CN114181939B - 一种表达na4蛋白和荧光标签的重组球虫载体及其检测方法 - Google Patents

一种表达na4蛋白和荧光标签的重组球虫载体及其检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种表达NA4蛋白和荧光标签的重组球虫载体及其检测方法，属于基因工程技术领域。本发明提供一种靶向ETH_00009555基因的sgRNA，可以进行精确的基因定点突变；由sgRNA、Cas9和同源重组片段建立基因编辑系统，可精确地将毒害艾美耳球虫的NA4蛋白和荧光标签蛋白等同源片段同源重组于ETH_00009555基因，构建一种表达NA4蛋白和荧光标签的重组球虫载体。所述重组球虫载体DNA经过PCR检测和测序，表明已成功重组于ETH_00009555基因；且重组球虫载体在荧光显微镜下具有明显的荧光信号，表明其已成功表达NA4蛋白和荧光标签蛋白。

Description

一种表达NA4蛋白和荧光标签的重组球虫载体及其检测方法
技术领域
本发明属于基因编辑技术领域，尤其涉及一种表达NA4蛋白和荧光标签的重组球虫载体及其检测方法。
背景技术
毒害艾美耳球虫(Eimeria necatrix)可引起9～14周龄的后备母鸡和种鸡发生急性小肠球虫病，不仅侵害小肠中段，引起小肠肠壁扩张、增厚、局部组织浅层和深层黏膜的严重损伤，严重影响肠道吸收功能，同时对盲肠黏膜造成损伤，表现中度的炎症反应。由于鸡球虫的虫种之间无交叉免疫作用，感染柔嫩艾美耳球虫的鸡群，在受到毒害艾美耳球虫感染时，还会导致同一鸡群暴发二次球虫病，给农户带来二次损失。
专利CN107647163A公开了一种球虫疫苗的吸附拌料免疫方法，将球虫疫苗稀释，与可食用、吸水能力强且容易分散的吸附剂均匀混合，使球虫卵囊能够附着在吸附剂上。将混合后的吸附剂与鸡饲料混合供鸡食用从而获得免疫。
专利CN109432006A公开了球虫疫苗喷滴免疫用佐剂，所述佐剂包括瓜尔胶10～34份，壳寡糖2～34份，吹干粉1.5～10份，食用色素1.5～7份，以及无水葡萄糖15～85份。所述佐剂在常温下能够快速溶解在疫苗稀释液中，将佐剂与疫苗稀释液混合均匀，将混合后的液体通过喷滴设备直接喷洒在鸡只上，使雏鸡快速建立免疫。该方法适用于集约化养鸡场和大型孵化场中，能够快速使雏鸡建立免疫，但这种方法需要多次进行免疫，需要的时间长，在尚未建立免疫前，鸡群仍然有爆发球虫病的风险。
目前国内市场上普遍使用预防球虫病的方法是使用多价弱毒活疫苗通过饮水或拌料免疫，但毒害艾美耳球虫弱毒活疫苗免疫效果并不理想，免疫保护建立较为困难。因此，研制同时预防毒害艾美耳球虫和柔嫩艾美耳球虫的免疫药物和/或疫苗具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种表达NA4蛋白和荧光标签的重组球虫载体及其检测方法。所述靶向ETH_00009555基因的sgRNA特异性强，脱靶率低，与Cas9核酸酶配合，可实现在柔嫩艾美耳球虫的ETH_00009555基因上插入NA4基因。本发明还提供一种ETH_00009555基因编辑系统，所述ETH_00009555基因编辑系统的基因编辑效率高，制备得到的重组球虫载体的基因型可稳定存在，应用价值高。所述重组球虫载体能表达NA4蛋白，所述NA4蛋白能刺激鸡产生中和性抗体抵抗毒害艾美耳球虫和柔嫩艾美耳球虫的感染，所述重组球虫载体能够用于研发同时预防毒害艾美耳球虫和柔嫩艾美耳球虫的球虫疫苗，其免疫效果更为高效安全。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种靶向ETH_00009555基因的sgRNA，所述靶向ETH_00009555基因的sgRNA的核苷酸序列包括SEQ ID No.1所示的序列。
本发明中所述ETH_00009555基因的核苷酸序列来自于NCBI。
SEQ ID No.1：aataggccgaccagacggtg。
本发明中，所述sgRNA靶向ETH_00009555基因中的非编码区序列，所述sgRNA具有良好的特异性与靶向性，脱靶率低，编辑效率高。
第二方面，本发明提供一种ETH_00009555基因编辑系统，所述ETH_00009555基因编辑系统包括第一方面所述的靶向ETH_00009555基因的sgRNA。
优选地，所述ETH_00009555基因编辑系统还包括Cas9核酸酶。
优选地，所述靶向ETH_00009555基因的sgRNA与所述含Cas9蛋白序列连接在同一个基因编辑质粒中。
优选地，所述ETH_00009555基因编辑系统还包括同源重组片段。
优选地，所述同源重组片段包括NA4基因和荧光标签基因。
本发明中，NA4蛋白是毒害艾美耳球虫的表面抗原之一，NA4蛋白的基因全长747bp，编码24个氨基酸，是由18KD和8KD的两条多肽链通过二硫键相连而成，其DNA序列含有3个内含子，基因N端有一段编码23个氨基酸的信号肽，此信号肽序列与柔嫩艾美耳球虫抗原基因TA4的同源性为100％。
本发明中，所述ETH_00009555基因编辑系统中的基因编辑质粒的核苷酸序列包括SEQ ID No.2所示的序列，通过ETH_00009555基因编辑系统与同源重组片段的配合，在柔嫩艾美耳球虫的ETH_00009555基因中实现NA4基因的定点插入，避免了非特异性的基因编辑，编辑效率高、脱靶率低。
SEQ ID No.2：
caagtaagcagaagcacgctgtatttccgggagggtgcgacgagacaaagtgcgcgagttgaaatcgtcgtggggacgattgcaccgcggccacatgttggagacactgaggacacacgggaaacgcgaaagatttcaaattaacgtacccaagcgcgaaagcttgcgcagcatacactcgaagcgaacatcccgaaccatcgagaggcggagagcgataagtctttcacgctgcgaagtgttgcgacggctgcgccgctgcactgtgaattgggcgccaatattgcatcctaggcctgacgcgcctcctgcagaacgcgagacactgggatatgtagagccaagggggaaaccttcgaactctcgaatgtcttctctgacaagaatcatatttccatcagttctgtcagattttcaaatggcgacctgcagaggcctgcttcctccctgtgcgctcttcgaaggggctttctgtcgcgcagggtcacctcgtccccgaagggggtgtttgccttctggtaaatggggatgtcaagttaataggccgaccagacggtggttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaagtggcaccgagtcggtgcttttttgagctccagcttttgttccctttagtgagggttaatttcgagcttggcgtaatcatggtcatagctgtttcctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacacaacatacgagccggaagcataaagtgtaaagcctggggtgcctaatgagtgagctaactcacattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaaggacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatgaagttttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaacttggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgaggcacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatccatagttgcctgactccccgtcgtgtagataactacgatacgggagggcttaccatctggccccagtgctgcaatgataccgcgagacccacgctcaccggctccagatttatcagcaataaaccagccagccggaagggccgagcgcagaagtggtcctgcaactttatccgcctccatccagtctattaattgttgccgggaagctagagtaagtagttcgccagttaatagtttgcgcaacgttgttgccattgctacaggcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatggcttcattcagctccggttcccaacgatcaaggcgagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaagcggttagctccttcggtcctccgatcgttgtcagaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggttatggcagcactgcataattctcttactgtcatgccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagtactcaaccaagtcattctgagaatagtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatacgggataataccgcgccacatagcagaactttaaaagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggcgaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagatccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaactgatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttctgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagggaataagggcgacacggaaatgttgaatactcatactcttcctttttcaatattattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgccacctaaattgtaagcgttaatattttgttaaaattcgcgttaaatttttgttaaatcagctcattttttaaccaataggccgaaatcggcaaaatcccttataaatcaaaagaatagaccgagatagggttgagtgttgttccagtttggaacaagagtccactattaaagaacgtggactccaacgtcaaagggcgaaaaaccgtctatcagggcgatggcccactacgtgaaccatcaccctaatcaagttttttggggtcgaggtgccgtaaagcactaaatcggaaccctaaagggagcccccgatttagagcttgacggggaaagccggcgaacgtggcgagaaaggaagggaagaaagcgaaaggagcgggcgctagggcgctggcaagtgtagcggtcacgctgcgcgtaaccaccacacccgccgcgcttaatgcgccgctacagggcgcgtcccattcgccattcaggctgcgcaactgttgggaagggcgatcggtgcgggcctcttcgctattacgccagctggcgaaagggggatgtgctgcaaggcgattaagttgggtaacgccagggttttcccagtcacgacgttgtaaaacgacggccagtgagcgcgcgtaatacgactcactatagggcgaattgggtaccgggccccccctcgaggtcgacggtatcgataagcttttacatccgttgccttttccacggtccgtgatttcatgtgcgtgcagcttcaaagactggtcgttgcgactaataagactgcagtgacaggtcgaatggtgggcaccttgctgatgactatctactgcaaagtctgagacaacgaacgaaacttcccacacgaggcatttgaaactgacggtgtctaggtaatatgcactgcaagacacggtactggggcctcgctgaattaggggccgatctcgttgccctatcagtgctcacagtgccgcaacgtaacaccagggcaggttcttgacagtggcaacaatgtgcgacgggcgtgtgaacgtttcgtagtcatagcgctagcacgtacctagccacatggtcgtgaggagctttaccatgcgtctagaaggtggatgcgggacacgccttcctggcctttggctcccgagacgcgtgttctaaccacaaaccttgagacgcgtgttccaaccacgcaccctgacacgcgtgttccaaccacgcaccctgagacgcgtgttctaaccacgcaccctgagacgcgtgttctaaccacgcaccctgagacgcgtgttctgccgcacaatgtgcacctgtaggaagctgtagtcactgctgattctcactgttctcggcaagggccgacgaccggagtacagtttttgtgggcagagccgttgtgcagctttccgttcttctcggttgtgtcacatgtgtcattgtcgtgtaaacacacggttgtatgtcggtttcgctgcaccacttcattatttcttctggttttttgacgagtatgcatctagacaaaatggacaagaagtacagcatcggcctggacatcggcaccaactctgtgggctgggccgtgatcaccgacgagtacaaggtgcccagcaagaaattcaaggtgctgggcaacaccgaccggcacagcatcaagaagaacctgatcggcgccctgctgttcgacagcggagaaacagccgaggccacccggctgaagagaaccgccagaagaagatacaccagacggaagaaccggatctgctatctgcaagagatcttcagcaacgagatggccaaggtggacgacagcttcttccacagactggaagagtccttcctggtggaagaggataagaagcacgagcggcaccccatcttcggcaacatcgtggacgaggtggcctaccacgagaagtaccccaccatctaccacctgagaaagaaactggtggacagcaccgacaaggccgacctgcggctgatctatctggccctggcccacatgatcaagttccggggccacttcctgatcgagggcgacctgaaccccgacaacagcgacgtggacaagctgttcatccagctggtgcagacctacaaccagctgttcgaggaaaaccccatcaacgccagcggcgtggacgccaaggccatcctgtctgcca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本发明中构建的同源重组片段含有his标签，his标签分子量小，免疫原性低，方便后期蛋白检测。本发明中NA4基因和荧光标签基因之间插入了间隔序列，间隔序列避免了NA4蛋白和荧光标签蛋白之间形成融合蛋白，有利于NA4蛋白发挥免疫学活性。
本发明中所述同源重组片段的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
SEQ ID No.3：
gctcagcgtgctggacccccttgttccttcaaaccttacttatgagggcttacgcatcgcacctgatgggtcggtgtagcgtgatcatttcactgttcagtagtaggtatgggaggagtgtagttggcaggatgtaggagctttgcaagcggtggaacggttgagatgagtagtgaacagaggctttgcccaatgtcggatagtgagtgtttctcgagcacgaaacgtgcaaggcaacaggttactgtaggtttatgtagttggcaagagtgggccttgcccagtattcggtagtaagtgtcaagcacgacaccagattgcgaagcaacaggtaattgtaggtttacgtatcgtacgtttttcatgggagtgtgacggaaagttgtgggtagcagggtccgggggagtctgcggcaagcagttcaacagattgatggaacagaaagattaagaggcggagtgtccgctgttgctgtgggcagaaagagggcggcgtagagaggcatttagtggatgcttttgaggagttctgggaggtcatcagtagtggggaaggtctaccgcaccgtctggtcggcctattagttaatgcccacatgacgggaaaggcacctatgctgcaagtcgcagctcactgaaaaaatagagccgtgcagggtctgttttgacgcttgcgcatgtaccagtagcggaaaggttgttaagtgcaaaaaatttcagtttatatagcgagtttatcgcagcccctcactaaccgtgaatctgtcagcgaatgcgtgagtacttcaatgttttggtccaccacttacacgcatcataggccgaaggttgctcacattttgacgatgaaaaaacgtgtgtatctaagaaaactgtctaatgagcataaaatgcatcgtcgtaatatagagggagatgcggtcagagacctgtaaaacgatcagatgctgtcacaggagccacctcacctagcgcacgtttcaccatagaaagttgccgacgcactcatacagaatccagaaaataacacaaaaatggagttgtaatgatgcattgtgagcgcctgcagcatctgctaaggttagtccttcaacgggcactccccccaaagtccgactgcacatggggatctaacctattcttaacagacctgactgatcccattaactcaacaggctcacatatgtatcatattaattccggccagtgtctctaaataaactcttttgtaggatctgccaactcactgcgggggggcacacagaagcaccacattgcacgacactgcttttgcgcaggctgcggggcaattaaacgttaacagtgcttgatccggccgaaatgacgcgaaatatttaaaacattatctgtttgtcagcctaacggagatgacatggtcgcacaagagactacagtgtgtgtgtgatgtctttcgtgcatcccaccgagcctctggaattcggcaccgcattagcccacacgtaaaacattgcgtacctaaccaagaagacttctcgggcagagaaaatgtaaaattatacattagcagagccacacattacactaaattgtttaattaggcttggttcacgttccgcagctcgtaatgcgggcgcgcgacagatcaacacacacacacaagcatctcggcagcacgtagtcactagtggaataaccgcgcacttcaacagaccattaaaaacctagacatttatatcctaaagcatgttctgttgaagcttcacaaagcagaattctaagacagcttagctcgtcgcaactcaggtggtgaaacagcaccatgctctagctggcagctgggactgtcacgtcgatgagccctgagtttctcatcgtacacacgcatttttcccagcatttcaattttttttgttgacccgggtgtgctcgcccactttgttcctgttgtccctttgctttctgtgtttttccgcaatggcgccccttcctcggcgaaggctagcgccctgcagggcattatcattgctggttggtctgcttgccgcaagttttgctttttctcaggaaacatacccaacagcagaaacgatggagtgtagagaggcgatgaacgagctcagaaaagcagcagggcttcctgaatttggaaatgctgttggagatgcagtagttctgccagcatactcgcacgaggccagggcggcaccagtggctgaaactctgtggaagacggaaatatgtcccaaagtcttaggaggagcaagggccaagagtgttaccgaagctgtcaagctaactggcaactttgcctactaccccgtcaccgacggcaaaagagagtgcagcgatgctctggagtactggaaaggcggactttcgcagttcaacgataaaattcccccaacatttcaagcgttgaacaaccccgctgtgtacaatgacagggccgtctcctttgtcgccctatacaaccccaaacccagccccgttgttagttgcgtactactccagtgccctaatgcaggaggtggtggacgcaggcttgcggcaggcacgacagatgctgtcatttgcttgacaaaccctgctcctttggcagcaggctcaccaccattcgacgacgagcaatggaagaaaattgttgactctctatctgaaaagaagcatcatcatcatcatcatgctactaacttcagcctgctgaagcaggctggagacgtggaggagaaccctggacctatggtgagcaagggcgaggaggataacatggccatcatcaaggagttcatgcgcttcaaggtgcacatggagggctccgtgaacggccacgagttcgagatcgagggcgagggcgagggccgcccctacgagggcacccagaccgccaagctgaaggtgaccaagggtggccccctgcccttcgcctgggacatcctgtcccctcagttcatgtacggctccaaggcctacgtgaagcaccccgccgacatccccgactacttgaagctgtccttccccgagggcttcaagtgggagcgcgtgatgaacttcgaggacggcggcgtggtgaccgtgacccaggactcctccctgcaggacggcgagttcatctacaaggtgaagctgcgcggcaccaacttcccctccgacggccccgtaatgcagaagaagaccatgggctgggaggcctcctccgagcggatgtaccccgaggacggcgccctgaagggcgagatcaagcagaggctgaagctgaaggacggcggccactacgacgctgaggtcaagaccacctacaaggccaagaagcccgtgcagctgcccggcgcctacaacgtcaacatcaagttggacatcacctcccacaacgaggactacaccatcgtggaacagtacgaacgcgccgagggccgccactccaccggcggcatggacgagctgtacaagtaaatttcgcgaagggcgtcaaacaaagtgccacagcggcctctttacttgtttgttctcactgaatttcgagatcttgagtgaagctgcacaaggaaggaaaacgtacatcctgcgccgtggtacattgcttcgctgtgcattgcgttcaataactgataaaccacaggatactttttattaggtgaatgtatcttgtgcggagtcaagcgttgagactgtacgtaccagtcgatattctttctgaagcaagagagaaacaattaaggcgctctttgtttacagtactagcagcgcctcacgcggacggtgcttcccttcatgtgaattcgtgaagaacacgtccaaaggtgactggaacattgcctaactattcaatcatgtacgatatattcatatttgcagtttatctagatgtgtttcaggtgcttaaccttttctaaccacgacaggagtcattagaattagcagcatgctttttctctagatgctatatcttgatgaaaatgctcacttcaccaatgaaaaaagcccacaactgtcgcggataggtcgaaataagctgaggtaatataaatattctattaattattgctttcggaagaagatacaggcacacaagctacttggcacccatgtggcagatcctaccaggctggagatttcgggtctctcaggcaacagcagattgctcacttcactcagtacactcctcgtgcagacgaatagcaaaatagagaaaaaagagaaacgtcttatgtacaagtcttcaaactttctcctgcagtctgaaatttgtactgcgggtgagcagcggatgagcacgcacacacagtcatagtaacgattgagcagccagataatttcagggaaccaatgaagtctaggcaattgatttttaaaaaattccgttgaagctacaaaaattcgagcgttcaatataacagattatatcatgatattgaagttggtgaaaacgcatcattccctagcggtggaggagaagcagcagcgaaaggtggaggaggcgatcttttggtggtgcgtgacggggtcagtcattggatttggtatctgccgctccatttgtagctaggagagcctctgatgccgtgacatcttgctaggttcgcactgtttccacaacgactactttgtttggtcattttcaccgtgaaagtatgttcaccttggagagagaaaatttgagagagctctgagttgttggaacagcccaagtagctgactctcataggatactactaaagccaaacggcgcgttgtagcgctcatctgcagggattgatctttaaaaaaatgatcttttaaggttcatgccatacttattgagttcgctaggtgtcaacttgtcgaacacattcttgaggtgttgcgtatctgggcgctcccaggggttccatgtgaagcaattgtccagcgttgcgcggacgctcggatgaaaccaggcaggaacggtaggtttgcgacgattgtacaagagcgcgtgtattactcctacgcatccacagaaatcagcattggtaatcgtcgtggctgttgcaaggtctggtagcaaagctgcatatatttgcttgactgaatttcacttaccctcgttagagtgta。
第三方面，本发明提供一种重组球虫载体，所述重组球虫载体含有第一方面所述的靶向ETH_00009555基因的sgRNA。
优选地，所述重组球虫载体含有第二方面所述的ETH_00009555基因编辑系统。
本发明中，通过对球虫的ETH_00009555基因进行编辑，所述重组球虫载体将突变的基因传递给子代球虫，实现了基因编辑的稳定性及可遗传性，降低了筛选的工作量，应用价值更为广泛。
优选地，所述重组球虫载体为经过第二方面所述的ETH_00009555基因编辑系统编辑后，在ETH_00009555基因上整合了所述NA4基因和所述荧光标签基因的球虫。
第四方面，本发明中提供一种第三方面所述的重组球虫载体的构建方法，所述重组球虫载体的构建方法包括：
构建基因编辑质粒；
构建同源重组片段；
将基因编辑质粒和所述同源重组片段导入球虫子孢子中，感染动物；
筛选阳性克隆，得到所述重组球虫载体。
本发明中，所述构建方法简单，可操作性强，编辑效率高，容易获得稳定性状遗传的虫株。
优选地，所述基因编辑质粒的构建方法包括：
PCR扩增所述靶向ETH_00009555基因的sgRNA和Cas9的编码序列，并连接所述编码序列，得到含有靶向ETH_00009555基因的sgRNA和Cas9的基因编辑质粒。
优选地，所述同源重组片段的构建方法包括：
依次将NA4基因和荧光标签基因按顺序连接得到整体片段，将所述整体片段构建到克隆载体上，得到所述同源重组质粒；
以所得同源重组质粒为模板，通过PCR扩增得到仅含5’同源臂、启动子、NA4基因、荧光标签基因和3’同源臂的同源重组片段。
优选地，所述荧光标签基因包括mCherry荧光蛋白基因。
优选地，所述同源重组片段的构建方法还包括测序验证的步骤。
优选地，所述导入包括电转染。
优选地，所述球虫包括柔嫩艾美耳球虫。
优选地，所述动物包括鸡。
优选地，所述筛选阳性克隆的步骤包括：
根据荧光标签基因，进行筛选，得到阳性球虫。
优选地，所述筛选阳性克隆的步骤还包括将所得阳性球虫口服接种，重复接种后得到稳定表达NA4蛋白的重组球虫载体。
本发明中通过在荧光显微镜下观察荧光即筛选出阳性后代，然后通过口服接种，重复4～5代后得到稳定表达NA4蛋白的重组球虫载体。
作为本发明的优选技术方案，所述重组球虫载体的构建方法的步骤包括：
(1)构建含有靶向ETH_00009555基因的sgRNA和Cas9的基因编辑质粒：
PCR扩增所述靶向ETH_00009555基因的sgRNA和Cas9的编码序列，并连接所述编码序列，得到所述含有靶向ETH_00009555基因的sgRNA和Cas9的基因编辑质粒；
(2)构建同源重组片段：
依次将NA4基因和荧光标签基因按顺序连接得到整体片段，将所述整体片段构建到克隆载体上，得到所述同源重组质粒；
以所得同源重组质粒为模板，通过PCR扩增得到仅含5’同源臂、启动子、NA4基因、mCherry基因和3’同源臂的同源重组片段；
(3)将所述含有靶向ETH_00009555基因的sgRNA和Cas9的基因编辑质粒和所述同源重组片段通过电转染导入柔嫩艾美耳球虫子孢子中，使用球虫子孢子感染鸡；
(4)筛选阳性克隆：
根据同源重组片段上的荧光标签基因，进行筛选，得到阳性球虫；将所得阳性球虫口服接种，重复4～5代后得到稳定表达NA4蛋白的重组球虫载体。
步骤(1)和步骤(2)的顺序不受编号限制。
第五方面，本发明提供一种第三方面所述的重组球虫载体的检测方法，所述检测方法包括PCR扩增检测和/或荧光检测。
优选地，所述PCR扩增检测的靶点基因包括NA4基因和/或荧光标签基因；
优选地，所述荧光检测包括根据所述重组球虫载体的荧光进行检测。
本发明中对重组球虫载体的进行检测方法包括：
提取所得阳性重组球虫载体的基因组DNA，利用引物进行PCR检测，测序，NA4基因和荧光标签基因都成功重组，证明成功构建一种表达NA4蛋白和荧光标签基因的重组球虫载体。
需要说明的是，本发明中所使用的科学和技术术语及其缩略语具有本领域技术人员通常理解的含义。以下列举了本发明中使用的部分术语和缩略语：
sgRNA：small guide RNA，小向导RNA。
mCherry荧光蛋白：红色荧光蛋白。
PCR：Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明所述靶向ETH_00009555基因的sgRNA和ETH_00009555基因编辑系统具有良好的特异性和极低的脱靶率，基因编辑效率高；将ETH_00009555基因编辑系统导入柔嫩艾美耳球虫子孢子中，可以在ETH_00009555基因中定点插入NA4基因，避免了非特异性的基因编辑，编辑效率高，脱靶率低。NA4蛋白能刺激鸡产生中和性抗体抵抗毒害艾美耳球虫和柔嫩艾美耳球虫的感染，同源重组质粒含有his标签，his标签分子量小，免疫原性低，方便后期蛋白检测。所述NA4基因和荧光标签基因之间插入了间隔序列，避免了NA4蛋白和荧光标签蛋白之间形成融合蛋白，有利于NA4蛋白发挥免疫学活性。
(2)本发明通过在ETH_00009555基因中定点插入NA4基因，得到了一种可用于同时预防毒害艾美耳球虫和柔嫩艾美耳球虫的重组球虫载体，技术成熟，操作简单，成功率高，具有良好的重复性。构建的重组球虫载体可以通过产生子孢子的方式将编辑后的基因传递给子代球虫，实现了基因编辑的稳定性及可遗传性，降低了筛选的工作量。
附图说明
图1为实施例3中基因编辑质粒pSAG1-CAS9-U6-sgACTIN3H的图谱。
图2为实施例3中同源重组片段的图谱。
图3为实施例3中第1代卵囊的荧光显微镜图片(放大倍数＝100倍)。
图4为实施例3中第4代卵囊的荧光显微镜图片(放大倍数＝100倍)。
图5为实施例4中重组球虫载体的PCR检测结果。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
材料：
PCR扩增试剂购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；
质粒提取试剂盒购自赛默飞世尔科技公司；
Q5点突变试剂盒购自NEB(北京)有限公司；
KLD点突变试剂盒购自NEB(北京)有限公司；
柔嫩艾美耳球虫来自佛山市正典生物技术有限公司。
实施例1
本实施例提供一种靶向ETH_00009555基因的sgRNA，所述sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
SEQ ID No.1：aataggccgaccagacggtg。
本发明中，所述sgRNA靶向ETH_00009555基因的非编码区序列，所述sgRNA具有良好的特异性与靶向性，脱靶率低，编辑效率高。
实施例2
本实施例提供一种ETH_00009555基因编辑系统，所述ETH_00009555基因编辑系统包括靶向ETH_00009555基因的sgRNA、Cas9以及同源重组片段。
所述靶向ETH_00009555基因的sgRNA与所述Cas9连接在同一个基因编辑质粒中。
所述同源重组片段包括ETH_00009555基因5’同源臂、SAG13启动子、NA4基因、mCherry红色荧光蛋白、SAG13终止子和ETH_00009555基因3’同源臂。
所述ETH_00009555基因编辑系统能够在柔嫩艾美耳球虫的ETH_00009555基因上定点插入毒害艾美耳球虫的NA4基因，避免了非特异性的基因编辑，编辑效率高，脱靶率低。
实施例3
本实施例提供一种重组球虫载体，所述重组球虫载体为经过实施例2中ETH_00009555基因编辑系统编辑后，在ETH_00009555基因上定点插入毒害艾美耳球虫的NA4基因的柔嫩艾美耳球虫。
所述重组球虫载体通过如下方法进行构建：
(1)构建含有靶向ETH_00009555基因的sgRNA和Cas9的基因编辑质粒：
选择ETH_00009555基因的非编码区作为插入位点，该位点的核苷酸序列如SEQ IDNo.4所示。
SEQ ID No.4：
tgtgggcagaaagagggcggcgtagagaggcatttagtggatgcttttgaggagttctgggaggtcatcagtagtggggaaggtctaccgcaccgtctggtcggcctattagttaatgcccacatgaggcgatcttttggtggtgcgtgacggggtcagtcattgga。
利用Q5点突变试剂盒进行PCR反应，正向引物序列sgACTIN F的核苷酸序列如SEQID No.5所示，反向引物sgACTIN R的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示，模板为pSAG1-CAS9-U6质粒，得到PCR产物，反应体系如表1所示。
SEQ ID No.5：aataggccgaccagacggtggttttagagctagaaatagcaagtt。
SEQ ID No.6：aacttgacatccccatttacc。
表1
试剂 用量(μL)
酶、dNTPs和缓冲液的混合物 12.5
正向引物 1.25
反向引物 1.25
pSAG1-CAS9-U6-sgUPRT质粒 1
水 补足至25
PCR反应条件如表2所示：
表2
PCR产物进行KLD反应，KLD反应的反应体系如表3。
表3
试剂 用量(μL)
反应缓冲液 5
酶混合物 1
PCR产物 1
水 补足至10
将获得的KLD混合物转化DH5α感受态，提取质粒，SalⅠ单酶切鉴定阳性克隆，并使用测序验证的引物M13进行单向测序，所述测序验证的引物M13的核苷酸序列如SEQ IDNo.7所示。基因编辑质粒的图谱如图1所示，所述基因编辑质粒pSAG1-CAS9-U6-sgACTIN3H的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
SEQ ID No.7：caggaaacagctatgac。
(2)构建同源重组片段：
依次将ETH_00009555基因5’同源臂、SAG13启动子、毒害艾美耳球虫的NA4基因、mCherry荧光蛋白基因、SAG13终止子和ETH_00009555基因3’同源臂按顺序连接得到整体片段，将所述整体片段构建到载体上，得到所述同源重组质粒，基因序列发送至深圳华大基因股份有限公司合成质粒。
用所述同源重组质粒转化感受态细胞DH5α，提取质粒。用线性化引物PCR扩增所述同源重组质粒，所述线性化引物的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示，所述线性化引物的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示，获得同源重组片段，所述同源重组片段的图谱如图2所示，所述同源重组片段的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
SEQ ID No.8：gctcagcgtgctggacc。
SEQ ID No.9：tacactctaacgagggtaagt。
(3)电转染子孢子：
将基因编辑质粒和同源重组片段共转染至柔嫩艾美耳球虫的子孢子中。柔嫩艾美耳球虫子孢子的数量为100万个，基因编辑质粒与同源重组片段拷贝数的比为1:1。子孢子用不完全电转液洗涤后转移至完全电转液中，并置于直径为4mm电转杯中，加入基因编辑质粒和化同源重组片段充分混合，电转条件为2000v、0.25ms、脉冲3次，电击后室温静置30min，将转染后的子孢子经泄殖腔感染雏鸡。
不完全电转液配方：10mM K2HPO4/KH2PO4(pH7.6)、120mM KCl、0.15mM CaCl2，25mMHEPES、2mM EGTA和5mM MgCl2。
完全电转液配方：在不完全电转液的基础上添加了终浓度为2mM ATP和5mM谷胱甘肽。
(4)筛选阳性克隆：
收集第7天的粪便，纯化获得卵囊，卵囊孢子化后，在荧光显微镜下观察荧光单卵囊，图3为第1代卵囊的荧光显微镜图片。筛选阳性球虫后代并口服接种，重复4代后得到阳性率80％的卵囊，图4为第4代卵囊的荧光显微镜图片。通过上述构建方法，本实施例成功在柔嫩艾美耳球虫的ETH_00009555基因上定点插入毒害艾美耳球虫NA4基因和荧光标签基因，构建了一种表达毒害艾美耳球虫的NA4蛋白和荧光标签的重组球虫载体。
实施例4
本实施例提供一种重组球虫载体检测方法，所述检测方法用于实施例3中定点插入毒害艾美耳球虫NA4基因和荧光标签基因的重组球虫载体。
所述重组球虫载体通过如下方法进行检测：
正向引物序列NA4-mCherry F的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示，反向引物NA4-mCherry R的核苷酸序列如SEQ ID No.11所示，模板为重组球虫载体DNA、cDNA、同源重组质粒、亲本株DNA，得到条带大小为1200bp的PCR产物，反应体系如表4所示。图5为重组球虫载体的PCR检测结果，PCR结果表明实施例3成功构建了重组球虫载体。
SEQ ID No.10：tcgcacgaggccagg。
SEQ ID No.11：ttacttgtacagctcgtccat。
表4
试剂 用量(μL)
酶、dNTPs和缓冲液的混合物 12.5
正向引物 1.25
反向引物 1.25
模板 1
水 补足至25
本发明所述的构建方法能成功构建、筛选表达毒害艾美耳球虫NA4蛋白的柔嫩艾美耳球虫，并且可通过荧光显微镜观察和PCR检测出阳性重组球虫载体。
申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
序列表
<110> 佛山市正典生物技术有限公司
<120> 一种表达NA4蛋白和荧光标签的重组球虫载体及其检测方法
<130> 2021
<160> 11
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 1
aataggccga ccagacggtg 20
<210> 2
<211> 9674
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 2
caagtaagca gaagcacgct gtatttccgg gagggtgcga cgagacaaag tgcgcgagtt 60
gaaatcgtcg tggggacgat tgcaccgcgg ccacatgttg gagacactga ggacacacgg 120
gaaacgcgaa agatttcaaa ttaacgtacc caagcgcgaa agcttgcgca gcatacactc 180
gaagcgaaca tcccgaacca tcgagaggcg gagagcgata agtctttcac gctgcgaagt 240
gttgcgacgg ctgcgccgct gcactgtgaa ttgggcgcca atattgcatc ctaggcctga 300
cgcgcctcct gcagaacgcg agacactggg atatgtagag ccaaggggga aaccttcgaa 360
ctctcgaatg tcttctctga caagaatcat atttccatca gttctgtcag attttcaaat 420
ggcgacctgc agaggcctgc ttcctccctg tgcgctcttc gaaggggctt tctgtcgcgc 480
agggtcacct cgtccccgaa gggggtgttt gccttctggt aaatggggat gtcaagttaa 540
taggccgacc agacggtggt tttagagcta gaaatagcaa gttaaaataa ggctagtccg 600
ttatcaactt gaaaagtggc accgagtcgg tgcttttttg agctccagct tttgttccct 660
ttagtgaggg ttaatttcga gcttggcgta atcatggtca tagctgtttc ctgtgtgaaa 720
ttgttatccg ctcacaattc cacacaacat acgagccgga agcataaagt gtaaagcctg 780
gggtgcctaa tgagtgagct aactcacatt aattgcgttg cgctcactgc ccgctttcca 840
gtcgggaaac ctgtcgtgcc agctgcatta atgaatcggc caacgcgcgg ggagaggcgg 900
tttgcgtatt gggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct cggtcgttcg 960
gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca cagaatcagg 1020
ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa 1080
ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg 1140
acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg cgtttccccc 1200
tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc 1260
ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt atctcagttc 1320
ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg 1380
ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc 1440
actggcagca gccactggta acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga 1500
gttcttgaag tggtggccta actacggcta cactagaagg acagtatttg gtatctgcgc 1560
tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg gcaaacaaac 1620
caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg 1680
atctcaagaa gatcctttga tcttttctac ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc 1740
acgttaaggg attttggtca tgagattatc aaaaaggatc ttcacctaga tccttttaaa 1800
ttaaaaatga agttttaaat caatctaaag tatatatgag taaacttggt ctgacagtta 1860
ccaatgctta atcagtgagg cacctatctc agcgatctgt ctatttcgtt catccatagt 1920
tgcctgactc cccgtcgtgt agataactac gatacgggag ggcttaccat ctggccccag 1980
tgctgcaatg ataccgcgag acccacgctc accggctcca gatttatcag caataaacca 2040
gccagccgga agggccgagc gcagaagtgg tcctgcaact ttatccgcct ccatccagtc 2100
tattaattgt tgccgggaag ctagagtaag tagttcgcca gttaatagtt tgcgcaacgt 2160
tgttgccatt gctacaggca tcgtggtgtc acgctcgtcg tttggtatgg cttcattcag 2220
ctccggttcc caacgatcaa ggcgagttac atgatccccc atgttgtgca aaaaagcggt 2280
tagctccttc ggtcctccga tcgttgtcag aagtaagttg gccgcagtgt tatcactcat 2340
ggttatggca gcactgcata attctcttac tgtcatgcca tccgtaagat gcttttctgt 2400
gactggtgag tactcaacca agtcattctg agaatagtgt atgcggcgac cgagttgctc 2460
ttgcccggcg tcaatacggg ataataccgc gccacatagc agaactttaa aagtgctcat 2520
cattggaaaa cgttcttcgg ggcgaaaact ctcaaggatc ttaccgctgt tgagatccag 2580
ttcgatgtaa cccactcgtg cacccaactg atcttcagca tcttttactt tcaccagcgt 2640
ttctgggtga gcaaaaacag gaaggcaaaa tgccgcaaaa aagggaataa gggcgacacg 2700
gaaatgttga atactcatac tcttcctttt tcaatattat tgaagcattt atcagggtta 2760
ttgtctcatg agcggataca tatttgaatg tatttagaaa aataaacaaa taggggttcc 2820
gcgcacattt ccccgaaaag tgccacctaa attgtaagcg ttaatatttt gttaaaattc 2880
gcgttaaatt tttgttaaat cagctcattt tttaaccaat aggccgaaat cggcaaaatc 2940
ccttataaat caaaagaata gaccgagata gggttgagtg ttgttccagt ttggaacaag 3000
agtccactat taaagaacgt ggactccaac gtcaaagggc gaaaaaccgt ctatcagggc 3060
gatggcccac tacgtgaacc atcaccctaa tcaagttttt tggggtcgag gtgccgtaaa 3120
gcactaaatc ggaaccctaa agggagcccc cgatttagag cttgacgggg aaagccggcg 3180
aacgtggcga gaaaggaagg gaagaaagcg aaaggagcgg gcgctagggc gctggcaagt 3240
gtagcggtca cgctgcgcgt aaccaccaca cccgccgcgc ttaatgcgcc gctacagggc 3300
gcgtcccatt cgccattcag gctgcgcaac tgttgggaag ggcgatcggt gcgggcctct 3360
tcgctattac gccagctggc gaaaggggga tgtgctgcaa ggcgattaag ttgggtaacg 3420
ccagggtttt cccagtcacg acgttgtaaa acgacggcca gtgagcgcgc gtaatacgac 3480
tcactatagg gcgaattggg taccgggccc cccctcgagg tcgacggtat cgataagctt 3540
ttacatccgt tgccttttcc acggtccgtg atttcatgtg cgtgcagctt caaagactgg 3600
tcgttgcgac taataagact gcagtgacag gtcgaatggt gggcaccttg ctgatgacta 3660
tctactgcaa agtctgagac aacgaacgaa acttcccaca cgaggcattt gaaactgacg 3720
gtgtctaggt aatatgcact gcaagacacg gtactggggc ctcgctgaat taggggccga 3780
tctcgttgcc ctatcagtgc tcacagtgcc gcaacgtaac accagggcag gttcttgaca 3840
gtggcaacaa tgtgcgacgg gcgtgtgaac gtttcgtagt catagcgcta gcacgtacct 3900
agccacatgg tcgtgaggag ctttaccatg cgtctagaag gtggatgcgg gacacgcctt 3960
cctggccttt ggctcccgag acgcgtgttc taaccacaaa ccttgagacg cgtgttccaa 4020
ccacgcaccc tgacacgcgt gttccaacca cgcaccctga gacgcgtgtt ctaaccacgc 4080
accctgagac gcgtgttcta accacgcacc ctgagacgcg tgttctgccg cacaatgtgc 4140
acctgtagga agctgtagtc actgctgatt ctcactgttc tcggcaaggg ccgacgaccg 4200
gagtacagtt tttgtgggca gagccgttgt gcagctttcc gttcttctcg gttgtgtcac 4260
atgtgtcatt gtcgtgtaaa cacacggttg tatgtcggtt tcgctgcacc acttcattat 4320
ttcttctggt tttttgacga gtatgcatct agacaaaatg gacaagaagt acagcatcgg 4380
cctggacatc ggcaccaact ctgtgggctg ggccgtgatc accgacgagt acaaggtgcc 4440
cagcaagaaa ttcaaggtgc tgggcaacac cgaccggcac agcatcaaga agaacctgat 4500
cggcgccctg ctgttcgaca gcggagaaac agccgaggcc acccggctga agagaaccgc 4560
cagaagaaga tacaccagac ggaagaaccg gatctgctat ctgcaagaga tcttcagcaa 4620
cgagatggcc aaggtggacg acagcttctt ccacagactg gaagagtcct tcctggtgga 4680
agaggataag aagcacgagc ggcaccccat cttcggcaac atcgtggacg aggtggccta 4740
ccacgagaag taccccacca tctaccacct gagaaagaaa ctggtggaca gcaccgacaa 4800
ggccgacctg cggctgatct atctggccct ggcccacatg atcaagttcc ggggccactt 4860
cctgatcgag ggcgacctga accccgacaa cagcgacgtg gacaagctgt tcatccagct 4920
ggtgcagacc tacaaccagc tgttcgagga aaaccccatc aacgccagcg gcgtggacgc 4980
caaggccatc ctgtctgcca gactgagcaa gagcagacgg ctggaaaatc tgatcgccca 5040
gctgcccggc gagaagaaga atggcctgtt cggcaacctg attgccctga gcctgggcct 5100
gacccccaac ttcaagagca acttcgacct ggccgaggat gccaaactgc agctgagcaa 5160
ggacacctac gacgacgacc tggacaacct gctggcccag atcggcgacc agtacgccga 5220
cctgtttctg gccgccaaga acctgtccga cgccatcctg ctgagcgaca tcctgagagt 5280
gaacaccgag atcaccaagg cccccctgag cgcctctatg atcaagagat acgacgagca 5340
ccaccaggac ctgaccctgc tgaaagctct cgtgcggcag cagctgcctg agaagtacaa 5400
agagattttc ttcgaccaga gcaagaacgg ctacgccggc tacatcgatg gcggagccag 5460
ccaggaagag ttctacaagt tcatcaagcc catcctggaa aagatggacg gcaccgagga 5520
actgctcgtg aagctgaaca gagaggacct gctgcggaag cagcggacct tcgacaacgg 5580
cagcatcccc caccagatcc acctgggaga gctgcacgcc attctgcggc ggcaggaaga 5640
tttttaccca ttcctgaagg acaaccggga aaagatcgag aagatcctga ccttccgcat 5700
cccctactac gtgggccctc tggccagggg aaacagcaga ttcgcctgga tgaccagaaa 5760
gagcgaggaa accatcaccc cctggaactt cgaggaagtg gtggacaagg gcgccagcgc 5820
ccagagcttc atcgagcgga tgaccaactt cgataagaac ctgcccaacg agaaggtgct 5880
gcccaagcac agcctgctgt acgagtactt caccgtgtac aacgagctga ccaaagtgaa 5940
atacgtgacc gagggaatga gaaagcccgc cttcctgagc ggcgagcaga aaaaagccat 6000
cgtggacctg ctgttcaaga ccaaccggaa agtgaccgtg aagcagctga aagaggacta 6060
cttcaagaaa atcgagtgct tcgactccgt ggaaatctcc ggcgtggaag atcggttcaa 6120
cgcctccctg ggcacatacc acgatctgct gaaaattatc aaggacaagg acttcctgga 6180
caatgaggaa aacgaggaca ttctggaaga tatcgtgctg accctgacac tgtttgagga 6240
cagagagatg atcgaggaac ggctgaaaac ctatgcccac ctgttcgacg acaaagtgat 6300
gaagcagctg aagcggcgga gatacaccgg ctggggcagg ctgagccgga agctgatcaa 6360
cggcatccgg gacaagcagt ccggcaagac aatcctggat ttcctgaagt ccgacggctt 6420
cgccaacaga aacttcatgc agctgatcca cgacgacagc ctgaccttta aagaggacat 6480
ccagaaagcc caggtgtccg gccagggcga tagcctgcac gagcacattg ccaatctggc 6540
cggcagcccc gccattaaga agggcatcct gcagacagtg aaggtggtgg acgagctcgt 6600
gaaagtgatg ggccggcaca agcccgagaa catcgtgatc gaaatggcca gagagaacca 6660
gaccacccag aagggacaga agaacagccg cgagagaatg aagcggatcg aagagggcat 6720
caaagagctg ggcagccaga tcctgaaaga acaccccgtg gaaaacaccc agctgcagaa 6780
cgagaagctg tacctgtact acctgcagaa tgggcgggat atgtacgtgg accaggaact 6840
ggacatcaac cggctgtccg actacgatgt ggaccatatc gtgcctcaga gctttctgaa 6900
ggacgactcc atcgataaca aagtgctgac tcggagcgac aagaaccggg gcaagagcga 6960
caacgtgccc tccgaagagg tcgtgaagaa gatgaagaac tactggcgcc agctgctgaa 7020
tgccaagctg attacccaga ggaagttcga caatctgacc aaggccgaga gaggcggcct 7080
gagcgaactg gataaggccg gcttcatcaa gagacagctg gtggaaaccc ggcagatcac 7140
aaagcacgtg gcacagatcc tggactcccg gatgaacact aagtacgacg agaacgacaa 7200
actgatccgg gaagtgaaag tgatcaccct gaagtccaag ctggtgtccg atttccggaa 7260
ggatttccag ttttacaaag tgcgcgagat caacaactac caccacgccc acgacgccta 7320
cctgaacgcc gtcgtgggaa ccgccctgat caaaaagtac cctaagctgg aaagcgagtt 7380
cgtgtacggc gactacaagg tgtacgacgt gcggaagatg atcgccaaga gcgagcagga 7440
aatcggcaag gctaccgcca agtacttctt ctacagcaac atcatgaact ttttcaagac 7500
cgagattacc ctggccaacg gcgagatccg gaagcggcct ctgatcgaga caaacggcga 7560
aacaggcgag atcgtgtggg ataagggccg ggactttgcc accgtgcgga aagtgctgtc 7620
tatgccccaa gtgaatatcg tgaaaaagac cgaggtgcag acaggcggct tcagcaaaga 7680
gtctatcctg cccaagagga acagcgacaa gctgatcgcc agaaagaagg actgggaccc 7740
taagaagtac ggcggcttcg acagccccac cgtggcctat tctgtgctgg tggtggccaa 7800
agtggaaaag ggcaagtcca agaaactgaa gagtgtgaaa gagctgctgg ggatcaccat 7860
catggaaaga agcagcttcg agaagaatcc catcgacttt ctggaagcca agggctacaa 7920
agaagtgaaa aaggacctga tcatcaagct gcctaagtac tccctgttcg agctggaaaa 7980
cggccggaag agaatgctgg cctctgccgg cgaactgcag aagggaaacg aactggccct 8040
gccctccaaa tatgtgaact tcctgtacct ggccagccac tatgagaagc tgaagggctc 8100
ccccgaggat aatgagcaga aacagctgtt tgtggaacag cacaaacact acctggacga 8160
gatcatcgag cagatcagcg agttctccaa gagagtgatc ctggccgacg ctaatctgga 8220
caaggtgctg agcgcctaca acaagcacag agacaagcct atcagagagc aggccgagaa 8280
tatcatccac ctgtttaccc tgaccaatct gggagcccct gccgccttca agtactttga 8340
caccaccatc gaccggaaga ggtacaccag caccaaagag gtgctggacg ccaccctgat 8400
ccaccagagc atcaccggcc tgtacgagac acggatcgac ctgtctcagc tgggaggcga 8460
cgcctatccc tatgacgtgc ccgattatgc cagcctgggc agcggctccc ccaagaaaaa 8520
acgcaaggtg gaagatccta agaaaaagcg gaaagtggac ggcattggta gtgggagcaa 8580
cggcagcagc ggatccgtga gcaagggcga ggagctgttc accggggtgg tgcccatcct 8640
ggtcgagctg gacggcgacg taaacggcca caagttcagc gtgcgcggcg agggcgaggg 8700
cgatgccacc aacggcaagc tgaccctgaa gttcatctgc accaccggca agctgcccgt 8760
gccctggccc accctcgtga ccaccctgac ctacggcgtg cagtgcttca gccgctaccc 8820
cgaccacatg aagcagcacg acttcttcaa gtccgccatg cccgaaggct acgtccagga 8880
gcgcaccatc tccttcaagg acgacggcac ctacaagacc cgcgccgagg tgaagttcga 8940
gggcgacacc ctggtgaacc gcatcgagct gaagggcatc gacttcaagg aggacggcaa 9000
catcctgggg cacaagctgg agtacaactt caacagccac aacgtctata tcacggccga 9060
caagcagaag aacggcatca aggcgaactt caagatccgc cacaacgtcg aggacggcag 9120
cgtgcagctc gccgaccact accagcagaa cacccccatc ggcgacggcc ccgtgctgct 9180
gcccgacaac cactacctga gcacccagtc caagctgagc aaagacccca acgagaagcg 9240
cgatcacatg gtcctgctgg agttcgtgac cgccgccggg atcactctcg gcatggacga 9300
gctgtacaag tagttaatta atcaccgttg tgctcacttc tcaaatcgac aaaggaaaca 9360
cacttcgtgc agcatgtgcc ccattataaa gaaactgagt tgttccgttg tggcttgcag 9420
gtgtcacatc cacaaaaacc ggccgactct aaataggagt gtttcgcagc aagcagcgaa 9480
agtttatgac tgggtccgaa tctctgaacg gatgtgtggc ggacctggct gatgttgatc 9540
gccgtcgaca cacgcgccac atgggtcaat acacaagaca gctatcagtt gttttagtcg 9600
aaccggttaa cacaattctt gcccccccga gggggatcca ctagttctag agcggccgcc 9660
accgcggtgg agct 9674
<210> 3
<211> 5055
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 3
gctcagcgtg ctggaccccc ttgttccttc aaaccttact tatgagggct tacgcatcgc 60
acctgatggg tcggtgtagc gtgatcattt cactgttcag tagtaggtat gggaggagtg 120
tagttggcag gatgtaggag ctttgcaagc ggtggaacgg ttgagatgag tagtgaacag 180
aggctttgcc caatgtcgga tagtgagtgt ttctcgagca cgaaacgtgc aaggcaacag 240
gttactgtag gtttatgtag ttggcaagag tgggccttgc ccagtattcg gtagtaagtg 300
tcaagcacga caccagattg cgaagcaaca ggtaattgta ggtttacgta tcgtacgttt 360
ttcatgggag tgtgacggaa agttgtgggt agcagggtcc gggggagtct gcggcaagca 420
gttcaacaga ttgatggaac agaaagatta agaggcggag tgtccgctgt tgctgtgggc 480
agaaagaggg cggcgtagag aggcatttag tggatgcttt tgaggagttc tgggaggtca 540
tcagtagtgg ggaaggtcta ccgcaccgtc tggtcggcct attagttaat gcccacatga 600
cgggaaaggc acctatgctg caagtcgcag ctcactgaaa aaatagagcc gtgcagggtc 660
tgttttgacg cttgcgcatg taccagtagc ggaaaggttg ttaagtgcaa aaaatttcag 720
tttatatagc gagtttatcg cagcccctca ctaaccgtga atctgtcagc gaatgcgtga 780
gtacttcaat gttttggtcc accacttaca cgcatcatag gccgaaggtt gctcacattt 840
tgacgatgaa aaaacgtgtg tatctaagaa aactgtctaa tgagcataaa atgcatcgtc 900
gtaatataga gggagatgcg gtcagagacc tgtaaaacga tcagatgctg tcacaggagc 960
cacctcacct agcgcacgtt tcaccataga aagttgccga cgcactcata cagaatccag 1020
aaaataacac aaaaatggag ttgtaatgat gcattgtgag cgcctgcagc atctgctaag 1080
gttagtcctt caacgggcac tccccccaaa gtccgactgc acatggggat ctaacctatt 1140
cttaacagac ctgactgatc ccattaactc aacaggctca catatgtatc atattaattc 1200
cggccagtgt ctctaaataa actcttttgt aggatctgcc aactcactgc gggggggcac 1260
acagaagcac cacattgcac gacactgctt ttgcgcaggc tgcggggcaa ttaaacgtta 1320
acagtgcttg atccggccga aatgacgcga aatatttaaa acattatctg tttgtcagcc 1380
taacggagat gacatggtcg cacaagagac tacagtgtgt gtgtgatgtc tttcgtgcat 1440
cccaccgagc ctctggaatt cggcaccgca ttagcccaca cgtaaaacat tgcgtaccta 1500
accaagaaga cttctcgggc agagaaaatg taaaattata cattagcaga gccacacatt 1560
acactaaatt gtttaattag gcttggttca cgttccgcag ctcgtaatgc gggcgcgcga 1620
cagatcaaca cacacacaca agcatctcgg cagcacgtag tcactagtgg aataaccgcg 1680
cacttcaaca gaccattaaa aacctagaca tttatatcct aaagcatgtt ctgttgaagc 1740
ttcacaaagc agaattctaa gacagcttag ctcgtcgcaa ctcaggtggt gaaacagcac 1800
catgctctag ctggcagctg ggactgtcac gtcgatgagc cctgagtttc tcatcgtaca 1860
cacgcatttt tcccagcatt tcaatttttt ttgttgaccc gggtgtgctc gcccactttg 1920
ttcctgttgt ccctttgctt tctgtgtttt tccgcaatgg cgccccttcc tcggcgaagg 1980
ctagcgccct gcagggcatt atcattgctg gttggtctgc ttgccgcaag ttttgctttt 2040
tctcaggaaa catacccaac agcagaaacg atggagtgta gagaggcgat gaacgagctc 2100
agaaaagcag cagggcttcc tgaatttgga aatgctgttg gagatgcagt agttctgcca 2160
gcatactcgc acgaggccag ggcggcacca gtggctgaaa ctctgtggaa gacggaaata 2220
tgtcccaaag tcttaggagg agcaagggcc aagagtgtta ccgaagctgt caagctaact 2280
ggcaactttg cctactaccc cgtcaccgac ggcaaaagag agtgcagcga tgctctggag 2340
tactggaaag gcggactttc gcagttcaac gataaaattc ccccaacatt tcaagcgttg 2400
aacaaccccg ctgtgtacaa tgacagggcc gtctcctttg tcgccctata caaccccaaa 2460
cccagccccg ttgttagttg cgtactactc cagtgcccta atgcaggagg tggtggacgc 2520
aggcttgcgg caggcacgac agatgctgtc atttgcttga caaaccctgc tcctttggca 2580
gcaggctcac caccattcga cgacgagcaa tggaagaaaa ttgttgactc tctatctgaa 2640
aagaagcatc atcatcatca tcatgctact aacttcagcc tgctgaagca ggctggagac 2700
gtggaggaga accctggacc tatggtgagc aagggcgagg aggataacat ggccatcatc 2760
aaggagttca tgcgcttcaa ggtgcacatg gagggctccg tgaacggcca cgagttcgag 2820
atcgagggcg agggcgaggg ccgcccctac gagggcaccc agaccgccaa gctgaaggtg 2880
accaagggtg gccccctgcc cttcgcctgg gacatcctgt cccctcagtt catgtacggc 2940
tccaaggcct acgtgaagca ccccgccgac atccccgact acttgaagct gtccttcccc 3000
gagggcttca agtgggagcg cgtgatgaac ttcgaggacg gcggcgtggt gaccgtgacc 3060
caggactcct ccctgcagga cggcgagttc atctacaagg tgaagctgcg cggcaccaac 3120
ttcccctccg acggccccgt aatgcagaag aagaccatgg gctgggaggc ctcctccgag 3180
cggatgtacc ccgaggacgg cgccctgaag ggcgagatca agcagaggct gaagctgaag 3240
gacggcggcc actacgacgc tgaggtcaag accacctaca aggccaagaa gcccgtgcag 3300
ctgcccggcg cctacaacgt caacatcaag ttggacatca cctcccacaa cgaggactac 3360
accatcgtgg aacagtacga acgcgccgag ggccgccact ccaccggcgg catggacgag 3420
ctgtacaagt aaatttcgcg aagggcgtca aacaaagtgc cacagcggcc tctttacttg 3480
tttgttctca ctgaatttcg agatcttgag tgaagctgca caaggaagga aaacgtacat 3540
cctgcgccgt ggtacattgc ttcgctgtgc attgcgttca ataactgata aaccacagga 3600
tactttttat taggtgaatg tatcttgtgc ggagtcaagc gttgagactg tacgtaccag 3660
tcgatattct ttctgaagca agagagaaac aattaaggcg ctctttgttt acagtactag 3720
cagcgcctca cgcggacggt gcttcccttc atgtgaattc gtgaagaaca cgtccaaagg 3780
tgactggaac attgcctaac tattcaatca tgtacgatat attcatattt gcagtttatc 3840
tagatgtgtt tcaggtgctt aaccttttct aaccacgaca ggagtcatta gaattagcag 3900
catgcttttt ctctagatgc tatatcttga tgaaaatgct cacttcacca atgaaaaaag 3960
cccacaactg tcgcggatag gtcgaaataa gctgaggtaa tataaatatt ctattaatta 4020
ttgctttcgg aagaagatac aggcacacaa gctacttggc acccatgtgg cagatcctac 4080
caggctggag atttcgggtc tctcaggcaa cagcagattg ctcacttcac tcagtacact 4140
cctcgtgcag acgaatagca aaatagagaa aaaagagaaa cgtcttatgt acaagtcttc 4200
aaactttctc ctgcagtctg aaatttgtac tgcgggtgag cagcggatga gcacgcacac 4260
acagtcatag taacgattga gcagccagat aatttcaggg aaccaatgaa gtctaggcaa 4320
ttgattttta aaaaattccg ttgaagctac aaaaattcga gcgttcaata taacagatta 4380
tatcatgata ttgaagttgg tgaaaacgca tcattcccta gcggtggagg agaagcagca 4440
gcgaaaggtg gaggaggcga tcttttggtg gtgcgtgacg gggtcagtca ttggatttgg 4500
tatctgccgc tccatttgta gctaggagag cctctgatgc cgtgacatct tgctaggttc 4560
gcactgtttc cacaacgact actttgtttg gtcattttca ccgtgaaagt atgttcacct 4620
tggagagaga aaatttgaga gagctctgag ttgttggaac agcccaagta gctgactctc 4680
ataggatact actaaagcca aacggcgcgt tgtagcgctc atctgcaggg attgatcttt 4740
aaaaaaatga tcttttaagg ttcatgccat acttattgag ttcgctaggt gtcaacttgt 4800
cgaacacatt cttgaggtgt tgcgtatctg ggcgctccca ggggttccat gtgaagcaat 4860
tgtccagcgt tgcgcggacg ctcggatgaa accaggcagg aacggtaggt ttgcgacgat 4920
tgtacaagag cgcgtgtatt actcctacgc atccacagaa atcagcattg gtaatcgtcg 4980
tggctgttgc aaggtctggt agcaaagctg catatatttg cttgactgaa tttcacttac 5040
cctcgttaga gtgta 5055
<210> 4
<211> 167
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 4
tgtgggcaga aagagggcgg cgtagagagg catttagtgg atgcttttga ggagttctgg 60
gaggtcatca gtagtgggga aggtctaccg caccgtctgg tcggcctatt agttaatgcc 120
cacatgaggc gatcttttgg tggtgcgtga cggggtcagt cattgga 167
<210> 5
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 5
aataggccga ccagacggtg gttttagagc tagaaatagc aagtt 45
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 6
aacttgacat ccccatttac c 21
<210> 7
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 7
caggaaacag ctatgac 17
<210> 8
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 8
gctcagcgtg ctggacc 17
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 9
tacactctaa cgagggtaag t 21
<210> 10
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 10
tcgcacgagg ccagg 15
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 11
ttacttgtac agctcgtcca t 21

Claims (2)

1.一种ETH_00009555基因编辑系统，其特征在于，所述基因编辑系统选择ETH_00009555基因的非编码区作为插入位点，该位点的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；
所述ETH_00009555基因编辑系统包括靶向ETH_00009555基因的sgRNA、Cas9核酸酶和同源重组片段；
所述靶向ETH_00009555基因的sgRNA核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；
所述同源重组片段中包括NA4基因和荧光标签基因；
所述ETH_00009555基因编辑系统中的基因编辑质粒的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；
所述同源重组片段的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
2.一种重组球虫载体，其特征在于，所述重组球虫载体为经过权利要求1所述的ETH_00009555基因编辑系统编辑后，在ETH_00009555基因中整合了所述NA4基因和荧光标签基因的球虫载体。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103028111A (zh) * 2011-10-10 2013-04-10 南京农业大学 一种鸡艾美耳球虫免疫调节型多价多表位dna疫苗
CN113583876A (zh) * 2021-08-02 2021-11-02 中国农业科学院上海兽医研究所(中国动物卫生与流行病学中心上海分中心) EYFP敲入到Et.Actin基因的鸡柔嫩艾美尔球虫虫株的制备

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103028111A (zh) * 2011-10-10 2013-04-10 南京农业大学 一种鸡艾美耳球虫免疫调节型多价多表位dna疫苗
CN113583876A (zh) * 2021-08-02 2021-11-02 中国农业科学院上海兽医研究所(中国动物卫生与流行病学中心上海分中心) EYFP敲入到Et.Actin基因的鸡柔嫩艾美尔球虫虫株的制备

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