CN104745626B - 一种条件性基因敲除动物模型的快速构建方法及应用 - Google Patents
一种条件性基因敲除动物模型的快速构建方法及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种条件性基因敲除动物模型的快速构建方法,其是采用CRISPR/Cas9技术完成的。具体方法可以为:设计CRISPR/Cas9系统针对动物待敲除基因的gRNA靶点序列,设计相应的启动子,构建质粒,实现条件性基因敲除。其可以实现快速有效、简单易行、经济高效、适用范围广的条件性基因敲除动物模型的构建,可以解决上述传统方法(特异性重组酶系统Cre‑LoxP)的缺陷。
Description
技术领域
本发明涉及基因编辑技术领域,尤其是涉及一种条件性基因敲除动物模型的快速构建方法以及其应用。
背景技术
CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeatsequences)/Cas9系统是一种新型的基因编辑技术。该技术利用具有引导作用的sgRNA(short guide RNA)与基因组DNA靶序列特异性结合,招募具有内切酶功能的Cas9蛋白对目标靶点进行切割。DNA双链被切开后,残端在没有同源序列时以非同源末端连接的方式修复或是存在同源序列时以同源重组的方式修复。修复过程会出现碱基缺失或增添导致基因失活。CRIPSR/Cas9技术已实现果蝇、斑马鱼、小鼠、大鼠、猴、人等多个物种的基因敲除,并广泛应用于基因编辑的其他方面,如基因敲入、定点整合及缺失、定点突变等。相比于其他基因编辑系统如TALENs,ZFNs等核酸酶技术,CRISPR/Cas9在基因组中有丰富的靶点,设计容易,操作简单,敲除效率高,经济成本低,并且能够实现多个基因同时敲除等优点,在基因敲除动物模型构建以及疾病模型的构建和治疗领域具有非常广泛的应用前景。
通过显微注射将DNA注射到小鼠受精卵中,然后移植到孕鼠的囊胚中,能发育成转基因的嵌合体,后代可以得到转基因的动物,通过这种方法可以将目的基因快速导入小鼠体内。利用这种方法可以快速将CRISPR/Cas9系统整合到小鼠基因组中。
目前条件性基因敲除动物模型主要是通过特异性重组酶系统Cre-LoxP(或Flp-Frt)来实现的,将带有特定flox位点的转基因小鼠与细胞特异性表达的Cre酶的转基因小鼠杂交可以获得特定组织细胞中基因敲除的小鼠。更换Cre酶的基因的启动子可以实现多种条件(如药物诱导、特定时间、特定组织等)下基因敲除。但是这种条件性基因敲除的方法需要同时构建两个转基因小鼠(flox小鼠和Cre小鼠),而且条件性基因敲除小鼠只能通过flox小鼠和Cre小鼠杂交而来,获得条件性基因敲除的纯合小鼠周期较长,成本较高,操作复杂。
发明内容
本发明的目的是提供一种简单易行、经济高效、适用范围广的条件性基因敲除动物模型的快速构建方法及其应用。
为了实现上述目的,本发明采用如下技术方案:
一种条件性基因敲除动物模型的快速构建方法,其是采用CRISPR/Cas9技术完成的。具体方法可以为:设计CRISPR/Cas9系统针对动物待敲除基因的gRNA靶点序列,设计相应的启动子,构建质粒,实现条件性基因敲除。其可以实现快速有效、简单易行的条件性基因敲除动物模型的构建,可以解决上述传统方法(特异性重组酶系统Cre-LoxP)的缺陷。
根据本发明的一个优选实施方案,本发明的构建方法可以用于小鼠骨组织特异性γ谷氨酸羧化酶基因(GGCX)敲除小鼠模型的快速构建。但是本领域技术人员都可以理解的是,在更换GGCX的gRNA序列后,能够同时敲除多个基因。在更换骨特异性的启动子后,可实现在其他组织中特异性的基因敲除。
进一步地,本发明提供一种小鼠骨组织特异性γ谷氨酸羧化酶基因敲除小鼠模型的快速构建方法,设计CRISPR/Cas9系统针对小鼠GGCX基因的gRNA靶点序列,设计相应的启动子,构建质粒,实现GGCX基因敲除;其中CRISPR/Cas9系统针对小鼠GGCX基因的gRNA靶点为两个,其序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。所述SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2分别是针对GGCX外显子一和外显子二的gRNA靶点。
其中所述启动子优选为小鼠骨特异性Osterix启动子,序列如SEQ ID NO.19所示。
其中所述CRISPR/Cas9系统中的Cas9质粒,优选包括Cas9基因及核定位信号序列,含有如SEQ ID NO.10所示的碱基序列。
在上述基础上,本发明提供的最优选的用于条件性敲除小鼠GGCX基因的质粒,为Posterix-Cas9-gRNA1-gRNA2,质粒图谱见附图7所示。所述条件性基因敲除质粒Posterix-Cas9-gRNA1-gRNA2,利用受精卵显微注射的方法整合到小鼠基因组中,获得条件性基因敲除的后代。
本发明的方法具有以下优点:
1、只需构建一只转基因小鼠就可以实现条件性基因敲除。避免了Cre小鼠和flox小鼠复杂的杂交过程。
2、构建用于条件性基因敲除的转基因小鼠,可实现在骨组织中特异性的敲除GGCX基因。
3、在更换GGCX的gRNA序列后,能够同时敲除多个基因。在更换骨特异性的启动子后,可实现在其他组织中特异性的基因敲除。
4、基因敲除周期缩短,经济成本显著减小。
利用本发明可以快速实现多个物种多种条件性基因敲除。获得的条件性基因敲除动物遗传背景清晰,能够稳定遗传,能够广泛应用于基因功能的研究和各种疾病模型的构建。
上述说明仅是本发明技术方案的概述,为了能够更清楚了解本发明的技术手段,并可依照说明书的内容予以实施,以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。
附图说明
图1是CRISPR/Cas9系统针对GGCX靶点序列及位置示意图,大写为外显子序列,小写为内含子序列;
图2是gRNA活性验证测序峰图;
图3是三个CMV-Cas9-gRNA质粒示意图;
图4是三个CMV-Cas9-gRNA质粒活性验证测序峰图;
图5是三个CMV-Cas9-gRNA质粒剪切电泳图;
图6是三个CMV-Cas9-gRNA质粒剪切测序图;
图7是OSX-Cas9-gRNA1-gRNA2质粒图谱;
图8是OSX-Cas9-gRNA质粒剪切测序图;
图9是转基因OSX-Cas9-gRNA质粒线性化电泳图;
图10是OSX-Cas9-gRNA转基因小鼠鉴定图;
图11是OSX-Cas9-gRNA转基因小鼠骨GGCX敲除电泳鉴定图;
图12是OSX-Cas9-gRNA转基因小鼠骨GGCX敲除测序鉴定分析图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例,对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。
所涉及的化学试剂或生物制品,如未特别说明都为商业化产品。另外,其他未注明的实验操作按照常规分子生物学操作方法进行。
实施例1
针对小鼠GGCX设计gRNA靶点
参照gRNA设计原则,针对γ谷氨酸羧化酶(GGCX)第一个和第二个外显子分别设计gRNA1和gRNA2靶点,序列如下所示:
gRNA靶点1:GAGCAACCAGTGCGGAGCCG(如SEQ ID NO.1所示)
gRNA靶点2:GCCAGGTTTGCAGGGTCCGT(如SEQ ID NO.2所示)
详细信息如图1所示。
构建gRNA载体
1、gRNA空载体酶切
gRNA空载体从addgene公司购买。gRNA空载体连在-Blunt II-载体中。使用Afl II酶(NEB)酶切,胶回收酶切片段一。
gRNA空载体序列:如SEQ ID NO.3所示。
2、构建gRNA靶点序列插入片段
1)设计引物序列如下:
gRNA1上游引物gRNA1-F(如SEQ ID NO.4所示):
5’-TTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGAGCAA CCAGTGCGGAGCCG-3’
gRNA1下游引物gRNA1-R(如SEQ ID NO.5所示):
5’-GACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAACCGGCTCC GCACTGGTTGCT-3’
gRNA2上游引物gRNA2-F(如SEQ ID NO.6所示):
5’-TTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGCCAGGT TTGCAGGGTCCGT-3’
gRNA2上游引物gRNA2-R(如SEQ ID NO.7所示):
5'-GACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAACACGGACC CTGCAAACCTGG-3'
2)PCR扩增插入片段
PCR体系:上游引物gRNA1-F(10μM)5μl,下游引物gRNA1-R(10μM)5μl,pfu酶(康为世纪)10μl。
PCR程序:94℃5分,72℃3分,68℃3分,64℃3分。
胶回收100bp大小的gRNA1插入片段二。
用上述方法获得100bp大小的gRNA2插入片段三。
3、分别将片段二和片段三连入gRNA空载体
使用无缝克隆试剂盒(Biomiga)分别将片段一和片段二连接构建gRNA1质粒,片段一和片段三连接构建gRNA2质粒。具体操作步骤参考试剂盒说明书。将连接产物转化DH5α大肠杆菌(康为世纪),在含有kana(50μg/ml)的平板尚均匀涂布,16小时后PCR筛选阳性克隆菌,挑取克隆,37℃摇菌16小时,抽提质粒。
4、测序
将抽提的质粒送三博远志公司测序,测序结果证实序列正确。
gRNA1序列:如SEQ ID NO.8所示。
gRNA2序列:如SEQ ID NO.9所示。
gRNA活性验证
1、细胞培养
小鼠前成骨细胞系MC3T3-E1培养于37℃,5%CO2的恒温培养箱中。使用2.5%EDTA胰酶(Gibco)消化细胞,加入适量培养液反复吹打混匀细胞,离心后接种到6孔板中,细胞密度融合到80%转染质粒。
2、gRNA1和gRNA2分别和Cas9质粒共转染细胞
Cas9质粒购买于addgene公司,启动子为真核生物强启动子CMV。其Cas9及核定位信号相关序列如SEQ ID NO.10所示。
使用lipofectamine3000转染试剂(Invtrogen)将Cas9和gRNA1(gRNA2)各1μg转染到MC3T3-E1中。具体方法参照说明书。24小时加入1000ng/ml浓度的G418筛选,72小时后收集剩余的活细胞,使用通用型柱式基因组提取试剂盒(康为世纪)提取基因组DNA。
3、从基因组DNA中PCR扩增包括GGCX靶点的片段
GGCX靶点上游引物GGCX-F(如SEQ ID NO.11所示)
5'-CTTGTTCTGAAAACTGTC-3'
GGCX靶点下游引物GGCX-R(如SEQ ID NO.12所示)
5'-TTATCAGAGTAATAGAAAGC-3'
PCR扩增产物预计913bp
PCR反应体系:ES TaqmaterMix(康为世纪)10μl,GGCX-F引物1μl,GGCX-R引物1μl,基因组DNA模板100ng,dH2O补至20μl。
PCR反应条件:预变形94℃5分,变形94℃30秒,退火55℃30秒,延伸72℃1分,35个循环,终延伸72℃5分。
测序验证活性
将PCR产物送公司测序,结果显示两条设计的gRNA在各自靶点处都出现套峰,表明两条gRNA都具有活性。测序套峰结果图见附图2。
四、构建CMV-Cas9-gRNA
1、酶切Cas9质粒
使用Sex AI内切酶(Thermo)单酶切Cas9质粒,胶回收片段四,去磷酸化酶(Takara)使切口去磷酸化。
PCR扩增gRNA片段
设计引物序列如下:
SexA I-gRNA(如SEQ ID NO.13所示):
CATACCAGGTATTCGCCCTTTGTA
gRNA-Sex A I(如SEQ ID NO.14所示):
TGAACCTGGTTAATGCCAACTTTGTA
Xho I-gRNA(如SEQ ID NO.15所示):
CATCTCGAGATTCGCCCTTTGTA
gRNA-Xho I(如SEQ ID NO.16所示):
TGACTCGAGTAATGCCAACTTTGTA
2)PCR扩增及酶切
使用pfu酶分别以gRNA1和gRNA2为模板,以SexA I-gRNA和gRNA-Sex A I为引物PCR扩增片段。扩增的gRNA1和gRNA2片段两端添加了Sex AI酶切位点。片段回收后使用SexAI内切酶酶切后,胶回收片段Sex AI-gRNA1-Sex AI片段五和Sex AI-gRNA2-Sex AI片段六。
以gRNA1为模板,SexA I-gRNA和gRNA-Xho I为引物PCR扩增片段。扩增的片段在gRNA1上游添加Sex AI,下游添加Xho I。片段回收后使用Sex AI和XhoI内切酶酶切后,胶回收片段七Sex AI-gRNA1-Xho I。
以gRNA2为模板,Xho I-gRNA和gRNA-Sex A I为引物PCR扩增片段。扩增的片段在gRNA2上游添加Xho I,下游添加Sex AI。片段回收后使用Sex AI和XhoI内切酶酶切后,胶回收片段八Xho I-gRNA2-Sex AI。
使用T4连接酶(NEB)分别将片段四与片段五连接构建CMV-Cas9-gRNA1;片段四与片段五连接构建CMV-Cas9-gRNA2;片段四与片段六和片段七连接构建CMV-Cas9-gRNA1-gRNA2。
将连接产物转化DH5α大肠杆菌,在含有AMP(100μg/ml)的平板尚均匀涂布,16小时后PCR筛选阳性克隆菌,挑取克隆,37℃摇菌16小时,抽提质粒。
测序
将抽提的质粒送公司测序,测序结果表明插入序列完全正确。三个质粒示意图见附图3。
检测基因敲除效率
1、验证活性
1)将CMV-Cas9-gRNA1,CMV-Cas9-gRNA2,CMV-Cas9-gRNA1-gRNA2三个质粒转染到MC3T3-E1中,24小时加入1000ng/ml浓度的G418筛选,72小时后收集剩余的活细胞,提取基因组DNA。
2)从基因组DNA中PCR扩增包括靶点的片段
3)测序
将PCR产物送公司测序发现CMV-Cas9-gRNA1,CMV-Cas9-gRNA2在各自的靶点上出现套峰,CMV-Cas9-gRNA1-gRNA2在两个靶点上都出现套峰。表明设计三个质粒都能有效敲除GGCX。详细信息见附图4。
2、检测基因敲除效率
1)将CMV-Cas9-gRNA1,CMV-Cas9-gRNA2,CMV-Cas9-gRNA1-gRNA2三个质粒转染到MC3T3-E1中,72小时后收集细胞,提取基因组DNA。
2)从基因组DNA中PCR扩增包括靶点的片段,胶图可见CMV-Cas9-gRNA1,CMV-Cas9-gRNA2条带与对照相比变小,CMV-Cas9-gRNA1,CMV-Cas9-gRNA2可以见到多条带,结果也证实三个质粒能够剪切GGCX。胶图见附图5。
3)从基因组DNA中PCR扩增包括靶点的片段,使用快速DNA产物纯化试剂盒(康为世纪)回收所有PCR产物,连接到pMd-20T载体(Takara)中,涂布在含有AMP(100μg/ml),X-gal(20mg/ml),ITPG(1mM)琼脂糖平板上培养16小时,挑取至少20个白色克隆摇菌。37℃摇菌16小时,抽提质粒。
4)质粒送公司测序,测序结果表明CMV-Cas9-gRNA1-gRNA2转染细胞后剪切效率为83.3%(20/24),明显高于Cas9-gRNA1的65%(15/23)和Cas9-gRNA2的56%(14/24)。CMV-Cas9-gRNA1-gRNA2基因敲除效果最高,因此选择该系统进行下一步实验。详细信息见附图6。
六、条件性基因敲除质粒OSX-Cas9-gRNA构建
1、从小鼠基因组中PCR扩增出小鼠osterix启动子,在上游引物添加Mlu I酶切位点,在下游添加Nhe I酶切位点。
设计引物序列如下
Posterix-F(如SEQ ID NO.17所示):
AGCACGCGTCCTCAGTCCTGCTTGCCTTA
Posterix-R(如SEQ ID NO.18所示)
GCTGCTAGCAGAGAACCGAGGAGCCAGT:
PCR反应体系:pfu酶(康为世纪)25μl,上游引物Posterix-F(10uM)2.5μl,下游引物Posterix-R(10uM)2.5μl,小鼠基因组DNA 100ng,加水至50μl。
PCR反应条件:预变性94℃5min,变性94℃30秒,退火55℃30秒,延伸72℃30秒,重复30个循环,终延伸72℃3分。
胶回收回收2000bp左右的条带,使用Mlu I内切酶(NEB)和Nhe I内切酶(NEB)酶切片段,胶回收试剂盒回收片段九。
Osterix启动子序列:如SEQ ID NO.19所示。
2、使用Mlu I内切酶和Nhe I内切酶酶切CMV-Cas9-gRNA1-gRNA2质粒,胶回收试剂盒回收10000bp左右的片段十。
3、将片段九和片段十按照摩尔比1:10的比例混合用T4连接酶连接。具体操作步骤参考试剂盒说明书。将连接产物转化DH5α大肠杆菌(康为世纪),在含有AMP(100μg/ml)的平板尚均匀涂布,12小时后PCR筛选阳性克隆菌,挑取克隆,37℃摇菌16小时,抽提质粒。
4、测序证实OSX-Cas9-gRNA1-gRNA2质粒序列正确。质粒图谱信息见附图7。
七、验证OSX-Cas9-gRNA1-gRNA2活性
1、将OSX-Cas9-gRNA1-gRNA2转染到MC3T3-E1中,24小时加入1000ng/ml浓度的G418筛选,72小时后收集剩余的活细胞,提取基因组DNA。
2、使用GGCX-F和GGCX-R引物PCR扩增包含靶点的片段,将PCR产物回收,连接到pMd-20T载体中,涂布在含有AMP(100μg/ml),X-gal(20mg/ml),ITPG(1mM)琼脂糖平板上培养16小时,挑取20个白色克隆摇菌。37℃摇菌16小时,抽提质粒。
3、质粒送公司测序,测序结果显示靶点位置DNA发生剪切。详细信息见附图8。
构建条件性基因敲除小鼠
1、线性化OSX-Cas9-gRNA1-gRNA2
使用Bgl I单酶切OSX-Cas9-gRNA1-gRNA2,酶切后胶回收片段十一。酶切鉴定图见附图9。
DNA显微注射构建转基因小鼠
线性化的OSX-Cas9-gRNA1-gRNA2质粒由中国医学科学院医学实验动物研究所研究所通过DNA显微注射受精卵的方法获得转入OSX-Cas9-gRNA1-gRNA2的4只转基因小鼠。
转基因小鼠验证
无菌条件下剪取4只转基因小鼠后肢脚趾,将皮肤和趾骨分离干净,分别提取皮肤和趾骨基因组DNA,PCR扩增Cas9基因和gRNA基因。
设计引物如下
Cas9jc-F(如SEQ ID NO.20所示):
5'-AGGCTGACTTGCGGTTGA-3'
Cas9jc-R(如SEQ ID NO.21所示):
5'-CCGAGTGACAGGGCGATA-3'
gRNAjc-F(如SEQ ID NO.22所示):
5'-AGGCTAGTCCGTTATCAA-3'
gRNAjc-R(如SEQ ID NO.23所示):
5'-TGTACAAGAAAGCTGGGT-3'
PCR反应体系:ES TaqmaterMix 10μl,Cas9jc-F引物1μl,Cas9jc-R引物1μl(或gRNAjc-F引物1μl,gRNAjc-R引物1μl),趾骨基因组DNA模板100ng,dH2O补至20μl。
PCR反应条件:预变形94℃5分,变形94℃30秒,退火55℃30秒,延伸72℃1分,35个循环,终延伸72℃5分。
电泳图可见四只转基因阳性小鼠都检测到条带,两只阴性对照组则没有,结果表明OSX-Cas9-gRNA1-gRNA2转基因小鼠构建成功。详细信息见附图10。
4、条件性基因敲除小鼠验证
PCR分别扩增转基因小鼠皮肤和趾骨基因组DNA的GGCX靶点片段,具体方法参照上述实验过程,检测到4只转基因小鼠趾骨基因组DNA能扩增出900bp大小条带,同时在500bp左右也出现条带,而阴性对照组和皮肤中没有检测到500bp左右的条带。详细信息附图11。
将Founder 3小鼠趾骨PCR产物回收后,连接到pMD-20-T载体中,涂布在含有AMP(100μg/ml),X-gal(20mg/ml),ITPG(1mM)琼脂糖平板上培养16小时,挑取至少10个白色克隆摇菌。37℃摇菌16小时,抽提质粒。将质粒送公司测序,测序结果显示靶点位置DNA发生剪切。详细信息见附图12。
通过转基因技术构建条件性敲除质粒OSX-Cas9-gRNA1-gRNA2转基因小鼠,在转基因小鼠骨中检测到特定靶点发生缺失突变,而皮肤中没有发生。单克隆测序结果确认了特定靶点DNA发生缺失突变,由此证明利用CRISPR/Cas9技术快速构建条件性基因敲除动物模型成功实现。这种方法构建的小鼠生长状态和繁殖能力没有受到影响。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,并不用于限制本发明,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明技术原理的前提下,还可以做出若干改进和变型,这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。
Claims (2)
1.一种小鼠骨组织特异性γ谷氨酸羧化酶基因敲除小鼠模型的快速构建方法,其特征在于:设计CRISPR/Cas9系统针对小鼠GGCX基因的gRNA靶点序列,设计相应的启动子,构建质粒,实现GGCX基因敲除,所述质粒为Posterix-Cas9-gRNA1-gRNA2,质粒图谱见附图7所示;其中CRISPR/Cas9系统针对小鼠GGCX基因的gRNA靶点为两个,其序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示,gRNA1和gRNA2的序列分别如SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示;
所述SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2分别是针对GGCX外显子一和外显子二的gRNA靶点;
所述启动子为小鼠骨特异性Osterix启动子,序列如SEQ ID NO.19所示;
所述CRISPR/Cas9系统中的Cas9质粒,包括Cas9基因及核定位信号序列,含有如SEQ IDNO.10所示的碱基序列。
2.权利要求1所述质粒Posterix-Cas9-gRNA1-gRNA2在快速构建骨特异性GGCX基因敲除小鼠模型中的应用。
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