CN109251897A

CN109251897A - 一种猪圆环病毒3型毒株及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN109251897A
Application number: CN201811031496.3A
Authority: CN
Inventors: 刘爵; 姜海军; 王丹; 韦莉; 王菁; 朱珊珊; 全荣; 侯磊; 褚军; 李子璇; 郭雨欣; 奚衍洋; 宋慧琦; 袁枫
Original assignee: Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Current assignee: Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Priority date: 2018-09-05
Filing date: 2018-09-05
Publication date: 2019-01-22

Abstract

本发明提供了一种猪圆环病毒3型毒株PCV3‑LY及其应用。该病毒是国内外首次通过感染性克隆技术拯救出的猪圆环病毒3型,接种贴壁生长的单层猪肾细胞PK15细胞培养后，进行D‑氨基葡萄糖处理而后继续培养，收获细胞培养物作为下一轮传代的接种物，依次连续传代获得一株细胞培养适应毒株。在适应过程中，传至15代后可以观察到明显的细胞病变。经过间接免疫荧光证实该细胞能够支持猪圆环病毒3型的有效复制。病毒的滴度lgTCID₅₀＝10^6.53/mL。动物回归试验发现5头28日龄猪攻毒后可以致死两头，该病毒对仔猪致病力较强。这是国内外首次通过感染性克隆技术拯救出的猪圆环病毒3型，为进一步研究PCV3的致病机制以及开展有效防控该病的疫苗研究提供直接支持。

Description

一种猪圆环病毒3型毒株及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种猪圆环病毒3型毒株、其制备方法及应用。

背景技术

猪圆环病毒(Porcine circovirus，PCV)属于圆环病毒科(Circoviridae)圆环病毒属(Circovirus)成员。猪圆环病毒颗粒为二十面体对称、无囊膜包裹的、单股环状DNA病毒。在电镜下，猪圆环病毒是一种无囊膜的呈二十面体对称的圆形小颗粒病毒，直径17nm，具有单股环状的DNA基因组。猪圆环病毒对氯仿、碘酒、酒精等有机溶剂不敏感，可在70℃稳定存活15分钟，但对苯酚、季胺类化合物、氢氧化钠和氧化剂等试剂较敏感。2016年前根据致病性、抗原性和核酸序列的差异，将PCV分为PCV1和PCV2。PCV1于1974年由德国学者Tischer等首次从污染的猪肾传代细胞系PK15分离获得，通过人工感染猪试验证实，该病毒没有引起显著临床症状和病理变。

PCV2于1998年首次报道，发现其是断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的主要病原。PMWS在临床上以断奶仔猪呼吸急促、腹泻、贫血、间质性肺炎和进行性消瘦以及明显的淋巴结病变为主要特征。1997年在加拿大西部发现PMWS以后，在世界上许多国家和地区都有该病的报道。该病主要发生在5～12周龄仔猪。除此之外，PCV2也能够引起猪皮炎肾病综合征(PNDS)、母猪繁殖障碍、新生仔猪腹泻病、增生性坏死性肺炎(PNP)、猪呼吸道综合征及仔猪先天性震颤等多种猪圆环相关疾病(PCVAD)。在中国，该病是由郎洪武等首次发现的。目前，我国PCV2感染的形势亦相当严峻。近年来，以PCV2为主要病原引起的猪圆环病毒病在世界范围内广泛流行，该病毒主要侵害猪的免疫系统，并能够造成机体的免疫抑制，对全世界的生猪养殖造成了重大的经济损失。

2016年，在美国北卡罗莱纳州的一个商品化猪场，猪场工作人员发现母猪死亡率增加了10.2％，受孕率降低了0.6％。猪场中一部分母猪表现厌食，皮肤呈现多灶性丘疹，斑点和表面皮炎，这些临床症状与传统的猪圆环病毒病引起的临床症状相似，但对所有母猪和胎儿组织进行免疫组化和荧光定量PCR检测都未检测到对PCV2、猪流行性腹泻病毒、高致病性蓝耳病病毒、猪瘟病毒、猪细小病毒等。随后研究人员进行病毒分离，检测到一种新型的圆环病毒3型(PCV3)。该病毒基因组长为2,000bp，其能引起猪的皮炎肾病终合症、繁殖障碍及心脏和多系统的炎症反应，但是如何能够获得活的圆环病毒3型(PCV3)，目前的分离方法还无法获得。

目前，猪圆环病毒3型(PCV3)为一种新发的猪传染病的病原菌，其能引起猪的皮炎肾病综合症、繁殖障碍及心脏和多系统的炎症反应，该病原菌对猪场疾病控制十分重要，这需要对我国PCV3感染情况进行全面的调查。由于我国新发现的猪圆环病毒3型与美国的猪圆环病毒3型有差异，所以目前尚无针对该病原的有效措施。因此，研制PCV3的诊断试剂和疫苗已成当务之急。而采用常规方法来分离PCV3病毒极易污染外源病毒。因而开展PCV3感染性分子克隆的研究对该病毒致病机理以及增殖特性相关方面的研究具有重要的意义，以期为进一步深入研究猪圆环病毒病疫苗，为深入研究PCV3与宿主相互作用的分子机制以及病毒的分子流行病学研究奠定了基础，这对该病毒的监控以及之后的控制和预防尤为重要。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供一种新的猪圆环病毒3型毒株，命名为PCV3/LY，本发明的另一个目的在于提供所述猪圆环病毒3型毒株PCV3/LY的应用。

为实现上述目的，本发明采用以下的技术方案为：

一种猪圆环病毒3型毒株，其特征在于，其含有包括如SEQ ID NO.1所示的碱基序列。

一种包含有如SEQ ID NO.1所示的碱基序列的重组质粒。

进一步地，所述重组质粒的原始载体为质粒pBluescript II SK载体，其碱基序列如SEQ ID NO.2所示。

含有如SEQ ID NO.1所示的碱基序列的重组质粒的制备方法如下：先合成如SEQID NO.1所示的碱基序列，之后用SacII内切酶进行酶切并回收纯化目的片段，将pBlueScript SK载体用SacII内切酶进行酶切，采用T4DNA连接酶将回收纯化的目的片段插入到酶切后的pBlueScript SK载体重，然后将连接产物转化到DH5感受态细胞，涂氨苄抗性板进行蓝白斑筛选。

如上所述的重组质粒适于在单层猪肾细胞PK15细胞中生长。

一种猪圆环病毒3型毒株的制备方法，其包括如下步骤：

S1、将权利要求2所述的重组质粒，转染单层猪肾细胞PK15细胞中培养，之后消化；

S2、加含有10％小牛血清的DMEM培养基培养，待细胞接近长成单层时，弃去细胞培养液；

S3、加入适量D-氨基葡萄糖溶液，作用后，弃去D-氨基葡萄糖；

S4、用适量的灭菌PBS轻轻洗细胞3次，然后再加入含2％血清的DMEM维持液继续培养96小时，即获得猪圆环病毒3型毒株。

如上所述的制备方法，优选地，在步骤S1中，培养时间为72小时，在步骤S2中，培养时间为18-24小时。

如上所述的制备方法，优选地，在步骤S3中，所述D-氨基葡萄糖溶液为含300mmol/L的D-氨基葡萄糖的DMEM培养液，用量以能完全覆盖PK15细胞单层为准。

如上所述的制备方法，优选地，在步骤S3中，所述加入D-氨基葡萄糖溶液后，在37℃作用30min。

如上所述的猪圆环病毒3型毒株或制备方法获得的猪圆环病毒3型毒株在制备防治猪圆环3型病毒感染引起的疾病的疫苗中的应用。

如上所述的猪圆环病毒3型毒株或制备方法获得的猪圆环病毒3型毒株在制备疫苗生产毒种中的应用。如上所述的猪圆环病毒3型毒株或制备方法获得的猪圆环病毒3型毒株在评价猪圆环3型疫苗的有效性及保护效果中的应用。

本发明的有益效果在于：

本发明提供的一种新的猪圆环病毒3型毒株，是国内外首次通过感染性克隆技术拯救出的猪圆环病毒3型，获得的毒株更加纯净。其对仔猪致病力较强，明确其对各器官的病变症状，为进一步研究PCV3的致病机制以及开展有效防控该病的疫苗研究提供直接支持。可用于制备疫苗生产毒种、或用于制备防治猪圆环3型病毒感染引起的疾病的疫苗中的应用，还可用来评价猪圆环3型疫苗的有效性及保护效果。本发明为进一步研究PCV3病毒在猪体内的复制机理及致病机理打下基础，也为深入开展PCV3病毒的分子生物学及免疫学的研究开辟了新途径。

附图说明

图1为PCV3-LY在PK15细胞上的致细胞病变图片。

图2为为转染后的IFA检测结果(2A)和阴性对照(2B)。

图3(1)为PCR扩增的电泳图。

图3(2)为PCV3攻毒组猪临床表现的皮炎症状。

图4为实验猪生存曲线。

图5为实验猪体温变化曲线。

图6为实验猪体重变化曲线。

图7为PCV3攻毒猪剖检后猪肺脏病变。

图8为PCV3攻毒猪剖检后猪肾脏病变。

图9为PCV3攻毒猪剖检后猪肺门淋巴结病变。

图10为PCV3攻毒猪肺脏病理切片检查结果。

图11为PCV3攻毒猪肺门淋巴结病理切片检查结果。

图12为PCV3攻毒猪肾脏病理切片检查结果。

图13为PCV3攻毒猪肺脏免疫组织化学检测结果。

图14为PCV3攻毒猪肺门淋巴结免疫组织化学检测结果。

图15为PCV3攻毒猪肾脏免疫组织化学检测结果。

具体实施方式

以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的前提下，对本发明所作的修饰或者替换，均属于本发明的范畴。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。下列实施例中常规的实验方法，可参见Sambrook等编写的分子克隆书。仪器的使用参照仪器操作说明进行。

实施例1

本发明的在研究过程中，经过大量实验，最终选定如下方法制备获得具有PCV3病毒特性的克隆病毒，并通过大量不同细胞进行优化，筛选出最适于克隆病毒的有效复制的细胞，其优化筛选过程在此不在赘述，下面将说明新型PCV3病毒的制备与培养方法。

步骤一：PCV3双拷贝全基因感染性分子克隆的构建

根据本课题已提交到NCBI数据库中的PCV3全基因组PCV3/CN/Hebei-LY/2015序列(序列号为：MF318451)，由北京中美泰和生物技术有限公司通过核酸合成技术人工合成两个拷贝的PCV3/Hebei-LY全基因组，并以首尾相连的方式连接。随后将合成的双拷贝基因即如SEQ IDNO.1所示的序列，插入到pBlueScript SK载体中,其中pBlueScript SK载体的基如SEQ ID NO.2所示。合成的双拷贝基因两端分别带有SacII酶切位点(CCGCGG)和相应的保护性碱基TCC。将pBlueScript SK载体和合成的双拷贝基因分别用SacII内切酶进行酶切并回收纯化。随后将酶切的双拷贝基因通过T4DNA连接酶插入到pBlueScript SK载体中,然后将连接产物转化到DH5α感受态细胞，涂氨苄抗性板进行蓝白斑筛选，筛选白斑并提取质粒记为pBlueScript-PCV3，进行PCR检测，所用引物：上游引物SEQ ID No.3：5’-GTGCCGTAGAAGTCTGTCATT-3’；下游引物SEQ ID No.4：5’-TACACTCAGCCCTGTAATTTCT-3’，PCR扩增程序：94℃预变性2min；94℃变性30s，62℃退火20s，72℃延伸20s，35个循环数；72℃终延伸2min。扩增产物条带大小345bp为阳性。并进行菌落筛选鉴定，进一步全序列测定，最终成功构建双拷贝重组质粒pBlueScript-PCV3。本发明中选用的pBlueScript SK载体作为非组成型高拷贝质粒，能提高PCV3病毒的拯救效率。

阳性重组质粒大量提取。将已构建的双拷贝重组质粒pBlueScript-PCV3提取后测定纯度和浓度，于-20℃冰箱中保存备用，具体提取步骤如下：

1、柱平衡：向吸附柱CP6中(吸附柱放入50mL收集管中)加入2.5mL的平衡液BL，8,000rpm离心2min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

2、取100mL过夜培养的白斑进行PCR筛选，扩增条带为345bp大小的菌液为阳性菌液加入离心管，室温8,000rpm离心3min收集细菌，尽量吸除上清。

3、尽量吸除上清，为确保上清液全部吸取，请用干净的吸水纸吸去瓶壁上的水滴。

4、向留有菌体沉淀的离心管中加入8mL溶液P1(已加入RNase A)，使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。

5、向离心管中加入8mL溶液P2，立即温和地上下翻转6-8次，使菌体充分裂解，室温放置5min。

6、向离心管中加入8mL溶液P4，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，至溶液出现白色分散絮状沉淀。然后室温放置10min左右。8,000rpm离心5-10min，使白色沉淀离至管底，将全部溶液小心倒入过滤器CS1中，慢慢推动推柄过滤，滤液收集在干净的50mL的管中。

7、向滤液中加入0.3倍滤液体积的异丙醇，上下颠倒混匀后转移到吸附柱CP6中(吸附柱放入50mL收集管中)。

8、室温8,000rpm离心2min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP6重新放回收集管中。

9、向吸附柱CP6中加入10ml漂洗液PW，在8,000rpm离心2min，弃掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

10、重复操作步骤9。

11、向吸附柱CP6中加入3mL无水乙醇，室温8,000rpm离心2min，倒掉废液。

12、将吸附柱CP6重新放回收集管中，8,000rpm离心5min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。

13、将吸附柱CP6置于一个干净的50mL收集管中，向吸附膜中间部位悬空滴加1-2ml洗脱缓冲液TB，室温放置5min，然后室温8,000rpm离心2min。将50ml离心管中的洗脱液，即获得双拷贝重组质粒全部移入一个干净的1.5mL离心管，-20℃保存。

步骤二：PCV3感染性克隆在PK15细胞上转染、传代以及体外感染性鉴定。

重组质粒转染单层猪肾细胞(PK15细胞)。复苏并传代培养PK15细胞，选用进入对数生长期的无PCV1和PCV2污染的PK15细胞用0.25％胰酶按常规方法消化，以1×10⁵个细胞/mL接种6孔板，每孔3mL，放入37℃的含5％CO₂培养箱中培养，待细胞铺满约90％时，通过转染细胞的通用型脂质体3000介导转染PK15细胞，具体转染步骤如下：每孔吸取250μL Opti-MEM培养基与10μL脂质体3000充分混匀后，再吸取250μL Opti-MEM加入3μg步骤一获得的双拷贝重组质粒和3μLreagent plus；将上述两种溶液混合，室温下放置5min；与此同时，将六孔板中的细胞用Opti-MEM轻轻洗涤两遍后，每孔再加入新鲜的2mL Opti-MEM，随后将质粒/脂质体复合物逐滴加入孔中，摇动培养板，轻轻混匀，在37℃5％CO₂培养箱中培养72小时，同时设平行转染空载体pBlueScript SK作为阴性对照。

在PK15细胞上的传代。将按步骤一种构建好的双拷贝重组质粒转染贴壁生长的单层猪肾细胞PK15细胞72小时后用0.25％胰酶按常规方法消化，然后加入含有10％小牛血清的DMEM培养基，培养18-24小时后，待细胞接近长成单层时，弃去细胞培养液，加入适量含300mmol/L的D-氨基葡萄糖的DMEM培养液(以能完全覆盖细胞单层为准)，37℃作用30min；弃去D-氨基葡萄糖，用适量的灭菌PBS轻轻洗细胞3次，然后再加入含2％血清的DMEM维持液继续培养96小时。按照此方法继续盲传15代直至有明显的细胞病变出现(如图1所示，其中图1A为正常图，图1B为病变图)。同时设立转染空载体pBlueScript SK的细胞作为阴性对照，均用D-氨基葡萄糖处理30min后放入37℃5％CO₂培养箱中继续培养。

在PK15细胞上的感染性鉴定。应用间接免疫荧光(IFA)的方法对病毒在PK15细胞上能否稳定增殖进行检测，具体操作步骤如下：将收获的盲传15代后有病变的病毒液按10％的比例同步接种于消化好的PK15细胞悬液，再接种于8孔细胞Nun Lab-Tek^TMIIChamber Slide^TM腔室载玻片中，1mL/孔，放置入37℃5％CO₂培养箱中继续培养48小时，甩弃腔室内液体，用PBS洗涤三遍，倒扣拍干腔室内液体后再进行下面步骤：用4％多聚甲醛固定30min，PBS洗涤2次，晾干。用0.2％Tritonx-100/PBS处理接毒细胞，37℃10min，PBS洗涤2次，晾干。每孔加正常兔血清封闭液4℃封闭过夜。孵育一抗：用抗体稀释液将抗PCV3阳性血清按1:50的比例稀释，充分混匀后每孔加入100μL，37℃孵育1h后弃掉一抗，PBS洗涤5次，每次5分钟，晾干。孵育二抗：用抗体稀释液将兔抗猪IgG-FITC(l:1,00)的比例稀释，充分混匀后每孔加入100μL，包裹上锡箔纸避光，37℃避光孵育1h弃掉二抗，PBS洗涤5次，每次5分钟，晾干。封片：每孔加入甘油100μL，倒置荧光显微镜下观察，结果如图2A、2B，其中，图2A是转染后的IFA检测结果，图2B阴性对照，结果说明，经过间接免疫荧光证实该细胞能够支持猪圆环病毒3型的有效复制。

步骤三：拯救毒株各代次盲传病毒液PCR检测

收获每一代病毒液保存于-20℃，抽取部分代次病毒液提取DNA进行PCR检测，PCR所用的引物、扩增条件与步骤一中的相同，检测结果如图3(1)所示，其中各条带为1:15代；2:16代；3:17代，M：marker。

1为。结果表明：拯救的PCV3病毒(第15、16、17代次的PCV3-LY病毒)在本研究使用的PK15细胞上具有良好的适应性。

步骤四：拯救毒株毒价的测定

抽取步骤二中盲传收获的病毒液部分代次F15做间接免疫荧光实验，计算阳性细胞孔数，用Reed-Muench法计算半数细胞培养感染量进行检测：将长成单层的PK15细胞用0.25％的胰酶按照常规方法进行消化，分装到96孔细胞培养板，用维持液将待测病毒液以10倍倍比稀释后同步接种PK15细胞中，每个稀释度接种8孔细胞，每孔100μL，并留两列PK15细胞做空白对照，37℃5％CO₂培养箱中继续培养24h。弃去96孔细胞培养板内的液体，用DMEM细胞培养液轻轻洗涤细胞表面2次，加足维持液继续培养48h，每孔加入100μL 4％多聚甲醛固定30min，PBS洗涂2次，晾干。每孔加正常兔血清封闭液4℃封闭过夜。孵育一抗：用抗体稀释液将抗PCV3阳性血清按1:50的比例稀释，充分混匀后每孔加入100μL，37℃孵育1h后弃掉一抗，PBS洗涤5次，每次5分钟，晾干。孵育二抗：用抗体稀释液将兔抗猪IgG-FITC(l:100)的比例稀释，充分混匀后每孔加入100μL，包裹上锡箔纸避光，37℃避光孵育1h弃掉二抗，PBS洗涤5次，每次5分钟，晾干。封片：每孔加入甘油100μL，倒置荧光显微镜下观察。以出现绿色荧光者为阳性，表示病毒在此孔得到扩增；记录每列中出现绿色荧光的孔数，按Reed-Muench法计算病毒的半数感染量(TCID₅₀)。经计算得出，病毒的滴度lgTCID₅₀＝10^6.53/mL。

实施例2动物回归实验

筛选PCV1、PCV2、PRV、PRRSV、CSFV、PPV、SIV、JEV、PEDV为阴性的4周龄健康SPF仔猪10头，随机分为2组。第一组5头为阴性对照猪，第二组5头为攻毒组，每头通过鼻腔接种2毫升通过感染性克隆技术拯救出的PCV3-LY病毒液，在攻毒前后每天记录猪的体温等临床表现，肛门体温变化情况。攻毒后0、7、14、21、28天称重，记录猪只体重变化情况。攻毒后28天，存活仔猪处死并采集心、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、腹股沟淋巴结、肺门淋巴结、扁桃体，肉眼可见病变脏器组织。

结果为攻毒组猪临床表现为厌食，精神状态差，呼吸困难，气喘，皮肤呈现多灶性丘疹，斑点和表面皮炎等症状，如图3所示。攻毒组猪在分别在攻毒后16天和18天各死亡一头，生存曲线见图4。攻毒组猪只从第二天开始体温开始升高，在攻毒后16天体温达到最高，攻毒组的猪仔整个实验过程的体温都比阴性对照组高，体温变化情况见图5。攻毒组体重增重量在攻毒后7、14、21、28都小于阴性对照组，体重变化情况见图6。攻毒猪剖检后发现猪肺脏充血，出血，有实变，如图7所示；肾脏肿大，有出血点，如图8所示；肺门淋巴结出血，肿大，如图9所示。

攻毒后28天，存活仔猪处死进行剖检，采集肺脏，肝脏、脾脏，肾脏，腹股沟淋巴结，肺门淋巴结等肉眼可见病变脏器组织，进行病理切片检查及免疫组织化学检测。结果表明，PCV3攻击猪的肺脏可见整个肺组织普遍发生实变，几乎所有支气管腔及大部分肺泡均被化脓性炎性渗出物所填充，渗出物主要为嗜中性粒细胞及其坏事碎片、脱落的变性坏死的上皮细胞碎片。肺泡隔毛细血管扩张充血，血细胞凝集，肺小叶间质极度扩张，间质中充满大量蛋白渗出物，如图10所示；肺门淋巴结：皮质、髓质血管明显扩张、充血，大面积、成片出血，皮质淋巴组织成片坏死，淋巴组织中弥散“星空样”小点坏死。被膜下淋巴窦及髓质淋巴窦中大片的、密集的嗜酸性粒细胞浸润。皮质、髓质血管明显扩张、充血，如图11所示；肾脏可见皮质肾小管上皮普遍变性，并见多量蛋白管型，局部见淋巴细胞浸润。多发性、局灶性出血，局部近曲小管上皮肿胀，核固缩坏死，远曲小管上皮空泡化，如图12所示。

免疫组织化学检查组织中PCV3阳性信号，PCV3攻击猪的支气管上皮细胞表面，间质血管内容物、肺泡腔内渗出物、尘细胞、隔细胞等均呈现强阳性反应，如图13所示；肺门淋巴结：皮质和髓质的网状细胞、巨噬细胞及嗜酸性粒细胞胞浆均呈阳性反应，淋巴细胞为阴性。在坏死组织区域呈明显的阳性反应，如图14所示；肾脏中肾小球毛细血管内皮呈阴性反应，肾小管上皮细胞浆及部分细胞核呈明显的阳性反应，在坏死的上皮细胞阳性反应更强，如图15所示。由此可见，本发明方法拯救出的PCV3病毒可以很好的在仔猪体内复制对仔猪有较强的致病性。

本发明制备获得的毒株，是国内外首次通过感染性克隆技术拯救出的猪圆环病毒3型，为进一步研究PCV3的致病机制以及开展有效防控该病的疫苗研究提供直接支持。可用于在制备防治猪圆环3型病毒感染引起的疾病的疫苗中的应用、及在制备疫苗生产毒种中的应用，还可用于在评价猪圆环3型疫苗的有效性及保护效果中的应用。

序列表

<110> 北京市农林科学院

<120> 一种猪圆环病毒3型毒株及其制备方法和应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 4000

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tagtattacc cggcacctcg gaacccggat ccacggaggt ctgtagggag aaaaagtggt 60

atcccattat ggatgctccg caccgtgtga gtggatatac cgggcagtgg atgatgaagc 120

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tgcggggtga tggggttggg taaaccgcgt gattttaaaa ctgaagttta tgtttttatt 720

ggtcctccag gatgcgggaa aacgcgggaa gcttgtgcgg atgcggctgc gcgggaattg 780

cagttgtatt tcaagccacg agggccttgg tgggatggtt ataatgggga gggtgctgtt 840

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gacatggaga cagtgtatcc aataaactat tgattttatt tgcacttgtg tacaattatt 1140

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tgccgtagaa gtctgtcatt ccagtttttt ccgggacata aatgctccaa agcagtgctc 1440

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ggctttgtcc tgggtgagcg ctggtagttc ccgccagaag tggttttggg gtgaagtaac 1560

ggctgtgttt ttttttagaa gtcataactt tacgagtgga actttccgca taagggtcgt 1620

cttggagcca agtgtttgtg gtccaggcgc cgtctagatc tatggctgtg tgcccgaaca 1680

tagtttttgt ttgctgagcc ggaaaaatta cagggctgag tgtaactttc atctttagta 1740

tcttataata ttcaaagcta attgcagttt cccattcgtt taggcgggta atgaagtggt 1800

tggcgtgcca gggcttgtta ttctgagggg ttccaacgga aatgacgttc atggtggagt 1860

atttctttgt gtagtatgtg ccagctgtgg gcctcctaat gaatagtttt cttctgacat 1920

agcgccttct gtggcgtcgt cgtctccttg ggcggggtct tcttctgaat atagctctgt 1980

gtctcatttt ggtgccgggg tagtattacc cggcacctcg gaacccggat ccacggaggt 2040

ctgtagggag aaaaagtggt atcccattat ggatgctccg caccgtgtga gtggatatac 2100

cgggcagtgg atgatgaagc ggcctcgtgt tttgatgccg caggacgggg actggataac 2160

tgagtttttg tggtgctacg agtgtcctga agataaggac ttttattgtc atcctattct 2220

aggtccggag ggaaagcccg aaacacaggt ggtgttttac gataaacaac tggaccccga 2280

ccgagtggga atctattgtg gagtgtggag gcagtatagc gagatacctt attatcggca 2340

aagaggttgg aaaaagcggt accccacact tgcaagggta cgtgaatttc aagaacaaaa 2400

ggcgactcag ctcggtgaag cgcttacccg gatttggtcg ggcccatctg gagccggcga 2460

gggggagcca caaagaggcc agcgagtact gcaagaaaga gggggattac ctcgagattg 2520

gcgaagattc ctcttcgggt accagatcgg atcttcaagc agcagctcgg attctgacgg 2580

agacgtcggg aaatctgact gaagttgcgg agaagatgcc tgcagtattt atacgttatg 2640

ggcggggttt gcgtgatttt tgcggggtga tggggttggg taaaccgcgt gattttaaaa 2700

ctgaagttta tgtttttatt ggtcctccag gatgcgggaa aacgcgggaa gcttgtgcgg 2760

atgcggctgc gcgggaattg cagttgtatt tcaagccacg agggccttgg tgggatggtt 2820

ataatgggga gggtgctgtt attctggatg atttttatgg gtgggttcca tttgatgaat 2880

tgctgagaat tggggacagg taccctctga gggttcctgt taagggtggg tttgttaatt 2940

ttgtggctaa ggtattatat attactagta atgttgtacc ggaggagtgg tattcatcgg 3000

agaatattcg tggaaagttg gaggcattgt ttaggaggtt cactaaggtt gtttgttggg 3060

gggagggggg ggtaaagaaa gacatggaga cagtgtatcc aataaactat tgattttatt 3120

tgcacttgtg tacaattatt gcgttggggt gggggtattt attgggtggg tgggtgggca 3180

gccccctagc cacggcttgt cgcccccacc gaagcatgtg ggggatgggg tccccacatg 3240

cgagggcgtt tacctgtgcc cgcacccgaa gcgcagcggg agcgcgcgcg aggggacacg 3300

gcttgtcgcc accggagggg tcagatttat atttattttc agttagagaa cggacttgta 3360

acgaatccaa acttctttgg tgccgtagaa gtctgtcatt ccagtttttt ccgggacata 3420

aatgctccaa agcagtgctc cccattgaac ggtggggtca tatgtgttga gccatggggt 3480

gggtctggag aaaaagaaga ggctttgtcc tgggtgagcg ctggtagttc ccgccagaag 3540

tggttttggg gtgaagtaac ggctgtgttt ttttttagaa gtcataactt tacgagtgga 3600

actttccgca taagggtcgt cttggagcca agtgtttgtg gtccaggcgc cgtctagatc 3660

tatggctgtg tgcccgaaca tagtttttgt ttgctgagcc ggaaaaatta cagggctgag 3720

tgtaactttc atctttagta tcttataata ttcaaagcta attgcagttt cccattcgtt 3780

taggcgggta atgaagtggt tggcgtgcca gggcttgtta ttctgagggg ttccaacgga 3840

aatgacgttc atggtggagt atttctttgt gtagtatgtg ccagctgtgg gcctcctaat 3900

gaatagtttt cttctgacat agcgccttct gtggcgtcgt cgtctccttg ggcggggtct 3960

tcttctgaat atagctctgt gtctcatttt ggtgccgggg 4000

<210> 2

<211> 2961

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ctaaattgta agcgttaata ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc 60

attttttaac caataggccg aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag aatagaccga 120

gatagggttg agtgttgttc cagtttggaa caagagtcca ctattaaaga acgtggactc 180

caacgtcaaa gggcgaaaaa ccgtctatca gggcgatggc ccactacgtg aaccatcacc 240

ctaatcaagt tttttggggt cgaggtgccg taaagcacta aatcggaacc ctaaagggag 300

cccccgattt agagcttgac ggggaaagcc ggcgaacgtg gcgagaaagg aagggaagaa 360

agcgaaagga gcgggcgcta gggcgctggc aagtgtagcg gtcacgctgc gcgtaaccac 420

cacacccgcc gcgcttaatg cgccgctaca gggcgcgtcc cattcgccat tcaggctgcg 480

caactgttgg gaagggcgat cggtgcgggc ctcttcgcta ttacgccagc tggcgaaagg 540

gggatgtgct gcaaggcgat taagttgggt aacgccaggg ttttcccagt cacgacgttg 600

taaaacgacg gccagtgagc gcgcgtaata cgactcacta tagggcgaat tgggtaccgg 660

gccccccctc gaggtcgacg gtatcgataa gcttgatatc gaattcctgc agcccggggg 720

atccactagt tctagagcgg ccgccaccgc ggtggagctc cagcttttgt tccctttagt 780

gagggttaat tgcgcgcttg gcgtaatcat ggtcatagct gtttcctgtg tgaaattgtt 840

atccgctcac aattccacac aacatacgag ccggaagcat aaagtgtaaa gcctggggtg 900

cctaatgagt gagctaactc acattaattg cgttgcgctc actgcccgct ttccagtcgg 960

gaaacctgtc gtgccagctg cattaatgaa tcggccaacg cgcggggaga ggcggtttgc 1020

gtattgggcg ctcttccgct tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc 1080

ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa tcaggggata 1140

acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg 1200

cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct 1260

caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa 1320

gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc 1380

tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt 1440

aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg 1500

ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca acccggtaag acacgactta tcgccactgg 1560

cagcagccac tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct 1620

tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta gaaggacagt atttggtatc tgcgctctgc 1680

tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg 1740

ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc 1800

aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt 1860

aagggatttt ggtcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt ttaaattaaa 1920

aatgaagttt taaatcaatc taaagtatat atgagtaaac ttggtctgac agttaccaat 1980

gcttaatcag tgaggcacct atctcagcga tctgtctatt tcgttcatcc atagttgcct 2040

gactccccgt cgtgtagata actacgatac gggagggctt accatctggc cccagtgctg 2100

caatgatacc gcgagaccca cgctcaccgg ctccagattt atcagcaata aaccagccag 2160

ccggaagggc cgagcgcaga agtggtcctg caactttatc cgcctccatc cagtctatta 2220

attgttgccg ggaagctaga gtaagtagtt cgccagttaa tagtttgcgc aacgttgttg 2280

ccattgctac aggcatcgtg gtgtcacgct cgtcgtttgg tatggcttca ttcagctccg 2340

gttcccaacg atcaaggcga gttacatgat cccccatgtt gtgcaaaaaa gcggttagct 2400

ccttcggtcc tccgatcgtt gtcagaagta agttggccgc agtgttatca ctcatggtta 2460

tggcagcact gcataattct cttactgtca tgccatccgt aagatgcttt tctgtgactg 2520

gtgagtactc aaccaagtca ttctgagaat agtgtatgcg gcgaccgagt tgctcttgcc 2580

cggcgtcaat acgggataat accgcgccac atagcagaac tttaaaagtg ctcatcattg 2640

gaaaacgttc ttcggggcga aaactctcaa ggatcttacc gctgttgaga tccagttcga 2700

tgtaacccac tcgtgcaccc aactgatctt cagcatcttt tactttcacc agcgtttctg 2760

ggtgagcaaa aacaggaagg caaaatgccg caaaaaaggg aataagggcg acacggaaat 2820

gttgaatact catactcttc ctttttcaat attattgaag catttatcag ggttattgtc 2880

tcatgagcgg atacatattt gaatgtattt agaaaaataa acaaataggg gttccgcgca 2940

catttccccg aaaagtgcca c 2961

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gtgccgtaga agtctgtcat t 21

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tacactcagc cctgtaattt ct 22

Claims

1.一种猪圆环病毒3型毒株，其特征在于，其含有包括如SEQ ID NO.1所示的碱基序列。

2.一种包含有如SEQ ID NO.1所示的碱基序列的重组质粒。

3.如权利要求2所述的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒的原始载体为质粒pBluescript II SK载体，其碱基序列如SEQ ID NO.2所示。

4.如权利要求2所述的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒适于在单层猪肾细胞PK15细胞中生长。

5.一种猪圆环病毒3型毒株的制备方法，其特征在于，其包括如下步骤：

6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，在步骤S1中，培养时间为72小时，在步骤S2中，培养时间为18-24小时。

7.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，在步骤S3中，所述D-氨基葡萄糖溶液为含300m mol/L的D-氨基葡萄糖的DMEM培养液，用量以能完全覆盖PK15细胞单层为准。

8.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，在步骤S3中，所述加入D-氨基葡萄糖溶液后，在37℃作用30min。

9.如权利要求1所述的猪圆环病毒3型毒株或权利要求5-8中任一项所说的制备方法获得的猪圆环病毒3型毒株在制备防治猪圆环3型病毒感染引起的疾病的疫苗中的应用；或在制备疫苗生产毒种中的应用。

10.如权利要求1所述的猪圆环病毒3型毒株或权利要求5-8中任一项所说的制备方法获得的猪圆环病毒3型毒株在评价猪圆环3型疫苗的有效性及保护效果中的应用。