CN113293155A - 一种几丁二糖脱乙酰酶突变体及应用 - Google Patents

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CN113293155A CN202110603957.5A CN202110603957A CN113293155A CN 113293155 A CN113293155 A CN 113293155A CN 202110603957 A CN202110603957 A CN 202110603957A CN 113293155 A CN113293155 A CN 113293155A
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吕雪芹
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李江华
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刘延峰
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    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates

Abstract

本发明涉及一种几丁二糖脱乙酰酶突变体，由极端嗜热古菌Pyrococcus horikoshii的几丁二糖脱乙酰酶的第74位的甘氨酸G突变为丙氨酸A得到。本发明提高了几丁二糖脱乙酰酶Dac的酶活、表达量和催化效率，解决了几丁二糖脱乙酰酶Dac转化合成氨基葡萄糖GlcN效率不高的问题。

Description

一种几丁二糖脱乙酰酶突变体及应用
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种几丁二糖脱乙酰酶突变体及应用。
背景技术
氨基葡萄糖GlcN又叫葡萄糖胺，是葡萄糖的一个羟基被氨基取代后的化合物，在医疗美容、农业生产、食品保健等领域有着广泛应用。作为形成软骨组织细胞的重要营养素，氨基葡萄糖GlcN在许多国家已被列入医药品行列。几丁二糖脱乙酰酶Dac在生产壳寡糖和单糖方面有着不容忽视的巨大潜力，市场上现存的脱乙酰酶，多是针对乙酰氨基葡萄糖的多聚体或寡聚体发挥作用，而针对单体形式发挥功能的脱乙酰酶鲜有报道。
几丁二糖脱乙酰酶Dac来源于极端嗜热古菌Pyrococcus horikoshii，具有良好的热稳定性和极强的耐热性。刘波等(极端嗜热古菌Pyrococcus horikoshii几丁二糖脱乙酰酶的克隆、表达及性质研究，微生物学报，2006(02)，255-258)指出几丁二糖脱乙酰酶Dac不仅对几丁二糖有活性，对乙酰氨基葡萄糖单体也有很高的催化活性，可以催化几丁二糖的非还原性末端脱去乙酰基，从而生成非还原性末端部分脱乙酰化的GlcN-GlcNAc，然后在外切氨基糖苷酶的作用下生成氨基葡萄糖GlcN和N-乙酰氨基葡萄糖GlcNAc，随后，几丁二糖脱乙酰酶Dac再催化N-乙酰氨基葡萄糖GlcNAc脱乙酰生成氨基葡萄糖GlcN，相较于化学水解法和微生物催化法生产氨基葡萄糖GlcN，酶法催化具有原料来源丰富，且价格低廉，生产工艺简单等优点。
来源于热球菌属的几丁二糖脱乙酰酶Dac可以利用N-乙酰氨基葡萄糖GlcNAc为底物进行单酶催化反应，实现氨基葡萄糖GlcN的一步生产。但利用几丁二糖脱乙酰酶Dac转化合成氨基葡萄糖GlcN效率不高，且酶的活性低，因此，酶的催化效率等酶学特性还有待进一步改进。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明通过丙氨酸扫描结合高通量筛选，提供了一种几丁二糖脱乙酰酶Dac突变体，提高了几丁二糖脱乙酰酶Dac的酶活、表达量和催化效率，从而解决了几丁二糖脱乙酰酶Dac转化合成氨基葡萄糖GlcN效率不高的问题。
本发明的第一个目的是提供一种几丁二糖脱乙酰酶突变体，由氨基酸序列如SEQID NO.3所示的几丁二糖脱乙酰酶的第74位的甘氨酸G突变为丙氨酸A得到。
本发明的第二个目的是提供一种编码几丁二糖脱乙酰酶突变体的基因，含有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
本发明的第三个目的是提供一种携带上述几丁二糖脱乙酰酶突变体的载体。
本发明的第四个目的是提供一种表达上述几丁二糖脱乙酰酶突变体的细胞。
进一步地，细胞为枯草芽孢杆菌。
进一步地，枯草芽孢杆菌以B.subtilis WB600为宿主，以p43NMK为表达载体，表达上述几丁二糖脱乙酰酶突变体。
本发明上述重组枯草芽孢杆菌的构建方法，包括以下步骤：将极端嗜热古菌编码几丁二糖脱乙酰酶的基因与p43NMK载体连接，得到重组表达载体p43NMK-Dac，以p43NMK-Dac为模板，通过PCR扩增的方法将特定序列突变后，将突变质粒转入枯草芽孢杆菌进行筛选，得到重组枯草芽孢杆菌。
本发明利用丙氨酸体积小同时对蛋白质结构影响较小的特性，将几丁二糖脱乙酰酶Dac的关键氨基酸替换成丙氨酸，建立几丁二糖脱乙酰酶Dac的丙氨酸扫描文库，考察不同位点突变时，几丁二糖脱乙酰酶Dac的酶活变化及某些功能的衰退情况，通过表达和筛选过程，从而鉴定某个氨基酸残基在几丁二糖脱乙酰酶Dac的功能和稳定性等方面发挥的重要作用。
进一步地，特定序列指通过分子对接软件预测酶与底物结合区域附近的15个氨基酸位点，通过定点突变将15个氨基酸残基突变为丙氨酸。
进一步地，通过邻苯二甲醛显色试剂对氨基葡萄糖进行显色反应确定催化活力明显提高的突变体。
本发明的第五个目的是提供一种上述几丁二糖脱乙酰酶突变体或细胞在合成氨基葡萄糖或含氨基葡萄糖产品中的应用。
进一步地，几丁二糖脱乙酰酶突变体或细胞发酵得到的含有几丁二糖脱乙酰酶突变体的上清液为催化剂，以N-乙酰氨基葡萄糖为底物生产氨基葡萄糖
进一步地，以发酵48-72h的重组枯草芽孢杆菌上清液为催化剂，以80-120g/L的N-乙酰氨基葡萄糖为底物，于35-45℃条件下转化N-乙酰氨基葡萄糖生成氨基葡萄糖。优选地，以发酵60h的重组枯草芽孢杆菌上清液为催化剂，以100g/L的N-乙酰氨基葡萄糖为底物，于40℃条件下转化N-乙酰氨基葡萄糖生成氨基葡萄糖。
进一步地，经12000rpm、4℃离心2min得到上清液。
进一步地，将重组枯草芽孢杆菌于37℃培养至OD600＝3.0-5.0得到种子培养液，优选OD600＝5.0。
进一步地，按体积计2-5％的接种量接种种子培养液，优选4％。
进一步地，重组枯草芽孢杆菌的发酵培养基包括蛋白胨12g/L、酵母提取物24g/L、甘油、KH2PO4 2.31g/L和K2HPO412.54 g/L，其中，甘油体积为发酵培养基体积的4‰。
借由上述方案，本发明至少具有以下优点：
本发明通过对几丁二糖脱乙酰酶Dac分子与底物GlcNAc结合区域附近的位点进行丙氨酸突变扫描，获得几丁二糖脱乙酰酶Dac突变体及其工程菌株B.subtilis WB600(G74A)。与现有技术相比，本发明的几丁二糖脱乙酰酶胞外酶活最高可达3215.66U/mL，表达量也有所提高，Km值由野生型Dac的5.21mM降低到4.83mM，催化效率kcat/Km提高了1.59倍。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合详细附图说明如后。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明。
图1为实施例1分子模拟对接时距离最近的5个位点；
图2为实施例1分子模拟对接时距离稍远的10个位点；
图3为实施例2定点突变引物进行PCR扩增的结果；
图4为突变体胞外酶活测定结果。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
实施例1
分子对接及位点选择
为了提高Dac的催化效率，利用软件Discovery Studio的CDOCKER模块进行分子对接实验，确定底物分子与蛋白分子的结合位点及影响蛋白催化效率的关键位点，以便选择进行丙氨酸扫描的氨基酸残基。以Dac的三维结构模型为分子蛋白，以底物GlcNAc为配体，图1为Dac与底物距离最近且能形成氢键的五个位点
Figure BDA0003093579940000052
图2为底物周围距离稍远的10个位点
Figure BDA0003093579940000053
根据分子对接结果，选择了15个位点进行丙氨酸扫描，分别为P45、D46、D47、G74、M76、E77、R92、D115、T116、H152、F168、Q223、F224、W232、H264。
实施例2
预测位点的突变体构建
根据几丁二糖脱乙酰酶Dac的碱基序列，设计简并引物，如表1。利用双酶切连接的方法将目的基因(序列如SEQ ID NO.1所示)插入表达载体pP43NMK中(酶切位点为KpnI和PstI)，构建重组质粒pP43NMK-Dac。根据Dac的编码序列设计定点突变引物，如表1，进行PCR扩增(如图3)，及大肠杆菌Escherichia coli JM109转化，将质粒提取后，转入表达宿主枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis WB600。
表1定点突变引物序列
Figure BDA0003093579940000051
Figure BDA0003093579940000061
实施例3
突变体胞外酶活测定
将构建好的15个突变体菌株单克隆转化子挑入含有5mL液体LB培养基的50mL离心管中进行种子培养，每管添加了10mg/mL的卡那霉素。种子液在弹簧摇床上37℃培养12h后以4％的接种量转接至含有96mL液体TB培养基的500mL三角瓶中进行发酵培养，每瓶添加10mg/mL卡那霉素。通过邻苯二甲醛显色法进行粗酶液酶活检测，具体方式如下：
发酵60h后，取发酵液1mL，12000rpm，4℃离心2min。上清液即为粗酶液，底物为用pH8.0的磷酸缓冲液配置的100g/L的N-乙酰氨基葡萄糖GlcNAc溶液。将待测粗酶液与底物各100μL分别装于1.5mL EP管后40℃预热5min。预热后将粗酶液和底物混合，40℃震荡反应2min，然后加入0.5mol/L HCl终止反应。12000rpm离心2min后取50μL上清加入950μL PB中。混合均匀后取5μL加入100μL OPA检测试剂中，震荡2min。利用酶标仪检测其在330nm处的吸光值。以预先加入0.5mol/L HCl失活后的酶液为反应空白对照。
精确称取标准品配制0.5g/L、1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L GlcN溶液，取5μL加入100μL OPA检测试剂中，震荡1min，30℃保温2min。利用酶标仪检测其在330nm处的吸光值，绘制GlcN的标准曲线。
酶活力(在40℃反应条件下，1h能转化1μmol底物N-乙酰氨基葡萄糖GlcNAc为1μmol产物氨基葡萄糖GlcN所需的酶量，称为一个酶活力单位，即1U＝1μmol/h)计算公式如下所示：
Figure BDA0003093579940000071
其中：X：粗酶液酶活力(U/mL)；A：粗酶液体积0.1(mL)；B：底物溶液体积0.1(mL)；M：加入终止剂后样品稀释倍数1.5；C：反应液GlcN浓度(g/L)；D：空白液GlcN浓度(g/L)。T：反应时间2(min)；60：1h为60min；215.6：标准样品氨基葡萄糖盐酸盐摩尔质量(g/mol)；0.1：底物溶液体积数(mL)x：酶液稀释倍数20。结果如图4。
图4显示，15个突变体中与底物距离较近的5个位点(1-5)的突变体酶活均下降明显(除了H152)，其中H264A基本丧失酶活，说明这四个位点在酶和底物结合过程中有着关键作用。10个距离稍远的位点(5-10)的突变体中G174A，F168A和W232A这三个突变体的酶活提升显著，其中G74A酶活最高，达到3215.66U/ml，与野生型Dac相比提升了40％。
实施例4
动力学参数的测定
对实施例3中筛到的转入p43NMK-G74A-Dac的B.subtilisWB600菌株的发酵上清液进行蛋白纯化：
取50mL发酵60h后的发酵液以8000rpm 4℃离心15min，取上清液于85℃条件下进行水浴30min，然后8000rpm 4℃离心15min，将上清液置于pH 7.0的PB缓冲液中过夜透析。将所得透析液利用0.45μm的滤膜过滤后通过阴离子交换柱(HiTrap Q HP柱)进行纯化，具体纯化步骤如下：
利用5-10个柱体积的ddH2O清洗柱子，流速2mL/min。利用5-10个柱体积的蛋白纯化A液平衡柱子，流速2mL/min。将准备好的蛋白样品加入到蛋白纯化柱中，流速1mL/min。待上完适量的蛋白样品后，利用蛋白纯化B液梯度洗脱，流速1mL/min。将所获蛋白液置于PB1缓冲液进行过夜透析。获得目标蛋白，4℃保存。
纯化完成后，在40℃反应温度下，以不同浓度的底物GlcNAc溶液(浓度范围：0.9-22.6mmol/L)，进行动力学参数的Km和Vmax值的测定，kcat的计算公式为Kcat＝Vmax/E，其中：Vmax为最大反应速率(μM/s)；E为蛋白浓度(mM)，动力学参数检测结果如表2。
表2动力学参数检测结果
Figure BDA0003093579940000081
由表2可见，突变体G74A的催化效率与野生型相比明显提高：Km值从原始Dac的值5.21mM降低为4.65mM，Vmax值由原来的8.11μM/s提高到了11.28μM/s，kcat/Km提升了1.59倍。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
序列表
<110> 江南大学
<120> 一种几丁二糖脱乙酰酶突变体及应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 7768
<212> DNA
<213> （人工合成）
<400> 1
tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60
cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120
ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180
accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240
attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300
tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360
tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt ccttaaggaa cgtacagacg 420
gcttaaaagc ctttaaaaac gtttttaagg ggtttgtaga caaggtaaag gataaaacag 480
cacaattcca agaaaaacac gatttagaac ctaaaaagaa cgaatttgaa ctaactcata 540
accgagaggt aaaaaaagaa cgaagtcgag atcagggaat gagtttataa aataaaaaaa 600
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aagttataag tgactaaaca aataactaaa tagatggggg tttcttttaa tattatgtgt 840
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ggggatatta aaaagagtat aggtttttat tgggataaag taggtttcac tttggttcac 3060
catgaagatg gattcgcagt tctaatgtgt aatgaggttc ggattcatct atgggaggca 3120
agtgatgaag gctggcgcct cgtagtaatg attcaccggt ttgtacaggt gcggagtcgt 3180
ttattgctgg tactgctagt tgccgcattg aagtagaggg aattgatgaa ttatatcaac 3240
atattaagcc tttgggcatt ttgcacccca atacatcatt aaaagatcag tggtgggatg 3300
aacgagactt tgcagtaatt gatcccgaca acaatttgat tagctttttt caacaaataa 3360
aaagctaaaa tctattatta atctgttcag caatcgggcg cgattgctga ataaaagata 3420
cgagagacct ctcttgtatc ttttttattt tgagtggttt tgtccgttac actagaaaac 3480
cgaaagacaa taaaaatttt attcttgctg agtctggctt tcggtaagct agacaaaacg 3540
gacaaaataa aaattggcaa gggtttaaag gtggagattt tttgagtgat cttctcaaaa 3600
aatactacct gtcccttgct gatttttaaa cgagcacgag agcaaaaccc ccctttgctg 3660
aggtggcaga gggcaggttt ttttgtttct tttttctcgt aaaaaaaaga aaggtcttaa 3720
aggttttatg gttttggtcg gcactgccgc gcctcgcaga gcacacactt tatgaatata 3780
aagtatagtg tgttatactt tacttggaag tggttgccgg aaagagcgaa aatgcctcac 3840
atttgtgcca cctaaaaagg agcgatttac atatgagtta tgcagtttgt agaatgcaaa 3900
aagtgaaatc agctggacta aaaggcatgc aatttcataa tcaaagagag cgaaaaagta 3960
gaacgaatga tgatattgac catgagcgaa cacgtgaaaa ttatgatttg aaaaatgata 4020
aaaatattga ttacaacgaa cgtgtcaaag aaattattga atcacaaaaa acaggtacaa 4080
gaaaaacgag gaaagatgct gttcttgtaa atgagttgct agtaacatct gaccgagatt 4140
tttttgagca actggatcct gataggtggt atgttttcgc ttgaactttt aaatacagcc 4200
attgaacata cggttgattt aataactgac aaacatcacc ctcttgctaa agcggccaag 4260
gacgctgccg ccggggctgt ttgcgttttt gccgtgattt cgtgtatcat tggtttactt 4320
atttttttgc caaagctgta atggctgaaa attcttacat ttattttaca tttttagaaa 4380
tgggcgtgaa aaaaagcgcg cgattatgta aaatataaag tgatagcggt accattatag 4440
gtaagagagg aatgtacaca tggtcgtcaa catgttcgag gacatcgaca cgttcgagga 4500
ggtaccatta taggtaagag aggaatgtac acatgaaaaa aatcacaaca aacgaacaat 4560
ttaatgaact gattcaaatg gcgaaaccac tatcaaaagg gggaattttg gtgaaaaaag 4620
tattgattgc aggtgcagta ggaacagcag ttcttttcgg aaccctttca tcaggtatac 4680
caggtttacc cgcggcagac gctatggtcg tcaacatgtt cgaggacatc gacacgttcg 4740
aggaagcgtt taacaagctg ctgcgcgaag tcctggaatt tgatctgcaa aatccgttca 4800
aagacgcgaa gaaagtcctt tgcatcgaac cgcatccgga cgattgcgtt attggaatgg 4860
gcggcacaat caaaaaactg agcgatatgg gcgtcgaagt catctacgtt tgcatgacag 4920
acggctatat gggcacaaca gacgaaagcc tgtcaggaca cgaattagca gcaatccgcc 4980
gcaaagaaga agaagaaagc gcacgcctgc tgggcgttaa aaagatctat tggctgaact 5040
accgcgatac agaactgccg tattcacgcg aagtccgcaa agatctgacg aaaattctgc 5100
gcaaagaaca accggacgga gtttttgcac cagatccttg gcttccgtac gaatcacatc 5160
cggatcatag acgcacaggc tttctggcga ttgaatcagt tgcgtttagc cagctgccga 5220
attttagcaa cacggatctg gacattggcc tgaatccgta taacagcgga agctttatcg 5280
cgctgtacta cacgcacaaa ccgaactaca tcgtcgacat cacggacctg atggaactga 5340
aactgaaggc gattcgcgtc catagaagcc agtttccgga cgatatttgg gagaaatggg 5400
aaccgttcct gagaacaatc gcgatgttct acggcgaaaa aatcggcgtt cgctacggag 5460
aaggctttag aattatgccg ggcctgttct accacatcac accgtttacg gacctgatct 5520
gactgcagaa gcttggcgta atcatggtca tagctgtttc ctgtgtgaaa ttgttatccg 5580
ctcacaattc cacacaacat acgagccgga agcataaagt gtaaagcctg gggtgcctaa 5640
tgagtgagct aactcacatt aattgcgttg cgctcactgc ccgctttcca gtcgggaaac 5700
ctgtcgtgcc agctgcatta atgaatcggc caacgcgcgg ggagaggcgg tttgcgtatt 5760
gggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct cggtcgttcg gctgcggcga 5820
gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca cagaatcagg ggataacgca 5880
ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa ggccgcgttg 5940
ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt 6000
cagaggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg cgtttccccc tggaagctcc 6060
ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc ctttctccct 6120
tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt atctcagttc ggtgtaggtc 6180
gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg ctgcgcctta 6240
tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc actggcagca 6300
gccactggta acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga gttcttgaag 6360
tggtggccta actacggcta cactagaaga acagtatttg gtatctgcgc tctgctgaag 6420
ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg gcaaacaaac caccgctggt 6480
agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg atctcaagaa 6540
gatcctttga tcttttctac ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc acgttaaggg 6600
attttggtca tgagattatc aaaaaggatc ttcacctaga tccttttaaa ttaaaaatga 6660
agttttaaat caatctaaag tatatatgag taaacttggt ctgacagtta ccaatgctta 6720
atcagtgagg cacctatctc agcgatctgt ctatttcgtt catccatagt tgcctgactc 6780
cccgtcgtgt agataactac gatacgggag ggcttaccat ctggccccag tgctgcaatg 6840
ataccgcgag acccacgctc accggctcca gatttatcag caataaacca gccagccgga 6900
agggccgagc gcagaagtgg tcctgcaact ttatccgcct ccatccagtc tattaattgt 6960
tgccgggaag ctagagtaag tagttcgcca gttaatagtt tgcgcaacgt tgttgccatt 7020
gctacaggca tcgtggtgtc acgctcgtcg tttggtatgg cttcattcag ctccggttcc 7080
caacgatcaa ggcgagttac atgatccccc atgttgtgca aaaaagcggt tagctccttc 7140
ggtcctccga tcgttgtcag aagtaagttg gccgcagtgt tatcactcat ggttatggca 7200
gcactgcata attctcttac tgtcatgcca tccgtaagat gcttttctgt gactggtgag 7260
tactcaacca agtcattctg agaatagtgt atgcggcgac cgagttgctc ttgcccggcg 7320
tcaatacggg ataataccgc gccacatagc agaactttaa aagtgctcat cattggaaaa 7380
cgttcttcgg ggcgaaaact ctcaaggatc ttaccgctgt tgagatccag ttcgatgtaa 7440
cccactcgtg cacccaactg atcttcagca tcttttactt tcaccagcgt ttctgggtga 7500
gcaaaaacag gaaggcaaaa tgccgcaaaa aagggaataa gggcgacacg gaaatgttga 7560
atactcatac tcttcctttt tcaatattat tgaagcattt atcagggtta ttgtctcatg 7620
agcggataca tatttgaatg tatttagaaa aataaacaaa taggggttcc gcgcacattt 7680
ccccgaaaag tgccacctga cgtctaagaa accattatta tcatgacatt aacctataaa 7740
aataggcgta tcacgaggcc ctttcgtc 7768
<210> 2
<211> 7768
<212> DNA
<213> （人工合成）
<400> 2
tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60
cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120
ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180
accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240
attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300
tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360
tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt ccttaaggaa cgtacagacg 420
gcttaaaagc ctttaaaaac gtttttaagg ggtttgtaga caaggtaaag gataaaacag 480
cacaattcca agaaaaacac gatttagaac ctaaaaagaa cgaatttgaa ctaactcata 540
accgagaggt aaaaaaagaa cgaagtcgag atcagggaat gagtttataa aataaaaaaa 600
gcacctgaaa aggtgtcttt ttttgatggt tttgaacttg ttctttctta tcttgataca 660
tatagaaata acgtcatttt tattttagtt gctgaaaggt gcgttgaagt gttggtatgt 720
atgtgtttta aagtattgaa aacccttaaa attggttgca cagaaaaacc ccatctgtta 780
aagttataag tgactaaaca aataactaaa tagatggggg tttcttttaa tattatgtgt 840
cctaatagta gcatttattc agatgaaaaa tcaagggttt tagtggacaa gacaaaaagt 900
ggaaaagtga gaccatggag agaaaagaaa atcgctaatg ttgattactt tgaacttctg 960
catattcttg aatttaaaaa ggctgaaaga gtaaaagatt gtgctgaaat attagagtat 1020
aaacaaaatc gtgaaacagg cgaaagaaag ttgtatcgag tgtggttttg taaatccagg 1080
ctttgtccaa tgtgcaactg gaggagagca atgaaacatg gcattcagtc acaaaaggtt 1140
gttgctgaag ttattaaaca aaagccaaca gttcgttggt tgtttctcac attaacagtt 1200
aaaaatgttt atgatggcga agaattaaat aagagtttgt cagatatggc tcaaggattt 1260
cgccgaatga tgcaatataa aaaaattaat aaaaatcttg ttggttttat gcgtgcaacg 1320
gaagtgacaa taaataataa agataattct tataatcagc acatgcatgt attggtatgt 1380
gtggaaccaa cttattttaa gaatacagaa aactacgtga atcaaaaaca atggattcaa 1440
ttttggaaaa aggcaatgaa attagactat gatccaaatg taaaagttca aatgattcga 1500
ccgaaaaata aatataaatc ggatatacaa tcggcaattg acgaaactgc aaaatatcct 1560
gtaaaggata cggattttat gaccgatgat gaagaaaaga atttgaaacg tttgtctgat 1620
ttggaggaag gtttacaccg taaaaggtta atctcctatg gtggtttgtt aaaagaaata 1680
cataaaaaat taaaccttga tgacacagaa gaaggcgatt tgattcatac agatgatgac 1740
gaaaaagccg atgaagatgg attttctatt attgcaatgt ggaattggga acggaaaaat 1800
tattttatta aagagtagtt caacaaacgg gccagtttgt tgaagattag atgctataat 1860
tgttattaaa aggattgaag gatgcttagg aagacgagtt attaatagct gaataagaac 1920
ggtgctctcc aaatattctt atttagaaaa gcaaatctaa aattatctga aaagggaatg 1980
agaatagtga atggaccaat aataatgact agagaagaaa gaatgaagat tgttcatgaa 2040
attaaggaac gaatattgga taaatatggg gatgatgtta aggctattgg tgtttatggc 2100
tctcttggtc gtcagactga tgggccctat tcggatattg agatgatgtg tgtcatgtca 2160
acagaggaag cagagttcag ccatgaatgg acaaccggtg agtggaaggt ggaagtgaat 2220
tttgatagcg aagagattct actagattat gcatctcagg tggaatcaga ttggccgctt 2280
acacatggtc aatttttctc tattttgccg atttatgatt caggtggata cttagagaaa 2340
gtgtatcaaa ctgctaaatc ggtagaagcc caaacgttcc acgatgcgat ttgtgccctt 2400
atcgtagaag agctgtttga atatgcaggc aaatggcgta atattcgtgt gcaaggaccg 2460
acaacatttc taccatcctt gactgtacag gtagcaatgg caggtgccat gttgattggt 2520
ctgcatcatc gcatctgtta tacgacgagc gcttcggtct taactgaagc agttaagcaa 2580
tcagatcttc cttcaggtta tgaccatctg tgccagttcg taatgtctgg tcaactttcc 2640
gactctgaga aacttctgga atcgctagag aatttctgga atgggattca ggagtggaca 2700
gaacgacacg gatatatagt ggatgtgtca aaacgcatac cattttgaac gatgacctct 2760
aataattgtt aatcatgttg gttacgtatt tattaacttc tcctagtatt agtaattatc 2820
atggctgtca tggcgcatta acggaataaa gggtgtgctt aaatcgggcc attttgcgta 2880
ataagaaaaa ggattaatta tgagcgaatt gaattaataa taaggtaata gatttacatt 2940
agaaaatgaa aggggatttt atgcgtgaga atgttacagt ctatcccggc attgccagtc 3000
ggggatatta aaaagagtat aggtttttat tgggataaag taggtttcac tttggttcac 3060
catgaagatg gattcgcagt tctaatgtgt aatgaggttc ggattcatct atgggaggca 3120
agtgatgaag gctggcgcct cgtagtaatg attcaccggt ttgtacaggt gcggagtcgt 3180
ttattgctgg tactgctagt tgccgcattg aagtagaggg aattgatgaa ttatatcaac 3240
atattaagcc tttgggcatt ttgcacccca atacatcatt aaaagatcag tggtgggatg 3300
aacgagactt tgcagtaatt gatcccgaca acaatttgat tagctttttt caacaaataa 3360
aaagctaaaa tctattatta atctgttcag caatcgggcg cgattgctga ataaaagata 3420
cgagagacct ctcttgtatc ttttttattt tgagtggttt tgtccgttac actagaaaac 3480
cgaaagacaa taaaaatttt attcttgctg agtctggctt tcggtaagct agacaaaacg 3540
gacaaaataa aaattggcaa gggtttaaag gtggagattt tttgagtgat cttctcaaaa 3600
aatactacct gtcccttgct gatttttaaa cgagcacgag agcaaaaccc ccctttgctg 3660
aggtggcaga gggcaggttt ttttgtttct tttttctcgt aaaaaaaaga aaggtcttaa 3720
aggttttatg gttttggtcg gcactgccgc gcctcgcaga gcacacactt tatgaatata 3780
aagtatagtg tgttatactt tacttggaag tggttgccgg aaagagcgaa aatgcctcac 3840
atttgtgcca cctaaaaagg agcgatttac atatgagtta tgcagtttgt agaatgcaaa 3900
aagtgaaatc agctggacta aaaggcatgc aatttcataa tcaaagagag cgaaaaagta 3960
gaacgaatga tgatattgac catgagcgaa cacgtgaaaa ttatgatttg aaaaatgata 4020
aaaatattga ttacaacgaa cgtgtcaaag aaattattga atcacaaaaa acaggtacaa 4080
gaaaaacgag gaaagatgct gttcttgtaa atgagttgct agtaacatct gaccgagatt 4140
tttttgagca actggatcct gataggtggt atgttttcgc ttgaactttt aaatacagcc 4200
attgaacata cggttgattt aataactgac aaacatcacc ctcttgctaa agcggccaag 4260
gacgctgccg ccggggctgt ttgcgttttt gccgtgattt cgtgtatcat tggtttactt 4320
atttttttgc caaagctgta atggctgaaa attcttacat ttattttaca tttttagaaa 4380
tgggcgtgaa aaaaagcgcg cgattatgta aaatataaag tgatagcggt accattatag 4440
gtaagagagg aatgtacaca tggtcgtcaa catgttcgag gacatcgaca cgttcgagga 4500
ggtaccatta taggtaagag aggaatgtac acatgaaaaa aatcacaaca aacgaacaat 4560
ttaatgaact gattcaaatg gcgaaaccac tatcaaaagg gggaattttg gtgaaaaaag 4620
tattgattgc aggtgcagta ggaacagcag ttcttttcgg aaccctttca tcaggtatac 4680
caggtttacc cgcggcagac gctatggtcg tcaacatgtt cgaggacatc gacacgttcg 4740
aggaagcgtt taacaagctg ctgcgcgaag tcctggaatt tgatctgcaa aatccgttca 4800
aagacgcgaa gaaagtcctt tgcatcgaac cgcatccgga cgattgcgtt attggaatgg 4860
gcggcacaat caaaaaactg agcgatatgg gcgtcgaagt catctacgtt tgcatgacag 4920
acgcgtatat gggcacaaca gacgaaagcc tgtcaggaca cgaattagca gcaatccgcc 4980
gcaaagaaga agaagaaagc gcacgcctgc tgggcgttaa aaagatctat tggctgaact 5040
accgcgatac agaactgccg tattcacgcg aagtccgcaa agatctgacg aaaattctgc 5100
gcaaagaaca accggacgga gtttttgcac cagatccttg gcttccgtac gaatcacatc 5160
cggatcatag acgcacaggc tttctggcga ttgaatcagt tgcgtttagc cagctgccga 5220
attttagcaa cacggatctg gacattggcc tgaatccgta taacagcgga agctttatcg 5280
cgctgtacta cacgcacaaa ccgaactaca tcgtcgacat cacggacctg atggaactga 5340
aactgaaggc gattcgcgtc catagaagcc agtttccgga cgatatttgg gagaaatggg 5400
aaccgttcct gagaacaatc gcgatgttct acggcgaaaa aatcggcgtt cgctacggag 5460
aaggctttag aattatgccg ggcctgttct accacatcac accgtttacg gacctgatct 5520
gactgcagaa gcttggcgta atcatggtca tagctgtttc ctgtgtgaaa ttgttatccg 5580
ctcacaattc cacacaacat acgagccgga agcataaagt gtaaagcctg gggtgcctaa 5640
tgagtgagct aactcacatt aattgcgttg cgctcactgc ccgctttcca gtcgggaaac 5700
ctgtcgtgcc agctgcatta atgaatcggc caacgcgcgg ggagaggcgg tttgcgtatt 5760
gggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct cggtcgttcg gctgcggcga 5820
gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca cagaatcagg ggataacgca 5880
ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa ggccgcgttg 5940
ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt 6000
cagaggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg cgtttccccc tggaagctcc 6060
ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc ctttctccct 6120
tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt atctcagttc ggtgtaggtc 6180
gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg ctgcgcctta 6240
tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc actggcagca 6300
gccactggta acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga gttcttgaag 6360
tggtggccta actacggcta cactagaaga acagtatttg gtatctgcgc tctgctgaag 6420
ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg gcaaacaaac caccgctggt 6480
agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg atctcaagaa 6540
gatcctttga tcttttctac ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc acgttaaggg 6600
attttggtca tgagattatc aaaaaggatc ttcacctaga tccttttaaa ttaaaaatga 6660
agttttaaat caatctaaag tatatatgag taaacttggt ctgacagtta ccaatgctta 6720
atcagtgagg cacctatctc agcgatctgt ctatttcgtt catccatagt tgcctgactc 6780
cccgtcgtgt agataactac gatacgggag ggcttaccat ctggccccag tgctgcaatg 6840
ataccgcgag acccacgctc accggctcca gatttatcag caataaacca gccagccgga 6900
agggccgagc gcagaagtgg tcctgcaact ttatccgcct ccatccagtc tattaattgt 6960
tgccgggaag ctagagtaag tagttcgcca gttaatagtt tgcgcaacgt tgttgccatt 7020
gctacaggca tcgtggtgtc acgctcgtcg tttggtatgg cttcattcag ctccggttcc 7080
caacgatcaa ggcgagttac atgatccccc atgttgtgca aaaaagcggt tagctccttc 7140
ggtcctccga tcgttgtcag aagtaagttg gccgcagtgt tatcactcat ggttatggca 7200
gcactgcata attctcttac tgtcatgcca tccgtaagat gcttttctgt gactggtgag 7260
tactcaacca agtcattctg agaatagtgt atgcggcgac cgagttgctc ttgcccggcg 7320
tcaatacggg ataataccgc gccacatagc agaactttaa aagtgctcat cattggaaaa 7380
cgttcttcgg ggcgaaaact ctcaaggatc ttaccgctgt tgagatccag ttcgatgtaa 7440
cccactcgtg cacccaactg atcttcagca tcttttactt tcaccagcgt ttctgggtga 7500
gcaaaaacag gaaggcaaaa tgccgcaaaa aagggaataa gggcgacacg gaaatgttga 7560
atactcatac tcttcctttt tcaatattat tgaagcattt atcagggtta ttgtctcatg 7620
agcggataca tatttgaatg tatttagaaa aataaacaaa taggggttcc gcgcacattt 7680
ccccgaaaag tgccacctga cgtctaagaa accattatta tcatgacatt aacctataaa 7740
aataggcgta tcacgaggcc ctttcgtc 7768
<210> 3
<211> 272
<212> PRT
<213> （人工合成）
<400> 3
Met Val Val Ala Met Pro Gly Ala Ile Ala Thr Pro Gly Gly Ala Pro
1 5 10 15
Ala Leu Leu Leu Ala Gly Val Leu Gly Pro Ala Leu Gly Ala Pro Pro
20 25 30
Leu Ala Ala Leu Leu Val Leu Cys Ile Gly Pro His Pro Ala Ala Cys
35 40 45
Val Ile Gly Met Gly Gly Thr Ile Leu Leu Leu Ser Ala Met Gly Val
50 55 60
Gly Val Ile Thr Val Cys Met Thr Ala Ala Thr Met Gly Thr Thr Ala
65 70 75 80
Gly Ser Leu Ser Gly His Gly Leu Ala Ala Ile Ala Ala Leu Gly Gly
85 90 95
Gly Gly Ser Ala Ala Leu Leu Gly Val Leu Leu Ile Thr Thr Leu Ala
100 105 110
Thr Ala Ala Thr Gly Leu Pro Thr Ser Ala Gly Val Ala Leu Ala Leu
115 120 125
Thr Leu Ile Leu Ala Leu Gly Gly Pro Ala Gly Val Pro Ala Pro Ala
130 135 140
Pro Thr Leu Pro Thr Gly Ser His Pro Ala His Ala Ala Thr Gly Pro
145 150 155 160
Leu Ala Ile Gly Ser Val Ala Pro Ser Gly Leu Pro Ala Pro Ser Ala
165 170 175
Thr Ala Leu Ala Ile Gly Leu Ala Pro Thr Ala Ser Gly Ser Pro Ile
180 185 190
Ala Leu Thr Thr Thr His Leu Pro Ala Thr Ile Val Ala Ile Thr Ala
195 200 205
Leu Met Gly Leu Leu Leu Leu Ala Ile Ala Val His Ala Ser Gly Pro
210 215 220
Pro Ala Ala Ile Thr Gly Leu Thr Gly Pro Pro Leu Ala Thr Ile Ala
225 230 235 240
Met Pro Thr Gly Gly Leu Ile Gly Val Ala Thr Gly Gly Gly Pro Ala
245 250 255
Ile Met Pro Gly Leu Pro Thr His Ile Thr Pro Pro Thr Ala Leu Ile
260 265 270

Claims (10)

1.一种几丁二糖脱乙酰酶突变体，其特征在于：所述几丁二糖脱乙酰酶突变体由氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的几丁二糖脱乙酰酶的第74位的甘氨酸G突变为丙氨酸A得到。
2.一种编码几丁二糖脱乙酰酶突变体的基因，其特征在于：含有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
3.携带权利要求1所述突变体的载体。
4.表达权利要求1所述突变体的细胞。
5.根据权利要求4所述的细胞，其特征在于：所述细胞为枯草芽孢杆菌。
6.根据权利要求5所述的细胞，其特征在于：所述枯草芽孢杆菌以B.subtilis WB600为宿主，以p43NMK为表达载体，表达所述几丁二糖脱乙酰酶突变体。
7.一种权利要求1所述几丁二糖脱乙酰酶突变体或权利要求4所述细胞在合成氨基葡萄糖或含氨基葡萄糖产品中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：以所述几丁二糖脱乙酰酶突变体或所述细胞发酵得到的含有几丁二糖脱乙酰酶突变体的上清液为催化剂，以N-乙酰氨基葡萄糖为底物生产氨基葡萄糖。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：发酵48-72h。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：催化的温度为35-45℃。
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