CN114736308B - 球虫抗原肽/il5的融合蛋白基因工程菌的制备及用途 - Google Patents

球虫抗原肽/il5的融合蛋白基因工程菌的制备及用途 Download PDF

Info

Publication number
CN114736308B
CN114736308B CN202210253988.7A CN202210253988A CN114736308B CN 114736308 B CN114736308 B CN 114736308B CN 202210253988 A CN202210253988 A CN 202210253988A CN 114736308 B CN114736308 B CN 114736308B
Authority
CN
China
Prior art keywords
coccidian
seq
fusion protein
plasmid
gene
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202210253988.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN114736308A (zh
Inventor
不公告发明人
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sichuan Yimeikang Technology Co ltd
Original Assignee
Sichuan Yimeikang Technology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sichuan Yimeikang Technology Co ltd filed Critical Sichuan Yimeikang Technology Co ltd
Priority to CN202210253988.7A priority Critical patent/CN114736308B/zh
Publication of CN114736308A publication Critical patent/CN114736308A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114736308B publication Critical patent/CN114736308B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/44—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from protozoa
    • C07K14/455—Eimeria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/002—Protozoa antigens
    • A61K39/012—Coccidia antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/385—Haptens or antigens, bound to carriers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/12—Antidiarrhoeals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A61P33/02—Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/5409—IL-5
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/75—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Bacillus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A61K2039/552—Veterinary vaccine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/70—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in livestock or poultry

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种球虫抗原肽/IL5的融合蛋白基因工程菌的制备及用途，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。其编码基因序列如SEQ ID No.2所示。本发明的蛋白对禽球虫具有显著预防和治疗调节作用。食品级枯草芽孢杆菌表达的阳离子多肽复合物通过黏膜免疫引起动物肠道的获得性免疫应答，产生抗球虫的抗体。白细胞介素5是嗜酸性粒细胞激活因子，可以激活肠道的嗜酸性粒细胞，分泌抗寄生虫活性物质，修复由于球虫感染引起的肠道黏膜受损。

Description

球虫抗原肽/IL5的融合蛋白基因工程菌的制备及用途
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种食品级枯草芽孢杆菌(不含耐药基因)预防和治疗禽球虫病的球虫抗原肽/IL5与枯草芽孢杆菌分泌肽融合蛋白、融合基因、表达载体及其基因工程菌。
背景技术
球虫病每年给我国畜禽养殖带来数十亿的损失，目前主要依靠抗生素来抑制球虫爆发，但不能解决根本问题。抗生素的使用造成耐药性增加，养殖成本升高。兽药残留危害人类健康。
为了对付球虫等原虫寄生虫的耐药性问题，世界上每1～2年就必需推出一种新药。随着人们对环境与健康要求的不断提高，研制新药的费用越来越高，使许多制药公司已放弃了新药的研制。另一个必须认识的事实是，几乎没有一种药是完美无缺的，很多药物不仅有毒副作用，而且其在肉、蛋内的残留也危及人的健康。为此，规定了一定的停药期限。这使得养禽者和科研人员面临着一个严重的问题，即在停药期间如何避免球虫病的暴发。因此，急需一种安全高效的球虫病等原虫预防类药物，口服球虫疫苗是理想的选择，安全高效，制作简单，成本低廉，拌料口服节约注射人工等诸多优势。
国外对球虫生物工程苗的研究已进行了不少工作，并获得了裂殖子、子孢子、折光体及棒状体的多种抗原，为重组球虫苗和亚单位球虫苗的研制提供了可能性。现有的研究表明，用重组抗原免疫鸡只能提供部分保护力，其保护水平还不足以抵抗毒力虫株的侵袭。因此生物工程球虫苗要想达到商业应用，还必须解决许多问题，如保护力的提高，制苗费用的降低等等。
目前，我国农业农村部印发《直接饲喂微生物和发酵制品生产菌株鉴定及其安全性评价指南》农办牧【2021】43号文件指出，转基因发酵制品生产菌株应不具有获得性耐药、不产生临床相关抗菌药物、无致病性/产毒能力、遗传修饰未引入/改变关注基因，且在发酵制品中未检出生产菌株重组DNA的生产菌株判定为无危害，发酵制品无生产菌株引起的风险。具有获得性耐药的生产菌株判定为具有危害。若发酵制品生产菌株携带获得性耐药基因，并在发酵制品中检测到耐药基因的完整DNA片段，则发酵制品对靶动物和暴露物种具有风险，不建议该菌株用于发酵制品的生产；若发酵制品中未检出生产菌株相关耐药基因DNA片段，则认为不具有风险。因此要求转基因菌株中，转入DNA片段不含耐药基因。
发明内容
本发明所要解决的技术问题为：如何提供一种食品级球虫抗原肽/IL5的融合蛋白及分泌表达该融合蛋白的基因工程菌，用于预防和治疗家畜细菌性腹泻，解决现有球虫病疫苗保护力不高的问题。
本发明的技术方案为：球虫抗原肽/IL5的融合蛋白，所述融合蛋白的氨基酸序列为：
MIQKRKRTVSFRLVLMCTLLFVSLPITKTSAAVGSSRVDVPGGSGDDDDKMRTHLYFLLLTVGISATPLRSNLAELQTWLQQIYQSVDMLNLRIETPVSADDENCIKTLFEGTALLKNNPEMRRFGTFFQSFDKLRPSLTAQLTGEGECDTERKNVKKFIEKLRTFIRKLSRDARVGSGDDDDKSHGMVMCANAEDKSSVELLQGSGGAYMQLSRRGGDAAFDEKEVGSGGGAGGDGGAGGGTGGSGEEEGSGNGLSVDETIKVTSAGWTKSEGSGSSSSCCALLQLEKQDLEQSLGSGFNDSQRQATKDAGTIAGLNVGSGALNDPVVYNDRAVSFVALYNGSGAWDTSVKEWLVDTGKVYAGGGSGAWDTSVKEWLVDTGKVYAGGGSGRLTVRGGLQEKEAVKVTANGGSGSDALEYWKGGLSQFNDKIPPGSGGRISSYYTSPLLLSGTCSLSGSGNPSSSATADCRVVTCTQTNTGSGKASQRDFQLLKHLTRWYNHMGSGAEVAAACATKASAEAALLTGGSGFYPSYHSTPQRP(SEQ ID No:1)。
上述氨基酸序列中：
MIQKRKRTVSFRLVLMCTLLFVSLPITKTSAAVGSSRVDVPG为信号肽序列。
MRTHLYFLLLTVGISATPLRSNLAELQTWLQQIYQSVDMLNLRIETPVSADDENCIKTLFEGTALLKNNPEMRRFGTFFQSFDKLRPSLTAQLTGEGECDTERKNVKKFIEKLRTFIRKLSRDARV为IL5序列片段。
SHGMVMCANAEDKSSVELLQ,GAYMQLSRRGGDAAFDEKEV,GGAGGDGGAGGGTGEEE,NGLSVDETIKVTSAGWTKSE,SSSSCCALLQLEKQDLEQSL,FNDSQRQATKDAGTIAGLNV,ALNDPVVYNDRAVSFVALYN,AWDTSVKEWLVDTGKVYAGG,AWDTSVKEWLVDTGKVYAGG,RLTVRGGLQEKEAVKVTANG,SDALEYWKGGLSQFNDKIPP,GRISSYYTSPLLLSGTCSLS,NPSSSATADCRVVTCTQTNT,KASQRDFQLLKHLTRWYNHM,AEVAAACATKASAEAALLTG为抗原基因蛋白预测片段，通过GSG连接，具有较高的免疫原性。
FYPSYHSTPQRP为树突细胞诱导肽，帮助抗原靶向树突细胞，提高抗原被免疫细胞吞噬的可能性。
本发明的融合蛋白通过GSGDDDDK氨基酸序列链接，GSGDDDDK在枯草芽孢杆菌外周蛋白酶切割成独立的活性结构域，利用GSGDDDDK氨基酸柔性序列保护了抗原多肽与白细胞介素5的独立折叠，GSGDDDDK氨基酸序列保障该融合蛋白能够有效的被分泌蛋白酶激酶切割识别。有效地保障了球虫抗原肽/IL5在肠黏膜层释放，抑杀肠道内病原微生物，调节免疫应答，同时，球虫抗原肽/IL5能够通过M细胞调节肠系膜淋巴结(P氏小结)内部的淋巴细胞。
本发明的球虫抗原肽/IL5的基因参照NCBI－gene bank数据库的基因序列。该融合基因能实现融合基因的高效表达，带有自动分割位点，通过自动分割位点的碱基片断连接球虫抗原肽/IL5蛋白，表达后的融合蛋白在肠道里被胰蛋白酶激酶切割成独立的活性结构域。
编码球虫抗原肽/IL5的融合蛋白的碱基序列。
进一步地，所述碱基序列为：
ATGATCCAAAAACGTAAACGTACAGTTTCTTTCCGTCTTGTTCTTATGTGCACACTTCTTTTCGTTTCTCTTCCTATCACAAAAACATCTGCTGCTGTTGGCTCTTCTCGTGTTGATGTTCCTGGCGGCTCTGGCGATGATGATGATAAAATGCGTACACATCTTTACTTCCTTCTTCTTACAGTTGGCATCTCTGCTACACCTCTTCGTTCTAACCTTGCTGAACTTCAAACATGGCTTCAACAAATCTACCAATCTGTTGATATGCTTAACCTTCGTATCGAAACACCTGTTTCTGCTGATGATGAAAACTGCATCAAAACACTTTTCGAAGGCACAGCTCTTCTTAAAAACAACCCTGAAATGCGTCGTTTCGGCACATTCTTCCAATCTTTCGATAAACTTCGTCCTTCTCTTACAGCTCAACTTACAGGCGAAGGCGAATGCGATACAGAACGTAAAAACGTTAAAAAATTCATCGAAAAACTTCGTACATTCATCCGTAAACTTTCTCGTGATGCTCGTGTTGGCTCTGGCGATGATGATGATAAATCTCATGGCATGGTTATGTGCGCTAACGCTGAAGATAAATCTTCTGTTGAACTTCTTCAAGGCTCTGGCGGCGCTTACATGCAACTTTCTCGTCGTGGCGGCGATGCTGCTTTCGATGAAAAAGAAGTTGGCTCTGGCGGCGGCGCTGGCGGCGATGGCGGCGCTGGCGGCGGCACAGGCGGCTCTGGCGAAGAAGAAGGCTCTGGCAACGGCCTTTCTGTTGATGAAACAATCAAAGTTACATCTGCTGGCTGGACAAAATCTGAAGGCTCTGGCTCTTCTTCTTCTTGCTGCGCTCTTCTTCAACTTGAAAAACAAGATCTTGAACAATCTCTTGGCTCTGGCTTCAACGATTCTCAACGTCAAGCTACAAAAGATGCTGGCACAATCGCTGGCCTTAACGTTGGCTCTGGCGCTCTTAACGATCCTGTTGTTTACAACGATCGTGCTGTTTCTTTCGTTGCTCTTTACAACGGCTCTGGCGCTTGGGATACATCTGTTAAAGAATGGCTTGTTGATACAGGCAAAGTTTACGCTGGCGGCGGCTCTGGCGCTTGGGATACATCTGTTAAAGAATGGCTTGTTGATACAGGCAAAGTTTACGCTGGCGGCGGCTCTGGCCGTCTTACAGTTCGTGGCGGCCTTCAAGAAAAAGAAGCTGTTAAAGTTACAGCTAACGGCGGCTCTGGCTCTGATGCTCTTGAATACTGGAAAGGCGGCCTTTCTCAATTCAACGATAAAATCCCTCCTGGCTCTGGCGGCCGTATCTCTTCTTACTACACATCTCCTCTTCTTCTTTCTGGCACATGCTCTCTTTCTGGCTCTGGCAACCCTTCTTCTTCTGCTACAGCTGATTGCCGTGTTGTTACATGCACACAAACAAACACAGGCTCTGGCAAAGCTTCTCAACGTGATTTCCAACTTCTTAAACATCTTACACGTTGGTACAACCATATGGGCTCTGGCGCTGAAGTTGCTGCTGCTTGCGCTACAAAAGCTTCTGCTGAAGCTGCTCTTCTTACAGGCGGCTCTGGCTTCTACCCTTCTTACCATTCTACACCTCAACGTCCT(SEQ ID No.2)。
表达载体，含有编码球虫抗原肽/IL5的融合蛋白的碱基序列或SEQ ID No.2所示的碱基序列。
进一步地，所述的表达载体为质粒plasmid 2021，图谱如图2所示。DNA序列如SEQID No.4所示。该表达质粒能够去除在克隆过程中所使用的amp抗性基因片段。通过ECORⅠ，可实现酶切去除Amp基因。
一种含有上述所述的表达载体的基因工程菌。
进一步地，所述的基因工程菌为枯草芽孢杆菌BS168/wxp，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.24234。该菌株为枯草芽孢杆菌BS168的改进表达分泌型菌株，该菌株将多余的蛋白水解酶基因敲除掉，有利于分泌蛋白的稳定性。其基因型为：nprE aprE epr bpr mpr::ble nprB::bsrΔvpr wprA::hyg cm::neoydcDE::Pxyl-ycdE；NeoR。
本发明的球虫抗原肽/IL5的融合蛋白或上述所述的基因工程菌在制备预防或/和治疗家畜球虫感染药物上的应用。
本发明球虫抗原肽/IL5的融合蛋白基因工程菌的构建方法，包括如下步骤：
1)以SEQ ID No.3所示的DNA片段为模板，以SEQ ID No.5(GCGGTACCGAGCTCGCTCGAG)和SEQ ID No.6(TGCAGCGGCTAGCCCCTCGAGTCA)所示的核苷酸序列为引物，PCR扩增，得到融合基因扩增片段；
2)采用Xho Ⅰ酶酶切载体质粒plasmid 2021与扩增片段，采用同源重组酶将酶切后的载体质粒与扩增片段连接；所述载体质粒plasmid 2021的DNA序列如SEQ ID No.4所示。
3)将连接产物转化大肠杆菌获得阳性克隆子，提取质粒，测序验证后，得到融合基因表达载体。进一步地，步骤2)中，采用Xho Ⅰ酶切。
进一步地，步骤2)中，所述载体为质粒plasmid 2021。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明的融合蛋白对禽球虫具有显著预防和治疗调节作用。食品级枯草芽孢杆菌表达的多肽复合物通过黏膜免疫引起动物肠道的获得性免疫应答，产生抗球虫的抗体。白细胞介素5是嗜酸性粒细胞激活因子，可以激活肠道的嗜酸性粒细胞，分泌抗寄生虫活性物质，修复由于球虫感染引起的肠道黏膜受损。
本发明的重组球虫抗原肽/IL5枯草芽孢杆菌不含任何抗性基因，符合农业部转基因工程菌的新产品认证要求。该菌可以在肠道定殖，持续表达抗原片段及免疫激活多肽，核心功能为预防球虫感染，作为类似口服疫苗的产品，具有使用方便，可以在饲料及饮水中作为日常添加。
附图说明
图1：为PCR片段电泳图片，重组质粒构建图片；M0：marker DL5000；M1：重组基因Ct-AMP1与载体质粒，M2：构建好的融合基因质粒；
图2：plasmid 2021质粒图谱；
图3：嵌合体抗原结构分析；
图4：为重组融合蛋白亲水性分析；
图5：禽抗球虫实验肉鸡存活对比；
图6：禽抗球虫实验肉鸡平均重量对比；
图7：禽抗球虫实验肉鸡相对增重率对比；
图8：禽抗球虫实验肉鸡抗球虫抗体效价对比。
具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为从商业渠道购买得到的。
本发明用到的生物材料
质粒plasmid 2021来自于pHT43，具有amp抗性，改造主要是在amp的两端引入ECORI酶切位点。在大肠杆菌克隆完成后可以通过ECOR I酶切，去掉氨苄抗性基因，从而在芽孢杆菌电转化后无抗性基因残留其中。质粒图谱见图2，其核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BS168/wxp，于2022年1月4日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.24234。
实施例1
球虫抗原肽/IL5的融合蛋白，氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，通过球虫抗原肽/IL5的融合基因的表达得到。该氨基酸序列中：
MIQKRKRTVSFRLVLMCTLLFVSLPITKTSAAVGSSRVDVPG为信号肽序列。
MRTHLYFLLLTVGISATPLRSNLAELQTWLQQIYQSVDMLNLRIETPVSADDENCIKTLFEGTALLKNNPEMRRFGTFFQSFDKLRPSLTAQLTGEGECDTERKNVKKFIEKLRTFIRKLSRDARV为IL5序列片段。
SHGMVMCANAEDKSSVELLQ,GAYMQLSRRGGDAAFDEKEV,GGAGGDGGAGGGTGEEE,NGLSVDETIKVTSAGWTKSE,SSSSCCALLQLEKQDLEQSL,FNDSQRQATKDAGTIAGLNV,ALNDPVVYNDRAVSFVALYN,AWDTSVKEWLVDTGKVYAGG,AWDTSVKEWLVDTGKVYAGG,RLTVRGGLQEKEAVKVTANG,SDALEYWKGGLSQFNDKIPP,GRISSYYTSPLLLSGTCSLS,NPSSSATADCRVVTCTQTNT,KASQRDFQLLKHLTRWYNHM,AEVAAACATKASAEAALLTG为抗原基因蛋白预测片段，通过GSG连接，具有较高的免疫原性。
FYPSYHSTPQRP为树突细胞诱导肽，帮助抗原靶向树突细胞，提高抗原被免疫细胞吞噬的可能性。
球虫抗原肽/IL5的基因参照NCBI－gene bank数据库的基因序列。该融合基因能实现融合基因的高效表达，带有自动分割位点，通过自动分割位点的碱基片断连接球虫抗原肽/IL5蛋白，表达后的融合蛋白在肠道里被胰蛋白酶激酶切割成独立的活性结构域。
实施例2编码球虫抗原肽/IL5的融合蛋白的融合基因的合成
编码球虫抗原肽/IL5的融合蛋白的融合基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
当将真核基因克隆在原核生物中表达时，需将真核生物偏爱的密码子改为原核生物(枯草芽孢杆菌)偏爱的密码子，才能实现高效表达。本发明根据相应细胞的密码子偏好性对基因序列进行密码子优化，设计得到核苷酸序列SEQ ID No.2。
本实施例的融合基因以脱氧核糖核苷酸为底物，在DNA合成仪上合成目标序列的核苷酸片段。
实施例3球虫抗原肽/IL5的融合蛋白编码基因表达载体的构建
为了与质粒载体连接，在编码序列上下游分别设计了同源臂序列和酶切位点。即在SEQ ID No.2所述核苷酸序列的上游增加GCGGTACCGAGCTCGCTCGAG，在下游增加TGACTCGAGGGGCTAGCCGCTGCA。改进后的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。在DNA合成仪上合成目标序列的核苷酸片段。
1)以SEQ ID No.3所示的DNA片段为模板，以SEQ ID No.5
(GCGGTACCGAGCTCGCTCGAG)和SEQ ID No.6
(TGCAGCGGCTAGCCCCTCGAGTCA)所示的核苷酸序列为引物，PCR扩增，得到融合基因扩增片段；
2)采用XhoⅠ酶酶切载体质粒plasmid 2021与扩增片段，采用同源重组酶将酶切后的载体质粒与扩增片段连接；所述载体质粒plasmid 2021的DNA序列如SEQ ID No.4所示。
3)将连接产物转化大肠杆菌获得阳性克隆子，提取质粒，测序验证后，得到融合基因表达载体。
PCR扩增条件：
94℃1min
(94℃10s，52℃10s，68℃10s)5cycles
(94℃10s，68℃15s)30cycles
68℃1min
酶切体系：Xho Ⅰ酶切Q buffer(购自Fermentals)1μL Xho Ⅰ，10μL 2X Q buffer，9μL ddH2O 16℃10min。
实施例4重组球虫抗原肽/IL5枯草芽孢杆菌的构建
将实施例3得到的融合基因的表达载体用EcoR Ⅰ酶切，酶切后的片段电泳分离，大片段继续用T4连接酶连接后得到无抗性基因残留的质粒与融合蛋白基因，然后电转枯草芽孢杆菌BS168/wxp，该菌株保藏编号为CGMCC No.24234。该菌株由BS168枯草芽孢杆菌驯化得到，其主要特点是芽孢萌发加速，2-3小时即可见到菌体。
实验试剂：
GM:LB+0.5M山梨醇
ETM:0.5M山梨醇，0.5M甘露醇，10％甘油
RM：LB+0.5M山梨醇+0.38甘露醇
电转仪：新芝基因导入仪
电转具体方法如下：
1)新鲜平板挑枯草芽孢杆菌BS168/wxp单菌落(小一点为好)接种于5ml LB培养基中，过夜培养。
2)测量摇管内OD，控制好接种量，使接种完毕后培养基的OD在0.19-0.2之间。培养基为
50mlGM。37℃，200rpm培养至OD600＝1.0(大约3-4小时)左右。
3)取全部菌液冰水浴10min，然后5000rpm 8min 4℃离心收集菌体。
4)用40ml预冷的电转缓冲液ETM洗涤菌体，5000rpm，8min，4℃离心去上清，如此漂洗3次。
5)将洗涤后的菌体重悬于等500μl的ETM中，每管分装60μl。
6)将60μl感受态细胞中加入1-6μl质粒，冰浴孵育5min，加入预冷的电转杯(1mm)中，电击一次。电转仪设置：2.0kv,25μF200Ω，1mm,电击1次.(持续时间4.5ms-5ms之间)
7)电击完毕立即加入1ml复苏培养基RM，37℃，200rpm，复苏3h后，涂板。37℃，过夜培养。
实施例5：重组球虫抗原肽/IL5枯草芽孢杆菌的生产工艺
菌种转生产种子
培养基：
(1)LB培养基：蛋白胨10g，酵母膏5g，NaCl 10g，蒸馏水1000ml，pH为7，(可溶性淀粉20g)琼脂20g。
(2)种子培养基：LB培养基+K2HPO4 0.8％，pH：7.0-7.5。
培养条件：
转速220转每分，温度37-39℃；
培养时间：8-12小时；
表1
Figure GDA0003943405890000081
种子培养超过12小时，菌种形态变短，部分自融(抗菌肽低表达积累)，部分转芽孢，整体菌数下降，不利于接种。
液体发酵：
大罐发酵培养基1：LB培养基：工业蛋白胨10g，工业酵母膏5g，工业NaCl 10g，工业葡萄糖2-5g蒸馏水1000ml，pH为7。
大罐发酵培养基2：豆饼粉5.6％，玉米粉7.2％，K2HPO4 0.8％，(NH4)2SO4 0.4％，NH4Cl 0.13％，CaCl2 0.13％，MnSO4 0.2％，MgSO4 0.2％；
大罐发酵培养基1用于固体发酵所需液体菌种，发酵时间一般为12-16小时，根据菌体生长状态调节；
大罐发酵培养基2主要用于直接发酵，用于诱导芽孢形成，培养时间一般为24-36小时。罐压：0.05MPa，通气量/培养量＝1:1.2～1:1.5(L/分钟：/L)。
实施例6：
实验单位：成都市华科生物学研究中心
实验分组情况：
表2
Figure GDA0003943405890000091
饲养条件：
严格按照肉鸡饲养管理与质量控制技术饲喂流程，重组球虫抗原肽/IL5枯草芽孢杆菌添加剂量为每吨料添加1kg，饲料中无任何抗生素及药品添加。攻毒毒株柔嫩艾美耳球虫来源于球虫及坏死性肠炎高发病鸡场。
实验时间：2019.09.10—2019.10.10
主要观察指标：
添加组及攻毒组存活率；
2，各组在饲养周期内增重情况；
实验结果：
存活率统计：
表3：饲喂四周小鸡存活数率
Figure GDA0003943405890000092
Figure GDA0003943405890000101
从表3及图5可以看出，采用无抗饲料，小鸡自然死亡率达到16％，而添加重组球虫抗原肽/IL5枯草芽孢杆菌的阳性对照组死亡率仅4％。在攻毒后，无添加组存活率仅为30％，用于发病后的治疗组存活率为52％。
表4：各组不同时间相对增重比值及差异标注
Figure GDA0003943405890000102
从表4及图6、图7可以看出，与阴性对照组相比，添加重组球虫抗原肽/IL5枯草芽孢杆菌的组在第一周体重即有显著增加。在实验最后，1日龄开始持续添加的两组体重超过对照组约10％，而15日龄及以后添加的攻毒组体重较对照组减少15-20％。1日龄开始添加组较15日龄及攻毒以后添加组体重相差30％以上。
表5通过球虫抗体检测试剂盒检测艾美耳球虫的抗体保护水平
抗体效价 14天 29天
C-/- 0.578 0.698
C+/- 0.67 4.356
S1-/+ 0.78 4.987
S2+/+ 0.778 8.95
S3+/+ 0.663 6.432
S4+/+ 0.478 6.896
抗体水平S2组最高，主要是由于1日龄预防使用本产品，在15日龄攻毒，相当于二次加强接种，因此抗体水平最高，如图8所示。C+/-组能有效的产生抗体。抗体水平略低于野毒攻毒产生的水平。同时与球虫抗原攻毒使用，可以有效的保护感染期的损伤。
上述实验说明：重组球虫抗原肽/IL5枯草芽孢杆菌具有促进肉鸡生长的性能，与球虫发病组差异可达30％；重组球虫抗原肽/IL5枯草芽孢杆菌在1日龄开始添加对预防球虫及腹泻有显著效果，保护率可达94％；重组球虫抗原肽/IL5枯草芽孢杆菌对于治疗经球虫感染发病的效果一般，保护率仅为52％；重组球虫抗原肽/IL5枯草芽孢杆菌对于预防交叉感染及控制球虫传播保护率可达74％；重组球虫抗原肽/IL5枯草芽孢杆菌能诱导机体产生大量保护性抗体，有效保护禽球虫感染。
本发明的重组球虫抗原肽/IL5枯草芽孢杆菌不含任何抗性基因，符合农业部转基因工程菌的新产品认证要求。该菌可以在肠道定殖，持续表达抗原片段及免疫激活多肽，核心功能为预防球虫感染，作为类似口服疫苗的产品，具有使用方便，可以在饲料及饮水中作为日常添加。
序列表
<110> 魏于清
<120> 球虫抗原肽/IL5的融合蛋白基因工程菌的制备及用途
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 541
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Ile Gln Lys Arg Lys Arg Thr Val Ser Phe Arg Leu Val Leu Met
1 5 10 15
Cys Thr Leu Leu Phe Val Ser Leu Pro Ile Thr Lys Thr Ser Ala Ala
20 25 30
Val Gly Ser Ser Arg Val Asp Val Pro Gly Gly Ser Gly Asp Asp Asp
35 40 45
Asp Lys Met Arg Thr His Leu Tyr Phe Leu Leu Leu Thr Val Gly Ile
50 55 60
Ser Ala Thr Pro Leu Arg Ser Asn Leu Ala Glu Leu Gln Thr Trp Leu
65 70 75 80
Gln Gln Ile Tyr Gln Ser Val Asp Met Leu Asn Leu Arg Ile Glu Thr
85 90 95
Pro Val Ser Ala Asp Asp Glu Asn Cys Ile Lys Thr Leu Phe Glu Gly
100 105 110
Thr Ala Leu Leu Lys Asn Asn Pro Glu Met Arg Arg Phe Gly Thr Phe
115 120 125
Phe Gln Ser Phe Asp Lys Leu Arg Pro Ser Leu Thr Ala Gln Leu Thr
130 135 140
Gly Glu Gly Glu Cys Asp Thr Glu Arg Lys Asn Val Lys Lys Phe Ile
145 150 155 160
Glu Lys Leu Arg Thr Phe Ile Arg Lys Leu Ser Arg Asp Ala Arg Val
165 170 175
Gly Ser Gly Asp Asp Asp Asp Lys Ser His Gly Met Val Met Cys Ala
180 185 190
Asn Ala Glu Asp Lys Ser Ser Val Glu Leu Leu Gln Gly Ser Gly Gly
195 200 205
Ala Tyr Met Gln Leu Ser Arg Arg Gly Gly Asp Ala Ala Phe Asp Glu
210 215 220
Lys Glu Val Gly Ser Gly Gly Gly Ala Gly Gly Asp Gly Gly Ala Gly
225 230 235 240
Gly Gly Thr Gly Gly Ser Gly Glu Glu Glu Gly Ser Gly Asn Gly Leu
245 250 255
Ser Val Asp Glu Thr Ile Lys Val Thr Ser Ala Gly Trp Thr Lys Ser
260 265 270
Glu Gly Ser Gly Ser Ser Ser Ser Cys Cys Ala Leu Leu Gln Leu Glu
275 280 285
Lys Gln Asp Leu Glu Gln Ser Leu Gly Ser Gly Phe Asn Asp Ser Gln
290 295 300
Arg Gln Ala Thr Lys Asp Ala Gly Thr Ile Ala Gly Leu Asn Val Gly
305 310 315 320
Ser Gly Ala Leu Asn Asp Pro Val Val Tyr Asn Asp Arg Ala Val Ser
325 330 335
Phe Val Ala Leu Tyr Asn Gly Ser Gly Ala Trp Asp Thr Ser Val Lys
340 345 350
Glu Trp Leu Val Asp Thr Gly Lys Val Tyr Ala Gly Gly Gly Ser Gly
355 360 365
Ala Trp Asp Thr Ser Val Lys Glu Trp Leu Val Asp Thr Gly Lys Val
370 375 380
Tyr Ala Gly Gly Gly Ser Gly Arg Leu Thr Val Arg Gly Gly Leu Gln
385 390 395 400
Glu Lys Glu Ala Val Lys Val Thr Ala Asn Gly Gly Ser Gly Ser Asp
405 410 415
Ala Leu Glu Tyr Trp Lys Gly Gly Leu Ser Gln Phe Asn Asp Lys Ile
420 425 430
Pro Pro Gly Ser Gly Gly Arg Ile Ser Ser Tyr Tyr Thr Ser Pro Leu
435 440 445
Leu Leu Ser Gly Thr Cys Ser Leu Ser Gly Ser Gly Asn Pro Ser Ser
450 455 460
Ser Ala Thr Ala Asp Cys Arg Val Val Thr Cys Thr Gln Thr Asn Thr
465 470 475 480
Gly Ser Gly Lys Ala Ser Gln Arg Asp Phe Gln Leu Leu Lys His Leu
485 490 495
Thr Arg Trp Tyr Asn His Met Gly Ser Gly Ala Glu Val Ala Ala Ala
500 505 510
Cys Ala Thr Lys Ala Ser Ala Glu Ala Ala Leu Leu Thr Gly Gly Ser
515 520 525
Gly Phe Tyr Pro Ser Tyr His Ser Thr Pro Gln Arg Pro
530 535 540
<210> 2
<211> 1623
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgatccaaa aacgtaaacg tacagtttct ttccgtcttg ttcttatgtg cacacttctt 60
ttcgtttctc ttcctatcac aaaaacatct gctgctgttg gctcttctcg tgttgatgtt 120
cctggcggct ctggcgatga tgatgataaa atgcgtacac atctttactt ccttcttctt 180
acagttggca tctctgctac acctcttcgt tctaaccttg ctgaacttca aacatggctt 240
caacaaatct accaatctgt tgatatgctt aaccttcgta tcgaaacacc tgtttctgct 300
gatgatgaaa actgcatcaa aacacttttc gaaggcacag ctcttcttaa aaacaaccct 360
gaaatgcgtc gtttcggcac attcttccaa tctttcgata aacttcgtcc ttctcttaca 420
gctcaactta caggcgaagg cgaatgcgat acagaacgta aaaacgttaa aaaattcatc 480
gaaaaacttc gtacattcat ccgtaaactt tctcgtgatg ctcgtgttgg ctctggcgat 540
gatgatgata aatctcatgg catggttatg tgcgctaacg ctgaagataa atcttctgtt 600
gaacttcttc aaggctctgg cggcgcttac atgcaacttt ctcgtcgtgg cggcgatgct 660
gctttcgatg aaaaagaagt tggctctggc ggcggcgctg gcggcgatgg cggcgctggc 720
ggcggcacag gcggctctgg cgaagaagaa ggctctggca acggcctttc tgttgatgaa 780
acaatcaaag ttacatctgc tggctggaca aaatctgaag gctctggctc ttcttcttct 840
tgctgcgctc ttcttcaact tgaaaaacaa gatcttgaac aatctcttgg ctctggcttc 900
aacgattctc aacgtcaagc tacaaaagat gctggcacaa tcgctggcct taacgttggc 960
tctggcgctc ttaacgatcc tgttgtttac aacgatcgtg ctgtttcttt cgttgctctt 1020
tacaacggct ctggcgcttg ggatacatct gttaaagaat ggcttgttga tacaggcaaa 1080
gtttacgctg gcggcggctc tggcgcttgg gatacatctg ttaaagaatg gcttgttgat 1140
acaggcaaag tttacgctgg cggcggctct ggccgtctta cagttcgtgg cggccttcaa 1200
gaaaaagaag ctgttaaagt tacagctaac ggcggctctg gctctgatgc tcttgaatac 1260
tggaaaggcg gcctttctca attcaacgat aaaatccctc ctggctctgg cggccgtatc 1320
tcttcttact acacatctcc tcttcttctt tctggcacat gctctctttc tggctctggc 1380
aacccttctt cttctgctac agctgattgc cgtgttgtta catgcacaca aacaaacaca 1440
ggctctggca aagcttctca acgtgatttc caacttctta aacatcttac acgttggtac 1500
aaccatatgg gctctggcgc tgaagttgct gctgcttgcg ctacaaaagc ttctgctgaa 1560
gctgctcttc ttacaggcgg ctctggcttc tacccttctt accattctac acctcaacgt 1620
cct 1623
<210> 3
<211> 1668
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gcggtaccga gctcgctcga gatgatccaa aaacgtaaac gtacagtttc tttccgtctt 60
gttcttatgt gcacacttct tttcgtttct cttcctatca caaaaacatc tgctgctgtt 120
ggctcttctc gtgttgatgt tcctggcggc tctggcgatg atgatgataa aatgcgtaca 180
catctttact tccttcttct tacagttggc atctctgcta cacctcttcg ttctaacctt 240
gctgaacttc aaacatggct tcaacaaatc taccaatctg ttgatatgct taaccttcgt 300
atcgaaacac ctgtttctgc tgatgatgaa aactgcatca aaacactttt cgaaggcaca 360
gctcttctta aaaacaaccc tgaaatgcgt cgtttcggca cattcttcca atctttcgat 420
aaacttcgtc cttctcttac agctcaactt acaggcgaag gcgaatgcga tacagaacgt 480
aaaaacgtta aaaaattcat cgaaaaactt cgtacattca tccgtaaact ttctcgtgat 540
gctcgtgttg gctctggcga tgatgatgat aaatctcatg gcatggttat gtgcgctaac 600
gctgaagata aatcttctgt tgaacttctt caaggctctg gcggcgctta catgcaactt 660
tctcgtcgtg gcggcgatgc tgctttcgat gaaaaagaag ttggctctgg cggcggcgct 720
ggcggcgatg gcggcgctgg cggcggcaca ggcggctctg gcgaagaaga aggctctggc 780
aacggccttt ctgttgatga aacaatcaaa gttacatctg ctggctggac aaaatctgaa 840
ggctctggct cttcttcttc ttgctgcgct cttcttcaac ttgaaaaaca agatcttgaa 900
caatctcttg gctctggctt caacgattct caacgtcaag ctacaaaaga tgctggcaca 960
atcgctggcc ttaacgttgg ctctggcgct cttaacgatc ctgttgttta caacgatcgt 1020
gctgtttctt tcgttgctct ttacaacggc tctggcgctt gggatacatc tgttaaagaa 1080
tggcttgttg atacaggcaa agtttacgct ggcggcggct ctggcgcttg ggatacatct 1140
gttaaagaat ggcttgttga tacaggcaaa gtttacgctg gcggcggctc tggccgtctt 1200
acagttcgtg gcggccttca agaaaaagaa gctgttaaag ttacagctaa cggcggctct 1260
ggctctgatg ctcttgaata ctggaaaggc ggcctttctc aattcaacga taaaatccct 1320
cctggctctg gcggccgtat ctcttcttac tacacatctc ctcttcttct ttctggcaca 1380
tgctctcttt ctggctctgg caacccttct tcttctgcta cagctgattg ccgtgttgtt 1440
acatgcacac aaacaaacac aggctctggc aaagcttctc aacgtgattt ccaacttctt 1500
aaacatctta cacgttggta caaccatatg ggctctggcg ctgaagttgc tgctgcttgc 1560
gctacaaaag cttctgctga agctgctctt cttacaggcg gctctggctt ctacccttct 1620
taccattcta cacctcaacg tccttgactc gaggggctag ccgctgca 1668
<210> 4
<211> 4718
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60
cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120
ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180
accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240
attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300
tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360
tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt ccttaaggaa cgtacagacg 420
gcttaaaagc ctttaaaaac gtttttaagg ggtttgtaga caaggtaaag gataaaacag 480
cacaattcca agaaaaacac gatttagaac ctaaaaagaa cgaatttgaa ctaactcata 540
accgagaggt aaaaaaagaa cgaagtcgag atcagggaat gagtttataa aataaaaaaa 600
gcacctgaaa aggtgtcttt ttttgatggt tttgaacttg ttctttctta tcttgataca 660
tatagaaata acgtcatttt tattttagtt gctgaaaggt gcgttgaagt gttggtatgt 720
atgtgtttta aagtattgaa aacccttaaa attggtacga tgacctctaa taattgttaa 780
tcatgttggt tacgtattta ttaacttctc ctagtattag taattatcat ggctgtcatg 840
gcgcattaac ggaataaagg gtgtgcttaa atcgggccat tttgcgtaat aagaaaaagg 900
attaattatg agcgaattga attaataata aggtaataga tttacattag aaaatgaaag 960
gggattttat gcgtgagaat gttacagtct atcccggcat tgccagtcgg ggatattaaa 1020
aagagtatag gtttttattg ggataaagta ggtttcactt tggttcacca tgaagatgga 1080
ttcgcagttc taatgtgtaa tgaggttcgg attcatctat gggaggcaag tgatgaaggc 1140
tggcgcctcg tagtaatgat tcaccggttt gtacaggtgc ggagtcgttt attgctggta 1200
ctgctagttg ccgcattgaa gtagagggaa ttgatgaatt atatcaacat attaagcctt 1260
tgggcatttt gcaccccaat acatcattaa aagatcagtg gtgggatgaa cgagactttg 1320
cagtaattga tcccgacaac aatttgatta gcttttttca acaaataaaa agctaaaatc 1380
tattattaat ctgttcagca atcgggcgcg attgctgaat aaaagatacg agagacctct 1440
cttgtatctt ttttattttg agtggttttg tccgttacac tagaaaaccg aaagacaata 1500
aaaattttat tcttgctgag tctggctttc ggtaagctag acaaaacgga caaaataaaa 1560
attggcaagg gtttaaaggt ggagattttt tgagtgatct tctcaaaaaa tactacctgt 1620
cccttgctga tttttaaacg agcacgagag caaaaccccc ctttgctgag gtggcagagg 1680
gcaggttttt ttgtttcttt tttctcgtaa aaaaaagaaa ggtcttaaag gttttatggt 1740
tttggtcggc actgccgcgc ctcgcagagc acacacttta tgaatataaa gtatagtgtg 1800
ttatacttta cttggaagtg gttgccggaa agagcgaaaa tgcctcacat ttgtgccacc 1860
taaaaaggag cgatttacat atgagttatg cagtttgtag aatgcaaaaa gtgaaatcag 1920
ctggactaaa aggcatgcaa tttcataatc aaagagagcg aaaaagtaga acgaatgatg 1980
atattgacca tgagcgaaca cgtgaaaatt atgatttgaa aaatgataaa aatattgatt 2040
acaacgaacg tgtcaaagaa attattgaat cacaaaaaac aggtacaaga aaaacgagga 2100
aagatgctgt tcttgtaaat gagttgctag taacatctga ccgagatttt tttgagcaac 2160
tggatcctga taggtggtat gttttcgctt gaacttttaa atacagccat tgaacatacg 2220
gttgatttaa taactgacaa acatcaccct cttgctaaag cggccaagga cgctgccgcc 2280
ggggctgttt gcgtttttgc cgtgatttcg tgtatcattg gtttacttat ttttttgcca 2340
aagctgtaat ggctgaaaat tcttacattt attttacatt tttagaaatg ggcgtgaaaa 2400
aaagcgcgcg attatgtaaa atataaagtg atagcggtac cgagctcgct cgaggggcta 2460
gccgctgcag ttgaattcaa gcttggcgta atcatggtca tagctgtttc ctgtgtgaaa 2520
ttgttatccg ctcacaattc cacacaacat acgagccgga agcataaagt gtaaagcctg 2580
gggtgcctaa tgagtgagct aactcacatt aattgcgttg cgctcactgc ccgctttcca 2640
gtcgggaaac ctgtcgtgcc agctgcatta atgaatcggc caacgcgcgg ggagaggcgg 2700
tttgcgtatt gggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct cggtcgttcg 2760
gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca cagaatcagg 2820
ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa 2880
ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg 2940
acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg cgtttccccc 3000
tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc 3060
ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt atctcagttc 3120
ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg 3180
ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc 3240
actggcagca gccactggta acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga 3300
gttcttgaag tggtggccta actacggcta cactagaaga acagtatttg gtatctgcgc 3360
tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg gcaaacaaac 3420
caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg 3480
atctcaagaa gatcctttga tcttttctac ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc 3540
acgttaaggg attttggtca tgagattatc aaaaaggatc ttcacctaga tccttttaaa 3600
ttaaaaatga agttttaaat caatctaaag tatatatgag taaacttggt ctgacagtta 3660
ccaatgctta atcagtgagg cacctatctc agcgatctgt ctatttcgtt catccatagt 3720
tgcctgactc cccgtcgtgt agataactac gatacgggag ggcttaccat ctggccccag 3780
tgctgcaatg ataccgcgag acccacgctc accggctcca gatttatcag caataaacca 3840
gccagccgga agggccgagc gcagaagtgg tcctgcaact ttatccgcct ccatccagtc 3900
tattaattgt tgccgggaag ctagagtaag tagttcgcca gttaatagtt tgcgcaacgt 3960
tgttgccatt gctacaggca tcgtggtgtc acgctcgtcg tttggtatgg cttcattcag 4020
ctccggttcc caacgatcaa ggcgagttac atgatccccc atgttgtgca aaaaagcggt 4080
tagctccttc ggtcctccga tcgttgtcag aagtaagttg gccgcagtgt tatcactcat 4140
ggttatggca gcactgcata attctcttac tgtcatgcca tccgtaagat gcttttctgt 4200
gactggtgag tactcaacca agtcattctg agaatagtgt atgcggcgac cgagttgctc 4260
ttgcccggcg tcaatacggg ataataccgc gccacatagc agaactttaa aagtgctcat 4320
cattggaaaa cgttcttcgg ggcgaaaact ctcaaggatc ttaccgctgt tgagatccag 4380
ttcgatgtaa cccactcgtg cacccaactg atcttcagca tcttttactt tcaccagcgt 4440
ttctgggtga gcaaaaacag gaaggcaaaa tgccgcaaaa aagggaataa gggcgacacg 4500
gaaatgttga atactcatac tcttcctttt tcaatattat tgaagcattt atcagggtta 4560
ttgtctcatg agcggataca tatttgaatg tatttagaaa aataaacaaa taggggttcc 4620
gcgcacattt ccccgaaaag tgccacctga cgtctaagaa accattatta tcatgacatt 4680
aacctataaa aataggcgta tcacgaggcc ctttcgtc 4718
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gcggtaccga gctcgctcga g 21
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tgcagcggct agcccctcga gtca 24

Claims (9)

1.球虫抗原肽/IL5的融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.编码权利要求1所述的融合蛋白的多核苷酸。
3.根据权利要求2所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸的序列 如SEQ ID No.2所示。
4.表达载体，含有权利要求2或3所述的多核苷酸。
5.根据权利要求4所述的表达载体，其特征在于，所述的表达载体为含有权利要求2或3所述的多核苷酸的质粒plasmid 2021，质粒plasmid 2021的DNA序列如SEQ ID No.4所示。
6.一种含有权利要求5所述的表达载体的基因工程菌。
7.根据权利要求6所述的基因工程菌，其特征在于，所述的基因工程菌为含有权利要求5所述的表达载体的枯草芽孢杆菌BS168/wxp，所述枯草芽孢杆菌BS168/wxp的保藏编号为CGMCC No.24234。
8.权利要求1所述的球虫抗原肽/IL5的融合蛋白或权利要求7所述的基因工程菌在制备预防或/和治疗鸡球虫感染药物上的应用。
9.球虫抗原肽/IL5的融合蛋白基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）以SEQ ID No.3所示的DNA片段为模板，以SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示的核苷酸序列为引物，PCR扩增，得到融合基因扩增片段；
2）采用XhoⅠ酶酶切载体质粒plasmid 2021与扩增片段，采用同源重组酶将酶切后的载体质粒与扩增片段连接；
3）将连接产物转化大肠杆菌获得阳性克隆子，提取质粒，测序验证后，得到所述融合基因的表达载体；
4）用EcoRⅠ酶切步骤3）得到的表达载体，酶切后的片段电泳分离，大片段用T4连接酶连接后得到无抗性基因残留的质粒与融合蛋白基因，然后电转枯草芽孢杆菌BS168/wxp；
所述质粒plasmid 2021的DNA序列如SEQ ID No.4所示，枯草芽孢杆菌BS168/wxp保藏编号为CGMCC No.24234。
CN202210253988.7A 2022-03-15 2022-03-15 球虫抗原肽/il5的融合蛋白基因工程菌的制备及用途 Active CN114736308B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210253988.7A CN114736308B (zh) 2022-03-15 2022-03-15 球虫抗原肽/il5的融合蛋白基因工程菌的制备及用途

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210253988.7A CN114736308B (zh) 2022-03-15 2022-03-15 球虫抗原肽/il5的融合蛋白基因工程菌的制备及用途

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114736308A CN114736308A (zh) 2022-07-12
CN114736308B true CN114736308B (zh) 2022-12-27

Family

ID=82276328

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210253988.7A Active CN114736308B (zh) 2022-03-15 2022-03-15 球虫抗原肽/il5的融合蛋白基因工程菌的制备及用途

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114736308B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116254214A (zh) * 2022-12-29 2023-06-13 佛山科学技术学院 一种枯草芽孢杆菌重组菌株及其制备方法和应用

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ZA200400479B (en) * 2001-07-06 2006-05-31 Abic Biolog Lab Teva Nucleic acids encoding recombinant 56 a 82 KDA antigens from gametocytes of Eimeria maxima and their use
TW201247700A (en) * 2011-05-05 2012-12-01 Baylor Res Inst Immunoglobulin-like transcript (ILT) receptors as CD8 antagonists
AU2017316649A1 (en) * 2016-08-23 2019-03-07 The Regents Of The University Of California Proteolytically cleavable chimeric polypeptides and methods of use thereof
CN108948163B (zh) * 2018-08-01 2020-11-06 四川百可馨生物制药有限公司 澳洲坚果植物防御素及其应用
CN114702597B (zh) * 2022-03-15 2023-07-04 五康生物科技股份有限公司 表达植物抗菌肽Ct-AMP1的工程菌构建与应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN114736308A (zh) 2022-07-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN109706185B (zh) 基于碱基编辑系统突变起始密码子实现基因敲除的方法及应用
CN108410787A (zh) 一种合成乳酰-n-新四糖的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用
CN107557388A (zh) 一种用于car‑t制备的慢病毒载体及其构建方法和应用
CN114702597B (zh) 表达植物抗菌肽Ct-AMP1的工程菌构建与应用
CN108949693A (zh) 一种对t细胞免疫检测点通路进行基因敲除的方法及应用
CN114736308B (zh) 球虫抗原肽/il5的融合蛋白基因工程菌的制备及用途
CN113943720A (zh) 一种绿盲蝽GRK基因、其dsRNA及其合成方法和应用
CN110938651A (zh) 靶向打靶载体及靶向整合外源基因至小鼠f4/80外显子22位点构建bac克隆的方法和应用
CN114853901B (zh) 表达抗菌肽afp1融合蛋白的工程菌构建与应用
CN111500641A (zh) 转人神经生长因子基因猪的制备方法
US20010010928A1 (en) Protozoan expression system
CN114410559B (zh) 一种钝化重金属的地杆菌工程菌株及其构建方法
CN107287201B (zh) 一种强广谱启动子及其应用
KR100721140B1 (ko) 류코노스톡과 대장균에서 상호복제가 가능한 셔틀벡터
KR102009273B1 (ko) 구제역 taw97 주의 방어 항원이 발현되는 재조합 바이러스
CN101899465A (zh) 一种重组j亚群禽白血病病毒感染性克隆质粒及其制备方法和应用
KR101535070B1 (ko) 혈관성장인자 유전자의 형질전환을 위한 재조합 발현 벡터 및 이를 이용한 혈관성장인자 발현 줄기세포주
CN113293155A (zh) 一种几丁二糖脱乙酰酶突变体及应用
CN109852589A (zh) 一种建兰花叶病毒株系的克隆及其转录载体构建
CN107751545A (zh) 大肠杆菌素或能表现大肠杆菌的微生物用于制备增肉剂的用途
CN114181939B (zh) 一种表达na4蛋白和荧光标签的重组球虫载体及其检测方法
CN113846116B (zh) 一种提高酿酒酵母中花青素合成效率的方法
KR20170017115A (ko) 단백질분해효소억제제, 역전사효소억제제 및 통합효소억제제 내성도 동시 예측을 위한 유전형 및 표현형검사법
KR101891602B1 (ko) 구제역 o형 한국발생주 sea 지역형 및 me-sa 지역형의 방어항원이 동시에 발현되는 재조합 바이러스
CN110129366A (zh) 一种载体组合及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
TA01 Transfer of patent application right
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20220831

Address after: No.1109, 11th floor, building 8, no.388, north section of Yizhou Avenue, hi tech Zone, Chengdu, Sichuan 610000

Applicant after: Sichuan yimeikang Technology Co.,Ltd.

Address before: 610000 No.9, guojiaqiao West Street, Wuhou District, Chengdu, Sichuan Province

Applicant before: Wei Yuqing

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant