CN113215157B - 特异性靶向人AXL基因的sgRNA及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了特异性靶向人AXL基因的sgRNA及其应用，属于生物医药领域。本发明还公开了一种基于CRISPR系统构建人AXL基因敲除细胞的方法。本发明所述的sgRNA可以介导Cas9蛋白高效地切割靶点DNA，进而用于编辑人AXL基因。本发明的sgRNA可以通过CRIPSR/Cas9系统实现高效打靶。

Description

特异性靶向人AXL基因的sgRNA及其应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及特异性靶向人AXL基因的sgRNA及其应用。
背景技术
AXL一词源于希腊语“Anexelekto”，意为不受控制的，AXL与TYRO3、MER共同组成受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase，RTK)中的TAM家族。AXL基因位于染色体19q13.2，共有20个外显子，编码一个含有894个氨基酸的蛋白分子。在结构上，AXL包含3个结构域：胞外结构域、跨膜域和胞内域。AXL的配体为生长停滞特异性蛋白6(growth arrestspecific protein 6，Gas6)。AXL的激活方式包括：配体依赖的激活和配体非依赖的激活。1988年，研究者在慢性髓性白血病患者向急性期转化的相关基因筛选中发现了AXL[1]。1991年，两个课题组报道了AXL是一种具有转化潜力的受体酪氨酸酶，但它在细胞内的作用不清楚，其中一个研究组将其命名为UFO，意为未知功能的[2,3]。1996年，AXL被证明能够影响成纤维细胞的有丝分裂和生存[4]。近年来的研究发现AXL激活后能够活化下游多个信号通路，包括激活肌醇3激酶(PI3K)、蛋白激酶C(PKC)等。AXL在肺腺癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌等多种肿瘤组织中过表达，并参与调控肿瘤侵袭、转移和耐药等过程[5,6]。以AXL为靶点开发小分子抑制剂和抗体是肿瘤治疗领域的热点之一。
Clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)/CRISPR-associated(Cas)被称为第三代人工核酸内切酶，可用于各种复杂基因组的编辑。由于其突变效率高、靶向精准、操作简单、周期短及成本低的特点，被认为是一种具有广阔应用前景的基因组定点改造分子工具。Cas9靶向切割DNA是通过两种小RNA--crRNA(CRISPRRNA)、tracrRNA(trans-activating crRNA)和靶序列互补识别的原理实现的。现在已经把两种小RNA融合成一条RNA链，简称sgRNA(single guide RNA)。因此，sgRNA能否做到特异性、精确靶向目标基因是CRISPR-Cas9能否特异性敲除目标基因的先决条件。能够设计、制备出精确性和特异性靶向目标基因的sgRNA成为CRISPR-Cas9基因敲除的关键技术。利用CRISPR系统进行针对AXL的基因编辑可以为肿瘤免疫治疗提供一种快速、简便、高效的策略。
[1]LIU E,HJELLE B,BISHOP J M.Transforming genes in chronicmyelogenous leukemia[J].Proc NatlAcad Sci U S A,1988,85(6):1952-1956.
[2]O'BRYAN J P,FRYE R A,COGSWELL P C,et al.axl,a transforming geneisolated from primary human myeloid leukemia cells,encodes a novel receptortyrosine kinase[J].Mol Cell Biol,1991,11(10):5016-5031.
[3]JANSSEN J,SCHULZ A,STEENVOORDENA,et al.Anovel putative tyrosinekinase receptor with oncogenic potential[J].Oncogene,1991,6(11):2113-2120.
[4]GORUPPI S,RUARO E,SCHNEIDER C J O.Gas6,the ligand ofAxl tyrosinekinase receptor,has mitogenic and survival activities for serum starvedNIH3T3fibroblasts[J].Oncogene,1996,12(3):471-480.
[5]TSUKITA Y,FUJINO N,MIYAUCHI E,et al.Axl kinase drives immunecheckpoint and chemokine signalling pathways in lung adenocarcinomas[J/OL].Mol Cancer,2019,18(1):24.[20-11-20].https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6369543/.
[6]ZHU C J,WEI Y Q,WEI X W.AXL receptor tyrosine kinase as apromising anti-cancer approach:functions,molecular mechanisms and clinicalapplications[J/OL].Mol Cancer,2019,18(1):153[20-11-20].https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6827209/.
发明内容
本发明的第一目的在于提供特异性靶向人AXL基因的sgRNA。
本发明的第二目的在于提供一种可用于人AXL基因编辑的载体。
本发明的第三目的在于提供一种基于CRISPR系统构建人AXL基因敲除细胞的方法。
为实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
本发明第一方面提供了特异性靶向人AXL基因的sgRNA，所述的sgRNA序列包括sgRNA1、sgRNA2、sgRNA3、sgRNA4、sgRNA5、sgRNA6、sgRNA8中任意一种或多种，所述sgRNA1、sgRNA2、sgRNA3、sgRNA位于人AXL基因剪切变体201和202共同第一外显子区，所述sgRNA5、sgRNA6、sgRNA8位于人AXL基因剪切变体203第一外显子区。
进一步，所述的sgRNA1序列如SEQ ID NO.1所示，所述的sgRNA2序列如SEQ IDNO.2所示，所述的sgRNA3序列如SEQ ID NO.3所示，所述的sgRNA4序列如SEQ ID NO.4所示，所述的sgRNA5序列如SEQ ID NO.5所示，所述的sgRNA6序列如SEQ ID NO.6所示，所述的sgRNA8序列如SEQ ID NO.8所示。
进一步，所述的sgRNA序列包括sgRNA3、sgRNA4、sgRNA5和sgRNA8的组合。
本发明第二方面提供了一种基因编辑载体，所述的载体包含本发明第一方面所述的sgRNA。
本发明第三方面提供了一种试剂盒，所述的试剂盒包括本发明第一方面所述的sgRNA或本发明第二方面所述的载体。
本发明第四方面提供了一种基于CRISPR系统构建人AXL基因敲除细胞的方法，所述的方法向细胞中递送本发明第一方面所述的sgRNA或本发明第二方面所述的载体，得到人AXL基因敲除的细胞。
进一步，所述的细胞包括PANC-1细胞。
进一步，所述的方法包括如下步骤：
(1)构建携带本发明第一方面所述sgRNA的重组质粒；
(2)将步骤(1)中的重组质粒与Cas 9质粒转染到细胞中。
进一步，转染时Cas9表达载体与重组质粒的质量比为2:1。
进一步，(1)包括步骤：
a.扩增含有本发明第一方面所述sgRNA的片段；
b.将扩增产物与质粒连接；
c.将连接产物进行转化、鉴定。
进一步，所述的sgRNA为多重sgRNA。
进一步，扩增多重sgRNA的引物序列如SEQ ID NO.29-34所示。
进一步，扩增sgRNA的模板为pUC57-U6-sgRNA。
进一步，连接质粒为pGL3-U6-sgRNA-PGK-Puro。
本发明第五方面提供了一种人AXL基因敲除细胞，所述的细胞是采用本发明第四方面所述的方法构建。
进一步，所述的细胞包括PANC-1细胞。
本发明第六方面提供了一种组合物，所述的组合物包括本发明第一方面所述的sgRNA或本发明第二方面所述的载体。
本发明第七方面提供了如下任一项所述的应用：
(1)本发明第一方面所述的sgRNA或本发明第二方面所述的载体或本发明第三方面所述的试剂盒在敲除人AXL基因中的应用；
(2)本发明第一方面所述的sgRNA或本发明第二方面所述的载体或本发明第三方面所述的试剂盒在制备敲除人AXL基因的产品中的应用；
(3)本发明第一方面所述的sgRNA在构建人AXL基因编辑载体中的应用；
(4)本发明第一方面所述的sgRNA或本发明第二方面所述的载体或本发明第三方面所述的试剂盒在构建人AXL基因敲除的细胞中的应用；
(5)本发明第六方面所述的组合物在制备预防和/或治疗癌症的药物中的应用。
进一步，所述的细胞包括PANC-1细胞。
进一步，所述的癌症包括肺腺癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌。
进一步，所述的癌症为胰腺癌。
本发明的优点和有益效果：
本发明提供了特异性靶向人AXL基因的sgRNA，本发明的sgRNA可以通过CRISPR/Cas9系统实现高效打靶。
本发明还提供了一种基于CRISPR系统构建人AXL基因敲除细胞的方法。
附图说明
图1是UCSC Genome Browser Home网站中人源AXL基因剪切变体相关信息图，其中图A是人源AXL基因剪切变体位置示意图，人源AXL基因剪切变体信息列表图；
图2是8条sgRNA以“头对头”原则设计模式图；
图3是T7EN I酶切检测sgRNA介导的切割效率实验结果图；
图4是多重sgRNA重组质粒4条sgRNA串联表达模式图；
图5是多重sgRNA重组质粒测序结果图；
图6是Western Blot检测单克隆细胞AXL表达水平实验结果图；
图7是AXL敲除后对胰腺癌细胞PANC-1克隆形成能力和生存信号通路相关蛋白的影响实验结果图，其中，图A是克隆形成实验结晶紫染色显示野生型细胞和敲除型细胞克隆球的代表性图片及克隆数统计图，图B是Western Blot检测敲除AXL后PANC-1细胞信号通路变化实验结果图。
具体实施方式
基因编辑
基因组编辑技术诸如锌指核酸酶(ZFN)(Porteus,和Baltimore(2003)Science300:763；Miller等人(2007)Nat.Biotechnol.25:778-785；Sander等人(2011)Nature Methods 8:67-69；Wood等人(2011)Science 333:307)和转录激活剂样效应核酸酶(TALEN)(Wood等人(2011)Science 333:307；Boch等人(2009)Science326:1509-1512；Moscou和Bogdanove(2009)Science 326:1501；Christian等人(2010)Genetics 186:757-761；Miller等人(2011)Nat.Biotechnol.29:143-148；Zhang等人(2011)Nat.Biotechnol.29:149-153；Reyon等人(2012)Nat.Biotechnol.30:460-465)已经具有生成靶向的基因组修饰并提供准确地校正疾病突变的潜力。尽管有效，但这些技术受实际限制的阻碍，因为ZFN和TALEN配对都需要合成用于给定DNA靶位点的大且独特的识别蛋白。几个研究组最近已经报道了绕过这些关键限制的通过使用工程改造的II型CRISPR/Cas9系统的高效基因组编辑(Cong等人(2013)Science 339:819-823；Jinek等人(2013)eLife 2:e00471；Mali等人(2013)Science 339:823-826；Cho等人(2013)Nat.Biotechnol.31:230-232；Hwang等人(2013)Nat.Biotechnol.31:227-229)。不同于制备相对耗时且困难的ZFN和TALEN，依赖于向导RNA(sgRNA)、Cas9蛋白的核酸酶活性的CRISPR构建体，对于合成是简单且快速的，并且可以多重化。
术语“Cas9蛋白”是指CRISPR/Cas9系统的主要蛋白质元素，其与crRNA(CRISPRRNA)和tracrRNA(反式激活性crRNA)形成复合物以形成活化的内切核酸酶或切口酶。CRISPR/Cas9系统是一种RNA引导的基因工程工具，它能够引起靶点特异性的DNA双链断裂，这种断裂能够激发内源性的DNA修复机制，包括NHEJ和同源重组(Homologydirectedrepair，HDR)等。NHEJ是一种低保真度的DNA修复，断裂的DNA修复重连的过程中会发生碱基随机的插入或丢失，实现剪接的改变。
此外，Cas9蛋白质不仅可包括野生型Cas9，还可包括失活的Cas9(dCas9)或Cas9变体诸如Cas9切口酶。其中，失活的Cas9可为包含与dCas9结合的FokI核酸酶结构域的RFN或与转录激活因子或阻遏物结构域结合的dCas9；Cas9切口酶可为D10ACas9或H840ACas9，但不限于此。
本发明的Cas9蛋白在其来源上不受限制。例如，Cas9蛋白可以来源于化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)、新凶手弗朗西丝菌(Francisella novicida)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、嗜肺性军团病杆菌(Legionellapneumophila)、无害李斯特(氏)菌(Listeria innocua)或变形链球菌(Streptococcus mutans)。
载体
在本发明中，术语“载体”是指能够转运与其连接的另一核酸的核酸分子。载体包括但不限于，单链、双链、或部分双链的核酸分子；包含一个或多个游离端、无游离端(例如环状的)的核酸分子；包含DNA、RNA、或两者的核酸分子；以及本领域已知的其他多种多样的多核苷酸。一种类型的载体是“质粒”，其是指其中可以诸如通过标准分子克隆技术插入额外的DNA区段的环状双链DNA环。另一种类型的载体是病毒载体，其中病毒衍生的DNA或RNA序列存在于用于包装为病毒(例如，逆转录病毒、复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒、复制缺陷型腺病毒和腺相关病毒)的载体中。病毒载体还包括由用于转染入宿主细胞中的病毒携带的多核苷酸。
某些载体(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)能够在它们被导入的宿主细胞中自主复制。其他载体(例如，非附加型哺乳动物载体)在引入宿主细胞后整合至宿主细胞的基因组中，并且由此与宿主基因组一起复制。而且，某些载体能够指导它们可操作连接的基因的表达。此类载体在本文中被称为“表达载体”。在重组DNA技术中使用的普通表达载体通常是质粒形式。
方法
在一些方面，本发明提供这样的方法，其包括向细胞递送一种或多种多核苷酸，诸如或如本文所述的一种或多种载体、其一种或多种转录物和/或一种或多种由其转录的蛋白。可以使用常规的基于病毒和非病毒的基因转移方法来将核酸引入哺乳动物细胞或靶组织中。可以使用此类方法来向培养物或细胞施用编码CRISPR系统的组分的核酸。非病毒载体递送系统包括DNA质粒、RNA、裸核酸以及与递送媒介物(诸如脂质体)复合的核酸。病毒载体递送系统包括DNA和RNA病毒。
核酸的非病毒递送方法包括脂转染、核转染、显微注射、基因枪、病毒体等。脂转染描述于例如美国专利号5,049,386、4,946,787和4,897,355中并且脂转染试剂是市售的(例如，TransfectamTM和LipofectinTM)。
药物
本发明提供了一种药物，所述药物是包括藉由CRISPR/Cas9基因编辑法破坏AXL的试剂。
所述的药物中，还可含有药学上可接受的载体。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量。本发明的药物制剂还可制成缓释制剂。
其他
术语“sgRNA”即“单一引导RNA(Single-guide RNA，sgRNA)”，其是基于“目标基因上的靶位点”设计，其包含的序列足以与内切核酸酶Cas9协同作用，引导发生Cas9介导的靶位点上DNA双链断裂。
术语“多核苷酸”、“核苷酸”和“核酸”可互换使用。它们是指任何长度的核苷酸的聚合形式，无论脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸、或其类似物。多核苷酸可具有任何三维结构，并且可以执行已知或未知的任何功能。以下是多核苷酸的非限制性实例：基因或基因片段的编码区或非编码区、从连锁分析定义的多个基因座(一个基因座)、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转运RNA、核糖体RNA、短干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、微-RNA(miRNA)、核酶、cDNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、核酸探针、和引物。多核苷酸可以包含一个或多个修饰的核苷酸，诸如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。如果存在，可以在聚合物组装之前或之后进行核苷酸结构的修饰。核苷酸的序列可以被非核苷酸组分中断。多核苷酸可以在聚合后进一步修饰，诸如通过与标记的组分缀合来进一步修饰。
尽管本文采用特定术语，但它们仅在一般和描述性意义上、而不是为了限制的目的来使用。除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。
本文中在诸如“A和/或B”的短语中使用的术语“和/或”旨在包括A和B两者；A或B；A(单独)；以及B(单独)。同样地，在诸如“A、B和/或C”的短语中使用的术语“和/或”旨在涵盖以下实施方案的每一个：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；以及C(单独)。
除非另有说明，本发明的实施例采用免疫学、生物化学、化学、分子生物学、微生物学、细胞生物学、基因组学和重组DNA的常规技术，其在本领域的技术内(Sambrook,Fritsch和Maniatis(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版；Ausubel等人,编(1987)Current Protocols in Molecular Biology)；MacPherson等人,编(1995)Methodsin Enzymology(Academic Press,Inc.):PCR 2:A Practical Approach)；Harlow和Lane,编(1988)Antibodies,A Laboratory Manual；Freshney,编(1987)Animal Cell Culture)。
以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案，具体实施例不代表对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明理念所做出的一些非本质的修改和调整仍属于本发明的保护范围。
实施例1人AXL基因的靶向性sgRNA的设计与合成
登录UCSC Genome Browser Home网站检索到人源AXL基因有5个剪切变体(201、201、203、204、205)，如图1所示。其中有3个剪切变体(201、202、203)能够编码蛋白，针对能够编码蛋白的3个剪切变体组成性外显子区域按照“头对头”原则设计8条成对的sgRNA，其中sgRNA 1-4位于AXL剪切变体201和202共同第一外显子区，sgRNA5-8位于AXL剪切变体203第一外显子区(同时也是剪切变体201、202的外显子区)。8条配对的sgRNA的设计方法如图2所示，sgRNA序列如表1所示。在sgRNA正义链的5'端添加ACCG，反义链5'端添加AAAC，形成粘性末端(如表2所示)，以便与Bsa I酶切后的pGL3-U6-sgRNA-PGK-Puro载体连接。sgRNA的序列由金唯智公司合成。
表1 8条靶向AXL基因的sgRNA序列
Figure BDA0003076441070000091
Figure BDA0003076441070000101
表2针对sgRNA序列设计的引物
Figure BDA0003076441070000102
实施例2 sgRNA重组质粒构建
一、实验方法
1、质粒构建
(1)将反向互补的两条寡核苷酸单链热变性、退火构建成有粘性末端的单一sgRNA双链片段。PCR反应体系：sgRNA正义链2μL(100μM)，sgRNA反义链2μL(100μM)，NE BufferⅡ2μL，去离子水补至20μL；PCR反应条件：95℃，5min；95℃，1s(-2℃/循环)，共6个循环；85℃，1s(-0.1℃/循环)，共601个循环。
(2)将pGL3-U6-sgRNA-PGK-Puro用Bsa I酶切进行线性化，将sgRNA与线性化的pGL3-U6-sgRNA-PGK-Puro载体连接。连接反应体系：酶切后的载体12ng，双链sgRNA片段2μL，5×T4 DNA连接酶缓冲液1μL，T4 DNA连接酶0.5μL，去离子水补至5μL。PCR反应条件：16℃，2h；
(3)连接产物进行转化，挑克隆，提质粒，送公司测序。
2、转化
连接产物转化DH5α感受态细胞
(1)将DH5α感受态细胞从-80℃冰箱取出放置冰上融化；
(2)在无菌操作台内操作，取出一个1.5mL无菌离心管，在冰上将5μL连接产物加入10μL感受态细胞中，吹打混匀后冰上静置30min；
(3)冰浴结束后，将1.5mL离心管插入浮漂中放入42℃水浴锅内热击45s；
(4)立即将离心管取出放于冰上静置2min；
(5)在离心管内加入100μL不含抗生素LB培养基，吹打混匀，45°角倾斜放于细菌摇床内摇37℃200rpm摇1h；
(6)摇菌结束，4500rpm，3min离心；
(7)将含氨苄抗生素的LB培养板从4℃拿出复温至室温，吸弃60μL上清，留50μL重悬菌体，均匀涂在细菌培养板上，加入适量无菌钢珠，上下左右晃动培养板使菌液均匀涂满培养板；
(8)将培养板倒扣，做好标记后置于37℃恒温培养箱内孵育16h。
3、挑取单克隆、摇菌
(1)在15mL无菌离心管内加入3mL LB培养基和3μL 50mg/mL的氨苄抗生素，吹打混匀；
(2)用镊子夹取小白枪头轻轻挑取边缘清楚、圆形、大小均匀的单克隆，放入含抗生素的LB培养基的15mL离心管内；
(3)盖上离心管盖，用胶布固定，做好标记，45°角倾斜放于37℃细菌摇床内摇12h，转速为200rpm。
4、质粒提取
(1)向吸附柱CP4中加入500μL的平衡液BL，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
(2)将培养过夜的菌液移入2mL离心管内，12000rpm离心1min，尽量移除上清；
(3)向菌体沉淀加入500μL Buffer P1和5μL RNase A(10mg/mL)，涡旋混匀保证细菌悬液中无小的菌块；
(4)加入500μL Buffer P2，温和地翻转1.5mL离心管，使菌体充分裂解(不宜超过5分钟)；
(5)向离心管加入500μLBuffer P4，立即轻轻翻转6-8次，直至形成紧实的白色凝集块；
(6)12000rpm离心10min，小心吸取上清加入过滤柱CS中；
(7)12000rpm离心2min，流出液收集在一个干净的2mL离心管中；
(8)向滤液中加入0.3倍体积的异丙醇，颠倒混匀，转移至吸附柱CP4中，12000rpm离心1min，弃流出液；
(9)将CP4放回收集管，加入500μL去蛋白液PD，12000rpm离心1min，弃流出液；
(10)将CP4放回收集管，加入600μL漂洗液PW，12000rpm离心1min，弃流出液，重复此操作一次；
(11)再用12000rpm离心2min，彻底去除残留的PW；
(12)将离心柱小心移入一干净的1.5mL离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100μL预热至65℃去离子水，室温静置2min,12000rpm离心1min；
(13)测取260nm紫外线下光密度(OD值)，测定所提质粒的DNA浓度，放-20℃保存备用。
5、琼脂糖凝胶电泳
(1)配制1％琼脂糖凝胶：60mL 1×TAE溶液添加0.6g琼脂糖粉末，用微波炉中高火加热3分钟，待溶液冷却至65℃左右时，再加入5μL溴化乙锭溶液(10mg/mL)，晃匀混合液后倒入准备好的制胶板内，室温静置40min；
(2)加样：将DNA样品与6×DNA上样缓冲液按比例配成混合体系，按顺序加入凝胶孔中，在上样孔前一个孔加入5μL DNAMarker，用来指示目的条带的大小位置；
(3)电泳：恒压160V，20min，当溴酚蓝移动到胶面下1/3处停止电泳；
(4)电泳完毕后取出凝胶，于成像仪中拍照。
6、细胞转染
(1)将HEK-293T细胞按3×105个/孔接种于6孔细胞培养板中，放培养箱过夜使其贴壁生长；
(2)转染前1h更换800μL完全培养基；
(3)转染时Cas9表达载体与sgRNA重组质粒的质量比为2:1，待转染质粒与Lipofectamine 2000的质量体积比为1:3，分别用100μL 1×Opti-MEM I培养基稀释总质量为2.5μg的待转质粒和7.5μL Lipofectamine 2000脂质体，将脂质体稀释液逐滴加入质粒稀释液中，轻轻吹打混匀，室温静置20min，将200μL转染复合物均匀滴加至6孔板相应孔中轻轻晃匀，移入细胞培养箱培养；
(4)转染6h后，将细胞培养板中的液体更换为新鲜培养基；
(5)转染24h后，加入2μg/mL的Puro进行药物筛选；
(6)转染96h后裂解细胞，抽提基因组DNA。
7、T7EN I酶切检测sgRNA介导的切割效率
(1)设计T7EN I检测引物：设计合适的T7EN I检测引物(如表3所示)，使之能扩增出含有sgRNA识别位点的DNA片段。
表3 T7EN I检测引物
Figure BDA0003076441070000141
(2)PCR扩增：反应体系为，基因组DNA200 ng，T7EN I检测引物4μL(10μmol/L)，
Figure BDA0003076441070000142
FastPfu Fly Buffer 20μL，dNTPs 8μL，
Figure BDA0003076441070000143
FastPfu FlyDNAPolymerase 2μL，去离子水补至100μL。反应条件为，95℃2min；95℃20s，60℃20s(-0.2℃/循环)，72℃1min，共30个循环；72℃5min。
(3)T7EN I酶切：退火体系：纯化后的PCR产物200ng，10×T7EN I Buffer 2μL，去离子水将体系补至20μL。反应条件：95℃，5min；95℃，1s(-2℃/循环)，共6个循环；85℃，1s(-0.1℃/循环)，共601个循环。反应结束后，立即将产物取出置于冰上，在体系中补加0.5μLT7EN I酶，37℃孵育25min。
(4)进行琼脂糖凝胶电泳，拍照成像，并通过Image J软件对成像结果进行定量，切割效率(％)＝(两条切割带的灰度值之和/全长带与切割带灰度值的总和)×100％，计算出具体的切割效率。
二、实验结果
单条sgRNA的切割效率检测结果如表4、图3所示。
表4单条sgRNA的切割效率
Figure BDA0003076441070000151
实施例3设计多重sgRNA引物
根据T7EN I酶切结果和多重sgRNA设计原则，筛选出切割活性高的4条配对sgRNA(分别为sgRNA3、sgRNA4、sgRNA5、sgRNA8)。以pUC57-U6-sgRNA载体为模板，设计含有这4条配对sgRNA的多重sgRNA引物序列(如表5所示，其中下划线标识4条配对sgRNA在引物序列中的位置)。
表5多重sgRNA引物序列
Figure BDA0003076441070000152
Figure BDA0003076441070000161
实施例4多重sgRNA重组质粒的构建
1、将两种sgRNA进行连接、扩增的方法：以pUC57-U6-sgRNA载体为模板，用引物扩增出含有两种sgRNA的PCR产物，PCR反应体系：pUC57-U6-sgRNA10ng，引物2μL(10μmol/L)，dNTPs 4μL，
Figure BDA0003076441070000162
FastPfu Fly Buffer 10μL，
Figure BDA0003076441070000163
FastPfu FlyDNAPolymerase 1μL，去离子水补至50μL。PCR反应条件：95℃2min；95℃20s，60℃20s(-0.2℃/循环)，72℃40s，共30个循环；72℃5min。
2、酶切、连接：将纯化后的PCR产物与pGL3-U6-sgRNA-ccdB-EF1α-Puro载体进行酶切、连接(如图4所示)，反应体系：纯化后的PCR产物200ng，pGL3-U6-sgRNA-ccdB-EF1α-Puro载体200ng，5×T4 DNA连接酶缓冲液3μL，T4 DNA连接酶1μL，Esp3 I 1μL，去离子水补至20μL。反应条件：37℃10min，16℃15min，共10个循环；37℃20min；85℃10s。
3、转化、挑克隆、提质粒，测序正确的克隆用于后续实验。
实施例5利用多重sgRNA重组质粒构建人AXL基因敲除细胞
一、实验方法
1、多重sgRNA重组质粒与Cas9质粒转染胰腺癌PANC-1细胞
(1)转染前24h，将PANC-1细胞按3×105/孔接种于6孔细胞培养板中；
(2)转染前1h更换预热的新鲜培养基，每孔800μL；
(3)转染时Cas9表达载体与多重sgRNA重组质粒的质量比为2:1，待转染质粒与Lipofectamine 2000的质量体积比为1:3，分别用100μL 1×Opti-MEM I培养基稀释总质量为2.5μg的待转质粒和7.5μL Lipofectamine 2000脂质体，将脂质体稀释液逐滴加入质粒稀释液中，轻轻吹打混匀，室温静置20min，将200μL转染复合物均匀滴加至6孔板相应孔中轻轻晃匀，移入细胞培养箱培养；
(4)转染6h后，将6孔板中的液体更换为新鲜培养基；
(5)转染24h后，加入4μg/mL的嘌呤霉素进行药物筛选；
(6)48h后对照孔细胞全部死亡，转染孔换成含2μg/mL嘌呤霉素的新鲜培养基。
(7)待细胞满后进行单克隆分选，按每孔5个细胞接种于96孔培养板中，放入细胞培养箱中培养。
2、细胞蛋白提取与浓度测定
2.1细胞蛋白提取
(1)配制裂解液：将1×RIPA、25×PI、100×磷酸酶抑制剂、100×PMSF按100:4:1:1的比例混合，置于冰上备用；
(2)从培养箱中取出培养好的细胞，吸弃培养基，沿培养皿壁小心的加入1mL预冷的1×PBS，轻轻晃动培养皿洗涤细胞，吸弃上清，尽量弃干净；
(3)将裂解液吹打混匀，6孔板每孔加入60μL裂解液，晃匀，使板底细胞可以充分接触裂解液；
(4)将6孔板置于冰上，每一种细胞用一个干净的细胞刮刀，先画“十”字，在打圈充分地把贴壁细胞刮下来，用移液枪将细胞裂解液吸入标记好的离心管；
(5)漩涡震荡30s，冰上静置5min，重复3次；
(6)4℃，12000g，15min离心；
(7)定量吸取上清，转移到新的标记好的离心管中，取2μL用于蛋白浓度测定，将剩余蛋白样品与5×Loading Buffer严格按照4:1的比例混合均匀，置于100℃的金属加热器中加热10min；；
(9)离心，5000rpm，5min，离心后蛋白样品保存于-20℃。
2.2蛋白浓度的检测
(1)根据BCA蛋白检测试剂盒说明书稀释标准蛋白液，加入96孔板中，绘制标准曲线；
(2)用去离子水将待检测的蛋白液稀释5倍，每孔10μL加入96孔板中；
(3)根据试剂盒说明书配制BCA工作液，每孔200μL加入96孔板中，混合均匀后放入37℃孵箱避光静置30min；
(4)用酶标仪在562nm波长下测定蛋白标准品和待检测蛋白液的吸光度。
3、AXL基因在胰腺癌PANC-1细胞中的功能分析
3.1采用细胞克隆实验检测AXL基因敲除PANC-1细胞的克隆形成能力
3.2采用Western Blot检测细胞生存信号相关蛋白AKT和ERK
二、实验结果
1、通过Western Blot检测获得的单克隆细胞中AXL的表达情况，一共检测了23个单克隆，其中有14个单克隆实现了AXL基因的完全敲除，9株细胞仍然存在AXL的表达，敲除效率达到60.8％(如图6所示)；
2、克隆形成实验结果表明，与未敲除AXL基因的PANC-1细胞相比，敲除AXL基因后，PANC-1细胞的克隆形成能力减弱(如图7A所示)；
3、Western Blot结果显示，敲除AXL基因后，PANC-1细胞的p-AKT蛋白显著降低(如图7B所示)。
综上所述，本发明设计的特异性靶向AXL基因的sgRNA具有较高的敲除效率。AXL在胰腺癌细胞PANC-1的增殖和生存中发挥重要作用，靶向AXL治疗胰腺癌可能是一个很有潜力的策略。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
序列表
<110> 徐州医科大学
南京国际医院有限公司
<120> 特异性靶向人AXL基因的sgRNA及其应用
<141> 2021-05-20
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<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ttccctgggt tgcccacga 19
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cggatgcttg cgaggtgag 19
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gatgaggggc cctggctgc 19
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accggaacag gatgactgga tag 23
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aaacctatcc agtcatcctg ttc 23
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accgcggatg cttgcgaggt gag 23
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accgacccct tatcacatcc gcg 23
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atgcgtctca tttagagcta gaaatagcaa gttaaaataa g 41
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cacaag 66

Claims (19)

1.特异性靶向人AXL基因的sgRNA，其特征在于，所述的sgRNA由sgRNA3、sgRNA4、sgRNA5、sgRNA8组成，所述sgRNA3、sgRNA4位于人AXL基因剪切变体201和202共同第一外显子区，所述sgRNA5、sgRNA8位于人AXL基因剪切变体203第一外显子区，所述的sgRNA3序列如SEQ ID NO.3所示，所述的sgRNA4序列如SEQ ID NO.4所示，所述的sgRNA5序列如SEQ IDNO.5所示，所述的sgRNA8序列如SEQ ID NO.8所示，所述的sgRNA为由sgRNA3、sgRNA4、sgRNA5、sgRNA8串联形成的sgRNA。
2.一种基因编辑载体，其特征在于，所述的载体包含权利要求1所述的sgRNA。
3.一种试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括权利要求1所述的sgRNA或权利要求2所述的载体。
4.一种体外基于CRISPR系统构建人AXL基因敲除细胞的方法，其特征在于，所述的方法向细胞中递送权利要求1所述的sgRNA或权利要求2所述的载体，得到人AXL基因敲除的细胞。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的细胞包括PANC-1细胞。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的方法包括如下步骤：
(1)构建携带权利要求1所述sgRNA的重组质粒；
(2)将步骤(1)中的重组质粒与Cas9表达载体转染到细胞中。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，转染时Cas9表达载体与重组质粒的质量比为2:1。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，(1)包括步骤：
a.扩增含有权利要求1所述sgRNA的片段；
b.将扩增产物与质粒连接；
c.将连接产物进行转化、鉴定。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的sgRNA为多重sgRNA。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，扩增多重sgRNA的引物序列如SEQ IDNO.29-34所示。
11.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，扩增sgRNA的模板为pUC57-U6-sgRNA。
12.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，连接质粒为pGL3-U6-sgRNA-PGK-Puro。
13.一种人AXL基因敲除细胞，其特征在于，所述的细胞是采用权利要求4-12任一项所述的方法构建。
14.根据权利要求13所述的细胞，其特征在于，所述的细胞包括PANC-1细胞。
15.一种组合物，其特征在于，所述的组合物包括权利要求1所述的sgRNA或权利要求2所述的载体。
16.如下任一项所述的应用：
(1)权利要求1所述的sgRNA或权利要求2所述的载体或权利要求3所述的试剂盒在制备敲除人AXL基因的产品中的应用；
(2)权利要求1所述的sgRNA在构建人AXL基因编辑载体中的应用；
(3)权利要求1所述的sgRNA或权利要求2所述的载体或权利要求3所述的试剂盒在体外构建人AXL基因敲除的细胞中的应用；
(4)权利要求15所述的组合物在制备预防和/或治疗癌症的药物中的应用。
17.根据权利要求16所述的应用，其特征在于，所述的细胞包括PANC-1细胞。
18.根据权利要求16所述的应用，其特征在于，所述的癌症包括肺腺癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌。
19.根据权利要求18所述的应用，其特征在于，所述的癌症为胰腺癌。
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