CN109777761A

CN109777761A - 一种分泌表达几丁二糖脱乙酰酶的工程菌构建及其应用

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Publication number: CN109777761A
Application number: CN201910193636.5A
Authority: CN
Inventors: 刘龙; 陈坚; 堵国成; 吕雪芹; 李江华; 姜竹; 卢伟; 张弘治; 卢健行; 刘长峰
Original assignee: Jiangnan University; Shandong Runde Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Jiangnan University; Shandong Runde Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2019-03-14
Filing date: 2019-03-14
Publication date: 2019-05-21
Anticipated expiration: 2039-03-14
Also published as: US20200291410A1; CN109777761B; US10934552B2

Abstract

本发明公开了一种分泌表达几丁二糖脱乙酰酶的工程菌的构建及其应用，属于发酵工程技术领域。本发明首先构建了一株异源分泌表达几丁二糖脱乙酰酶基因的重组枯草芽孢杆菌，首次在重组载体中加入信号肽片段yncM，该信号肽可以将目的蛋白几丁二糖脱乙酰酶分泌到重组枯草芽孢杆菌的细胞外，并获得了5’端的非翻译区的突变体，显著提高了目标蛋白的表达量，极大简化了后续酶分离纯化的步骤。获得的几丁二糖脱乙酰酶，以发酵培养基发酵培养50‑60h时酶活达到最高为1548.7U/mL，几丁二糖脱乙酰酶产量最高约为620mg/L。同时，该方法具有低生产成本、生产条件温和、纯化工艺步骤简单、生产操作安全等优点。

Description

一种分泌表达几丁二糖脱乙酰酶的工程菌构建及其应用

技术领域

本发明涉及一种分泌表达几丁二糖脱乙酰酶的工程菌构建及其应用，属于发酵工程技术领域。

背景技术

几丁二糖脱乙酰酶(Diacetylchitobiose Deacetylase)来源于极端嗜热古菌(Pyrococcus horikoshii OT3)，是在生物降解几丁质和壳聚糖，生产壳聚寡糖和壳聚单糖的过程中的关键酶。其中，几丁二糖脱乙酰酶对乙酰氨基葡萄糖单体也具有很高活性，可用于生产氨基葡萄糖。氨基葡萄糖对修复和维持软骨及关节组织功能具有重要作用，是当今世界上认可度较高的一种有效降低骨关节炎发病率的药品，当作为膳食营养补充剂时能有效的减缓骨关节炎症。此外，几丁二糖脱乙酰酶在极端嗜热古菌属中几丁质的代谢途径中有重要作用。该酶来源于极端嗜热古菌，因此具有极强的耐热性和良好的热稳定性，但极端嗜热古菌中的生长条件要求苛刻，培养成本昂贵，因此，工艺简单、绿色环保且高效的几丁二糖生产方法亟待开发。

目前，不同来源的几丁二糖脱乙酰酶已经在大肠杆菌中表达以用于研究几丁质的降解机制，然而，质粒过表达的几丁二糖脱乙酰酶均以包涵体的形式大量积累，将目的基因插入大肠杆菌染色体或利用枯草芽孢杆菌为宿主，进行酶的胞内表达可产生可溶性重组蛋白，但产量依然很低，采用这些方法表达几丁二糖脱乙酰酶依然存在表达量较低，纯酶获得需经过细胞破壁，纯化步骤复杂等缺点，且可溶性蛋白的产量低于40mg/L。因此，需要利用现代生物工程技术及发酵工程手段，提高酶的表达量，以满足众多领域的需求。目前，尚无几丁二糖脱乙酰酶分泌表达的报道，酶的胞外生产可极大地简化后续蛋白纯化工艺，无需细胞破碎及蛋白复性等复杂的提取工艺，且几丁二糖脱乙酰酶的特殊耐热性及热稳定性可简化下游提纯工艺，可显著降低纯酶的生产成本。

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis，B subtilis)是一种被广泛用作食品酶制剂及重要营养化学品的生产宿主，其产品被FDA认证为“generally regarded as safe”(GRAS)安全级别。枯草芽孢杆菌由于其无致病性、安全、无明显密码子偏嗜性、代谢产物分离纯化简便等优点，被广泛作为酶与抗生素等的表达宿主应用于工业生产；其遗传背景较清晰，易于基因工程操作；安全无毒素，对生物和环境不会构成威胁；可进行分泌表达，易于纯化；发酵工艺简单，原料成本低廉，因此建立几丁二糖脱乙酰酶高效分泌表达的枯草芽孢杆菌菌株具有良好的经济效益和社会效益。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种基因工程菌，融合表达了几丁二糖脱乙酰酶(Diacetylchitobiose Deacetylase)与yncM信号肽，并在几丁二糖脱乙酰酶基因的5’非翻译区引入含SEQ ID NO.3的DNA片段。

在本发明的一种实施方式中，所述几丁二糖脱乙酰酶Genbank登录号为PH0499。

在本发明的一种实施方式中，yncM信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌以p43NMK为载体。

在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌以B.subtilis WB600为宿主。

在本发明的一种实施方式中，编码所述几丁二糖脱乙酰酶的基因序列如SEQ IDNO.2所示。

本发明的第二个目的是提供一种制备几丁二糖脱乙酰酶的方法，是应用了上述的基因工程菌进行发酵。

在本发明的一种实施方式中，将上述的基因工程菌在LB培养基中培养，培养条件为：35-37℃，200-220rpm，培养10-15h，获得种子液；以2-5％接种量将种子液接种到TB发酵培养基中，培养条件为：35-37℃，200-220rpm，培养14h-96h。

上述LB培养基为本领域常规培养基，每升组分包括：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl10g。

上述TB培养基为本领域常规培养基，每升组分包括：蛋白胨12g，酵母粉24g，NaCl10g，4mL甘油，2.31g KH₂PO₄，12.54g K₂HPO₄。

本发明的第三个目的是提供上述的基因工程菌的构建方法，将几丁二糖脱乙酰酶与yncM信号肽进行融合，并在几丁二糖脱乙酰酶基因的5’非翻译区引入了突变序列SEQ IDNO.3，最后将获得的完整片段与载体进行连接，转入枯草芽孢杆菌中，得到基因工程菌。

本发明的第四个目的是提供上述的基因工程菌在制备药物或膳食补充剂中的应用。

本发明的第五个目的是提供上述的基因工程菌在制备氨基葡萄糖中的应用。

本发明首先构建了一株异源分泌表达几丁二糖脱乙酰酶基因的重组枯草芽孢杆菌，首次在重组载体中加入信号肽片段yncM，该信号肽可以将目的蛋白几丁二糖脱乙酰酶分泌到重组枯草芽孢杆菌的细胞外，并获得了5’端的非翻译区的突变体，显著提高了目标蛋白的表达量，极大简化了后续酶分离纯化的步骤。获得的几丁二糖脱乙酰酶，以发酵培养基发酵培养50-60h时酶活达到最高为1548.7U/mL，几丁二糖脱乙酰酶产量最高约为620mg/L。同时，该方法具有低生产成本、生产条件温和、纯化工艺步骤简单、生产操作安全等优点。

附图说明

图1：重组质粒构建图。

图2：突变前后的5’非翻译区序列对比图；a：未发生突变时质粒pP43NMK-yncM-Dac的5’非翻译区的序列；b：发送序列插入后获得的突变质粒pP43mut-yncM-Dac的5’非翻译区的序列。

图3：几丁二糖脱乙酰酶在不同发酵阶段的酶活曲线及菌体生长曲线。

图4：含有不同信号肽的几丁二糖酶活力柱形图，1:不含Dac基因；2：含Dac基因但不含信号肽；3：含Dac基因及yncM信号肽；4：含Dac基因及bpr信号肽；5：含Dac基因及ywbN信号肽；6：含Dac基因及ansZ信号肽；7：含Dac基因及yvgO信号肽；8：含Dac基因及amyE信号肽；9：含Dac基因及oppA信号肽；10：含Dac基因及vpr信号肽；11：含Dac基因及lipA信号肽；12：含Dac基因及wapA信号肽；13：含Dac基因及Epr信号肽；14：含Dac基因及yclQ信号肽。

图5：5’非翻译区突变前后胞外酶对比图，a:5’非翻译区突变前后胞外酶活差异；b：5’非翻译区突变前后发酵上清中胞外酶含量蛋白胶图；M:分子量蛋白标准；1:pP43NMK-yncM-Dac；2:pP43mut-yncM-Dac。

具体实施方式

(一)菌株和载体

质粒的复制采用大肠杆菌(Escherichia coli JM109)为宿主菌，脱乙酰酶的表达及菌株发酵采用枯草芽孢杆菌(B.subtilis WB600)。质粒pP43NMK为商业化质粒。

(二)试剂、酶及相关试剂盒：

抗生素(硫酸卡那霉素和氨苄青霉素)购自于上海生工有限公司。

各种化学试剂均为分析纯，购自于上海国药集团。

各种限制性内切酶和DNA连接酶购自于Takara公司。

1kb DNA Ladder、质粒小量提取试剂盒购自于上海生工有限公司。胶回收试剂盒购自于Fermentas公司。

(三)培养基

种子培养基(每100mL含有)：蛋白胨1g，酵母粉0.5g，NaCl 1g。

发酵培养基(每100mL含有)：蛋白胨1.2g，酵母粉2.4g，甘油0.4mL，KH₂PO₄ 0.23g，K₂HPO₄ 1.25g。

(四)HPLC测定方法

HPCL待测样品制备：取1mL反应液，离心去除反应中沉淀，取适量上清液，用去离子水进行适当稀释后经孔径为0.22μm的滤膜过滤。滤液供高效液相色谱分析。

乙酰氨基葡萄糖的含量测定：Agilent 1260高效液相色谱仪(配示差检测器)；采用HPX-87H柱(Bio-Rad,Hercules,CA)；0.5mM稀硫酸为流动相；流速：0.6mL/min；进样量：10μL；柱温：40℃；等度洗脱。示差检测器下检测。

氨基葡萄糖的含量测定：Agilent 1260高效液相色谱仪(配紫外可见检测器)采用Agilent ODS(250mm×4.6mm，5μm)色谱柱；衍生试剂为OPA(邻苯二甲醛，o-phthaldialdehyde)流动相A配制方法：称取3.02g无水乙酸钠于烧杯中，加去离子水溶解并定容至1L，然后加入200μL三乙胺，用5％的醋酸将PH调到7.20±0.05；抽滤后加入5毫升四氢呋喃，混合后备用。流动相B：配制方法：称取3.02g无水乙酸钠于烧杯中；加去离子水溶解并定容至200mL；用5％醋酸将pH调到7.20±0.05；抽滤后，再向此溶液加入400mL乙腈和400mL甲醇，混合后备用。流速：1.0mL/min；进样量：20μL；柱温：40℃。梯度洗脱。紫外检测器在检测波长为330nm下进行检测。

(五)酶活力单位定义及测定方法

在40℃，以50mM pH 8.0的PB为缓冲液的条件下，1h能转化1μmol底物乙酰氨基葡萄糖为1μmol产物氨基葡萄糖的酶量，称为一个酶活力单位，即1U＝1μmol/h。

几丁二糖脱乙酰酶酶活力测定方法：

准确吸取5mL乙酰氨基葡萄糖溶液分别加入洁净具塞试管1#、2#中，置于40℃水浴锅中预热5分钟，2#加入5mL粗酶液(酶液用pH 8.0的PB缓冲液进行适当稀释，稀释系数为N)，1#加入5mL PB溶液，40℃恒温水浴中间歇振荡2min，取出后迅速在1#、2#试管中加入1M的稀盐酸溶液1mL终止反应。混匀溶液用液相色谱进行外标法检测分析。

标准曲线绘制：准确称取乙酰氨基葡萄糖标准品(精确到0.0001g)配制1g/L，2g/L，3g/L，4g/L，5g/L乙酰氨基葡萄糖溶液，进液相检测，绘制标准曲线。

酶活力计算：

式中：X——酶活力，U/mL；

5——酶液体积数，mL；

5——底物溶液(100g/L乙酰氨基葡萄糖溶液)体积数，mL；

A——反应液氨基葡萄糖含量，g/L；

B——空白液氨基葡萄糖含量，g/L；

N——酶液稀释倍数；

1.1——加入终止剂后样品稀释倍数；

215.6——标准样品氨基葡萄糖盐酸盐摩尔质量，g/mol；

5——底物溶液(100g/L乙酰氨基葡萄糖溶液)体积数，mL；

2——反应时间，min；

60——1h为60min。

本发明中所使用的生物化学技术均为本领域中的常规技术。

实施例1几丁二糖脱乙酰酶分泌表达重组质粒构建

将编码信号肽yncM的基因(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)和编码几丁二糖脱乙酰酶Dac的基因(核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)，利用无缝克隆法将两个目的基因插入表达载体pP43NMK中(插入位点为KpnI和PstI)，构建重组质粒pP43NMK-yncM-Dac(如图1)。

实施例2 5’非翻译区突变体的获得

在实施例1构建重组质粒pP43NMK-yncM-Dac的过程中，获得了5’非翻译区突变体，经测序分析后发现在5’端有73bp的碱基插入(如图2)，将该突变的重组质粒命名为pP43mut-yncM-Dac(核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示)。

实施例3重组枯草芽孢杆菌的构建

将实施例2所得的重组质粒pP43mut-yncM-Dac转化到克隆宿主E.coli JM109中，挑取在LB卡那抗性平板上生长的单菌落，进行菌落PCR验证，培养阳性克隆子抽提质粒进行双酶切验证，挑出酶切条带正确的进行测序，测序结果正确的重组质粒转化到表达宿主B.subtilis WB600中。

实施例4几丁二糖脱乙酰酶编码基因在B.subtilis WB600中的分泌表达

将实施例3中所得到重组枯草芽孢杆菌菌株接种到含卡那抗生素(10mg/L)的种子培养基中37℃，220rpm震荡培养过夜。按4％的接种量(v/v)转接到新鲜含卡那抗生素(10mg/L)的发酵培养基中37℃，220rpm震荡培养14-80h。在发酵过程中酶活最高达到1548.7U/mL，几丁二糖脱乙酰酶的产量最高达到620mg/L。

实施例5重组枯草芽孢杆菌的生长情况

将实施例3中所得到重组枯草芽孢杆菌菌株接种到含卡那抗生素(10mg/L)的种子培养基中37℃，220rpm震荡培养过夜。按4％的接种量(v/v)转接到新鲜含卡那抗生素(10mg/L)的发酵培养基中37℃，220rpm震荡培养。每2-8h取样，用去离子水进行适当稀释，用紫外分光光度计测OD₆₀₀，绘制菌体生长曲线。如图3所示，12h后菌体生长进入平衡期，14h菌体浓度达到最高(OD₆₀₀＝23.3)，18h左右开始下降，随后进入衰亡期。

实施例6几丁二糖脱乙酰酶在B.subtilis WB600中不同阶段的酶活检测

取不同发酵阶段的样品，8000xg离心，弃菌体，获得上清液，即为粗酶液。根据上述酶活检测方法进行酶活测定。，检测过程中控制乙酰氨基葡萄糖的降解率在10％以下。否则，酶液需用浓度为50mM，pH 8.0的PB缓冲液进行适当稀释，再按上述方法进行酶活测定。根据测定结果绘制酶活随时间变化曲线图。如图3所示，发酵上清液中的几丁二糖脱乙酰酶在延迟期和对数期的前期仅有微弱酶活，进入平衡器开始检测到明显的胞外酶活，当生长进入衰退期时，发酵上清液中的几丁二糖脱乙酰酶活性显著提高，48h后胞外酶活增长缓慢，60h时到达峰值(1548.7U/mL)，然后基本趋于平稳。

对比例1

以融合了不同信号肽(yncM,bpr,ywbN,ansZ,yvgO,amyE,oppA,vpr,lipA,wapA,Epr和yclQ，氨基酸序列见表1)的质粒作为对照，其余条件同实施例1-6。在发酵过程中，融合了不同信号肽的质粒，酶活从0-18.6U/mL不等，胞外酶活最高达到18.6U/mL，如图4所示。

表1信号肽序列

对比例2

以5’非翻译区未突变的重组质粒pP43NMK-yncM-Dac作为对照，其余条件同实施例1-6。在发酵过程中酶活最高达到18.6U/mL，几丁二糖脱乙酰酶的产量最高达到12mg/L，如图5所示。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

山东润德生物科技有限公司

<120> 一种分泌表达几丁二糖脱乙酰酶的工程菌构建及其应用

<160> 16

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 126

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

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gtaggaacag cagttctttt cggaaccctt tcatcaggta taccaggttt acccgcggca 120

gacgct 126

<210> 2

<211> 819

<212> DNA

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<212> DNA

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<400> 4

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accgagaggt aaaaaaagaa cgaagtcgag atcagggaat gagtttataa aataaaaaaa 600

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aaaatattga ttacaacgaa cgtgtcaaag aaattattga atcacaaaaa acaggtacaa 4080

gaaaaacgag gaaagatgct gttcttgtaa atgagttgct agtaacatct gaccgagatt 4140

tttttgagca actggatcct gataggtggt atgttttcgc ttgaactttt aaatacagcc 4200

attgaacata cggttgattt aataactgac aaacatcacc ctcttgctaa agcggccaag 4260

gacgctgccg ccggggctgt ttgcgttttt gccgtgattt cgtgtatcat tggtttactt 4320

atttttttgc caaagctgta atggctgaaa attcttacat ttattttaca tttttagaaa 4380

tgggcgtgaa aaaaagcgcg cgattatgta aaatataaag tgatagcggt accattatag 4440

gtaagagagg aatgtacaca tggtcgtcaa catgttcgag gacatcgaca cgttcgagga 4500

ggtaccatta taggtaagag aggaatgtac acatggcgaa accactatca aaagggggaa 4560

ttttggtgaa aaaagtattg attgcaggtg cagtaggaac agcagttctt ttcggaaccc 4620

tttcatcagg tataccaggt ttacccgcgg cagacgctat ggtcgtcaac atgttcgagg 4680

acatcgacac gttcgaggaa gcgtttaaca agctgctgcg cgaagtcctg gaatttgatc 4740

tgcaaaatcc gttcaaagac gcgaagaaag tcctttgcat cgaaccgcat ccggacgatt 4800

gcgttattgg aatgggcggc acaatcaaaa aactgagcga tatgggcgtc gaagtcatct 4860

acgtttgcat gacagacggc tatatgggca caacagacga aagcctgtca ggacacgaat 4920

tagcagcaat ccgccgcaaa gaagaagaag aaagcgcacg cctgctgggc gttaaaaaga 4980

tctattggct gaactaccgc gatacagaac tgccgtattc acgcgaagtc cgcaaagatc 5040

tgacgaaaat tctgcgcaaa gaacaaccgg acggagtttt tgcaccagat ccttggcttc 5100

cgtacgaatc acatccggat catagacgca caggctttct ggcgattgaa tcagttgcgt 5160

ttagccagct gccgaatttt agcaacacgg atctggacat tggcctgaat ccgtataaca 5220

gcggaagctt tatcgcgctg tactacacgc acaaaccgaa ctacatcgtc gacatcacgg 5280

acctgatgga actgaaactg aaggcgattc gcgtccatag aagccagttt ccggacgata 5340

tttgggagaa atgggaaccg ttcctgagaa caatcgcgat gttctacggc gaaaaaatcg 5400

gcgttcgcta cggagaaggc tttagaatta tgccgggcct gttctaccac atcacaccgt 5460

ttacggacct gatctgactg cagaagcttg gcgtaatcat ggtcatagct gtttcctgtg 5520

tgaaattgtt atccgctcac aattccacac aacatacgag ccggaagcat aaagtgtaaa 5580

gcctggggtg cctaatgagt gagctaactc acattaattg cgttgcgctc actgcccgct 5640

ttccagtcgg gaaacctgtc gtgccagctg cattaatgaa tcggccaacg cgcggggaga 5700

ggcggtttgc gtattgggcg ctcttccgct tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc 5760

gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa 5820

tcaggggata acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt 5880

aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa 5940

aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt 6000

ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg 6060

tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg taggtatctc 6120

agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc 6180

gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca acccggtaag acacgactta 6240

tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct 6300

acagagttct tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta gaagaacagt atttggtatc 6360

tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa 6420

caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa 6480

aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa 6540

aactcacgtt aagggatttt ggtcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt 6600

ttaaattaaa aatgaagttt taaatcaatc taaagtatat atgagtaaac ttggtctgac 6660

agttaccaat gcttaatcag tgaggcacct atctcagcga tctgtctatt tcgttcatcc 6720

atagttgcct gactccccgt cgtgtagata actacgatac gggagggctt accatctggc 6780

cccagtgctg caatgatacc gcgagaccca cgctcaccgg ctccagattt atcagcaata 6840

aaccagccag ccggaagggc cgagcgcaga agtggtcctg caactttatc cgcctccatc 6900

cagtctatta attgttgccg ggaagctaga gtaagtagtt cgccagttaa tagtttgcgc 6960

aacgttgttg ccattgctac aggcatcgtg gtgtcacgct cgtcgtttgg tatggcttca 7020

ttcagctccg gttcccaacg atcaaggcga gttacatgat cccccatgtt gtgcaaaaaa 7080

gcggttagct ccttcggtcc tccgatcgtt gtcagaagta agttggccgc agtgttatca 7140

ctcatggtta tggcagcact gcataattct cttactgtca tgccatccgt aagatgcttt 7200

tctgtgactg gtgagtactc aaccaagtca ttctgagaat agtgtatgcg gcgaccgagt 7260

tgctcttgcc cggcgtcaat acgggataat accgcgccac atagcagaac tttaaaagtg 7320

ctcatcattg gaaaacgttc ttcggggcga aaactctcaa ggatcttacc gctgttgaga 7380

tccagttcga tgtaacccac tcgtgcaccc aactgatctt cagcatcttt tactttcacc 7440

agcgtttctg ggtgagcaaa aacaggaagg caaaatgccg caaaaaaggg aataagggcg 7500

acacggaaat gttgaatact catactcttc ctttttcaat attattgaag catttatcag 7560

ggttattgtc tcatgagcgg atacatattt gaatgtattt agaaaaataa acaaataggg 7620

gttccgcgca catttccccg aaaagtgcca cctgacgtct aagaaaccat tattatcatg 7680

acattaacct ataaaaatag gcgtatcacg aggccctttc gtc 7723

<210> 5

<211> 47

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Met Ala Lys Pro Leu Ser Lys Gly Gly Ile Leu Val Lys Lys Val Leu

1 5 10 15

Ile Ala Gly Ala Val Gly Thr Ala Val Leu Phe Gly Thr Leu Ser Ser

20 25 30

Gly Ile Pro Gly Leu Pro Ala Ala Asp Ala Gln Val Ala Lys Ala

35 40 45

<210> 6

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 6

Met Arg Lys Lys Thr Lys Asn Arg Leu Ile Ser Ser Val Leu Ser Thr

1 5 10 15

Val Val Ile Ser Ser Leu Leu Phe Pro Gly Ala Ala Gly Ala

20 25 30

<210> 7

<211> 28

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 7

Met Ser Asp Glu Gln Lys Lys Pro Glu Gln Ile His Arg Arg Asp Ile

1 5 10 15

Leu Lys Trp Gly Ala Met Ala Gly Ala Ala Val Ala

20 25

<210> 8

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 8

Met Lys Lys Gln Arg Met Leu Val Leu Phe Thr Ala Leu Leu Phe Val

1 5 10 15

Phe Thr Gly Cys Ser His Ser

20

<210> 9

<211> 26

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 9

Met Lys Arg Ile Arg Ile Pro Met Thr Leu Ala Leu Gly Ala Ala Leu

1 5 10 15

Thr Ile Ala Pro Leu Ser Phe Ala Ser Ala

20 25

<210> 10

<211> 33

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 10

Met Phe Ala Lys Arg Phe Lys Thr Ser Leu Leu Pro Leu Phe Ala Gly

1 5 10 15

Phe Leu Leu Leu Phe His Leu Val Leu Ala Gly Pro Ala Ala Ala Ser

20 25 30

Ala

<210> 11

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 11

Met Lys Lys Arg Trp Ser Ile Val Thr Leu Met Leu Ile Phe Thr Leu

1 5 10 15

Val Leu Ser Ala

20

<210> 12

<211> 28

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 12

Met Lys Lys Gly Ile Ile Arg Phe Leu Leu Val Ser Phe Val Leu Phe

1 5 10 15

Phe Ala Leu Ser Thr Gly Ile Thr Gly Val Gln Ala

20 25

<210> 13

<211> 31

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 13

Met Lys Phe Val Lys Arg Arg Ile Ile Ala Leu Val Thr Ile Leu Met

1 5 10 15

Leu Ser Val Thr Ser Leu Phe Ala Leu Gln Pro Ser Ala Lys Ala

20 25 30

<210> 14

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 14

Met Lys Lys Arg Lys Arg Arg Asn Phe Lys Arg Phe Ile Ala Ala Phe

1 5 10 15

Leu Val Leu Ala Leu Met Ile Ser Leu Val Pro Ala Asp Val Leu Ala

20 25 30

<210> 15

<211> 27

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 15

Met Lys Asn Met Ser Cys Lys Leu Val Val Ser Val Thr Leu Phe Phe

1 5 10 15

Ser Phe Leu Thr Ile Gly Pro Leu Ala His Ala

20 25

<210> 16

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 16

Met Lys Lys Phe Ala Leu Leu Phe Ile Ala Leu Val Thr Ala Val Val

1 5 10 15

Ile Ser Ala Cys Gly Asn Gln Ser Thr Ser Ser Lys Gly

20 25

Claims

1.一种基因工程菌，其特征在于，融合表达了几丁二糖脱乙酰酶与yncM信号肽，并在几丁二糖脱乙酰酶基因的5’非翻译区引入含SEQ ID NO.3的DNA片段。

2.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，以枯草芽孢杆菌为宿主。

3.如权利要求1或2所述的基因工程菌，其特征在于，yncM信号肽的核苷酸序列如SEQID NO.1所示，编码所述几丁二糖脱乙酰酶的基因序列如SEQ ID NO.2所示。

4.如权利要求1-3任一所述的基因工程菌，其特征在于，以p43NMK为载体。

5.一种制备几丁二糖脱乙酰酶的方法，其特征在于，应用了权利要求1-4任一所述的基因工程菌进行发酵。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，以2-5％接种量将基因工程菌种子液接种到TB发酵培养基中，培养条件为：35-37℃，200-220rpm，培养14h-96h。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述种子液是将权利要求1-4任一所述的基因工程菌在LB培养基中培养而得，培养条件为：35-37℃，200-220rpm，培养10-15h。

8.权利要求1-4任一所述的基因工程菌的构建方法，其特征在于，将几丁二糖脱乙酰酶与yncM信号肽进行融合，并在几丁二糖脱乙酰酶基因的5’非翻译区引入了突变序列SEQ IDNO.3，最后将获得的完整片段与载体进行连接，转入枯草芽孢杆菌中，得到基因工程菌。

9.权利要求1-4任一所述的基因工程菌在制备药物或膳食补充剂中的应用。

10.权利要求1-4任一所述的基因工程菌在制备氨基葡萄糖或含氨基葡萄糖的产品中的应用。