CN101880652A - 表达猪干扰素(α、β或γ)的重组新城疫弱毒疫苗株 - Google Patents

Abstract

本发明涉及表达猪干扰素(α、β或γ-干扰素)的重组新城疫弱毒疫苗株，具体地，涉及表达猪干扰素(α、β或γ-干扰素)的重组新城疫LaSota弱毒疫苗株。本发明还公开了制备所述重组新城疫弱毒疫苗株的方法和该重组新城疫弱毒疫苗株在制备猪α、β或γ-干扰素中的应用。

Description

表达猪干扰素(α、β或γ)的重组新城疫弱毒疫苗株

技术领域

本发明涉及重组病毒疫苗领域，具体地，本发明涉及一种表达猪干扰素(α、β或γ-干扰素)的重组新城疫弱毒疫苗株，更具体地，涉及一种表达猪干扰素(α、β或γ-干扰素)的重组新城疫LaSota弱毒疫苗株。本发明还公开了制备所述重组新城疫弱毒疫苗株的方法和该重组新城疫弱毒疫苗株在制备猪α、β或γ-干扰素中的应用。

背景技术

干扰素主要是由动物细胞在病毒等诱生剂的作用下诱导产生的。许多动物，包括人、哺乳动物、鸟类、鱼类等都能产生干扰素。根据干扰素的抗原特性和分子结构分成不同的类型。干扰素(IFN)分为I型和II型，I型干扰素基因缺少内含子，包括α、β、δ、ω、τ5种类型，II型仅有γ型1种，含有内含子。目前所发现的猪干扰素包括IFN-α、β、ω、τ和IFN-γ，并且IFN-τ未在其它物种中发现[1]。猪IFN-α、ω，分别是由12个和5个以上的相关功能基因编码的蛋白质家族组成，这些干扰素的各亚型之间同源性很高，天然IFN-α常常是IFN-α、ω功能基因表达产物的混合体，而INF-β、ω和IFN-γ仅由单一基因编码。现在已完成基因克隆、测序和定位的猪干扰素基因主要包括IFN-α、β、ω和IFN-γ。

干扰素是一种高活性、多功能的生物活性蛋白，具有强烈的免疫调节作用，可明显提高机体抗感染能力。它无论对病毒、细菌、立克次氏体、衣原体、原虫，只要寄生在细胞内，均有一定的抑制作用。猪白细胞IFN对哺乳仔猪和断奶仔猪病毒性腹泻或病毒、细菌混合感染引起的腹泻均有良好的预防和治疗效果^[2]。IFN具有预防和治疗双重作用，并且无毒副作用，不会产生耐药性，也不存在药物残留。干扰素类产品的开发为防治动物病毒性疾病开辟了新的途径，具有良好的推广应用前景。

负链RNA病毒的反向遗传操作(Reverse genetic)是通过操作病毒基因组cDNA制造新病毒的过程，其基本过程是：①组装完整的病毒基因组(或重组型基因组)cDNA克隆，5’末端精确地缀于T7启动子后，3’末端精确缀于自我剪切的核酸酶序列和T7转录终止信号之前，构成基因组cDNA转录模板；②以基因组cDNA转录模板与启动病毒复制必须的转录相关功能结构蛋白如核蛋白(NP)、磷酸蛋白(P)和聚合酶蛋白(L)的表达质粒(T7启动子)一起，共转染整合表达T7聚合酶的病毒复制许可细胞；③24-72小时后收获培养上清，过滤后继续敏感细胞传代或接种鸡胚尿囊腔救获(rescue)病毒。对基因组cDNA进行突变、缺失或外源基因插入修饰后，通过反向遗传操作系统(reverse genetic system，RGS系统)可获得相应的突变或重组的负链RNA病毒。

申请人之前获得授权的中国专利“新城疫LaSota疫苗株反向遗传操作系统及其应用”(申请号200510097997.8，申请日2005年9月2日)已经建立了一种新城疫LaSota弱毒疫苗株的反向遗传操作系统，并且成功救获了野生型病毒株，并且为进一步开展新城疫病毒活载体疫苗研制及重组新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)相关基础奠定了坚实的基础。

发明内容

基于猪干扰素在治疗猪病毒性疾病和免疫调节方面广阔的应用前景，本文在已建立的新城疫病毒疫苗株，如新城疫病毒LaSota疫苗株反向遗传操作系统的基础上，构建了表达猪α、β、γ干扰素基因的全基因组克隆，实现了猪α、β、γ干扰素在SPF鸡胚内高效、稳定表达，并对其表达产物进行了抗病毒活性研究，探索猪干扰素产业化应用的可行性。

因此，本发明的一个目的是提供以下各项：

1.一种表达编码猪干扰素的基因的重组新城疫弱毒疫苗株。

2.根据以上1的重组新城疫弱毒疫苗株，其为重组新城疫LaSota弱毒疫苗株。

3.根据以上1或2的重组新城疫弱毒疫苗株，其中所述猪干扰素是猪α、β或γ-干扰素，优选所述猪α、β和γ-干扰素的氨基酸序列分别如SEQID No.1、SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示，更优选编码所述猪α、β和γ-干扰素的基因如SEQ ID No.4、SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示。

4.根据以上1或2的重组新城疫弱毒疫苗株，其为rL-Swine α、rL-Swine β、或rL-Swine γ。

5.根据以上1-4中任何一项的重组新城疫弱毒疫苗株在制备猪干扰素中的应用。

6.一种生产以上1-4中任何一项的重组新城疫弱毒疫苗株的方法，该方法包括：

(1)构建转录质粒，该转录质粒包括其中插入编码猪干扰素的基因的所述新城疫弱毒疫苗株的基因组cDNA序列；

(2)构建一个或多个转录辅助质粒，该转录辅助质粒包括编码所述新城疫弱毒疫苗株的核蛋白(NP)的cDNA序列、编码所述新城疫弱毒疫苗株的磷酸蛋白(P)的cDNA序列、和编码所述新城疫弱毒疫苗株的大聚合酶蛋白(L)的cDNA序列；

(3)将所述转录质粒和转录辅助质粒共转染所述新城疫弱毒疫苗株复制许可的宿主细胞，培养转染后的宿主细胞；

(4)收获上清液，过滤后继续敏感细胞传代或接种鸡胚尿囊腔救获重组病毒株。

7.根据以上6的方法，其中所述重组新城疫弱毒疫苗株是重组新城疫LaSota弱毒疫苗株。

8.根据以上6或7的方法，其中所述转录质粒是pBRN-FL-SwIFNα、pBRN-FL-SwIFNβ、或pBRN-FL-SwIFNγ(基因序列分别见SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9，质粒图谱分别见图5-7)。

9.根据以上6或7的方法，其中所述转录辅助质粒是质粒pBSNP、pBSP或pBSL。

10.根据以上6-9中任何一项的方法，其中所述宿主细胞是BHK-21。

11.根据以上6-10中任何一项的方法制备的重组新城疫弱毒疫苗株，优选为rL-Swine、rL-Swine β、或rL-Swine γ。

12.一种生产猪干扰素的方法，该方法包括：

1)将根据以上1-4中任何一项的重组新城疫弱毒疫苗株接种敏感细胞或接种鸡胚尿囊腔；

2)收获细胞上清液或鸡胚尿囊液。

13.重组新城疫(Newcastle disease virus)LaSota弱毒疫苗株rL-Swineα的SPF鸡胚接种尿囊液，其保藏号为CGMCC No.2615。

14.重组新城疫(Newcastle disease virus)LaSota弱毒疫苗株rL-Swineβ的SPF鸡胚接种尿囊液，其保藏号为CGMCC No.2628。

15.重组新城疫(Newcastle disease virus)LaSota弱毒疫苗株rL-Swineγ的SPF鸡胚接种尿囊液，其保藏号为CGMCC No.2616。

新城疫病毒LaSota株作为表达载体，分别构建表达猪α、β、γ-干扰素(Swine interferon-α，Swine interferon-β，Swine interferon-γ)完整开放阅读框的全基因组质粒pBRN-FL-SwIFNα、pBRN-FL-SwIFNβ、或pBRN-FL-SwIFNγ，转染BHK-21细胞获得表达SwIFN-α、β、γ重组新城疫病毒。重组新城疫(Newcastle disease virus)LaSota弱毒疫苗株rL-Swineα、rL-Swine β和rL-Swine γ接种的SPF鸡胚的鸡胚尿囊液于2008年7月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号分别为CGMCC No.2615、CGMCC No.2628和CGMCC No.2616。采用RT-PCR方法，证实收获的鸡胚尿囊液内的重组病毒含有相应外源基因。将重组病毒尿囊液经紫外线照射灭活新城疫病毒，利用表达增强型绿色荧光的重组水疱性口炎病毒(VSV-EGFP)在猪肾细胞(PK)和牛肾细胞(MDBK)细胞系上测定rL-Swine α，rL-Swine β，rL-Swine γ抗病毒活性，表达SwIFN的重组新城疫病毒均能有效抑制VSV-EGFP在PK和MDBK上的复制，rL-Swine α、rL-Swine β、rL-Swine γ接种SPF鸡胚所收尿囊液抗病毒活性高达2×10⁶～2×10⁷IU/mL。结果表明：SwIFN-α，SwIFN-β，SwIFN-γ在重组新城疫病毒rL-Swineα，rL-Swineβ，rL-Swineγ接种的SPF鸡胚尿囊液中获得良好表达，并具有高效而稳定的抗病毒活性。

附图说明

图1.新城疫病毒重组SwIFN基因组cDNA克隆的构建(空白矩形框代表NDV LaSota基因，SwIFN基因为灰色阴影矩形，经Pme I位点插入rLaSota载体，图下部为SwIFN基因开放阅读框，边框部分表示基因起始信号和基因终止信号序列，SwIFN基因起始密码子ATG和终止密码子TAA以下划线标示，SwIFN基因其余部分用逗点表示，Kozak序列用斜体表示)；

图2.利用VSV-EGFP-PK系统测定rL-Swineα/β/γ抗病毒活性(A～D：对接种rL-Swine α的SPF鸡胚尿囊液进行稀释(分别地，2×10⁴，2×10⁵，2×10⁶)；E～H：对接种rL-Swine β的SPF鸡胚尿囊液进行稀释(分别地，2×10⁴，2×10⁵，2×10⁶)；I～L：对接种rL-Swine γ的SPF鸡胚尿囊液进行稀释(分别地，2×10³，2×10⁴，2×10⁵)；M～N：对接种rLaSota的SPF鸡胚尿囊液进行稀释(分别地，2×10¹，2×10²)；O：阴性对照)；

图3利用VSV-EGFP-MDBK系统测定rL-Swineα/β/γ抗病毒活性(A～D：对接种rL-Swine α的SPF鸡胚尿囊液进行稀释(分别地，2×10⁴，2×10⁵，2×10⁶)；E～H：对接种rL-Swine β的SPF鸡胚尿囊液进行稀释(分别地，2×10⁴，2×10⁵，2×10⁶)；I～L：对接种rL-Swine γ的SPF鸡胚尿囊液进行稀释(分别地，2×10³，2×10⁴，2×10⁵)；M～N：对接种rLaSota的SPF鸡胚尿囊液进行稀释(分别地，2×10¹，2×10²)；O：阴性对照)；

图4.pBRN-FL-PmeI的质粒图谱；

图5.pBRN-FL-SwIFNα质粒图谱；

图6.pBRN-FL-SwIFNβ质粒图谱；

图7.pBRN-FL-SwIFNγ质粒图谱；

图8.质粒pBSNP的序列，带下划线的斜体部分是NP基因的编码序列；

图9.质粒pBSP的序列，带下划线的斜体部分是P基因的编码序列；

图10.质粒pBSL的序列，带下划线的斜体部分是L基因的编码序列。序列表说明

SEQ ID No.1猪α干扰素氨基酸序列；

SEQ ID No.2猪β干扰素氨基酸序列；

SEQ ID No.3猪γ干扰素氨基酸序列；

SEQ ID No.4猪α干扰素基因；

SEQ ID No.5猪β干扰素基因；

SEQ ID No.6猪γ干扰素基因；

SEQ ID No.7插入猪α干扰素的LaSota基因组序列的质粒：pBRN-FL-SwIFNα；

SEQ ID No.8插入猪β干扰素的LaSota基因组序列的质粒：pBRN-FL-SwIFNβ；

SEQ ID No.9插入猪γ干扰素的LaSota基因组序列的质粒：pBRN-FL-SwIFNγ；

SEQ ID No.10pBRN-FL-PmeI的核苷酸序列。

具体实施方式

下文将参考实施例详细描述本发明，所述实施例仅是意图举例说明本发明，而不是意图限制本发明的范围。本发明的范围由后附的权利要求具体限定。

实施例1猪α、β、γ干扰素在新城疫病毒LaSota疫苗株中的高效稳定表达及抗病毒活性检测

材料和方法

1材料

表达增强型绿色荧光蛋白报告基因的重组水疱性口炎病毒VSV-EGFP商购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所^[10]。BHK-21细胞(ATCCCCL-10)、PK(15)细胞(ATCC CCL-33)、MDBK(NBL-1)细胞(ATCCCCL-22)由本实验室传代培养，培养基为含10％胎牛血清的DMEM(Dulbecco′s Modified Eagle Media)；SPF鸡胚商购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所；表达T7聚合酶的痘病毒vTF7-3(ATCC，VR-2153)购自ATCC；新城疫LaSota克隆株rLaSota(按照ZL200510097997.8制备)由本实验室保存；rLaSota反向遗传操作系统基因组转录模板质粒pBRN-FL-PmeI(参见：葛金英，温志远，王永，等。表达绿色荧光蛋白重组新城疫病毒LaSota疫苗株的构建[J].微生物学报，2006，46(4)：547～551)(病毒基因组转录质粒pBRN-FL-PmeI，含有新城疫病毒的基因组全长cDNA，pBRN-FL-PmeI的序列信息见SEQ ID No.10，质粒图谱见图4)。

如ZL200510097997.8或参考文献[11]所述，将表达新城疫病毒(基因组序列：GenBank登录号AY845400)的核蛋白(NP)、磷酸蛋白(P)及大聚合酶蛋白(L)基因的开放阅读框架(ORF)cDNA分别紧接着克隆在pBlueScript载体(Clontech)质粒T7启动子下游，分别构建转录辅助质粒pBSNP，pBSP和pBSL(序列分别如图8至10所示)。

2表达猪α、β、γ干扰素基因的全基因组克隆的构建

参照genebank登录号EU364896、EF104599、EU249804委托上海捷瑞生物工程有限公司合成猪干扰素α、β、γ，合成的片段经EcoRV酶切位点连入同样经此酶处理的pBlueScript载体(Clontech)上，质粒命名为pBS-SwIFNα、pBS-SwIFNβ、pBS-SwIFNγ。

以质粒pBS-SwIFNα、pBS-SwIFNβ、pBS-SwIFNγ为模板，通过PCR引物在干扰素基因ORF的5′端引入PmeI限制酶识别序列和NDV自身聚合酶L识别的转录终止序列GE(TTAAGAAAAAA)、转录起始序列GS(ACGGGTAGAA)及增强基因表达的Kozak序列(GCCACC)，在干扰素基因ORF的3′端引入PmeI限制酶识别序列(所用引物见表1)；为了确保重组基因组cDNA全长总碱基数仍保持6的倍数，在引物GS和Kozak序列之间加入适当数量碱基进行调整。PCR末端经PmeI酶切插入同样经PmeI处理的pBRN-FL-PmeI^[4]载体内，表达猪α、β、γ干扰素的重组基因组全长cDNA克隆命名为pBRN-FL-SwIFNα、pBRN-FL-SwIFNβ、pBRN-FL-SwIFNγ(图1，质粒图谱见附图1，2，3)。利用引物NDV-3#PF：5′-gtccgtgcattgatcatg-3′和各基因PCR所用下游引物鉴定方向。

3重组病毒的拯救

BHK-21细胞接种于六孔板内生长达50～80％单层时，转录质粒pBRN-FL-SwIFNα、pBRN-FL-SwIFNβ、pBRN-FL-SwIFNγ分别与转录辅助质粒pBSNP、pBSP和pBSL共转染预先感染vTF7-3的BHK-21细胞。转染上清经0.22um孔径滤器过滤后接种9～11天的SPF鸡胚尿囊腔；接种后的SPF鸡胚继续培养3-5天，取鸡胚尿囊液50μl按常规进行新城疫病毒的血凝(HA)和血凝抑止(HI)试验，详细操作方法参见文献^[4]。收获HA及HI试验结果阳性尿囊液，-70℃冻存，并按常规方法分别于9-10日龄鸡胚尿囊腔接种进行传代、病毒滴度测定^[4]。重组新城疫LaSota弱毒疫苗株rL-Swine α、rL-Swine β和rL-Swineγ接种的SPF鸡胚尿囊液于2008年7月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号分别为CGMCC No.2615、CGMCC No.2628和CGMCC No.2616。

4重组病毒接种鸡胚尿囊液抗病毒活性检测

分别取rL-Swineα、rL-Swine β、rL-Swineγ以及rLaSota接种的SPF鸡胚尿囊液2ml放入平皿中，置于紫外灯下照射2h，每间隔20min摇动一次，以灭活NDV病毒。经紫外线灭活的尿囊液接种SPF鸡胚以检测病毒灭活是否彻底，每胚100μL，共接3枚，接种后的鸡胚置37℃孵化器内孵化，3天后检测鸡胚尿囊液是否HA阳性。HA阴性样品分装，-70℃保存备用。

用VSV-EGFP-PK和VSV-EGFP-MDBK细胞系统测定rL-Swineα、rL-Swineβ、rL-Swineγ的抗病毒活性，具体为：取灭活后重组病毒rL-Swineα、rL-Swine β、rL-Swine γ鸡胚尿囊液，每个样品100μL，用含5％胎牛血清的DMEM进行10倍系列稀释，在生长于96孔细胞培养板上的PK和MDBK细胞上加入2×10¹～2×10⁸稀释的尿囊液，同时取相同稀释倍数的灭活rLaSota鸡胚尿囊液作为对照组，于37℃作用24h。吸出上清后，接种VSV-EGFP，剂量为200PFU(噬斑形成单位)/孔感染细胞，感作1h后换完全培养液继续培养，同时设空白对照组，24h后荧光显微镜观察结果。以空白对照组为对照，将减少50％VSV-EGFP感染率的样品的最高稀释度定为1个病毒抑制单位(IU)。

5重组病毒尿囊液抗病毒稳定性检测

取灭活后重组病毒rL-Swine α、rL-Swine β、rL-Swineγ鸡胚尿囊液分装，100μL/管，一部分放4℃冰箱长期保存，每间隔1周取出一份进行抗病毒活性检测；另一部分放-70℃冰箱，取冻融1次、2次、3次样品检测抗病毒活性单位的变化，以检测反复冻融对抗病毒活性的影响。

结果

1表达猪α、β、γ干扰素基因的全基因组克隆的构建及鉴定

通过PCR引物在干扰素基因SwIFNα、SwIFNβ、SwIFNγ的ORF的5′端和3′端引入PmeI限制酶识别序列(所用引物见表1)；由于插入的外源基因为PmeI单切连入pBRN-FL-PmeI载体，因此克隆质粒经PmeI酶切的产物应有两条，一条为载体，约为18kb，另一条为外源基因及其所携带的GE/GS等长约500～600bp；而经鉴定引物进行PCR扩增，应得到比相应外源基因大200bp左右的条带，产物约700～800bp，电泳结果显示与预期相符(结果未显示)。证明表达猪α、β、γ干扰素的重组基因组全长cDNA克隆构建成功，构建示意图见图1。

表1构建表达猪α、β、γ干扰素基因的全基因组克隆所用引物

注：下划线部分为干扰素基因特异序列，酶切位点用边框表示，Kozak序列用斜体表示，基因起始信号和基因结束信号用小写字符表示，用黑体字符调整碱基数以适应6的倍数规则。

2重组病毒的拯救及鉴定

全基因组转录质粒pBRN-FL-SwIFNα、pBRN-FL-SwIFNβ、pBRN-FL-SwIFNγ分别与转录辅助质粒pBSNP、pBSP和pBSL共转染预先感染vTF7-3的BHK-21细胞。转染上清接种后SPF胚继续培养3-5天，取鸡胚尿囊液50μL按常规进行新城疫病毒的血凝(HA)和血凝抑止(HI)试验。收获HA及HI试验结果阳性尿囊液，-70℃冻存。同时进行RT-PCR鉴定，PCR产物测序结果(数据未显示)证明重组病毒基因组内含有相应的外源基因片段，至此成功拯救出表达猪干扰素α、β、γ的重组新城疫病毒，并分别命名为rL-Swine α、rL-Swineβ和rL-Swineγ。

3rL-Swineα、rL-Swine β和rL-Swine γ抗病毒活性检测

收获的重组病毒尿囊液经紫外线灭活，进行10倍系列稀释，稀释后的样品处理细胞24h，然后按每孔200PFU的接种量感染VSV-EGFP，24h后经荧光显微镜观察结果。2×10³倍稀释的rL-Swine α和2×10⁴倍稀释的rL-Swine β可以完全抑制VSV-EGFP的复制，无荧光出现(图2A，D)，2×10³倍稀释孔的rL-Swine γ仅有数个发荧光细胞，可90％以上抑制VSV-EGFP的复制。2×10⁴倍稀释rL-Swine α和rL-Swine γ以及2×10⁵倍稀释孔的rL-Swine β可部分抑制VSV-EGFP的复制，荧光亮度约为对照组的一半(图2B，E，H)，未加干扰素样品的对照孔出现大量荧光(图2L)，VSV-EGFP在PK细胞中大量复制。同样2×10²倍稀释的rLaSota病毒接种SPF鸡胚尿囊液组也出现大量荧光(图2K)，不能抑制VSV-EGFP的复制，但是10倍稀释时可以非特异性的部分抑制VSV-EGFP在PK细胞中的复制(图2J)。测得rL-Swine α、rL-Swine β在PK细胞上的抗病毒活性为2×10⁶IU/mL，rL-Swine γ抗病毒活性为2×10⁵IU/mL。

经同样处理的MDBK细胞接种VSV-EGFP 24h后经荧光显微镜观察结果。2×10⁶倍稀释的rL-Swine α和rL-Swine β以及2×10⁵倍稀释的rL-Swineγ可以抑制90％的VSV-EGFP在MDBK细胞上的复制(图3A，D，G)，2×10⁶倍稀释孔的rL-Swine β仅有数个发荧光细胞。2×10⁷倍稀释rL-Swine α和rL-Swine β以及2×10⁶倍稀释孔的rL-Swine γ可部分抑制VSV-EGFP的复制，荧光亮度约为对照组的一半(图3B，E，H)，2×10⁸倍稀释rL-Swine α和rL-Swine β以及2×10⁷倍稀释孔的rL-Swine γ与未加干扰素样品的对照孔一样出现大量荧光(图2C，F，I)，几乎不能抑制VSV-EGFP在MDBK细胞中大量复制。测得rL-Swine α、rL-Swine β在MDBK细胞上的抗病毒活性为2×10⁸IU/mL，rL-Swine γ抗病毒活性为2×10⁷IU/mL。

4重组病毒尿囊液抗病毒稳定性检测

rL-Swine α、rL-Swine β、rL-Swine γ接种的鸡胚尿囊液经反复冻溶3次后，利用VSV-EGFP-PK细胞系统测定抗病毒活性无明显下降；4℃保存可长达10天其抗病毒活性无明显下降，仍具有高达10⁶TCID₅₀/mL抗病毒活性。可以在传统冷藏条件下长途运输而不影响使用。

当前，猪的病毒性疾病危害严重，而目前尚无特效药物可以治疗病毒性疾病。尽管一些化学合成的抗病毒药物如盐酸金刚烷胺、利巴韦林等对少数病毒病有一定的作用，但由于这些药物在人医上也广泛应用，为防止药物残留及耐药性的产生，目前已禁止在兽医临床上应用；而干扰素具有的生物学活性，及其速效多能的特点使其在防治病毒性传染病，抑制肿瘤生长，促进增重等方面具有重要意义；因此，研究开发的猪基因工程可有效控制当前对我国养猪业危害严重的病毒性疾病，因此，重组猪干扰素具有广阔的应用前景。

目前人重组干扰素和细胞因子产品已广泛用于人类医学临床，但动物干扰素和细胞因子的应用在我国兽医临床中才刚刚起步。正常情况下，动物体内干扰素和细胞因子基因处于封闭状态，只有在病毒感染或诱导下才表达干扰素基因，但是表达量很小，因此单靠病毒感染自身诱导的干扰素对病毒性疾病和细胞内寄生菌和寄生虫病的治疗作用是微乎其微的；而且由于其表达量低，也非常难以提取纯化。因此，在考虑使用干扰素防治动物病毒性疾病时，最好采用基因工程技术生产；采用基因工程技术原核表达技术生产干扰素和细胞因子具有活性效价高、产量大、成本低廉、生产速度快、易于规模化生产等优点，因此可以在生产实践中应用。

近年来分子生物学的迅速发展，干扰素的研究也日益深入，特别是PCR技术的广泛应用，极大地推动了动物干扰素基因的研究，动物干扰素基因的克隆与表达成为研究热点，采用基因工程的方法研制重组干扰素已成为干扰素制剂研究的重点。最初以在大肠杆菌中进行原核表达猪α干扰素为主，表达纯化的蛋白经过复性具有明显的抗病毒生物学活性^[5]。证明了原核表达PoIFN-α的可行性及将基因工程原核表达的PoIFN-α真正用于生产实践中作为抗病毒制剂的可行性。但原核表达蛋白经常以包涵体的形式出现，需要经过变性、复性的过程，复性不完全还可能导致干扰素的生物学活性不能正常发挥，而且纯化过程费时、费力，生产成本高限制了干扰素的大规模应用。万建青等^[6]利用酵母表达系统表达猪干扰素，尝试真核表达干扰素取得了成功。秦立廷等^[7]尝试利用杆状病毒表达系统表达猪γ干扰素，重组杆状病毒感染的昆虫细胞培养上清具有高达10⁵TCID₅₀/mL个抗病毒活性单位。杜以军等^[8]利用猪IFN-α的成熟蛋白基因构建了重组腺病毒质粒pAd-poIFN-α转染HEK-293A细胞，滴度为10⁷TCID₅₀/mL。并经RT-PCR证明目的基因在mRNA水平上的有效表达；在PK-15细胞上可以检测到较强的抗猪口蹄疫病毒活性。国内外研究资料显示重组猪干扰素对水泡性口炎病毒(VSV)、流感病毒^[9]、传染性胃肠炎病毒(TGEV)^[10]、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)^[11]、口蹄疫病毒(FMDV)^[12]均有明显的抑制作用。

新城疫病毒反向遗传操作系统的成功建立使NDV作为活载体的应用得到了广泛研究。2001-2002年，Palese.P.^[13]等相继构建表达H1亚型流感病毒HA免疫原基因的重组NDV B1株和表达H7亚型流感病毒HA免疫原基因的重组NDVB 1株。2004年，Samal S.^[14]等采用LaSota疫苗株为活载体，构建了表达传染性法氏囊病毒(IBDV)变异株GLS-5的重组新城疫病毒，免疫雏鸡可有效抵御IBDV变异株及新城疫强毒的攻击。2007年，Ge J^[15]等以LaSota疫苗株为活载体，构建表达H5亚型高致病力禽流感病毒HA基因，免疫雏鸡可100％抵抗H5亚型高致病力禽流感病毒的致死性攻击。

NDV作为载体具有无可比拟的优势，LaSota疫苗株具有良好的安全性和外源基因遗传稳定性，生产成本低廉，表达的外源蛋白产品不仅接近天然状态，而且无须纯化，重复性好便于产业化。为此，在前人研究的基础上，利用新城疫病毒反向遗传操作系统，在新城疫病毒基因组骨架上成功克隆了猪α、β、γ干扰素，并拯救出稳定表达猪α、β、γ干扰素的重组新城疫病毒-rL-Swine α、rL-Swine β和rL-Swine γ。利用VSV-EGFP-PK细胞系统测定rL-Swine α、rL-Swine β、rL-Swine γ接种的鸡胚尿囊液具有高达10⁶TCID₅₀/mL抗病毒活性，经反复冻溶或4℃长期保存其抗病毒活性无明显下降。此外，利用MDBK细胞测定rL-Swine α、rL-Swine β和rL-Swine γ的抗病毒活性，结果证明猪干扰素可以诱导牛细胞产生抗病毒反应，而且活性高达10⁸TCID₅₀/mL，可以同时作为猪、牛通用干扰素应用。以新城疫病毒LaSota株为载体表达猪α、β、γ干扰素既具有高水平抗病毒活性，又便于大规模生产，具有光明的应用前景。

参考文献：

[1]Cao R B，Zhang S F，Cai M H.et al.Molecular Cloning of a Novel PorcineInterferon-αand Its Expression in Escherichia coli.Agr Biotechnol，2004(3)：278～282

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[3].温志远，葛金英，胡森，王永，郝永清，步志高表达增强绿色荧光蛋白重组水泡性口炎病毒印地安那株的构建，预防兽医学报，2007，29(12)：905～910

[4].葛金英，温志远，王永，等。表达绿色荧光蛋白重组新城疫病毒LaSota疫苗株的构建[J].微生物学报，2006，46(4)：547～551.

[5]谢海燕，郭霄峰.猪α-干扰素的原核表达.华南农业大学学报，2005(4)：86～88

[6]万建青，吴文学，夏春，等.毕赤酵母表达猪干扰素基因及其抑制蓝耳病病毒效果[J].生物工程学报，2002，18(6)：683～686.

[7]秦立廷，王喜军，胡森，李志中，陈伟业，等.重组杆状病毒表达猪γ-干扰素及其抗病毒活性的研究[J].生物工程学报，2007，(3)：

[8]杜以军，姜平，李玉峰，等猪α-干扰素重组腺病毒的构建及其抗口蹄疫病毒活性研究.中国病毒学，2006(4)：390～393

[9]Horisberger M A.Virus-specific effects of recombinant porcineinterferon-gamma and the induction of Mx proteins in pig cells.JInterferon Res.1992(6)：439～444

[10]Jordan L T，Derbyshire J B.Antiviral activity of interferon againsttransmissible gastroenteritis virus in cell culture and ligated intestinalsegments in neonatal.Vet Microbiol.1994(3)：263～276

[11]Buddaert W，Van Reeth K，Pensaert M.In vivo and in vitro interferon(IFN)studies with the porcine reproductive and respiratory syndrome virus(PRRSV).Adv Exp Med Biol.1998，440：461～467

[12]Chinsangaram J，Koster M，Grubman MJ.Inhibition of L-deleted foot-and-mouth disease virus replication by alpha/beta interferon involvesdouble-stranded RNA-dependent protein kinase.J Virol，2001(12)：498～503

[13]Swayne E.D.，Suarez L.D.，Schultz-Cherry S.et al，RecombinantParamyxovirus Type 1-Avian Influenza-H7 Virus as a Vaccine forProtection of Chickens Against Influenza and Newcastle Disease.AVIANDISEASES，2003，47：1047-1050

[14]Huang Z.，Elankumaran S.，Yunus A.S.，and Samal S.K.A RecombinantNewcastle Disease Virus(NDV)Expressing VP2 Protein of InfectiousBursal Disease Virus(IBDV)Protects against NDV and IBDV.Journal ofGeneral Virology，2004，78：10054-10063

[15]Jinying G，Guohua D，Zhiyuan W，et al.Newcastle Disease Virus-BasedLive Attenuated Vaccine Completely Protects Chickens and Mice fromLethal Challenge of Homologous and Heterologous H5N1 AvianInfluenza Viruses.Journal of Virology，2007，81：150-158.

序列表

<110>中国农业科学院哈尔滨兽医研究所

<120>表达猪干扰素(α、β或γ)的重组新城疫弱毒疫苗株

<130>IB088769

<160>10

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>189

<212>PRT

<213>猪

<400>1

Met Ala Pro Thr Ser Ala Phe Leu Thr Ala Leu Val Leu Leu Ser Cys

1               5                   10                  15

Asn Ala Ile Cys Ser Leu Gly Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu

            20                  25                  30

Ala His Thr Arg Ala Leu Arg Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser

        35                  40                  45

Pro Phe Ser Cys Leu Asp His Arg Arg Asp Phe Gly Ser Pro His Glu

    50                  55                  60

Ala Phe Gly Gly Asn Gln Val Gln Lys Ala Gln Ala Met Ala Leu Val

65                  70                  75                  80

His Glu Met Leu Gln Gln Thr Phe Gln Leu Phe Ser Thr Glu Gly Ser

                85                  90                  95

Ala Ala Ala Trp Asp Glu Ser Leu Leu His Gln Phe Cys Thr Gly Leu

            100                 105                 110

Asp Gln Gln Leu Arg Asp Leu Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Ala Gly

        115                 120                 125

Leu Glu Gly Thr Pro Leu Leu Glu Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg

    130                 135                 140

Lys Tyr Phe His Arg Leu Thr Leu Tyr Leu Gln Glu Lys Ser Tyr Ser

145                 150                 155                 160

Pro Cys Ala Trp Glu Ile Val Arg Ala Glu Val Met Arg Ser Phe Ser

                165                 170                 175

Ser Ser Arg Asn Leu Gln Asp Arg Leu Arg Lys Lys Glu

            180                 185

<210>2

<211>186

<212>PRT

<213>猪

<400>2

Met Ala Asn Lys Cys Ile Leu Gln Ile Ala Leu Leu Met Cys Phe Ser

1               5                   10                  15

Thr Thr Ala Leu Ser Met Ser Tyr Asp Val Leu Arg Tyr Gln Gln Arg

            20                  25                  30

Ser Ser Asn Leu Ala Cys Gln Lys Leu Leu Gly Gln Leu Pro Gly Thr

        35                  40                  45

Pro Gln Tyr Cys Leu Glu Asp Arg Met Asn Phe Glu Val Pro Glu Glu

    50                  55                  60

Ile Met Gln Pro Pro Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Val Leu Ile Ile

65                  70                  75                  80

His Glu Met Leu Gln Gln Ile Phe Gly Ile Leu Arg Arg Asn Phe Ser

                85                  90                  95

Ser Thr Gly Trp Asn Glu Thr Val Ile Lys Thr lle Leu Val Glu Leu

            100                 105                 110

Asp Gly Gln Met Asp Asp Leu Glu Thr Ile Leu Glu Glu Ile Met Glu

        115                 120                 125

Glu Glu Asn Phe Pro Arg Gly Asp Met Thr Ile Leu His Leu Lys Lys

    130                 135                 140

Tyr Tyr Leu Ser Ile Leu Gln Tyr Leu Lys Ser Lys Glu Tyr Arg Ser

145                 150                 155                 160

Cys Ala Trp Thr Val Val Gln Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Ser Phe

                165                 170                 175

Leu Asn Arg Leu Thr Asp Tyr Leu Arg Asn

            180                 185

<210>3

<211>166

<212>PRT

<213>猪

<400>3

Met Ser Tyr Thr Thr Tyr Phe Leu Ala Phe Gln Leu Cys Val Thr Leu

1               5                   10                  15

Cys Phe Ser Gly Ser Tyr Cys Gln Ala Pro Phe Phe Lys Glu Ile Thr

             20                 25                  30

Ile Leu Lys Asp Tyr Phe Asn Ala Ser Thr Ser Asp Val Pro Asn Gly

        35                  40                  45

Gly Pro Leu Phe Leu Glu Ile Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp

    50                  55                  60

Lys Lys Ile Ile Gln Ser Gln Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Phe Phe

65                  70                  75                  80

Glu Ile Phe Lys Asp Asn Gln Ala Ile Gln Arg Ser Met Asp Val Ile

                85                  90                  95

Lys Gln Asp Met Phe Gln Arg Phe Leu Asn Gly Ser Ser Gly Lys Leu

            100                 105                 110

Asn Asp Phe Glu Lys Leu Ile Lys Ile Pro Val Asp Asn Leu Gln Ile

        115                 120                 125

Gln Arg Lys Ala Ile Ser Glu Leu Ile Lys Val Met Asn Asp Leu Ser

    130                 135                 140

Pro Arg Ser Asn Leu Arg Lys Arg Lys Arg Ser Gln Thr Met Phe Gln

145                 150                 155                 160

Gly Gln Arg Ala Ser Lys

                165

<210>4

<211>570

<212>DNA

<213>猪

<400>4

atggccccaa cctcagcctt cctcacggcc ctggtgctac tcagctgcaa tgccatctgc     60

tctctgggct gtgacctgcc tcagacccac agcctggctc acaccagggc cctgaggctc    120

ctggcacaaa tgaggagaat ctcccccttc tcctgcctgg accacagaag ggactttgga    180

tcccctcatg aggcctttgg gggcaaccag gtccagaagg ctcaagccat ggctctggtg    240

catgagatgc tccagcagac cttccagctc ttcagcacag agggctcggc tgctgcctgg    300

gatgagagcc tcctgcacca gttctgcact ggactggatc agcagctcag ggacctggaa    360

gcctgtgtca tgcaggaggc ggggctggaa gggacccccc tgctggagga ggactccatc    420

ctggctgtga ggaaatactt ccacagactc accctctatc tgcaagagaa gagctacagc    480

ccctgtgcct gggagatcgt cagggcagaa gtcatgagat ccttctcttc ctccagaaac    540

ctgcaagaca gactcaggaa gaaggagtga                                     570

<210>5

<211>561

<212>DNA

<213>猪

<400>5

atggctaaca agtgcatcct ccaaatcgct ctcctgatgt gtttctccac cacagctctt     60

tccatgagct atgatgtgct tcgataccaa caaaggagca gcaatttggc atgtcagaag    120

ctcctgggac agttgcctgg gactcctcaa tattgcctcg aagataggat gaactttgag    180

gtccctgagg agattatgca accaccacaa ttccagaagg aagatgcagt attgattatc    240

cacgagatgc tccagcagat cttcggcatt ctcagaagaa atttctctag cactggctgg    300

aatgaaaccg tcattaagac tatccttgtg gaacttgatg ggcagatgga tgacctggag    360

acaatcctgg aggaaatcat ggaggaggaa aatttcccca ggggagacat gaccattctt    420

cacctgaaga aatattactt gagcattctg cagtacctga agtccaagga gtacagaagc    480

tgtgcctgga cagtcgtcca agtggaaatc ctcaggaact tttctttcct taacagactt    540

acagattacc tccggaactg a                                              561

<210>6

<211>501

<212>DNA

<213>猪

<400>6

atgagttata caacttattt cttagctttt cagctttgcg tgactttgtg tttttctggc     60

tcttactgcc aggcgccctt ttttaaagaa ataacgatcc taaaggacta ttttaatgca    120

agtacctcag atgtacctaa tggtggacct cttttcttag aaattttgaa gaattggaaa    180

gaggagagtg acaaaaaaat aattcagagc caaattgtct ccttctactt caaattcttt    240

gaaatcttca aagataacca ggccattcaa aggagcatgg atgtgatcaa gcaagacatg    300

tttcagaggt tcctaaatgg tagctctggg aaactgaatg acttcgaaaa gctgattaaa    360

attccggtag ataatctgca gatccagcgc aaagccatca gtgaactcat caaagtgatg    420

aatgatctgt caccaagatc taacctaaga aagcggaaga gaagtcagac tatgttccaa    480

ggccagagag catcaaaata a                                              501

<210>7

<211>20630

<212>DNA

<213>人工

<400>7

ttctcatgtt tgacagctta tcatcgataa gctttaatgc ggtagtttat cacagttaaa     60

ttgctaacgc agtcaggcac cgtgtatgaa atctaacaat gcgctcatcg tcatcctcgg    120

caccgtcacc ctggatgctg taggcatagg cttggttatg ccggtactgc cgggcctctt    180

gcgggatatc gtccattccg acagcatcgc cagtcactat ggcgtgctgc tagcgctata    240

tgcgttgatg caatttctat gcgcacccgt tctcggagca ctgtccgacc gctttggccg    300

ccgcccagtc ctgctcgctt cgctacttgg agccactatc gactacgcga tcatggcgac    360

cacacccgtc ctgtggatcc tctacgccgg acgcatcgtg gccggcatca ccggcgccac    420

aggtgcggtt gctggcgcct atatcgccga catcaccgat ggggaagatc gggctcgcca    480

cttcgggctc atgagcgctt gtttcggcgt gggtatggtg gcaggccccg tggccggggg    540

actgttgggc gccatctcct tgcatgcacc attccttgcg gcggcggtgc tcaacggcct    600

caacctacta ctgggctgct tcctaatgca ggagtcgcat aagggagagc gtcgaccgat    660

gcccttgaga gccttcaacc cagtcagctc cttccggtgg gcgcggggca tgactatcgt    720

cgccgcactt atgactgtct tctttatcat gcaactcgta ggacaggtgc cggcagcgct    780

ctgggtcatt ttcggcgagg accgctttcg ctggagcgcg acgatgatcg gcctgtcgct    840

tgcggtattc ggaatcttgc acgccctcgc tcaagccttc gtcactggtc ccgccaccaa    900

acgtttcggc gagaagcagg ccattatcgc cggcatggcg gccgacgcgc tgggctacgt    960

cttgctggcg ttcgcgacgc gaggctggat ggccttcccc attatgattc ttctcgcttc   1020

cggcggcatc gggatgcccg cgttgcaggc catgctgtcc aggcaggtag atgacgacca   1080

tcagggacag cttcaaggat cgctcgcggc tcttaccagc ctaacttcga tcactggacc   1140

gctgatcgtc acggcgattt atgccgcctc ggcgagcaca tggaacgggt tggcatggat   1200

tgtaggcgcc gccctatacc ttgtctgcct ccccgcgttg cgtcgcggtg catggagccg   1260

ggccacctcg acctgaatgg aagccggcgg cacctcgcta acggattcac cactccaaga   1320

attggagcca atcaattctt gcggagaact gtgaatgcgc aaaccaaccc ttggcagaac   1380

atatccatcg cgtccgccat ctccagcagc cgcacgcggc gcatctcggg cagcgttggg   1440

tcctggccac gggtgcgcat gatcgtgctc ctgtcgttga ggacccggct aggctggcgg   1500

ggttgcctta ctggttagca gaatgaatca ccgatacgcg agcgaacgtg aagcgactgc   1560

tgctgcaaaa cgtctgcgac ctgagcaaca acatgaatgg tcttcggttt ccgtgtttcg   1620

taaagtctgg aaacgcggaa gtcagcgccc tgcaccatta tgttccggat ctgcatcgca   1680

ggatgctgct ggctaccctg tggaacacct acatctgtat taacgaagcg ctggcattga   1740

ccctgagtga tttttctctg gtcccgccgc atccataccg ccagttgttt accctcacaa   1800

cgttccagta accgggcatg ttcatcatca gtaacccgta tcgtgagcat cctctctcgt   1860

ttcatcggta tcattacccc catgaacaga aatccccctt acacggaggc atcagtgacc   1920

aaacaggaaa aaaccgccct taacatggcc cgctttatca gaagccagac attaacgctt   1980

ctggagaaac tcaacgagct ggacgcggat gaacaggcag acatctgtga atcgcttcac   2040

gaccacgctg atgagcttta ccgcagctgc ctcgcgcgtt tcggtgatga cggtgaaaac   2100

ctctgacaca tgcagctccc ggagacggtc acagcttgtc tgtaagcgga tgccgggagc   2160

agacaagccc gtcagggcgc gtcagcgggt gttggcgggt gtcggggcgc agccatgacc   2220

cagtcacgta gcgatagcgg agtgtatact ggcttaacta tgcggcatca gagcagattg   2280

tactgagagt gcaccatatg cggtgtgaaa taccgcacag atgcgtaagg agaaaatacc   2340

gcatcaggcg ctcttccgct tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc   2400

ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa tcaggggata   2460

acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg   2520

cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct   2580

caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa   2640

gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc   2700

tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt   2760

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ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca acccggtaag acacgactta tcgccactgg   2880

cagcagccac tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct   2940

tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta gaaggacagt atttggtatc tgcgctctgc   3000

tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg   3060

ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc   3120

aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt   3180

aagggatttt ggtcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt ttaaattaaa   3240

aatgaagttt taaatcaatc taaagtatat atgagtaaac ttggtctgac agttaccaat   3300

gcttaatcag tgaggcacct atctcagcga tctgtctatt tcgttcatcc atagttgcct   3360

gactccccgt cgtgtagata actacgatac gggagggctt accatctggc cccagtgctg   3420

caatgatacc gcgagaccca cgctcaccgg ctccagattt atcagcaata aaccagccag   3480

ccggaagggc cgagcgcaga agtggtcctg caactttatc cgcctccatc cagtctatta   3540

attgttgccg ggaagctaga gtaagtagtt cgccagttaa tagtttgcgc aacgttgttg   3600

ccattgctgc aggcatcgtg gtgtcacgct cgtcgtttgg tatggcttca ttcagctccg   3660

gttcccaacg atcaaggcga gttacatgat cccccatgtt gtgcaaaaaa gcggttagct   3720

ccttcggtcc tccgatcgtt gtcagaagta agttggccgc agtgttatca ctcatggtta   3780

tggcagcact gcataattct cttactgtca tgccatccgt aagatgcttt tctgtgactg   3840

gtgagtactc aaccaagtca ttctgagaat agtgtatgcg gcgaccgagt tgctcttgcc   3900

cggcgtcaac acgggataat accgcgccac atagcagaac tttaaaagtg ctcatcattg   3960

gaaaacgttc ttcggggcga aaactctcaa ggatcttacc gctgttgaga tccagttcga   4020

tgtaacccac tcgtgcaccc aactgatctt cagcatcttt tactttcacc agcgtttctg   4080

ggtgagcaaa aacaggaagg caaaatgccg caaaaaaggg aataagggcg acacggaaat   4140

gttgaatact catactcttc ctttttcaat attattgaag catttatcag ggttattgtc   4200

tcatgagcgg atacatattt gaatgtattt agaaaaataa acaaataggg gttccgcgca   4260

catttccccg aaaagtgcca cctgacgtct aagaaaccat tattatcatg acattaacct   4320

ataaaaatag gcgtatcacg aggccctttc gtcttcaaga attctaggcg gctatatgcg   4380

ttggatgcaa tttctatgcg cacccgttct cggagcactg tccgaccgct ttggccgccg   4440

cccagtcctg ctcgcttcgc tacttggagc cactatcgag ctacgcgatc atggcgacca   4500

cacccgtcct gtggatcccc cgaagtctag aactagtgga tccccctgat acgactcact   4560

ataggaccaa acagagaatc cgtgagttac gataaaaggc gaaggagcaa ttgaagtcgc   4620

acgggtagaa ggtgtgactc tcgagtgcga gcccgaagca caaactcgag aaagccttct   4680

gccaacatgt cttccgtatt tgatgagtac gaacagctcc tcgcggctca gactcgcccc   4740

aatggagctc atggaggggg agaaaaaggg agtaccttaa aagtagacgt cccggtattc   4800

actcttaaca gtgatgaccc agaagataga tggagctttg tggtattctg cctccggatt   4860

gctgttagcg aagatgccaa caaaccactc aggcaaggtg ctctcatatc tcttttatgc   4920

tcccactcac aggtaatgag gaaccatgtt gcccttgcag ggaaacagaa tgaagccaca   4980

ttggccgtgc ttgagattga tggctttgcc aacggcacgc cccagttcaa caataggagt   5040

ggagtgtctg aagagagagc acagagattt gcgatgatag caggatctct ccctcgggca   5100

tgcagcaacg gaaccccgtt cgtcacagcc ggggccgaag atgatgcacc agaagacatc   5160

accgataccc tggagaggat cctctctatc caggctcaag tatgggtcac agtagcaaaa   5220

gccatgactg cgtatgagac tgcagatgag tcggaaacaa ggcgaatcaa taagtatatg   5280

cagcaaggca gggtccaaaa gaaatacatc ctctaccccg tatgcaggag cacaatccaa   5340

ctcacgatca gacagtctct tgcagtccgc atctttttgg ttagcgagct caagagaggc   5400

cgcaacacgg caggtggtac ctctacttat tataacctgg taggggacgt agactcatac   5460

atcaggaata ccgggcttac tgcattcttc ttgacactca agtacggaat caacaccaag   5520

acatcagccc ttgcacttag tagcctctca ggcgacatcc agaagatgaa gcagctcatg   5580

cgtttgtatc ggatgaaagg agataatgcg ccgtacatga cattacttgg tgatagtgac   5640

cagatgagct ttgcgcctgc cgagtatgca caactttact cctttgccat gggtatggca   5700

tcagtcctag ataaaggtac tgggaaatac caatttgcca gggactttat gagcacatca   5760

ttctggagac ttggagtaga gtacgctcag gctcagggaa gtagcattaa cgaggatatg   5820

gctgccgagc taaagctaac cccagcagca aggaggggcc tggcagctgc tgcccaacgg   5880

gtctccgagg agaccagcag catagacatg cctactcaac aagtcggagt cctcactggg   5940

cttagcgagg gggggtccca agctctacaa ggcggatcga atagatcgca agggcaacca   6000

gaagccgggg atggggagac ccaattcctg gatctgatga gagcggtagc aaatagcatg   6060

agggaggcgc caaactctgc acagggcact ccccaatcgg ggcctccccc aactcctggg   6120

ccatcccaag ataacgacac cgactggggg tattgataaa caaaacccag cctgcttcca   6180

caaaaacatc ccaatgccct cacccgtagt cgacccctcg atttgcggct ctatatgacc   6240

acaccctcaa acaaacatcc ccctctttcc tccctccccc tgctgtacaa ctccgcacgc   6300

cctagatacc acaggcacaa tgcggctcac taacaatcaa aacagagccg agggaattag   6360

aaaaaagtac gggtagaaga gggatattca gagatcaggg caagtctccc gagtctctgc   6420

tctctcctct acctgataga ccaggacaaa catggccacc tttacggatg cagagatcga   6480

cgagctattt gagacaagtg gaactgtcat tgacaacata attacagccc agggtaaacc   6540

agcagagact gttggaagga gtgcaatccc acaaggcaag accaaggtgc tgagcgcagc   6600

atgggagaag catgggagca tccagccacc ggccagtcaa gacaaccccg atcgacagga   6660

cagatctgac aaacaaccat ccacacccga gcaaacgacc ccgcatgaca gcccgccggc   6720

cacatccgcc gaccagcccc ccacccaggc cacagacgaa gccgtcgaca cacagctcag   6780

gaccggagca agcaactctc tgctgttgat gcttgacaag ctcagcaata aatcgtccaa   6840

tgctaaaaag ggcccatggt cgagccccca agaggggaat caccaacgtc cgactcaaca   6900

gcaggggagt caacccagtc gcggaaacag tcaggaaaga ccgcagaacc aagtcaaggc   6960

cgcccctgga aaccagggca cagacgtgaa cacagcatat catggacaat gggaggagtc   7020

acaactatca gctggtgcaa cccctcatgc tctccgatca aggcagagcc aagacaatac   7080

ccttgtatct gcggatcatg tccagccacc tgtagacttt gtgcaagcga tgatgtctat   7140

gatggaggcg atatcacaga gagtaagtaa ggttgactat cagctagatc ttgtcttgaa   7200

acagacatcc tccatcccta tgatgcggtc cgaaatccaa cagctgaaaa catctgttgc   7260

agtcatggaa gccaacttgg gaatgatgaa gattctggat cccggttgtg ccaacatttc   7320

atctctgagt gatctacggg cagttgcccg atctcacccg gttttagttt caggccctgg   7380

agacccctct ccctatgtga cacaaggagg cgaaatggca cttaataaac tttcgcaacc   7440

agtgccacat ccatctgaat tgattaaacc cgccactgca tgcgggcctg atataggagt   7500

ggaaaaggac actgtccgtg cattgatcat gtcacgccca atgcacccga gttcttcagc   7560

caagctccta agcaagttag atgcagccgg gtcgatcgag gaaatcagga aaatcaagcg   7620

ccttgctcta aatggctaat tactactgcc acacgcagcg ggtccctgtc cactcggcat   7680

cacacggaat ctgcaccgag ttcccccccg cagacccaag gtccaactct gtttaaactt   7740

agaaaaaata cgggtagaag ctcagccacc atggccccaa cctcagcctt cctcacggcc   7800

ctggtgctac tcagctgcaa tgccatctgc tctctgggct gtgacctgcc tcagacccac   7860

agcctggctc acaccagggc cctgaggctc ctggcacaaa tgaggagaat ctcccccttc   7920

tcctgcctgg accacagaag ggactttgga tcccctcatg aggcctttgg gggcaaccag   7980

gtccagaagg ctcaagccat ggctctggtg catgagatgc tccagcagac cttccagctc   8040

ttcagcacag agggctcggc tgctgcctgg gatgagagcc tcctgcacca gttctgcact   8100

ggactggatc agcagctcag ggacctggaa gcctgtgtca tgcaggaggc ggggctggaa   8160

gggacccccc tgctggagga ggactccatc ctggctgtga ggaaatactt ccacagactc   8220

accctctatc tgcaagagaa gagctacagc ccctgtgcct gggagatcgt cagggcagaa   8280

gtcatgagat ccttctcttc ctccagaaac ctgcaagaca gactcaggaa gaaggagtga   8340

gtttaaaccc aagcggcaat cctctctcgc ttcctcagcc ccactgaatg gacgcgtaac   8400

cgtaattaat ctagctacat ttaagattaa gaaaaaatac gggtagaatt ggagtgcccc   8460

aattgtgcca agatggactc atctaggaca attgggctgt actttgattc tgcccattct   8520

tctagcaacc tgttagcatt tccgatcgtc ctacaaggca caggagatgg gaagaagcaa   8580

atcgccccgc aatataggat ccagcgcctt gacttgtgga ctgatagtaa ggaggactca   8640

gtattcatca ccacctatgg attcatcttt caagttggga atgaagaagc cactgtcggc   8700

atgatcgatg ataaacccaa gcgcgagtta ctttccgctg cgatgctctg cctaggaagc   8760

gtcccaaata ccggagacct tattgagctg gcaagggcct gtctcactat gatagtcaca   8820

tgcaagaaga gtgcaactaa tactgagaga atggttttct cagtagtgca ggcaccccaa   8880

gtgctgcaaa gctgtagggt tgtggcaaac aaatactcat cagtgaatgc agtcaagcac   8940

gtgaaagcgc cagagaagat tcccgggagt ggaaccctag aatataaggt gaactttgtc   9000

tccttgactg tggtaccgaa gaaggatgtc tacaagatcc cagctgcagt attgaaggtt   9060

tctggctcga gtctgtacaa tcttgcgctc aatgtcacta ttaatgtgga ggttgacccg   9120

aggagtcctt tggttaaatc tctgtctaag tctgacagcg gatactatgc taacctcttc   9180

ttgcatattg gacttatgac caccgtagat aggaagggga agaaagtgac atttgacaag   9240

ctggaaaaga aaataaggag ccttgatcta tctgtcgggc tcagtgatgt gctcgggcct   9300

tccgtgttgg taaaagcaag aggtgcacgg actaagcttt tggcaccttt cttctctagc   9360

agtgggacag cctgctatcc catagcaaat gcttctcctc aggtggccaa gatactctgg   9420

agtcaaaccg cgtgcctgcg gagcgttaaa atcattatcc aagcaggtac ccaacgcgct   9480

gtcgcagtga ccgccgacca cgaggttacc tctactaagc tggagaaggg gcacaccctt   9540

gccaaataca atccttttaa gaaataagct gcgtctctga gattgcgctc cgcccactca   9600

cccagatcat catgacacaa aaaactaatc tgtcttgatt atttacagtt agtttacctg   9660

cctatcaagt tagaaaaaac acgggtagaa gattctggat cccggttggc gccctccagg   9720

tgcaagatgg gctccagacc ttctaccaag aacccagcac ctatgatgct gactatccgg   9780

gttgcgctgg tactgagttg catctgtccg gcaaactcca ttgatggcag gcctcttgca   9840

gctgcaggaa ttgtggttac aggagacaaa gccgtcaaca tatacacctc atcccagaca   9900

ggatcaatca tagttaagct cctcccgaat ctgcccaagg ataaggaggc atgtgcgaaa   9960

gcccccttgg atgcatacaa caggacattg accactttgc tcacccccct tggtgactct  10020

atccgtagga tacaagagtc tgtgactaca tctggagggg ggagacaggg gcgccttata  10080

ggcgccatta ttggcggtgt ggctcttggg gttgcaactg ccgcacaaat aacagcggcc  10140

gcagctctga tacaagccaa acaaaatgct gccaacatcc tccgacttaa agagagcatt  10200

gccgcaacca atgaggctgt gcatgaggtc actgacggat tatcgcaact agcagtggca  10260

gttgggaaga tgcagcagtt tgttaatgac caacttaata aaacagctca ggaattagac  10320

tgcatcaaaa ttgcacagca agttggtgta gagctcaacc tgtacctaac cgaattgact  10380

acagtattcg gaccacaaat cacttcacct gctttaaaca agctgactat tcaggcactt  10440

tacaatctag ctggtggaaa tatggattac ttattgacta agttaggtgt agggaacaat  10500

caactcagct cattaatcgg tagcggctta atcaccggta accctattct atacgactca  10560

cagactcaac tcttgggtat acgggtaact ctaccttcag tcgggaacct aaataatatg  10620

cgtgccacct acttggaaac cttatccgta agcacaacca ggggatttgc ctcggcactt  10680

gtccccaaag tggtgacaca ggtcggttct gtgatagaag aacttgacac ctcatactgt  10740

atagaaactg acttagattt atattgtaca agaatagtaa cgttccctat gtcccctggt  10800

atttattcct gcttgagcgg caatacgtcg gcctgtatgt actcaaagac cgaaggcgca  10860

cttactacac catacatgac tatcaaaggt tcagtcatcg ccaactgcaa gatgacaaca  10920

tgtagatgtg taaacccccc gggtatcata tcgcaaaact atggagaagc cgtgtctcta  10980

atagataaac aatcatgcaa tgttttatcc ttaggcggga taactttaag gctcagtggg  11040

gaattcgatg taacttatca gaagaatatc tcaatacaag attctcaagt aataataaca  11100

ggcaatcttg atatctcaac tgagcttggg aatgtcaaca actcgatcag taatgctttg  11160

aataagttag aggaaagcaa cagaaaacta gacaaagtca atgtcaaact gactagcaca  11220

tctgctctca ttacctatat cgttttgact atcatatctc ttgtttttgg tatacttagc  11280

ctgattctag catgctacct aatgtacaag caaaaggcgc aacaaaagac cttattatgg  11340

cttgggaata atactctaga ccagatgaga gccactacaa aaatgtgaac acagatgagg  11400

aacgaaggtt tccctaatag taatttgtgt gaaagttctg gtagtctgtc agttcagagg  11460

gttaagaaaa aactaccggt tgtagatgac caaaggacga tatacgggta gaacggtaag  11520

agaggccgcc cctcaattgc gagccaggct tcacaacctc cgttctaccg cttcaccgac  11580

aacggtcctc aatcatggac cgcgccgtta gccaagttgc gttagagaat gatgaaagag  11640

aggcaaaaaa tacatggcgc ttgatattcc ggattgcaat cttattctta acagtagtga  11700

ccttggctat atctgtagcc tcccttttat atagcatggg ggctagcaca cctagcgatc  11760

ttgtaggcat accgactagg aattccaggg cagaagaaaa gattacatct acacttggtt  11820

ccaatcaaga tgtagtagat aggatatata agcaagtggc ccttgagtct ccgttggcat  11880

tgttaaaaac tgagaccaca attatgaacg caataacatc tctctcttat cagattaatg  11940

gagctgcaaa caacagtggg tggggggcac ttatccatga cccagattat atagggggga  12000

taggcaaaga actcattgta gatgatgcta gtgatgtcac atcattctat ccctctgcat  12060

ttcaagaaca tctgaatttt atcccggcgc ctactacagg atcaggttgc actcgaatac  12120

cctcatttga catgagtgct acccattact gctacaccca taatgtaata ttgtctggat  12180

gcagagatca ctcacattca tatcagtatt tagcacttgg tgtgctccgg acatctgcaa  12240

cagggagggt attcttttct actctgcgtt ccatcaacct ggacgacacc caaaatcgga  12300

agtcttgcag tgtgagtgca actcccctgg gttgtgatat gctgtgctcg aaagtcacgg  12360

agacagagga agaagattat aactcagctg tccctacgcg gatggtacat gggaggttag  12420

ggttcgacgg ccagtaccac gaaaaggacc tagatgtcac aacattattc ggggactggg  12480

tggccaacta cccaggagta gggggtggat cttttattga cagccgcgta tggttctcag  12540

tctacggagg gttaaaaccc aattcaccca gtgacactgt acaggaaggg aaatatgtga  12600

tatacaagcg atacaatgac acatgcccag atgagcaaga ctaccagatt cgaatggcca  12660

ggtcttcgta taagcctgga cggtttggtg ggaaacgcat acagcaggct atcttatcta  12720

tcaaggtgtc aacatcctta ggcgaagacc cggtactgac tgtaccgccc aacacagtca  12780

cactcatggg ggccgaaggc agaattctca cagtagggac atctcatttc ttgtatcaac  12840

gagggtcatc atacttctct cccgcgttat tatatcctat gacagtcagc aacaaaacag  12900

ccactcttca tagtccttat acattcaatg ccttcactcg gccaggtagt atcccttgcc  12960

aggcttcagc aagatgcccc aacccgtgtg ttactggagt ctatacagat ccacatcccc  13020

taatcttcta tagaaaccac accttgcgag gggtattcgg gacaatgctt gatggtgtac  13080

aagcaagact taaccctgcg tctgcagtat tcgatagcac atcccgcagt cgcattactc  13140

gagtgagttc aagcagtacc aaagcagcat acacaacatc aacttgtttt aaagtggtca  13200

agactaataa gacctattgt ctcagcattg ctgaaatatc taatactctc ttcggagaat  13260

tcagaatcgt cccgttacta gttgagatcc tcaaagatga cggggttaga gaagccaggt  13320

ctggctagtt gagtcaatta taaaggagtt ggaaagatgg cattgtatca cctatcttct  13380

gcgacatcaa gaatcaaacc gaatgccggc gcgtgctcga attccatgtt gccagttgac  13440

cacaatcagc cagtgctcat gcgatcagat taagccttgt caatagtctc ttgattaaga  13500

aaaaatgtaa gtggcaatga gatacaaggc aaaacagctc atggtaaata atacgggtag  13560

aacatggcga gctccggtcc tgaaagggca gagcatcaga ttatcctacc agagtcacac  13620

ctgtcttcac cattggtcaa gcacaaacta ctctattact ggaaattaac tgggctaccg  13680

cttcctgatg aatgtgactt cgaccacctc attctcagcc gacaatggaa aaaaatactt  13740

gaatcggcct ctcctgatac tgagagaatg ataaaactcg gaagggcagt acaccaaact  13800

cttaaccaca attccagaat aaccggagtg ctccacccca ggtgtttaga agaactggct  13860

aatattgagg tcccagattc aaccaacaaa tttcggaaga ttgagaagaa gatccaaatt  13920

cacaacacga gatatggaga actgttcaca aggctgtgta cgcatataga gaagaaactg  13980

ctggggtcat cttggtctaa caatgtcccc cggtcagagg agttcagcag catccgtacg  14040

gacccggcat tctggtttca ctcaaaatgg tccacagcca agtttgcatg gctccatata  14100

aaacagatcc agaggcatct gatggtggca gctaggacaa ggtctgcggc caacaaattg  14160

gtgatgctaa cccataaggt aggccaagtc tttgtcactc ctgaacttgt cgttgtgacg  14220

catacgaatg agaacaagtt cacatgtctt acccaggaac ttgtattgat gtatgcagat  14280

atgatggagg gcagagatat ggtcaacata atatcaacca cggcggtgca tctcagaagc  14340

ttatcagaga aaattgatga cattttgcgg ttaatagacg ctctggcaaa agacttgggt  14400

aatcaagtct acgatgttgt atcactaatg gagggatttg catacggagc tgtccagcta  14460

ctcgagccgt caggtacatt tgcaggagat ttcttcgcat tcaacctgca ggagcttaaa  14520

gacattctaa ttggcctcct ccccaatgat atagcagaat ccgtgactca tgcaatcgct  14580

actgtattct ctggtttaga acagaatcaa gcagctgaga tgttgtgtct gttgcgtctg  14640

tggggtcacc cactgcttga gtcccgtatt gccgcaaagg cagtcaggag ccaaatgtgc  14700

gcaccgaaaa tggtagactt tgatatgatc cttcaggtac tgtctttctt caagggaaca  14760

atcatcaacg ggtacagaaa gaagaatgca ggtgtgtggc cgcgagtcaa agtggataca  14820

atatatggga aggtcattgg gcaactacat gcagattcag cagagatttc acacgatatc  14880

atgttgagag agtataagag tttatctgca cttgaatttg agccatgtat agaatatgac  14940

cctgtcacca acctgagcat gttcctaaaa gacaaggcaa tcgcacaccc caacgataat  15000

tggcttgcct cgtttaggcg gaaccttctc tccgaagacc agaagaaaca tgtaaaagaa  15060

gcaacttcga ctaatcgcct cttgatagag tttttagagt caaatgattt tgatccatat  15120

aaagagatgg aatatctgac gacccttgag taccttagag atgacaatgt ggcagtatca  15180

tactcgctca aggagaagga agtgaaagtt aatggacgga tcttcgctaa gctgacaaag  15240

aagttaagga actgtcaggt gatggcggaa gggatcctag ccgatcagat tgcacctttc  15300

tttcagggaa atggagtcat tcaggatagc atatccttga ccaagagtat gctagcgatg  15360

agtcaactgt cttttaacag caataagaaa cgtatcactg actgtaaaga aagagtatct  15420

tcaaaccgca atcatgatcc gaaaagcaag aaccgtcgga gagttgcaac cttcataaca  15480

actgacctgc aaaagtactg tcttaattgg agatatcaga caatcaaatt gttcgctcat  15540

gccatcaatc agttgatggg cctacctcac ttcttcgaat ggattcacct aagactgatg  15600

gacactacga tgttcgtagg agaccctttc aatcctccaa gtgaccctac tgactgtgac  15660

ctctcaagag tccctaatga tgacatatat attgtcagtg ccagaggggg tatcgaagga  15720

ttatgccaga agctatggac aatgatctca attgctgcaa tccaacttgc tgcagctaga  15780

tcgcattgtc gtgttgcctg tatggtacag ggtgataatc aagtaatagc agtaacgaga  15840

gaggtaagat cagacgactc tccggagatg gtgttgacac agttgcatca agccagtgat  15900

aatttcttca aggaattaat tcatgtcaat catttgattg gccataattt gaaggatcgt  15960

gaaaccatca ggtcagacac attcttcata tacagcaaac gaatcttcaa agatggagca  16020

atcctcagtc aagtcctcaa aaattcatct aaattagtgc tagtgtcagg tgatctcagt  16080

gaaaacaccg taatgtcctg tgccaacatt gcctctactg tagcacggct atgcgagaac  16140

gggcttccca aagacttctg ttactattta aactatataa tgagttgtgt gcagacatac  16200

tttgactctg agttctccat caccaacaat tcgcaccccg atcttaatca gtcgtggatt  16260

gaggacatct cttttgtgca ctcatatgtt ctgactcctg cccaattagg gggactgagt  16320

aaccttcaat actcaaggct ctacactaga aatatcggtg acccggggac tactgctttt  16380

gcagagatcc agcgactaga agcagtggga ttactgagtc ctaacattat gactaatatc  16440

ttaactaggc cgcctgggaa tggagattgg gccagtctgt gcaacgaccc atactctttc  16500

aattttgaga ctgttgcaag cccaaatatt gttcttaaga aacatacgcg aagagtccta  16560

tttgaaactt gttcaaatcc cttattgtct ggagtgcaca cagaggataa tgaggcagaa  16620

gagaaggcat tggctgaatt cttgcttaat caagaggtga ttcatccccg cgttgcgcat  16680

gccatcatgg aggcaagctc tgtaggtagg agaaagcaaa ttcaagggct tgttgacaca  16740

acaaacaccg taattaagat tgcgcttact aggaggccat taggcataaa gaggctgatg  16800

cggatagtca attattctag catgcatgca atgctgttta gagacgatgt tttttcctcc  16860

agtagatcca accacccctt agtctcttct aatatgtgtt ctctgacact ggcagactat  16920

gcacggaata gaagctggtc acctttgacg ggaggcagga aaatactggg tgtatctaat  16980

cctgatacga tagaactcgt agagggtgag attcttagtg taagcggagg gtgtacaaga  17040

tgtgacagcg gagatgaaca atttacttgg ttccatcttc caagcaatat agaattgacc  17100

gatgacacca gcaagaatcc tccgatgagg gtaccatatc tcgggtcgaa gacacaggag  17160

aggagagctg cctcacttgc aaaaatagct catatgtcgc cacatgtaaa ggctgcccta  17220

agggcatcat ccgtgttgat ctgggcttat ggggataatg acgtaaattg gactgctgct  17280

cttacgattg caaaatctcg gtgtaatgta aacttagagt atcttcggtt actgtcccct  17340

ttacccacgg ctgggaatct tcaacataga ctagatgatg gtataactca gatgacattc  17400

acccctgcat ctctctacag gtgtcacctt acattcacat atccaatgat tctcaaaggc  17460

tgttcactga agaaggagtc aaagagggga atgtggttta ccaacagagt catgctcttg  17520

ggtttatctc taatcgaatc gatatttcca atgacagcaa ccaggacata tgatgagatc  17580

acactgcacc tacatagtaa atttagttgc tgtatcagag aagcacctgt tgcggttcct  17640

ttcgagctac ttggggtggt accggaactg aggacagtga cctcaaataa gtttatgtat  17700

gatcctagcc ctggatcgga gggagacttt gcgagacttg acttagctat cttcaagagt  17760

tatgagctta atctggagtc atatcccacg atagagctaa tgaacattct ttcaatatcc  17820

agcgggaagt tgattggcca gtctgtggtt tcttatgatg aagatacctc cataaagaat  17880

gacgccataa tagtgtacga caatacccga aattggatca gtgaagctca gaattcagat  17940

gtggtccgcc tatttgaata tgcagcactt gaagtgctcc tcaactgttc ttaccaactc  18000

tattacctga gagtaagagg cctagacaat attgtcttat atatgggtga tttatacaag  18060

aatatgccag gaattctact ttccaacatt gcagctacaa tatctcatcc cgtcattcat  18120

tcaaggttac atgcagtggg cctggtcaac catgacggat cacaccaact tgcagatacg  18180

gattttatcg aaatgtctgc aaaactatta gtatcttgca cccgacgtgt gatctccggc  18240

ttatattcag gaaataagta tgatctgctg ttcccatctg tcttagatga taacctgaat  18300

gagaagatgc ttcagctgat atcccggtta tgctgtctgt acacggtact ctttgctaca  18360

acaagagaaa tcccgaaaat aagaggctta actacaaaag agaaatgttc aatacccact  18420

gagtatttac tgtcggatgc tgtgaaacca ttacttagcc ccgatcaagt gagctctatc  18480

atgtctccta acataattac attcccagct aatccgtact acatgtctcg gaagagcctc  18540

aatttgatca gggaaaggga ggacagggat actatcctgg tgttgttgtt cccccaagag  18600

ccattattag agttcccttc tgtgcaagat attggtgctc gagtgaaaga tccattcacc  18660

cgacaacctg cggcattttt gcaagagtta gatttgagtg ctccagcaag gtatgacgca  18720

ttcacactta gtcagattca tcctgaactc acatctccaa atccggagga agactactta  18780

gtacgatact tgttcagagg gatagggact gcatcttcct cttggtataa ggcatctcat  18840

ctcctttctg tacccgaggt aagatgtgca agacacggga actccttata cttagctgaa  18900

gggagcggag ccatcatgag tcttctcgaa ctgcatgtac cacatgaaac tatctattac  18960

aatacgctct tttcaaatga gatgaacccc ccgcaatgac atttcgggcc gaccccaact  19020

cagtttttga attcggttgt ttataggaat ctacaggcgg aggtaacatg caaagatgga  19080

tttgtccaag agttccgtcc attatggaga gaaaatacag aggaaagtga cctgacctca  19140

gataaagcag tggggtatat tacatctgca gtgccctaca gatctgtatc attgctgcat  19200

tgtgacattg aaactcctcc agggtccaat caaagcttac tagatcaact agctatcaat  19260

ttatctctga ttgccatgca ttctgtaagg gagggcgggg tagtaatcat caaagtgttg  19320

tatgcaatgg gatactactt tcatctactc atgaacttgt ttgctccgtg ttccacaaaa  19380

ggatatattc tctctaatgg ttatgcatgt cgaggagata tggagtgtta cctggtattt  19440

gtcatgggtt acctgggcgg gcctacattt gtacatgagg tggtgaggat ggcaaaaact  19500

ctggtgcagc ggcacggtac gctcttgtct aaatcagatg agatcacact gaccaggtta  19560

ttcacctcac agcggcagcg tgtgacagac atcctatcca gtcctttacc aagattaata  19620

aagtacttga ggaagaatat tgacactgcg ctgattgaag ccgggggaca gcccgtccgt  19680

ccattctgtg cggagagtct ggtgagcacg ctagcgaaca taactcagat aacccagatt  19740

atcgctagtc acattgacac agttatccgg tctgtgatat atatggaagc tgagggtgat  19800

ctcgctgaca cagtatttct atttacccct tacaatctct ctactgacgg gaaaaagagg  19860

acatcactta aacagtgcac gagacagatc ctagaggtta caatactagg tcttagagtc  19920

gaaaatctca ataaaatagg cgatataatc agtctagagc ttaaaggcat gatctccatg  19980

gaggacctta tcccactaag gacatacttg aagcatagta cctgccctaa atatttgaag  20040

gctgtcctag gtattaccaa actcaaagaa atgtttacag acacttctgt actgtacttg  20100

actcgtgctc aacaaaaatt ctacatgaaa actataggca atgcagtcaa cggatattac  20160

agtaactgtg actcttaacg aaaatcacat attaataggc tccttttttg gccaattgta  20220

ttcttgttga tttaatcata ttatgttaga aaaaagttga accctgactc cttaggactc  20280

gaattcgaac tcaaataaat gtcttaaaaa aaggttgcgc acaattattc ttgagtgtag  20340

tctcgtcatt caccaaatct ttgtttggtg ggtcggcatg gcatctccac ctcctcgcgg  20400

tccgacctgg gcatccgaag gaggacgtcg tccactcgga tggctaaggg aggggccccc  20460

gcggggctgc taacaaagcc cgaaaggaag ctgagttggc tgctgccacc gctgagcaat  20520

aactagcata accccttggg gcctctaaac gggtcttgag gggttttttg ctgaaaggag  20580

gaactatatc cggatcgaga cctcgatact agtgcggtgg agctgaattc             20630

<210>8

<211>20626

<212>DNA

<213>人工

<400>8

ttctcatgtt tgacagctta tcatcgataa gctttaatgc ggtagtttat cacagttaaa     60

ttgctaacgc agtcaggcac cgtgtatgaa atctaacaat gcgctcatcg tcatcctcgg    120

caccgtcacc ctggatgctg taggcatagg cttggttatg ccggtactgc cgggcctctt    180

gcgggatatc gtccattccg acagcatcgc cagtcactat ggcgtgctgc tagcgctata    240

tgcgttgatg caatttctat gcgcacccgt tctcggagca ctgtccgacc gctttggccg    300

ccgcccagtc ctgctcgctt cgctacttgg agccactatc gactacgcga tcatggcgac    360

cacacccgtc ctgtggatcc tctacgccgg acgcatcgtg gccggcatca ccggcgccac    420

aggtgcggtt gctggcgcct atatcgccga catcaccgat ggggaagatc gggctcgcca    480

cttcgggctc atgagcgctt gtttcggcgt gggtatggtg gcaggccccg tggccggggg    540

actgttgggc gccatctcct tgcatgcacc attccttgcg gcggcggtgc tcaacggcct    600

caacctacta ctgggctgct tcctaatgca ggagtcgcat aagggagagc gtcgaccgat    660

gcccttgaga gccttcaacc cagtcagctc cttccggtgg gcgcggggca tgactatcgt    720

cgccgcactt atgactgtct tctttatcat gcaactcgta ggacaggtgc cggcagcgct    780

ctgggtcatt ttcggcgagg accgctttcg ctggagcgcg acgatgatcg gcctgtcgct    840

tgcggtattc ggaatcttgc acgccctcgc tcaagccttc gtcactggtc ccgccaccaa    900

acgtttcggc gagaagcagg ccattatcgc cggcatggcg gccgacgcgc tgggctacgt    960

cttgctggcg ttcgcgacgc gaggctggat ggccttcccc attatgattc ttctcgcttc   1020

cggcggcatc gggatgcccg cgttgcaggc catgctgtcc aggcaggtag atgacgacca   1080

tcagggacag cttcaaggat cgctcgcggc tcttaccagc ctaacttcga tcactggacc   1140

gctgatcgtc acggcgattt atgccgcctc ggcgagcaca tggaacgggt tggcatggat   1200

tgtaggcgcc gccctatacc ttgtctgcct ccccgcgttg cgtcgcggtg catggagccg   1260

ggccacctcg acctgaatgg aagccggcgg cacctcgcta acggattcac cactccaaga   1320

attggagcca atcaattctt gcggagaact gtgaatgcgc aaaccaaccc ttggcagaac   1380

atatccatcg cgtccgccat ctccagcagc cgcacgcggc gcatctcggg cagcgttggg   1440

tcctggccac gggtgcgcat gatcgtgctc ctgtcgttga ggacccggct aggctggcgg   1500

ggttgcctta ctggttagca gaatgaatca ccgatacgcg agcgaacgtg aagcgactgc   1560

tgctgcaaaa cgtctgcgac ctgagcaaca acatgaatgg tcttcggttt ccgtgtttcg   1620

taaagtctgg aaacgcggaa gtcagcgccc tgcaccatta tgttccggat ctgcatcgca   1680

ggatgctgct ggctaccctg tggaacacct acatctgtat taacgaagcg ctggcattga   1740

ccctgagtga tttttctctg gtcccgccgc atccataccg ccagttgttt accctcacaa   1800

cgttccagta accgggcatg ttcatcatca gtaacccgta tcgtgagcat cctctctcgt   1860

ttcatcggta tcattacccc catgaacaga aatccccctt acacggaggc atcagtgacc   1920

aaacaggaaa aaaccgccct taacatggcc cgctttatca gaagccagac attaacgctt   1980

ctggagaaac tcaacgagct ggacgcggat gaacaggcag acatctgtga atcgcttcac   2040

gaccacgctg atgagcttta ccgcagctgc ctcgcgcgtt tcggtgatga cggtgaaaac   2100

ctctgacaca tgcagctccc ggagacggtc acagcttgtc tgtaagcgga tgccgggagc   2160

agacaagccc gtcagggcgc gtcagcgggt gttggcgggt gtcggggcgc agccatgacc   2220

cagtcacgta gcgatagcgg agtgtatact ggcttaacta tgcggcatca gagcagattg   2280

tactgagagt gcaccatatg cggtgtgaaa taccgcacag atgcgtaagg agaaaatacc   2340

gcatcaggcg ctcttccgct tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc   2400

ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa tcaggggata   2460

acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg   2520

cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct   2580

caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa   2640

gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc   2700

tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt   2760

aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg   2820

ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca acccggtaag acacgactta tcgccactgg   2880

cagcagccac tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct   2940

tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta gaaggacagt atttggtatc tgcgctctgc   3000

tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg   3060

ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc   3120

aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt   3180

aagggatttt ggtcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt ttaaattaaa   3240

aatgaagttt taaatcaatc taaagtatat atgagtaaac ttggtctgac agttaccaat   3300

gcttaatcag tgaggcacct atctcagcga tctgtctatt tcgttcatcc atagttgcct   3360

gactccccgt cgtgtagata actacgatac gggagggctt accatctggc cccagtgctg   3420

caatgatacc gcgagaccca cgctcaccgg ctccagattt atcagcaata aaccagccag   3480

ccggaagggc cgagcgcaga agtggtcctg caactttatc cgcctccatc cagtctatta   3540

attgttgccg ggaagctaga gtaagtagtt cgccagttaa tagtttgcgc aacgttgttg   3600

ccattgctgc aggcatcgtg gtgtcacgct cgtcgtttgg tatggcttca ttcagctccg   3660

gttcccaacg atcaaggcga gttacatgat cccccatgtt gtgcaaaaaa gcggttagct   3720

ccttcggtcc tccgatcgtt gtcagaagta agttggccgc agtgttatca ctcatggtta   3780

tggcagcact gcataattct cttactgtca tgccatccgt aagatgcttt tctgtgactg   3840

gtgagtactc aaccaagtca ttctgagaat agtgtatgcg gcgaccgagt tgctcttgcc   3900

cggcgtcaac acgggataat accgcgccac atagcagaac tttaaaagtg ctcatcattg   3960

gaaaacgttc ttcggggcga aaactctcaa ggatcttacc gctgttgaga tccagttcga   4020

tgtaacccac tcgtgcaccc aactgatctt cagcatcttt tactttcacc agcgtttctg   4080

ggtgagcaaa aacaggaagg caaaatgccg caaaaaaggg aataagggcg acacggaaat   4140

gttgaatact catactcttc ctttttcaat attattgaag catttatcag ggttattgtc   4200

tcatgagcgg atacatattt gaatgtattt agaaaaataa acaaataggg gttccgcgca   4260

catttccccg aaaagtgcca cctgacgtct aagaaaccat tattatcatg acattaacct   4320

ataaaaatag gcgtatcacg aggccctttc gtcttcaaga attctaggcg gctatatgcg   4380

ttggatgcaa tttctatgcg cacccgttct cggagcactg tccgaccgct ttggccgccg   4440

cccagtcctg ctcgcttcgc tacttggagc cactatcgag ctacgcgatc atggcgacca   4500

cacccgtcct gtggatcccc cgaagtctag aactagtgga tccccctgat acgactcact   4560

ataggaccaa acagagaatc cgtgagttac gataaaaggc gaaggagcaa ttgaagtcgc   4620

acgggtagaa ggtgtgactc tcgagtgcga gcccgaagca caaactcgag aaagccttct   4680

gccaacatgt cttccgtatt tgatgagtac gaacagctcc tcgcggctca gactcgcccc   4740

aatggagctc atggaggggg agaaaaaggg agtaccttaa aagtagacgt cccggtattc   4800

actcttaaca gtgatgaccc agaagataga tggagctttg tggtattctg cctccggatt   4860

gctgttagcg aagatgccaa caaaccactc aggcaaggtg ctctcatatc tcttttatgc   4920

tcccactcac aggtaatgag gaaccatgtt gcccttgcag ggaaacagaa tgaagccaca   4980

ttggccgtgc ttgagattga tggctttgcc aacggcacgc cccagttcaa caataggagt   5040

ggagtgtctg aagagagagc acagagattt gcgatgatag caggatctct ccctcgggca   5100

tgcagcaacg gaaccccgtt cgtcacagcc ggggccgaag atgatgcacc agaagacatc   5160

accgataccc tggagaggat cctctctatc caggctcaag tatgggtcac agtagcaaaa   5220

gccatgactg cgtatgagac tgcagatgag tcggaaacaa ggcgaatcaa taagtatatg   5280

cagcaaggca gggtccaaaa gaaatacatc ctctaccccg tatgcaggag cacaatccaa   5340

ctcacgatca gacagtctct tgcagtccgc atctttttgg ttagcgagct caagagaggc   5400

cgcaacacgg caggtggtac ctctacttat tataacctgg taggggacgt agactcatac   5460

atcaggaata ccgggcttac tgcattcttc ttgacactca agtacggaat caacaccaag   5520

acatcagccc ttgcacttag tagcctctca ggcgacatcc agaagatgaa gcagctcatg   5580

cgtttgtatc ggatgaaagg agataatgcg ccgtacatga cattacttgg tgatagtgac   5640

cagatgagct ttgcgcctgc cgagtatgca caactttact cctttgccat gggtatggca   5700

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cttagcgagg gggggtccca agctctacaa ggcggatcga atagatcgca agggcaacca   6000

gaagccgggg atggggagac ccaattcctg gatctgatga gagcggtagc aaatagcatg   6060

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ccatcccaag ataacgacac cgactggggg tattgataaa caaaacccag cctgcttcca   6180

caaaaacatc ccaatgccct cacccgtagt cgacccctcg atttgcggct ctatatgacc   6240

acaccctcaa acaaacatcc ccctctttcc tccctccccc tgctgtacaa ctccgcacgc   6300

cctagatacc acaggcacaa tgcggctcac taacaatcaa aacagagccg agggaattag   6360

aaaaaagtac gggtagaaga gggatattca gagatcaggg caagtctccc gagtctctgc   6420

tctctcctct acctgataga ccaggacaaa catggccacc tttacggatg cagagatcga   6480

cgagctattt gagacaagtg gaactgtcat tgacaacata attacagccc agggtaaacc   6540

agcagagact gttggaagga gtgcaatccc acaaggcaag accaaggtgc tgagcgcagc   6600

atgggagaag catgggagca tccagccacc ggccagtcaa gacaaccccg atcgacagga   6660

cagatctgac aaacaaccat ccacacccga gcaaacgacc ccgcatgaca gcccgccggc   6720

cacatccgcc gaccagcccc ccacccaggc cacagacgaa gccgtcgaca cacagctcag   6780

gaccggagca agcaactctc tgctgttgat gcttgacaag ctcagcaata aatcgtccaa   6840

tgctaaaaag ggcccatggt cgagccccca agaggggaat caccaacgtc cgactcaaca   6900

gcaggggagt caacccagtc gcggaaacag tcaggaaaga ccgcagaacc aagtcaaggc   6960

cgcccctgga aaccagggca cagacgtgaa cacagcatat catggacaat gggaggagtc   7020

acaactatca gctggtgcaa cccctcatgc tctccgatca aggcagagcc aagacaatac   7080

ccttgtatct gcggatcatg tccagccacc tgtagacttt gtgcaagcga tgatgtctat   7140

gatggaggcg atatcacaga gagtaagtaa ggttgactat cagctagatc ttgtcttgaa   7200

acagacatcc tccatcccta tgatgcggtc cgaaatccaa cagctgaaaa catctgttgc   7260

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atctctgagt gatctacggg cagttgcccg atctcacccg gttttagttt caggccctgg   7380

agacccctct ccctatgtga cacaaggagg cgaaatggca cttaataaac tttcgcaacc   7440

agtgccacat ccatctgaat tgattaaacc cgccactgca tgcgggcctg atataggagt   7500

ggaaaaggac actgtccgtg cattgatcat gtcacgccca atgcacccga gttcttcagc   7560

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accaacaaag gagcagcaat ttggcatgtc agaagctcct gggacagttg cctgggactc   7920

ctcaatattg cctcgaagat aggatgaact ttgaggtccc tgaggagatt atgcaaccac   7980

cacaattcca gaaggaagat gcagtattga ttatccacga gatgctccag cagatcttcg   8040

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aggaaaattt ccccagggga gacatgacca ttcttcacct gaagaaatat tacttgagca   8220

ttctgcagta cctgaagtcc aaggagtaca gaagctgtgc ctggacagtc gtccaagtgg   8280

aaatcctcag gaacttttct ttccttaaca gacttacaga ttacctccgg aactgagttt   8340

aaacccaagc ggcaatcctc tctcgcttcc tcagccccac tgaatggacg cgtaaccgta   8400

attaatctag ctacatttaa gattaagaaa aaatacgggt agaattggag tgccccaatt   8460

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gcaacctgtt agcatttccg atcgtcctac aaggcacagg agatgggaag aagcaaatcg   8580

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tcatcaccac ctatggattc atctttcaag ttgggaatga agaagccact gtcggcatga   8700

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caaataccgg agaccttatt gagctggcaa gggcctgtct cactatgata gtcacatgca   8820

agaagagtgc aactaatact gagagaatgg ttttctcagt agtgcaggca ccccaagtgc   8880

tgcaaagctg tagggttgtg gcaaacaaat actcatcagt gaatgcagtc aagcacgtga   8940

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tgactgtggt accgaagaag gatgtctaca agatcccagc tgcagtattg aaggtttctg   9060

gctcgagtct gtacaatctt gcgctcaatg tcactattaa tgtggaggtt gacccgagga   9120

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gatcatcatg acacaaaaaa ctaatctgtc ttgattattt acagttagtt tacctgccta   9660

tcaagttaga aaaaacacgg gtagaagatt ctggatcccg gttggcgccc tccaggtgca   9720

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atcttgatat ctcaactgag cttgggaatg tcaacaactc gatcagtaat gctttgaata  11160

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ctctcattac ctatatcgtt ttgactatca tatctcttgt ttttggtata cttagcctga  11280

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aaaaaataca tggcgcttga tattccggat tgcaatctta ttcttaacag tagtgacctt  11700

ggctatatct gtagcctccc ttttatatag catgggggct agcacaccta gcgatcttgt  11760

aggcataccg actaggaatt ccagggcaga agaaaagatt acatctacac ttggttccaa  11820

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agaacatctg aattttatcc cggcgcctac tacaggatca ggttgcactc gaataccctc  12120

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ttcagcaaga tgccccaacc cgtgtgttac tggagtctat acagatccac atcccctaat  13020

cttctataga aaccacacct tgcgaggggt attcgggaca atgcttgatg gtgtacaagc  13080

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catcaagaat caaaccgaat gccggcgcgt gctcgaattc catgttgcca gttgaccaca  13440

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accacaattc cagaataacc ggagtgctcc accccaggtg tttagaagaa ctggctaata  13860

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acacgagata tggagaactg ttcacaaggc tgtgtacgca tatagagaag aaactgctgg  13980

ggtcatcttg gtctaacaat gtcccccggt cagaggagtt cagcagcatc cgtacggacc  14040

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agggaaatgg agtcattcag gatagcatat ccttgaccaa gagtatgcta gcgatgagtc  15360

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catcatccgt gttgatctgg gcttatgggg ataatgacgt aaattggact gctgctctta  17280

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ctgcatctct ctacaggtgt caccttacat tcacatatcc aatgattctc aaaggctgtt  17460

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cctcacagcg gcagcgtgtg acagacatcc tatccagtcc tttaccaaga ttaataaagt  19620

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tctgtgcgga gagtctggtg agcacgctag cgaacataac tcagataacc cagattatcg  19740

ctagtcacat tgacacagtt atccggtctg tgatatatat ggaagctgag ggtgatctcg  19800

ctgacacagt atttctattt accccttaca atctctctac tgacgggaaa aagaggacat  19860

cacttaaaca gtgcacgaga cagatcctag aggttacaat actaggtctt agagtcgaaa  19920

atctcaataa aataggcgat ataatcagtc tagagcttaa aggcatgatc tccatggagg  19980

accttatccc actaaggaca tacttgaagc atagtacctg ccctaaatat ttgaaggctg  20040

tcctaggtat taccaaactc aaagaaatgt ttacagacac ttctgtactg tacttgactc  20100

gtgctcaaca aaaattctac atgaaaacta taggcaatgc agtcaacgga tattacagta  20160

actgtgactc ttaacgaaaa tcacatatta ataggctcct tttttggcca attgtattct  20220

tgttgattta atcatattat gttagaaaaa agttgaaccc tgactcctta ggactcgaat  20280

tcgaactcaa ataaatgtct taaaaaaagg ttgcgcacaa ttattcttga gtgtagtctc  20340

gtcattcacc aaatctttgt ttggtgggtc ggcatggcat ctccacctcc tcgcggtccg  20400

acctgggcat ccgaaggagg acgtcgtcca ctcggatggc taagggaggg gcccccgcgg  20460

ggctgctaac aaagcccgaa aggaagctga gttggctgct gccaccgctg agcaataact  20520

agcataaccc cttggggcct ctaaacgggt cttgaggggt tttttgctga aaggaggaac  20580

tatatccgga tcgagacctc gatactagtg cggtggagct gaattc                 20626

<210>9

<211>20566

<212>DNA

<213>人工

<400>9

ttctcatgtt tgacagctta tcatcgataa gctttaatgc ggtagtttat cacagttaaa     60

ttgctaacgc agtcaggcac cgtgtatgaa atctaacaat gcgctcatcg tcatcctcgg    120

caccgtcacc ctggatgctg taggcatagg cttggttatg ccggtactgc cgggcctctt    180

gcgggatatc gtccattccg acagcatcgc cagtcactat ggcgtgctgc tagcgctata    240

tgcgttgatg caatttctat gcgcacccgt tctcggagca ctgtccgacc gctttggccg    300

ccgcccagtc ctgctcgctt cgctacttgg agccactatc gactacgcga tcatggcgac    360

cacacccgtc ctgtggatcc tctacgccgg acgcatcgtg gccggcatca ccggcgccac    420

aggtgcggtt gctggcgcct atatcgccga catcaccgat ggggaagatc gggctcgcca    480

cttcgggctc atgagcgctt gtttcggcgt gggtatggtg gcaggccccg tggccggggg    540

actgttgggc gccatctcct tgcatgcacc attccttgcg gcggcggtgc tcaacggcct    600

caacctacta ctgggctgct tcctaatgca ggagtcgcat aagggagagc gtcgaccgat    660

gcccttgaga gccttcaacc cagtcagctc cttccggtgg gcgcggggca tgactatcgt    720

cgccgcactt atgactgtct tctttatcat gcaactcgta ggacaggtgc cggcagcgct    780

ctgggtcatt ttcggcgagg accgctttcg ctggagcgcg acgatgatcg gcctgtcgct    840

tgcggtattc ggaatcttgc acgccctcgc tcaagccttc gtcactggtc ccgccaccaa    900

acgtttcggc gagaagcagg ccattatcgc cggcatggcg gccgacgcgc tgggctacgt    960

cttgctggcg ttcgcgacgc gaggctggat ggccttcccc attatgattc ttctcgcttc   1020

cggcggcatc gggatgcccg cgttgcaggc catgctgtcc aggcaggtag atgacgacca   1080

tcagggacag cttcaaggat cgctcgcggc tcttaccagc ctaacttcga tcactggacc   1140

gctgatcgtc acggcgattt atgccgcctc ggcgagcaca tggaacgggt tggcatggat   1200

tgtaggcgcc gccctatacc ttgtctgcct ccccgcgttg cgtcgcggtg catggagccg   1260

ggccacctcg acctgaatgg aagccggcgg cacctcgcta acggattcac cactccaaga   1320

attggagcca atcaattctt gcggagaact gtgaatgcgc aaaccaaccc ttggcagaac   1380

atatccatcg cgtccgccat ctccagcagc cgcacgcggc gcatctcggg cagcgttggg   1440

tcctggccac gggtgcgcat gatcgtgctc ctgtcgttga ggacccggct aggctggcgg   1500

ggttgcctta ctggttagca gaatgaatca ccgatacgcg agcgaacgtg aagcgactgc   1560

tgctgcaaaa cgtctgcgac ctgagcaaca acatgaatgg tcttcggttt ccgtgtttcg   1620

taaagtctgg aaacgcggaa gtcagcgccc tgcaccatta tgttccggat ctgcatcgca   1680

ggatgctgct ggctaccctg tggaacacct acatctgtat taacgaagcg ctggcattga   1740

ccctgagtga tttttctctg gtcccgccgc atccataccg ccagttgttt accctcacaa   1800

cgttccagta accgggcatg ttcatcatca gtaacccgta tcgtgagcat cctctctcgt   1860

ttcatcggta tcattacccc catgaacaga aatccccctt acacggaggc atcagtgacc   1920

aaacaggaaa aaaccgccct taacatggcc cgctttatca gaagccagac attaacgctt   1980

ctggagaaac tcaacgagct ggacgcggat gaacaggcag acatctgtga atcgcttcac   2040

gaccacgctg atgagcttta ccgcagctgc ctcgcgcgtt tcggtgatga cggtgaaaac   2100

ctctgacaca tgcagctccc ggagacggtc acagcttgtc tgtaagcgga tgccgggagc   2160

agacaagccc gtcagggcgc gtcagcgggt gttggcgggt gtcggggcgc agccatgacc   2220

cagtcacgta gcgatagcgg agtgtatact ggcttaacta tgcggcatca gagcagattg   2280

tactgagagt gcaccatatg cggtgtgaaa taccgcacag atgcgtaagg agaaaatacc   2340

gcatcaggcg ctcttccgct tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc   2400

ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa tcaggggata   2460

acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg   2520

cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct   2580

caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa   2640

gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc   2700

tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt   2760

aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg   2820

ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca acccggtaag acacgactta tcgccactgg   2880

cagcagccac tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct   2940

tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta gaaggacagt atttggtatc tgcgctctgc   3000

tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg   3060

ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc   3120

aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt   3180

aagggatttt ggtcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt ttaaattaaa   3240

aatgaagttt taaatcaatc taaagtatat atgagtaaac ttggtctgac agttaccaat   3300

gcttaatcag tgaggcacct atctcagcga tctgtctatt tcgttcatcc atagttgcct   3360

gactccccgt cgtgtagata actacgatac gggagggctt accatctggc cccagtgctg   3420

caatgatacc gcgagaccca cgctcaccgg ctccagattt atcagcaata aaccagccag   3480

ccggaagggc cgagcgcaga agtggtcctg caactttatc cgcctccatc cagtctatta   3540

attgttgccg ggaagctaga gtaagtagtt cgccagttaa tagtttgcgc aacgttgttg   3600

ccattgctgc aggcatcgtg gtgtcacgct cgtcgtttgg tatggcttca ttcagctccg   3660

gttcccaacg atcaaggcga gttacatgat cccccatgtt gtgcaaaaaa gcggttagct   3720

ccttcggtcc tccgatcgtt gtcagaagta agttggccgc agtgttatca ctcatggtta   3780

tggcagcact gcataattct cttactgtca tgccatccgt aagatgcttt tctgtgactg   3840

gtgagtactc aaccaagtca ttctgagaat agtgtatgcg gcgaccgagt tgctcttgcc   3900

cggcgtcaac acgggataat accgcgccac atagcagaac tttaaaagtg ctcatcattg   3960

gaaaacgttc ttcggggcga aaactctcaa ggatcttacc gctgttgaga tccagttcga   4020

tgtaacccac tcgtgcaccc aactgatctt cagcatcttt tactttcacc agcgtttctg   4080

ggtgagcaaa aacaggaagg caaaatgccg caaaaaaggg aataagggcg acacggaaat   4140

gttgaatact catactcttc ctttttcaat attattgaag catttatcag ggttattgtc   4200

tcatgagcgg atacatattt gaatgtattt agaaaaataa acaaataggg gttccgcgca   4260

catttccccg aaaagtgcca cctgacgtct aagaaaccat tattatcatg acattaacct   4320

ataaaaatag gcgtatcacg aggccctttc gtcttcaaga attctaggcg gctatatgcg   4380

ttggatgcaa tttctatgcg cacccgttct cggagcactg tccgaccgct ttggccgccg   4440

cccagtcctg ctcgcttcgc tacttggagc cactatcgag ctacgcgatc atggcgacca   4500

cacccgtcct gtggatcccc cgaagtctag aactagtgga tccccctgat acgactcact   4560

ataggaccaa acagagaatc cgtgagttac gataaaaggc gaaggagcaa ttgaagtcgc   4620

acgggtagaa ggtgtgactc tcgagtgcga gcccgaagca caaactcgag aaagccttct   4680

gccaacatgt cttccgtatt tgatgagtac gaacagctcc tcgcggctca gactcgcccc   4740

aatggagctc atggaggggg agaaaaaggg agtaccttaa aagtagacgt cccggtattc   4800

actcttaaca gtgatgaccc agaagataga tggagctttg tggtattctg cctccggatt   4860

gctgttagcg aagatgccaa caaaccactc aggcaaggtg ctctcatatc tcttttatgc   4920

tcccactcac aggtaatgag gaaccatgtt gcccttgcag ggaaacagaa tgaagccaca   4980

ttggccgtgc ttgagattga tggctttgcc aacggcacgc cccagttcaa caataggagt   5040

ggagtgtctg aagagagagc acagagattt gcgatgatag caggatctct ccctcgggca   5100

tgcagcaacg gaaccccgtt cgtcacagcc ggggccgaag atgatgcacc agaagacatc   5160

accgataccc tggagaggat cctctctatc caggctcaag tatgggtcac agtagcaaaa   5220

gccatgactg cgtatgagac tgcagatgag tcggaaacaa ggcgaatcaa taagtatatg   5280

cagcaaggca gggtccaaaa gaaatacatc ctctaccccg tatgcaggag cacaatccaa   5340

ctcacgatca gacagtctct tgcagtccgc atctttttgg ttagcgagct caagagaggc   5400

cgcaacacgg caggtggtac ctctacttat tataacctgg taggggacgt agactcatac   5460

atcaggaata ccgggcttac tgcattcttc ttgacactca agtacggaat caacaccaag   5520

acatcagccc ttgcacttag tagcctctca ggcgacatcc agaagatgaa gcagctcatg   5580

cgtttgtatc ggatgaaagg agataatgcg ccgtacatga cattacttgg tgatagtgac   5640

cagatgagct ttgcgcctgc cgagtatgca caactttact cctttgccat gggtatggca   5700

tcagtcctag ataaaggtac tgggaaatac caatttgcca gggactttat gagcacatca   5760

ttctggagac ttggagtaga gtacgctcag gctcagggaa gtagcattaa cgaggatatg   5820

gctgccgagc taaagctaac cccagcagca aggaggggcc tggcagctgc tgcccaacgg   5880

gtctccgagg agaccagcag catagacatg cctactcaac aagtcggagt cctcactggg   5940

cttagcgagg gggggtccca agctctacaa ggcggatcga atagatcgca agggcaacca   6000

gaagccgggg atggggagac ccaattcctg gatctgatga gagcggtagc aaatagcatg   6060

agggaggcgc caaactctgc acagggcact ccccaatcgg ggcctccccc aactcctggg   6120

ccatcccaag ataacgacac cgactggggg tattgataaa caaaacccag cctgcttcca   6180

caaaaacatc ccaatgccct cacccgtagt cgacccctcg atttgcggct ctatatgacc   6240

acaccctcaa acaaacatcc ccctctttcc tccctccccc tgctgtacaa ctccgcacgc   6300

cctagatacc acaggcacaa tgcggctcac taacaatcaa aacagagccg agggaattag   6360

aaaaaagtac gggtagaaga gggatattca gagatcaggg caagtctccc gagtctctgc   6420

tctctcctct acctgataga ccaggacaaa catggccacc tttacggatg cagagatcga   6480

cgagctattt gagacaagtg gaactgtcat tgacaacata attacagccc agggtaaacc   6540

agcagagact gttggaagga gtgcaatccc acaaggcaag accaaggtgc tgagcgcagc   6600

atgggagaag catgggagca tccagccacc ggccagtcaa gacaaccccg atcgacagga   6660

cagatctgac aaacaaccat ccacacccga gcaaacgacc ccgcatgaca gcccgccggc   6720

cacatccgcc gaccagcccc ccacccaggc cacagacgaa gccgtcgaca cacagctcag   6780

gaccggagca agcaactctc tgctgttgat gcttgacaag ctcagcaata aatcgtccaa   6840

tgctaaaaag ggcccatggt cgagccccca agaggggaat caccaacgtc cgactcaaca   6900

gcaggggagt caacccagtc gcggaaacag tcaggaaaga ccgcagaacc aagtcaaggc   6960

cgcccctgga aaccagggca cagacgtgaa cacagcatat catggacaat gggaggagtc   7020

acaactatca gctggtgcaa cccctcatgc tctccgatca aggcagagcc aagacaatac   7080

ccttgtatct gcggatcatg tccagccacc tgtagacttt gtgcaagcga tgatgtctat   7140

gatggaggcg atatcacaga gagtaagtaa ggttgactat cagctagatc ttgtcttgaa   7200

acagacatcc tccatcccta tgatgcggtc cgaaatccaa cagctgaaaa catctgttgc   7260

agtcatggaa gccaacttgg gaatgatgaa gattctggat cccggttgtg ccaacatttc   7320

atctctgagt gatctacggg cagttgcccg atctcacccg gttttagttt caggccctgg   7380

agacccctct ccctatgtga cacaaggagg cgaaatggca cttaataaac tttcgcaacc   7440

agtgccacat ccatctgaat tgattaaacc cgccactgca tgcgggcctg atataggagt   7500

ggaaaaggac actgtccgtg cattgatcat gtcacgccca atgcacccga gttcttcagc   7560

caagctccta agcaagttag atgcagccgg gtcgatcgag gaaatcagga aaatcaagcg   7620

ccttgctcta aatggctaat tactactgcc acacgcagcg ggtccctgtc cactcggcat   7680

cacacggaat ctgcaccgag ttcccccccg cagacccaag gtccaactct gtttaaacgt   7740

ttaaacttag aaaaaatacg ggtagaagcg ccaccatgag ttatacaact tatttcttag   7800

cttttcagct ttgcgtgact ttgtgttttt ctggctctta ctgccaggcg ccctttttta   7860

aagaaataac gatcctaaag gactatttta atgcaagtac ctcagatgta cctaatggtg   7920

gacctctttt cttagaaatt ttgaagaatt ggaaagagga gagtgacaaa aaaataattc   7980

agagccaaat tgtctccttc tacttcaaat tctttgaaat cttcaaagat aaccaggcca   8040

ttcaaaggag catggatgtg atcaagcaag acatgtttca gaggttccta aatggtagct   8100

ctgggaaact gaatgacttc gaaaagctga ttaaaattcc ggtagataat ctgcagatcc   8160

agcgcaaagc catcagtgaa ctcatcaaag tgatgaatga tctgtcacca agatctaacc   8220

taagaaagcg gaagagaagt cagactatgt tccaaggcca gagagcatca aaataagttt   8280

aaacccaagc ggcaatcctc tctcgcttcc tcagccccac tgaatggacg cgtaaccgta   8340

attaatctag ctacatttaa gattaagaaa aaatacgggt agaattggag tgccccaatt   8400

gtgccaagat ggactcatct aggacaattg ggctgtactt tgattctgcc cattcttcta   8460

gcaacctgtt agcatttccg atcgtcctac aaggcacagg agatgggaag aagcaaatcg   8520

ccccgcaata taggatccag cgccttgact tgtggactga tagtaaggag gactcagtat   8580

tcatcaccac ctatggattc atctttcaag ttgggaatga agaagccact gtcggcatga   8640

tcgatgataa acccaagcgc gagttacttt ccgctgcgat gctctgccta ggaagcgtcc   8700

caaataccgg agaccttatt gagctggcaa gggcctgtct cactatgata gtcacatgca   8760

agaagagtgc aactaatact gagagaatgg ttttctcagt agtgcaggca ccccaagtgc   8820

tgcaaagctg tagggttgtg gcaaacaaat actcatcagt gaatgcagtc aagcacgtga   8880

aagcgccaga gaagattccc gggagtggaa ccctagaata taaggtgaac tttgtctcct   8940

tgactgtggt accgaagaag gatgtctaca agatcccagc tgcagtattg aaggtttctg   9000

gctcgagtct gtacaatctt gcgctcaatg tcactattaa tgtggaggtt gacccgagga   9060

gtcctttggt taaatctctg tctaagtctg acagcggata ctatgctaac ctcttcttgc   9120

atattggact tatgaccacc gtagatagga aggggaagaa agtgacattt gacaagctgg   9180

aaaagaaaat aaggagcctt gatctatctg tcgggctcag tgatgtgctc gggccttccg   9240

tgttggtaaa agcaagaggt gcacggacta agcttttggc acctttcttc tctagcagtg   9300

ggacagcctg ctatcccata gcaaatgctt ctcctcaggt ggccaagata ctctggagtc   9360

aaaccgcgtg cctgcggagc gttaaaatca ttatccaagc aggtacccaa cgcgctgtcg   9420

cagtgaccgc cgaccacgag gttacctcta ctaagctgga gaaggggcac acccttgcca   9480

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cgctggtact gagttgcatc tgtccggcaa actccattga tggcaggcct cttgcagctg   9780

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caatcatagt taagctcctc ccgaatctgc ccaaggataa ggaggcatgt gcgaaagccc   9900

ccttggatgc atacaacagg acattgacca ctttgctcac cccccttggt gactctatcc   9960

gtaggataca agagtctgtg actacatctg gaggggggag acaggggcgc cttataggcg  10020

ccattattgg cggtgtggct cttggggttg caactgccgc acaaataaca gcggccgcag  10080

ctctgataca agccaaacaa aatgctgcca acatcctccg acttaaagag agcattgccg  10140

caaccaatga ggctgtgcat gaggtcactg acggattatc gcaactagca gtggcagttg  10200

ggaagatgca gcagtttgtt aatgaccaac ttaataaaac agctcaggaa ttagactgca  10260

tcaaaattgc acagcaagtt ggtgtagagc tcaacctgta cctaaccgaa ttgactacag  10320

tattcggacc acaaatcact tcacctgctt taaacaagct gactattcag gcactttaca  10380

atctagctgg tggaaatatg gattacttat tgactaagtt aggtgtaggg aacaatcaac  10440

tcagctcatt aatcggtagc ggcttaatca ccggtaaccc tattctatac gactcacaga  10500

ctcaactctt gggtatacgg gtaactctac cttcagtcgg gaacctaaat aatatgcgtg  10560

ccacctactt ggaaacctta tccgtaagca caaccagggg atttgcctcg gcacttgtcc  10620

ccaaagtggt gacacaggtc ggttctgtga tagaagaact tgacacctca tactgtatag  10680

aaactgactt agatttatat tgtacaagaa tagtaacgtt ccctatgtcc cctggtattt  10740

attcctgctt gagcggcaat acgtcggcct gtatgtactc aaagaccgaa ggcgcactta  10800

ctacaccata catgactatc aaaggttcag tcatcgccaa ctgcaagatg acaacatgta  10860

gatgtgtaaa ccccccgggt atcatatcgc aaaactatgg agaagccgtg tctctaatag  10920

ataaacaatc atgcaatgtt ttatccttag gcgggataac tttaaggctc agtggggaat  10980

tcgatgtaac ttatcagaag aatatctcaa tacaagattc tcaagtaata ataacaggca  11040

atcttgatat ctcaactgag cttgggaatg tcaacaactc gatcagtaat gctttgaata  11100

agttagagga aagcaacaga aaactagaca aagtcaatgt caaactgact agcacatctg  11160

ctctcattac ctatatcgtt ttgactatca tatctcttgt ttttggtata cttagcctga  11220

ttctagcatg ctacctaatg tacaagcaaa aggcgcaaca aaagacctta ttatggcttg  11280

ggaataatac tctagaccag atgagagcca ctacaaaaat gtgaacacag atgaggaacg  11340

aaggtttccc taatagtaat ttgtgtgaaa gttctggtag tctgtcagtt cagagggtta  11400

agaaaaaact accggttgta gatgaccaaa ggacgatata cgggtagaac ggtaagagag  11460

gccgcccctc aattgcgagc caggcttcac aacctccgtt ctaccgcttc accgacaacg  11520

gtcctcaatc atggaccgcg ccgttagcca agttgcgtta gagaatgatg aaagagaggc  11580

aaaaaataca tggcgcttga tattccggat tgcaatctta ttcttaacag tagtgacctt  11640

ggctatatct gtagcctccc ttttatatag catgggggct agcacaccta gcgatcttgt  11700

aggcataccg actaggaatt ccagggcaga agaaaagatt acatctacac ttggttccaa  11760

tcaagatgta gtagatagga tatataagca agtggccctt gagtctccgt tggcattgtt  11820

aaaaactgag accacaatta tgaacgcaat aacatctctc tcttatcaga ttaatggagc  11880

tgcaaacaac agtgggtggg gggcacttat ccatgaccca gattatatag gggggatagg  11940

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agaacatctg aattttatcc cggcgcctac tacaggatca ggttgcactc gaataccctc  12060

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agatcactca cattcatatc agtatttagc acttggtgtg ctccggacat ctgcaacagg  12180

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catgggggcc gaaggcagaa ttctcacagt agggacatct catttcttgt atcaacgagg  12780

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cacttaaaca gtgcacgaga cagatcctag aggttacaat actaggtctt agagtcgaaa  19860

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gtgctcaaca aaaattctac atgaaaacta taggcaatgc agtcaacgga tattacagta  20100

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tgttgattta atcatattat gttagaaaaa agttgaaccc tgactcctta ggactcgaat  20220

tcgaactcaa ataaatgtct taaaaaaagg ttgcgcacaa ttattcttga gtgtagtctc  20280

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tatatccgga tcgagacctc gatactagtg cggtggagct gaattc                 20566

<210>10

<211>20020

<212>DNA

<213>人工

<400>10

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gactccccgt cgtgtagata actacgatac gggagggctt accatctggc cccagtgctg   3420

caatgatacc gcgagaccca cgctcaccgg ctccagattt atcagcaata aaccagccag   3480

ccggaagggc cgagcgcaga agtggtcctg caactttatc cgcctccatc cagtctatta   3540

attgttgccg ggaagctaga gtaagtagtt cgccagttaa tagtttgcgc aacgttgttg   3600

ccattgctgc aggcatcgtg gtgtcacgct cgtcgtttgg tatggcttca ttcagctccg   3660

gttcccaacg atcaaggcga gttacatgat cccccatgtt gtgcaaaaaa gcggttagct   3720

ccttcggtcc tccgatcgtt gtcagaagta agttggccgc agtgttatca ctcatggtta   3780

tggcagcact gcataattct cttactgtca tgccatccgt aagatgcttt tctgtgactg   3840

gtgagtactc aaccaagtca ttctgagaat agtgtatgcg gcgaccgagt tgctcttgcc   3900

cggcgtcaac acgggataat accgcgccac atagcagaac tttaaaagtg ctcatcattg   3960

gaaaacgttc ttcggggcga aaactctcaa ggatcttacc gctgttgaga tccagttcga   4020

tgtaacccac tcgtgcaccc aactgatctt cagcatcttt tactttcacc agcgtttctg   4080

ggtgagcaaa aacaggaagg caaaatgccg caaaaaaggg aataagggcg acacggaaat   4140

gttgaatact catactcttc ctttttcaat attattgaag catttatcag ggttattgtc   4200

tcatgagcgg atacatattt gaatgtattt agaaaaataa acaaataggg gttccgcgca   4260

catttccccg aaaagtgcca cctgacgtct aagaaaccat tattatcatg acattaacct   4320

ataaaaatag gcgtatcacg aggccctttc gtcttcaaga attctaggcg gctatatgcg   4380

ttggatgcaa tttctatgcg cacccgttct cggagcactg tccgaccgct ttggccgccg   4440

cccagtcctg ctcgcttcgc tacttggagc cactatcgag ctacgcgatc atggcgacca   4500

cacccgtcct gtggatcccc cgaagtctag aactagtgga tccccctgat acgactcact   4560

ataggaccaa acagagaatc cgtgagttac gataaaaggc gaaggagcaa ttgaagtcgc   4620

acgggtagaa ggtgtgactc tcgagtgcga gcccgaagca caaactcgag aaagccttct   4680

gccaacatgt cttccgtatt tgatgagtac gaacagctcc tcgcggctca gactcgcccc   4740

aatggagctc atggaggggg agaaaaaggg agtaccttaa aagtagacgt cccggtattc   4800

actcttaaca gtgatgaccc agaagataga tggagctttg tggtattctg cctccggatt   4860

gctgttagcg aagatgccaa caaaccactc aggcaaggtg ctctcatatc tcttttatgc   4920

tcccactcac aggtaatgag gaaccatgtt gcccttgcag ggaaacagaa tgaagccaca   4980

ttggccgtgc ttgagattga tggctttgcc aacggcacgc cccagttcaa caataggagt   5040

ggagtgtctg aagagagagc acagagattt gcgatgatag caggatctct ccctcgggca   5100

tgcagcaacg gaaccccgtt cgtcacagcc ggggccgaag atgatgcacc agaagacatc   5160

accgataccc tggagaggat cctctctatc caggctcaag tatgggtcac agtagcaaaa   5220

gccatgactg cgtatgagac tgcagatgag tcggaaacaa ggcgaatcaa taagtatatg   5280

cagcaaggca gggtccaaaa gaaatacatc ctctaccccg tatgcaggag cacaatccaa   5340

ctcacgatca gacagtctct tgcagtccgc atctttttgg ttagcgagct caagagaggc   5400

cgcaacacgg caggtggtac ctctacttat tataacctgg taggggacgt agactcatac   5460

atcaggaata ccgggcttac tgcattcttc ttgacactca agtacggaat caacaccaag   5520

acatcagccc ttgcacttag tagcctctca ggcgacatcc agaagatgaa gcagctcatg   5580

cgtttgtatc ggatgaaagg agataatgcg ccgtacatga cattacttgg tgatagtgac   5640

cagatgagct ttgcgcctgc cgagtatgca caactttact cctttgccat gggtatggca   5700

tcagtcctag ataaaggtac tgggaaatac caatttgcca gggactttat gagcacatca   5760

ttctggagac ttggagtaga gtacgctcag gctcagggaa gtagcattaa cgaggatatg   5820

gctgccgagc taaagctaac cccagcagca aggaggggcc tggcagctgc tgcccaacgg   5880

gtctccgagg agaccagcag catagacatg cctactcaac aagtcggagt cctcactggg   5940

cttagcgagg gggggtccca agctctacaa ggcggatcga atagatcgca agggcaacca   6000

gaagccgggg atggggagac ccaattcctg gatctgatga gagcggtagc aaatagcatg   6060

agggaggcgc caaactctgc acagggcact ccccaatcgg ggcctccccc aactcctggg   6120

ccatcccaag ataacgacac cgactggggg tattgataaa caaaacccag cctgcttcca   6180

caaaaacatc ccaatgccct cacccgtagt cgacccctcg atttgcggct ctatatgacc   6240

acaccctcaa acaaacatcc ccctctttcc tccctccccc tgctgtacaa ctccgcacgc   6300

cctagatacc acaggcacaa tgcggctcac taacaatcaa aacagagccg agggaattag   6360

aaaaaagtac gggtagaaga gggatattca gagatcaggg caagtctccc gagtctctgc   6420

tctctcctct acctgataga ccaggacaaa catggccacc tttacggatg cagagatcga   6480

cgagctattt gagacaagtg gaactgtcat tgacaacata attacagccc agggtaaacc   6540

agcagagact gttggaagga gtgcaatccc acaaggcaag accaaggtgc tgagcgcagc   6600

atgggagaag catgggagca tccagccacc ggccagtcaa gacaaccccg atcgacagga   6660

cagatctgac aaacaaccat ccacacccga gcaaacgacc ccgcatgaca gcccgccggc   6720

cacatccgcc gaccagcccc ccacccaggc cacagacgaa gccgtcgaca cacagctcag   6780

gaccggagca agcaactctc tgctgttgat gcttgacaag ctcagcaata aatcgtccaa   6840

tgctaaaaag ggcccatggt cgagccccca agaggggaat caccaacgtc cgactcaaca   6900

gcaggggagt caacccagtc gcggaaacag tcaggaaaga ccgcagaacc aagtcaaggc   6960

cgcccctgga aaccagggca cagacgtgaa cacagcatat catggacaat gggaggagtc   7020

acaactatca gctggtgcaa cccctcatgc tctccgatca aggcagagcc aagacaatac   7080

ccttgtatct gcggatcatg tccagccacc tgtagacttt gtgcaagcga tgatgtctat   7140

gatggaggcg atatcacaga gagtaagtaa ggttgactat cagctagatc ttgtcttgaa   7200

acagacatcc tccatcccta tgatgcggtc cgaaatccaa cagctgaaaa catctgttgc   7260

agtcatggaa gccaacttgg gaatgatgaa gattctggat cccggttgtg ccaacatttc   7320

atctctgagt gatctacggg cagttgcccg atctcacccg gttttagttt caggccctgg   7380

agacccctct ccctatgtga cacaaggagg cgaaatggca cttaataaac tttcgcaacc   7440

agtgccacat ccatctgaat tgattaaacc cgccactgca tgcgggcctg atataggagt   7500

ggaaaaggac actgtccgtg cattgatcat gtcacgccca atgcacccga gttcttcagc   7560

caagctccta agcaagttag atgcagccgg gtcgatcgag gaaatcagga aaatcaagcg   7620

ccttgctcta aatggctaat tactactgcc acacgcagcg ggtccctgtc cactcggcat   7680

cacacggaat ctgcaccgag ttcccccccg cagacccaag gtccaactct gtttaaaccc   7740

aagcggcaat cctctctcgc ttcctcagcc ccactgaatg gacgcgtaac cgtaattaat   7800

ctagctacat ttaagattaa gaaaaaatac gggtagaatt ggagtgcccc aattgtgcca   7860

agatggactc atctaggaca attgggctgt actttgattc tgcccattct tctagcaacc   7920

tgttagcatt tccgatcgtc ctacaaggca caggagatgg gaagaagcaa atcgccccgc   7980

aatataggat ccagcgcctt gacttgtgga ctgatagtaa ggaggactca gtattcatca   8040

ccacctatgg attcatcttt caagttggga atgaagaagc cactgtcggc atgatcgatg   8100

ataaacccaa gcgcgagtta ctttccgctg cgatgctctg cctaggaagc gtcccaaata   8160

ccggagacct tattgagctg gcaagggcct gtctcactat gatagtcaca tgcaagaaga   8220

gtgcaactaa tactgagaga atggttttct cagtagtgca ggcaccccaa gtgctgcaaa   8280

gctgtagggt tgtggcaaac aaatactcat cagtgaatgc agtcaagcac gtgaaagcgc   8340

cagagaagat tcccgggagt ggaaccctag aatataaggt gaactttgtc tccttgactg   8400

tggtaccgaa gaaggatgtc tacaagatcc cagctgcagt attgaaggtt tctggctcga   8460

gtctgtacaa tcttgcgctc aatgtcacta ttaatgtgga ggttgacccg aggagtcctt   8520

tggttaaatc tctgtctaag tctgacagcg gatactatgc taacctcttc ttgcatattg   8580

gacttatgac caccgtagat aggaagggga agaaagtgac atttgacaag ctggaaaaga   8640

aaataaggag ccttgatcta tctgtcgggc tcagtgatgt gctcgggcct tccgtgttgg   8700

taaaagcaag aggtgcacgg actaagcttt tggcaccttt cttctctagc agtgggacag   8760

cctgctatcc catagcaaat gcttctcctc aggtggccaa gatactctgg agtcaaaccg   8820

cgtgcctgcg gagcgttaaa atcattatcc aagcaggtac ccaacgcgct gtcgcagtga   8880

ccgccgacca cgaggttacc tctactaagc tggagaaggg gcacaccctt gccaaataca   8940

atccttttaa gaaataagct gcgtctctga gattgcgctc cgcccactca cccagatcat   9000

catgacacaa aaaactaatc tgtcttgatt atttacagtt agtttacctg cctatcaagt   9060

tagaaaaaac acgggtagaa gattctggat cccggttggc gccctccagg tgcaagatgg   9120

gctccagacc ttctaccaag aacccagcac ctatgatgct gactatccgg gttgcgctgg   9180

tactgagttg catctgtccg gcaaactcca ttgatggcag gcctcttgca gctgcaggaa   9240

ttgtggttac aggagacaaa gccgtcaaca tatacacctc atcccagaca ggatcaatca   9300

tagttaagct cctcccgaat ctgcccaagg ataaggaggc atgtgcgaaa gcccccttgg   9360

atgcatacaa caggacattg accactttgc tcacccccct tggtgactct atccgtagga   9420

tacaagagtc tgtgactaca tctggagggg ggagacaggg gcgccttata ggcgccatta   9480

ttggcggtgt ggctcttggg gttgcaactg ccgcacaaat aacagcggcc gcagctctga   9540

tacaagccaa acaaaatgct gccaacatcc tccgacttaa agagagcatt gccgcaacca   9600

atgaggctgt gcatgaggtc actgacggat tatcgcaact agcagtggca gttgggaaga   9660

tgcagcagtt tgttaatgac caacttaata aaacagctca ggaattagac tgcatcaaaa   9720

ttgcacagca agttggtgta gagctcaacc tgtacctaac cgaattgact acagtattcg   9780

gaccacaaat cacttcacct gctttaaaca agctgactat tcaggcactt tacaatctag   9840

ctggtggaaa tatggattac ttattgacta agttaggtgt agggaacaat caactcagct   9900

cattaatcgg tagcggctta atcaccggta accctattct atacgactca cagactcaac   9960

tcttgggtat acgggtaact ctaccttcag tcgggaacct aaataatatg cgtgccacct  10020

acttggaaac cttatccgta agcacaacca ggggatttgc ctcggcactt gtccccaaag  10080

tggtgacaca ggtcggttct gtgatagaag aacttgacac ctcatactgt atagaaactg  10140

acttagattt atattgtaca agaatagtaa cgttccctat gtcccctggt atttattcct  10200

gcttgagcgg caatacgtcg gcctgtatgt actcaaagac cgaaggcgca cttactacac  10260

catacatgac tatcaaaggt tcagtcatcg ccaactgcaa gatgacaaca tgtagatgtg  10320

taaacccccc gggtatcata tcgcaaaact atggagaagc cgtgtctcta atagataaac  10380

aatcatgcaa tgttttatcc ttaggcggga taactttaag gctcagtggg gaattcgatg  10440

taacttatca gaagaatatc tcaatacaag attctcaagt aataataaca ggcaatcttg  10500

atatctcaac tgagcttggg aatgtcaaca actcgatcag taatgctttg aataagttag  10560

aggaaagcaa cagaaaacta gacaaagtca atgtcaaact gactagcaca tctgctctca  10620

ttacctatat cgttttgact atcatatctc ttgtttttgg tatacttagc ctgattctag  10680

catgctacct aatgtacaag caaaaggcgc aacaaaagac cttattatgg cttgggaata  10740

atactctaga ccagatgaga gccactacaa aaatgtgaac acagatgagg aacgaaggtt  10800

tccctaatag taatttgtgt gaaagttctg gtagtctgtc agttcagagg gttaagaaaa  10860

aactaccggt tgtagatgac caaaggacga tatacgggta gaacggtaag agaggccgcc  10920

cctcaattgc gagccaggct tcacaacctc cgttctaccg cttcaccgac aacggtcctc  10980

aatcatggac cgcgccgtta gccaagttgc gttagagaat gatgaaagag aggcaaaaaa  11040

tacatggcgc ttgatattcc ggattgcaat cttattctta acagtagtga ccttggctat  11100

atctgtagcc tcccttttat atagcatggg ggctagcaca cctagcgatc ttgtaggcat  11160

accgactagg aattccaggg cagaagaaaa gattacatct acacttggtt ccaatcaaga  11220

tgtagtagat aggatatata agcaagtggc ccttgagtct ccgttggcat tgttaaaaac  11280

tgagaccaca attatgaacg caataacatc tctctcttat cagattaatg gagctgcaaa  11340

caacagtggg tggggggcac ttatccatga cccagattat atagggggga taggcaaaga  11400

actcattgta gatgatgcta gtgatgtcac atcattctat ccctctgcat ttcaagaaca  11460

tctgaatttt atcccggcgc ctactacagg atcaggttgc actcgaatac cctcatttga  11520

catgagtgct acccattact gctacaccca taatgtaata ttgtctggat gcagagatca  11580

ctcacattca tatcagtatt tagcacttgg tgtgctccgg acatctgcaa cagggagggt  11640

attcttttct actctgcgtt ccatcaacct ggacgacacc caaaatcgga agtcttgcag  11700

tgtgagtgca actcccctgg gttgtgatat gctgtgctcg aaagtcacgg agacagagga  11760

agaagattat aactcagctg tccctacgcg gatggtacat gggaggttag ggttcgacgg  11820

ccagtaccac gaaaaggacc tagatgtcac aacattattc ggggactggg tggccaacta  11880

cccaggagta gggggtggat cttttattga cagccgcgta tggttctcag tctacggagg  11940

gttaaaaccc aattcaccca gtgacactgt acaggaaggg aaatatgtga tatacaagcg  12000

atacaatgac acatgcccag atgagcaaga ctaccagatt cgaatggcca ggtcttcgta  12060

taagcctgga cggtttggtg ggaaacgcat acagcaggct atcttatcta tcaaggtgtc  12120

aacatcctta ggcgaagacc cggtactgac tgtaccgccc aacacagtca cactcatggg  12180

ggccgaaggc agaattctca cagtagggac atctcatttc ttgtatcaac gagggtcatc  12240

atacttctct cccgcgttat tatatcctat gacagtcagc aacaaaacag ccactcttca  12300

tagtccttat acattcaatg ccttcactcg gccaggtagt atcccttgcc aggcttcagc  12360

aagatgcccc aacccgtgtg ttactggagt ctatacagat ccacatcccc taatcttcta  12420

tagaaaccac accttgcgag gggtattcgg gacaatgctt gatggtgtac aagcaagact  12480

taaccctgcg tctgcagtat tcgatagcac atcccgcagt cgcattactc gagtgagttc  12540

aagcagtacc aaagcagcat acacaacatc aacttgtttt aaagtggtca agactaataa  12600

gacctattgt ctcagcattg ctgaaatatc taatactctc ttcggagaat tcagaatcgt  12660

cccgttacta gttgagatcc tcaaagatga cggggttaga gaagccaggt ctggctagtt  12720

gagtcaatta taaaggagtt ggaaagatgg cattgtatca cctatcttct gcgacatcaa  12780

gaatcaaacc gaatgccggc gcgtgctcga attccatgtt gccagttgac cacaatcagc  12840

cagtgctcat gcgatcagat taagccttgt caatagtctc ttgattaaga aaaaatgtaa  12900

gtggcaatga gatacaaggc aaaacagctc atggtaaata atacgggtag aacatggcga  12960

gctccggtcc tgaaagggca gagcatcaga ttatcctacc agagtcacac ctgtcttcac  13020

cattggtcaa gcacaaacta ctctattact ggaaattaac tgggctaccg cttcctgatg  13080

aatgtgactt cgaccacctc attctcagcc gacaatggaa aaaaatactt gaatcggcct  13140

ctcctgatac tgagagaatg ataaaactcg gaagggcagt acaccaaact cttaaccaca  13200

attccagaat aaccggagtg ctccacccca ggtgtttaga agaactggct aatattgagg  13260

tcccagattc aaccaacaaa tttcggaaga ttgagaagaa gatccaaatt cacaacacga  13320

gatatggaga actgttcaca aggctgtgta cgcatataga gaagaaactg ctggggtcat  13380

cttggtctaa caatgtcccc cggtcagagg agttcagcag catccgtacg gacccggcat  13440

tctggtttca ctcaaaatgg tccacagcca agtttgcatg gctccatata aaacagatcc  13500

agaggcatct gatggtggca gctaggacaa ggtctgcggc caacaaattg gtgatgctaa  13560

cccataaggt aggccaagtc tttgtcactc ctgaacttgt cgttgtgacg catacgaatg  13620

agaacaagtt cacatgtctt acccaggaac ttgtattgat gtatgcagat atgatggagg  13680

gcagagatat ggtcaacata atatcaacca cggcggtgca tctcagaagc ttatcagaga  13740

aaattgatga cattttgcgg ttaatagacg ctctggcaaa agacttgggt aatcaagtct  13800

acgatgttgt atcactaatg gagggatttg catacggagc tgtccagcta ctcgagccgt  13860

caggtacatt tgcaggagat ttcttcgcat tcaacctgca ggagcttaaa gacattctaa  13920

ttggcctcct ccccaatgat atagcagaat ccgtgactca tgcaatcgct actgtattct  13980

ctggtttaga acagaatcaa gcagctgaga tgttgtgtct gttgcgtctg tggggtcacc  14040

cactgcttga gtcccgtatt gccgcaaagg cagtcaggag ccaaatgtgc gcaccgaaaa  14100

tggtagactt tgatatgatc cttcaggtac tgtctttctt caagggaaca atcatcaacg  14160

ggtacagaaa gaagaatgca ggtgtgtggc cgcgagtcaa agtggataca atatatggga  14220

aggtcattgg gcaactacat gcagattcag cagagatttc acacgatatc atgttgagag  14280

agtataagag tttatctgca cttgaatttg agccatgtat agaatatgac cctgtcacca  14340

acctgagcat gttcctaaaa gacaaggcaa tcgcacaccc caacgataat tggcttgcct  14400

cgtttaggcg gaaccttctc tccgaagacc agaagaaaca tgtaaaagaa gcaacttcga  14460

ctaatcgcct cttgatagag tttttagagt caaatgattt tgatccatat aaagagatgg  14520

aatatctgac gacccttgag taccttagag atgacaatgt ggcagtatca tactcgctca  14580

aggagaagga agtgaaagtt aatggacgga tcttcgctaa gctgacaaag aagttaagga  14640

actgtcaggt gatggcggaa gggatcctag ccgatcagat tgcacctttc tttcagggaa  14700

atggagtcat tcaggatagc atatccttga ccaagagtat gctagcgatg agtcaactgt  14760

cttttaacag caataagaaa cgtatcactg actgtaaaga aagagtatct tcaaaccgca  14820

atcatgatcc gaaaagcaag aaccgtcgga gagttgcaac cttcataaca actgacctgc  14880

aaaagtactg tcttaattgg agatatcaga caatcaaatt gttcgctcat gccatcaatc  14940

agttgatggg cctacctcac ttcttcgaat ggattcacct aagactgatg gacactacga  15000

tgttcgtagg agaccctttc aatcctccaa gtgaccctac tgactgtgac ctctcaagag  15060

tccctaatga tgacatatat attgtcagtg ccagaggggg tatcgaagga ttatgccaga  15120

agctatggac aatgatctca attgctgcaa tccaacttgc tgcagctaga tcgcattgtc  15180

gtgttgcctg tatggtacag ggtgataatc aagtaatagc agtaacgaga gaggtaagat  15240

cagacgactc tccggagatg gtgttgacac agttgcatca agccagtgat aatttcttca  15300

aggaattaat tcatgtcaat catttgattg gccataattt gaaggatcgt gaaaccatca  15360

ggtcagacac attcttcata tacagcaaac gaatcttcaa agatggagca atcctcagtc  15420

aagtcctcaa aaattcatct aaattagtgc tagtgtcagg tgatctcagt gaaaacaccg  15480

taatgtcctg tgccaacatt gcctctactg tagcacggct atgcgagaac gggcttccca  15540

aagacttctg ttactattta aactatataa tgagttgtgt gcagacatac tttgactctg  15600

agttctccat caccaacaat tcgcaccccg atcttaatca gtcgtggatt gaggacatct  15660

cttttgtgca ctcatatgtt ctgactcctg cccaattagg gggactgagt aaccttcaat  15720

actcaaggct ctacactaga aatatcggtg acccggggac tactgctttt gcagagatcc  15780

agcgactaga agcagtggga ttactgagtc ctaacattat gactaatatc ttaactaggc  15840

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accccttggg gcctctaaac gggtcttgag gggttttttg ctgaaaggag gaactatatc  19980

cggatcgaga cctcgatact agtgcggtgg agctgaattc                        20020

Claims (15)

1.一种表达编码猪干扰素的基因的重组新城疫弱毒疫苗株。

2.根据权利要求1的重组新城疫弱毒疫苗株，其为重组新城疫LaSota弱毒疫苗株。

3.根据权利要求1或2的重组新城疫弱毒疫苗株，其中所述猪干扰素是猪α、β和γ-干扰素，优选所述猪α、β和γ-干扰素的氨基酸序列分别如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示，更优选编码所述猪α、β和γ-干扰素的基因如SEQ ID No.4、SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示。

4.根据权利要求1或2的重组新城疫弱毒疫苗株，其为rL-Swine α、rL-Swine β、或rL-Swineγ。

5.根据权利要求1-4中任何一项的重组新城疫弱毒疫苗株在制备猪干扰素中的应用。

6.一种生产权利要求1-4中任何一项的重组新城疫弱毒疫苗株的方法，该方法包括：

(1)构建转录质粒，该转录质粒包括其中插入编码猪干扰素的基因的所述新城疫弱毒疫苗株的基因组cDNA序列；

(2)构建一个或多个转录辅助质粒，该转录辅助质粒包括编码所述新城疫弱毒疫苗株的核蛋白(NP)的cDNA序列、编码所述新城疫弱毒疫苗株的磷酸蛋白(P)的cDNA序列、和编码所述新城疫弱毒疫苗株的大聚合酶蛋白(L)的cDNA序列；

(3)将所述转录质粒和转录辅助质粒共转染所述新城疫弱毒疫苗株复制许可的宿主细胞，培养转染后的宿主细胞；

(4)收获上清液，过滤后继续敏感细胞传代或接种鸡胚尿囊腔救获重组病毒株。

7.根据权利要求6的方法，其中所述重组新城疫弱毒疫苗株是重组新城疫LaSota弱毒疫苗株。

8.根据权利要求6或7的方法，其中所述转录质粒是pBRN-FL-SwIFNα、pBRN-FL-SwIFNβ、或pBRN-FL-SwIFNγ。

9.根据权利要求6或7的方法，其中所述转录辅助质粒是质粒pBSNP、pBSP或pBSL。

10.根据权利要求6-9中任何一项的方法，其中所述宿主细胞是BHK-21。

11.根据权利要求6-10中任何一项的方法制备的重组新城疫弱毒疫苗株，优选为rL-Swine α、rL-Swine β、或rL-Swine γ。

12.一种生产猪干扰素的方法，该方法包括：

1)将根据权利要求1-4中任何一项的重组新城疫弱毒疫苗株接种敏感细胞或接种鸡胚尿囊腔；

2)收获细胞上清液或鸡胚尿囊液。

13.重组新城疫LaSota弱毒疫苗株rL-Swine α的SPF鸡胚尿囊液，其保藏号为CGMCC No.2615。

14.重组新城疫LaSota弱毒疫苗株rL-Swine β的SPF鸡胚尿囊液，其保藏号为CGMCC No.2628。

15.重组新城疫LaSota弱毒疫苗株rL-Swine γ的SPF鸡胚尿囊液，其保藏号为CGMCC No.2616。

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