CN107557383A - 一种tymv病毒诱导的十字花科内源基因沉默方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种TYMV病毒诱导的十字花科内源基因沉默方法及其应用,以目标基因cDNA为模板进行PCR扩增，纯化连接载体，转化大肠杆菌，阳性克隆测序得到目的编码区全长CDS序列；根据测序后的结果选择序列为(T/A/G/C)TGA或(T/A/C)TAG或(T/A/C)TAA向后选择40bp序列；3’端加上其反向互补序列，两端再加入和线性化载体两端对应的同源序列长度为15bp的序列，合成双链DNA片段并与载体pTY‑s融合连接，融合连接产物转化大肠杆菌，培养提取质粒，选择幼苗第一片真叶长出时，基因枪轰击，快速转入栽培土中培养。本发明载体构建容易，转染效率高，基因沉默效果明显，性状持久。

Description

一种TYMV病毒诱导的十字花科内源基因沉默方法及其应用

技术领域

本发明属于植物生物工程技术领域，涉及芜菁黄化花叶病毒诱导的基因沉默技术及其应用。

背景技术

植物中，病毒诱导的基因沉默(Virus-induced gene silencing,VIGS)属于转录后的基因沉默(post-transcriptional gene silencing,PTGS)¹，携带靶基因cDNA片段的重组病毒感染植物后诱导靶基因沉默而出现的表型突变，具有简便、快捷、可靠等特性的研究植物基因功能工具。重组病毒载体侵染植物后，首先转录RNA，然后由内源性RNA聚合酶(RDRP)复制产生双链RNA(dsRNA)分子，是触发转录后基因沉默关键激发子。dsRNA被Dicer酶类似物识别并切割形成21-24nt的小分子干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)²。siRNAs在细胞内被依赖RNA的RNase进一步扩增并以单链形式与Argonaute(AGO)蛋白等结合形成RNA诱导的沉默复合体(RNA-induced silencing complex,RISC)，RISC利用这些单链siRNA特异地与细胞内的同源RNA互作，从而使靶mRNA降解，发生转录后水平的基因沉默^3,4。

十字花科(结球十字花科和不结球十字花科)，隶属十字花科(Cruciferae)芸薹属(Brassica)蔬菜作物，含有丰富的多种维生素和抗氧化物质，具有生长快、产量高、耐储运等优良品质。随着人们生活水平的提高，对十字花科品质要求也越来越高，利用TYMV病毒诱导的白菜内源基因沉默可用于白菜作物基因的功能分析，以揭示与产量、抗病性相关基因的分子机理，定向育种，为生产提供优良品种具有重要意义。

芜菁黄花叶病毒(Turnip yellow mosaic virus，TYMV)是一种具有正义RNA链的高等植物病毒，可侵染多种十字花科作物，并有较好的效果⁵。其基因组结构如图1所示，一个6.3kb的RNA分子，编码三个开放阅读框：一个69kDa(69K)蛋白作为病毒运动蛋白和RNA干扰抑制子、病毒蛋白复制所需的206kDa(206k)前体蛋白、以及植物病毒复制过程中产生20kDa的病毒外壳蛋白(CP蛋白)^1,6。但现有技术利用TYMV沉默基因的方法仍存在不足，如：载体构建平末端连接困难，且侵染效率低，效果差，仅在叶片观察到有沉默表型等问题。

1Pflieger,S.et al.Efficient virus-induced gene silencing inArabidopsis using a'one-step'TYMV-derived vector.The Plant journal:for celland molecular biology 56,678-690,doi:10.1111/j.1365-313X.2008.03620.x(2008).

2Llave,C.Virus-derived small interfering RNAs at the core of plant-virus interactions.Trends in plant science 15,701-707,doi:10.1016/j.tplants.2010.09.001(2010).

3Waterhouse,P.M.&Fusaro,A.F.Plant science.Viruses face a doubledefense by plant small RNAs.Science(New York,N.Y.)313,54-55,doi:10.1126/science.1130818(2006).

4Ding,S.W.&Voinnet,O.Antiviral immunity directed by small RNAs.Cell130,413-426,doi:10.1016/j.cell.2007.07.039(2007).

5Jupin,I.A protocol for VIGS in Arabidopsis thaliana using a one-stepTYMV-derived vector.Methods in molecular biology(Clifton,N.J.)975,197-210,doi:10.1007/978-1-62703-278-0_15(2013).

6Chen,J.,Li,W.X.,Xie,D.,Peng,J.R.&Ding,S.W.Viral virulence proteinsuppresses RNA silencing-mediated defense but upregulates the role ofmicrorna in host gene expression.The Plant cell 16,1302-1313,doi:10.1105/tpc.018986(2004).

发明内容

本发明提供一种针对十字花科作物高效的TYMV诱导基因沉默的方法，获得病毒诱导的十字花科内源基因功能验证体系。本发明利用TYMV衍生的载体pTY-s，通过infusion方法构建载体，载体携带靶基因特异40bp片段及其反向互补序列，利用基因枪轰击将质粒DNA接种至植物细胞内，能够有效沉默植物内源基因的表达。

本发明涉及十字花科作物中直接沉默目的基因表达的方法。提供了一种用于TYMV病毒介导的基因沉默体系，并针对以前TYMV载体构建困难，侵染效率低的问题，利用infusion酶代替传统的T4连接酶通过同源重组的方式构建载体，并以基因枪法代替原有的摩擦接种法，优化了目的基因载体构建和基因侵染的方法，并引起了不同器官的沉默效应，具体技术方案如下：

一种TYMV病毒诱导的十字花科内源基因沉默方法，包括如下步骤：

(1)以十字花科的幼叶目标基因cDNA为模板进行PCR扩增，根据NCBI数据库设计扩增引物进行PCR扩增，纯化目标基因片段，连接载体，化学法转化大肠杆菌，挑取单克隆进行菌落PCR鉴定，阳性克隆测序得到目的编码区全长CDS序列；

(2)根据测序后的结果选取40bp片段，选取原则为：5’端第2-4个碱基为TGA，TAA或TAG，且选择序列的前三个碱基避免为GTA，即选择序列为(T/A/G/C)TGA或(T/A/C)TAG或(T/A/C)TAA向后选择40bp序列；

(3)步骤(2)选取的40bp片段，3’端加上其反向互补序列，两端再加入和线性化载体两端对应的同源序列长度为15bp的序列，然后一共110bp的序列合成双链DNA片段；

(4)将步骤(3)获得的双链DNA片段与载体pTY-s融合连接，融合连接产物化学转化法转化大肠杆菌，获得阳性菌落；

(5)步骤(4)获得的阳性菌落进行培养提取质粒，并旋转蒸发使之浓度为1.5～2.5μg/μl；

(6)选择幼苗第一片真叶长出时，采用步骤(5)浓缩的质粒进行基因枪轰击，轰击后的幼苗快速转入栽培土中培养。

本发明步骤(4)所述的载体pTY-s是用TYMV病毒改良的，具体制备方式如下：在NCBI数据库搜索CAMV35s启动子和终止子序列合成并分别连接到TYMV cDNA的5’端和3’端，再克隆到pMD-18T(takara)载体上，序列如SEQ ID NO.1所示。选用本发明所述的载体pTY-s病毒症状得以减轻，对植物伤害极小，且沉默效率大大提高，并且可同时观察到多个器官沉默的表型。本发明利用TYNV病毒改良后的载体pTY-s，携带目的基因特异40bp片段及其反向互补序列的重组质粒侵染植株可以有效抑制目的基因的表达。

本发明还提供一种载体pTY-s，序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供所述载体pTY-s在生物工程中的应用，特别是在植物内源基因沉默或基因验证方法中的应用。

本发明步骤(4)载体pTY-s可以经酶切纯化后利用Infusion酶将步骤(3)获得的双链DNA片段与载体pTY-s融合连接。

本发明步骤(4)双链DNA片段与载体pTY-s的融合体系为：载体pTY-s：90ng，双链DNA片段：100ng，Infusion酶：1ul，5xInfusion Buffer：2ul，加灭菌水至10ul，PCR程序为：37℃10min。

本发明步骤(4)化学转化法转化大肠杆菌后，可以用SnaBI进行酶切或用病毒CP结构特异性引物鉴定，引物序列优选为：CP-F:TCCACCCTCACCACCTTCTACCG，CP-R：GTGTGGGGACAGACCTCGCTAACT。

本发明步骤(5)阳性菌落培养的条件优选为含有氨苄青霉素的LB培养基中，37℃，250rpm震荡培养。

本发明步骤(5)提取质粒可以利用试剂盒进行，如TIANGEN质粒大量提取试剂盒。

本发明步骤(6)轰击后的幼苗快速转入栽培土中培养的条件为：首先暗培养22～26h后，人工培养箱中培养，培养条件为22～25℃、相对湿度48～52％，光周期为(15～17)L/(9～7)D。

本发明还提供所述方法在十字花科作物基因沉默或基因功能验证中的应用。

本发明沉默后的植物可通过以下方法验证：幼苗在15-17d后观察基因沉默表型，提取对照及光漂白植株的总RNA，反转录形成cDNA，用病毒CP结构特异性引物扩增鉴定光漂白植株有含有目的片段522bp，对照组侵染pTY-s植株片段长度为442bp。并设计基因特异引物，引物序列优选为PDS-F:AAGACAAGAACAAGG，PDS-R：ACGAGGAGCACTACGGA。利用实时定量PCR检测目的基因的沉默效率。

本发明还提供一种更为具体的TYMV病毒诱导的十字花科内源基因沉默方法，包括如下步骤：

1、TYMV介导的基因沉默体系目的基因载体构建步骤与重组载体质粒大量提取：

(1)根据NCBI数据库下载十字花科的目的基因的CDS序列并设计引物以十字花科的幼叶cDNA为模板进行PCR扩增，PCR产物进行凝胶电泳，并用凝胶纯化回收试剂盒纯化目标基因片段，连接blunt-zero载体，化学法转化大肠杆菌Trans-T1，挑取单克隆进行菌落PCR鉴定，获得中间载体用于测序，得到两种十字花科作物的目的基因编码区全长序列。

(2)从克隆得到的目的基因中选取合适的40bp片段用于载体构建，选取原则为：第2-4个碱基为TGA，TAA或TAG，为方便后期筛选，选择序列的前三个碱基避免为GTA，以免使SnaBI位点重组，故所选择序列为(T/A/G/C)TGA或(T/A/C)TAG或(T/A/C)TAA向后选择40bp序列。

(3)本发明所用载体构建方法为Infusion一步克隆法：选择合适的40bp目的基因序列，并其反向互补序列加到后面，两端再加入和线性化载体两端对应的同源序列长度为15bp的序列，然后一共110bp的序列交公司合成双链DNA片段，载体pTY-s经SnaBI酶消化后利用Infusion酶将合成片段与载体连接，连接产物化学转化法转化Trans-T1大肠杆菌，在含有氨苄青霉素的LB平板上37℃静置培养12h，挑选单克隆菌落，用SnaBI进行酶切或用病毒CP结构特异性引物鉴定。引物序列为：CP-F:TCCACCCTCACCACCTTCTACCG，CP-R：GTGTGGGGACAGACCTCGCTAACT。

(4)将验证好的基因沉默重组载体取500ul菌液转至含有氨苄青霉素的LB培养基中，37℃，250rpm震荡过夜，利用TIANGEN质粒大量提取试剂盒提取质粒。

2、十字花科幼苗培养：

选择颗粒饱满的十字花科种子消毒，播种到穴盘中，15-17d后幼苗第一片真叶长出时，进行基因枪轰击。

3、基因枪轰击幼苗：

步骤(4)所得到的质粒经旋转蒸发得到2ug/μl的高浓度质粒，金粉包被后，利用于手持式基因枪轰击步骤3中所述幼苗，轰击后的幼苗快速转入栽培土中，暗培养24h后，人工培养箱中培养，培养条件为22-25℃、相对湿度50％，光周期为16L/8D。

本发明还公开一种病毒诱导的十字花科目的基因沉默验证的方法：步骤3中，幼苗在15-17d后观察基因沉默表型，提取对照及光漂白植株的总RNA，反转录形成cDNA，用病毒CP结构特异性引物扩增鉴定光漂白植株有含有目的片段522bp，对照组侵染pTY-s植株片段长度为442bp。并设计基因特异引物，利用实时定量PCR检测目的基因的沉默效率。

本发明相对于现有技术的有益效果：

1)本发明所建立的十字花科作物高效的TYMV诱导基因沉默的体系，具有载体构建简单、快速的特点；

2)利用基因枪轰击侵染植株，代替摩擦接种，历时短，操作简单，且大大提高了侵染效率和沉默效率；

3)优化了载体构建的方式，在目的片段两端加上载体同源序列，以同源重组方式连接载体，本发明不需借助农杆菌转染，以高浓度大肠杆菌质粒接种；

4)采用本发明所述的载体pTY-s病毒症状得以减轻，对植物伤害极小，且沉默效率大大提高；

5)可同时观察到多个器官沉默的表型，取得了良好的效果；

6)由于TYMV寄主范围是全部十字花科植物，本应用亦可用于全部十字花科蔬菜类作物(例如白菜、芸薹属的甘蓝、芥蓝及萝卜属的萝卜)的内源基因功能验证或介导基因沉默，可快速、高通量的验证十字花科蔬菜类作物的基因功能，为十字花科蔬菜作物分子设计育种提供了基础。本发明利用TYMV病毒诱导的十字花科内源基因沉默可用于十字花科作物基因的功能分析，以揭示与产量、抗病性相关基因的分子机理，定向育种，为生产提供优良品种具有重要意义。

附图说明

图1：TYMV病毒的RNA基因组结构示意图；

图2：TYMV病毒衍生载体pTY-s示意图；

图3：pTY-s酶切后插入80nt寡核苷酸的选择原则示意图；

图4：pTY-s酶切后插入80nt寡核苷酸的示意图；

图5：同源重组方法载体构建示意图；

图6：植物指示基因PDS沉默表型图；

图7：植物指示基因PDS沉默表型图；

图8阳性植株PCR检测结果；

图9：阳性植株实时定量检测。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明的技术方法做进一步详细说明。实施例仅用于说明本发明而不限制本发明范围，以下实验材料无特别说明均为市售。

本实验所用载体pTY-s是用TYMV病毒改良的，具体制备方式如下：在NCBI数据库搜索CAMV35s启动子和终止子序列合成并分别连接到TYMV cDNA的5’端和3’端，再克隆到pMD-18T(takara)载体上，如图2所示(A.PTY-s主要是由35sCAMV启动子和终止子以及TYMVcDNA三部分组成BpTY-s质粒图谱)，序列如SEQ ID NO.1所示。该病毒经改良后病毒症状得以减轻，对植物伤害极小，且沉默效率大大提高，可同时观察到多个器官沉默的表型。

实施例1一种TYMV病毒诱导的十字花科内源基因沉默方法

(1)PDS基因的克隆及测序验证

通过NCBI数据库搜索不结球白菜和大白菜两种白菜作物的PDS基因序列。以cDNA为模板进行PCR扩增，紫外灯下对目的条带进行切胶回收目的片段，连接blunt-zero载体(购自TransGenBiotech)，化学法转化Trans-T1大肠杆菌，含有氨苄青霉素的LB平板37℃静置过夜培养，挑取单菌落进行PCR鉴定，阳性质粒提取测序，得到PDS基因全长序列。

(2)载体构建及质粒大量提取

从中选取合适的40bp序列及其反向互补序列，选取原则如图3和图4所示：第2-4个碱基为TGA，TAA或TAG，为方便后期筛选，选择序列的前三个碱基避免为GTA，以免使SnaBI位点重组，故所选择序列为(T/A/G/C)TGA或(T/A/C)TAG或(T/A/C)TAA向后选择40bp序列，即在目的片段序列5’端查找(T/A/G/C)TGA或(T/A/C)TAG或(T/A/C)TAA并向后选择40bp序列，加上线性化载体两端15bp序列长片段送公司合成共110bp的双链DNA。载体pTY-s(如图2)经SnaBI酶切(购自TaKaRa)，PCR纯化试剂盒纯化后与合成的序列加Infusion酶37℃连接30min，转化Trans-T1大肠杆菌，于含氨苄青霉素的LB培养基上37℃培养12h，载体构建过程如图5所示(目的片段经反向互补形成双链DNA后用in-fusion酶克隆到SnaBI位点)。挑取单克隆菌落，扩繁提取质粒，质粒经过SnaBI酶切和PCR验证，获得重组VIGS载体pTY-PDS。取验证好的重组载体菌液500ul接种于含有氨苄青霉素的200ml的LB培养基中，37℃250rpm培养12h，根据天根公司质粒大量提取试剂盒说明书提取质粒。

(3)白菜幼苗培养

挑选籽粒饱满的种子，消毒后置于放了浸湿滤纸的培养皿中，暗培养24h催芽，播种在穴盘中并放置在培养室，培养室条件为：温度(24+1)℃，相对湿度(50+2)％，光周期为16L/18D，培养15-17d，至长出第一片真叶。

(4)质粒金粉包被与基因枪轰击

上述所得到的质粒经旋转蒸发至2ng/μl的高浓度质粒，吸取8μl金粉悬浮液于1.5ml EP管中，依次加入2.5μl质粒DNA，使终加入量为5μg，按先后顺序加入50μl2.5MCaCl₂，20ul0.1M亚精胺，冰浴20min，边冰浴边间歇性震荡，振荡混匀10min,12000rpm离心5s,弃上清，以140μl乙醇漂洗一次，再用无水乙醇漂洗两次，加入10μl无水乙醇，悬浮待用。超净工作台中轰击上述培养的幼苗，用PDS-1000/He型基因枪，轰击条件为：氦气压为1300Psi，真空度为26-27cm汞柱，9cm靶距。轰击后的幼苗快速转入栽培土中，暗培养25h后，人工培养箱中培养，培养条件为22～25℃、相对湿度48～52％，光周期为16L/8D。

实施例2沉默后表型及PCR检测

基因枪轰击后15-17d幼苗出现光漂白现象，如图6(A.不结球十字花科pTY-s侵染；B.不结球十字花科pTY-PDS侵染；C.结球十字花科pTY-s侵染；D.结球十字花科pTY-PDS侵染)和图7(不结球十字花科在不同器官引起沉默表型，1,不结球十字花科未侵染2不结球十字花科pTY-PDS侵染3不结球十字花科pTY-s侵染)所示，结果表明PDS基因在叶，茎，根，花梗，果荚多个器官被有效沉默。为进一步在分子水平上验证基因沉默效果，进行PCR检测。提取幼苗总RNA，反转录获得cDNA，首先以CP-F/R进行PCR鉴定，反应完成后以2％琼脂糖凝胶电泳检测。用CP病毒CP结构特异性引物鉴定鉴定光漂白植株及对照组植株，电泳鉴定结果如图8所示，其中1条带为pTY-PDS结球白菜侵染植株检测522bp，2条带为pTY-s侵染植株条带442bp，3条带为pTY-PDS不结球白菜侵染植株检测522bp，M：Marker DL2000，结果表明5ug质粒可以达到100％侵染效率。再以基因特异引物PDS F/R特异性引物分别对漂白植株及对照组植株进行实时定量PCR，每组三个重复，检测PDS的沉默效率，如图9所示，结果表明PDS在结球白菜和不结球白菜中表达量显著降低，沉默效率可达到74％-78％。

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 一种TYMV病毒诱导的十字花科内源基因沉默方法及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 10043

<212> DNA

<213> 芜菁黄花叶病毒(Turnip yellow mosaic virus)

<400> 1

atggtggagc acgacactct cgtctactcc aagaatatca aagatacagt ctcagaagac 60

caaagggcta ttgagacttt tcaacaaagg gtaatatcgg gaaacctcct cggattccat 120

tgcccagcta tctgtcactt catcaaaagg acagtagaaa aggaaggtgg cacctacaaa 180

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aagccagtct ccctcccgct ttcgcctcca ccttcgttcc ccgtccacct ccagcggcat 2700

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cccaacgcac ccatcaaaat tctgacctcg cgctcgaaag ttcaacctca accgaacctc 2820

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tgggctccca ccttttgcac cattcactgc ctgcaccccc cacccacccc cttccatctt 3060

cacagctgtt acccgcacct ttaacgaacg accccactgc gatcggcccg gtgctcccct 3120

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acagccaact cagcaatgaa gagaccaaca ctctcgggct ttcaactgaa cacctcactg 3360

cgttggccca cctttacaac ttccaggcaa ccgtttactc cgatcgcggc cccatcctct 3420

tcggcccctc cgacaccatc aagaggatag acatcaccca caccaccgga ccgccatccc 3480

acttttcacc cggcaaaaga ctcctaggca gccaaccctc cgctaagggc catccctccg 3540

acccactcat cagagccatg aagtctttca aagtatccgg caactacctt cccttctctg 3600

aggcccacaa ccatcccacc tccatctcac acgccaagaa cttgatttca aacatgaaga 3660

atggtttcga cggcgtcctc tccctcctcg acgtctccac gggccaacga accggacccr 3720

cccccaaaga acggatcatc cagatagacc actaccttga caccaacccc ggcaaaacca 3780

ctcctgtggt gcatttcgct ggcttcgctg gctgtgggaa gacatatccg atccaacagc 3840

tcctcaaaac caaactgttc aaagacttcc gggtctcttg ccctaccaca gaactcagaa 3900

ccgaatggaa gacagcgatg gaactccacg gctcccagtc atggcgcttt aacacttggg 3960

agtcttccat tctcaagtca tccagaatcc tggtcattga tgagatctac aaaatgccaa 4020

gagggtacct cgacctttcc atcctcgccg accccgccct cgagctcgtc ataattctcg 4080

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cctctgaaac tctcaggctg ctaccataca tcgacatgta ctgctggtgg agttaccgca 4200

ttcctcaatg catcgcccga ctcttccaaa ttcacagctt caatgcctgg caaggagtta 4260

tcgggtccgt ttccactccc catgatcaat cccccgtcct caccaacagt catgcctcat 4320

ctcttacctt caacagcctg ggatatcgct cctgcacgat cagctctagc caaggcctca 4380

cattctgcga ccccgccata atcgtcctgg acaactacac caagtggctc tcctcggcta 4440

acggcctcgt cgccctcact cgatccagat caggcgtcca attcatgkgc ccctcttcct 4500

acgtcggggg aaccaacggc tcttccgcca tgttttccga cgccttcaac aacagcctca 4560

tcatcatgga tcgctacttc ccatccctgt tcccgcaact caagctcatc acctcccccc 4620

tcacaactcg cggccccaaa ctcaacgggg ccacccccag cgcatccccc acccaccgtt 4680

cgccaaactt ccaccttccc ccacacattc cgctctccta tgatcgtgat tttgttacgg 4740

tgaacccaac tctccccgac caaggacccg aaacaagact cgacacccac tttctcccac 4800

cgtctcggct ccctctccat ttcgatctcc caccggctat caccccaccc ccggtttcca 4860

caagcgtcga cccgccacaa gcgaaagcta gccccgtcta cccaggcgag ttcttcgatt 4920

ctctggcggc gttcttctta ccagcacacg acccatcaac aagggaaata ctccacaaag 4980

atcaatctag caaccagttc ccctggttcg accgaccctt cagcctgtcc tgccagccct 5040

caagtctgat ttccgccaag catgcaccca accatgatcc gacccttcta ccggcctcca 5100

tcaacaaacg cttgcgattc agacccagtg actcaccgca ccaaatcacc gcggacgacg 5160

tggtcctagg cctgcaactc tttcactctc tttgtcgcgc ctactcacgt caacccaaca 5220

gcaccgttcc attcaaccct gaacttttcg cagaatgcat ctctctgaat gagtacgcac 5280

agctcagttc caaaacccaa tccaccatag tggccaacgc ttcacgctcc gacccagact 5340

ggcgacacac caccgtcaag atcttcgcga aagcccaaca caaagtcaac gacggctcca 5400

tcttcggctc gtggaaagcc tgccagaccc tcgcactcat gcacgactac gtgattctgg 5460

ttcttggacc cgtcaagaaa taccagagaa tcttcgacaa cgctgaccgg ccacctaaca 5520

tctactcaca ctgcggcaag acacccaacc aacttcgaga ttggtgccag gaacatctca 5580

ctcattccac ccccaaaatc gcaaacgact acaccgcttt cgaccagtcc cagcatggag 5640

aatccgtggt ccttgaagcc ctcaaaatga agagactgaa cattccragc catctgattc 5700

agctccacgt ccacctcaag accaacgtct ccacccagtt cggccccctc acatgcatgc 5760

gcctaaccgg ggaacccgga acttacgacg acaacactga ctataacctc gcagtcatct 5820

actcccagta tgacgtcggt tcctgcccca tcatggtttc tggcgacgac tcactcatag 5880

accaccccct tcccactcgc cacgactggc catccgttct caaacgcctc cacctccgct 5940

tcaaacttga actcacctct caccccctct tctgtggcta ctacgtcggt ccagccggct 6000

gcatccgcaa ccccctggcc cttttctgca agctcatgat cgccgtggac gacgacgccc 6060

tcgacgaccg acgactcagc tacctcaccg agttcaccac cggacacctc cttggcgaat 6120

cactgtggca cctcctccct gaaacccatg ttcagtatca gtcagcctgc tttgacttct 6180

tctgcaggcg gtgcccaaga cacgagaaaa tgctcctcga cgactccaca cccgcactca 6240

gcctcctcga acgaatcact tcttcgccga ggtggctcac caaaaatgcc atgtacctcc 6300

tccctgccaa gctacgactg gccatcacct ctctatctca aacgcagtcc ttcccagaat 6360

ccatcgaggt ttcccacgct gagtctgaat tgcttcacta cgtccaatag caatcagccc 6420

caacatggaa atcgacaaag aactcgcccc ccaagaccgc accgtcaccg tcgccaccgt 6480

cctaccagct gtccccggcc catcacctct caccatcaaa caaccgttyc agtctgaagt 6540

tctatttgct ggaaccaaag atgccgaggc ttctctcacc atcgccaaca tcgacagcgt 6600

ttccaccctc accaccttct accgtcatgc atctctggaa tcactctggg tcactatcca 6660

tcccaccttg caagccccag ctttcccgac cacggtcggt gtctgctggg tacccgccaa 6720

ttctccagtc actcccgccc aaatcaccaa gacctatggt ggccagatct tctgcattgg 6780

cggcgccatc aacaccctct cacctctcat cgtcaagtgc ccacttgaaa tgatgaaccc 6840

ccgggtcaag gattcgattc agtaccttga ctcgcccaaa ctcctcatct ccatcaccgc 6900

tcaacccacc gctccccccg catcgacctg cataataact gtatcaggaa ctctctcgat 6960

gcactctccg ctcatcacgg acactctacg taagttctcg atctttaaaa tcgttagctc 7020

gccagttagc gaggtctgtc cccacacgac agataatcgg gtgcaactcc cgcccctctt 7080

ccgagggtca tcggaacccg ttcaaacatt tggcaataaa gtttcttaag attgaatcct 7140

gttgccggtc ttgcgatgat tatcatataa tttctgttga attacgttaa gcatgtaata 7200

attaacatgt aatgcatgac gttatttatg agatgggttt ttatgattag agtcccgcaa 7260

ttatacattt aatacgcgat agaaaacaaa atatagcgcg caaactagga taaattatcg 7320

cgcgcggtgt catctatgtt actagatcgg gtcgcgcgtt tcggtgatga cggtgaaaac 7380

ctctgacaca tgcagctccc ggagacggtc acagcttgtc tgtaagcgga tgccgggagc 7440

agacaagccc gtcagggcgc gtcagcgggt gttggcgggt gtcggggctg gcttaactat 7500

gcggcatcag agcagattgt actgagagtg caccatatgc ggtgtgaaat accgcacaga 7560

tgcgtaagga gaaaataccg catcaggcgc cattcgccat tcaggctgcg caactgttgg 7620

gaagggcgat cggtgcgggc ctcttcgcta ttacgccagc tggcgaaagg gggatgtgct 7680

gcaaggcgat taagttgggt aacgccaggg ttttcccagt cacgacgttg taaaacgacg 7740

gccagtgcca agcttgcatg cctgcaggtc gacgatatct ctagaggatc cccgggtacc 7800

gagctcgaat tcgtaatcat ggtcatagct gtttcctgtg tgaaattgtt atccgctcac 7860

aattccacac aacatacgag ccggaagcat aaagtgtaaa gcctggggtg cctaatgagt 7920

gagctaactc acattaattg cgttgcgctc actgcccgct ttccagtcgg gaaacctgtc 7980

gtgccagctg cattaatgaa tcggccaacg cgcggggaga ggcggtttgc gtattgggcg 8040

ctcttccgct tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt 8100

atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa 8160

gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc 8220

gtttttccat aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag 8280

gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt 8340

gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg 8400

aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg 8460

ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg 8520

taactatcgt cttgagtcca acccggtaag acacgactta tcgccactgg cagcagccac 8580

tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg 8640

gcctaactac ggctacacta gaagaacagt atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt 8700

taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg 8760

tggttttttt gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc 8820

tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt 8880

ggtcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt ttaaattaaa aatgaagttt 8940

taaatcaatc taaagtatat atgagtaaac ttggtctgac agttaccaat gcttaatcag 9000

tgaggcacct atctcagcga tctgtctatt tcgttcatcc atagttgcct gactccccgt 9060

cgtgtagata actacgatac gggagggctt accatctggc cccagtgctg caatgatacc 9120

gcgagaccca cgctcaccgg ctccagattt atcagcaata aaccagccag ccggaagggc 9180

cgagcgcaga agtggtcctg caactttatc cgcctccatc cagtctatta attgttgccg 9240

ggaagctaga gtaagtagtt cgccagttaa tagtttgcgc aacgttgttg ccattgctac 9300

aggcatcgtg gtgtcacgct cgtcgtttgg tatggcttca ttcagctccg gttcccaacg 9360

atcaaggcga gttacatgat cccccatgtt gtgcaaaaaa gcggttagct ccttcggtcc 9420

tccgatcgtt gtcagaagta agttggccgc agtgttatca ctcatggtta tggcagcact 9480

gcataattct cttactgtca tgccatccgt aagatgcttt tctgtgactg gtgagtactc 9540

aaccaagtca ttctgagaat agtgtatgcg gcgaccgagt tgctcttgcc cggcgtcaat 9600

acgggataat accgcgccac atagcagaac tttaaaagtg ctcatcattg gaaaacgttc 9660

ttcggggcga aaactctcaa ggatcttacc gctgttgaga tccagttcga tgtaacccac 9720

tcgtgcaccc aactgatctt cagcatcttt tactttcacc agcgtttctg ggtgagcaaa 9780

aacaggaagg caaaatgccg caaaaaaggg aataagggcg acacggaaat gttgaatact 9840

catactcttc ctttttcaat attattgaag catttatcag ggttattgtc tcatgagcgg 9900

atacatattt gaatgtattt agaaaaataa acaaataggg gttccgcgca catttccccg 9960

aaaagtgcca cctgacgtct aagaaaccat tattatcatg acattaacct ataaaaatag 10020

gcgtatcacg aggccctttc gtc 10043

Claims (9)

1.一种TYMV病毒诱导的十字花科内源基因沉默方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)以十字花科的幼叶目标基因cDNA为模板进行PCR扩增，根据NCBI数据库设计扩增引物进行PCR扩增，纯化目标基因片段，连接载体，化学法转化大肠杆菌，挑取单克隆进行菌落PCR鉴定，阳性克隆测序得到目的编码区全长CDS序列；

(2)根据测序后的结果选取40bp片段，选取原则为：5’端第2-4个碱基为TGA，TAA或TAG，且选择序列的前三个碱基避免为GTA，即选择序列为(T/A/G/C)TGA 或(T/A/C)TAG或(T/A/C)TAA向后选择40bp序列；

(3)步骤(2)选取的40bp片段，3’端加上其反向互补序列，两端再加入和线性化载体两端对应的同源序列长度为15bp的序列，然后一共110bp的序列合成双链DNA片段；

(4)将步骤(3)获得的双链DNA片段与载体pTY-s融合连接，融合连接产物化学转化法转化大肠杆菌，获得阳性菌落；

(5)步骤(4)获得的阳性菌落进行培养提取质粒，并旋转蒸发使之浓度为1.5～2.5μg/μl；

(6)选择幼苗第一片真叶长出时，采用步骤(5)浓缩的质粒进行基因枪轰击，轰击后的幼苗快速转入栽培土中培养。

2.根据权利要求1所述的TYMV病毒诱导的十字花科内源基因沉默方法，其特征在于，步骤(4)所述的载体pTY-s序列如SEQ ID NO.1所示。

3.根据权利要求1所述的TYMV病毒诱导的十字花科内源基因沉默方法，其特征在于，步骤(4)双链DNA片段与载体pTY-s的融合体系为：载体pTY-s：90ng，双链DNA片段：100ng，Infusion酶：1ul，5xInfusion Buffer：2ul，加灭菌水至10ul，PCR程序为：37℃10min。

4.根据权利要求1所述的TYMV病毒诱导的十字花科内源基因沉默方法，其特征在于，步骤(5)阳性菌落培养的条件为：含有氨苄青霉素的LB培养基中，37℃，250rpm震荡培养。

5.根据权利要求1所述的TYMV病毒诱导的十字花科内源基因沉默方法，其特征在于，步骤(6)轰击后的幼苗快速转入栽培土中培养的条件为：首先暗培养22～26h后，人工培养箱中培养，培养条件为22～25℃、相对湿度48～52％，光周期为(15～17)L/(9～7)D。

6.权利要求1～5任一项所述的方法在十字花科作物基因沉默或基因功能验证中的应用。

7.一种载体pTY-s，序列如SEQ ID NO.1所示。

8.权利要求7所述载体pTY-s在生物工程中的应用。

9.权利要求7所述载体pTY-s在植物内源基因沉默或基因验证方法中的应用。