KR101522217B1

KR101522217B1 - Ｆｓｈ 제조 세포 클론

Info

Publication number: KR101522217B1
Application number: KR1020107001959A
Authority: KR
Inventors: 슈테판 아놀트; 난니 옐리넥
Original assignee: 바이오제너릭스 게엠베하
Priority date: 2007-06-28
Filing date: 2008-06-27
Publication date: 2015-05-21
Also published as: CA2690844A1; EA022993B1; CN101720332A; JP5570980B2; CY1114463T1; NZ581702A; CA2690844C; HRP20130921T1; EP2492280A1; IL202280A; US20120034655A1; BRPI0813913A8; RS52976B; US8318457B2; SI2170942T1; PL2170942T3; IL202280A0; AU2008267138B9; AU2008267138A1; MX2010000385A

Abstract

본 발명은 CHO 세포의 코돈 사용에 대하여 변형된, 각각 인간 여포 자극 호르몬 (FSH)의 α- 및 β-사슬을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자에 관한 것이다. 본 발명은 또한 그러한 핵산 서열을 포함하는 재조합 핵산 분자, 및 그러한 재조합 핵산 분자를 함유하는 숙주 세포, 및 재조합 인간 FSH 제조에서의 그들의 용도에 관한 것이다. 마지막으로, 본 발명은 또한, 무혈청 조건하의 현탁 배양물에서 세포를 본 발명의 재조합 핵산 분자로 트랜스펙트시킴으로써, 인간 여포 자극 호르몬을 발현하는 숙주 세포를 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

ＦＳＨ 제조 세포 클론{FSH PRODUCING CELL CLONE}

본 발명은 각각 인간 여포 자극 호르몬(human follicle stimulating hormone; FSH)의 α- 및 β-사슬을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자(nucleic acid molecules)에 관한 것으로, 상기 핵산 서열은 야생형 인간 FSH 핵산 서열과 비교하여, CHO 세포에서의 코돈 사용(codon usage)에 대하여 변형된다.

또한, 본 발명은 그러한 핵산 서열을 포함하는 재조합 핵산 분자(recombinant nucleic acid molecule) 및 그러한 재조합 핵산 분자를 함유하는 숙주 세포(host cells), 및 재조합 인간 FSH 제조에서의 그의 용도에 관한 것이다.

마지막으로, 본 발명은 무혈청(serum-free) 조건하 현탁 배양물에서 세포를 본 발명의 재조합 핵산 분자로 트랜스펙트(transfect)함으로써 인간 여포 자극 호르몬을 발현하는 숙주 세포를 제조하는 방법에 관한 것이다.

여포 자극 호르몬 (FSH)은 뇌하수체전엽(anterior pituitary)의 성선자극 세포(gonadotrophic cells)에 의하여 생성되며, 순환계로 방출된다. FSH는 여성의 난모세포 성숙과 남성의 정자형성의 조절에 있어서 황체 형성 호르몬(luteinizing hormone; LH)과 함께 작용한다. FSH 및 LH는 별개의 유전자에 의하여 코딩되는 2개의 비공유적으로 연결된 α- 및 β-사슬로 이루어지는 헤테로다이머 당단백질(heterodimeric glycoproteins)의 패밀리에 속한다. FSH 및 LH의 α-사슬의 아미노산 서열은 동일한 반면에, β-사슬의 아미노산 서열은 양 단백질에서 상이하다. α- 및 β-사슬 모두 글리코실화된다(glycosylated). FSH의 α-사슬은 52 및 78 위치에 2개의 잠재적인 아스파라긴-연결 글리코실레이션 부위(asparagine-linked glycosylation sites)를 가지며, 반면에, FSH의 β-사슬는 7 및 24 위치에 2개의 잠재적인 아스파라긴-연결 글리코실레이션 부위를 갖는다(Olijve et al. (1996) MoI. Hum. Reprod. 2(5): 371-382).

인간 FSH는 무배란 여성을 치료하는데 이용되며, 다낭성 발생(multifollicular development)(과배란(superovulation))의 자극용으로, 및 IVF, GIFT 또는 ZIFT와 같은 보조 수정(assisted conception)용 제제에 이용된다. 또한, 인간 FSH는 FSH를 낮게 생성하거나 생성하지 못하는 여성에서 여포의 성숙화를 자극하고, 선천성 또는 후천성 저생식샘 자극호르몬 생식샘저하증(hypogonadotropic hypogonadism)을 앓는 남성에서 정자형성을 자극하는데 이용된다.

본래, 의학적 용도의 FSH는 인간의 폐경후(post-menopausal) 소변으로부터 정제되었다. 그러나, 이러한 정제된 FSH는 LH 및 인간 유래의 다른 오염 단백질도 함유한다는 단점을 갖는다. 또한, 이와 같은 천연 근원의 이용은 제한된 제품 이용가능성 및 일관성을 의미한다.

재조합 DNA 기술의 출현으로, α- 및 β-사슬을 코딩하는 핵산 서열로 트랜스펙트된 세포 배양물에서 인간 FSH를 생성하는 것이 가능해졌다. α- 및 β-사슬을 코딩하는 DNA 서열 및 재조합 인간 FSH의 제조 방법은 예를 들어, WO 88/10270, WO 86/04589 및 EP 0 735 13에 개시되어 있다.

현재, 독일 시장에는 2종의 상업적인 재조합 인간 FSH 제품, 즉 GONAL-F^® 및 PUREGON^®가 있으며, 이들은 모두 CHO 세포에서 α- 및 β-사슬을 코딩하는 야생형(wild-type) DNA의 발현에 의하여 제조된다.

그러나, 주어진 수의 세포에 대하여 FSH의 수율(yield) 및 발현비율(expression rate)을 향상시키기 위하여 FSH 사슬의 발현을 최적화시킬 필요성이 여전히 존재한다. 따라서, 본 발명의 기저를 이루는 문제점은 재조합 인간 FSH가 진핵 세포에서 다량으로 제조될 수 있는 핵산 서열 및 재조합 핵산 분자를 제공하는 것이다.

본 발명에 따르면, 이와 같은 문제점 및 또 다른 문제점은 독립항의 특징에 의하여 해결된다.

유리한 실시예들은 종속항에 정의된다.

본 발명에 따르면, 중국 햄스터 난소(Chinese hamster ovary(CHO)) 세포에서 코돈 사용(codon usage)에 따라 조절된 인간 FSH의 α- 및 β-사슬을 코딩하는 변형(modified) 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자는 CHO 세포를 트랜스펙트하는데 이용되며, 트랜스펙트된 CHO세포에서 FSH 제조를 현저하게 증가시킨다.

본 발명의 맥락에서, 용어 "FSH 제조를 증가시킨다(increase in FSH production)"는 숙주 세포에서 변형 핵산 서열을 발현시킬 때, 동일한 아미노산 서열을 갖는 FSH를 코딩하는 비-변형(non-modified) 핵산 서열이 예를 들어, 유사한 트랜스펙션(transfection) 과정, 유사한 발현 벡터(expression vectors) 등과 같은 유사한 조건 하에서 동일한 형태의 숙주 세포에서 발현되는 경우에 비하여, 더 많은 양의 FSH가 숙주 세포에서 제조되는 상황을 나타낸다.

20개 아미노산이 61개의 트리플렛 코돈(triplet codons)에 의하여 특정되므로, 유전 암호(genetic code)는 불필요하다. 따라서, 20개의 단백질성(proteinogenic) 아미노산의 대부분은 몇몇 염기 트리플렛(코돈)에 의하여 코딩된다. 특정 아미노산을 특정하는 코돈은 특정한 유기체에서 동일한 빈도(frequency)로 이용되지 않지만, 빈번하게 이용되는 선호되는 코돈(preferred codons) 및 덜 빈번하게 이용되는 드문 코돈(rare codons)이 있다. 코돈 사용(codon usage)에서의 이러한 차이는 선택적 진화 압력(selective evolutionary pressures), 특히 번역(translation)의 효율(efficiency) 때문이다. 드물게 존재하는 코돈의 낮은 번역 효율에 대한 하나의 이유는 상응하는 아미노아실-tRNA 풀(pools)이 격감되어 단백질 합성에 더 이상 이용될 수 없다는 것이다.

또한, 상이한 유기체들은 상이한 코돈을 선호한다. 따라서, 예를 들어, 포유동물 세포로부터 유래한 재조합 DNA의 발현은 종종 E. coli 세포에서 단지 준최적으로(suboptimally) 진행된다. 따라서, 빈번하게 사용되는 코돈에 의한 드물게 사용되는 코돈의 대체는 일부 경우에 발현을 증강시킬 수 있다.

많은 유기체에 있어서, 다수의 유전자의 DNA 서열이 공지되어 있고, 각각의 유기체에서 특정 코돈의 사용 빈도가 얻어지는 표가 있다. 이러한 표를 이용함으로써, 단백질 서열이 상대적으로 정확하게 역-번역되어(back-translated), 단백질의 상이한 아미노산에 대하여 각각의 유기체에서 선호되는 코돈을 함유하는 DNA 서열을 형성할 수 있다. 코돈 사용에 대한 표는, 그 중에서도, 하기 인터넷 주소에서 찾을 수 있다: http://www.kazusa.or.jp/codon/index.html; 또는 http://www.entelechon.com/index.php?id=tools/index.

예를 들어, http //www.entelechon.com/eng/backtranslation.html에서와 같이, 축퇴 DNA 서열(degenerate DNA sequence)를 형성하기 위한, 단백질 서열, 예를 들어, 인간 FSH의 α- 또는 β-사슬의 단백질 서열의 역번역(reverse translation)에 이용될 수 있는 프로그램도 있다.

본 발명의 목적을 위하여, 용어 "핵산 서열(nucleic acid sequence)"은 펩티드, 단백질 등과 같은 폴리펩티드를 코딩하는 임의의 핵산 분자에 관한 것이다. 이러한 핵산 분자는 DNA, RNA 또는 그의 유사체(analogues)로 만들어 질 수 있다. 그러나, DNA로 만들어진 핵산 분자가 바람직하다.

당업자는 출발 뉴클레오티드 서열의 변형(modification)이 코돈 사용에 대하여 최적화(optimization) 과정을 기술하는 것임을 명확하게 인식할 것이다.

예를 들어, 외래 야생형 효소의 코딩 서열(coding sequence)이 CHO 세포의 코돈 사용에 따라 조절되는 경우, 도입된 변화는 변형된 서열과 출발 서열을 비교함으로써 쉽게 확인될 수 있다(도 1a 및 1b 참조). 또한, 두 서열은 모두 동일한 아미노산 서열을 코딩할 것이다. 인간 FSH의 α-사슬의 아미노산 서열은 서열식별번호 5에 나타내고, 인간 FSH의 β-사슬의 아미노산 서열은 서열식별번호 6에 나타낸다. 이 아미노산 서열들은 각각 EMBL 데이터베이스에 accession number J 00152로, 및 NCBI 데이터베이스에 accession number NM_000510로 기탁된 인간 FSH의 α- 및 β-사슬의 야생형 아미노산 서열들에 상응한다.

인간 FSH의 α-사슬의 경우, 출발 핵산 서열은 서열식별번호 3에 나타내고, 인간 FSH의 β-사슬의 경우, 출발 핵산 서열은 서열식별번호 4에 나타낸다.

본 발명에 따르면, 인간 FSH의 α-사슬을 코딩하는 핵산 서열은 출발 서열과비교하여, 적어도 30개 위치(positions)에서, 바람직하게는 적어도 40개 위치에서, 특히 바람직하게는 적어도 50개 위치에서, 더욱 특히 바람직하게는 적어도 60개 또는 70개 위치에서, 가장 바람직하게는 적어도 75개 위치에서, CHO 세포에서의 코돈 사용에 대하여 변형된다.

또한, 본 발명에 따르면, 인간 FSH의 β-사슬을 코딩하는 핵산 서열은 출발 서열과 비교하여, 적어도 25개 위치에서, 바람직하게는 적어도 30개 위치에서, 더욱 바람직하게는 적어도 40개 위치에서, 특히 바람직하게는 적어도 50개 위치에서, 더욱 특히 바람직하게는 60개 위치에서, 가장 바람직하게는 적어도 65개 위치에서, CHO 세포에서의 코돈 사용에 대하여 변형된다.

가장 바람직하게는, 인간 FSH의 β-사슬을 코딩하는 변형 핵산 서열은 서열식별번호 1에 주어진 핵산 서열의 코딩 영역(coding region), 또는 전체 코딩 영역에 걸쳐, 서열식별번호 1에 주어진 핵산 서열의 코딩 영역에 대하여 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 92% 또는 94%, 특히 바람직하게는 적어도 96% 또는 98%, 가장 바람직하게는 적어도 99% 동일한 핵산 서열이다. 서열식별번호 1에서, 코딩 영역은 뉴클레오티드 56에서 출발하여, 뉴클레오티드 442까지 달한다.

가장 바람직하게는, 인간 FSH의 α-사슬을 코딩하는 최적화된 핵산 서열은 서열식별번호 2에 주어진 핵산 서열의 코딩 영역, 또는 전체 코딩 영역에 걸쳐, 서열식별번호 2에 주어진 코딩 영역에 대하여 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 87% 또는 90%, 특히 바람직하게는 적어도 92% 또는 94%, 가장 바람직하게는 적어도 96%, 98% 또는 99% 동일한 핵산 서열이다. 서열식별번호 2에서, 코딩 영역은 뉴클레오티드 19에서 출발하여, 뉴클레오티드 366까지 달한다.

본 발명의 목적을 위하여, 용어 "비-변형 핵산 서열(non-modified nucleic acid sequence)", "야생형 핵산 서열(wild-type nucleic acid sequence)" 또는 "출발 핵산 서열(starting nucleic acid sequence)"은 숙주 세포에서 (과)발현에 이용되기 위한 것이며, 숙주 세포에서 코돈 사용에 따라 조절되지 않고, 단백질을 코딩하는 실제 야생형 핵산 서열인, 핵산 서열에 관한 것이다.

본 발명의 목적을 위하여, 용어 "변형 핵산 서열(modified nucleic acid sequence)" 또는 "최적화된 핵산 서열(optimized nucleic acid sequence)"은 비-변형/출발 핵산 서열을 숙주 세포의 코돈 사용에 따라 조절함으로써 숙주 세포에서의 발현에 대하여 변형된 서열에 관한 것이다. 변형된 또는 최적화된 핵산 서열은 비-변형 서열에 의하여 코딩되는 단백질과 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질을 코딩한다.

서열 동일성(identity)은 상이한 알고리즘에 기초하는 다수의 프로그램에 의하여 결정된다. 여기에서, Needleman and Wunsch, 또는 Smith and Waterman의 알고리즘은 특히 신뢰성 있는 결과를 달성한다. 서열 비교를 위하여, 프로그램 PiIeUp (Feng and Doolittle (1987) J. MoI. Evolution 25: 351 - 360; Higgins et al. (1989) CABIOS 5: 151 - 153) 또는 프로그램 Gap and Best Fit (Needleman and Wunsch (1970) J. MoI. Biol. 48: 443 - 453 및 Smith and Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2: 482 - 489)가 이용되었으며, 이들은 GCG software package (Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA)에 포함되어 있다.

퍼센트로 주어진 서열 동일성은 하기 세팅으로 전체 서열 영역에 걸쳐 프로그램 Gap으로 결정되었다: Gap Weight: 50, Length Weight: 3, Average Match: 10,000, 및 Average Mismatch: 0.000.

다르게 특정되지 않으면, 상기 세팅이 서열 비교를 위한 표준 세팅으로 이용되었다.

이론에 얽매이려 하지 않고, 코돈-최적화 DNA 서열은 더욱 효율적인 번역을 가능케 하고, 그의 형성된 mRNAs가 세포에서 더 긴 반감기를 가지므로, 번역에 있어서 더욱 빈번하게 이용할 수 있는 것으로 추정된다.

당업자는 본래의 출발 핵산 서열을, 동일한 아미노산의 그러나 코돈 사용이 상이한 폴리펩티드를 코딩하는 변형 핵산 서열로 변화시킬 수 있는 기술을 잘 알고 있다. 이는 예를 들어, 중합효소 연쇄 반응 기초 돌연변이유발 기술(polymerase chain reaction based mutagenesis techniques)에 의하여, 통상적으로 알려진 클로닝(cloning) 과정에 의하여, 화학 합성 등에 의하여 이루어질 수 있다.

또한, 본 발명의 목적은 인간 FSH의 β-사슬을 코딩하는 변형 핵산 서열을 포함하는 재조합 핵산 분자이며, 상기에서, 변형 핵산 서열은 서열식별번호 1에 따른 뉴클레오티드 서열의 코딩 영역 및 서열식별번호 1에 나타낸 뉴클레오티드 서열의 코딩 영역에 대하여 적어도 90% 이상의 서열 동일성(sequence identity)을 갖는 뉴클레오티드 서열로 이루어진 군으로부터 선택되며, 상기에서 변형 핵산 서열은 숙주 세포에서 활성(active)인 프로모터(promoter)에 의하여 제어된다.

용어 "숙주 세포에서 활성인 프로모터(promoter which is active in a host cell)"는 핵산 서열의 발현이 바람직한 숙주 세포에서 핵산 서열을 발현시키는 재조합 핵산 분자 내의 프로모터를 의미하려는 것이다. 프로모터의 활성은 프로모터에 결합하고 전사(transcription)를 활성화시킬 수 있는 전사 인자(transcription factors)의 존재에 의하여 일반적으로 결정된다.

포유동물 세포에서 핵산 서열의 발현에 적합한 프로모터는 당업자에게 잘 알려져 있고, CMV, SV40, HTLV 또는 아데노바이러스 주요 후발 프로모터(adenovirus major late promoters)와 같은 바이러스 프로모터(viral promoters), 및 EF-1α-프로모터 또는 UbC 프로모터와 같은 다른 프로모터를 포함한다.

본 발명의 목적을 위하여, 용어 "숙주 세포(host cell)"는 발현, 즉, 예를 들어 폴리펩티드의 제조를 위한 핵산 서열의 전사(transcription) 및 번역(translation)에 통상적으로 이용되는 임의의 세포를 나타낸다. 특히, 용어 "숙주 세포" 또는 "유기체(organism)"는 원핵 생물, 저등 진핵 생물, 식물, 곤충 세포 또는 포유동물 세포 배양 시스템(cell culture system)에 관한 것이다. 바람직하게, 숙주 세포는 포유동물 세포이며, 더욱 바람직하게, 숙주 세포는 설치류 세포이며, 더욱 더 바람직하게, 숙주 세포는 CHO 세포와 유사한 코돈 사용을 갖는 설치류 세포이며, 가장 바람직하게, 이 숙주 세포는 CHO 세포이다.

변형 서열의 발현 및 재조합 인간 FSH의 제조에 이용되는 숙주 CHO 세포주(cell line)는 CHO-K1 세포주의 유도체이며, 2수소 엽산 환원효소(dihydro folate reductase(dhfr)) 활성이 결핍되어 있다. 이 세포주는 DSMZ (Cat. No. ACC 126)로부터 얻어졌으며, 서스펜젼 및 무혈청 배양 조건에 따라 조절되었다.

인간 FSH의 β-사슬을 코딩하는 제1 최적화된 핵산 서열 및 인간 FSH의 α-사슬을 코딩하는 제2 최적화된 핵산 서열을 포함하는 재조합 핵산 분자를 함유하는 CHO 세포주는 2007년 3월 28일에, 수탁번호 DSM ACC2833으로 브라운슈바이크(Braunschweig)의 DSMZ에 기탁되었다.

본 발명의 의미 내에서 용어 "재조합 핵산 분자"는 숙주 세포에 도입될 수 있으며, 재조합 핵산 분자 내에 함유되는 핵산 서열의 발현을 가져올 수 있는 모든 종류의 핵산 분자를 포함하는 것으로 의도된다. 이 용어는 그 중에서도, 플라스미드 벡터, 및 아데노바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 및 레트로바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터를 포함하며, 플라스미드 벡터가 바람직하다.

포유동물 세포에서 단백질을 발현하는데 이용될 수 있는 적합한 플라스미드 벡터의 예는 잘 알려져 있으며, 예를 들어, pCI 벡터 시리즈(vector series), pSI (Promega), pcDNA® 벡터, pCEP4, pREP4, pSHOOTER™, pZeoSV2 (Invitrogen), pBlast, pMono, pSELECT, pVITRO 및 pVIVO (InVivogen)을 포함한다. 프로모터 및 발현되어야 하는 핵산 서열 외에, 재조합 핵산 분자는 폴리아데닐레이션(polyadenylation) 서열, 양성적으로 변형된(positively transformed) 원핵 생물 및/또는 진핵 생물의 확인을 가능케 하는 원핵 생물 및/또는 진핵 생물 선택 유전자(selection genes), 및 복제 근원(origin of replication)과 같은 다른 기능적 요소를 일반적으로 함유한다. 전문가는 특정 목적을 위하여 선택해야 하는 요소가 어떤 것인지, 및 어떤 벡터가 특정 숙주 세포에서 특정 핵산 서열의 발현에 적합한 것인지를 알고 있다.

본 발명의 핵산 서열을 포함하는 재조합 핵산 분자는 문헌, 예를 들어, ambrook and Russell (2001) Molecular cloning - a laboratory manual, 3rd edition, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, NY, USA.에 기재되어 있는 표준 분자생물학적 방법에 의하여 얻어질 수 있다.

바람직하게는, 본 발명의 재조합 핵산 분자는 인간 FSH의 β-사슬을 코딩하는 변형 핵산 서열 및 FSH의 α-사슬을 코딩하는 핵산 서열을 둘다 포함한다.

인간 FSH의 α-사슬을 코딩하는 핵산 서열은 서열식별번호 2에 따른 핵산 서열의 코딩 영역, 서열식별번호 2에 나타낸 핵산 서열의 코딩 영역에 대하여 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열, 서열식별번호 3에 나타낸 비-변형 핵산 서열의 코딩 영역 및 서열식별번호 3에 나타낸 핵산 서열의 코딩 영역에 대하여 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는, 인간 FSH의 α-사슬을 코딩하는 최적화된 핵산 서열로부터 선택된다.

인간 FSH의 α-사슬을 코딩하는 핵산 서열은 예를 들어, 내부 리보좀 진입 부위(internal ribosome entry site(IRES))에 의하여, 인간 FSH의 β-사슬을 코딩하는 핵산 서열과 동일한 프로모터에 의하여 제어될 수 있으며, 또는 별개의 프로모터에 의하여 제어될 수 있다. 바람직하게는, 인간 FSH의 α-사슬을 코딩하는 핵산 서열은 별개의 프로모터에 의하여 제어되는 것이다. 더욱 바람직하게는, 인간 FSH의 최적화된 β-사슬을 코딩하는 핵산 서열은 SV40 프로모터에 의하여 제어되며, 인간 FSH의 α-사슬을 코딩하는 핵산 서열은 CMV 프로모터에 의하여 제어된다. 가장 바람직하게는, 본 발명의 재조합 핵산 분자는 서열식별번호 7에 나타낸 핵산 서열을 갖는다.

또한, 본 발명은 인간 FSH의 β-사슬을 코딩하는 최적화된 핵산 서열을 포함하는 재조합 핵산 분자를 함유하며, 서열식별번호 2에 따른 뉴클레오티드 서열의 코딩 영역 및 서열식별번호 2에 나타낸 핵산 서열의 코딩 영역에 대하여 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호 3에 나타낸 비-변형 핵산 서열의 코딩 영역 및 서열식별번호 3에 나타낸 핵산 서열의 코딩 영역에 대하여 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 변형 핵산 서열로부터 선택되는 인간 FSH의 α-사슬을 코딩하는 핵산 서열을 더 함유하는, 숙주 세포에 관한 것이다.

인간 FSH의 α-사슬을 코딩하는 핵산 서열은 인간 FSH의 β-사슬을 코딩하는 최적화된 핵산 서열과 동일한 재조합 핵산 분자에 존재할 수 있거나, 또는 별개의 재조합 핵산 분자 상의 숙주 세포에 도입될 수 있다. 바람직하게, 인간 FSH의 α-사슬을 코딩하는 핵산 서열은 인간 FSH의 β-사슬을 코딩하는 최적화된 핵산 서열과 동일한 재조합 핵산 분자 내에 존재한다.

숙주 세포는 NIH3T3 세포, CHO 세포, COS 세포, 293 세포, Jurkat 세포, BHK 세포 및 HeLa 세포와 같은, 포유동물 세포 배양 시스템으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게, 숙주 세포는 설치류 세포이며, 더욱 바람직하게, 숙주 세포는 CHO 세포와 유사한 코돈 사용을 갖는 설치류 세포이며, 가장 바람직하게 이 숙주 세포는 CHO 세포이다.

또한, 본 발명의 목적은 인간 FSH의 β-사슬을 코딩하는 변형 핵산 서열 및 인간 FSH의 α-사슬을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 핵산 분자를 함유하는 숙주 세포를 포함하는 세포 배양물(cell culture)이며, 여기에서, α- 사슬을 코딩하는 핵산 서열은 적합한 배지(culture medium)에서, 전술한 바와 같은 비-변형 핵산 서열 및 변형 핵산 서열로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

세포 배양물(cell culture)은 숙주 세포의 성장을 뒷받침하는 조건 하에서, 적합한 배지에서 숙주 세포를 배양시킴으로써 얻어진다.

용어 "세포를 배양하는(cultivating cells)"은 증식, 세포의 정상적 대사 및 재조합 단백질의 형성을 가능케 하는 조건 하에서, 세포가 생체 내에(in vivo) 유지되는 것을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 이는 세포가 모든 필요한 영양분 및 산소를 공급받고, 적합한 pH 및 적합한 오스몰 농도(osmolarity)에서 유지되는 것을 의미한다. 세포는 임의의 적합한 방법으로 배양될 수 있다. 바람직하게, 세포는 예를 들어, 플라스크 또는 롤러 플라스크(roller flasks)에서, 현탁 배양물(suspension culture)로서 배양된다. 용어 "배양(cultivation)"은 회분 배양(batch cultivation), 유가 배양(fed-batch cultivation) 및 관류 배양(perfusion cultures) 및 다른 적합한 배양 방법을 포함한다.

"현탁액에서 배양하는(Cultivating in suspension)"은 세포가 표면에 부착하지 않고, 배지 내에 분포된 것을 의미한다.

본 발명의 의미 내에서 "회분 배양(Batch cultivation)"은 배양 중에 배지가 첨가되거나 빼내어지지 않는 배양 방법이다.

본 발명의 의미 내에서 "유가 배양(fed-batch method)"은 배양 중에 배지가 첨가되지만, 배지가 빼내어지지 않는 배양 방법이다.

본 발명의 범위 내에서 "관류 배양(Perfusion culturing)"은 배양 중에 배지가 빼내어지고, 새로운 배지가 첨가되는 배양 방법이다.

배지는 단지 낮은 혈청 함량(serum content), 예를 들어, 최대 함량 1% (v/v) 혈청을 갖는 것이 바람직하며; 배지가 무혈청인 것이 가장 바람직하다. 적합한 배지의 예는 RPMI 1640, DMEM, F12, ProCHO5 또는 eRDF와 같은, 기본 배지(basal media)이며, 이는 세포의 요구에 따라 서로, 및 보충물(supplements)과 혼합될 수 있다. 글루코오스 및 아미노산에 더하여, 배지는 오린 트리카르복실산(aurin tricarboxylic acid; ATA)과 같은 킬레이터(chelators), 포스페이트염과 같은 무기염(anorganic salts), 푸트레신(putrescine)과 같은 폴리아민(polyamines) 및 그의 전구체(precursors), 인슐린과 같은 호르몬, 아스코르브산 및 비타민 혼합물과 같은 항산화제(antioxidants), 에탄올아민과 같은 리피드 전구체(lipid precursors) 및 플루로닉 F68(pluronic F68)과 같은 세포-보호 물질을 함유할 수 있다. 전문가는 특정 세포 형태의 배양에 대하여 이용되는 배지를 알고 있다. 바람직하게, 배지는 ProCHO5이다.

또한, 본 발명의 목적은 본 발명에 따른 숙주 세포를 어느 정도의 시간 기간 동안 적합한 배지에서 먼저 배양시킨 후, 세포 배양 상청액(cell culture supernatant)을 수확하는 방법이다.

"세포 배양 상청액(cell culture supernatant)"은 어느 정도의 시간 기간 동안 세포와 접촉한 후, 세포로부터 분리되는 세포 배지이다. 세포 배양 상청액은 세포에 의하여 제조된 재조합 단백질을 함유한다. 세포는 여과 및 원심분리와 같은 통상적인 분리 기술에 의하여 상청액으로부터 분리될 수 있다. 장기간 배양에서, 본 발명에 따른 숙주 세포의 상청액은 적어도 500 ng/㎖, 바람직하게는 적어도 1000 ng/㎖, 더욱 바람직하게는 적어도 1500 ng/㎖, 및 가장 바람직하게는 적어도 2000 ng/㎖의 FSH 농도를 함유한다.

재조합 인간 FSH는 일 이상의 정제 단계에 의하여 세포 배양 상청액으로부터 정제될 수 있다. 적합한 정제 방법은 전문가에게 공지되어 있으며, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피(hydrophobic interaction chromatography), 하이드록시아파타이트 크로마토그래피(hydroxyapatite chromatography), 친화도 크로마토그래피(affinity chromatography) 및 겔 여과(gel filtration)를 포함한다. 재조합 인간 FSH를 정제하는 방법은 예를 들어, WO 00/63248, WO 2006/051070 및 WO 2005/063811에 개시되어 있다.

의약으로서의 투여를 위하여, 정제된 재조합 인간 FSH는 일 이상의 부형제(excipients)와 혼합되어, 환자에게 투여될 수 있는 포뮬레이션을 얻는다. 재조합 인간 FSH에 대한 적합한 포뮬레이션은 그 중에서도, EP 0 853 945, EP 1 285 665, EP 0 974 359, EP 1 188 444 및 EP 1 169 349에 개시되어 있다.

본 발명의 숙주 세포는, 인간 FSH의 β-사슬을 코딩하는 변형 핵산 서열만 포함하거나, 또는 인간 FSH의 α-사슬을 코딩하는 핵산 서열도 또한 포함하는 본 발명의 재조합 핵산 분자로 세포를 트렌스펙트(transfect)시킴으로써 제조된다. 대안으로, β-사슬을 코딩하는 핵산 서열 및 α-사슬을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 동시에 또는 연속적으로 숙주 세포에 도입되는 별개의 재조합 핵산 분자에 존재할 수 있다.

적합한 트랜스펙션(transfection) 방법은 당업자에게 공지되어 있으며, 예를 들어, 칼슘 포스페이트 침전(calcium phosphate precipitation), DEAE-덱스트린-매개 트랜스펙션(DEAE-dextran-mediated transfection), 전기천공(electroporation) 및 리포펙션(lipofection)을 포함한다. SuperFect, PolyFect, Effectene (Qiagen), TransFast™, ProFection^®, Transfectam^®(Promega) 및 TransPass™ (NEB)과 같은 상업적으로 구입가능한 트렌스펙션용 키트도 이용될 수 있다. 바람직하게, 세포는 서스펜젼에 있는 중에 트렌스펙트되며, 무혈청 조건에서 트랜스펙트된다.

상업적 규모의 재조합 인간 FSH 제조를 위하여, 세포는 일반적으로 안정적으로 트랜스펙트되며, 이는 트랜스펙트되지 않은 세포를 죽이는 선택제(selection agent)에 의하여 트랜스펙션(transfection) 후에, 성공적으로 트랜스펙트된 세포가 선택되며, 반면에, 저항 유전자(resistance gene)를 함유하는 트랜스펙트된 세포는 성장을 계속하는 것을 의미한다. 적합한 선택제는 제오신(zeocin), 네오마이신(neomycin) 및 푸로마이신(puromycin)과 같은 항생제(antibiotics) 및 메토트렉세이트(methotrexate)와 같은 다른 약물을 포함한다.

도 1 : 인간 FSH의 α-사슬 및 β-사슬을 코딩하는 비-변형 및 변형 핵산 서열의 비교
a) 인간 FSH의 α-사슬을 코딩하는 변형 및 비-변형 핵산 서열의 서열 비교
pXM17ss#6: 인간 FSH의 α-사슬을 코딩하는 변형 핵산 서열을 함유하는 플라스미드(plasmid)의 일부 (서열식별번호 2)
wt α FSH: 인간 FSH의 α-사슬을 코딩하는 비-변형 핵산 서열 (서열식별번호 3)
출발 코돈(start codon) 및 중지 코돈(stop codons)은 굵은 글씨로 나타낸다.
b) 인간 FSH의 β-사슬을 코딩하는 변형 및 비-변형 핵산 서열의 서열 비교
Query: 인간 FSH의 β-사슬을 코딩하는 비-변형 핵산 서열 (서열식별번호 4)
Subject: 인간 FSH의 β-사슬을 코딩하는 변형 핵산 서열 (서열식별번호 1)
출발 코돈(start codon) 및 중지 코돈(stop codons)은 굵은 글씨로 나타낸다.
도 2: 인간 FSH의 α-사슬을 코딩하는 변형 핵산 서열 및 인간 FSH의 β-사슬을 코딩하는 변형 핵산 서열을 모두 함유하는 재조합 핵산 분자의 맵(map).
도 3: CHO 세포에서 일과성 발현(transient expression) 후에, α- 및 β-사슬의 상이한 조합의 발현 분석.
야생형 α- 및 β-사슬의 조합을 발현하는 세포에 대한 상대적 FSH 발현을 나타낸다.
w/w: 비-변형 α-사슬 및 비-변형 β- 사슬
s/w: 변형 α-사슬 및 비-변형 β-사슬
w/s: 변형 β-사슬 및 비-변형 α-사슬
s/s: 변형 α-사슬 및 변형 β-사슬

본 발명은 하기 실시예에 의하여 상세하게 설명되며, 이는 제한적인 것으로 이해되어서는 안된다.

실시예

1. 인간 FSH의 α- 및 β-사슬을 코딩하는 최적화된 핵산 서열을 포함하는 재조합 핵산 분자의 클로닝(Cloning)

SV40 폴리아데닐레이션 부위(polyadenylation site) 및 스플라이스 부위(splice site), 및 RSV 프로모터, 쥐의 2수소 엽산 환원 효소 유전자(mouse dihydro folate reductase gene) 및 SV40 폴리아데닐레이션 및 스플라이스 부위로 이루어진 dhfr 유전자 카세트(dhfr gene cassette)를 이미 함유하는 pUC18 벡터 골격(vector backbone)이 이용되었다. 2수소 엽산 환원 효소 유전자는 양성적으로(positively) 트랜스펙트된 세포를 선택하고, 약물 메토트렉세이트(methotrexate)로 트랜스펙트된 유전자를 증폭(amplification)시킬 수 있다.

인간 FSH의 α- 및 β-사슬의 비-변형 서열은 각각 Fiddes and Goodman (1979) Nature 281 : 351-356 및 Jameson et al. (1988) MoI. Endocrinol. 2(9): 806-815로부터 유래되었다. 이러한 서열들은 코딩 영역이 빈번하게 이용되는 CHO 유전자에서의 코돈 사용(codon usage)에 대하여 조절되어, 최적화되었다.

또한, 추가적인 중지 코돈(stop codon)이 번역(translation)의 효율적인 종결(termination)을 확실하게 하기 위하여 도입되었다. β- 및 α-사슬에 대한 최적화된 뉴클레오티드 서열은 각각 서열식별번호 1 및 2에 나타내고, 야생형 및 변형 핵산 서열의 비교는 도 1a 및 1b에 나타낸다. 서열 비교는 인간 FSH의 α-사슬을 코딩하는 변형 및 비-변형 핵산 서열이 80% 동일하며, 반면에 인간 FSH의 β-사슬을 코딩하는 변형 및 비-변형 핵산 서열이 85% 동일한 것을 나타낸다.

변형 서열은 제한 효소(restriction enzymes) SacⅡ 및 NcoⅠ로 절단한 후, 라이게이션(ligation)함으로써 pUC18 골격의 2개의 복제물에 개별적으로 삽입되었다.

CMV 프로모터 및 SV40 프로모터는 하기 프라이머(primers)를 갖는 적합한 주형(template) DNA로부터 증폭되었으며, AscⅠ 및 PacⅠ 제한 부위(restriction site)를 동시에 도입하였다(하기 프라이머에 밑줄 그어짐):

Asc-CMV-F 프라미어

5' - GGC GCG CCT TTT GCT CAC ATG GCT CG - 3' (서열식별번호 8)

Pac-CMV-R 프라이머

5' - CCT TAA TTA AGA GCT GTA ATT GAA CTG GGA GTG -3 ' (서열식별번호 9)

Asc-SV40-F 프라이머

5' - GGC GCG CCG CAT ACG CGG ATC TG - 3' (서열식별번호 10)

Pac-SV40-R 프라이머

5' - CCT TAA TTA AGT TCG AGA CTG TTG TGT CAG AAG A - 3' (서열식별번호 11)

CMV 프로모터는 플라스미드를 제한 효소 AscⅠ 및 PacⅠ로 절단하고, 라이게이션함으로써 인간 FSH의 α-사슬을 함유하는 플라스미드에 도입되었고, SV40 프로모터는 제한 효소 AscⅠ 및 PacⅠ로 플라스미드를 절단하고, 라이게이션함으로써 인간 FSH의 β-사슬을 함유하는 플라스미드에 도입되었다.

마지막으로, SV40 프로모터, β-사슬을 코딩하는 핵산 서열 및 SV40 폴리아데닐레이션 신호(signal)을 포함하는 인간 FSH의 β-사슬에 대한 발현 카세트(expression cassette)는 하기 프라이머로 증폭되었으며, 증폭물(amplificate)의 5' 및 3' 말단 모두에 NotⅠ 제한 부위를 동시에 도입하였다(하기 프라이머에 밑줄 그어짐):

beta-NotⅠ-F 프라이머

5' - GCG GCC GCA TAC GCG GAT CTG C - 3' (서열식별번호 12)

beta-NotⅠ-R 프라이머

5' - GCG GCC GCT CAC TCA TTA GGC ACC CCA GG - 3' (서열식별번호 13)

다음으로, 증폭물(amplificate)은 인간 FSH의 α-사슬을 함유하는 NotⅠ-절단 플라스미드(NotⅠ-cut plasmid)에 삽입되었다. 수득된, α-사슬을 코딩하는 최적화된 핵산 서열 및 β-사슬을 코딩하는 최적화된 핵산 서열을 모두 함유하는 플라스미드를 도 2에 나타낸다. 2개의 최적화된 핵산 서열을 모두 갖는 플라스미드의 서열은 서열식별번호 7에 나타낸다.

2. 인간 FSH 의 α- 및 β-사슬의 상이한 조합을 함유하는 재조합 핵산 분자에 의한 CHO 세포의 일과성 트랜스펙션( transient transfection )

α-사슬을 코딩하는 최적화된 핵산 서열 또는 β-사슬을 코딩하는 최적화된 핵산 서열의 어느 하나를 상응하는 야생형 β-사슬 또는 α-사슬과의 조합으로 함유하거나, 또는 2개의 최적화된 서열을 모두 함유하는 플라스미드를 상기 1에 기재된 바와 같이 제조하였다. DNA를 HT 없이, 8 mM 글루타민을 함유하는 배지 ProCHO5 (Lonza)와 혼합하여 총 부피를 200 ㎕로 하였다. 다음으로, 20 ㎕의 SuperFect 시약 (Qiagen)을 DNA 용액에 가하고, 혼합하였다. 이후, 이 혼합물을 실온에서 5~10분 동안 배양하였다.

1.68 x 10⁶개 CHO 세포를 함유하는 분취액(aliquots)을 원심분리하였고(5분, 800 rpm, 18~25℃), 상청액을 제거하고, 세포를 HT 없이 8 mM의 글루타민을 함유하는 배지 ProCHO5 1.1 ㎖에 재현탁시켰다. 다음으로, DNA 혼합물을 5~10분 동안 배양한 후에, 서스펜젼을 DNA 혼합물에 옮기고, 혼합한 후, 6-웰 플레이트의 하나의 웰에 옮겼다. 세포를 37℃에서 3시간 동안 배양하였으며, 이 배양에 의하여 세포 부착에 이르렀다. 상청액을 제거하고, 세포를 1 ㎖ PBS로 3회 세척한 후, 새로운 배지(HT 없이, 8 mM의 글루타민을 함유하는 ProCHO5 2 ㎖)를 첨가하였다. 37℃에서 2일 동안 배양한 후, 상청액을 제거하고 원심분리하였다. 상청액을 농축하고(농축 인자(concentration factor) 16.67), FSH 농도를 ELISA 판독기 (Anogen)로 결정하였다. 이 측정의 결과를 도 3에 나타낸다.

이 결과는 야생형 β-사슬과 조합된 변형 α-사슬의 도입이 2개의 야생형 사슬들의 조합과 비교하여 약 50%의 발현 감소에 이르는 것을 나타낸다. 반대로, 야생형 및 변형 α-사슬과 조합된 변형 β- 사슬은 야생형 α-사슬 및 야생형 β-사슬의 조합과 비교하여 1.5~3의 인자(factor)만큼 증강된 일과성(transient) FSH 발현에 이르게 된다. 따라서, 특히, 변형 β-사슬의 이용이 일과성 트랜스펙션 후에 FSH 발현의 현저한 증강에 이르게 되며, 반면에, 변형 α-사슬은 FSH 제조에 긍정적인 영향을 미치지 않는다.

DSMZ

DSMACC2833

20070328

<110> Biogenerix AG <120> FSH Producing Cell Clone <130> P09MP100/KR <150> EP07111257.7 <151> 2007-06-28 <160> 13 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 471 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified beta chain <400> 1 aggatccccg ggtacctccc cgcggggagg cgcgcccctt aattaagccg ccaccatgaa 60 gaccctgcag ttcttcttcc tgttctgctg ctggaaggcc atctgctgca acagctgcga 120 gctgaccaac atcaccatcg ccatcgagaa ggaggagtgc aggttctgca tcagcatcaa 180 caccacctgg tgcgccggat actgctacac cagggacctg gtgtacaagg accccgccag 240 gcccaagatc cagaagacct gcaccttcaa ggagctggtg tacgagaccg tgagggtgcc 300 cggctgcgcc caccacgccg acagcctgta cacctacccc gtggccaccc agtgccactg 360 cggcaagtgc gacagcgaca gcaccgactg caccgtgagg ggcctgggcc ccagctactg 420 cagcttcggc gagatgaagg agtaatgacc atggcatgcg agctcgaatt c 471 <210> 2 <211> 372 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified alpha chain <400> 2 cttaattaag ccgccagcat ggactactac aggaagtacg ccgccatctt cctggtgacc 60 ctgagcgtgt tcctgcacgt gctgcacagc gccccagacg tgcaggactg 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Ser 115 <210> 6 <211> 129 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Met Lys Thr Leu Gln Phe Phe Phe Leu Phe Cys Cys Trp Lys Ala Ile 1 5 10 15 Cys Cys Asn Ser Cys Glu Leu Thr Asn Ile Thr Ile Ala Ile Glu Lys 20 25 30 Glu Glu Cys Arg Phe Cys Ile Ser Ile Asn Thr Thr Trp Cys Ala Gly 35 40 45 Tyr Cys Tyr Thr Arg Asp Leu Val Tyr Lys Asp Pro Ala Arg Pro Lys 50 55 60 Ile Gln Lys Thr Cys Thr Phe Lys Glu Leu Val Tyr Glu Thr Val Arg 65 70 75 80 Val Pro Gly Cys Ala His His Ala Asp Ser Leu Tyr Thr Tyr Pro Val 85 90 95 Ala Thr Gln Cys His Cys Gly Lys Cys Asp Ser Asp Ser Thr Asp Cys 100 105 110 Thr Val Arg Gly Leu Gly Pro Ser Tyr Cys Ser Phe Gly Glu Met Lys 115 120 125 Glu <210> 7 <211> 8983 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Plasmid <400> 7 ggaataagaa agcggccgct cactcattag gcaccccagg ctttacactt tatgcttccg 60 gctcgtatgt tgtgtggaat tgtgagcgga taacaatttc acacaggaaa cagctatgac 120 atgattacga attcgagctc ggtacccggg gatccagaca tgataagata cattgatgag 180 tttggacaaa ccacaactag aatgcagtga aaaaaatgct 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gggcctaccc 3600 cacccccctg aggagcaaga agaccatgct ggtgcagaag aacgtgacca gcgagagcac 3660 ctgctgcgtg gccaagagct acaacagggt gaccgtgatg ggcggcttca aggtggagaa 3720 ccacaccgcc tgccactgca gcacctgcta ctaccacaag agctaatgac catggacact 3780 ccagtgccag caatgacatc tcaggggcca gaggaactgt ccagagagca actctgagat 3840 ctaaggatgt cacagggcca acttgagggc ccagagcagg aagcattcag agagcagctt 3900 taaactcagg gacagagcca tgctgggaag acgcctgagc tcaagccgaa ttccagcaca 3960 ctggcggccg ttactagtgg atccgagctc ggtaccaagc ttatcgatac cgtcgacctc 4020 gaggggccgc ctgcgggctg ccccgctttg cggacgggct gtccccgcgc gaacggaacg 4080 ttggactttc gttaacattg accaagaact gcatggacct aacattcgat ctcattcagt 4140 attaaagggg ggagggggag ggggttacaa actgcaatag agactgtaga ttgcttctgt 4200 agtgggatct ttgtgaagga accttacttc tgtggtgtga cataattgga caaactacct 4260 acagagattt aaagctctaa ggtaaatata aaatttttaa gtgtataatg tgttaaacta 4320 ctgattctaa ttgtttgtgt attttagatt ccaacctatg gaactgatga atgggagcag 4380 tggtggaatg cctttaatga ggaaaacctg ttttgctcag aagaaatgcc atctagtgat 4440 gatgaggcta ctgctgactc tcaacattct actcctccaa aaaagaagag aaaggtagaa 4500 gaccccaagg actttccttc agaattgcta agttttttga gtcatgctgt gtttagtaat 4560 agaactcttg cttgctttgc tatttacacc acaaaggaaa aagctgcact gctatacaag 4620 aaaattatgg aaaaatattc tgtaaccttt ataagtaggc ataacagtta taatcataac 4680 atactgtttt ttcttactcc acacaggcat agagtgtctg ctattaataa ctatgctcaa 4740 aaattgtgta cctttagctt tttaatttgt aaaggggtta ataaggaata tttgatgtat 4800 agtgccttga ctagagatca taatcagcca taccacattt gtagaggttt tacttgcttt 4860 aaaaaacctc ccacacctcc ccctgaacct gaaacataaa atgaatgcaa ttgttgttgt 4920 taacttgttt attgcagctt ataatggtta caaataaagc aatagcatca caaatttcac 4980 aaataaagca tttttttcac tgcattctag ttgtggtttg tccaaactca tcaatgtatc 5040 ttatcatgtc tggatccccg ggtaccgagc tcgaattcgt aatcatgtca tagctgtttc 5100 ctgtgtgaaa ttgttatccg ctcacaattc cacacaacat acgagccgga agcataaagt 5160 gtaaagcctg gggtgcctaa tgagtgagct aactcacatt aattgcgttg cgctcactgc 5220 ccgctttcca gtcgggaaac ctgtcgtgcc agctgcatta atgaatcggc caacgcgcgg 5280 ggagaggcgg tttgcgtatt gggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct 5340 cggtcgttcg gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca 5400 cagaatcagg ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga 5460 accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc 5520 acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg 5580 cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat 5640 acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt 5700 atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc 5760 agcccgaccg ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg 5820 acttatcgcc actggcagca gccactggta acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg 5880 gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta actacggcta cactagaaga acagtatttg 5940 gtatctgcgc tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg 6000 gcaaacaaac caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag attacgcgca 6060 gaaaaaaagg atctcaagaa gatcctttga tcttttctac ggggtctgac gctcagtgga 6120 acgaaaactc acgttaaggg attttggtca tgagattatc aaaaaggatc ttcacctaga 6180 tccttttaaa ttaaaaatga agttttaaat caatctaaag tatatatgag taaacttggt 6240 ctgacagtta ccaatgctta atcagtgagg cacctatctc agcgatctgt ctatttcgtt 6300 catccatagt tgcctgactc cccgtcgtgt agataactac gatacgggag ggcttaccat 6360 ctggccccag tgctgcaatg ataccgcgag acccacgctc accggctcca gatttatcag 6420 caataaacca gccagccgga agggccgagc gcagaagtgg tcctgcaact ttatccgcct 6480 ccatccagtc tattaattgt tgccgggaag ctagagtaag tagttcgcca gttaatagtt 6540 tgcgcaacgt tgttgccatt gctacaggca tcgtggtgtc acgctcgtcg tttggtatgg 6600 cttcattcag ctccggttcc caacgatcaa ggcgagttac atgatccccc atgttgtgca 6660 aaaaagcggt tagctccttc ggtcctccga tcgttgtcag aagtaagttg gccgcagtgt 6720 tatcactcat ggttatggca gcactgcata attctcttac tgtcatgcca tccgtaagat 6780 gcttttctgt gactggtgag tactcaacca agtcattctg agaatagtgt atgcggcgac 6840 cgagttgctc ttgcccggcg tcaatacggg ataataccgc gccacatagc agaactttaa 6900 aagtgctcat cattggaaaa cgttcttcgg ggcgaaaact ctcaaggatc ttaccgctgt 6960 tgagatccag ttcgatgtaa cccactcgtg cacccaactg atcttcagca tcttttactt 7020 tcaccagcgt ttctgggtga gcaaaaacag gaaggcaaaa tgccgcaaaa aagggaataa 7080 gggcgacacg gaaatgttga atactcatac tcttcctttt tcaatattat tgaagcattt 7140 atcagggtta ttgtctcatg agcggataca tatttgaatg tatttagaaa aataaacaaa 7200 taggggttcc gcgcacattt ccccgaaaag tgccacctga cgtctaagaa accattatta 7260 tcatgacatt aacctataaa aataggcgta tcacgaggcc ctttcgtctc gcgcgtttcg 7320 gtgatgacgg tgaaaacctc tgacacatgc agctcccgga gacggtcaca gcttgtctgt 7380 aagcggatgc cgggagcaga caagcccgtc agggcgcgtc agcgggtgtt ggcgggtgtc 7440 ggggctggct taactatgcg gcatcagagc agattgtact gagagtgcac catatgcgag 7500 ccaagactgc cactgcactc cagcctggtt cccaatagac cctgaaggcc ctacaggttg 7560 tcttcccaac ctgccccttg ctccatacca cccgcctcca ccccataata ttatacaagg 7620 acacctagtc aaacaaaatg atgcaactta attttattag gacaaggctg gtgggcactg 7680 gagtagcacc ttccacgacc aggagaggca ctggggaggg gtcacaggga tgccacccgg 7740 gcagctagaa gccacagctg cagttagtct ttcttctcgt agacttcaaa cttatacttg 7800 atgccttttt cctcctggac ctcagagagg acgcctgggt attctgggag aagtttatat 7860 ttccccaaat caatttctgg gaaaaacgtg tcactttcaa attcctgcat gatccttgtc 7920 acaaagagtc tgaggtggcc tggttgattc atggcttcct ggtaaacaga actgcctccg 7980 actatccaaa ccatgtctac tttacttgcc aattccggtt gttcaataag tcttaaggca 8040 tcatccaaac ttttggcaag aaaatgagct cctcgtggtg gttctttgag ttctctactg 8100 agaactatat taattctgtc ctttaaaggt cgattcttct caggaatgga gaaccaggtt 8160 ttcctaccca taatcaccag attctgttta ccttccactg aagaggttgt ggtcattctt 8220 tggaagtact tgaactcgtt cctgagcgga ggccagggta ggtctccgtt cttgccaatc 8280 cccatatttt gggacacggc gacgatgcag ttcaatggtc gaaccatgat ggaagcttgg 8340 aggtgcacac caatgtggtg aatggtcaaa tggcgtttat tgtatcgagc taggcactta 8400 aatacaatat ctctgcaatg cggaattcag tggttcgtcc aatccatgtc agacccgtct 8460 gttgccttcc taataaggca cgatcgtacc accttacttc caccaatcgg catgcacggt 8520 gctttttctc tccttgtaag gcatgttgct aactcatcgt taccatgttg caagactaca 8580 agagtattgc ataagactac atttccccct ccctatgcaa aagcgaaact actatatcct 8640 gaggggactc ctaaccgcgt acaaccgaag ccccgctttt cgcctaaaca caccctagtc 8700 ccctcagata cgcgtatatc tggcccgtac atcgcgaagc agcgcaaaac gcctaaccct 8760 aagcagattc ttcatgcaat tgtcggtcaa gccttgcctt gttgtagctt aaattttgct 8820 cgcgcactac tcagcgacct ccaacacaca agcagggagc agatactggc ttaactatgc 8880 ggcatcagag cagattgtac tgagagtgca ccatatggtg cactctcagt acaatctgct 8940 ctgcagatct ggcctccgcg ccgggttttg gcgcctcccg cgg 8983 <210> 8 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Asc-CMV-F Primer <400> 8 ggcgcgcctt ttgctcacat ggctcg 26 <210> 9 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pac-CMV-R Primer <400> 9 ccttaattaa gagctgtaat tgaactggga gtg 33 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Asc-SV40-F Primer <400> 10 ggcgcgccgc atacgcggat ctg 23 <210> 11 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pac-SV40-R Primer <400> 11 ccttaattaa gttcgagact gttgtgtcag aaga 34 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-NotI-F Primer <400> 12 gcggccgcat acgcggatct gc 22 <210> 13 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-NotI-R Primer <400> 13 gcggccgctc actcattagg caccccagg 29

Claims

서열식별번호 1에 따른 핵산 서열의 코딩 영역(coding region), 및 서열식별번호 1에 나타낸 핵산 서열의 코딩 영역에 대하여 적어도 90%의 서열 동일성(sequence identity)을 갖는 핵산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는, 서열식별번호 6에 따른 인간 여포 자극 호르몬 (FSH)의 β 사슬을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자.
서열식별번호 2에 따른 핵산 서열의 코딩 영역(coding region), 및 서열식별번호 2에 나타낸 핵산 서열의 코딩 영역에 대하여 적어도 85%의 서열 동일성(sequence identity)을 갖는 핵산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는, 서열식별번호 5에 따른 인간 여포 자극 호르몬 (FSH)의 α 사슬을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자.
숙주 세포에서 활성인 프로모터에 의하여 제어되는, 제1항에 따른 제1 핵산 서열을 포함하는 재조합 핵산 분자.
제3항에 있어서,
제2항에 따른 제2 핵산 서열을 더 포함하는
재조합 핵산 분자.
제3항에 있어서,
서열식별번호 3에 따른 핵산 서열의 코딩 영역, 및 서열식별번호 3에 나타낸 핵산 서열의 코딩 영역에 대하여 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 제2 핵산 서열을 더 포함하는
재조합 핵산 분자.
제4항에 있어서,
제2 핵산 서열은 별개의 프로모터에 의하여 제어되는
재조합 핵산 분자.
제4항에 있어서,
제1 핵산 서열, 제2 핵산 서열, 또는 제1 핵산 서열 및 제2 핵산 서열은 바이러스 프로모터(viral promoter)에 의하여 제어되는
재조합 핵산 분자.
제7항에 있어서,
제1 핵산 서열은 SV40 프로모터에 의하여 제어되는
재조합 핵산 분자.
제7항에 있어서,
제2 핵산 서열은 CMV 프로모터에 의하여 제어되는
재조합 핵산 분자.
제3항에 있어서,
서열식별번호 7에 나타낸 핵산 서열을 갖는
재조합 핵산 분자.
제4항에 따른 재조합 핵산 분자를 함유하는 숙주 세포.
제11항에 있어서,
포유동물 세포인
숙주 세포.
제11항에 있어서,
중국 햄스터 난소(Chinese hamster ovary; CHO) 세포인
숙주 세포.
제11항에 있어서,
수탁번호 DSM ACC2833을 갖는
숙주 세포.
제3항에 따른 제1 재조합 핵산 분자, 및 제2항에 따른 핵산 서열 및 서열식별번호 3에 나타낸 핵산 서열로부터 선택되는 핵산 서열을 포함하는 제2 재조합 핵산 분자를 함유하는 숙주 세포.
적합한 배지에 제11항에 따른 숙주 세포를 포함하는 세포 배양물(cell culture).
적합한 배지에 제11항에 따른 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
세포 배양 상청액(cell culture supernatant)을 수확하는 단계를 포함하는
재조합 인간 FSH의 제조방법.
제17항에 있어서,
세포 배양 상청액으로부터 재조합 인간 FSH를 정제하는 단계를 더 포함하는
방법.
숙주 세포에서 활성인 프로모터에 의하여 제어되는, 서열식별번호 1에 따른 핵산 서열의 코딩 영역(coding region) 및 서열식별번호 1에 나타낸 핵산 서열의 코딩 영역에 대하여 적어도 90%의 서열 동일성(sequence identity)을 갖는 핵산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는, 서열식별번호 6에 따른 인간 여포 자극 호르몬 (FSH)의 β 사슬을 코딩하는 제1 핵산 서열; 및
서열식별번호 2에 따른 핵산 서열의 코딩 영역(coding region) 및 서열식별번호 2에 나타낸 핵산 서열의 코딩 영역에 대하여 적어도 85%의 서열 동일성(sequence identity)을 갖는 핵산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는, 서열식별번호 5에 따른 인간 여포 자극 호르몬 (FSH)의 α 사슬을 코딩하는 제2 핵산 서열
을 포함하는 재조합 핵산 분자에 의해 무혈청 조건하의 현탁 배양물(suspension culture)에서 세포를 트랜스펙트(transfect)시키는 것을 포함하는
제11항에 따른 숙주 세포의 제조방법.
숙주 세포에서 활성인 프로모터에 의하여 제어되는, 서열식별번호 1에 따른 핵산 서열의 코딩 영역(coding region) 및 서열식별번호 1에 나타낸 핵산 서열의 코딩 영역에 대하여 적어도 90%의 서열 동일성(sequence identity)을 갖는 핵산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는, 서열식별번호 6에 따른 인간 여포 자극 호르몬 (FSH)의 β 사슬을 코딩하는 제1 핵산 서열을 포함하는 제1 재조합 핵산 분자; 및
서열식별번호 2에 따른 핵산 서열의 코딩 영역(coding region) 및 서열식별번호 2에 나타낸 핵산 서열의 코딩 영역에 대하여 적어도 85%의 서열 동일성(sequence identity)을 갖는 핵산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는, 서열식별번호 5에 따른 인간 여포 자극 호르몬 (FSH)의 α 사슬을 코딩하는 핵산 서열 및 서열식별번호 3에 나타낸 핵산 서열로부터 선택되는 핵산 서열을 포함하는 제2 재조합 핵산 분자
에 의해 무혈청 조건하의 현탁 배양물에서 세포를 트랜스펙트시키는 것을 포함하는
제15항에 따른 숙주 세포의 제조방법.
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