CN107557388A - 一种用于car‑t制备的慢病毒载体及其构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了用于CAR‑T细胞制备的慢病毒载体及其构建方法和在制备抗肿瘤细胞制品中的应用，同时本发明还建立了荧光定量PCR检测病毒滴度的方法，为临床应用提供了检测标准。本发明提供的慢病毒载体具有长度小，在T细胞中能够稳定、高效表达CAR基因，在病毒包装细胞如HEK293T中可以包装出高滴度的慢病毒、不含GFP、Neomycin等与治疗无关的基因。经实验验证，该慢病毒载体适用于CAR‑T研究和临床应用。

Description

一种用于CAR-T制备的慢病毒载体及其构建方法和应用

技术领域

本发明涉及细胞免疫治疗领域，具体涉及一种用于CAR-T制备的慢病毒载体及其构建方法和应用。

背景技术

免疫细胞治疗技术是近几年出现的最新的治疗肿瘤的技术，和现有的手术、放疗、化疗、靶向治疗相比，具有自身不可替代的优势和发展潜力，因此，被称为肿瘤治疗的第五大技术。免疫细胞治疗主要包括传统的CIK(Cytokine Induced Killer cells，0CIK)、DC-CIK(Dendritic Cells，DC)和最新的CAR-T技术。CAR-T技术，全称为嵌合抗原受体T细胞技术(Chimeric Antigen Receptor T cells，CAR-T)，CAR主要结构包括细胞外结合肿瘤相关抗原(Tumor Associated Antigen，TAA)的单链抗体结构域和细胞胞浆内活化T细胞的CD28协同刺激信号和CD3ζ信号，该组合的基因工程设计的序列，克隆入慢病毒载体，包装为慢病毒，感染肿瘤患者的T细胞，就制备成功CAR-T，CAR-T回输肿瘤患者后，T细胞表面的单链抗体识别肿瘤细胞TAA，进而活化T细胞，活化的T细胞杀死识别的肿瘤细胞。CAR-T技术从2011年取得突破性进展以来，在白血病和淋巴瘤的大量临床试验中，对白血病取得了93％的缓解率，对淋巴瘤取得了47％的缓解率，对于肺癌、肝癌、胃癌等实体肿瘤，正在进行不同设计、不同临床实施方法的临床试验，逐渐将会报道振奋人心的结果。

在CAR-T技术的实施中，最为关键的是慢病毒载体的构建，尽管慢病毒载体的研究有了很大进展，但距离临床应用还有很长的路要走。例如，重组病毒的滴度还不够高，除Naldini等报道的结果外，其余均在10³TU/ml～10⁴TU/ml之间，难以达到体内应用的需要。造成重组病毒滴度低的主要原因之一是慢病毒的启动子表达强度大，在T细胞中表达过量的CAR基因，常常没有活性。为此，设计、构建、使用合适表达强度的慢病毒载体是CAR-T应用中的关键环节，已成为制约CAR-T技术研究和应用的主要瓶颈之一。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种用于CAR-T细胞制备的慢病毒载体pLVCD3-MCS及其构建方法和在制备抗肿瘤药物中的应用，由pLVCD3-MCS构建的表达嵌合抗原受体(CAR)的重组慢病毒载体可大大提高重组病毒滴度，检测可达2x10⁶TU/ml，且不表达GFP、Neomycin等与治疗无关的标志基因，适用于CAR-T研究和临床应用。

为了实现本发明的目的，本发明人通过大量试验研究和不懈探索，最终获得了如下技术方案：

一种用于CAR-T制备的慢病毒载体，所述慢病毒载体为pLVCD3-MCS,其核苷酸序列如SEQ ID 1所示,其制备方法包括以下步骤：

步骤1：基因合成CD3-MCS序列，两端设置ClaI和BamHI限制性内切酶位点，CD3-MCS的序列如SEQ ID 2所示；

步骤2：用限制性内切酶ClaI和BamHI双酶切pCDH-EF1-MCS载体，回收酶切后约6kb的片段；

步骤3：T4DNA Ligase连接步骤2回收获得的酶切产物和步骤1基因合成的CD3-MCS片段，获得慢病毒表达载体pLVCD3-MCS，序列如SEQ ID 1所示。

优选地，如上所述的一种CAR-T制备的慢病毒载体的使用方法，该载体可用于重组慢病毒，具体方法为：

步骤1：将目的基因克隆入pLVCD3-MCS载体获得重组慢病毒骨架载体；

步骤2：将步骤1获得的重组慢病毒的骨架载体和psPAX2和pMD2.0G共同转染宿主细胞，所述宿主细胞为HEK293或HEK293T细胞；

步骤3：培养共同转染后的HEK293T细胞；

步骤4：收集细胞培养上清液，并分离获得重组慢病毒。

优选地，如上所述的一种CAR-T制备的慢病毒载体的使用方法，所述的重组慢病毒的骨架载体由如下方法制备得到：将针对肿瘤相关抗原的CAR基因克隆入pLVCD3-MCS的多克隆位点处，其中所述CAR基因识别的肿瘤相关抗原选自CD19、CD20、CD22、CD23、CD30、CD33、B细胞表面抗体轻链、CD123、CD138、CD171、BCMA、CD38、NKG2D、ROR1、间皮蛋白、c-Met、EGFR、ERBB2、ERBB3、ERBB4、PDGFR、GPC3、PSCA、EpCAM、PSMA、EGFRvIII、GD-2、NY-ESO-1、IL-13Rα2、EphA2、FAP、EGFRVIII、MUC-1、MAGE-A3或其任意组合。

本发明的慢病毒载体pLVCD3-MCS及重组的慢病毒骨架载体可应用于抗肿瘤药物的制备。

最后，本发明还公开了一种测定重组病毒滴度的方法，包括如下步骤：

步骤1：慢病毒包装，用克隆有针对肿瘤相关抗原(TAA)的CAR基因的重组慢病毒骨架载体分别和提供病毒膜蛋白、结构蛋白的包装质粒psPAX2、pMD2.0G共转染宿主细胞，收获重组病毒；

步骤2：将步骤(1)的重组病毒制备梯度浓度的DNA样品：按照5-15倍比例梯度稀释步骤1制备的重组病毒，制成3-10组等梯度浓度的重组病毒稀释液，用稀释后的等梯度浓度的重组病毒稀释液分别感染相同浓度的HEK293T细胞并培养，收集等体积经感染和培养的HEK293T细胞并分别提取DNA；

步骤3：设计荧光定量PCR引物：设计靶向慢病毒载体上的WPRE元件和HEK293T基因组中ALB基因的引物，并用这两对引物进行PCR扩增，回收扩增产物并构建pMD18-T载体制备标准质粒；

步骤4：荧光定量PCR方法测定重组病毒滴度：分别取等量步骤2提取的梯度浓度的DNA样品和步骤3获得的质粒标准品，建立荧光定量PCR扩增体系，相同条件下进行扩增，分析实验结果，用绝对定量的方法测定重组病毒滴度。

与现有技术相比，本发明取得的优点为：

1、本发明提供的慢病毒载体pLVCD3-MCS中设计有能在T细胞高效表达的CD3基因的启动子，且该载体长度相对较小，经实验验证，由pLVCD3-MCS构建的表达嵌合抗原受体(CAR)的重组慢病毒载体可大大提高重组病毒滴度，检测可达2x10⁶TU/ml，且不表达GFP、Neomycin等与治疗无关的标志基因，适用于CAR-T研究和临床应用。

2、该发明还建立了基于慢病毒载体中WPRE元件及HEK293T细胞中ALB基因的荧光定量PCR检测病毒滴度的方法，为临床应用提供了快速检测标准。

附图说明

图1为pCDH-EF1-MCS载体的图谱。

图2为CD3启动子的荧光素酶活性实验。

图3为本发明构建的pLVCD3-MCS慢病毒载体图谱。

图4为CD3、EF-1α基因在PBMC中的表达。

图5为CD3启动子及EF-1a启动子驱动的CAR在CAR-T细胞不同培养阶段中的表达变化图。

图6为pLVCD3-MCS驱动GFP在T淋巴细胞中的表达。

图7为19BBz基因PCR产物电泳图，其中19BBz基因：1743bp，Marker：1000bp，2000bp，3000bp，4000bp，5000bp，6000bp，8000bp，10000bp。

图8为菌液PCR鉴定电泳图，其中，19BBz基因：1743bp，Marker：1000bp，2000bp，3000bp，4000bp，5000bp，6000bp，8000bp，10000bp。

图9为荧光定量PCR熔解曲线图，a为循环数荧光强度曲线，图b为温度荧光强度曲线，图c为循环数和病毒浓度标准曲线。

图10为pLVCD3-19BBz慢病毒包装后的滴度检测，其中图a为温度荧光强度曲线，图b为循环数荧光强度曲线。

图11为pLVCD3-19BBz感染T淋巴细胞的杀伤实验，其中图a为循环数荧光强度曲线，图b为温度荧光强度曲线。

具体实施方式

下面结合附图和实施方式对本发明做进一步的详细说明。以下实施例仅是范例性的，仅用以对本发明的技术方案做更进一步的详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，在不偏离本发明技术方案的精神和范围内，对技术方案进行的修改或者替换均应涵盖在本发明的权利要求保护范围内。

实施例1

一、慢病毒载体pLVCD3-MCS的设计和合成

(1)以SBI公司的pCDH-EF1-MCS慢病毒载体作为起始载体，pCDH-EF1-MCS大小是6kb，载体序列见SEQ ID1，载体图谱见附图1。

(2)合成CD3-MCS序列(武汉金开瑞生物工程有限公司)

使用Primer5.0软件分析pCDH-EF1-MCS慢病毒载体的序列，发现酶切位点ClaI和酶切位点BamHI能够切下起始载体上无关元件部分，酶切后载体大小为6kb。

使用CD3基因启动子的序列，加上pCDH-EF1-MCS慢病毒载体的多克隆位点序列，得到序列CD3-MCS，序列见SEQID2；合成的CD3-MCS序列两端分别加上ClaI(ATCG)或MluI(ACGCGT)的序列(武汉金开瑞生物工程有限公司)。

(3)酶切pCDH-EF1-MCS慢病毒载体和含CD3-MCS基因序列的合成载体，反应条件为37℃水浴，酶切2小时，酶切体系如下：

(4)回收酶切后产物：使用Biomiga胶回收试剂盒(货号：DC-3511-01)，胶回收步骤参照说明书，按照胶回收试剂盒说明书进行胶回收操作。

(5)连接反应：使用Takara的快速连接试剂盒(货号：6022)，根据载体(酶切过)nmole数:片段(酶切过的目的基因片段)nmole数＝1:3，即：[载体质量(50ng/100ng)/载体分子质量]×3＝片段质量/片段分子量；其中，载体pCDH-EF1-MCS慢病毒，基因序列CD3-MCS，连接体系如下：

pCDH-EF1-MCS载体	2.9μl
		CD3-MCS	1μl
去离子水	1.1μl
		Solution I	5μl
总体积	10μl

按上述内容定量加入各组分至1.5mL离心管中(SolutionⅠ冰上加)，充分混匀,16℃水浴30min。

(6)转化、涂氨苄平板：冰上加感受态50μl，冰上孵20～30min；42℃水浴90s；冰上2～5min；加500μl LB复苏1h；4000rpm离心5min，留适量上清液50-100μl重悬，涂板(氨苄抗性)。

(7)挑克隆，摇菌：第二天，待克隆长出后，随机挑取几个克隆，于3ml LB液体培养基内摇菌过夜。

(8)质粒提取：使用Biomega的无内毒素质粒提取试剂盒(货号：PD1220-02)，按照说明书进行质粒提取操作。

(9)测序得到构建好的载体序列，经过对比验证序列正确，序列和基因结构和图3一致。

二、重组慢病毒pLVCD3-MCS-19BBZ的构建和pLVCD3-MCS-GFP的构建

1、pLVCD3-MCS-19BBZ的构建

(1)19BBz基因合成：19BBz基因序列如SEQ ID15所示。

(2)引物设计：使用Primer5.0软件分析19BBz基因序列，发现单酶切位点EcoRI(识别序列GAATTC)、BamHI(识别序列GGATCC)适合用于基因克隆，能够和pLVCD3-MCS载体的多克隆位点匹配，设计上、下游引物如SEQ ID16、17所示。

(3)PCR扩增：收到合成的序列和引物后，进行PCR扩增，反应体系见下表(使用Toyobo的高保真KODFx酶)，PCR产物电泳见附图7。

2×PCR Buffer	25μl
		2mM dNTP	10μl
10mM Primer正向	1.5μl
		10mM Primer反向	1.5μl
CD19CAR Template	1μl(50ng/μl)
		KOD FX	1μl
去离子水	10μl
		总体积	50μl

(4)酶切：反应条件为37℃水浴，酶切2小时，酶切反应体系如下：

pLVCD3-MCS载体	2μg
		ClaI(NEB)	2μl
MluI-HF(NEB)	2μl
		Cutsmart buffer(NEB)	5μl
补水至总体积	50μl

(5)回收酶切后产物，使用Biomega胶回收试剂盒(货号：DC-3511-01)，步骤同前pLVCD3-MCS载体构建。

(6)连接反应，操作同前pLVCD3-MCS载体构建。

(7)转化，涂氨苄平板，操作同前pLVCD3-MCS载体构建。

(8)挑克隆，摇菌，PCR鉴定，引物为克隆所用引物，反应条件同步骤(3)PCR扩增，实验结果见附图8。

(9)质粒提取，使用Biomega的无内毒素质粒提取试剂盒(货号：PD1220-02)，步骤同前pLVCD3-MCS载体构建。

(10)测序得到构建好的载体序列，经过对比验证序列正确。

2、pLVCD3-MCS-GFP的构建：方法同pLVCD3-MCS-19BBZ的构建，将19BBZ基因换成GFP基因即可。

三、pLVCD3-MCS-19BBZ和pLVCD3-MCS-GFP慢病毒包装

pLVCD3-MCS-19BBZ慢病毒和pLVCD3-MCS-GFP慢病毒包装遵循常规方法，包括如下步骤：

(1)细胞培养：293T细胞培养于37℃，5％CO₂孵箱内，培养基为DMEM/HighGlucose/10％FBS。

(2)种植细胞包装病毒前一天，胰酶消化293T细胞，5×10⁶细胞/孔种植10cm培养皿，准备包装pLVCD3-MCS-19BBZ慢病毒。

(3)细胞转染：细胞转染时，除了使用pLVCD3-MCS-19BBZ质粒外，每种质粒还需要和包装质粒(提供病毒膜蛋白和结构蛋白)psPAX2、pMD2.0G共转染，其中pLVCD3-MCS-19BBZ使用5μg，psPAX2使用3.75μg，pMD2.0G使用1.25μg。转染时，将以上三种质粒的混合物加入500μl MEM培养基内，在另一个微型离心管内将25μl Lipofectamine2000转染试剂加入500μl MEM培养基内，然后，将稀释后的转染试剂加入稀释后的质粒上方，混匀，离心，室温静置20分钟；时间到后，将质粒和转染试剂的混合物加入10cm培养皿内，摇晃、混匀，放入孵箱。

(4)收获病毒：细胞转染3天后可以收获病毒，将9ml含病毒培养基转入50ml离心管内，4℃，1500rpm，离心5分钟，去除死亡的293T细胞碎片，然后将含病毒培养基在20℃，20000rpm超速离心后分装，-80℃冻存。

慢病毒pLVCD3-MCS-GFP的转染制备病毒方法和pLVCD3-MCS-19BBZ慢病毒一样。

四、荧光定量PCR测定病毒滴度

(1)测定前一天，种植293T细胞至24孔板，2×10⁵个细胞/孔，一种病毒准备4个孔。

(2)第二天，感染病毒，按10倍比例系列稀释病毒，具体为：首先在1.5ml离心管准备180μl细胞培养基，第一管内加入20μl病毒原液，吹打混匀，移出20μl稀释后的病毒液至第二管，吹打混匀，依次往后稀释，得到的每管内的病毒液为20μl、2μl、0.2μl、0.02μl，吸掉24孔板内培养基，加入稀释过的病毒液；CO₂孵箱培养72h。

(3)DNA提取：按照DNA提取试剂盒操作方案分离DNA。

(4)荧光定量PCR

1)设计荧光定量PCR引物(引物对应为SEQ ID3、4、5、6)

2)稀释质粒标准品以获得1×10⁷至1×10³拷贝/4μl。

3)配置pcr体系：引物与序列表相一致(是SEQ ID3、4、5、6)

2×SYBR Green mix	10ul
		DEPC水	4.4ul
首尾引物(10uM)	0.8μl
		标准或待测gDNA(10ng/μl)	4ul

4)循环条件：95℃15s，68℃15s，40个循环。

熔解曲线如附图9所示。

扩增曲线如附图10所示。

5)标准曲线和滴度计算，最终本发明的滴度为原液5×10⁶-2×10⁷。

对于制备的重组病毒pLVCD3-MCS-19BBZ和pLVCD3-MCS-GFP慢病毒，我们进行了如下的测定：

试验1病毒杀伤细胞制备和检测

(1)pLVCD3-MCS-GFP和pLVCD3-MCS-19BBZ病毒感染培养细胞

1)胰蛋白酶(胰蛋白酶+0.25％EDTA)消化并计数HEK293T细胞。

2)使用DMEM+10％FBS+100U/ml双抗培养基调整细胞密度3×105细胞/ml，种植至24孔板中每孔1ml。

3)向细胞中滴加10μl的病毒液，并充分混合。

4)37℃孵育48-72h。

(2)gDNA提取

1)弃除培养基，1ml PBS将细胞重悬并收集至1.5ml EP管。

2)使用微量离心机将细胞以300xg离心3分钟，重悬于200μl PBS中，按照gDNA提取试剂盒操作方案分离gDNA。

3)取部分gDNA稀释至10ng/μl，进行qPCR。

(3)qPCR

1)稀释质粒标准品以获得1×10⁷至1×10³拷贝/4μl。

2)配置pcr体系：

2×SYBR Green mix	10ul
		DEPC水	4.4ul
首尾引物(10uM)	0.8μl
		标准或待测gDNA(10ng/μl)	4ul

3)循环条件：95℃15s，68℃15s，40个循环。

(4)PBMC细胞感染：离心法感染悬浮细胞

1)室温，300g离心PBMC细胞，3min。

2)每5×10⁵细胞加入1ml病毒液，种植至24孔板，Parafilm膜封口。

3)室温，1000g离心1.5h，37℃孵育过夜。

4)收集细胞，300g离心3min，无血清生长培养基重悬，37℃孵育48-72h。制备好的pLVCD3-MCS-GFP在PBMC细胞中的表达量通过荧光显微镜进行观察。结果见附图6，可以见到GFP基因在CD3启动子的驱动下进行了合适强度的表达。

(5)LDH杀伤实验：方法：LDH释放检测。

A、效应T细胞与靶细胞分别计数，靶细胞设置浓度为1×10⁴/孔；效靶比分别设置80:1；40:1；20:1；10:1，设靶细胞最大释放组，自发释放组，效应细胞自发释放组以及实验组。

B、每组体系均为200μl(1％胎牛血清的1640)，继续按常规培养5h。到预定的检测时间点前1小时，从细胞培养箱里取出细胞培养板，在“样品最大酶活性对照孔”中加入试剂盒提供的LDH释放试剂，加入量为原有培养液体积的10％。加入LDH释放试剂后，反复吹打数次混匀，然后继续在细胞培养箱中孵育。

C、到达预定时间后，将细胞培养板用多孔板离心机400g离心5min，分别取各孔的上清液120μl，加入到一新的96孔板相应孔中，随即进行样品测定。

D、样品测定:各孔分别加入60μl LDH检测工作液，混匀，室温(约25℃)避光孵育30min(可用铝箔包裹后置于水平摇床或侧摆摇床上缓慢摇动)，然后在490nm处测定吸光度，使用600nm或大于600nm的任一波长作为参考波长进行双波长测定。

计算(测得的各组吸光度均应减去背景空白对照孔吸光度)

细胞毒性或死亡率(％)＝(处理样品吸光度－样品对照孔吸光度)/(细胞最大酶活性的吸光度－样品对照孔吸光度)×100

INT溶液(1×)的配制：根据所需的INT溶液(1×)的量，取适量INT溶液(10×)用INT稀释液稀释至1×。例如，取20μl INT溶液(10×)，加入180μl INT稀释液，混匀后即配制为200μl INT溶液(1×)。INT溶液(1×)宜现配现用，配制后4℃保存可于当天使用，不宜配制后冻存。

LDH检测工作液的配制:根据待测定的样品数(含对照)，参考下表在临检测前新鲜配制适量的检测工作液。

注意：LDH检测工作液必须现配现用，配制和使用过程中均要注意适当避光。

图11可见杀伤效果，图11a横坐标是CAR-T细胞数量，纵坐标是固定细胞数量在经体外杀伤后释放出细胞内的Luciferase，后者用双荧光素梅检测出来的荧光值

图11b可见制备的CAR-T细胞对K562-CD19细胞和Raji细胞以及Nalm-6细胞均有较好的杀伤作用，

试验2、双荧光素酶检测CD3启动子活性

(1)从NCBI数据库中获取CD3的启动子，基因合成其序列并构建到pGL3Basic载体中。

(2)共转染上述构建的载体及对照载体pRL-TK至293T细胞中。

(3)根据Promega的Reporter Assay System的操作说明，于转染后36h收集转染的细胞，冰上裂解，收集裂解的总蛋白，依据操作说明中的方法测定总蛋白中荧光素酶的活性。

实验结果见图2，结果表明：对比克隆得到的全长(-2037/+80)启动子和最小(-328/+80)启动子区的转录活性，区域(-1201/+80)启动子表现出的转录活性最强，适合驱动外源基因在CD3阳性的PBMC中进行外源基因的表达。

试验3荧光定量PCR检测人PBMC中的CD3和EF1α基因的表达量以及不同培养时间的CAR-T细胞中CAR结构的表达量变化

(1)根据NCBI数据库中CD3、EF-1α、β-actin基因的序列以及CAR结构的序列，设计定量PCR的引物(序列详见SEQ ID 7-14)。

(2)提取PBMC或者CAR-T细胞的总RNA，以oligo d(T)18位引物进行反转录获得总cDNA。

(3)依据下列反应体系配制反应样品

序号	反应物	剂量	序号	反应物	剂量
						1	SYBRGreen 1染料	10μl	5	Taq酶	1μl
2	内参照上游引物F	0.5μl	6	待测样品cDNA	5μl
						3	内参照下游引物R	0.5μl	7	ddH2O	32.5μl
4	dNTP	0.5μl	8	总体积	50μl

(4)混匀上述扩增体系，将反应管置于BIO-RAD CFX96Touch^TM Real-Time PCRDetection System中，以95℃3min，94℃15sec 68℃15sec，30cycles，72℃5min后再进行产物的溶解曲线分析。

(5)以β-actin的表达量为参考基准，计算CD3、EF-1α以及CAR基因的相对表达量。

实验结果见图4，从结果中可以看到CD3启动子的表达强度约为EF-1α启动子的强度的70％左右。

试验4培养含CAR基因的PBMC细胞不同天数，通过荧光定量PCR检测CAR基因在EF-1α启动子和CD3启动子的驱动下的表达量

培养含CAR基因的PBMC细胞从0天到18天，通过荧光定量PCR检测CAR基因在EF-1α启动子和CD3启动子的驱动下的表达量，实验结果见图5，从图5中可以看到CD3的启动子介导的外源基因表达强度持续且保持稳定，对比而言EF-1α启动子在PBMC体外培养时呈逐渐下降的趋势，到培养18天的时候外源基因的表达量下降了50％。

SEQUENCE LISTING

<110> 生研医药（武汉）有限公司

<120> 一种用于CAR-T制备的慢病毒载体及其构建方法和应用

<130> 1

<160> 15

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 7072

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

acgcgtgtag tcttatgcaa tactcttgta gtcttgcaac atggtaacga tgagttagca 60

acatgcctta caaggagaga aaaagcaccg tgcatgccga ttggtggaag taaggtggta 120

cgatcgtgcc ttattaggaa ggcaacagac gggtctgaca tggattggac gaaccactga 180

attgccgcat tgcagagata ttgtatttaa gtgcctagct cgatacaata aacgggtctc 240

tctggttaga ccagatctga gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta 300

agcctcaata aagcttgcct tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact 360

ctggtaacta gagatccctc agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agcagtggcg 420

cccgaacagg gacctgaaag cgaaagggaa accagagctc tctcgacgca ggactcggct 480

tgctgaagcg cgcacggcaa gaggcgaggg gcggcgactg gtgagtacgc caaaaatttt 540

gactagcgga ggctagaagg agagagatgg gtgcgagagc gtcagtatta agcgggggag 600

aattagatcg cgatgggaaa aaattcggtt aaggccaggg ggaaagaaaa aatataaatt 660

aaaacatata gtatgggcaa gcagggagct agaacgattc gcagttaatc ctggcctgtt 720

agaaacatca gaaggctgta gacaaatact gggacagcta caaccatccc ttcagacagg 780

atcagaagaa cttagatcat tatataatac agtagcaacc ctctattgtg tgcatcaaag 840

gatagagata aaagacacca aggaagcttt agacaagata gaggaagagc aaaacaaaag 900

taagaccacc gcacagcaag cggccactga tcttcagacc tggaggagga gatatgaggg 960

acaattggag aagtgaatta tataaatata aagtagtaaa aattgaacca ttaggagtag 1020

cacccaccaa ggcaaagaga agagtggtgc agagagaaaa aagagcagtg ggaataggag 1080

ctttgttcct tgggttcttg ggagcagcag gaagcactat gggcgcagcc tcaatgacgc 1140

tgacggtaca ggccagacaa ttattgtctg gtatagtgca gcagcagaac aatttgctga 1200

gggctattga ggcgcaacag catctgttgc aactcacagt ctggggcatc aagcagctcc 1260

aggcaagaat cctggctgtg gaaagatacc taaaggatca acagctcctg gggatttggg 1320

gttgctctgg aaaactcatt tgcaccactg ctgtgccttg gaatgctagt tggagtaata 1380

aatctctgga acagattgga atcacacgac ctggatggag tgggacagag aaattaacaa 1440

ttacacaagc ttaatacact ccttaattga agaatcgcaa aaccagcaag aaaagaatga 1500

acaagaatta ttggaattag ataaatgggc aagtttgtgg aattggttta acataacaaa 1560

ttggctgtgg tatataaaat tattcataat gatagtagga ggcttggtag gtttaagaat 1620

agtttttgct gtactttcta tagtgaatag agttaggcag ggatattcac cattatcgtt 1680

tcagacccac ctcccaaccc cgaggggacc cgacaggccc gaaggaatag aagaagaagg 1740

tggagagaga gacagagaca gatccattcg attagtgaac ggatctcgac ggtatcggtt 1800

aacttttaaa agaaaagggg ggattggggg gtacagtgca ggggaaagaa tagtagacat 1860

aatagcaaca gacatacaaa ctaaagaatt acaaaaacaa attacaaaat tcaaaatttt 1920

atcgattgtc ttcattttgg tatatgtagg cttcatcagt gtgtcagcac cccagaccaa 1980

tgacaacctt cactgatgaa gactcagact aaatgtagag acagactact tgggctgtag 2040

tgacatctct acctaccacc tacttgctgt gtggccttga gtaagtcatc ggccccctta 2100

ggggtcaatt taggctctga gtaggtacca agtctgatga tgggaatgct gtttccatca 2160

cttagaggta tgcggtgatt tgcaggactc actttcttca tagtgtcctt tgatgcacaa 2220

aaacttttaa ttgtgatgaa gtccaattta tcaattttat gttggattgc tgtgactttg 2280

gattattggc tattcttgta cattaatttt tttcatatca attttggaat cagcttaact 2340

tgttctaaaa ctttttgttg gtattttcaa tgaaatagat tgattaatta agagagaatg 2400

gtggtctcct taaaagagag cttcctatca aagaagggta tgcctttcca tttacccaag 2460

tcctttcggc gttcttcagc aatgttttaa agtttgtttc atatagatat attacaattt 2520

ttagacgaag tttatgtcta ggttttaatg ttttattatt gtaaattact ctggtgttta 2580

aatgttgaca actaacacaa gtgtttaaaa tactatgtga gctacagtat ttcacacaat 2640

gatccaaatt caggccaagt tcagatctgc aacctcagat ctactccagc tctttgcttt 2700

atagataagg aagctgaagt ctagagatgt tgagtgactg actcaacgcc acacagcaag 2760

taggtggtag gcagagatgt cactaaagcc caaggaatct gtctctacat ttgtcctgga 2820

ctctaatcca gggttctgtc attttgccag ccaccataaa atatttgaca gtctaggaaa 2880

acagcaaatg ttcttacatc catcgagaac ttgtatttgc ctagagatgg actttaccaa 2940

tcaagatagg aattagataa gaattatttt ttttaaaaaa aggagcatta aaacaatggt 3000

caaatgagag aaaaagcaaa attcagacag acagatacat acacacaccc caaaccctca 3060

aacctccagg gcttcctgcc tgtgaaccga aagggggagt gcgaatttct tggccctgtc 3120

ggcaggggat ccgctagcgt ttaaacgcgg ccgcgaattc gtcgacaatc aacctctgga 3180

ttacaaaatt tgtgaaagat tgactggtat tcttaactat gttgctcctt ttacgctatg 3240

tggatacgct gctttaatgc ctttgtatca tgctattgct tcccgtatgg ctttcatttt 3300

ctcctccttg tataaatcct ggttgctgtc tctttatgag gagttgtggc ccgttgtcag 3360

gcaacgtggc gtggtgtgca ctgtgtttgc tgacgcaacc cccactggtt ggggcattgc 3420

caccacctgt cagctccttt ccgggacttt cgctttcccc ctccctattg ccacggcgga 3480

actcatcgcc gcctgccttg cccgctgctg gacaggggct cggctgttgg gcactgacaa 3540

ttccgtggtg ttgtcgggga aatcatcgtc ctttccttgg ctgctcgcct gtgttgccac 3600

ctggattctg cgcgggacgt ccttctgcta cgtcccttcg gccctcaatc cagcggacct 3660

tccttcccgc ggcctgctgc cggctctgcg gcctcttccg cgtcttcgcc ttcgccctca 3720

gacgagtcgg atctcccttt gggccgcctc cccgcctggt acctttaaga ccaatgactt 3780

acaaggcagc tgtagatctt agccactttt taaaagaaaa ggggggactg gaagggctaa 3840

ttcactccca acgaaaataa gatctgcttt ttgcttgtac tgggtctctc tggttagacc 3900

agatctgagc ctgggagctc tctggctaac tagggaaccc actgcttaag cctcaataaa 3960

gcttgccttg agtgcttcaa gtagtgtgtg cccgtctgtt gtgtgactct ggtaactaga 4020

gatccctcag acccttttag tcagtgtgga aaatctctag cagtagtagt tcatgtcatc 4080

ttattattca gtatttataa cttgcaaaga aatgaatatc agagagtgag aggaacttgt 4140

ttattgcagc ttataatggt tacaaataaa gcaatagcat cacaaatttc acaaataaag 4200

catttttttc actgcattct agttgtggtt tgtccaaact catcaatgta tcttatcatg 4260

tctggctcta gctatcccgc ccctaactcc gcccagttcc gcccattctc cgccccatgg 4320

ctgactaatt ttttttattt atgcagaggc cgaggccgcc tcggcctctg agctattcca 4380

gaagtagtga ggaggctttt ttggaggcct agacttttgc agagacggcc caaattcgta 4440

atcatggtca tagctgtttc ctgtgtgaaa ttgttatccg ctcacaattc cacacaacat 4500

acgagccgga agcataaagt gtaaagcctg gggtgcctaa tgagtgagct aactcacatt 4560

aattgcgttg cgctcactgc ccgctttcca gtcgggaaac ctgtcgtgcc agctgcatta 4620

atgaatcggc caacgcgcgg ggagaggcgg tttgcgtatt gggcgctctt ccgcttcctc 4680

gctcactgac tcgctgcgct cggtcgttcg gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa 4740

ggcggtaata cggttatcca cagaatcagg ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa 4800

aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct 4860

ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac 4920

aggactataa agataccagg cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc 4980

gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc 5040

tcatagctca cgctgtaggt atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg 5100

tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga 5160

gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc actggcagca gccactggta acaggattag 5220

cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta actacggcta 5280

cactagaagg acagtatttg gtatctgcgc tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag 5340

agttggtagc tcttgatccg gcaaacaaac caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg 5400

caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg atctcaagaa gatcctttga tcttttctac 5460

ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc acgttaaggg attttggtca tgagattatc 5520

aaaaaggatc ttcacctaga tccttttaaa ttaaaaatga agttttaaat caatctaaag 5580

tatatatgag taaacttggt ctgacagtta ccaatgctta atcagtgagg cacctatctc 5640

agcgatctgt ctatttcgtt catccatagt tgcctgactc cccgtcgtgt agataactac 5700

gatacgggag ggcttaccat ctggccccag tgctgcaatg ataccgcgag acccacgctc 5760

accggctcca gatttatcag caataaacca gccagccgga agggccgagc gcagaagtgg 5820

tcctgcaact ttatccgcct ccatccagtc tattaattgt tgccgggaag ctagagtaag 5880

tagttcgcca gttaatagtt tgcgcaacgt tgttgccatt gctacaggca tcgtggtgtc 5940

acgctcgtcg tttggtatgg cttcattcag ctccggttcc caacgatcaa ggcgagttac 6000

atgatccccc atgttgtgca aaaaagcggt tagctccttc ggtcctccga tcgttgtcag 6060

aagtaagttg gccgcagtgt tatcactcat ggttatggca gcactgcata attctcttac 6120

tgtcatgcca tccgtaagat gcttttctgt gactggtgag tactcaacca agtcattctg 6180

agaatagtgt atgcggcgac cgagttgctc ttgcccggcg tcaatacggg ataataccgc 6240

gccacatagc agaactttaa aagtgctcat cattggaaaa cgttcttcgg ggcgaaaact 6300

ctcaaggatc ttaccgctgt tgagatccag ttcgatgtaa cccactcgtg cacccaactg 6360

atcttcagca tcttttactt tcaccagcgt ttctgggtga gcaaaaacag gaaggcaaaa 6420

tgccgcaaaa aagggaataa gggcgacacg gaaatgttga atactcatac tcttcctttt 6480

tcaatattat tgaagcattt atcagggtta ttgtctcatg agcggataca tatttgaatg 6540

tatttagaaa aataaacaaa taggggttcc gcgcacattt ccccgaaaag tgccacctga 6600

cgtctaagaa accattatta tcatgacatt aacctataaa aataggcgta tcacgaggcc 6660

ctttcgtctc gcgcgtttcg gtgatgacgg tgaaaacctc tgacacatgc agctcccgga 6720

gacggtcaca gcttgtctgt aagcggatgc cgggagcaga caagcccgtc agggcgcgtc 6780

agcgggtgtt ggcgggtgtc ggggctggct taactatgcg gcatcagagc agattgtact 6840

gagagtgcac catatgcggt gtgaaatacc gcacagatgc gtaaggagaa aataccgcat 6900

caggcgccat tcgccattca ggctgcgcaa ctgttgggaa gggcgatcgg tgcgggcctc 6960

ttcgctatta cgccagctgg cgaaaggggg atgtgctgca aggcgattaa gttgggtaac 7020

gccagggttt tcccagtcac gacgttgtaa aacgacggcc agtgccaagc tg 7072

<210> 2

<211> 1212

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 2

atcgattgtc ttcattttgg tatatgtagg cttcatcagt gtgtcagcac cccagaccaa 60

tgacaacctt cactgatgaa gactcagact aaatgtagag acagactact tgggctgtag 120

tgacatctct acctaccacc tacttgctgt gtggccttga gtaagtcatc ggccccctta 180

ggggtcaatt taggctctga gtaggtacca agtctgatga tgggaatgct gtttccatca 240

cttagaggta tgcggtgatt tgcaggactc actttcttca tagtgtcctt tgatgcacaa 300

aaacttttaa ttgtgatgaa gtccaattta tcaattttat gttggattgc tgtgactttg 360

gattattggc tattcttgta cattaatttt tttcatatca attttggaat cagcttaact 420

tgttctaaaa ctttttgttg gtattttcaa tgaaatagat tgattaatta agagagaatg 480

gtggtctcct taaaagagag cttcctatca aagaagggta tgcctttcca tttacccaag 540

tcctttcggc gttcttcagc aatgttttaa agtttgtttc atatagatat attacaattt 600

ttagacgaag tttatgtcta ggttttaatg ttttattatt gtaaattact ctggtgttta 660

aatgttgaca actaacacaa gtgtttaaaa tactatgtga gctacagtat ttcacacaat 720

gatccaaatt caggccaagt tcagatctgc aacctcagat ctactccagc tctttgcttt 780

atagataagg aagctgaagt ctagagatgt tgagtgactg actcaacgcc acacagcaag 840

taggtggtag gcagagatgt cactaaagcc caaggaatct gtctctacat ttgtcctgga 900

ctctaatcca gggttctgtc attttgccag ccaccataaa atatttgaca gtctaggaaa 960

acagcaaatg ttcttacatc catcgagaac ttgtatttgc ctagagatgg actttaccaa 1020

tcaagatagg aattagataa gaattatttt ttttaaaaaa aggagcatta aaacaatggt 1080

caaatgagag aaaaagcaaa attcagacag acagatacat acacacaccc caaaccctca 1140

aacctccagg gcttcctgcc tgtgaaccga aagggggagt gcgaatttct tggccctgtc 1200

ggcaggggat cc 1212

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 3

atgaggagtt gtggcccgtt gt 22

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 4

ttgagtagcg gcggacgga 19

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 5

gtgggctgta atcatcgt 18

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 6

gtgataatcg aaacttccct c 21

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 7

gggatgtatc agtgtaaagg 20

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 8

ctgtccagca atgaagtag 19

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 9

ggctgagtcg ggaggata 18

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 10

cagggtgaca ggtcttgct 19

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 11

acttagttgc gttacaccct t 21

<210> 12

<211> 18

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 12

gtcaccttca ccgttcca 18

<210> 13

<211> 18

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 13

tctggagtgg ctgggagt 18

<210> 14

<211> 18

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 14

tggttgagga gacggtga 18

<210> 15

<211> 1461

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 15

atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60

ccggacatcc agatgacaca gactacatcc tccctgtctg cctctctggg agacagagtc 120

accatcagtt gcagggcaag tcaggacatt agtaaatatt taaattggta tcagcagaaa 180

ccagatggaa ctgttaaact cctgatctac catacatcaa gattacactc aggagtccca 240

tcaaggttca gtggcagtgg gtctggaaca gattattctc tcaccattag caacctggag 300

caagaagata ttgccactta cttttgccaa cagggtaata cgcttccgta cacgttcgga 360

ggggggacca agctggagat cacaggtggc ggtggctcgg gcggtggtgg gtcgggtggc 420

ggcggatctg aggtgaaact gcaggagtca ggacctggcc tggtggcgcc ctcacagagc 480

ctgtccgtca catgcactgt ctcaggggtc tcattacccg actatggtgt aagctggatt 540

cgccagcctc cacgaaaggg tctggagtgg ctgggagtaa tatggggtag tgaaaccaca 600

tactataatt cagctctcaa atccagactg accatcatca aggacaactc caagagccaa 660

gttttcttaa aaatgaacag tctgcaaact gatgacacag ccatttacta ctgtgccaaa 720

cattattact acggtggtag ctatgctatg gactactggg gccaaggaac ctcagtcacc 780

gtctcctcaa ccacgacgcc agcgccgcga ccaccaacac cggcgcccac catcgcgtcg 840

cagcccctgt ccctgcgccc agaggcgtgc cggccagcgg cggggggcgc agtgcacacg 900

agggggctgg acttcgcctg tgatatctac atctgggcgc ccttggccgg gacttgtggg 960

gtccttctcc tgtcactggt tatcaccctt tactgcaaac ggggcagaaa gaaactcctg 1020

tatatattca aacaaccatt tatgagacca gtacaaacta ctcaagagga agatggctgt 1080

agctgccgat ttccagaaga agaagaagga ggatgtgaac tgagagtgaa gttcagcagg 1140

agcgcagacg cccccgcgta caagcagggc cagaaccagc tctataacga gctcaatcta 1200

ggacgaagag aggagtacga tgttttggac aagagacgtg gccgggaccc tgagatgggg 1260

ggaaagccga gaaggaagaa ccctcaggaa ggcctgtaca atgaactgca gaaagataag 1320

atggcggagg cctacagtga gattgggatg aaaggcgagc gccggagggg caaggggcac 1380

gatggccttt accagggtct cagtacagcc accaaggaca cctacgacgc ccttcacatg 1440

caggccctgc cccctcgcta a 1461

<210> 16

<211> 18

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 16

atggccttac cagtgacc 18

<210> 17

<211> 18

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 17

ttagcgaggg gtcagggc 18

Claims (7)

1.一种用于CAR-T制备的慢病毒载体，其特征在于，所述慢病毒载体为pLVCD3-MCS,其核苷酸序列如SEQ ID 1所示。

2.如权利要求1所述的一种用于CAR-T制备的慢病毒载体的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤1：基因合成CD3-MCS序列，两端设置ClaI和BamHI限制性内切酶位点，所述CD3-MCS的序列如SEQ ID 2所示；

步骤2：用限制性内切酶ClaI和BamHI双酶切pCDH-EF1-MCS载体，并回收酶切后的片段；

步骤3：T4DNA Ligase连接步骤2回收的酶切产物和步骤1合成的CD3-MCS序列，获得慢病毒表达载体pLVCD3-MCS。

3.如权利要求1所述的一种CAR-T制备的慢病毒载体的使用方法，其特征在于：该载体pLVCD3-MCS可用于重组慢病毒，包括下述步骤：

步骤1：将目的基因克隆入pLVCD3-MCS载体获得重组慢病毒骨架载体；

步骤2：将步骤1的重组慢病毒骨架载体和psPAX2、pMD2.0G共同转染宿主细胞，所述宿主细胞为HEK293或HEK293T细胞；

步骤3：培养共同转染后的HEK293T细胞；

步骤4：收集细胞培养上清液，并分离获得重组慢病毒。

4.如权利要求3所述的一种CAR-T制备的慢病毒载体的使用方法，其特征在于：步骤(1)中所述的重组慢病毒骨架载体由如下方法制备得到：将针对肿瘤相关抗原的CAR基因克隆入pLVCD3-MCS的多克隆位点处。

5.如权利要求4所述的一种CAR-T制备的慢病毒载体的使用方法，其特征在于，所述CAR基因识别的肿瘤相关抗原选自CD19、CD20、CD22、CD23、CD30、CD33、B细胞表面抗体轻链、CD123、CD138、CD171、BCMA、CD38、NKG2D、ROR1、间皮蛋白、c-Met、EGFR、ERBB2、ERBB3、ERBB4、PDGFR、GPC3、PSCA、EpCAM、PSMA、EGFRvIII、GD-2、NY-ESO-1、IL-13Rα2、EphA2、FAP、EGFRVIII、MUC-1、MAGE-A3或其任意组合。

6.如权利要求1所述的一种慢病毒载体pLVCD3-MCS在制备抗肿瘤药物中的应用。

7.如权利要求4或5所述的一种重组慢病毒骨架载体在制备抗肿瘤药物中的应用。