CN109312360B - 用于原代细胞的基于转座子的转染系统 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及基因工程领域，特别地涉及适用于转染原代细胞如T细胞的基于转座子的转染试剂盒，其包含编码转座酶的mRNA，或用于产生编码所述转座酶的mRNA的试剂，以及包含转座子的小环DNA。本发明还涉及包含转座子的核酸，优选DNA小环，其中所述转座子编码蛋白质和至少一种miRNA，其中编码miRNA的序列位于内含子中，并且所述蛋白质和miRNA的表达受相同启动子的调节。本发明还提供了可用本发明方法获得的细胞群体。还提供了转染方法，以及例如在免疫疗法，特别是在继承性T细胞疗法或者T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)基因疗法中的医疗用途。

Description

用于原代细胞的基于转座子的转染系统
技术领域
本发明涉及基因工程领域，特别地涉及适用于转染细胞系和原代细胞 (如T细胞)的基于转座子的转染试剂盒，其包含编码转座酶的mRNA，或用于产生编码所述转座酶的mRNA的试剂，以及包含转座子的小环DNA。本发明还涉及包含转座子的核酸，优选DNA小环，其中所述转座子编码至少一种蛋白质和至少一种miRNA，其中编码miRNA的序列位于内含子中，并且所述蛋白质和miRNA的表达受相同启动子的调节。本发明还提供了可用本发明方法获得的细胞群。还提供了转染方法以及例如在免疫疗法(特别是使用T细胞受体(TCR)基因修饰的T细胞(TCR基因疗法)或嵌合抗原受体(CAR)基因修饰的T细胞(CAR基因疗法)的继承性T细胞疗法 (adoptive T cell therapy))中的医疗用途。
背景技术
继承性T细胞疗法(adoptive T cell therapy)(ATT)是一种治疗癌症、慢性感染和自身免疫疾病的有前途的免疫治疗策略。ATT需要制备识别并根除患病细胞的大量抗原特异性T细胞。ATT一方面涉及将天然存在的抗原特异性T细胞分离、扩增和再输注到患者体内以治疗所述疾病。然而，就癌症而言，大多数患者缺乏适量的天然存在的抗原特异性T细胞(肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocyte)，TIL)，并且这些细胞很难从许多肿瘤实体中分离出来。因此，ATT另一方面使用宿主细胞，所述宿主细胞已经用抗原受体基因(TCR，CAR)进行工程改造以赋予所述细胞以新的抗原特异性。使用CAR-和TCR-工程改造的T细胞的ATT已成功用于治疗癌症和病毒相关性疾病，对于其他治疗顽固的疾病(Vonderheide et al., 2014；Robbins et al.,2015)。
TCR和CAR基因疗法需要基因工程化大量的原代人类T细胞。这可以使用病毒载体系统有效地完成。然而，该技术费力、耗时且昂贵。相比之下，使用基于质粒DNA的转座子载体系统具有多个优点。GMP级载体的生产(特别是大规模载体生产)速度更快、劳动强度更低、成本更低并且减少了行政 负担。此外，与病毒载体相比，转座子载体的转基因能力较大，并且一些转座子显示出不偏爱活性基因的随机整合模式。
使用由两个DNA质粒组成的常规转座子载体系统(图1中的A)进行原代细胞的遗传修饰的主要缺点是由DNA转染诱导的高细胞死亡率(图2 中的A)，这阻碍了转染细胞的快速扩增并且需要根本性的优化。尽管存在这个缺点，基于转座子的方法已成功应用于原代细胞(例如T细胞)的基因工程化。然而，常规方法效率较低，这是因为大多数T细胞在转染后死亡，只有小百分比存活细胞稳定地表达转基因。在使用常规方法转染细胞后，应用两种策略来获得所需数量的遗传修饰的T细胞以用于治疗。首先，借助于呈递转移的抗原受体的特异性配体的刺激细胞系选择性地扩增细胞(Singh et al.,2013)。因此，需要产生对于每种抗原受体的新刺激细胞系 (具有新特异性)。另外，在转移的抗原受体的特异性未知或转座子不编码抗原受体的情况下，不能诱导这种修饰的细胞的选择性生长。第二种策略是在特异性抗体的帮助下，分选出用于表面表达转移的TCR的转染细胞。然后，使用同种刺激(allostimulation)扩增分选的细胞(Deninger et al., 2016)。该策略需要转染具有全长小鼠恒定区的TCR(其在人类中为免疫原性的)以及批准用于临床方案的抗体。此外，在该方案中通过其内源性 TCR刺激分选的T细胞。其中转移的TCR完全取代内源性TCR的细胞不能以这种方式扩增。因此，同种异体刺激(allogeneic stimulation)内在地与产生用于疗法的细胞的意图不相容，所述用于疗法的细胞在其表面上尽可能多地表达转移的TCR。最后，选择性扩增和转染细胞的分选都不能直接解决低转染率和高细胞死亡率的问题。总之，非常需要为这些细胞(特别是原代细胞和难以以合理的功效转染的其它细胞)的基因工程化提供更有效的方法和试剂盒。
通过本发明，特别是通过权利要求的主题，解决了这一问题。
发明内容
本发明提供了试剂盒，其包含：
a)编码能够移动转座子的转座酶的核酸，其中所述核酸选自包括以下各项的组：
(i)编码所述转座酶的mRNA；或
(ii)功能性地连接到启动子的编码所述转座酶的DNA，其中所述试剂盒可选地进一步包含适用于体外转录的试剂，该试剂包含三磷酸核糖核苷酸、适用于转录的缓冲液和适用于转录的RNA聚合酶；和
b)包含所述转座子的小环DNA，其中所述转座子编码蛋白质和/或 miRNA，其中所述蛋白质和/或miRNA的表达受启动子调节。
在本发明的上下文中，“一种(a)”不仅仅指“一个(one)”，而是涵盖“两个或更多个”。因此，转座子可以编码一种或多种蛋白质和/或一种或多种miRNA。例如，转座子可编码两种蛋白质和一种miRNA。优选地，它编码一种蛋白质和两种(或更多种)miRNA。当然，它还可以编码两种蛋白质和两种miRNA。
在一个实施方式中，a)的核酸是已经在体外转录的mRNA，即 ivtRNA(图1中的B)。也可以使用纯化的RNA。RNA应该具有高质量和高浓度，例如，与常规获得的ivtRNA相当。(a)通过以5'帽类似物形成的 mRNA的量，(b)poly(A)尾和(c)RNA的纯度来确定质量。
发明人可以证明，包含编码转座酶的ivtRNA的本发明试剂盒的使用导致比编码转座酶的DNA更高的转染效率(图3)以及改善的人类T细胞活力(图4)。
在可替代的实施方式中，编码转座酶的核酸是适合体外转录的DNA。优选地，在所述实施方式中，该试剂盒还包含用于体外转录的试剂和可选的说明书，诸如含有5'帽类似物的核糖核苷酸三磷酸、适合转录的缓冲液和适用于体外转录的RNA聚合酶，例如T7RNA聚合酶。DNA可以是用于RNA生产的载体，例如pcDNA3.1+(hygro)(Thermo FisherScientific, Waltham,美国)。该试剂盒可包含兔网织红细胞裂解物，其包含用于体外转录的所有试剂。这样的试剂盒用于生产ivtRNA，然后根据本发明，将该ivtRNA用于制备转染的细胞，特别是转染的原代细胞，优选原代T细胞或干细胞。已知这种细胞特别难以转染。
由所述核酸编码的转座酶可以是在脊椎动物细胞中(特别是在人类细胞中)起作用的转座酶。它选自包含以下各项的II类可转座元件的组：睡美人(Sleeping Beauty)转座酶、青蛙王子(FrogPrince)、piggyBac、Tol2 和其它Tc1/mariner-type(水手型)转座酶，优选睡美人转座酶，例如Ivics et al.,1997中所公开的，最优选SB100X(Mátés et al.,2009)。
本发明的试剂盒，还包含含有转座子的小环DNA作为第二核酸，其可通过转座酶来移动(图1中的C)。在本发明的上下文中，转座子不编码转座酶本身。所述转座子编码蛋白质和/或miRNA，其中所述蛋白质和/ 或miRNA的表达受启动子调节。小环是小的环状质粒衍生物，其已经大部分或完全不含非必需的原核载体部分。特别地，小环不含有编码细菌序列(如抗生素抗性基因或ORI)的DNA。
本发明的小环DNA优选包含小于5kb，更优选小于4kb，小于3kb或小于2kb。发明人发现最小尺寸的DNA小环提高了效率。小环编码表达盒，该表达盒包含启动子、内含子和poly(A)信号以及转座子的TIR(末端反向重复)和间隔物，它们总共包含约1.75kb。小环的最终尺寸取决于编码区的尺寸。
DE 10 2011 118 018 A1或Garrels et al.,2016中描述了小环及它们与睡美人转座酶的结合使用。
发明人可以证明，包含编码转座酶的mRNA和包含转座子的小环 DNA的组合的本发明的试剂盒使用令人惊讶地导致高转染效率和细胞活力(图5)。这对转染脆弱的或难以转染的细胞特别重要，例如T细胞、B 细胞、干细胞和许多其他细胞类型，特别是原代细胞(图12)。
因此，本发明还提供了用于以高转染效率和高活力生产转染的细胞的方法，特别是转染的原代细胞或干细胞，优选原代T细胞，如原代人类T 细胞。高或改善的活力优选高于30％，更优选高于35％或高于40％。例如，可以在转染后第4天评估活力。高转染效率优选高于活细胞的50％，或更优选高于60％。所述方法包括使用本发明的试剂盒。特别地，其包含其中使细胞与以下物质接触的步骤：
a)编码能够移动转座子的转座酶(优选睡美人(Sleeping Beauty))的 mRNA，
b)包含所述转座子的小环DNA，其中所述转座子编码至少一种蛋白质和/或至少一种miRNA，其中所述蛋白质和/或miRNA的表达受启动子调节。优选地，所述转座子编码蛋白质和至少一种优选两种miRNA，其中所述蛋白质和miRNA的表达受相同启动子的调节。
优选地，所述接触包括电穿孔。
在本发明优选的实施方式中，所述转座子编码蛋白质和miRNA(图1 中的D)。优选地，编码蛋白质的转座子包含内含子，所述内含子包含编码miRNA的序列，其中所述蛋白质和miRNA的表达受相同启动子的调节(图6中的A)。在优选的实施方式中，编码蛋白质的转座子包含内含子，所述内含子包含编码至少两种miRNA的序列，其中所述蛋白质和miRNA 的表达受相同启动子的调节。
因此，本发明还提供了一种包含转座子的核酸，其中所述转座子编码至少一种蛋白质和至少一种miRNA，其中编码蛋白质的核酸包含内含子，所述内含子包含编码miRNA的序列，其中蛋白质和miRNA的表达受相同启动子的调节。所述核酸选自包含质粒或小环DNA的组，优选小环 DNA。如果核酸不是小环DNA，则其适合生产小环DNA，因为其包括整合盒外的重组位点，这允许在适于产生小环的特定细菌菌株中在繁殖期间生产小环载体(Kay etal.,2010)，例如ZYCY10P3S2T.(System Biosciences, Mountain View,USA)。这种菌株例如能够表达PhiC31整合酶和I-SceI核酸内切酶。所述核酸可以例如是本发明试剂盒生产中的中间产物。
在本发明的转座子中使用的优选内含子是嵌合内含子，其包含来自人类β-球蛋白基因的第一内含子的5'-剪接供体位点和来自免疫球蛋白基因重链可变区的3'-剪接受体位点，例如US20070190617中公开的。在pCI 和pSI哺乳动物表达载体Promega 7/09的数据表中描述了内含子的优选特征，并且优选地，使用包含在所述载体中的内含子。Choi etal.,2014,Mol Brain 7:17提及了包含所述内含子的载体的序列。
在现有技术中，miRNA通常由不同的启动子表达，或置于转基因的 3'或5'。已经显示，将miRNA掺入到内含子中改善了转基因表达(Chung et al.,2006)。值得注意的是，病毒载体不允许应用高效的内含子。利用本发明的转座子，发明人能够通过掺入多种miRNA来沉默靶细胞的多种细胞因子并同时获得高的转基因表达水平。掺入到γ-逆转录病毒载体的类似基因沉默方法将导致转基因表达水平降低。
转座子相对于病毒载体的附加优点是，根据本发明，在转座子的背景下，可以使用包含相同miRNA骨架并且例如甚至具有相同的完整miRNA 序列的两种或更多种miRNA，而不会损害稳定性。这提高了靶的下调效率，而不需要优化序列(图8)。相比之下，Amendola atal.,2009表明，在病毒载体中使用相同的miRNA两次导致所述载体不稳定和重排。因此，在病毒系统中，有必要在miRNA的最佳效率之间找到折衷，这取决于 miRNA骨架和靶序列之间的相互作用以及防止相同或相似miRNA之间重组的必要性。相反，在根据本发明所述的转座子系统中，没有必要找到这样的折衷。
本发明进一步提供了一种包含转座子的核酸，其中所述转座子编码至少一种蛋白质和两种或更多种miRNA，优选三种或更多种miRNA，四种或更多种miRNA，五种或更多种miRNA或者六种或更多种miRNA，其中编码蛋白质的核酸包含内含子，所述内含子包含编码miRNA的序列，其中蛋白质和miRNA的表达受相同启动子的调节。可选地，在所述miRNA 中，两种或更多种miRNA，优选地，三种或更多种miRNA，四种或更多种miRNA，五种或更多种miRNA或者六种或更多种miRNA，例如所有 miRNA，包含相同的骨架。
优选地，为了在ATT中使用，由转座子编码的蛋白质是TCR或CAR 构建体。TCR构建体可包含一个TCRα链构建体和一个TCRβ链构建体，或单链TCR构建体或CAR构建体。优选地，TCR构建体包含TCRα链构建体和TCRβ链构建体。优选地，CAR构建体包含抗体(scFv)构建体的单链可变片段、间隔区(spacer region)构建体和信号区构建体。
可选地，可以优化TCRα链构建体和TCRβ链构建体的密码子使用以增强TCR在重组T细胞中的表达。人类可变区可以与以下各项组合：鼠恒定区(Cohen et al.,2006)或最小鼠恒定区，即仅含有来自鼠恒定区的限定氨基酸(Sommermeyer et al.,2010；Bialer etal.,2010)并且附加地包含附加半胱氨酸桥(Cohen et al.,2007；Kuball et al.,2007)的人类恒定区域，其增加了转基因TCR链彼此的优先结合，并减少了与由受体T细胞表达的内源性TCR链的配对。发明人已经证明，最佳地，TCR构建体包含被优化用于彼此配对的TCRα链和TCRβ链，其中TCRα和β链构建体各自优选在恒定区包含(a)相对于天然人类TCR的附加Cys残基和(b)鼠氨基酸序列，其中另外地，TCR链是人源的。在优选的实施方式中，TCR构建体包含SEQ ID NO:23。
包括单链(sc)TCR构建体以及异二聚体TCR构建体。scTCR可以包含第一TCR链构建体的可变区(例如α链)和整个(全长)第二TCR链(例如β链)，反之亦然。另外，scTCR可以可选地包含一个或多个接头，其将两个或更多个多肽连接在一起。接头可以是例如肽，其将两条单链连接在一起。还可以编码与细胞因子(例如人类细胞因子，例如IL-2、IL-7、IL-15 或IL-21)融合的scTCR。
另外，可以产生可溶性受体分子和融合蛋白，它们含有TCRα和TCR β链基因的可变区和例如抗体结构域。这些可以是Ig结构域，例如IgG恒定结构域。另外，可以将TCR链的可变区与例如本发明的融合蛋白中的抗-CD3抗体结构域融合，例如以向靶恶性细胞提供可溶性单克隆TCR试剂以向靶细胞提供效应子功能，所述靶恶性细胞在细胞表面表达相应的肽-主要组织相容性复合物(pMHC)并且通过例如抗-CD3靶向结构域接合T 细胞(Liddy etal.,2012)。
TCR构建体能够特异性结合抗原，优选地是由癌细胞和/或病毒感染的细胞以及参与自身免疫性疾病的细胞特异性表达或过表达的抗原。如本文所用，术语“能够特异性结合给定抗原”或“识别给定抗原”或“对于给定抗原具有特异性”，意指TCR构建体可以，优选以高亲和力并通过其可变结构域，特异性结合并免疫学识别表位。可以通过本领域技术人员熟知的方法分析亲和力，例如通过BiaCore。
在优选的实施方式中，转座子进一步编码至少两种miRNA，可选地，三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或更多种miRNA(图6中的A,B)。与编码的蛋白质组合(是TCR构建体或CAR构建体)，优选的是，由转座子编码的miRNA能够抑制TCRα和/或TCRβ链的表达，特别是T细胞的两种内源性TCR链的表达。因此防止了TCR链的错配。然而，编码的蛋白质的表达未被沉默，特别是miRNA不能沉默TCR链或 TCR构建体或CAR(由转座子编码)的表达。优选地，由转座子编码的 TCR链或TCR构建体是密码子优化的，因此序列与内源性TCR序列显著不同。例如，为了预防GvHD(移植物抗宿主病)或减少GvHD(参考US 9,181,527)，其中由转座子编码的miRNA能够抑制TCRα和/或TCRβ链(特别是T细胞的两种内源性TCR链)的表达的实施方案也可以是令人感兴趣的。
发明人能够证明，本发明的小环DNA转座子构建体适用于共表达转基因和甚至多种miRNA，而不会消除转基因的表达。内源性TCR表达的抑制减少了由一个内源性和一个转基因TCR链组成的潜在危险的混合 TCR的产生。另外，内源性TCR的沉默(图6中的C)促进转基因，治疗性 TCR的表达，所述转基因，治疗性TCR需要用于表面表达的细胞辅因子。因此，本发明的基于转座子的载体提供了功能性TCR的有效表达(图6中的D，图7中的A，B)和关键的安全性特征。
转座子优选编码两种能够沉默TCRα链和TCRβ链表达的miRNA。 miRNA通常能够沉默要被遗传修饰的T细胞的内源性TCR链的表达。SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16或SEQ IDNO:19中提供了合适的编码 miRNA的示例性序列。
在一个实施方式中，转座子编码两种或更多种，优选两种具有相同骨架序列的miRNA，或两种或更多种具有相同序列的miRNA。
可替代地或附加地，由转座子编码的miRNA能够沉默能限制转移细胞的治疗效率的蛋白质的表达。在癌症或病毒相关性疾病的免疫疗法的情况下，能够下调效应子功能和/或T细胞增殖的蛋白质选自于包含CTLA4、 PDCD1、LAG3、HAVCR2和TIGIT的抑制性表面受体的组，选自于负调节TCR或共刺激路径包含CBLB、CISH、DGK和TNFAIP3的细胞内蛋白质的组，选自于限制细胞因子的生产包含SPRY2和CREM的细胞内蛋白质的组，或选自于稳定功能失调T细胞表型包含MAF、EGR3、NDRG1 和DTX1的蛋白质的组。
在ATT的背景下，调节蛋白质和/或miRNA表达的启动子具有在T 细胞中表达的功能。优选地，MPSV启动子可用于T细胞工程化。替代性启动子是EF1a、PGK、CMV、CAG等。
在一个实施方式中，本发明提供pSB-miR-T1367(SEQ ID NO:22)，或根据SEQ IDNO:14所述的用于产生本发明的小环的亲本质粒。当然，质粒或小环可以替代地编码不同的TCR构建体。
在优选的实施方式中，在整个本发明中，转座子包括货物(cargo)核酸，其侧翼为左和右反向重复/直接重复(IR/DR)，其中
(i)转座子能够被睡美人转座酶蛋白质移动(mobilize)；
(ii)左IR/DR包括外左DR基序和内左DR基序，其中外左DR基序包含SEQ ID NO：1的核苷酸序列，并且内左DR基序包含SEQ ID NO：2的核苷酸序列；和
(iii)右IR/DR包括外右DR基序和内右DR基序，其中外右DR基序包含SEQ ID NO：1的核苷酸序列的反向序列并且内右DR基序包含SEQ ID NO：2的核苷酸序列的反向序列。
所述货物核酸包含本发明的至少一种蛋白质和至少一种miRNA。优选地，所述外左DR基序包含SEQ ID NO：3的核苷酸序列和/或所述外右 DR基序包含SEQ ID NO：4的核苷酸序列的反向序列。优选地，内左DR 基序包含SEQ ID NO：5的核苷酸序列，和/或内右DR基序包含SEQ ID NO： 6的核苷酸序列的反向序列。优选地，左IR/DR包含能够用作增强子的 HDR区，该HDR区在外DR和内DR之间包含SEQ ID NO：7的核苷酸序列，其中可选地，右IR/DR还包含所述HDR区的反向互补。优选地，左 IR/DR包含选自于SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9组成的组的核苷酸序列。优选地，右IR/DR包含选自于SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13组成的组的反向互补核苷酸序列。已经表明，这种称为pT4或pT5转座子的转座子具有高转座效率，因此可以有利地用于本发明的上下文中。
表1：优选的IR/DR序列
具有HDR的pT4的左IR/DR：
左外DR SEQ ID NO：1 CAGTTGAAGT CGGAAGTTTA CATACACYTW AG
左内DR SEQ ID NO：2 YCCAGTGGGT CAGAAGTGTA CATACAC<u>G</u>V<u>K</u><u>C</u>T
HDR SEQ ID NO：7 GTKTA CAKACASD
框架： pT
SEQ ID NO：8
TACAGTTGAAGTCGGAAGTTTACATACACYTWAGTTGGAGTCATTAAAACTCGTTTTTCAACTACTCCACAAATTTC TTGTTAACAAACAATAGTTTTGGCAAGTCAGTTAGGACATCTACTTTGTGCATGACACAAGTCATTTTTCCAACAAT TGTKTACAKACASDTTATTTCACTTATAATTCACTGTATCACAATYCCAGTGGGTCAGAAGTGT ACATACACGVKCT
具有HDR的pT5的左IR/DR：
左外DR SEQ ID NO：1 CAGTTGAAGT CGGAAGTTTA CATACACYTW AG
左内DR SEQ ID NO：2 YCCAGTGGGT CAGAAGT<u>G</u>TA CATAcAC<u>G</u>V<u>K</u><u>C</u>T
HDR SEQ ID NO：7 GTKTA CAKACASD
框架： pT2
SEQ ID NO：9
TATACAGTTGAAGTCGGAAGTTTACATACACYTWAGTTGGAGTCATTAAAACTCGTTTTTCAACTACTCCACAAATT TCTTGTTAACAAACAATAGTTTTGGCAAGTCAGTTAGGACATCTACTTTGTGCATGACACAAGTCATTTTTCCAACA ATTGTKTACAKACASDTTATTTCACTTATAATTCACTGTATCACAATYCCAGTGGGTCAGAAGT GTACATACACGVKCT
不具有HDR的pT4的右IR/DR(右IR/DR包含给定序列的反向互补)：
右外DR SEQ ID NO：1 CAGTTGAAGT CGGAAGTTTA CATACACYTW AG
右内DR SEQ TD NO：2 YCCAGTGGGT CAGAAGTGTA CATACAC<u>G</u>V<u>K</u><u>C</u>T
框架： pT
SEQ ID NO：10
TACAGTTGAAGTCGGAAGTTTACATACACYTWAGCCAAATACATTTAAACTCACTTTTTCACAATTCCTGACATTTA ATCCGAGTAAAGATTCCCTGTCTTAAGGTCAGTTAGGATCACCACTTTATTTTAAGAATGTGAAATATCAGAATAAT AGTAGAGAGAATGATTCATTTCAGCTTTTATTTCTTTCATCACATTYCCAGTGGGTCAGAAGTG TACATACACGVKCT
不具有HDR的pT5的右IR/DR(右IR/DR包含给定序列的反向互补)：
右外DR SEQ ID NO：1 CAGTTGAAGTCGGAAGTTTA CATACACYTW AG
右内DR SEQ ID NO：2 YCCAGTGGGT CAGAAGTGTA CATACAC<u>G</u>V<u>K</u><u>C</u>T
框架： pT2
SEQ ID NO：11
TATACAGTTGAAGTCGGAAGTTTACATACACYTWAGCCAAATACATTTAAACTCACTTTTTCACAATTCCTGACATT TAATCCTAGTAAAAATTCCCTCTCTTAGGTCAGTTAGGATCACCACTTTATTTTAAGAATGTGAAATATCAGAATAA TAGTAGAGAGAATGATTCATTTCAGCTTTTATTTCTTTCATCACATTYCCAGTGGGTCAGAAGT GTACATACACGVKCT
具有HDR的pT4的右IR/DR(右IR/DR包含给定序列的反向互补)：
右外DR SEQ ID NO：1 CAGTTGAAGT CGGAAGTTTA CATACACYTW AG
右内DR SEQ ID NO：2 YCCAGTGGGT CAGAAGTGTA cATACAC<u>G</u>V<u>K</u><u>C</u>T
HDR SEQ ID NO：7 GTKTA CAKACASD
框架： pT
SEQ ID NO：12
TACAGTTGAAGTCGGAAGTTTACATACACYTWAGCCAAATACATTTAAACTCACTTTTTCACAATTCCTGACATTTA ATCCGAGTAAAGATTCCCTGTCTTAAGGTCAGTTAGGATCACCACTTTATTTTAAGAATGTGAAATATCAGAATAAT AGTAGAGAGAATGATGTKTACAKACASDTCATTTCAGCTTTTATTTCTTTCATCACATTYCCAG TGGGTCAGAAGTGTACATACACGVKCT
具有HDR的pT5的右IR/DR(右IR/DR包含给定序列的反向互补)：
右外DR SEQ ID NO：1 CAGTTGAAGT CGGAAGTTTA CATACACYTW AG
右内DR SEQ ID NO：2 YCCAGTGGGT CAGAAGTGTA CATACAC<u>G</u>V<u>K</u><u>C</u>T
HDR SEQ ID NO：7 GTKTA CAKACASD
框架： pT2
SEQ ID NO：13
TATACAGTTGAAGTCGGAAGTTTACATACACYTWAGCCAAATACATTTAAACTCACTTTTTCACAATTCCTGACATT TAATCCTAGTAAAAATTCCCTGTCTTAGGTCAGTTAGGATCACCACTTTATTTTAAGAATGTGAAATATCAGAATAA TAGTAGAGAGAATGATGTKTACAKACASDTCATTTCAGCTTTTATTTCTTTCATCACATTYCCA GTGGGTCAGAAGTGTACATACACGVKCT
Y＝C/T，其中Y在左DR中优选为T并且在右DR中优选为C；
W＝A/T，其中W在左DR中优选为A且在右DR中优选为T；
V＝A/G/C，其中V优选为C；
K＝G/T，其中K优选为G；
S＝C/G，
D＝A/T/G。
最优选地，Y在左DR中为T且在右DR中为C；W在左DR中为A 且在右DR中为T；V为C；S为C，D为G且K为G。
在转座子的优选实施方式中，左IR/DR包含SEQ ID NO：8的核苷酸序列且右IR/DR包含SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：12的反向互补核苷酸序列。在这些多核苷酸中，框架区对应于pT，并且本发明的多核苷酸被指定为pT4。
在转座子的另一个优选实施方式中，左IR/DR包含SEQ ID NO：9的核苷酸序列并且右IR/DR包含SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：13的反向互补核苷酸序列。在这些多核苷酸中，框架区对应于pT2，并且本发明的多核苷酸被指定为pT5。
包含例如以上及实施例中所述的转座子的小环DNA优选地被包含在本发明的试剂盒中。
本发明还包括一种制备转染细胞的方法，其中所述被转染的细胞优选为原代细胞，最优选为原代T细胞，所述方法包含使用本发明试剂盒的核酸转染细胞，所述核酸包含a)编码能够移动转座子的转座酶的mRNA；和 b)包含所述转座子的小环DNA，其中所述转座子编码蛋白质和/或miRNA，其中蛋白质和/或miRNA的表达受一个启动子调节。
优选地，通过电穿孔来转染细胞，然而，其它非病毒转染方法也是可以的，例如物理方法，如细胞挤压(cell squeezing)、声孔效应 (sonoporation)、流体动力学输送(hydrodynamic delivery)，使用用磷酸钙、树枝状聚合物、脂质体或阳离子聚合物的基于化学品的转染方法，或基于颗粒的方法，如使用基因枪。
在本发明的方法中，优选地，被转染(例如通过电穿孔)的细胞是从患者分离的原代人类T细胞。在这种情况下，所述方法可选地进一步包含使用选自于包含抗-CD3抗体、抗-CD28抗体、抗-CD137抗体、抗-CD134 抗体、抗-CD357抗体、IL-2、IL-7、IL-15和IL-21的组中的一种或多种刺激物刺激T细胞。然而，发明人可以证明，在本发明的方法中，即使没有这样的刺激，转染的T细胞也能存活并且可以扩增。
在一个实施方式中，本发明的方法不包括转染细胞的选择和/或富集。
因此，本发明的方法还构成一种制备具有增强活力的转染细胞的方法。使用编码TCR构建体的本发明的优选转座子和能够下调内源性TCR 链的表达的miRNA，本发明的方法特别适用于制备具有降低的内源性 TCR链表达的转染TCR转基因细胞，和/或用于减少转基因和内源性TCR 链的配对。
使用本发明的试剂盒和方法，通过表达编码TCR构建体的核酸，可以产生对来自主要组织相容性复合物(MHC)上呈现的限定抗原的表位特异的T细胞。如果这种T细胞要用于治疗患者，则优选使用自体T细胞。可替代地，使用免疫抑制可以实现同种异体设定。
本发明还提供了一种遗传修饰的细胞(例如T细胞)的群体，所述细胞包含如上或实施例中所述的编码至少一种蛋白质和至少一种miRNA的转座子，其中编码蛋白质的核酸包含含有编码miRNA的序列的内含子，其中蛋白质和miRNA的表达受相同启动子的调节。所述遗传修饰的细胞群体优选可通过本发明的方法获得。
本发明还提供了一种药物组合物，其包含如上所述的遗传修饰的细胞群体，其例如包含以上或实施例中所述的编码至少一种蛋白质和至少一种 miRNA的转座子，其中编码蛋白质的核酸包含含有编码miRNA的序列的内含子，其中蛋白质和miRNA的表达受相同启动子的调节。优选地，所述药物组合物用于通过继承性T细胞疗法治疗患者，其中所述患者选自包括癌症患者和/或感染病毒或细菌病原体的患者和/或患有自身免疫性疾病的患者的组，并且其中细胞包含表达TCR或CAR构建体且优选地抑制T 细胞内源性TCR表达的miRNA的T细胞。所述药物组合物可以用于预防或减少病原体诸如病毒(例如CMV、EBV、HIV或HPV)的感染，其中采用了适合的TCR或CAR构建体。
本发明还教导了一种治疗有需求的患者(例如感染病毒，或患有癌症，例如与病毒有关的癌症，例如患有自身免疫性疾病)的方法，或一种减少病毒感染或减少所述感染的症状的方法，包含向所述患者给药本发明的合适药物组合物。
在整个本发明中，T细胞可以是CD8+或CD4+T细胞，优选CD8+细胞或调节性T细胞。药物组合物还可以包含转基因CD4+和CD8+T细胞，其中各自的TCR优选针对相同抗原的不同表位。优选地，T细胞是人类T 细胞，并且待治疗的患者是人类患者。
通过以下实施例进一步说明本发明，这些实施例旨在举例说明本发明，而不是限制其范围。本文引用的所有参考文献均在此完全引入。本文公开的本发明的所有实施方式均可以组合。
附图说明
图1
本发明中应用的基于睡美人转座子的基因转移系统的改进的示意图。
与常规的睡美人转移系统(A)相比，本发明的试剂盒包含编码睡美人转座酶的mRNA(ivtRNA)(B)、包含编码转基因的转座子的小环DNA(C) 和沉默内源性基团的miRNA(D)，所述内源性基团阻碍有效转基因(例如 TCR)的表达和治疗功效。
图2
将质粒DNA转染到人类T细胞中导致剂量依赖性T细胞死亡率。
使用编码GFP的质粒DNA(pSB-GFP)转染的人类T细胞显示出剂量依赖性死亡率，而相似量的转染的GFP-mRNA仅显示T细胞计数的轻微减少(A)。与pSB-GFP的转染相比，GFP-ivtRNA的转染更有效并且产生更多的GFP+T细胞。另外，转染后三至四天，高DNA量(>10μg)的转染导致了GFP+T细胞减少(B)。
图3
以ivtRNA及以编码转座酶的质粒的形式递送转座酶产生了相似的基因转移效率。
使用常规的基于睡美人转座子的基因转移系统将转座酶作为DNA质粒(SBTS-co)递送和使用本发明的基于睡美人转座子的基因转移系统将转座酶作为ivtRNA(SBTS-iR)递送，在人类T细胞中的GFP表达的比较。所显示的是第1天(瞬时表达)和第12天(稳定表达)的GFP+CD3+T细胞百分比。
图4
将转座酶作为ivtRNA递送的基于睡美人转座子的基因转移增加了细胞活力(viability)。
如图2所示，采用SBTS-co和SBTS-iR，使用编码GFP的转座子转染人类T细胞。显示了使用不同量的转座子质粒和DNA转座酶或ivtRNA 转座酶转染后24小时存活T细胞的百分比。
图5
使用小环DNA转座子的基于睡美人转座子的基因转移提高了转染效率。
含有编码转座酶的ivtRNA以及转座子质粒DNA(pSB)或转座子小环 DNA(mSB)的基于睡美人转座子的基因转移系统的比较，转座子质粒DNA (pSB)和转座子小环DNA(mSB)这两者均编码GFP(A)。示出了平均荧光强度、MFI(B)和GFP+人类T细胞的百分比(C)。pmax-GFP表示无ivtRNA 转座酶的瞬时转染对照，无TF(non-TF)表示未使用核酸的转染条件。
图6
递送编码工程化的TCR的小环转座子DNA和用于内源性TCR沉默的miRNA的基于睡美人转座子的基因转移系统导致治疗性TCR的表达改善。
携带(harboring)miRNA(miR)和在MAGE-A1反应性TCR T1367序列中的修饰的小环转座子载体(A)。包含具有不同修饰的TCR T1367的小环转座子载体。1：优化的TCR密码子；2：1加miRNA盒(miR)；3：优化的TCR密码子，附加的半胱氨酸键，最小的鼠源化C-区(opt)；4：3加 miRNA盒(miR opt)(B)。miRNA的表达减少了治疗性和内源性TCR链之间形成的错配TCR的形成(C)。通过MHC多聚体(multimer)结合测量的， miRNA的表达增加了TCR-工程化的人类T细胞的功能(D)。
图7
使用基于完全优化的睡美人转座子的基因转移系统工程化的人类T 细胞显示出改善的功能。
使用基于完全优化的睡美人转座子的基因转移系统(编码转座酶的 ivtRNA、含有miRNA以敲除(knowndown)内源性TCR表达的小环转座子DNA、优化的治疗性TCR)转染人类T细胞，响应于肽载指示剂细胞 (peptide-loaded indicator cells)(A)和MAGE-A1+HLA-A*02:01+ (MAGE-A1+,A2+)肿瘤细胞系显示出改善的IFN-γ释放，而A2-和 MAGE-A1-细胞系并未确认(B)。
图8
使用本发明的系统，可以在一个载体中组合相同的miRNA(2x相同的miRNA)。
使用转座酶质粒和编码GFP的SB转座子质粒以及一个(B)或两个相同的(C)人类TCRα链(TRAC,SEQ ID NO:15)特异性的miRNA或不使用 miRNA(A)，对Jurkat细胞进行电穿孔，并在8天后通过流式细胞术分析 CD3表面表达。一个miRNA盒的敲除率为74％，而两次结合至转座子载体中的相同miRNA盒的敲除率为84％。
图9
原代人类T细胞(HTC)：质粒(p)vs.小环(mc)。
使用15μg SB转座酶RNA和2.5μg SB转座子载体(作为质粒或小环) 对原代人类T细胞进行电穿孔，并且4天后通过流式细胞术进行分析。代替常规质粒，将SB转座子提供为小环大幅提高了转染效率(B)，而不会损害T细胞活力(viability)(A)。
图10
原代人类T细胞(HTC)：SB RNA vs.SB质粒。
使用2.5μg编码GFP的SB转座子小环以及15μg SB转座酶(作为体外转录的RNA(SBRNA)或作为质粒(SB质粒))对原代人类T细胞进行电穿孔，并且4天后通过流式细胞术进行分析。代替质粒DNA，将SB转座酶提供为RNA降低了转染后的T细胞死亡率，即提高了T细胞活力(A)。其还提高了转染效率(B)。
图11
原代人类T细胞(HTC)：常规双质粒(p)系统vs.小环(mc)/RNA。
使用常规的SB双质粒系统(使用2.5μg转座子载体和2.5μg转座酶载体)或者使用2.5μg转座子小环和15μg SB RNA对原代人类T细胞进行电穿孔，并且在4天后通过流式细胞术进行分析。代替常规的双质粒系统，应用小环和RNA大幅提高了转染效率(B)，而不会损害T细胞活力(A)。
图12
Jurkat细胞与原代人类T细胞(HTC)的比较：常规双质粒(p)系统 vs.小环(mc)/RNA。
替代方法使用大量质粒DNA来实现类似的效率。然而，这些大量质粒DNA的使用导致高细胞死亡率，阻碍用于临床应用的大规模T细胞生成。尽管这种方法适用于细胞系的转染，但原代T细胞很少能经受大量DNA的转染。另外，DNA转染的原代T细胞显示出T细胞活化的延迟，因此难以扩展。此处，我们将使用转座子小环和转座酶RNA的我们的方法与使用大量质粒DNA的常规方法进行了比较。使用据报道可以达到很高的转染效率的常规SB双质粒系统(使用大量DNA(10μg/10μg或 20μg/10μg)，或使用我们的小环/RNA方法，对原代人类T细胞(A)或Jurkat 细胞系细胞(B)进行电穿孔，并在4天后通过流式细胞术分析。尽管Jurkat 细胞耐受大量DNA，但原代T细胞几乎不能经受使用20μg或30μg总 DNA。然而，我们的小环/RNA方法能够有效转染原代T细胞，确保电穿孔后T细胞存活(viable)(30-40％活力(viability))。
具体实施方式
实施例1
常规睡美人基因转移系统(SBTS-co)的生产
将睡美人pT2/HB转座子质粒(Cui et al.,2002)修饰以携带MP71逆转录病毒载体的MPSV启动子(Engels et al.,2003)、嵌合内含子和psiCHECK2 的polyA信号(Promega,Madison,USA)。然后，分别将增强的绿色荧光蛋白(GFP)和MAGE-A1特异性人TCR T1367转基因(Obenaus et al.,2015)克隆到经修饰的pT2载体中，以分别获得pSB-GFP和pSB-T1367。
为了有效的TCR表达，TCR T1367序列经密码子优化(Geneart, Darmstadt,Germany)并且通过PCR经由猪捷申病毒(porcine teschovirus) 的2A元素(P2A)连接TCRα-和TCRβ-链(Leisegang et al.,2008)。通过含有附加半胱氨酸桥的最小鼠源化对应物(Sommermeyer and Uckert,2010)替代 TCR T1367人类恒定区(Kuball et al.,2007；Rosenberg et al.,2008), (T1367opt)。最终的TCR构建体对应于SEQ ID NO:23(专利WO2014118236A2,High avidity antigen recognizing constructs(高亲和力抗原识别构建体))。使用EndoFree Plasmid Maxi试剂盒(Qiagen,Hilden, Germany)生产转座子质粒DNA(pSB-GFP,pSB-T1367)。转座子质粒与睡美人SB100X转座酶(Mátés et al.,2009)配合使用，所述睡美人SB100X转座酶作为DNA质粒递送，通过电穿孔转染人类T细胞。
实施例2
使用体外转录的(ivt)RNA转座酶生产睡美人基因转移系统(SBTS-iR)
使用mMESSAGE mMACHINE T7试剂盒(ThermoFischer,Waltham, USA)根据制造商的指示，由pcDNA3.1/Hygro(+)(Invitrogen,Carlsbad,USA) 制备编码睡美人SB100X转座酶或GFP的ivtRNA。使用Poly(A)-加尾试剂盒(Poly(A)-tailing kit)(ThermoFischer,Waltham,USA)添加poly(A)-尾，并且使用RNeasy试剂盒(Qiagen)在柱上纯化RNA。将ivtRNA转座酶与经修饰的睡美人pT2/HB转座子质粒(实施例1)配合使用以通过电穿孔来转染人类T细胞。
实施例3
睡美人转座子小环DNA的生产
为了生成亲本小环载体(parental minicircle vector)，经由BamHI限制性位点，将含有启动子、内含子、转基因和polyA信号的盒插入到质粒 pMC.BESPX-MCS2(SystemBiosciences,Mountain View,USA)。在小环重组位点attB和左反向重复之间插入210bp的间隔物(spacer)。最终质粒对应于SEQ ID NO:14。使用MC-Easy小环DNA生产试剂盒(SystemBiosciences,Palo Alto,USA)和EndoFree Plasmid Mega试剂盒(Qiagen)根据制造商的指示，生产睡美人转座子小环DNA(mSB-GFP,mSB-T1367)。使用Poly(A)-加尾试剂盒(ThermoFischer)添加poly(A)-尾，并且使用RNeasy 试剂盒(Qiagen)在柱上纯化RNA。将转座子小环DNA与ivtRNA转座酶(实施例2)配合使用以通过电穿孔来转染人类T细胞。
实施例4
用于沉默内源性TCR的微(mi)RNA的生产
如我们针对小鼠TCR所描述的，设计人类TCR特异性miRNA盒 (Bunse et al.,2014)。将TCRα-特异性反义序列TGA AAG TTT AGG TTC GTA TCT G(SEQ ID NO:15)和TCRβ-特异性反义序列TCT GAT GGC TCA AAC ACA GCG A(SEQ ID NO:16)分别整合到miRNA环境miR-155 (Chung et al.,2006),SEQ ID NO:17和人工miRNA(
Figure BDA0001794792850000162
et al.,2006),SEQ ID NO:18中，获得SEQ ID NO:19。
然后，将miRNA插入到TCR转座子质粒的内含子中，获得 pSB-miR-T1367co(SEQ IDNO:22)。
实施例5
T细胞的分离和电穿孔以及Jurkat细胞的电穿孔
通过在Biocoll(Biochrom,Berlin,Germany)上离心，随后使用EasySep 人类T细胞富集试剂盒(STEMCELL Technologies,
Figure BDA0001794792850000161
Germany)进行富集，由新鲜分离的PBMC制备T细胞。在TCR转移的情况下，通过用PE 标记的抗-Vβ3抗体(克隆Jovi-3,Ancell,Bayport,USA)温育，随后用抗-PE 珠(STEMCELL Technologies,Vancouver,Kanada)选择，从细胞级分中耗尽 (deplete)Vβ3-阳性细胞。
根据制造商的指示，对T细胞使用Amaxa人类T细胞Nucleofector 试剂盒(Lonza,Basel,Schweiz)且对Jurkat细胞使用Amaxa细胞系 Nucleofector试剂盒V进行电穿孔。将6-10x106个T细胞或5-10x106个 Jurkat细胞悬浮于100μl核转染缓冲液和1.25μg至20μg转座子载体 DNA中，并且转移到比色皿中。然后，对T细胞应用程序U-14，并且对 Jurkat细胞应用程序X-01，立即向细胞提供2ml T细胞培养基(TCM:RPMI 1640,10％胎牛血清,1mM丙酮酸钠,1x非必需氨基酸)并且培养过夜。电穿孔后一天，将T细胞重悬浮于2ml补充有400U/ml重组人类白细胞介素-2(IL-2,Chiron,Marburg,Germany)的新鲜TCM中，并且通过将它们接种在覆盖有抗-CD3(克隆OKT3,5μg/ml)和抗-CD28(克隆CD28.2,1μg/ml) 抗体的24-孔板上以进行活化。然后将细胞扩增最长达18天。在功能分析前三至四天，IL-2的浓度降至40U/ml。
实施例6
分析测量：
流式细胞术
在4℃下使用针对CD8(HIT8α)、Vβ3(Jovi-3,Ancell)、CD25(BC96)、 CD28和CD3(UCHT1)的mAb，在50μl PBS中进行T细胞表面染色30 分钟。抗体购自Biolegend(SanDiego,USA)、eBioscience、BD或Beckman Coulter。MAGE-A1/HLA-A2多聚体(multimer)(MBLInternational,Woburn, USA)染色在4℃下进行30分钟。通过SYTOX Blue(LifeTechnologies, Carlsbad,USA)的死细胞染色和FSC/SSC淋巴细胞门(gate)确定T细胞活力(viability)。在FACS CantoII(BD)或MACS Quant(Miltenyi Biotec, BergischGladbach,Germany)上采集数据，并且使用FlowJo软件(Tree Star, Ashland,USA)进行分析。由Biosyntan(Berlin,Germany)生成MAGE-A1278 -特异性肽(KVLEYVIKV,SEQ ID NO:20)和不相关的酪氨酸酶-特异性对照肽Tyr369(YMDGTMSQV,SEQ ID NO:21)。
细胞因子释放试验
为了检测分泌的细胞因子，将TCR-修饰的T细胞(每孔104)与 MAGE-A1278-加载的T2细胞或肿瘤细胞系一起以1:1的效应子:靶(E:T)比率接种在96-孔圆底板中。24小时后收获上清液，并通过ELISA或细胞计数珠阵列分析(两者均来自BD)。
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US 9,181,527；US20070190617：DE10 2011 118 018 Al.
序列表
<110> 马克思-德布鲁克-分子医学中心（Max-Delbrueck-Centrum fuer MolekulareMedizin）
柏林洪堡大学（Humboldt-Universität zu Berlin）
<120> 用于原代细胞的基于转座子的转染系统（A transposon-based transfectionsystem for primary cells）
<130> MDC16343PCT
<160> 23
<170> BiSSAP 1.3
<210> 1
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> misc_feature
<223> pT 4/5 共有序列外DR
<400> 1
cagttgaagt cggaagttta catacacytw ag 32
<210> 2
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> misc_feature
<223> pT4/5 共有序列内DR
<400> 2
yccagtgggt cagaagtgta catacacgvk ct 32
<210> 3
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> misc_feature
<223> pT4/5 左外DR
<400> 3
cagttgaagt cggaagttta catacactta ag 32
<210> 4
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> misc_feature
<223> pT4/5 右外DR
<400> 4
cagttgaagt cggaagttta catacacctt ag 32
<210> 5
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> misc_feature
<223> pT4/5 左内DR
<400> 5
tccagtgggt cagaagtgta catacacgvk ct 32
<210> 6
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> misc_feature
<223> pT4/5 右内DR
<400> 6
cccagtgggt cagaagtgta catacacgvk ct 32
<210> 7
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> misc_feature
<223> HDR
<400> 7
gtktacakac asd 13
<210> 8
<211> 231
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> misc_feature
<223> 具有HDR的pT4的左 IR/DR
<400> 8
tacagttgaa gtcggaagtt tacatacacy twagttggag tcattaaaac tcgtttttca 60
actactccac aaatttcttg ttaacaaaca atagttttgg caagtcagtt aggacatcta 120
ctttgtgcat gacacaagtc atttttccaa caattgtkta cakacasdtt atttcactta 180
taattcactg tatcacaaty ccagtgggtc agaagtgtac atacacgvkc t 231
<210> 9
<211> 233
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> misc_feature
<223> 具有HDR的pT5的左 IR/DR
<400> 9
tatacagttg aagtcggaag tttacataca cytwagttgg agtcattaaa actcgttttt 60
caactactcc acaaatttct tgttaacaaa caatagtttt ggcaagtcag ttaggacatc 120
tactttgtgc atgacacaag tcatttttcc aacaattgtk tacakacasd ttatttcact 180
tataattcac tgtatcacaa tyccagtggg tcagaagtgt acatacacgv kct 233
<210> 10
<211> 232
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> misc_feature
<223> 不具有HDR的pT4的右 IR/DR (右IR/DR包含给定序列的反向互补)
<400> 10
tacagttgaa gtcggaagtt tacatacacy twagccaaat acatttaaac tcactttttc 60
acaattcctg acatttaatc cgagtaaaga ttccctgtct taaggtcagt taggatcacc 120
actttatttt aagaatgtga aatatcagaa taatagtaga gagaatgatt catttcagct 180
tttatttctt tcatcacatt yccagtgggt cagaagtgta catacacgvk ct 232
<210> 11
<211> 233
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> misc_feature
<223> 不具有HDR的pT5的右 IR/DR（右IR/DR包含给定序列的反向互补）:
<400> 11
tatacagttg aagtcggaag tttacataca cytwagccaa atacatttaa actcactttt 60
tcacaattcc tgacatttaa tcctagtaaa aattccctgt cttaggtcag ttaggatcac 120
cactttattt taagaatgtg aaatatcaga ataatagtag agagaatgat tcatttcagc 180
ttttatttct ttcatcacat tyccagtggg tcagaagtgt acatacacgv kct 233
<210> 12
<211> 245
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> misc_feature
<223> 具有HDR的pT4的右IR/DR(右IR/DR包含给定序列的反向互补)
<400> 12
tacagttgaa gtcggaagtt tacatacacy twagccaaat acatttaaac tcactttttc 60
acaattcctg acatttaatc cgagtaaaga ttccctgtct taaggtcagt taggatcacc 120
actttatttt aagaatgtga aatatcagaa taatagtaga gagaatgatg tktacakaca 180
sdtcatttca gcttttattt ctttcatcac attyccagtg ggtcagaagt gtacatacac 240
gvkct 245
<210> 13
<211> 246
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> misc_feature
<223> 具有HDR的pT5的右IR/DR(右IR/DR包含给定序列的反向互补)
<400> 13
tatacagttg aagtcggaag tttacataca cytwagccaa atacatttaa actcactttt 60
tcacaattcc tgacatttaa tcctagtaaa aattccctgt cttaggtcag ttaggatcac 120
cactttattt taagaatgtg aaatatcaga ataatagtag agagaatgat gtktacakac 180
asdtcatttc agcttttatt tctttcatca cattyccagt gggtcagaag tgtacataca 240
cgvkct 246
<210> 14
<211> 6461
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> misc_feature
<223> 用于小环生产的质粒
<400> 14
ttgcagaaga tcctgaacgt gcagaagaag ctgcctatca tccagaagat catcatcatg 60
gactctaaga ccgactacca gggcttccag agcatgtaca cattcgtgac atctcatctg 120
cctcctggct tcaacgagta cgacttcgtg ccagagtctt tcgacaggga caaaaccatt 180
gccctgatca tgaacagctc tgggtctacc gagatctgat atctctagag tcgagctagc 240
ttcgaattta aatcggatcc ctatacagtt gaagtcggaa gtttacatac accttagcca 300
aatacattta aactcacttt ttcacaattc ctgacattta atcctagtaa aaattccctg 360
tcttaggtca gttaggatca ccactttatt ttaagaatgt gaaatatcag aataatagta 420
gagagaatga ttcatttcag cttttatttc tttcatcaca ttcccagtgg gtcagaagtt 480
tacatacact caattagtat ttggtagcat tgcctttaaa ttgtttaact tgggtcaaac 540
atttcgagta gccttccaca agctagatcc tgggaataaa tggcggtaag atgctcgaat 600
tacacacaaa aaaccaacac acagatgtaa tgaaaataaa gatattttat tgaattctta 660
cttgtacagc tcgtccatgc cgagagtgat cccggcggcg gtcacgaact ccagcaggac 720
catgtgatcg cgcttctcgt tggggtcttt gctcagggcg gactgggtgc tcaggtagtg 780
gttgtcgggc agcagcacgg ggccgtcgcc gatgggggtg ttctgctggt agtggtcggc 840
gagctgcacg ctgccgtcct cgatgttgtg gcggatcttg aagttcacct tgatgccgtt 900
cttctgcttg tcggccatga tatagacgtt gtggctgttg tagttgtact ccagcttgtg 960
ccccaggatg ttgccgtcct ccttgaagtc gatgcccttc agctcgatgc ggttcaccag 1020
ggtgtcgccc tcgaacttca cctcggcgcg ggtcttgtag ttgccgtcgt ccttgaagaa 1080
gatggtgcgc tcctggacgt agccttcggg catggcggac ttgaagaagt cgtgctgctt 1140
catgtggtcg gggtagcggc tgaagcactg cacgccgtag gtcagggtgg tcacgagggt 1200
gggccagggc acgggcagct tgccggtggt gcagatgaac ttcagggtca gcttgccgta 1260
ggtggcatcg ccctcgccct cgccggacac gctgaacttg tggccgttta cgtcgccgtc 1320
cagctcgacc aggatgggca ccaccccggt gaacagctcc tcgcccttgc tcaccatgcg 1380
gccgctggga gtggacacct gtggagagaa aggcaaagtg gatgtcagta agaccaatag 1440
gtgcctatca gaaacgcaag agtcttcatg cattaattac gcgttctgtc tcgacaagcc 1500
cagtttctat tggtctcctt aaacctgtct tgtaaccttg atacttacct gcccagtgcc 1560
tctccggaca aatgaaagac ccccgaggtg ggcagtcaat cactcagagg agaccctccc 1620
aaggaacagc gagaccacga gtcggatgca actgcaagag ggtttattga gaacacgggt 1680
acccgggcga cgcagtctat cggaggactg gcgcgccgag tgaggggttg tgggctcttt 1740
tattgagctc ggggagcaga agcgcgcgaa cagaagcgag aagcgaactg attggttagt 1800
tcaaataagg cacagggtca tttcaggtcc ttggggcacc ctggaaacat ctgatggttc 1860
tctagaaact gctgagggcg ggaccgcatc tggggaccat ctgttcttgg ccctgagccg 1920
gggcaggaac tgcttaccac agatatcctg tttggcccat attctgctgt tccaactgtt 1980
cttggccctg agccggggca ggaactgctt accacagata tcctgtttgg cccatattct 2040
gctgtctctc tgttcctaac cttgatctga acttctcaag cttctaaagc catgacatca 2100
ttttctggaa ttttccaagc tgtttaaagg cacagtcaac ttagtgtatg taaacttctg 2160
acccactgga attgtgatac agtgaattat aagtgaaata atctgtctgt aaacaattgt 2220
tggaaaaatg acttgtgtca tgcacaaagt agatgtccta actgacttgc caaaactatt 2280
gtttgttaac aagaaatttg tggagtagtt gaaaaacgag ttttaatgac tccaacttaa 2340
gtgtatgtaa acttccgact tcaactgtat agggatccct gcaggagctc gtcgacccat 2400
gggggcccgc cccaactggg gtaacctttg agttctctca gttgggggta atcagcatca 2460
tgatgtggta ccacatcatg atgctgatta taagaatgcg gccgccacac tctagtggat 2520
ctcgagttaa taattcagaa gaactcgtca agaaggcgat agaaggcgat gcgctgcgaa 2580
tcgggagcgg cgataccgta aagcacgagg aagcggtcag cccattcgcc gccaagctct 2640
tcagcaatat cacgggtagc caacgctatg tcctgatagc ggtccgccac acccagccgg 2700
ccacagtcga tgaatccaga aaagcggcca ttttccacca tgatattcgg caagcaggca 2760
tcgccatggg tcacgacgag atcctcgccg tcgggcatgc tcgccttgag cctggcgaac 2820
agttcggctg gcgcgagccc ctgatgctct tcgtccagat catcctgatc gacaagaccg 2880
gcttccatcc gagtacgtgc tcgctcgatg cgatgtttcg cttggtggtc gaatgggcag 2940
gtagccggat caagcgtatg cagccgccgc attgcatcag ccatgatgga tactttctcg 3000
gcaggagcaa ggtgtagatg acatggagat cctgccccgg cacttcgccc aatagcagcc 3060
agtcccttcc cgcttcagtg acaacgtcga gcacagctgc gcaaggaacg cccgtcgtgg 3120
ccagccacga tagccgcgct gcctcgtctt gcagttcatt cagggcaccg gacaggtcgg 3180
tcttgacaaa aagaaccggg cgcccctgcg ctgacagccg gaacacggcg gcatcagagc 3240
agccgattgt ctgttgtgcc cagtcatagc cgaatagcct ctccacccaa gcggccggag 3300
aacctgcgtg caatccatct tgttcaatca tgcgaaacga tcctcatcct gtctcttgat 3360
cagagcttga tcccctgcgc catcagatcc ttggcggcga gaaagccatc cagtttactt 3420
tgcagggctt cccaacctta ccagagggcg ccccagctgg caattccggt tcgcttgctg 3480
tccataaaac cgcccagtct agctatcgcc atgtaagccc actgcaagct acctgctttc 3540
tctttgcgct tgcgttttcc cttgtccaga tagcccagta gctgacattc atccggggtc 3600
agcaccgttt ctgcggactg gctttctacg tgctcgaggg gggccaaacg gtctccagct 3660
tggctgtttt ggcggatgag agaagatttt cagcctgata cagattaaat cagaacgcag 3720
aagcggtctg ataaaacaga atttgcctgg cggcagtagc gcggtggtcc cacctgaccc 3780
catgccgaac tcagaagtga aacgccgtag cgccgatggt agtgtggggt ctccccatgc 3840
gagagtaggg aactgccagg catcaaataa aacgaaaggc tcagtcgaaa gactgggcct 3900
ttcgttttat ctgttgtttg tcggtgaacg ctctcctgag taggacaaat ccgccgggag 3960
cggatttgaa cgttgcgaag caacggcccg gagggtggcg ggcaggacgc ccgccataaa 4020
ctgccaggca tcaaattaag cagaaggcca tcctgacgga tggccttttt gcgtttctac 4080
aaactctttt gtttattttt ctaaatacat tcaaatatgt atccgctcat gaccaaaatc 4140
ccttaacgtg agttttcgtt ccactgagcg tcagaccccg tagaaaagat caaaggatct 4200
tcttgagatc ctttttttct gcgcgtaatc tgctgcttgc aaacaaaaaa accaccgcta 4260
ccagcggtgg tttgtttgcc ggatcaagag ctaccaactc tttttccgaa ggtaactggc 4320
ttcagcagag cgcagatacc aaatactgtc cttctagtgt agccgtagtt aggccaccac 4380
ttcaagaact ctgtagcacc gcctacatac ctcgctctgc taatcctgtt accagtggct 4440
gctgccagtg gcgataagtc gtgtcttacc gggttggact caagacgata gttaccggat 4500
aaggcgcagc ggtcgggctg aacggggggt tcgtgcacac agcccagctt ggagcgaacg 4560
acctacaccg aactgagata cctacagcgt gagctatgag aaagcgccac gcttcccgaa 4620
gggagaaagg cggacaggta tccggtaagc ggcagggtcg gaacaggaga gcgcacgagg 4680
gagcttccag ggggaaacgc ctggtatctt tatagtcctg tcgggtttcg ccacctctga 4740
cttgagcgtc gatttttgtg atgctcgtca ggggggcgga gcctatggaa aaacgccagc 4800
aacgcggcct ttttacggtt cctggccttt tgctggcctt ttgctcacat gttctttcct 4860
gcgttatccc ctgattctgt ggataaccgt attaccgcct ttgagtgagc tgataccgct 4920
cgccgcagcc gaacgaccga gcgcagcgag tcagtgagcg aggaagcgga agagcgcctg 4980
atgcggtatt ttctccttac gcatctgtgc ggtatttcac accgcatatg gtgcactctc 5040
agtacaatct gctctgatgc cgcatagtta agccagtata cactccgcta tcgctacgtg 5100
actgggtcat ggctgcgccc cgacacccgc caacacccgc tgacgcgccc tgacgggctt 5160
gtctgctccc ggcatccgct tacagacaag ctgtgaccgt ctccgggagc tgcatgtgtc 5220
agaggttttc accgtcatca ccgaaacgcg cgaggcagca gatcaattcg cgcgcgaagg 5280
cgaagcggca tgcataatgt gcctgtcaaa tggacgaagc agggattctg caaaccctat 5340
gctactccgt caagccgtca attgtctgat tcgttaccaa ttatgacaac ttgacggcta 5400
catcattcac tttttcttca caaccggcac ggaactcgct cgggctggcc ccggtgcatt 5460
ttttaaatac ccgcgagaaa tagagttgat cgtcaaaacc aacattgcga ccgacggtgg 5520
cgataggcat ccgggtggtg ctcaaaagca gcttcgcctg gctgatacgt tggtcctcgc 5580
gccagcttaa gacgctaatc cctaactgct ggcggaaaag atgtgacaga cgcgacggcg 5640
acaagcaaac atgctgtgcg acgctggcga tacattaccc tgttatccct agatgacatt 5700
accctgttat cccagatgac attaccctgt tatccctaga tgacattacc ctgttatccc 5760
tagatgacat ttaccctgtt atccctagat gacattaccc tgttatccca gatgacatta 5820
ccctgttatc cctagataca ttaccctgtt atcccagatg acataccctg ttatccctag 5880
atgacattac cctgttatcc cagatgacat taccctgtta tccctagata cattaccctg 5940
ttatcccaga tgacataccc tgttatccct agatgacatt accctgttat cccagatgac 6000
attaccctgt tatccctaga tacattaccc tgttatccca gatgacatac cctgttatcc 6060
ctagatgaca ttaccctgtt atcccagatg acattaccct gttatcccta gatacattac 6120
cctgttatcc cagatgacat accctgttat ccctagatga cattaccctg ttatcccaga 6180
tgacattacc ctgttatccc tagatacatt accctgttat cccagatgac ataccctgtt 6240
atccctagat gacattaccc tgttatccca gatgacatta ccctgttatc cctagataca 6300
ttaccctgtt atcccagatg acataccctg ttatccctag atgacattac cctgttatcc 6360
cagataaact caatgatgat gatgatgatg gtcgagactc agcggccgcg gtgccagggc 6420
gtgcccttgg gctccccggg cgcgactagt gaattcagat c 6461
<210> 15
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> misc_feature
<223> TCRα-特异性反义序列
<400> 15
tgaaagttta ggttcgtatc tg 22
<210> 16
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> misc_feature
<223> TCRβ-特异性反义序列
<400> 16
tctgatggct caaacacagc ga 22
<210> 17
<211> 149
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> misc_feature
<223> miR-155
<400> 17
cttatcctct ggctgctgga ggcttgctga aggctgtatg ctgtgaaagt ttaggttcgt 60
atctgttttg gcctctgact gacagatacg aataaacttt cacaggacac aaggcctgtt 120
actagcactc acatggaaca aatggccac 149
<210> 18
<211> 157
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> misc_feature
<223> 人工 miRNA
<400> 18
caagagaaca aagtggagtc tttgttgccc acacccagct tccctggctc tctgatggct 60
caaacacagc gagtacatga gacacgctgt gtttcagcca tcggtgagct tgggaagcat 120
ctgcagcaga gcctgcctgg tggcccctga gagattt 157
<210> 19
<211> 312
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> misc_feature
<223> 用于沉默人类TCR a和b链表达的miRNA构建体
<400> 19
cttatcctct ggctgctgga ggcttgctga aggctgtatg ctgtgaaagt ttaggttcgt 60
atctgttttg gcctctgact gacagatacg aataaacttt cacaggacac aaggcctgtt 120
actagcactc acatggaaca aatggccaca cgcgccaaga gaacaaagtg gagtctttgt 180
tgcccacacc cagcttccct ggctctctga tggctcaaac acagcgagta catgagacac 240
gctgtgtttc agccatcggt gagcttggga agcatctgca gcagagcctg cctggtggcc 300
cctgagagat tt 312
<210> 20
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> MUTAGEN
<223> MAGE-A1278 -特异性肽
<400> 20
Lys Val Leu Glu Tyr Val Ile Lys Val
1 5
<210> 21
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> MUTAGEN
<223> 酪氨酸酶-特异性对照肽Tyr369
<400> 21
Tyr Met Asp Gly Thr Met Ser Gln Val
1 5
<210> 22
<211> 6417
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> misc_feature
<223> pSB-miR-TCR1367co
<400> 22
caaggcgatt aagttgggta acgccagggt tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg 60
ccagtgagcg cgcgtaatac gactcactat agggcgaatt ggagctcgga tccctataca 120
gttgaagtcg gaagtttaca tacacttaag ttggagtcat taaaactcgt ttttcaacta 180
ctccacaaat ttcttgttaa caaacaatag ttttggcaag tcagttagga catctacttt 240
gtgcatgaca caagtcattt ttccaacaat tgtttacaga cagattattt cacttataat 300
tcactgtatc acaattccag tgggtcagaa gtttacatac actaagttga ctgtgccttt 360
aaacagcttg gaaaattcca gaaaatgatg tcatggcttt agaagcttga gaagttcaga 420
tcaaggttag gaacagagag acagcagaat atgggccaaa caggatatct gtggtaagca 480
gttcctgccc cggctcaggg ccaagaacag ttggaacagc agaatatggg ccaaacagga 540
tatctgtggt aagcagttcc tgccccggct cagggccaag aacagatggt ccccagatgc 600
ggtcccgccc tcagcagttt ctagagaacc atcagatgtt tccagggtgc cccaaggacc 660
tgaaatgacc ctgtgcctta tttgaactaa ccaatcagtt cgcttctcgc ttctgttcgc 720
gcgcttctgc tccccgagct caataaaaga gcccacaacc cctcactcgg cgcgccagtc 780
ctccgataga ctgcgtcgcc cgggtacccg tgttctcaat aaaccctctt gcagttgcat 840
ccgactcgtg gtctcgctgt tccttgggag ggtctcctct gagtgattga ctgcccacct 900
cgggggtctt tcatttgtcc ggagaggcac tgggcaggta agtatcaagg ttacaagaca 960
ggtttaagga gaccaataga aactgggctt gtcgagacag aacgcgcctt atcctctggc 1020
tgctggaggc ttgctgaagg ctgtatgctg tgaaagttta ggttcgtatc tgttttggcc 1080
tctgactgac agatacgaat aaactttcac aggacacaag gcctgttact agcactcaca 1140
tggaacaaat ggccacacgc gccaagagaa caaagtggag tctttgttgc ccacacccag 1200
cttccctggc tctctgatgg ctcaaacaca gcgagtacat gagacacgct gtgtttcagc 1260
catcggtgag cttgggaagc atctgcagca gagcctgcct ggtggcccct gagagattta 1320
cgcgtaatta atgcatgaag actcttgcgt ttctgatagg cacctattgg tcttactgac 1380
atccactttg cctttctctc cacaggtgtc cactcccagc ggccgccacc atgggaatca 1440
gactgctgtg cagagtggcc ttctgcttcc tggccgtggg cctggtggac gtgaaagtga 1500
cccagagcag cagatacctc gtgaagcgga ccggcgagaa ggtgttcctg gaatgcgtgc 1560
aggacatgga ccacgagaat atgttctggt acagacagga ccccggcctg ggcctgcggc 1620
tgatctactt cagctacgac gtgaagatga aggaaaaggg cgacatcccc gagggctaca 1680
gcgtgtccag agagaagaaa gagcggttca gcctgatcct ggaaagcgcc agcaccaacc 1740
agaccagcat gtacctgtgc gccagcagag gcctggccgg ctacgagcag tattttggcc 1800
ctggcacccg gctgaccgtg accgaggatc tgaagaacgt gttcccccca gaggtggccg 1860
tgttcgagcc ttctgaggcc gagatcagcc acacccagaa agccaccctc gtgtgtctgg 1920
ccaccggctt ctaccccgac cacgtggaac tgtcttggtg ggtcaacggc aaagaggtgc 1980
acagcggcgt gtccaccgat ccccagcctc tgaaagaaca gcccgccctg aacgacagcc 2040
ggtactgcct gtccagcaga ctgagagtgt ccgccacctt ctggcagaac ccccggaacc 2100
acttcagatg ccaggtgcag ttctacggcc tgagcgagaa cgacgagtgg acccaggaca 2160
gagccaagcc cgtgacacag atcgtgtctg ccgaagcctg gggcagagcc gattgcggct 2220
ttaccagcga gagctaccag cagggcgtgc tgagcgccac catcctgtac gagatcctgc 2280
tgggcaaggc caccctgtac gccgtgctgg tgtctgccct ggtgctgatg gccatggtca 2340
agcggaagga ctccagaggc ggaagcggcg ccaccaactt cagcctgctg aaacaggccg 2400
gcgacgtgga agagaaccct ggccccatga agacttcgcc ggcttcagct tcctgttcct 2460
gtggctgcag ctggactgca tgagcagagg cgaggacgtg gaacagagcc tgtttctgag 2520
cgtgcgcgag ggcgacagca gcgtgatcaa ttgcacctac accgacagct ccagcaccta 2580
cctgtactgg tacaagcagg aacctggcgc cggactgcag ctgctgacct acatcttcag 2640
caacatggac atgaagcagg accagagact gaccgtgctg ctgaacaaga aggacaagca 2700
cctgagcctg cggatcgccg atacccagac aggcgacagc gccatctact tttgcgccga 2760
gagcatcggc agcaacagcg gctacgccct gaatttcggc aagggcacaa gcctgctcgt 2820
gaccccccac atccagaacc ctgaccctgc cgtgtaccag ctgcgggaca gcaagagcag 2880
cgacaagagc gtgtgcctgt tcaccgactt cgacagccag accaacgtgt cccagagcaa 2940
ggacagcgac gtgtacatca ccgacaagac agtgctggac atgcggagca tggacttcaa 3000
gagcaactcc gccgtggctt ggagcaacaa gagcgacttc gcctgcgcca acgccttcaa 3060
caacagcatt atccctgagg acacattctt cccaagcccc gagagcagct gtgacgtgaa 3120
gctggtggaa aagagcttcg agacagacac caacctgaac ttccagaacc tgagcgtgat 3180
cggcttcaga atcctgctgc tgaaggtggc cggcttcaac ctgctgatga ccctgagact 3240
gtggtccagc tgaattcaat aaaatatctt tattttcatt acatctgtgt gttggttttt 3300
tgtgtgtaat tcggatctag cttgtggaag gctactcgaa atgtttgacc caagttaaac 3360
aatttaaagg caatgctacc aaatactaat tgagtgtatg taaacttctg acccactggg 3420
aatgtgatga aagaaataaa agctgaaatg aatcattctc tctactatta ttctgatatt 3480
tcacattctt aaaataaagt ggtgatccta actgacctaa gacagggaat ttttactagg 3540
attaaatgtc aggaattgtg aaaaagtgag tttaaatgta tttggctaag gtgtatgtaa 3600
acttccgact tcaactgtat agggatcctc tagctagagt cgacctcgag ggggggcccg 3660
gtacccagct tttgttccct ttagtgaggg ttaatttcga gcttggcgta atcatggtca 3720
tagctgtttc ctgtgtgaaa ttgttatccg ctcacaattc cacacaacat acgagccgga 3780
agcataaagt gtaaagcctg gggtgcctaa tgagtgagct aactcacatt aattgcgttg 3840
cgctcactgc ccgctttcca gtcgggaaac ctgtcgtgcc agctgcatta atgaatcggc 3900
caacgcgcgg ggagaggcgg tttgcgtatt gggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac 3960
tcgctgcgct cggtcgttcg gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata 4020
cggttatcca cagaatcagg ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa 4080
aaggccagga accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct 4140
gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac aggactataa 4200
agataccagg cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg 4260
cttaccggat acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca 4320
cgctgtaggt atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa 4380
ccccccgttc agcccgaccg ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg 4440
gtaagacacg acttatcgcc actggcagca gccactggta acaggattag cagagcgagg 4500
tatgtaggcg gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta actacggcta cactagaagg 4560
acagtatttg gtatctgcgc tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc 4620
tcttgatccg gcaaacaaac caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag 4680
attacgcgca gaaaaaaagg atctcaagaa gatcctttga tcttttctac ggggtctgac 4740
gctcagtgga acgaaaactc acgttaaggg attttggtca tgagattatc aaaaaggatc 4800
ttcacctaga tccttttaaa ttaaaaatga agttttaaat caatctaaag tatatatgag 4860
taaacttggt ctgacagtta ccaatgctta atcagtgagg cacctatctc agcgatctgt 4920
ctatttcgtt catccatagt tgcctgactc cccgtcgtgt agataactac gatacgggag 4980
ggcttaccat ctggccccag tgctgcaatg ataccgcgag acccacgctc accggctcca 5040
gatttatcag caataaacca gccagccgga agggccgagc gcagaagtgg tcctgcaact 5100
ttatccgcct ccatccagtc tattaattgt tgccgggaag ctagagtaag tagttcgcca 5160
gttaatagtt tgcgcaacgt tgttgccatt gctacaggca tcgtggtgtc acgctcgtcg 5220
tttggtatgg cttcattcag ctccggttcc caacgatcaa ggcgagttac atgatccccc 5280
atgttgtgca aaaaagcggt tagctccttc ggtcctccga tcgttgtcag aagtaagttg 5340
gccgcagtgt tatcactcat ggttatggca gcactgcata attctcttac tgtcatgcca 5400
tccgtaagat gcttttctgt gactggtgag tactcaacca agtcattctg agaatagtgt 5460
atgcggcgac cgagttgctc ttgcccggcg tcaatacggg ataataccgc gccacatagc 5520
agaactttaa aagtgctcat cattggaaaa cgttcttcgg ggcgaaaact ctcaaggatc 5580
ttaccgctgt tgagatccag ttcgatgtaa cccactcgtg cacccaactg atcttcagca 5640
tcttttactt tcaccagcgt ttctgggtga gcaaaaacag gaaggcaaaa tgccgcaaaa 5700
aagggaataa gggcgacacg gaaatgttga atactcatac tcttcctttt tcaatattat 5760
tgaagcattt atcagggtta ttgtctcatg agcggataca tatttgaatg tatttagaaa 5820
aataaacaaa taggggttcc gcgcacattt ccccgaaaag tgccacctga cgcgccctgt 5880
agcggcgcat taagcgcggc gggtgtggtg gttacgcgca gcgtgaccgc tacacttgcc 5940
agcgccctag cgcccgctcc tttcgctttc ttcccttcct ttctcgccac gttcgccggc 6000
tttccccgtc aagctctaaa tcgggggctc cctttagggt tccgatttag tgctttacgg 6060
cacctcgacc ccaaaaaact tgattagggt gatggttcac gtagtgggcc atcgccctga 6120
tagacggttt ttcgcccttt gacgttggag tccacgttct ttaatagtgg actcttgttc 6180
caaactggaa caacactcaa ccctatctcg gtctattctt ttgatttata agggattttg 6240
ccgatttcgg cctattggtt aaaaaatgag ctgatttaac aaaaatttaa cgcgaatttt 6300
aacaaaatat taacgcttac aatttccatt cgccattcag gctgcgcaac tgttgggaag 6360
ggcgatcggt gcgggcctct tcgctattac gccagctggc gaaaggggga tgtgctg 6417
<210> 23
<211> 1824
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> misc_feature
<223> TCR1367, 密码子优化的最小鼠源化的附加半胱氨酸桥
<400> 23
atgggaatca gactgctgtg cagagtggcc ttctgcttcc tggccgtggg cctggtggac 60
gtgaaagtga cccagagcag cagatacctc gtgaagcgga ccggcgagaa ggtgttcctg 120
gaatgcgtgc aggacatgga ccacgagaat atgttctggt acagacagga ccccggcctg 180
ggcctgcggc tgatctactt cagctacgac gtgaagatga aggaaaaggg cgacatcccc 240
gagggctaca gcgtgtccag agagaagaaa gagcggttca gcctgatcct ggaaagcgcc 300
agcaccaacc agaccagcat gtacctgtgc gccagcagag gcctggccgg ctacgagcag 360
tattttggcc ctggcacccg gctgaccgtg accgaggacc tgaagaacgt gttccccccc 420
gaggtggccg tgttcgagcc cagcaaggcc gagatcgccc acacccagaa agccaccctg 480
gtgtgcctgg ccaccggctt ctaccccgac cacgtggaac tgtcttggtg ggtgaacggc 540
aaagaggtgc acagcggcgt gtgtaccgac ccccagcccc tgaaagagca gcctgccctg 600
aacgactccc ggtactgcct gagcagccgg ctgagagtgt ccgccacctt ctggcagaac 660
ccccggaacc acttcagatg ccaggtgcag ttctacggcc tgagcgagaa cgacgagtgg 720
acccaggacc gggccaagcc cgtgacccag attgtgtctg ccgaggcctg gggcagagct 780
gattgtggca tcaccagcgc cagctaccac cagggcgtgc tgagcgccac catcctgtac 840
gagatcctgc tgggcaaggc caccctgtac gccgtgctgg tgtccgccct ggtgctgatg 900
gccatggtga aacggaagga cagcagaggc ggcagcggcg ccaccaactt tagcctgctg 960
aaacaggccg gcgacgtgga agagaaccct ggccccatga agaccttcgc cggcttcagc 1020
ttcctgttcc tgtggctgca gctggactgc atgagcaggg gcgaggacgt ggaacagagc 1080
ctgtttctga gcgtgcgcga gggcgacagc agcgtgatca attgcaccta caccgacagc 1140
tccagcacct acctgtactg gtacaagcag gaacctggcg ccggactgca gctgctgacc 1200
tacatcttca gcaacatgga catgaagcag gaccagagac tgaccgtgct gctgaacaag 1260
aaggacaagc acctgagcct gcggatcgcc gatacccaga caggcgacag cgccatctac 1320
ttttgcgccg agagcatcgg cagcaacagc ggctacgccc tgaacttcgg caagggcaca 1380
agcctgctcg tgacccctca catccagaac cccgaccccg ccgtgtacca gctgcgggac 1440
agcaagagca gcgacaagag cgtgtgcctg ttcaccgact tcgacagcca gaccaacgtg 1500
tcccagagca aggacagcga cgtgtacatc accgacaagt gcgtgctgga catgcggagc 1560
atggacttca agagcaactc cgccgtggcc tggtccaaca agagcgactt cgcctgcgcc 1620
aacgccttca acaacagcat catccccgag gacacattct tccccagctc cgacgtgccc 1680
tgcgacgtga agctggtgga aaagagcttc gagacagaca ccaacctgaa cttccagaac 1740
ctgagcgtga tcggcttcag aatcctgctg ctgaaggtgg ctggcttcaa cctgctgatg 1800
accctgcggc tgtggagcag ctga 1824

Claims (26)

1.一种用于制备转染细胞的方法，包括用以下各项转染细胞：
a)编码能够移动转座子的转座酶的mRNA，
和
b)包含所述转座子的小环DNA，其中所述转座子编码至少一种蛋白质和至少一种miRNA，
其中，被转染的细胞是原代T细胞，
其中，编码所述蛋白质的转座子包含内含子，所述内含子包含编码所述miRNA的序列，其中所述蛋白质和miRNA的表达受相同启动子的调节。
2.根据权利要求1所述的方法，其中被转染的细胞是从患者分离的原代T细胞。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法进一步包含使用选自包含抗-CD3抗体、抗-CD28抗体、抗-CD137抗体、抗-CD134抗体、抗-CD357抗体、IL-2、IL-7、IL-15和IL-21的组的一种或多种刺激物来刺激T细胞。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，用核酸对所述细胞进行电穿孔。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述转座酶选自包括以下各项的II类可转座元件的组：piggyBac、Tol2和Tc1/水手型转座子，包括青蛙王子转座酶和睡美人转座酶。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述转座酶是睡美人转座酶。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述转座酶是SB100X。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述小环DNA包含小于5kb。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述小环DNA包含小于4kb。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述小环DNA包含小于3kb。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述小环DNA包含小于2kb。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述蛋白质是TCR构建体，其中所述TCR构建体选自包含以下各项的组：一个TCRα链构建体和一个TCRβ链构建体的组；和单链TCR构建体或嵌合抗原受体(CAR)。
13.根据权利要求12所述的方法，其中CAR构建体包含抗体构建体的单链可变片段(Fv)、间隔区构建体和信号区构建体。
14.根据权利要求12所述的方法，其中所述TCR构建体包含经优化用于彼此配对的TCRα链构建体和TCRβ链构建体。
15.根据权利要求14所述的方法，其中TCRα链和TCRβ链各自包含：
(a)相对于天然人TCR的附加Cys残基，和/或
(b)恒定区中的鼠氨基酸序列，其中另外地，TCR链是人源的。
16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述转座子编码至少两种miRNA。
17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述转座子编码三、四、五、六、七、八、九、十或更多种miRNA。
18.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中由所述转座子编码的所述miRNA能够沉默TCRα链和/或TCRβ链的表达，其中所述miRNA不能沉默由所述转座子编码的TCR链的表达。
19.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述转座子编码能够沉默TCRα链和TCRβ链的表达的两种miRNA。
20.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中由所述转座子编码的miRNA能够沉默能够限制转移细胞的治疗效率的蛋白质的表达，其中能够限制T细胞的治疗效率的蛋白质选自包含CTLA4、PDCD1、LAG3、HAVCR2和TIGIT的抑制性表面受体的组，选自包含CBLB、CISH、DGK和TNFAIP3的负调节TCR或共刺激路径的细胞内蛋白质的组，选自包含SPRY2和CREM的限制细胞因子生产的细胞内蛋白质的组，或选自包含MAF、EGR3、NDRG1和DTX1的稳定功能失调T细胞表型的蛋白质的组。
21.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述转座子包含：
侧翼为左反向重复/直接重复(IR/DR)和右反向重复/直接重复(IR/DR)的货物核酸，其中
(i)所述转座子能够被睡美人转座酶蛋白质移动；
(ii)左IR/DR包括外左DR基序和内左DR基序，其中所述外左DR基序包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列，并且所述内左DR基序包含SEQ ID NO:2的核苷酸序列；和
(iii)右IR/DR包括外右DR基序和内右DR基序，其中所述外右DR基序包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列的反向序列并且所述内右DR基序包含SEQ ID NO:2的核苷酸序列的反向序列。
22.前述权利要求中任一项所述的方法，其中编码所述转座酶的核酸是ivtRNA。
23.一种遗传修饰的细胞群体，其中所述群体是通过权利要求1至22中任一项所述的方法可获得的。
24.根据权利要求23所述的遗传修饰的细胞群体，其中所述转座子编码至少两种miRNA。
25.一种包含权利要求23所述的遗传修饰的细胞群体的药物组合物，其中，
所述细胞用于通过继承性T细胞疗法来治疗患者，其中所述患者选自包括癌症患者和/或感染病毒或细菌病原体的患者的组，并且其中所述细胞包含表达TCR构建体的T细胞。
26.根据权利要求25所述的药物组合物，其中，所述转座子编码至少两种miRNA。
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