CN106244555A - 一种提高基因打靶的效率的方法及β‑球蛋白基因位点的碱基原位修复方法 - Google Patents

一种提高基因打靶的效率的方法及β‑球蛋白基因位点的碱基原位修复方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种提高基因打靶的效率的方法及β‑球蛋白基因位点的碱基原位修复方法。该种提高基因打靶的效率的方法包括以下步骤：S10：确定基因原位修复的位点；S20：引入CRISPR/Ca系统对编辑位点DNA进行切割造成DNA损伤，同时提供修复模板片段。基于现有基因修饰所存在的不足，单链寡核苷酸ssODNs和小分子化合物参与CRISPR/Cas9基因修饰系统后，在基因修饰效率、时效性、修饰的质量得到了提高。

Description

一种提高基因打靶的效率的方法及β-球蛋白基因位点的碱基 原位修复方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种提高基因打靶的效率的方法及β-球蛋白基因位点的碱基原位修复方法。
背景技术
TALEN技术是目前商业化最成功的技术，虽然将单个的TALEN模块进行组装需要大量的分子克隆和测序操作，十分繁琐，但是很多商业公司可以提供组装好的三联密码子TALEN模块，甚至四联密码子TALEN模块，这样就大大缩短了构建TALEN元件的实验周期。不过也正是因为如此，绝大多数实验室都难以自行完成TALEN技术的完整操作，对其推广造成了障碍。
ZFN技术则是最早被广泛使用的基因组定点修饰技术，各大平台均比较完善，有很多可以直接使用的资源。然而由于其自身的三联属性，其设计比TALEN更为繁琐，而且高度依赖于目标序列及其上下游序列，还具有脱靶率高及细胞毒性大等诸多限制性因素。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种提高基因打靶的效率的方法，包括以下步骤：
S10：确定基因原位修复的位点；
S20：引入CRISPR/Ca系统对编辑位点DNA进行切割造成DNA损伤，同时提供修复模板片段。
本发明还提供了一种β-球蛋白基因位点的碱基原位修复方法，包括以下步骤：
(1)在人类地中海贫血的β-球蛋白基因缺陷的多能干细胞中对β-球蛋白基因位点的碱基进行原位修复；
(2)靶向人β-球蛋白基因缺陷的载体诱导性多能干细胞的构建；
(3)多能干细胞基因矫正效率的检测；
(4)单链寡核苷酸ssODNs、spCas9-HF1载体β-地中海贫血的β-链球蛋白基因位点进行基因打靶修饰；
(5)提取DNA进行PCR分析。
在某些实施方式中，所述步骤(5)之后还包括测序进行验证基因确定克隆的正确性的过程。
在某些实施方式中，所述步骤(5)中引物序列为：
F:5’ACGGCTGTCATCACTTAGACCT3’
R:5’TCCCCTTCCTATGACATGAACT3’
Rwt(5’TCCCCAAAGGACTCAAAGAACC 3’)
RΔ(5’AGATCCCCAAAGGACTCAACC3’)。
在某些实施方式中，所述测序为高通量测序。
在某些实施方式中，所述步骤(2)中，具体过程为：从确诊为中海贫血β-41/42球蛋白基因纯合外显子的患者获取皮肤；从皮肤中分离成纤维细胞；对所得到的成纤维细胞进行转染；转染后的成纤维细胞接种在基质胶铺垫的培养皿中继续培养；再将诱导性多能干细胞接种于基质胶铺垫的组织培养皿中培养，并每3～4天利用干细胞技术传代一次。
在某些实施方式中，所述步骤(3)中，具体过程为：使用慢病毒pwpsld构建EGFP表达双荧光报告载体：pef1α-mcherry-2a-Δ41/42-egfp。
在某些实施方式中，所述步骤(4)中，具体过程为：
①取多能干细胞,spCas9/HF1载体，ssODN4进行转染；
②转染后放入Y-27632抑制剂12～48小时，加入小分子化合物L755507；
③转染后36～72小时，分选表达绿色荧光的细胞。
在某些实施方式中，所述步骤①中取多能干细胞1×106个,spCas9/HF1载体8ug，ssODN4 2μg进行转染。
在某些实施方式中，所述步骤②中转染后放入10μM Y-27632抑制剂24小时。
本发明提供的一种提高基因打靶的效率的方法及β-球蛋白基因位点的碱基原位修复方法相对于现有技术的优点在于：
1、经发明人研究发现，现有技术的缺陷主要原因在于：需要大量的分子克隆和测序操作，十分繁琐，虽然很多商业公司提供组装好的模块，缩短了构建实验周期，绝大多数实验室都难以自行完成TALEN技术的完整操作，对其推广造成了障碍；
2、ZFN技术的三联属性，其设计比TALEN更为繁琐，而且高度依赖于目标序列及其上下游序列，脱靶率高及细胞毒性大等限制性因素；
3、CRISPR/Cas技术有上下文依赖性，目前只能应用于上游有PAM序列的靶位；
4、效率低、细胞毒性强；
基于以上现有基因修饰所存在的不足，单链寡核苷酸ssODNs和小分子化合物参与CRISPR/Cas9基因修饰系统后，在基因修饰效率、时效性、修饰的质量得到了提高。
具体实施方式
下面结合具体实施例的方式对本发明的权利要求做进一步的详细说明，在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。
但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
本发明提供了一种提高基因打靶的效率的方法，其包括以下步骤：
S10：确定基因原位修复的位点；
S20：引入CRISPR/Ca系统对编辑位点DNA进行切割造成DNA损伤，同时提供修复模板片段。
上述，基因打靶技术是一种按照DNA同源重组原理，以胚胎干细胞为主要操作对象，结合分子克隆与细胞培养、转染、筛选技术在细胞水平引入、改造、修饰特定遗传信息的实验手段。它是建立在胚胎干细胞培养技术(Embryonic stem cells，ESCs)和同源重组技术基础上发展起来的一门新技术，该技术具有定位性强、打靶后的新基因可随染色体稳定遗传等特点。
细胞基因组DNA都会不时出现双链或单链断裂等损伤，这主要是由细胞外界生存环境条件的改变、细胞内部的氧化及物理损伤及细胞的DNA复制和减数分裂引起的。这种现象在我们人类细胞中发生的频率从数次到数千次不等，若细胞中的DNA损伤在细胞进入下一个细胞分裂前不能得到正确修复，就会导致细胞遗传信息的改变，细胞分裂停止或是机体清除，因此我们生物机体在进化过程中发展出了DNA损伤修复系统。研究发现在真核细胞中，染色体DNA出现的单链断裂和双链断裂可依两条途径进行自我修复：同源重组(HR)和非同源末端连接(NHEJ)。
基因打靶技术主要是借助于真核细胞自身的这种DNA损伤修复机制，根据相关基因在基因组的结构和功能信息，借助分子克隆技术设计相应同源打靶片段，将目的基因特异敲除或用其它基因替代失活，从而人为地修饰基因组，实现对靶基因的定点敲除或将目的基因片段定点整合到基因组的一项转基因技术。该技术除了可部分或完全中止某一基因的表达外，还包括引入新基因及引入定点突变。既可以使用突变基因或其它基因代替正常基因，也可以用正常基因代替突变基因。
由于基因修饰技术近几年取得了很大的突破，目前可以把基因打靶技术分为传统的基因打靶技术和新型基因打靶技术；也可根据研究目的和打靶模式，将基因打靶技术分为：靶向基因敲除、条件性基因打靶、基因定位整合、基因靶向修饰、以及可以特异降低靶基因mRNA的小RNA干扰技术。
虽然常规的基因打靶技术可以实现基因的靶向修饰，但是由于同源重组概率很低，且筛选周期较长等原因使得这项技术的应用受到很大的限制。尽管依靠细胞内的自发同源重组建立的基因打靶技术在原核生物、酵母和小鼠胚胎干细胞(mESCs)中已得到了较好应用，但由于其在其它细胞中同源重组发生的概率很低，应用仍然存在较大困难，严重限制了这些物种中基因功能的深入研究。在过去的十年间，人工核酸酶(Engineeredendonuclease，EEN)介导的基因组编辑技术的日渐成熟，将这一现状彻底改变，使得研究人员可以操作各种细胞类型和生物的任何基因，使得这项技术被Nature Methods杂志评选为2011年度最受关注的技术成果。从技术的发展来看，这类酶主要包括3种：锌指核酸酶(Zincfinger nucleases，ZFn)、转录激活因子样效应物核酸酶(Transcription activator-likeeffector nucleases，TALEN)，以及CRISPR-Cas9技术。这种技术突破了传统基因打靶技术的限制，理论上能在任何物种基因组的能在内源性序列上引入特异性修改，切除基因片段，定点整合目的基因以及进行碱基替换，使之成为在多种细胞类型和生物体内进行高效、位点特异性的基因修饰的一个常用工具，在生物基因组改造、基因功能分析，动植物抗病育种等重大的基因组学问题的解决中将具有广阔的应用前景。
可以理解的是，CRISPR/Cas技术摆脱了合成并组装具有特异性DNA识别能力蛋白模块的繁琐操作，其gRNA的设计和合成工作量远远小于TALEN和ZFN技术的DNA识别模块的构建过程，且毒性远远低于ZFN技术。基于以上现由于的基因修饰所存在的不足，本发明利用单链寡核苷酸ssODNs和小分子化合物，结合CRISPR/Cas9基因修饰系统后，在β-地中海贫血诱导多能干细胞基因修复效率大大提高。
本发明还提供了一种β-球蛋白基因位点的碱基原位修复方法，包括以下步骤：
(1)在人类地中海贫血的β-球蛋白基因缺陷的多能干细胞中对β-球蛋白基因位点的碱基进行原位修复；
(2)靶向人β-球蛋白基因缺陷的载体诱导性多能干细胞的构建；
(3)多能干细胞基因矫正效率的检测；
(4)单链寡核苷酸ssODNs、spCas9-HF1载体β-地中海贫血的β-链球蛋白基因位点进行基因打靶修饰；
(5)提取DNA进行PCR分析。
上述，小分子化合物L755507可以明显增强CRISPR-基因修饰效率，等位基因的纠正效率可以达到54％，单基因的修饰效率到达25.5％，脱靶和外显子序列分析结果可以证实CRISPR/Cas9的效率。
根据本发明，以地中海贫血的多能干细胞(iPSCs)为研究对象，利用gRNAs、单链寡核苷酸ssODNs、小分子化合物参与到CRISPR/Cas9基因修饰系统进行β-地中海贫血的β-链球蛋白修复，得到成功，并且进一步应用于临床疾病治疗的潜力。
进一步的，所述步骤(5)之后还包括测序进行验证基因确定克隆的正确性的过程。
进一步的，所述步骤(5)中引物序列为：
F:5’ACGGCTGTCATCACTTAGACCT3’
R:5’TCCCCTTCCTATGACATGAACT3’
Rwt(5’TCCCCAAAGGACTCAAAGAACC 3’)
RΔ(5’AGATCCCCAAAGGACTCAACC3’)。
进一步的，所述测序为高通量测序。
进一步的，所述步骤(2)中，具体过程为：从确诊为中海贫血β-41/42球蛋白基因纯合外显子的患者获取皮肤；从皮肤中分离成纤维细胞；对所得到的成纤维细胞进行转染；转染后的成纤维细胞接种在基质胶铺垫的培养皿中继续培养；再将诱导性多能干细胞接种于基质胶铺垫的组织培养皿中培养，并每3～4天利用干细胞技术传代一次。
进一步的，所述步骤(3)中，具体过程为：使用慢病毒pwpsld构建EGFP表达双荧光报告载体：pef1α-mcherry-2a-Δ41/42-egfp。
进一步的，所述步骤(4)中，具体过程为：
①取多能干细胞,spCas9/HF1载体，ssODN4进行转染；
②转染后放入Y-27632抑制剂12～48小时，加入小分子化合物L755507；
③转染后36～72小时，分选表达绿色荧光的细胞。
进一步的，所述步骤①中取多能干细胞1×106个,spCas9/HF1载体8ug，ssODN4 2μg进行转染。
进一步的，所述步骤②中转染后放入10μM Y-27632抑制剂24小时。
为了便于理解本发明，下面合实施例来进一步说明本发明的技术方案。申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细工艺设备和工艺流程，但本发明并不局限于上述详细工艺设备和工艺流程，即不意味着本发明必须依赖上述详细工艺设备和工艺流程才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
实施例1
ssODNs和spCas9-HF1纠正地贫的β-球蛋白基因缺陷的iPSCs
主要步骤：
⑴iPSCs 1×106,8ug spCas9/HF1载体，2μg ssODN4，Neon Transfection System(Thermo Fisher)转染系统；
⑵转染后放入mTeSR1配制的10μM Y-27632抑制剂24小时，加入或者不加小分子化合物L755507；
⑶转染后48小时，使用Fluorescence-Activated Cell Sorting(FACS)分选表达绿色荧光的细胞，然后放入6孔板继续培养10天；
⑷TIANamp Genomic DNA kit(Tiangen)提取DNA进行PCR分析，需要100ng DNA模板和LA Taq(Takara)；
引物序列：
F：5’ACGGCTGTCATCACTTAGACCT3’(突变位点上游430bp)
R：5’TCCCCTTCCTATGACATGAACT3’(突变位点下游243bp)
R wt(5’TCCCCAAAGGACTCAAAGAACC 3’)
RΔ(5’AGATCCCCAAAGGACTCAACC3’)
⑸测序进行验证基因确定克隆的正确性，最后通过高通量测序进一步验证。
实施例2
ssODNs和spCas9-HF1纠正地贫的β-球蛋白基因缺陷的iPSCs
主要步骤：
⑴iPSCs 1×106，8ug spCas9/HF1载体，2μg ssODN4，Neon Transfection System(Thermo Fisher)转染系统；
⑵转染后放入mTeSR1配制的10μM Y-27632抑制剂12小时，加入或者不加小分子化合物L755507；
⑶转染后36小时，使用Fluorescence-Activated Cell Sorting(FACS)分选表达绿色荧光的细胞，然后放入6孔板继续培养10天；
⑷TIANamp Genomic DNA kit(Tiangen)提取DNA进行PCR分析，需要100ng DNA模板和LA Taq(Takara)；
引物序列：
F：5’ACGGCTGTCATCACTTAGACCT3’(突变位点上游430bp)
R：5’TCCCCTTCCTATGACATGAACT3’(突变位点下游243bp)
R wt(5’TCCCCAAAGGACTCAAAGAACC 3’)
RΔ(5’AGATCCCCAAAGGACTCAACC3’)
⑸测序进行验证基因确定克隆的正确性，最后通过高通量测序进一步验证。
实施例3
ssODNs和spCas9-HF1纠正地贫的β-球蛋白基因缺陷的iPSCs
主要步骤：
⑴iPSCs 1×106，8ug spCas9/HF1载体，2μg ssODN4，Neon Transfection System(Thermo Fisher)转染系统；
⑵转染后放入mTeSR1配制的10μM Y-27632抑制剂48小时，加入或者不加小分子化合物L755507；
⑶转染后72小时，使用Fluorescence-Activated Cell Sorting(FACS)分选表达绿色荧光的细胞，然后放入6孔板继续培养10天；
⑷TIANamp Genomic DNA kit(Tiangen)提取DNA进行PCR分析，需要100ng DNA模板和LA Taq(Takara)；
引物序列：
F：5’ACGGCTGTCATCACTTAGACCT3’(突变位点上游430bp)
R：5’TCCCCTTCCTATGACATGAACT3’(突变位点下游243bp)
R wt(5’TCCCCAAAGGACTCAAAGAACC 3’)
RΔ(5’AGATCCCCAAAGGACTCAACC3’)
⑸测序进行验证基因确定克隆的正确性，最后通过高通量测序进一步验证。

Claims (10)

1.一种提高基因打靶的效率的方法，其特征在于：包括以下步骤：
S10：确定基因原位修复的位点；
S20：引入CRISPR/Ca系统对编辑位点DNA进行切割造成DNA损伤，同时提供修复模板片段。
2.一种β-球蛋白基因位点的碱基原位修复方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)在人类地中海贫血的β-球蛋白基因缺陷的多能干细胞中对β-球蛋白基因位点的碱基进行原位修复；
(2)靶向人β-球蛋白基因缺陷的载体诱导性多能干细胞的构建；
(3)多能干细胞基因矫正效率的检测；
(4)单链寡核苷酸ssODNs、spCas9-HF1载体β-地中海贫血的β-链球蛋白基因位点进行基因打靶修饰；
(5)提取DNA进行PCR分析。
3.如权利要求2所述的β-球蛋白基因位点的碱基原位修复方法，其特征在于：所述步骤(5)之后还包括测序进行验证基因确定克隆的正确性的过程。
4.如权利要求2所述的β-球蛋白基因位点的碱基原位修复方法，其特征在于：所述步骤(5)中引物序列为：
F:5’ACGGCTGTCATCACTTAGACCT3’
R:5’TCCCCTTCCTATGACATGAACT3’
Rwt(5’TCCCCAAAGGACTCAAAGAACC3’)
RΔ(5’AGATCCCCAAAGGACTCAACC3’)。
5.如权利要求3所述的β-球蛋白基因位点的碱基原位修复方法，其特征在于：所述测序为高通量测序。
6.如权利要求2所述的β-球蛋白基因位点的碱基原位修复方法，其特征在于：所述步骤(2)中，具体过程为：从确诊为中海贫血β-41/42球蛋白基因纯合外显子的患者获取皮肤；从皮肤中分离成纤维细胞；对所得到的成纤维细胞进行转染；转染后的成纤维细胞接种在基质胶铺垫的培养皿中继续培养；再将诱导性多能干细胞接种于基质胶铺垫的组织培养皿中培养，并每3～4天利用干细胞技术传代一次。
7.如权利要求2所述的β-球蛋白基因位点的碱基原位修复方法，其特征在于：所述步骤(3)中，具体过程为：使用慢病毒pwpsld构建EGFP表达双荧光报告载体：pef1α-mcherry-2a-Δ41/42-egfp。
8.如权利要求2所述的β-球蛋白基因位点的碱基原位修复方法，其特征在于：所述步骤(4)中，具体过程为：
①取多能干细胞,spCas9/HF1载体，ssODN4进行转染；
②转染后放入Y-27632抑制剂12～48小时，加入小分子化合物L755507；
③转染后36～72小时，分选表达绿色荧光的细胞。
9.如权利要求8所述的β-球蛋白基因位点的碱基原位修复方法，其特征在于：所述步骤①中取多能干细胞1×106个,spCas9/HF1载体8ug，ssODN4 2μg进行转染。
10.如权利要求8所述的β-球蛋白基因位点的碱基原位修复方法，其特征在于：所述步骤②中转染后放入10μM Y-27632抑制剂24小时。
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