CN110777144B

CN110777144B - 一种特异靶向小鼠Krt14基因的sgRNA导向序列及其应用

Info

Publication number: CN110777144B
Application number: CN201911070100.0A
Authority: CN
Inventors: 岳鹏鹏; 于鸿浩; 付灿; 李勇; 马海林
Original assignee: Guilin Medical University
Current assignee: Renke (Beijing) Biotechnology Co.,Ltd.
Priority date: 2019-11-05
Filing date: 2019-11-05
Publication date: 2021-04-06
Anticipated expiration: 2039-11-05
Also published as: CN110777144A

Abstract

本发明公开了一种特异靶向小鼠Krt14基因的sgRNA导向序列及其应用，属于医学遗传学和分子生物学技术领域。所述sgRNA对应的核苷酸序列为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4中的任意一种序列。本发明还公开了利用上述的特异靶向小鼠Krt14基因的sgRNA导向序列编辑小鼠Krt14基因的方法。本发明的sgRNA导向序列可以介导Cas9蛋白高效地切割靶点DNA，进而用于编辑小鼠Krt14基因，影响小鼠Krt14基因编码蛋白的功能。本发明的sgRNA导向序列可以通过CRISPR/Cas9系统实现高效打靶，效率分别为70％、90％、65％和100％。

Description

一种特异靶向小鼠Krt14基因的sgRNA导向序列及其应用

技术领域

本发明涉及一种特异靶向小鼠Krt14基因的sgRNA导向序列及其应用，属于医学遗传学和分子生物学技术领域。

背景技术

CRISPR/Cas系统最早在细菌中被发现，其在真细菌和古细菌中行使获得性免疫功能，可抵抗外源病毒和质粒入侵。人们通过基因工程手段对微生物自身生物的CRISPR/Cas系统进行改造，从而创造了可广泛应用于高等生物的基因编辑的打靶系统，CRISPR/Cas9系统。该系统自2012年问世以来，其为生命科学以及生物医学研究注入了强大的动力，成为近年来的研究热点。2013年起，研究者们利用CRISPR/Cas9的DNA结合活性与内切酶活性，成功地在哺乳动物细胞中对基因组进行了编辑。在CRISPR/Cas9系统中，Cas9内切酶在单链向导RNA(single guide RNA,sgRNA)的指引下，通过碱基互补配对原则，结合到基因组靶点位置，产生双链DNA断裂(DSBs)，从而引发细胞内的修复机制，即非同源末端连接途径(NHEJ)或同源重组定向修复(HDR)，在修复过程中发生碱基的缺失或插入，最终达到基因编辑的目的。Cas9蛋白结合靶点的关键是sgRNA(与靶点互补的序列约20bp)，仅改变sgRNA序列，即可对感兴趣的几乎任意基因组区域进行编辑。与应用较早的基因编辑技术如锌指蛋白核酸酶(ZFN)或转录激活因子样效应物核酸酶(TALENs)相比，CRISPR/Cas9系统具有设计灵活、成本低、操作简单、准确性高、可多位点同时打靶等优势。

sgRNA中文名称为向导RNA。原核生物中Cas9靶向切割DNA是需要两种小RNA--crRNA(CRISPR RNA)和tracrRNA(transactivating crRNA)和靶序列互补识别的原理实现的。目前，通过基因工程手段将这两种小RNA融合为一种RNA，即sgRNA。sgRNA的主要功能是识别和结合到目标基因组DNA上，并介导Cas9蛋白切割DNA双链。因此，sgRNA能否做到高效靶向识别和结合目标基因是CRISPR-Cas9能否特异性编辑目标基因的先决条件，尤其是基因敲除和基因敲入，sgRNA的高效性对基因打靶的影响至关重要。因此，能够设计、制备出高效靶向目标基因的sgRNA是基于CRISPR-Cas9系统进行基因编辑的关键。

单纯性大疱性表皮松懈症是一种常染色显性遗传病。患者皮肤的真皮胶原纤维结构发生改变，皮肤、黏膜的脆性增加。轻微的机械摩擦或外伤可导致皮肤出现大疱性糜烂为特点的皮肤和黏膜机械应激反应。临床表现为幼年即可发病，皮肤广泛性的病变并累及全身各个系统，如手、脚、肘、膝、眼睛、口腔黏膜、食管、肠道以及泌尿生殖系统等，是一种严重的皮肤病。由于对该病的分子机理仍不清楚，目前的治疗办法主要以消除感染和瘙痒等症状以及预防疼痛和创伤为主，还没有治愈该病的良好方法。

研究表明，人KRT14基因突变是单纯性大疱性表皮松懈症的主要病因之一。KRT14是角蛋白家族中的一员，与角蛋白5组成一对角蛋白。正常人的皮肤内KRT14编码蛋白在表皮基底层和毛囊中表达，是一种重要的结构蛋白。Krt14基因的突变具有高度的遗传异质性，变异类型主要包括错义突变、插入突变、缺失突变、无义突变以及拼接位点突变等。不同突变类型引起的临床症状、临床表现亦不相同。因此，有必要筛查明确的、典型的KRT14致病突变位点，并将突变位点定位于小鼠基因组上，然后通过CRISPR/Cas9系统对该位点进行打靶，可以建立Krt14基因突变细胞模型或动物模型，从而精准的模拟单纯性大疱性表皮松懈症，为深入的理解KRT14基因的致病机制以及探索可行的治疗策略具有重要意义。然而，目前并没有针对小鼠Krt14基因的sgRNA导向序列以及编辑该基因的方法。鉴于此，有必要提供一种可以模拟人类致病突变的特异靶向小鼠Krt14基因的sgRNA导向序列及利用其特异性编辑Krt14基因的方法，以解决现有技术的不足。

发明内容

本发明的目的之一，提供一种特异靶向小鼠Krt14基因的sgRNA导向序列。本发明的sgRNA导向序列，是参考人类单纯性大疱性表皮松懈症KRT14基因的致病突变位点，然后将该位点定位于小鼠Krt14基因上，根据定位的位点DNA序列而设计的。本发明的sgRNA导向序列可以介导Cas9蛋白高效、特异性地切割靶点DNA，进而用于编辑小鼠Krt14基因，影响小鼠Krt14基因编码蛋白的功能。本发明的四个sgRNA导向序列均可以通过CRISPR/Cas9系统实现高效打靶，效率分别为70％、90％、65％和100％。

本发明解决上述问题的技术方案如下：一种特异靶向小鼠Krt14基因的sgRNA导向序列，所述sgRNA对应的核苷酸序列为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.4中的任意一种序列。

所述sgRNA的核苷酸序列如下：

SEQ ID NO.1：5'-gcagaacctcaatgaccgcc-3'。

SEQ ID NO.2：5'-tgaccgcctggccacctacc-3'。

SEQ ID NO.3：5'-tgtccaggtaggtggccagg-3'。

SEQ ID NO.4：5'-aggtggccaggcggtcattg-3'。

本申请的发明人，为了得到上述特异靶向小鼠Krt14基因的sgRNA导向序列，进行了如下工作：

第一步：进行了人KRT14基因致病突变位点的筛查，确定人KRT14 p.Arg125位点为拟突变位点。

单纯性大疱性表皮松懈症是由KRT14基因突变引起的，首先利用OMIM数据库筛查了人KRT14基因的致病突变，共筛查到19个突变位点(如表1所示)；为了更广泛的筛查KRT14的致病突变，本发明也利用ExAC在线数据库检索到KRT14功能失活突变9种(如图1和表2所示)；然后，本发明又利用ClinVar数据库检索KRT14致病突变情况，共检索36种突变，本发明列出10种突变(如表3所示)。综合分析三个数据的结果，最终确定了人KRT14 p.Arg125为拟突变位点。

第二步：小鼠Krt14基因致病突变位点的定位，定位小鼠p.Arg131位点的DNA编码序列。

由于人和小鼠的物种差异，同一功能基因的基因结构可能不同，因此本申请的发明人利用Clustal Omega在线软件比对了人KRT14和小鼠Krt14蛋白序列，发现人KRT14p.Arg125位点与小鼠Krt14 p.Arg131位点相对应(如图2所示)。然后从Ensembl数据库中导出小鼠Krt14基因序列，利用Vector NTI软件定位p.Arg125位点的DNA编码序列，然后在其附近设计基因打靶位点(如图3所示)。

第三步：致病位点的基因编辑：符合5'-N(21)GG序列特征的位点为CRISPR/Cas9系统的编辑靶点，然后找到p.Arg125位点附近的靶点。

利用Vector NTI软件的“Find Motifs”功能搜索具有5'-N(21)GG序列特征的位点，凡是符合该序列特征的位点均被认为是CRISPR/Cas9系统的编辑靶点，然后找到p.Arg125位点编码序列附近的靶点(如图3所示)。

所述sgRNA在Krt14基因上的靶序列符合5'-N(21)GG的序列排列规则，所述sgRNA均能通过改变编码的序列，从而影响Krt14蛋白的表达和功能。所述sgRNA在Krt14基因上的靶序列是唯一的。

本发明的目的之二，提供一种利用上述特异靶向小鼠Krt14基因的sgRNA导向序列编辑小鼠Krt14基因的方法。本发明利用上述特异靶向小鼠Krt14基因的sgRNA导向序列，构建了可模拟人类Krt14基因的致病突变的CRISPR/Cas9系统，实现了小鼠3T3细胞的高效转染，确定了合适的阳性细胞药物筛选浓度，并实现了微量细胞的基因型分析，用于非医疗诊断或治疗目的，对研究Krt14功能、单纯性大疱性表皮松懈症致病机理以及相关治疗方法等具有极其重要的作用。

本发明解决上述问题的技术方案如下：一种利用上述特异靶向小鼠Krt14基因的sgRNA导向序列编辑小鼠Krt14基因的方法，包括如下步骤：

步骤1：在上述的特异靶向小鼠Krt14基因的sgRNA导向序列的5'端加上accg合成得到正向寡核苷酸序列；

同时根据上述的特异靶向小鼠Krt14基因的sgRNA导向序列获得其对应的DNA互补链，并且在DNA互补链的5'端加上aaac合成得到反向寡核苷酸序列；

将正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列退火，形成具有粘性末端的双链DNA片段；

步骤2：利用Bsa I限制性内切酶酶切如SEQ ID NO.5所示的目标载体pGL3-U6-sgRNA质粒，得到酶切产物pGL3-U6-sgRNA-Bsa I；

步骤3：将步骤1得到的具有粘性末端的双链DNA片段和步骤2得到的酶切产物pGL3-U6-sgRNA-Bsa I连接，将连接产物转化感受态大肠杆菌并涂布于含氨苄抗性的LB培养基上，37℃过夜培养20h后，挑取单克隆并用SEQ ID NO.6所示的通用引物U6通过测序鉴定出阳性克隆，对阳性克隆摇菌、提取质粒，得到pGL3-U6-Krt14-sgRNA质粒；

步骤4：将步骤3得到的pGL3-U6-Krt14-sgRNA质粒和SEQ ID NO.7所示的pST1374-NLS-flag-linker-Cas9表达质粒，共转染小鼠3T3细胞，经药物筛选后，得到阳性的sgRNA-Cas9共转染细胞；

步骤5：将步骤4得到的阳性的sgRNA-Cas9共转染细胞，进行细胞裂解，以得到的细胞裂解液为模板进行打靶位点DNA的PCR扩增反应，取打靶位点DNA的PCR扩增产物进行Sanger测序，如果打靶位点出现套峰，则初步确认发生了基因编辑；

步骤6：TA克隆测序分析步骤5初步确认发生了基因编辑的打靶位点的基因型，并获得基因编辑后的小鼠细胞。

在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。

进一步，步骤1中，所述退火的反应体系具体为：10μM正向寡核苷酸，5μL；10μM反向寡核苷酸，5μL；10×T7 Endonuclease I buffer，2μL；ddH₂O，8μL；反应程序具体为：95℃，5min；95℃到85℃，-1℃/循环，共10个循环；85℃到25℃，-0.1℃/循环，共600个循环，退火产物-20℃保存。

采用上述进一步的有益效果是：采用上述反应体系和反应程序，可以实现正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列更加精准的配对互补，从而高效形成带有粘性末端的双链DNA片段。其中，-1℃/循环是指每降低1℃，循环一次；-0.1℃/循环，是指每降低0.1℃，循环一次。

进一步，步骤2中，所述酶切的反应体系具体为：pGL3-U6-sgRNA质粒，2μg；10×酶切buffer，2μL；Bsa I限制性内切酶，2μL；补充ddH₂O至总体积20μL，将酶切反应体系置于37℃反应3h。

采用上述进一步的有益效果是：采用上述反应体系，可以将pGL3-U6-sgRNA质粒充分酶切。

进一步，步骤3中，所述转化感受态大肠杆菌的具体方法为：取5μL连接产物快速加入到30μL感受态大肠杆菌中，充分混匀，冰上静置25min，42℃水浴热激90s，冰上冷却2min，加入150μL的LB液体培养基，转速为220转/min，37℃活化30min，然后涂布于氨苄抗性的LB培养基表面。

采用上述进一步的有益效果是：使得连接产物可以高效转化到感受态大肠杆菌中，使得重组子充分活化，提高阳性重组子的比例。

进一步，步骤3中，所述含氨苄抗性的LB培养基中，氨苄青霉素的浓度为50μg/mL。

采用上述进一步的有益效果是：采用含氨苄抗性的LB培养基，可以有效杀伤阴性大肠杆菌，提高阳性菌落数量。

进一步，步骤3中，所述摇菌的温度为37℃，转速为220转/min，过夜培养。

进一步，步骤3中，所述提取质粒采用去内毒素质粒中提试剂盒

采用上述进一步的有益效果是：采用去内毒素质粒中提试剂盒，可以获得高质量、高浓度、无内毒素的质粒，提高后续的细胞转染效率。

上述去内毒素质粒中提试剂盒可以市售购买，如可以购自北京康为世纪生物科技有限公司，货号为CW2105S。

进一步，步骤4中，所述药物为浓度为10μg/ml的嘌呤霉素和浓度为20μg/ml的杀稻瘟菌素。

采用上述进一步的有益效果是：利用嘌呤霉素和杀稻瘟菌素，可以高效筛选出sgRNA-Cas9的阳性转染细胞。

进一步，步骤4中，所述小鼠3T3细胞在转染前，先接种培养于含5％v/v胎牛血清的DMEM完全培养基中，于37℃，5％CO₂培养箱中培养，每2d-3d更换新鲜培养基，待细胞汇合度达到80％-90％后，以0.25％胰蛋白酶消化并传代，然后分至6孔板中，16h-18h后，待细胞汇合度达到80％-90％时进行转染。

采用上述进一步的有益效果是：小鼠3T3细胞，即小鼠成纤维细胞。采用小鼠3T3细胞，可以验证sgRNA导向序列具有高效的基因编辑效率。小鼠3T细胞具有易培养、高效DNA转染效率等特点，且对嘌呤霉素和杀稻瘟菌素具有较高的敏感性，便于药物筛选阳性转染细胞。

转染小鼠3T3细胞，采用Lipofectamine^TM3000Transfection Reagent(Invitrogen^TM)试剂盒。上述试剂盒可以市售购买，如可以购自Thermo Fisher Scientific公司，货号为L3000015。转染时，每个孔(直径34.8mm)转染sgRNA表达质粒2.5μg和Cas9质粒2.5μg。

上述含胎牛血清和DMEM培养基，可以从市面购买，如购自Thermo FisherScientific公司，货号为16140071或11965118，都可以达到相同的效果。

进一步，步骤5中，所述打靶位点DNA的PCR扩增反应的体系为：细胞裂解液2μL，上游引物1μL，下游引物1μL，dNTP Mixture 2μL，TaKaRa Ex Taq 1μL，10×Ex Taq Buffer2.5μL，灭菌水补充至25μL；所述打靶位点DNA的PCR扩增反应的程序为：95℃，5min；95℃，20s，72℃，20s，-1℃/循环，72℃，25s，共10个循环；95℃，20s，62℃，20s，72℃，25s，共25个循环；72℃，5min，16℃，无穷。

其中，上述-1℃/循环是指每降低1℃，循环一次。

更进一步，所述上游引物的序列如SEQ ID NO.8所示。

SEQ ID NO.8：5'-ccatgaagggctcttgtggt-3'。

更进一步，所述下游引物的序列如SEQ ID NO.9所示。

SEQ ID NO.9：5'-ttggaggacactggaatggc-3'。

上述上游引物和下游引物由上海百力格生物技术有限公司合成。上述dNTPMixture、TaKaRa Ex Taq和10×Ex Taq Buffer均购自宝日医生物技术(北京)有限公司，货号为RR001A。

进一步，步骤6中，所述TA克隆测序具体为：将步骤5得到的打靶位点的PCR扩增产物进行胶回收纯化，将纯化后的DNA进行连接，然后16℃金属浴1h，得到连接产物；将连接产物转化感受态大肠杆菌并涂布于氨苄抗性的LB培养基上，37℃过夜培养20h后，进行菌落PCR反应验证，筛选出阳性克隆，并将阳性克隆进行Sanger测序。

采用上述更进一步的有益效果是：采用TA克隆测序，可以将单条PCR产物连接到载体上，通过测序分析可以得到打靶位点的基因型。

上述Solution I和PMD19载体可以市售购买，如可以购自宝日医生物技术(北京)有限公司，货号为6013。

更进一步，所述连接的反应体系体系为：PCR纯化产物40ng、Solution I 2.5μL和PMD19载体0.5μL，加水补充至5μL；所述转化感受态大肠杆菌的具体方法为：取5μL连接产物快速加入到30μL感受态大肠杆菌中，充分混匀，冰上静置25min，42℃水浴热激90s，冰上冷却2min，加入150μL的LB液体培养基，转速为220转/min，37℃活化30min，然后涂布于氨苄抗性的LB培养基表面。

更进一步，所述具有氨苄抗性的LB培养基中，氨苄青霉素的浓度为50μg/mL。

采用上述更进一步的有益效果是：采用具有氨苄抗性的LB培养基，可以有效杀伤阴性大肠杆菌，提高阳性菌落数量。

更进一步，所述菌落PCR反应的体系为：菌落水溶液1μL，Premix Taq酶5μL，上游引物0.5μL，下游引物0.5μL，灭菌水补充至10μL；所述菌落PCR反应的程序为：95℃，5min；95℃，20s，60℃，20s，72℃，25s，26个循环；72℃，5min。

更进一步，所述上游引物的序列如SEQ ID NO.10所示。

SEQ ID NO.10：5'-gtaaaacgacggccagt-3'。

更进一步，所述下游引物的序列如SEQ ID NO.11所示。

SEQ ID NO.11：5'-caggaaacagctatgac-3'。

上述上游引物和下游引物由上海百力格生物技术有限公司合成。上述Premix Taq酶购自宝日医生物技术(北京)有限公司，货号为R004Q。

更进一步，所述菌落水溶液是取直径为1mm的单克隆菌落溶解于10μL灭菌水中制备而成。

本发明的有益效果：

(1)本发明的sgRNA导向序列可以介导Cas9蛋白，高效、特异性地切割靶点DNA，进而用于编辑小鼠Krt14基因，影响小鼠Krt14基因编码蛋白的功能。本发明的四个sgRNA导向序列均可以通过CRISPR/Cas9系统实现高效打靶，效率分别为70％、90％、65％和100％。

(2)本发明利用上述特异靶向小鼠Krt14基因的sgRNA导向序列，构建了可模拟人类Krt14基因的致病突变的CRISPR/Cas9系统，用于非医疗诊断或治疗目的，实现了小鼠3T3细胞的高效转染，确定了合适的阳性细胞药物筛选浓度，并实现了微量细胞的基因型分析，用于非医疗诊断或治疗目的，对研究Krt14功能、单纯性大疱性表皮松懈症致病机理以及相关治疗方法等具有极其重要的作用。

附图说明

图1为ExAC数据库中人KRT14基因外显子结构及功能失活突变示意图。图中圆点代表功能失活突变。箭头代表基因的转录方向。

图2为人KRT14和小鼠Krt14基因编码蛋白序列比对。框内代表拟突变的人125位精氨酸(Arg)位点和小鼠131位Arg位点相对应。

图3为模拟人KRT14基因突变的小鼠Krt14基因打靶位点示意图及序列。

图4为pGL3-U6-Krt14-sgRNA4的测序峰图。图中，黑色阴影表明sgRNA4的编码序列正确插入到pGL3-U6-sgRNA质粒载体中。

图5为sgRNA1-Cas9药筛后的阳性转染细胞。

图6为sgRNA1靶点基因编辑序列。阴影部分为发生编辑的打靶序列。

图7为sgRNA2靶点基因编辑序列。阴影部分为发生编辑的打靶序列。

图8为sgRNA3靶点基因编辑序列。阴影部分为发生编辑的打靶序列。

图9为sgRNA4靶点基因编辑序列。阴影部分为发生编辑的打靶序列。

图10为sgRNA1打靶位点TA克隆的PCR产物电泳图。图中，M代表Marker，数字代表TA克隆的菌落序号。

具体实施方式

以下结合具体附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

一、进行了人KRT14基因致病突变位点的筛查，确定人KRT14 p.Arg125位点为拟突变位点。

表1 OMIM数据库中人KRT14基因致病突变情况

注：加粗字体为拟突变位点。

表2 ExAC数据库中人KRT14基因功能失活突变情况

表3 ClinVar数据库中人Krt14基因缺失突变情况

注：加粗字体为拟突变位点；共检索到36种突变，本表列出10种突变。

二、小鼠Krt14基因致病突变位点的定位，定位小鼠p.Arg131位点的DNA编码序列。

三、致病位点的基因编辑：符合5'-N(21)GG序列特征的位点为CRISPR/Cas9系统的编辑靶点，然后找到p.Arg125位点附近的靶点。

利用Vector NTI软件的“Find Motifs”功能搜索具有5'-N(21)GG序列特征的位点，凡是符合该序列特征的位点均被认为是CRISPR/Cas9系统的编辑靶点，然后找到p.Tyr609位点编码序列附近的靶点(如图3所示)。

本发明共设计4个打靶位点的sgRNA导向序列，分别为如SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的序列。

SEQ ID NO.1：5'-gcagaacctcaatgaccgcc-3'(以下简称为“sgRNA1”)。

SEQ ID NO.2：5'-tgaccgcctggccacctacc-3'(以下简称为“sgRNA2”)。

SEQ ID NO.3：5'-tgtccaggtaggtggccagg-3'(以下简称为“sgRNA3”)。

SEQ ID NO.4：5'-aggtggccaggcggtcattg-3'(以下简称为“sgRNA4”)。

四、利用上述sgRNA导向序列编辑小鼠Krt14基因

步骤1：sgRNA表达载体的构建

在上述4个sgRNA导向序列的5'端加上accg合成得到正向寡核苷酸序列(Krt14-M-sg1⁺、Krt14-M-sg2⁺、Krt14-M-sg3⁺、Krt14-M-sg4⁺)；

同时根据上述sgRNA导向序列获得其对应的DNA互补链，并且在DNA互补链的5'端加上aaac合成得到反向寡核苷酸序列(Krt14-M-sg1^-、Krt14-M-sg2^-、Krt14-M-sg3^-、Krt14-M-sg4^-)；

将正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列退火，形成具有粘性末端的双链DNA片段。其中，退火的反应体系具体为：10μM正向寡核苷酸，5μL；10μM反向寡核苷酸，5μL；10×T7Endonuclease I buffer，2μL；ddH₂O，8μL；反应程序具体为：95℃，5min；95℃到85℃，-1℃/循环(即每降低1℃，循环一次)，共10个循环；85℃到12℃，-0.1℃/循环(即每降低0.1℃，循环一次)，共600个循环，退火产物-20℃保存。

化学合成的正向寡核苷酸和反向寡核苷酸，具体如表4所示。

表3化学合成的正向寡核苷酸和反向寡核苷酸

Krt14-M-sg1<sup>+</sup>	5'-accggcagaacctcaatgaccgcc-3'(SEQ ID NO.30)
		Krt14-M-sg1<sup>-</sup>	5'-aaacggcggtcattgaggttctgc-3'(SEQ ID NO.31)
Krt14-M-sg2<sup>+</sup>	5'-accgtgaccgcctggccacctacc-3'(SEQ ID NO.32)
		Krt14-M-sg2<sup>-</sup>	5'-aaacggtaggtggccaggcggtca-3'(SEQ ID NO.33)
Krt14-M-sg3<sup>+</sup>	5'-accgtgtccaggtaggtggccagg-3'(SEQ ID NO.34)
		Krt14-M-sg3<sup>-</sup>	5'-aaaccctggccacctacctggaca-3'(SEQ ID NO.35)
Krt14-M-sg4<sup>+</sup>	5'-accgaggtggccaggcggtcattg-3'(SEQ ID NO.36)
		Krt14-M-sg4-	5'-aaaccaatgaccgcctggccacct-3'(SEQ ID NO.37)

步骤2：利用Bsa I限制性内切酶酶切SEQ ID NO.5所示的目标载体pGL3-U6-sgRNA质粒，得到酶切产物pGL3-U6-sgRNA-Bsa I。其中，酶切的反应体系具体为：pGL3-U6-sgRNA质粒，2μg；10×酶切buffer，2μL；Bsa I限制性内切酶，2μL；补充ddH₂O至总体积20μL，将酶切反应体系置于37℃反应3h。

步骤3：将步骤1得到的具有粘性末端的双链DNA片段分别和步骤2得到的酶切产物pGL3-U6-sgRNA-Bsa I连接，取5μL连接产物快速加入到30μL感受态大肠杆菌中，充分混匀，冰上静置25min，42℃水浴热激90s，冰上冷却2min，加入150μL的LB液体培养基，转速为220转/min，37℃活化30min。然后，涂布于含氨苄抗性的LB培养基(其中氨苄青霉素的浓度为50μg/mL)表面，37℃过夜培养20h后，挑取单克隆并用菌液PCR和琼脂糖凝胶电泳的出阳性克隆。将阳性克隆在37℃，转速为220转/min，摇菌过夜培养。采用去内毒素质粒中提试剂盒提取质粒，分别得到pGL3-U6-Krt14-sgRNA1质粒、pGL3-U6-Krt14-sgRNA2质粒、pGL3-U6-Krt14-sgRNA3质粒和pGL3-U6-Krt14-sgRNA4。上述质粒利用如SEQ ID NO.6所示的通用引物U6进行测序确认目标DNA片段插入到载体的特定位点(如图4所示)。上述去内毒素质粒中提试剂盒可以市售购买，如可以购自北京康为世纪生物科技有限公司，货号为CW2105S。

SEQ ID NO.6：5'-atggactatcatatgcttaccgta-3'。

步骤4：将小鼠3T3细胞先接种培养于含5％v/v胎牛血清的DMEM完全培养基中，于37℃，5％CO₂培养箱中培养，每2d-3d更换新鲜培养基，待细胞汇合度达到80％-90％后，以0.25％胰蛋白酶消化并传代。然后，分至6孔板中，16h-18h后，待细胞汇合度达到80％-90％时进行转染。

采用Lipofectamine^TM3000Transfection Reagent(Invitrogen^TM)试剂盒分别装载步骤3得到的pGL3-U6-Krt14-sgRNA1质粒、pGL3-U6-Krt14-sgRNA2质粒、pGL3-U6-Krt14-sgRNA3质粒、以及如SEQ ID NO.7所示的pST1374-NLS-flag-linker-Cas9表达质粒，共转染小鼠3T3细胞。上述Lipofectamine^TM3000Transfection Reagent(Invitrogen^TM)试剂盒可以市售购买，如可以购自Thermo Fisher Scientific公司，货号为L3000015。转染时，每个孔(直径34.8mm)转染sgRNA表达质粒2.5μg和pST1374-NLS-flag-linker-Cas9表达质粒2.5μg。

采用浓度为10μg/ml的嘌呤霉素和浓度为20μg/ml的杀稻瘟菌素进行药物筛选，分别得到阳性的sgRNA1-Cas9共转染细胞(如图5所示)、sgRNA2-Cas9共转染细胞、sgRNA3-Cas9共转染细胞和sgRNA4-Cas9共转染细胞。然后，将上述4组共转染细胞用磷酸盐缓冲液洗涤3次，然后用0.25％的胰蛋白酶消化，并离心收集。

步骤5：采用TransDirect Animal Tissue PCR kit试剂盒将步骤4得到的阳性的sgRNA1-Cas9共转染细胞、阳性的sgRNA2-Cas9共转染细胞、阳性的sgRNA3-Cas9共转染细胞和阳性的sgRNA4-Cas9共转染细胞分别于转速为8000转/min，5min离心去上清，加入8μL的AD1悬浮细胞沉淀，然后取8μL液体至PCR管，加入2μL的AD2，55℃孵育10min，95℃，3min；加入8μL的AD3混匀，分别得到3组细胞的细胞裂解液，作为后续打靶位点DNA的PCR扩增的模板，-20℃保存。上述TransDirect Animal Tissue PCR kit试剂盒可以市售购买，如可以购自北京全式金生物公司，货号为AD201-01。

分别以上述4组细胞的细胞裂解液为模板，进行打靶位点DNA的PCR扩增反应。打靶位点DNA的PCR扩增反应的体系为：细胞裂解液2μL，上游引物1μL，下游引物1μL，dNTPMixture 2μL，TaKaRa Ex Taq 1μL，10×Ex Taq Buffer 2.5μL，灭菌水补充至25μL。上游引物的序列如SEQ ID NO.8所示，SEQ ID NO.8：5'-ccatgaagggctcttgtggt-3'。下游引物的序列如SEQ ID NO.9所示，SEQ ID NO.9：5'-ttggaggacactggaatggc-3'。

上游引物和下游引物均由上海百力格生物技术有限公司合成。上述dNTPMixture、TaKaRa Ex Taq和10×Ex TaqBuffer均购自宝日医生物技术(北京)有限公司，货号为RR001A。

上述4组打靶位点DNA的PCR扩增反应的程序均为：95℃，5min；95℃，20s，72℃，20s，-1℃/循环(即每降低1℃，循环一次)，72℃，25s，共10个循环；95℃，20s，62℃，20s，72℃，25s，共25个循环；72℃，5min，16℃，无穷。分别取5μL上述4组打靶位点DNA的PCR扩增产物进行质量百分数为1％的琼脂糖凝胶电泳检测。

分别取上述4组打靶位点DNA的PCR产物进行Sanger测序，Sanger测序上海百力格生物技术有限公司进行。如果打靶位点出现套峰，则初步确认发生了基因编辑。测序结果如图6-图8所示。测序结果表明，在设计的4个打靶位点中，sgRNA1、sgRNA2、sgRNA3均发生了基因编辑(如图6-图9所示)，证明sgRNA1、sgRNA2、sgRNA3和sgRNA4均是可靠的基因编辑靶点。

步骤6：TA克隆测序分析步骤4初步确认发生了基因编辑的打靶位点的基因型，并获得基因编辑后的小鼠细胞。

将扩增sgRNA1、sgRNA2、sgRNA3和sgRNA4靶点的PCR产物进行胶回收纯化，将纯化后的DNA进行连接，连接的反应体系为：PCR纯化产物40ng、Solution I 2.5μL和PMD19载体0.5μL，加水补充至5μL；然后16℃金属浴1h，得到连接产物。上述Solution I和PMD19载体可以市售购买，如可以购自宝日医生物技术(北京)有限公司，货号为6013。

取5μL连接产物快速加入到30μL感受态大肠杆菌中，充分混匀，冰上静置25min，42℃水浴热激90s，冰上冷却2min，加入150μL的LB液体培养基，转速为220转/min，37℃活化30min。然后，涂布于含氨苄抗性的LB培养基(其中氨苄青霉素的浓度为50μg/mL)表面，37℃过夜培养20h后，进行菌落PCR反应验证。菌落PCR反应的体系为：菌落水溶液1μL，PremixTaq酶5μL，上游引物0.5μL，下游引物0.5μL，灭菌水补充至10μL。其中，所述菌落水溶液是取直径1mm的单克隆菌落溶解于10μL灭菌水中制备而成。上游引物的序列如SEQ ID NO.10所示，SEQ ID NO.10：5'-gtaaaacgacggccagt-3'。下游引物的序列如SEQ ID NO.11所示，SEQID NO.11：5'-caggaaacagctatgac-3'。

菌落PCR反应的程序为：95℃，5min；95℃，20s，60℃，20s，72℃，25s，26个循环；72℃，5min，然后进行电泳鉴定(图10)。

筛选出阳性克隆，并将阳性克隆进行Sanger测序。Sanger测序上海百力格生物技术有限公司进行。测序结果与原序列比对分析表明，在sgRNA1、sgRNA2、sgRNA3和sgRNA4靶点位置发生了碱基的随机插入和缺失，编辑效率分别为70％、90％、65％和100％。(如表5-表8所示)。

表5 sgRNA1靶点基因型分析

注：加粗字体代表靶点序列；斜体字母代表插入序列。

表6 sgRNA2靶点基因型分析

注：加粗字体代表靶点序列；斜体字母代表插入序列。

表7 sgRNA3靶点基因型分析

注：加粗字体代表靶点序列；斜体字母代表插入序列。

表8 sgRNA4靶点基因型分析

注：加粗表靶点序列；斜体字母代表插入序列。

由此可见，sgRNA1、sgRNA2、sgRNA3和sgRNA4导向序列均可以介导Cas9蛋白，高效、特异性地切割靶点DNA，进而用于编辑小鼠Krt14基因，影响小鼠Krt14基因的表达。本发明的四个sgRNA导向序列均可以通过CRISPR/Cas9系统实现高效打靶，效率分别为70％、90％、65％和100％。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 桂林医学院

<120> 一种特异靶向小鼠Krt14基因的sgRNA导向序列及其应用

<160> 67

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gcagaacctc aatgaccgcc 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tgaccgcctg gccacctacc 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tgtccaggta ggtggccagg 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aggtggccag gcggtcattg 20

<210> 5

<211> 4951

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ggtaccgatt agtgaacgga tctcgacggt atcgatcacg agactagcct cgagcggccg 60

cccccttcac cgagggccta tttcccatga ttccttcata tttgcatata cgatacaagg 120

ctgttagaga gataattgga attaatttga ctgtaaacac aaagatatta gtacaaaata 180

cgtgacgtag aaagtaataa tttcttgggt agtttgcagt tttaaaatta tgttttaaaa 240

tggactatca tatgcttacc gtaacttgaa agtatttcga tttcttggct ttatatatct 300

tgtggaaagg acgaaacacc gggagaccga gagagggtct cagttttaga gctagaaata 360

gcaagttaaa ataaggctag tccgttatca acttgaaaaa gtggcaccga gtcggtgctt 420

tttttaaaga attctcgacc tcgagacaaa tggcagtatt catccacaat tttaaaagaa 480

aaggggggat tggggggtac agtgcagggg aaagaatagt agacataata gcaacagaca 540

tacaaactaa agaattacaa aaacaaatta caaaaattca aaattttcgg gtttattaca 600

gggacagcag agatccactt tggccgcggc tcgagggggt tggggttgcg ccttttccaa 660

ggcagccctg ggtttgcgca gggacgcggc tgctctgggc gtggttccgg gaaacgcagc 720

ggcgccgacc ctgggactcg cacattcttc acgtccgttc gcagcgtcac ccggatcttc 780

gccgctaccc ttgtgggccc cccggcgacg cttcctgctc cgcccctaag tcgggaaggt 840

tccttgcggt tcgcggcgtg ccggacgtga caaacggaag ccgcacgtct cactagtacc 900

ctcgcagacg gacagcgcca gggagcaatg gcagcgcgcc gaccgcgatg ggctgtggcc 960

aatagcggct gctcagcagg gcgcgccgag agcagcggcc gggaaggggc ggtgcgggag 1020

gcggggtgtg gggcggtagt gtgggccctg ttcctgcccg cgcggtgttc cgcattctgc 1080

aagcctccgg agcgcacgtc ggcagtcggc tccctcgttg accgaatcac cgacctctct 1140

ccccaggggg atccaccgga gcttaccatg accgagtaca agcccacggt gcgcctcgcc 1200

acccgcgacg acgtccccag ggccgtacgc accctcgccg ccgcgttcgc cgactacccc 1260

gccacgcgcc acaccgtcga tccggaccgc cacatcgagc gggtcaccga gctgcaagaa 1320

ctcttcctca cgcgcgtcgg gctcgacatc ggcaaggtgt gggtcgcgga cgacggcgcc 1380

gcggtggcgg tctggaccac gccggagagc gtcgaagcgg gggcggtgtt cgccgagatc 1440

ggcccgcgca tggccgagtt gagcggttcc cggctggccg cgcagcaaca gatggaaggc 1500

ctcctggcgc cgcaccggcc caaggagccc gcgtggttcc tggccaccgt cggcgtctcg 1560

cccgaccacc agggcaaggg tctgggcagc gccgtcgtgc tccccggagt ggaggcggcc 1620

gagcgcgccg gggtgcccgc cttcctggaa acctccgcgc cccgcaacct ccccttctac 1680

gagcggctcg gcttcaccgt caccgccgac gtcgaggtgc ccgaaggacc gcgcacctgg 1740

tgcatgaccc gcaagcccgg tgcctgacgc ccgccccacg acccgcagcg cccgaccgaa 1800

aggagcgcac gaccccatgc atcggtacct ttaagaccaa tgacttacaa ggcagctgta 1860

gatcttagcc actttctaga gtcggggcgg ccggccgctt cgagcagaca tgataagata 1920

cattgatgag tttggacaaa ccacaactag aatgcagtga aaaaaatgct ttatttgtga 1980

aatttgtgat gctattgctt tatttgtaac cattataagc tgcaataaac aagttaacaa 2040

caacaattgc attcatttta tgtttcaggt tcagggggag gtgtgggagg ttttttaaag 2100

caagtaaaac ctctacaaat gtggtaaaat cgataaggat ccgtcgaccg atgcccttga 2160

gagccttcaa cccagtcagc tccttccggt gggcgcgggg catgactatc gtcgccgcac 2220

ttatgactgt cttctttatc atgcaactcg taggacaggt gccggcagcg ctcttccgct 2280

tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac 2340

tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa gaacatgtga 2400

gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat 2460

aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac 2520

ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct 2580

gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg 2640

ctttctcaat gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg 2700

ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt 2760

cttgagtcca acccggtaag acacgactta tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg 2820

attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg gcctaactac 2880

ggctacacta gaaggacagt atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga 2940

aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt 3000

gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt 3060

tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt ggtcatgaga 3120

ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt ttaaattaaa aatgaagttt taaatcaatc 3180

taaagtatat atgagtaaac ttggtctgac agttaccaat gcttaatcag tgaggcacct 3240

atctcagcga tctgtctatt tcgttcatcc atagttgcct gactccccgt cgtgtagata 3300

actacgatac gggagggctt accatctggc cccagtgctg caatgatacc gcgggaccca 3360

cgctcaccgg ctccagattt atcagcaata aaccagccag ccggaagggc cgagcgcaga 3420

agtggtcctg caactttatc cgcctccatc cagtctatta attgttgccg ggaagctaga 3480

gtaagtagtt cgccagttaa tagtttgcgc aacgttgttg ccattgctac aggcatcgtg 3540

gtgtcacgct cgtcgtttgg tatggcttca ttcagctccg gttcccaacg atcaaggcga 3600

gttacatgat cccccatgtt gtgcaaaaaa gcggttagct ccttcggtcc tccgatcgtt 3660

gtcagaagta agttggccgc agtgttatca ctcatggtta tggcagcact gcataattct 3720

cttactgtca tgccatccgt aagatgcttt tctgtgactg gtgagtactc aaccaagtca 3780

ttctgagaat agtgtatgcg gcgaccgagt tgctcttgcc cggcgtcaat acgggataat 3840

accgcgccac atagcagaac tttaaaagtg ctcatcattg gaaaacgttc ttcggggcga 3900

aaactctcaa ggatcttacc gctgttgaga tccagttcga tgtaacccac tcgtgcaccc 3960

aactgatctt cagcatcttt tactttcacc agcgtttctg ggtgagcaaa aacaggaagg 4020

caaaatgccg caaaaaaggg aataagggcg acacggaaat gttgaatact catactcttc 4080

ctttttcaat attattgaag catttatcag ggttattgtc tcatgagcgg atacatattt 4140

gaatgtattt agaaaaataa acaaataggg gttccgcgca catttccccg aaaagtgcca 4200

cctgacgcgc cctgtagcgg cgcattaagc gcggcgggtg tggtggttac gcgcagcgtg 4260

accgctacac ttgccagcgc cctagcgccc gctcctttcg ctttcttccc ttcctttctc 4320

gccacgttcg ccggctttcc ccgtcaagct ctaaatcggg ggctcccttt agggttccga 4380

tttagtgctt tacggcacct cgaccccaaa aaacttgatt agggtgatgg ttcacgtagt 4440

gggccatcgc cctgatagac ggtttttcgc cctttgacgt tggagtccac gttctttaat 4500

agtggactct tgttccaaac tggaacaaca ctcaacccta tctcggtcta ttcttttgat 4560

ttataaggga ttttgccgat ttcggcctat tggttaaaaa atgagctgat ttaacaaaaa 4620

tttaacgcga attttaacaa aatattaacg tttacaattt cccattcgcc attcaggctg 4680

cgcaactgtt gggaagggcg atcggtgcgg gcctcttcgc tattacgcca gcccaagcta 4740

ccatgataag taagtaatat taaggtacgg gaggtacttg gagcggccgc aataaaatat 4800

ctttattttc attacatctg tgtgttggtt ttttgtgtga atcgatagta ctaacatacg 4860

ctctccatca aaacaaaacg aaacaaaaca aactagcaaa ataggctgtc cccagtgcaa 4920

gtgcaggtgc cagaacattt ctctatcgat a 4951

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atggactatc atatgcttac cgta 24

<210> 7

<211> 9317

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

agcgcccaat acgcaaaccg cctctccccg cgcgttggcc gattcattaa tgcagctggc 60

acgacaggtt tcccgactgg aaagcgggca gtgagcgcaa cgcaattaat gtgagttagc 120

tcactcatta ggcaccccag gctttacact ttatgcttcc ggctcgtatg ttgtgtggaa 180

ttgtgagcgg ataacaattt cacacaggaa acagctatga ccatgattac gccaagctct 240

agctagaggt cgacggtata cagacatgat aagatacatt gatgagtttg gacaaaccac 300

aactagaatg cagtgaaaaa aatgctttat ttgtgaaatt tgtgatgcta ttgctttatt 360

tgtaaccatt ataagctgca ataaacaagt tggggtgggc gaagaactcc agcatgagat 420

ccccgcgctg gaggatcatc cagccggcgt cccggaaaac gattccgaag cccaaccttt 480

catagaaggc ggcggtggaa tcgaaatctc gtagcacgtg tcagtcctgc tcctcggcca 540

cgaagtgctt agccctccca cacataacca gagggcagca attcacgaat cccaactgcc 600

gtcggctgtc catcactgtc cttcactatg gctttgatcc caggatgcag atcgagaagc 660

acctgtcggc accgtccgca ggggctcaag atgcccctgt tctcatttcc gatcgcgacg 720

atacaagtca ggttgccagc tgccgcagca gcagcagtgc ccagcaccac gagttctgca 780

caaggtcccc cagtaaaatg atatacattg acaccagtga agatgcggcc gtcgctagag 840

agagctgcgc tggcgacgct gtagtcttca gagatgggga tgctgttgat tgtagccgtt 900

gctctttcaa tgagggtgga ttcttcttga gacaaaggct tggccatggt ttagttcctc 960

accttgtcgt attatactat gccgatatac tatgccgatg attaattgtc aacacgtgct 1020

gatcagatcc gaaaatggat atacaagctc ccgggagctt tttgcaaaag cctaggcctc 1080

caaaaaagcc tcctcactac ttctggaata gctcagaggc agaggcggcc tcggcctctg 1140

cataaataaa aaaaattagt cagccatggg gcggagaatg ggcggaactg ggcggagtta 1200

ggggcgggat gggcggagtt aggggcggga ctatggttgc tgactaattg agatgcatgc 1260

tttgcatact tctgcctgct ggggagcctg gggactttcc acacctggtt gctgactaat 1320

tgagatgcat gctttgcata cttctgcctg ctggggagcc tggggacttt ccacacccta 1380

actgacacac attccacaga attaattcgc gttaaatttt tgttaaatca gctcattttt 1440

taaccaatag gccgaaatcg gcaaaatccc ttataaatca aaagaataga ccgagatagg 1500

gttgagtgtt gttccagttt ggaacaagag tccactatta aagaacgtgg actccaacgt 1560

caaagggcga aaaaccgtct atcagggcga tggcccacta cgtgaaccat caccctaatc 1620

aagttttttg gggtcgaggt gccgtaaagc actaaatcgg aaccctaaag ggagcccccg 1680

atttagagct tgacggggaa agccggcgaa cgtggcgaga aaggaaggga agaaagcgaa 1740

aggagcgggc gctagggcgc tggcaagtgt agcggtcacg ctgcgcgtaa ccaccacacc 1800

cgccgcgctt aatgcgccgc tacagggcgc gtggggatac cccctagagc cccagctggt 1860

tctttccgcc tcagaagcca tagagcccac cgcatcccca gcatgcctgc tattgtcttc 1920

ccaatcctcc cccttgctgt cctgccccac cccacccccc agaatagaat gacacctact 1980

cagacaatgc gatgcaattt cctcatttta ttaggaaagg acagtgggag tggcaccttc 2040

cagggtcaag gaaggcacgg gggaggggca aacaacagat ggctggcaac tagaaggcac 2100

agtcgaggct gatcagcggg tttaaactca atggtgatgg tgatgatgac cggtacgcgt 2160

agaatcgaga ccgaggagag ggttagggat aggcttacct tcgaagggcc cctagtcgcc 2220

gccgagctga gacaggtcga tgcgagtctc gtacagtccg gtaattgact ggtgtatcag 2280

ggtggcatcg agaacttctt tggtagaggt gtaccgcttc ctgtcaatag ttgtatcgaa 2340

atacttgaag gcagcaggag cgcccagatt agtcagagta aagaggtgga taatattctc 2400

tgcttgttcg cgaattggct tgtccctgtg cttattatat gcgctcagca ctttatcgag 2460

gtttgcatcg gccagaataa cccgcttgct gaactcgcta atctgttcaa tgatttcgtc 2520

caggtagtgt ttatgttgct caacaaagag ttgcttctgc tcattgtctt cagggctacc 2580

tttgagtttc tcgtagtggg aggccagata caggaagttc acgtatttgg agggcagagc 2640

cagctcgttt cctttctgca gctctccggc ggaggccagc atccgcttcc taccattctc 2700

cagctcaaag agagagtact tgggcagttt gatgatgaga tctttcttca cttctttata 2760

gcccttagct tccaggaaat cgattggatt cttctcgaag ctggatctct ccataatagt 2820

aattccgagc agctccttaa cagacttgag tttcttggac ttgcctttct ccacttttgc 2880

cacgaccaga acggaataag ccactgtagg ggaatcgaaa ccgccatact tctttgggtc 2940

ccaatctttc ttcctggcga tcagcttgtc agagttccgc tttggcagga tgctctcctt 3000

tgagaatccg ccggtctgca cttcggtctt cttcacgata ttgacttgtg gcatggacag 3060

caccttccgc acagttgcga agtccctgcc tttatcccac acgatttctc ctgtttctcc 3120

gtttgtttcg atcagtgggc gcttccggat ttcgccgtta gccagggtta tctcagtctt 3180

aaagaaattc atgatattag agtagaagaa gtacttggcg gtggctttgc caatctcttg 3240

ctcagacttt gctatcatct tcctcacatc gtagacttta tagtcaccgt acacgaactc 3300

agactccagt ttagggtatt tcttgatcag ggcggtgcca acgacagcat tgagataggc 3360

atcgtgagca tgatggtaat tgtttatttc gcgaactttg tagaattgaa agtccttccg 3420

gaagtcagac accagcttgc tcttcagagt tatcactttc acttccctga tcagcttatc 3480

gttctcatcg tacttagtgt tcatcctaga gtcgaggatt tgtgccacgt gtttggtaat 3540

ctggcgtgtt tcgaccagtt gcctcttaat aaagccggcc ttgtcgagtt cgctcagacc 3600

tcctctttct gccttagtca gattgtcaaa cttccgctgg gtgatcagtt tggcgttgag 3660

gagctgccgc cagtaattct tcatcttctt gaccacctct tctgatggaa cattgtcaga 3720

cttaccgcga ttcttatcgg atctggtcag caccttgttg tcaatggagt catctttgag 3780

gaaggactgt ggaacaatat ggtccacgtc ataatcggac agccggttga tgtcgagttc 3840

ctggtcaacg tacatgtccc gcccgttctg gaggtagtac aggtagagtt tctcgttctg 3900

gagctgtgta ttctccacag ggtgctcctt cagtatctga gatcccagct ccttaattcc 3960

ctcttcgatt cttttcatcc gttcccgaga gttcttctgg cccttctggg tggtttggtt 4020

ctcccttgcc atttcgataa cgatattctc tggcttgtgc cgacccatca ctttgacgag 4080

ttcgtccacg accttgactg tctgcagtat tcccttcttt atggcgggtg atccagcgag 4140

gttggcgatg tgctcgtgca ggctgtcgcc ttgaccgctc acctgtgcct tctggatgtc 4200

ctctttaaat gtcagagagt catcgtgaat cagttgcatg aagttcctgt tagcgaatcc 4260

gtcggatttc aggaaatcca ggatggtctt tccgctctgt ttgtcgcgga tgccgtttat 4320

gagtttcctg gagagtctac cccacccagt gtagcgccgc cgcttgagct gtttcatgac 4380

tttatcgtca aacagatggg cataggtctt caggcgctct tcgatcatct ctctatcctc 4440

gaacagagtc agggtcagca cgatatcttc caggatgtcc tcgttctcct cattatcgag 4500

gaaatctttg tctttgatta tcttcagcag atcatggtaa gtgcccaggc tggcattaaa 4560

gcggtcctcc acgccagaga tttccactga gtcaaagcat tcgatcttct taaagtaatc 4620

ctccttgagc tgcttcactg tcacctttct attagtcttg aagagcagat caacgatagc 4680

cttcttctgc tctccggaca ggaaggcagg cttcctcatg ccctcggtca cgtacttcac 4740

tttagtcagc tcgttataga cggtgaaata ctcgtacagg agtgaatgtt tgggcaggac 4800

cttctcgttg ggcaggttct tatcgaaatt ggtcatccgt tcgatgaatg actgggcgct 4860

tgcgccctta tccacgacct cttcgaagtt ccaaggagta attgtctcct cagatttcct 4920

ggtcatccaa gcgaagcggg agttgcctct agccagaggg ccgacgtaat aagggatcct 4980

gaaggtcagg atcttctcta tcttctcccg gttatccttc aggaaaggat agaaatcctc 5040

ctgcctgcgg aggattgcat gcagctctcc caggtgtatc tgatgtggaa tggagccatt 5100

atcaaaggtc ctctgcttcc tcagcaggtc ctccctgttc agcttcacca gcagctcttc 5160

agtaccgtcc atcttctcga ggattggttt gatgaacttg taaaattctt cctgtgatgc 5220

tccgccatcg atgtatccgg catatccatt cttgctctgg tcgaagaata tctctttgta 5280

cttctctggc agctgttgcc tcacgagggc tttgagcaga gtcaggtctt gatggtgttc 5340

atcatagcgt tttatcatgg aggcgctcag aggtgctttg gtgatctcag tgttgacccg 5400

gagtatgtcg ctcagcagaa tggcgtcgga gagattctta gcagccagaa agagatcggc 5460

gtactggtcg cctatctgtg cgagcaggtt gtccagatca tcgtcatagg tgtccttgga 5520

gagctggagt ttagcatctt cggccagatc aaaattggac ttgaagttag gtgtcaggcc 5580

caggctcagg gcgatgaggt tcccaaacag gccgttcttc ttttctcctg gcagttgggc 5640

aatcagattc tccagtctgc gtgacttgga cagccgagcg gacagaatag ccttggcatc 5700

cacaccagaa gcgtttatgg gattctcctc gaacagttgg ttatatgtct gcaccagttg 5760

aatgaagagt ttatccacat cggaattatc gggattcagg tcgccctcga tcagaaagtg 5820

tcctctaaac tttatcatat gagccagggc cagatagatg agcctcaggt ctgctttatc 5880

ggtgctgtcc accagcttct tcctcagatg gtagattgta ggatactttt catggtaagc 5940

cacctcatcc acgatatttc cgaatatagg gtgcctctcg tgtttcttat cctcctccac 6000

cagaaagctc tcttccaggc ggtgaaagaa ggagtcgtcc accttagcca tttcgttgct 6060

aaagatctct tgcagataac atatccgatt cttgcggcgg gtgtatctcc gccttgcggt 6120

ccgcttcagc cgagtagctt cagcggtttc accggagtcg aagaggagtg ctccgatcag 6180

gttcttcttg attgaatggc ggtcagtatt acccagcacc ttgaatttct tgcttggcac 6240

cttatactcg tcggttatga cggcccagcc aacggagttt gtcccgatat ccagtccaat 6300

agagtatttc ttgtctctag tgtgggtccg ctggtgtctg gtcagagcac cagactgaga 6360

gaaagattta ccacactctg ggcatttgta tggcttctcg ccgggttcca gtctagattt 6420

atcgtcgtca tccttgtagt cagcggccgc caccttcctc tttttcttag gtcccatggt 6480

gctagccagc ttgggtctcc ctatagtgag tcgtattaat ttcgataagc cagtaagcag 6540

tgggttctct agttagccag agagctctgc ttatatagac ctcccaccgt acacgcctac 6600

cgcccatttg cgtcaatggg gcggagttgt tacgacattt tggaaagtcc cgttgatttt 6660

ggtgccaaaa caaactccca ttgacgtcaa tggggtggag acttggaaat ccccgtgagt 6720

caaaccgcta tccacgccca ttgatgtact gccaaaaccg catcaccatg gtaatagcga 6780

tgactaatac gtagatgtac tgccaagtag gaaagtccca taaggtcatg tactgggcat 6840

aatgccaggc gggccattta ccgtcattga cgtcaatagg gggcgtactt ggcatatgat 6900

acacttgatg tactgccaag tgggcagttt accgtaaata ctccacccat tgacgtcaat 6960

ggaaagtccc tattggcgtt actatgggaa catacgtcat tattgacgtc aatgggcggg 7020

ggtcgttggg cggtcagcca ggcgggccat ttaccgtaag ttatgtaacg cggaactcca 7080

tatatgggct atgaactaat gaccccgtaa ttgattacta ttaataacta gtcaataatc 7140

aatgtcaacg cgtatatctg gcccgtacat cgcgaagcag cgcaaaacgc ctaaccctaa 7200

gcagattctt catgcaattg tcggtcaagc cttgccttgt tgtagcttaa attttgctcg 7260

cgcactactc agcgacctcc aacacacaag cagggagcag atactggctt aactatgcgg 7320

catcagagca gattgtactg agagtgcacc ataggggatc gggagatctc ccgatccgtc 7380

gacgtcaggt ggcacttttc ggggaaatgt gcgcggaacc cctatttgtt tatttttcta 7440

aatacattca aatatgtatc cgctcatgag acaataaccc tgataaatgc ttcaataata 7500

ttgaaaaagg aagagtatga gtattcaaca tttccgtgtc gcccttattc ccttttttgc 7560

ggcattttgc cttcctgttt ttgctcaccc agaaacgctg gtgaaagtaa aagatgctga 7620

agatcagttg ggtgcacgag tgggttacat cgaactggat ctcaacagcg gtaagatcct 7680

tgagagtttt cgccccgaag aacgttttcc aatgatgagc acttttaaag ttctgctatg 7740

tggcgcggta ttatcccgta ttgacgccgg gcaagagcaa ctcggtcgcc gcatacacta 7800

ttctcagaat gacttggttg agtactcacc agtcacagaa aagcatctta cggatggcat 7860

gacagtaaga gaattatgca gtgctgccat aaccatgagt gataacactg cggccaactt 7920

acttctgaca acgatcggag gaccgaagga gctaaccgct tttttgcaca acatggggga 7980

tcatgtaact cgccttgatc gttgggaacc ggagctgaat gaagccatac caaacgacga 8040

gcgtgacacc acgatgcctg tagcaatggc aacaacgttg cgcaaactat taactggcga 8100

actacttact ctagcttccc ggcaacaatt aatagactgg atggaggcgg ataaagttgc 8160

aggaccactt ctgcgctcgg cccttccggc tggctggttt attgctgata aatctggagc 8220

cggtgagcgt gggtctcgcg gtatcattgc agcactgggg ccagatggta agccctcccg 8280

tatcgtagtt atctacacga cggggagtca ggcaactatg gatgaacgaa atagacagat 8340

cgctgagata ggtgcctcac tgattaagca ttggtaactg tcagaccaag tttactcata 8400

tatactttag attgatttaa aacttcattt ttaatttaaa aggatctagg tgaagatcct 8460

ttttgataat ctcatgacca aaatccctta acgtgagttt tcgttccact gagcgtcaga 8520

ccccgtagaa aagatcaaag gatcttcttg agatcctttt tttctgcgcg taatctgctg 8580

cttgcaaaca aaaaaaccac cgctaccagc ggtggtttgt ttgccggatc aagagctacc 8640

aactcttttt ccgaaggtaa ctggcttcag cagagcgcag ataccaaata ctgttcttct 8700

agtgtagccg tagttaggcc accacttcaa gaactctgta gcaccgccta catacctcgc 8760

tctgctaatc ctgttaccag tggctgctgc cagtggcgat aagtcgtgtc ttaccgggtt 8820

ggactcaaga cgatagttac cggataaggc gcagcggtcg ggctgaacgg ggggttcgtg 8880

cacacagccc agcttggagc gaacgaccta caccgaactg agatacctac agcgtgagct 8940

atgagaaagc gccacgcttc ccgaagggag aaaggcggac aggtatccgg taagcggcag 9000

ggtcggaaca ggagagcgca cgagggagct tccaggggga aacgcctggt atctttatag 9060

tcctgtcggg tttcgccacc tctgacttga gcgtcgattt ttgtgatgct cgtcaggggg 9120

gcggagccta tggaaaaacg ccagcaacgc ggccttttta cggttcctgg ccttttgctg 9180

gccttttgct cacatgttct ttcctgcgtt atcccctgat tctgtggata accgtattac 9240

cgcctttgag tgagctgata ccgctcgccg cagccgaacg accgagcgca gcgagtcagt 9300

gagcgaggaa gcggaag 9317

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ccatgaaggg ctcttgtggt 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ttggaggaca ctggaatggc 20

<210> 10

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gtaaaacgac ggccagt 17

<210> 11

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

caggaaacag ctatgac 17

<210> 12

<211> 1

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

g 1

<210> 13

<211> 3

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

att 3

<210> 14

<211> 2

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gc 2

<210> 15

<211> 1

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

g 1

<210> 16

<211> 1

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

t 1

<210> 17

<211> 1

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

g 1

<210> 18

<211> 1

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

c 1

<210> 19

<211> 1

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

a 1

<210> 20

<211> 2

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

ag 2

<210> 21

<211> 1

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

a 1

<210> 22

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

ggggcggact aaggggaggg ccaagactca ct 32

<210> 23

<211> 1

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

g 1

<210> 24

<211> 1

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

g 1

<210> 25

<211> 1

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

a 1

<210> 26

<211> 1

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

g 1

<210> 27

<211> 1

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

t 1

<210> 28

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

cgatccagag ga 12

<210> 29

<211> 1

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

c 1

<210> 30

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

accggcagaa cctcaatgac cgcc 24

<210> 31

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

aaacggcggt cattgaggtt ctgc 24

<210> 32

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

accgtgaccg cctggccacc tacc 24

<210> 33

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

aaacggtagg tggccaggcg gtca 24

<210> 34

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

accgtgtcca ggtaggtggc cagg 24

<210> 35

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

aaaccctggc cacctacctg gaca 24

<210> 36

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

accgaggtgg ccaggcggtc attg 24

<210> 37

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 37

aaaccaatga ccgcctggcc acct 24

<210> 38

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 38

gaccatgcag aacctcaatg accgcctggc ca 32

<210> 39

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 39

gaccatgcag aacctcaatg accccgcctg gcca 34

<210> 40

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 40

gaccatgcag aacctcaatg acccgcctgg cca 33

<210> 41

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 41

gaccatgcag aacctcaatg 20

<210> 42

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 42

gaccatgcag aacctcaatg cgcctggcca 30

<210> 43

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 43

cctcaatgac cgcctggcca cctacctgga ca 32

<210> 44

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 44

cctcaatgac cgcctggcca ccttggaca 29

<210> 45

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 45

cctcaatgac cgcctggcca cctggaca 28

<210> 46

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 46

cctcaatgac cgcctggcca ccttacctgg aca 33

<210> 47

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 47

cctcaatgac cgcctggcca ctacctggac a 31

<210> 48

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 48

cctcaatgac cgcctacctg gaca 24

<210> 49

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 49

cctcaatgac cgcctggcca ctggaca 27

<210> 50

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 50

cctcaatgac cgcctggcca ctacctggac a 31

<210> 51

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 51

cctcaatgac cgcctggcca cctaccggac a 31

<210> 52

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 52

gcaccttgtc caggtaggtg gccaggcggt ca 32

<210> 53

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 53

gcaccttgtc caggtaggtg gccggcggtc a 31

<210> 54

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 54

gcaccttgtc caggtaggtg gcccaggcgg tca 33

<210> 55

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 55

gcaccttgtc caggtaggtg gccccaggcg gtca 34

<210> 56

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 56

gcaccttgtc caggtaggtg gcc 23

<210> 57

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 57

gcaccttgtc caggtaggtg gcccggtca 29

<210> 58

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 58

gcaccttgtc caggtcaggc ggtca 25

<210> 59

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 59

gcaccttgtc caggtaggtg gaggcggtca 30

<210> 60

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 60

gaacctcaat gaccgcctgg ccacctacct gg 32

<210> 61

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 61

gaaccctggc cacctacctg g 21

<210> 62

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 62

gaacctctga ccgcctggcc acctacctgg 30

<210> 63

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 63

gaacctcatg accgcctggc cacctacctg g 31

<210> 64

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 64

gaaccgcctg gccacctacc tgg 23

<210> 65

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 65

gaacctcctg gccacctacc tgg 23

<210> 66

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 66

gaacctcaat tgaccgcctg gccacctacc tgg 33

<210> 67

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 67

gaacctcaat ttgaccgcct ggccacctac ctgg 34

Claims

1.一种特异靶向小鼠Krt14基因的sgRNA导向核苷酸片段，其特征在于，所述sgRNA对应的核苷酸序列为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4中的任意一种序列。

2.一种利用权利要求1所述的特异靶向小鼠Krt14基因的sgRNA导向序列编辑小鼠Krt14基因的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1：在权利要求1所述的特异靶向小鼠Krt14基因的sgRNA导向序列的5'端加上accg合成得到正向寡核苷酸序列；

同时根据权利要求1所述的特异靶向小鼠Krt14基因的sgRNA导向序列获得其对应的DNA互补链，并且在DNA互补链的5'端加上aaac合成得到反向寡核苷酸序列；

步骤2：利用Bsa I限制性内切酶酶切SEQ ID NO.5所示的目标载体pGL3-U6-sgRNA质粒，得到酶切产物pGL3-U6-sgRNA-Bsa I；

步骤3：将步骤1得到的具有粘性末端的双链DNA片段和步骤2得到的酶切产物pGL3-U6-sgRNA-Bsa I连接，将连接产物转化感受态大肠杆菌并涂布于氨苄抗性的LB培养基上，37℃过夜培养20h后，挑取单克隆并用SEQ ID NO.6所示的通用引物U6通过测序鉴定出阳性克隆，对阳性克隆摇菌、提取质粒，得到pGL3-U6-Krt14-sgRNA质粒；

步骤5：将步骤4得到的阳性的sgRNA-Cas9共转染细胞进行细胞裂解，以得到细胞裂解液为模板进行打靶位点DNA的PCR扩增反应，取打靶位点DNA的PCR扩增产物进行Sanger测序，如果打靶位点出现套峰，则初步确认发生了基因编辑；所述打靶位点DNA的PCR扩增反应的体系为：细胞裂解液2μL，上游引物1μL，下游引物1μL，dNTP Mixture 2μL，TaKaRa Ex Taq1μL，10×Ex Taq Buffer 2.5μL，灭菌水补充至25μL；所述打靶位点DNA的PCR扩增反应的程序为：95℃，5min；95℃，20s，72℃，20s，-1℃/循环，72℃，25s，共10个循环；95℃，20s，62℃，20s，72℃，25s，共25个循环；72℃，5min，16℃，无穷；所述上游引物的序列如SEQ ID NO.8所示；所述下游引物的序列如SEQ ID NO.9所示；

3.根据权利要求2所述的编辑小鼠Krt14基因的方法，其特征在于，步骤1中，所述退火的反应体系具体为：10μM正向寡核苷酸，5μL；10μM反向寡核苷酸，5μL；10×T7Endonuclease I buffer，2μL；ddH₂O，8μL；反应程序具体为：95℃，5min；95℃到85℃，-1℃/循环，共10个循环；85℃到25℃，-0.1℃/循环，共600个循环，退火产物-20℃保存。

4.根据权利要求2所述的编辑小鼠Krt14基因的方法，其特征在于，步骤2中，所述酶切的反应体系具体为：pGL3-U6-sgRNA质粒，2μg；10×酶切buffer，2μL；Bsa I限制性内切酶，2μL；补充ddH₂O至总体积20μL，将酶切反应体系置于37℃反应3h。

5.根据权利要求2所述的编辑小鼠Krt14基因的方法，其特征在于，步骤3中，所述转化感受态大肠杆菌的具体方法为：取5μL连接产物快速加入到30μL感受态大肠杆菌中，充分混匀，冰上静置25min，42℃水浴热激90s，冰上冷却2min，加入150μL的LB液体培养基，转速为220转/min，37℃活化30min，然后涂布于氨苄抗性的LB培养基表面；所述具有氨苄抗性的LB培养基中，氨苄青霉素的浓度为50μg/mL；所述摇菌的温度为37℃，转速为220转/min，涂布于培养基上后，倒置过夜培养；所述提取质粒采用去内毒素质粒中提试剂盒。

6.根据权利要求2所述的编辑小鼠Krt14基因的方法，其特征在于，步骤4中，所述药物为浓度为10μg/ml的嘌呤霉素和浓度为20μg/ml的杀稻瘟菌素；所述小鼠3T3细胞在转染前，先接种培养于含5％v/v胎牛血清的DMEM完全培养基中，于37℃，5％CO₂培养箱中培养，每2d-3d更换新鲜培养基，待细胞汇合度达到80％-90％后，以0.25％胰蛋白酶消化，然后传代于6孔板中，16h-18h后，待细胞汇合度达到80％-90％时再进行转染。

7.根据权利要求2所述的编辑小鼠Krt14基因的方法，其特征在于，步骤6中，所述TA克隆测序具体为：将步骤5得到的打靶位点的PCR扩增产物进行胶回收纯化，将纯化后的DNA连接于质粒载体上，得到连接产物；将连接产物转化感受态大肠杆菌并涂布于氨苄抗性的LB培养基上，37℃过夜培养20h后，进行菌落PCR反应验证，筛选出阳性克隆，并将阳性克隆进行Sanger测序。

8.根据权利要求7所述的编辑小鼠Krt14基因的方法，其特征在于，所述连接的反应体系体系为：PCR纯化产物40ng、Solution I 2.5μL和PMD19载体0.5μL，加水补充至5μL；所述转化感受态大肠杆菌的具体方法为：取5μL连接产物快速加入到30μL感受态大肠杆菌中，充分混匀，冰上静置25min，42℃水浴热激90s，冰上冷却2min，加入150μL的LB液体培养基，转速为220转/min，37℃活化30min，然后涂布于氨苄抗性的LB培养基表面；所述具有氨苄抗性的LB培养基中，氨苄青霉素的浓度为50μg/mL；所述菌落PCR反应的体系为：菌落水溶液1μL，Premix Taq酶5μL，上游引物0.5μL，下游引物0.5μL，灭菌水3μL；所述菌落PCR反应的程序为：95℃，5min；95℃，20s，60℃，20s，72℃，25s，26个循环；72℃，5min；

所述上游引物的序列如SEQ ID NO.10所示；所述下游引物的序列如SEQ ID NO.11所示。