CN105112412B - 用于敲除人BTF基因的gRNA序列及其敲除方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基因工程领域，具体提供了一种提供一种用于敲除细胞人BTF（Bcl‑2‑associated transcription factor 1）基因的sgRNA序列。在细胞中该gRNA能够特异结合于人BTF编码序列第251‑269bp，并与Cas形成复合物，对BTF基因核酸序列进行特异切割，利用细胞非重组末端连接(NHEJ)修复机制，造成BTF基因移码突变，进而获得BTF基因敲除细胞。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程领域。更具体地，本发明涉及在细胞水平稳定敲除BTF（Bcl-2-associated transcription factor 1）基因。
背景技术
BTF是KASOF等利用酵母双杂交系统寻找病毒抗凋亡蛋白E1B 19K相互作用蛋白时新发现的，位于染色体6q21-23区段，该区段稳定性较差，在多种肿瘤中易发生染色体的缺失。BTF在多种上皮组织均存在较强的表达，如骨骼肌、胎盘、心、脑、肺、肾及胰腺；在肿瘤细胞HeLa S3、白血病细胞HL-60、K-562、MOL74、结肠腺癌SW480、肺癌细胞A549及巴金氏淋巴瘤细胞Raji均表达。
BTF具有basic zipper-like（位于110 -126aa）、Myb-like（位于522 -531aa）DNA结合结构域，在正常非凋亡细胞，BTF位于细胞浆，而在凋亡细胞或死细胞BTF位于细胞核可能发挥其转录因子的功能，激活凋亡相关基因表达。研究表明E1B19K、Bcl-2及Bcl-xL与BTF存在相互作用，它们可以抑制BTF转运入细胞核，而停留在细胞浆，消除其转录活性。在DNA损伤反应中，PKCδ磷酸化BTF，PKCδ/BTF结合于CEP元件，激活下游靶基因P53的表达，从而发动细胞凋亡及细胞生长阻滞。在依托泊苷诱导的DNA损伤反应中，转录因子 Bcl-2-associated transcription factor 1（BTF or BCLAF1)激活下游靶基因P53的表达，从而发动细胞凋亡及细胞生长阻滞。YY Lee等研究表明高剂量放射（10Gy）可以促进BTF与γH2AX共聚集，抑制DNA双链断裂(double-stranded breaks,DSBs) s的损伤修复，增强CEP-P53表达，促进细胞凋亡。BTF-/-敲除小鼠的研究表明BTF在肺发育及免疫系统稳态中发挥调节细胞凋亡的作用。在肺囊形发育阶段，BTF表达非常强，是平滑肌时间、空间正确排列所必须的，但在肺发育晚期BTF不表达。
CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，CRISPR）是一系列成簇排列的DNA序列，被称作“规律间隔成簇短回文重复序列”，是细菌中一种对付诸如病毒等外来DNA的防御系统。Cas基因编码的蛋白包含核酸酶、聚合酶、解旋酶以及与核糖核酸结合的结构域。CRISPR 转录出的 RNA与Cas蛋白结合形成核糖核蛋白复合物协同行使CRISPR/Cas系统的免疫功能，来对Cas蛋白起到导向作用，因此这段RNA也被称为单链导向RNA（singleguide RNA，gRNA）或者是导向RNA（guide RNA）。当复合体检测到入侵的DNA和gRNA序列一致时，Cas蛋白就能够切割入侵的DNA，达到防御的目的。只需针对需要编辑的DNA序列合成一段导向RNA的DNA序列，在转入宿主细胞后，产生的人工构建的gRNA就能指导Cas9蛋白切割宿主细胞特定的DNA序列，从而起到基因编辑的作用。
发明内容
本发明的第一方面是提供一种用于CRISPR/Cas9敲除人细胞BTF（Bcl-2-associated transcription factor 1）基因的gRNA的靶DNA序列，所述序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明的第二方面是提供一种采用上述DNA序列敲除人细胞BTF（Bcl-2-associated transcription factor 1）基因的方法，具体步骤如下：
（1）人工合成所述DNA序列及其互补链；将核酸片段插入到gRNA克隆质粒并通过大肠杆菌TOP10转化，挑单克隆菌株，提取质粒，测序鉴定；
（2）分别将gRNA克隆质粒及hCas9质粒转化入大肠杆菌TOP10，培养过夜，提取细胞转染质粒；
（3）将转染细胞培养基换为无血清培养基，将gRNA克隆质粒及hCas9质粒用培养基配制成转染混合液，加入到转染细胞培养基中，5-6小时后，转染细胞培养基替换为血清培养基继续培养2-3天，即得敲除BTF基因的转染细胞。
本发明的第三方面是提供所述DNA序列在敲除BTF基因中的应用。
具体实施方式
实施例1CRISPR/Cas9 BTF-guide RNA质粒构建、细胞转染及突变鉴定
（1）CRISPR/Cas9 BTF-guide RNA质粒构建
合成核苷酸序列5’-TTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGGAGGAGGTAGATATCATCGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTC-3’，及其反向互补序列5’-GACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAACCGATGATATCTACCTCCTCCGGTGTTTCGTCCTTTCCACAAGATATATAAAGCCAAGAAA-3’。另外，设计其他gRNA序列用于对比，具体如下：对比序例1：其gRNA序列为TTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGGGTATTATCAAGGAGGAGGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTC；对比序列2：其gRNA序列为TTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCAGACGACCTTATGGGTACAGGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTC。将三种gRNA核苷酸序列各自用去离子菌水配成100µM，置600ml沸水，自然室温冷却退火，形成双链，分别克隆至gRNAcloning质粒。gRNA_cloning质粒载体骨架为pCR-Blunt II-TOPO，包含有U6启动子、guide RNAscaffold及末端信号序列，在U6启动子、guide RNAscaffold之间有靶序列插入酶切位点AflII，购自addgene公司（美国马萨诸塞州剑桥市）。AflII酶切gRNA_cloning质粒（addgene公司Plasmid#41824），Gibson assembly（NEB E2611）方法将核酸片段插入到AflII酶切线性化的gRNAcloning质粒（addgene#41824）。转化大肠杆菌TOP10，挑单克隆菌株，提取质粒，测序鉴定。
（2）细胞转染转质粒提取
无菌操作分别挑取gRNA 克隆及hCas9质粒（addgene#41815）转化大肠杆菌TOP10，接种15ml 50μg/ml抗生素Kan与100ug/ml Amp抗生素LB培养基，37℃培养过夜。按PureLinkHiPure Plasmid DNA Purification Kits（lifetechnologies K2100-06）说明书提取细胞转染质粒，浓度要求大于1µg/µl。
（3）A549细胞转染
选择肺癌A549作为转染细胞系。转染前一天将A549细胞接种6孔板，接种密度50%。转染：各取1μg gRNA与hCas9质粒，溶于100μl Opti-mem培养基，将2μl lipo-2000溶于100μl Opti-mem培养基中，混匀室温放置5min后混合，放置20min。将12孔板内培养基换成无血清培养基，每孔1ml，每孔200μl加入转染混合液。5-6小时换成37℃预热有10%胎牛血清培养基DMEM。置37℃ 5%CO2，90%湿度培养2-3天，收集细胞。
（4）细胞BTF突变鉴定
小量全血基因组DNA快速提取试剂盒操作说明，提取收集细胞基因组，以BTF-F5’-GTGTGTGTGTGTTTTGTGCC-3’，BTF-R 5’-TTGGACTCCTGGAACGTGAA-3’为引物，PCR扩增BTF片段，PCR扩增条件为：95℃ 3min； 94℃ 30s ；56℃30s；72 1min50s；30个循环；72℃延伸10min，扩增产物约450bp。PCR产物以BTF-F或BTF-R作为测序引物进行DNA测序，在靶点位置出现重叠峰即为造突变成功。将另一半细胞利用有限稀释法，分离单细胞，扩大培养后，提取基因组，PCR扩增BTF突变区，产物经DNA测序鉴定，在BTF基因251-269bp处可见突变重叠峰，说明敲除成功。而gRNA对比序列1，2按同样方法平行操作，未见BTF突变重叠峰。
实施例2 转染后的A549细胞中BTF蛋白的检测
将实施例1经过转染、筛选得到BTF基因移码突变的细胞，接种至6孔板扩大培养，将转染前A549细胞设为对照，加入100-200μl3╳SDS-PAGE上样缓冲液，沸水煮5-7分钟，取10至20ul上样SDS-PAGE蛋白电泳。电泳完毕后，按照常规蛋白湿转，5% 脱脂奶粉、0.05MPBS PH7.4封闭3hr，将封闭后的PVDF膜置于兔抗人BTF抗体（1:200，Abcam/ab181240，英国剑桥科学园），缓冲液为5% 脱脂奶粉、0.05M PBS PH7.2，室温2hr或2-8℃过夜，用漂洗缓冲液0.05M PBS PH7.2 、0.1% Tween-20漂洗四次，每次5分钟，再将膜转移至0.05M PBSPH7.2 、0.2% Tween-20、1:5000稀释山羊抗兔二抗缓冲液（sigma/A0545，美国圣路易斯，密苏里州），室温40-60min，再用漂洗缓冲漂洗四次，每次5min。漂洗完毕后将蛋白印迹膜用ECL显影检测。BTF移码基因突变A549细胞中western-blot检测不到BTF蛋白条带，而对照组则有BTF蛋白条带出现。另外，对比序列1和2转染的细胞经同样western-blot检测发现有BTF蛋白条带出现。
Claims (2)
1.一种用于敲除人细胞BTF（Bcl-2-associated transcription factor 1）基因的CRISPR/CAS guide RNA的靶DNA序列，所述序列如SEQ ID NO: 1所示。
2.权利要求1所述DNA序列在制备敲除BTF基因药物中的应用。
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