-Editing wurden auch in anderen humanen Zelllinien ausgeführt (102A-102B). Dual-Flap-Prime-Editing wurde in vier verschiedenen humanen Zelllinien ausgeführt (102A). HEK293T- und HeLa-Zellen wurden mit dualen pegRNAs und PE2 zum Editing von drei verschiedenen genomischen Loci (IDS, MYC und TIMM44) transfiziert. U2OS- und K562-Zellen wurden mit denselben Komponenten nukleofiziert. Das Dual-Flap-Prime-Editing zeigte in allen vier humanen Zellen an den Ziel-Loci eine robuste Editing-Effizienz, insbesondere bei HEK293T- und K562- Zellen. Die zellulären Mechanismen, die Dual-Flap-Prime-Editing ermöglichen, sind in vielen humanen Zelltypen konserviert. Multi-Flap-(Quadruple-pegRNA) gerichtete Inversion einer 2,7-kb-Sequenz wurde auch am AAVS1-Locus in HeLa Zellen ausgeführt (102B).
  • Die Inversionseffizienz wurde auch mittels HTS am CCRS-Locus gemessen (103A-103B). Der Prozentsatz des erwarteten Inversions-Edit-Allels wurde mit HTS gemessen. Vier Quad-pegRNA-Sätze von PE2 wurden jeweils in HEK293T-Zellen transfiziert. Es wurde eine Dual-Flap-vermittelte Sequenzduplikation (~100 nt) am CCRS-Locus in HEK293T-Zellen ausgeführt (103A). Die Editing-Effizienz erreicht ~1,5 % über die HTS 300-Zyklus-Paarend-Sequenzierungsanalyse. Eine Quadruple-Flap-vermittelte Sequenzinversion (~95-117 nt) wurde ebenfalls am CCRS-Locus in HeLa-Zellen ausgeführt (103B). Die Editing-Effizienz erreicht -1,2 % über die HTS 300-Zyklus-Paarend- Sequenzierungsanalyse. Dieses Ergebnis zeigt, dass das Multi-Flap-Prime-Editing die Duplikation und Inversion am CCRS-Locus erfolgreich und präzise vermitteln kann. Die Editing-Spezifität ist hoch, wenn die anvisierte Sequenz dupliziert ist (Prozentsatz der Indels < 2 %).
  • Anschließend wurden HEK293T-Zellen mit den Plasmiden transfiziert, die Exo1, Fen1, Red Fluorescence-Protein (Kontrolle), DNA2, Mlh1 neg und P53-Inhibitor mit pegRNA und PE2 exprimieren (104A-104D). Die Editing-Effizienz wurde mittels HTS gemessen. Die Editing-Effizienz wurde zwischen dem Kandidaten und der RFP-Kontrolle verglichen. HEK293T-Zellen wurden auch mit den siRNA-Plasmiden und pegRNA und PE2 für jeden Ziel-Locus transfiziert (104E). Nicht-gezielte siRNA (siNT) wurde als Kontrolle verwendet. Die Editing-Effizienz wurde mittels HTS gemessen. Die Editing-Effizienz wurde für jeden Ziel-Locus zwischen siRNA-Knockdown und siNT ctrl verglichen. HEK293T-Zellen wurden mit dualen pegRNAs, PE2 und den Plasmiden transfiziert, die Exol, Fen1, Red Fluorescence-Protein (ctrl), DNA2, M1h1 neg bzw. P53-Inhibitor exprimieren. Die Editing- Effizienz wurde - mittels HTS gemessen. Die Editing-Effizienz wurde zwischen dem Kandidaten und der RFP-Kontrolle verglichen. Es zeigte sich, dass die Überexprimierung von FEN1 die Dual-Flap-Editing-Effizienz bei allen vier Ziel-Loci (MYC, TIMM44, IDS, CCR5) verbessert.
  • Die Dual-Flap-vermittelte Sequenzverdopplung wurde auch am AAVS1-Locus ausgeführt (105A). Durch die Verwendung von Dual-Flap-pegRNAs, die zwei einzigartige 3'-Flap-Strukturen erzeugen, wurde eine -300 bp Sequenzverdopplung am AAVS1-Locus in 293T-Zellen induziert (105B). Erwartete Allele wurden mit spezifischen Primern amplifiziert und einem HTS unterzogen. Ungefähr 94 % der Reads wurden an die erwarteten Allele mit Duplikation angeglichen. In den unbehandelten Samples wurden keine Duplikationsprodukte beobachtet.
  • Gezielte IDS-Genomsequenz-Inversion wurde auch mit Quadruple-Flap-Prime-Editing ausgeführt (106). Ungefähr 13 % der Patienten mit Hunter-Syndrom weisen eine Inversion der IDS-Gensequenzen auf (Bondeson et al., Human Molecular Genetics, 1995). Mit Quadruple-Flap-Prime-Editing wurde diese pathogene Inversion der etwa 40 kb großen IDS- Genomsequenz in HEK293T-Zellen induziert. Sechs Sätze vierfacher pegRNAs wurden getestet, indem HEK293T-Zellen mit den pegRNAs und PE2 transfiziert wurden. Es wurden Primer verwendet, die spezifisch die invertierten Sequenzen an der Kreuzung „ab“ und der Kreuzung „cd“ amplifizieren. Ungefähr 95 % der erwarteten Sequenzen des invertierten Allels wurden an beiden Kreuzungen mit IDS_QF1 beobachtet. Andere Sätze von pegRNAs haben ebenfalls einen hohen Wirkungsgrad der erwarteten Allelsequenzen an beiden Kreuzungen. In den unbehandelten Samples wurden keine invertierten Kreuzungsprodukte beobachtet.
  • Es wurde auch festgestellt, dass die Modifikation des 3'-Motivs der PegRNA die Dual- Flap-Editing-Effizienz am IDS-Locus verbessert (107). Um die Dual-Flap-Editing- Effizienz weiter zu verbessern, wurde ein Pseudoknoten-evoPreQ1-Motiv zum Schutz des 3'- Endes der PegRNA eingeführt. Beim Vergleichen der durch die unmodifizierten und die evoPreQ1-modifizierten dualen pegRNAs erzeugten Editing-Effizienz wurde eine allgemeine Steigerung der Editing-Effizienz mit modifizierten pegRNAs am Ziel-Locus IDS festgestellt. Die Verbesserung der Dual-Flap-Editing-Effizienz kann bis zum 5,3-Fachen betragen.
  • Referenzen Beispiele 7 und 8):
    • 1. Rouct, P., Smih, F. & Jasin, M. Expression of a site-specific endonuclease stimulatcs [1328] homologous recombination in mammalian cells. PNAS 91, 6064-6068 (1994).
    • 2. Heyer, W.-D., Ehmsen, K. T. & Liu, J. Regulation of homologous recombination in [1329] eukaryotes. Annu. Rev. Genet. 44, 113-139 (2010).
    • 3. Chapman, J. R., Taylor, M. R. G. & Boulton, S. J. Playing the end game: DNA [1330] double-strand break repair pathway choice. Mol. Cell 47, 497-510 (2012).
    • 4. Cox, D. B. T., Platt, R. J. & Zhang, F. Therapeutic genome editing: prospects and [1331] challeilges. Nature Medicine 21,121-131 (2015).
    • S. Rouet, P., Smih, F. & Jasin, M. Introduction of doublc-strand break;; into the genome [1332] of mouse cells by expression of a rare-cutting endonuclease. Mol Cell Biol 14, 8096-8106 (1994).
    • 6. Bibikova, M., Golic, M., Golic, K. G. & Carroll, D. Targeted chromosomal cleavage [1333] and mutagenesis in Drosophila using zinc-finger nucleases. Genetics 161, 1169-1175 (2002).
    • 7. Umov, F. D., Rcbar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S. & Gregory, P. D. Genome [1334] editing with cnginccred zinc finger nucleases. Nat Rev Genet 11, 636-646 (2010).
    • 8. Mali, P. et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science 339, 823- [1335] 826 (2013).
    • 9. Cong, L. et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas Systems. Science [1336] 339,819-823 (2013).
    • 10.Jinek, M. et al. RNA-programmed genome editing in human cells. eLite 2, e00471 [1337] (2013).
    • 11. Kosicki, M., Tomberg, K. & Bradley, A. Repair of double-strand breaks induced by CRISPR-Cas9 leads to large deletions and complex rearrangements. Nature Biotechnology 36. 765- [1338] 771 (2018).
    • 12. Ihry, R. J. et al. p53 inhibits CRISPR-Cas9 engineering in human pluripotent stem [1339] cells. Nature Medicine 24, 939-946 (2018).
    • 13. Haapanicmi, E., Botla, S., Persson, J., Schmierer, B. & Taipalc, J. CRISPR-Cas9 genome editing induces a p53-mediated DNA damage response. Nature Medicine 24. 927-930 [1340] (2018).
    • 14. Anzalone, A. V. et al. Scarch-and-rcplace genome editing without double-strand [1341] breaks or donor DNA. Nature 576,149-157 (2019).
  • BEISPIEL 9 - PROGRAMMIERBARE GROSSE DNA-DELETION, AUSTAUSCH, INTEGRATION UND INVERSION MIT TWIN-PRIME-EDITING UND STELLENSPEZIFISCHEN REKOMBINASEN
  • Die gezielte Deletion, der Austausch, die Integration oder die Inversion von DNA- Sequenzen an bestimmten Stellen im Genom kann prinzipiell zur Erforschung oder Behandlung vieler humaner genetischer Krankheiten eingesetzt werden. Es ist jedoch nach wie vor eine Herausforderung, diese Umwandlungen von DNA-Sequenzen in einem Säugetierzellgenom präzise und effizient durchzuführen. Hierin wird das Twin-Prime-Editing (twinPE) vorgestellt, ein Verfahren für den programmierbaren Austausch oder die Entfernung von DNA-Sequenzen an endogenen humanen Genomstellen, ohne dass Doppelstrang-DNA- Brüche erforderlich sind. twinPE verwendet ein Prime-Editor (PE)-Protein und zwei Prime- Editing-Leit-RNAs (pegRNAs), die die Synthese komplementärer DNA-Flaps auf gegenüberliegenden Strängen der genomischen DNA templieren, was zum Austausch endogener DNA-Sequenzen zwischen den PE-induzierten Nickstellen durch pegRNA-kodierte Sequenzen führt. Hierin wird gezeigt, dass twinPE präzise Deletionen von bis zu 780 bp und einen präzisen Austausch genomischer DNA-Sequenzen durch neue Sequenzen von bis zu 108 bp ausführen kann. Durch die Kombination von Einzel- oder Multiplex-TwinPE mit stellenspezifischen Serin-Rekombinasen wird gezeigt, dass eine gezielte Integration von DNA- Plasmiden in Gengröße an Safe-Harbor-Loci, die AAVS1, CCR5 und ALB beinhalten, möglich ist. Ferner wird eine 39-kb-Inversion an IDS demonstriert, die zur Korrektur eines häufigen Hunter-Syndrom-Allels verwendet werden könnte. TwinPE erweitert die Möglichkeiten des Genom-Editings erheblich, ohne dass Doppelstrang-DNA-Brüche erforderlich sind, und ermöglicht in Kombination mit anderen Genom-Editing-Tools die Korrektur oder Ergänzung komplexer pathogener Allelvarianten in humanen Zellen.
  • Krankheitsassoziierte humangenetische Varianten entstehen durch eine Vielzahl von Sequenzveränderungen, die von Substitutionen einzelner Basenpaare bis hin zu Deletionen und Umlagerungen im Megabasenbereich reichen. Genom-Editing-Ansätze, die diese pathogenen Varianten in humane Zellen einbauen, korrigieren oder ergänzen können, weisen das Potenzial auf, das Verständnis für humangenetische Krankheiten zu verbessern und könnten zur Entwicklung neuer Therapeutika führen. In jüngster Zeit wurden mehrere Genom-Editing- Ansätze basierend auf CRISPR-Cas-Systemen für das Genom-Editing entwickelt, die Nukleasen, Basen-Editoren und Prime-Editoren beinhalten. CRISPR-Cas-Nukleasen können, wenn sie mit einer Leit-RNA verwendet werden, zur Unterbrechung von Genen durch die Erzeugung von DNA-Doppelstrangbrüchen (DSBs) verwendet werden, die zu stochastischen Indels führen. Basen-Editoren können verwendet werden, um präzise C·G-zu-T·A- oder A·T- zu-G·C-Übergangs-Basenpaar-Edits oder C·G-zu-G·C-Basenpaar-Edits einzubauen. Prime- Editoren können jedes beliebige der zwölf Basenpaar-Substitutions-Edits sowie kleine bis mittelgroße Insertionen und Deletionen präzise einbauen. Diese Strategien sind jedoch nicht direkt für umfangreichere Genom-Edits wie große Deletionen, Insertionen, Austausche oder Inversionen geeignet.
  • Bisher wurden gepaarte Cas9-Nuklease-Strategien für die gezielte Deletion von genomischen DNA-Sequenzen mit einer Länge von ~50 bis >100.000 Basenpaaren entwickelt. Durch Bereitstellen einer linearen Donor-DNA-Sequenz kann außerdem die gezielte Insertion neuer DNA-Sequenzen an einzelnen Schnittstellen oder zwischen gepaarten Schnittstellen durch Endjoining oder homologiegeleitete DNA-Reparaturprozesse ausgeführt werden. Obwohl sie in vielerlei Hinsicht vielseitig sind, haben die Ansätze mit einzelnen und gepaarten Nukleasen auch einige Nachteile. Erstens kann die Verwendung gepaarter Nukleasen für Deletionen mehrere On-Target-Nebenprodukte erzeugen, einschließlich der gewünschte Deletion mit Indels, Indels an einzelnen DSB-Stellen ohne die gewünschte Deletion, eine unerwünschte Inversion der DNA-Sequenz zwischen DSB-Stellen und die unbeabsichtigte Integration einer exogenen DNA-Sequenz an DSB-Stellen. Darüber hinaus ist die genaue Lage der Deletionen durch die Verfügbarkeit von PAM und die entsprechenden von der Nuklease erzeugten Schnittstellen eingeschränkt. Ähnliche Einschränkungen und Nebenprodukte gibt es beim DNA-Donor-Knock-in, das bei homologieunabhängigen Ansätzen häufig ohne Kontrolle der Sequenzausrichtung erfolgt. Schließlich kann die gleichzeitige Erzeugung mehrerer DSBs an On-Target- und Off-Target-Stellen, die mit zusätzlichen Leit-RNAs wahrscheinlicher wird, zu Genom-Modifikationen außerhalb des Ziels, chromosomalen Umlagerungen oder Chromothripsen führen. Daher bestehen bei der Anwendung von Nuklease-basierten Editing- Strategien für die Exzision, den Austausch oder die Insertion größerer DNA-Sequenzen erhebliche Herausforderungen in Bezug auf Produktkontrolle und -reinheit.
  • Prime-Editing hat gezeigt, dass es in der Lage ist, präzise Insertionen von bis zu ~40 bp und Deletionen von bis zu ~80 bp in humanen Zellen mit einem hohen Verhältnis von gewünschtem Produkt zu Nebenprodukt durchzuführen. Im Prinzip könnten mit Prime-Editing viele der Herausforderungen, die mit Nukleasen verbunden sind, umgangen werden, indem die Erzeugung von DSBs vermieden wird. Prime-Editing hat jedoch noch nicht gezeigt, dass es größere Insertionen und Deletionen in der Größe typischer Genkodierungssequenzen vermitteln kann, und der vermutete Mechanismus einfacher Prime-Editing-Reaktionen erschwert diese größeren DNA-Veränderungen, da lange PegRNA-Template für die reverse Transkription erforderlich sind. Stellenspezifische DNA-Rekombinase-Enzyme weisen die Fähigkeit auf, mehrere DNA-Transformationen auszuführen, einschließlich Exzision, Inversion, Integration oder Austausch großer DNA-Sequenzen. Die Umprogrammierung stellenspezifischer Rekombinasen stellt jedoch eine Herausforderung dar, die den Einsatz für Genom-Engineering- und Editing-Anwendungen erschwert.
  • Hierin wird die Entwicklung des Twin-Prime-Editing (twinPE) vorgestellt, das die Deletion, Substitution oder Insertion von DNA-Sequenzen an endogenen genomischen Stellen mit hoher Effizienz in humanen Zellen ermöglicht. Zusätzlich zu diesen Veränderungen wird gezeigt, dass twinPE verwendet werden kann, um eine oder mehrere Rekombinase- Erkennungsstellen mit hoher Effizienz an Zielstellen im humanen Genom zu integrieren, die anschließend als Substrate für stellenspezifische Serin-Rekombinase-Enzyme verwendet werden können, die die gezielte Integration von genetischer Fracht oder die gezielte Inversion der genomischen DNA-Sequenz ermöglichen.
  • Ergebnisse
  • Beim Prime-Editing wird ein Prime-Editor-Protein verwendet, das eine Fusion einer katalytisch beeinträchtigten Cas9-Nickase und eines Wildtyp- (PE1) oder gentechnisch veränderten (PE2) MMLV-Enzyms für die reverse Transkriptase umfasst, sowie eine Leit- RNA für das Prime-Editing (pegRNA), die sowohl die genomische Zielstelle spezifiziert als auch den gewünschten Edit kodiert. Nach der Erkennung der Zielstelle kappen PE-pegRNA- Komplexe den PAM-haltigen DNA-Strang und transkribieren das RT-Templat der pegRNA direkt in die genomische DNA, wobei der genickte Strang als Primer dient. Nach der reversen Transkription dringt der neu synthetisierte 3'-Flap in die benachbarte DNA ein, zu der er weitgehend homolog ist, und tauscht die redundante 5'-Flap-Sequenz aus. Der gegenüberliegende, nicht-editierte Strang wird dann unter Verwendung des editierten DNA- Strangs als Templat repariert. Dieser vorgeschlagene Editing-Weg bietet daher zwei Möglichkeiten, bei denen die zelluläre DNA-Reparatur den gewünschten Edit ablehnen und die DNA-Sequenz in ihre ursprüngliche Form zurückführen kann.
  • Es wurde vorhergesagt, dass die Umgehung potenziell ungünstiger Schritte bei der DNA-Reparatur das Prime-Editing mit erhöhter Effizienz ermöglichen und verschiedene Klassen von Genom-Edits erlauben könnte. Darüber hinaus wurde eine Twin-Prime-Editing (TwinPE)-Strategie entwickelt, bei der ein Paar pegRNAs verwendet wird, die jeweils auf den einen oder den anderen DNA-Strang abzielen und die Synthese einer 3'-Flap-DNA-Sequenz templieren, die komplementär zu der von der anderen pegRNA vorgegebenen Sequenz ist (108A). Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass, wenn die neu synthetisierten DNA- Stränge der endogenen Zielstelle sehr unähnlich sind, die 3'-Flaps bevorzugt hybridisieren würden, um ein Zwischenprodukt zu erzeugen, das annealisierte 3'-Überhänge der neuen DNA- Sequenz und annealisierte 5'-Überhänge der ursprünglichen DNA-Sequenz aufweist (108A). Da beide editierten Stränge von Prime-Editor-Komplexen synthetisiert werden, ist es nicht erforderlich, dass edithaltige Flap-Stränge in die Zielstelle eindringen oder dass der Edit in den komplementären DNA-Strang kopiert wird. Die Exzision der ursprünglichen DNA- Sequenz (annealisierte 5'-Überhänge), das Auffüllen von Lücken durch Polymerasen und die Ligation des Nicking-Paares würden zum Austausch der endogenen Sequenz zwischen den Nickstellen durch die gepaarten 3'-Flap-Sequenzen führen (108A). Aufgrund der Flexibilität bei der Templat-Ausgestaltung kann der Edit im Prinzip eine neue DNA-Sequenz einführen, einen Abschnitt der DNA-Sequenz austauschen oder einen Abschnitt der DNA- Sequenz löschen.
  • Um die twinPE-Strategie zu evaluieren, wurde der HEK-Stelle-3-Locus (zuvor als HEK3 bezeichnet) in HEK293T gezielt so verändert, dass 90 bp der endogenen Sequenz durch eine 38-bp-Bxb1-attB-Ansatzsequenz ausgetauscht wurden (108B). Für jeden Protospacer wurden drei pegRNAs mit RT-Templaten ausgestaltet, die 30, 34 oder 38 nt der 38-bp-attB-Sequenz enthielten (108C). Paarweise Kombinationen dieser pegRNAs sollen 3'-Flaps mit überlappender Komplementarität im Bereich von 22 bis 38 bp erzeugen (108C). Spannenderweise wurde, als beide pegRNAs zusammen mit PE2 in einer Plasmid-DNA-Transfektion in Zellen eingebracht wurden, eine hohe Effizienz der Insertion der attB-Stelle beobachtet, wobei einige Kombinationen von pegRNAs basierend auf der Sequenzierung des Amplikons einen Wirkungsgrad von >80 % Umwandlung in das gewünschte Produkt erbrachten (108C). Eine ähnliche Strategie für die Insertion der 50- bp-Bxb1-attP-Anheftungssequenz führte zu einem Editing mit einer Effizienz von bis zu 58 % (108C). Dabei war es nicht notwendig, dass jede pegRNA die gesamte Insertionssequenz kodiert, da teilweise überlappende komplementäre Flaps den Einbau der attB- oder attP- Sequenz in voller Länge ermöglichten. Allerdings führten 3'-Flaps mit größerer Überlappung zu einer etwas höheren Editing-Effizienz und weniger Indels für die Insertion der Bxb1-attB- und attP-Sequenzen an HEK-Stelle 3.
  • Als Nächstes wurde twinPE getestet, um zu bestimmen, ob es die Insertion von DNA- Sequenzen unterstützen kann, die größer sind als die, die mit den Systemen PE2 oder PE3 nachgewiesen wurden. Zunächst wurde die PE3-vermittelte Insertion von Fragmenten der kodierenden Sequenz von FKBP12 mit einer Länge von 12 bis 321 bp untersucht. Bei der PE3- Insertion in den HEK-Stelle-3-Locus wurden für die kürzeren 12-bp- und 36-bp-Insertionen bescheidene Wirkungsgrade erzielt (31,8 % bzw. 17,3 %), während für die 108-bp-Insertion nur sehr wenig Produkt (0,8 %) und für die 321-bp-lnsertion kein Produkt in voller Länge beobachtet wurde (109A). Im Gegensatz dazu ermöglichte twinPE eine Insertionseffizienz von 16 % für das 108-bp-Fragment, was einer 20-fachen Verbesserung gegenüber PE3 entspricht. Darüber hinaus wurden 113-bp- und 103-bp-Insertionen, die gepaarte Bxb1-Rekombinasestellen enthielten, mit ähnlicher Effizienz (10,7 % bzw. 9,7 %) am CCRS-Locus erzielt (Daten nicht gezeigt). Diese Ergebnisse veranschaulichen das Potenzial für eine größere Sequenzinsertion mit twinPE im Vergleich zu PE3.
  • Eine potenzielle Anwendung der twinPE-Strategie ist der Austausch exonischer kodierender DNA-Sequenzen durch neu kodierte Sequenzen, die die Proteinsequenz beibehalten und das Potenzial aufweisen, jede Mutation zwischen den twinPE-induzierten Nickstellen zu korrigieren. Um diesen Ansatz zu testen, wurde das PAH-Gen anvisiert, dessen Mutationen die genetische Stoffwechselstörung Phenylketonurie (PKU) verursachen. Die Umkodierung von Abschnitten von Exon 4 und Exon 7 wurde in PAH von HEK293T- Wildtypzellen getestet, wo ein korrigierendes Editing nachweisbar ist. Durch das Testen verschiedener Flap-Überlappungslängen und das Hinzufügen von evoPreQ1-Motiven am 3'- Ende der pegRNAs wurde die gewünschte Sequenz-Rekodierung mit bescheidenen Effizienzen erreicht, die bis zu 9,4 % durchschnittliche Effizienz für eine 64-bp-Rekodierung in Exon 4, bis zu 22,7 % durchschnittliche Effizienz für eine 46-bp-Rekodierung in Exon 7 und bis zu 27,4 % durchschnittliche Effizienz für eine 64-bp-Rekodierung in Exon 7 erreichten (109B). Basierend auf den in der bioPKU-Datenbank verzeichneten Mutationen ermöglicht das TwinPE-Editing dieser Regionen insgesamt die Korrektur verschiedener Mutationen, die bei PKU eine Rolle spielen. Weitere untersuchte Exons konnten ebenfalls rekodiert werden, wenn auch mit geringerer Effizienz (112). Diese Ergebnisse zeigen, dass twinPE im Prinzip dazu verwendet werden könnte, mehrere Mutationen mit einem einzigen Paar pegRNAs zu korrigieren.
  • Neben der Insertion und dem Austausch von DNA-Sequenzen sollte twinPE auch in der Lage sein, präzise Deletion-Edits vorzunehmen. Gepaarte-Nuklease-Deletions-Strategien erzeugen Deletionen, die sich über die beiden DSB-Stellen erstrecken und somit durch die PAM-Verfügbarkeit eingeschränkt sind, und erwünschte Deletionen werden oft von unerwünschten Indel-Nebenprodukten begleitet. Im Gegensatz dazu weist twinPE das Potenzial auf, Deletionen mit größerer Flexibilität und Präzision durchzuführen, da keine DSB erzeugt werden und zusätzliche DNA-Sequenzen an den twinPE-induzierten Nickstellen eingeschrieben werden können. Um twinPE für präzise Deletionen zu bewerten, wurden drei Strategien mit gepaarten pegRNAs verglichen: eine „Single-Anker“-twinPE-Strategie, eine „Hybrid-Anker“-twinPE-Strategie und die kürzlich berichtete „PrimeDel“-Strategie (109C). Jede Strategie unterscheidet sich in der Sequenz, die in den komplementären Flaps kodiert wird, was eine flexible Positionierung der Deletion in Bezug auf die Nickstellen ermöglicht.
  • Mit der Single-Anker-Strategie wurden komplementäre 13-nt-Flaps verwendet, um 77 bp der Sequenz neben einer der pegRNA-induzierten Nickstellen mit einer Effizienz von 14,8 % zu löschen, und komplementäre 34-nt-Flaps wurden verwendet, um 56 bp der Sequenz mit einer Effizienz von 18,8 % präzise herauszuschneiden (109D). Unter Verwendung der Hybrid-Anker-Strategie wurden 64 bp zwischen den pegRNA-induzierten Nickstellen gelöscht, so dass das Produkt 13 bp der Sequenz 3' von jeder Nickstelle beibehält, mit einer Effizienz von 11,7 % (109D). Schließlich wurde die PrimeDel-Strategie auf die Deletion von 90 bp zwischen den pegRNA-induzierten Nickstellen getestet, was mit einer Effizienz von 40,4 % gelang (109D). Bemerkenswert ist, dass die PrimeDel-Strategie die PAM- Sequenzen auf beiden Strängen unterbricht, was wahrscheinlich die Effizienz erhöht und gleichzeitig die Zahl der Indels verringert. Die Editing-Effizienz konnte durch die Hinzufügung des evoPreQ1-Motivs am 3'-Ende der pegRNAs um das 1,5- bis 2,5-fache gesteigert werden, wenngleich dies in einigen Fällen mit einer Zunahme der Indels einherging (109D). Zusammengenommen zeigen diese Daten, dass twinPE eine Strategie zur Ausführung gezielter Deletionen mit hoher Flexibilität bietet, die nicht von der Verfügbarkeit perfekt positionierter Nuklease-Schnittstellen abhängt.
  • Schließlich wurde ein therapeutisch relevanter Locus, DMD, als Ziel gewählt, um twinPE für größere Deletionen einzusetzen. Pathogene DMD-Allele, die für die Duchenne- Muskeldystrophie verantwortlich sind, enthalten in der Regel große Deletionen in Regionen, die Exons enthalten, die zu rahmenverschobenen mRNA-Transkripten führen. Da die Produktion des Dystrophin-Proteins in voller Länge ohne Austausch der gelöschten Exons zu einer teilweisen Rettung der Proteinfunktion führen kann, wurde die Unterbrechung eines zweiten Exons, das den Reading Frame wiederherstellt, als mögliche therapeutische Strategie vorgeschlagen. Drei twinPE-Deletionsstrategien wurden zusammen mit einer bereits berichteten Cas9-Nuklease-Deletionsstrategie zur Exzision von Exon 51 bei DMD untersucht. Bei der Verwendung von twinPE-Deletionsansätzen mit einem Anker wurde eine Effizienz von 14,4 % bis 24 % für die Deletion einer 780-bp-Sequenz beobachtet, die Exon 51 in DMD enthält (109E). Während die gepaarte Cas9-Nuklease-Strategie eine höhere Deletionseffizienz (durchschnittlich 49,8 %) im Vergleich zu den twinPE-Strategien (durchschnittlich 14 % bis 24 %) erzielte, ging die gepaarte Cas9-Nuklease-vermittelte Deletion auch mit wesentlich höheren Indel-Werten (33 % gewünschte Deletion mit Indels, 11% Indels ohne die gewünschte Deletion) im Vergleich zu twinPE (1% bis 12 % Gesamtindels) einher (109E). Exon 51 von DMD konnte auch unter Verwendung alternativer Spacer-Paare exzidiert werden, die mit der PrimeDel-Strategie eine Deletion von 627 bp (28,8 % durchschnittliche Effizienz) oder mit der Single-Anker-twinPE-Strategie eine Deletion von 590 bp (26,4 % durchschnittliche Effizienz) erzeugten, oder indem mit twinPE eine Sequenz von 589 bp durch eine Bxb1-attB-Sequenz von 38 bp ausgetauscht wurde (bis zu 40,4 % durchschnittliche Effizienz) (109E). Diese Experimente zeigen, dass twinPE und PrimeDel in der Lage sind, große Deletionen an therapeutisch relevanten Loci in humanen Zellen mit überlegener Produktreinheit im Vergleich zu gepaarten Cas9-Nuklease-Strategien zu erzeugen, wenn auch mit niedrigeren durchschnittlichen Effizienzen.
  • Gezielte DNA-Integration an Safe-Harbor-Loci mit twinPE und Bxb1-Integrase
  • Obwohl twinPE in der Lage ist, größere Insertions-Edits auszuführen als PE3, reichten die oberen Grenzen der Sequenzinsertionsgröße von noch nicht aus, um die Integration von DNA-Fragmenten in Gengröße zu unterstützen. Da mit twinPE die Insertion von Bxb1- Anheftungssequenzen in endogene humane Genomstellen mit hoher Effizienz erreicht worden ist, wurde twinPE mit Serinrekombinasen zur stellenspezifischen Integration von DNA-Fracht kombiniert. Zur Identifizierung von Stellen für die Integration von DNA-Fracht wurde die twinPE-vermittelte Insertion von Bxb1-attB- und attP-Anheftungssequenzen an etablierten Safe-Harbor-Loci in HEK293T-Zellen durchgeführt. 32 Spacer-Paare, die auf den AAVS1- Locus abzielen, wurden auf die Insertion der 50-bp-Bxb1-attP-Sequenz untersucht (Daten nicht gezeigt). Von den evaluierten Spacer-Paaren erreichten die optimalen pegRNAs für 18 von 32 Spacer-Kombinationen eine korrekte Insertionseffizienz von >50 % durch Amplikon- Sequenzierung (110A). Zusätzlich wurden 19 Spacer-Paare, die auf den CCR5-Locus abzielen, auf die Insertion der 38-bp-Bxb1-attB-Sequenz untersucht (Daten nicht gezeigt), von denen 6 Spacer-Paare durch Amplikon-Sequenzierung >50 % der gewünschten Editing- Effizienz erreichten (110B). Diese Ergebnisse zeigen, dass twinPE zur Insertion von Rekombinase-Anheftungssequenzen an Safe-Harbor-Loci in humanen Zellen mit hoher Effizienz verwendet werden kann.
  • Als Nächstes wurden mit twinPE eingefügte Bxb1-attB- und attP-Sequenzen untersucht, um zu bestimmen, ob sie als Zielstellen für die Integration von Plasmid-DNA- Fracht dienen können, die Partner-Bxb1-Anheftungsstellen beherbergt. Zunächst wurden mit twinPE Einzelzellklone erzeugt, die homozygote attB-Insertionen am CCRS-Locus tragen (Daten nicht gezeigt). Die Transfektion dieser klonalen Zelllinie mit einem Plasmid, das Bxb1- Rekombinase exprimiert, und einem 5,6-kB-attP-enthaltenden Donor-DNA-Plasmid ergab einen Wirkungsgrad von 12-17 % Knock-in an der Zielstelle, gemessen mittels ddPCR (113), was mit den zuvor berichteten BxB1-Integrationseffizienzen übereinstimmt. Ermutigt durch diese Ergebnisse wurden die twinPE-vermittelte Insertion an der Anheftungsstelle und die BxB1-vermittelte DNA-Donor-Integration untersucht, um zu bestimmen, ob sie in einem einzigen Transfektionsschritt erreicht werden können. Spannenderweise führte die Transfektion von HEK293T-Zellen mit Plasmiden, die PE2, beide pegRNAs, Bxb1-und Donor-DNA kodieren, zu einer Knock-in-Effizienz von 1,4-6,8 %, gemessen mittels ddPCR (110C). Die erwarteten Kreuzungssequenzen, die die erwarteten attL- und attR-Rekombinationsprodukte enthielten, wurden durch Amplikonsequenzierung bestätigt, wobei die Produktreinheiten zwischen 71 und 95 % lagen (114).
  • In dem Bemühen, die „One-Pot“-Knock-in-Effizienz zu verbessern, wurde der twinPE- vermittelte Einbau entweder von attB- oder attP-Anheftungsstellen, der kanonischen (GT) Bxb1-Kernsequenz, einer alternativen (GA) Bxb1-Kernsequenz und unterschiedlicher Flap- Überlappungslängen getestet. Es zeigte sich, dass der Einbau der attB-Stelle mit twinPE besser ausgeführt wurde als der Einbau der attP-Stelle für One-Pot-Knock-in-Transfektionen (3,3 % gegenüber 0,5 % Knock-in, 110D). Darüber hinaus wurde beobachtet, dass die Insertion von Anheftungsstellen mit der kanonischen GT-Kernsequenz generell zu höheren Knock-in- Effizienzen führte als die Insertion von Anheftungsstellen mit der alternativen GA-Sequenz (3,3 % gegenüber 0% im attB-Kontext, 110D). Bemerkenswert ist jedoch, dass die kanonischen und alternativen Kernsequenzen eine orthogonale Rekombination mit den entsprechenden attP-Anheftungsstellen ermöglichen. Das Reduzieren der Überlappung zwischen pegRNA-kodierten Rekombinase-Sequenzen verbesserte ebenfalls die Knock-in- Effizienz, und zwar von 3,3 % mit 38 Basenpaaren Überlappung auf 5,5 % mit 20 Basenpaaren Überlappung beim Einfügen von attB (110D), was möglicherweise auf den reduzierten Umfang der Anheftungssequenz innerhalb der pegRNA-exprimierenden Plasmid-DNA- Sequenz zurückzuführen ist. Obwohl bei allen Überlappungslängen eine ähnliche twinPE- Effizienz beobachtet wurde, war die Rekombination zwischen Donor-DNA und pegRNA- Plasmid reduziert (115A-115B).
  • Als Nächstes wurde die Donor-Integration am ALB-Locus bewertet, der für die therapeutische Proteinsekretion aus Hepatozyten genutzt werden kann. Albumin wird aktiv von der Leber sezerniert und macht etwa 60 % der humanen Plasmaproteine aus. Daher könnte durch die Integration therapeutischer Transgene in den ALB-Locus bei einem relativ kleinen Prozentsatz von Hepatozyten ein therapeutisches Niveau der Proteinexprimierung für viele Krankheiten erreicht werden. Es wurde eine Strategie entwickelt, die auf das Intron 1 von ALB abzielt, wobei Bxb1 die Integration einer zirkulären DNA vermittelt, die eine Spleißakzeptorsequenz enthält, gefolgt von der cDNA für ein gewünschtes Protein. Die Integration würde im Prinzip das Spleißen des Albumin-Sekretionssignals, das in Exon 1 kodiert ist, in die Sequenz, die das therapeutische Transgen kodiert, ermöglichen. Zunächst wurden pegRNA-Paare auf die Insertion der Bxb1-attB-Sequenz in Intron 1 von ALB untersucht. Nach dem Screening der pegRNA-Paare wurde eine Spacer-Kombination identifiziert, die bei der Amplikon-Sequenzierung eine 43%ige korrekte Insertion der attB- Sequenz erreichte (110E). Eine einfache Knock-in-Transfektion an diesem Locus wurde mit einer Effizienz von 1,3 % in HEK293T erreicht (110F). In Huh7-Zellen wurde eine 34%ige korrekte Insertion der attB-Sequenz mit einer Knock-in-Effizienz von 2,6 % bei einmaliger Transfektion beobachtet. Interessanterweise war das Knock-in an ALB in Huh7 effizienter als das Knock-in an CCR5 (2,6 % gegenüber 1,1 %), obwohl das CCR5-Knock-in effizienter war als das ALB-Knock-in in HEK293T-Zellen.
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  • Multiplex-Editing und rekombinasevermittelte Inversion
  • Große strukturelle Varianten finden sich in vielen humanpathogenen Allelen, wie z. B. die große 0,6-Mb-Inversion am Locus F8, die ~50% der schweren Hämophilie-A-Fälle verursacht. Inspiriert durch die hohe Effizienz der Insertion von Anheftungsstellen durch Rekombinasen mit twinPE wurde die Idee geboren, dass das Multiplexing der Insertion von attB- und attP-Bxb1-Anheftungsstellen zur Korrektur komplexerer genetischer Varianten durch unidirektionale Deletion oder Inversion der dazwischenliegenden DNA-Sequenz genutzt werden könnte. Um diesen Ansatz an einem therapeutisch relevanten Locus zu testen, wurde eine 39-kb-Inversion zwischen IDS und seinem Pseudogen IDS2 versucht. Inversionen zwischen diesen Stellen wurden in ~13 % der Fälle von Hunter-Syndrom beobachtet, und die Charakterisierung der Bruchpunkte in pathogenen Allelen hat ergeben, dass die Inversion häufig innerhalb eines Rekombinations-Hotspots von Intron 7 auftritt, der sowohl in IDS als auch in IDS2 vorhanden ist. Daher wurden Regionen, die diese Rekombinations-Hotspots flankieren, gezielt für die Insertion von Bxb1-attP- und attB-Anheftungssequenzen ausgewählt, die, wenn sie in entgegengesetzte Richtungen ausgerichtet sind, als Substrate für die unidirektionale Inversion durch Bxb1 zur Korrektur der pathogenen Allelsequenz in Patientenzellen verwendet werden können (111A). Nach dem Screening von 12 pegRNA-Spacer-Paaren und der Optimierung von pegRNA-Sequenz-Merkmalen wurde festgestellt, dass pegRNA-Paare, die in der Lage sind, attP- oder attB-Anheftungsstellen an der linken bzw. rechten Zielstelle einzufügen, eine Effizienz von 73,7 % bzw. 69,8 % aufweisen (111B).
  • Als nächstes wurde die Multiplexing twinPE-vermittelte Insertion von attP- und attB- Anheftungsstellen mit der Bxb1-Rekombinase-vermittelten Inversion der 39-kb-Sequenz in IDS und IDS2 untersucht. Zunächst wurde die sequentielle DNA-Transfektion mit twinPE- Komponenten und anschließender Bxb1-Rekombinase untersucht. Ein erster Satz von pegRNAs (Satz 1) wurde getestet, der eine vorwärtsgerichtete attP-Sequenz in Intron 3 von IDS2 und eine rückwärtsgerichtete attB-Sequenz in Intron 7 von IDS einbaut. Darüber hinaus wurde ein zweiter Satz pegRNAs (Satz 2) verwendet, um in einer ersten Transfektion eine rückwärtsgerichtete attP-Sequenz in IDS2 und eine vorwärtsgerichtete attB-Sequenz in IDS einzubauen. Beim Multiplex-Editing mit pegRNA Satz 1 bzw. Satz 2 wurden 52,3 % bzw. 54,5 % attP-Sequenz-Insertion und 27,6 % bzw. 30,9 % attB-Sequenz-Insertion beobachtet (111C). Wurden die editierten Zellen anschließend mit Bxb1-Rekombinase transfiziert, wurde im Vergleich zu Mock-Transfektionskontrollen ein deutlich geringerer Prozentsatz amplifizierter Allele beobachtet, die attP- und attB-Sequenzen enthielten (p-Wert < 0,05), was darauf hindeutet, dass einige editierte Allele als Substrate für die Bxb1-vermittelte Rekombination verwendet wurden (111C). Die Amplifikation der erwarteten Inversionskreuzungen und die anschließende Amplikonsequenzierung zeigten sowohl die attLals auch die attR-Sequenzsignaturen der Bxb1-vermittelten Rekombination, wobei die Produktreinheit an beiden Kreuzungen bei oder über 80 % lag (111D).
  • Um die One-Pot-twinPE und die Bxb1-vermittelte Inversion durchzuführen und unerwünschte Rekombinationen zwischen pegRNA-Plasmid-DNA zu vermeiden, wurden all- RNA-Komponenten, die PE2-mRNA, synthetische pegRNAs aus Satz 1 und Bxb1-mRNA umfassen, nukleofiziert. Mithilfe der Amplikonsequenzierung wurden die erwarteten invertierten Allelkreuzungen, die attR- und attL-Sequenzen enthalten, erfasst. Um die Inversionseffizienz zu quantifizieren, wurde ferner ein reverse Primer entworfen, der an eine identische Sequenz sowohl im nicht-invertierten als auch im invertierten Allel binden kann und daher beide Edits mit demselben Primerpaar amplifiziert (116). Es wurden ~4,6-7,2 % bzw. ~1,5-2,3 % Inversionseffizienz für die „sequenzielle“ und die „One-Pot“-Strategie beobachtet (111E). Insgesamt belegen diese Daten, dass die Kombination von twinPE mit stellenspezifischen Serinrekombinasen zur Korrektur einer bei Hunter-Syndrom-Allelen häufig vorkommenden 39-kb-Inversion verwendet werden kann und als vielversprechende therapeutische Plattform für die Korrektur anderer komplexer pathogener Varianten dienen könnte.
  • Erörterung
  • Wie hierin vorgestellt, wurde ein Twin-Prime-Editing-Ansatz entwickelt, mit dem DNA-Sequenzen an bestimmten Stellen im Genom humaner Zellen gelöscht, ausgetauscht oder eingefügt werden können. In Kombination mit stellenspezifischen Serin-Rekombinase- Enzymen kann twinPE auch die Integration von DNA-Fracht oder die Inversion von DNA- Sequenzen unterstützen.
  • Verfahren
  • Allgemeine Verfahren
  • Die DNA-Amplifikation erfolgte durch PCR unter Verwendung von Phusion U Green Multiplex PCR Master Mix (ThermoFisher Scientific) oder Q5 Hot Start High-Fidelity 2x Master Mix (New England BioLabs), sofern nicht anders angegeben. DNA-Oligonukleotide wurden von Integrated DNA Technologies bezogen. Plasmide, die sgRNAs exprimieren, wurden durch Ligation von annealisierten Oligonukleotiden in einen BsmBI-aufgeschlossenen Akzeptor-Vektor konstruiert. Plasmide, die pegRNAs exprimieren, wurden durch Gibson- Assembly oder Golden-Gate-Assembly konstruiert, wie zuvor beschrieben. Die Sequenzen der in diesem Beispiel verwendeten sgRNA- und pegRNA-Konstrukte sind in den Tabellen 11-12 aufgelistet. Tabelle 11. Sequenzen der in diesem Beispiel verwendeten sgRNA
    sgRNA Spacer-Sequenz SEQ-ID- NR:
    HEK3_3b _+90_Nicking
    Figure DE112021002672T5_1419
    		 616
    pU6-Sp-sgRNA- DMDExo51-A1
    Figure DE112021002672T5_1420
    		 3971
    pU6-Sp-sgRNA- DMDExo51-A3
    Figure DE112021002672T5_1421
    		 3972
    pU6-Sp-sgRNA- DMDExo51-B1 Gcagttgcctaagaactggt 3973
    Tabelle 12. Sequenzen der in diesem Beispiel verwendeten pegRNA
    pegRNA Spacer- Sequenz Spacer SEQ-ID- NR: 3'-Verlängerung Verlängerung SEQ- ID-NR:
    HEK3_attB_A_38
    Figure DE112021002672T5_1422
    		 383
    Figure DE112021002672T5_1423
    		 4029
    HEK3_attB_A_34
    Figure DE112021002672T5_1424
    		 383
    Figure DE112021002672T5_1425
    		 4030
    HEK3_attB_A_30
    Figure DE112021002672T5_1426
    		 383
    Figure DE112021002672T5_1427
    		 4031
    HEK3_attB_B_38
    Figure DE112021002672T5_1428
    		 616
    Figure DE112021002672T5_1429
    		 4032
    HEK3_attB_B_34
    Figure DE112021002672T5_1430
    		 616
    Figure DE112021002672T5_1431
    		 4033
    HEK3_attB_B_30
    Figure DE112021002672T5_1432
    		 616
    Figure DE112021002672T5_1433
    		 4034
    HEK3_attP_A_43
    Figure DE112021002672T5_1434
    		 383
    Figure DE112021002672T5_1435
    		 4035
    HEK3_attP_A_39
    Figure DE112021002672T5_1436
    		 383
    Figure DE112021002672T5_1437
    		 4036
    HEK3_attP_A_35
    Figure DE112021002672T5_1438
    		 383
    Figure DE112021002672T5_1439
    		 4037
    HEK3_attP_B_44
    Figure DE112021002672T5_1440
    		 616
    Figure DE112021002672T5_1441
    		 4038
    HEK3_attP_B_40
    Figure DE112021002672T5_1442
    		 616
    Figure DE112021002672T5_1443
    		 4039
    HEK3_attP_B_36
    Figure DE112021002672T5_1444
    		 616
    Figure DE112021002672T5_1445
    		 4040
    PE3_HEK3_FKBP_ins12bp
    Figure DE112021002672T5_1446
    		 383
    Figure DE112021002672T5_1447
    		 4041
    PE3_HEK3_ FKBP_ins36bp
    Figure DE112021002672T5_1448
    		 383
    Figure DE112021002672T5_1449
    		 4042
    PE3_HEK3_ FKBP_ins108bp
    Figure DE112021002672T5_1450
    		 383
    Figure DE112021002672T5_1451
    		 4043
    PE3_HEK3_ FKBP_ins321bp
    Figure DE112021002672T5_1452
    		 383
    Figure DE112021002672T5_1453
    		 4044
    twinPE_HEK3_FKBP_ins108bp_32bp_Überhang_A
    Figure DE112021002672T5_1454
    		 383
    Figure DE112021002672T5_1455
    		 4045
    twinPE_HEK3_FKBP_ins108bp_32bp_Überhang_B
    Figure DE112021002672T5_1456
    		 616
    Figure DE112021002672T5_1457
    		 4046
    pU6-Sp- gRNA- HEK3_del_DF_A_13ntTEMP_Basic
    Figure DE112021002672T5_1458
    		 383 tcctctgccatcacgtgctcagtctg 4047
    pU6-Sp- gRNA- HEK3_del_DF_B_13ntTEMP_Basic
    Figure DE112021002672T5_1459
    		 616 tgatggcagaggaccgggatactgg 4048
    pU6-Sp- gRNA- HEK3_del_DF_A 34ntTEMP_Basic
    Figure DE112021002672T5_1460
    		 383
    Figure DE112021002672T5_1461
    		 4049
    pU6-Sp- gRNA- HEK3_del_DF_B 34ntTEMP_Basic
    Figure DE112021002672T5_1462
    		 616
    Figure DE112021002672T5_1463
    		 4050
    pU6-Sp- gRNA- HEK3_del_DF_A_13- 13TEMP_Hybrid
    Figure DE112021002672T5_1464
    		 383 tgcaggagctgcatcctctgccatcacgtgctcagtctg 4051
    pU6-Sp- gRNA- HEK3_del_DF_B_13- 13TEMP_Hybrid
    Figure DE112021002672T5_1465
    		 616 tgatggcagaggatgcagctcctgcaccgggatactgg 4052
    pU6-Sp- gRNA- HEK3_del_DF_A_31ntTEMP_Shendure
    Figure DE112021002672T5_1466
    		 383
    Figure DE112021002672T5_1467
    		 4053
    pU6-Sp- gRNA- HEK3_del_DF_B_31ntTEMP_Shendure
    Figure DE112021002672T5_1468
    		 616
    Figure DE112021002672T5_1469
    		 4054
    pU6-Sp- gRNA- HEK3_del_DF_A_13ntTEMP_Basic_EvoPreQ1
    Figure DE112021002672T5_1470
    		 383
    Figure DE112021002672T5_1471
    		 4055
    pU6-Sp- gRNA- HEK3_del_DF_B_13ntTEMP_Basic_EvoPreQ1
    Figure DE112021002672T5_1472
    		 616
    Figure DE112021002672T5_1473
    		 4056
    pU6-Sp- gRNA- HEK3_del_DF_A_34ntTEMP_Basic_EvoPreQ1
    Figure DE112021002672T5_1474
    		 383
    Figure DE112021002672T5_1475
    		 4057
    pU6-Sp- gRNA- HEK3_del_DF_B_34ntTEMP_Basic_EvoPreQ1
    Figure DE112021002672T5_1476
    		 616
    Figure DE112021002672T5_1477
    		 4058
    pU6-Sp- gRNA- HEK3_del_DF_A_13- 13TEMP_Hybrid_EvoPreQ1
    Figure DE112021002672T5_1478
    		 383
    Figure DE112021002672T5_1479
    		 4059
    pU6-Sp- gRNA- HEK3_del_DF_B_13- 13TEMP_Hybrid_EvoPreQ1
    Figure DE112021002672T5_1480
    		 616
    Figure DE112021002672T5_1481
    		 4060
    pU6-Sp- gRNA- HEK3_del_DF_A_31ntTEMP_Shendure_EvoPreQ1
    Figure DE112021002672T5_1482
    		 383
    Figure DE112021002672T5_1483
    		 4061
    pU6-Sp- gRNA- HEK3_del_DF_B_31ntTEMP_Shendure_EvoPreQ1
    Figure DE112021002672T5_1484
    		 616
    Figure DE112021002672T5_1485
    		 4062
    pU6-Sp- pegRNA- DMDExo51- A1_a_Basic
    Figure DE112021002672T5_1486
    		 3971
    Figure DE112021002672T5_1487
    		 4063
    pU6-Sp- pegRNA- DMDExo51- A1_b_Basic
    Figure DE112021002672T5_1488
    		 3971
    Figure DE112021002672T5_1489
    		 4064
    pU6-Sp- pegRNA- DMDExo51- A1_c_Basic
    Figure DE112021002672T5_1490
    		 3971
    Figure DE112021002672T5_1491
    		 4065
    pU6-Sp- pegRNA- DMDExo51- B1_A1_b_Basic
    Figure DE112021002672T5_1492
    		 3973
    Figure DE112021002672T5_1493
    		 4066
    pU6-Sp- pegRNA- DMDExo51- B1_A1_c_Basic
    Figure DE112021002672T5_1494
    		 3973
    Figure DE112021002672T5_1495
    		 4067
    pU6-Sp- pegRNA- DMDExo51- A3_c_Basic
    Figure DE112021002672T5_1496
    		 3972
    Figure DE112021002672T5_1497
    		 4068
    pU6-Sp- pegRNA- DMDExo51- B_ A3_a_Basic
    Figure DE112021002672T5_1498
    		 3973
    Figure DE112021002672T5_1499
    		 4069
    pu6-sp- pegma- dmdexo51- a3- b1_a_PrimeDel
    Figure DE112021002672T5_1500
    		 3972
    Figure DE112021002672T5_1501
    		 4070
    pu6-sp- pegma- dmdexo51- b1-a3_a- PrimeDel
    Figure DE112021002672T5_1502
    		 3973 accacttccacaatgtatatgattgttactgagttcttagg 4071
    pu6-sp- pegma- dmdexo51- b1-a3__b- PrimeDel
    Figure DE112021002672T5_1503
    		 3973 accacttccacaatgtatatgattgttactgagttcttaggcaa 4072
    pU6-Sp- pegRNA- DMDExo51- A3_b_attB_fwd
    Figure DE112021002672T5_1504
    		 3972
    Figure DE112021002672T5_1505
    		 4073
    pU6-Sp- pegRNA- DMDExo51- A3_c_attB_fwd
    Figure DE112021002672T5_1506
    		 3972
    Figure DE112021002672T5_1507
    		 4074
    pU6-Sp- pegRNA- DMDExo51- B1_b _attB_fwd
    Figure DE112021002672T5_1508
    		 3973
    Figure DE112021002672T5_1509
    		 4075
    pU6-Sp- pegRNA- DMDExoS1- B1_c_attB_fwd
    Figure DE112021002672T5_1510
    		 3973
    Figure DE112021002672T5_1511
    		 4076
    pU6-Sp- pegRNA- DMDExo51- B2_b_attB_fwd
    Figure DE112021002672T5_1512
    		 3974
    Figure DE112021002672T5_1513
    		 4077
    pU6-Sp- pegRNA- DMDExo51- B2_c_attB_fwd
    Figure DE112021002672T5_1514
    		 3974
    Figure DE112021002672T5_1515
    		 4078
    A_1077a
    Figure DE112021002672T5_1516
    		 3975
    Figure DE112021002672T5_1517
    		 4079
    A 1077b
    Figure DE112021002672T5_1518
    		 3975
    Figure DE112021002672T5_1519
    		 4080
    A_1077c
    Figure DE112021002672T5_1520
    		 3975
    Figure DE112021002672T5_1521
    		 4081
    A_1098a
    Figure DE112021002672T5_1522
    		 3976
    Figure DE112021002672T5_1523
    		 4082
    A_1098b
    Figure DE112021002672T5_1524
    		 3976
    Figure DE112021002672T5_1525
    		 4083
    A_1098c
    Figure DE112021002672T5_1526
    		 3976
    Figure DE112021002672T5_1527
    		 4084
    A_1246a
    Figure DE112021002672T5_1528
    		 3977
    Figure DE112021002672T5_1529
    		 4085
    A_1246b
    Figure DE112021002672T5_1530
    		 3977
    Figure DE112021002672T5_1531
    		 4086
    A_1246c
    Figure DE112021002672T5_1532
    		 3977
    Figure DE112021002672T5_1533
    		 4087
    A_1267a
    Figure DE112021002672T5_1534
    		 3978
    Figure DE112021002672T5_1535
    		 4088
    A_1267b
    Figure DE112021002672T5_1536
    		 3978
    Figure DE112021002672T5_1537
    		 4089
    A_1267c
    Figure DE112021002672T5_1538
    		 3978
    Figure DE112021002672T5_1539
    		 4090
    A_1293a
    Figure DE112021002672T5_1540
    		 3979
    Figure DE112021002672T5_1541
    		 4091
    A_1293b
    Figure DE112021002672T5_1542
    		 3979
    Figure DE112021002672T5_1543
    		 4092
    A_1293c
    Figure DE112021002672T5_1544
    		 3979
    Figure DE112021002672T5_1545
    		 4093
    A_1307a
    Figure DE112021002672T5_1546
    		 3980
    Figure DE112021002672T5_1547
    		 4094
    A_1307b
    Figure DE112021002672T5_1548
    		 3980
    Figure DE112021002672T5_1549
    		 4095
    A_1307c
    Figure DE112021002672T5_1550
    		 3980
    Figure DE112021002672T5_1551
    		 4096
    A_1582a
    Figure DE112021002672T5_1552
    		 3981
    Figure DE112021002672T5_1553
    		 4097
    A_1582b
    Figure DE112021002672T5_1554
    		 3981
    Figure DE112021002672T5_1555
    		 4098
    A_1582c
    Figure DE112021002672T5_1556
    		 3981
    Figure DE112021002672T5_1557
    		 4099
    A_1615a
    Figure DE112021002672T5_1558
    		 3982
    Figure DE112021002672T5_1559
    		 4100
    A_1615b
    Figure DE112021002672T5_1560
    		 3982
    Figure DE112021002672T5_1561
    		 4101
    A_1615c
    Figure DE112021002672T5_1562
    		 3982
    Figure DE112021002672T5_1563
    		 4102
    A_1647a
    Figure DE112021002672T5_1564
    		 3983
    Figure DE112021002672T5_1565
    		 4103
    A_1647b
    Figure DE112021002672T5_1566
    		 3983
    Figure DE112021002672T5_1567
    		 4104
    A_1647c
    Figure DE112021002672T5_1568
    		 3983
    Figure DE112021002672T5_1569
    		 4105
    A_1810a
    Figure DE112021002672T5_1570
    		 3984
    Figure DE112021002672T5_1571
    		 4106
    A_1810b
    Figure DE112021002672T5_1572
    		 3984
    Figure DE112021002672T5_1573
    		 4107
    A_1810c
    Figure DE112021002672T5_1574
    		 3984
    Figure DE112021002672T5_1575
    		 4108
    A_1890a
    Figure DE112021002672T5_1576
    		 3985
    Figure DE112021002672T5_1577
    		 4109
    A_1890b
    Figure DE112021002672T5_1578
    		 3985
    Figure DE112021002672T5_1579
    		 4110
    A_1890c
    Figure DE112021002672T5_1580
    		 3985
    Figure DE112021002672T5_1581
    		 4111
    A_3786a
    Figure DE112021002672T5_1582
    		 3986
    Figure DE112021002672T5_1583
    		 4112
    A_3786b
    Figure DE112021002672T5_1584
    		 3986
    Figure DE112021002672T5_1585
    		 4113
    A_3786c
    Figure DE112021002672T5_1586
    		 3986
    Figure DE112021002672T5_1587
    		 4114
    A_3835a
    Figure DE112021002672T5_1588
    		 3987
    Figure DE112021002672T5_1589
    		 4115
    A_3835b
    Figure DE112021002672T5_1590
    		 3987
    Figure DE112021002672T5_1591
    		 4116
    A_3835c
    Figure DE112021002672T5_1592
    		 3987
    Figure DE112021002672T5_1593
    		 4117
    A_3856a
    Figure DE112021002672T5_1594
    		 3988
    Figure DE112021002672T5_1595
    		 4118
    A_3856b
    Figure DE112021002672T5_1596
    		 3988
    Figure DE112021002672T5_1597
    		 4119
    A_3856c
    Figure DE112021002672T5_1598
    		 3988
    Figure DE112021002672T5_1599
    		 4120
    B_1154a
    Figure DE112021002672T5_1600
    		 3989
    Figure DE112021002672T5_1601
    		 4121
    B_1154b
    Figure DE112021002672T5_1602
    		 3989
    Figure DE112021002672T5_1603
    		 4122
    B_1154c
    Figure DE112021002672T5_1604
    		 3989
    Figure DE112021002672T5_1605
    		 4123
    B_1314a
    Figure DE112021002672T5_1606
    		 3990
    Figure DE112021002672T5_1607
    		 4124
    B_1314b
    Figure DE112021002672T5_1608
    		 3990
    Figure DE112021002672T5_1609
    		 4125
    B_1314c
    Figure DE112021002672T5_1610
    		 3990
    Figure DE112021002672T5_1611
    		 4126
    B_1376a
    Figure DE112021002672T5_1612
    		 3991
    Figure DE112021002672T5_1613
    		 4127
    B_1376b
    Figure DE112021002672T5_1614
    		 3991
    Figure DE112021002672T5_1615
    		 4128
    B_1376c
    Figure DE112021002672T5_1616
    		 3991
    Figure DE112021002672T5_1617
    		 4129
    B_1640a
    Figure DE112021002672T5_1618
    		 3992
    Figure DE112021002672T5_1619
    		 4130
    B_1640b
    Figure DE112021002672T5_1620
    		 3992
    Figure DE112021002672T5_1621
    		 4131
    B_1640c
    Figure DE112021002672T5_1622
    		 3992
    Figure DE112021002672T5_1623
    		 4132
    B_1676a
    Figure DE112021002672T5_1624
    		 3993
    Figure DE112021002672T5_1625
    		 4133
    B_1676b
    Figure DE112021002672T5_1626
    		 3993
    Figure DE112021002672T5_1627
    		 4134
    B_1676c
    Figure DE112021002672T5_1628
    		 3993
    Figure DE112021002672T5_1629
    		 4135
    B_1701a
    Figure DE112021002672T5_1630
    		 3994
    Figure DE112021002672T5_1631
    		 4136
    B_1701b
    Figure DE112021002672T5_1632
    		 3994
    Figure DE112021002672T5_1633
    		 4137
    B_1701c
    Figure DE112021002672T5_1634
    		 3994
    Figure DE112021002672T5_1635
    		 4138
    B_1705a
    Figure DE112021002672T5_1636
    		 3995
    Figure DE112021002672T5_1637
    		 4139
    B_1705b
    Figure DE112021002672T5_1638
    		 3995
    Figure DE112021002672T5_1639
    		 4140
    B_1705c
    Figure DE112021002672T5_1640
    		 3995
    Figure DE112021002672T5_1641
    		 4141
    B_1883a
    Figure DE112021002672T5_1642
    		 3996
    Figure DE112021002672T5_1643
    		 4142
    B_1883b
    Figure DE112021002672T5_1644
    		 3996
    Figure DE112021002672T5_1645
    		 4143
    B_1883c
    Figure DE112021002672T5_1646
    		 3996
    Figure DE112021002672T5_1647
    		 4144
    B_1902a
    Figure DE112021002672T5_1648
    		 3997
    Figure DE112021002672T5_1649
    		 4145
    B_1902b
    Figure DE112021002672T5_1650
    		 3997
    Figure DE112021002672T5_1651
    		 4146
    B_1902c
    Figure DE112021002672T5_1652
    		 3997
    Figure DE112021002672T5_1653
    		 4147
    B_1962a
    Figure DE112021002672T5_1654
    		 3998
    Figure DE112021002672T5_1655
    		 4148
    B_1962b
    Figure DE112021002672T5_1656
    		 3998
    Figure DE112021002672T5_1657
    		 4149
    B_1962c
    Figure DE112021002672T5_1658
    		 3998
    Figure DE112021002672T5_1659
    		 4150
    B_3839a
    Figure DE112021002672T5_1660
    		 3999
    Figure DE112021002672T5_1661
    		 4151
    B_3839b
    Figure DE112021002672T5_1662
    		 3999
    Figure DE112021002672T5_1663
    		 4152
    B_3839c
    Figure DE112021002672T5_1664
    		 3999
    Figure DE112021002672T5_1665
    		 4153
    B_3903a
    Figure DE112021002672T5_1666
    		 4000
    Figure DE112021002672T5_1667
    		 4154
    B_3903b
    Figure DE112021002672T5_1668
    		 4000
    Figure DE112021002672T5_1669
    		 4155
    B_3903c
    Figure DE112021002672T5_1670
    		 4000
    Figure DE112021002672T5_1671
    		 4156
    B_3930a
    Figure DE112021002672T5_1672
    		 4001
    Figure DE112021002672T5_1673
    		 4157
    B_3930b
    Figure DE112021002672T5_1674
    		 4001
    Figure DE112021002672T5_1675
    		 4158
    B_3930c
    Figure DE112021002672T5_1676
    		 4001
    Figure DE112021002672T5_1677
    		 4159
    A_1_223_a
    Figure DE112021002672T5_1678
    		 4002
    Figure DE112021002672T5_1679
    		 4160
    A_1_223_b
    Figure DE112021002672T5_1680
    		 4002
    Figure DE112021002672T5_1681
    		 4161
    A_1_223_c
    Figure DE112021002672T5_1682
    		 4002
    Figure DE112021002672T5_1683
    		 4162
    A_2_260_a
    Figure DE112021002672T5_1684
    		 4003
    Figure DE112021002672T5_1685
    		 4163
    A_2_260_b
    Figure DE112021002672T5_1686
    		 4003
    Figure DE112021002672T5_1687
    		 4164
    A_2_260_c
    Figure DE112021002672T5_1688
    		 4003
    Figure DE112021002672T5_1689
    		 4165
    A_3_325_a
    Figure DE112021002672T5_1690
    		 4004
    Figure DE112021002672T5_1691
    		 4166
    A_3_325_b
    Figure DE112021002672T5_1692
    		 4004
    Figure DE112021002672T5_1693
    		 4167
    A_3_325_c
    Figure DE112021002672T5_1694
    		 4004
    Figure DE112021002672T5_1695
    		 4168
    A_4_360_a
    Figure DE112021002672T5_1696
    		 4005
    Figure DE112021002672T5_1697
    		 4169
    A_4_360_b
    Figure DE112021002672T5_1698
    		 4005
    Figure DE112021002672T5_1699
    		 4170
    A_4_360_c
    Figure DE112021002672T5_1700
    		 4005
    Figure DE112021002672T5_1701
    		 4171
    A_5_507_a
    Figure DE112021002672T5_1702
    		 4006
    Figure DE112021002672T5_1703
    		 4172
    A_5_507_b
    Figure DE112021002672T5_1704
    		 4006
    Figure DE112021002672T5_1705
    		 4173
    A_5_507_c
    Figure DE112021002672T5_1706
    		 4006
    Figure DE112021002672T5_1707
    		 4174
    A_6_510_a
    Figure DE112021002672T5_1708
    		 4007
    Figure DE112021002672T5_1709
    		 4175
    A_6_510_b
    Figure DE112021002672T5_1710
    		 4007
    Figure DE112021002672T5_1711
    		 4176
    A_6_510_c
    Figure DE112021002672T5_1712
    		 4007
    Figure DE112021002672T5_1713
    		 4177
    A_7_532_a
    Figure DE112021002672T5_1714
    		 4008
    Figure DE112021002672T5_1715
    		 4178
    A_7_532_b
    Figure DE112021002672T5_1716
    		 4008
    Figure DE112021002672T5_1717
    		 4179
    A_7_532_c
    Figure DE112021002672T5_1718
    		 4008
    Figure DE112021002672T5_1719
    		 4180
    B_1_272_a
    Figure DE112021002672T5_1720
    		 4009
    Figure DE112021002672T5_1721
    		 4181
    B_1_272_b
    Figure DE112021002672T5_1722
    		 4009
    Figure DE112021002672T5_1723
    		 4182
    B_1_272_c
    Figure DE112021002672T5_1724
    		 4009
    Figure DE112021002672T5_1725
    		 4183
    B_2_291_a
    Figure DE112021002672T5_1726
    		 4010
    Figure DE112021002672T5_1727
    		 4184
    B_2_291_b
    Figure DE112021002672T5_1728
    		 4010
    Figure DE112021002672T5_1729
    		 4185
    B_2_291_c
    Figure DE112021002672T5_1730
    		 4010
    Figure DE112021002672T5_1731
    		 4186
    B_3_305_a
    Figure DE112021002672T5_1732
    		 4011
    Figure DE112021002672T5_1733
    		 4187
    B_3_305_b
    Figure DE112021002672T5_1734
    		 4011
    Figure DE112021002672T5_1735
    		 4188
    B_3_305_c
    Figure DE112021002672T5_1736
    		 4011
    Figure DE112021002672T5_1737
    		 4189
    B_4_326_a
    Figure DE112021002672T5_1738
    		 4012
    Figure DE112021002672T5_1739
    		 4190
    B_4_326_b
    Figure DE112021002672T5_1740
    		 4012
    Figure DE112021002672T5_1741
    		 4191
    B_4_326_c
    Figure DE112021002672T5_1742
    		 4012
    Figure DE112021002672T5_1743
    		 4192
    B_5_330_a
    Figure DE112021002672T5_1744
    		 4013
    Figure DE112021002672T5_1745
    		 4193
    B_5_330_b
    Figure DE112021002672T5_1746
    		 4013
    Figure DE112021002672T5_1747
    		 4194
    B_5_330_c
    Figure DE112021002672T5_1748
    		 4013
    Figure DE112021002672T5_1749
    		 4195
    B_6_414_a
    Figure DE112021002672T5_1750
    		 4014
    Figure DE112021002672T5_1751
    		 4196
    B_6_414_b
    Figure DE112021002672T5_1752
    		 4014
    Figure DE112021002672T5_1753
    		 4197
    B_6_414_c
    Figure DE112021002672T5_1754
    		 4014
    Figure DE112021002672T5_1755
    		 4198
    B_7_538_a
    Figure DE112021002672T5_1756
    		 4015
    Figure DE112021002672T5_1757
    		 4199
    B_7_538_b
    Figure DE112021002672T5_1758
    		 4015
    Figure DE112021002672T5_1759
    		 4200
    B_7_538_c
    Figure DE112021002672T5_1760
    		 4015
    Figure DE112021002672T5_1761
    		 4201
    B_8_584_a
    Figure DE112021002672T5_1762
    		 4016
    Figure DE112021002672T5_1763
    		 4202
    B_8_584_b
    Figure DE112021002672T5_1764
    		 4016
    Figure DE112021002672T5_1765
    		 4203
    B_8_584_c
    Figure DE112021002672T5_1766
    		 4016
    Figure DE112021002672T5_1767
    		 4204
    B_9_601_a
    Figure DE112021002672T5_1768
    		 4017
    Figure DE112021002672T5_1769
    		 4205
    B_9_601_b
    Figure DE112021002672T5_1770
    		 4017
    Figure DE112021002672T5_1771
    		 4206
    B_9_601_c
    Figure DE112021002672T5_1772
    		 4017
    Figure DE112021002672T5_1773
    		 4207
    A_3_325_a
    Figure DE112021002672T5_1774
    		 4004
    Figure DE112021002672T5_1775
    		 4166
    B_6_414_b
    Figure DE112021002672T5_1776
    		 4014
    Figure DE112021002672T5_1777
    		 4197
    A_5_507_c
    Figure DE112021002672T5_1778
    		 4006
    Figure DE112021002672T5_1779
    		 4174
    A_6_510_b
    Figure DE112021002672T5_1780
    		 4007
    Figure DE112021002672T5_1781
    		 4176
    A_7_532_b
    Figure DE112021002672T5_1782
    		 4008
    Figure DE112021002672T5_1783
    		 4179
    B_8_584_b
    Figure DE112021002672T5_1784
    		 4016
    Figure DE112021002672T5_1785
    		 4203
    A_1077c
    Figure DE112021002672T5_1786
    		 3975
    Figure DE112021002672T5_1787
    		 4081
    B_1154c
    Figure DE112021002672T5_1788
    		 3989
    Figure DE112021002672T5_1789
    		 4123
    A_3786c
    Figure DE112021002672T5_1790
    		 3986
    Figure DE112021002672T5_1791
    		 4114
    B_3903c
    Figure DE112021002672T5_1792
    		 4000
    Figure DE112021002672T5_1793
    		 4156
    B_3930c
    Figure DE112021002672T5_1794
    		 4001
    Figure DE112021002672T5_1795
    		 4159
    A_7_532_b
    Figure DE112021002672T5_1796
    		 4008
    Figure DE112021002672T5_1797
    		 4179
    B_8_584_b
    Figure DE112021002672T5_1798
    		 4016
    Figure DE112021002672T5_1799
    		 4203
    A7_attB_30
    Figure DE112021002672T5_1800
    		 4008
    Figure DE112021002672T5_1801
    		 4208
    B8_attB_30
    Figure DE112021002672T5_1802
    		 4016
    Figure DE112021002672T5_1803
    		 4209
    A7_attB_20
    Figure DE112021002672T5_1804
    		 4008
    Figure DE112021002672T5_1805
    		 4210
    B8_attB_20
    Figure DE112021002672T5_1806
    		 4016
    Figure DE112021002672T5_1807
    		 4211
    A7_attB_GA_38
    Figure DE112021002672T5_1808
    		 4008
    Figure DE112021002672T5_1809
    		 4212
    B8_attB_GA_38
    Figure DE112021002672T5_1810
    		 4016
    Figure DE112021002672T5_1811
    		 4213
    A7_attB_GA_30
    Figure DE112021002672T5_1812
    		 4008
    Figure DE112021002672T5_1813
    		 4214
    B8_attB_GA_30
    Figure DE112021002672T5_1814
    		 4016
    Figure DE112021002672T5_1815
    		 4215
    A7_attB_GA_20
    Figure DE112021002672T5_1816
    		 4008
    Figure DE112021002672T5_1817
    		 4216
    B8_attB_GA_20
    Figure DE112021002672T5_1818
    		 4016
    Figure DE112021002672T5_1819
    		 4217
    A7_attP_50
    Figure DE112021002672T5_1820
    		 4008
    Figure DE112021002672T5_1821
    		 4218
    B8_attP_50
    Figure DE112021002672T5_1822
    		 4016
    Figure DE112021002672T5_1823
    		 4219
    A7_attP_40
    Figure DE112021002672T5_1824
    		 4008
    Figure DE112021002672T5_1825
    		 4220
    B8_attP_40
    Figure DE112021002672T5_1826
    		 4016
    Figure DE112021002672T5_1827
    		 4221
    A7_attP_30
    Figure DE112021002672T5_1828
    		 4008
    Figure DE112021002672T5_1829
    		 4222
    B8_attP_30
    Figure DE112021002672T5_1830
    		 4016
    Figure DE112021002672T5_1831
    		 4223
    A7_attP_GA_50
    Figure DE112021002672T5_1832
    		 4008
    Figure DE112021002672T5_1833
    		 4224
    B8_attP_GA_50
    Figure DE112021002672T5_1834
    		 4016
    Figure DE112021002672T5_1835
    		 4225
    A7_attP_GA_40
    Figure DE112021002672T5_1836
    		 4008
    Figure DE112021002672T5_1837
    		 4226
    B8_attP_GA_40
    Figure DE112021002672T5_1838
    		 4016
    Figure DE112021002672T5_1839
    		 4227
    A7_attP_GA_30
    Figure DE112021002672T5_1840
    		 4008
    Figure DE112021002672T5_1841
    		 4228
    B8_attP_GA_30
    Figure DE112021002672T5_1842
    		 4016
    Figure DE112021002672T5_1843
    		 4229
    A277_b
    Figure DE112021002672T5_1844
    		 4018
    Figure DE112021002672T5_1845
    		 4230
    A277_c
    Figure DE112021002672T5_1846
    		 4018
    Figure DE112021002672T5_1847
    		 4231
    B358_b
    Figure DE112021002672T5_1848
    		 4019
    Figure DE112021002672T5_1849
    		 4232
    B358_c
    Figure DE112021002672T5_1850
    		 4019
    Figure DE112021002672T5_1851
    		 4233
    A7_attB_20
    Figure DE112021002672T5_1852
    		 4008
    Figure DE112021002672T5_1853
    		 4210
    B8_attB_20
    Figure DE112021002672T5_1854
    		 4016
    Figure DE112021002672T5_1855
    		 4211
    A277_c
    Figure DE112021002672T5_1856
    		 4018
    Figure DE112021002672T5_1857
    		 4231
    B358_c
    Figure DE112021002672T5_1858
    		 4019
    Figure DE112021002672T5_1859
    		 4233
    pU6-Sp- gRNA- IDS_DF_A1_a_attP_fwd.dna
    Figure DE112021002672T5_1860
    		 4020
    Figure DE112021002672T5_1861
    		 4234
    pU6-Sp- gRNA- IDS_DF_A1_a_attP_rev.dna
    Figure DE112021002672T5_1862
    		 4020
    Figure DE112021002672T5_1863
    		 4235
    pU6-Sp- gRNA- IDS_DF_A1_c_attP_fwd.dna
    Figure DE112021002672T5_1864
    		 4020
    Figure DE112021002672T5_1865
    		 4236
    pU6-Sp- gRNA- IDS_DF_A1_c_attP_rev.dna
    Figure DE112021002672T5_1866
    		 4020
    Figure DE112021002672T5_1867
    		 4237
    pU6-Sp- gRNA- IDS_DF_A4_b_attP_fwd.dna
    Figure DE112021002672T5_1868
    		 4021
    Figure DE112021002672T5_1869
    		 4238
    pU6-Sp- gRNA- IDS_DF_A4_b_attP_rev.dna
    Figure DE112021002672T5_1870
    		 4021
    Figure DE112021002672T5_1871
    		 4236
    pU6-Sp- gRNA- IDS_DF_B2_a_attP_fwd.dna
    Figure DE112021002672T5_1872
    		 4022
    Figure DE112021002672T5_1873
    		 4240
    pU6-Sp- gRNA- IDS_DF_B2 _a_attP_rev. dna
    Figure DE112021002672T5_1874
    		 4022
    Figure DE112021002672T5_1875
    		 4241
    pU6-SpgRNA- IDS_DF_B3_a_attP_fwd.dna
    Figure DE112021002672T5_1876
    		 4023
    Figure DE112021002672T5_1877
    		 4242
    pU6-Sp- gRNA- IDS_DF_B3_a_attP_rev.dna
    Figure DE112021002672T5_1878
    		 4023
    Figure DE112021002672T5_1879
    		 4243
    pU6-Sp- gRNA- IDS_DF_B4_b_attP_fwd. dna
    Figure DE112021002672T5_1880
    		 4024
    Figure DE112021002672T5_1881
    		 4244
    pU6-Sp- gRNA- IDS_DF_B4 _b_attP_rev.dna
    Figure DE112021002672T5_1882
    		 4024
    Figure DE112021002672T5_1883
    		 4245
    pU6-Sp- gRNA- IDS_DF_B7 _b_attP_fwd.dna
    Figure DE112021002672T5_1884
    		 4025
    Figure DE112021002672T5_1885
    		 4246
    pU6-Sp- gRNA- IDS_DF_B7_b_attP_rev.dna
    Figure DE112021002672T5_1886
    		 4025
    Figure DE112021002672T5_1887
    		 4247
    pU6-Sp- gRNA- IDS_DF_C2_c_attB_fwd.dna
    Figure DE112021002672T5_1888
    		 4026
    Figure DE112021002672T5_1889
    		 4248
    pU6-Sp- gRNA- IDS_DF_C2_c_attB_rev.dna
    Figure DE112021002672T5_1890
    		 4026
    Figure DE112021002672T5_1891
    		 4249
    pU6-Sp- gRNA- IDS_DF_D1_b_attB_fwd.dna
    Figure DE112021002672T5_1892
    		 4027
    Figure DE112021002672T5_1893
    		 4250
    pU6-Sp- gRNA- IDS_DF_D1_b_attB_rev.dna
    Figure DE112021002672T5_1894
    		 4027
    Figure DE112021002672T5_1895
    		 4251
    pU6-Sp- gRNA- IDS_DF_D2_c_attB_fwd.dna
    Figure DE112021002672T5_1896
    		 4028
    Figure DE112021002672T5_1897
    		 4252
    pU6-Sp- gRNA- IDS_DF_D2_c_attB_rev.dna
    Figure DE112021002672T5_1898
    		 4028
    Figure DE112021002672T5_1899
    		 4253
  • Alle Vektoren für Experimente mit Säugetierzellen wurden mit Plasmid Plus Midiprep- Kits (Qiagen) oder PureYield Plasmid Miniprep-Kits (Promega) oder QIAprep Spin Miniprep- Kits gereinigt.
  • Allgemeine Säugetierzellkulturbedingungen
  • HEK293T- (ATCC CRL-3216), U2OS- (ATTC HTB-96), K562- (CCL-243) und HeLa- (CCL-2) Zellen wurden von ATCC erworben und in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) plus GlutaMAX (ThermoFisher Scientific), McCoy's 5A-Medium (Gibco), RPMI-Medium-1640 plus GlutaMAX (Gibco) oder Eagle's Minimal Essential Medium (EMEM, ATCC) kultiviert und überführt, jeweils ergänzt mit 10 % (v/v) fötalem Rinderserum (Gibco, qualifiziert) und 1x Penicillin-Streptomycin (Corning). Alle Zelltypen wurden bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert, gepflegt und kultiviert. Die Zelllinien wurden von ihren jeweiligen Lieferanten authentifiziert und negativ auf Mykoplasmen getestet.
  • Transfektionsprotokoll für HEK293T-, HeLa- und Huh7-Gewebekulturen und genomische DNA-Präparation
  • Gezüchtete HEK293T-Zellen wurden auf mit Poly-D-Lysin beschichteten 48-Well- Platten (Corning) ausgesät. 16-24 Stunden nach der Aussaat wurden die Zellen bei ca. 60 % Konfluenz mit 1 µ1 Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher Scientific) gemäß den Herstellerprotokollen transfiziert und entweder mit: 750 ng PE2-Plasmid, 125 ng pegRNA 1 und 125 ng pegRNA 2 (für twinPE-Transfektionen); 750 ng PE2-Plasmid, 250 ng pegRNA- Plasmid und 83 ng sgRNA-Plasmid (für PE3-Transfektionen); oder 750 ng Cas9 und 125 ng sgRNA 1 und 125 ng sgRNA 2 (für gepaarte Cas9-Nuklease-Transfektionen). Sofern nicht anders angegeben, wurden die Zellen drei Tage nach der Transfektion kultiviert. Danach wurde das Medium entfernt, die Zellen wurden mit 1x PBS-Lösung (Thermo Fisher Scientific) gewaschen, und die genomische DNA wurde durch Zugabe von 150 µl frisch hergestelltem Lysepuffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,5; 0,05 % SDS; 25 µg/ml Proteinase K (Thermo Fisher Scientific)) direkt in jedes Well der Gewebekulturplatte extrahiert. Die genomische DNA- Mischung wurde 1 bis 2 Stunden bei 37 °C inkubiert, gefolgt von einer 30-minütigen Inaktivierung des Enzyms bei 80°C. Die für die Amplifikation genomischer Säugetierzell- DNA verwendeten Primer sind in Tabelle 13 aufgeführt. Tabelle 13. Sequenzen der in diesem Beispiel verwendeten Primer
    Primer Sequenz SEQ-ID- NR:
    HEK3_fwd
    Figure DE112021002672T5_1900
    		 3811
    HEK3_rev
    Figure DE112021002672T5_1901
    		 3812
    HEK3_fwd
    Figure DE112021002672T5_1902
    		 3811
    HEK3_rev
    Figure DE112021002672T5_1903
    		 3812
    DMD_UMI_fwd1
    Figure DE112021002672T5_1904
    		 4254
    DMD_UMI_fwd2
    Figure DE112021002672T5_1905
    		 4255
    DMD_rev0 TGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTggctacttttgttatttgcatt 4256
    AAVS1_AVA1713
    Figure DE112021002672T5_1906
    		 4257
    AAVS1_AVA1717
    Figure DE112021002672T5_1907
    		 4258
    AAVS1_AVA1651
    Figure DE112021002672T5_1908
    		 4259
    AAVS1_AVA1652
    Figure DE112021002672T5_1909
    		 4260
    AAVS1_AVA1653
    Figure DE112021002672T5_1910
    		 4261
    AAVS1_AVA1715
    Figure DE112021002672T5_1911
    		 4262
    AAVS1_AVA1655
    Figure DE112021002672T5_1912
    		 4263
    AAVS1_AVA1656
    Figure DE112021002672T5_1913
    		 4264
    AAVS1_AVA1707
    Figure DE112021002672T5_1914
    		 4265
    AAVS1_AVA1710
    Figure DE112021002672T5_1915
    		 4266
    CCR5_AVA1678
    Figure DE112021002672T5_1916
    		 4267
    CCR5_AVA1679
    Figure DE112021002672T5_1917
    		 4268
    CCR5_AVA1680
    Figure DE112021002672T5_1918
    		 4269
    CCR5_AVA1681
    Figure DE112021002672T5_1919
    		 4270
    CCR5_AVA1682
    Figure DE112021002672T5_1920
    		 4271
    CCR5_AVA1683
    Figure DE112021002672T5_1921
    		 4272
    IDS_AVA 1763
    Figure DE112021002672T5_1922
    		 4273
    IDS_AVA1764
    Figure DE112021002672T5_1923
    		 4274
    IDS_AVA1765
    Figure DE112021002672T5_1924
    		 4275
    IDS_AVA1766
    Figure DE112021002672T5_1925
    		 4276
    IDS_AVA1769
    Figure DE112021002672T5_1926
    		 4277
    IDS_AVA1770
    Figure DE112021002672T5_1927
    		 4278
    IDS_UMI_junc1_fwd
    Figure DE112021002672T5_1928
    		 4279
    IDS_junc2_fwd
    Figure DE112021002672T5_1929
    		 4280
    IDS_universal_rev
    Figure DE112021002672T5_1930
    		 4281
  • HeLa-Zellen wurden mit einer ähnlichen Dichte wie HEK293T-Zellen gezüchtet und ausgesät, und jedes Well der Zellen wurde mit 190 ng PE2_P2A_Blast (Blasticidin- Resistenzgen), 31,5 ng pegRNA1 und 31,5 ng pegRNA 2 (für twinPE-Transfektionen) mit 0,75 ul HeLa-Monsterreagenz (Mirus) transfiziert. Die Zellen wurden dann 24 Stunden nach der Transfektion mit 10 ug/ml für die Seletion behandelt. Die übrigen Schritte zur Gewinnung genomischer DNA sind mit denen von HEK293T-Zellen identisch. Huh7-Zellen wurden mit 150 k/Well auf mit Poly-D-Lysin beschichteten 24-Well-Platten (Corning) ausgesät. 16-24 Stunden nach der Aussaat wurden die Zellen bei hoher Konfluenz mit 2 µl Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher Scientific) gemäß den Herstellerprotokollen und bis zu 800 ng Plasmid-DNA transfiziert. Die Sammlung genomischer DNA erfolgte wie oben für HEK293T beschrieben.
  • Hochdurchsatz-DNA-Seguenzierung von genomischen DNA-Samples
  • Genomische Stellen von Interesse wurden aus genomischen DNA-Samples amplifiziert und auf einem Illumina MiSeq sequenziert, wie zuvor mit den folgenden Änderungen beschrieben. Kurz gesagt, Amplifikationsprimer, die Illumina-Vorwärts- und Rückwärtsadapter (Tabelle 13) enthalten, wurden für eine erste Runde der PCR (PCR 1) verwendet, die die genomische Region von Interesse amplifiziert. 25 µl PCR 1-Reaktionen wurden mit 0,5 µM von jedem Vorwärts- und Rückwärtsprimer, 1 µl genomischem DNA- Extrakt und 12,5 µl Phusion-U-Green-Multiplex-PCR-Master-Mix ausgeführt. Die PCR- Reaktionen wurden wie folgt durchgeführt: 98 °C für 2 min, dann 30 Zyklen [98 °C für 10 s, 61 °C für 20 s und 72 °C für 30 s], gefolgt von einer abschließenden 72 °C-Verlängerung für 2 min. Jedem Sample wurden in einer sekundären PCR-Reaktion (PCR 2) eindeutige Illumina- Barcoding-Primerpaare hinzugefügt. Konkret enthielten 25 µl einer gegebenen PCR 2- Reaktion 0,5 µM jedes eindeutigen Vorwärts- und Rückwärts-Illumina-Barcoding- Primerpaares, 1 µl der ungereinigten PCR 1-Reaktionsmischung und 12,5 µl des Phusion U Green Multiplex PCR 2x Master Mix. Die Barcoding-PCR-2-Reaktionen wurden wie folgt durchgeführt: 98 °C für 2 min, dann 12 Zyklen [98 °C für 10 s, 61 °C für 20 s und 72 °C für 30 s], gefolgt von einer abschließenden 72 °C-Verlängerung für 2 min. Die PCR-Produkte wurden analytisch durch Elektrophorese in einem 1,5%igen Agarosegel ausgewertet. PCR-2- Produkte (gepoolt nach gemeinsamen Amplicons) wurden durch Elektrophorese mit einem 1,5%igen Agarosegel unter Verwendung eines QIAquick-Gelextraktionskits (Qiagen) gereinigt und mit 40 µl Wasser eluiert. Die DNA-Konzentration wurde mittels fluorometrischer Quantifizierung (Qubit, ThermoFisher Scientific) oder qPCR (KAPA- Library-Quantification-Kit-Illumina, KAPA Biosystems) gemessen und auf einem Illumina MiSeq-Instrument gemäß den Herstellerprotokollen sequenziert.
  • Die Sequenzierungs-Reads wurden mit MiSeq-Reporter (Illumina) demultiplexiert. Das Alignment der Amplikon-Sequenzen auf eine Referenzsequenz wurde mit CRISPResso2 ausgeführt. Für die Quantifizierung des Prime-Editing-Gesamtertrags wurde die Prime- Editing-Effizienz wie folgt berechnet: % von [Anzahl der Reads mit dem gewünschten Edit, die keine Indels enthalten] ÷ [Anzahl der gesamten Reads]. Zur Quantifizierung des Punktmutations-Editings wurde CRISPResso2 im Standardmodus mit eingeschalteter Funktion „discard_indel_reads“ ausgeführt. Das Prime-Editing für den Einbau von Punktmutationen wurde dann explizit berechnet als: [Häufigkeit der spezifizierten Punktmutation in nicht verworfenen Reads] x [Anzahl der nicht verworfenen Reads] ÷ [Gesamt-Reads]. Für Quantifizierung des Editing wurde CRISPResso2 im HDR-Modus mit dem gewünschten Allel als erwartetem Allel (e-Flag) und mit eingeschaltetem „discard_indel_reads“ ausgeführt. Der Editing-Wirkungsgrad wurde wie folgt berechnet: [Anzahl der nicht verworfenen HDR-ausgerichteten Reads] ÷ [Gesamt-Reads]. Der Wirkungsgrad von Indel-Reads wurde berechnet als: [Anzahl der Indel-enthaltenden verworfenen Reads] ÷ [Gesamt-Reads]. Eindeutige molekulare Identifikatoren (UMIs) wurden zur Quantifizierung der Deletionseffizienz und zur Bewertung der PCR-Verzerrung in diesem dreistufigen PCR-Protokoll verwendet. Kurz gesagt wurde im ersten Schritt der linearen Amplifikation 1 ul genomischer DNA-Extrakt mit 0,1 uM eines einzelnen Vorwärts-UMI- Primers, der 15-bp- oder 16-bp-Unique Molecular Identifiers enthält, und 12,5 ul Phusion-U- Green-Multiplex-PCR-Master-Mix in einer 25-ul-Reaktion linear amplifiziert. Die PCR- Produkte wurden dann mit 1,6-fachen AmPure-Beads (Beckman Coulter) gereinigt und in 20 ul QIAGEN-Elutionspuffer eluiert. Im zweiten Schritt wurden dann 1 oder 2 ul linear amplifizierter PCR-Eluente für 30 Zyklen mit 0,5 uM jedes Vorwärts- und Rückwärtsprimers, Phusion-U-Green-Multiplex-PCR-Mix in einer 25-ul-Reaktion amplifiziert. In diesem Fall wird der Vorwärtsprimer an die P5 Illumina-Adaptor-Sequenz annealisiert, die sich an der 5' des UMI Primers und stromaufwärts von UMI befindet. Die PCR-Produkte wurden mit 1X Ampure-Beads gereinigt und in 25 ul Elutionspuffer eluiert. Im dritten Schritt wurde 1 ul Elutionspuffer für 12 Zyklen amplifiziert, wie oben erwähnt, um eine eindeutige Illumina- Barcodierung hinzuzufügen. Um die große Deletion am DMD-Locus zu beurteilen, wurden die obere Gruppe (uneditiertes großes Amplikon) und die untere Gruppe (editierte Amplikons mit Deletionen) separat aus der 1,5%igen Agarose herausgeschnitten und die endgültige Bibliothek (60 pM der oberen Gruppen gegenüber 20 pM der unteren Gruppen) wurde in zwei getrennte Miseq-Kits geladen, um ein schwaches Clustering von großen Amplikons (~1 kb) im Vergleich zu kurzen (~300 bp) zu vermeiden.
  • Rohe Sequenzierungs-Reads wurden mit AmpUMI UMI dedupliziert. Für Paired-End- Reads wurde SeqKit verwendet, um R1s mit dem umgekehrten Komplement von R2s zu verketten (ohne Überlappung zusammenzuführen). Die verketteten R1+R2s wurden mithilfe der UMI am 5'-Ende von R1 dedupliziert. UMI-deduplizierte R1s oder konkatenierte R1+R2s wurden mit CRISPResso2 analysiert. Für die Analyse konkatenierter R1+R2s wurde eine geeignete konkatenierte Referenz-Amplikon-Sequenz bereitgestellt, um Sequenzierungs- Alignment-Artefakte aufgrund der Konkatenation zu minimieren.
  • Nukleofektion von U2OS und K562
  • Die Nukleofektion wurde in allen Experimenten mit K562- und U2OS-Zellen ausgeführt. Pro Nukleofektion wurden 200.000 Zellen verwendet. Die gezählten Zellen wurden abgeschleudert und mit PBS gewaschen und dann in der Nukleofektionslösung gemäß der Empfehlung des Lonza SE Cell Line 4D-Nucleofector Kits resuspendiert. Nach der Nukleofektion der Zellen in der Vorrichtung wurden die Zellen in der Küvette bei Raumtemperatur 10 Minuten lang inkubiert. Der Inhalt der Küvette wurde in eine 48-Well- Platte überführt, die mit vorgewärmten Medien gefüllt war. Die genomische DNA wurde extrahiert und für die Illumina Miseq-Vorbereitung vorbereitet, wie oben beschrieben.
  • One-Pot-twinPE und BxbI-vermitteltes Fracht-Knock-in und große Inversion:
  • Für das One-Pot-vermittelte große Inversions-Experiment wurden eine sequenzielle Plasmid-Transfektion und eine One-Pot-mRNA-Nukleofektion ausgeführt. Bei der sequentiellen Plasmid-Transfektion wurden HEK293T-Zellen mit 750 ng PE2 und 62,5 ng jeder pegRNA (insgesamt vier) unter Verwendung von Lipofectamine 2000 wie oben beschrieben transfiziert. Nach drei Tagen wurden die Zellen trypsinisiert, in 24-Well-Platten ausplattiert und etwa sieben Tage lang weitergegeben. Anschließend wurden 20 k Zellen erneut ausgesät und mit 500 ng BxBI-Plasmid transfiziert. Die genomische DNA wurde extrahiert und für die Illumina Miseq-Vorbereitung vorbereitet, wie oben beschrieben. Bei dem One-Pot- mRNA-Nukleofektionsexperiment wurden 200.000 Zellen mit 1 ug PE2 mRNA, 30 pmol jeder synthetischen pegRNA (insgesamt 4 pegRNAs) und 750 ng BxBI mRNA nukleofiziert. Synthetische pegRNAs wurden bei IDT bestellt, und die mRNA-Transkripte wurden nach dem veröffentlichten Protokoll in vitro transkribiert. 20 ul einer Mischung aus Lonza-Puffer und Zellen wurden mit dem Programm CM-130 elektroporiert und mit 80 ul erwärmtem Medium fünf Minuten lang aufgefangen. 25 ul Samples aus der Küvette wurden dann in jedes Well der 48-Well-Platte gegeben und bei 37 °C 72 Stunden lang inkubiert.
  • SONSTIGE IN DIESER OFFENBARUNG ANGEGEBENE REFERENZEN
  • Die folgenden Referenzen sind hierin jeweils in ihrer Gesamtheit durch Bezugnahme aufgenommen.
    1. 1. Jinek, M. et al. A Programmable Dual-RNA-Guided DNA Endonuclease in Adaptive Bacterial Immunity. Science 337, 816-821 (2012).
    2. 2. Cong, L. et al. Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems. Science 339, 819-823 (2013).
    3. 3. Komor, A. C., Badran, A. H. & Liu, D. R. CRISPR-Based Technologies for the Manipulation of Eukaryotic Genomes. Cell 168, 20-36 (2017).
    4. 4. Komor, A. C., Kim, Y. B., Packer, M. S., Zuris, J. A. & Liu, D. R. Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature 533, 420-424 (2016).
    5. 5. Nishida, K. et al. Targeted nucleotide editing using hybrid prokaryotic and vertebrate adaptive immune systems. Science 353, aaf8729 (2016).
    6. 6. Gaudelli, N. M. et al. Programmable base editing of A·T to G·C in genomic DNA without DNA cleavage. Nature 551, 464-471 (2017).
    7. 7. ClinVar, July 2019.
    8. 8. Dunbar, C. E. et al. Gene therapy comes of age. Science 359, eaan4672 (2018).
    9. 9. Cox, D. B. T., Platt, R. J. & Zhang, F. Therapeutic genome editing: prospects and challenges. Nat. Med. 21, 121-131 (2015).
    10. 10. Adli, M. The CRISPR tool kit for genome editing and beyond. Nat. Commun. 9,1911 (2018).
    11. 11. Kleinstiver, B. P. et al. Engineered CRISPR-Cas9 nucleases with altered PAM specificities. Nature 523, 481-485 (2015).
    12. 12. Kleinstiver, B. P. et al. High-fidelity CRISPR-Cas9 nucleases with no detectable genomewide off-target effects. Nature 529,490-495 (2016).
    13. 13. Hu, J. H. et al. Evolved Cas9 variants with broad PAM compatibility and high DNA specificity. Nature 556, 57-63 (2018).
    14. 14. Nishimasu, H. et al. Engineered CRISPR-Cas9 nuclease with expanded targeting space. Science 361, 1259-1262 (2018).
    15. 15. Jasin, M. & Rothstein, R. Repair of strand breaks by homologous recombination. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 5, a012740 (2013).
    16. 16. Paquet, D. et al. Efficient introduction of specific homozygous and hetcrozygous mutations using CR1SPR/Cas9. Nature 533,125-129 (2016).
    17. 17. Kosicki, M., Tomberg, K. & Bradley, A. Repair of double-strand breaks induced by CRISPR-Cas9 leads to large deletions and complex reairangements. Nat. Biotechnol. 36, 765-771 (2018).
    18. 18. Haapaniemi, E., Botla, S., Persson, J., Schmierer, B. & Taipale, J. CRISPR-Cas9 genome editing induces a p53-mediated DNA damage response. Nat. Med. 24,927-930 (2018).
    19. 19. Ihry. R. J. et al. p53 inhibits CRISPR-Cas9 engineering in human pluripotent stem cells. Nat. Med. 24, 939-946 (2018).
    20. 20. Richardson, C. D., Ray, G. J., DeWitt, M. A., Curie, G. L. & Corn, J. E. Enhancing homology-directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetrie donor DNA. Nat. Biotechnol. 34,339-344 (2016).
    21. 21. Srivastava, M. et al. An Inhibitor of Nonhomologous End-Joining Abrogates Double-Strand Break Repair and Impedes Cancer Progression. Cell 151, 1474-1487 (2012).
    22. 22. Chu, V. T. et al. Incrcasing the efficiency of homology-directcd repair für CRISPR-Cas9- induced precise gene editing in mammalian cells. Nat. Biotechnol. 33, 543-548 (2015).
    23. 23. Maruyama, T. et al. Increasing the efficiency of precise genome editing with CRISPR-Cas9 by inhibition of nonhomologous end joining. Nat. Biotechnol. 33, 538-542 (2015).
    24. 24. Kim, Y. B. et al. Increasing the genome-targeting scope and precision of base editing with engineered Cas9-cytidine deaminase fusions. Nat. Biotechnol. 35, 371-376 (2017).
    25. 25. Li, X. et al. Base editing with a Cpfl-cytidine deaminase fusion. Nat. Biotechnol. 36, 324-327 (2018).
    26. 26. Gehrke, J. M. et al. An APOBEC3A-Cas9 base editor with minimized bystander and off- target activities. Nat. Biotechnol. (2018). doi:10.1038/nbt.4199
    27. 27. Rees, H. A. & Liu, D. R. Base editing: precision chemistry on the genome and transcriptome of living cells. Nat. Rev. Genet. 1 (2018). doi:10.1038/s41576-018-0059-1.
    28. 28. Ostertag, E. M. & Kazazian Jr, H. H. Biology of Mammalian Ll Retrotransposons. Annu. Rev. Genet. 35, 501-538 (2001).
    29. 29. Zimmerly, S., Guo, H., Perlman, P. S. & Lambowitz, A. M. Group II intron mobility occurs by target DNA- primed reverse transcription. Cell 82, 545-554 (1995).
    30. 30. Luan, D. D., Korman, M. H., Jakubczak, J. L. & Eickbush, T. H. Reverse transcription of R2Bm RNA is primed by a nick at the chromosomal target site: a mechanism for non-LTR retrotransposition. Cell 72, 595-605 (1993).
    31. 31. Feng, Q., Moran, J. V., Kazazian, H. H. & Boeke, J. D. Human Ll retrotransposon encodes a conscrvcd endonuclcase required for retrotransposition. Cell 87, 905-916 (1996).
    32. 32. Jinek, M. et al. Structures of Cas9 Endonucleases Reveal RNA-Mediated Conformational Activation. Science 343, 1247997 (2014).
    33. 33. Jiang, F. et al. Structures of a CRISPR-Cas9 R-loop complex primed for DNA cleavage. Science aa(18282 (2016). doi:10.1126/science.aad8282
    34. 34. Qi, L. S. et al. Repuiposing CRISPR as an RNA-Guided Platform für Sequence-Specific Control of Gene Expression. Cell 152, 1173-1183 (2013).
    35. 35. Tang, W., Hu, J. H. & Liu, D. R. Aptazyme-cmbcddcd guide RNAs enable ligandresponsive genome editing and transcriptional activation. Nat. Commun. 8, 15939 (2017).
    36. 36. Shechner, D. M., Hacisuleyman, E., Younger, S. T. & Rinn, J. L. Multiplexable, locusspecific targeting of long RNAs with CRISPR-Display. Nat. Methods 12, 664-670 (2015).
    37. 37. Anders, C. & Jinck, M. Chapter One - In vitro Enzymology of Cas9. in Methods in Enzymology (eds. Doudna, J. A. & Sontheimer, E. J.) 546,1-20 (Academic Press, 2014).
    38. 38. Briner, A. E. et al. Guide RNA Functional Modules Direct Cas9 Activity and Orthogonality. Mol. Cell 56, 333-339 (2014).
    39. 39. Nowalk-, C. M., Lawson, S., Zerez, M. & Bleris, L. Guide RNA engineering for versatile Cas9 functionality. Nucleic Acids Res. 44, 9555-9564 (2016).
    40. 40. Sternberg, S. H., Redding, S., Jinek, M., Greene, E. C. & Doudna, J. A. DNA interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9. Nature 507, 62-67 (2014).
    41. 41. Mohr, S. et al. Thermostabie group II intron reverse transcriptasc fusion proteins and their use in cDNA synthesis and next-generation RNA sequencing. RNA 19, 958-970 (2013).
    42. 42. Stamos, J. L., Lentzsch, A. M. & Lambowitz, A. M. Structure of a Thermostable Group II Intron Reverse Transcriptase with Template-Primer and Its Functional and Evolutionary Implications. Mol. Cell 68, 926- 939.e4 (2017).
    43. 43. Zhao, C. & Pyle, A. M. Crystal structures of a group II intron maturase reveal a missing link in spliceosome evolution. Nat. Struct. Mol. Biol. 23,558-565 (2016).
    44. 44. Zhao, C., Liu, F. & Pyle, A. M. An ultraprocessive, accurate reverse transcriptase encoded by a metazoan group II intron. RNA 24, 183-195 (2018).
    45. 45. Ran, F. A. et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat. Protoc. 8, 2281-2308 (2013).
    46. 46. Liu, Y., Kao, H.-I. & Bambara, R. A. Flap endonuclease 1: a central component of DNA metabolism. Annu. Rev. Biochem. 73,589-615 (2004).
    47. 47. Krokan, H. E. & Bjorås M. Base Excision Repair. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 5, (2013).
    48. 48. Kelman, Z. PCNA: structure, functions and interactions. Oncogene 14,629-640 (1997).
    49. 49. Choc, K. N. & Moldovan, G.-L. Forging Ahead through Darkness: PCNA, Still the Principal Conductor at the Replication Fork. Mol. Cell 65, 380-392 (2017).
    50. 50. Li, X., Li, J., Harrington, J., Lieber, M. R. & Burgers, P. M. Lagging strand DNA synthesis at the eukaryotic replication fork involves binding and stimulation of FEN-1 by proliferating cell nuclear antigen. J. Biol. Chem. 270,22109-22112 (1995).
    51. 51. Tom, S., Henricksen, L. A. & Bambara, R. A. Mechanism whereby proliferating cell nuclear antigen stimulates flap endonuclease 1. J. Biol. Chem. 275, 10498-10505 (2000).
    52. 52. Tanenbaum, M. E., Gilbert, L. A., Qi, L. S., Weissman, J. S. & Vale, R. D. A proteintagging system for signal amplification in gene expression and fluorescence imaging. Cell 159, 635- 646 (2014).
    53. 53. Bertrand, E. et al. Localization of ASH1 mRNA particles in living yeast. Mol. Cell 2, 437-445 (1998).
    54. 54. Dahlman, J. E. et al. Orthogonal gene knockout and activation with a catalytically active Cas9 nuclease. Nat. Biotechnol. 33, 1159-1161 (2015).
    55. 55. Tsai, S. Q. et al. GUIDE-seq enables genome-wide profiling of off-target cleavage by CRISPR-Cas nucleases. Nat. Biotechnol. 33, 187-197 (2015).
    56. 56. Tsai, S. Q. et al. CIRCLE-seq: a highly sensitive in vitro screen for genome-wide CRISPR- Cas9 nuclease off-targets. Nat. Methods 14, 607-614 (2017).
    57. 57. Schek N, Cooke C, Alwine JC. Molecular and Cellular Biology. (1992).
    58. 58. Gil A, Proudfoot NJ. Cell. (1987).
    59. 59. Zhao, B.S., Roundtree, I.A., He, C. Nat Rev Mol Cell Biol. (2017).
    60. 60. Rubio, M.A.T., Hopper, A.K. Wiley Interdiscip Rev RNA (2011).
    61. 61. Shechner, D.M., Hacisulcyman E., Youngcr, S.T., Rinn, J.L. Nat Methods. (2015).
    62. 62. Paige, J.S., Wu, K.Y., Jaffrey, S.R. Science (2011).
    63. 63. Ray D., ... Hughes TR. Nature (2013).
    64. 64. Chadalavada, D. M., Cerrone-Szakal, A. L., Bevilacqua. P.C. RNA (2007).
    65. 65. Forster AC, Symons RH. Cell. (1987).
    66. 66. Weinberg Z, Kim PB, Chen TH, Li S, Harns KA, Lünse CE, Breaker RR. Nat. Chem. Biol. (2015).
    67. 67. Feldstein PA, Buzayan JM. Bruening G. Gene (1989).
    68. 68. Saville BJ, Collins RA. Cell. (1990).
    69. 69. Winkler WC, Nahvi A, Roth A, Collins JA, Breaker RR. Nature (2004).
    70. 70. Roth A, Weinberg Z, Chen AG, Kim PG, Ames TD, Breaker RR. Nat Chem Biol. (2013).
    71. 71. Choudhury R, Tsai YS, Oominguez D, Wang Y, Wang Z. Nat Commun. (2012).
    72. 72. MacRae IJ. Doudna JA. Curr Opin Struct Biol. (2007).
    73. 73. Bernstein E, Caudy AA, Hammond SM, Hannon GJ Nature (2001).
    74. 74. Filippov V, Solovyev V, Filippova M, Gill SS. Gene (2000).
    75. 75. Cadwell RC and Joyce GF. PCR Methods Appl. (1992).
    76. 76. McInerney P, Adams P, and Hadi MZ. Mol Biol lnt. (2014).
    77. 77. Esvelt KM, Carlson JC, and Liu DR. Nature. (2011).
    78. 78. Naorem SS, Hin J, Wang S, Lee WR, Heng X, Miller JF, Guo H. Proc Natl Acad Sci USA (2017).
    79. 79. Martinez MA, Vartanian JP, Wain-Hobson S. Proc Natl Acad Sei USA (1994).
    80. 80. Meyer AJ, Ellefson JW, Ellington AD. Curr Protoc Mol Biol. (2014).
    81. 81. Wang HH, Isaacs FJ, Carr PA, Sun ZZ, Xu G, Forest CR, Church GM. Nature. (2009).
    82. 82. Nyerges Ä et al. Proc Natl Acad Sci USA. (2016).
    83. 83. Mascola JR, Haynes BF. Immunol Rev. (2013).
    84. 84. X. Wen, K. Wen, D. Cao. G. Li, R. W. Jones, J. Li, S. Szu, Y. Hoshino, L. Yuan, Inclusion of a universal tetanus toxoid CD4(+) T cell epitope P2 significantly cnhanced the immunogenicity of recombinant rotavirus ΔVP8* subunit parenteral vaccines. Vaccine 32, 4420-4427 (2014).
    85. 85. G. Ada, D. Isaacs, Carbohydrate-protein conjugate vaccines. Clin Microbiol Infect 9, 79-$5 (2003).
    86. 86. E. Malito, B. Bursulaya, C. Chen, P. L. Surdo, M. Picchianti, E. Balducci, M. Biancucci, A. Brock, F. Berti, M. J. Bottomley, M. Nissum, P. Costantino, R. Rappuoli, G. Spraggon, Structural basis for lack of toxicity of the diphtheria toxin mutant CRM 197. Proceedings of the National Academy of Sciences 109,5229 (2012).
    87. 87. J. de Wit, M. E. Emmelot, M. C. M. Poelen, J. Lanfermeijer, W. G. H. Han, C. van Els, P. Kaaijk, The Human CD4(+) T Cell Response against Mumps Virus Targets a Broadly Recognized Nucleoprotein Epitope. J Virol 93, (2019).
    88. 88. M. May, C. A. Rieder, R. J. Rowe, Emergent lineages of mumps virus suggest the need für a polyvalent vaccine. Int J Infect Dis 66, 1-4 (2018).
    89. 89. M. Ramamurthy, P. Rajendiran, N. Saravanan, S. Sankar, S. Gopalan, B. Nandagopal, Identification of immunogenic β-cell epitope peptides of rubella virus El glycoprotein towards development of highly specific immunoassays and/or vaccine. Conference Abstract, (2019).
    90. 90. U. S. F. Tambunan, F. R. P. Sipahutar, A. A. Parikesit, D. Kerami, Vaccine Design for H5N1 Based on B- and T-cell Epitope Predictions. Bioinform Biol Insights 10, 27-35 (2016).
    91. 91. Asante, EA. et. al. „A naturally occurring variant of the human prion protein completely prevents prion disease“. Nature. (2015).
    92. 92. Crabtree, G. R. & Schreiber, S. L. Three-part inventions: intracellular signaling and induced proximity. Trends Biochem. Sci. 21, 418-22 (1996).
    93. 93. Liu, J. et al. Calcineurin Is a Common Target of A and FKBP-FK506 Complexes. Cell 66, 807-815 (1991).
    94. 94. Keith, C. T. et al. A mammalian protein targeted by G I -arresting rapamycin-receptor complex. Nature 369, 756-758 (2003).
    95. 95. Spencer, D. M., Wandless, T. J., Schreiber, S. L. S. & Crabtree, G. R. Controlling signal transduction with synthetic ligands. Science 262, 1019-24 (1993).
    96. 96. Pruschy, M. N. et al. Mechanistic studies of a signaling pathway activated by the organic dimerizer FK10:12. Chem. Biol. 1, 163-172 (1994).
    97. 97. Spencer, D. M. et al. Functional analysis of Fas signaling in vivo using synthetic inducers of dimerization. Curr. Biol. 6, 839-847 (1996).
    98. 98. Belshaw, P. J., Spencer, D. M., Crabtree, G. R. & Schreiber, S. L. Controlling programmed cell death with a cyclophilin-cyclosporin-based chemical inducer of dimerization. Chem. Biol. 3,731-738 (1996).
    99. 99. Yang, J. X., Symes, K., Mercola, M. & Schreiber, S. L. Small-molecule control of insulin and PDGF receptor signaling and the role of membrane attachment. Curr. Biol. 8, 11-18 (1998).
    100. 100. Belshaw, P. J., Ho, S. N., Crabtree, G. R. & Schreiber, S. L. Controlling protein association and subcellular localization with a synthetic ligand that induces heterodimerization of proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. 93,4604-4607 (2002).
    101. 101. Stockwell, B. R. & Schreiber, S. L. Probing the role of homc>meric and heteromeric receptor interactions in TGF-β signaling using small molecule dimenzers. Curr. Biol. 8, 761-773 (2004).
    102. 102. Spencer, D. M., Graef, I., Austin, D. J., Schreiber, S. L. & Crabtree, G. R. A general strategy for producing conditional alleles of Src-like tyrosine kinases. Proc. Natl. Acad. Sei. 92, 9805- 9809 (2006).
    103. 103. Holsinger, L. J., Spencer, D. M., Austin, D. J., Schreiber, S. L. & Crabtree, G. R. Signal transduction in T lymphocytes using a conditional allele of Sos. Proc. Natl. Acad. Sei. 92, 9810-9814 (2006).
    104. 104. Myers, M. G. Insulin Signal Transduction and the 1RS Proteins. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 36,615-658 (1996).
    105. 105. Watowich, S. S. The erythropoietin receptor: Molecular structure and hematopoietic signaling pathways. J. Investig. Med. 59, 1067-1072 (2011).
    106. 106. Blau, C. A., Peterson, K. R., Drachman, J. G. & Spencer, D. M. A proliferation switch for genetically modified cells. Proc. Natl. Acad. Sci. 94, 3076-3081 (2002).
    107. 107. Clackson, T. et al. Redesigning an FKBP-ligand interface to generate chemical dimerizers with novel specificity. Proc. Natl. Acad. Sci. 95, 10437-10442 (1998).
    108. 108. Diver, S. T. & Schreiber, S. L. Single-step synthesis of cell-permeable protein dimerizers that activate signal transduction and gene expression. J. Am. Chem. Soc. 119, 5106-5109 (1997).
    109. 109. Guo, Z. F., Zhang, R. & Liang, F. Sen. Facile functionalixation of FK506 for biological studies by the thiol-ene ‚click‘ reaction. RSC Adv. 4, 11400-11403 (2014).
    110. 110. Robinson, D. R., Wu, Y.-M. & Lin, S.-F. The protein tyrosine kinase family of the human genome. Oncogene 19, 5548-5557 (2000).
    111. 111. Landrum, M. J. et al. ClinVar: public archive of interpretations of clinically relevant variants. Nucleic Acids Res. 44, D862-D868 (2016).
    112. 112. Jinck, M. et al. A Programmable Dual-RNA-Guided DNA Endonuclease in Adaptive Bacterial Immunity. Science 337, 816-821 (2012).
    113. 113. Cong, L. et al. Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems. Science 339, 819-823 (2013).
    114. 114. Mali, P. et al. RNA-Guided Human Genome Engineering via Cas9. Science 339, 823- 826 (2013).
    115. 115. Yang, H. et al. One-Step Generation of Mice Carrying Reporter and Conditional Alleles by CRISPR/Cas-Mediated Genome Engineering. Cell 154, 1370-1379 (2013).
    116. 116. Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J. & Kim, J.-S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Res. 24, 1012-1019 (2014).
    117. 117. Orlando, S. J. et al. Zinc-finger nuclease-driven targeted integration into mammalian genomes using donors with limited chromosomal homology. Nucleic Acids Res. 38, e152-e152 (2010).
    118. 118. Tsai, S. Q. et al. GUlDE-seq enables genome-wide profiling of off-target cleavage by CRISPR-Cas nucleases. Nat. Biotechnol. 33, 187-197 (2015).
    119. 119. Suzuki, K. et al. In vivo genome editing via CRISPR/Cas9 mediated homology- independent targeted integration. Nature 540, 144-149 (2016).
    120. 120. Kosicki, M., Tomberg, K. & Bradley, A. Repair of double-strand breaks induced by CRISPR- Cas9 leads to large deletions and complex rearrangements. Nat. Biotechnol. 36, 765-771 (2018).
    121. 121. Haapanicmi, E., Botla, S., Persson, J., Schmierer, B. & Taipale, J. CRISPR-Cas9 genome editing induces a p53-mediated DNA damage response. Nat. Med. 24, 927-930 (2018).
    122. 122. Ihry, R. J. et al. p53 inhibits CRISPR-Cas9 engineering in human pluripotent stem cells. Nat. Med. 24, 939-94fi (2018).
    123. 123. Chapman, J. R., Taylor, M. R. G. & Boulton, S. J. Playing die end game: DNA double- strand break repair pathway choice. Mol. Cell 47, 497-510 (2012).
    124. 124. Cox, D. B. T., Platt, R. J. & Zhang, F. Therapeutic genome editing: prospects and challenges. Nat. Med. 21, 121-131 (2015).
    125. 125. Paquet, D. et al. Efficient introduction of specific homozygous and heterozygous mutations using CRISPR/Cas9. Nature 533,125-129 (2016).
    126. 126. Chu, V. T. et al. Increasing the efficiency of homology-directed repair for CRISPR-Cas9- induccd precise gene editing in mammalian cells. Nat. Biotechnol. 33, 543-548 (2015).
    127. 127. Maruyama, T. et al. Increasing the efficiency of precise genome editing with CRISPR- Cas9 by inhibition of nonhomologous end joining. Nat. Biotechnol. 33, 538-542 (2015).
    128. 128. Rees, H. A., Yeh, W.-H. & Liu, D. R. Development of hRad5l-Cas9 nickase fusions that mediale HDR without double-stranded breaks. Nat. Commun. 10, 1-12 (2019).
    129. 129. Komor, A. C., Kim, Y. B., Packer, M. S., Zuris, J. A. & Liu, D. R. Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature 533, 420- 424 (2016).
    130. 130. Gaudelli, N. M. et al. Programmable base editing of A·T to G·C in genomic DNA without DNA cleavage. Nature 551, 464-471 (2017).
    131. 131. Gao, X. et al. Treatment of autosomal dominant hearing loss by in vivo delivery of genome editing agents. Nature 553, 217-221 (2018).
    132. 132. Ingram, V. M. A specific chemical difference between the globins of normal human and sickle-cell anaemia haemoglobin. Nature 178, 792-794 (1956).
    133. 133. Myerowitz, R. & Costigan, F. C. The major defect in Ashkenazi Jews with Tay-Sachs disease is an insertion in the gene for the alpha-chain of beta-hexosaminidase. J. Biol. Chem. 263, 18587-18589 (1988).
    134. 134. Zielenski, J. Genotype and Phenotype in Cystic Fibrosis. Respiration 67, 1 17-133 (2000).
    135. 135. Mead, S. et al. A Novel Protective Prion Protein Variant that Colocalizes with Kuru Exposure. N. Engt. J. Med. 361, 2056-2065 (2009).
    136. 136. Manaffini, L. A. & Sontheimer, E. J. CRISPR interference limits horizontal gene transfer in staphylococci by targeting DNA. Science 322, 1843-1845 (2008).
    137. 137. Barrangou, R. et al. CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes. Science 315, 1709-1712 (2007).
    138. 138. Jiang, F. & Doudna, J. A. CRISPR-Cas9 Structures and Mechanisms. Annu. Rev. Biophys. 46, 505-529 (2017).
    139. 139. Hille, F. et al. The Biology of CRISPR-Cas: Backward and Forward. Cell 172, 1239-1259 (2018).
    140. 140. Luan, D. D., Korman, M. H., Jakubczak, J. L. & Eickbush, T. H. Reverse transcription of R2Bm RNA is primed by a nick at the chromosomal target site: a mechanism for non- LTR retrotransposition. Cell 72, 595-605 (1993).
    141. 141. Liu, Y., Kao, H.-I. & Bambara, R. A. Flap endonuclease 1: a central component of DNA metabolism. Annu. Rev. Biochem. 73, 589-615 (2004).
    142. 142. Rees, H. A. & Liu, D. R. Base editing: precision chemistry on the genome and transcriptome of living cells. Nat. Rev. Genet. 19, 770 (2018).
    143. 143. Richardson, C. D., Ray, G. J., DeWitt, M. A., Curie, G. L. & Corn, J. E. Enhancing homology- directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmeuric donor DNA. Nat. Biotechnol. 34, 339-344 (2016).
    144. 144. Qi, L. S. et al. Repurposing CRISPR as an RNA-Guided Platform for Sequence-Specific Control of Gene Expression. Cell 152, 1173-1 183 (2013).
    145. 145. Shechner, D. M., Hacisulcyman, E., Younger, S. T. & Rinn, J. L. Multiplexable, locusspecific targeting of long RNAs with CRISPR-Display. Nat. Methods 12,664-670 (2015).
    146. 146. Tang, W., Hu, J. H. & Liu, D. R. Aptazyme-embedded guide RNAs enable ligand- responsive genome editing and transcriptional activation. Nat. Commun. 8, 15939 (2017).
    147. 147. Jinek, M. et al. Structures of Cas9 Endonucleases Reveal RNA-Mediated Conformational Activation. Science 343, 1247997 (2014).
    148. 148. Nishimasu, H. et al. Crystal Structure of Cas9 in Complex with Guide RNA and Target DNA. Cell 156, 935-949 (2014).
    149. 149. Jiang, F., Zhou, K., Ma, L., Gressel, S. & Doudna, J. A. A Cas9-guide RNA complex preorganized for target DNA recognition. Science 348, 1477-1481 (2015).
    150. 150. Baranauskas, A. et al. Generation and characterization of new highly thermostable and processive M-MuLV reverse transcriptase variants. Protein Eng. Des. Sei. 25, 657-668 (2012).
    151. 151. Gerard, G. F. et al. The role of template-primer in protection of reverse transcriptase from thermal inactivation. Nucleic Acids Res. 30, 3118-3129 (2002).
    152. 152. Arezi, B. & Hogrefe, H. Novel mutations in Moloney Murine Leukemia Virus reverse transcriptase increase thermostability through tighter binding to template-primer. Nucleic Acids Res. 37,473-481 (2009).
    153. 153. Kotewicz, M. L., Sampson, C. M., D'Alessio, J. M. & Gerard, G. F. Isolation of cloned Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase lacking ribonuclease H activity. Nucleic Acids Res. 16, 265-277 (1988).
    154. 154. Shen, M. W. et al. Predictable and precise template-free CRISPR editing of pathogenic variants. Nature 563, 646-651 (2018).
    155. 155. Thuronyi, B. W. et al. Continuous evolution of base editors with expanded target compatibility and improved activity. Nat. Biotechnol. (2019). doi:10.1038/s41587-019- 0193-0
    156. 156. Kim, Y. B. et al. Increasing the genome-targeting scope and precision of base editing with engineered Cas9-cytidine deaminase fusions. Nat. Biotechnol. 35, 371-376 (2017).
    157. 157. Koblan, L. W. et al. Improving cytidine and adenine base editors by expression optimization and ancestral reconstruction. Nat. Biotechnol. (2018). doi:10.1038/nbt.4172
    158. 158. Komor, A. C. et al. Improved base excision repair inhibition and bacteriophage Mu Gam protein yietds C:G-to-T:A base editors with higher efficiency and product purity. Sei. Adv. 3. eaao4774 (2017).
    159. 159. Kleinstiver, B. P. et al. High-fidelity CRISPR-Cas9 nucleases with no detectable genome- wide off-target effects. Nature 529, 490-495 (2016).
    160. 160. Zuo, E. et al. Cytosine base editor generates substantial off-target single-nucleotide variants in mouse embryos. Science 364, 289-292 (2019).
    161. 161. Jin, S. et al. Cytosine, but not adenine, base editors induce genome-wide off-target mutations in rice. Science 364, 292-295 (2019).
    162. 162. Kim, D., Kim, D., Lee, G., Cho, S.-I. & Kim, J.-S. Genome-wide target specificity of CRISPR RNA-guided adenine base editors. Nat. Biotechnol. 37, 430-435 (2019).
    163. 163. Grünewald, J. et al. Transcriptome-wide off-target RNA editing induced by CRISPR- guided DNA base editors. Nature 569, 433-437 (2019).
    164. 164. Zhou, C. et al. Off-target RNA mutation induced by DNA base editing and its elimination by mutagenesis. Nature 571, 275-278 (2019).
    165. 165. Rees, H. A., Wilson, C., Doman, J. L. & Liu, D. R. Analysis and minimization of cellular RNA editing by DNA adenine base editors. Sei. Adv. 5, eaax5717 (2019).
    166. 166. Ostertag, E. M. & Kazazian Jr, H. H. Biology of Mammalian L1 Retrotransposons. Annu. Rev. Genet. 35, 501-538 (2001).
    167. 167. Griffiths, D. J. Endogenous retroviruses in the human genome sequence, Genome Biol. 2, REVIEWS1017 (2001).
    168. 168. Berkhout, S., Jebbink, M. & Zsiros, J. Identification of an Active Reverse Transcriptase Enzyme Encoded by a Human Endogenous HERV-K Retrovirus. J. Virol. 73, 2365-2375 (1999).
    169. 169. Halvas, E. K., Svarovskaia, E. S. & Pathak, V. K. Role of Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase Deoxyribonucleoside Triphosphate-Binding Site in Retroviral Replication and In Vivo Fidelity. J. Virol. 74, 10349-10358 (2000).
    170. 170. Dever, D. P. et al. CRISPR/Cas9 Beta-globin Gene Targeting in Human Hematopoietic Stern Cells. Nature 539, 384-389 (2016).
    171. 171. Park, S. H. et al. Highly efficient editing of the β-globin gene in patient-derived hematopoietic stem and progenitor cells to treat sickle cell disease. Nucleic Acids Res. doi:10.1093/nar/gkz475
    172. 172. Collinge, J. Prion diseases of humans and animals: their causes and molecular basis. Annu. Rev. Neurosci. 24, 519-550 (2001).
    173. 173. Asante, E. A. et al. A naturally occurring variant of the human prion protein completely prevents prion disease. Nature 522, 478-481 (2015).
    174. 174. Anzalone, A. V., Lin, A. J., Zairis, S., Rabadan, R. & Cornish, V. W. Reprogramming eukaryotic translation with ligand-responsive synthetic RNA switches. Nat. Methods 13, 453- 458 (2016).
    175. 175. Badran, A. H. et al. Continuous evolution of Bacillus thuringiensis toxins overcomes insect resistance. Nature 533, 58-63 (2016).
    176. 176. Anders, C. & Jinek, M. Chapter One - In Vitro Enzymology of Cas9. in Methods in Enzymology (eds. Doudna, J. A. & Sontheimer, E. J.) 546, 1-20 (Academic Press, 2014).
    177. 177. Pirakitikulr, N., Ostrov, N., Perulta-Yahya, P. & Cornish, V. W. PCRIess library mutagenesis via oligonucleotide recombination in yeast. Protein Sei. Publ. Protein Soc. 19, 2336-2346 (2010).
    178. 178. Clement, K. et al. CRISPResso2 provides accurate and rapid genome editing sequence analysis. Nat. Biotechnol. 37, 224-226 (2019).
    179. 179. Tsai, S. Q. et al. GUIDE-seq enables genome-wide proftling of off-target cleavage by CRISPR-Cas nucleases. Nat. Biotechnol. 33, 187-197 (2015).
    180. 180. Kleinstiver, B. P. et al. High-fidelity CRISPR-Cas9 nucleases with no detectable genome- wide off- target effects. Nature 529, 490-495 (2016).
    181. 181. Koblan, L. W. et al. Improving cytidine and adenine base editors by expression optimization and ancestral reconstruction. Nat. Biotechnol. (2018). doi: 10.1038/nbt.4172
    182. 182. Baranauskas, A. et al. Generation and characterization of new highly thermostable and processive M-MuLV reverse transcriptase variants. Protein Eng. Des. Sei. 25, 657-668 (2012).
    183. 183. Schechner, DM, Hacisuleyman E.. Younger ST, Rinn JL. Nat Methods 664-70 (2015).
    184. 184. Brown JA, et al. Nat Struct Mol Biol 633-40 (2014).
    185. 185. Conrad NA and Steitz JA. EMBO J 1831-41 (2005).
    186. 186. Bartlett JS, et al. Proc Natl Acad Sei USA 8852-7 (1996).
    187. 187. Mitton-Fry RM, DeGregorio SJ, Wang J, Steitz TA, Steitz JA. Science 1244-7 (2010).
    188. 188. Forster AC, Symons RH. Cell. 1987.
    189. 189. Weinberg Z, Kim PB, Chen TH, Li S, Harris KA, Lünse CE, Breaker RR. Nat. Chem. Biol. 2015.
    190. 190. Feldstein PA, Buzayan JM, Bruening G. Gene 1989.
    191. 191. Saville BJ, Collins RA. Cell. 1990.
    192. 192. Roth A, Weinberg Z, Chen AG. Kim PG, Ames TD, Breaker RR. Nat Chem Biol. 2013.
    193. 193. Borchardt EK, et al. RNA 1921-30 (2015).
    194. 194. Zhang Y, et al. Mol Cell 792-806 (2013).
    195. 195. Dang Y, et al. Genome Biol 280 (2015).
    196. 196. Schaefer M, Kapoor U, and Jantsch MF. Open Biol 170077 (2017).
    197. 197. Nahar S, et al. Chem Comm 2377-80 (2018).
    198. 198. Gao Y and Zhao Y. J Integr Plant Biol 343-9 (2014).
    199. 199. Dubois N, Marquet R, Paillart J, Bemacchi S. Front Microbiol 527 (2018).
    200. 200. Costa M and Michel F. EMBO J 1276-85 (1995).
    201. 201. Hu JH, et al. Nature 57-63 (2018).
    202. 202. Furukawa K, Gu H, Breaker RR. Methods Mol Biol. 209-20 (2014).
    203. 203. Zettler, J., Schütz, V. & Mootz, H. D. The naturally split Npu DnaE intein exhibits an extraordinarily high rate in the protein trans-splicing reaction. FEBS Lett. 583, 909-914 (2009).
    204. 204. Kügler, S., Kilic, E. & Bähr, M. Human synapsin 1 gene promoter confers highly neuronspecific long-term transgene expression from an adenoviral vector in the adult rat brain depending on the transduced area. Gene Ther. 10, 337-347 (2003).
    205. 205. de Felipe, P., Hughes, L. E., Ryan, M. D. & Brown, J. D. Co-translational, intraribosoinat cleavage of polypeptides by the foot-and-mouth disease virus 2A peptide. J. Biol. Chem. 278, 11441-11448 (2003).
    206. 206. Levy, J. M. & Nicoll, R. A. Membrane-associated guanylate kinase dynamics reveat regional and developmental specificity of synapse stability. J. Physiol. 595, 1699-1709 (2017).
    207. 207. Li, B. & Dewey, C. N. RSEM: accurate transcript quantification from RNA-Seq data with or without a reference genome. BMC Bioinformatics 12, 323 (2011).
    208. 208. Ritchie, M. E. et al. limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies. Nucleic Acids Res. 43, e47-e47 (2015).
  • ÄQUIVALENTE UND UMFANG
  • In den Artikeln können „ein“/„eine“/„einer“ und „der“/„die“/„das“ eines oder mehrere bedeuten, sofern nicht das Gegenteil angegeben oder anderweitig aus dem Kontext ersichtlich ist. Ausführungsformen oder Beschreibungen, die ein „oder“ zwischen einem oder mehreren Mitgliedern einer Gruppe beinhalten, gelten als erfüllt, wenn ein, mehr als ein oder alle Mitglieder der Gruppe in einem bestimmten Produkt oder Verfahren vorhanden sind, darin verwendet werden oder anderweitig für dieses relevant sind, sofern nicht das Gegenteil angegeben oder anderweitig aus dem Zusammenhang ersichtlich ist. Die Erfindung beinhaltet Ausführungsformen, bei denen genau ein Mitglied der Gruppe in einem bestimmten Produkt oder Verfahren vorhanden ist, verwendet wird oder anderweitig für dieses relevant ist. Die Erfindung beinhaltet Ausführungsformen, bei denen mehr als ein oder alle Mitglieder der Gruppe in einem bestimmten Produkt oder Verfahren vorhanden sind, darin verwendet werden oder anderweitig für dieses relevant sind.
  • Ferner umfasst die Offenbarung alle Variationen, Kombinationen und Permutationen, bei denen eine oder mehrere Beschränkungen, Elemente, Klauseln und beschreibende Begriffe aus einem oder mehreren der aufgeführten Ansprüche in einen anderen Anspruch aufgenommen werden. Zum Beispiel kann jeder Anspruch, der von einem anderen Anspruch abhängt, modifiziert werden, um eine oder mehrere Beschränkungen zu beinhalten, die in einem anderen Anspruch enthalten sind, der von demselben Grundaanspruch abhängt. Werden Elemente in Form von Listen dargestellt, z. B. in Form von Markush-Gruppen, so wird jede Untergruppe der Elemente ebenfalls offenbart, und jedes Element kann aus der Gruppe entfernt werden. Es versteht sich, dass im Allgemeinen, wenn die Erfindung oder Aspekte der Erfindung als bestimmte Elemente und/oder Merkmale umfassend bezeichnet wird/werden, bestimmte Ausführungsformen der Offenbarung oder Aspekte der Offenbarung aus solchen Elementen und/oder Merkmalen bestehen oder im Wesentlichen daraus bestehen. Der Einfachheit halber wurden diese Ausführungsformen hierin nicht spezifisch in diesen Worten dargestellt. Es wird auch darauf hingewiesen, dass die Begriffe „umfassend“ und „enthaltend“ offen zu verstehen sind und die Aufnahme zusätzlicher Elemente oder Schritte erlauben. Wo Bereiche angegeben sind, sind Endpunkte beinhaltet. Darüber hinaus können Werte, die als Bereiche ausgedrückt sind, jeden beliebigen spezifischen Wert oder Teilbereich innerhalb der angegebenen Bereiche in verschiedenen Ausführungsformen der Erfindung annehmen, und zwar bis zum Zehntel der Einheit der unteren Grenze des Bereichs, sofern der Kontext nicht eindeutig etwas anderes vorschreibt, oder sich aus dem Kontext und dem Verständnis eines Fachmanns ergibt.
  • Diese Anmeldung bezieht sich auf verschiedene erteilte Patente, veröffentlichte Patentanmeldungen, Fachzeitschriftenartikel und andere Veröffentlichungen, die alle hierin durch Bezugnahme aufgenommen sind. Im Falle eines Widerspruchs zwischen einer der enthaltenen Referenzen und der vorliegenden Spezifikation ist die Spezifikation maßgebend. Darüber hinaus kann jede bestimmte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, die zum Stand der Technik gehört, ausdrücklich von einer oder mehreren Ausführungsformen ausgeschlossen werden. Da solche Ausführungsformen als dem Fachmann bekannt vorausgesetzt werden, können sie ausgeschlossen sein, auch wenn der Ausschluss hierin nicht ausdrücklich dargelegt ist. Jede bestimmte Ausführungsform der Erfindung kann aus jedem beliebigen Grund ausgeschlossen werden, unabhängig davon, ob dies mit dem Stand der Technik zusammenhängt oder nicht.
  • Der Fachmann wird viele Äquivalente zu den hierin beschriebenen Ausführungsformen erkennen oder in der Lage sein, sie durch einfaches Experimentieren festzustellen. Der Umfang der hierin beschriebenen Ausführungsformen ist nicht auf die obige Beschreibung beschränkt, sondern entspricht vielmehr den Sätzen in den beigefügten Ausführungsformen. Dem Fachmann erschließt sich, dass verschiedene Änderungen und Modifikationen an dieser Beschreibung vorgenommen werden können, ohne vom Geist oder Umfang der vorliegenden Erfindung, wie sie in den folgenden Ausführungsformen definiert ist, abzuweichen.
  • ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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  • Zitierte Patentliteratur
    • US 63022397 B [0002]
    • US 63116785 B [0002]
    • US 62820813 B [0003]
    • US 62858958 B [0003]
    • US 62889996 B [0003]
    • US 62922654 B [0003]
    • US 62913553 B [0003]
    • US 62973558 B [0003]
    • US 62931195 B [0003]
    • US 62944231 B [0003]
    • US 62974537 B [0003]
    • US 62991069 B [0003]
    • US 63100548 B [0003]
    • US 5496714 A [0128]
    • US 5834247 A [0128]
    • EP 2000011690 A [0141, 0445]
    • WO 2001038547 A [0141]
    • US 5244797 A [0176]
    • WO 2010028347 A [0179, 0303, 0369]
    • WO 2012088381 A [0179, 0303, 0369]
    • US 9023594 B [0179, 0303, 0369]
    • WO 2015134121 A [0179, 0303, 0369]
    • WO 2016168631 A [0179, 0303, 0369]
    • WO 2013045632 A [0193, 0319, 0475]
    • WO 2014055782 A [0193, 0319, 0475]
    • WO 2016069774 A [0193, 0319, 0475]
    • EP 2877490 A [0193, 0319, 0475]
    • US 12965590 B [0336]
    • US 13426991 B [0336]
    • US 8450471 B [0336]
    • US 13427040 B [0336]
    • US 8440431 B [0336]
    • US 13427137 B [0336]
    • US 8440432 B [0336]
    • US 13738381 B [0336]
    • WO 2015027134 A [0336]
    • US 9181535 B [0336]
    • US 5436149 A [0339]
    • US 4889818 A [0339]
    • US 4965185 A [0339]
    • US 5079352 A [0339]
    • US 5614365 A [0339]
    • US 5374553 A [0339]
    • US 5270179 A [0339]
    • US 5047342 A [0339]
    • US 5512462 A [0339]
    • WO 9206188 A [0339]
    • WO 9206200 A [0339]
    • WO 9610640 A [0339]
    • US 5677152 A [0351]
    • US 6479264 B [0351]
    • US 6183998 B [0351]
    • US 4663290 A [0355]
    • US 20110059502 A [0489]
    • US 61836080 B [0520]
    • KR 710351 [0586]
    • US 5049386 A [0611, 0662, 0847]
    • US 4946787 A [0611, 0612, 0662, 0663, 0847, 0848]
    • US 4897355 A [0611, 0662, 0847]
    • WO 9117424 A [0611, 0662, 0847]
    • WO 9116024 A [0611, 0662, 0847]
    • US 4186183 A [0612, 0663, 0848]
    • US 4217344 A [0612, 0663, 0848]
    • US 4235871 A [0612, 0663, 0848]
    • US 4261975 A [0612, 0663, 0848]
    • US 4485054 A [0612, 0663, 0848]
    • US 4501728 A [0612, 0663, 0848]
    • US 4774085 A [0612, 0663, 0848]
    • US 4837028 A [0612, 0663, 0848]
    • US 4797368 A [0614]
    • WO 9324641 A [0614]
    • US 5173414 A [0614]
    • US 20030087817 A [0615, 0850]
    • US 20120322861 A [0619]
    • US 2014028330 A [0669]
    • US 8822663 B2 [0669]
    • ES 2740248 T3 [0669]
    • EP 2755693 A4 [0669]
    • EP 2755986 A4 [0669]
    • WO 2014152940 A1 [0669]
    • EP 3450553 B1 [0669]
    • EP 3362461 A1 [0669]
    • US 4880635 A [0813]
    • US 4906477 A [0813]
    • US 4911928 A [0813]
    • US 4917951 A [0813]
    • US 4920016 A [0813]
    • US 4921757 A [0813]
    • US 5139941 A [0833]
    • US 5962313 A [0833]
    • US 9526784 B [0849]
    • US 9737604 B [0849]
  • Zitierte Nicht-Patentliteratur
    • U01AI142756, RM1HG009490, R01EB022376 und R35GM118062 [0001]
    • akte Nr. B1195.70074US00 [0003]
    • B1195.70074US01 [0003]
    • B1195.70074US02 [0003]
    • B1 195.70083US00 [0003]
    • B1195.70074US03 [0003]
    • B1 195.70083US01 [0003]
    • B1 195.70074US04 [0003]
    • B1195.70074US05 [0003]
    • akte Nr. B1195.70083US02 [0003]
    • B1 195.70074US06 [0003]
    • B1195.70083US03 [0003]
    • PCT/US20/23721; PCT/US20/23730; PCT/US20/23713; PCT/US20/23712; PCT/US20/23727; PCT/US20/23724; PCT/US20/23725; PCT/LJS20/23728; PCT/US20/23732; PCT/US20/23723; PCT/US20/23553; und PCT/US20/23583 [0003]
    • Camarero und Muir, J. Amer. Chem. Soc., 121:5597-5598 (1999); Chong, et al., Gene, 192:271-281 (1997), Chong, et al., Nucleic Acids Res., 26:5109-5115 (1998); Chong, et al., J. Biol. Chem., 273:10567-10577 (1998); Cotton, et al. J. Am. Chem. Soc., 121:1100-1101 (1999); Evans, et al., J. Biol. Chem., 274:18359-18363 (1999); Evans, et al., J. Biol. Chem., 274:3923-3926 (1999); Evans, et al., Protein Sci., 7:2256-2264 (1998); Evans, et al., J. Biol. Chem., 275:9091-9094 (2000); Iwai und Pluckthun, FEBS Lett. 459:166-172 (1999); Mathys, et al., Gene, 231:1-13 (1999); Mills, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:3543-3548 (1998); Muir, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:6705-6710 (1998); Otomo, et al., Biochemistry 38:16040-16044 (1999); Otomo, et al., J. Biolmol. NMR 14:105-114 (1999); Scott, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:13638-13643 (1999); Severinov und Muir, J. Biol. Chem., 273:16205-16209 (1998); Shingledecker, et al., Gene, 207:187-195 (1998); Southworth, et al., EMBO J. 17:918-926 (1998); Southworth, et al., Biotechniques, 27:110- 120 (1999); Wood, et al., Nat. Biotechnol., 17:889-892 (1999); Wu, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:9226-9231 (1998a); Wu, et al., Biochim Biophys Acta 1387:422-432 (1998b); Xu, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:388-393 (1999); Yamazaki, et al., J. Am. Chem. Soc., 120:5591-5592 (1998 [0128]
    • Brown et al., „Serine recombinases as tools for genome engineering“ Methods. 2011 ;53(4):372-9; Hirano et al., „Site-specific recombinases as tools for heterologous gene integration.“ Appl. Microbiol. Biotechnol. 2011; 92(2):227-39; Chavez und Calos, „Therapeutic applications of the ΦC31 integrase system.“ Curr. Gene Ther. 2011;11(5):375-81; Turan und Bode, „Site-specific recombinases: from tag-and-target- to tag-and-exchange-based genomic modifications.“ FASEB J. 2011; 25(12):4088-107; Venken und Bellen, „Genome-wide manipulations of Drosophila melanogaster with transposons, Flp recombinase, and ΦC31 integrase.“ Methods Mol. Biol. 2012; 859:203-28; Murphy, „Phage recombinases and their applications“ Adv. Virus Res. 2012; 83:367-414; Zhang et al., „Conditional gene manipulation: Cre-ating a new biological era.“ J. Zhejiang Univ. Sci. B. 2012; 13(7):511-24; Karpenshif und Bernstein, „From yeast to mammals: recent advances in genetic control of homologous recombination.“ DNA- Reparatur (Amst). 2012; 1;11(10):781-8 [0173]
    • Groth et al., „Phage integrases: biology and applications“ J. Mol. Biol. 2004; 335, 667-678; Gordley et al., „Synthese von programmierbaren Integrasen“ Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 2009; 106, 5053-5058 [0173]
    • Klippel et al., „Isolation and characterisation of unusual gin mutants“ EMBO J. 1988; 7: 3983-3989: Burke et al., „Activating mutations of Tn3 resolvase marking interfaces important in recombination catalysis and its regulation. Mol Microbiol. 2004; 51: 937-948; Olorunniji et al., „Synapsis and catalysis by activated Tn3 resolvase mutants“ Nucleic Acids Res. 2008; 36: 7181-7191; Rowland et al., „Regulatory mutations in Sin recombinase support a structure-based model of the synaptosome“ Mol Microbiol. 2009; 74: 282-298; Akopian et al., „Chimeric recombinases with designed DNA sequence recognition.“ Proc Natl Acad Sci USA. 2003;100: 8688-8691; Gordley et al., „Evolution of programmable zinc finger-recombinases with activity in human cells. J Mol Biol. 2007; 367: 802-813; Gordley et al., „Synthesis of programmable integrases“ Proc Natl Acad Sei USA. 2009; 106: 5053-5058; Amold et al., „Mutants of Tn3 resolvase which do not require accessory binding sites for recombination activity.“ EMBO J. 1999; 18: 1407-1414; Gaj et al., „Structure-guided reprogramming of serine recombinase DNA sequence specificity“ Proc Natl Acad Sei USA. 2011;108(2):498-503; und Proudfoot et al., „Zinc finger recombinases with adaptable DNA sequence specificity.“ PloS One. 2011;6(4):e19537 [0173]
    • Klippel et al., „Isolation and characterisation of unusual gin mutants“ EMBO J. 1988; 7: 3983-3989: Burke et al., „Activating mutations of Tn3 resolvase marking interfaces important in recombination catalysis and its regulation. MolMicrobiol. 2004; 51: 937-948; Olorunniji et al., „Synapsis and catalysis by activated Tn3 resolvase mutants“ Nucleic Acids Res. 2008; 36: 7181-7191; Rowland et al., „Regulatory mutations in Sin recombinase support a structure- based model of the synaptosome“ Mol Microbiol. 2009; 74: 282-298; Akopian et al., „Chimeric recombinases with designed DNA sequence recognition“ Proc Natl Acad Sei USA. 2003;100: 8688-8691 [0173]
    • Smith et al., „Diversity in the serine recombinases“ Mol Microbiol. 2002;44: 299-307 [0173]
    • Guo et al., „Structure of Cre recombinase complexed with DNA in a site-specific recombination synapse“ Nature. 1997; 389:40-46; Hartung et al., „Cre mutants with altered DNA binding properties“ J Biol Chem 1998; 273:22884-22891; Shaikh et al., „Chimeras of the Flp and Cre recombinases: Tests of the mode of cleavage by Flp and Cre. J Mol Biol. 2000; 302:27-48; Rongrong et al., „Effect of deletion mutation on the recombination activity of Cre recombinase“ Acta Biochim Pol. 2005; 52:541-544; Kilbride et al., „Determinants of product topology in a hybrid Cre-Tn3 resolvase site-specific recombination system“ J Mol Biol. 2006; 355:185-195; Warren et al., „A chimeric cre recombinase with regulated directionality“ Proc Natl Acad Sci USA. 2008 105:18278-18283; Van Duyne, „Teaching Cre to follow directions“ Proc Natl Acad Sci USA. 2009 Jan 6;106(1):4-5; Numrych et al., „A comparison of the effects of single-base and triple-base changes in the integrase armtype binding sites on the site-specific recombination of bacteriophage λ.“ Nucleic Acids Res. 1990; 18:3953-3959; Tirumalai et al., „The recognition of core-type DNA sites by λ integrase“ J Mol Biol. 1998; 279:513-527; Aihara et al., „A conformational switch controls the DNA cleavage activity of λ integrase“ Mol Cell. 2003; 12:187-198; Biswas et al., „A structural basis for allosteric control ofDNA recombination by λ integrase“ Nature. 2005; 435:1059-1066; und Warren et al., „Mutations in the amino-terminal domain of λ-integrase have differential effects on integrative and excisive recombination“ Mol Microbiol. 2005; 55:1104-1112 [0173]
    • Berger et al. In Biochemistry 22:2365-2372 (1983 [0176]
    • Gerard, G. R., DNA 5:271-279 (1986) und Kotewicz, M. L., et al., Gene 35:249-258 (1985 [0176]
    • PCT/US2009/056194 [0179, 0303, 0369]
    • PCT/US2011/066747 [0179, 0303, 0369]
    • PCT/US2015/012022 [0179, 0303, 0369]
    • PCT/US2016/027795 [0179, 0303, 0369]
    • Stevens et al., „A promiscuous split intein with expanded protein engineering applications“, PNAS, 2017, Vol.114: 8538-8543; Iwai et al., „Highly efficient protein trans-splicing by a naturally split DnaE intein from Nostc punctiforme, FEBS Lett, 580: 1853-1858 [0193]
    • Shingledecker, et al.,Gene 207:187 (1998), Southworth, et al., EMBOJ. 17:918 (1998); Mills, et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 95:3543-3548 (1998); Lew, et al., J. Biol. Chem., 273:15887- 15890 (1998); Wu, et al., Biochim. Biophys. Acta 35732:1 (1998b), Yamazaki, et al., J. Am. Chem. Soc. 120:5591 (1998), Evans, et al., J. Biol. Chem. 275:9091 (2000); Otomo, et al., Biochemistry 38:16040-16044 (1999); Otomo, et al., J. Biolmol. NMR 14:105-114 (1999); Scott, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:13638-13643 (1999 [0194]
    • Stevens et al. „A promiscuous split intein with expanded protein engineering applications“, PNAS, 2017, Vol. 114: 8538-8543; Iwai et al. „Highly efficient protein trans-splicing by a naturally split DnaE intein from Nostc punctiforme“, FEBS Lett, 580: 1853-1858 [0319]
    • Shingledecker, et al., Gene 207:187 (1998), Southworth, et al., EMBOJ. 17:918 (1998); Mills, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:3543-3548 (1998); Lew, et al., J. Biol. Chem., 273:15887- 15890 (1998); Wu, et al., Biochim. Biophys. Acta 35732:1 (1998b), Yamazaki, et al., J. Am. Chem. Soc. 120:5591 (1998), Evans, et al., J. Biol. Chem. 275:9091 (2000); Otomo, et al., Biochemistry 38:16040-16044 (1999); Otomo, et al., J. Biolmol. NMR 14:105-114 (1999); Scott, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:13638-13643 (1999 [0320, 0476]
    • Boch et al., „Breaking the Code of DNA Binding Specificity of TAL-Type III Effectors“, Science, Bd. 326, S. 1509-1512 (2009), Bogdanove et al., TAL Effectors: Customizable Proteins for DNA Targeting, Science, Bd. 333, S. 1843-1846 (2011), Cade et al., „Highly efficient generation of heritable zebrafish gene mutations using homo- and heterodimeric TALENs“, Nucleic Acids Research, Bd. 40, S. 8001- 8010 (2012 [0336]
    • Carroll et al. „Genome Engineering with Zinc-Finger Nucleases“, Genetics, Aug 2011, Vol. 188: 773-782; Durai et al. „Zinc finger nucleases: custom-designed molecular scissors for genome engineering of plant and mammalian cells,“ Nucleic Acids Res, 2005, Vol. 33: 5978-90 [0337]
    • Gaj et al. „ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering,“ Trends Biotechnol. 2013, Vol.31: 397-405 [0337]
    • Barnes, W. M., Gene 112:29-35 (1992); Lawyer, F. C., et al., PCR Meth. Appl. 2:275-287 (1993); Flaman, J.-M, et al., Nuc. Acids Res. 22(15): 3259- 3260(1994 [0339]
    • Kacian et al., 1971, Biochim. Biophys. Acta 46: 365-83; Yang et al., 1972, Biochem. Biophys. Res. Comm. 47: 505-11; Gerard et al., 1975, J. Virol. 15: 785-97; Liu et al., 1977, Arch. Virol. 55 187-200; Kato et al., 1984, J. Virol. Methods 9: 325-39; Luke et al., 1990, Biochem. 29: 1764-69 and Le Grice et al., 1991, J. Virol. 65: 7004-07 [0354]
    • Gerard, G. R., DNA:271-79 (1986); Kotewicz, M. L., et al., Gene 35:249-58 (1985); Tanese, N., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA):4944-48 (1985); Roth, M. J., at al., J. Biol. Chem. 260:9326-35 (1985); Michel, F., et al., Nature 316:641-43 (1985); Akins, R. A., et al., Cell 47:505-16 (1986), EMBO J. 4:1267-75 (1985); und Fawcett, D. F., Cell 47:1007-15 (1986 [0355]
    • Bebenek et al. „Error-prone Polymerization by HIV-1 Reverse Transcriptase“, JBiol Chem, 1993, Vol. 268: 10324-10334 [0371]
    • Sebastian-Martin et al. „Transcriptional inaccuracy threshold attenuates differences in RNA-dependent DNA synthesis fidelity between retroviral reverse transcriptases“, Scientific Reports, 2018, Vol. 8: 627 [0371]
    • Johansson et al. „RNA recognition by the MS2 phage coat protein“, Sein Virol, 1997, Vol. 8(3): 176-185; Delebecque et al. „Organization of intracellular reactions with rationally designed RNA assemblies,“ Science, 2011, Vol. 333: 470-474; Mali et al. „Cas9 transcriptional activators for target specificity screening and paired nickases for cooperative genome engineering“, Nat. Biotechnol., 2013, Vol.31: 833-838; und Zalatan et al. „Engineering complex synthetic transcriptional programs with CRISPR RNA scaffolds“, Cell, 2015, Vol. 160: 339-350 [0478]
    • A. R. Gruber et al., 2008, Cell 106(1): 23-24; und PA Carr und GM Church, 2009, Nature Biotechnology 27(12): 1151-62 [0520]
    • BI-2013/004A [0520]
    • Anderson, Science 256:808-813 (1992); Nabel & Felgner, TIBTECH 11:211-217 (1993); Mitani & Caskey, TIBTECH 11:162- 166 (1993); Dillon, TIBTECH 11:167-175 (1993); Miller, Nature 357:455-460 (1992); Van Brunt, Biotechnology 6(10):1149-1154 (1988); Vigne, Restorative Neurology and Neuroscience 8:35-36 (1995); Kremer & Perricaudet, British Medical Bulletin 51(1):31-44 (1995); Haddada et al., in Current Topics in Microbiology and Immunology Doerfler and Bihm (eds) (1995); and Yu et al., Gene Therapy 1 :13-26 (1994 [0610]
    • Crystal, Science 270:404-410 (1995); Blaese et al., Cancer Gen Ther. 2:291-297 (1995); Behr et al., Bioconjugate Chem. 5:382-389 (1994); Remy et al., Bioconjugate Chem. 5:647-654 (1994); Gao et al., Gene Therapy 2:710-722 (1995); Ahmad et al., Cancer Res. 52:4817-4820 (1992 [0612, 0663, 0848]
    • Buchscher et al ., J. Virol. 66:2731-2739 (1992); Johann et al., J. Virol. 66:1635-1640 (1992); Sommnerfelt et al., Virol. 176:58-59 (1990); Wilson et al., J. Virol. 63:2374-2378 (1989); Miller et al., J. Virol. 65:2220-2224 (1991); PCT/US94/05700 [0614]
    • West et al., Virology 160:38-47 (1987 [0614]
    • Kotin, Human Gene Therapy 5:793-801 (1994); Muzyczka, J. Clin. Invest. 94:1351 (1994 [0614]
    • Tratschin et al., Mol. Cell. Biol. 5:3251-3260 (1985); Tratschin et al., Mol. Cell. Biol. 4:2072-2081 (1984); Hermonat & Muzyczka, PNAS 81:6466-6470 (1984); und Samulski et al., J. Virol. 63:03822- 3828 (1989 [0614]
    • Bagynszky et al. „Characterization of mutations in PRNP (prion) gene and their possible roles in neurodegenerative disease“, Neuropsychiatr Dis Treat., 2018; 14: 2067-2085 [0792]
    • Zhang YP et al., Gene Ther. 1999, 6:1438-47 [0813]
    • „Gene delivery to skeletal muscle results in sustained expression and systemic delivery of a therapeutic protein". Kessler PD, Podsakoff GM, Chen X, McQuiston SA, Colosi PC, Matelis LA, Kurtzman GJ, Byme BJ. Proc Natl Acad Sei USA. 1996 Nov 26;93(24):14082-7 [0833]
    • Curtis A. Machida. „Methods in Molecular Medicine™. Viral Vectors for Gene Therapy Methods and Protocols.“ 10.1385/1-59259-304-6:201 [0833]
    • t. Siehe Rees, H.A. et al. „Improving the DNA specificity and applicability of base editing through protein engineering and protein delivery“, Nat. Commun. 8, 15790 (2017 [0849]

Claims (232)

  1. Ein System zum gleichzeitigen Editieren beider Stränge einer doppelsträngigen DNA- Sequenz an einer zu editierenden Zielstelle, wobei das System einen ersten Primer-Editor- Komplex und einen zweiten Primer-Editor-Komplex umfasst, wobei jeder der ersten und zweiten Primer-Editor-Komplexe umfasst: (1) einen Primer-Editor, umfassend (i) ein Nukleinsäure-programmierbares DNA-bindendes Protein (napDNAbp) und (ii) ein Polypeptid mit einer RNA-abhängigen DNA-Polymerase-Aktivität; und (2) eine pegRNA, die eine Spacersequenz, einen gRNA-Kern, eine DNA-Synthese-Template und eine Primer- Bindungsstelle umfasst, wobei die DNA-Synthese-Template der pegRNA des ersten Prime- Editor-Komplexes eine erste einzelsträngige DNA-Sequenz kodiert und die DNA-Synthese- Template der pegRNA des zweiten Prime-Editor-Komplexes eine zweite einzelsträngige DNA-Sequenz kodiert, wobei die erste einzelsträngige DNA-Sequenz und die zweite einzelsträngige DNA-Sequenz jeweils eine Region der Komplementarität zur anderen umfassen, und wobei die erste einzelsträngige DNA-Sequenz und die zweite einzelsträngige DNA-Sequenz einen Duplex bilden, der einen editierten Abschnitt im Vergleich zur DNA- Sequenz an der zu editierenden Zielstelle umfasst, der in die zu editierende Zielstelle integriert wird.
  2. System nach Anspruch 1, wobei der Prime-Editor des ersten Prime-Editor-Komplexes, des zweiten Prime-Editor-Komplexes oder sowohl des ersten Prime-Editor-Komplexes als auch des zweiten Prime-Editor-Komplexes ein Fusionsprotein ist, das das napDNAbp und das Polypeptid mit einer RNA-abhängigen DNA-Polymerase-Aktivität umfasst.
  3. Das System nach Anspruch 1 oder 2, wobei der erste Prime-Editor-Komplex und der zweite Prime-Editor-Komplex denselben Prime-Editor umfassen.
  4. Das System nach Anspruch 1 oder 2, wobei der erste Prime-Editor-Komplex und der zweite Prime-Editor-Komplex unterschiedliche Prime-Editoren umfassen.
  5. Das System nach einem der Ansprüche 1-4, wobei das napDNAbp eine Cas9-Domäne oder eine Variante davon ist.
  6. Das System nach einem der Ansprüche 1-5, wobei das napDNAbp eine nukleaseaktive Cas9-Domäne, eine Nuklease-inaktive Cas9-Domäne, eine Cas9-Nickase-Domäne oder eine Variante davon ist.
  7. Das System nach einem der Ansprüche 1-4, wobei das napDNAbp ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Cas9, Cas12e, Cas12d, Cas12a, Cas12b1, Cas13a, Cas12c, CasX, CasY und Argonaute.
  8. Das System nach einem der Ansprüche 1-7, wobei das napDNAbp eine Nickase- Aktivität aufweist.
  9. Das System nach einem der Ansprüche 1-4, wobei das napDNAbp eine Aminosäuresequenz einer der SEQ-ID-NR.: 18-88 umfasst, oder eine Aminosäuresequenz umfasst, die mindestens 80 %, 85 %, 90 %, 95 % oder 99 % Sequenzidentität mit einer beliebigen SEQ-ID-NR: 18-88 hat.
  10. Das System nach einem der Ansprüche 1-9, wobei das Polypeptid mit einer RNA- abhängigen DNA-Polymerase-Aktivität eine reverse Transkriptase ist.
  11. Das System nach einem der Ansprüche 1-10, wobei das Polypeptid mit einer RNA- abhängigen DNA-Polymerase-Aktivität eine Aminosäuresequenz nach einer der folgenden SEQ-ID-NR.: 89-100, 105-122, 128-129, 132, 139, 143, 149, 154, 159 und 700-766 umfasst, oder eine Aminosäuresequenz umfasst, die mindestens 80 %, 85 %, 90 %, 95 % oder 99 % Sequenzidentität mit einer beliebigen von SEQ-ID-NR: 89-100, 105-122, 128-129 und 132 hat.
  12. Das System nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei der Prime-Editor weiterhin einen Linker umfasst, der das napDNAbp und das Polypeptid mit der RNA-abhängigen DNA- Polymerase-Aktivität miteinander verbindet.
  13. System nach Anspruch 12, wobei der Linker eine Aminosäuresequenz aus einer der SEQ-ID-NR.: 166-177 umfasst, oder eine Aminosäuresequenz umfasst, die mindestens 80 %, 85 %, 90 %, 95 % oder 99 % Sequenzidentität mit einer beliebigen SEQ-ID-NR: 166-177 hat.
  14. Das System nach Anspruch 12 oder 13, wobei der Linker 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 oder 50 Aminosäuren lang ist.
  15. Das System nach einem der Ansprüche 1-14, wobei die pegRNA eine Nukleotidsequenz einer der SEQ-ID-NR.: 325-330, 499-505, 101-104, 181-183 und 223-244 umfasst, oder eine Nukleotidsequenz umfasst, die mindestens 80 %, 85 %, 90 %, 95 % oder 99 % Sequenzidentität mit einer beliebigen von SEQ-ID-NR: 325-330,499-505,101-104,181- 183 und 223-244 hat.
  16. Das System nach einem der Ansprüche 1-15, wobei die Spacer-Sequenz der pegRNA des ersten Prime-Editor-Komplexes an eine erste Bindungsstelle auf einem ersten Strang der doppelsträngigen DNA-Sequenz stromaufwärts von der zu editierenden Zielstelle bindet.
  17. Das System nach einem der Ansprüche 1-16, wobei die Spacer-Sequenz der pegRNA des zweiten Prime-Editor-Komplexes an eine zweite Bindungsstelle auf einem zweiten Strang der doppelsträngigen DNA-Sequenz stromabwärts von der zu editierenden Zielstelle bindet.
  18. System nach Anspruch 17, wobei die Bindung der Spacer-Sequenz der pegRNAs des ersten und zweiten Prime-Editor-Komplexes in Gegenwart einer PAM-Sequenz zum Nicking des ersten bzw. zweiten Strangs an einer Einkerbung proximal zu den PAM-Sequenzen auf jedem Strang durch die napDNAbps des ersten und zweiten Prime-Editor-Komplexes führt.
  19. System nach Anspruch 18, wobei die erste und zweite Bindungsstelle zwei Enden einer zusammenhängenden Region doppelsträngiger DNA definieren, die die zu editierende Zielstelle umfasst.
  20. System nach Anspruch 19, wobei der zusammenhängende Bereich zwischen der ersten und zweiten Bindungsstelle mindestens 10 Nukleobasenpaare, mindestens 11 Nukleobasenpaare, mindestens 12 Nukleobasenpaare, mindestens 13 Nukleobasenpaare, mindestens 14 Nukleobasenpaare, mindestens 15 Nukleobasenpaare, mindestens 16 Nukleobasenpaare, mindestens 17 Nukleobasenpaare, mindestens 18 Nukleobasenpaare, mindestens 19 Nukleobasenpaare, mindestens 20 Nukleobasenpaare, mindestens 21 Nukleobasenpaare, mindestens 22 Nukleobasenpaare, mindestens 23 Nukleobasenpaare, mindestens 24 Nukleobasenpaare, mindestens 25 Nukleobasenpaare, mindestens 26 Nukleobasenpaare, mindestens 27 Nukleobasenpaare, mindestens 28 Nukleobasenpaare, mindestens 29 Nukleobasenpaare, mindestens 30 Nukleobasenpaare, mindestens 31 Nukleobasenpaare, mindestens 32 Nukleobasenpaare, mindestens 33 Nukleobasenpaare, mindestens 34 Nukleobasenpaare, mindestens 35 Nukleobasenpaare, mindestens 36 Nukleobasenpaare, mindestens 37 Nukleobasenpaare, mindestens 38 Nukleobasenpaare, mindestens 39 Nukleobasenpaare, oder mindestens 40 Nukleobasenpaare, mindestens 41 Nukleotide, mindestens 42 Nukleotide, mindestens 43 Nukleotide, mindestens 44 Nukleotide, mindestens 45 Nukleotide, mindestens 46 Nukleotide, mindestens 47 Nukleotide, mindestens 48 Nukleotide, mindestens 49 Nukleotide, mindestens 50 Nukleotide, mindestens 51 Nukleotide, mindestens 52 Nukleotide, mindestens 53 Nukleotide, mindestens 54 Nukleotide, mindestens 55 Nukleotide, mindestens 56 Nukleotide, mindestens 57 Nukleotide, mindestens 58 Nukleotide, mindestens 59 Nukleotide, mindestens 60 Nukleotide, mindestens 61 Nukleotide, mindestens 62 Nukleotide, mindestens 63 Nukleotide, mindestens 64 Nukleotide, mindestens 65 Nukleotide, mindestens 66 Nukleotide, mindestens 67 Nukleotide, mindestens 68 Nukleotide, mindestens 69 Nukleotide, mindestens 70 Nukleotide, mindestens 71 Nukleotide, mindestens 72 Nukleotide, mindestens 73 Nukleotide, mindestens 74 Nukleotide, mindestens 75 Nukleotide, mindestens 76 Nukleotide, mindestens 77 Nukleotide, mindestens 78 Nukleotide, mindestens 79 Nukleotide, mindestens 80 Nukleotide, mindestens 81 Nukleotide, mindestens 82 Nukleotide, mindestens 83 Nukleotide, mindestens 84 Nukleotide, mindestens 85 Nukleotide, mindestens 86 Nukleotide, mindestens 87 Nukleotide, mindestens 88 Nukleotide, mindestens 89 Nukleotide, mindestens 90 Nukleotide, mindestens 91 Nukleotide, mindestens 92 Nukleotide, mindestens 93 Nukleotide, mindestens 94 Nukleotid, mindestens 95 Nukleotide, mindestens 96 Nukleotide, mindestens 97 Nukleotide, mindestens 98 Nukleotide, mindestens 99 Nukleotide, mindestens 100 Nukleotide, mindestens 101 Nukleotide, mindestens 102 Nukleotide, mindestens 103 Nukleotide, mindestens 104 Nukleotide, mindestens 105 Nukleotide, mindestens 106 Nukleotide, mindestens 107 Nukleotide, mindestens 108 Nukleotide, mindestens 109 Nukleotide oder mindestens 110 Nukleotide lang ist.
  21. Das System nach Anspruch 19, wobei der zusammenhängende Bereich durch den Duplex ersetzt wird, der den bearbeiteten Teil umfasst.
  22. Das System nach einem der Ansprüche 1-21, wobei die DNA-Synthesematrize mindestens 1 Nukleotid, mindestens 2 Nukleotide, mindestens 3 Nukleotide, mindestens 4 Nukleotide, mindestens 5 Nukleotide, mindestens 6 Nukleotide, mindestens 7 Nukleotide, mindestens 8 Nukleotide, mindestens 9 Nukleotide, mindestens 10 Nukleotide, mindestens 11 Nukleotide, mindestens 12 Nukleotide, mindestens 13 Nukleotide, mindestens 14 Nukleotide, mindestens 15 Nukleotide, mindestens 16 Nukleotide, mindestens 17 Nukleotide, mindestens 18 Nukleotide, mindestens 19 Nukleotide, mindestens 20 Nukleotide, mindestens 21 Nukleotide, mindestens 22 Nukleotide, mindestens 23 Nukleotide, mindestens 24 Nukleotide, mindestens 25 Nukleotide, mindestens 26 Nukleotide, mindestens 27 Nukleotide, mindestens 28 Nukleotide, mindestens 29 Nukleotide, mindestens 30 Nukleotide, mindestens 31 Nukleotide, mindestens 32 Nukleotide, mindestens 33 Nukleotide, mindestens 34 Nukleotide, mindestens 35 Nukleotide, mindestens 36 Nukleotide, mindestens 37 Nukleotide, mindestens 38 Nukleotide, mindestens 39 Nukleotide, mindestens 40 Nukleotide, mindestens 41 Nukleotide, mindestens 42 Nukleotide, mindestens 43 Nukleotide, mindestens 44 Nukleotide, mindestens 45 Nukleotide, mindestens 46 Nukleotide, mindestens 47 Nukleotide, mindestens 48 Nukleotide, mindestens 49 Nukleotide, mindestens 50 Nukleotide, mindestens 51 Nukleotide, mindestens 52 Nukleotide, mindestens 53 Nukleotide, mindestens 54 Nukleotide, mindestens 55 Nukleotide, mindestens 56 Nukleotide, mindestens 57 Nukleotide, mindestens 58 Nukleotide, mindestens 59 Nukleotide, mindestens 60 Nukleotide, mindestens 61 Nukleotide, mindestens 62 Nukleotide, mindestens 63 Nukleotide, mindestens 64 Nukleotide, mindestens 65 Nukleotide, mindestens 66 Nukleotide, mindestens 67 Nukleotide, mindestens 68 Nukleotide, mindestens 69 Nukleotide, mindestens 70 Nukleotide, mindestens 71 Nukleotide, mindestens 72 Nukleotide, mindestens 73 Nukleotide, mindestens 74 Nukleotide, mindestens 75 Nukleotide, mindestens 76 Nukleotide, mindestens 77 Nukleotide, mindestens 78 Nukleotide, mindestens 79 Nukleotide, mindestens 80 Nukleotide, mindestens 81 Nukleotide, mindestens 82 Nukleotide, mindestens 83 Nukleotide, mindestens 84 Nukleotide, mindestens 85 Nukleotide, mindestens 86 Nukleotide, mindestens 87 Nukleotide, mindestens 88 Nukleotide, mindestens 89 Nukleotide, mindestens 90 Nukleotide, mindestens 91 Nukleotide, mindestens 92 Nukleotide, mindestens 93 Nukleotide, mindestens 94 Nukleotide, mindestens 95 Nukleotide, mindestens 96 Nukleotide, mindestens 97 Nukleotide, mindestens 98 Nukleotide, mindestens 99 Nukleotide, mindestens 100 Nukleotide, mindestens 101 Nukleotide, mindestens 102 Nukleotide, mindestens 103 Nukleotide, mindestens 104 Nukleotide, mindestens 105 Nukleotide, mindestens 106 Nukleotide, mindestens 107 Nukleotide, mindestens 108 Nukleotide, mindestens 109 Nukleotide oder mindestens 110 Nukleotide lang ist.
  23. System nach einem der Ansprüche 1-22, wobei die erste einzelsträngige DNA-Sequenz und die zweite einzelsträngige DNA-Sequenz die gleichen Längen aufweisen.
  24. System nach einem der Ansprüche 1-22, wobei die erste einzelsträngige DNA-Sequenz und die zweite einzelsträngige DNA-Sequenz unterschiedliche Längen aufweisen.
  25. System nach einem der Ansprüche 1-24, wobei die Komplementaritätsregion mindestens 99 %, mindestens 95 %, mindestens 90 %, mindestens 85 %, mindestens 80 %, mindestens 75 %, mindestens 70 %, mindestens 65 %, mindestens 60 %, mindestens 55 %, mindestens 50 %, mindestens 45 %, mindestens 40 %, mindestens 35 %, mindestens 30 %, mindestens 25 %, mindestens 20 %, mindestens 15 % oder mindestens 10 % der Gesamtlänge der ersten einzelsträngigen DNA-Sequenz oder der zweiten einzelsträngigen DNA-Sequenz beträgt.
  26. System nach Anspruch 25, wobei die Komplementaritätsregion mindestens 5 Nukleotide, mindestens 6 Nukleotide, mindestens 7 Nukleotide, mindestens 8 Nukleotide, mindestens 9 Nukleotide, mindestens 10 Nukleotide, mindestens 11 Nukleotide, mindestens 12 Nukleotide, mindestens 13 Nukleotide, mindestens 14 Nukleotide, mindestens 15 Nukleotide, mindestens 16 Nukleotide, mindestens 17 Nukleotide, mindestens 18 Nukleotide, mindestens 19 Nukleotide, mindestens 20 Nukleotide, mindestens 21 Nukleotide, mindestens 22 Nukleotide, mindestens 23 Nukleotide, mindestens 24 Nukleotide, mindestens 25 Nukleotide, mindestens 26 Nukleotide, mindestens 27 Nukleotide, mindestens 28 Nukleotide, mindestens 29 Nukleotide, mindestens 30 Nukleotide, mindestens 31 Nukleotide, mindestens 32 Nukleotide, mindestens 33 Nukleotide, mindestens 34 Nukleotide, mindestens 35 Nukleotide, mindestens 36 Nukleotide, mindestens 37 Nukleotide, mindestens 38 Nukleotide, mindestens 39 Nukleotide, mindestens 40 Nukleotide, mindestens 41 Nukleotide, mindestens 42 Nukleotide, mindestens 43 Nukleotide, mindestens 44 Nukleotide, mindestens 45 Nukleotide, mindestens 46 Nukleotide, mindestens 47 Nukleotide, mindestens 48 Nukleotide, mindestens 49 Nukleotide, mindestens 50 Nukleotide, mindestens 51 Nukleotide, mindestens 52 Nukleotide, mindestens 53 Nukleotide, mindestens 54 Nukleotide, mindestens 55 Nukleotide, mindestens 56 Nukleotide, mindestens 57 Nukleotide, mindestens 58 Nukleotide, mindestens 59 Nukleotide, mindestens 60 Nukleotide, mindestens 61 Nukleotide, mindestens 62 Nukleotide, mindestens 63 Nukleotide, mindestens 64 Nukleotide, mindestens 65 Nukleotide, mindestens 66 Nukleotide, mindestens 67 Nukleotide, mindestens 68 Nukleotide, mindestens 69 Nukleotide, mindestens 70 Nukleotide, mindestens 71 Nukleotide, mindestens 72 Nukleotide, mindestens 73 Nukleotide, mindestens 74 Nukleotide, mindestens 75 Nukleotide, mindestens 76 Nukleotide, mindestens 77 Nukleotide, mindestens 78 Nukleotide, mindestens 79 Nukleotide, mindestens 80 Nukleotide, mindestens 81 Nukleotide, mindestens 82 Nukleotide, mindestens 83 Nukleotide, mindestens 84 Nukleotide, mindestens 85 Nukleotide, mindestens 86 Nukleotide, mindestens 87 Nukleotide, mindestens 88 Nukleotide, mindestens 89 Nukleotide, mindestens 90 Nukleotide, mindestens 91 Nukleotide, mindestens 92 Nukleotide, mindestens 93 Nukleotide, mindestens 94 Nukleotid, mindestens 95 Nukleotide, mindestens 96 Nukleotide, mindestens 97 Nukleotide, mindestens 98 Nukleotide, mindestens 99 Nukleotide, mindestens 100 Nukleotide, mindestens 101 Nukleotide, mindestens 102 Nukleotide, mindestens 103 Nukleotide, mindestens 104 Nukleotide, mindestens 105 Nukleotide, mindestens 106 Nukleotide, mindestens 107 Nukleotide, mindestens 108 Nukleotide, mindestens 109 Nukleotide oder mindestens 110 Nukleotide lang ist und entweder kürzer oder gleich der Länge der gewünschten DNA-Sequenz und ihres Komplements ist.
  27. System nach Anspruch 25, wobei die Komplementaritätsregion der ersten einzelsträngigen DNA-Sequenz und der zweiten einzelsträngigen DNA-Sequenz den Duplex formen, der den editierten Teil umfasst.
  28. System nach einem der Ansprüche 1-27, wobei die erste einzelsträngige DNA-Sequenz und die zweite einzelsträngige DNA-Sequenz jeweils einzelsträngige DNA-Stränge mit 3'- Enden sind.
  29. System nach Anspruch 21, wobei das Ersetzen der zusammenhängenden Region durch den Duplex, der den editierten Teil umfasst, zu einer Insertion, Deletion oder einem Ersetzen von DNA an der Zielstelle führt.
  30. System zum gleichzeitigen Editieren beider Stränge einer doppelsträngigen DNA- Sequenz an einer zu editierenden Zielstelle, wobei das System Folgendes umfasst: a) einen ersten Prime-Editor-Komplex, der Folgendes umfasst: i.einen ersten Prime-Editor, der ein erstes Nukleinsäure-programmierbares DNA- Bindungsprotein (erstes napDNAbp) umfasst, und ein erstes Polypeptid, das eine RNA- abhängige DNA-Polymeraseaktivität umfasst; und ii.eine erste Prime-Editing-Guide-RNA (erste PEgRNA), die an eine erste Bindungsstelle auf einem ersten Strang der doppelsträngigen DNA-Sequenz stromaufwärts der zu editierenden Zielstelle anbindet; b) einen zweiten Prime-Editor-Komplex, der Folgendes umfasst: iii.einen zweiten Prime-Editor, der ein zweites Nukleinsäure-programmierbares DNA- Bindungsprotein (zweites napDNAbp) umfasst, und ein zweites Polypeptid, das eine RNA-abhängige DNA-Polymeraseaktivität umfasst; und iv.eine zweite Prime-Editing-Guide-RNA (zweite PEgRNA), die an eine zweite Bindungsstelle auf einem zweiten Strang der doppelsträngigen DNA-Sequenz stromabwärts der zu editierenden Zielstelle anbindet; wobei die erste PEgRNA eine erste DNA-Synthese-Template umfasst, die eine erste einzelsträngige DNA-Sequenz kodiert, und die zweite PEgRNA mit einer zweiten DNA- Synthese-Template, die eine zweite einzelsträngige DNA-Sequenz kodiert, und wobei der erste Strang und der zweite Strang der doppelsträngigen DNA-Sequenz komplementär sind.
  31. System nach Anspruch 30, wobei der Prime-Editor des ersten Prime-Editor-Komplex, der zweite Prime-Editor-Komplex oder der erste und der zweite Prime-Editor-Komplex ein Fusionsprotein ist, welches das napDNAbp und das Polypeptid mit RNA-abhängiger DNA- Polymeraseaktivität umfasst.
  32. System nach Anspruch 30, wobei die erste und die zweite einzelsträngige DNA- Sequenz jeweils eine Komplementaritätsregion mit der anderen aufweisen.
  33. System nach Anspruch 30, wobei die erste einzelsträngige DNA-Sequenz und die zweite einzelsträngige DNA-Sequenz einen Duplex bilden, der den editierten Teil umfasst, der sich in die zu editierende Zielstelle integriert.
  34. System nach Anspruch 30, wobei die erste einzelsträngige DNA-Sequenz und/oder die zweite einzelsträngige Sequenz keine Sequenzhomologie im Vergleich zur DNA-Sequenz an der Zielstelle umfasst.
  35. System nach Anspruch 30, wobei die erste PEgRNA überdies eine erste Spacer- Sequenz, einen ersten gRNA-Kern und eine erste Primer-Bindungsstelle umfasst, und die zweite PEgRNA überdies eine zweite Spacer-Sequenz, einen zweiten gRNA-Kern und eine zweite Primer-Bindungsstelle umfasst.
  36. System nach einem der Ansprüche 30-35, wobei der erste Prime-Editor-Komplex und der zweite Prime-Editor-Komplex denselben Prime-Editor umfassen.
  37. System nach einem der Ansprüche 30-36, wobei das erste Polypeptid, das eine RNA- abhängige DNA-Polymeraseaktivität umfasst, und das zweite Polypeptid, das eine RNA- abhängige DNA-Polymeraseaktivität umfasst, gleich sind.
  38. System nach einem der Ansprüche 30-37, wobei das erste und/oder zweite napDNAbp eine Cas9-Domäne oder Variante davon ist.
  39. System nach einem der Ansprüche 30-38, wobei das erste und/oder zweite napDNAbp eine Nuklease-aktive Cas9-Domäne, eine Nuklease-inaktive Cas9-Domäne, eine Cas9- Nickase-Domäne oder eine Variante ebendieser ist.
  40. System nach einem der Ansprüche 30-39, wobei das erste und/oder zweite napDNAbp aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Cas9, Cas12e, Cas12d, Cas12a, Cas12b1, Cas13a, Cas12c, CasX, CasY und Argonaute besteht.
  41. System nach einem der Ansprüche 30-40, wobei das napDNAbp eine Nickase-Aktivität aufweist.
  42. System nach einem der Ansprüche 30-41, wobei das erste und/oder zweite napDNAbp eine beliebige Aminosäuresequenz von SEQ-ID-NR: 18-88 umfasst, oder eine Aminosäuresequenz umfasst, die mindestens 80 %, 85 %, 90 %, 95 % oder 99 % Sequenzidentität mit einer beliebigen SEQ-ID-NR: 18-88 hat.
  43. System nach einem der Ansprüche 30-42, wobei das erste und/oder zweite Polypeptid mit einer RNA-abhängigen DNA-Polymeraseaktivität eine reverse Transkriptase ist.
  44. System nach einem der Ansprüche 30-43, wobei das erste und/oder zweite Polypeptid mit einer RNA-abhängigen DNA-Polymeraseaktivität eine Aminosäuresequenz mit einer beliebigen von SEQ-ID-NR: 89-100, 105-122, 128-129, 132, 139, 143, 149, 154, 159 und 700- 766 umfasst, oder eine Aminosäuresequenz umfasst, die mindestens 80 %, 85 %, 90 %, 95 % oder 99 % Sequenzidentität mit einer beliebigen von SEQ-ID-NR: 89-100, 105-122, 128-129 und 132 hat.
  45. System nach einem der Ansprüche 30-44, wobei der erste Prime-Editor überdies einen Linker umfasst, der das erste napDNAbp und das erste Polypeptid mit RNA-abhängiger DNA- Polymeraseaktivität verknüpft; und/oder der zweite Prime-Editor überdies einen Linker umfasst, der das zweite napDNAbp und das zweite Polypeptid mit RNA-abhängiger DNA- Polymeraseaktivität verknüpft.
  46. System nach Anspruch 45, wobei der Linker eine beliebige Aminosäuresequenz von SEQ-ID-NR: 166-177 umfasst, oder eine Aminosäuresequenz umfasst, die mindestens 80 %, 85 %, 90 %, 95 % oder 99 % Sequenzidentität mit einer beliebigen SEQ-ID-NR: 166-177 hat.
  47. System nach Anspruch 45, wobei der Linker eine Länge von 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 oder 50 Aminosäuren hat.
  48. System nach einem der Ansprüche 30-47, wobei die erste und/oder zweite PEgRNA eine beliebige Nukleotidsequenz von SEQ-ID-NR: 325-330, 499-505, 101-104, 181-183 und 223-244 umfasst, oder eine Nukleotidsequenz umfasst, die mindestens 80 %, 85 %, 90 %, 95 % oder 99 % Sequenzidentität mit einer beliebigen von SEQ-ID-NR: 325-330, 499-505, 101-104, 181-183 und 223-244 hat.
  49. System nach einem der Ansprüche 30-48, wobei die erste Spacer-Sequenz an eine erste Bindungsstelle auf einem ersten Strang der doppelsträngigen DNA-Sequenz stromaufwärts der zu editierenden Zielstelle anbindet.
  50. System nach Anspruch 35, wobei die zweite Spacer-Sequenz des zweiten Prime-Editor- Komplexes an eine zweite Bindungsstelle auf einem zweiten Strang der doppelsträngigen DNA-Sequenz stromabwärts der zu editierenden Zielstelle anbindet.
  51. System nach Anspruch 35, wobei das Anbinden der Spacer-Sequenz des ersten und zweiten Prime-Editor-Komplexes in Präsenz einer PAM-Sequenz zum Nicking des ersten und zweiten Strangs führt, jeweils an einer Nick-Stelle, die proximal zur PAM-Sequenz jedes Strangs beim ersten und/oder zweiten napDNAbp der beiden ersten und zweiten Prime-Editor- Komplexe liegt.
  52. System nach Anspruch 30, wobei die erste und zweite Bindungsstelle zwei Enden einer zusammenhängenden Region doppelsträngiger DNA definieren, welche die zu editierende Zielstelle umfasst.
  53. System nach Anspruch 52, wobei die zusammenhängende Region zwischen der ersten und zweiten Bindungsstelle mindestens 10 Nukleobasenpaare, mindestens 11 Nukleobasenpaare, mindestens 12 Nukleobasenpaare, mindestens 13 Nukleobasenpaare, mindestens 14 Nukleobasenpaare, mindestens 15 Nukleobasenpaare, mindestens 16 Nukleobasenpaare, mindestens 17 Nukleobasenpaare, mindestens 18 Nukleobasenpaare, mindestens 19 Nukleobasenpaare, mindestens 20 Nukleobasenpaare, mindestens 21 Nukleobasenpaare, mindestens 22 Nukleobasenpaare, mindestens 23 Nukleobasenpaare, mindestens 24 Nukleobasenpaare, mindestens 25 Nukleobasenpaare, mindestens 26 Nukleobasenpaare, mindestens 27 Nukleobasenpaare, mindestens 28 Nukleobasenpaare, mindestens 29 Nukleobasenpaare, mindestens 30 Nukleobasenpaare, mindestens 31 Nukleobasenpaare, mindestens 32 Nukleobasenpaare, mindestens 33 Nukleobasenpaare, mindestens 34 Nukleobasenpaare, mindestens 35 Nukleobasenpaare, mindestens 36 Nukleobasenpaare, mindestens 37 Nukleobasenpaare, mindestens 38 Nukleobasenpaare, mindestens 39 Nukleobasenpaare, mindestens 40 Nukleobasenpaare, mindestens 41 Nukleotide, mindestens 42 Nukleotide, mindestens 43 Nukleotide, mindestens 44 Nukleotide, mindestens 45 Nukleotide, mindestens 46 Nukleotide, mindestens 47 Nukleotide, mindestens 48 Nukleotide, mindestens 49 Nukleotide, mindestens 50 Nukleotide, mindestens 51 Nukleotide, mindestens 52 Nukleotide, mindestens 53 Nukleotide, mindestens 54 Nukleotide, mindestens 55 Nukleotide, mindestens 56 Nukleotide, mindestens 57 Nukleotide, mindestens 58 Nukleotide, mindestens 59 Nukleotide, mindestens 60 Nukleotide, mindestens 61 Nukleotide, mindestens 62 Nukleotide, mindestens 63 Nukleotide, mindestens 64 Nukleotide, mindestens 65 Nukleotide, mindestens 66 Nukleotide, mindestens 67 Nukleotide, mindestens 68 Nukleotide, mindestens 69 Nukleotide, mindestens 70 Nukleotide, mindestens 71 Nukleotide, mindestens 72 Nukleotide, mindestens 73 Nukleotide, mindestens 74 Nukleotide, mindestens 75 Nukleotide, mindestens 76 Nukleotide, mindestens 77 Nukleotide, mindestens 78 Nukleotide, mindestens 79 Nukleotide, mindestens 80 Nukleotide, mindestens 81 Nukleotide, mindestens 82 Nukleotide, mindestens 83 Nukleotide, mindestens 84 Nukleotide, mindestens 85 Nukleotide, mindestens 86 Nukleotide, mindestens 87 Nukleotide, mindestens 88 Nukleotide, mindestens 89 Nukleotide, mindestens 90 Nukleotide, mindestens 91 Nukleotide, mindestens 92 Nukleotide, mindestens 93 Nukleotide, mindestens 94 Nukleotide, mindestens 95 Nukleotide, mindestens 96 Nukleotide, mindestens 97 Nukleotide, mindestens 98 Nukleotide, mindestens 99 Nukleotide, mindestens 100 Nukleotide, mindestens 101 Nukleotide, mindestens 102 Nukleotide, mindestens 103 Nukleotide, mindestens 104 Nukleotide, mindestens 105 Nukleotide, mindestens 106 Nukleotide, mindestens 107 Nukleotide, mindestens 108 Nukleotide, mindestens 109 Nukleotide oder mindestens 110 Nukleotide lang ist.
  54. System nach Anspruch 52, wobei die zusammenhängende Region von dem Duplex ersetzt wird, der den editierten Teil enthält.
  55. System nach einem der Ansprüche 30-54, wobei die erste und/oder zweite DNA- Synthese-Template mindestens 1 Nukleotid, mindestens 2 Nukleotide, mindestens 3 Nukleotide, mindestens 4 Nukleotide, mindestens 5 Nukleotide, mindestens 6 Nukleotide, mindestens 7 Nukleotide, mindestens 8 Nukleotide, mindestens 9 Nukleotide, mindestens 10 Nukleotide, mindestens 11 Nukleotide, mindestens 12 Nukleotide, mindestens 13 Nukleotide, mindestens 14 Nukleotide, mindestens 15 Nukleotide, mindestens 16 Nukleotide, mindestens 17 Nukleotide, mindestens 18 Nukleotide, mindestens 19 Nukleotide, mindestens 20 Nukleotide, mindestens 21 Nukleotide, mindestens 22 Nukleotide, mindestens 23 Nukleotide, mindestens 24 Nukleotide, mindestens 25 Nukleotide, mindestens 26 Nukleotide, mindestens 27 Nukleotide, mindestens 28 Nukleotide, mindestens 29 Nukleotide, mindestens 30 Nukleotide, mindestens 31 Nukleotide, mindestens 32 Nukleotide, mindestens 33 Nukleotide, mindestens 34 Nukleotide, mindestens 35 Nukleotide, mindestens 36 Nukleotide, mindestens 37 Nukleotide, mindestens 38 Nukleotide, mindestens 39 Nukleotide, mindestens 40 Nukleotide, mindestens 41 Nukleotide, mindestens 42 Nukleotide, mindestens 43 Nukleotide, mindestens 44 Nukleotide, mindestens 45 Nukleotide, mindestens 46 Nukleotide, mindestens 47 Nukleotide, mindestens 48 Nukleotide, mindestens 49 Nukleotide, mindestens 50 Nukleotide, mindestens 51 Nukleotide, mindestens 52 Nukleotide, mindestens 53 Nukleotide, mindestens 54 Nukleotide, mindestens 55 Nukleotide, mindestens 56 Nukleotide, mindestens 57 Nukleotide, mindestens 58 Nukleotide, mindestens 59 Nukleotide, mindestens 60 Nukleotide, mindestens 61 Nukleotide, mindestens 62 Nukleotide, mindestens 63 Nukleotide, mindestens 64 Nukleotide, mindestens 65 Nukleotide, mindestens 66 Nukleotide, mindestens 67 Nukleotide, mindestens 68 Nukleotide, mindestens 69 Nukleotide, mindestens 70 Nukleotide, mindestens 71 Nukleotide, mindestens 72 Nukleotide, mindestens 73 Nukleotide, mindestens 74 Nukleotide, mindestens 75 Nukleotide, mindestens 76 Nukleotide, mindestens 77 Nukleotide, mindestens 78 Nukleotide, mindestens 79 Nukleotide, mindestens 80 Nukleotide, mindestens 81 Nukleotide, mindestens 82 Nukleotide, mindestens 83 Nukleotide, mindestens 84 Nukleotide, mindestens 85 Nukleotide, mindestens 86 Nukleotide, mindestens 87 Nukleotide, mindestens 88 Nukleotide, mindestens 89 Nukleotide, mindestens 90 Nukleotid, mindestens 91 Nukleotide, mindestens 92 Nukleotide, mindestens 93 Nukleotide, mindestens 94 Nukleotide, mindestens 95 Nukleotide, mindestens 96 Nukleotide, mindestens 97 Nukleotide, mindestens 98 Nukleotide, mindestens 99 Nukleotide, mindestens 100 Nukleotide, mindestens 101 Nukleotide, mindestens 102 Nukleotide, mindestens 103 Nukleotide, mindestens 104 Nukleotide, mindestens 105 Nukleotide, mindestens 106 Nukleotide, mindestens 107 Nukleotide, mindestens 108 Nukleotide, mindestens 109 Nukleotide oder mindestens 110 Nukleotide lang ist.
  56. System nach einem der Ansprüche 30-55, wobei die erste einzelsträngige DNA- Sequenz und die zweite einzelsträngige DNA-Sequenz die gleichen Längen aufweisen.
  57. System nach einem der Ansprüche 30-56, wobei die erste einzelsträngige DNA- Sequenz und die zweite einzelsträngige DNA-Sequenz unterschiedliche Längen aufweisen.
  58. System nach einem der Ansprüche 30-57, wobei die Komplementaritätsregion mindestens 99 %, mindestens 95 %, mindestens 90 %, mindestens 85 %, mindestens 80 %, mindestens 75 %, mindestens 70 %, mindestens 65 %, mindestens 60 %, mindestens 55 %, mindestens 50 %, mindestens 45 %, mindestens 40 %, mindestens 35 %, mindestens 30 %, mindestens 25 %, mindestens 20 %, mindestens 15 % oder mindestens 10 % der Gesamtlänge der ersten einzelsträngigen DNA-Sequenz oder der zweiten einzelsträngigen DNA-Sequenz beträgt.
  59. System nach einem der Ansprüche 30-58, wobei die Komplementaritätsregion mindestens 5 Nukleotide, mindestens 6 Nukleotide, mindestens 7 Nukleotide, mindestens 8 Nukleotide, mindestens 9 Nukleotide, mindestens 10 Nukleotide, mindestens 11 Nukleotide, mindestens 12 Nukleotide, mindestens 13 Nukleotide, mindestens 14 Nukleotide, mindestens 15 Nukleotide, mindestens 16 Nukleotide, mindestens 17 Nukleotide, mindestens 18 Nukleotide, mindestens 19 Nukleotide, mindestens 20 Nukleotide, mindestens 21 Nukleotide, mindestens 22 Nukleotide, mindestens 23 Nukleotide, mindestens 24 Nukleotide, mindestens 25 Nukleotide, mindestens 26 Nukleotide, mindestens 27 Nukleotide, mindestens 28 Nukleotide, mindestens 29 Nukleotide, mindestens 30 Nukleotide, mindestens 31 Nukleotide, mindestens 32 Nukleotide, mindestens 33 Nukleotide, mindestens 34 Nukleotide, mindestens 35 Nukleotide, mindestens 36 Nukleotide, mindestens 37 Nukleotide, mindestens 38 Nukleotide, mindestens 39 Nukleotide, mindestens 40 Nukleotide, mindestens 41 Nukleotide, mindestens 42 Nukleotide, mindestens 43 Nukleotide, mindestens 44 Nukleotide, mindestens 45 Nukleotide, mindestens 46 Nukleotide, mindestens 47 Nukleotide, mindestens 48 Nukleotide, mindestens 49 Nukleotide, mindestens 50 Nukleotide, mindestens 51 Nukleotide, mindestens 52 Nukleotide, mindestens 53 Nukleotide, mindestens 54 Nukleotide, mindestens 55 Nukleotide, mindestens 56 Nukleotide, mindestens 57 Nukleotide, mindestens 58 Nukleotide, mindestens 59 Nukleotide, mindestens 60 Nukleotide, mindestens 61 Nukleotide, mindestens 62 Nukleotide, mindestens 63 Nukleotide, mindestens 64 Nukleotide, mindestens 65 Nukleotide, mindestens 66 Nukleotide, mindestens 67 Nukleotide, mindestens 68 Nukleotide, mindestens 69 Nukleotide, mindestens 70 Nukleotide, mindestens 71 Nukleotide, mindestens 72 Nukleotide, mindestens 73 Nukleotide, mindestens 74 Nukleotide, mindestens 75 Nukleotide, mindestens 76 Nukleotide, mindestens 77 Nukleotide, mindestens 78 Nukleotide, mindestens 79 Nukleotide, mindestens 80 Nukleotide, mindestens 81 Nukleotide, mindestens 82 Nukleotide, mindestens 83 Nukleotide, mindestens 84 Nukleotide, mindestens 85 Nukleotide, mindestens 86 Nukleotide, mindestens 87 Nukleotide, mindestens 88 Nukleotide, mindestens 89 Nukleotide, mindestens 90 Nukleotide, mindestens 91 Nukleotide, mindestens 92 Nukleotide, mindestens 93 Nukleotide, mindestens 94 Nukleotid, mindestens 95 Nukleotide, mindestens 96 Nukleotide, mindestens 97 Nukleotide, mindestens 98 Nukleotide, mindestens 99 Nukleotide, mindestens 100 Nukleotide, mindestens 101 Nukleotide, mindestens 102 Nukleotide, mindestens 103 Nukleotide, mindestens 104 Nukleotide, mindestens 105 Nukleotide, mindestens 106 Nukleotide, mindestens 107 Nukleotide, mindestens 108 Nukleotide, mindestens 109 Nukleotide oder mindestens 110 Nukleotide lang ist.
  60. System nach einem der Ansprüche 30-59, wobei die Komplementaritätsregion der ersten einzelsträngigen DNA-Sequenz und der zweiten einzelsträngigen DNA-Sequenz einen Duplex formen.
  61. System nach einem der Ansprüche 30-60, wobei die erste einzelsträngige DNA- Sequenz und die zweite einzelsträngige DNA-Sequenz jeweils einzelsträngige DNA-Stränge mit 3'-Enden sind.
  62. System nach Anspruch 54, wobei das Ersetzen der zusammenhängenden Region durch den Duplex, der den editierten Teil umfasst, zu einer Insertion, Deletion oder einem Ersetzen von DNA an der Zielstelle führt.
  63. Polynukleotid, welches das System nach einem der Ansprüche 1-62 kodiert.
  64. Polynukleotid, das den ersten und zweiten Prime-Editor nach einem der Ansprüche 1- 62 kodiert.
  65. Polynukleotid, das die erste und/oder zweite PEgRNA nach einem der Ansprüche 1-62 kodiert.
  66. Polynukleotid, das die erste und/oder zweite PEgRNA nach einem der Ansprüche 30- 62 kodiert.
  67. Polynukleotid, das die erste und zweite PEgRNA nach einem der Ansprüche 1-29 kodiert.
  68. Polynukleotid, das die erste und zweite PEgRNA nach einem der Ansprüche 30-62 kodiert.
  69. Vektor, der ein Polynukleotid nach einem der Ansprüche 63-68 umfasst.
  70. Zelle, die ein Polynukleotid nach einem der Ansprüche 63-68 oder einen Vektor nach Anspruch 69 umfasst.
  71. Pharmazeutische Zusammensetzung, die ein Polynukleotid nach einem der Ansprüche 63-68, einen Vektor nach Anspruch 69 oder eine Zelle nach Anspruch 70 und einen pharmazeutisch verträglichen Hilfsstoff umfasst.
  72. Kit, das ein Polynukleotid nach einem der Ansprüche 63-68, oder einen Vektor nach Anspruch 69 und Anweisungen für das gleichzeitige Editieren beider Stränge einer doppelsträngigen DNA-Sequenz an der zu editierenden Zielstelle umfasst.
  73. Verfahren zum gleichzeitigen Editieren eines ersten und eines zweiten komplementären Strangs einer doppelsträngigen DNA-Sequenz an der Zielstelle, besagtes Verfahren umfasst das Inkontaktbringen der doppelsträngigen DNA-Sequenz mit einem Paar Prime-Editor- Komplexe, wobei das Paar Folgendes umfasst: a. einen ersten Prime-Editor-Komplex, der Folgendes umfasst: i.einen ersten Prime-Editor, der ein erstes Nukleinsäure-programmierbares DNA- Bindungsprotein (napDNAbp) umfasst, und ein erstes Polypeptid, das eine RNA-abhängige DNA-Polymeraseaktivität umfasst; und ii.eine erste Prime-Editing-Guide-RNA (erste PEgRNA), die an eine erste Bindungsstelle auf einem ersten Strang der genomischen DNA-Sequenz stromaufwärts der Zielstelle anbindet; b. einen zweiten Prime-Editor-Komplex, der Folgendes umfasst: i.einen zweiten Prime-Editor, der ein zweites Nukleinsäure-programmierbares DNA- Bindungsprotein (zweites napDNAbp) umfasst, und ein zweites Polypeptid, das eine RNA- abhängige DNA-Polymeraseaktivität umfasst; und ii.eine zweite Prime-Editing-Guide-RNA (zweite PEgRNA), die an eine zweite Bindungsstelle auf einem zweiten Strang der genomischen DNA-Sequenz stromabwärts der Zielstelle anbindet; wobei der erste Prime-Editor-Komplex einen ersten Nick bei einer Sequenz erzeugt, die der ersten Bindungsstelle komplementär ist, und daraufhin die Polymerisation einer ersten einzelsträngigen DNA-Sequenz mit 3'-Ende ausgehend vom 5'-Ende, das durch den ersten Nick entstand, hervorruft; wobei der zweite Prime-Editor-Komplex einen zweiten Nick bei einer Sequenz erzeugt, die der zweiten Bindungsstelle komplementär ist, und daraufhin die Polymerisation einer zweiten einzelsträngigen DNA-Sequenz mit 3'-Ende ausgehend vom 5'-Ende, das durch den zweiten Nick entstand, hervorruft; wobei die erste einzelsträngige DNA-Sequenz und die zweite einzelsträngige DNA-Sequenz reverse Komplemente für zumindest eine Komplementaritätsregion sind und einen Duplex formen, der ein Edit enthält; und wobei der Duplex den genickten ersten und zweiten komplementären Strang der doppelsträngigen DNA-Sequenz ersetzt.
  74. Verfahren nach Anspruch 73, wobei der Prime-Editor des ersten Prime-Editor- Komplexes, der zweite Prime-Editor-Komplex oder der erste und der zweite Prime-Editor- Komplex ein Fusionsprotein ist, welches das napDNAbp und das Polypeptid mit RNA- abhängiger DNA-Polymeraseaktivität umfasst.
  75. Verfahren nach Anspruch 73, wobei der erste Prime-Editor-Komplex und der zweite Prime-Editor-Komplex denselben Prime-Editor umfassen.
  76. Verfahren nach Anspruch 73, wobei der erste Prime-Editor-Komplex und der zweite Prime-Editor-Komplex einen unterschiedlichen Prime-Editor umfassen.
  77. Verfahren nach einem der Ansprüche 73-76, wobei das erste und/oder zweite napDNAbp eine Cas9-Domäne oder Variante ebendieser ist.
  78. Verfahren nach einem der Ansprüche 73-77, wobei das erste und/oder zweite napDNAbp eine Nuklease-aktive Cas9-Domäne, eine Nuklease-inaktive Cas9-Domäne, eine Cas9-Nickase-Domäne oder eine Variante ebendieser ist.
  79. Verfahren nach einem der Ansprüche 73-78, wobei das erste und/oder zweite napDNAbp aus der Gruppe bestehend aus: Cas9, Cas12e, Cas12d, Cas12a, Cas12b1, Cas13a, Cas12c, CasX, CasY und Argonaute.
  80. Verfahren nach einem der Ansprüche 73-79, wobei das erste und/oder zweite napDNAbp eine Nickase-Aktivität aufweist.
  81. Verfahren nach einem der Ansprüche 73-80, wobei das erste und/oder zweite napDNAbp eine beliebige Aminosäuresequenz von SEQ-ID-NR: 18-88 umfasst, oder eine Aminosäuresequenz umfasst, die mindestens 80 %, 85 %, 90 %, 95 % oder 99 % Sequenzidentität mit einer beliebigen SEQ-ID-NR: 18-88 hat.
  82. Verfahren nach einem der Ansprüche 73-81, wobei das erste und/oder zweite Polypeptid mit einer RNA-abhängigen DNA-Polymeraseaktivität eine reverse Transkriptase ist.
  83. Verfahren nach einem der Ansprüche 73-82, wobei das erste und/oder zweite Polypeptid mit einer RNA-abhängigen DNA-Polymeraseaktivität eine Aminosäuresequenz mit einer beliebigen von SEQ-ID-NR: 89-100, 105-122, 128-129, 132, 139, 143, 149, 154, 159 und 700-766 umfasst, oder eine Aminosäuresequenz umfasst, die mindestens 80 %, 85 %, 90 %, 95 % oder 99 % Sequenzidentität mit einer beliebigen von SEQ-ID-NR: 89-100, 105-122, 128- 129 und 132 hat.
  84. Verfahren nach einem der Ansprüche 73-83, wobei der erste Prime-Editor überdies einen Linker umfasst, der das erste napDNAbp und das erste Polypeptid mit RNA-abhängiger DNA-Polymeraseaktivität verknüpft, und/oder der zweite Prime-Editor überdies einen Linker umfasst, der das zweite napDNAbp und das zweite Polypeptid mit RNA-abhängiger DNA- Polymeraseaktivität verknüpft.
  85. Verfahren nach Anspruch 84, wobei der Linker eine beliebige Aminosäuresequenz von SEQ-ID-NR: 166-177 umfasst, oder eine Aminosäuresequenz umfasst, die mindestens 80 %, 85 %, 90 %, 95 % oder 99 % Sequenzidentität mit einer beliebigen SEQ-ID-NR: 166-177 hat.
  86. Verfahren nach Anspruch 84 oder 85, wobei der Linker eine Länge von 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 oder 50 Aminosäuren hat.
  87. Verfahren nach einem der Ansprüche 73-86, wobei die erste und/oder zweite PEgRNA eine beliebige Nukleotidsequenz von SEQ-ID-NR: 325-330, 499-505, 101-104, 181-183 und 223-244 umfasst, oder eine Nukleotidsequenz umfasst, die mindestens 80 %, 85 %, 90 %, 95 % oder 99 % Sequenzidentität mit einer beliebigen von SEQ-ID-NR: 325-330, 499-505, 101-104, 181-183 und 223-244 hat.
  88. Verfahren nach einem der Ansprüche 73-87, wobei die erste und/oder zweite PEgRNA eine beliebige Nukleotidsequenz von SEQ-ID-NR: 325-330, 499-505, 101-104, 181-183 und 223-244 umfasst, oder eine Nukleotidsequenz umfasst, die mindestens 80 %, 85 %, 90 %, 95 % oder 99 % Sequenzidentität mit einer beliebigen von SEQ-ID-NR: 325-330, 499-505, 101-104, 181-183 und 223-244 hat.
  89. Verfahren nach einem der Ansprüche 73-88, wobei die erste Spacer-Sequenz des ersten Prime-Editor-Komplexes an eine erste Bindungsstelle auf einem ersten Strang der doppelsträngigen DNA-Sequenz stromaufwärts der zu editierenden Zielstelle anbindet.
  90. Verfahren nach einem der Ansprüche 73-89, wobei die zweite Spacer-Sequenz des zweiten Prime-Editor-Komplexes an eine zweite Bindungsstelle auf einem zweiten Strang der doppelsträngigen DNA-Sequenz stromabwärts der zu editierenden Zielstelle anbindet.
  91. Verfahren nach Anspruch 90, wobei das Anbinden der ersten und zweiten Spacer- Sequenz des ersten und zweiten Prime-Editor-Komplexes in Präsenz einer PAM-Sequenz zum Nicking des ersten und zweiten Strangs führt, jeweils an einer Nick-Stelle, die proximal zur PAM-Sequenz jedes Strangs beim napDNAbp der beiden ersten und zweiten Prime-Editor- Komplexe liegt.
  92. Verfahren nach Anspruch 91, wobei die erste und zweite Bindungsstelle zwei Enden einer zusammenhängenden Region doppelsträngiger DNA definieren, welche die zu editierende Zielstelle umfasst.
  93. Verfahren nach Anspruch 92, wobei die zusammenhängende Region mindestens 10 Nukleobasenpaare, mindestens 11 Nukleobasenpaare, mindestens 12 Nukleobasenpaare, mindestens 13 Nukleobasenpaare, mindestens 14 Nukleobasenpaare, mindestens 15 Nukleobasenpaare, mindestens 16 Nukleobasenpaare, mindestens 17 Nukleobasenpaare, mindestens 18 Nukleobasenpaare, mindestens 19 Nukleobasenpaare, mindestens 20 Nukleobasenpaare, mindestens 21 Nukleobasenpaare, mindestens 22 Nukleobasenpaare, mindestens 23 Nukleobasenpaare, mindestens 24 Nukleobasenpaare, mindestens 25 Nukleobasenpaare, mindestens 26 Nukleobasenpaare, mindestens 27 Nukleobasenpaare, mindestens 28 Nukleobasenpaare, mindestens 29 Nukleobasenpaare, mindestens 30 Nukleobasenpaare, mindestens 31 Nukleobasenpaare, mindestens 32 Nukleobasenpaare, mindestens 33 Nukleobasenpaare, mindestens 34 Nukleobasenpaare, mindestens 35 Nukleobasenpaare, mindestens 36 Nukleobasenpaare, mindestens 37 Nukleobasenpaare, mindestens 38 Nukleobasenpaare, mindestens 39 Nukleobasenpaare, mindestens 40 Nukleobasenpaare, mindestens 41 Nukleotide, mindestens 42 Nukleotide, mindestens 43 Nukleotide, mindestens 44 Nukleotide, mindestens 45 Nukleotide, mindestens 46 Nukleotide, mindestens 47 Nukleotide, mindestens 48 Nukleotide, mindestens 49 Nukleotide, mindestens 50 Nukleotide, mindestens 51 Nukleotide, mindestens 52 Nukleotide, mindestens 53 Nukleotide, mindestens 54 Nukleotide, mindestens 55 Nukleotide, mindestens 56 Nukleotide, mindestens 57 Nukleotide, mindestens 58 Nukleotide, mindestens 59 Nukleotide, mindestens 60 Nukleotide, mindestens 61 Nukleotide, mindestens 62 Nukleotide, mindestens 63 Nukleotide, mindestens 64 Nukleotide, mindestens 65 Nukleotide, mindestens 66 Nukleotide, mindestens 67 Nukleotide, mindestens 68 Nukleotide, mindestens 69 Nukleotide, mindestens 70 Nukleotide, mindestens 71 Nukleotide, mindestens 72 Nukleotide, mindestens 73 Nukleotide, mindestens 74 Nukleotide, mindestens 75 Nukleotide, mindestens 76 Nukleotide, mindestens 77 Nukleotide, mindestens 78 Nukleotide, mindestens 79 Nukleotide, mindestens 80 Nukleotide, mindestens 81 Nukleotide, mindestens 82 Nukleotide, mindestens 83 Nukleotide, mindestens 84 Nukleotide, mindestens 85 Nukleotide, mindestens 86 Nukleotide, mindestens 87 Nukleotide, mindestens 88 Nukleotide, mindestens 89 Nukleotide, mindestens 90 Nukleotide, mindestens 91 Nukleotide, mindestens 92 Nukleotide, mindestens 93 Nukleotide, mindestens 94 Nukleotide, mindestens 95 Nukleotide, mindestens 96 Nukleotide, mindestens 97 Nukleotide, mindestens 98 Nukleotide, mindestens 99 Nukleotide, mindestens 100 Nukleotide, mindestens 101 Nukleotide, mindestens 102 Nukleotide, mindestens 103 Nukleotide, mindestens 104 Nukleotide, mindestens 105 Nukleotide, mindestens 106 Nukleotide, mindestens 107 Nukleotide, mindestens 108 Nukleotide, mindestens 109 Nukleotide oder mindestens 110 Nukleotide lang ist.
  94. Verfahren nach Anspruch 92 oder 93, wobei die zusammenhängende Region von dem Duplex ersetzt wird, der den editierten Teil enthält.
  95. Verfahren nach einem der Ansprüche 73-94, wobei die erste und/oder zweite DNA- Synthese-Template mindestens 1 Nukleotid, mindestens 2 Nukleotide, mindestens 3 Nukleotide, mindestens 4 Nukleotide, mindestens 5 Nukleotide, mindestens 6 Nukleotide, mindestens 7 Nukleotide, mindestens 8 Nukleotide, mindestens 9 Nukleotide, mindestens 10 Nukleotide, mindestens 11 Nukleotide, mindestens 12 Nukleotide, mindestens 13 Nukleotide, mindestens 14 Nukleotide, mindestens 15 Nukleotide, mindestens 16 Nukleotide, mindestens 17 Nukleotide, mindestens 18 Nukleotide, mindestens 19 Nukleotide, mindestens 20 Nukleotide, mindestens 21 Nukleotide, mindestens 22 Nukleotide, mindestens 23 Nukleotide, mindestens 24 Nukleotide, mindestens 25 Nukleotide, mindestens 26 Nukleotide, mindestens 27 Nukleotide, mindestens 28 Nukleotide, mindestens 29 Nukleotide, mindestens 30 Nukleotide, mindestens 31 Nukleotide, mindestens 32 Nukleotide, mindestens 33 Nukleotide, mindestens 34 Nukleotide, mindestens 35 Nukleotide, mindestens 36 Nukleotide, mindestens 37 Nukleotide, mindestens 38 Nukleotide, mindestens 39 Nukleotide, mindestens 40 Nukleotide, mindestens 41 Nukleotide, mindestens 42 Nukleotide, mindestens 43 Nukleotide, mindestens 44 Nukleotide, mindestens 45 Nukleotide, mindestens 46 Nukleotide, mindestens 47 Nukleotide, mindestens 48 Nukleotide, mindestens 49 Nukleotide, mindestens 50 Nukleotide, mindestens 51 Nukleotide, mindestens 52 Nukleotide, mindestens 53 Nukleotide, mindestens 54 Nukleotide, mindestens 55 Nukleotide, mindestens 56 Nukleotide, mindestens 57 Nukleotide, mindestens 58 Nukleotide, mindestens 59 Nukleotide, mindestens 60 Nukleotide, mindestens 61 Nukleotide, mindestens 62 Nukleotide, mindestens 63 Nukleotide, mindestens 64 Nukleotide, mindestens 65 Nukleotide, mindestens 66 Nukleotide, mindestens 67 Nukleotide, mindestens 68 Nukleotide, mindestens 69 Nukleotide, mindestens 70 Nukleotide, mindestens 71 Nukleotide, mindestens 72 Nukleotide, mindestens 73 Nukleotide, mindestens 74 Nukleotide, mindestens 75 Nukleotide, mindestens 76 Nukleotide, mindestens 77 Nukleotide, mindestens 78 Nukleotide, mindestens 79 Nukleotide, mindestens 80 Nukleotide, mindestens 81 Nukleotide, mindestens 82 Nukleotide, mindestens 83 Nukleotide, mindestens 84 Nukleotide, mindestens 85 Nukleotide, mindestens 86 Nukleotide, mindestens 87 Nukleotide, mindestens 88 Nukleotide, mindestens 89 Nukleotide, mindestens 90 Nukleotid, mindestens 91 Nukleotide, mindestens 92 Nukleotide, mindestens 93 Nukleotide, mindestens 94 Nukleotide, mindestens 95 Nukleotide, mindestens 96 Nukleotide, mindestens 97 Nukleotide, mindestens 98 Nukleotide, mindestens 99 Nukleotide, mindestens 100 Nukleotide, mindestens 101 Nukleotide, mindestens 102 Nukleotide, mindestens 103 Nukleotide, mindestens 104 Nukleotide, mindestens 105 Nukleotide, mindestens 106 Nukleotide, mindestens 107 Nukleotide, mindestens 108 Nukleotide, mindestens 109 Nukleotide oder mindestens 110 Nukleotide lang ist.
  96. Verfahren nach einem der Ansprüche 73-95, wobei die erste einzelsträngige DNA- Sequenz und die zweite einzelsträngige DNA-Sequenz die gleichen Längen aufweisen.
  97. Verfahren nach einem der Ansprüche 73-96, wobei die erste einzelsträngige DNA- Sequenz und die zweite einzelsträngige DNA-Sequenz unterschiedliche Längen aufweisen.
  98. Verfahren nach einem der Ansprüche 73-97, wobei die Komplementaritätsregion mindestens 99 %, mindestens 95 %, mindestens 90 %, mindestens 85 %, mindestens 80 %, mindestens 75 %, mindestens 70 %, mindestens 65 %, mindestens 60 %, mindestens 55 %, mindestens 50 %, mindestens 45 %, mindestens 40 %, mindestens 35 %, mindestens 30 %, mindestens 25 %, mindestens 20 %, mindestens 15 % oder mindestens 10 % der Gesamtlänge der ersten einzelsträngigen DNA-Sequenz oder der zweiten einzelsträngigen DNA-Sequenz beträgt.
  99. Verfahren nach einem der Ansprüche 73-98, wobei die Komplementaritätsregion mindestens 5 Nukleotide, mindestens 6 Nukleotide, mindestens 7 Nukleotide, mindestens 8 Nukleotide, mindestens 9 Nukleotide, mindestens 10 Nukleotide, mindestens 11 Nukleotide, mindestens 12 Nukleotide, mindestens 13 Nukleotide, mindestens 14 Nukleotide, mindestens 15 Nukleotide, mindestens 16 Nukleotide, mindestens 17 Nukleotide, mindestens 18 Nukleotide, mindestens 19 Nukleotide, mindestens 20 Nukleotide, mindestens 21 Nukleotide, mindestens 22 Nukleotide, mindestens 23 Nukleotide, mindestens 24 Nukleotide, mindestens 25 Nukleotide, mindestens 26 Nukleotide, mindestens 27 Nukleotide, mindestens 28 Nukleotide, mindestens 29 Nukleotide, mindestens 30 Nukleotide, mindestens 31 Nukleotide, mindestens 32 Nukleotide, mindestens 33 Nukleotide, mindestens 34 Nukleotide, mindestens 35 Nukleotide, mindestens 36 Nukleotide, mindestens 37 Nukleotide, mindestens 38 Nukleotide, mindestens 39 Nukleotide, mindestens 40 Nukleotide, mindestens 41 Nukleotide, mindestens 42 Nukleotide, mindestens 43 Nukleotide, mindestens 44 Nukleotide, mindestens 45 Nukleotide, mindestens 46 Nukleotide, mindestens 47 Nukleotide, mindestens 48 Nukleotide, mindestens 49 Nukleotide, mindestens 50 Nukleotide, mindestens 51 Nukleotide, mindestens 52 Nukleotide, mindestens 53 Nukleotide, mindestens 54 Nukleotide, mindestens 55 Nukleotide, mindestens 56 Nukleotide, mindestens 57 Nukleotide, mindestens 58 Nukleotide, mindestens 59 Nukleotide, mindestens 60 Nukleotide, mindestens 61 Nukleotide, mindestens 62 Nukleotide, mindestens 63 Nukleotide, mindestens 64 Nukleotide, mindestens 65 Nukleotide, mindestens 66 Nukleotide, mindestens 67 Nukleotide, mindestens 68 Nukleotide, mindestens 69 Nukleotide, mindestens 70 Nukleotide, mindestens 71 Nukleotide, mindestens 72 Nukleotide, mindestens 73 Nukleotide, mindestens 74 Nukleotide, mindestens 75 Nukleotide, mindestens 76 Nukleotide, mindestens 77 Nukleotide, mindestens 78 Nukleotide, mindestens 79 Nukleotide, mindestens 80 Nukleotide, mindestens 81 Nukleotide, mindestens 82 Nukleotide, mindestens 83 Nukleotide, mindestens 84 Nukleotide, mindestens 85 Nukleotide, mindestens 86 Nukleotide, mindestens 87 Nukleotide, mindestens 88 Nukleotide, mindestens 89 Nukleotide, mindestens 90 Nukleotide, mindestens 91 Nukleotide, mindestens 92 Nukleotide, mindestens 93 Nukleotide, mindestens 94 Nukleotid, mindestens 95 Nukleotide, mindestens 96 Nukleotide, mindestens 97 Nukleotide, mindestens 98 Nukleotide, mindestens 99 Nukleotide, mindestens 100 Nukleotide, mindestens 101 Nukleotide, mindestens 102 Nukleotide, mindestens 103 Nukleotide, mindestens 104 Nukleotide, mindestens 105 Nukleotide, mindestens 106 Nukleotide, mindestens 107 Nukleotide, mindestens 108 Nukleotide, mindestens 109 Nukleotide oder mindestens 110 Nukleotide lang ist und entweder kürzer oder gleich der Länge der gewünschten DNA-Sequenz und ihres Komplements ist.
  100. Verfahren nach einem der Ansprüche 73-99, wobei die Komplementaritätsregion der ersten einzelsträngigen DNA-Sequenz und der zweiten einzelsträngigen DNA-Sequenz den Duplex formen.
  101. Verfahren nach einem der Ansprüche 73-100, wobei die erste einzelsträngige DNA- Sequenz und die zweite einzelsträngige DNA-Sequenz jeweils einzelsträngige DNA-Stränge mit 3'-Enden sind.
  102. Verfahren nach Anspruch 94, wobei das Ersetzen der zusammenhängenden Region durch den Duplex, der den editierten Teil umfasst, zu einer Insertion, Deletion oder einem Ersetzen von DNA an der Zielstelle führt.
  103. Verfahren nach einem der Ansprüche 73-102, wobei der Duplex, der einen Edit umfasst, eine oder mehrere Rekombinasestellen umfasst.
  104. Verfahren nach Anspruch 103, das überdies das Bereitstellen einer Rekombinase umfasst, um ein Rekombinase-vermitteltes Editing der DNA-Sequenz an der zu editierenden Zielstelle zu fördern.
  105. PEgRNA-Paar zum Verwenden in Dual-Prime-Editing, wobei das Paar Folgendes umfasst: c. eine erste Prime-Editing-Guide-RNA (erste PEgRNA), die an eine erste Bindungsstelle auf einem ersten Strang einer doppelsträngigen DNA-Sequenz stromaufwärts der zu editierenden Zielstelle anbindet, wobei die erste PEgRNA eine erste Spacer-Sequenz, einen ersten gRNA-Kern, eine erste DNA-Synthese-Template und eine erste Primer-Bindungsstelle umfasst, wobei die erste DNA-Synthese-Template eine erste einzelsträngige DNA-Sequenz kodiert, die einen editierten Teil enthält; d. eine zweite Prime-Editing-Guide-RNA (zweite PEgRNA), die an eine zweite Bindungsstelle auf einem zweiten Strang einer doppelsträngigen DNA-Sequenz stromabwärts der zu editierenden Zielstelle anbindet, wobei die zweite PEgRNA eine zweite Spacer- Sequenz, einen zweiten gRNA-Kern, eine zweite DNA-Synthese-Template und eine zweite Primer-Bindungsstelle umfasst, wobei die zweite DNA-Synthese-Template eine zweite einzelsträngige DNA-Sequenz kodiert, die einen editierten Teil enthält, wobei die zweite einzelsträngige DNA-Sequenz eine Komplementaritätsregion mit der ersten einzelsträngigen DNA-Sequenz aufweist.
  106. PEgRNA-Paar nach Anspruch 105, wobei die erste PEgRNA folgende Struktur umfasst: 5'-[erste gRNA-Spacer-Sequenz]-[erster gRNA-Kern]-[erste DNA-Synthese-Template]-[erste Primer-Bindungsstelle]-3'; und wobei die zweite PEgRNA folgende Struktur umfasst: 5'-[zweite gRNA-Spacer-Sequenz]-[zweiter gRNA-Kern]-[zweite DNA-Synthese-Template]- [zweite Primer-Bindungsstelle]-3'.
  107. PEgRNAs-Paar nach Anspruch 105 oder 106, wobei die erste einzelsträngige DNA- Sequenz und die zweite einzelsträngige DNA-Sequenz einen Duplex bilden, der sich in an der zu editierende Zielstelle in die doppelsträngige DNA-Sequenz integriert.
  108. PEgRNA-Paar nach Anspruch 107, wobei die Integration des Duplex zu einer Insertion, Deletion oder einem Ersetzen von DNA an der Zielstelle führt.
  109. PEgRNA-Paar nach Anspruch 108, wobei die Insertion mindestens 1 Nukleotid, mindestens 2 Nukleotide, mindestens 3 Nukleotide, mindestens 4 Nukleotide, mindestens 5 Nukleotide, mindestens 6 Nukleotide, mindestens 7 Nukleotide, mindestens 8 Nukleotide, mindestens 9 Nukleotide, mindestens 10 Nukleotide, mindestens 11 Nukleotide, mindestens 12 Nukleotide, mindestens 13 Nukleotide, mindestens 14 Nukleotide, mindestens 15 Nukleotide, mindestens 16 Nukleotide, mindestens 17 Nukleotide, mindestens 18 Nukleotide, mindestens 19 Nukleotide, mindestens 20 Nukleotide, mindestens 21 Nukleotide, mindestens 22 Nukleotide, mindestens 23 Nukleotide, mindestens 24 Nukleotide, mindestens 25 Nukleotide, mindestens 26 Nukleotide, mindestens 27 Nukleotide, mindestens 28 Nukleotide, mindestens 29 Nukleotide, mindestens 30 Nukleotide, mindestens 31 Nukleotide, mindestens 32 Nukleotide, mindestens 33 Nukleotide, mindestens 34 Nukleotide, mindestens 35 Nukleotide, mindestens 36 Nukleotide, mindestens 37 Nukleotide, mindestens 38 Nukleotide, mindestens 39 Nukleotide, mindestens 40 Nukleotide, mindestens 41 Nukleotide, mindestens 42 Nukleotide, mindestens 43 Nukleotide, mindestens 44 Nukleotide, mindestens 45 Nukleotide, mindestens 46 Nukleotide, mindestens 47 Nukleotide, mindestens 48 Nukleotide, mindestens 49 Nukleotide, mindestens 50 Nukleotide, mindestens 51 Nukleotide, mindestens 52 Nukleotide, mindestens 53 Nukleotide, mindestens 54 Nukleotide, mindestens 55 Nukleotide, mindestens 56 Nukleotide, mindestens 57 Nukleotide, mindestens 58 Nukleotide, mindestens 59 Nukleotide, mindestens 60 Nukleotide, mindestens 61 Nukleotide, mindestens 62 Nukleotide, mindestens 63 Nukleotide, mindestens 64 Nukleotide, mindestens 65 Nukleotide, mindestens 66 Nukleotide, mindestens 67 Nukleotide, mindestens 68 Nukleotide, mindestens 69 Nukleotide, mindestens 70 Nukleotide, mindestens 71 Nukleotide, mindestens 72 Nukleotide, mindestens 73 Nukleotide, mindestens 74 Nukleotide, mindestens 75 Nukleotide, mindestens 76 Nukleotide, mindestens 77 Nukleotide, mindestens 78 Nukleotide, mindestens 79 Nukleotide, mindestens 80 Nukleotide, mindestens 81 Nukleotide, mindestens 82 Nukleotide, mindestens 83 Nukleotide, mindestens 84 Nukleotide, mindestens 85 Nukleotide, mindestens 86 Nukleotide, mindestens 87 Nukleotide, mindestens 88 Nukleotide, mindestens 89 Nukleotide, mindestens 90 Nukleotid, mindestens 91 Nukleotide, mindestens 92 Nukleotide, mindestens 93 Nukleotide, mindestens 94 Nukleotide, mindestens 95 Nukleotide, mindestens 96 Nukleotide, mindestens 97 Nukleotide, mindestens 98 Nukleotide, mindestens 99 Nukleotide, mindestens 100 Nukleotide, mindestens 101 Nukleotide, mindestens 102 Nukleotide, mindestens 103 Nukleotide, mindestens 104 Nukleotide, mindestens 105 Nukleotide, mindestens 106 Nukleotide, mindestens 107 Nukleotide, mindestens 108 Nukleotide, mindestens 109 Nukleotide oder mindestens 110 Nukleotide lang ist.
  110. PEgRNA-Paar nach Anspruch 108, wobei die Deletion mindestens 1 Nukleotid, mindestens 2 Nukleotide, mindestens 3 Nukleotide, mindestens 4 Nukleotide, mindestens 5 Nukleotide, mindestens 6 Nukleotide, mindestens 7 Nukleotide, mindestens 8 Nukleotide, mindestens 9 Nukleotide, mindestens 10 Nukleotide, mindestens 11 Nukleotide, mindestens 12 Nukleotide, mindestens 13 Nukleotide, mindestens 14 Nukleotide, mindestens 15 Nukleotide, mindestens 16 Nukleotide, mindestens 17 Nukleotide, mindestens 18 Nukleotide, mindestens 19 Nukleotide, mindestens 20 Nukleotide, mindestens 21 Nukleotide, mindestens 22 Nukleotide, mindestens 23 Nukleotide, mindestens 24 Nukleotide, mindestens 25 Nukleotide, mindestens 26 Nukleotide, mindestens 27 Nukleotide, mindestens 28 Nukleotide, mindestens 29 Nukleotide, mindestens 30 Nukleotide, mindestens 31 Nukleotide, mindestens 32 Nukleotide, mindestens 33 Nukleotide, mindestens 34 Nukleotide, mindestens 35 Nukleotide, mindestens 36 Nukleotide, mindestens 37 Nukleotide, mindestens 38 Nukleotide, mindestens 39 Nukleotide, mindestens 40 Nukleotide, mindestens 41 Nukleotide, mindestens 42 Nukleotide, mindestens 43 Nukleotide, mindestens 44 Nukleotide, mindestens 45 Nukleotide, mindestens 46 Nukleotide, mindestens 47 Nukleotide, mindestens 48 Nukleotide, mindestens 49 Nukleotide, mindestens 50 Nukleotide, mindestens 51 Nukleotide, mindestens 52 Nukleotide, mindestens 53 Nukleotide, mindestens 54 Nukleotide, mindestens 55 Nukleotide, mindestens 56 Nukleotide, mindestens 57 Nukleotide, mindestens 58 Nukleotide, mindestens 59 Nukleotide, mindestens 60 Nukleotide, mindestens 61 Nukleotide, mindestens 62 Nukleotide, mindestens 63 Nukleotide, mindestens 64 Nukleotide, mindestens 65 Nukleotide, mindestens 66 Nukleotide, mindestens 67 Nukleotide, mindestens 68 Nukleotide, mindestens 69 Nukleotide, mindestens 70 Nukleotide, mindestens 71 Nukleotide, mindestens 72 Nukleotide, mindestens 73 Nukleotide, mindestens 74 Nukleotide, mindestens 75 Nukleotide, mindestens 76 Nukleotide, mindestens 77 Nukleotide, mindestens 78 Nukleotide, mindestens 79 Nukleotide, mindestens 80 Nukleotide, mindestens 81 Nukleotide, mindestens 82 Nukleotide, mindestens 83 Nukleotide, mindestens 84 Nukleotide, mindestens 85 Nukleotide, mindestens 86 Nukleotide, mindestens 87 Nukleotide, mindestens 88 Nukleotide, mindestens 89 Nukleotide, mindestens 90 Nukleotid, mindestens 91 Nukleotide, mindestens 92 Nukleotide, mindestens 93 Nukleotide, mindestens 94 Nukleotide, mindestens 95 Nukleotide, mindestens 96 Nukleotide, mindestens 97 Nukleotide, mindestens 98 Nukleotide, mindestens 99 Nukleotide, mindestens 100 Nukleotide, mindestens 101 Nukleotide, mindestens 102 Nukleotide, mindestens 103 Nukleotide, mindestens 104 Nukleotide, mindestens 105 Nukleotide, mindestens 106 Nukleotide, mindestens 107 Nukleotide, mindestens 108 Nukleotide, mindestens 109 Nukleotide oder mindestens 110 Nukleotide lang ist.
  111. PEgRNA-Paar nach Anspruch 108, wobei der Ersatz mindestens 1 Nukleotid, mindestens 2 Nukleotide, mindestens 3 Nukleotide, mindestens 4 Nukleotide, mindestens 5 Nukleotide, mindestens 6 Nukleotide, mindestens 7 Nukleotide, mindestens 8 Nukleotide, mindestens 9 Nukleotide, mindestens 10 Nukleotide, mindestens 11 Nukleotide, mindestens 12 Nukleotide, mindestens 13 Nukleotide, mindestens 14 Nukleotide, mindestens 15 Nukleotide, mindestens 16 Nukleotide, mindestens 17 Nukleotide, mindestens 18 Nukleotide, mindestens 19 Nukleotide, mindestens 20 Nukleotide, mindestens 21 Nukleotide, mindestens 22 Nukleotide, mindestens 23 Nukleotide, mindestens 24 Nukleotide, mindestens 25 Nukleotide, mindestens 26 Nukleotide, mindestens 27 Nukleotide, mindestens 28 Nukleotide, mindestens 29 Nukleotide, mindestens 30 Nukleotide, mindestens 31 Nukleotide, mindestens 32 Nukleotide, mindestens 33 Nukleotide, mindestens 34 Nukleotide, mindestens 35 Nukleotide, mindestens 36 Nukleotide, mindestens 37 Nukleotide, mindestens 38 Nukleotide, mindestens 39 Nukleotide, mindestens 40 Nukleotide, mindestens 41 Nukleotide, mindestens 42 Nukleotide, mindestens 43 Nukleotide, mindestens 44 Nukleotide, mindestens 45 Nukleotide, mindestens 46 Nukleotide, mindestens 47 Nukleotide, mindestens 48 Nukleotide, mindestens 49 Nukleotide, mindestens 50 Nukleotide, mindestens 51 Nukleotide, mindestens 52 Nukleotide, mindestens 53 Nukleotide, mindestens 54 Nukleotide, mindestens 55 Nukleotide, mindestens 56 Nukleotide, mindestens 57 Nukleotide, mindestens 58 Nukleotide, mindestens 59 Nukleotide, mindestens 60 Nukleotide, mindestens 61 Nukleotide, mindestens 62 Nukleotide, mindestens 63 Nukleotide, mindestens 64 Nukleotide, mindestens 65 Nukleotide, mindestens 66 Nukleotide, mindestens 67 Nukleotide, mindestens 68 Nukleotide, mindestens 69 Nukleotide, mindestens 70 Nukleotide, mindestens 71 Nukleotide, mindestens 72 Nukleotide, mindestens 73 Nukleotide, mindestens 74 Nukleotide, mindestens 75 Nukleotide, mindestens 76 Nukleotide, mindestens 77 Nukleotide, mindestens 78 Nukleotide, mindestens 79 Nukleotide, mindestens 80 Nukleotide, mindestens 81 Nukleotide, mindestens 82 Nukleotide, mindestens 83 Nukleotide, mindestens 84 Nukleotide, mindestens 85 Nukleotide, mindestens 86 Nukleotide, mindestens 87 Nukleotide, mindestens 88 Nukleotide, mindestens 89 Nukleotide, mindestens 90 Nukleotid, mindestens 91 Nukleotide, mindestens 92 Nukleotide, mindestens 93 Nukleotide, mindestens 94 Nukleotide, mindestens 95 Nukleotide, mindestens 96 Nukleotide, mindestens 97 Nukleotide, mindestens 98 Nukleotide, mindestens 99 Nukleotide, mindestens 100 Nukleotide, mindestens 101 Nukleotide, mindestens 102 Nukleotide, mindestens 103 Nukleotide, mindestens 104 Nukleotide, mindestens 105 Nukleotide, mindestens 106 Nukleotide, mindestens 107 Nukleotide, mindestens 108 Nukleotide, mindestens 109 Nukleotide oder mindestens 110 Nukleotide lang ist.
  112. Polynukleotid, das ein PEgRNA-Paar nach einem der Ansprüche 105-111 kodiert.
  113. Vektor, der das Polynukleotid aus Anspruch 112 umfasst, für die Expression des PEgRNA-Paares in einer Zelle.
  114. Zelle, die den Vektor nach Anspruch 113 umfasst.
  115. Pharmazeutische Zusammensetzung, die ein PEgRNA-Paar nach einem der Ansprüche 105-111, einen Vektor nach Anspruch 113 oder eine Zelle nach Anspruch 114 und einen pharmazeutisch verträglichen Hilfsstoff umfasst.
  116. Paar Prime-Editor-Komplexe, wobei das Paar Folgendes umfasst: e. einen ersten Prime-Editor-Komplex, der Folgendes umfasst: i.einen ersten Prime-Editor, der ein erstes Nukleinsäure-programmierbares DNA- Bindungsprotein (napDNAbp) umfasst, und ein erstes Polypeptid, das eine RNA-abhängige DNA-Polymeraseaktivität umfasst; und ii.eine erste Prime-Editing-Guide-RNA (erste PEgRNA), die an eine erste Zielsequenz auf einem ersten Strang der genomischen DNA-Sequenz stromaufwärts der Zielstelle anbindet; f. einen zweiten Prime-Editor-Komplex, der Folgendes umfasst: i.einen zweiten Prime-Editor, der ein zweites Nukleinsäure-programmierbares DNA- Bindungsprotein (zweites napDNAbp) umfasst, und ein zweites Polypeptid, das eine RNA- abhängige DNA-Polymeraseaktivität umfasst; und ii.eine zweite Prime-Editing-Guide-RNA (zweite PEgRNA), die an eine zweite Zielsequenz auf einem zweiten Strang der genomischen DNA-Sequenz stromabwärts der Zielstelle anbindet.
  117. Paar Prime-Editor-Komplexe nach Anspruch 116, wobei der Prime-Editor des ersten Prime-Editor-Komplexes, der zweite Prime-Editor-Komplex oder der erste und der zweite Prime-Editor-Komplex ein Fusionsprotein ist, welches das napDNAbp und das Polypeptid mit RNA-abhängiger DNA-Polymeraseaktivität umfasst.
  118. Polynukleotid, das ein Paar Prime-Editor-Komplexe nach Anspruch 116 oder 117 kodiert.
  119. Vektor, der das Polynukleotid aus Anspruch 118 umfasst, für die Expression der Prime- Editor-Komplexe in einer Zelle.
  120. Zelle, die den Vektor nach Anspruch 119 umfasst.
  121. Pharmazeutische Zusammensetzung, die ein Paar Prime-Editor-Komplexe nach Anspruch 116 oder 117, einen Vektor nach Anspruch 119 oder eine Zelle nach Anspruch 120 und einen pharmazeutisch verträglichen Hilfsstoff umfasst.
  122. System nach einem der Ansprüche 1-62, oder Verfahren nach einem der Ansprüche 73- 104, wobei die Integration des Duplex, der den editierten Teil umfasst, zu einer Insertion, Deletion oder einem Ersetzen von DNA an der Zielstelle führt.
  123. System oder Verfahren nach Anspruch 122, wobei die Insertion ein Peptid-Tag ist.
  124. System oder Verfahren nach Anspruch 123, wobei das Peptid-Tag ein Polyhistidin ist (z. B. HHHHHH) (SEQ-ID-NR: 252-262), FLAG (z. B. DYKDDDDK) (SEQ-ID-NR.: 2), V5 (z. B. GKPIPNPLLGLDST) (SEQ-ID-NR: 3), GCN4, HA (z. B. YPYDVPDYA) (SEQ-ID- NR: 5), Myc (z. B. EQKLISEED) (SEQ-ID-NR: 6) oder GST.
  125. System oder Verfahren nach Anspruch 123, wobei das Peptid-Tag eine Aminosäuresequenz aufweist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus SEQ-ID-NR: 1-6, 245-249, 252-262, 264-273, 275-276, 281, 278-288 und 622 besteht.
  126. System oder Verfahren nach Anspruch 122, wobei die Insertion ein Immunepitop-Tag ist.
  127. System oder Verfahren nach Anspruch 126, wobei das Immunepitop-Tag aus folgender Gruppe ausgewählt ist: Tetanustoxoid (SEQ-ID-NR: 396); Diphtherie-Toxin-Mutante CRM197 (SEQ-ID-NR: 630); Mumps-Immunepitop 1 (SEQ-ID-NR: 400); Mumps- Immunepitop 2 (SEQ-ID-NR: 402); Mumps-Immunepitop 3 (SEQ-ID-NR: 404); Rötelnvirus (SEQ-ID-NR: 406); Hämagglutinin (SEQ-ID-NR: 408); Neuraminidase (SEQ-ID-NR: 410); TAP1 (SEQ-ID-NR: 412); TAP2 (SEQ-ID-NR: 414); Hämagglutinin-Epitope zu Klasse IHLA (SEQ-ID-NR: 416); Neuraminidase-Epitope zu Klasse 1 HLA (SEQ-ID-NR: 418); Hämagglutinin-Epitope zu Klasse II HLA (SEQ-ID-NR: 420); Neuraminidase-Epitope zu Klasse II HLA (SEQ-ID-NR: 422); Hämagglutinin-Epitop H5N1-gebundene Klasse I und Klasse II HLA (SEQ-ID-NR: 424); und Neuraminidase-Epitop H5N1-gebundene Klasse I und Klasse II HLA (SEQ-ID-NR: 426).
  128. System oder Verfahren nach Anspruch 122, wobei die Insertion eine Dimerisierungsdomäne ist.
  129. System oder Verfahren nach Anspruch 128, wobei die Dimerisierungsdomäne eine Kleinmolekül-Bindungsdomäne ist, von FKBP12 mit SEQ-ID-NR: 488, FKBP12-F36V mit SEQ-ID-NR: 489, oder Cyclophilin mit SEQ-ID-NR: 490 oder 493-494.
  130. System zum gleichzeitigen Editieren beider Stränge einer doppelsträngigen DNA- Sequenz an einer zu editierenden Zielstelle, wobei das System Folgendes umfasst: a) einen ersten Prime-Editor-Komplex, der Folgendes umfasst: i. einen ersten Prime-Editor, der ein erstes Nukleinsäure-programmierbares DNA- Bindungsprotein (erstes napDNAbp) umfasst, und ein erstes Polypeptid, das eine RNA- abhängige DNA-Polymeraseaktivität umfasst; und ii.eine erste Prime-Editing-Guide-RNA (erste PEgRNA), die an eine erste Bindungsstelle auf einem ersten Strang der doppelsträngigen DNA-Sequenz stromaufwärts der zu editierenden Zielstelle anbindet; b) einen zweiten Prime-Editor-Komplex, der Folgendes umfasst: i.einen zweiten Prime-Editor, der ein zweites Nukleinsäure-programmierbares DNA- Bindungsprotein (zweites napDNAbp) umfasst, und ein zweites Polypeptid, das eine RNA- abhängige DNA-Polymeraseaktivität umfasst; und ii.eine zweite Prime-Editing-Guide-RNA (zweite PEgRNA), die an eine zweite Bindungsstelle auf einem zweiten Strang der doppelsträngigen DNA-Sequenz stromaufwärts der zu editierenden Zielstelle anbindet; c) einen dritten Prime-Editor-Komplex, der Folgendes umfasst: i.einen dritten Prime-Editor, der ein drittes Nukleinsäure-programmierbares DNA- Bindungsprotein (drittes napDNAbp) umfasst, und ein drittes Polypeptid, das eine RNA- abhängige DNA-Polymeraseaktivität umfasst; und ii.eine dritte Prime-Editing-Guide-RNA (dritte PEgRNA), die an eine dritte Bindungsstelle auf dem ersten Strang der doppelsträngigen DNA-Sequenz stromabwärts der zu editierenden Zielstelle anbindet; d) einen vierten Prime-Editor-Komplex, der Folgendes umfasst: i.einen vierten Prime-Editor, der ein viertes Nukleinsäure-programmierbares DNA- Bindungsprotein (viertes napDNAbp) umfasst, und ein viertes Polypeptid, das eine RNA- abhängige DNA-Polymeraseaktivität umfasst; und ii.eine vierte Prime-Editing-Guide-RNA (vierte PEgRNA), die an eine vierte Bindungsstelle auf dem zweiten Strang der doppelsträngigen DNA-Sequenz stromabwärts der zu editierenden Zielstelle anbindet; wobei die erste PEgRNA eine erste DNA-Synthese-Template umfasst, die eine erste einzelsträngige DNA-Sequenz kodiert, und die zweite PEgRNA eine zweite DNA-Synthese- Template umfasst, die eine zweite einzelsträngige DNA-Sequenz kodiert, und die dritte PEgRNA eine dritte DNA-Synthese-Template umfasst, die eine dritte einzelsträngige DNA- Sequenz kodiert, und die vierte PEgRNA eine vierte DNA-Synthese-Template umfasst, die eine vierte einzelsträngige DNA-Sequenz kodiert; wobei die erste und die dritte einzelsträngige DNA-Sequenz jeweils eine Komplementaritätsregion mit der anderen umfassen, und wobei die zweite und die vierte einzelsträngige DNA-Sequenz jeweils eine Komplementaritätsregion mit der anderen umfassen.
  131. System zum Editieren einer oder mehrerer doppelsträngiger DNA-Sequenz, wobei das System Folgendes umfasst: a) einen ersten Prime-Editor-Komplex, der Folgendes umfasst: i.einen ersten Prime-Editor, der ein erstes Nukleinsäure-programmierbares DNA- Bindungsprotein (erstes napDNAbp) umfasst, und ein erstes Polypeptid, das eine RNA- abhängige DNA-Polymeraseaktivität umfasst; und ii.eine erste Prime-Editing-Guide-RNA (erste PEgRNA), die an eine erste Bindungsstelle auf einem ersten Strang der ersten doppelsträngigen DNA-Sequenz an einer ersten zu editierenden Zielstelle anbindet; b) einen zweiten Prime-Editor-Komplex, der Folgendes umfasst: i.einen zweiten Prime-Editor, der ein zweites Nukleinsäure-programmierbares DNA- Bindungsprotein (zweites napDNAbp) umfasst, und ein zweites Polypeptid, das eine RNA- abhängige DNA-Polymeraseaktivität umfasst; und ii.eine zweite Prime-Editing-Guide-RNA (zweite PEgRNA), die an eine zweite Bindungsstelle auf einem zweiten Strang der ersten doppelsträngigen DNA-Sequenz an der ersten zu editierenden Zielstelle anbindet; c) einen dritten Prime-Editor-Komplex, der Folgendes umfasst: i.einen dritten Prime-Editor, der ein drittes Nukleinsäure-programmierbares DNA- Bindungsprotein (drittes napDNAbp) umfasst, und ein drittes Polypeptid, das eine RNA- abhängige DNA-Polymeraseaktivität umfasst; und ii.eine dritte Prime-Editing-Guide-RNA (dritte PEgRNA), die an eine erste Bindungsstelle auf einem ersten Strang der zweiten doppelsträngigen DNA-Sequenz an einer zweiten zu editierenden Zielstelle anbindet; d) einen vierten Prime-Editor-Komplex, der Folgendes umfasst: i.einen vierten Prime-Editor, der ein viertes Nukleinsäure-programmierbares DNA- Bindungsprotein (viertes napDNAbp) umfasst, und ein viertes Polypeptid, das eine RNA- abhängige DNA-Polymeraseaktivität umfasst; und ii.eine vierte Prime-Editing-Guide-RNA (vierte PEgRNA), die an eine zweite Bindungsstelle auf einem zweiten Strang der zweiten doppelsträngigen DNA-Sequenz an der zweiten zu editierenden Zielstelle anbindet; wobei die erste PEgRNA eine erste DNA-Synthese-Template umfasst, die eine erste einzelsträngige DNA-Sequenz kodiert, und die zweite PEgRNA eine zweite DNA-Synthese- Template umfasst, die eine zweite einzelsträngige DNA-Sequenz kodiert, und die dritte PEgRNA eine dritte DNA-Synthese-Template umfasst, die eine dritte einzelsträngige DNA- Sequenz kodiert, und die vierte PEgRNA eine vierte DNA-Synthese-Template umfasst, die eine vierte einzelsträngige DNA-Sequenz kodiert; wobei die erste und die dritte einzelsträngige DNA-Sequenz jeweils eine Komplementaritätsregion mit der anderen umfassen, und wobei die zweite und die vierte einzelsträngige DNA-Sequenz jeweils eine Komplementaritätsregion mit der anderen umfassen.
  132. System nach Anspruch 131, wobei der Prime-Editor des ersten Prime-Editor-Komplex, der zweite Prime-Editor-Komplex, der dritte Prime-Editor-Komplex, und/oder der vierte Prime-Editor-Komplex ein Fusionsprotein ist, welches das napDNAbp und das Polypeptid mit RNA-abhängiger DNA-Polymeraseaktivität umfasst.
  133. System nach einem der Ansprüche 130-132, wobei (i) die erste PEgRNA überdies eine erste Spacer-Sequenz, einen ersten gRNA-Kern und eine erste Primer-Bindungsstelle umfasst; (ii) die zweite PEgRNA überdies eine zweite Spacer-Sequenz, einen zweiten gRNA- Kern und eine zweite Primer-Bindungsstelle umfasst; (iii) die dritte PEgRNA überdies eine dritte Spacer-Sequenz, einen dritten gRNA-Kern und eine dritte Primer-Bindungsstelle umfasst; und (iv) die vierte PEgRNA überdies eine vierte Spacer-Sequenz, einen vierten gRNA-Kern und eine vierte Primer-Bindungsstelle umfasst.
  134. System nach Anspruch 131, wobei die Komplementaritätsregion der ersten und dritten einzelsträngigen DNA-Sequenz und/oder die Komplementaritätsregion der zweiten und vierten einzelsträngigen DNA-Sequenz einen Duplex formen.
  135. System nach Anspruch 134, wobei die erste Spacer-Sequenz an die erste Bindungsstelle der ersten doppelsträngigen DNA-Sequenz stromaufwärts der ersten zu editierenden Zielstelle anbindet und die zweite Spacer-Sequenz an die zweite Bindungsstelle der ersten doppelsträngigen DNA-Sequenz stromabwärts der ersten zu editierenden Zielstelle anbindet.
  136. System nach Anspruch 134 und 135, wobei die dritte Spacer-Sequenz an die erste Bindungsstelle der zweiten doppelsträngigen DNA-Sequenz stromabwärts der zweiten zu editierenden Zielstelle anbindet und die vierte Spacer-Sequenz an die zweite Bindungsstelle der zweiten doppelsträngigen DNA-Sequenz stromabwärts der zweiten zu editierenden Zielstelle anbindet.
  137. System nach einem der Ansprüche 134-136, wobei die erste und zweite Bindungsstelle zwei Enden einer ersten zusammenhängenden Region der ersten doppelsträngigen DNA definieren.
  138. System nach einem der Ansprüche 134-137, wobei die dritte und vierte Bindungsstelle zwei Enden einer zweiten zusammenhängenden Region der zweiten doppelsträngigen DNA definieren.
  139. System nach Anspruch 134, wobei die zusammenhängende Region zwischen der ersten und zweiten Bindungsstelle oder der dritten und vierten Bindungsstelle mindestens 10 Nukleobasenpaare, mindestens 11 Nukleobasenpaare, mindestens 12 Nukleobasenpaare, mindestens 13 Nukleobasenpaare, mindestens 14 Nukleobasenpaare, mindestens 15 Nukleobasenpaare, mindestens 16 Nukleobasenpaare, mindestens 17 Nukleobasenpaare, mindestens 18 Nukleobasenpaare, mindestens 19 Nukleobasenpaare, mindestens 20 Nukleobasenpaare, mindestens 21 Nukleobasenpaare, mindestens 22 Nukleobasenpaare, mindestens 23 Nukleobasenpaare, mindestens 24 Nukleobasenpaare, mindestens 25 Nukleobasenpaare, mindestens 26 Nukleobasenpaare, mindestens 27 Nukleobasenpaare, mindestens 28 Nukleobasenpaare, mindestens 29 Nukleobasenpaare, mindestens 30 Nukleobasenpaare, mindestens 31 Nukleobasenpaare, mindestens 32 Nukleobasenpaare, mindestens 33 Nukleobasenpaare, mindestens 34 Nukleobasenpaare, mindestens 35 Nukleobasenpaare, mindestens 36 Nukleobasenpaare, mindestens 37 Nukleobasenpaare, mindestens 38 Nukleobasenpaare, mindestens 39 Nukleobasenpaare, mindestens 40 Nukleobasenpaare, mindestens 41 Nukleotide, mindestens 42 Nukleotide, mindestens 43 Nukleotide, mindestens 44 Nukleotide, mindestens 45 Nukleotide, mindestens 46 Nukleotide, mindestens 47 Nukleotide, mindestens 48 Nukleotide, mindestens 49 Nukleotide, mindestens 50 Nukleotide, mindestens 51 Nukleotide, mindestens 52 Nukleotide, mindestens 53 Nukleotide, mindestens 54 Nukleotide, mindestens 55 Nukleotide, mindestens 56 Nukleotide, mindestens 57 Nukleotide, mindestens 58 Nukleotide, mindestens 59 Nukleotide, mindestens 60 Nukleotide, mindestens 61 Nukleotide, mindestens 62 Nukleotide, mindestens 63 Nukleotide, mindestens 64 Nukleotide, mindestens 65 Nukleotide, mindestens 66 Nukleotide, mindestens 67 Nukleotide, mindestens 68 Nukleotide, mindestens 69 Nukleotide, mindestens 70 Nukleotide, mindestens 71 Nukleotide, mindestens 72 Nukleotide, mindestens 73 Nukleotide, mindestens 74 Nukleotide, mindestens 75 Nukleotide, mindestens 76 Nukleotide, mindestens 77 Nukleotide, mindestens 78 Nukleotide, mindestens 79 Nukleotide, mindestens 80 Nukleotide, mindestens 81 Nukleotide, mindestens 82 Nukleotide, mindestens 83 Nukleotide, mindestens 84 Nukleotide, mindestens 85 Nukleotide, mindestens 86 Nukleotide, mindestens 87 Nukleotide, mindestens 88 Nukleotide, mindestens 89 Nukleotide, mindestens 90 Nukleotide, mindestens 91 Nukleotide, mindestens 92 Nukleotide, mindestens 93 Nukleotide, mindestens 94 Nukleotide, mindestens 95 Nukleotide, mindestens 96 Nukleotide, mindestens 97 Nukleotide, mindestens 98 Nukleotide, mindestens 99 Nukleotide, mindestens 100 Nukleotide, mindestens 101 Nukleotide, mindestens 102 Nukleotide, mindestens 103 Nukleotide, mindestens 104 Nukleotide, mindestens 105 Nukleotide, mindestens 106 Nukleotide, mindestens 107 Nukleotide, mindestens 108 Nukleotide, mindestens 109 Nukleotide oder mindestens 110 Nukleotide lang ist.
  140. System nach einem der Ansprüche 134-139, wobei die Komplementaritätsregion der ersten einzelsträngigen DNA-Sequenz und der zweite einzelsträngige DNA-Sequenz und/oder die Komplementaritätsregion der zweiten einzelsträngigen DNA-Sequenz und der vierten einzelsträngige DNA-Sequenz einen Duplex formen.
  141. System nach Anspruch 140, wobei der Duplex in die erste doppelsträngige DNA und/oder die zweite doppelsträngige DNA eingebaut wird.
  142. System nach einem der Ansprüche 134-141, wobei das System zum Ersetzen der ersten zusammenhängenden Region durch die zweite zusammenhängende Region in der ersten doppelsträngigen DNA führt.
  143. System nach einem der Ansprüche 134-142, wobei das System zum Austausch der ersten zusammenhängenden Region und der zweiten zusammenhängenden Region zwischen der ersten doppelsträngigen DNA und der zweiten doppelsträngigen DNA führt.
  144. System nach einem der Ansprüche 134-143, wobei der erste Prime-Editor-Komplex, der zweite Prime-Editor-Komplex, der dritte Prime-Editor-Komplex und der vierte Prime- Editor-Komplex den gleichen Prime-Editor umfassen.
  145. System nach einem der Ansprüche 134-144, wobei das erste, zweite, dritte und vierte Polypeptid mit einer RNA-abhängigen DNA-Polymeraseaktivität gleich sind.
  146. System nach einem der Ansprüche 134-145, wobei das erste, zweite, dritte und/oder vierte napDNAbp eine Cas9-Domäne oder Variante davon ist.
  147. System nach einem der Ansprüche 134-146, wobei das erste, zweite, dritte und/oder vierte napDNAbp eine Nuklease-aktive Cas9-Domäne, eine Nuklease-inaktive Cas9-Domäne, eine Cas9-Nickase-Domäne oder eine Variante ebendieser ist.
  148. System nach einem der Ansprüche 134-147, wobei das erste, zweite, dritte und/oder vierte napDNAbp aus der Gruppe bestehend aus: Cas9, Cas12e, Cas12d, Cas12a, Cas12b1, Cas13a, Cas12c und Argonaute stammt.
  149. System nach einem der Ansprüche 134-148, wobei das erste, zweite, dritte und/oder vierte napDNAbp eine Nickase-Aktivität aufweist.
  150. System nach einem der Ansprüche 134-149, wobei das erste, zweite, dritte und/oder vierte napDNAbp eine Aminosäuresequenz mit einer der SEQ-ID-NR: 2-65 umfasst, oder eine Aminosäuresequenz umfasst, die mindestens 80 %, 85 %, 90 %, 95 % oder 99 % Sequenzidentität mit einer der SEQ-ID-NR: 2-65 hat.
  151. System nach einem der Ansprüche 134-150, wobei das erste, zweite, dritte und/oder vierte Polypeptid mit einer RNA-abhängigen DNA-Polymeraseaktivität eine reverse Transkriptase ist.
  152. System nach einem der Ansprüche 134-151, wobei das erste, zweite, dritte und/oder vierte Polypeptid mit einer RNA-abhängigen DNA-Polymeraseaktivität eine Aminosäuresequenz mit einer der SEQ-ID-NR: 37, 68-79, 82-98, 81, 98 und 110 umfasst, oder eine Aminosäuresequenz umfasst, die mindestens 80 %, 85 %, 90 %, 95 % oder 99 % Sequenzidentität mit einer der SEQ-ID-NR: 37, 68-79, 82-98, 81, 98 und 110 hat.
  153. System nach einem der Ansprüche 134-152, wobei (i) der erste Prime-Editor überdies einen Linker enthält, der das erste napDNAbp und das erste Polypeptid mit RNA-abhängiger DNA-Polymeraseaktivität verbindet; (ii) der zweite Prime-Editor überdies einen Linker enthält, der das zweite napDNAbp und das zweite Polypeptid mit RNA-abhängiger DNA-Polymeraseaktivität verbindet; (iii) der dritte Prime-Editor überdies einen Linker enthält, der das dritte napDNAbp und das dritte Polypeptid mit RNA-abhängiger DNA-Polymeraseaktivität verbindet; und/oder (iv) der vierte Prime-Editor überdies einen Linker enthält, der das vierte napDNAbp und das vierte Polypeptid mit RNA-abhängiger DNA-Polymeraseaktivität verbindet.
  154. System nach Anspruch 153, wobei der Linker eine Aminosäuresequenz mit einer der SEQ-ID-NR: 119-128 umfasst, oder eine Aminosäuresequenz umfasst, die mindestens 80 %, 85 %, 90 %, 95 % oder 99 % Sequenzidentität mit einer der SEQ-ID-NR: 119-128 hat.
  155. System nach Anspruch 153 oder 154, wobei der Linker eine Länge von 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 oder 50 Aminosäuren hat.
  156. System nach einem der Ansprüche 134-155, wobei die erste, zweite, dritte und/oder vierte PEgRNA eine Nukleotidsequenz mit einer der SEQ-ID-NR: 192-203 umfasst, oder eine Nukleotidsequenz umfasst, die mindestens 80 %, 85 %, 90 %, 95 % oder 99 % Sequenzidentität mit einer der SEQ-ID-NR: 192-203 hat.
  157. System nach einem der Ansprüche 134-156, wobei die erste Spacer-Sequenz an eine erste Bindungsstelle auf einem ersten Strang der doppelsträngigen DNA-Sequenz stromaufwärts der zu editierenden Zielstelle anbindet.
  158. System nach einem der Ansprüche 134-157, wobei die zweite Spacer-Sequenz des zweiten Prime-Editor-Komplexes an eine zweite Bindungsstelle auf einem zweiten Strang der doppelsträngigen DNA-Sequenz stromaufwärts der zu editierenden Zielstelle anbindet.
  159. System nach einem der Ansprüche 134-158, wobei die dritte Spacer-Sequenz an eine dritte Bindungsstelle auf einem ersten Strang der doppelsträngigen DNA-Sequenz stromabwärts der zu editierenden Zielstelle anbindet.
  160. System nach einem der Ansprüche 134-159, wobei die vierte Spacer-Sequenz des vierten Prime-Editor-Komplexes an eine vierte Bindungsstelle auf einem zweiten Strang der doppelsträngigen DNA-Sequenz stromabwärts der zu editierenden Zielstelle anbindet.
  161. System nach Anspruch 160, wobei das Anbinden der Spacer-Sequenz des ersten und zweiten Prime-Editor-Komplexes in Präsenz einer PAM-Sequenz zum Nicken des ersten und zweiten Strangs führt, jeweils an einer Nick-Stelle, die proximal zur PAM-Sequenz jedes Strangs beim ersten und/oder zweiten napDNAbp der beiden ersten und zweiten Prime-Editor- Komplexe liegt.
  162. System nach Anspruch 161, wobei das Anbinden der Spacer-Sequenz des dritten und vierten Prime-Editor-Komplexes in Präsenz einer PAM-Sequenz zum Nicken des ersten und zweiten Strangs führt, jeweils an einer Nick-Stelle, die proximal zur PAM-Sequenz jedes Strangs beim dritten und/oder vierten napDNAbp der beiden dritten und vierten Prime-Editor- Komplexe liegt.
  163. System nach Anspruch 133, wobei die erste und dritte Bindungsstelle, oder die zweite und vierte Bindungsstelle zwei Enden einer zusammenhängenden Region doppelsträngiger DNA definieren.
  164. System nach Anspruch 163, wobei die zusammenhängende Region zwischen der ersten und dritten Bindungsstelle oder der zweiten und vierten Bindungsstelle mindestens 10 Nukleobasenpaare, mindestens 11 Nukleobasenpaare, mindestens 12 Nukleobasenpaare, mindestens 13 Nukleobasenpaare, mindestens 14 Nukleobasenpaare, mindestens 15 Nukleobasenpaare, mindestens 16 Nukleobasenpaare, mindestens 17 Nukleobasenpaare, mindestens 18 Nukleobasenpaare, mindestens 19 Nukleobasenpaare, mindestens 20 Nukleobasenpaare, mindestens 21 Nukleobasenpaare, mindestens 22 Nukleobasenpaare, mindestens 23 Nukleobasenpaare, mindestens 24 Nukleobasenpaare, mindestens 25 Nukleobasenpaare, mindestens 26 Nukleobasenpaare, mindestens 27 Nukleobasenpaare, mindestens 28 Nukleobasenpaare, mindestens 29 Nukleobasenpaare, mindestens 30 Nukleobasenpaare, mindestens 31 Nukleobasenpaare, mindestens 32 Nukleobasenpaare, mindestens 33 Nukleobasenpaare, mindestens 34 Nukleobasenpaare, mindestens 35 Nukleobasenpaare, mindestens 36 Nukleobasenpaare, mindestens 37 Nukleobasenpaare, mindestens 38 Nukleobasenpaare, mindestens 39 Nukleobasenpaare, mindestens 40 Nukleobasenpaare, mindestens 41 Nukleotide, mindestens 42 Nukleotide, mindestens 43 Nukleotide, mindestens 44 Nukleotide, mindestens 45 Nukleotide, mindestens 46 Nukleotide, mindestens 47 Nukleotide, mindestens 48 Nukleotide, mindestens 49 Nukleotide, mindestens 50 Nukleotide, mindestens 51 Nukleotide, mindestens 52 Nukleotide, mindestens 53 Nukleotide, mindestens 54 Nukleotide, mindestens 55 Nukleotide, mindestens 56 Nukleotide, mindestens 57 Nukleotide, mindestens 58 Nukleotide, mindestens 59 Nukleotide, mindestens 60 Nukleotide, mindestens 61 Nukleotide, mindestens 62 Nukleotide, mindestens 63 Nukleotide, mindestens 64 Nukleotide, mindestens 65 Nukleotide, mindestens 66 Nukleotide, mindestens 67 Nukleotide, mindestens 68 Nukleotide, mindestens 69 Nukleotide, mindestens 70 Nukleotide, mindestens 71 Nukleotide, mindestens 72 Nukleotide, mindestens 73 Nukleotide, mindestens 74 Nukleotide, mindestens 75 Nukleotide, mindestens 76 Nukleotide, mindestens 77 Nukleotide, mindestens 78 Nukleotide, mindestens 79 Nukleotide, mindestens 80 Nukleotide, mindestens 81 Nukleotide, mindestens 82 Nukleotide, mindestens 83 Nukleotide, mindestens 84 Nukleotide, mindestens 85 Nukleotide, mindestens 86 Nukleotide, mindestens 87 Nukleotide, mindestens 88 Nukleotide, mindestens 89 Nukleotide, mindestens 90 Nukleotide, mindestens 91 Nukleotide, mindestens 92 Nukleotide, mindestens 93 Nukleotide, mindestens 94 Nukleotide, mindestens 95 Nukleotide, mindestens 96 Nukleotide, mindestens 97 Nukleotide, mindestens 98 Nukleotide, mindestens 99 Nukleotide, mindestens 100 Nukleotide, mindestens 101 Nukleotide, mindestens 102 Nukleotide, mindestens 103 Nukleotide, mindestens 104 Nukleotide, mindestens 105 Nukleotide, mindestens 106 Nukleotide, mindestens 107 Nukleotide, mindestens 108 Nukleotide, mindestens 109 Nukleotide oder mindestens 110 Nukleotide lang ist.
  165. System nach einem der Ansprüche 130-164, wobei die Komplementaritätsregion der ersten einzelsträngigen DNA-Sequenz und der dritten einzelsträngige DNA-Sequenz und/oder die Komplementaritätsregion der zweiten einzelsträngigen DNA-Sequenz und der vierten einzelsträngige DNA-Sequenz einen Duplex formen.
  166. System nach Anspruch 164, wobei die zusammenhängende Region von dem Duplex ersetzt wird.
  167. System nach Anspruch 166, wobei der Duplex an der Zielstelle in die doppelsträngige DNA eingebaut wird.
  168. System nach einem der Ansprüche 122-167, wobei die erste, zweite, dritte und/oder vierte DNA-Synthese-Template mindestens 1 Nukleotid, mindestens 2 Nukleotide, mindestens 3 Nukleotide, mindestens 4 Nukleotide, mindestens 5 Nukleotide, mindestens 6 Nukleotide, mindestens 7 Nukleotide, mindestens 8 Nukleotide, mindestens 9 Nukleotide, mindestens 10 Nukleotide, mindestens 11 Nukleotide, mindestens 12 Nukleotide, mindestens 13 Nukleotide, mindestens 14 Nukleotide, mindestens 15 Nukleotide, mindestens 16 Nukleotide, mindestens 17 Nukleotide, mindestens 18 Nukleotide, mindestens 19 Nukleotide, mindestens 20 Nukleotide, mindestens 21 Nukleotide, mindestens 22 Nukleotide, mindestens 23 Nukleotide, mindestens 24 Nukleotide, mindestens 25 Nukleotide, mindestens 26 Nukleotide, mindestens 27 Nukleotide, mindestens 28 Nukleotide, mindestens 29 Nukleotide, mindestens 30 Nukleotide, mindestens 31 Nukleotide, mindestens 32 Nukleotide, mindestens 33 Nukleotide, mindestens 34 Nukleotide, mindestens 35 Nukleotide, mindestens 36 Nukleotide, mindestens 37 Nukleotide, mindestens 38 Nukleotide, mindestens 39 Nukleotide, mindestens 40 Nukleotide, mindestens 41 Nukleotide, mindestens 42 Nukleotide, mindestens 43 Nukleotide, mindestens 44 Nukleotide, mindestens 45 Nukleotide, mindestens 46 Nukleotide, mindestens 47 Nukleotide, mindestens 48 Nukleotide, mindestens 49 Nukleotide, mindestens 50 Nukleotide, mindestens 51 Nukleotide, mindestens 52 Nukleotide, mindestens 53 Nukleotide, mindestens 54 Nukleotide, mindestens 55 Nukleotide, mindestens 56 Nukleotide, mindestens 57 Nukleotide, mindestens 58 Nukleotide, mindestens 59 Nukleotide, mindestens 60 Nukleotide, mindestens 61 Nukleotide, mindestens 62 Nukleotide, mindestens 63 Nukleotide, mindestens 64 Nukleotide, mindestens 65 Nukleotide, mindestens 66 Nukleotide, mindestens 67 Nukleotide, mindestens 68 Nukleotide, mindestens 69 Nukleotide, mindestens 70 Nukleotide, mindestens 71 Nukleotide, mindestens 72 Nukleotide, mindestens 73 Nukleotide, mindestens 74 Nukleotide, mindestens 75 Nukleotide, mindestens 76 Nukleotide, mindestens 77 Nukleotide, mindestens 78 Nukleotide, mindestens 79 Nukleotide, mindestens 80 Nukleotide, mindestens 81 Nukleotide, mindestens 82 Nukleotide, mindestens 83 Nukleotide, mindestens 84 Nukleotide, mindestens 85 Nukleotide, mindestens 86 Nukleotide, mindestens 87 Nukleotide, mindestens 88 Nukleotide, mindestens 89 Nukleotide, mindestens 90 Nukleotide, mindestens 91 Nukleotide, mindestens 92 Nukleotide, mindestens 93 Nukleotide, mindestens 94 Nukleotide, mindestens 95 Nukleotide, mindestens 96 Nukleotide, mindestens 97 Nukleotide, mindestens 98 Nukleotide, mindestens 99 Nukleotide, mindestens 100 Nukleotide, mindestens 101 Nukleotide, mindestens 102 Nukleotide, mindestens 103 Nukleotide, mindestens 104 Nukleotide, mindestens 105 Nukleotide, mindestens 106 Nukleotide, mindestens 107 Nukleotide, mindestens 108 Nukleotide, mindestens 109 Nukleotide oder mindestens 110 Nukleotide lang ist.
  169. System nach einem der Ansprüche 122-168, wobei die erste einzelsträngige DNA- Sequenz und die zweite einzelsträngige DNA-Sequenz und/oder die dritte einzelsträngige DNA-Sequenz und die vierte einzelsträngige DNA-Sequenz die gleichen Längen aufweisen.
  170. System nach einem der Ansprüche 122-169, wobei die erste einzelsträngige DNA- Sequenz und die zweite einzelsträngige DNA-Sequenz und/oder die dritte einzelsträngige DNA-Sequenz und die vierte einzelsträngige DNA-Sequenz unterschiedliche Längen aufweisen.
  171. System nach einem der Ansprüche 122-170, wobei die Komplementaritätsregion der ersten, zweiten, dritten und/oder vierten einzelsträngigen DNA-Sequenz mindestens 99 %, mindestens 95 %, mindestens 90 %, mindestens 85 %, mindestens 80 %, mindestens 75 %, mindestens 70 %, mindestens 65 %, mindestens 60 %, mindestens 55 %, mindestens 50 %, mindestens 45 %, mindestens 40 %, mindestens 35 %, mindestens 30 %, mindestens 25 %, mindestens 20 %, mindestens 15 % oder mindestens 10 % der Gesamtlänge der ersten einzelsträngigen DNA-Sequenz und der dritten einzelsträngigen DNA-Sequenz oder der zweiten einzelsträngigen DNA-Sequenz und der vierten einzelsträngigen DNA-Sequenz beträgt.
  172. System nach einem der Ansprüche 122-171, wobei die Komplementaritätsregion der ersten, zweiten, dritten und/oder vierten einzelsträngigen DNA-Sequenz mindestens 5 Nukleotide, mindestens 6 Nukleotide, mindestens 7 Nukleotide, mindestens 8 Nukleotide, mindestens 9 Nukleotide, mindestens 10 Nukleotide, mindestens 11 Nukleotide, mindestens 12 Nukleotide, mindestens 13 Nukleotide, mindestens 14 Nukleotide, mindestens 15 Nukleotide, mindestens 16 Nukleotide, mindestens 17 Nukleotide, mindestens 18 Nukleotide, mindestens 19 Nukleotide, mindestens 20 Nukleotide, mindestens 21 Nukleotide, mindestens 22 Nukleotide, mindestens 23 Nukleotide, mindestens 24 Nukleotide, mindestens 25 Nukleotide, mindestens 26 Nukleotide, mindestens 27 Nukleotide, mindestens 28 Nukleotide, mindestens 29 Nukleotide, mindestens 30 Nukleotide, mindestens 31 Nukleotide, mindestens 32 Nukleotide, mindestens 33 Nukleotide, mindestens 34 Nukleotide, mindestens 35 Nukleotide, mindestens 36 Nukleotide, mindestens 37 Nukleotide, mindestens 38 Nukleotide, mindestens 39 Nukleotide, mindestens 40 Nukleotide, mindestens 41 Nukleotide, mindestens 42 Nukleotide, mindestens 43 Nukleotide, mindestens 44 Nukleotide, mindestens 45 Nukleotide, mindestens 46 Nukleotide, mindestens 47 Nukleotide, mindestens 48 Nukleotide, mindestens 49 Nukleotide, mindestens 50 Nukleotide, mindestens 51 Nukleotide, mindestens 52 Nukleotide, mindestens 53 Nukleotide, mindestens 54 Nukleotide, mindestens 55 Nukleotide, mindestens 56 Nukleotide, mindestens 57 Nukleotide, mindestens 58 Nukleotide, mindestens 59 Nukleotide, mindestens 60 Nukleotide, mindestens 61 Nukleotide, mindestens 62 Nukleotide, mindestens 63 Nukleotide, mindestens 64 Nukleotide, mindestens 65 Nukleotide, mindestens 66 Nukleotide, mindestens 67 Nukleotide, mindestens 68 Nukleotide, mindestens 69 Nukleotide, mindestens 70 Nukleotide, mindestens 71 Nukleotide, mindestens 72 Nukleotide, mindestens 73 Nukleotide, mindestens 74 Nukleotide, mindestens 75 Nukleotide, mindestens 76 Nukleotide, mindestens 77 Nukleotide, mindestens 78 Nukleotide, mindestens 79 Nukleotide, mindestens 80 Nukleotide, mindestens 81 Nukleotide, mindestens 82 Nukleotide, mindestens 83 Nukleotide, mindestens 84 Nukleotide, mindestens 85 Nukleotide, mindestens 86 Nukleotide, mindestens 87 Nukleotide, mindestens 88 Nukleotide, mindestens 89 Nukleotide, mindestens 90 Nukleotide, mindestens 91 Nukleotide, mindestens 92 Nukleotide, mindestens 93 Nukleotide, mindestens 94 Nukleotide, mindestens 95 Nukleotide, mindestens 96 Nukleotide, mindestens 97 Nukleotide, mindestens 98 Nukleotide, mindestens 99 Nukleotide, mindestens 100 Nukleotide, mindestens 101 Nukleotide, mindestens 102 Nukleotide, mindestens 103 Nukleotide, mindestens 104 Nukleotide, mindestens 105 Nukleotide, mindestens 106 Nukleotide, mindestens 107 Nukleotide, mindestens 108 Nukleotide, mindestens 109 Nukleotide oder mindestens 110 Nukleotide lang ist und entweder kürzer oder gleich der Länge der ersten einzelsträngigen DNA-Sequenz und der dritten einzelsträngigen DNA-Sequenz, und der zweiten einzelsträngigen DNA-Sequenz und der vierten einzelsträngigen DNA-Sequenz ist.
  173. System nach einem der Ansprüche 130-172, wobei die erste, zweite, dritte und/oder vierte einzelsträngige DNA-Sequenz jeweils einzelsträngige DNA-Stränge mit 3'-Enden sind.
  174. System nach Anspruch 173, wobei das Integrieren des Duplex, der den editierten Teil umfasst, zu einer Insertion, Deletion oder einem Ersetzen von DNA an der Zielstelle führt.
  175. Polynukleotid, das den ersten, zweiten, dritten und/oder vierten Prime-Editor nach einem der Ansprüche 130-174 kodiert.
  176. Polynukleotid, das die erste, zweite, dritte und/oder vierte PEgRNA nach einem der Ansprüche 130-175 kodiert.
  177. Vektor, der ein Polynukleotid nach Anspruch 175 oder 176 umfasst.
  178. Zelle, die ein Polynukleotid nach Anspruch 175 oder 176 oder einen Vektor nach Anspruch 177 umfasst.
  179. Pharmazeutische Zusammensetzung, die ein Polynukleotid nach Anspruch 175 oder 176, einen Vektor nach Anspruch 177 oder eine Zelle nach Anspruch 178 und einen pharmazeutisch verträglichen Hilfsstoff umfasst.
  180. Kit, das ein Polynukleotid nach Anspruch 175 oder 176, oder einen Vektor nach Anspruch 177 und Anweisungen für das gleichzeitige Editieren beider Stränge einer doppelsträngigen DNA-Sequenz an der zu editierenden Zielstelle umfasst.
  181. Verfahren zum gleichzeitigen Editieren eines ersten und zweiten komplementären Strangs einer doppelsträngigen DNA-Sequenz an einer Zielstelle, wobei besagtes Verfahren das Inkontaktbringen der doppelsträngigen DNA-Sequenz mit einem Paar Prime-Editor- Komplexe umfasst, wobei das Paar Folgendes umfasst: (a) einen ersten Prime-Editor-Komplex, der Folgendes umfasst: i.einen ersten Prime-Editor, der ein erstes Nukleinsäure-programmierbares DNA- Bindungsprotein (erstes napDNAbp) umfasst, und ein erstes Polypeptid, das eine RNAabhängige DNA-Polymeraseaktivität umfasst; und ii.eine erste Prime-Editing-Guide-RNA (erste PEgRNA), die an eine erste Zielsequenz auf dem ersten Strang der genomischen DNA-Sequenz stromaufwärts der Zielstelle anbindet; (b) einen zweiten Prime-Editor-Komplex, der Folgendes umfasst: i.einen zweiten Prime-Editor, der ein zweites Nukleinsäure-programmierbares DNA- Bindungsprotein (zweites napDNAbp) umfasst, und ein zweites Polypeptid, das eine RNAabhängige DNA-Polymeraseaktivität umfasst; und ii.eine zweite Prime-Editing-Guide-RNA (zweite PEgRNA), die an eine zweite Zielsequenz auf dem zweiten Strang der genomischen DNA-Sequenz stromaufwärts der Zielstelle anbindet; (c) einen dritten Prime-Editor-Komplex, der Folgendes umfasst: i.einen dritten Prime-Editor, der ein drittes Nukleinsäure-programmierbares DNA- Bindungsprotein (drittes napDNAbp) umfasst, und ein drittes Polypeptid, das eine RNAabhängige DNA-Polymeraseaktivität umfasst; und ii.eine dritte Prime-Editing-Guide-RNA (dritte PEgRNA), die an eine dritte Zielsequenz auf dem ersten Strang der genomischen DNA-Sequenz stromabwärts der Zielstelle anbindet; (d) einen vierten Prime-Editor-Komplex, der Folgendes umfasst: i.einen vierten Prime-Editor, der ein zweites Nukleinsäure-programmierbares DNA- Bindungsprotein (viertes napDNAbp) umfasst, und ein viertes Polypeptid, das eine RNAabhängige DNA-Polymeraseaktivität umfasst; und ii.eine vierte Prime-Editing-Guide-RNA (vierte PEgRNA), die an eine vierte Zielsequenz auf dem zweiten Strang der genomischen DNA-Sequenz stromabwärts der Zielstelle anbindet; wobei der erste Prime-Editor-Komplex einen ersten Nick bei der ersten Zielsequenz erzeugt und daraufhin die Polymerisation einer ersten einzelsträngigen DNA-Sequenz mit 3'-Ende ausgehend vom 5'-Ende, das durch den ersten Nick entstand, hervorruft; wobei der zweite Prime-Editor-Komplex einen zweiten Nick bei der zweiten Zielsequenz erzeugt und daraufhin die Polymerisation einer zweiten einzelsträngigen DNA-Sequenz mit 3'- Ende ausgehend vom 5'-Ende, das durch den zweiten Nick entstand, hervorruft; wobei der dritte Prime-Editor-Komplex einen dritten Nick bei der dritten Zielsequenz erzeugt und daraufhin die Polymerisation einer dritten einzelsträngigen DNA-Sequenz mit 3'-Ende ausgehend vom 5'-Ende, das durch den dritten Nick entstand, hervorruft; wobei der vierte Prime-Editor-Komplex einen vierten Nick bei der vierten Zielsequenz erzeugt und daraufhin die Polymerisation einer vierten einzelsträngigen DNA-Sequenz mit 3'-Ende ausgehend vom 5'-Ende, das durch den vierten Nick entstand, hervorruft; wobei die erste einzelsträngige DNA-Sequenz und die zweite einzelsträngige DNA-Sequenz reverse Komplemente für zumindest eine Komplementaritätsregion sind und einen Duplex formen, wobei der Duplex die genickten ersten und zweiten komplementären Stränge der doppelsträngigen DNA-Sequenz ersetzt; und wobei die dritte einzelsträngige DNA-Sequenz und die vierte einzelsträngige DNA-Sequenz reverse Komplemente für zumindest eine Komplementaritätsregion sind und einen Duplex formen, wobei der Duplex die genickten ersten und zweiten komplementären Stränge der doppelsträngigen DNA-Sequenz ersetzt.
  182. Verfahren nach Anspruch 181, wobei der Prime-Editor des ersten Prime-Editor- Komplexes, des zweiten Prime-Editor-Komplexes, des dritten Prime-Editor-Komplexes und/oder des vierten Prime-Editor-Komplexes ein Fusionsprotein ist, welches das napDNAbp und das Polypeptid mit RNA-abhängiger DNA-Polymeraseaktivität umfasst.
  183. Verfahren nach Anspruch 181 oder 182, wobei der erste Prime-Editor-Komplex, der zweite Prime-Editor-Komplex, der dritte Prime-Editor-Komplex und der vierte Prime-Editor- Komplex den gleichen Prime-Editor umfassen.
  184. Verfahren nach einem der Ansprüche 181-183, wobei der erste, zweite, dritte und/oder vierte Prime-Editor-Komplex einen unterschiedlichen Prime-Editor umfassen.
  185. Verfahren nach einem der Ansprüche 181-184, wobei das erste, zweite, dritte und/oder vierte napDNAbp eine Cas9-Domäne oder Variante davon ist.
  186. Verfahren nach einem der Ansprüche 181-185, wobei das erste, zweite, dritte und/oder vierte napDNAbp eine Nuklease-aktive Cas9-Domäne, eine Nuklease-inaktive Cas9-Domäne, eine Cas9-Nickase-Domäne oder eine Variante ebendieser ist.
  187. Verfahren nach einem der Ansprüche 181-184, wobei das erste, zweite, dritte und/oder vierte napDNAbp aus der Gruppe bestehend aus: Cas9, Cas12e, Cas12d, Cas12a, Cas12b1, Casl3a, Cas12c stammt.
  188. Verfahren nach einem der Ansprüche 181-187, wobei das erste, zweite, dritte und/oder vierte napDNAbp eine Nickase-Aktivität aufweist.
  189. Verfahren nach einem der Ansprüche 181-188, wobei das erste, zweite, dritte und/oder vierte napDNAbp eine Aminosäuresequenz mit einer der SEQ-ID-NR: 2-65 umfasst, oder eine Aminosäuresequenz umfasst, die mindestens 80 %, 85 %, 90 %, 95 % oder 99 % Sequenzidentität mit einer der SEQ-ID-NR: 2-65 hat.
  190. Verfahren nach einem der Ansprüche 181-189, wobei das erste, zweite, dritte und/oder vierte Polypeptid mit einer RNA-abhängigen DNA-Polymeraseaktivität eine reverse Transkriptase ist.
  191. Verfahren nach einem der Ansprüche 181-190, wobei das erste, zweite, dritte und/oder vierte Polypeptid mit einer RNA-abhängigen DNA-Polymeraseaktivität eine Aminosäuresequenz mit einer der SEQ-ID-NR: 37, 68-79, 82-98, 81, 98 und 110 umfasst, oder eine Aminosäuresequenz umfasst, die mindestens 80 %, 85 %, 90 %, 95 % oder 99 % Sequenzidentität mit einer der SEQ-ID-NR: 37, 68-79, 82-98, 81, 98 und 110 hat.
  192. Verfahren nach einem der Ansprüche 181-191, wobei (i) der erste Prime-Editor überdies einen Linker enthält, der das erste napDNAbp und das erste Polypeptid mit RNA-abhängiger DNA-Polymeraseaktivität verbindet; (ii) der zweite Prime-Editor überdies einen Linker enthält, der das zweite napDNAbp und das zweite Polypeptid mit RNA-abhängiger DNA-Polymeraseaktivität verbindet; (iii) der dritte Prime-Editor überdies einen Linker enthält, der das dritte napDNAbp und das dritte Polypeptid mit RNA-abhängiger DNA-Polymeraseaktivität verbindet; und/oder (iv) der vierte Prime-Editor überdies einen Linker enthält, der das vierte napDNAbp und das vierte Polypeptid mit RNA-abhängiger DNA-Polymeraseaktivität verbindet.
  193. Verfahren nach Anspruch 192, wobei der Linker eine Aminosäuresequenz mit einer der SEQ-ID-NR: 119-128 umfasst, oder eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80 %, 85 %, 90 %, 95 % oder 99 % Sequenzidentität mit einer der SEQ-ID-Nummern: 119-128 hat.
  194. Verfahren nach Anspruch 192 oder 193, wobei der Linker eine Länge von 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 oder 50 Aminosäuren hat.
  195. Verfahren nach einem der Ansprüche 192-194, wobei die erste, zweite, dritte und/oder vierte PEgRNA eine Nukleotidsequenz mit einer der SEQ-ID-NR: 192-203 umfasst, oder eine Nukleotidsequenz umfasst, die mindestens 80 %, 85 %, 90 %, 95 % oder 99 % Sequenzidentität mit einer der SEQ-ID-NR: 192-203 hat.
  196. Verfahren nach einem der Ansprüche 192-195, wobei die erste Spacer-Sequenz des ersten Prime-Editor-Komplexes an eine erste Bindungsstelle auf einem ersten Strang der doppelsträngigen DNA-Sequenz stromaufwärts der zu editierenden Zielstelle anbindet.
  197. Verfahren nach einem der Ansprüche 192-196, wobei die zweite Spacer-Sequenz des zweiten Prime-Editor-Komplexes an eine zweite Bindungsstelle auf einem zweiten Strang der doppelsträngigen DNA-Sequenz stromabwärts der zu editierenden Zielstelle anbindet.
  198. Verfahren nach einem der Ansprüche 192-197, wobei die dritte Spacer-Sequenz des dritten Prime-Editor-Komplexes an eine dritte Bindungsstelle auf einem ersten Strang der doppelsträngigen DNA-Sequenz stromaufwärts der zu editierenden Zielstelle anbindet.
  199. Verfahren nach einem der Ansprüche 192-198, wobei die vierte Spacer-Sequenz des vierten Prime-Editor-Komplexes an eine vierte Bindungsstelle auf einem zweiten Strang der doppelsträngigen DNA-Sequenz stromabwärts der zu editierenden Zielstelle anbindet.
  200. Verfahren nach Anspruch 199, wobei das Anbinden der ersten und zweiten Spacer- Sequenz des ersten und zweiten Prime-Editor-Komplexes in Präsenz einer PAM-Sequenz zum Nicken des ersten und zweiten Strangs führt, jeweils an einer Nick-Stelle, die proximal zur PAM-Sequenz jedes Strangs beim napDNAbp der beiden ersten und zweiten Prime-Editor- Komplexe liegt.
  201. Verfahren nach Anspruch 200, wobei das Anbinden der dritten und vierten Spacer- Sequenz des dritten und vierten Prime-Editor-Komplexes in Präsenz einer PAM-Sequenz zum Nicken des ersten und zweiten Strangs führt, jeweils an einer Nick-Stelle, die proximal zur PAM-Sequenz jedes Strangs beim dritten und/oder vierten napDNAbp der beiden dritten und vierten Prime-Editor-Komplexe liegt.
  202. Verfahren nach Anspruch 200 oder 201, wobei die erste und zweite Bindungsstelle und/oder die dritte und vierte Bindungsstelle zwei Enden einer zusammenhängenden Region doppelsträngiger DNA definieren, welche die zu editierende Zielstelle umfasst.
  203. Verfahren nach Anspruch 202, wobei die zusammenhängende Region zwischen der ersten und zweiten Bindungsstelle und/oder die zusammenhängende Region zwischen der dritten und vierten Bindungsstelle mindestens 10 Nukleobasenpaare, mindestens 11 Nukleobasenpaare, mindestens 12 Nukleobasenpaare, mindestens 13 Nukleobasenpaare, mindestens 14 Nukleobasenpaare, mindestens 15 Nukleobasenpaare, mindestens 16 Nukleobasenpaare, mindestens 17 Nukleobasenpaare, mindestens 18 Nukleobasenpaare, mindestens 19 Nukleobasenpaare, mindestens 20 Nukleobasenpaare, mindestens 21 Nukleobasenpaare, mindestens 22 Nukleobasenpaare, mindestens 23 Nukleobasenpaare, mindestens 24 Nukleobasenpaare, mindestens 25 Nukleobasenpaare, mindestens 26 Nukleobasenpaare, mindestens 27 Nukleobasenpaare, mindestens 28 Nukleobasenpaare, mindestens 29 Nukleobasenpaare, mindestens 30 Nukleobasenpaare, mindestens 31 Nukleobasenpaare, mindestens 32 Nukleobasenpaare, mindestens 33 Nukleobasenpaare, mindestens 34 Nukleobasenpaare, mindestens 35 Nukleobasenpaare, mindestens 36 Nukleobasenpaare, mindestens 37 Nukleobasenpaare, mindestens 38 Nukleobasenpaare, mindestens 39 Nukleobasenpaare, mindestens 40 Nukleobasenpaare, mindestens 41 Nukleotide, mindestens 42 Nukleotide, mindestens 43 Nukleotide, mindestens 44 Nukleotide, mindestens 45 Nukleotide, mindestens 46 Nukleotide, mindestens 47 Nukleotide, mindestens 48 Nukleotide, mindestens 49 Nukleotide, mindestens 50 Nukleotide, mindestens 51 Nukleotide, mindestens 52 Nukleotide, mindestens 53 Nukleotide, mindestens 54 Nukleotide, mindestens 55 Nukleotide, mindestens 56 Nukleotide, mindestens 57 Nukleotide, mindestens 58 Nukleotide, mindestens 59 Nukleotide, mindestens 60 Nukleotide, mindestens 61 Nukleotide, mindestens 62 Nukleotide, mindestens 63 Nukleotide, mindestens 64 Nukleotide, mindestens 65 Nukleotide, mindestens 66 Nukleotide, mindestens 67 Nukleotide, mindestens 68 Nukleotide, mindestens 69 Nukleotide, mindestens 70 Nukleotide, mindestens 71 Nukleotide, mindestens 72 Nukleotide, mindestens 73 Nukleotide, mindestens 74 Nukleotide, mindestens 75 Nukleotide, mindestens 76 Nukleotide, mindestens 77 Nukleotide, mindestens 78 Nukleotide, mindestens 79 Nukleotide, mindestens 80 Nukleotide, mindestens 81 Nukleotide, mindestens 82 Nukleotide, mindestens 83 Nukleotide, mindestens 84 Nukleotide, mindestens 85 Nukleotide, mindestens 86 Nukleotide, mindestens 87 Nukleotide, mindestens 88 Nukleotide, mindestens 89 Nukleotide, mindestens 90 Nukleotide, mindestens 91 Nukleotide, mindestens 92 Nukleotide, mindestens 93 Nukleotide, mindestens 94 Nukleotide, mindestens 95 Nukleotide, mindestens 96 Nukleotide, mindestens 97 Nukleotide, mindestens 98 Nukleotide, mindestens 99 Nukleotide, mindestens 100 Nukleotide, mindestens 101 Nukleotide, mindestens 102 Nukleotide, mindestens 103 Nukleotide, mindestens 104 Nukleotide, mindestens 105 Nukleotide, mindestens 106 Nukleotide, mindestens 107 Nukleotide, mindestens 108 Nukleotide, mindestens 109 Nukleotide oder mindestens 110 Nukleotide lang ist.
  204. Verfahren nach Anspruch 202 oder 203, wobei die zusammenhängende Region vom Duplex ersetzt wird.
  205. Verfahren nach einem der Ansprüche 181-204, wobei die erste, zweite, dritte und/oder vierte DNA-Synthese-Template mindestens 1 Nukleotid, mindestens 2 Nukleotide, mindestens 3 Nukleotide, mindestens 4 Nukleotide, mindestens 5 Nukleotide, mindestens 6 Nukleotide, mindestens 7 Nukleotide, mindestens 8 Nukleotide, mindestens 9 Nukleotide, mindestens 10 Nukleotide, mindestens 11 Nukleotide, mindestens 12 Nukleotide, mindestens 13 Nukleotide, mindestens 14 Nukleotide, mindestens 15 Nukleotide, mindestens 16 Nukleotide, mindestens 17 Nukleotide, mindestens 18 Nukleotide, mindestens 19 Nukleotide, mindestens 20 Nukleotide, mindestens 21 Nukleotide, mindestens 22 Nukleotide, mindestens 23 Nukleotide, mindestens 24 Nukleotide, mindestens 25 Nukleotide, mindestens 26 Nukleotide, mindestens 27 Nukleotide, mindestens 28 Nukleotide, mindestens 29 Nukleotide, mindestens 30 Nukleotide, mindestens 31 Nukleotide, mindestens 32 Nukleotide, mindestens 33 Nukleotide, mindestens 34 Nukleotide, mindestens 35 Nukleotide, mindestens 36 Nukleotide, mindestens 37 Nukleotide, mindestens 38 Nukleotide, mindestens 39 Nukleotide, mindestens 40 Nukleotide, mindestens 41 Nukleotide, mindestens 42 Nukleotide, mindestens 43 Nukleotide, mindestens 44 Nukleotide, mindestens 45 Nukleotide, mindestens 46 Nukleotide, mindestens 47 Nukleotide, mindestens 48 Nukleotide, mindestens 49 Nukleotide, mindestens 50 Nukleotide, mindestens 51 Nukleotide, mindestens 52 Nukleotide, mindestens 53 Nukleotide, mindestens 54 Nukleotide, mindestens 55 Nukleotide, mindestens 56 Nukleotide, mindestens 57 Nukleotide, mindestens 58 Nukleotide, mindestens 59 Nukleotide, mindestens 60 Nukleotide, mindestens 61 Nukleotide, mindestens 62 Nukleotide, mindestens 63 Nukleotide, mindestens 64 Nukleotide, mindestens 65 Nukleotide, mindestens 66 Nukleotide, mindestens 67 Nukleotide, mindestens 68 Nukleotide, mindestens 69 Nukleotide, mindestens 70 Nukleotide, mindestens 71 Nukleotide, mindestens 72 Nukleotide, mindestens 73 Nukleotide, mindestens 74 Nukleotide, mindestens 75 Nukleotide, mindestens 76 Nukleotide, mindestens 77 Nukleotide, mindestens 78 Nukleotide, mindestens 79 Nukleotide, mindestens 80 Nukleotide, mindestens 81 Nukleotide, mindestens 82 Nukleotide, mindestens 83 Nukleotide, mindestens 84 Nukleotide, mindestens 85 Nukleotide, mindestens 86 Nukleotide, mindestens 87 Nukleotide, mindestens 88 Nukleotide, mindestens 89 Nukleotide, mindestens 90 Nukleotide, mindestens 91 Nukleotide, mindestens 92 Nukleotide, mindestens 93 Nukleotide, mindestens 94 Nukleotide, mindestens 95 Nukleotide, mindestens 96 Nukleotide, mindestens 97 Nukleotide, mindestens 98 Nukleotide, mindestens 99 Nukleotide, mindestens 100 Nukleotide, mindestens 101 Nukleotide, mindestens 102 Nukleotide, mindestens 103 Nukleotide, mindestens 104 Nukleotide, mindestens 105 Nukleotide, mindestens 106 Nukleotide, mindestens 107 Nukleotide, mindestens 108 Nukleotide, mindestens 109 Nukleotide oder mindestens 110 Nukleotide lang ist.
  206. Verfahren nach einem der Ansprüche 181-205, wobei die erste einzelsträngige DNA- Sequenz und die zweite einzelsträngige DNA-Sequenz und/oder die dritte einzelsträngige DNA-Sequenz und die vierte einzelsträngige DNA-Sequenz die gleichen Längen aufweisen.
  207. Verfahren nach einem der Ansprüche 181-206, wobei die erste einzelsträngige DNA- Sequenz und die zweite einzelsträngige DNA-Sequenz und/oder die dritte einzelsträngige DNA-Sequenz und die vierte einzelsträngige DNA-Sequenz unterschiedliche Längen aufweisen.
  208. Verfahren nach einem der Ansprüche 181-207, wobei die Komplementaritätsregion mindestens 99 %, mindestens 95 %, mindestens 90 %, mindestens 85 %, mindestens 80 %, mindestens 75 %, mindestens 70 %, mindestens 65 %, mindestens 60 %, mindestens 55 %, mindestens 50 %, mindestens 45 %, mindestens 40 %, mindestens 35 %, mindestens 30 %, mindestens 25 %, mindestens 20 %, mindestens 15 % oder mindestens 10 % der Gesamtlänge der ersten einzelsträngigen DNA-Sequenz und der zweiten einzelsträngigen DNA-Sequenz oder der dritten einzelsträngigen DNA-Sequenz und der vierten einzelsträngigen DNA- Sequenz beträgt.
  209. Verfahren nach einem der Ansprüche 181-208, wobei die Komplementaritätsregion mindestens 5 Nukleotide, mindestens 6 Nukleotide, mindestens 7 Nukleotide, mindestens 8 Nukleotide, mindestens 9 Nukleotide, mindestens 10 Nukleotide, mindestens 11 Nukleotide, mindestens 12 Nukleotide, mindestens 13 Nukleotide, mindestens 14 Nukleotide, mindestens 15 Nukleotide, mindestens 16 Nukleotide, mindestens 17 Nukleotide, mindestens 18 Nukleotide, mindestens 19 Nukleotide, mindestens 20 Nukleotide, mindestens 21 Nukleotide, mindestens 22 Nukleotide, mindestens 23 Nukleotide, mindestens 24 Nukleotide, mindestens 25 Nukleotide, mindestens 26 Nukleotide, mindestens 27 Nukleotide, mindestens 28 Nukleotide, mindestens 29 Nukleotide, mindestens 30 Nukleotide, mindestens 31 Nukleotide, mindestens 32 Nukleotide, mindestens 33 Nukleotide, mindestens 34 Nukleotide, mindestens 35 Nukleotide, mindestens 36 Nukleotide, mindestens 37 Nukleotide, mindestens 38 Nukleotide, mindestens 39 Nukleotide, mindestens 40 Nukleotide, mindestens 41 Nukleotide, mindestens 42 Nukleotide, mindestens 43 Nukleotide, mindestens 44 Nukleotide, mindestens 45 Nukleotide, mindestens 46 Nukleotide, mindestens 47 Nukleotide, mindestens 48 Nukleotide, mindestens 49 Nukleotide, mindestens 50 Nukleotide, mindestens 51 Nukleotide, mindestens 52 Nukleotide, mindestens 53 Nukleotide, mindestens 54 Nukleotide, mindestens 55 Nukleotide, mindestens 56 Nukleotide, mindestens 57 Nukleotide, mindestens 58 Nukleotide, mindestens 59 Nukleotide, mindestens 60 Nukleotide, mindestens 61 Nukleotide, mindestens 62 Nukleotide, mindestens 63 Nukleotide, mindestens 64 Nukleotide, mindestens 65 Nukleotide, mindestens 66 Nukleotide, mindestens 67 Nukleotide, mindestens 68 Nukleotide, mindestens 69 Nukleotide, mindestens 70 Nukleotide, mindestens 71 Nukleotide, mindestens 72 Nukleotide, mindestens 73 Nukleotide, mindestens 74 Nukleotide, mindestens 75 Nukleotide, mindestens 76 Nukleotide, mindestens 77 Nukleotide, mindestens 78 Nukleotide, mindestens 79 Nukleotide, mindestens 80 Nukleotide, mindestens 81 Nukleotide, mindestens 82 Nukleotide, mindestens 83 Nukleotide, mindestens 84 Nukleotide, mindestens 85 Nukleotide, mindestens 86 Nukleotide, mindestens 87 Nukleotide, mindestens 88 Nukleotide, mindestens 89 Nukleotide, mindestens 90 Nukleotide, mindestens 91 Nukleotide, mindestens 92 Nukleotide, mindestens 93 Nukleotide, mindestens 94 Nukleotid, mindestens 95 Nukleotide, mindestens 96 Nukleotide, mindestens 97 Nukleotide, mindestens 98 Nukleotide, mindestens 99 Nukleotide, mindestens 100 Nukleotide, mindestens 101 Nukleotide, mindestens 102 Nukleotide, mindestens 103 Nukleotide, mindestens 104 Nukleotide, mindestens 105 Nukleotide, mindestens 106 Nukleotide, mindestens 107 Nukleotide, mindestens 108 Nukleotide, mindestens 109 Nukleotide oder mindestens 110 Nukleotide lang ist.
  210. Verfahren nach einem der Ansprüche 188-209, wobei die Komplementaritätsregion der ersten einzelsträngigen DNA-Sequenz und der zweiten einzelsträngige DNA-Sequenz und/oder der dritten einzelsträngigen DNA-Sequenz und der vierten einzelsträngige DNA- Sequenz den Duplex formen.
  211. Verfahren nach einem der Ansprüche 188-210, wobei die erste einzelsträngige DNA- Sequenz und die zweite einzelsträngige DNA-Sequenz und/oder die dritte einzelsträngige DNA-Sequenz und die vierte einzelsträngige DNA-Sequenz alle einzelsträngige DNA-Stränge mit 3'-Enden sind.
  212. Verfahren nach Anspruch 204, wobei das Ersetzen der zusammenhängenden Region durch den Duplex, der den editierten Teil umfasst, zu einer Insertion, Deletion oder einem Ersetzen von DNA an der Zielstelle führt.
  213. Verfahren nach einem der Ansprüche 181-212, wobei sich die erste einzelsträngige DNA-Sequenz und die zweite einzelsträngige DNA-Sequenz an den Enden der Ziel-DNA- Sequenz befinden und wobei sich die dritte einzelsträngige DNA-Sequenz und die vierte einzelsträngige DNA-Sequenz an den gegenüberliegenden Enden der gleichen Ziel-DNA- Sequenz befinden.
  214. Verfahren nach Anspruch 213, wobei die Ziel-DNA-Sequenz invertiert wird.
  215. Verfahren nach einem der Ansprüche 181-214, das überdies einen zirkulären DNA- Donor umfasst.
  216. Verfahren nach einem der Ansprüche 215, wobei sich die erste einzelsträngige DNA- Sequenz und die dritte einzelsträngige DNA-Sequenz an unterschiedlichen Enden der DNA- Zielsequenz befinden und wobei sich die zweite einzelsträngige DNA-Sequenz und die vierte einzelsträngige DNA-Sequenz am zirkulären DNA-Donor befinden.
  217. Verfahren nach Anspruch 216, wobei ein Teil des zirkulären DNA-Donors zwischen der zweiten einzelsträngigen DNA-Sequenz und der vierten einzelsträngigen DNA-Sequenz die Zielsequenz zwischen der ersten einzelsträngigen DNA-Sequenz und der dritten einzelsträngigen DNA-Sequenz ersetzt.
  218. Verfahren nach einem der Ansprüche 181-217, wobei sich die erste einzelsträngige DNA-Sequenz und die dritte einzelsträngige DNA-Sequenz auf einem Nukleinsäuremolekül befinden und wobei sich die zweite einzelsträngige DNA-Sequenz und die vierte einzelsträngige DNA-Sequenz auf einem zweiten Nukleinsäuremolekül befinden.
  219. Verfahren nach Anspruch 218, wobei ein Teil des ersten Nukleinsäuremoleküls zwischen der ersten einzelsträngigen DNA-Sequenz und der dritten einzelsträngigen DNA- Sequenz in das zweite Nukleinsäuremolekül eingebaut wird und wobei ein Teil des zweiten Nukleinsäuremoleküls zwischen der zweiten einzelsträngigen DNA-Sequenz und der vierten einzelsträngigen DNA-Sequenz in das erste Nukleinsäuremolekül eingebaut wird.
  220. Verfahren nach Anspruch 218 oder 219, wobei das erste Nukleinsäuremolekül ein erstes Chromosom ist und das zweite Nukleinsäuremolekül ein zweites Chromosom ist.
  221. PEgRNA-Set, das im Multi-Flap-Prime-Editing verwendet wird, wobei die PEgRNAs Folgendes umfassen: (a) eine erste Prime-Editing-Guide-RNA (erste PEgRNA), die an eine erste Bindungsstelle auf einem ersten Strang einer doppelsträngigen DNA-Sequenz stromaufwärts der zu editierenden Zielstelle anbindet, wobei die erste PEgRNA eine erste Spacer-Sequenz, einen ersten gRNA-Kern, eine erste DNA-Synthese-Template und eine erste Primer-Bindungsstelle umfasst, wobei die erste DNA-Synthese-Template eine erste einzelsträngige DNA-Sequenz kodiert; (b) eine zweite Prime-Editing-Guide-RNA (zweite PEgRNA), die an eine zweite Bindungsstelle auf einem zweiten Strang einer doppelsträngigen DNA-Sequenz stromaufwärts der zu editierenden Zielstelle anbindet, wobei die zweite PEgRNA eine zweite Spacer- Sequenz, einen zweiten gRNA-Kern, eine zweite DNA-Synthese-Template und eine zweite Primer-Bindungsstelle umfasst, wobei die zweite DNA-Synthese-Template eine zweite einzelsträngige DNA-Sequenz kodiert, die den editierten Teil enthält, wobei die zweite einzelsträngige DNA-Sequenz komplementär zur ersten einzelsträngigen DNA-Sequenz ist. (c) eine dritte Prime-Editing-Guide-RNA (dritte PEgRNA), die an eine dritte Bindungsstelle auf einem ersten Strang einer doppelsträngigen DNA-Sequenz stromabwärts der zu editierenden Zielstelle anbindet, wobei die dritte PEgRNA eine dritte Spacer-Sequenz, einen dritten gRNA-Kern, eine dritte DNA-Synthese-Template und eine dritte Primer- Bindungsstelle umfasst, wobei die dritte DNA-Synthese-Template eine dritte einzelsträngige DNA-Sequenz kodiert; (d) eine vierte Prime-Editing-Guide-RNA (vierte PEgRNA), die an eine vierte Bindungsstelle auf einem zweiten Strang einer doppelsträngigen DNA-Sequenz stromabwärts der zu editierenden Zielstelle anbindet, wobei die vierte PEgRNA eine vierte Spacer-Sequenz, einen vierten gRNA-Kern, eine vierte DNA-Synthese-Template und eine vierte Primer- Bindungsstelle umfasst, wobei die vierte DNA-Synthese-Template eine vierte einzelsträngige DNA-Sequenz kodiert, wobei die vierte einzelsträngige DNA-Sequenz eine Komplementaritätsregion mit der dritten einzelsträngigen DNA-Sequenz aufweist.
  222. PEgRNA-Set nach Anspruch 221, wobei die erste PEgRNA folgende Struktur umfasst: 5'-[erste gRNA-Spacer-Sequenz]-[erster gRNA-Kern]-[erste DNA-Synthese-Template]-[erste Primer-Bindungsstelle]-3'; die zweite PEgRNA folgende Struktur umfasst: 5'-[zweite gRNA-Spacer-Sequenz]-[zweiter gRNA-Kern]-[zweite DNA-Synthese-Template]- [zweite Primer-Bindungsstelle]-3'; die dritte PEgRNA folgende Struktur umfasst: 5'-[dritte gRNA-Spacer-Sequenz]-[dritte gRNA-Kem]-[dritte DNA-Synthese-Template]- [dritte Primer-Bindungsstelle]-3'; und die vierte PEgRNA folgende Struktur umfasst: 5'-[vierte gRNA-Spacer-Sequenz]-[vierter gRNA-Kern]-[vierte DNA-Synthese-Template]- [vierte Primer-Bindungsstelle]-3'.
  223. PEgRNA-Set nach Anspruch 221 oder 222, wobei die erste einzelsträngige DNA- Sequenz und die zweite einzelsträngige DNA-Sequenz und/oder die dritte einzelsträngige DNA-Sequenz und die vierte einzelsträngige DNA-Sequenz einen Duplex bilden, der sich an der zu editierenden Zielstelle in die doppelsträngige DNA-Sequenz integriert.
  224. PEgRNA-Set nach einem der Ansprüche 221-223, wobei das Integrieren des Duplex zu einer Insertion, Deletion oder einem Ersetzen von DNA an der Zielstelle führt.
  225. PEgRNA-Set nach Anspruch 224, wobei die Insertion mindestens 1 Nukleotid, mindestens 2 Nukleotide, mindestens 3 Nukleotide, mindestens 4 Nukleotide, mindestens 5 Nukleotide, mindestens 6 Nukleotide, mindestens 7 Nukleotide, mindestens 8 Nukleotide, mindestens 9 Nukleotide, mindestens 10 Nukleotide, mindestens 11 Nukleotide, mindestens 12 Nukleotide, mindestens 13 Nukleotide, mindestens 14 Nukleotide, mindestens 15 Nukleotide, mindestens 16 Nukleotide, mindestens 17 Nukleotide, mindestens 18 Nukleotide, mindestens 19 Nukleotide, mindestens 20 Nukleotide, mindestens 21 Nukleotide, mindestens 22 Nukleotide, mindestens 23 Nukleotide, mindestens 24 Nukleotide, mindestens 25 Nukleotide, mindestens 26 Nukleotide, mindestens 27 Nukleotide, mindestens 28 Nukleotide, mindestens 29 Nukleotide, mindestens 30 Nukleotide, mindestens 31 Nukleotide, mindestens 32 Nukleotide, mindestens 33 Nukleotide, mindestens 34 Nukleotide, mindestens 35 Nukleotide, mindestens 36 Nukleotide, mindestens 37 Nukleotide, mindestens 38 Nukleotide, mindestens 39 Nukleotide, mindestens 40 Nukleotide, mindestens 41 Nukleotide, mindestens 42 Nukleotide, mindestens 43 Nukleotide, mindestens 44 Nukleotide, mindestens 45 Nukleotide, mindestens 46 Nukleotide, mindestens 47 Nukleotide, mindestens 48 Nukleotide, mindestens 49 Nukleotide, mindestens 50 Nukleotide, mindestens 51 Nukleotide, mindestens 52 Nukleotide, mindestens 53 Nukleotide, mindestens 54 Nukleotide, mindestens 55 Nukleotide, mindestens 56 Nukleotide, mindestens 57 Nukleotide, mindestens 58 Nukleotide, mindestens 59 Nukleotide, mindestens 60 Nukleotide, mindestens 61 Nukleotide, mindestens 62 Nukleotide, mindestens 63 Nukleotide, mindestens 64 Nukleotide, mindestens 65 Nukleotide, mindestens 66 Nukleotide, mindestens 67 Nukleotide, mindestens 68 Nukleotide, mindestens 69 Nukleotide, mindestens 70 Nukleotide, mindestens 71 Nukleotide, mindestens 72 Nukleotide, mindestens 73 Nukleotide, mindestens 74 Nukleotide, mindestens 75 Nukleotide, mindestens 76 Nukleotide, mindestens 77 Nukleotide, mindestens 78 Nukleotide, mindestens 79 Nukleotide, mindestens 80 Nukleotide, mindestens 81 Nukleotide, mindestens 82 Nukleotide, mindestens 83 Nukleotide, mindestens 84 Nukleotide, mindestens 85 Nukleotide, mindestens 86 Nukleotide, mindestens 87 Nukleotide, mindestens 88 Nukleotide, mindestens 89 Nukleotide, mindestens 90 Nukleotid, mindestens 91 Nukleotide, mindestens 92 Nukleotide, mindestens 93 Nukleotide, mindestens 94 Nukleotide, mindestens 95 Nukleotide, mindestens 96 Nukleotide, mindestens 97 Nukleotide, mindestens 98 Nukleotide, mindestens 99 Nukleotide, mindestens 100 Nukleotide, mindestens 101 Nukleotide, mindestens 102 Nukleotide, mindestens 103 Nukleotide, mindestens 104 Nukleotide, mindestens 105 Nukleotide, mindestens 106 Nukleotide, mindestens 107 Nukleotide, mindestens 108 Nukleotide, mindestens 109 Nukleotide oder mindestens 110 Nukleotide lang ist.
  226. PEgRNA-Set nach Anspruch 224, wobei die Deletion mindestens 1 Nukleotid, mindestens 2 Nukleotide, mindestens 3 Nukleotide, mindestens 4 Nukleotide, mindestens 5 Nukleotide, mindestens 6 Nukleotide, mindestens 7 Nukleotide, mindestens 8 Nukleotide, mindestens 9 Nukleotide, mindestens 10 Nukleotide, mindestens 11 Nukleotide, mindestens 12 Nukleotide, mindestens 13 Nukleotide, mindestens 14 Nukleotide, mindestens 15 Nukleotide, mindestens 16 Nukleotide, mindestens 17 Nukleotide, mindestens 18 Nukleotide, mindestens 19 Nukleotide, mindestens 20 Nukleotide, mindestens 21 Nukleotide, mindestens 22 Nukleotide, mindestens 23 Nukleotide, mindestens 24 Nukleotide, mindestens 25 Nukleotide, mindestens 26 Nukleotide, mindestens 27 Nukleotide, mindestens 28 Nukleotide, mindestens 29 Nukleotide, mindestens 30 Nukleotide, mindestens 31 Nukleotide, mindestens 32 Nukleotide, mindestens 33 Nukleotide, mindestens 34 Nukleotide, mindestens 35 Nukleotide, mindestens 36 Nukleotide, mindestens 37 Nukleotide, mindestens 38 Nukleotide, mindestens 39 Nukleotide, mindestens 40 Nukleotide, mindestens 41 Nukleotide, mindestens 42 Nukleotide, mindestens 43 Nukleotide, mindestens 44 Nukleotide, mindestens 45 Nukleotide, mindestens 46 Nukleotide, mindestens 47 Nukleotide, mindestens 48 Nukleotide, mindestens 49 Nukleotide, mindestens 50 Nukleotide, mindestens 51 Nukleotide, mindestens 52 Nukleotide, mindestens 53 Nukleotide, mindestens 54 Nukleotide, mindestens 55 Nukleotide, mindestens 56 Nukleotide, mindestens 57 Nukleotide, mindestens 58 Nukleotide, mindestens 59 Nukleotide, mindestens 60 Nukleotide, mindestens 61 Nukleotide, mindestens 62 Nukleotide, mindestens 63 Nukleotide, mindestens 64 Nukleotide, mindestens 65 Nukleotide, mindestens 66 Nukleotide, mindestens 67 Nukleotide, mindestens 68 Nukleotide, mindestens 69 Nukleotide, mindestens 70 Nukleotide, mindestens 71 Nukleotide, mindestens 72 Nukleotide, mindestens 73 Nukleotide, mindestens 74 Nukleotide, mindestens 75 Nukleotide, mindestens 76 Nukleotide, mindestens 77 Nukleotide, mindestens 78 Nukleotide, mindestens 79 Nukleotide, mindestens 80 Nukleotide, mindestens 81 Nukleotide, mindestens 82 Nukleotide, mindestens 83 Nukleotide, mindestens 84 Nukleotide, mindestens 85 Nukleotide, mindestens 86 Nukleotide, mindestens 87 Nukleotide, mindestens 88 Nukleotide, mindestens 89 Nukleotide, mindestens 90 Nukleotid, mindestens 91 Nukleotide, mindestens 92 Nukleotide, mindestens 93 Nukleotide, mindestens 94 Nukleotide, mindestens 95 Nukleotide, mindestens 96 Nukleotide, mindestens 97 Nukleotide, mindestens 98 Nukleotide, mindestens 99 Nukleotide, mindestens 100 Nukleotide, mindestens 101 Nukleotide, mindestens 102 Nukleotide, mindestens 103 Nukleotide, mindestens 104 Nukleotide, mindestens 105 Nukleotide, mindestens 106 Nukleotide, mindestens 107 Nukleotide, mindestens 108 Nukleotide, mindestens 109 Nukleotide oder mindestens 110 Nukleotide lang ist.
  227. PEgRNA-Set nach Anspruch 224, wobei der Ersatz mindestens 1 Nukleotid, mindestens 2 Nukleotide, mindestens 3 Nukleotide, mindestens 4 Nukleotide, mindestens 5 Nukleotide, mindestens 6 Nukleotide, mindestens 7 Nukleotide, mindestens 8 Nukleotide, mindestens 9 Nukleotide, mindestens 10 Nukleotide, mindestens 11 Nukleotide, mindestens 12 Nukleotide, mindestens 13 Nukleotide, mindestens 14 Nukleotide, mindestens 15 Nukleotide, mindestens 16 Nukleotide, mindestens 17 Nukleotide, mindestens 18 Nukleotide, mindestens 19 Nukleotide, mindestens 20 Nukleotide, mindestens 21 Nukleotide, mindestens 22 Nukleotide, mindestens 23 Nukleotide, mindestens 24 Nukleotide, mindestens 25 Nukleotide, mindestens 26 Nukleotide, mindestens 27 Nukleotide, mindestens 28 Nukleotide, mindestens 29 Nukleotide, mindestens 30 Nukleotide, mindestens 31 Nukleotide, mindestens 32 Nukleotide, mindestens 33 Nukleotide, mindestens 34 Nukleotide, mindestens 35 Nukleotide, mindestens 36 Nukleotide, mindestens 37 Nukleotide, mindestens 38 Nukleotide, mindestens 39 Nukleotide, mindestens 40 Nukleotide, mindestens 41 Nukleotide, mindestens 42 Nukleotide, mindestens 43 Nukleotide, mindestens 44 Nukleotide, mindestens 45 Nukleotide, mindestens 46 Nukleotide, mindestens 47 Nukleotide, mindestens 48 Nukleotide, mindestens 49 Nukleotide, mindestens 50 Nukleotide, mindestens 51 Nukleotide, mindestens 52 Nukleotide, mindestens 53 Nukleotide, mindestens 54 Nukleotide, mindestens 55 Nukleotide, mindestens 56 Nukleotide, mindestens 57 Nukleotide, mindestens 58 Nukleotide, mindestens 59 Nukleotide, mindestens 60 Nukleotide, mindestens 61 Nukleotide, mindestens 62 Nukleotide, mindestens 63 Nukleotide, mindestens 64 Nukleotide, mindestens 65 Nukleotide, mindestens 66 Nukleotide, mindestens 67 Nukleotide, mindestens 68 Nukleotide, mindestens 69 Nukleotide, mindestens 70 Nukleotide, mindestens 71 Nukleotide, mindestens 72 Nukleotide, mindestens 73 Nukleotide, mindestens 74 Nukleotide, mindestens 75 Nukleotide, mindestens 76 Nukleotide, mindestens 77 Nukleotide, mindestens 78 Nukleotide, mindestens 79 Nukleotide, mindestens 80 Nukleotide, mindestens 81 Nukleotide, mindestens 82 Nukleotide, mindestens 83 Nukleotide, mindestens 84 Nukleotide, mindestens 85 Nukleotide, mindestens 86 Nukleotide, mindestens 87 Nukleotide, mindestens 88 Nukleotide, mindestens 89 Nukleotide, mindestens 90 Nukleotid, mindestens 91 Nukleotide, mindestens 92 Nukleotide, mindestens 93 Nukleotide, mindestens 94 Nukleotide, mindestens 95 Nukleotide, mindestens 96 Nukleotide, mindestens 97 Nukleotide, mindestens 98 Nukleotide, mindestens 99 Nukleotide, mindestens 100 Nukleotide, mindestens 101 Nukleotide, mindestens 102 Nukleotide, mindestens 103 Nukleotide, mindestens 104 Nukleotide, mindestens 105 Nukleotide, mindestens 106 Nukleotide, mindestens 107 Nukleotide, mindestens 108 Nukleotide, mindestens 109 Nukleotide oder mindestens 110 Nukleotide lang ist.
  228. Polynukleotid, das ein PEgRNA-Set nach einem der Ansprüche 221-227 kodiert.
  229. Vektor, der das Polynukleotid aus Anspruch 228 umfasst, für die Expression einer Vielzahl von PEgRNAs in einer Zelle.
  230. Zelle, die den Vektor nach Anspruch 229 umfasst.
  231. Pharmazeutische Zusammensetzung, die eine Vielzahl von PEgRNAs nach einem der Ansprüche 221-227, einen Vektor nach Anspruch 229 oder eine Zelle nach Anspruch 230 und einen pharmazeutisch verträglichen Hilfsstoff umfasst.
  232. Verfahren zum Modifizieren eines Genoms in einer Zelle, das Folgendes umfasst: (i) das Inkontaktbringen eines Genoms mit einem Dual-Flap-Prime-Editing-System, wobei besagtes System einen ersten Prime-Editor- / PegRNA-Komplex umfasst, der ein erstes 3'-Nukleinsäure-Flap an der ersten Nick-Stelle auf einem ersten Strang einer Zielstelle installieren kann, und einen zweiter Prime-Editor- / PEgRNA-Komplex umfasst, der ein zweites 3'-Nukleinsäure-Flap an einer zweiten Nick-Stelle auf einem zweiten Strang der Zielstelle installieren kann, wobei das erste 3'-Nukleinsäure-Flap und das zweite 3'-Nukleinsäure-Flap reverse Komplementsequenzen sind, die einen Duplex formen, und wobei der Duplex eine erste Rekombinasestelle umfasst und wobei die Zelle den Duplex, der die erste Rekombinasestelle umfasst, an der Zielstelle statt eines endogenen Duplex installiert, der sich zwischen der ersten und zweiten Nick-Stelle befindet; (ii) das Inkontaktbringen der ersten Rekombinasestelle mit einer Donor-Nukleinsäure, welche die zweite Rekombinasestelle umfasst; und (iii) das Inkontaktbringen des Genoms mit einer rekombinasefähigen Rekombination zwischen der ersten und zweiten Rekombinasestelle, wodurch die Donor-Nukleinsäure an der Zielstelle in das Genom integriert wird.
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Families Citing this family (52)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20150044192A1 (en) 2013-08-09 2015-02-12 President And Fellows Of Harvard College Methods for identifying a target site of a cas9 nuclease
WO2016022363A2 (en) 2014-07-30 2016-02-11 President And Fellows Of Harvard College Cas9 proteins including ligand-dependent inteins
AU2017308889B2 (en) 2016-08-09 2023-11-09 President And Fellows Of Harvard College Programmable Cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof
US10745677B2 (en) 2016-12-23 2020-08-18 President And Fellows Of Harvard College Editing of CCR5 receptor gene to protect against HIV infection
US11898179B2 (en) 2017-03-09 2024-02-13 President And Fellows Of Harvard College Suppression of pain by gene editing
US11560566B2 (en) 2017-05-12 2023-01-24 President And Fellows Of Harvard College Aptazyme-embedded guide RNAs for use with CRISPR-Cas9 in genome editing and transcriptional activation
WO2019023680A1 (en) 2017-07-28 2019-01-31 President And Fellows Of Harvard College METHODS AND COMPOSITIONS FOR EVOLUTION OF BASIC EDITORS USING PHAGE-ASSISTED CONTINUOUS EVOLUTION (PACE)
WO2019139645A2 (en) 2017-08-30 2019-07-18 President And Fellows Of Harvard College High efficiency base editors comprising gam
US11795443B2 (en) 2017-10-16 2023-10-24 The Broad Institute, Inc. Uses of adenosine base editors
CA3130488A1 (en) 2019-03-19 2020-09-24 David R. Liu Methods and compositions for editing nucleotide sequences
GB2614813A (en) 2020-05-08 2023-07-19 Harvard College Methods and compositions for simultaneous editing of both strands of a target double-stranded nucleotide sequence
JP2023543803A (ja) * 2020-09-24 2023-10-18 ザ ブロード インスティテュート，インコーポレーテッド プライム編集ガイドｒｎａ、その組成物、及びその使用方法
US20220145293A1 (en) 2020-10-21 2022-05-12 Massachusetts Institute Of Technology Systems, methods, and compositions for site-specific genetic engineering using programmable addition via site-specific targeting elements (paste)
US11884924B2 (en) 2021-02-16 2024-01-30 Inscripta, Inc. Dual strand nucleic acid-guided nickase editing
EP4349979A1 (de) 2021-05-27 2024-04-10 Institute Of Zoology, Chinese Academy Of Sciences Manipulierte cas12i-nuklease, effektorprotein und verwendung davon
CA3219487A1 (en) 2021-05-28 2022-12-01 Richard C. Mulligan Lipid particles containing a truncated baboon endogenous retrovirus (baev) envelope glycoprotein and related methods and uses
WO2023019229A1 (en) 2021-08-11 2023-02-16 Sana Biotechnology, Inc. Genetically modified primary cells for allogeneic cell therapy
WO2023019227A1 (en) 2021-08-11 2023-02-16 Sana Biotechnology, Inc. Genetically modified cells for allogeneic cell therapy to reduce complement-mediated inflammatory reactions
AU2022325955A1 (en) 2021-08-11 2024-02-08 Sana Biotechnology, Inc. Genetically modified cells for allogeneic cell therapy to reduce instant blood mediated inflammatory reactions
WO2023019226A1 (en) 2021-08-11 2023-02-16 Sana Biotechnology, Inc. Genetically modified cells for allogeneic cell therapy
GB202113933D0 (en) * 2021-09-29 2021-11-10 Genome Res Ltd Methods for gene editing
WO2023069790A1 (en) 2021-10-22 2023-04-27 Sana Biotechnology, Inc. Methods of engineering allogeneic t cells with a transgene in a tcr locus and associated compositions and methods
WO2023076898A1 (en) * 2021-10-25 2023-05-04 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for editing a genome with prime editing and a recombinase
WO2023077148A1 (en) 2021-11-01 2023-05-04 Tome Biosciences, Inc. Single construct platform for simultaneous delivery of gene editing machinery and nucleic acid cargo
WO2023102481A1 (en) * 2021-12-02 2023-06-08 Inscripta, Inc. Trackable nucleic acid-guided editing
WO2023102550A2 (en) 2021-12-03 2023-06-08 The Broad Institute, Inc. Compositions and methods for efficient in vivo delivery
WO2023115041A1 (en) 2021-12-17 2023-06-22 Sana Biotechnology, Inc. Modified paramyxoviridae attachment glycoproteins
TW202342498A (zh) 2021-12-17 2023-11-01 美商薩那生物科技公司 經修飾副黏液病毒科融合醣蛋白
WO2023122023A1 (en) * 2021-12-20 2023-06-29 Inscripta, Inc. Targeted genomic barcoding for tracking of editing events
WO2023122764A1 (en) 2021-12-22 2023-06-29 Tome Biosciences, Inc. Co-delivery of a gene editor construct and a donor template
WO2023133595A2 (en) 2022-01-10 2023-07-13 Sana Biotechnology, Inc. Methods of ex vivo dosing and administration of lipid particles or viral vectors and related systems and uses
WO2023150518A1 (en) 2022-02-01 2023-08-10 Sana Biotechnology, Inc. Cd3-targeted lentiviral vectors and uses thereof
WO2023150647A1 (en) 2022-02-02 2023-08-10 Sana Biotechnology, Inc. Methods of repeat dosing and administration of lipid particles or viral vectors and related systems and uses
WO2023154011A2 (en) * 2022-02-08 2023-08-17 National University Of Singapore Compositions and methods for genome editing
WO2023158836A1 (en) 2022-02-17 2023-08-24 Sana Biotechnology, Inc. Engineered cd47 proteins and uses thereof
WO2023163806A1 (en) * 2022-02-22 2023-08-31 Massachusetts Institute Of Technology Engineered nucleases and methods of use thereof
WO2023205708A1 (en) * 2022-04-20 2023-10-26 Massachusetts Institute Of Technology SITE SPECIFIC GENETIC ENGINEERING UTILIZING TRANS-TEMPLATE RNAs
WO2023205710A1 (en) * 2022-04-20 2023-10-26 Massachusetts Institute Of Technology Programmable gene editing using guide rna pair
WO2023205744A1 (en) 2022-04-20 2023-10-26 Tome Biosciences, Inc. Programmable gene insertion compositions
WO2023215831A1 (en) 2022-05-04 2023-11-09 Tome Biosciences, Inc. Guide rna compositions for programmable gene insertion
WO2023225670A2 (en) 2022-05-20 2023-11-23 Tome Biosciences, Inc. Ex vivo programmable gene insertion
WO2023232024A1 (en) * 2022-05-30 2023-12-07 Wuhan University System and methods for duplicating target fragments
WO2023250174A1 (en) * 2022-06-23 2023-12-28 Prime Medicine, Inc. Split prime editors
CN115331736B (zh) * 2022-07-20 2023-07-25 佛山科学技术学院 基于文本匹配延伸高通量测序基因的拼接方法
WO2024020587A2 (en) 2022-07-22 2024-01-25 Tome Biosciences, Inc. Pleiopluripotent stem cell programmable gene insertion
WO2024026302A2 (en) * 2022-07-26 2024-02-01 Asimov Inc. Compositions and methods for adeno-associated viral production
WO2024026415A1 (en) * 2022-07-27 2024-02-01 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Compositions, systems, and methods for prime editing
WO2024038003A1 (en) * 2022-08-15 2024-02-22 Institut Pasteur Methods and systems for generating nucleic acid diversity in crispr-associated genes
WO2024044655A1 (en) 2022-08-24 2024-02-29 Sana Biotechnology, Inc. Delivery of heterologous proteins
WO2024042489A1 (en) 2022-08-25 2024-02-29 LifeEDIT Therapeutics, Inc. Chemical modification of guide rnas with locked nucleic acid for rna guided nuclease-mediated gene editing
WO2024064838A1 (en) 2022-09-21 2024-03-28 Sana Biotechnology, Inc. Lipid particles comprising variant paramyxovirus attachment glycoproteins and uses thereof
WO2024077267A1 (en) 2022-10-07 2024-04-11 The Broad Institute, Inc. Prime editing methods and compositions for treating triplet repeat disorders

Citations (68)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4186183A (en) 1978-03-29 1980-01-29 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Liposome carriers in chemotherapy of leishmaniasis
US4217344A (en) 1976-06-23 1980-08-12 L'oreal Compositions containing aqueous dispersions of lipid spheres
US4235871A (en) 1978-02-24 1980-11-25 Papahadjopoulos Demetrios P Method of encapsulating biologically active materials in lipid vesicles
US4261975A (en) 1979-09-19 1981-04-14 Merck & Co., Inc. Viral liposome particle
US4485054A (en) 1982-10-04 1984-11-27 Lipoderm Pharmaceuticals Limited Method of encapsulating biologically active materials in multilamellar lipid vesicles (MLV)
US4501728A (en) 1983-01-06 1985-02-26 Technology Unlimited, Inc. Masking of liposomes from RES recognition
US4663290A (en) 1982-01-21 1987-05-05 Molecular Genetics, Inc. Production of reverse transcriptase
US4774085A (en) 1985-07-09 1988-09-27 501 Board of Regents, Univ. of Texas Pharmaceutical administration systems containing a mixture of immunomodulators
US4797368A (en) 1985-03-15 1989-01-10 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Adeno-associated virus as eukaryotic expression vector
US4837028A (en) 1986-12-24 1989-06-06 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US4880635A (en) 1984-08-08 1989-11-14 The Liposome Company, Inc. Dehydrated liposomes
US4889818A (en) 1986-08-22 1989-12-26 Cetus Corporation Purified thermostable enzyme
US4897355A (en) 1985-01-07 1990-01-30 Syntex (U.S.A.) Inc. N[ω,(ω-1)-dialkyloxy]- and N-[ω,(ω-1)-dialkenyloxy]-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
US4906477A (en) 1987-02-09 1990-03-06 Kabushiki Kaisha Vitamin Kenkyusyo Antineoplastic agent-entrapping liposomes
US4911928A (en) 1987-03-13 1990-03-27 Micro-Pak, Inc. Paucilamellar lipid vesicles
US4917951A (en) 1987-07-28 1990-04-17 Micro-Pak, Inc. Lipid vesicles formed of surfactants and steroids
US4920016A (en) 1986-12-24 1990-04-24 Linear Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US4921757A (en) 1985-04-26 1990-05-01 Massachusetts Institute Of Technology System for delayed and pulsed release of biologically active substances
US4946787A (en) 1985-01-07 1990-08-07 Syntex (U.S.A.) Inc. N-(ω,(ω-1)-dialkyloxy)- and N-(ω,(ω-1)-dialkenyloxy)-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
US4965185A (en) 1988-06-22 1990-10-23 Grischenko Valentin I Method for low-temperature preservation of embryos
US5047342A (en) 1989-08-10 1991-09-10 Life Technologies, Inc. Cloning and expression of T5 DNA polymerase
US5049386A (en) 1985-01-07 1991-09-17 Syntex (U.S.A.) Inc. N-ω,(ω-1)-dialkyloxy)- and N-(ω,(ω-1)-dialkenyloxy)Alk-1-YL-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
WO1991016024A1 (en) 1990-04-19 1991-10-31 Vical, Inc. Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules
WO1991017424A1 (en) 1990-05-03 1991-11-14 Vical, Inc. Intracellular delivery of biologically active substances by means of self-assembling lipid complexes
US5079352A (en) 1986-08-22 1992-01-07 Cetus Corporation Purified thermostable enzyme
WO1992006200A1 (en) 1990-09-28 1992-04-16 F. Hoffmann-La-Roche Ag 5' to 3' exonuclease mutations of thermostable dna polymerases
WO1992006188A2 (en) 1990-10-05 1992-04-16 Barnes Wayne M Thermostable dna polymerase
US5139941A (en) 1985-10-31 1992-08-18 University Of Florida Research Foundation, Inc. AAV transduction vectors
US5173414A (en) 1990-10-30 1992-12-22 Applied Immune Sciences, Inc. Production of recombinant adeno-associated virus vectors
US5244797A (en) 1988-01-13 1993-09-14 Life Technologies, Inc. Cloned genes encoding reverse transcriptase lacking RNase H activity
WO1993024641A2 (en) 1992-06-02 1993-12-09 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services Adeno-associated virus with inverted terminal repeat sequences as promoter
US5270179A (en) 1989-08-10 1993-12-14 Life Technologies, Inc. Cloning and expression of T5 DNA polymerase reduced in 3'- to-5' exonuclease activity
US5374553A (en) 1986-08-22 1994-12-20 Hoffmann-La Roche Inc. DNA encoding a thermostable nucleic acid polymerase enzyme from thermotoga maritima
US5436149A (en) 1993-02-19 1995-07-25 Barnes; Wayne M. Thermostable DNA polymerase with enhanced thermostability and enhanced length and efficiency of primer extension
US5496714A (en) 1992-12-09 1996-03-05 New England Biolabs, Inc. Modification of protein by use of a controllable interveining protein sequence
WO1996010640A1 (en) 1994-09-30 1996-04-11 Life Technologies, Inc. Cloned dna polymerases from thermotoga neapolitana and mutants thereof
US5512462A (en) 1994-02-25 1996-04-30 Hoffmann-La Roche Inc. Methods and reagents for the polymerase chain reaction amplification of long DNA sequences
US5614365A (en) 1994-10-17 1997-03-25 President & Fellow Of Harvard College DNA polymerase having modified nucleotide binding site for DNA sequencing
US5677152A (en) 1995-08-25 1997-10-14 Roche Molecular Systems, Inc. Nucleic acid amplification using a reersibly inactivated thermostable enzyme
US5834247A (en) 1992-12-09 1998-11-10 New England Biolabs, Inc. Modified proteins comprising controllable intervening protein sequences or their elements methods of producing same and methods for purification of a target protein comprised by a modified protein
US5962313A (en) 1996-01-18 1999-10-05 Avigen, Inc. Adeno-associated virus vectors comprising a gene encoding a lyosomal enzyme
US6183998B1 (en) 1998-05-29 2001-02-06 Qiagen Gmbh Max-Volmer-Strasse 4 Method for reversible modification of thermostable enzymes
WO2001038547A2 (en) 1999-11-24 2001-05-31 Mcs Micro Carrier Systems Gmbh Polypeptides comprising multimers of nuclear localization signals or of protein transduction domains and their use for transferring molecules into cells
US6479264B1 (en) 1999-08-27 2002-11-12 Advanced Biotechnologies Limited Reversible inactivation enzymes
US20030087817A1 (en) 1999-01-12 2003-05-08 Sangamo Biosciences, Inc. Regulation of endogenous gene expression in cells using zinc finger proteins
KR100710351B1 (ko) 2004-06-28 2007-04-23 엘지전자 주식회사 접착형 유기 ｅｌ 디스플레이
WO2010028347A2 (en) 2008-09-05 2010-03-11 President & Fellows Of Harvard College Continuous directed evolution of proteins and nucleic acids
US20110059502A1 (en) 2009-09-07 2011-03-10 Chalasani Sreekanth H Multiple domain proteins
WO2012088381A2 (en) 2010-12-22 2012-06-28 President And Fellows Of Harvard College Continuous directed evolution
US20120322861A1 (en) 2007-02-23 2012-12-20 Barry John Byrne Compositions and Methods for Treating Diseases
WO2013045632A1 (en) 2011-09-28 2013-04-04 Era Biotech, S.A. Split inteins and uses thereof
US8440432B2 (en) 2009-12-10 2013-05-14 Regents Of The University Of Minnesota Tal effector-mediated DNA modification
US20140028330A1 (en) 2012-07-26 2014-01-30 General Electric Company Method and system for improved wireless sensing
WO2014055782A1 (en) 2012-10-03 2014-04-10 Agrivida, Inc. Intein-modified proteases, their production and industrial applications
EP2755986A1 (de) 2011-09-12 2014-07-23 Moderna Therapeutics, Inc. Manipulierte nukleinsäuren und anwendungsverfahren dafür
EP2755693A2 (de) 2011-09-12 2014-07-23 Moderna Therapeutics, Inc. Manipulierte nukleinsäuren und anwendungsverfahren dafür
US8822663B2 (en) 2010-08-06 2014-09-02 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
WO2014152940A1 (en) 2013-03-14 2014-09-25 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Mrna therapeutic compositions and use to treat diseases and disorders
WO2015027134A1 (en) 2013-08-22 2015-02-26 President And Fellows Of Harvard College Engineered transcription activator-like effector (tale) domains and uses thereof
EP2877490A2 (de) 2012-06-27 2015-06-03 The Trustees Of Princeton University Geteilte inteine, konjugate davon und verwendungen davon
WO2015134121A2 (en) 2014-01-20 2015-09-11 President And Fellows Of Harvard College Negative selection and stringency modulation in continuous evolution systems
US9181535B2 (en) 2012-09-24 2015-11-10 The Chinese University Of Hong Kong Transcription activator-like effector nucleases (TALENs)
WO2016069774A1 (en) 2014-10-28 2016-05-06 Agrivida, Inc. Methods and compositions for stabilizing trans-splicing intein modified proteases
WO2016168631A1 (en) 2015-04-17 2016-10-20 President And Fellows Of Harvard College Vector-based mutagenesis system
US9526784B2 (en) 2013-09-06 2016-12-27 President And Fellows Of Harvard College Delivery system for functional nucleases
EP3362461A1 (de) 2015-10-16 2018-08-22 Modernatx, Inc. Mrna-cap-analoga mit modifizierter phosphatverbindung
EP3450553B1 (de) 2014-03-24 2019-12-25 Translate Bio, Inc. Mrna-therapie zur behandlung von augenerkrankungen
ES2740248T3 (es) 2011-06-08 2020-02-05 Translate Bio Inc Composiciones de nanopartículas lipídicas y métodos para la administración ARNm

Family Cites Families (1764)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4182449A (en) 1978-04-18 1980-01-08 Kozlow William J Adhesive bandage and package
US4737323A (en) 1986-02-13 1988-04-12 Liposome Technology, Inc. Liposome extrusion method
US5017492A (en) 1986-02-27 1991-05-21 Life Technologies, Inc. Reverse transcriptase and method for its production
DE122007000007I1 (de) 1986-04-09 2007-05-16 Genzyme Corp Genetisch transformierte Tiere, die ein gewünschtes Protein in Milch absondern
JPH068256B2 (ja) 1987-04-23 1994-02-02 エフ エム シー コーポレーション 殺虫性シクロプロピル置換ジ（アリール）化合物類
US4873316A (en) 1987-06-23 1989-10-10 Biogen, Inc. Isolation of exogenous recombinant proteins from the milk of transgenic mammals
ES2065919T5 (es) 1987-12-15 2005-06-16 Gene Shears Pty Limited Ribozimas.
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
JP3771253B2 (ja) 1988-09-02 2006-04-26 ダイアックス コープ． 新規な結合タンパク質の生成と選択
JP3058686B2 (ja) 1989-08-31 2000-07-04 シティ・オブ・ホープ キメラｄｎａ―ｒｎａ触媒活性配列
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
US5637459A (en) 1990-06-11 1997-06-10 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: chimeric selex
US5580737A (en) 1990-06-11 1996-12-03 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. High-affinity nucleic acid ligands that discriminate between theophylline and caffeine
ES2061416T3 (es) 1990-10-12 1997-03-01 Max Planck Gesellschaft Ribozimas modificadas.
NZ241311A (en) 1991-01-17 1995-03-28 Gen Hospital Corp Rna sequence having trans-splicing activity, plant strains
NZ241310A (en) 1991-01-17 1995-03-28 Gen Hospital Corp Trans-splicing ribozymes
AU662148B2 (en) 1991-04-10 1995-08-24 Scripps Research Institute, The Heterodimeric receptor libraries using phagemids
DE4216134A1 (de) 1991-06-20 1992-12-24 Europ Lab Molekularbiolog Synthetische katalytische oligonukleotidstrukturen
US6872816B1 (en) 1996-01-24 2005-03-29 Third Wave Technologies, Inc. Nucleic acid detection kits
US5652094A (en) 1992-01-31 1997-07-29 University Of Montreal Nucleozymes
JPH05274181A (ja) 1992-03-25 1993-10-22 Nec Corp ブレークポイント設定・解除方式
US5434058A (en) 1993-02-09 1995-07-18 Arch Development Corporation Apolipoprotein B MRNA editing protein compositions and methods
KR960702518A (ko) 1993-05-17 1996-04-27 린다 에스, 스티븐슨 Hiv 감염 및 aids에 대한 리보자임 유전자 치료(ribozyme gene therapy for hiv infection and aids)
US5651981A (en) 1994-03-29 1997-07-29 Northwestern University Cationic phospholipids for transfection
US5874560A (en) 1994-04-22 1999-02-23 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Melanoma antigens and their use in diagnostic and therapeutic methods
US5449639A (en) 1994-10-24 1995-09-12 Taiwan Semiconductor Manufacturing Company Ltd. Disposable metal anti-reflection coating process used together with metal dry/wet etch
US5767099A (en) 1994-12-09 1998-06-16 Genzyme Corporation Cationic amphiphiles containing amino acid or dervatized amino acid groups for intracellular delivery of therapeutic molecules
US6057153A (en) 1995-01-13 2000-05-02 Yale University Stabilized external guide sequences
US5795587A (en) 1995-01-23 1998-08-18 University Of Pittsburgh Stable lipid-comprising drug delivery complexes and methods for their production
US5830430A (en) 1995-02-21 1998-11-03 Imarx Pharmaceutical Corp. Cationic lipids and the use thereof
US5851548A (en) 1995-06-07 1998-12-22 Gen-Probe Incorporated Liposomes containing cationic lipids and vitamin D
NO953680D0 (no) 1995-09-18 1995-09-18 Hans Prydz Cellesyklusenzymer
US6077705A (en) 1996-05-17 2000-06-20 Thomas Jefferson University Ribozyme-mediated gene replacement
US6887707B2 (en) 1996-10-28 2005-05-03 University Of Washington Induction of viral mutation by incorporation of miscoding ribonucleoside analogs into viral RNA
GB9701425D0 (en) 1997-01-24 1997-03-12 Bioinvent Int Ab A method for in vitro molecular evolution of protein function
US5981182A (en) 1997-03-13 1999-11-09 Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University Vector constructs for the selection and identification of open reading frames
US20040203109A1 (en) 1997-06-06 2004-10-14 Incyte Corporation Human regulatory proteins
US5849528A (en) 1997-08-21 1998-12-15 Incyte Pharmaceuticals, Inc.. Polynucleotides encoding a human S100 protein
US6355415B1 (en) 1997-09-29 2002-03-12 Ohio University Compositions and methods for the use of ribozymes to determine gene function
US6156509A (en) 1997-11-12 2000-12-05 Genencor International, Inc. Method of increasing efficiency of directed evolution of a gene using phagemid
US6429301B1 (en) 1998-04-17 2002-08-06 Whitehead Institute For Biomedical Research Use of a ribozyme to join nucleic acids and peptides
US8097648B2 (en) 1998-06-17 2012-01-17 Eisai R&D Management Co., Ltd. Methods and compositions for use in treating cancer
US6429298B1 (en) 1998-10-13 2002-08-06 Board Of Regents, The University Of Texas System Assays for identifying functional alterations in the p53 tumor suppressor
EP1829856A3 (de) 1998-11-12 2009-02-25 Invitrogen Corporation Transfektionsreagenzien
US7013219B2 (en) 1999-01-12 2006-03-14 Sangamo Biosciences, Inc. Regulation of endogenous gene expression in cells using zinc finger proteins
US6453242B1 (en) 1999-01-12 2002-09-17 Sangamo Biosciences, Inc. Selection of sites for targeting by zinc finger proteins and methods of designing zinc finger proteins to bind to preselected sites
US6599692B1 (en) 1999-09-14 2003-07-29 Sangamo Bioscience, Inc. Functional genomics using zinc finger proteins
US20090130718A1 (en) 1999-02-04 2009-05-21 Diversa Corporation Gene site saturation mutagenesis
WO2000058480A1 (fr) 1999-03-29 2000-10-05 Kansai Technology Licensing Organization Co., Ltd. Nouvelle cytidine desaminase
US6365410B1 (en) 1999-05-19 2002-04-02 Genencor International, Inc. Directed evolution of microorganisms
EP1230268B1 (de) 1999-11-18 2009-10-14 Pharmexa Inc. Heteroklitische analoga von klasse-i epitopen
EP1236045B1 (de) 1999-12-06 2005-11-09 Sangamo Biosciences Inc. Methoden zur verwendung von randomisierten zinkfingerprotein-bibliotheken zur identifizierung von genfunktionen
ATE483970T1 (de) 2000-02-08 2010-10-15 Sangamo Biosciences Inc Zellen zur entdeckung von medikamenten
US7378248B2 (en) 2000-03-06 2008-05-27 Rigel Pharmaceuticals, Inc. In vivo production of cyclic peptides for inhibiting protein-protein interaction
US7078208B2 (en) 2000-05-26 2006-07-18 Invitrogen Corporation Thermostable reverse transcriptases and uses thereof
US6573092B1 (en) 2000-10-10 2003-06-03 Genvec, Inc. Method of preparing a eukaryotic viral vector
CA2881568C (en) 2000-10-27 2019-09-24 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Nucleic acids and proteins from streptococcus groups a & b
US20040003420A1 (en) 2000-11-10 2004-01-01 Ralf Kuhn Modified recombinase
US7067650B1 (en) 2000-11-22 2006-06-27 National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology Ribozymes targeting bradeion transcripts and use thereof
AU2002227882B2 (en) 2001-01-25 2007-06-28 Evolva Ltd Concatemers of differentially expressed multiple genes
US20050222030A1 (en) 2001-02-21 2005-10-06 Anthony Allison Modified annexin proteins and methods for preventing thrombosis
ATE398180T1 (de) 2001-02-27 2008-07-15 Univ Rochester Verfahren und zusammensetzungen zur modifikation der bearbeitung von apolipoprotein b-mrna
US7678554B2 (en) 2001-03-19 2010-03-16 President And Fellows Of Harvard College Nucleic acid shuffling
US7807408B2 (en) 2001-03-19 2010-10-05 President & Fellows Of Harvard College Directed evolution of proteins
US7476500B1 (en) 2001-03-19 2009-01-13 President And Fellows Of Harvard College In vivo selection system for enzyme activity
ES2271306T5 (es) 2001-03-19 2013-10-16 President And Fellows Of Harvard College Evolución de una nueva función molecular
US20040197892A1 (en) 2001-04-04 2004-10-07 Michael Moore Composition binding polypeptides
DK2128246T3 (da) 2001-04-19 2014-05-12 Univ California Fremgangsmåder og sammensætninger til fremstilling af ortogonale tRNA-aminoacyl-tRNA-syntetasepar.
WO2002103028A2 (en) 2001-05-30 2002-12-27 Biomedical Center In silico screening for phenotype-associated expressed sequences
ATE432981T1 (de) 2001-07-26 2009-06-15 Stratagene California Multi-stellen-mutagenese
US20030167533A1 (en) 2002-02-04 2003-09-04 Yadav Narendra S. Intein-mediated protein splicing
ES2421596T3 (es) 2002-05-10 2013-09-04 Medical Res Council Desaminasa inducida por activación (AID)
AU2003274397A1 (en) 2002-06-05 2003-12-22 University Of Florida Production of pseudotyped recombinant aav virions
US9388459B2 (en) 2002-06-17 2016-07-12 Affymetrix, Inc. Methods for genotyping
EP1578932A4 (de) 2002-07-12 2006-08-30 Affymetrix Inc Synthetische tag-gene
WO2004016767A2 (en) 2002-08-19 2004-02-26 The President And Fellows Of Harvard College Evolving new molecular function
JP2006500030A (ja) 2002-09-20 2006-01-05 イェール ユニバーシティ リボスイッチ、その使用方法、ならびにリボスイッチとともに用いるための組成物
US8017323B2 (en) 2003-03-26 2011-09-13 President And Fellows Of Harvard College Free reactant use in nucleic acid-templated synthesis
EP1613962B1 (de) 2003-04-14 2008-10-29 Caliper Life Sciences, Inc. Reduktion der migrations-shift-assay-interferenz
US8017755B2 (en) 2003-05-23 2011-09-13 President And Fellows Of Harvard College RNA-based transcriptional regulators
US20050136429A1 (en) 2003-07-03 2005-06-23 Massachusetts Institute Of Technology SIRT1 modulation of adipogenesis and adipose function
AU2004267359B2 (en) 2003-07-07 2010-09-09 The Scripps Research Institute Compositions of orthogonal lysyl-tRNA and aminoacyl-tRNA synthetase pairs and uses thereof
EP1651660B1 (de) 2003-08-08 2018-01-24 Sangamo Therapeutics, Inc. Verfahren und zusammensetzungen zur gezielten spaltung und rekombination
US7670807B2 (en) 2004-03-10 2010-03-02 East Tennessee State Univ. Research Foundation RNA-dependent DNA polymerase from Geobacillus stearothermophilus
WO2005098043A2 (en) 2004-03-30 2005-10-20 The President And Fellows Of Harvard College Ligand-dependent protein splicing
US7595179B2 (en) 2004-04-19 2009-09-29 Applied Biosystems, Llc Recombinant reverse transcriptases
US7919277B2 (en) 2004-04-28 2011-04-05 Danisco A/S Detection and typing of bacterial strains
US7476734B2 (en) 2005-12-06 2009-01-13 Helicos Biosciences Corporation Nucleotide analogs
WO2006002547A1 (en) 2004-07-06 2006-01-12 UNIVERSITé DE SHERBROOKE A target-dependent nucleic acid adapter
US7851658B2 (en) 2004-08-17 2010-12-14 President And Fellows Of Harvard College Palladium-catalyzed carbon-carbon bond forming reactions
US8728526B2 (en) 2004-08-19 2014-05-20 The United States of America, Represented by Secretary of Department of Health and Human Services, NIH Coacervate microparticles useful for the sustained release administration of therapeutic agents
WO2006042112A2 (en) 2004-10-05 2006-04-20 California Institute Of Technology Aptamer regulated nucleic acids and uses thereof
US9034650B2 (en) * 2005-02-02 2015-05-19 Intrexon Corporation Site-specific serine recombinases and methods of their use
US8178291B2 (en) 2005-02-18 2012-05-15 Monogram Biosciences, Inc. Methods and compositions for determining hypersusceptibility of HIV-1 to non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors
JP2006248978A (ja) 2005-03-10 2006-09-21 Mebiopharm Co Ltd 新規なリポソーム製剤
DE602006013134D1 (de) 2005-06-17 2010-05-06 Harvard College Iterierte verzweigende reaktionswege über nukleinsäure-vermittelte chemie
WO2007011722A2 (en) 2005-07-15 2007-01-25 President And Fellows Of Harvard College Reaction discovery system
US9783791B2 (en) 2005-08-10 2017-10-10 Agilent Technologies, Inc. Mutant reverse transcriptase and methods of use
AU2012244264B2 (en) 2005-08-26 2015-08-06 Dupont Nutrition Biosciences Aps Use
NZ597299A (en) 2005-08-26 2013-03-28 Dupont Nutrition Biosci Aps Use of a cas gene in combination with CRISPR repeats for modulating resistance in a cell
AU2015252023B2 (en) 2005-08-26 2017-06-29 Dupont Nutrition Biosciences Aps Use
US20080241917A1 (en) 2005-09-30 2008-10-02 Hidetaka Akita Vector For Delivering Target Substance Into Nucleus or Cell
KR100784478B1 (ko) 2005-12-05 2007-12-11 한국과학기술원 기능요소의 동시 삽입에 의한 신기능을 갖는 단백질을제조하는 방법
US20080051317A1 (en) 2005-12-15 2008-02-28 George Church Polypeptides comprising unnatural amino acids, methods for their production and uses therefor
CA2960570C (en) 2006-05-05 2018-05-08 Molecular Transfer, Inc. Lipids for transfection of eukaryotic cells
ES2373586T3 (es) 2006-05-19 2012-02-06 Danisco A/S Microorganismos marcados y métodos para marcar.
EP3045532A1 (de) 2006-06-02 2016-07-20 President and Fellows of Harvard College Neugestaltung von proteinoberflächen
WO2007142202A1 (ja) 2006-06-06 2007-12-13 Panasonic Corporation ヌクレオチド鎖修飾方法
US7572618B2 (en) 2006-06-30 2009-08-11 Bristol-Myers Squibb Company Polynucleotides encoding novel PCSK9 variants
WO2008005529A2 (en) 2006-07-07 2008-01-10 The Trustees Columbia University In The City Of New York Cell-mediated directed evolution
CN104531672B (zh) 2007-03-02 2020-01-10 杜邦营养生物科学有限公司 具有改善的噬菌体抗性的培养物
EP2137300B1 (de) 2007-04-26 2011-10-26 Ramot at Tel-Aviv University Ltd. Pluripotente autologe Stammzellen aus der mündlichen oder gastrointestinalen Schleimhaut
WO2009002418A2 (en) 2007-06-21 2008-12-31 Merck & Co., Inc. T-cell peptide epitopes from carcinoembryonic antigen, immunogenic analogs, and uses thereof
FR2919804B1 (fr) 2007-08-08 2010-08-27 Erytech Pharma Composition et vaccin therapeutique anti-tumoral
US8183221B2 (en) 2007-09-05 2012-05-22 Medtronic, Inc. Suppression of SCN9A gene expression and/or function for the treatment of pain
WO2009042163A2 (en) 2007-09-27 2009-04-02 Sangamo Biosciences, Inc. Rapid in vivo identification of biologically active nucleases
US9029524B2 (en) 2007-12-10 2015-05-12 California Institute Of Technology Signal activated RNA interference
EP2087789A1 (de) 2008-02-06 2009-08-12 Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf FTO-modifiziertes nichtmenschliches Säugetier
CA2714378A1 (en) 2008-02-08 2009-08-13 Sangamo Biosciences, Inc. Treatment of chronic pain with zinc finger proteins
GB0806562D0 (en) 2008-04-10 2008-05-14 Fermentas Uab Production of nucleic acid
WO2009146179A1 (en) 2008-04-15 2009-12-03 University Of Iowa Research Foundation Zinc finger nuclease for the cftr gene and methods of use thereof
WO2009134808A2 (en) 2008-04-28 2009-11-05 President And Fellows Of Harvard College Supercharged proteins for cell penetration
US8394604B2 (en) 2008-04-30 2013-03-12 Paul Xiang-Qin Liu Protein splicing using short terminal split inteins
US8546553B2 (en) 2008-07-25 2013-10-01 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Prokaryotic RNAi-like system and methods of use
FR2934346B1 (fr) 2008-07-28 2010-09-03 Claude Benit Valve pour installation sanitaire et dispositif multifonction pour appareil sanitaire comprenant une telle valve
JP2010033344A (ja) 2008-07-29 2010-02-12 Azabu Jui Gakuen 核酸構成塩基の偏在性を表す方法
EP2159286A1 (de) 2008-09-01 2010-03-03 Consiglio Nazionale Delle Ricerche Verfahren zur Gewinnung von Oligonucleotid-Aptameren und Verwendungen damit
EP2331071A1 (de) 2008-09-05 2011-06-15 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale Neue multimodulare anordnung zur intrazellulären abgabe
US8636884B2 (en) 2008-09-15 2014-01-28 Abbott Diabetes Care Inc. Cationic polymer based wired enzyme formulations for use in analyte sensors
US20100076057A1 (en) 2008-09-23 2010-03-25 Northwestern University TARGET DNA INTERFERENCE WITH crRNA
WO2010054108A2 (en) 2008-11-06 2010-05-14 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Cas6 polypeptides and methods of use
WO2010054154A2 (en) 2008-11-07 2010-05-14 Danisco A/S Bifidobacteria crispr sequences
US20110016540A1 (en) 2008-12-04 2011-01-20 Sigma-Aldrich Co. Genome editing of genes associated with trinucleotide repeat expansion disorders in animals
CA2746632C (en) 2008-12-11 2020-06-30 Pacific Biosciences Of California, Inc. Characterization of modified nucleic acids
US9175338B2 (en) 2008-12-11 2015-11-03 Pacific Biosciences Of California, Inc. Methods for identifying nucleic acid modifications
WO2010075424A2 (en) 2008-12-22 2010-07-01 The Regents Of University Of California Compositions and methods for downregulating prokaryotic genes
WO2010091203A2 (en) 2009-02-04 2010-08-12 Lucigen Corporation Rna-and dna-copying enzymes
US8389679B2 (en) 2009-02-05 2013-03-05 The Regents Of The University Of California Targeted antimicrobial moieties
US20100305197A1 (en) 2009-02-05 2010-12-02 Massachusetts Institute Of Technology Conditionally Active Ribozymes And Uses Thereof
AU2010221284B2 (en) 2009-03-04 2015-10-01 Board Of Regents, The University Of Texas System Stabilized reverse transcriptase fusion proteins
DK2403944T3 (da) 2009-03-06 2019-05-27 Synthetic Genomics Inc Methods for cloning and manipulating genomes
CA2754764A1 (en) 2009-03-10 2010-09-16 Baylor Research Institute Antigen presenting cell targeted cancer vaccines
US8501405B2 (en) 2009-04-27 2013-08-06 Pacific Biosciences Of California, Inc. Real-time sequencing methods and systems
JP2012525146A (ja) 2009-04-28 2012-10-22 プレジデント アンド フェロウズ オブ ハーバード カレッジ 細胞透過のための過剰に荷電されたタンパク質
WO2010132092A2 (en) 2009-05-12 2010-11-18 The Scripps Research Institute Cytidine deaminase fusions and related methods
US9063156B2 (en) 2009-06-12 2015-06-23 Pacific Biosciences Of California, Inc. Real-time analytical methods and systems
JP5798116B2 (ja) 2009-06-30 2015-10-21 サンガモ バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッド 生物活性のあるヌクレアーゼの迅速なスクリーニングおよびヌクレアーゼ修飾細胞の単離
WO2011000106A1 (en) 2009-07-01 2011-01-06 Protiva Biotherapeutics, Inc. Improved cationic lipids and methods for the delivery of therapeutic agents
US20120178647A1 (en) 2009-08-03 2012-07-12 The General Hospital Corporation Engineering of zinc finger arrays by context-dependent assembly
EP2462230B1 (de) 2009-08-03 2015-07-15 Recombinetics, Inc. Verfahren und zusammensetzungen für gezielte genmodifikation
GB0913681D0 (en) 2009-08-05 2009-09-16 Glaxosmithkline Biolog Sa Immunogenic composition
MX2012005069A (es) 2009-10-30 2012-07-17 Synthetic Genomics Inc Codificar texto hacia secuencias de acido nucleico.
LT3460056T (lt) 2009-11-02 2020-12-28 University Of Washington Terapinės nukleazės kompozicijos ir būdai
US9175340B2 (en) 2009-11-04 2015-11-03 President And Fellows Of Harvard College Reactivity-dependent and interaction-dependent PCR
US20110104787A1 (en) 2009-11-05 2011-05-05 President And Fellows Of Harvard College Fusion Peptides That Bind to and Modify Target Nucleic Acid Sequences
WO2011068916A1 (en) 2009-12-01 2011-06-09 Intezyne Technologies, Incorporated Pegylated polyplexes for polynucleotide delivery
ME03327B (de) 2009-12-01 2019-10-20 Translate Bio Inc Steroidderivat zur ausgabe von mrna bei humangenetischen erkrankungen
US20130011380A1 (en) 2009-12-18 2013-01-10 Blau Helen M Use of Cytidine Deaminase-Related Agents to Promote Demethylation and Cell Reprogramming
AU2011207769B2 (en) 2010-01-22 2015-05-28 Corteva Agriscience Llc Targeted genomic alteration
UA113493C2 (xx) 2010-01-22 2017-02-10 Спосіб видалення ділянки днк в рослині
US9198983B2 (en) 2010-01-25 2015-12-01 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of Mylip/Idol gene
EP2542676A1 (de) 2010-03-05 2013-01-09 Synthetic Genomics, Inc. Verfahren zum klonen und manipulieren von genomen
GB201004575D0 (en) 2010-03-19 2010-05-05 Immatics Biotechnologies Gmbh Composition of tumor associated peptides and related anti cancer vaccine for the treatment of gastric cancer and other cancers
WO2011123830A2 (en) 2010-04-02 2011-10-06 Amunix Operating Inc. Alpha 1-antitrypsin compositions and methods of making and using same
CN103038338B (zh) 2010-05-10 2017-03-08 加利福尼亚大学董事会 核糖核酸内切酶组合物及其使用方法
WO2011146121A1 (en) 2010-05-17 2011-11-24 Sangamo Biosciences, Inc. Novel dna-binding proteins and uses thereof
GB201008267D0 (en) 2010-05-18 2010-06-30 Univ Edinburgh Cationic lipids
WO2011147590A2 (en) 2010-05-27 2011-12-01 Heinrich-Pette-Institut Tailored recombinase for recombining asymmetric target sites in a plurality of retrovirus strains
WO2011153120A1 (en) 2010-06-04 2011-12-08 Merck Sharp & Dohme Corp. Novel low molecular weight cationic lipids for oligonucleotide delivery
EP2392208B1 (de) 2010-06-07 2016-05-04 Helmholtz Zentrum München Deutsches Forschungszentrum für Gesundheit und Umwelt (GmbH) Fusionsproteine, die eine DNA-Bindungsdomäne eines TAL-Effektorproteins und eine unspezifische Spaltungsdomäne einer Restriktionsnuklease umfassen, und deren Verwendung
WO2011159369A1 (en) 2010-06-14 2011-12-22 Iowa State University Research Foundation, Inc. Nuclease activity of tal effector and foki fusion protein
WO2012016186A1 (en) 2010-07-29 2012-02-02 President And Fellows Of Harvard College Macrocyclic kinase inhibitors and uses thereof
US8900814B2 (en) 2010-08-13 2014-12-02 Kyoto University Variant reverse transcriptase
CN103619514B (zh) 2010-09-20 2016-09-28 Spi制药公司 微包囊方法和制品
WO2012054726A1 (en) 2010-10-20 2012-04-26 Danisco A/S Lactococcus crispr-cas sequences
WO2012054727A1 (en) 2010-10-22 2012-04-26 Bio-Rad Laboratories, Inc. Reverse transcriptase mixtures with improved storage stability
US20140005269A1 (en) 2010-11-26 2014-01-02 University Of The Witwatersrand, Johannesburg Polymeric matrix of polymer-lipid nanoparticles as a pharmaceutical dosage form
KR101255338B1 (ko) 2010-12-15 2013-04-16 포항공과대학교 산학협력단 표적 세포에 대한 폴리뉴클레오티드 전달체
ES2753198T5 (es) 2010-12-16 2023-05-31 Amgen Europe Gmbh Formas farmacéuticas orales de liberación controlada de fármacos poco solubles y sus usos
US9499592B2 (en) 2011-01-26 2016-11-22 President And Fellows Of Harvard College Transcription activator-like effectors
KR101818126B1 (ko) 2011-02-09 2018-01-15 (주)바이오니아 열안정성이 증가된 역전사효소
US9528124B2 (en) 2013-08-27 2016-12-27 Recombinetics, Inc. Efficient non-meiotic allele introgression
US9200045B2 (en) 2011-03-11 2015-12-01 President And Fellows Of Harvard College Small molecule-dependent inteins and uses thereof
US9164079B2 (en) 2011-03-17 2015-10-20 Greyledge Technologies Llc Systems for autologous biological therapeutics
US20120244601A1 (en) 2011-03-22 2012-09-27 Bertozzi Carolyn R Riboswitch based inducible gene expression platform
JP2012210172A (ja) 2011-03-30 2012-11-01 Japan Science & Technology Agency 外部環境に応答して内部の物質組成を変えるリポソーム
US8709466B2 (en) 2011-03-31 2014-04-29 International Business Machines Corporation Cationic polymers for antimicrobial applications and delivery of bioactive materials
US20140115726A1 (en) 2011-04-05 2014-04-24 Cellectis New tale-protein scaffolds and uses thereof
US20140128449A1 (en) 2011-04-07 2014-05-08 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Oligonucleotide modulation of splicing
US10092660B2 (en) 2011-04-25 2018-10-09 Stc.Unm Solid compositions for pharmaceutical use
JP6158170B2 (ja) 2011-04-27 2017-07-12 アミリス， インコーポレイテッド ゲノム修飾のための方法
US8691750B2 (en) 2011-05-17 2014-04-08 Axolabs Gmbh Lipids and compositions for intracellular delivery of biologically active compounds
WO2012158986A2 (en) 2011-05-17 2012-11-22 Transposagen Biopharmaceuticals, Inc. Methods for site-specific genetic modification in stem cells using xanthomonas tal nucleases (xtn) for the creation of model organisms
WO2012158985A2 (en) 2011-05-17 2012-11-22 Transposagen Biopharmaceuticals, Inc. Methods for site-specific genetic modification in spermatogonial stem cells using zinc finger nuclease (zfn) for the creation of model organisms
WO2012164565A1 (en) 2011-06-01 2012-12-06 Yeda Research And Development Co. Ltd. Compositions and methods for downregulating prokaryotic genes
WO2013006451A2 (en) 2011-07-01 2013-01-10 President And Fellows Of Harvard College Macrocyclic insulin-degrading enzyme (ide) inhibitors and uses thereof
WO2013012674A1 (en) 2011-07-15 2013-01-24 The General Hospital Corporation Methods of transcription activator like effector assembly
WO2013013105A2 (en) 2011-07-19 2013-01-24 Vivoscript,Inc. Compositions and methods for re-programming cells without genetic modification for repairing cartilage damage
JP6261500B2 (ja) 2011-07-22 2018-01-17 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ ヌクレアーゼ切断特異性の評価および改善
AU2012317323B2 (en) 2011-09-28 2017-10-05 Fujimoto Pharmaceutical Corporation NGF aptamer and application thereof
CN103088008B (zh) 2011-10-31 2014-08-20 中国科学院微生物研究所 胞苷脱氨酶及其编码基因和它们的应用
PT2788487T (pt) 2011-12-08 2018-07-03 Sarepta Therapeutics Inc Análogos de oligonucleótido visando lmna humano
JP2015500648A (ja) 2011-12-16 2015-01-08 ターゲットジーン バイオテクノロジーズ リミテッド 所定の標的核酸配列を修飾するための組成物及び方法
AU2012352180A1 (en) 2011-12-16 2014-07-31 Moderna Therapeutics, Inc. Modified nucleoside, nucleotide, and nucleic acid compositions
GB201122458D0 (en) 2011-12-30 2012-02-08 Univ Wageningen Modified cascade ribonucleoproteins and uses thereof
WO2013119602A1 (en) 2012-02-06 2013-08-15 President And Fellows Of Harvard College Arrdc1-mediated microvesicles (armms) and uses thereof
KR101833589B1 (ko) 2012-02-24 2018-03-02 프레드 헛친슨 켄서 리서치 센터 이상혈색소증 치료를 위한 조성물 및 방법
CA3179537A1 (en) 2012-02-27 2013-09-06 Amunix Pharmaceuticals, Inc. Xten conjugate compositions and methods of making same
MX359327B (es) 2012-02-29 2018-09-25 Sangamo Biosciences Inc Composiciones y sus usos para tratar y prevenir la enfermedad de huntington.
CN104364394B (zh) 2012-03-17 2019-02-22 加州大学评议会 痤疮的快速诊断和个体化治疗
US9637739B2 (en) 2012-03-20 2017-05-02 Vilnius University RNA-directed DNA cleavage by the Cas9-crRNA complex
WO2013141680A1 (en) 2012-03-20 2013-09-26 Vilnius University RNA-DIRECTED DNA CLEAVAGE BY THE Cas9-crRNA COMPLEX
WO2013152359A1 (en) 2012-04-06 2013-10-10 The Regents Of The University Of California Novel tetrazines and method of synthesizing the same
WO2013160230A1 (en) 2012-04-23 2013-10-31 Bayer Cropscience Nv Targeted genome engineering in plants
KR102091298B1 (ko) 2012-05-02 2020-03-19 다우 아그로사이언시즈 엘엘씨 말산 탈수소효소의 표적화된 변형
EP2847338B1 (de) 2012-05-07 2018-09-19 Sangamo Therapeutics, Inc. Verfahren und zusammensetzungen zur nukleasevermittelten gezielten integration von transgenen
US11120889B2 (en) 2012-05-09 2021-09-14 Georgia Tech Research Corporation Method for synthesizing a nuclease with reduced off-site cleavage
EP2855667B1 (de) 2012-05-25 2023-08-09 Cellectis Verfahren zur züchtung allogener und immunsuppressions-resistenter t-zellen zur immuntherapie
PE20190844A1 (es) 2012-05-25 2019-06-17 Emmanuelle Charpentier Modulacion de transcripcion con arn de direccion a adn generico
US20150017136A1 (en) 2013-07-15 2015-01-15 Cellectis Methods for engineering allogeneic and highly active t cell for immunotherapy
MX2014014650A (es) 2012-05-30 2015-10-14 Univ Washington Minivectores superenrollados como una herramienta para la reparacion, alteración y reemplazo de ácido desoxirribonucleico.
US9102936B2 (en) 2012-06-11 2015-08-11 Agilent Technologies, Inc. Method of adaptor-dimer subtraction using a CRISPR CAS6 protein
EP2858486A4 (de) 2012-06-12 2016-04-13 Hoffmann La Roche Verfahren und zusammensetzungen zur erzeugung von allelen mit konditionellem knockout
EP2674501A1 (de) 2012-06-14 2013-12-18 Agence nationale de sécurité sanitaire de l'alimentation,de l'environnement et du travail Verfahren zur Erkennung und Identifikation von enterohämorragischen Escherichia coli
US9688971B2 (en) 2012-06-15 2017-06-27 The Regents Of The University Of California Endoribonuclease and methods of use thereof
WO2013192278A1 (en) 2012-06-19 2013-12-27 Regents Of The University Of Minnesota Gene targeting in plants using dna viruses
US9267127B2 (en) 2012-06-21 2016-02-23 President And Fellows Of Harvard College Evolution of bond-forming enzymes
ES2663424T3 (es) 2012-06-29 2018-04-12 Massachusetts Institute Of Technology Genética combinatoria masivamente en paralelo
US9125508B2 (en) 2012-06-30 2015-09-08 Seasons 4, Inc. Collapsible tree system
HUE051612T2 (hu) 2012-07-11 2021-03-01 Sangamo Therapeutics Inc Eljárások és készítmények lizoszomális tárolási betegségek kezelésére
EP2872154B1 (de) 2012-07-11 2017-05-31 Sangamo BioSciences, Inc. Verfahren und zusammensetzungen zur freisetzung von biologischen wirkstoffen
KR20230065381A (ko) 2012-07-25 2023-05-11 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 유도 ｄｎａ 결합 단백질 및 게놈 교란 도구 및 이의 적용
US10058078B2 (en) 2012-07-31 2018-08-28 Recombinetics, Inc. Production of FMDV-resistant livestock by allele substitution
WO2014020608A1 (en) 2012-07-31 2014-02-06 Yeda Research And Development Co. Ltd. Methods of diagnosing and treating motor neuron diseases
WO2014022702A2 (en) 2012-08-03 2014-02-06 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for controlling gene expression by rna processing
IN2015DN01480A (de) 2012-08-29 2015-07-03 Sangamo Biosciences Inc
PT2893004T (pt) 2012-09-04 2019-01-21 Cellectis Recetor de antígeno quimérico de cadeia múltipla e utilizações do mesmo
DK2893022T3 (da) 2012-09-04 2020-07-27 Scripps Research Inst Kimæriske polypeptider med målrettet bindingsspecificitet
US9937205B2 (en) 2012-09-04 2018-04-10 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Inhibition of diacylglycerol kinase to augment adoptive T cell transfer
CN105264067B (zh) 2012-09-07 2020-11-10 美国陶氏益农公司 Fad3性能基因座及相应的能够诱导靶向断裂的靶位点特异性结合蛋白
UA119135C2 (uk) 2012-09-07 2019-05-10 ДАУ АГРОСАЙЄНСІЗ ЕлЕлСі Спосіб отримання трансгенної рослини
UA118090C2 (uk) 2012-09-07 2018-11-26 ДАУ АГРОСАЙЄНСІЗ ЕлЕлСі Спосіб інтегрування послідовності нуклеїнової кислоти, що представляє інтерес, у ген fad2 у клітині сої та специфічний для локусу fad2 білок, що зв'язується, здатний індукувати спрямований розрив
AR092482A1 (es) 2012-09-07 2015-04-22 Dow Agrosciences Llc Enriquecimiento de la clasificacion de las celulas activadas por fluorescencia (facs) para generar plantas
WO2014043143A1 (en) 2012-09-11 2014-03-20 Life Technologies Corporation Nucleic acid amplification
GB201216564D0 (en) 2012-09-17 2012-10-31 Univ Edinburgh Genetically edited animal
US10612053B2 (en) 2012-09-18 2020-04-07 The Translational Genomics Research Institute Isolated genes and transgenic organisms for producing biofuels
JO3470B1 (ar) 2012-10-08 2020-07-05 Merck Sharp & Dohme مشتقات 5- فينوكسي-3h-بيريميدين-4-أون واستخدامها كمثبطات ناسخ عكسي ل hiv
AU2013329186B2 (en) 2012-10-10 2019-02-14 Sangamo Therapeutics, Inc. T cell modifying compounds and uses thereof
WO2014059255A1 (en) 2012-10-12 2014-04-17 The General Hospital Corporation Transcription activator-like effector (tale) - lysine-specific demethylase 1 (lsd1) fusion proteins
KR101706085B1 (ko) 2012-10-23 2017-02-14 주식회사 툴젠 표적 DNA에 특이적인 가이드 RNA 및 Cas 단백질을 암호화하는 핵산 또는 Cas 단백질을 포함하는, 표적 DNA를 절단하기 위한 조성물 및 이의 용도
US20140115728A1 (en) 2012-10-24 2014-04-24 A. Joseph Tector Double knockout (gt/cmah-ko) pigs, organs and tissues
BR112015009589A2 (pt) 2012-10-30 2017-11-14 Recombinetics Inc processos de produção de um animal de produção não humano, animal de produção geneticamente modificado não humano, organismo in vitro não humano escolhido do grupo que consiste em uma célula ou um animal blastocisto, o organismo in vitro, processo de produção de uma célula de animal de produção geneticamente modificado não humano, animal de produção não humano e método de produção de um animal de produção geneticamente modificado não humano
CA2890160A1 (en) 2012-10-31 2014-05-08 Cellectis Coupling herbicide resistance with targeted insertion of transgenes in plants
US11041165B2 (en) 2012-10-31 2021-06-22 Two Blades Foundation Identification of a Xanthomonas euvesicatoria resistance gene from pepper (Capsicum annuum) and method for generating plants with resistance
CA2890110C (en) 2012-11-01 2023-05-02 Factor Bioscience Inc. Methods and products for expressing proteins in cells
WO2014071235A1 (en) 2012-11-01 2014-05-08 Massachusetts Institute Of Technology Genetic device for the controlled destruction of dna
US20140127752A1 (en) 2012-11-07 2014-05-08 Zhaohui Zhou Method, composition, and reagent kit for targeted genomic enrichment
CA2890824A1 (en) 2012-11-09 2014-05-15 Marco Archetti Diffusible factors and cancer cells
US20140140969A1 (en) 2012-11-20 2014-05-22 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for muscular dystrophies
AU2013348113A1 (en) 2012-11-20 2015-06-11 J.R. Simplot Company TAL-mediated transfer DNA insertion
EP2922960A4 (de) 2012-11-20 2016-06-29 Cold Spring Harbor Lab Mutationen bei solanaceae-pflanzen zur modulation der sprossenarchitektur und verbesserung von ertragsabhängigen phänotypen
SG11201504038XA (en) 2012-11-27 2015-06-29 Childrens Medical Center Targeting bcl11a distal regulatory elements for fetal hemoglobin reinduction
WO2014085261A1 (en) 2012-11-29 2014-06-05 North Carolina State University Synthetic pathway for biological carbon dioxide sequestration
WO2014082644A1 (en) 2012-11-30 2014-06-05 WULFF, Peter, Samuel Circular rna for inhibition of microrna
US20160010154A1 (en) 2012-11-30 2016-01-14 The Parkinson's Institute Screening assays for therapeutics for parkinson's disease
JP2016500254A (ja) 2012-12-05 2016-01-12 サンガモ バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッド 代謝疾患の調節のための方法および組成物
CA3144049A1 (en) 2012-12-06 2014-06-12 Synthetic Genomics, Inc. Algal mutants having a locked-in high light acclimated phenotype
KR102145760B1 (ko) 2012-12-06 2020-08-19 시그마-알드리치 컴퍼니., 엘엘씨 Crispr-기초된 유전체 변형과 조절
US9447422B2 (en) 2012-12-06 2016-09-20 Synthetic Genomics, Inc. Autonomous replication sequences and episomal DNA molecules
US9914931B2 (en) 2012-12-07 2018-03-13 Synthetic Genomics, Inc. Nannochloropsis spliced leader sequences and uses therefor
EP2928303A4 (de) 2012-12-07 2016-07-13 Haplomics Inc Faktor-viii-mutationsreparatur und toleranzinduktion
WO2014093479A1 (en) 2012-12-11 2014-06-19 Montana State University Crispr (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) rna-guided control of gene regulation
CN114634950A (zh) 2012-12-12 2022-06-17 布罗德研究所有限公司 用于序列操纵的crispr-cas组分系统、方法以及组合物
EP3045537A1 (de) 2012-12-12 2016-07-20 The Broad Institute, Inc. Technische konzeption und optimierung von systemen, verfahren und zusammensetzungen zur sequenzmanipulation funktionellen domänen
WO2014093635A1 (en) 2012-12-12 2014-06-19 The Broad Institute, Inc. Engineering and optimization of improved systems, methods and enzyme compositions for sequence manipulation
US8697359B1 (en) 2012-12-12 2014-04-15 The Broad Institute, Inc. CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products
RU2701662C9 (ru) 2012-12-12 2019-10-31 Те Брод Инститьют, Инк. Компоненты системы crispr-cas, способы и композиции для манипуляции с последовательностями
ES2701749T3 (es) 2012-12-12 2019-02-25 Broad Inst Inc Métodos, modelos, sistemas y aparatos para identificar secuencias diana para enzimas Cas o sistemas CRISPR-Cas para secuencias diana y transmitir resultados de los mismos
EP4299741A3 (de) 2012-12-12 2024-02-28 The Broad Institute, Inc. Ausgabe, bearbeitung und optimierung von systeme, verfahren und zusammensetzungen für sequenzmanipulation und therapeutische anwendungen
CN113528577A (zh) 2012-12-12 2021-10-22 布罗德研究所有限公司 用于序列操纵的系统、方法和优化的指导组合物的工程化
EP2931899A1 (de) 2012-12-12 2015-10-21 The Broad Institute, Inc. Funktionale genomik unter verwendung von crispr-cas systemen, zusammensetzungen, verfahren, knockout-bibliotheken und anwendungen davon
WO2014093694A1 (en) 2012-12-12 2014-06-19 The Broad Institute, Inc. Crispr-cas nickase systems, methods and compositions for sequence manipulation in eukaryotes
EP2931898B1 (de) 2012-12-12 2016-03-09 The Broad Institute, Inc. Technische konzeption und optimierung von systemen, verfahren und zusammensetzungen zur sequenzmanipulation funktionellen domänen
JP2016500268A (ja) 2012-12-13 2016-01-12 ダウ アグロサイエンシィズ エルエルシー トウモロコシにおける特定の遺伝子座に対する精密な遺伝子標的化
AU2013358998B2 (en) 2012-12-13 2019-04-18 Massachusetts Institute Of Technology Recombinase-based logic and memory systems
JP6473419B2 (ja) 2012-12-13 2019-02-20 ダウ アグロサイエンシィズ エルエルシー 部位特異的ヌクレアーゼ活性のｄｎａ検出方法
KR20150095861A (ko) 2012-12-17 2015-08-21 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 Rna-가이드된 인간 게놈 조작
US9708589B2 (en) 2012-12-18 2017-07-18 Monsanto Technology Llc Compositions and methods for custom site-specific DNA recombinases
TR201808715T4 (tr) 2012-12-21 2018-07-23 Cellectis Düşük soğuk indüklü tatlandırması olan patatesler.
DK2938184T3 (en) 2012-12-27 2018-12-17 Keygene Nv Method of removing a genetic linkage in a plant
EP2943579B1 (de) 2013-01-10 2018-09-12 Dharmacon, Inc. Bibliotheken und verfahren zur erzeugung von molekülen
CN105142396A (zh) 2013-01-14 2015-12-09 重组股份有限公司 缺角家畜
CA2898184A1 (en) 2013-01-16 2014-07-24 Emory University Cas9-nucleic acid complexes and uses related thereto
CN103233028B (zh) 2013-01-25 2015-05-13 南京徇齐生物技术有限公司 一种无物种限制无生物安全性问题的真核生物基因打靶方法及螺旋结构dna序列
AU2014215025B2 (en) 2013-02-05 2018-08-30 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Cell lines for virus production and methods of use
US10660943B2 (en) 2013-02-07 2020-05-26 The Rockefeller University Sequence specific antimicrobials
WO2014125668A1 (ja) 2013-02-14 2014-08-21 国立大学法人大阪大学 内在性dna配列特異的結合分子を用いる特定ゲノム領域の単離方法
WO2014127287A1 (en) 2013-02-14 2014-08-21 Massachusetts Institute Of Technology Method for in vivo tergated mutagenesis
CA2900992C (en) 2013-02-20 2023-02-28 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Genetic modification of rats
US20150353885A1 (en) 2013-02-21 2015-12-10 Cellectis Method to counter-select cells or organisms by linking loci to nuclease components
ES2522765B2 (es) 2013-02-22 2015-03-18 Universidad De Alicante Método para dectectar inserciones de espaciadores en estructuras CRISPR
JP6491113B2 (ja) 2013-02-25 2019-03-27 サンガモ セラピューティクス， インコーポレイテッド ヌクレアーゼ媒介性遺伝子破壊を増強するための方法および組成物
JP2016507244A (ja) 2013-02-27 2016-03-10 ヘルムホルツ・ツェントルム・ミュンヒェン・ドイチェス・フォルシュンクスツェントルム・フューア・ゲズントハイト・ウント・ウムベルト（ゲーエムベーハー）Ｈｅｌｍｈｏｌｔｚ Ｚｅｎｔｒｕｍ ＭｕｅｎｃｈｅｎＤｅｕｔｓｃｈｅｓ Ｆｏｒｓｃｈｕｎｇｓｚｅｎｔｒｕｍ ｆｕｅｒ Ｇｅｓｕｎｄｈｅｉｔ ｕｎｄ Ｕｍｗｅｌｔ （ＧｍｂＨ） Ｃａｓ９ヌクレアーゼによる卵母細胞における遺伝子編集
US10047366B2 (en) 2013-03-06 2018-08-14 The Johns Hopkins University Telomerator-a tool for chromosome engineering
US10612043B2 (en) 2013-03-09 2020-04-07 Agilent Technologies, Inc. Methods of in vivo engineering of large sequences using multiple CRISPR/cas selections of recombineering events
CN105283539A (zh) 2013-03-12 2016-01-27 桑格摩生物科学股份有限公司 用于hla的修饰的方法和组合物
US10329574B2 (en) 2013-03-12 2019-06-25 E I Du Pont De Nemours And Company Methods for the identification of variant recognition sites for rare-cutting engineered double-strand-break-inducing agents and compositions and uses thereof
WO2014158593A1 (en) 2013-03-13 2014-10-02 President And Fellows Of Harvard College Mutants of cre recombinase
DK3620534T3 (da) 2013-03-14 2021-12-06 Caribou Biosciences Inc Crispr-cas sammensætninger af nucleinsyre-targeting nucleinsyrer
US20140283156A1 (en) 2013-03-14 2014-09-18 Cold Spring Harbor Laboratory Trans-splicing ribozymes and silent recombinases
US20160138027A1 (en) 2013-03-14 2016-05-19 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Treatment of diseases and conditions associated with dysregulation of mammalian target of rapamycin complex 1 (mtorc1)
US20140363561A1 (en) 2013-03-15 2014-12-11 J.R. Simplot Company Tal-mediated transfer dna insertion
US11332719B2 (en) 2013-03-15 2022-05-17 The Broad Institute, Inc. Recombinant virus and preparations thereof
EP2971006A4 (de) 2013-03-15 2017-02-08 Transposagen Biopharmaceuticals, Inc. Reproduzierbares verfahren für hodengesteuerte genetische modifikation und spermagesteuerte genetische modifikation
EP2970997A1 (de) 2013-03-15 2016-01-20 Regents of the University of Minnesota Manipulation von pflanzengenomen unter verwendung von crispr-/cas-systemen
US20140273230A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Sigma-Aldrich Co., Llc Crispr-based genome modification and regulation
US9234213B2 (en) 2013-03-15 2016-01-12 System Biosciences, Llc Compositions and methods directed to CRISPR/Cas genomic engineering systems
US20140349400A1 (en) 2013-03-15 2014-11-27 Massachusetts Institute Of Technology Programmable Modification of DNA
UA120033C2 (uk) 2013-03-15 2019-09-25 Сібас Юс Ллс Спосіб підвищення ефективності спрямованої модифікації генів із застосуванням опосередкованої олігонуклеотидами репарації генів
EP3741868A1 (de) 2013-03-15 2020-11-25 The General Hospital Corporation Rna-gesteuertes targeting von genetischen und epigenomischen regulatorischen proteinen an spezifischen genomischen loci
WO2014204578A1 (en) 2013-06-21 2014-12-24 The General Hospital Corporation Using rna-guided foki nucleases (rfns) to increase specificity for rna-guided genome editing
US10760064B2 (en) 2013-03-15 2020-09-01 The General Hospital Corporation RNA-guided targeting of genetic and epigenomic regulatory proteins to specific genomic loci
AU2014235968B2 (en) 2013-03-21 2018-05-24 Ospedale San Raffaele Srl Targeted disruption of T cell receptor genes using engineered zinc finger protein nucleases
CN105121650A (zh) 2013-04-02 2015-12-02 拜尔作物科学公司 真核生物中的靶向基因组工程
CA3185368A1 (en) 2013-04-03 2014-10-09 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Effective generation of tumor-targeted t cells derived from pluripotent stem cells
US11274305B2 (en) 2013-04-04 2022-03-15 Trustees Of Dartmouth College Compositions and methods for in vivo excision of HIV-1 proviral DNA
JP2016522679A (ja) 2013-04-04 2016-08-04 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を用いたゲノム編集の治療的使用
RU2723130C2 (ru) 2013-04-05 2020-06-08 ДАУ АГРОСАЙЕНСИЗ ЭлЭлСи Способы и композиции для встраивания экзогенной последовательности в геном растений
US20150056629A1 (en) 2013-04-14 2015-02-26 Katriona Guthrie-Honea Compositions, systems, and methods for detecting a DNA sequence
SG11201508028QA (en) 2013-04-16 2015-10-29 Regeneron Pharma Targeted modification of rat genome
US20160040155A1 (en) 2013-04-16 2016-02-11 University Of Washington Through Its Center For Commercialization Activating an alternative pathway for homology-directed repair to stimulate targeted gene correction and genome engineering
WO2014172470A2 (en) 2013-04-16 2014-10-23 Whitehead Institute For Biomedical Research Methods of mutating, modifying or modulating nucleic acid in a cell or nonhuman mammal
EP2796558A1 (de) 2013-04-23 2014-10-29 Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn Verbessertes Gen-Targeting und Nucleinsäureträgermoleküle, insbesondere zur Verwendung bei Pflanzen
EP2989214A4 (de) 2013-04-23 2016-12-28 Harvard College In-situ-interaktionsbestimmung
CN103224947B (zh) 2013-04-28 2015-06-10 陕西师范大学 一种基因打靶系统
US10604771B2 (en) 2013-05-10 2020-03-31 Sangamo Therapeutics, Inc. Delivery methods and compositions for nuclease-mediated genome engineering
AU2014262474B2 (en) 2013-05-10 2019-10-31 Whitehead Institute For Biomedical Research In vitro production of red blood cells with sortaggable proteins
WO2014184744A1 (en) 2013-05-13 2014-11-20 Cellectis Methods for engineering highly active t cell for immunotherapy
TWI636992B (zh) 2013-05-13 2018-10-01 瑟勒提斯公司 Ｃｄ１９特異性嵌合抗原受體及其用途
JP2016521975A (ja) 2013-05-15 2016-07-28 サンガモ バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッド 遺伝的状態の処置のための方法および組成物
WO2014186686A2 (en) 2013-05-17 2014-11-20 Two Blades Foundation Targeted mutagenesis and genome engineering in plants using rna-guided cas nucleases
EP3778899A1 (de) 2013-05-22 2021-02-17 Northwestern University Rna-gerichtete dna-spaltung und genmanipulation durch das enzym cas9 aus neisseria meningitidis
AU2014273490B2 (en) 2013-05-29 2019-05-09 Cellectis Methods for engineering T cells for immunotherapy by using RNA-guided Cas nuclease system
US9873907B2 (en) 2013-05-29 2018-01-23 Agilent Technologies, Inc. Method for fragmenting genomic DNA using CAS9
CA2913869C (en) 2013-05-29 2023-01-24 Cellectis New compact scaffold of cas9 in the type ii crispr system
DK3004349T3 (en) 2013-05-29 2018-06-06 Cellectis Sa A method for producing precise DNA cleavage using CAS9 nickase activity
WO2014194190A1 (en) 2013-05-30 2014-12-04 The Penn State Research Foundation Gene targeting and genetic modification of plants via rna-guided genome editing
US20140359796A1 (en) 2013-05-31 2014-12-04 Recombinetics, Inc. Genetically sterile animals
ES2716867T3 (es) 2013-05-31 2019-06-17 Cellectis Sa Endonucleasa de asentamiento LAGLIDADG que escinde el gen de receptor de células T alfa y usos de la misma
JP6488283B2 (ja) 2013-05-31 2019-03-20 セレクティスＣｅｌｌｅｃｔｉｓ Ｃ−ｃケモカイン受容体５型（ｃｃｒ５）遺伝子を開裂するｌａｇｌｉｄａｄｇホーミングエンドヌクレアーゼおよびその用途
KR20230042154A (ko) 2013-06-04 2023-03-27 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 Rna-가이드된 전사 조절
US9267135B2 (en) 2013-06-04 2016-02-23 President And Fellows Of Harvard College RNA-guided transcriptional regulation
EP3417880A1 (de) 2013-06-05 2018-12-26 Duke University Rna-geführte genmanipulation und genregulierung
US20150315252A1 (en) 2013-06-11 2015-11-05 Clontech Laboratories, Inc. Protein enriched microvesicles and methods of making and using the same
WO2014201015A2 (en) 2013-06-11 2014-12-18 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for target dna modification
EP3008192B1 (de) 2013-06-11 2019-07-17 Takara Bio USA, Inc. Proteinangereicherte mikrovesikel und verfahren zur herstellung und verwendung davon
US20160145631A1 (en) 2013-06-14 2016-05-26 Cellectis Methods for non-transgenic genome editing in plants
EP3011031B1 (de) 2013-06-17 2020-09-30 The Broad Institute Inc. Abgabe und verwendung von crispr-cas-systemen, vektoren und zusammensetzungen für leber-targeting und -behandlung
MX2015017313A (es) 2013-06-17 2016-11-25 Broad Inst Inc Suministro, uso y aplicaciones terapéuticas de los sistemas y composiciones crispr-cas, para actuar sobre trastornos y enfermedades utilizando componentes víricos.
WO2014204723A1 (en) 2013-06-17 2014-12-24 The Broad Institute Inc. Oncogenic models based on delivery and use of the crispr-cas systems, vectors and compositions
BR112015031611A2 (pt) 2013-06-17 2017-12-12 Massachusetts Inst Technology aplicação, manipulação e otimização de sistemas, métodos e composições para direcionamento e modelação de doenças e distúrbios de células pós-mitóticas
DK3011029T3 (da) 2013-06-17 2020-03-16 Broad Inst Inc Administration, modificering og optimering af tandem-guidesystemer, fremgangsmåder og sammensætninger til sekvensmanipulering
WO2014204727A1 (en) 2013-06-17 2014-12-24 The Broad Institute Inc. Functional genomics using crispr-cas systems, compositions methods, screens and applications thereof
EP4245853A3 (de) 2013-06-17 2023-10-18 The Broad Institute, Inc. Optimierte crispr-cas-doppel-nickase-systeme, verfahren und zusammensetzungen zur sequenzmanipulation
RU2016101246A (ru) 2013-06-19 2017-07-24 СИГМА-ЭЛДРИЧ КО. ЭлЭлСи Направленная интеграция
EP3013939A1 (de) 2013-06-25 2016-05-04 Cellectis Modifizierte diatome für biokraftstoffproduktion
WO2015002780A1 (en) 2013-07-01 2015-01-08 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Transcription activator-like effector (tale) libraries and methods of synthesis and use
JP2016528890A (ja) 2013-07-09 2016-09-23 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を用いるゲノム編集の治療用の使用
AU2014287393B2 (en) 2013-07-09 2020-10-22 President And Fellows Of Harvard College Multiplex RNA-guided genome engineering
WO2015004241A2 (en) 2013-07-10 2015-01-15 Novartis Ag Multiple proteases deficient filamentous fungal cells and methods of use thereof
WO2015006437A1 (en) 2013-07-10 2015-01-15 Majzoub Joseph A Mrap2 knockouts
CA2917639C (en) 2013-07-10 2024-01-02 President And Fellows Of Harvard College Orthogonal cas9 proteins for rna-guided gene regulation and editing
HUE056760T2 (hu) 2013-07-11 2022-03-28 Modernatx Inc A CRISPR-hez kapcsolódó fehérjéket és a szintetikus SGRNS-ket kódoló szintetikus polinukleotidokat tartalmazó készítmények és felhasználási módjaik
WO2015007194A1 (zh) 2013-07-16 2015-01-22 中国科学院上海生命科学研究院 植物基因组定点修饰方法
CN105392885B (zh) 2013-07-19 2020-11-03 赖瑞克斯生物科技公司 用于产生双等位基因敲除的方法和组合物
GB201313235D0 (en) 2013-07-24 2013-09-04 Univ Edinburgh Antiviral Compositions Methods and Animals
CN103388006B (zh) 2013-07-26 2015-10-28 华东师范大学 一种基因定点突变的构建方法
US11306328B2 (en) 2013-07-26 2022-04-19 President And Fellows Of Harvard College Genome engineering
US10421957B2 (en) 2013-07-29 2019-09-24 Agilent Technologies, Inc. DNA assembly using an RNA-programmable nickase
CA2920253A1 (en) 2013-08-02 2015-02-05 Enevolv, Inc. Processes and host cells for genome, pathway, and biomolecular engineering
ITTO20130669A1 (it) 2013-08-05 2015-02-06 Consiglio Nazionale Ricerche Vettore adeno-associato ricombinante muscolo-specifico e suo impiego nel trattamento di patologie muscolari
WO2015021426A1 (en) 2013-08-09 2015-02-12 Sage Labs, Inc. A crispr/cas system-based novel fusion protein and its application in genome editing
US20150044192A1 (en) 2013-08-09 2015-02-12 President And Fellows Of Harvard College Methods for identifying a target site of a cas9 nuclease
WO2015024017A2 (en) 2013-08-16 2015-02-19 President And Fellows Of Harvard College Rna polymerase, methods of purification and methods of use
WO2015021990A1 (en) 2013-08-16 2015-02-19 University Of Copenhagen Rna probing method and reagents
CA2921778A1 (en) 2013-08-20 2015-02-26 Universiteit Gent Inhibition of a lncrna for treatment of melanoma
EP3611268A1 (de) 2013-08-22 2020-02-19 E. I. du Pont de Nemours and Company Pflanzengenommodifizierung mit rns/cas-endonukleaseführungssystemen und verfahren zur verwendung
US9567609B2 (en) 2013-08-28 2017-02-14 Sangamo Biosciences, Inc. Compositions for linking DNA-binding domains and cleavage domains
GB201315321D0 (en) 2013-08-28 2013-10-09 Koninklijke Nederlandse Akademie Van Wetenschappen Transduction Buffer
WO2015031775A1 (en) 2013-08-29 2015-03-05 Temple University Of The Commonwealth System Of Higher Education Methods and compositions for rna-guided treatment of hiv infection
CA2922823C (en) 2013-09-04 2023-01-17 Dow Agrosciences Llc Rapid targeting analysis in crops for determining donor insertion
AU2014316676B2 (en) 2013-09-04 2020-07-23 Csir Site-specific nuclease single-cell assay targeting gene regulatory elements to silence gene expression
EP4353078A2 (de) 2013-09-04 2024-04-17 KWS SAAT SE & Co. KGaA Helminthosporium turcicum-resistente pflanze
EP4074330A1 (de) 2013-09-05 2022-10-19 Massachusetts Institute of Technology Abstimmung von mikrobiellen populationen mit programmierbaren nukleasen
US9388430B2 (en) 2013-09-06 2016-07-12 President And Fellows Of Harvard College Cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof
US9340799B2 (en) 2013-09-06 2016-05-17 President And Fellows Of Harvard College MRNA-sensing switchable gRNAs
WO2016070129A1 (en) 2014-10-30 2016-05-06 President And Fellows Of Harvard College Delivery of negatively charged proteins using cationic lipids
ES2844174T3 (es) 2013-09-18 2021-07-21 Kymab Ltd Métodos, células y organismos
WO2015040075A1 (en) 2013-09-18 2015-03-26 Genome Research Limited Genomic screening methods using rna-guided endonucleases
US10202593B2 (en) 2013-09-20 2019-02-12 President And Fellows Of Harvard College Evolved sortases and uses thereof
EP3049116B1 (de) 2013-09-23 2019-01-02 Rensselaer Polytechnic Institute Nanopartikelvermittelte genabgabe, genommanipulations- und ligandenanzielungsmodifikation in verschiedenen zellpopulationen
WO2015048690A1 (en) 2013-09-27 2015-04-02 The Regents Of The University Of California Optimized small guide rnas and methods of use
US20160237455A1 (en) 2013-09-27 2016-08-18 Editas Medicine, Inc. Crispr-related methods and compositions
MX2016004032A (es) 2013-09-30 2016-06-02 Univ California Identificacion de cxcr8, un receptor de quimiocinas novedoso.
US20160237451A1 (en) 2013-09-30 2016-08-18 Regents Of The University Of Minnesota Conferring resistance to geminiviruses in plants using crispr/cas systems
US20160208214A1 (en) 2013-10-02 2016-07-21 Northeastern University Methods and compositions for generation of developmentally-incompetent eggs in recipients of nuclear genetic transfer
JP5774657B2 (ja) 2013-10-04 2015-09-09 国立大学法人京都大学 エレクトロポレーションを利用した哺乳類の遺伝子改変方法
CN105916977A (zh) 2013-10-07 2016-08-31 东北大学 用于使用自体细胞系统从生殖系细胞离体产生有发育能力的卵的方法和组合物
WO2015052231A2 (en) 2013-10-08 2015-04-16 Technical University Of Denmark Multiplex editing system
US20150098954A1 (en) 2013-10-08 2015-04-09 Elwha Llc Compositions and Methods Related to CRISPR Targeting
DE102013111099B4 (de) 2013-10-08 2023-11-30 Eberhard Karls Universität Tübingen Medizinische Fakultät Permanente Genkorrektur mittels nukleotidmodifizierter messenger RNA
JP2015076485A (ja) 2013-10-08 2015-04-20 株式会社ジャパンディスプレイ 表示装置
US20160355875A1 (en) 2013-10-11 2016-12-08 Cellectis Methods and kits for detecting nucleic acid sequences of interest using dna-binding protein domain
WO2015057671A1 (en) 2013-10-14 2015-04-23 The Broad Institute, Inc. Artificial transcription factors comprising a sliding domain and uses thereof
CN105814083A (zh) 2013-10-15 2016-07-27 加州生物医学研究所 嵌合抗原受体t细胞开关和其用途
WO2015057834A1 (en) 2013-10-15 2015-04-23 The California Institute For Biomedical Research Peptidic chimeric antigen receptor t cell switches and uses thereof
US10117899B2 (en) 2013-10-17 2018-11-06 Sangamo Therapeutics, Inc. Delivery methods and compositions for nuclease-mediated genome engineering in hematopoietic stem cells
EP3058072B1 (de) 2013-10-17 2021-05-19 Sangamo Therapeutics, Inc. Freisetzungsverfahren und zusammensetzungen für nukleasevermitteltes genomengineering
WO2015058047A2 (en) 2013-10-18 2015-04-23 President And Fellows Of Harvard College Fluorination of organic compounds
AU2014338910B2 (en) 2013-10-25 2020-12-10 Cellectis Design of rare-cutting endonucleases for efficient and specific targeting DNA sequences comprising highly repetitive motives
WO2015065964A1 (en) 2013-10-28 2015-05-07 The Broad Institute Inc. Functional genomics using crispr-cas systems, compositions, methods, screens and applications thereof
US10584358B2 (en) 2013-10-30 2020-03-10 North Carolina State University Compositions and methods related to a type-II CRISPR-Cas system in Lactobacillus buchneri
UY35814A (es) 2013-11-04 2015-05-29 Dow Agrosciences Llc ?lugares óptimos para la soja?.
WO2015066637A1 (en) 2013-11-04 2015-05-07 Dow Agrosciences Llc A universal donor system for gene targeting
AU2014341934B2 (en) 2013-11-04 2017-12-07 Corteva Agriscience Llc Optimal soybean loci
RU2709734C2 (ru) 2013-11-04 2019-12-19 ДАУ АГРОСАЙЕНСИЗ ЭлЭлСи Оптимальные локусы маиса
NZ719494A (en) 2013-11-04 2017-09-29 Dow Agrosciences Llc Optimal maize loci
WO2015069682A2 (en) 2013-11-05 2015-05-14 President And Fellows Of Harvard College Precise microbiota engineering at the cellular level
LT3066201T (lt) 2013-11-07 2018-08-10 Editas Medicine, Inc. Su crispr susiję būdai ir kompozicijos su valdančiomis grnr
WO2015077058A2 (en) 2013-11-08 2015-05-28 The Broad Institute, Inc. Compositions and methods for selecting a treatment for b-cell neoplasias
WO2015070193A1 (en) 2013-11-11 2015-05-14 Liu Oliver Compositions and methods for targeted gene disruption in prokaryotes
MX2016006106A (es) 2013-11-11 2016-12-09 Sangamo Biosciences Inc Metodos y composiciones para tratar la enfermedad de huntington.
EP3068881B1 (de) 2013-11-13 2019-02-27 Children's Medical Center Corporation Nukleasevermittelte regulierung der genexpression
WO2015073867A1 (en) 2013-11-15 2015-05-21 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services Engineering neural stem cells using homologous recombination
EP3071695A2 (de) 2013-11-18 2016-09-28 Crispr Therapeutics AG Crispr-cas-systemmaterialien und verfahren
CN106103703A (zh) 2013-11-18 2016-11-09 耶鲁大学 使用转座子的组合物和方法
WO2015075056A1 (en) 2013-11-19 2015-05-28 Thermo Fisher Scientific Baltics Uab Programmable enzymes for isolation of specific dna fragments
US10787684B2 (en) 2013-11-19 2020-09-29 President And Fellows Of Harvard College Large gene excision and insertion
US9074199B1 (en) 2013-11-19 2015-07-07 President And Fellows Of Harvard College Mutant Cas9 proteins
US11098094B2 (en) 2013-11-20 2021-08-24 Fondazione Telethon Artificial DNA-binding proteins and uses thereof
CA2930784C (en) 2013-11-22 2023-01-31 Cellectis Method for generating batches of allogeneic t cells with averaged potency
JP6976058B2 (ja) 2013-11-22 2021-12-01 セレクティスCellectis 免疫療法のための化学療法薬耐性ｔ細胞を工学的に作製する方法
CA2930973A1 (en) 2013-11-22 2015-05-28 Pal SAERTROM C/ebp alpha short activating rna compositions and methods of use
CN103642836A (zh) 2013-11-26 2014-03-19 苏州同善生物科技有限公司 一种基于crispr基因敲除技术建立脆性x综合症灵长类动物模型的方法
CN103614415A (zh) 2013-11-27 2014-03-05 苏州同善生物科技有限公司 一种基于crispr基因敲除技术建立肥胖症大鼠动物模型的方法
US10450586B2 (en) 2013-11-28 2019-10-22 Horizon Discovery Limited Somatic haploid human cell line
AU2014364051B2 (en) 2013-12-09 2018-12-20 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for treating hemophilia
JP6174811B2 (ja) 2013-12-11 2017-08-02 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドＲｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． ゲノムの標的改変のための方法及び組成物
JP2017501149A (ja) 2013-12-12 2017-01-12 ザ・ブロード・インスティテュート・インコーポレイテッド 粒子送達構成成分を用いた障害及び疾患の標的化のためのｃｒｉｓｐｒ−ｃａｓ系及び組成物の送達、使用及び治療適用
US9840699B2 (en) 2013-12-12 2017-12-12 President And Fellows Of Harvard College Methods for nucleic acid editing
JP6793547B2 (ja) 2013-12-12 2020-12-02 ザ・ブロード・インスティテュート・インコーポレイテッド 最適化機能ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系による配列操作のための系、方法および組成物
US9994831B2 (en) 2013-12-12 2018-06-12 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for modifying a single stranded target nucleic acid
EP4219699A1 (de) 2013-12-12 2023-08-02 The Broad Institute, Inc. Konstruktion von systemen, verfahren und optimierten führungszusammensetzungen mit neuen architekturen zur sequenzmanipulation
KR20160097327A (ko) 2013-12-12 2016-08-17 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 유전자 산물, 구조 정보 및 유도성 모듈형 ｃａｓ 효소의 발현의 변경을 위한 ｃｒｉｓｐｒ-ｃａｓ 시스템 및 방법
JP2017527256A (ja) 2013-12-12 2017-09-21 ザ・ブロード・インスティテュート・インコーポレイテッド ＨＢＶ及びウイルス性疾患及び障害のためのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系及び組成物の送達、使用及び治療適用
BR112016013547A2 (pt) 2013-12-12 2017-10-03 Broad Inst Inc Composições e métodos de uso de sistemas crispr-cas em distúrbios de repetições de nucleotídeos
ES2765481T3 (es) 2013-12-12 2020-06-09 Broad Inst Inc Administración, uso y aplicaciones terapéuticas de los sistemas crispr-cas y composiciones para la edición genómica
WO2015089364A1 (en) 2013-12-12 2015-06-18 The Broad Institute Inc. Crystal structure of a crispr-cas system, and uses thereof
EP3080256B1 (de) 2013-12-13 2018-06-13 Cellectis Cas9-nuklease-plattform zur mikroalgengenomengineering
EP3080275B1 (de) 2013-12-13 2020-01-15 Cellectis Verfahren zur auswahl von mittels nuklease transformierten diatomeen
US20150191744A1 (en) 2013-12-17 2015-07-09 University Of Massachusetts Cas9 effector-mediated regulation of transcription, differentiation and gene editing/labeling
KR102274445B1 (ko) 2013-12-19 2021-07-08 아미리스 인코퍼레이티드 게놈 삽입을 위한 방법
JP6721508B2 (ja) 2013-12-26 2020-07-15 ザ ジェネラル ホスピタル コーポレイション 多重ガイドｒｎａ
DK3090062T3 (da) 2013-12-30 2020-09-21 Univ Pittsburgh Commonwealth Sys Higher Education Fusionsgener associeret med fremadskridende prostatakræft
CN103668472B (zh) 2013-12-31 2014-12-24 北京大学 利用CRISPR/Cas9系统构建真核基因敲除文库的方法
WO2015103153A1 (en) 2013-12-31 2015-07-09 The Regents Of The University Of California Cas9 crystals and methods of use thereof
JP6747974B2 (ja) 2014-01-08 2020-08-26 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ Ｒｎａ誘導型遺伝子ドライブ
WO2015108993A1 (en) 2014-01-14 2015-07-23 Lam Therapeutics, Inc. Mutagenesis methods
US10774338B2 (en) 2014-01-16 2020-09-15 The Regents Of The University Of California Generation of heritable chimeric plant traits
US10557146B2 (en) 2014-01-21 2020-02-11 The Institute Of Genetics And Developmental Biology, Chinese Academy Of Sciences Modified plants
GB201400962D0 (en) 2014-01-21 2014-03-05 Kloehn Peter C Screening for target-specific affinity binders using RNA interference
CN106164261A (zh) 2014-01-22 2016-11-23 生命技术公司 适用于高温核酸合成的新颖逆转录酶
JP2017503514A (ja) 2014-01-24 2017-02-02 ノースカロライナ ステート ユニバーシティーＮｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃａｓ９ターゲッティングをガイドする配列に関する方法および組成物
US10034463B2 (en) 2014-01-24 2018-07-31 Children's Medical Center Corporation High-throughput mouse model for optimizing antibody affinities
US10354746B2 (en) 2014-01-27 2019-07-16 Georgia Tech Research Corporation Methods and systems for identifying CRISPR/Cas off-target sites
CN104805078A (zh) 2014-01-28 2015-07-29 北京大学 用于高效基因组编辑的rna分子的设计、合成及其应用
WO2015116686A1 (en) 2014-01-29 2015-08-06 Agilent Technologies, Inc. Cas9-based isothermal method of detection of specific dna sequence
US20150291969A1 (en) 2014-01-30 2015-10-15 Chromatin, Inc. Compositions for reduced lignin content in sorghum and improving cell wall digestibility, and methods of making the same
US10233456B2 (en) 2014-01-30 2019-03-19 The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Method, vectors, cells, seeds and kits for stacking genes into a single genomic site
KR102415811B1 (ko) 2014-01-31 2022-07-04 팩터 바이오사이언스 인크. 핵산 제조 및 송달을 위한 방법 및 산물
GB201401707D0 (en) 2014-01-31 2014-03-19 Sec Dep For Health The Adeno-associated viral vectors
US10072066B2 (en) 2014-02-03 2018-09-11 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for treatment of a beta thalessemia
WO2015115903A1 (en) 2014-02-03 2015-08-06 Academisch Ziekenhuis Leiden H.O.D.N. Lumc Site-specific dna break-induced genome editing using engineered nucleases
PL3102722T3 (pl) 2014-02-04 2021-03-08 Jumpcode Genomics, Inc. Frakcjonowanie genomu
USRE48856E1 (en) 2014-02-07 2021-12-21 Vib Vzw Inhibition of NEAT1 for treatment of solid tumors
CA3075047C (en) 2014-02-11 2022-02-01 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Crispr enable method for multiplex genome editing
EP3105325B1 (de) 2014-02-13 2019-12-04 Takara Bio USA, Inc. Verfahren zur abreicherung eines zielmoleküls aus einer anfänglichen sammlung von nukleinsäuren sowie zusammensetzungen und kits zur durchführung davon
BR112016017806B1 (pt) 2014-02-14 2023-05-02 Cellectis Uso de células t engenheiradas para imunoterapia contra células patológicas, e método ex vivo para preparação das mesmas
US10286084B2 (en) 2014-02-18 2019-05-14 Duke University Compositions for the inactivation of virus replication and methods of making and using the same
DK3116994T3 (da) 2014-02-20 2019-10-21 Dsm Ip Assets Bv Phage-ufølsom streptococcus thermophilus
EP3107552B1 (de) 2014-02-21 2018-03-28 Cellectis Verfahren zur in-situ-hemmung von regulatorischen t-zellen
WO2015127428A1 (en) 2014-02-24 2015-08-27 Massachusetts Institute Of Technology Methods for in vivo genome editing
WO2015127439A1 (en) 2014-02-24 2015-08-27 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for nuclease-mediated targeted integration
JP6521669B2 (ja) 2014-02-25 2019-05-29 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 標的ｄｎａに変異が導入された植物細胞、及びその製造方法
EP3971283A1 (de) 2014-02-27 2022-03-23 Monsanto Technology LLC Zusammensetzungen und verfahren zur stellengerichteten genommodifikation
CN103820441B (zh) 2014-03-04 2017-05-17 黄行许 CRISPR‑Cas9特异性敲除人CTLA4基因的方法以及用于特异性靶向CTLA4基因的sgRNA
CN103820454B (zh) 2014-03-04 2016-03-30 上海金卫生物技术有限公司 CRISPR-Cas9特异性敲除人PD1基因的方法以及用于特异性靶向PD1基因的sgRNA
WO2015134812A1 (en) 2014-03-05 2015-09-11 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for treating usher syndrome and retinitis pigmentosa
ES2752175T3 (es) 2014-03-05 2020-04-03 Univ Kobe Nat Univ Corp Método de modificación de la secuencia genómica para convertir específicamente bases de ácido nucleico de una secuencia de ADN seleccionada como diana, y complejo molecular para su uso en el mismo
EP3553176A1 (de) 2014-03-10 2019-10-16 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-assoziierte verfahren und zusammensetzungen zur behandlung von kongenitaler leberscher amaurose 10 (lca10)
WO2015136001A1 (en) 2014-03-11 2015-09-17 Cellectis Method for generating t-cells compatible for allogenic transplantation
ES2821149T3 (es) 2014-03-12 2021-04-23 Prec Biosciences Inc Eliminación del exón del gen de la distrofina mediante nucleasas modificadas genéticamente
WO2015138870A2 (en) 2014-03-13 2015-09-17 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for targeted epigenetic modification
US20170088845A1 (en) 2014-03-14 2017-03-30 The Regents Of The University Of California Vectors and methods for fungal genome engineering by crispr-cas9
EP4357452A2 (de) 2014-03-14 2024-04-24 Cibus US LLC Verfahren und zusammensetzungen zur erhöhung der effizienz gezielter genmodifizierung mittels oligonukleotidvermittelter genreparatur
JP6594891B2 (ja) 2014-03-18 2019-10-23 サンガモ セラピューティクス， インコーポレイテッド ジンクフィンガータンパク質発現を調節するための方法および組成物
EP3126498A4 (de) 2014-03-20 2017-08-23 Université Laval Crispr-basierte verfahren und produkte zur erhöhung der frataxinkonzentration und verwendungen davon
CN106460009A (zh) 2014-03-21 2017-02-22 小利兰·斯坦福大学托管委员会 无核酸酶的基因组编辑
PT3122766T (pt) 2014-03-24 2021-05-19 Immco Diagnostics Inc Detecção melhorada de anticorpos anti-nucleares e diagnóstico para distúrbios autoimunitários sistémicos e não sistémicos
AU2015236045B2 (en) 2014-03-25 2021-09-23 Ginkgo Bioworks, Inc. Methods and genetic systems for cell engineering
CA2943622A1 (en) 2014-03-25 2015-10-01 Editas Medicine Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for treating hiv infection and aids
CN106459951A (zh) 2014-03-26 2017-02-22 马里兰大学派克分院 驯养的大型动物的受精卵中的靶向基因组编辑
WO2015148860A1 (en) 2014-03-26 2015-10-01 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for treating beta-thalassemia
US11242525B2 (en) 2014-03-26 2022-02-08 Editas Medicine, Inc. CRISPR/CAS-related methods and compositions for treating sickle cell disease
US9993563B2 (en) 2014-03-28 2018-06-12 Aposense Ltd. Compounds and methods for trans-membrane delivery of molecules
KR20160138210A (ko) 2014-03-28 2016-12-02 아포센스 엘티디. 분자의 막횡단 전달을 위한 화합물 및 방법
WO2015153760A2 (en) 2014-04-01 2015-10-08 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for prevention or treatment of a nervous system disorder
EP3126497B1 (de) 2014-04-01 2018-12-12 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-bezogene verfahren und zusammensetzungen zur behandlung von hsv-1 infektionen
WO2015153791A1 (en) 2014-04-01 2015-10-08 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for treating herpes simplex virus type 2 (hsv-2)
EP3126495A1 (de) 2014-04-02 2017-02-08 Editas Medicine, Inc. Verfahren und zusammensetzungen in zusammenhang mit crispr/cas zur behandlung eines primären offenwinkelglaukoms
WO2015153889A2 (en) 2014-04-02 2015-10-08 University Of Florida Research Foundation, Incorporated Materials and methods for the treatment of latent viral infection
US20170022499A1 (en) 2014-04-03 2017-01-26 Massachusetts Institute Of Techology Methods and compositions for the production of guide rna
CN103911376B (zh) 2014-04-03 2017-02-15 黄行许 CRISPR‑Cas9靶向敲除乙肝病毒cccDNA及其特异性sgRNA
JP2017512481A (ja) 2014-04-08 2017-05-25 ノースカロライナ ステート ユニバーシティーＮｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃｒｉｓｐｒ関連遺伝子を用いた、ｒｎａ依存性の転写抑制のための方法および組成物
EP3556858A3 (de) 2014-04-09 2020-01-22 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-assoziierte verfahren und zusammensetzungen zur behandlung von mukoviszidose
EP3129488B1 (de) 2014-04-10 2019-06-12 The Regents of The University of California Verfahren und zusammensetzungen zur verwendung von argonaut zur modifizierung einer einzelsträngigen zielnukleinsäure
EP3129473B8 (de) 2014-04-11 2020-12-23 Cellectis Verfahren zur erzeugung von immunzellen, die gegen eine arginin- und/oder tryptophanverarmte mikroumgebung resistent sind
ES2962509T3 (es) 2014-04-14 2024-03-19 Maxcyte Inc Métodos y composiciones para modificar ADN genómico
PL3132034T3 (pl) 2014-04-14 2021-04-06 Nemesis Bioscience Ltd. Środek terapeutyczny
CN103923911B (zh) 2014-04-14 2016-06-08 上海金卫生物技术有限公司 CRISPR-Cas9特异性敲除人CCR5基因的方法以及用于特异性靶向CCR5基因的sgRNA
GB201406968D0 (en) 2014-04-17 2014-06-04 Green Biologics Ltd Deletion mutants
GB201406970D0 (en) 2014-04-17 2014-06-04 Green Biologics Ltd Targeted mutations
SG10201809157VA (en) 2014-04-18 2018-11-29 Editas Medicine Inc Crispr-cas-related methods, compositions and components for cancer immunotherapy
CN105039399A (zh) 2014-04-23 2015-11-11 复旦大学 多能干细胞-遗传性心肌病心肌细胞及其制备方法
WO2015164748A1 (en) 2014-04-24 2015-10-29 Sangamo Biosciences, Inc. Engineered transcription activator like effector (tale) proteins
AU2015249371B2 (en) 2014-04-24 2020-04-30 Board Of Regents, The University Of Texas System Application of induced pluripotent stem cells to generate adoptive cell therapy products
KR101823661B1 (ko) 2014-04-24 2018-01-30 기초과학연구원 마이크로 상동 기반의 유전자 녹아웃을 위한 뉴클레아제 표적 서열을 확인하는 방법
WO2015168158A1 (en) 2014-04-28 2015-11-05 Fredy Altpeter Targeted genome editing to modify lignin biosynthesis and cell wall composition
CN106535630B (zh) 2014-04-28 2020-04-24 重组股份有限公司 多重基因编辑
CA2946987A1 (en) 2014-04-28 2015-11-05 Joseph F. Petolino Haploid maize transformation
US10494422B2 (en) 2014-04-29 2019-12-03 Seattle Children's Hospital CCR5 disruption of cells expressing anti-HIV chimeric antigen receptor (CAR) derived from broadly neutralizing antibodies
CN104178506B (zh) 2014-04-30 2017-03-01 清华大学 Taler蛋白通过空间位阻发挥转录抑制作用及其应用
WO2015165276A1 (zh) 2014-04-30 2015-11-05 清华大学 利用tale转录抑制子在哺乳动物细胞中模块化构建合成基因线路的试剂盒
WO2015165275A1 (zh) 2014-04-30 2015-11-05 清华大学 利用tale转录抑制子在哺乳动物细胞中模块化构建合成基因线路
WO2015168404A1 (en) 2014-04-30 2015-11-05 Massachusetts Institute Of Technology Toehold-gated guide rna for programmable cas9 circuitry with rna input
US20170037431A1 (en) 2014-05-01 2017-02-09 University Of Washington In vivo Gene Engineering with Adenoviral Vectors
GB201407852D0 (en) 2014-05-02 2014-06-18 Iontas Ltd Preparation of libraries od protein variants expressed in eukaryotic cells and use for selecting binding molecules
WO2015171603A1 (en) 2014-05-06 2015-11-12 Two Blades Foundation Methods for producing plants with enhanced resistance to oomycete pathogens
MX2016014565A (es) 2014-05-08 2017-05-23 Sangamo Biosciences Inc Metodos y composiciones para tratar la enfermedad de huntington.
AU2015255656A1 (en) 2014-05-09 2016-11-10 Assembly Biosciences, Inc. Methods and compositions for treating hepatitis B virus infections
US10280419B2 (en) 2014-05-09 2019-05-07 UNIVERSITé LAVAL Reduction of amyloid beta peptide production via modification of the APP gene using the CRISPR/Cas system
WO2015171894A1 (en) 2014-05-09 2015-11-12 The Regents Of The University Of California Methods for selecting plants after genome editing
AU2015259191B2 (en) 2014-05-13 2019-03-21 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for prevention or treatment of a disease
WO2015173436A1 (en) 2014-05-16 2015-11-19 Vrije Universiteit Brussel Genetic correction of myotonic dystrophy type 1
CN103981212B (zh) 2014-05-16 2016-06-01 安徽省农业科学院水稻研究所 将黄色颖壳的水稻品种的颖壳颜色改为褐色的育种方法
CN103981211B (zh) 2014-05-16 2016-07-06 安徽省农业科学院水稻研究所 一种创制闭颖授粉水稻材料的育种方法
CN104004782B (zh) 2014-05-16 2016-06-08 安徽省农业科学院水稻研究所 一种延长水稻生育期的育种方法
CN104017821B (zh) 2014-05-16 2016-07-06 安徽省农业科学院水稻研究所 定向编辑颖壳颜色决定基因OsCHI创制褐壳水稻材料的方法
JP2017517256A (ja) 2014-05-20 2017-06-29 リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ ミネソタ 遺伝子配列を編集する方法
CA2852593A1 (en) 2014-05-23 2015-11-23 Universite Laval Methods for producing dopaminergic neurons and uses thereof
WO2015183885A1 (en) 2014-05-27 2015-12-03 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Methods and compositions for perturbing gene expression in hematopoietic stem cell lineages in vivo
KR101886381B1 (ko) 2014-05-28 2018-08-10 기초과학연구원 불활성화된 표적 특이적 뉴클레아제를 이용한 표적 dna의 분리 방법
WO2015184268A1 (en) 2014-05-30 2015-12-03 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Compositions and methods of delivering treatments for latent viral infections
WO2015188065A1 (en) 2014-06-05 2015-12-10 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for nuclease design
CN104004778B (zh) 2014-06-06 2016-03-02 重庆高圣生物医药有限责任公司 含有CRISPR/Cas9系统的靶向敲除载体及其腺病毒和应用
WO2015188191A1 (en) 2014-06-06 2015-12-10 Wong Wilson W Dna recombinase circuits for logical control of gene expression
WO2015188094A1 (en) 2014-06-06 2015-12-10 President And Fellows Of Harvard College Methods for targeted modification of genomic dna
EP3155018A4 (de) 2014-06-06 2018-01-10 The California Institute for Biomedical Research Antikörperfusionsproteine mit konstanter region und zusammensetzungen daraus
EP3708671A1 (de) 2014-06-06 2020-09-16 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Verfahren und zusammensetzungen für die veränderung eines ziellokus
WO2015188132A1 (en) 2014-06-06 2015-12-10 The California Institute For Biomedical Research Methods of constructing amino terminal immunoglobulin fusion proteins and compositions thereof
EP3155116A4 (de) 2014-06-10 2017-12-27 Massachusetts Institute Of Technology Verfahren zur genbearbeitung
US11274302B2 (en) 2016-08-17 2022-03-15 Diacarta Ltd Specific synthetic chimeric Xenonucleic acid guide RNA; s(XNA-gRNA) for enhancing CRISPR mediated genome editing efficiency
WO2016053397A2 (en) 2014-06-11 2016-04-07 Duke University Compositions and methods for rapid and dynamic flux control using synthetic metabolic valves
EP3155098A4 (de) 2014-06-11 2018-01-03 Howard, Tom E. Faktor-viii-mutationsreparatur und toleranzinduktion sowie entsprechende cdna, zusammensetzungen, verfahren und systeme
WO2015191911A2 (en) 2014-06-12 2015-12-17 Clontech Laboratories, Inc. Protein enriched microvesicles and methods of making and using the same
WO2015189693A1 (en) 2014-06-12 2015-12-17 King Abdullah University Of Science And Technology Targeted viral-mediated plant genome editing using crispr/cas9
BR112016029178A2 (pt) 2014-06-16 2017-10-17 Univ Johns Hopkins composições e métodos para a expressão de rnas guia de crispr usando o promotor h1
WO2015195547A1 (en) 2014-06-16 2015-12-23 University Of Washington Methods for controlling stem cell potential and for gene editing in stem cells
CA2952613A1 (en) 2014-06-17 2015-12-23 Poseida Therapeutics, Inc. A method for directing proteins to specific loci in the genome and uses thereof
CA2952906A1 (en) 2014-06-20 2015-12-23 Cellectis Potatoes with reduced granule-bound starch synthase
PL3155099T3 (pl) 2014-06-23 2018-08-31 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Łączenie dna mediowane nukleazą
ES2888976T3 (es) 2014-06-23 2022-01-10 Massachusetts Gen Hospital Identificación no sesgada pangenómica de DSBs evaluada por secuenciación (GUIDE-Seq.)
WO2015200555A2 (en) 2014-06-25 2015-12-30 Caribou Biosciences, Inc. Rna modification to engineer cas9 activity
GB201411344D0 (en) 2014-06-26 2014-08-13 Univ Leicester Cloning
PL3161128T3 (pl) 2014-06-26 2019-02-28 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Sposoby i kompozycje do celowanych modyfikacji genetycznych i sposoby zastosowania
WO2016001978A1 (ja) 2014-06-30 2016-01-07 花王株式会社 冷却用貼付シート
CN106662033B (zh) 2014-06-30 2019-01-18 日产自动车株式会社 内燃机
US20180187172A1 (en) 2014-07-01 2018-07-05 Board Of Regents, The University Of Texas System Regulated gene expression from viral vectors
BR112016030852A2 (pt) 2014-07-02 2018-01-16 Shire Human Genetic Therapies encapsulação de rna mensageiro
WO2016007604A1 (en) 2014-07-09 2016-01-14 Gen9, Inc. Compositions and methods for site-directed dna nicking and cleaving
EP2966170A1 (de) 2014-07-10 2016-01-13 Heinrich-Pette-Institut Leibniz-Institut für experimentelle Virologie-Stiftung bürgerlichen Rechts - HBV-Inaktivierung
US20170183677A1 (en) 2014-07-11 2017-06-29 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Agronomic trait modification using guide rna/cas endonuclease systems and methods of use
CA2954626A1 (en) 2014-07-11 2016-01-14 E. I. Du Pont De Nemours And Company Compositions and methods for producing plants resistant to glyphosate herbicide
CA2954791A1 (en) 2014-07-14 2016-01-21 The Regents Of The University Of California Crispr/cas transcriptional modulation
CN104109687A (zh) 2014-07-14 2014-10-22 四川大学 运动发酵单胞菌CRISPR-Cas9系统的构建与应用
MA40253A (fr) 2014-07-15 2017-05-24 Juno Therapeutics Inc Cellules modifiées pour thérapie cellulaire adoptive
US9944933B2 (en) 2014-07-17 2018-04-17 Georgia Tech Research Corporation Aptamer-guided gene targeting
WO2016011428A1 (en) 2014-07-17 2016-01-21 University Of Pittsburgh - Of The Commonwealth System Of Higher Education Methods of treating cells containing fusion genes
US10975406B2 (en) 2014-07-18 2021-04-13 Massachusetts Institute Of Technology Directed endonucleases for repeatable nucleic acid cleavage
US20160053272A1 (en) 2014-07-18 2016-02-25 Whitehead Institute For Biomedical Research Methods Of Modifying A Sequence Using CRISPR
US20160053304A1 (en) 2014-07-18 2016-02-25 Whitehead Institute For Biomedical Research Methods Of Depleting Target Sequences Using CRISPR
EP3172237A2 (de) 2014-07-21 2017-05-31 Novartis AG Behandlung von krebs mithilfe von humanisiertem chimärem anti-bcma-antigenrezeptor
CA2955382C (en) 2014-07-21 2023-07-18 Illumina, Inc. Polynucleotide enrichment using crispr-cas systems
CN106415742B (zh) 2014-07-22 2019-07-26 松下知识产权经营株式会社 复合磁性材料、使用其的线圈部件以及复合磁性材料的制造方法
DK3172315T3 (da) 2014-07-24 2020-12-21 Dsm Ip Assets Bv Fagresistente mælkesyrebakterier
CA2956108A1 (en) 2014-07-25 2016-01-28 Boehringer Ingelheim International Gmbh Enhanced reprogramming to ips cells
US9757420B2 (en) 2014-07-25 2017-09-12 Sangamo Therapeutics, Inc. Gene editing for HIV gene therapy
WO2016014794A1 (en) 2014-07-25 2016-01-28 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for modulating nuclease-mediated genome engineering in hematopoietic stem cells
WO2016016119A1 (en) 2014-07-26 2016-02-04 Consiglio Nazionale Delle Ricerche Compositions and methods for treatment of muscular dystrophy
WO2016022363A2 (en) 2014-07-30 2016-02-11 President And Fellows Of Harvard College Cas9 proteins including ligand-dependent inteins
US9616090B2 (en) 2014-07-30 2017-04-11 Sangamo Biosciences, Inc. Gene correction of SCID-related genes in hematopoietic stem and progenitor cells
FR3024464A1 (fr) 2014-07-30 2016-02-05 Centre Nat Rech Scient Ciblage de vecteurs integratifs non-viraux dans les sequences d'adn nucleolaires chez les eucaryotes
US9850521B2 (en) 2014-08-01 2017-12-26 Agilent Technologies, Inc. In vitro assay buffer for Cas9
US20160076093A1 (en) 2014-08-04 2016-03-17 University Of Washington Multiplex homology-directed repair
EP2982758A1 (de) 2014-08-04 2016-02-10 Centre Hospitalier Universitaire Vaudois (CHUV) Gemonänderung zur Behandlung von Morbus Huntington
KR20180015731A (ko) 2014-08-06 2018-02-13 주식회사 툴젠 캄필로박터 제주니 crispr/cas 시스템 유래 rgen을 이용한 유전체 교정
US10280402B2 (en) 2014-08-06 2019-05-07 College Of Medicine Pochon Cha University Industry-Academic Cooperation Foundation Immune-compatible cells created by nuclease-mediated editing of genes encoding HLA
WO2016022931A1 (en) 2014-08-07 2016-02-11 The Rockefeller University Compositions and methods for transcription-based crispr-cas dna editing
US9932566B2 (en) 2014-08-07 2018-04-03 Agilent Technologies, Inc. CIS-blocked guide RNA
EP3180034B1 (de) 2014-08-11 2022-04-20 The Board of Regents of The University of Texas System Vorbeugung von muskeldystrophie durch crispr/cas9-vermittelte geneditierung
US10513711B2 (en) 2014-08-13 2019-12-24 Dupont Us Holding, Llc Genetic targeting in non-conventional yeast using an RNA-guided endonuclease
CN104178461B (zh) 2014-08-14 2017-02-01 北京蛋白质组研究中心 携带cas9的重组腺病毒及其应用
CN107429241A (zh) 2014-08-14 2017-12-01 北京百奥赛图基因生物技术有限公司 Dna敲入系统
US9879270B2 (en) 2014-08-15 2018-01-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Constructs and methods for genome editing and genetic engineering of fungi and protists
EP3686279B1 (de) 2014-08-17 2023-01-04 The Broad Institute, Inc. Genombearbeitung mit cas9-nickasen
AU2015305570C1 (en) 2014-08-19 2020-07-23 President And Fellows Of Harvard College RNA-guided systems for probing and mapping of nucleic acids
WO2016028887A1 (en) 2014-08-19 2016-02-25 Pacific Biosciences Of California, Inc. Compositions and methods for enrichment of nucleic acids
WO2016026444A1 (en) 2014-08-20 2016-02-25 Shanghai Institutes For Biological Sciences, Chinese Academy Of Sciences Biomarker and therapeutic target for triple negative breast cancer
TW201614073A (en) 2014-08-25 2016-04-16 Geneweave Biosciences Inc Non-replicative transduction particles and transduction particle-based reporter systems
CN107207573A (zh) 2014-08-26 2017-09-26 加利福尼亚大学董事会 超敏aba受体
CA2959070C (en) 2014-08-27 2020-11-10 Caribou Biosciences, Inc. Methods for increasing cas9-mediated engineering efficiency
EP3633032A3 (de) 2014-08-28 2020-07-29 North Carolina State University Neuartige cas9-proteine und führungsmerkmale für dna-targeting und genomeditierung
US10570418B2 (en) 2014-09-02 2020-02-25 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for RNA-directed target DNA modification
EP3188746A4 (de) 2014-09-05 2018-05-02 The Johns Hopkins University Capn9/capns2-aktivität als ziel für eine therapeutische strategie zur behandlung von myofibroblastendifferenzierung und assoziierten erkrankungen
EP3189140B1 (de) 2014-09-05 2019-10-23 Vilnius University Programmierbare rna-zerkleinerung durch das typ iii-a-crispr-cas-system von streptococcus thermophilus
US20170298450A1 (en) 2014-09-10 2017-10-19 The Regents Of The University Of California Reconstruction of ancestral cells by enzymatic recording
US11560568B2 (en) 2014-09-12 2023-01-24 E. I. Du Pont De Nemours And Company Generation of site-specific-integration sites for complex trait loci in corn and soybean, and methods of use
CN106795488B (zh) 2014-09-16 2021-03-30 桑格摩治疗股份有限公司 用于造血干细胞中核酸酶介导的基因组工程化和校正的方法和组合物
KR20190125537A (ko) 2014-09-16 2019-11-06 길리애드 사이언시즈, 인코포레이티드 톨-유사 수용체 조정제의 고체 형태
WO2016049163A2 (en) 2014-09-24 2016-03-31 The Broad Institute Inc. Use and production of chd8+/- transgenic animals with behavioral phenotypes characteristic of autism spectrum disorder
EP3800260A1 (de) 2014-09-24 2021-04-07 City of Hope Adeno-assoziierte virusvektorvarianten für hocheffiziente genomeditierung und verfahren dafür
WO2016049251A1 (en) 2014-09-24 2016-03-31 The Broad Institute Inc. Delivery, use and therapeutic applications of the crispr-cas systems and compositions for modeling mutations in leukocytes
WO2016049024A2 (en) 2014-09-24 2016-03-31 The Broad Institute Inc. Delivery, use and therapeutic applications of the crispr-cas systems and compositions for modeling competition of multiple cancer mutations in vivo
WO2016049258A2 (en) 2014-09-25 2016-03-31 The Broad Institute Inc. Functional screening with optimized functional crispr-cas systems
WO2016046635A1 (en) 2014-09-25 2016-03-31 Institut Pasteur Methods for characterizing human papillomavirus associated cervical lesions
WO2016054225A1 (en) 2014-09-30 2016-04-07 Stc.Unm Plasmid delivery in the treatment of cancer and other disease states
KR102630014B1 (ko) 2014-10-01 2024-01-25 더 제너럴 하스피탈 코포레이션 뉴클레아제-유도 상동성-지정 복구의 효율 증가 방법
US9943612B2 (en) 2014-10-09 2018-04-17 Seattle Children's Hospital Long poly(A) plasmids and methods for introduction of long poly(A) sequences into the plasmid
EP3998344A1 (de) 2014-10-09 2022-05-18 Life Technologies Corporation Crispr-oligonukleotide und geneditierung
CA2963693A1 (en) 2014-10-10 2016-04-14 Editas Medicine, Inc. Compositions and methods for promoting homology directed repair
CN107530399B (zh) 2014-10-10 2022-03-18 马萨诸塞眼科耳科诊所 治疗分子在体外和体内的有效递送
WO2016061073A1 (en) 2014-10-14 2016-04-21 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Composition and method for in vivo engineering of chromosomal rearrangements
RU2706965C2 (ru) 2014-10-15 2019-11-21 Регенерон Фармасьютикалз, Инк. Способы и композиции для получения или поддержания плюрипотентных клеток
CN107208086A (zh) 2014-10-17 2017-09-26 霍华德休斯医学研究所 基因组探针
CN104342457A (zh) 2014-10-17 2015-02-11 杭州师范大学 一种将外源基因定点整合到靶标基因的方法
CN107027313B (zh) 2014-10-17 2021-09-07 宾州研究基金会 用于多元rna引导的基因组编辑和其它rna技术的方法和组合物
US10793922B2 (en) 2014-10-20 2020-10-06 Envirologix Inc. Compositions and methods for detecting an RNA virus
WO2016077052A2 (en) 2014-10-22 2016-05-19 President And Fellows Of Harvard College Evolution of proteases
US20170306306A1 (en) 2014-10-24 2017-10-26 Life Technologies Corporation Compositions and Methods for Enhancing Homologous Recombination
US20170247762A1 (en) 2014-10-27 2017-08-31 The Board Institute Inc. Compositions, methods and use of synthetic lethal screening
WO2016069912A1 (en) 2014-10-29 2016-05-06 Massachusetts Eye And Ear Infirmary Efficient delivery of therapeutic molecules in vitro and in vivo
MA40880A (fr) 2014-10-30 2017-09-05 Temple Univ Of The Commonwealth Éradication guidée par l'arn du virus jc humain et d'autres polyomavirus
US9816080B2 (en) 2014-10-31 2017-11-14 President And Fellows Of Harvard College Delivery of CAS9 via ARRDC1-mediated microvesicles (ARMMs)
EP3708155A1 (de) 2014-10-31 2020-09-16 Massachusetts Institute Of Technology Massiv parallele kombinatorische genetik für crispr
KR20230098910A (ko) 2014-10-31 2023-07-04 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실베니아 변형된 t 세포에서 유전자 발현의 변경 및 그의 용도
CN104504304B (zh) 2014-11-03 2017-08-25 深圳先进技术研究院 一种成簇的规律间隔的短回文重复序列识别方法及装置
CN104404036B (zh) 2014-11-03 2017-12-01 赛业（苏州）生物科技有限公司 基于CRISPR/Cas9技术的条件性基因敲除方法
WO2016072936A1 (en) 2014-11-03 2016-05-12 Nanyang Technological University Novel recombinant expression systems
DK3216867T3 (da) 2014-11-04 2020-06-22 Univ Kobe Nat Univ Corp Fremgangsmåde til at modificere genomsekvens for at introducere specifik mutation i tilsigtet dna-sekvens ved base-fjernelsesreaktion og molekylekompleks anvendt dertil
WO2016073559A1 (en) 2014-11-05 2016-05-12 The Regents Of The University Of California Methods for autocatalytic genome editing and neutralizing autocatalytic genome editing
EP3215611B1 (de) 2014-11-06 2019-08-21 E. I. du Pont de Nemours and Company Peptidvermittelte freisetzung von rna-geführter endonuklease in zellen
CA2963820A1 (en) 2014-11-07 2016-05-12 Editas Medicine, Inc. Methods for improving crispr/cas-mediated genome-editing
ES2706531T3 (es) 2014-11-11 2019-03-29 Illumina Inc Amplificación de polinucleótidos empleando sistemas CRISPR-Cas
CN107532142A (zh) 2014-11-11 2018-01-02 应用干细胞有限公司 使用同源重组改造间充质干细胞
JP6621820B2 (ja) 2014-11-14 2019-12-18 インスティチュート フォー ベーシック サイエンスＩｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｆｏｒ Ｂａｓｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅ ゲノムでプログラマブルヌクレアーゼの非標的位置を検出する方法
EP3467110A1 (de) 2014-11-15 2019-04-10 Zumutor Biologics Inc. Dna-bindende domäne, nichtfucosylierte und teilweise fucosylierte proteine und verfahren dafür
WO2016080097A1 (ja) 2014-11-17 2016-05-26 国立大学法人東京医科歯科大学 簡便で高効率の遺伝子改変非ヒト哺乳動物の作製方法
EP3222728B1 (de) 2014-11-19 2021-07-14 Institute for Basic Science Verfahren zur regulierung der genexpression mithilfe des aus zwei vektoren exprimierten cas9-proteins
US11319555B2 (en) 2014-11-20 2022-05-03 Duke University Compositions, systems and methods for cell therapy
RU2734770C2 (ru) 2014-11-21 2020-10-23 Регенерон Фармасьютикалз, Инк. Способы и композиции для нацеленной генетической модификации с использованием парных гидовых рнк
US10227661B2 (en) 2014-11-21 2019-03-12 GeneWeave Biosciences, Inc. Sequence-specific detection and phenotype determination
WO2016086177A2 (en) 2014-11-25 2016-06-02 Drexel University Compositions and methods for hiv quasi-species excision from hiv-1-infected patients
WO2016084088A1 (en) 2014-11-26 2016-06-02 Ramot At Tel-Aviv University Ltd. Targeted elimination of bacterial genes
GB201421096D0 (en) 2014-11-27 2015-01-14 Imp Innovations Ltd Genome editing methods
EP3224363B1 (de) 2014-11-27 2021-11-03 Yissum Research Development Company of the Hebrew University of Jerusalem Ltd. Nukleinsäurekonstrukte zur genomeditierung
CN105695485B (zh) 2014-11-27 2020-02-21 中国科学院上海生命科学研究院 一种用于丝状真菌Crispr-Cas系统的Cas9编码基因及其应用
US20180105834A1 (en) 2014-11-27 2018-04-19 Institute Of Animal Sciences, Chinese Academy Of Agrigultural Sciences A method of site-directed insertion to h11 locus in pigs by using site-directed cutting system
US20170266320A1 (en) 2014-12-01 2017-09-21 President And Fellows Of Harvard College RNA-Guided Systems for In Vivo Gene Editing
US10479997B2 (en) 2014-12-01 2019-11-19 Novartis Ag Compositions and methods for diagnosis and treatment of prostate cancer
WO2016089433A1 (en) 2014-12-03 2016-06-09 Agilent Technologies, Inc. Guide rna with chemical modifications
CN104450774A (zh) 2014-12-04 2015-03-25 中国农业科学院作物科学研究所 一种大豆CRISPR/Cas9体系的构建及其在大豆基因修饰中的应用
US10975392B2 (en) 2014-12-05 2021-04-13 Abcam Plc Site-directed CRISPR/recombinase compositions and methods of integrating transgenes
CN104531705A (zh) 2014-12-09 2015-04-22 中国农业大学 利用CRISPR-Cas9系统敲除动物myostatin基因的方法
CN104531704B (zh) 2014-12-09 2019-05-21 中国农业大学 利用CRISPR-Cas9系统敲除动物FGF5基因的方法
CA2969847A1 (en) 2014-12-10 2016-06-16 Regents Of The University Of Minnesota Genetically modified cells, tissues, and organs for treating disease
CN104480144B (zh) 2014-12-12 2017-04-12 武汉大学 用于艾滋病基因治疗的CRISPR/Cas9重组慢病毒载体及其慢病毒
WO2016094872A1 (en) 2014-12-12 2016-06-16 The Broad Institute Inc. Dead guides for crispr transcription factors
EP3230445B1 (de) 2014-12-12 2024-01-24 Tod M. Woolf Zusammensetzungen und verfahren zur editierung von nukleinsäuren in zellen mit oligonukleotiden
WO2016094880A1 (en) 2014-12-12 2016-06-16 The Broad Institute Inc. Delivery, use and therapeutic applications of crispr systems and compositions for genome editing as to hematopoietic stem cells (hscs)
EP3985115A1 (de) 2014-12-12 2022-04-20 The Broad Institute, Inc. Geschützte guide-rnas (pgrnas)
WO2016094874A1 (en) 2014-12-12 2016-06-16 The Broad Institute Inc. Escorted and functionalized guides for crispr-cas systems
CN107249645A (zh) 2014-12-12 2017-10-13 朱坚 用于选择性消除所关注细胞的方法和组合物
US10221398B2 (en) 2014-12-16 2019-03-05 C3J Therapeutics, Inc. Compositions of and methods for in vitro viral genome engineering
US11427829B2 (en) 2014-12-16 2022-08-30 Danisco Us Inc Fungal genome modification systems and methods of use
EP3233095A2 (de) 2014-12-17 2017-10-25 Cellectis Nicht-t-zell-transduktionsbereich mit expression des hemmenden chimären antigenrezeptors (icar oder n-car)
EP3712269A1 (de) 2014-12-17 2020-09-23 ProQR Therapeutics II B.V. Gezieltes rna-editing
US20170369866A1 (en) 2014-12-17 2017-12-28 E I Du Pont De Nemours And Company Compositions and methods for efficient gene editing in e. coli using guide rna/cas endonuclease systems in combination with circular polynucleotide modification templates
WO2016097751A1 (en) 2014-12-18 2016-06-23 The University Of Bath Method of cas9 mediated genome engineering
US9840702B2 (en) 2014-12-18 2017-12-12 Integrated Dna Technologies, Inc. CRISPR-based compositions and methods of use
WO2016100974A1 (en) 2014-12-19 2016-06-23 The Broad Institute Inc. Unbiased identification of double-strand breaks and genomic rearrangement by genome-wide insert capture sequencing
CN104745626B (zh) 2014-12-19 2018-05-01 中国航天员科研训练中心 一种条件性基因敲除动物模型的快速构建方法及应用
JP6947638B2 (ja) 2014-12-20 2021-10-13 アーク バイオ， エルエルシー Ｃｒｉｓｐｒ／ｃａｓ系タンパク質を使用する核酸の標的化枯渇、富化および分割のための組成物および方法
CN104560864B (zh) 2014-12-22 2017-08-11 中国科学院微生物研究所 利用CRISPR‑Cas9系统构建的敲除IFN‑β基因的293T细胞系
US10190106B2 (en) 2014-12-22 2019-01-29 Univesity Of Massachusetts Cas9-DNA targeting unit chimeras
US11053271B2 (en) 2014-12-23 2021-07-06 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for nucleic acid integration
WO2016106236A1 (en) 2014-12-23 2016-06-30 The Broad Institute Inc. Rna-targeting system
AU2015369725A1 (en) 2014-12-24 2017-06-29 Massachusetts Institute Of Technology CRISPR having or associated with destabilization domains
AU2015101792A4 (en) 2014-12-24 2016-01-28 Massachusetts Institute Of Technology Engineering of systems, methods and optimized enzyme and guide scaffolds for sequence manipulation
WO2016103233A2 (en) 2014-12-24 2016-06-30 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Systems and methods for genome modification and regulation
CN104651398A (zh) 2014-12-24 2015-05-27 杭州师范大学 利用CRISPR-Cas9特异敲出microRNA基因家族的方法
WO2016104716A1 (ja) 2014-12-26 2016-06-30 国立研究開発法人理化学研究所 遺伝子のノックアウト方法
CN104498493B (zh) 2014-12-30 2017-12-26 武汉大学 CRISPR/Cas9特异性敲除乙型肝炎病毒的方法以及用于特异性靶向HBV DNA的gRNA
WO2016108926A1 (en) 2014-12-30 2016-07-07 The Broad Institute Inc. Crispr mediated in vivo modeling and genetic screening of tumor growth and metastasis
WO2016109255A1 (en) 2014-12-30 2016-07-07 University Of South Florida Methods and compositions for cloning into large vectors
CN104651399B (zh) 2014-12-31 2018-11-16 广西大学 一种利用CRISPR/Cas系统在猪胚胎细胞中实现基因敲除的方法
EP3240889A4 (de) 2014-12-31 2018-06-20 Synthetic Genomics, Inc. Zusammensetzungen und verfahren zur hocheffizienten in vivo genomeditierung
DK3242948T3 (da) 2015-01-06 2022-03-07 Dsm Ip Assets Bv Crispr-cas-system til en yarrowia-værtscelle
DK3242950T3 (da) 2015-01-06 2021-12-20 Dsm Ip Assets Bv Crispr-cas-system til en trådformet svampeværtscelle
CN108064280B (zh) 2015-01-06 2021-10-29 延世大学校产学协力团 利用以凝血因子viii基因为靶的核酸内切酶的a型血友病治疗用组合物
DK3242949T3 (da) 2015-01-06 2022-01-24 Dsm Ip Assets Bv Crispr-cas-system til en gærværtscelle
CN104651392B (zh) 2015-01-06 2018-07-31 华南农业大学 一种利用CRISPR/Cas9系统定点突变P/TMS12-1获得温敏不育系的方法
WO2016112242A1 (en) 2015-01-08 2016-07-14 President And Fellows Of Harvard College Split cas9 proteins
CN104593422A (zh) 2015-01-08 2015-05-06 中国农业大学 一种抗蓝耳病克隆猪的制备方法
WO2016112351A1 (en) 2015-01-09 2016-07-14 Bio-Rad Laboratories, Inc. Detection of genome editing
US11208638B2 (en) 2015-01-12 2021-12-28 The Regents Of The University Of California Heterodimeric Cas9 and methods of use thereof
CN107250373A (zh) 2015-01-12 2017-10-13 麻省理工学院 通过微流体递送实现的基因编辑
WO2016112963A1 (en) 2015-01-13 2016-07-21 Riboxx Gmbh Delivery of biomolecules into cells
MA41349A (fr) 2015-01-14 2017-11-21 Univ Temple Éradication de l'herpès simplex de type i et d'autres virus de l'herpès associés guidée par arn
CA2972740A1 (en) 2015-01-14 2016-07-21 Universite D'aix-Marseille Proteasome inhibitors for treating a disorder related to an accumulation of non-degraded abnormal protein or a cancer
WO2016115326A1 (en) 2015-01-15 2016-07-21 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods for modulating genome editing
CN104611370A (zh) 2015-01-16 2015-05-13 深圳市科晖瑞生物医药有限公司 一种剔除β2-微球蛋白基因片段的方法
KR102085189B1 (ko) 2015-01-19 2020-04-28 인스티튜트 오브 제네틱스 앤드 디벨롭멘털 바이오롤지, 차이니즈 아카데미 오브 사이언시스 일시적인 유전자 발현을 통한 정교한 식물 변형 방법
CN104725626B (zh) 2015-01-22 2016-06-29 漳州亚邦化学有限公司 一种适用于人造石英石的不饱和树脂的制备方法
CN105821072A (zh) 2015-01-23 2016-08-03 深圳华大基因研究院 用于DNA组装的CRISPR-Cas9系统及DNA组装方法
WO2016123071A1 (en) 2015-01-26 2016-08-04 Cold Spring Harbor Laboratory Methods of identifying essential protein domains
US10059940B2 (en) 2015-01-27 2018-08-28 Minghong Zhong Chemically ligated RNAs for CRISPR/Cas9-lgRNA complexes as antiviral therapeutic agents
CN104561095B (zh) 2015-01-27 2017-08-22 深圳市国创纳米抗体技术有限公司 一种能够生产人神经生长因子的转基因小鼠的制备方法
JP6835726B2 (ja) 2015-01-28 2021-02-24 パイオニア ハイ−ブレッド インターナショナル， インコーポレイテッド Ｃｒｉｓｐｒハイブリッドｄｎａ／ｒｎａポリヌクレオチドおよび使用方法
WO2016123243A1 (en) 2015-01-28 2016-08-04 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for labeling a single-stranded target nucleic acid
EP3798302A1 (de) 2015-01-29 2021-03-31 Meiogenix Verfahren zur induktion gezielter meiotischer rekombinationen
CN107429254B (zh) 2015-01-30 2021-10-15 加利福尼亚大学董事会 原代造血细胞中的蛋白递送
CN107849563B (zh) 2015-02-02 2021-10-19 梅里特斯英国第二有限公司 通过对选择性剪接进行适体介导的调节来实现的基因表达调控
CN104593418A (zh) 2015-02-06 2015-05-06 中国医学科学院医学实验动物研究所 一种人源化大鼠药物评价动物模型建立的方法
WO2016130600A2 (en) 2015-02-09 2016-08-18 Duke University Compositions and methods for epigenome editing
KR101584933B1 (ko) 2015-02-10 2016-01-13 성균관대학교산학협력단 항생제 내성 억제용 재조합 벡터 및 이의 용도
WO2016130697A1 (en) 2015-02-11 2016-08-18 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Methods and kits for generating vectors that co-express multiple target molecules
CN104928321B (zh) 2015-02-12 2018-06-01 中国科学院西北高原生物研究所 一种由Crispr/Cas9诱导的鳞片缺失斑马鱼模式及建立方法
CN104726494B (zh) 2015-02-12 2018-10-23 中国人民解放军第二军医大学 CRISPR-Cas9技术构建染色体易位干细胞及动物模型的方法
US10584321B2 (en) 2015-02-13 2020-03-10 University Of Massachusetts Compositions and methods for transient delivery of nucleases
US20160244784A1 (en) 2015-02-15 2016-08-25 Massachusetts Institute Of Technology Population-Hastened Assembly Genetic Engineering
WO2016132122A1 (en) 2015-02-17 2016-08-25 University Of Edinburgh Assay construct
WO2016133165A1 (ja) 2015-02-19 2016-08-25 国立大学法人徳島大学 Ｃａｓ９ ｍＲＮＡを哺乳動物の受精卵にエレクトロポレーションにより導入する方法
EP3262173A2 (de) 2015-02-23 2018-01-03 Crispr Therapeutics AG Materialien und verfahren zur behandlung von humangenetischen erkrankungen einschliesslich hämoglobinopathien
EP3262162A4 (de) 2015-02-23 2018-08-08 Voyager Therapeutics, Inc. Regulierbare expression unter verwendung des adeno-assoziierten virus (aav)
CN107532168A (zh) 2015-02-23 2018-01-02 克里斯珀医疗股份公司 治疗血红蛋白病的材料和方法
US20180002715A1 (en) 2015-02-25 2018-01-04 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Composition and methods for regulated expression of a guide rna/cas endonuclease complex
KR20160103953A (ko) 2015-02-25 2016-09-02 연세대학교 산학협력단 Crispr 시스템을 이용한 다중 위치 염기서열의 동시 포획 방법
WO2016135507A1 (en) 2015-02-27 2016-09-01 University Of Edinburgh Nucleic acid editing systems
CN104805099B (zh) 2015-03-02 2018-04-13 中国人民解放军第二军医大学 一种安全编码Cas9蛋白的核酸分子及其表达载体
AU2016226077B2 (en) 2015-03-03 2021-12-23 The General Hospital Corporation Engineered CRISPR-Cas9 nucleases with altered PAM specificity
CN104651401B (zh) 2015-03-05 2019-03-08 东华大学 一种mir-505双等位基因敲除的方法
CN104673816A (zh) 2015-03-05 2015-06-03 广东医学院 一种pCr-NHEJ载体及其构建方法及其用于细菌基因定点敲除的应用
WO2016145150A2 (en) 2015-03-11 2016-09-15 The Broad Institute Inc. Selective treatment of prmt5 dependent cancer
US20160264934A1 (en) 2015-03-11 2016-09-15 The General Hospital Corporation METHODS FOR MODULATING AND ASSAYING m6A IN STEM CELL POPULATIONS
WO2016141893A1 (zh) 2015-03-12 2016-09-15 中国科学院遗传与发育生物学研究所 一种提高植物对入侵的dna病毒的抵御能力的方法
GB201504223D0 (en) 2015-03-12 2015-04-29 Genome Res Ltd Biallelic genetic modification
CA3091771A1 (en) 2015-03-13 2016-09-22 The Jackson Laboratory A three-component crispr/cas complex system and uses thereof
EP3279321A4 (de) 2015-03-16 2018-10-31 Institute Of Genetics And Developmental Biology, Chinese Academy Of Sciences Verfahren zur anwendung einer nicht-genetischen substanz zur durchführung der stellengerichteten reform eines pflanzengenoms
CN106032540B (zh) 2015-03-16 2019-10-25 中国科学院上海生命科学研究院 CRISPR/Cas9核酸内切酶体系的腺相关病毒载体构建及其用途
WO2016149547A1 (en) 2015-03-17 2016-09-22 Bio-Rad Laboratories, Inc. Detection of genome editing
WO2016149484A2 (en) 2015-03-17 2016-09-22 Temple University Of The Commonwealth System Of Higher Education Compositions and methods for specific reactivation of hiv latent reservoir
MA41382A (fr) 2015-03-20 2017-11-28 Univ Temple Édition génique basée sur le système crispr/endonucléase à induction par tat
EP3271461A1 (de) 2015-03-20 2018-01-24 Danmarks Tekniske Universitet Crispr/cas9-basiertes engineering von actinomycin-genomen
CN104726449A (zh) 2015-03-23 2015-06-24 国家纳米科学中心 一种用于预防和/或治疗HIV的CRISPR-Cas9系统及其制备方法和用途
CN106148416B (zh) 2015-03-24 2019-12-17 华东师范大学 Cyp基因敲除大鼠的培育方法及其肝微粒体的制备方法
US20180112213A1 (en) 2015-03-25 2018-04-26 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-related methods, compositions and components
WO2016154579A2 (en) 2015-03-26 2016-09-29 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-mediated gene conversion
CA2981509A1 (en) 2015-03-30 2016-10-06 The Board Of Regents Of The Nevada System Of Higher Educ. On Behalf Of The University Of Nevada, La Compositions comprising talens and methods of treating hiv
KR20180029953A (ko) 2015-03-31 2018-03-21 엑셀리겐 사이언티픽, 인코포레이티드 세포 또는 유기체의 게놈으로의 ＤＮＡ 서열의 표적화 혼입을 위한 Ｃａｓ 9 레트로바이러스 인테그라제 시스템 및 Ｃａｓ 9 재조합효소 시스템
AU2016244033A1 (en) 2015-04-01 2017-10-19 Editas Medicine, Inc. CRISPR/CAS-related methods and compositions for treating Duchenne Muscular Dystrophy and Becker Muscular Dystrophy
WO2016161260A1 (en) 2015-04-02 2016-10-06 Agenovir Corporation Gene delivery methods and compositions
CN106167810A (zh) 2015-04-03 2016-11-30 内蒙古中科正标生物科技有限责任公司 基于CRISPR/Cas9技术的单子叶植物基因敲除载体及其应用
AU2016243052C1 (en) 2015-04-03 2022-11-24 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Composition and methods of genome editing of B-cells
US20170166928A1 (en) 2015-04-03 2017-06-15 Whitehead Institute For Biomedical Research Compositions And Methods For Genetically Modifying Yeast
EP3280803B1 (de) 2015-04-06 2021-05-26 The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University Chemisch modifizierte guide-rnas für crispr/ cas-vermittelte genregulierung
US11214779B2 (en) 2015-04-08 2022-01-04 University of Pittsburgh—of the Commonwealth System of Higher Education Activatable CRISPR/CAS9 for spatial and temporal control of genome editing
US11390860B2 (en) 2015-04-13 2022-07-19 The University Of Tokyo Set of polypeptides exhibiting nuclease activity or nickase activity with dependence on light or in presence of drug or suppressing or activating expression of target gene
US10155938B2 (en) 2015-04-14 2018-12-18 City Of Hope Coexpression of CAS9 and TREX2 for targeted mutagenesis
GB201506509D0 (en) 2015-04-16 2015-06-03 Univ Wageningen Nuclease-mediated genome editing
US10738290B2 (en) 2015-04-21 2020-08-11 Novartis Ag RNA-guided gene editing system and uses thereof
CN104805118A (zh) 2015-04-22 2015-07-29 扬州大学 一种苏禽黄鸡胚胎干细胞特定基因进行靶向敲除方法
CN104762321A (zh) 2015-04-22 2015-07-08 东北林业大学 基于CRISPR/Cas9系统靶向敲除KHV基因的敲除载体构建方法及其crRNA原件
AU2016253150B2 (en) 2015-04-24 2022-04-21 Editas Medicine, Inc. Evaluation of Cas9 molecule/guide RNA molecule complexes
US11268158B2 (en) 2015-04-24 2022-03-08 St. Jude Children's Research Hospital, Inc. Assay for safety assessment of therapeutic genetic manipulations, gene therapy vectors and compounds
CN107614012A (zh) 2015-04-24 2018-01-19 加利福尼亚大学董事会 使用工程化的细胞检测、监测或治疗疾病或病况的系统及制备和使用它们的方法
EP3289081B1 (de) 2015-04-27 2019-03-27 Genethon Zusammensetzungen und verfahren zur behandlung von expandierenden nukleotid-repeat-erkrankungen
EP3288594B1 (de) 2015-04-27 2022-06-29 The Trustees of The University of Pennsylvania Duales aav-vektorsystem für crispr-/cas9-vermittelte korrektur von menschlichen erkrankungen
EP3087974A1 (de) 2015-04-29 2016-11-02 Rodos BioTarget GmbH Gezielte nanoträger zur gezielten verabreichung von therapeutika für die gentherapie
WO2016176690A2 (en) 2015-04-30 2016-11-03 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Gene therapy for autosomal dominant diseases
WO2016176404A1 (en) 2015-04-30 2016-11-03 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Methods and kits for cloning-free genome editing
US20160346359A1 (en) 2015-05-01 2016-12-01 Spark Therapeutics, Inc. Adeno-associated Virus-Mediated CRISPR-Cas9 Treatment of Ocular Disease
DK3289076T3 (da) 2015-05-01 2022-01-17 Prec Biosciences Inc Præcis sletning af kromosomale sekvenser in vivo
CN108026566A (zh) 2015-05-04 2018-05-11 特拉维夫大学拉莫特有限公司 用于使dna片段化的方法和试剂盒
CN104894068A (zh) 2015-05-04 2015-09-09 南京凯地生物科技有限公司 一种利用CRISPR/Cas9制备CAR-T细胞的方法
GB2531454A (en) 2016-01-10 2016-04-20 Snipr Technologies Ltd Recombinogenic nucleic acid strands in situ
KR20200091499A (ko) 2015-05-06 2020-07-30 스니프르 테크놀로지스 리미티드 미생물 개체군 변경 및 미생물군 변형
WO2016182893A1 (en) 2015-05-08 2016-11-17 Teh Broad Institute Inc. Functional genomics using crispr-cas systems for saturating mutagenesis of non-coding elements, compositions, methods, libraries and applications thereof
EP3294873B1 (de) 2015-05-08 2020-08-19 The Children's Medical Center Corporation Abzielung auf funktionelle regionen des bcl11a-enhancers zur reinduktion von fetalem hämoglobin
EP3294896A1 (de) 2015-05-11 2018-03-21 Editas Medicine, Inc. Optimierte crispr/cas9-systeme und verfahren für die geneditierung in stammzellen
CA2985615A1 (en) 2015-05-11 2016-11-17 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for treating hiv infection and aids
KR101785847B1 (ko) 2015-05-12 2017-10-17 연세대학교 산학협력단 선형 이중가닥 ＤＮＡ를 활용한 ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ 시스템을 이용한 표적 유전체 교정
IL284707B2 (en) 2015-05-12 2024-01-01 Sangamo Therapeutics Inc Regulation of nuclease-mediated gene expression
EP3294343A4 (de) 2015-05-13 2018-09-26 Seattle Children's Hospital, dba Seattle Children's Research Institute Erhöhung von endonukleasebasierter geneditierung in primärzellen
CN105886498A (zh) 2015-05-13 2016-08-24 沈志荣 CRISPR-Cas9特异性敲除人PCSK9基因的方法以及用于特异性靶向PCSK9基因的sgRNA
WO2016183402A2 (en) 2015-05-13 2016-11-17 President And Fellows Of Harvard College Methods of making and using guide rna for use with cas9 systems
US11267899B2 (en) 2015-05-13 2022-03-08 Zumutor Biologics Inc. Afucosylated protein, cell expressing said protein and associated methods
US11535871B2 (en) 2015-05-14 2022-12-27 University Of Southern California Optimized gene editing utilizing a recombinant endonuclease system
US20180291372A1 (en) 2015-05-14 2018-10-11 Massachusetts Institute Of Technology Self-targeting genome editing system
JP2018515142A (ja) 2015-05-15 2018-06-14 ダーマコン，インコーポレイテッド． Ｃａｓ９介在遺伝子編集用の合成シングルガイドｒｎａ
MX2017014560A (es) 2015-05-15 2018-03-01 Pioneer Hi Bred Int Caracterizacion rapida de sistemas de endonucleasa cas, secuencias pam y elementos arn de guia.
PT3298134T (pt) 2015-05-16 2023-08-18 Genzyme Corp Edição génica de mutações intrónicas profundas
CN104846010B (zh) 2015-05-18 2018-07-06 安徽省农业科学院水稻研究所 一种删除转基因水稻筛选标记基因的方法
EP3298149A1 (de) 2015-05-18 2018-03-28 King Abdullah University Of Science And Technology Verfahren zur hemmung von pathogenen pflanzenvirusinfektionen durch crispr/cas9-vermittelter interferenz
EP3095870A1 (de) 2015-05-19 2016-11-23 Kws Saat Se Verfahren zur in-planta-transformation von pflanzen und darauf basierte herstellungsverfahren und daraus erhältliche produkte
CN106011104B (zh) 2015-05-21 2019-09-27 清华大学 利用拆分Cas系统进行基因编辑和表达调控方法
WO2016187904A1 (zh) 2015-05-22 2016-12-01 深圳市第二人民医院 CRISPR-Cas9特异性敲除猪CMAH基因的方法及用于特异性靶向CMAH基因的sgRNA
CN105518135B (zh) 2015-05-22 2020-11-24 深圳市第二人民医院 CRISPR-Cas9特异性敲除猪CMAH基因的方法及用于特异性靶向CMAH基因的sgRNA
US20160340622A1 (en) 2015-05-22 2016-11-24 Nabil Radi Abdou Bar Soap Anchoring Core
WO2016187717A1 (en) 2015-05-26 2016-12-01 Exerkine Corporation Exosomes useful for genome editing
CN104894075B (zh) 2015-05-28 2019-08-06 华中农业大学 CRISPR/Cas9和Cre/lox系统编辑伪狂犬病毒基因组制备疫苗方法和应用
WO2016191684A1 (en) 2015-05-28 2016-12-01 Finer Mitchell H Genome editing vectors
CN105624146B (zh) 2015-05-28 2019-02-15 中国科学院微生物研究所 基于CRISPR/Cas9和酿酒酵母细胞内源的同源重组的分子克隆方法
US20160348074A1 (en) 2015-05-29 2016-12-01 Agenovir Corporation Methods and compositions for treating cells for transplant
US20160350476A1 (en) 2015-05-29 2016-12-01 Agenovir Corporation Antiviral methods and compositions
US20160346362A1 (en) 2015-05-29 2016-12-01 Agenovir Corporation Methods and compositions for treating cytomegalovirus infections
WO2016196273A1 (en) 2015-05-29 2016-12-08 Agenovir Corporation Compositions and methods to treat viral infections
EP3302556A4 (de) 2015-05-29 2018-12-05 Clark Atlanta University Menschliche zelllinienmutanten für zic2
WO2016196282A1 (en) 2015-05-29 2016-12-08 Agenovir Corporation Compositions and methods for cell targeted hpv treatment
EP3303607A4 (de) 2015-05-29 2018-10-10 North Carolina State University Verfahren zum screening von bakterien, archaea, algen und hefe mit crispir-nukleinsäuren
US10117911B2 (en) 2015-05-29 2018-11-06 Agenovir Corporation Compositions and methods to treat herpes simplex virus infections
KR102553518B1 (ko) 2015-06-01 2023-07-07 템플 유니버시티-오브 더 커먼웰쓰 시스템 오브 하이어 에듀케이션 Hiv 감염의 rna-가이드된 치료를 위한 방법 및 조성물
WO2016191869A1 (en) 2015-06-01 2016-12-08 The Hospital For Sick Children Delivery of structurally diverse polypeptide cargo into mammalian cells by a bacterial toxin
CN105112445B (zh) 2015-06-02 2018-08-10 广州辉园苑医药科技有限公司 一种基于CRISPR-Cas9基因敲除技术的miR-205基因敲除试剂盒
EP3303585A4 (de) 2015-06-03 2018-10-31 Board of Regents of the University of Nebraska Dna-editierung mit verwendung von einzelstrang-dna
EP3303634B1 (de) 2015-06-03 2023-08-30 The Regents of The University of California Cas9-varianten und verfahren zur verwendung davon
WO2016197133A1 (en) 2015-06-04 2016-12-08 Protiva Biotherapeutics, Inc. Delivering crispr therapeutics with lipid nanoparticles
US20180245074A1 (en) 2015-06-04 2018-08-30 Protiva Biotherapeutics, Inc. Treating hepatitis b virus infection using crispr
EP3334823A4 (de) 2015-06-05 2019-05-22 The Regents of The University of California Verfahren und zusammensetzungen zur generierung von crispr/cas-guide-rna
CN105039339B (zh) 2015-06-05 2017-12-19 新疆畜牧科学院生物技术研究所 一种以RNA介导的特异性敲除绵羊FecB基因的方法及其专用sgRNA
WO2016201047A1 (en) 2015-06-09 2016-12-15 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for improving transplantation
CN107820516B (zh) 2015-06-10 2022-03-04 弗门尼舍有限公司 鉴定麝香化合物的方法
WO2016198500A1 (en) 2015-06-10 2016-12-15 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for rna-guided treatment of human cytomegalovirus (hcmv) infection
ES2961258T3 (es) 2015-06-10 2024-03-11 Firmenich & Cie Líneas celulares para el cribado de receptores de aroma y olor
US20160362667A1 (en) 2015-06-10 2016-12-15 Caribou Biosciences, Inc. CRISPR-Cas Compositions and Methods
CN105518139B (zh) 2015-06-11 2021-02-02 深圳市第二人民医院 CRISPR-Cas9特异性敲除猪FGL2基因的方法及用于特异性靶向FGL2基因的sgRNA
WO2016197361A1 (zh) 2015-06-11 2016-12-15 深圳市第二人民医院 CRISPR-Cas9特异性敲除猪GGTA1基因的方法及用于特异性靶向GGTA1基因的sgRNA
WO2016197354A1 (zh) 2015-06-11 2016-12-15 深圳市第二人民医院 CRISPR-Cas9特异性敲除猪PDX1基因的方法及用于特异性靶向PDX1基因的sgRNA
WO2016197362A1 (zh) 2015-06-11 2016-12-15 深圳市第二人民医院 CRISPR-Cas9特异性敲除猪vWF基因的方法及用于特异性靶向vWF基因的sgRNA
CN106414740A (zh) 2015-06-11 2017-02-15 深圳市第二人民医院 CRISPR‑Cas9特异性敲除猪SLA‑3基因的方法及用于特异性靶向SLA‑3基因的sgRNA
WO2016197359A1 (zh) 2015-06-11 2016-12-15 深圳市第二人民医院 CRISPR-Cas9特异性敲除猪SLA-1基因的方法及用于特异性靶向SLA-1基因的sgRNA
WO2016197356A1 (zh) 2015-06-11 2016-12-15 深圳市第二人民医院 CRISPR-Cas9特异性敲除猪SLA-2基因的方法及用于特异性靶向SLA-2基因的sgRNA
CN105518137B (zh) 2015-06-11 2021-04-30 深圳市第二人民医院 CRISPR-Cas9特异性敲除猪SALL1基因的方法及用于特异性靶向SALL1基因的sgRNA
CN105518138B (zh) 2015-06-11 2021-07-27 深圳市第二人民医院 CRISPR-Cas9特异性敲除猪GFRA1基因的方法及用于特异性靶向GFRA1基因的sgRNA
GB201510296D0 (en) 2015-06-12 2015-07-29 Univ Wageningen Thermostable CAS9 nucleases
WO2016201138A1 (en) 2015-06-12 2016-12-15 The Regents Of The University Of California Reporter cas9 variants and methods of use thereof
EP3307888A1 (de) 2015-06-12 2018-04-18 Erasmus University Medical Center Rotterdam Neue crispr-tests
JP7051438B2 (ja) 2015-06-15 2022-04-11 ノース カロライナ ステート ユニバーシティ 核酸およびｒｎａに基づく抗菌剤の効率的な送達のための方法および組成物
US11555207B2 (en) 2015-06-17 2023-01-17 The Uab Research Foundation CRISPR/Cas9 complex for introducing a functional polypeptide into cells of blood cell lineage
WO2016205728A1 (en) 2015-06-17 2016-12-22 Massachusetts Institute Of Technology Crispr mediated recording of cellular events
JP2018518182A (ja) 2015-06-17 2018-07-12 ザ ユーエービー リサーチ ファンデーション ゲノム編集のためのｃｒｉｓｐｒ／ｃａｓ９複合体
WO2016205623A1 (en) 2015-06-17 2016-12-22 North Carolina State University Methods and compositions for genome editing in bacteria using crispr-cas9 systems
CA3012631A1 (en) 2015-06-18 2016-12-22 The Broad Institute Inc. Novel crispr enzymes and systems
WO2016205745A2 (en) 2015-06-18 2016-12-22 The Broad Institute Inc. Cell sorting
US9957501B2 (en) 2015-06-18 2018-05-01 Sangamo Therapeutics, Inc. Nuclease-mediated regulation of gene expression
US10954513B2 (en) 2015-06-18 2021-03-23 University Of Utah Research Foundation RNA-guided transcriptional regulation and methods of using the same for the treatment of back pain
US9790490B2 (en) 2015-06-18 2017-10-17 The Broad Institute Inc. CRISPR enzymes and systems
RU2752834C2 (ru) 2015-06-18 2021-08-09 Те Брод Инститьют, Инк. Мутации фермента crispr, уменьшающие нецелевые эффекты
WO2016205759A1 (en) 2015-06-18 2016-12-22 The Broad Institute Inc. Engineering and optimization of systems, methods, enzymes and guide scaffolds of cas9 orthologs and variants for sequence manipulation
CA3012607A1 (en) 2015-06-18 2016-12-22 The Broad Institute Inc. Crispr enzymes and systems
WO2017004261A1 (en) 2015-06-29 2017-01-05 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Modified crispr rna and modified single crispr rna and uses thereof
US11279928B2 (en) 2015-06-29 2022-03-22 Massachusetts Institute Of Technology Compositions comprising nucleic acids and methods of using the same
GB201511376D0 (en) 2015-06-29 2015-08-12 Ecolab Usa Inc Process for the treatment of produced water from chemical enhanced oil recovery
WO2017001572A1 (en) 2015-06-30 2017-01-05 Cellectis Methods for improving functionality in nk cell by gene inactivation using specific endonuclease
KR20180041120A (ko) 2015-07-02 2018-04-23 더 존스 홉킨스 유니버시티 Cprispr/cas9-기반 치료
CN108026523B (zh) 2015-07-06 2021-11-30 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 向导rna组装载体
US20170009242A1 (en) 2015-07-06 2017-01-12 Whitehead Institute For Biomedical Research CRISPR-Mediated Genome Engineering for Protein Depletion
CN105132451B (zh) 2015-07-08 2019-07-23 电子科技大学 一种CRISPR/Cas9单一转录单元定向修饰骨架载体及其应用
US20170014449A1 (en) 2015-07-13 2017-01-19 Elwha LLC, a limited liability company of the State of Delaware Site-specific epigenetic editing
WO2017009399A1 (en) 2015-07-13 2017-01-19 Institut Pasteur Improving sequence-specific antimicrobials by blocking dna repair
US10450585B2 (en) 2015-07-13 2019-10-22 Sangamo Therapeutics, Inc. Delivery methods and compositions for nuclease-mediated genome engineering
US11390865B2 (en) 2015-07-14 2022-07-19 Fukuoka University Method for introducing site-directed RNA mutation, target editing guide RNA used in the method and target RNA-target editing guide RNA complex
MA42895A (fr) 2015-07-15 2018-05-23 Juno Therapeutics Inc Cellules modifiées pour thérapie cellulaire adoptive
WO2017011721A1 (en) 2015-07-15 2017-01-19 Rutgers, The State University Of New Jersey Nuclease-independent targeted gene editing platform and uses thereof
US20170020922A1 (en) 2015-07-16 2017-01-26 Batu Biologics Inc. Gene editing for immunological destruction of neoplasia
WO2017015101A1 (en) 2015-07-17 2017-01-26 University Of Washington Methods for maximizing the efficiency of targeted gene correction
WO2017015015A1 (en) 2015-07-17 2017-01-26 Emory University Crispr-associated protein from francisella and uses related thereto
US10392674B2 (en) 2015-07-22 2019-08-27 President And Fellows Of Harvard College Evolution of site-specific recombinases
EP3325018A4 (de) 2015-07-22 2019-04-24 Duke University Hochdurchsatz-screening von regulatorischen elementfunktionen mit epigenomeditierungstechnologien
AU2016297167A1 (en) 2015-07-23 2018-02-22 Mayo Foundation For Medical Education And Research Editing mitochondrial DNA
CN108025074A (zh) 2015-07-25 2018-05-11 哈比卜·弗罗斯特 用于为癌症和其他病理状态提供治疗或治愈的系统、装置和方法
CN106399360A (zh) 2015-07-27 2017-02-15 上海药明生物技术有限公司 基于crispr技术敲除fut8基因的方法
CN105063061B (zh) 2015-07-28 2018-10-30 华南农业大学 一种水稻千粒重基因tgw6突变体及其制备方法与应用
WO2017019867A1 (en) 2015-07-28 2017-02-02 Danisco Us Inc Genome editing systems and methods of use
CN106701808A (zh) 2015-07-29 2017-05-24 深圳华大基因研究院 Dna聚合酶i缺陷型菌株及其构建方法
US10612011B2 (en) 2015-07-30 2020-04-07 President And Fellows Of Harvard College Evolution of TALENs
EP3328399B1 (de) 2015-07-31 2023-12-27 Regents of the University of Minnesota Modifizierte zellen und therapieverfahren
WO2017069829A2 (en) 2015-07-31 2017-04-27 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York High-throughput strategy for dissecting mammalian genetic interactions
WO2017024047A1 (en) 2015-08-03 2017-02-09 Emendobio Inc. Compositions and methods for increasing nuclease induced recombination rate in cells
US20180230450A1 (en) 2015-08-03 2018-08-16 President And Fellows Of Harvard College Cas9 Genome Editing and Transcriptional Regulation
EP3331906A1 (de) 2015-08-06 2018-06-13 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Einstellbarer endogener proteinabbau
US11606940B2 (en) 2015-08-07 2023-03-21 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Method for producing an animal comprising a germline genetic modification
CN104962523B (zh) 2015-08-07 2018-05-25 苏州大学 一种测定非同源末端连接修复活性的方法
US9580727B1 (en) 2015-08-07 2017-02-28 Caribou Biosciences, Inc. Compositions and methods of engineered CRISPR-Cas9 systems using split-nexus Cas9-associated polynucleotides
KR20180041152A (ko) 2015-08-11 2018-04-23 셀렉티스 Cd38 항원 타겟팅 및 cd38 유전자 불활성화를 위하여 조작된 면역치료용 세포들
WO2017028768A1 (en) 2015-08-14 2017-02-23 Institute Of Genetics And Developmental Biology, Chinese Academy Of Sciences Method for obtaining glyphosate-resistant rice by site-directed nucleotide substitution
CN105255937A (zh) 2015-08-14 2016-01-20 西北农林科技大学 一种真核细胞III型启动子表达CRISPR sgRNA的方法及其应用
EP3337898B1 (de) 2015-08-19 2021-07-28 Arc Bio, LLC Erfassung von nukleinsäuren mittels eines nukleinsäuregeführten systems auf nukleasebasis
WO2017031483A1 (en) 2015-08-20 2017-02-23 Applied Stemcell, Inc. Nuclease with enhanced efficiency of genome editing
CN105112519A (zh) 2015-08-20 2015-12-02 郑州大学 一种基于crispr的大肠杆菌o157:h7菌株检测试剂盒及检测方法
CN105177126B (zh) 2015-08-21 2018-12-04 东华大学 一种利用荧光pcr技术对小鼠的分型鉴定方法
EP3341727B1 (de) 2015-08-25 2022-08-10 Duke University Zusammensetzungen und verfahren zur verbesserung der spezifität von genomischem engineering mit rna-geführten endonukleasen
CN106480083B (zh) 2015-08-26 2021-12-14 中国科学院分子植物科学卓越创新中心 CRISPR/Cas9介导的大片段DNA拼接方法
US9926546B2 (en) 2015-08-28 2018-03-27 The General Hospital Corporation Engineered CRISPR-Cas9 nucleases
AU2016316845B2 (en) 2015-08-28 2022-03-10 The General Hospital Corporation Engineered CRISPR-Cas9 nucleases
US9512446B1 (en) 2015-08-28 2016-12-06 The General Hospital Corporation Engineered CRISPR-Cas9 nucleases
CN105087620B (zh) 2015-08-31 2017-12-29 中国农业大学 一种过表达猪共刺激受体4‑1bb载体及其应用
US10526590B2 (en) 2015-08-31 2020-01-07 Agilent Technologies, Inc. Compounds and methods for CRISPR/Cas-based genome editing by homologous recombination
US20170058272A1 (en) 2015-08-31 2017-03-02 Caribou Biosciences, Inc. Directed nucleic acid repair
WO2017040793A1 (en) 2015-09-01 2017-03-09 Dana-Farber Cancer Institute Inc. Systems and methods for selection of grna targeting strands for cas9 localization
EP3344756A4 (de) 2015-09-02 2019-09-04 University of Massachusetts Nachweis von genloci mit crispr-arrayed-repeats und/oder polychromatischen single-guide-ribonukleinsäuren
US20180251789A1 (en) 2015-09-04 2018-09-06 Massachusetts Institute Of Technology Multilayer genetic safety kill circuits based on single cas9 protein and multiple engineered grna in mammalian cells
CN105400810B (zh) 2015-09-06 2019-05-07 吉林大学 采用敲除技术建立低磷性佝偻病模型的方法
EP3347464B1 (de) 2015-09-08 2024-01-24 University of Massachusetts Dnase-h-aktivität von neisseria meningitidis cas9
ES2902338T3 (es) 2015-09-09 2022-03-28 Univ Kobe Nat Univ Corp Método para modificar una secuencia genómica que convierte específicamente una nucleobase de una secuencia de ADN diana, y complejo molecular utilizado en dicho método
US10767173B2 (en) 2015-09-09 2020-09-08 National University Corporation Kobe University Method for converting genome sequence of gram-positive bacterium by specifically converting nucleic acid base of targeted DNA sequence, and molecular complex used in same
CN108291224A (zh) 2015-09-10 2018-07-17 优美佳生物技术有限公司 用于治疗青光眼的方法和组合物
WO2017044776A1 (en) 2015-09-10 2017-03-16 Texas Tech University System Single-guide rna (sgrna) with improved knockout efficiency
CN105274144A (zh) 2015-09-14 2016-01-27 徐又佳 通过CRISPR/Cas9技术得到敲除铁调素基因斑马鱼的制备方法
US10301613B2 (en) 2015-09-15 2019-05-28 Arizona Board Of Regents On Behalf Of Arizona State University Targeted remodeling of prokaryotic genomes using CRISPR-nickases
CN105210981B (zh) 2015-09-15 2018-09-28 中国科学院生物物理研究所 建立可应用于人类疾病研究的雪貂模型的方法及其应用
US10109551B2 (en) 2015-09-15 2018-10-23 Intel Corporation Methods and apparatuses for determining a parameter of a die
CN105112422B (zh) 2015-09-16 2019-11-08 中山大学 基因miR408和UCL在培育高产水稻中的应用
WO2017049129A2 (en) 2015-09-18 2017-03-23 President And Fellows Of Harvard College Methods of making guide rna
CN105132427B (zh) 2015-09-21 2019-01-08 新疆畜牧科学院生物技术研究所 一种以RNA介导的特异性敲除双基因获得基因编辑绵羊的方法及其专用sgRNA
US20180237800A1 (en) 2015-09-21 2018-08-23 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for target nucleic acid modification
CN108350454B (zh) 2015-09-21 2022-05-10 阿克丘勒斯治疗公司 等位基因选择性基因编辑及其用途
US10435441B2 (en) 2015-09-23 2019-10-08 Sangamo Therapeutics, Inc. HTT repressors and uses thereof
CN108350489B (zh) 2015-09-24 2022-04-29 西格马-奥尔德里奇有限责任公司 用于使用rna引导的核酸结合蛋白的分子邻位检测的方法和试剂
WO2017064546A1 (en) 2015-09-24 2017-04-20 Crispr Therapeutics Ag Novel family of rna-programmable endonucleases and their uses in genome editing and other applications
WO2017053879A1 (en) 2015-09-24 2017-03-30 Editas Medicine, Inc. Use of exonucleases to improve crispr/cas-mediated genome editing
WO2017053729A1 (en) 2015-09-25 2017-03-30 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Nuclease-mediated genome editing of primary cells and enrichment thereof
KR101745863B1 (ko) 2015-09-25 2017-06-12 전남대학교산학협력단 Crispr/cas9 시스템을 이용한 프로히비틴2 유전자 제거용 시발체
US20180258411A1 (en) 2015-09-25 2018-09-13 Tarveda Therapeutics, Inc. Compositions and methods for genome editing
KR101795999B1 (ko) 2015-09-25 2017-11-09 전남대학교산학협력단 Crispr/cas9 시스템을 이용한 베타2-마이크로글로불린 유전자 제거용 시발체
EP3147363B1 (de) 2015-09-26 2019-10-16 B.R.A.I.N. Ag Aktivierung von geschmacksrezeptorgenen in säugetierzellen mit hilfe von crispr-cas-9
CA2999912A1 (en) 2015-09-28 2017-04-06 Temple University - Of The Commonwealth System Of Higher Education Methods and compositions for rna-guided treatment of hiv infection
US20170088828A1 (en) 2015-09-29 2017-03-30 Agenovir Corporation Compositions and methods for treatment of latent viral infections
US20170088587A1 (en) 2015-09-29 2017-03-30 Agenovir Corporation Antiviral fusion proteins and genes
EP3355954A4 (de) 2015-09-29 2020-01-08 Agenovir Corporation Freisetzungsverfahren und zusammensetzungen
JP2018534258A (ja) 2015-09-29 2018-11-22 アジェノビア コーポレーション 潜伏ウイルスの転写制御のための組成物および方法
CN105177038B (zh) 2015-09-29 2018-08-24 中国科学院遗传与发育生物学研究所 一种高效定点编辑植物基因组的CRISPR/Cas9系统
CN105331627B (zh) 2015-09-30 2019-04-02 华中农业大学 一种利用内源CRISPR-Cas系统进行原核生物基因组编辑的方法
EP3356520B1 (de) 2015-10-02 2022-03-23 The U.S.A. as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services Lentivirales protein übertragungssystem zum rna-vermittelten genomeditieren
CA3004710A1 (en) 2015-10-06 2017-04-13 The Children's Hospital Of Philadelphia Compositions and methods for treating fragile x syndrome and related syndromes
US10760081B2 (en) 2015-10-07 2020-09-01 New York University Compositions and methods for enhancing CRISPR activity by POLQ inhibition
BR112018007177A2 (pt) 2015-10-08 2018-10-16 President And Fellows Of Harvard College edição de genoma multiplexado
WO2017062886A1 (en) 2015-10-08 2017-04-13 Cellink Corporation Battery interconnects
US11692182B2 (en) 2015-10-09 2023-07-04 Monsanto Technology Llc RNA-guided DNA nucleases and uses thereof
CA3004713A1 (en) 2015-10-09 2017-04-13 The Children's Hospital Of Philadelphia Compositions and methods for treating huntington's disease and related disorders
EP3362560B1 (de) 2015-10-12 2022-08-10 DuPont US Holding, LLC Geschützte dna-schablonen zur genmodifizierung und erhöhten homologen rekombination in zellen und verfahren zur verwendung
WO2017066497A2 (en) 2015-10-13 2017-04-20 Duke University Genome engineering with type i crispr systems in eukaryotic cells
CN108367081A (zh) 2015-10-14 2018-08-03 生命技术公司 核糖核蛋白转染剂
CN105400779A (zh) 2015-10-15 2016-03-16 芜湖医诺生物技术有限公司 嗜热链球菌CRISPR-Cas9系统识别的人CCR5基因的靶序列和sgRNA及其应用
US10947559B2 (en) 2015-10-16 2021-03-16 Astrazeneca Ab Inducible modification of a cell genome
WO2017066588A2 (en) 2015-10-16 2017-04-20 Temple University - Of The Commonwealth System Of Higher Education Methods and compositions utilizing cpf1 for rna-guided gene editing
FR3042506B1 (fr) 2015-10-16 2018-11-30 IFP Energies Nouvelles Outil genetique de transformation de bacteries clostridium
CN105331607A (zh) 2015-10-19 2016-02-17 芜湖医诺生物技术有限公司 嗜热链球菌CRISPR-Cas9系统识别的人CCR5基因的靶序列和sgRNA及其应用
WO2017070169A1 (en) 2015-10-19 2017-04-27 The Methodist Hospital Crispr-cas9 delivery to hard-to-transfect cells via membrane deformation
CN105331609A (zh) 2015-10-20 2016-02-17 芜湖医诺生物技术有限公司 脑膜炎双球菌CRISPR-Cas9系统识别的人CCR5基因的靶序列和sgRNA及其应用
CN105316324A (zh) 2015-10-20 2016-02-10 芜湖医诺生物技术有限公司 嗜热链球菌CRISPR-Cas9系统识别的人CXCR4基因的靶序列和sgRNA及其应用
CN105331608A (zh) 2015-10-20 2016-02-17 芜湖医诺生物技术有限公司 脑膜炎双球菌CRISPR-Cas9系统识别的人CXCR4基因的靶序列和sgRNA及其应用
JP7059179B2 (ja) 2015-10-20 2022-04-25 アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル 遺伝子操作のための方法及び製品
US20180282763A1 (en) 2015-10-20 2018-10-04 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Restoring function to a non-functional gene product via guided cas systems and methods of use
CN105316337A (zh) 2015-10-20 2016-02-10 芜湖医诺生物技术有限公司 嗜热链球菌CRISPR-Cas9系统识别的人CXCR4基因的靶序列和sgRNA及其应用
EP3365447A1 (de) 2015-10-21 2018-08-29 Editas Medicine, Inc. Verfahren und zusammensetzungen in zusammenhang mit crispr/cas zur behandlung von hepatitis b-virus
CN105219799A (zh) 2015-10-22 2016-01-06 天津吉诺沃生物科技有限公司 一种基于CRISPR/Cas系统的多年生黑麦草的育种方法
US20170211142A1 (en) 2015-10-22 2017-07-27 The Broad Institute, Inc. Novel crispr enzymes and systems
ES2699848T3 (es) 2015-10-23 2019-02-13 Caribou Biosciences Inc Acido nucleico CRISPR clase 2 de tipo cruzado modificado que se dirige a ácidos nucleicos
US20190225955A1 (en) 2015-10-23 2019-07-25 President And Fellows Of Harvard College Evolved cas9 proteins for gene editing
EP3159407A1 (de) 2015-10-23 2017-04-26 Silence Therapeutics (London) Ltd Guide-rnas, verfahren und verwendungen
US9988637B2 (en) 2015-10-26 2018-06-05 National Tsing Hua Univeristy Cas9 plasmid, genome editing system and method of Escherichia coli
TW201715041A (zh) 2015-10-26 2017-05-01 國立清華大學 細菌基因編輯方法
US10280411B2 (en) 2015-10-27 2019-05-07 Pacific Biosciences of California, In.c Methods, systems, and reagents for direct RNA sequencing
US20170152526A1 (en) 2015-10-27 2017-06-01 Recombinetics, Inc. Engineering of humanized car t-cell and platelets by genetic complementation
EP3368063B1 (de) 2015-10-28 2023-09-06 Vertex Pharmaceuticals Inc. Materialien und verfahren zur behandlung von duchenne-muskeldystrophie
CA3002524A1 (en) 2015-10-28 2017-05-04 Sangamo Therapeutics, Inc. Liver-specific constructs, factor viii expression cassettes and methods of use thereof
WO2017075335A1 (en) 2015-10-28 2017-05-04 Voyager Therapeutics, Inc. Regulatable expression using adeno-associated virus (aav)
US11111508B2 (en) 2015-10-30 2021-09-07 Brandeis University Modified CAS9 compositions and methods of use
EP3368670A1 (de) 2015-10-30 2018-09-05 Editas Medicine, Inc. Verfahren im zusammenhang mit crispir/cas und zusammensetzungen zur behandlung des herpes-simplex-virus
CN105238806B (zh) 2015-11-02 2018-11-27 中国科学院天津工业生物技术研究所 一种用于微生物的CRISPR/Cas9基因编辑载体的构建及其应用
CN105316327B (zh) 2015-11-03 2019-01-29 中国农业科学院作物科学研究所 小麦TaAGO4a基因CRISPR/Cas9载体及其应用
SG11201803701YA (en) 2015-11-04 2018-06-28 Univ Pennsylvania Methods and compositions for gene editing in hematopoietic stem cells
KR20180066262A (ko) 2015-11-04 2018-06-18 페이트 세러퓨틱스, 인코포레이티드 만능 세포의 유전자 조작
WO2017079428A1 (en) 2015-11-04 2017-05-11 President And Fellows Of Harvard College Site specific germline modification
GB2544270A (en) 2015-11-05 2017-05-17 Fundació Centre De Regulació Genòmica Nucleic acids, peptides and methods
JP2018533376A (ja) 2015-11-05 2018-11-15 セントロ デ インベスティガシオン ビオメディカ エン レッド 赤血球系譜を冒す代謝疾患に罹患している被験体から単離された細胞の遺伝子編集の方法、上記方法により得られた細胞、及びそれらの使用
WO2017078751A1 (en) 2015-11-06 2017-05-11 The Methodist Hospital Micoluidic cell deomailiy assay for enabling rapid and efficient kinase screening via the crispr-cas9 system
AU2016349738A1 (en) 2015-11-06 2018-05-24 The Jackson Laboratory Large genomic DNA knock-in and uses thereof
WO2017081097A1 (en) 2015-11-09 2017-05-18 Ifom Fondazione Istituto Firc Di Oncologia Molecolare Crispr-cas sgrna library
WO2017081288A1 (en) 2015-11-11 2017-05-18 Lonza Ltd Crispr-associated (cas) proteins with reduced immunogenicity
WO2017083722A1 (en) 2015-11-11 2017-05-18 Greenberg Kenneth P Crispr compositions and methods of using the same for gene therapy
CA2947904A1 (en) 2015-11-12 2017-05-12 Pfizer Inc. Tissue-specific genome engineering using crispr-cas9
US11306308B2 (en) 2015-11-13 2022-04-19 Massachusetts Institute Of Technology High-throughput CRISPR-based library screening
US20170191047A1 (en) 2015-11-13 2017-07-06 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Adenosine-specific rnase and methods of use
KR101885901B1 (ko) 2015-11-13 2018-08-07 기초과학연구원 5' 말단의 인산기가 제거된 rna를 포함하는 리보핵산단백질 전달용 조성물
IL259441B2 (en) 2015-11-16 2024-01-01 Res Inst Nationwide Childrens Hospital Materials and methods for the treatment of titin-based myopathies and other titinopathy
US11905521B2 (en) 2015-11-17 2024-02-20 The Chinese University Of Hong Kong Methods and systems for targeted gene manipulation
PT3380613T (pt) 2015-11-23 2022-12-02 Univ California Deteção e manipulação de arn celular através da administração nuclear de crispr/cas9
CN105602987A (zh) 2015-11-23 2016-05-25 深圳市默赛尔生物医学科技发展有限公司 一种高效的dc细胞xbp1基因敲除方法
US20170145438A1 (en) 2015-11-24 2017-05-25 University Of South Carolina Viral Vectors for Gene Editing
US10240145B2 (en) 2015-11-25 2019-03-26 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University CRISPR/Cas-mediated genome editing to treat EGFR-mutant lung cancer
EP3382018B1 (de) 2015-11-25 2022-03-30 National University Corporation Gunma University Dna-methylierungs-editierkit und dna-methylierungs-editierverfahren
WO2017091510A1 (en) 2015-11-27 2017-06-01 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for the production of hydrocarbons, hydrogen and carbon monoxide using engineered azotobacter strains
CN105505979A (zh) 2015-11-28 2016-04-20 湖北大学 一种以CRISPR/Cas9基因编辑技术打靶Badh2基因获得香稻品系的方法
CN106811479B (zh) 2015-11-30 2019-10-25 中国农业科学院作物科学研究所 利用CRISPR/Cas9系统定点修饰ALS基因获得抗除草剂水稻的系统及其应用
WO2017095111A1 (ko) 2015-11-30 2017-06-08 기초과학연구원 F. novicida 유래 Cas9을 포함하는 유전체 교정용 조성물
RU2634395C1 (ru) 2015-12-01 2017-10-26 Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Балтийский Федеральный Университет имени Иммануила Канта" (БФУ им. И. Канта) Генетическая конструкция на основе системы редактирования генома crispr/cas9, кодирующая нуклеазу cas9, специфически импортируемую в митохондрии клеток человека
CN105296518A (zh) 2015-12-01 2016-02-03 中国农业大学 一种用于CRISPR/Cas9技术的同源臂载体构建方法
US11118189B2 (en) 2015-12-02 2021-09-14 Ceres, Inc. Methods for genetic modification of plants
WO2017096041A1 (en) 2015-12-02 2017-06-08 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for modifying a target nucleic acid
WO2017093370A1 (en) 2015-12-03 2017-06-08 Technische Universität München T-cell specific genome editing
EP3384027A1 (de) 2015-12-04 2018-10-10 Novartis AG Zusammensetzungen und verfahren zur immunonkologie
CN105779448B (zh) 2015-12-04 2018-11-27 新疆农业大学 一种棉花启动子GbU6-7PS及应用
CN105779449B (zh) 2015-12-04 2018-11-27 新疆农业大学 一种棉花启动子GbU6-5PS及应用
CN106845151B (zh) 2015-12-07 2019-03-26 中国农业大学 CRISPR-Cas9系统sgRNA作用靶点的筛选方法及装置
CN105462968B (zh) 2015-12-07 2018-10-16 北京信生元生物医学科技有限公司 一种靶向apoCⅢ的CRISPR-Cas9系统及其应用
CN108473527A (zh) 2015-12-09 2018-08-31 切除生物治疗公司 用于消除免疫抑制疗法期间jc病毒激活和pml(进行性多灶性白质脑病)风险的基因编辑方法和组合物
DK3387134T3 (da) 2015-12-11 2020-12-21 Danisco Us Inc Fremgangsmåder og sammensætninger til øget nukleasemedieret genommodifikation og reducerede virkninger uden for målstedet
CN105463003A (zh) 2015-12-11 2016-04-06 扬州大学 一种消除卡那霉素耐药基因活性的重组载体及其构建方法
CN105296537A (zh) 2015-12-12 2016-02-03 西南大学 一种基于睾丸内注射的基因定点编辑技术
CN105400773B (zh) 2015-12-14 2018-06-26 同济大学 应用于大规模筛选癌症基因的CRISPR/Cas9富集测序方法
WO2017105350A1 (en) 2015-12-14 2017-06-22 Cellresearch Corporation Pte Ltd A method of generating a mammalian stem cell carrying a transgene, a mammalian stem cell generated by the method and pharmaceuticals uses of the mammalian stem cell
NO343153B1 (en) 2015-12-17 2018-11-19 Hydra Systems As A method of assessing the integrity status of a barrier plug
CN105463027A (zh) 2015-12-17 2016-04-06 中国农业大学 一种高肌肉量及肥厚型心肌病模型克隆猪的制备方法
WO2017106616A1 (en) 2015-12-17 2017-06-22 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Varicella zoster virus encoding regulatable cas9 nuclease
WO2017106767A1 (en) 2015-12-18 2017-06-22 The Scripps Research Institute Production of unnatural nucleotides using a crispr/cas9 system
US20190233814A1 (en) 2015-12-18 2019-08-01 The Broad Institute, Inc. Novel crispr enzymes and systems
MX2018007290A (es) 2015-12-18 2019-01-10 Danisco Us Inc Metodos y composiciones para expresion de acido ribonucleico (arn) guia basada en polimerasa ii (pol-ii).
CA3008382A1 (en) 2015-12-18 2017-06-22 Sangamo Therapeutics, Inc. Targeted disruption of the mhc cell receptor
WO2017105991A1 (en) 2015-12-18 2017-06-22 Danisco Us Inc. Methods and compositions for t-rna based guide rna expression
WO2017104404A1 (ja) 2015-12-18 2017-06-22 国立研究開発法人科学技術振興機構 遺伝子改変非ヒト生物、卵細胞、受精卵、及び標的遺伝子の改変方法
WO2017106569A1 (en) 2015-12-18 2017-06-22 The Regents Of The University Of California Modified site-directed modifying polypeptides and methods of use thereof
CN108778297B (zh) 2015-12-18 2024-02-09 桑格摩生物治疗股份有限公司 T细胞受体的靶向破坏
US11542466B2 (en) 2015-12-22 2023-01-03 North Carolina State University Methods and compositions for delivery of CRISPR based antimicrobials
KR20180107109A (ko) 2015-12-22 2018-10-01 큐어백 아게 Rna 분자 조성물의 제조 방법
JP6947729B2 (ja) 2015-12-23 2021-10-13 クリスパー セラピューティクス アクチェンゲゼルシャフト 筋萎縮性側索硬化症及び／または前頭側頭葉変性症の治療のための材料及び方法
CN105543270A (zh) 2015-12-24 2016-05-04 中国农业科学院作物科学研究所 双抗性CRISPR/Cas9载体及应用
CN105505976A (zh) 2015-12-25 2016-04-20 安徽大学 一种维吉尼亚链霉菌ibl14产青霉素重组菌株的构建方法
CN105543266A (zh) 2015-12-25 2016-05-04 安徽大学 一种维吉尼亚链霉菌IBL14中的CRISPR-Cas系统及应用其进行基因编辑的方法
WO2017115268A1 (en) 2015-12-28 2017-07-06 Novartis Ag Compositions and methods for the treatment of hemoglobinopathies
EP3397757A4 (de) 2015-12-29 2019-08-28 Monsanto Technology LLC Neuartige crispr-assoziierte transposasen und verwendungen davon
CN105441451B (zh) 2015-12-31 2019-03-22 暨南大学 一种特异靶向人ABCB1基因的sgRNA导向序列及应用
CN105567735A (zh) 2016-01-05 2016-05-11 华东师范大学 一种凝血因子基因突变的定点修复载体系统及方法
CN108473986A (zh) 2016-01-08 2018-08-31 诺维信公司 芽孢杆菌宿主细胞的基因组编辑
US11441146B2 (en) 2016-01-11 2022-09-13 Christiana Care Health Services, Inc. Compositions and methods for improving homogeneity of DNA generated using a CRISPR/Cas9 cleavage system
CN105647922A (zh) 2016-01-11 2016-06-08 中国人民解放军疾病预防控制所 基于一种新gRNA序列的CRISPR-Cas9系统在制备乙肝治疗药物中的应用
US11427837B2 (en) 2016-01-12 2022-08-30 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for enhanced genome editing
US20190010496A1 (en) 2016-01-14 2019-01-10 The Brigham And Women`S Hospital, Inc. Genome Editing for Treating Glioblastoma
KR20180134847A (ko) 2016-01-14 2018-12-19 멤피스 미츠 인코포레이티드 생체외 배양 과정 동안 체세포의 복제 능력을 증가시키는 방법
EP3402327A1 (de) 2016-01-15 2018-11-21 The Jackson Laboratory Genetisch modifizierte nichtmenschliche säuger durch multizyklus-elektroporation des cas9-proteins
CN105567734A (zh) 2016-01-18 2016-05-11 丹弥优生物技术（湖北）有限公司 一种基因组dna序列精准编辑方法
WO2017126987A1 (ru) 2016-01-18 2017-07-27 Анатолий Викторович ЗАЗУЛЯ Эритроциты для направленного транспорта лекарственного средства
CN105567738A (zh) 2016-01-18 2016-05-11 南开大学 使用基因组编辑技术CRISPR-Cas9诱导CCR5Δ32缺失的方法
US10731153B2 (en) * 2016-01-21 2020-08-04 Massachusetts Institute Of Technology Recombinases and target sequences
EP3405570A1 (de) 2016-01-22 2018-11-28 The Broad Institute, Inc. Kristallstruktur von crispr cpf1
CN105543228A (zh) 2016-01-25 2016-05-04 宁夏农林科学院 一种快速将水稻转化为香稻的方法
US20190032057A1 (en) 2016-01-25 2019-01-31 Excision Biotherapeutics, Inc. Methods and compositions for rna-guided treatment of hiv infection
AU2017371665A1 (en) 2016-01-25 2018-07-19 Excision Biotherapeutics RNA guided eradication of human JC virus and other polyomaviruses
CN105567689B (zh) 2016-01-25 2019-04-09 重庆威斯腾生物医药科技有限责任公司 CRISPR/Cas9靶向敲除人TCAB1基因及其特异性gRNA
EP3199632A1 (de) 2016-01-26 2017-08-02 ACIB GmbH Temperaturinduzierbares crispr-/cas-system
CN105567688A (zh) 2016-01-27 2016-05-11 武汉大学 一种可用于艾滋病基因治疗的CRISPR/SaCas9系统
FI3408292T3 (fi) 2016-01-29 2023-06-30 Univ Princeton Jaettuja inteiinejä, joilla on poikkeuksellinen silmukoitumisaktiivisuus
CA3013179A1 (en) 2016-01-30 2017-08-03 Bonac Corporation Artificial single guide rna and use thereof
CN105647968B (zh) 2016-02-02 2019-07-23 浙江大学 一种CRISPR/Cas9工作效率快速测试系统及其应用
CN107022562B (zh) 2016-02-02 2020-07-17 中国种子集团有限公司 利用CRISPR/Cas9系统对玉米基因定点突变的方法
US11845933B2 (en) 2016-02-03 2023-12-19 Massachusetts Institute Of Technology Structure-guided chemical modification of guide RNA and its applications
CN105671083B (zh) 2016-02-03 2017-09-29 安徽柯顿生物科技有限公司 PD‑1基因重组病毒质粒及构建、重组逆转录病毒Lenti‑PD‑1‑Puro及包装与应用
WO2017136520A1 (en) 2016-02-04 2017-08-10 President And Fellows Of Harvard College Mitochondrial genome editing and regulation
US20190038780A1 (en) 2016-02-05 2019-02-07 Regents Of The University Of Minnesota Vectors and system for modulating gene expression
WO2017139264A1 (en) 2016-02-09 2017-08-17 President And Fellows Of Harvard College Dna-guided gene editing and regulation
RU2016104674A (ru) 2016-02-11 2017-08-16 Анатолий Викторович Зазуля Устройство модификации эритроцита с механизмом направленного транспорта лекарственного средства для функций генной терапии crispr/cas9
US11666666B2 (en) 2016-02-11 2023-06-06 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for modifying a mutant dystrophin gene in a cell's genome
AU2017219605B2 (en) 2016-02-15 2023-04-13 Temple University - Of The Commonwealth System Of Higher Education Excision of retroviral nucleic acid sequences
US9896696B2 (en) 2016-02-15 2018-02-20 Benson Hill Biosystems, Inc. Compositions and methods for modifying genomes
CN105647962A (zh) 2016-02-15 2016-06-08 浙江大学 运用CRISPR-Cas9系统敲除水稻MIRNA393b茎环序列的基因编辑方法
CN105647969B (zh) 2016-02-16 2020-12-15 湖南师范大学 一种基因敲除选育stat1a基因缺失型斑马鱼的方法
CN105594664B (zh) 2016-02-16 2018-10-02 湖南师范大学 一种基因敲除选育stat1a基因缺失型斑马鱼的方法
AU2017221405A1 (en) 2016-02-16 2018-09-20 Carnegie Mellon University Compositions for enhancing targeted gene editing and methods of use thereof
CN105624187A (zh) 2016-02-17 2016-06-01 天津大学 酿酒酵母基因组定点突变的方法
CN109072243A (zh) 2016-02-18 2018-12-21 哈佛学院董事及会员团体 通过crispr-cas系统进行的分子记录的方法和系统
DK3653709T3 (da) 2016-02-22 2021-03-08 Caribou Biosciences Inc Fremgangsmåder til modulering af dna-reparationsresultater
US20170275665A1 (en) 2016-02-24 2017-09-28 Board Of Regents, The University Of Texas System Direct crispr spacer acquisition from rna by a reverse-transcriptase-cas1 fusion protein
CN105646719B (zh) 2016-02-24 2019-12-20 无锡市妇幼保健院 一种高效定点转基因的工具及其应用
CA3015353A1 (en) 2016-02-25 2017-08-31 Agenovir Corporation Viral and oncoviral nuclease treatment
US20170246260A1 (en) 2016-02-25 2017-08-31 Agenovir Corporation Modified antiviral nuclease
US20170247703A1 (en) 2016-02-25 2017-08-31 Agenovir Corporation Antiviral nuclease methods
WO2017147278A1 (en) 2016-02-25 2017-08-31 The Children's Medical Center Corporation Customized class switch of immunoglobulin genes in lymphoma and hybridoma by crispr/cas9 technology
CN114908093A (zh) 2016-02-26 2022-08-16 朗泽科技新西兰有限公司 用于c1固定菌的crispr/cas系统
US10538750B2 (en) 2016-02-29 2020-01-21 Agilent Technologies, Inc. Methods and compositions for blocking off-target nucleic acids from cleavage by CRISPR proteins
US11447768B2 (en) 2016-03-01 2022-09-20 University Of Florida Research Foundation, Incorporated Molecular cell diary system
CN105671070B (zh) 2016-03-03 2019-03-19 江南大学 一种用于枯草芽孢杆菌基因组编辑的CRISPRCas9系统及其构建方法
KR102438360B1 (ko) 2016-03-04 2022-08-31 에디타스 메디신, 인코포레이티드 암 면역요법을 위한 crispr-cpf1-관련 방법, 조성물 및 구성성분
CN107177591A (zh) 2016-03-09 2017-09-19 北京大学 利用CRISPR技术编辑CCR5基因的sgRNA序列及其用途
CN105821040B (zh) 2016-03-09 2018-12-14 李旭 联合免疫基因抑制高危型HPV表达的sgRNA、基因敲除载体及其应用
CN105821039B (zh) 2016-03-09 2020-02-07 李旭 联合免疫基因抑制HBV复制的特异性sgRNA、表达载体及其应用
CN105861547A (zh) 2016-03-10 2016-08-17 黄捷 身份证号码永久嵌入基因组的方法
EP3426778A1 (de) 2016-03-11 2019-01-16 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Neuartige cas9-systeme und verfahren zur verwendung
AU2017235333B2 (en) 2016-03-14 2023-08-24 Editas Medicine, Inc. CRISPR/CAS-related methods and compositions for treating beta hemoglobinopathies
WO2017160752A1 (en) 2016-03-14 2017-09-21 Intellia Therapeutics, Inc. Methods and compositions for gene editing
WO2017160689A1 (en) 2016-03-15 2017-09-21 University Of Massachusetts Anti-crispr compounds and methods of use
EP3430332B1 (de) 2016-03-15 2020-01-01 Carrier Corporation Verkaufskühlvitrine
EP3219799A1 (de) 2016-03-17 2017-09-20 IMBA-Institut für Molekulare Biotechnologie GmbH Bedingte crispr-sgrna-expression
US20200291370A1 (en) 2016-03-18 2020-09-17 President And Fellows Of Harvard College Mutant Cas Proteins
EP3433364A1 (de) 2016-03-25 2019-01-30 Editas Medicine, Inc. Systeme und verfahren zur behandlung von alpha-1-antitrypsin(a1at)-mangel
EP3433363A1 (de) 2016-03-25 2019-01-30 Editas Medicine, Inc. Genombearbeitungssysteme mit reparaturmodulierenden enzymmolekülen und verfahren zu deren verwendung
US10815535B2 (en) 2016-03-28 2020-10-27 The Charles Stark Draper Laboratory, Inc. Bacteriophage engineering methods
CN106047803A (zh) 2016-03-28 2016-10-26 青岛市胶州中心医院 CRISPR/Cas9靶向敲除兔BMP2基因的细胞模型及其应用
WO2017173054A1 (en) 2016-03-30 2017-10-05 Intellia Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticle formulations for crispr/cas components
CN109072212B (zh) 2016-03-30 2022-10-04 豪夫迈·罗氏有限公司 改善的分选酶
WO2017173004A1 (en) 2016-03-30 2017-10-05 Mikuni Takayasu A method for in vivo precise genome editing
US20190093128A1 (en) 2016-03-31 2019-03-28 The Regents Of The University Of California Methods for genome editing in zygotes
WO2017172860A1 (en) 2016-03-31 2017-10-05 President And Fellows Of Harvard College Methods and compositions for the single tube preparation of sequencing libraries using cas9
CN106167525B (zh) 2016-04-01 2019-03-19 北京康明百奥新药研发有限公司 筛选超低岩藻糖细胞系的方法和应用
US10301619B2 (en) 2016-04-01 2019-05-28 New England Biolabs, Inc. Compositions and methods relating to synthetic RNA polynucleotides created from synthetic DNA oligonucleotides
CN109072191B (zh) 2016-04-04 2024-03-22 苏黎世联邦理工学院 用于蛋白生产和文库产生的哺乳动物细胞系
US20190093091A1 (en) 2016-04-06 2019-03-28 Temple University - Of The Commonwealth System Of Higher Education Compositions for eradicating flavivirus infections in subjects
CN105802980A (zh) 2016-04-08 2016-07-27 北京大学 Gateway兼容性CRISPR/Cas9系统及其应用
CN106399306B (zh) 2016-04-12 2019-11-05 西安交通大学第一附属医院 靶向人lncRNA-UCA1抑制膀胱癌的sgRNA、基因载体及其应用
EP3443086B1 (de) 2016-04-13 2021-11-24 Editas Medicine, Inc. Cas9-fusionsmoleküle, geneditierungssysteme und verfahren zur verwendung davon
WO2017180711A1 (en) 2016-04-13 2017-10-19 Editas Medicine, Inc. Grna fusion molecules, gene editing systems, and methods of use thereof
EP3443081A4 (de) 2016-04-13 2019-10-30 Duke University Crispr/cas9-basierte repressoren zur in-vivo-ausschaltung von gen-targets und verfahren zur verwendung
EP3442596A1 (de) 2016-04-14 2019-02-20 Université de Lausanne Behandlung und/oder prävention von dna-triplett-wiederholungserkrankungen oder -störungen
JP7197363B2 (ja) 2016-04-14 2022-12-27 ボコ シリコン バレー， インコーポレイテッド ヌクレアーゼを使用するヒト神経幹細胞のゲノム編集
CN105821116A (zh) 2016-04-15 2016-08-03 扬州大学 一种绵羊mstn基因定向敲除及其影响成肌分化的检测方法
WO2017181107A2 (en) 2016-04-16 2017-10-19 Ohio State Innovation Foundation Modified cpf1 mrna, modified guide rna, and uses thereof
WO2017184334A1 (en) 2016-04-18 2017-10-26 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Generation of genetically engineered animals by crispr/cas9 genome editing in spermatogonial stem cells
WO2017182468A1 (en) 2016-04-18 2017-10-26 Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg Means and methods for inactivating therapeutic dna in a cell
CN106086062A (zh) 2016-04-19 2016-11-09 上海市农业科学院 一种获得番茄基因组定点敲除突变体的方法
SG10202010311SA (en) 2016-04-19 2020-11-27 Broad Inst Inc Novel Crispr Enzymes and Systems
CA3026110A1 (en) 2016-04-19 2017-11-02 The Broad Institute, Inc. Novel crispr enzymes and systems
EP3445853A1 (de) 2016-04-19 2019-02-27 The Broad Institute, Inc. Cpf1-komplexe mit reduzierter indelaktivität
CN105886616B (zh) 2016-04-20 2020-08-07 广东省农业科学院农业生物基因研究中心 一种用于猪基因编辑的高效特异性sgRNA识别位点引导序列及其筛选方法
CN107304435A (zh) 2016-04-22 2017-10-31 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 一种Cas9/RNA系统及其应用
CN105821075B (zh) 2016-04-22 2017-09-12 湖南农业大学 一种茶树咖啡因合成酶CRISPR/Cas9基因组编辑载体的构建方法
CN105861552B (zh) 2016-04-25 2019-10-11 西北农林科技大学 一种T7 RNA聚合酶介导的CRISPR/Cas9基因编辑系统的构建方法
US11248216B2 (en) 2016-04-25 2022-02-15 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for genomic editing
CN107326046A (zh) 2016-04-28 2017-11-07 上海邦耀生物科技有限公司 一种提高外源基因同源重组效率的方法
CN105821049B (zh) 2016-04-29 2019-06-04 中国农业大学 一种Fbxo40基因敲除猪的制备方法
CN105886534A (zh) 2016-04-29 2016-08-24 苏州溯源精微生物科技有限公司 一种抑制肿瘤转移的方法
CN109072207A (zh) 2016-04-29 2018-12-21 巴斯夫植物科学有限公司 用于修饰靶核酸的改进方法
SG11201809468XA (en) 2016-04-29 2018-11-29 Sarepta Therapeutics Inc Oligonucleotide analogues targeting human lmna
GB201819504D0 (en) 2016-05-01 2019-01-16 Neemo Inc Harnessing heterologous and endogenous crispr-cas machineries for efficient markerless genome editing in clostridium
WO2017192573A1 (en) 2016-05-02 2017-11-09 Massachusetts Institute Of Technology Nanoparticle conjugates of highly potent toxins and intraperitoneal administration of nanoparticles for treating or imaging cancer
EP3452101A2 (de) 2016-05-04 2019-03-13 CureVac AG Rna-codierung eines therapeutischen proteins
CN105950639A (zh) 2016-05-04 2016-09-21 广州美格生物科技有限公司 金黄色葡萄球菌CRISPR/Cas9系统的制备及其在构建小鼠模型中的应用
WO2017191210A1 (en) 2016-05-04 2017-11-09 Novozymes A/S Genome editing by crispr-cas9 in filamentous fungal host cells
EP3452498B1 (de) 2016-05-05 2023-07-05 Duke University Zusammensetzungen in zusammenhang mit crispr/cas zur behandlung von duchenne-muskeldystrophie
WO2017192172A1 (en) 2016-05-05 2017-11-09 Temple University - Of The Commonwealth System Of Higher Education Rna guided eradication of varicella zoster virus
CN105907785B (zh) 2016-05-05 2020-02-07 苏州吉玛基因股份有限公司 化学合成的crRNA用于CRISPR/Cpf1系统在基因编辑中的应用
CN106244591A (zh) 2016-08-23 2016-12-21 苏州吉玛基因股份有限公司 修饰crRNA在CRISPR/Cpf1基因编辑系统中的应用
WO2017190664A1 (zh) 2016-05-05 2017-11-09 苏州吉玛基因股份有限公司 化学合成的crRNA和修饰crRNA在CRISPR/Cpf1基因编辑系统中的应用
EP4023228A1 (de) 2016-05-06 2022-07-06 Tod M. Woolf Genomändernde oligonukleotide ohne programmierbare nukleasen
CN105985985B (zh) 2016-05-06 2019-12-31 苏州大学 Crispr技术编辑并用igf优化的异体间充质干细胞的制备方法及在治疗心梗中应用
WO2017196768A1 (en) 2016-05-09 2017-11-16 President And Fellows Of Harvard College Self-targeting guide rnas in crispr system
EP3455347A4 (de) 2016-05-10 2019-10-02 United States Government as Represented by The Department of Veterans Affairs Lentivirale abgabe von crispr/cas-konstrukten, die für hiv-1 infektion und -replikation essentielle gene spalten
CN105861554B (zh) 2016-05-10 2020-01-31 华南农业大学 一种基于对Rbmy基因进行编辑来实现动物性别控制的方法和应用
CN107365786A (zh) 2016-05-12 2017-11-21 中国科学院微生物研究所 一种将spacer序列克隆至CRISPR-Cas9系统中的方法及其应用
US20190345483A1 (en) 2016-05-12 2019-11-14 President And Fellows Of Harvard College AAV Split Cas9 Genome Editing and Transcriptional Regulation
WO2017197301A1 (en) 2016-05-12 2017-11-16 Hanley Brian P Safe delivery of crispr and other gene therapies to large fractions of somatic cells in humans and animals
KR101922989B1 (ko) 2016-05-13 2018-11-28 연세대학교 산학협력단 ＣＲＩＳＰＲ／Ｒｅｔｒｏｎ 시스템을 이용한 유전체상의 치환 변이 생성과 추적 방법
CN106011171B (zh) 2016-05-18 2019-10-11 西北农林科技大学 一种利用CRISPR/Cas9技术基于SSA修复的基因无缝编辑方法
CN105907758B (zh) 2016-05-18 2020-06-05 世翱（上海）生物医药科技有限公司 CRISPR-Cas9引导序列及其引物、转基因表达载体及其构建方法
CN105838733A (zh) 2016-05-18 2016-08-10 云南省农业科学院花卉研究所 Cas9 介导的香石竹基因编辑载体和应用
SG11201809552SA (en) 2016-05-20 2018-11-29 Regeneron Pharma Methods for breaking immunological tolerance using multiple guide rnas
CN106446600B (zh) 2016-05-20 2019-10-18 同济大学 一种基于CRISPR/Cas9的sgRNA的设计方法
US20190201551A1 (en) 2016-05-23 2019-07-04 Washington University Pulmonary targeted cas9/crispr for in vivo editing of disease genes
WO2017205290A1 (en) 2016-05-23 2017-11-30 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Bypassing the pam requirement of the crispr-cas system
CN105950560B (zh) 2016-05-24 2019-07-23 苏州系统医学研究所 人源化pd-l1肿瘤细胞系及具有该细胞系的动物模型与应用
CN106011167B (zh) 2016-05-27 2019-11-01 上海交通大学 雄性不育基因OsDPW2的应用及水稻育性恢复的方法
JP2019517261A (ja) 2016-06-01 2019-06-24 カーヴェーエス ザート ソシエタス・ヨーロピアＫｗｓ Ｓａａｔ Ｓｅ ゲノム操作のためのハイブリッド核酸配列
IL289989B (en) 2016-06-02 2022-09-01 Sigma Aldrich Co Llc Use of programmable DNA-binding proteins to enhance targeted genome modification
WO2017208247A1 (en) 2016-06-02 2017-12-07 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd. Assay for the removal of methyl-cytosine residues from dna
AU2017277810A1 (en) 2016-06-03 2018-12-06 Temple University - Of The Commonwealth System Of Higher Education Negative feedback regulation of HIV-1 by gene editing strategy
US11140883B2 (en) 2016-06-03 2021-10-12 Auburn University Gene editing of reproductive hormones to sterilize aquatic animals
CN106119275A (zh) 2016-06-07 2016-11-16 湖北大学 基于CRISPR/Cas9技术将非糯性水稻株系改造成糯性株系的打靶载体和方法
US20190256844A1 (en) 2016-06-07 2019-08-22 Temple University - Of The Commonwealth System Of Higher Education Rna guided compositions for preventing and treating hepatitis b virus infections
US10767175B2 (en) 2016-06-08 2020-09-08 Agilent Technologies, Inc. High specificity genome editing using chemically modified guide RNAs
WO2017222834A1 (en) 2016-06-10 2017-12-28 City Of Hope Compositions and methods for mitochondrial genome editing
CN106086008B (zh) 2016-06-10 2019-03-12 中国农业科学院植物保护研究所 烟粉虱MED隐种TRP基因的CRISPR/cas9系统及其应用
CN106434752A (zh) 2016-06-14 2017-02-22 南通大学附属医院 敲除Wnt3a基因的过程及其验证方法
US20200332305A1 (en) 2016-06-14 2020-10-22 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Use of cpfi endonuclease for plant genome modifications
CN106167821A (zh) 2016-06-16 2016-11-30 郑州大学 一种金黄色葡萄球菌crispr位点检测试剂盒及检测方法
CN105950633B (zh) 2016-06-16 2019-05-03 复旦大学 基因OsARF4在控制水稻粒长和千粒重中的应用
CN106167808A (zh) 2016-06-16 2016-11-30 郑州大学 一种基于CRISPR/Cas9技术消除mecA质粒的方法
US11788083B2 (en) 2016-06-17 2023-10-17 The Broad Institute, Inc. Type VI CRISPR orthologs and systems
US20190323038A1 (en) 2016-06-17 2019-10-24 Montana State Univesity Bidirectional targeting for genome editing
EP3472321A2 (de) 2016-06-17 2019-04-24 Genesis Technologies Limited Crispr-cas-system, materialien und verfahren
CN105950626B (zh) 2016-06-17 2018-09-28 新疆畜牧科学院生物技术研究所 基于CRISPR/Cas9获得不同毛色绵羊的方法及靶向ASIP基因的sgRNA
WO2017223107A1 (en) 2016-06-20 2017-12-28 Unity Biotechnology, Inc. Genome modifying enzyme therapy for diseases modulated by senescent cells
WO2017222773A1 (en) 2016-06-20 2017-12-28 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Novel cas systems and methods of use
AU2017282623B2 (en) 2016-06-20 2023-09-21 Keygene N.V. Method for targeted DNA alteration in plant cells
US20170362635A1 (en) 2016-06-20 2017-12-21 University Of Washington Muscle-specific crispr/cas9 editing of genes
CN106148370A (zh) 2016-06-21 2016-11-23 苏州瑞奇生物医药科技有限公司 肥胖症大鼠动物模型和构建方法
WO2017220751A1 (en) 2016-06-22 2017-12-28 Proqr Therapeutics Ii B.V. Single-stranded rna-editing oligonucleotides
US10988779B2 (en) 2016-06-22 2021-04-27 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Viral delivery of RNA utilizing self-cleaving ribozymes and CRISPR-based applications thereof
CN106047877B (zh) 2016-06-24 2019-01-11 中山大学附属第一医院 一种靶向敲除FTO基因的sgRNA及CRISPR/Cas9慢病毒系统与应用
CN106119283A (zh) 2016-06-24 2016-11-16 广西壮族自治区水牛研究所 一种利用CRISPR‑Cas9靶向敲除MSTN基因的方法
CN105925608A (zh) 2016-06-24 2016-09-07 广西壮族自治区水牛研究所 一种利用CRISPR-Cas9靶向敲除ALK6基因的方法
CA3029121A1 (en) 2016-06-29 2018-01-04 Crispr Therapeutics Ag Compositions and methods for gene editing
US11913017B2 (en) 2016-06-29 2024-02-27 The Regents Of The University Of California Efficient genetic screening method
CN106148286B (zh) 2016-06-29 2019-10-29 牛刚 一种用于检测热原的细胞模型的构建方法和细胞模型及热原检测试剂盒
WO2018005873A1 (en) 2016-06-29 2018-01-04 The Broad Institute Inc. Crispr-cas systems having destabilization domain
US10927383B2 (en) 2016-06-30 2021-02-23 Ethris Gmbh Cas9 mRNAs
US20180004537A1 (en) 2016-07-01 2018-01-04 Microsoft Technology Licensing, Llc Molecular State Machines
ES2817973T3 (es) 2016-07-01 2021-04-08 Microsoft Technology Licensing Llc Almacenamiento a través de la edición iterativa del ADN
US10892034B2 (en) 2016-07-01 2021-01-12 Microsoft Technology Licensing, Llc Use of homology direct repair to record timing of a molecular event
KR20190039703A (ko) 2016-07-05 2019-04-15 더 존스 홉킨스 유니버시티 Crispr/cas9-기반 조성물 및 망막 변성을 치료하기 위한 방법
US20190185847A1 (en) 2016-07-06 2019-06-20 Novozymes A/S Improving a Microorganism by CRISPR-Inhibition
CN106191057B (zh) 2016-07-06 2018-12-25 中山大学 一种用于敲除人CYP2E1基因的sgRNA序列、CYP2E1基因缺失细胞株的构建方法及其应用
CN106051058A (zh) 2016-07-07 2016-10-26 上海格昆机电科技有限公司 用于航天贮箱和粒子治疗仪的旋转机架及其传动机构
WO2018009822A1 (en) 2016-07-08 2018-01-11 Ohio State Innovation Foundation Modified nucleic acids, hybrid guide rnas, and uses thereof
CN107586777A (zh) 2016-07-08 2018-01-16 上海吉倍生物技术有限公司 人PDCD1基因sgRNA的用途及其相关药物
CN106047930B (zh) 2016-07-12 2020-05-19 北京百奥赛图基因生物技术有限公司 一种PS1基因条件性敲除flox大鼠的制备方法
WO2018013821A1 (en) 2016-07-13 2018-01-18 Dsm Ip Assets B.V. A crispr-cas system for an algal host cell
EP3485023B1 (de) 2016-07-15 2023-11-15 Salk Institute for Biological Studies Verfahren und zusammensetzungen zum genom-editieren von sich nichtteilenden zellen
WO2018013990A1 (en) 2016-07-15 2018-01-18 Zymergen Inc. Scarless dna assembly and genome editing using crispr/cpf1 and dna ligase
CN106191061B (zh) 2016-07-18 2019-06-18 暨南大学 一种特异靶向人ABCG2基因的sgRNA导向序列及其应用
CN106191062B (zh) 2016-07-18 2019-06-14 广东华南疫苗股份有限公司 一种tcr-/pd-1-双阴性t细胞及其构建方法
CN106190903B (zh) 2016-07-18 2019-04-02 华中农业大学 鸭疫里氏杆菌Cas9基因缺失突变株及其应用
CN106434651B (zh) 2016-07-19 2021-05-18 广西大学 根癌农杆菌和CRISPR-Cas9介导的基因定点插入失活方法及其应用
EP4275747A3 (de) 2016-07-19 2024-01-24 Duke University Therapeutische anwendungen von cpf1-basierter genomeditierung
JP2019520844A (ja) 2016-07-21 2019-07-25 マックスサイト インコーポレーティッド ゲノムｄｎａを改変するための方法および組成物
CN106191064B (zh) 2016-07-22 2019-06-07 中国农业大学 一种制备mc4r基因敲除猪的方法
WO2018015444A1 (en) 2016-07-22 2018-01-25 Novozymes A/S Crispr-cas9 genome editing with multiple guide rnas in filamentous fungi
CN106191107B (zh) 2016-07-22 2020-03-20 湖南农业大学 一种降低水稻籽粒落粒性的分子改良方法
WO2018022480A1 (en) 2016-07-25 2018-02-01 Mayo Foundation For Medical Education And Research Treating cancer
CA3031414A1 (en) 2016-07-26 2018-02-01 The General Hospital Corporation Variants of crispr from prevotella and francisella 1 (cpf1)
WO2018018979A1 (zh) 2016-07-26 2018-02-01 浙江大学 植物重组载体及无转基因成分的基因编辑植株的筛选方法
CN106222193B (zh) 2016-07-26 2019-09-20 浙江大学 一种重组载体及无转基因基因编辑植株的筛选方法
CN106191099A (zh) 2016-07-27 2016-12-07 苏州泓迅生物科技有限公司 一种基于CRISPR‑Cas9系统的酿酒酵母基因组并行多重编辑载体及其应用
CN106086061A (zh) 2016-07-27 2016-11-09 苏州泓迅生物科技有限公司 一种基于CRISPR‑Cas9系统的酿酒酵母基因组编辑载体及其应用
KR101828958B1 (ko) 2016-07-28 2018-02-13 주식회사 비엠티 옥외 배관용 히팅재킷
GB201613135D0 (en) 2016-07-29 2016-09-14 Medical Res Council Genome editing
CN106191113B (zh) 2016-07-29 2020-01-14 中国农业大学 一种mc3r基因敲除猪的制备方法
CN106434748A (zh) 2016-07-29 2017-02-22 中国科学院重庆绿色智能技术研究院 一种热激诱导型 Cas9 酶转基因斑马鱼的研制及应用
CN106191124B (zh) 2016-07-29 2019-10-11 中国科学院重庆绿色智能技术研究院 一种利用鱼卵保存液提高CRISPR-Cas9基因编辑和传代效率的鱼类育种方法
CN106191114B (zh) 2016-07-29 2020-02-11 中国科学院重庆绿色智能技术研究院 利用CRISPR-Cas9系统敲除鱼类MC4R基因的育种方法
CN106011150A (zh) 2016-08-01 2016-10-12 云南纳博生物科技有限公司 一种水稻穗粒数Gn1a基因人工定点突变体及其应用
CN106434688A (zh) 2016-08-01 2017-02-22 云南纳博生物科技有限公司 一种水稻直立密穗dep1基因人工定点突变体及其应用
US11866733B2 (en) 2016-08-01 2024-01-09 University of Pittsburgh—of the Commonwealth System of Higher Education Human induced pluripotent stem cells for high efficiency genetic engineering
JP7184364B2 (ja) 2016-08-02 2022-12-06 国立大学法人京都大学 ゲノム編集のための方法
US11566263B2 (en) 2016-08-02 2023-01-31 Editas Medicine, Inc. Compositions and methods for treating CEP290 associated disease
KR102547316B1 (ko) 2016-08-03 2023-06-23 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 아데노신 핵염기 편집제 및 그의 용도
CN106282241A (zh) 2016-08-05 2017-01-04 无锡市第二人民医院 通过CRISPR/Cas9得到敲除bmp2a基因的斑马鱼的方法
AU2017308889B2 (en) 2016-08-09 2023-11-09 President And Fellows Of Harvard College Programmable Cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof
KR101710026B1 (ko) 2016-08-10 2017-02-27 주식회사 무진메디 Cas9 단백질 및 가이드 RNA의 혼성체를 함유하는 나노 리포좀 전달체 조성물
CN106222203A (zh) 2016-08-10 2016-12-14 云南纳博生物科技有限公司 利用CRISPR/Cas技术获得家蚕丝素重链基因突变体及突变方法和应用
CN106172238B (zh) 2016-08-12 2019-01-22 中南大学 miR-124基因敲除小鼠动物模型的构建方法和应用
CN106222177B (zh) 2016-08-13 2018-06-26 江苏集萃药康生物科技有限公司 一种靶向人STAT6的CRISPR-Cas9系统及其用于治疗过敏性疾病的应用
US11810649B2 (en) 2016-08-17 2023-11-07 The Broad Institute, Inc. Methods for identifying novel gene editing elements
WO2018035250A1 (en) 2016-08-17 2018-02-22 The Broad Institute, Inc. Methods for identifying class 2 crispr-cas systems
US20210000091A1 (en) 2016-08-17 2021-01-07 The Regents Of The University Of California Split Trans-Complementing Gene-Drive System for Suppressing Aedes Aegypti Mosquitos
KR20190065251A (ko) 2016-08-18 2019-06-11 더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아 모듈러 AAV 전달 시스템을 통한 CRISPR-Cas 게놈 가공
JP2019528691A (ja) 2016-08-19 2019-10-17 ブルーバード バイオ， インコーポレイテッド ゲノム編集エンハンサー
EP3500677A4 (de) 2016-08-20 2020-04-01 Avellino Lab USA, Inc. Single-guide-rna, crispr/cas9-systeme und verfahren zur verwendung davon
CN106191071B (zh) 2016-08-22 2018-09-04 广州资生生物科技有限公司 一种CRISPR-Cas9系统及其用于治疗乳腺癌疾病的应用
CN106191116B (zh) 2016-08-22 2019-10-08 西北农林科技大学 基于CRISPR/Cas9的外源基因敲入整合系统及其建立方法和应用
CN106244555A (zh) 2016-08-23 2016-12-21 广州医科大学附属第三医院 一种提高基因打靶的效率的方法及β‑球蛋白基因位点的碱基原位修复方法
CN106086028B (zh) 2016-08-23 2019-04-23 中国农业科学院作物科学研究所 一种通过基因组编辑提高水稻抗性淀粉含量的方法及其专用sgRNA
US11542509B2 (en) 2016-08-24 2023-01-03 President And Fellows Of Harvard College Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing
CN106244609A (zh) 2016-08-24 2016-12-21 浙江理工大学 一种调节pi3k‑akt信号通路的非编码基因的筛选系统及筛选方法
CN106109417A (zh) 2016-08-24 2016-11-16 李因传 一种肝细胞膜仿生脂质体药物载体、制作方法及其应用
SG11201901364VA (en) 2016-08-24 2019-03-28 Sangamo Therapeutics Inc Engineered target specific nucleases
KR101856345B1 (ko) 2016-08-24 2018-06-20 경상대학교산학협력단 CRISPR/Cas9 시스템을 이용하여 APOBEC3H 및 APOBEC3CH 이중-넉아웃 고양이를 제조하는 방법
PL3504229T3 (pl) 2016-08-24 2022-04-19 Sangamo Therapeutics, Inc. Regulacja ekspresji genów przy użyciu nukleaz poddanych inżynierii
CN106544357B (zh) 2016-08-25 2018-08-21 湖南杂交水稻研究中心 一种培育镉低积累籼稻品种的方法
CN107784200B (zh) 2016-08-26 2020-11-06 深圳华大生命科学研究院 一种筛选新型CRISPR-Cas系统的方法和装置
CN106318973B (zh) 2016-08-26 2019-09-13 深圳市第二人民医院 一种基于CRISPR-Cas9的基因调控装置及基因调控方法
CN106350540A (zh) 2016-08-26 2017-01-25 苏州系统医学研究所 一种由慢病毒介导的高效可诱导型CRISPR/Cas9基因敲除载体及其应用
CN106244557B (zh) 2016-08-29 2019-10-25 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 定点突变ApoE基因与LDLR基因的方法
CN106399375A (zh) 2016-08-31 2017-02-15 南京凯地生物科技有限公司 利用CRISPR/Cas9敲除人PD‑1基因构建靶向CD19CAR‑T细胞的方法
CN106480097A (zh) 2016-10-13 2017-03-08 南京凯地生物科技有限公司 利用CRISPR/Cas9技术敲除人PD‑1基因构建可靶向MSLN新型CAR‑T细胞的方法及其应用
CN106399367A (zh) 2016-08-31 2017-02-15 深圳市卫光生物制品股份有限公司 提高crispr介导的同源重组效率的方法
CN107794272B (zh) 2016-09-06 2021-10-12 中国科学院上海营养与健康研究所 一种高特异性的crispr基因组编辑体系
CN106399377A (zh) 2016-09-07 2017-02-15 同济大学 一种基于CRISPR/Cas9高通量技术筛选药物靶点基因的方法
US20180105806A1 (en) 2016-09-07 2018-04-19 Massachusetts Institute Of Technology Method for rna-guided endonuclease-based dna assembly
US20190255106A1 (en) 2016-09-07 2019-08-22 Flagship Pioneering Inc. Methods and compositions for modulating gene expression
CN106367435B (zh) 2016-09-07 2019-11-08 电子科技大学 一种水稻miRNA定向敲除的方法
CN106399311A (zh) 2016-09-07 2017-02-15 同济大学 用于Chip‑seq全基因组结合谱的内源蛋白标记的方法
CN107574179B (zh) 2016-09-09 2018-07-10 康码（上海）生物科技有限公司 一种为克鲁维酵母优化的CRISPR/Cas9高效基因编辑系统
EP3510151A4 (de) 2016-09-09 2020-04-15 The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University Hochdurchsatz-präzisionsgenomeditierung
EP3512943B1 (de) 2016-09-14 2023-04-12 Yeda Research and Development Co. Ltd. Crisp-seq, integriertes verfahren für massiv parallele einzelzellen-rna-seq und crispr-gepoolte screens
CN106318934B (zh) 2016-09-21 2020-06-05 上海交通大学 胡萝卜β(1,2)木糖转移酶的基因全序列及用于转染双子叶植物的CRISPR/CAS9的质粒构建
WO2018058064A1 (en) 2016-09-23 2018-03-29 Casebia Therapeutics Limited Liability Partnership Compositions and methods for gene editing
US9580698B1 (en) 2016-09-23 2017-02-28 New England Biolabs, Inc. Mutant reverse transcriptase
CN106957858A (zh) 2016-09-23 2017-07-18 西北农林科技大学 一种利用CRISPR/Cas9系统共同敲除绵羊MSTN、ASIP、BCO2基因的方法
EP3516056A1 (de) 2016-09-23 2019-07-31 DSM IP Assets B.V. Guide-rna-expressionssystem für eine wirtszelle
US11319546B2 (en) 2016-09-28 2022-05-03 Cellivery Therapeutics, Inc. Cell-permeable (CP)-Cas9 recombinant protein and uses thereof
CN107881184B (zh) 2016-09-30 2021-08-27 中国科学院分子植物科学卓越创新中心 一种基于Cpf1的DNA体外拼接方法
CN110023494A (zh) 2016-09-30 2019-07-16 加利福尼亚大学董事会 Rna指导的核酸修饰酶及其使用方法
EP3518656A4 (de) 2016-09-30 2020-09-30 Monsanto Technology LLC Verfahren zur auswahl von zielorten zur ortsspezifischen genommodifikation in pflanzen
US11371062B2 (en) 2016-09-30 2022-06-28 The Regents Of The University Of California RNA-guided nucleic acid modifying enzymes and methods of use thereof
CN106480027A (zh) 2016-09-30 2017-03-08 重庆高圣生物医药有限责任公司 CRISPR/Cas9 靶向敲除人PD‑1基因及其特异性gRNA
CN107880132B (zh) 2016-09-30 2022-06-17 北京大学 一种融合蛋白及使用其进行同源重组的方法
US11730823B2 (en) 2016-10-03 2023-08-22 President And Fellows Of Harvard College Delivery of therapeutic RNAs via ARRDC1-mediated microvesicles
WO2018067846A1 (en) 2016-10-05 2018-04-12 President And Fellows Of Harvard College Methods of crispr mediated genome modulation in v. natriegens
US10669539B2 (en) 2016-10-06 2020-06-02 Pioneer Biolabs, Llc Methods and compositions for generating CRISPR guide RNA libraries
CA3039409A1 (en) 2016-10-07 2018-04-12 Integrated Dna Technologies, Inc. S. pyogenes cas9 mutant genes and polypeptides encoded by same
CN106479985A (zh) 2016-10-09 2017-03-08 上海吉玛制药技术有限公司 病毒介导的Cpf1蛋白在CRISPR/Cpf1基因编辑系统中的应用
US20190365862A1 (en) 2016-10-12 2019-12-05 Temple University - Of The Commonwealth System Of Higher Education Combination therapies for eradicating flavivirus infections in subjects
IT201600102542A1 (it) 2016-10-12 2018-04-12 Univ Degli Studi Di Trento Plasmide e sistema lentivirale contenente un circuito autolimitante della Cas9 che ne incrementa la sicurezza.
CN106434663A (zh) 2016-10-12 2017-02-22 遵义医学院 CRISPR/Cas9靶向敲除人ezrin基因增强子关键区的方法及其特异性gRNA
CN106434782B (zh) 2016-10-14 2020-01-10 南京工业大学 一种产顺式-4-羟脯氨酸的方法
KR20240007715A (ko) 2016-10-14 2024-01-16 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 핵염기 에디터의 aav 전달
WO2018071892A1 (en) 2016-10-14 2018-04-19 Joung J Keith Epigenetically regulated site-specific nucleases
WO2018071663A1 (en) 2016-10-14 2018-04-19 Emendobio Inc. Rna compositions for genome editing
WO2018074979A1 (en) 2016-10-17 2018-04-26 Nanyang Technological University Truncated crispr-cas proteins for dna targeting
US10640810B2 (en) 2016-10-19 2020-05-05 Drexel University Methods of specifically labeling nucleic acids using CRISPR/Cas
EP3532616A1 (de) 2016-10-28 2019-09-04 Editas Medicine, Inc. Verfahren im zusammenhang mit crispr/cas und zusammensetzungen zur behandlung des herpes-simplex-virus
US20180119141A1 (en) 2016-10-28 2018-05-03 Massachusetts Institute Of Technology Crispr/cas global regulator screening platform
WO2018081534A1 (en) 2016-10-28 2018-05-03 President And Fellows Of Harvard College Assay for exo-site binding molecules
US20180127759A1 (en) 2016-10-28 2018-05-10 Massachusetts Institute Of Technology Dynamic genome engineering
WO2018081728A1 (en) 2016-10-31 2018-05-03 Emendobio Inc. Compositions for genome editing
KR20190026828A (ko) 2016-10-31 2019-03-13 가부시키가이샤 에구치 고오슈우하 리액터
US20180245065A1 (en) 2016-11-01 2018-08-30 Novartis Ag Methods and compositions for enhancing gene editing
US11787795B2 (en) 2016-11-01 2023-10-17 President And Fellows Of Harvard College Inhibitors of RNA guided nucleases and uses thereof
US11732258B2 (en) 2016-11-02 2023-08-22 President And Fellows Of Harvard College Engineered guide RNA sequences for in situ detection and sequencing
GB201618507D0 (en) 2016-11-02 2016-12-14 Stichting Voor De Technische Wetenschappen And Wageningen Univ Microbial genome editing
CN106544353A (zh) 2016-11-08 2017-03-29 宁夏医科大学总医院 一种利用CRISPR‑Cas9清除鲍曼不动杆菌耐药性基因的方法
EP3538561A4 (de) 2016-11-11 2020-10-21 The Regents of The University of California Rna-geführte polypeptidvarianten und verfahren zur verwendung
CN106755088A (zh) 2016-11-11 2017-05-31 广东万海细胞生物科技有限公司 一种自体car‑t细胞制备方法及应用
CA3043774A1 (en) 2016-11-14 2018-05-17 Caixia Gao A method for base editing in plants
CN106566838B (zh) 2016-11-14 2019-11-01 上海伯豪生物技术有限公司 一种基于CRISPR-Cas9技术的miR-126全长基因敲除试剂盒及其应用
CN106554969A (zh) 2016-11-15 2017-04-05 陕西理工学院 基于抑菌杀菌的多靶点CRISPR/Cas9表达载体
CN106754912B (zh) 2016-11-16 2019-11-08 上海交通大学 一类定向清除肝细胞中HBVcccDNA的质粒及制剂
US11485760B2 (en) 2016-11-16 2022-11-01 The Regents Of The University Of California Inhibitors of CRISPR-Cas9
CN106480067A (zh) 2016-11-21 2017-03-08 中国农业科学院烟草研究所 烟草NtNAC096基因控制烟草衰老的应用
US20180282722A1 (en) 2016-11-21 2018-10-04 Massachusetts Institute Of Technology Chimeric DNA:RNA Guide for High Accuracy Cas9 Genome Editing
EP4321617A3 (de) 2016-11-22 2024-04-24 Integrated DNA Technologies Inc. Crispr/cpf1-systeme und -verfahren
US20200046854A1 (en) 2016-11-28 2020-02-13 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Prevention of muscular dystrophy by crispr/cpf1-mediated gene editing
CN106755091A (zh) 2016-11-28 2017-05-31 中国人民解放军第三军医大学第附属医院 基因敲除载体，mh7a细胞nlrp1基因敲除方法
CN106480036B (zh) 2016-11-30 2019-04-09 华南理工大学 一种具有启动子功能的dna片段及其应用
CN106834323A (zh) 2016-12-01 2017-06-13 安徽大学 一种基于维吉尼亚链霉菌IBL14基因cas7‑5‑3的基因编辑方法
WO2018098587A1 (en) 2016-12-01 2018-06-07 UNIVERSITé LAVAL Crispr-based treatment of friedreich ataxia
CN107043779B (zh) 2016-12-01 2020-05-12 中国农业科学院作物科学研究所 一种CRISPR/nCas9介导的定点碱基替换在植物中的应用
US9816093B1 (en) 2016-12-06 2017-11-14 Caribou Biosciences, Inc. Engineered nucleic acid-targeting nucleic acids
CN106701830B (zh) 2016-12-07 2020-01-03 湖南人文科技学院 一种敲除猪胚胎p66shc基因的方法
WO2018103686A1 (zh) 2016-12-07 2018-06-14 中国科学院上海生命科学研究院 叶绿体基因组编辑方法
US11192929B2 (en) 2016-12-08 2021-12-07 Regents Of The University Of Minnesota Site-specific DNA base editing using modified APOBEC enzymes
CN106544351B (zh) 2016-12-08 2019-09-10 江苏省农业科学院 CRISPR-Cas9体外敲除耐药基因mcr-1的方法及其专用细胞穿透肽
WO2018107028A1 (en) 2016-12-08 2018-06-14 Intellia Therapeutics, Inc. Modified guide rnas
WO2018107103A1 (en) 2016-12-09 2018-06-14 The Broad Institute, Inc. Crispr-systems for modifying a trait of interest in a plant
PL3551753T3 (pl) 2016-12-09 2022-10-31 The Broad Institute, Inc. Diagnostyka oparta na uk‎‎‎ładzie efektorowym crispr
WO2018111947A1 (en) 2016-12-12 2018-06-21 Integrated Dna Technologies, Inc. Genome editing enhancement
US20190032131A1 (en) 2016-12-12 2019-01-31 Integrated Dna Technologies, Inc. Genome editing detection
CN107893074A (zh) 2016-12-13 2018-04-10 广东赤萌医疗科技有限公司 一种用于敲除CXCR4基因的gRNA、表达载体、敲除系统、试剂盒
BR112019012155A2 (pt) 2016-12-14 2019-11-12 Stichting Technische Wetenschappen uso de pelo menos uma molécula-guia de rna e uma proteína cas, método de ligação, clivagem, marcação ou modificação de um polinucleotídeo alvo de fita dupla, célula transformada, e, complexo de nucleoproteína
WO2018109101A1 (en) 2016-12-14 2018-06-21 Wageningen Universiteit Thermostable cas9 nucleases
KR101748575B1 (ko) 2016-12-16 2017-06-20 주식회사 엠젠플러스 Ins 유전자 녹아웃 당뇨병 또는 당뇨병 합병증 동물모델 및 이의 제조방법
WO2018112336A1 (en) 2016-12-16 2018-06-21 Ohio State Innovation Foundation Systems and methods for dna-guided rna cleavage
WO2018112446A2 (en) 2016-12-18 2018-06-21 Selonterra, Inc. Use of apoe4 motif-mediated genes for diagnosis and treatment of alzheimer's disease
CN106755026A (zh) 2016-12-18 2017-05-31 吉林大学 sgRNA表达载体的构建及牙釉质钙化不全模型的建立
KR20230125856A (ko) 2016-12-23 2023-08-29 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 Pcsk9의 유전자 편집
US10745677B2 (en) 2016-12-23 2020-08-18 President And Fellows Of Harvard College Editing of CCR5 receptor gene to protect against HIV infection
CN106755424B (zh) 2016-12-26 2020-11-06 郑州大学 一种基于crispr的大肠杆菌st131系菌株检测引物、试剂盒及检测方法
CN107354173A (zh) 2016-12-26 2017-11-17 浙江省医学科学院 基于crispr技术和水动力尾静脉注射建立肝脏特异性敲除小鼠模型的方法
CN106755097A (zh) 2016-12-27 2017-05-31 安徽省农业科学院畜牧兽医研究所 一种山羊tlr4基因敲除载体及其构建方法
CN106834347A (zh) 2016-12-27 2017-06-13 安徽省农业科学院畜牧兽医研究所 一种山羊cdk2基因敲除载体及其构建方法
CN106597260B (zh) 2016-12-29 2020-04-03 合肥工业大学 基于连续小波分析和elm网络的模拟电路故障诊断方法
CN106834341B (zh) 2016-12-30 2020-06-16 中国农业大学 一种基因定点突变载体及其构建方法和应用
CN106755077A (zh) 2016-12-30 2017-05-31 华智水稻生物技术有限公司 利用crispr‑cas9技术对水稻cenh3基因定点突变的方法
CN106701763B (zh) 2016-12-30 2019-07-19 重庆高圣生物医药有限责任公司 CRISPR/Cas9靶向敲除人乙肝病毒P基因及其特异性gRNA
CN106868008A (zh) 2016-12-30 2017-06-20 重庆高圣生物医药有限责任公司 CRISPR/Cas9靶向敲除人Lin28A基因及其特异性gRNA
CN106701818B (zh) 2017-01-09 2020-04-24 湖南杂交水稻研究中心 一种培育水稻普通核不育系的方法
CN107012164B (zh) 2017-01-11 2023-03-03 电子科技大学 CRISPR/Cpf1植物基因组定向修饰功能单元、包含该功能单元的载体及其应用
US20190352634A1 (en) 2017-01-11 2019-11-21 Oxford University Innovation Limited Crispr rna
KR102084186B1 (ko) 2017-01-17 2020-03-03 기초과학연구원 Dna 단일가닥 절단에 의한 염기 교정 비표적 위치 확인 방법
CN107058372A (zh) 2017-01-18 2017-08-18 四川农业大学 一种应用于植物上的CRISPR/Cas9载体的构建方法
CN106701823A (zh) 2017-01-18 2017-05-24 上海交通大学 生产无岩藻糖单克隆抗体的cho细胞系建立及其应用
JP2020513783A (ja) 2017-01-18 2020-05-21 エクシジョン バイオセラピューティクス インコーポレイテッド Ｃｒｉｓｐｒ
CN106801056A (zh) 2017-01-24 2017-06-06 中国科学院广州生物医药与健康研究院 一种sgRNA及其构建的慢病毒载体和应用
AU2018212624A1 (en) 2017-01-30 2019-08-22 KWS SAAT SE & Co. KGaA Repair template linkage to endonucleases for genome engineering
TWI608100B (zh) 2017-02-03 2017-12-11 國立清華大學 Ｃａｓ９表達質體、大腸桿菌基因剪輯系統及其方法
TW201839136A (zh) 2017-02-06 2018-11-01 瑞士商諾華公司 治療血色素異常症之組合物及方法
WO2018145068A1 (en) 2017-02-06 2018-08-09 Trustees Of Boston University An integrated system for programmable dna methylation
US20190345501A1 (en) 2017-02-07 2019-11-14 Massachusetts Institute Of Technology Methods and compositions for rna-guided genetic circuits
JP2020506948A (ja) 2017-02-07 2020-03-05 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア ハプロ不全のための遺伝子治療
WO2018148647A2 (en) 2017-02-10 2018-08-16 Lajoie Marc Joseph Genome editing reagents and their use
IT201700016321A1 (it) 2017-02-14 2018-08-14 Univ Degli Studi Di Trento Mutanti di cas9 ad alta specificita' e loro applicazioni.
WO2018152197A1 (en) 2017-02-15 2018-08-23 Massachusetts Institute Of Technology Dna writers, molecular recorders and uses thereof
WO2018149915A1 (en) 2017-02-15 2018-08-23 Keygene N.V. Methods of targeted genetic alteration in plant cells
CN106957855B (zh) 2017-02-16 2020-04-17 上海市农业科学院 使用CRISPR/Cas9技术靶向敲除水稻矮杆基因SD1的方法
US20190367924A1 (en) 2017-02-17 2019-12-05 Temple University - Of The Commonwealth System Of Higher Education Gene editing therapy for hiv infection via dual targeting of hiv genome and ccr5
CA3053861A1 (en) 2017-02-20 2018-08-23 Institute Of Genetics And Developmental Biology, Chinese Academy Of Sciences Genome editing method
WO2018154459A1 (en) 2017-02-22 2018-08-30 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for treatment of primary hyperoxaluria type 1 (ph1) and other alanine-glyoxylate aminotransferase (agxt) gene related conditions or disorders
WO2018154418A1 (en) 2017-02-22 2018-08-30 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for treatment of early onset parkinson's disease (park1) and other synuclein, alpha (snca) gene related conditions or disorders
EP3585898A1 (de) 2017-02-22 2020-01-01 CRISPR Therapeutics AG Materialien und verfahren zur behandlung von spinozerebellärer ataxie typ 1 (sca1) und anderen mit dem gen des proteins von spinozerebellärer ataxie typ 1 (atxn1) assoziierten erkrankungen oder störungen
CA3054031A1 (en) 2017-02-22 2018-08-30 Crispr Therapeutics Ag Compositions and methods for gene editing
WO2018154462A2 (en) 2017-02-22 2018-08-30 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for treatment of spinocerebellar ataxia type 2 (sca2) and other spinocerebellar ataxia type 2 protein (atxn2) gene related conditions or disorders
US20200095579A1 (en) 2017-02-22 2020-03-26 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for treatment of merosin-deficient cogenital muscular dystrophy (mdcmd) and other laminin, alpha 2 (lama2) gene related conditions or disorders
WO2018156372A1 (en) 2017-02-22 2018-08-30 The Regents Of The University Of California Genetically modified non-human animals and products thereof
US20200248168A1 (en) 2017-02-22 2020-08-06 Crispr Therapeutics Ag Compositions and methods for treatment of proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (pcsk9)-related disorders
EP3585897A1 (de) 2017-02-22 2020-01-01 CRISPR Therapeutics AG Materialien und verfahren zur behandlung von dystropher epidermolysis bullosa (deb) und anderen leiden oder störungen im zusammenhang mit dem gen der kollagen-typ-vii-alpha-1-kette (col7a1)
US20190380314A1 (en) 2017-02-23 2019-12-19 President And Fellows Of Harvard College Methods of Genetic Modification of a Cell
CN106868031A (zh) 2017-02-24 2017-06-20 北京大学 一种基于分级组装的多个sgRNA串联并行表达的克隆方法及应用
WO2018161009A1 (en) 2017-03-03 2018-09-07 Yale University Aav-mediated direct in vivo crispr screen in glioblastoma
US11111492B2 (en) 2017-03-06 2021-09-07 Florida State University Research Foundation, Inc. Genome engineering methods using a cytosine-specific Cas9
WO2018165631A1 (en) 2017-03-09 2018-09-13 President And Fellows Of Harvard College Cancer vaccine
US11898179B2 (en) 2017-03-09 2024-02-13 President And Fellows Of Harvard College Suppression of pain by gene editing
EP3592777A1 (de) 2017-03-10 2020-01-15 President and Fellows of Harvard College Cytosin-zu-guanin-baseneditor
JP2020513814A (ja) 2017-03-14 2020-05-21 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア Ｃｒｉｓｐｒ ｃａｓ９免疫ステルス（ｉｍｍｕｎｅ ｓｔｅａｌｔｈ）の操作
AU2018234832A1 (en) 2017-03-15 2019-10-10 Massachusetts Institute Of Technology CRISPR effector system based diagnostics for virus detection
CN106978428A (zh) 2017-03-15 2017-07-25 上海吐露港生物科技有限公司 一种Cas蛋白特异结合靶标DNA、调控靶标基因转录的方法及试剂盒
CN106906242A (zh) 2017-03-16 2017-06-30 重庆高圣生物医药有限责任公司 一种提高CRIPSR/Cas9靶向敲除基因产生非同源性末端接合效率的方法
WO2018175502A2 (en) 2017-03-21 2018-09-27 Shuber Anthony P Treating cancer with cas endonuclease complexes
US11268082B2 (en) 2017-03-23 2022-03-08 President And Fellows Of Harvard College Nucleobase editors comprising nucleic acid programmable DNA binding proteins
CN107012213A (zh) 2017-03-24 2017-08-04 南开大学 结直肠癌的生物标记物
PT3526324T (pt) 2017-03-28 2021-10-20 Locanabio Inc Proteína associada a crispr (cas)
CN106947780A (zh) 2017-03-28 2017-07-14 扬州大学 一种兔mstn基因的编辑方法
CN106906240A (zh) 2017-03-29 2017-06-30 浙江大学 运用CRISPR‑Cas9系统敲除大麦VE合成通路中的关键基因HPT的方法
KR20190134673A (ko) 2017-03-30 2019-12-04 고쿠리츠 다이가쿠 호진 교토 다이가쿠 게놈 편집에 의한 엑손 스키핑 유도 방법
CN108660161B (zh) 2017-03-31 2023-05-09 中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心 基于CRISPR/Cas9技术的制备无嵌合基因敲除动物的方法
CN107058358B (zh) 2017-04-01 2020-06-09 中国科学院微生物研究所 一种双spacer序列识别切割CRISPR-Cas9载体构建及其在疣孢菌中的应用
US9938288B1 (en) 2017-04-05 2018-04-10 President And Fellows Of Harvard College Macrocyclic compound and uses thereof
CN106967726B (zh) 2017-04-05 2020-12-29 华南农业大学 一种创建亚洲栽培稻与非洲栽培稻种间杂种亲和系的方法和应用
CN107142282A (zh) 2017-04-06 2017-09-08 中山大学 一种利用CRISPR/Cas9在哺乳动物细胞中实现大片段DNA定点整合的方法
CN107034229A (zh) 2017-04-07 2017-08-11 江苏贝瑞利生物科技有限公司 一种植物中高效筛选CRISPR/CAS9基因编辑系统候选sgRNA系统及应用
ES2880366T3 (es) 2017-04-11 2021-11-24 Hoffmann La Roche Retrotranscriptasa mutante con un incremento en la estabilidad térmica así como productos, procedimientos y usos que involucran la misma
CN107058320B (zh) 2017-04-12 2019-08-02 南开大学 Il7r基因缺失斑马鱼突变体的制备及其应用
CN110799645A (zh) 2017-04-12 2020-02-14 博德研究所 新型vi型crispr直系同源物和系统
CN106916852B (zh) 2017-04-13 2020-12-04 上海科技大学 一种碱基编辑系统及其构建和应用方法
CN108728476A (zh) 2017-04-14 2018-11-02 复旦大学 一种利用crispr系统产生多样性抗体文库的方法
CN107298701B (zh) 2017-04-18 2020-10-30 上海大学 玉米转录因子ZmbZIP22及其应用
CN116732106A (zh) 2017-04-20 2023-09-12 E开创生物技术股份有限公司 产生基因修改的动物的方法
CN106957844A (zh) 2017-04-20 2017-07-18 华侨大学 一种能有效敲除HTLV‑1病毒基因组的CRISPR/Cas9的gRNA序列
US11773409B2 (en) 2017-04-21 2023-10-03 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University CRISPR/Cas 9-mediated integration of polynucleotides by sequential homologous recombination of AAV donor vectors
US11591589B2 (en) 2017-04-21 2023-02-28 The General Hospital Corporation Variants of Cpf1 (Cas12a) with altered PAM specificity
CN107043775B (zh) 2017-04-24 2020-06-16 中国农业科学院生物技术研究所 一种能促进棉花侧根发育的sgRNA及其应用
WO2018197495A1 (en) 2017-04-24 2018-11-01 Dupont Nutrition Biosciences Aps Novel anti-crispr genes and proteins and methods of use
US20180312822A1 (en) 2017-04-26 2018-11-01 10X Genomics, Inc. Mmlv reverse transcriptase variants
CN206970581U (zh) 2017-04-26 2018-02-06 重庆威斯腾生物医药科技有限责任公司 一种用于辅助CRISPR/cas9基因敲除的试剂盒
WO2018197020A1 (en) 2017-04-27 2018-11-01 Novozymes A/S Genome editing by crispr-cas9 using short donor oligonucleotides
CN110832074A (zh) 2017-05-03 2020-02-21 科沃施种子欧洲股份两合公司 CRISPR-Cas核酸内切酶在植物基因组工程中的应用
CN107012174A (zh) 2017-05-04 2017-08-04 昆明理工大学 CRISPR/Cas9技术在获得家蚕锌指蛋白基因突变体中的应用
EP3619302A4 (de) 2017-05-04 2021-01-20 The Trustees of The University of Pennsylvania Zusammensetzungen und verfahren zur geneditierung in t-zellen unter verwendung von crispr/cpf1
CN107254485A (zh) 2017-05-08 2017-10-17 南京农业大学 一种能够快速构建植物基因定点敲除载体的新反应体系
WO2018208755A1 (en) 2017-05-09 2018-11-15 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for tagging target proteins in proximity to a nucleotide sequence of interest
CN107129999A (zh) 2017-05-09 2017-09-05 福建省农业科学院畜牧兽医研究所 利用稳转CRISPR/Cas9系统对病毒基因组进行靶向编辑的方法
WO2018209158A2 (en) 2017-05-10 2018-11-15 Editas Medicine, Inc. Crispr/rna-guided nuclease systems and methods
WO2018208998A1 (en) 2017-05-10 2018-11-15 The Regents Of The University Of California Directed editing of cellular rna via nuclear delivery of crispr/cas9
US11560566B2 (en) 2017-05-12 2023-01-24 President And Fellows Of Harvard College Aptazyme-embedded guide RNAs for use with CRISPR-Cas9 in genome editing and transcriptional activation
CN107130000B (zh) 2017-05-12 2019-12-17 浙江卫未生物医药科技有限公司 一种同时敲除KRAS基因和EGFR基因的CRISPR-Cas9系统及其应用
US11692184B2 (en) 2017-05-16 2023-07-04 The Regents Of The University Of California Thermostable RNA-guided endonucleases and methods of use thereof
CN106916820B (zh) 2017-05-16 2019-09-27 吉林大学 能有效编辑猪ROSA26基因的sgRNA及其应用
CN106957830B (zh) 2017-05-16 2020-12-25 上海交通大学 一种Cas9核酸酶ΔF916及其用途
CN106967697B (zh) 2017-05-16 2021-03-26 上海交通大学 一种Cas9核酸酶G915F及其用途
CN107012250B (zh) 2017-05-16 2021-01-29 上海交通大学 一种适用于CRISPR/Cas9系统的基因组DNA片段编辑精准度的分析方法及应用
CN106939303B (zh) 2017-05-16 2021-02-23 上海交通大学 一种Cas9核酸酶R919P及其用途
CN107326042A (zh) 2017-05-16 2017-11-07 上海交通大学 水稻tms10基因的定点敲除系统及其应用
CN106957831B (zh) 2017-05-16 2021-03-12 上海交通大学 一种Cas9核酸酶K918A及其用途
CN106987570A (zh) 2017-05-16 2017-07-28 上海交通大学 一种Cas9核酸酶R780A及其用途
CN106947750B (zh) 2017-05-16 2020-12-08 上海交通大学 一种Cas9核酸酶Q920P及其用途
US20200171068A1 (en) 2017-05-18 2020-06-04 Children's National Medical Center Compositions comprising aptamers and nucleic acid payloads and methods of using the same
US20200181623A1 (en) 2017-05-18 2020-06-11 The Broad Institute, Inc. Systems, methods, and compositions for targeted nucleic acid editing
EP3625340A4 (de) 2017-05-18 2021-02-24 Cargill, Incorporated Genomeditiersystem
KR20200026804A (ko) 2017-05-18 2020-03-11 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 표적화된 핵산 편집을 위한 시스템, 방법 및 조성물
CN107043787B (zh) 2017-05-19 2017-12-26 南京医科大学 一种基于CRISPR/Cas9获得MARF1定点突变小鼠模型的构建方法和应用
CN107236737A (zh) 2017-05-19 2017-10-10 上海交通大学 特异靶向拟南芥ILK2基因的sgRNA序列及其应用
WO2018217852A1 (en) 2017-05-23 2018-11-29 Gettysburg College Crispr based tool for characterizing bacterial serovar diversity
CN107034188B (zh) 2017-05-24 2018-07-24 中山大学附属口腔医院 一种靶向骨的外泌体载体、CRISPR/Cas9基因编辑系统及应用
AU2018273968A1 (en) 2017-05-25 2019-11-28 The General Hospital Corporation Using split deaminases to limit unwanted off-target base editor deamination
WO2018217981A1 (en) 2017-05-26 2018-11-29 North Carolina State University Altered guide rnas for modulating cas9 activity and methods of use
CN107177625B (zh) 2017-05-26 2021-05-25 中国农业科学院植物保护研究所 一种定点突变的人工载体系统及定点突变方法
CN107287245B (zh) 2017-05-27 2020-03-17 南京农业大学 一种基于CRISPR/Cas9技术的Glrx1基因敲除动物模型的构建方法
CN107142272A (zh) 2017-06-05 2017-09-08 南京金斯瑞生物科技有限公司 一种控制大肠杆菌中质粒复制的方法
WO2018226855A1 (en) 2017-06-06 2018-12-13 The General Hospital Corporation Engineered crispr-cas9 nucleases
CN107177595A (zh) 2017-06-07 2017-09-19 浙江大学 用于猪CD163基因编辑的靶向sgRNA、修饰载体及其制备方法和应用
CN107034218A (zh) 2017-06-07 2017-08-11 浙江大学 用于猪APN基因编辑的靶向sgRNA、修饰载体及其制备方法和应用
CN107119071A (zh) 2017-06-07 2017-09-01 江苏三黍生物科技有限公司 一种降低植物直链淀粉含量的方法及应用
CN106987757A (zh) 2017-06-12 2017-07-28 苏州双金实业有限公司 一种耐腐蚀型奥氏体镍基合金
CN107236739A (zh) 2017-06-12 2017-10-10 上海捷易生物科技有限公司 CRISPR/SaCas9特异性敲除人CXCR4基因的方法
CN107227352A (zh) 2017-06-13 2017-10-03 西安医学院 基于eGFP的GPR120基因表达的检测方法及应用
CN107083392B (zh) 2017-06-13 2020-09-08 中国医学科学院病原生物学研究所 一种CRISPR/Cpf1基因编辑系统及其在分枝杆菌中的应用
CN107245502B (zh) 2017-06-14 2020-11-03 中国科学院武汉病毒研究所 Cd2结合蛋白(cd2ap)和其相互作用蛋白
CN107312798B (zh) 2017-06-16 2020-06-23 武汉大学 含特异靶向CCR5基因的gRNA序列的CRISPR/Cas9重组慢病毒载体及应用
CN107099850B (zh) 2017-06-19 2018-05-04 东北农业大学 一种通过酶切基因组构建CRISPR/Cas9基因组敲除文库的方法
CN107446951B (zh) 2017-06-20 2021-01-08 温氏食品集团股份有限公司 一种通过CRISPR/Cas9系统快速筛选重组鸡痘病毒的方法及其应用
CN107266541B (zh) 2017-06-20 2021-06-04 上海大学 玉米转录因子ZmbHLH167及其应用
CN107058328A (zh) 2017-06-22 2017-08-18 江苏三黍生物科技有限公司 一种提高植物直链淀粉含量的方法及应用
CN107227307A (zh) 2017-06-23 2017-10-03 东北农业大学 一种特异靶向猪IRS1基因的sgRNA导向序列及其应用
CN107119053A (zh) 2017-06-23 2017-09-01 东北农业大学 一种特异靶向猪MC4R基因的sgRNA导向序列及其应用
US9982279B1 (en) 2017-06-23 2018-05-29 Inscripta, Inc. Nucleic acid-guided nucleases
US10011849B1 (en) 2017-06-23 2018-07-03 Inscripta, Inc. Nucleic acid-guided nucleases
CN107099533A (zh) 2017-06-23 2017-08-29 东北农业大学 一种特异靶向猪IGFBP3基因的sgRNA导向序列及应用
US20200248169A1 (en) 2017-06-26 2020-08-06 The Broad Institute, Inc. Crispr/cas-cytidine deaminase based compositions, systems, and methods for targeted nucleic acid editing
CN107177631B (zh) 2017-06-26 2020-11-24 中国农业大学 利用CRISPR-CAS9技术敲除NRK细胞Slc22a2基因的方法
WO2019005884A1 (en) 2017-06-26 2019-01-03 The Broad Institute, Inc. CRISPR / CAS-ADENINE DEAMINASE COMPOSITIONS, SYSTEMS AND METHODS FOR TARGETED NUCLEIC ACID EDITION
CN107217075B (zh) 2017-06-28 2021-07-02 西安交通大学医学院第一附属医院 一种构建epo基因敲除斑马鱼动物模型的方法及引物、质粒与制备方法
CN107356793A (zh) 2017-07-01 2017-11-17 合肥东玖电气有限公司 一种防火电表箱
CN107312793A (zh) 2017-07-05 2017-11-03 新疆农业科学院园艺作物研究所 Cas9介导的番茄基因编辑载体及其应用
CN107190006A (zh) 2017-07-07 2017-09-22 南通大学附属医院 一种靶向IGF‑IR基因的sgRNA及其应用
WO2019010384A1 (en) 2017-07-07 2019-01-10 The Broad Institute, Inc. METHODS FOR DESIGNING GUIDE SEQUENCES FOR GUIDED NUCLEASES
CN107236741A (zh) 2017-07-19 2017-10-10 广州医科大学附属第五医院 一种敲除野生型T细胞TCR alpha链的gRNA及方法
CN107190008A (zh) 2017-07-19 2017-09-22 苏州吉赛基因测序科技有限公司 一种基于Crispr/cas9的捕获基因组目标序列的方法及其在高通量测序中的应用
CN107354156B (zh) 2017-07-19 2021-02-09 广州医科大学附属第五医院 一种敲除野生型T细胞TCR beta链的gRNA及方法
CN107400677B (zh) 2017-07-19 2020-05-22 江南大学 一种基于CRISPR-Cas9系统的地衣芽孢杆菌基因组编辑载体及其制备方法
CN107418974A (zh) 2017-07-28 2017-12-01 新乡医学院 一种利用单克隆细胞分选快速获得CRISPR/Cas9基因敲除稳定细胞株的方法
CN107446954A (zh) 2017-07-28 2017-12-08 新乡医学院 一种sd大鼠t细胞缺失遗传模型的制备方法
CN107435069A (zh) 2017-07-28 2017-12-05 新乡医学院 一种细胞系CRISPR/Cas9基因敲除的快速检测方法
CN107267515B (zh) 2017-07-28 2020-08-25 重庆医科大学附属儿童医院 CRISPR/Cas9靶向敲除人CNE10基因及其特异性gRNA
WO2019023680A1 (en) 2017-07-28 2019-01-31 President And Fellows Of Harvard College METHODS AND COMPOSITIONS FOR EVOLUTION OF BASIC EDITORS USING PHAGE-ASSISTED CONTINUOUS EVOLUTION (PACE)
CN107384922A (zh) 2017-07-28 2017-11-24 重庆医科大学附属儿童医院 CRISPR/Cas9靶向敲除人CNE9基因及其特异性gRNA
CN107435051B (zh) 2017-07-28 2020-06-02 新乡医学院 一种通过CRISPR/Cas9系统快速获得大片段缺失的细胞系基因敲除方法
CN107217042B (zh) 2017-07-31 2020-03-06 江苏东抗生物医药科技有限公司 一种生产无岩藻糖基化蛋白的基因工程细胞系及其建立方法
CN107446922A (zh) 2017-08-03 2017-12-08 无锡市第二人民医院 一种敲除人成骨细胞株中hepcidin基因的gRNA序列及其使用方法
CN107502618B (zh) 2017-08-08 2021-03-12 中国科学院微生物研究所 可控载体消除方法及易用型CRISPR-Cas9工具
CN107312785B (zh) 2017-08-09 2019-12-06 四川农业大学 OsKTN80b基因在降低水稻株高方面的应用
CN107365804B (zh) 2017-08-13 2019-12-20 中国人民解放军疾病预防控制所 一种使用温和噬菌体载体包装CRISPR-Cas9系统的方法
CN107384926B (zh) 2017-08-13 2020-06-26 中国人民解放军疾病预防控制所 一种靶向清除细菌耐药性质粒的CRISPR-Cas9系统及应用
CN107446923B (zh) 2017-08-13 2019-12-31 中国人民解放军疾病预防控制所 rAAV8-CRISPR-SaCas9系统及在制备乙肝治疗药物中的应用
CN107815463A (zh) 2017-08-15 2018-03-20 西南大学 CRISPR/Cas9技术介导miR167前体序列编辑体系的建立方法
CN108034656A (zh) 2017-08-16 2018-05-15 四川省农业科学院生物技术核技术研究所 与水稻红褐色颖壳性状有关的sgRNA、CRISPR/Cas9载体、载体构建、应用
CN107446924B (zh) 2017-08-16 2020-01-14 中国科学院华南植物园 一种基于CRISPR-Cas9的猕猴桃基因AcPDS编辑载体及其构建方法和应用
CN107384894B (zh) 2017-08-21 2019-10-22 华南师范大学 功能化氧化石墨烯高效运载CRISPR/Cas9用于基因编辑的方法
CN107299114B (zh) 2017-08-23 2021-08-27 中国科学院分子植物科学卓越创新中心 一种高效的酵母菌染色体融合方法
CN107557393B (zh) 2017-08-23 2020-05-08 中国科学院上海应用物理研究所 一种磁性纳米材料介导的CRISPR/Cas9 T细胞内递送系统及其制备方法和应用
CN107312795A (zh) 2017-08-24 2017-11-03 浙江省农业科学院 运用CRISPR/Cas9系统创制粉色果实番茄的基因编辑方法
CN107488649A (zh) 2017-08-25 2017-12-19 南方医科大学 一种Cpf1和p300核心结构域的融合蛋白、相应的DNA靶向激活系统和应用
CN107460196A (zh) 2017-08-25 2017-12-12 同济大学 一种免疫缺陷小鼠动物模型的构建方法及应用
CN107541525B (zh) 2017-08-26 2021-12-10 内蒙古大学 一种基于CRISPR/Cas9技术介导山羊Tβ4基因定点敲入的方法
CN107446932B (zh) 2017-08-29 2020-02-21 江西省农业科学院 一个控制水稻雄性生殖发育基因及其应用
WO2019139645A2 (en) 2017-08-30 2019-07-18 President And Fellows Of Harvard College High efficiency base editors comprising gam
CN107519492B (zh) 2017-09-06 2019-01-25 武汉迈特维尔生物科技有限公司 使用CRISPR技术敲除miR-3187-3p在冠状动脉粥样硬化性心脏病中的应用
CN107641631A (zh) 2017-09-07 2018-01-30 浙江工业大学 一种由化学转化介导的基于CRISPR/Cas9系统敲除大肠杆菌基因的方法
CN107362372B (zh) 2017-09-07 2019-01-11 佛山波若恩生物科技有限公司 使用crispr技术在冠状动脉粥样硬化性心脏病中的应用
CN107502608B (zh) 2017-09-08 2020-10-16 中山大学 用于敲除人ALDH2基因的sgRNA、ALDH2基因缺失细胞株的构建方法及应用
WO2019051097A1 (en) 2017-09-08 2019-03-14 The Regents Of The University Of California RNA-GUIDED ENDONUCLEASE FUSION POLYPEPTIDES AND METHODS OF USING SAME
CN107557455A (zh) 2017-09-15 2018-01-09 国家纳米科学中心 一种基于CRISPR‑Cas13a的特异性核酸片段的检测方法
CN107475300B (zh) 2017-09-18 2020-04-21 上海市同济医院 Ifit3-eKO1基因敲除小鼠动物模型的构建方法和应用
CN107557390A (zh) 2017-09-18 2018-01-09 江南大学 一种筛选cho细胞系高表达位点的方法
WO2019056002A1 (en) 2017-09-18 2019-03-21 President And Fellows Of Harvard College CONTINUOUS EVOLUTION FOR STABILIZED PROTEINS
CN107630042A (zh) 2017-09-19 2018-01-26 安徽大学 一种源于I型Cas系统4个cas基因的原核生物基因编辑方法
CN107557378A (zh) 2017-09-19 2018-01-09 安徽大学 一种基于I型CRISPR‑Cas系统中基因cas7‑3的真核基因编辑方法
CN107630041A (zh) 2017-09-19 2018-01-26 安徽大学 一种基于维吉尼亚链霉菌IBL14 I‑B型Cas系统的真核基因编辑方法
CN107557373A (zh) 2017-09-19 2018-01-09 安徽大学 一种基于I‑B型CRISPR‑Cas系统基因cas3的基因编辑方法
CN107523583A (zh) 2017-09-19 2017-12-29 安徽大学 一种源于I型CRISPR‑Cas系统中基因cas5‑3的原核基因编辑方法
CN107619837A (zh) 2017-09-20 2018-01-23 西北农林科技大学 利用Cas9切割核酸酶介导Ipr1定点插入获取转基因牛胎儿成纤维细胞的方法
CN107513531B (zh) 2017-09-21 2020-02-21 无锡市妇幼保健院 用于内源性过表达lncRNA-XIST的gRNA靶点序列及其应用
CN107686848A (zh) 2017-09-26 2018-02-13 中山大学孙逸仙纪念医院 转座子协同CRISPR/Cas9系统的稳定敲除单质粒载体及其应用
CN107760652A (zh) 2017-09-29 2018-03-06 华南理工大学 CRISPR/CAS9介导药物转运体靶向性敲除的caco‑2细胞模型及其方法
CN107557394A (zh) 2017-09-29 2018-01-09 南京鼓楼医院 降低CRISPR/Cas9介导的胚胎基因编辑脱靶率的方法
CN107760663A (zh) 2017-09-30 2018-03-06 新疆大学 油莎草pepc基因的克隆及表达载体的构建和应用
CN107630006B (zh) 2017-09-30 2020-09-11 山东兴瑞生物科技有限公司 一种制备tcr与hla双基因敲除的t细胞的方法
CN107828794A (zh) 2017-09-30 2018-03-23 上海市农业生物基因中心 一种水稻耐盐基因OsRR22突变体、其编码的氨基酸序列、植株及该突变体的创制方法
CN107604003A (zh) 2017-10-10 2018-01-19 南方医科大学 一种基于线性化crispr‑cas9慢病毒载体基因敲除试剂盒及其应用
WO2019075357A1 (en) 2017-10-12 2019-04-18 Wave Life Sciences Ltd. OLIGONUCLEOTIDE COMPOSITIONS AND RELATED METHODS
CN108102940B (zh) 2017-10-12 2021-07-13 中石化上海工程有限公司 一株利用CRISPR/Cas9系统敲除XKS1基因的工业酿酒酵母菌株及构建方法
CN107557381A (zh) 2017-10-12 2018-01-09 南京农业大学 一种白菜CRISPR‑Cas9基因编辑体系的建立及其应用
CN107474129B (zh) 2017-10-12 2018-10-19 江西汉氏联合干细胞科技有限公司 特异性增强crispr-cas系统基因编辑效率的方法
CN108103586A (zh) 2017-10-13 2018-06-01 上海科技大学 一种CRISPR/Cas9随机文库及其构建和应用
CN107586779B (zh) 2017-10-14 2018-08-28 天津金匙生物科技有限公司 使用crispr-cas系统对间充质干细胞进行casp3基因敲除的方法
CN107619829B (zh) 2017-10-14 2018-08-24 南京平港生物技术有限公司 使用crispr-cas系统对间充质干细胞进行gins2基因敲除的方法
CN107523567A (zh) 2017-10-16 2017-12-29 遵义医学院 一种敲除人ezrin基因增强子的食管癌细胞株的构建方法
US11795443B2 (en) 2017-10-16 2023-10-24 The Broad Institute, Inc. Uses of adenosine base editors
CN107760715B (zh) 2017-10-17 2021-12-10 张业胜 一种转基因载体及其构建方法和应用
CN107937427A (zh) 2017-10-20 2018-04-20 广东石油化工学院 一种基于CRISPR/Cas9体系的同源修复载体构建方法
US20210130800A1 (en) 2017-10-23 2021-05-06 The Broad Institute, Inc. Systems, methods, and compositions for targeted nucleic acid editing
CN107893086B (zh) 2017-10-24 2021-09-03 中国科学院武汉植物园 快速构建配对sgRNA的Cas9双元表达载体文库的方法
CN107760684B (zh) 2017-11-03 2018-09-25 上海拉德钫斯生物科技有限公司 使用crispr-cas系统对间充质干细胞进行rbm17基因敲除的方法
US20200239379A1 (en) 2017-11-05 2020-07-30 Aveterra Corp Method and Apparatus for Automated Composting of Organic Wastes
CN107858346B (zh) 2017-11-06 2020-06-16 天津大学 一种敲除酿酒酵母染色体的方法
CN107794276A (zh) 2017-11-08 2018-03-13 中国农业科学院作物科学研究所 一种crispr介导快速有效的农作物定点基因片段或等位基因替换方法和体系
US20200318086A1 (en) 2017-11-10 2020-10-08 Novozymes A/S Temperature-sensitive cas9 protein
CN107630043A (zh) 2017-11-14 2018-01-26 吉林大学 采用敲除技术建立Gadd45a敲除兔模型的方法
CN108441519A (zh) 2017-11-15 2018-08-24 中国农业大学 在crispr/cas9基因编辑中提高同源修复效率的方法
CN107858373B (zh) 2017-11-16 2020-03-17 山东省千佛山医院 内皮细胞条件性敲除ccr5基因小鼠模型的构建方法
CN107893075A (zh) 2017-11-17 2018-04-10 和元生物技术（上海）股份有限公司 CRISPR‑Cas9靶向敲除人肠癌细胞RITA基因及其特异性的sgRNA
CN108192956B (zh) 2017-11-17 2021-06-01 东南大学 一种基于Cas9核酸酶的DNA检测分析方法及其应用
CN107828874B (zh) 2017-11-20 2020-10-16 东南大学 一种基于crispr的dna检测和分型方法及其应用
CN107904261A (zh) 2017-11-21 2018-04-13 福州大学 CRISPR/Cas9纳米基因系统的制备及其在转染方面的应用
CN107653256A (zh) 2017-11-21 2018-02-02 云南省烟草农业科学研究院 一种烟草多酚氧化酶基因NtPPO1及其定点突变方法与应用
CN107893076A (zh) 2017-11-23 2018-04-10 和元生物技术（上海）股份有限公司 CRISPR‑Cas9靶向敲除人乳腺癌细胞RASSF2基因及其特异性的sgRNA
CN107937432B (zh) 2017-11-24 2020-05-01 华中农业大学 一种基于crispr系统的基因组编辑方法及其应用
CN107937501A (zh) 2017-11-24 2018-04-20 安徽师范大学 一种快速简便的筛选CRISPR/Cas基因编辑阳性对象的方法
CN107828738A (zh) 2017-11-28 2018-03-23 新乡医学院 一种dna甲基转移酶缺陷型cho细胞系及其制备方法及应用
CN107988256B (zh) 2017-12-01 2020-07-28 暨南大学 人亨廷顿基因敲入用重组载体及其构建方法和在模型猪构建中的应用
CN108148873A (zh) 2017-12-06 2018-06-12 南方医科大学 一种cav-1基因缺失斑马鱼及其制备方法
CN108570479B (zh) 2017-12-06 2020-04-03 内蒙古大学 一种基于CRISPR/Cas9技术介导绒山羊VEGF基因定点敲入的方法
CN108251423B (zh) 2017-12-07 2020-11-06 嘉兴市第一医院 CRISPR-Cas9系统特异性靶向人RSPO2基因的sgRNA及激活方法和应用
CN107974466B (zh) 2017-12-07 2020-09-29 中国科学院水生生物研究所 一种鲟鱼CRISPR/Cas9基因编辑方法
CN108315330B (zh) 2017-12-07 2020-05-19 嘉兴市第一医院 CRISPR-Cas9系统特异性靶向人RSPO2基因的sgRNA及敲除方法和应用
CN108148835A (zh) 2017-12-07 2018-06-12 和元生物技术（上海）股份有限公司 CRISPR-Cas9靶向敲除SLC30A1基因及其特异性的sgRNA
CN108103090B (zh) 2017-12-12 2021-06-15 中山大学附属第一医院 靶向RNA甲基化的RNA Cas9-m6A修饰载体系统及其构建方法和应用
CN107828826A (zh) 2017-12-12 2018-03-23 南开大学 一种体外高效获得神经干细胞的方法
CN108103098B (zh) 2017-12-14 2020-07-28 华南理工大学 一种化合物皮肤致敏体外评估细胞模型及其构建方法
CA3084825A1 (en) 2017-12-14 2019-06-20 Crispr Therapeutics Ag Novel rna-programmable endonuclease systems and their use in genome editing and other applications
WO2019118949A1 (en) 2017-12-15 2019-06-20 The Broad Institute, Inc. Systems and methods for predicting repair outcomes in genetic engineering
CN107988268A (zh) 2017-12-18 2018-05-04 湖南师范大学 一种基因敲除选育tcf25基因缺失型斑马鱼的方法
CN108018316A (zh) 2017-12-20 2018-05-11 湖南师范大学 一种基因敲除选育rmnd5b基因缺失型斑马鱼的方法
CA3084633A1 (en) 2017-12-21 2019-06-27 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for treatment of usher syndrome type 2a and/or non-syndromic autosomal recessive retinitis pigmentosa (arrp)
CN108048466B (zh) 2017-12-21 2020-02-07 嘉兴市第一医院 CRISPR-Cas13a系统特异性靶向人RSPO2基因的crRNA及系统和应用
RU2652899C1 (ru) 2017-12-28 2018-05-03 Федеральное бюджетное учреждение науки "Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора) РНК-проводники для подавления репликации вируса гепатита B и для элиминации вируса гепатита B из клетки-хозяина
CN107893080A (zh) 2017-12-29 2018-04-10 江苏省农业科学院 一种靶向大鼠Inhba基因的sgRNA及其应用
CN107988246A (zh) 2018-01-05 2018-05-04 汕头大学医学院 一种基因敲除载体及其斑马鱼胶质瘤模型
CN108103092B (zh) 2018-01-05 2021-02-12 中国农业科学院作物科学研究所 利用CRISPR-Cas系统修饰OsHPH基因获得矮化水稻的系统及其应用
CN107988229B (zh) 2018-01-05 2020-01-07 中国农业科学院作物科学研究所 一种利用CRISPR-Cas修饰OsTAC1基因获得分蘖改变的水稻的方法
CN108559760A (zh) 2018-01-09 2018-09-21 陕西师范大学 基于CRISPR靶向基因组修饰技术建立荧光素酶knock-in细胞系的方法
WO2019139951A1 (en) 2018-01-09 2019-07-18 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Detecting protein interaction sites in nucleic acids
US11268092B2 (en) 2018-01-12 2022-03-08 GenEdit, Inc. Structure-engineered guide RNA
CN108559730B (zh) 2018-01-12 2021-09-24 中国人民解放军第四军医大学 利用CRISPR/Cas9技术构建Hutat2:Fc基因敲入单核细胞的实验方法
CN108148837A (zh) 2018-01-12 2018-06-12 南京医科大学 ApoE-CRISPR/Cas9载体及其在敲除ApoE基因中的应用
CN108251451A (zh) 2018-01-16 2018-07-06 西南大学 HTT的CRISPR/Cas9-gRNA打靶序列对、质粒及其应用
CN108251452A (zh) 2018-01-17 2018-07-06 扬州大学 一种表达Cas9基因的转基因斑马鱼及其构建方法和应用
WO2019147014A1 (ko) 2018-01-23 2019-08-01 기초과학연구원 연장된 단일 가이드 rna 및 그 용도
CN108359712B (zh) 2018-02-09 2020-06-26 广东省农业科学院农业生物基因研究中心 一种快速高效筛选SgRNA靶向DNA序列的方法
CN208034188U (zh) 2018-02-09 2018-11-02 衡阳市振洋汽车配件有限公司 一种快速定位的加工孔用夹具
CN108559745A (zh) 2018-02-10 2018-09-21 和元生物技术（上海）股份有限公司 基于CRISPR-Cas9技术提高B16F10细胞转染效率的方法
CN108486145A (zh) 2018-02-12 2018-09-04 中国科学院遗传与发育生物学研究所 基于CRISPR/Cas9的植物高效同源重组方法
CN108359691B (zh) 2018-02-12 2021-09-28 中国科学院重庆绿色智能技术研究院 利用mito-CRISPR/Cas9系统敲除异常线粒体DNA的试剂盒及方法
WO2019161251A1 (en) 2018-02-15 2019-08-22 The Broad Institute, Inc. Cell data recorders and uses thereof
CN109021111B (zh) 2018-02-23 2021-12-07 上海科技大学 一种基因碱基编辑器
US20220307001A1 (en) 2018-02-27 2022-09-29 President And Fellows Of Harvard College Evolved cas9 variants and uses thereof
CN108396027A (zh) 2018-02-27 2018-08-14 和元生物技术（上海）股份有限公司 CRISPR-Cas9靶向敲除人肠癌细胞DEAF1基因及其特异性的sgRNA
CN108486159B (zh) 2018-03-01 2021-10-22 南通大学附属医院 一种敲除GRIN2D基因的CRISPR-Cas9系统及其应用
CN108342480B (zh) 2018-03-05 2022-03-01 北京医院 一种基因变异检测质控物及其制备方法
CN108410906A (zh) 2018-03-05 2018-08-17 淮海工学院 一种适用于海洋甲壳类线粒体基因组的CRISPR/Cpf1基因编辑方法
CN108410907B (zh) 2018-03-08 2021-08-27 湖南农业大学 一种基于CRISPR/Cas9技术实现HMGCR基因敲除的方法
CN108410911B (zh) 2018-03-09 2021-08-20 广西医科大学 基于CRISPR/Cas9技术构建的LMNA基因敲除的细胞系
CN108486146B (zh) 2018-03-16 2021-02-19 中国农业科学院作物科学研究所 LbCpf1-RR突变体用于CRISPR/Cpf1系统在植物基因编辑中的应用
CN108486108B (zh) 2018-03-16 2020-10-09 华南农业大学 一种敲除人hmgb1基因的细胞株及其应用
WO2019183641A1 (en) 2018-03-23 2019-09-26 Massachusetts Eye And Ear Infirmary Crispr/cas9-mediated exon-skipping approach for ush2a-associated usher syndrome
CN108384784A (zh) 2018-03-23 2018-08-10 广西医科大学 一种利用CRISPR/Cas9技术敲除Endoglin基因的方法
CN108410877A (zh) 2018-03-27 2018-08-17 和元生物技术（上海）股份有限公司 CRISPR-Cas9靶向敲除人细胞SANIL1基因及其特异性的sgRNA
CN108504685A (zh) 2018-03-27 2018-09-07 宜明细胞生物科技有限公司 一种利用CRISPR/Cas9系统同源重组修复IL-2RG缺陷基因的方法
CN108424931A (zh) 2018-03-29 2018-08-21 内蒙古大学 CRISPR/Cas9技术介导山羊VEGF基因定点整合的方法
CN108486234B (zh) 2018-03-29 2022-02-11 东南大学 一种crispr分型pcr的方法及其应用
CN108441520B (zh) 2018-04-04 2020-07-31 苏州大学 利用CRISPR/Cas9系统构建的基因条件性敲除方法
CN108504693A (zh) 2018-04-04 2018-09-07 首都医科大学附属北京朝阳医院 利用Crispr技术敲除T合酶基因构建的O-型糖基化异常的结肠癌细胞系
CN108486111A (zh) 2018-04-04 2018-09-04 山西医科大学 CRISPR-Cas9靶向敲除人SMYD3基因的方法及其特异性sgRNA
CN108753772B (zh) 2018-04-04 2020-10-30 南华大学 基于CRISPR/Cas技术敲除CAPNS1基因的人神经母细胞瘤细胞系的构建方法
CN108486154A (zh) 2018-04-04 2018-09-04 福州大学 一种唾液酸酶基因敲除小鼠模型的构建方法及其应用
CN108504657B (zh) 2018-04-12 2019-06-14 中南民族大学 利用crispr-cas9技术敲除hek293t细胞kdm2a基因的方法
CN108588182A (zh) 2018-04-13 2018-09-28 中国科学院深圳先进技术研究院 基于crispr-链取代的等温扩增及检测技术
CN108753817A (zh) 2018-04-13 2018-11-06 北京华伟康信生物科技有限公司 增强细胞的抗癌能力的方法及采用该方法获得的增强型细胞
WO2019204369A1 (en) 2018-04-17 2019-10-24 Applied Stemcell, Inc. Compositions and methods for treating spinal muscular atrophy
CN108753832A (zh) 2018-04-20 2018-11-06 中山大学 一种利用CRISPR/Cas9编辑大白猪CD163基因的方法
CN108823248A (zh) 2018-04-20 2018-11-16 中山大学 一种利用CRISPR/Cas9编辑陆川猪CD163基因的方法
CN108588071A (zh) 2018-04-25 2018-09-28 和元生物技术（上海）股份有限公司 CRISPR-Cas9靶向敲除人肠癌细胞CNR1基因及其特异性的sgRNA
CN108546712B (zh) 2018-04-26 2020-08-07 中国农业科学院作物科学研究所 一种利用CRISPR/LbCpf1系统实现目的基因在植物中同源重组的方法
CN108588128A (zh) 2018-04-26 2018-09-28 南昌大学 一种高效率大豆CRISPR/Cas9系统的构建方法及应用
CN108707621B (zh) 2018-04-26 2021-02-12 中国农业科学院作物科学研究所 一种CRISPR/Cpf1系统介导的以RNA转录本为修复模板的同源重组方法
CN108642053A (zh) 2018-04-28 2018-10-12 和元生物技术（上海）股份有限公司 CRISPR-Cas9靶向敲除人肠癌细胞PPP1R1C基因及其特异性的sgRNA
CN108611364A (zh) 2018-05-03 2018-10-02 南京农业大学 一种非转基因crispr突变体的制备方法
CN108588123A (zh) 2018-05-07 2018-09-28 南京医科大学 CRISPR/Cas9载体组合在制备基因敲除猪的血液制品中的应用
CA3100019A1 (en) 2018-05-11 2019-11-14 Beam Therapeutics Inc. Methods of substituting pathogenic amino acids using programmable base editor systems
CN108610399B (zh) 2018-05-14 2019-09-27 河北万玛生物医药有限公司 特异性增强crispr-cas系统在表皮干细胞中进行基因编辑效率的方法
CN108546717A (zh) 2018-05-15 2018-09-18 吉林大学 反义lncRNA介导顺式调控抑制靶基因表达的方法
CN108624622A (zh) 2018-05-16 2018-10-09 湖南艾佳生物科技股份有限公司 一种基于CRISPR-Cas9系统构建的能分泌小鼠白细胞介素-6的基因工程细胞株
CN108546718B (zh) 2018-05-16 2021-07-09 康春生 crRNA介导的CRISPR/Cas13a基因编辑系统在肿瘤细胞中的应用
CN108642055B (zh) 2018-05-17 2021-12-03 吉林大学 能有效编辑猪miR-17-92基因簇的sgRNA
CN108642078A (zh) 2018-05-18 2018-10-12 江苏省农业科学院 基于CRISPR/Cas9基因编辑技术选育绿豆开花传粉突变体的方法及专用gRNA
CN108642090A (zh) 2018-05-18 2018-10-12 中国人民解放军总医院 基于CRISPR/Cas9技术获得Nogo-B敲除模式小鼠的方法及应用
CN108642077A (zh) 2018-05-18 2018-10-12 江苏省农业科学院 基于CRISPR/Cas9基因编辑技术选育绿豆不育突变体的方法及专用gRNA
CN108559732A (zh) 2018-05-21 2018-09-21 陕西师范大学 基于CRISPR/Cas9靶向基因组修饰技术建立KI-T2A-luciferase细胞系的方法
CN108707620A (zh) 2018-05-22 2018-10-26 西北农林科技大学 一种Gene drive载体及构建方法
EP3797160A1 (de) 2018-05-23 2021-03-31 The Broad Institute Inc. Baseneditoren und verwendungen davon
US11117812B2 (en) 2018-05-24 2021-09-14 Aqua-Aerobic Systems, Inc. System and method of solids conditioning in a filtration system
CN108690844B (zh) 2018-05-25 2021-10-15 西南大学 HTT的CRISPR/Cas9-gRNA打靶序列对、质粒及HD细胞模型
CN108707629A (zh) 2018-05-28 2018-10-26 上海海洋大学 斑马鱼notch1b基因突变体的制备方法
CN108823249A (zh) 2018-05-28 2018-11-16 上海海洋大学 CRISPR/Cas9构建notch1a突变体斑马鱼的方法
CN108707628B (zh) 2018-05-28 2021-11-23 上海海洋大学 斑马鱼notch2基因突变体的制备方法
CN108753835A (zh) 2018-05-30 2018-11-06 中山大学 一种利用CRISPR/Cas9编辑猪BMP15基因的方法
CN108707604B (zh) 2018-05-30 2019-07-23 江西汉氏联合干细胞科技有限公司 表皮干细胞中采用CRISPR-Cas系统进行CNE10基因敲除
CN108753836B (zh) 2018-06-04 2021-10-12 北京大学 一种利用rna干扰机制的基因调控或编辑系统
CN108715850B (zh) 2018-06-05 2020-10-23 艾一生命科技(广东)有限公司 表皮干细胞中采用CRISPR-Cas系统进行GING2基因敲除
WO2019236566A1 (en) 2018-06-05 2019-12-12 Lifeedit, Inc. Rna-guided nucleases and active fragments and variants thereof and methods of use
CN108753813B (zh) 2018-06-08 2021-08-24 中国水稻研究所 获得无标记转基因植物的方法
CN108753783A (zh) 2018-06-13 2018-11-06 上海市同济医院 Sqstm1全基因敲除小鼠动物模型的构建方法和应用
US11913044B2 (en) 2018-06-14 2024-02-27 President And Fellows Of Harvard College Evolution of cytidine deaminases
CN108728486A (zh) 2018-06-20 2018-11-02 江苏省农业科学院 一种茄子CRISPR/Cas9基因敲除载体的构建方法和应用
CN108841845A (zh) 2018-06-21 2018-11-20 广东石油化工学院 一种带有筛选标记的CRISPR/Cas9载体及其构建方法
CN108893529A (zh) 2018-06-25 2018-11-27 武汉博杰生物医学科技有限公司 一种基于CRISPR技术特异性检测人KRAS基因2号及3号外显子突变的crRNA
CN108866093B (zh) 2018-07-04 2021-07-09 广东三杰牧草生物科技有限公司 一种利用CRISPR/Cas9系统对紫花苜蓿基因定点突变的方法
CN108913714A (zh) 2018-07-05 2018-11-30 江西省超级水稻研究发展中心 一种利用CRISPR/Cas9系统敲除BADH2基因创制香稻的方法
CN108795902A (zh) 2018-07-05 2018-11-13 深圳三智医学科技有限公司 一种安全高效的CRISPR/Cas9基因编辑技术
WO2020014261A1 (en) 2018-07-09 2020-01-16 The Broad Institute, Inc. Rna programmable epigenetic rna modifiers and uses thereof
CN108913691B (zh) 2018-07-16 2020-09-01 山东华御生物科技有限公司 表皮干细胞中采用CRISPR-Cas系统进行Card3基因敲除
CN108913664B (zh) 2018-07-20 2020-09-04 嘉兴学院 一种CRISPR/Cas9基因编辑方法敲除卵巢癌细胞中CFP1基因的方法
CN108853133A (zh) 2018-07-25 2018-11-23 福州大学 一种PAMAM与CRISPR/Cas9系统重组质粒递送纳米粒的制备方法
CN108823291B (zh) 2018-07-25 2022-04-12 领航医学科技(深圳)有限公司 基于crispr技术的特异性核酸片段定量检测方法
KR20210053898A (ko) 2018-07-31 2021-05-12 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 신규 crispr 효소 및 시스템
CN108913717A (zh) 2018-08-01 2018-11-30 河南农业大学 一种利用CRISPR/Cas9系统对水稻PHYB基因定点突变的方法
KR20210041008A (ko) 2018-08-03 2021-04-14 빔 테라퓨틱스, 인크. 핵산 표적 서열을 변형시키기 위한 다중-이펙터 핵염기 편집기 및 이를 이용하는 방법
WO2020041751A1 (en) 2018-08-23 2020-02-27 The Broad Institute, Inc. Cas9 variants having non-canonical pam specificities and uses thereof
EP3844272A1 (de) 2018-08-28 2021-07-07 Flagship Pioneering Innovations VI, LLC Verfahren und zusammensetzungen zum modulieren eines genoms
WO2020051360A1 (en) 2018-09-05 2020-03-12 The Broad Institute, Inc. Base editing for treating hutchinson-gilford progeria syndrome
WO2020069331A1 (en) 2018-09-28 2020-04-02 The Jackson Laboratory Artificial rna-guided splicing factors
US20220290113A1 (en) 2018-10-15 2022-09-15 University Of Massachusetts Programmable dna base editing by nme2cas9-deaminase fusion proteins
US20220380740A1 (en) 2018-10-24 2022-12-01 The Broad Institute, Inc. Constructs for improved hdr-dependent genomic editing
WO2020092453A1 (en) 2018-10-29 2020-05-07 The Broad Institute, Inc. Nucleobase editors comprising geocas9 and uses thereof
WO2020102659A1 (en) 2018-11-15 2020-05-22 The Broad Institute, Inc. G-to-t base editors and uses thereof
EP3880717A4 (de) 2018-11-16 2022-11-23 The Regents of The University of California Zusammensetzungen und verfahren zur freisetzung von crispr/cas-effektor-polypeptiden
CN109517841B (zh) 2018-12-05 2020-10-30 华东师范大学 一种用于核苷酸序列修饰的组合物、方法与应用
US20230002745A1 (en) 2019-01-23 2023-01-05 The Broad Institute, Inc. Supernegatively charged proteins and uses thereof
JP2022523302A (ja) 2019-01-28 2022-04-22 プロキューアール セラピューティクス ツー ベスローテン フェンノートシャップ アッシャー症候群の処置のためのｒｎａ編集オリゴヌクレオチド
KR20210121092A (ko) 2019-01-29 2021-10-07 유니버시티 오브 워싱턴 유전자 편집 방법
EP3918077A4 (de) 2019-01-31 2023-03-29 Beam Therapeutics, Inc. Nukleobaseneditoren mit reduzierter off-target-deaminierung und verfahren zu deren verwendung zur modifizierung einer nukleobasenzielsequenz
US20220177877A1 (en) 2019-03-04 2022-06-09 President And Fellows Of Harvard College Highly multiplexed base editing
WO2020181178A1 (en) 2019-03-06 2020-09-10 The Broad Institute, Inc. T:a to a:t base editing through thymine alkylation
WO2020181195A1 (en) 2019-03-06 2020-09-10 The Broad Institute, Inc. T:a to a:t base editing through adenine excision
US20220170013A1 (en) 2019-03-06 2022-06-02 The Broad Institute, Inc. T:a to a:t base editing through adenosine methylation
WO2020181180A1 (en) 2019-03-06 2020-09-10 The Broad Institute, Inc. A:t to c:g base editors and uses thereof
WO2020181202A1 (en) 2019-03-06 2020-09-10 The Broad Institute, Inc. A:t to t:a base editing through adenine deamination and oxidation
CA3130488A1 (en) 2019-03-19 2020-09-24 David R. Liu Methods and compositions for editing nucleotide sequences
WO2020210751A1 (en) 2019-04-12 2020-10-15 The Broad Institute, Inc. System for genome editing
WO2020214842A1 (en) 2019-04-17 2020-10-22 The Broad Institute, Inc. Adenine base editors with reduced off-target effects
US20220249697A1 (en) 2019-05-20 2022-08-11 The Broad Institute, Inc. Aav delivery of nucleobase editors
WO2020247587A1 (en) 2019-06-06 2020-12-10 Inscripta, Inc. Curing for recursive nucleic acid-guided cell editing
US20220259609A1 (en) 2019-07-30 2022-08-18 Pairwise Plants Services, Inc. Morphogenic regulators and methods of using the same
US20220315906A1 (en) 2019-08-08 2022-10-06 The Broad Institute, Inc. Base editors with diversified targeting scope
WO2021030666A1 (en) 2019-08-15 2021-02-18 The Broad Institute, Inc. Base editing by transglycosylation
WO2021042047A1 (en) 2019-08-30 2021-03-04 The General Hospital Corporation C-to-g transversion dna base editors
EP4021945A4 (de) 2019-08-30 2023-11-15 The General Hospital Corporation Kombinatorische adenin- und cytosin-dna-baseneditoren
WO2021072328A1 (en) 2019-10-10 2021-04-15 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for prime editing rna
US20220411768A1 (en) 2019-10-21 2022-12-29 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Methods of performing rna templated genome editing
WO2021081264A1 (en) 2019-10-24 2021-04-29 Pairwise Plants Services, Inc. Optimized crispr-cas nucleases and base editors and methods of use thereof
JP2023501223A (ja) 2019-10-30 2023-01-18 ペアーワイズ プランツ サービシズ， インコーポレイテッド Ｖ型ｃｒｉｓｐｒ－ｃａｓ塩基エディタおよびその使用方法
US20230086199A1 (en) 2019-11-26 2023-03-23 The Broad Institute, Inc. Systems and methods for evaluating cas9-independent off-target editing of nucleic acids
WO2021138469A1 (en) 2019-12-30 2021-07-08 The Broad Institute, Inc. Genome editing using reverse transcriptase enabled and fully active crispr complexes
EP4097124A1 (de) 2020-01-28 2022-12-07 The Broad Institute Inc. Baseneditoren, zusammensetzungen und verfahren zur modifizierung des mitochondrialen genoms
WO2021158995A1 (en) 2020-02-05 2021-08-12 The Broad Institute, Inc. Base editor predictive algorithm and method of use
WO2021158999A1 (en) 2020-02-05 2021-08-12 The Broad Institute, Inc. Gene editing methods for treating spinal muscular atrophy
WO2021158921A2 (en) 2020-02-05 2021-08-12 The Broad Institute, Inc. Adenine base editors and uses thereof
CA3174537A1 (en) 2020-03-04 2021-09-10 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Methods and compositions for modulating a genome
KR20230053735A (ko) 2020-03-04 2023-04-21 플래그쉽 파이어니어링 이노베이션스 브이아이, 엘엘씨 게놈의 조정을 위한 개선된 방법 및 조성물
CN116209756A (zh) 2020-03-04 2023-06-02 旗舰先锋创新Vi有限责任公司 调控基因组的方法和组合物
EP4114928A1 (de) 2020-03-05 2023-01-11 Flagship Pioneering Innovations VI, LLC Wirtsabwehrunterdrückende verfahren und zusammensetzungen zur modulation eines genoms
US20230127008A1 (en) 2020-03-11 2023-04-27 The Broad Institute, Inc. Stat3-targeted base editor therapeutics for the treatment of melanoma and other cancers
WO2021188840A1 (en) * 2020-03-19 2021-09-23 Rewrite Therapeutics, Inc. Methods and compositions for directed genome editing
US20230159913A1 (en) 2020-04-28 2023-05-25 The Broad Institute, Inc. Targeted base editing of the ush2a gene
GB2614813A (en) 2020-05-08 2023-07-19 Harvard College Methods and compositions for simultaneous editing of both strands of a target double-stranded nucleotide sequence
WO2022060185A1 (ko) 2020-09-18 2022-03-24 기초과학연구원 표적화된 탈아미노효소 및 이를 이용한 염기 교정
AU2022342169A1 (en) 2021-09-08 2024-03-28 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Hbb-modulating compositions and methods
WO2023039447A2 (en) 2021-09-08 2023-03-16 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Serpina-modulating compositions and methods

Patent Citations (74)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4217344A (en) 1976-06-23 1980-08-12 L'oreal Compositions containing aqueous dispersions of lipid spheres
US4235871A (en) 1978-02-24 1980-11-25 Papahadjopoulos Demetrios P Method of encapsulating biologically active materials in lipid vesicles
US4186183A (en) 1978-03-29 1980-01-29 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Liposome carriers in chemotherapy of leishmaniasis
US4261975A (en) 1979-09-19 1981-04-14 Merck & Co., Inc. Viral liposome particle
US4663290A (en) 1982-01-21 1987-05-05 Molecular Genetics, Inc. Production of reverse transcriptase
US4485054A (en) 1982-10-04 1984-11-27 Lipoderm Pharmaceuticals Limited Method of encapsulating biologically active materials in multilamellar lipid vesicles (MLV)
US4501728A (en) 1983-01-06 1985-02-26 Technology Unlimited, Inc. Masking of liposomes from RES recognition
US4880635B1 (en) 1984-08-08 1996-07-02 Liposome Company Dehydrated liposomes
US4880635A (en) 1984-08-08 1989-11-14 The Liposome Company, Inc. Dehydrated liposomes
US4897355A (en) 1985-01-07 1990-01-30 Syntex (U.S.A.) Inc. N[ω,(ω-1)-dialkyloxy]- and N-[ω,(ω-1)-dialkenyloxy]-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
US5049386A (en) 1985-01-07 1991-09-17 Syntex (U.S.A.) Inc. N-ω,(ω-1)-dialkyloxy)- and N-(ω,(ω-1)-dialkenyloxy)Alk-1-YL-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
US4946787A (en) 1985-01-07 1990-08-07 Syntex (U.S.A.) Inc. N-(ω,(ω-1)-dialkyloxy)- and N-(ω,(ω-1)-dialkenyloxy)-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
US4797368A (en) 1985-03-15 1989-01-10 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Adeno-associated virus as eukaryotic expression vector
US4921757A (en) 1985-04-26 1990-05-01 Massachusetts Institute Of Technology System for delayed and pulsed release of biologically active substances
US4774085A (en) 1985-07-09 1988-09-27 501 Board of Regents, Univ. of Texas Pharmaceutical administration systems containing a mixture of immunomodulators
US5139941A (en) 1985-10-31 1992-08-18 University Of Florida Research Foundation, Inc. AAV transduction vectors
US4889818A (en) 1986-08-22 1989-12-26 Cetus Corporation Purified thermostable enzyme
US5374553A (en) 1986-08-22 1994-12-20 Hoffmann-La Roche Inc. DNA encoding a thermostable nucleic acid polymerase enzyme from thermotoga maritima
US5079352A (en) 1986-08-22 1992-01-07 Cetus Corporation Purified thermostable enzyme
US4837028A (en) 1986-12-24 1989-06-06 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US4920016A (en) 1986-12-24 1990-04-24 Linear Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US4906477A (en) 1987-02-09 1990-03-06 Kabushiki Kaisha Vitamin Kenkyusyo Antineoplastic agent-entrapping liposomes
US4911928A (en) 1987-03-13 1990-03-27 Micro-Pak, Inc. Paucilamellar lipid vesicles
US4917951A (en) 1987-07-28 1990-04-17 Micro-Pak, Inc. Lipid vesicles formed of surfactants and steroids
US5244797B1 (en) 1988-01-13 1998-08-25 Life Technologies Inc Cloned genes encoding reverse transcriptase lacking rnase h activity
US5244797A (en) 1988-01-13 1993-09-14 Life Technologies, Inc. Cloned genes encoding reverse transcriptase lacking RNase H activity
US4965185A (en) 1988-06-22 1990-10-23 Grischenko Valentin I Method for low-temperature preservation of embryos
US5270179A (en) 1989-08-10 1993-12-14 Life Technologies, Inc. Cloning and expression of T5 DNA polymerase reduced in 3'- to-5' exonuclease activity
US5047342A (en) 1989-08-10 1991-09-10 Life Technologies, Inc. Cloning and expression of T5 DNA polymerase
WO1991016024A1 (en) 1990-04-19 1991-10-31 Vical, Inc. Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules
WO1991017424A1 (en) 1990-05-03 1991-11-14 Vical, Inc. Intracellular delivery of biologically active substances by means of self-assembling lipid complexes
WO1992006200A1 (en) 1990-09-28 1992-04-16 F. Hoffmann-La-Roche Ag 5' to 3' exonuclease mutations of thermostable dna polymerases
WO1992006188A2 (en) 1990-10-05 1992-04-16 Barnes Wayne M Thermostable dna polymerase
US5173414A (en) 1990-10-30 1992-12-22 Applied Immune Sciences, Inc. Production of recombinant adeno-associated virus vectors
WO1993024641A2 (en) 1992-06-02 1993-12-09 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services Adeno-associated virus with inverted terminal repeat sequences as promoter
US5496714A (en) 1992-12-09 1996-03-05 New England Biolabs, Inc. Modification of protein by use of a controllable interveining protein sequence
US5834247A (en) 1992-12-09 1998-11-10 New England Biolabs, Inc. Modified proteins comprising controllable intervening protein sequences or their elements methods of producing same and methods for purification of a target protein comprised by a modified protein
US5436149A (en) 1993-02-19 1995-07-25 Barnes; Wayne M. Thermostable DNA polymerase with enhanced thermostability and enhanced length and efficiency of primer extension
US5512462A (en) 1994-02-25 1996-04-30 Hoffmann-La Roche Inc. Methods and reagents for the polymerase chain reaction amplification of long DNA sequences
WO1996010640A1 (en) 1994-09-30 1996-04-11 Life Technologies, Inc. Cloned dna polymerases from thermotoga neapolitana and mutants thereof
US5614365A (en) 1994-10-17 1997-03-25 President & Fellow Of Harvard College DNA polymerase having modified nucleotide binding site for DNA sequencing
US5677152A (en) 1995-08-25 1997-10-14 Roche Molecular Systems, Inc. Nucleic acid amplification using a reersibly inactivated thermostable enzyme
US5962313A (en) 1996-01-18 1999-10-05 Avigen, Inc. Adeno-associated virus vectors comprising a gene encoding a lyosomal enzyme
US6183998B1 (en) 1998-05-29 2001-02-06 Qiagen Gmbh Max-Volmer-Strasse 4 Method for reversible modification of thermostable enzymes
US20030087817A1 (en) 1999-01-12 2003-05-08 Sangamo Biosciences, Inc. Regulation of endogenous gene expression in cells using zinc finger proteins
US6479264B1 (en) 1999-08-27 2002-11-12 Advanced Biotechnologies Limited Reversible inactivation enzymes
WO2001038547A2 (en) 1999-11-24 2001-05-31 Mcs Micro Carrier Systems Gmbh Polypeptides comprising multimers of nuclear localization signals or of protein transduction domains and their use for transferring molecules into cells
KR100710351B1 (ko) 2004-06-28 2007-04-23 엘지전자 주식회사 접착형 유기 ｅｌ 디스플레이
US20120322861A1 (en) 2007-02-23 2012-12-20 Barry John Byrne Compositions and Methods for Treating Diseases
US9023594B2 (en) 2008-09-05 2015-05-05 President And Fellows Of Harvard College Continuous directed evolution of proteins and nucleic acids
WO2010028347A2 (en) 2008-09-05 2010-03-11 President & Fellows Of Harvard College Continuous directed evolution of proteins and nucleic acids
US20110059502A1 (en) 2009-09-07 2011-03-10 Chalasani Sreekanth H Multiple domain proteins
US8440432B2 (en) 2009-12-10 2013-05-14 Regents Of The University Of Minnesota Tal effector-mediated DNA modification
US8440431B2 (en) 2009-12-10 2013-05-14 Regents Of The University Of Minnesota TAL effector-mediated DNA modification
US8450471B2 (en) 2009-12-10 2013-05-28 Regents Of The University Of Minnesota TAL effector-mediated DNA modification
US8822663B2 (en) 2010-08-06 2014-09-02 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
WO2012088381A2 (en) 2010-12-22 2012-06-28 President And Fellows Of Harvard College Continuous directed evolution
ES2740248T3 (es) 2011-06-08 2020-02-05 Translate Bio Inc Composiciones de nanopartículas lipídicas y métodos para la administración ARNm
EP2755986A1 (de) 2011-09-12 2014-07-23 Moderna Therapeutics, Inc. Manipulierte nukleinsäuren und anwendungsverfahren dafür
EP2755693A2 (de) 2011-09-12 2014-07-23 Moderna Therapeutics, Inc. Manipulierte nukleinsäuren und anwendungsverfahren dafür
WO2013045632A1 (en) 2011-09-28 2013-04-04 Era Biotech, S.A. Split inteins and uses thereof
EP2877490A2 (de) 2012-06-27 2015-06-03 The Trustees Of Princeton University Geteilte inteine, konjugate davon und verwendungen davon
US20140028330A1 (en) 2012-07-26 2014-01-30 General Electric Company Method and system for improved wireless sensing
US9181535B2 (en) 2012-09-24 2015-11-10 The Chinese University Of Hong Kong Transcription activator-like effector nucleases (TALENs)
WO2014055782A1 (en) 2012-10-03 2014-04-10 Agrivida, Inc. Intein-modified proteases, their production and industrial applications
WO2014152940A1 (en) 2013-03-14 2014-09-25 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Mrna therapeutic compositions and use to treat diseases and disorders
WO2015027134A1 (en) 2013-08-22 2015-02-26 President And Fellows Of Harvard College Engineered transcription activator-like effector (tale) domains and uses thereof
US9526784B2 (en) 2013-09-06 2016-12-27 President And Fellows Of Harvard College Delivery system for functional nucleases
US9737604B2 (en) 2013-09-06 2017-08-22 President And Fellows Of Harvard College Use of cationic lipids to deliver CAS9
WO2015134121A2 (en) 2014-01-20 2015-09-11 President And Fellows Of Harvard College Negative selection and stringency modulation in continuous evolution systems
EP3450553B1 (de) 2014-03-24 2019-12-25 Translate Bio, Inc. Mrna-therapie zur behandlung von augenerkrankungen
WO2016069774A1 (en) 2014-10-28 2016-05-06 Agrivida, Inc. Methods and compositions for stabilizing trans-splicing intein modified proteases
WO2016168631A1 (en) 2015-04-17 2016-10-20 President And Fellows Of Harvard College Vector-based mutagenesis system
EP3362461A1 (de) 2015-10-16 2018-08-22 Modernatx, Inc. Mrna-cap-analoga mit modifizierter phosphatverbindung

Non-Patent Citations (52)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
„Gene delivery to skeletal muscle results in sustained expression and systemic delivery of a therapeutic protein". Kessler PD, Podsakoff GM, Chen X, McQuiston SA, Colosi PC, Matelis LA, Kurtzman GJ, Byme BJ. Proc Natl Acad Sei USA. 1996 Nov 26;93(24):14082-7
A. R. Gruber et al., 2008, Cell 106(1): 23-24; und PA Carr und GM Church, 2009, Nature Biotechnology 27(12): 1151-62
akte Nr. B1195.70074US00
akte Nr. B1195.70083US02
Anderson, Science 256:808-813 (1992); Nabel & Felgner, TIBTECH 11:211-217 (1993); Mitani & Caskey, TIBTECH 11:162-166 (1993); Dillon, TIBTECH 11:167-175 (1993); Miller, Nature 357:455-460 (1992); Van Brunt, Biotechnology 6(10):1149-1154 (1988); Vigne, Restorative Neurology and Neuroscience 8:35-36 (1995); Kremer & Perricaudet, British Medical Bulletin 51(1):31-44 (1995); Haddada et al., in Current Topics in Microbiology and Immunology Doerfler and Bihm (eds) (1995); and Yu et al., Gene Therapy 1 :13-26 (1994
B1 195.70074US04
B1 195.70074US06
B1 195.70083US00
B1 195.70083US01
B1195.70074US01
B1195.70074US02
B1195.70074US03
B1195.70074US05
B1195.70083US03
Bagynszky et al. „Characterization of mutations in PRNP (prion) gene and their possible roles in neurodegenerative disease", Neuropsychiatr Dis Treat., 2018; 14: 2067-2085
Barnes, W. M., Gene 112:29-35 (1992); Lawyer, F. C., et al., PCR Meth. Appl. 2:275-287 (1993); Flaman, J.-M, et al., Nuc. Acids Res. 22(15): 3259- 3260(1994
Bebenek et al. „Error-prone Polymerization by HIV-1 Reverse Transcriptase", JBiol Chem, 1993, Vol. 268: 10324-10334
Berger et al. In Biochemistry 22:2365-2372 (1983
BI-2013/004A
Boch et al., „Breaking the Code of DNA Binding Specificity of TAL-Type III Effectors", Science, Bd. 326, S. 1509-1512 (2009), Bogdanove et al., TAL Effectors: Customizable Proteins for DNA Targeting, Science, Bd. 333, S. 1843-1846 (2011), Cade et al., „Highly efficient generation of heritable zebrafish gene mutations using homo- and heterodimeric TALENs", Nucleic Acids Research, Bd. 40, S. 8001-8010 (2012
Brown et al., „Serine recombinases as tools for genome engineering" Methods. 2011 ;53(4):372-9; Hirano et al., „Site-specific recombinases as tools for heterologous gene integration." Appl. Microbiol. Biotechnol. 2011; 92(2):227-39; Chavez und Calos, „Therapeutic applications of the ΦC31 integrase system." Curr. Gene Ther. 2011;11(5):375-81; Turan und Bode, „Site-specific recombinases: from tag-and-target- to tag-and-exchange-based genomic modifications." FASEB J. 2011; 25(12):4088-107; Venken und Bellen, „Genome-wide manipulations of Drosophila melanogaster with transposons, Flp recombinase, and ΦC31 integrase." Methods Mol. Biol. 2012; 859:203-28; Murphy, „Phage recombinases and their applications" Adv. Virus Res. 2012; 83:367-414; Zhang et al., „Conditional gene manipulation: Cre-ating a new biological era." J. Zhejiang Univ. Sci. B. 2012; 13(7):511-24; Karpenshif und Bernstein, „From yeast to mammals: recent advances in genetic control of homologous recombination." DNA-Reparatur (A
Buchscher et al ., J. Virol. 66:2731-2739 (1992); Johann et al., J. Virol. 66:1635-1640 (1992); Sommnerfelt et al., Virol. 176:58-59 (1990); Wilson et al., J. Virol. 63:2374-2378 (1989); Miller et al., J. Virol. 65:2220-2224 (1991); PCT/US94/05700
Camarero und Muir, J. Amer. Chem. Soc., 121:5597-5598 (1999); Chong, et al., Gene, 192:271-281 (1997), Chong, et al., Nucleic Acids Res., 26:5109-5115 (1998); Chong, et al., J. Biol. Chem., 273:10567-10577 (1998); Cotton, et al. J. Am. Chem. Soc., 121:1100-1101 (1999); Evans, et al., J. Biol. Chem., 274:18359-18363 (1999); Evans, et al., J. Biol. Chem., 274:3923-3926 (1999); Evans, et al., Protein Sci., 7:2256-2264 (1998); Evans, et al., J. Biol. Chem., 275:9091-9094 (2000); Iwai und Pluckthun, FEBS Lett. 459:166-172 (1999); Mathys, et al., Gene, 231:1-13 (1999); Mills, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:3543-3548 (1998); Muir, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:6705-6710 (1998); Otomo, et al., Biochemistry 38:16040-16044 (1999); Otomo, et al., J. Biolmol. NMR 14:105-114 (1999); Scott, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:13638-13643 (1999); Severinov und Muir, J. Biol. Chem., 273:16205-16209 (1998); Shingledecker, et al., Gene, 207:187-195 (1998); Southworth, et al., EMBO J. 17
Carroll et al. „Genome Engineering with Zinc-Finger Nucleases", Genetics, Aug 2011, Vol. 188: 773-782; Durai et al. „Zinc finger nucleases: custom-designed molecular scissors for genome engineering of plant and mammalian cells," Nucleic Acids Res, 2005, Vol. 33: 5978-90
Crystal, Science 270:404-410 (1995); Blaese et al., Cancer Gen Ther. 2:291-297 (1995); Behr et al., Bioconjugate Chem. 5:382-389 (1994); Remy et al., Bioconjugate Chem. 5:647-654 (1994); Gao et al., Gene Therapy 2:710-722 (1995); Ahmad et al., Cancer Res. 52:4817-4820 (1992
Curtis A. Machida. „Methods in Molecular Medicine™. Viral Vectors for Gene Therapy Methods and Protocols." 10.1385/1-59259-304-6:201
Gaj et al. „ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering," Trends Biotechnol. 2013, Vol.31: 397-405
Gerard, G. R., DNA 5:271-279 (1986) und Kotewicz, M. L., et al., Gene 35:249-258 (1985
Gerard, G. R., DNA:271-79 (1986); Kotewicz, M. L., et al., Gene 35:249-58 (1985); Tanese, N., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA):4944-48 (1985); Roth, M. J., at al., J. Biol. Chem. 260:9326-35 (1985); Michel, F., et al., Nature 316:641-43 (1985); Akins, R. A., et al., Cell 47:505-16 (1986), EMBO J. 4:1267-75 (1985); und Fawcett, D. F., Cell 47:1007-15 (1986
Groth et al., „Phage integrases: biology and applications" J. Mol. Biol. 2004; 335, 667-678; Gordley et al., „Synthese von programmierbaren Integrasen" Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 2009; 106, 5053-5058
Guo et al., „Structure of Cre recombinase complexed with DNA in a site-specific recombination synapse" Nature. 1997; 389:40-46; Hartung et al., „Cre mutants with altered DNA binding properties" J Biol Chem 1998; 273:22884-22891; Shaikh et al., „Chimeras of the Flp and Cre recombinases: Tests of the mode of cleavage by Flp and Cre. J Mol Biol. 2000; 302:27-48; Rongrong et al., „Effect of deletion mutation on the recombination activity of Cre recombinase" Acta Biochim Pol. 2005; 52:541-544; Kilbride et al., „Determinants of product topology in a hybrid Cre-Tn3 resolvase site-specific recombination system" J Mol Biol. 2006; 355:185-195; Warren et al., „A chimeric cre recombinase with regulated directionality" Proc Natl Acad Sci USA. 2008 105:18278-18283; Van Duyne, „Teaching Cre to follow directions" Proc Natl Acad Sci USA. 2009 Jan 6;106(1):4-5; Numrych et al., „A comparison of the effects of single-base and triple-base changes in the integrase armtype binding sites on the site-specific
Johansson et al. „RNA recognition by the MS2 phage coat protein", Sein Virol, 1997, Vol. 8(3): 176-185; Delebecque et al. „Organization of intracellular reactions with rationally designed RNA assemblies," Science, 2011, Vol. 333: 470-474; Mali et al. „Cas9 transcriptional activators for target specificity screening and paired nickases for cooperative genome engineering", Nat. Biotechnol., 2013, Vol.31: 833-838; und Zalatan et al. „Engineering complex synthetic transcriptional programs with CRISPR RNA scaffolds", Cell, 2015, Vol. 160: 339-350
Kacian et al., 1971, Biochim. Biophys. Acta 46: 365-83; Yang et al., 1972, Biochem. Biophys. Res. Comm. 47: 505-11; Gerard et al., 1975, J. Virol. 15: 785-97; Liu et al., 1977, Arch. Virol. 55 187-200; Kato et al., 1984, J. Virol. Methods 9: 325-39; Luke et al., 1990, Biochem. 29: 1764-69 and Le Grice et al., 1991, J. Virol. 65: 7004-07
Klippel et al., „Isolation and characterisation of unusual gin mutants" EMBO J. 1988; 7: 3983-3989: Burke et al., „Activating mutations of Tn3 resolvase marking interfaces important in recombination catalysis and its regulation. Mol Microbiol. 2004; 51: 937-948; Olorunniji et al., „Synapsis and catalysis by activated Tn3 resolvase mutants" Nucleic Acids Res. 2008; 36: 7181-7191; Rowland et al., „Regulatory mutations in Sin recombinase support a structure-based model of the synaptosome" Mol Microbiol. 2009; 74: 282-298; Akopian et al., „Chimeric recombinases with designed DNA sequence recognition." Proc Natl Acad Sci USA. 2003;100: 8688-8691; Gordley et al., „Evolution of programmable zinc finger-recombinases with activity in human cells. J Mol Biol. 2007; 367: 802-813; Gordley et al., „Synthesis of programmable integrases" Proc Natl Acad Sei USA. 2009; 106: 5053-5058; Amold et al., „Mutants of Tn3 resolvase which do not require accessory binding sites for recombination activity." EMBO
Klippel et al., „Isolation and characterisation of unusual gin mutants" EMBO J. 1988; 7: 3983-3989: Burke et al., „Activating mutations of Tn3 resolvase marking interfaces important in recombination catalysis and its regulation. MolMicrobiol. 2004; 51: 937-948; Olorunniji et al., „Synapsis and catalysis by activated Tn3 resolvase mutants" Nucleic Acids Res. 2008; 36: 7181-7191; Rowland et al., „Regulatory mutations in Sin recombinase support a structure-based model of the synaptosome" Mol Microbiol. 2009; 74: 282-298; Akopian et al., „Chimeric recombinases with designed DNA sequence recognition" Proc Natl Acad Sei USA. 2003;100: 8688-8691
Kotin, Human Gene Therapy 5:793-801 (1994); Muzyczka, J. Clin. Invest. 94:1351 (1994
PCT/US20/23721; PCT/US20/23730; PCT/US20/23713; PCT/US20/23712; PCT/US20/23727; PCT/US20/23724; PCT/US20/23725; PCT/LJS20/23728; PCT/US20/23732; PCT/US20/23723; PCT/US20/23553; und PCT/US20/23583
PCT/US2009/056194
PCT/US2011/066747
PCT/US2015/012022
PCT/US2016/027795
Sebastian-Martin et al. „Transcriptional inaccuracy threshold attenuates differences in RNA-dependent DNA synthesis fidelity between retroviral reverse transcriptases", Scientific Reports, 2018, Vol. 8: 627
Shingledecker, et al., Gene 207:187 (1998), Southworth, et al., EMBOJ. 17:918 (1998); Mills, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:3543-3548 (1998); Lew, et al., J. Biol. Chem., 273:15887-15890 (1998); Wu, et al., Biochim. Biophys. Acta 35732:1 (1998b), Yamazaki, et al., J. Am. Chem. Soc. 120:5591 (1998), Evans, et al., J. Biol. Chem. 275:9091 (2000); Otomo, et al., Biochemistry 38:16040-16044 (1999); Otomo, et al., J. Biolmol. NMR 14:105-114 (1999); Scott, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:13638-13643 (1999
Shingledecker, et al.,Gene 207:187 (1998), Southworth, et al., EMBOJ. 17:918 (1998); Mills, et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 95:3543-3548 (1998); Lew, et al., J. Biol. Chem., 273:15887-15890 (1998); Wu, et al., Biochim. Biophys. Acta 35732:1 (1998b), Yamazaki, et al., J. Am. Chem. Soc. 120:5591 (1998), Evans, et al., J. Biol. Chem. 275:9091 (2000); Otomo, et al., Biochemistry 38:16040-16044 (1999); Otomo, et al., J. Biolmol. NMR 14:105-114 (1999); Scott, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:13638-13643 (1999
Smith et al., „Diversity in the serine recombinases" Mol Microbiol. 2002;44: 299-307
Stevens et al. „A promiscuous split intein with expanded protein engineering applications", PNAS, 2017, Vol. 114: 8538-8543; Iwai et al. „Highly efficient protein trans-splicing by a naturally split DnaE intein from Nostc punctiforme", FEBS Lett, 580: 1853-1858
Stevens et al., „A promiscuous split intein with expanded protein engineering applications", PNAS, 2017, Vol.114: 8538-8543; Iwai et al., „Highly efficient protein trans-splicing by a naturally split DnaE intein from Nostc punctiforme, FEBS Lett, 580: 1853-1858
t. Siehe Rees, H.A. et al. „Improving the DNA specificity and applicability of base editing through protein engineering and protein delivery", Nat. Commun. 8, 15790 (2017
Tratschin et al., Mol. Cell. Biol. 5:3251-3260 (1985); Tratschin et al., Mol. Cell. Biol. 4:2072-2081 (1984); Hermonat & Muzyczka, PNAS 81:6466-6470 (1984); und Samulski et al., J. Virol. 63:03822-3828 (1989
U01AI142756, RM1HG009490, R01EB022376 und R35GM118062
West et al., Virology 160:38-47 (1987
Zhang YP et al., Gene Ther. 1999, 6:1438-47

Also Published As

Publication number Publication date
KR20230019843A (ko) 2023-02-09
BR112022022603A2 (pt) 2023-01-17
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WO2021226558A8 (en) 2022-01-13
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US20230220374A1 (en) 2023-07-13
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JP2023525304A (ja) 2023-06-15
WO2021226558A1 (en) 2021-11-11
MX2022014008A (es) 2023-02-09
US11912985B2 (en) 2024-02-27
IL297761A (en) 2022-12-01
GB202218378D0 (en) 2023-01-18
GB2614813A (en) 2023-07-19

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JPWO2020191233A5 (de)
JPWO2020191234A5 (de)