BRPI0813913B1 - Molécula de ácido nucleico, sequência de ácido nucleico recombinante, célula hospedeira, métodos para produzir fsh humano recombinante, e para produzir a célula hospedeira, e, uso de uma sequência de ácido nucleico. - Google Patents

Abstract

MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO, SEQUÊNCIA DE ÁCIDO NUCLEICO RECOMBINANTE, CÉLULA HOSPEDEIRA, MÉTODOS PARA PRODUZIR FSH HUMANO RECOMBINANTE, E PARA PRODUZIR A CÉLULA HOSPEDEIRA, E, USO DE UMA SEQUÊNCIA DE ÁCIDO NUCLEICO. A presente invenção diz respeito a moléculas de ácido nucleico compreendendo uma sequência de ácido nucleico codificando para a cadeia (alfa) e (beta) do hormônio estimulante de folículo (FSH), respectivamente, as quais foram modificadas em relação à utilização do códon nas células de CHO. A presente invenção ainda diz respeito a uma molécula de ácido nucleico recombinante compreendendo tais sequências de ácido nucleico e a células hospedeiras contendo tais moléculas de ácido nucleico recombinante, 'bem como seu uso na produção de FSH humano recombinante. Finalmente, a presente invenção também diz respeito a um método para produzir células hospedeiras expressando o hormônio estimulante de folículo humano pela transfecção de células na cultura em suspensão sob condições livres de soro com a molécula de ácido nucleico recombinante da presente invenção.

Description

A presente invenção diz respeito a moléculas de ácido nucleico compreendendo a sequência de ácido nucleico codificando para a cadeia α e β do hormônio estimulante de folículo humano (FSH), respectivamente, em que a sequência de ácido nucleico tenha sido modificada em relação à utilização do códon em células de CHO, em comparação com a sequência de ácido nucleico do FSH humano do tipo selvagem.

A presente invenção ainda diz respeito a uma molécula de ácido nucleico recombinante compreendendo tais sequências de ácido nucleico e células hospedeiras contendo tais moléculas de ácido nucleico recombinantes, bem como a seu uso na produção de FSH humano recombinante.

Finalmente, a presente invenção também diz respeito a um método para produzir células hospedeiras expressando o hormônio estimulante de folículo humano mediante a transfecção de células na cultura em suspensão sob condições livres de soro com a molécula de ácido nucleico da presente invenção.

O hormônio estimulante de folículo (FSH) é produzido pelas células gonadotróficas da pituitária anterior e liberado na circulação. O FSH atua junto com o hormônio luteinizante (LH) no controle da maturação dos oócitos nas fêmeas, e da espermatogênese nos machos. Tanto o FSH quanto o LH pertencem a uma família de glicoproteínas heterodiméricas que consistem em duas cadeias α e β não covalentemente ligadas, que são codificadas por genes separados. Embora a sequência de aminoácidos da cadeia α do FSH e do LH seja idêntica, a sequência de aminoácido da cadeia β é diferente em ambas as proteínas. Ambas as cadeias α e β são glicosiladas. A cadeia α do ambas as proteínas. Ambas as cadeias α e β são glicosiladas. A cadeia α do FSH tem dois sítios de glicosilação potenciais ligados à asparagina nas posições 52 e 78, enquanto a cadeia β do FSH tem dois sítios de glicosilação potenciais ligados à asparagina nas posições 7 e 24 (Olijve et al. (1996) Mol. Hum. Reprod. 2(5): 371-382).

O FSH humano é usado para tratar de mulheres sem ovulação, para estimulação do desenvolvimento multifolicular (superovulação) e na preparação para uma concepção assistida, tal como IVF, GIFT ou ZIFT. Além disso, o FSH humano é usado para estimular a maturação dos folículos nas mulheres com uma produção de FSH baixa ou ausente, e para o estímulo da espermatogênese nos homens com hipogonadismo hipergonadotrópico congênito ou adquirido.

Originalmente, o FSH para usos medicinais foi purificado da urina pós-menopáusica humana. Entretanto, este FSH purificado tem a desvantagem de que ele também contém LH e outras proteínas contaminantes de origem humana. Além disso, o uso de uma tal fonte natural implica na disponibilidade e consistência de produto limitado.

Com o advento da tecnologia de DNA recombinante, tomou-se possível produzir FSH humano em culturas de célula transfectadas com as sequências de ácido nucleico codificando para a cadeia α e a cadeia β. As sequências de DNA codificando para as cadeias oc e β, e os métodos para produzir FSH humano recombinante, foram apresentados, por exemplo, nas WO 88/10720, WO 86/04589 e EP 0 735 139.

Presentemente, existem dois produtos comerciais de FSH humano recombinante no mercado, na Alemanha, a saber, GONAL-F® e PUREGON®, ambos os quais sendo produzidos pela expressão do DNA do tipo selvagem codificando para as cadeias α e β em células de CHO.

Entretanto, existe ainda a necessidade de otimizar a expressão das cadeias de FSH para melhorar o índice de rendimento e expressão do FSH para um dado número de células, É assim um problema subjacente à presente invenção prover sequências de ácido nucleico e moléculas de ácido nucleico recombinantes, pelas quais o FSH humano recombinante possa ser produzido em grandes quantidades nas células eucarióticas.

Em conformidade com a presente invenção, este e outros problemas são solucionados por meios dos aspectos da principal reivindicação.

As formas de realização vantajosas são definidas nas sub- reivindicações. De acordo com a presente invenção, as moléculas de ácido nucleico compreendendo sequências de ácido nucleico codificando para as cadeias a e β do FSH humano, que tenham sido adaptadas para a utilização do códon nas células do ovário de hamster chinês (CFIO), são usadas para transfectar as células de CHO e levar a um aumento significativo na produção de FSH nas células de CHO transfectadas.

No contexto da presente invenção, a expressão “aumento na produção de FSH” refere-se à situação em que, após expressar as sequências de ácido nucleico modificadas na célula hospedeira, uma quantidade mais elevada de FSH é produzida em uma célula hospedeira em comparação com a situação em que uma sequência de ácido nucleico não modificada codificando FSH com mesma sequência de aminoácido é expressa no mesmo tipo de células hospedeiras sob condições semelhantes tais como, por exemplo, procedimentos de transfecção comparáveis, vetores de expressão comparáveis, etc.

O código genético é redundante, quando 20 aminoácidos são especificados por códons de 61 tripletos. Assim sendo, a maioria dos 20 aminoácidos proteinógenos são codificados por vários tripletos base (códons). Os códons que especificam um aminoácido particular não são usados, entretanto, com a mesma frequência em um organismo específico, porém existem códons preferidos que são usados frequentemente, e códons raros que são usados menos frequentemente. Referidas diferentes na utilização dos códons são atribuídas a pressões evolucionárias seletivas, e, em particular, à eficiência da translação. Uma razão para a eficiência de translação inferior dos códons de ocorrência rara, pode ser que os fundos de aminoacil-tRNA são exauridos e, portanto, não se acham mais disponíveis para a síntese protéica.

Além disso, os diferentes organismos preferem diferentes códons. Assim, por exemplo, a expressão de um DNA recombinante, originando-se de uma célula de mamífero, frequentemente ocorre apenas subotimamente nas células de E. co li. Portanto, a substituição dos códons raramente usados, por códons frequentemente usados, pode intensificar a expressão em alguns casos.

Para muitos organismos, a sequência de DNA de um grande número de genes é conhecida e existem tabelas das quais as a frequência de utilização de códons específicos no organismo respectivo pode derivada. Pelo uso das referidas tabelas, as sequências de proteínas podem ser relativamente, com exatidão, retrotraduzidas para formar uma sequência de DNA que contenha os códons preferidos no organismo respectivo para os diferentes aminoácidos da proteína. As tabelas para uso do códon podem, inter alia, ser encontradas nos seguintes endereços da internet: http://www. kazusa. or. j p/codon/index. html; ou http://www.entelechon.com/index.php?id=tools/index.

Existem também programas disponíveis para a tradução reversa de uma sequência de proteínas, por exemplo a sequência de proteínas da cadeia α ou β do FSH humano, para formar uma sequência de DNA degenerada, como, por exemplo, em http://www.entelechon.com/eng/backtranslation.html.

A expressão “sequência de ácido nucleico” para os fins da presente invenção diz respeito a qualquer molécula de ácido nucleico que

codifique para polipeptídeos tais como peptídeos, proteínas etc. Estas moléculas de ácido nucleico podem ser de DNA, RNA ou seus análogos. Entretanto, as moléculas de ácido nucleico que sejam feitas de DNA são as preferidas.

A pessoa habilitada na técnica é claramente ciente de que a modificação da sequência de nucleotídeos de partida descreve o processo de otimização em relação ao uso do códon.

Se, por exemplo, a sequência codificadora de uma enzima estranha do tipo selvagem, for ajustada para uso do códon das células de CHO, as mudanças introduzidas poderão ser facilmente identificadas pela comparação da sequência modificada com a sequência de partida (ver as Figuras la e lb). Além disso, ambas as sequências codificação para a mesma sequência de aminoácidos. A sequência de aminoácidos da cadeia α do FSH humano é descrita na SEQ ID NO: 5 e a sequência de aminoácidos da cadeia β do FSH humano é descrita na SEQ ID NO: 6. Estas sequências de aminoácidos correspondem às sequências de aminoácidos do tipo selvagem das cadeias cc e β do FSFI humano depositado sob o número de acesso J 00152, no banco de dados da EMBL, e sob o número de acesso NM_000510, no banco de dados da NCBI, respectivamente.

No caso da cadeia ot do FSH humano, a sequência de ácido nucleico de partida é mostrada na SEQ ID NO: 3, e no caso da cadeia β do FSH humano, a sequência de ácido nucleico de partida é mostrada na SEQ ID NO: 4.

De acordo com a invenção, a sequência de ácido nucleico codificando para a cadeia α do FSH humano é modificada em relação ao uso do códon nas células de CHO pelo menos em 30 posições, preferivelmente pelo menos em 40 posições, particularmente preferível pelo menos em 50 posições, também particularmente preferível pelo menos em 60 ou 70 posições, e o mais preferível pelo menos em 75 posições, em comparação com a sequência de partida.

Além disso, de acordo com a invenção, a sequência de ácido nucleico codificando para a cadeia β do FSH humano, é modificada em relação ao uso do códon nas células de CHO, pelo menos em 25 posições preferivelmente pelo menos em 30 posições, mais preferível pelo menos em 40 posições, particularmente preferível pelo menos em 50 posições, também particularmente preferível em 60 posições, e o mais preferível pelo menos em 65 posições, em comparação com a sequência de partida.

Muito preferivelmente, a sequência de ácido nucleico modificada codificando para a cadeia β do FSH humano é a região codificadora da sequência de ácido nucleico dada na SEQ ID NO: 1, ou uma sequência de ácido nucleico que seja idêntica à região codificadora da sequência de ácido nucleico dada na SEQ ID NO: 1 em pelo menos 90%, preferivelmente em pelo menos 92% ou 94%, particularmente preferível em pelo menos 96% ou 98%, e o mais preferível em pelo menos 99% sobre a região codificadora inteira. Na SEQ ID NO: 1, a região codificadora inicia no nucleotídeo 56 e se estende até o nucleotídeo 442.

Muito preferivelmente, a sequência de ácido nucleico otimizada codificando para a cadeia α do FSFI humano, é a região codificadora da sequência de ácido nucleico dada na SEQ ID NO: 2, ou uma sequência de ácido nucleico que seja idêntica à região codificadora da sequência de ácido nucleico dada na SEQ ID NO: 2, em pelo menos 85%, preferivelmente em pelo menos 87% ou 90%, particularmente preferível em pelo menos 92% ou 94%, e o mais preferível em pelo menos 96%, 98% ou 99% através da região codificadora inteira. Na SEQ ID NO: 2, a região codificadora inicia no nucleotídeo 19 e se estende até o nucleotídeo 366.

As expressões “sequência de ácido nucleico não modificada”, “sequência de ácido nucleico tipo selvagem” ou “sequência de ácido nucleico de partida”, para os fins da presente invenção, dizem respeito a uma sequência de ácido nucleico que se pretenda seja usada para (super)expressão em uma célula hospedeira, e que não tenha sido adaptada ao uso do códon na célula hospedeira, mas seja a sequência de ácido nucleico do tipo selvagem real codificando para a proteína.

As expressões “sequência de ácido nucleico modificada” ou sequência de ácido nucleico otimizada”, para os fins da presente invenção, dizem respeito a uma sequência que tenha sido modificada para expressão em uma célula hospedeira pela adaptação da sequência da sequência de ácido nucleico não modificada/de partida para o uso do códon da célula hospedeira. Uma sequência de ácido nucleico modificada ou otimizada codifica para uma proteína tendo a mesma sequência de ácido nucleico da proteína codificada pela sequência não modificada.

A identidade de sequência é determinada por vários programas com base em diferentes algoritmos. Inclusive, os algoritmos de Needleman e Wunsch ou Smith e Waterman alcançam resultados particularmente confiáveis. Para as comparações de sequências, o programa PileUp [Feng e Doolittle (1987) J. Mol. Evolution 25: 351-360; Higgins et al. (1989) CABIOS 5: 151-153] ou os programas Gap e Best Fit [Needleman e Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48: 443-453 e Smith e Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2: 482-489] foram usados, os quais acham-se contidos no pacote de programas GCG (Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA).

Os valores da identidade de sequências aqui fornecidos em percentuais foram determinados com o programa Gap através da região de sequência inteira com os seguintes ajustes: Gap Weight: 50, Length Weight: 3, Average Match: 10.000, e Average Mismatch: 0,000.

A menos que de outra forma especificado, referidos ajustes foram usados como ajustes padrão para comparações de sequências.

Sem que se pretenda estar ligados por uma hipótese, presume- se que as sequências de DNA otimizadas pelo códon possibilitem uma tradução mais eficiente e que os mRNAs destes formados possivelmente tenham um período de meia-vida mais longo na célula e estejam, portanto, mais frequentemente disponíveis para a tradução.

A pessoa versada na técnica é bem familiar para com as técnicas que possibilitem mudar a sequência de ácido nucleico de partida original em uma sequência de ácido nucleico modificada codificando os polipeptídeos de aminoácido idêntico, porém com diferente uso do códon. Isto pode, por exemplo, ser alcançado pelas técnicas da mutagênese com base na reação em cadeia da polimerase, pelos procedimentos de clonagem comumente conhecidos, pela síntese química, etc.

E igualmente um objeto da presente invenção uma molécula de ácido nucleico recombinante compreendendo uma sequência de ácido nucleico modificada codificando para a cadeia β do FSH humano, em que a sequência de ácido nucleico modificada é selecionada do grupo consistindo da região codificadora da sequência de nucleotídeos de acordo com a SEQ ID NO: 1 e as sequências de nucleotídeos tendo uma identidade de sequência de pelo menos 90% à região codificadora da sequência de nucleotídeos como descrito na SEQ ID NO: 1, e em que a sequência de ácido nucleico modificada se acha sob o controle de um promotor que é ativo em uma célula hospedeira.

A expressão “promotor que é ativo em uma célula hospedeira” intenta significar que o promotor dentro da molécula de ácido nucleico recombinante possibilita a expressão da sequência de ácido nucleico em uma célula hospedeira, na qual a expressão da sequência de ácido nucleico é desejável. A atividade de um promotor é usualmente determinada pela presença dos fatores de transcrição que sejam capazes de se ligar ao promotor e de ativar a transcrição.

Promotores que são adequados para a expressão das sequências de ácido nucleico em células de mamíferos são bem conhecidos da pessoa versada na técnica, e incluem promotores virais tais como CMV, SV40, HTLV ou o promotor tardio principal do adenovirus e outros promotores tais como o promotor EF-la ou o promotor UbC.

A expressão “célula hospedeira” para os fins da presente invenção refere-se a qualquer célula que seja comumente usada para expressão, isto é, transcrição e translação de sequências de ácido nucleico, por exemplo para a produção de polipeptídeos. Em particular as expressões “célula hospedeira” ou “organismo” dizem respeito a células procariotas, eucariotas inferiores, plantas, células de plantas e de insetos, ou sistemas de cultura de células de mamíferos. Preferivelmente, a célula hospedeira é uma célula de mamífero, mais preferível a célula hospedeira é uma célula de roedor, ainda mais preferível a célula hospedeira é uma célula de roedor que tenha o uso de um códon semelhante à célula de CHO e, mais preferível, esta célula hospedeira é uma célula de CHO.

A linhagem celular hospedeira de CHO usada para expressão das sequências modificadas e para produção do FSH humano recombinante é um derivado de uma linhagem celular de CHO-K1 e é deficiente na atividade da diidrofolato redutase (dhfr). A linhagem celular foi obtida da DSMZ (Catálogo n2 ACC 126) e adaptada às condições de suspensão e cultura livre de soro.

Uma linhagem celular de CHO contendo uma molécula de ácido nucleico recombinante compreendendo uma primeira sequência de ácido nucleico otimizada codificando para a cadeia β do FSH humano e uma segunda sequência de ácido nucleico otimizada codificando para a cadeia cc do FSH humano, foi depositada em 28 de março de 2007 na DSMZ em Braunschweig sob o número de depósito DSM ACC2833.

A expressão “molécula de ácido nucleico recombinante” dentro do significado da presente invenção, intenta compreender todas as espécies de moléculas de ácido nucleico que sejam capazes de ser introduzidas em uma célula hospedeira e de efetuarem a expressão de uma sequência de ácido nucleico que esteja contida dentro da molécula de ácido nucleico recombinante. A expressão compreende, inter alia, vetores plasmídeos e vetores virais tais como os vetores adenovirais, lentivirais e retrovirais, com os vetores plasmídeos sendo os preferidos.

Exemplos de vetores plasmídeos adequados que podem ser usados para expressar proteínas nas células de mamíferos, são bem conhecidos e incluem, por exemplo, a série de vetores pCI, pSI (promega), vetores pcDNA®, pCEP4, pREP4, pSHOOTER®, pZeoSV2 (Invitrogen), pBlast, pMono, pSELECT, pVITRO e pVIVO (InVivogen). Além do promotor e da sequência de ácido nucleico a serem expressos, uma molécula de ácido nucleico recombinante usualmente contém outros elementos funcionais tais como as sequências de poliadenilação, os genes de seleção procarióticos e/ou eucarióticos que possibilitam a identificação das células procarióticas e/ou eucarióticas positivamente transformadas, e uma origem de replicação. O técnico entendido sabe quais os elementos que ele tem de selecionar para uma finalidade específica, e que vetor plasmídeo é adequado para a expressão de uma sequência de ácido nucleico específica em uma célula hospedeira específica.

As moléculas de ácido nucleico recombinante compreendendo as sequências de ácido nucleico da presente invenção podem ser obtidas por métodos biológicos moleculares padrão que são descritos na literatura, por exemplo em Sambrook e Russell (2001) Molecular cloning - a laboratory manual, 3â edição, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, NY, USA.

Preferivelmente, a molécula de ácido nucleico recombinante da presente invenção compreende tanto uma sequência de ácido nucleico modificada para a cadeia β do FSH humano, quanto uma sequência de ácido nucleico codificando para a cadeia α do FSH.

A sequência de ácido nucleico codificando para a cadeia a do FSH humano é selecionada de uma sequência de ácido nucleico otimizada codificando para a cadeia α do FSH humano que é selecionada do grupo consistindo da região codificadora da sequência de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 2, as sequências de ácido nucleico tendo uma identidade de sequência de pelo menos 85% à região codificadora da sequência de ácido nucleico, como apresentado na SEQ ID NO: 2, à região codificadora da sequência de ácido nucleico não modificada como apresentado na SEQ ID NO: 3, e as sequências de ácido nucleico tendo uma identidade de sequência de pelo menos 70% à região codificadora da sequência de ácido nucleico, como apresentado na SEQ ID NO: 3.

A sequência de ácido nucleico codificando para a cadeia α do FSH humano pode estar sob o controle do mesmo promotor como a sequência de ácido nucleico codificando para a cadeia β do FSH humano, por exemplo por meio de um sítio de entrada de ribossoma interno (IRES), ou ele pode estar sob o controle de um promotor separado. Preferivelmente, a sequência de ácido nucleico codificando para a cadeia α do FSH humano, acha-se sob o controle de um promotor separado. Mais preferivelmente, a sequência de ácido nucleico codificando para a cadeia β otimizada do FSH humano, acha- se sob o controle de um promotor SV40 e a sequência de ácido nucleico codificando para a cadeia α do FSH humano acha-se sob o controle de um promotor do CMV. O mais preferível é que a molécula de ácido nucleico recombinante da presente invenção tenha a sequência de ácido nucleico apresentada na SEQ ID NO: 7.

A presente invenção ainda diz respeito a uma célula hospedeira que contenha uma molécula de ácido nucleico recombinante compreendendo a sequência de ácido nucleico otimizada codificando para a cadeia β do FSH humano, e que ainda contenha uma sequência de ácido nucleico codificando para a cadeia oc do FSH humano que seja selecionada de uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo consistindo na região codificadora da sequência de nucleotídeos de acordo com a SEQ ID NO: 2, e as sequências de nucleotídeos tendo uma identidade de sequência de pelo menos 85% à região codificadora da sequência de ácido nucleico, como descrito na SEQ ID NO: 2, e à região codificadora da sequência de ácido nucleico não modificada, como descrito na SEQ ID NO: 3, e às sequências de ácido nucleico tendo uma identidade de sequência de pelo menos 70% à região codificadora da sequência de ácido nucleico como descrito na SEQ ID NO: 3.

A sequência de ácido nucleico codificando para a cadeia α do FSH humano pode estar presente na mesma molécula de ácido nucleico recombinante, como a sequência de ácido nucleico otimizada codificando para a cadeia β do FSH humano, ou ela pode ser introduzida na célula hospedeira em uma molécula de ácido nucleico recombinante separada. Preferivelmente, a sequência de ácido nucleico codificando para a cadeia α do FSH humano se acha presente na mesma molécula de ácido nucleico recombinante como a sequência de ácido nucleico otimizada codificando para a cadeia β do FSH humano.

A célula hospedeira pode ser selecionada de sistemas de cultura de célula de mamíferos, tais como as células NIH3T3, as células de CHO, as células de COS, as células 293, as células de Jurkat, as células de BHK e as células HeLa. Preferivelmente, a célula hospedeira é uma célula de roedores, mais preferível a célula hospedeira é uma célula de roedores que tenha um uso de códon similar à da célula de CHO e, o mais preferível, esta célula hospedeira é uma célula de CHO.

É igualmente um objeto da presente invenção uma cultura de célula compreendendo as células hospedeiras contendo uma molécula de ácido nucleico recombinante compreendendo uma sequência de ácido nucleico codificando para a cadeia β do FSH humano e uma sequência de ácido nucleico codificando para a cadeia oc do FSH humano, em que a sequência de ácido nucleico codificando para a cadeia oc pode ser selecionada do grupo consistindo na sequência de ácido nucleico não modificada e a sequência de ácido nucleico modificada conforme definido acima, em um meio de cultura adequado.

A cultura de célula é obtida pelo cultivo das células hospedeiras em um meio de cultura adequado, sob condições que apoiem o crescimento das células hospedeiras.

A expressão “cultivo das células” deve ser entendida como significando que as células são mantidas in vivo sob condições que permitam a proliferação, o metabolismo normal das células e a formação da proteína recombinante. Isso significa que as células são supridas de todos os nutrientes necessários, assim como com oxigênio, e são mantidas em um pH adequado e uma osmolaridade adequada. As células podem ser cultivadas de qualquer forma adequada. Preferivelmente, as células são cultivadas como cultura em suspensão, por exemplo em frascos ou em frascos rolantes. O termo “cultura” inclui a cultura de batelada, a cultura de batelada alimentada, bem como as culturas de perfusão e outros métodos de cultura adequados. “Cultura em suspensão” significa que as células não aderem a uma superfície, mas são distribuídas no meio de cultura. “Cultura de batelada” dentro do significado da presente invenção é um método de cultura em que o meio de cultura não é nem acrescentado nem retirado durante a cultura.

Uma “cultura de batelada alimentada”, dentro do significado da presente invenção, é um método de cultura em que o meio de cultura é adicionado durante o cultivo, mas nenhum meio de cultura é retirado. “Culturas de perfusão”, dentro do escopo da presente invenção, é um método de cultura em que o meio de cultura é retirado e novo meio de cultura é adicionado durante a cultura.

O meio de cultura preferivelmente tem apenas um baixo conteúdo de soro, por exemplo um conteúdo máximo de 1% (v/v) de soro; da forma mais preferível, o meio é livre de soro. Exemplos de meios de cultura adequados são os meios basais tais como o RPMI 1640, DMEM, F12, ProCHO5 ou eRDF, os quais podem ser misturados entre si e com suplementos de acordo com a necessidade das células. Além da glicose e dos aminoácidos, o meio pode conter quelantes tais como o ácido aurina tricarboxílico (ATA), sais anorgânicos tais como os sais de fosfato, as poliaminas e seus precursores tais como a putrescina, hormônios tais como a insulina, antioxidantes tais como o ácido ascórbico e misturas de vitaminas, precursores lipídicos tais como a etanolamina e as substâncias protetoras das células, tais como o F68 plurônico. O técnico versado sabe que meio de cultura usar para o cultivo do tipo celular específico. Preferivelmente, o meio de cultura é o ProCHO5.

É também um objeto da presente invenção um método no qual uma célula hospedeira de acordo com a presente invenção é primeiramente cultivada em um meio de cultura adequado por um certo período de tempo, e depois o sobrenadante da cultura de célula é colhido.

O “sobrenadante da cultura de célula” é o meio de cultura de célula que tenha ficado em contato com as células por um certo período de tempo, e que tenha sido depois separado das células. O sobrenadante da cultura de célula contém a proteína recombinante produzida pelas células. As células podem ser separadas do sobrenadante por técnicas convencionais de separação tais como a filtração e a centrifugação. Nas culturas de longo prazo, o sobrenadante das células hospedeiras de acordo com a presente invenção contém concentrações de FSH de pelo menos 500 ng/ml, de preferência de pelo menos 1000 ng/ml, mais preferível de pelo menos 1500 ng/ml, e o mais preferível de pelo menos 2000 ng/ml.

O FSH humano recombinante pode ser purificado do sobrenadante da cultura de célula por uma ou mais etapas de purificação. Os métodos de purificação adequados são conhecidos da pessoa habilitada e incluem a cromatografia por troca de íons, a cromatografia por interação hidrofóbica, a cromatografia por hidroxiapatita, a cromatografia por afinidade e por filtração em gel. Métodos para purificar FSH humano recombinante são apresentados, por exemplo, nas WO 00/63248, WO 2006/051070 e WO 2005/063811.

Para a administração como um medicamento, o FSH humano recombinante purificado é misturado com um ou mais excipientes para se obter uma formulação que possa ser administrada aos pacientes. Formulações adequadas para FSH humano recombinante são apresentadas, inter alia, nas EP 0 853 945, EP 1 285 665, EP 0 974 359, EP 1 188 444 e EP 1 169 349.

A célula hospedeira da presente invenção é produzida pelas células de transfecção com uma molécula de ácido nucleico recombinante da presente invenção que compreenda ou apenas a sequência de ácido nucleico modificada codificando para a cadeia β do FSH humano ou também uma sequência de ácido nucleico codificando para a cadeia α do FSH humano. Altemativamente, a sequência de ácido nucleico codificando para a cadeia β e a sequência de nucleotídeos codificando para a cadeia a, podem estar presentes nas moléculas de ácido nucleico recombinantes separadas, que são introduzidas na célula hospedeira, ou simultânea ou sucessivamente.

Métodos de transfecção adequados são conhecidos da pessoa versada na técnica e incluem, por exemplo, a precipitação de fosfato de cálcio, a transfecção mediada pelo DEAE-dextrano, eletroporação e lipofecção. Kits comercialmente disponíveis para a transfecção, tais como SuperFect, PolyFect, Effectene (Qiagen), TransFast®, ProFection®, Transfectam® (Promega) e TransPass® (NEB), podem também ser usados. Preferivelmente, as células são transfectadas enquanto em suspensão, e são transfectadas sob condições livres de soro.

Para a produção do FSH humano recombinante em uma escala comercial, as células são usualmente transfectadas de forma estável, o que significa que as células transformadas com sucesso são selecionadas após a transfecção por meio de um agente de seleção que extermine as células não transfectadas, ao passo que as células transfectadas contendo o gene de resistência continuam em cultivo. Reagentes de seleção adequados incluem antibióticos tais como a zeocina, a neomicina e a puromicina, e outros medicamentos tais como o metotrexato.

A presente invenção é ilustrada por meio dos seguintes exemplos, os quais não devem ser entendidos como limitativos.

EXEMPLOS

1. CLONAGEM DE UMA MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO RECOMBINANTE COMPREENDENDO AS SEQUÊNCIAS DE ÁCIDO NUCLEICO CODIFICANDO PARA AS CADEIAS α E β DO FSH HUMANO. Uma estrutura do vetor pUC18 foi usada, a qual já continha um sítio de poliadenilação SV40 e sítio de enlace, e um cassete do gene dhfr consistindo de um promotor de RSV, o gene de diidrofolato redutase de camundongo, e um sítio de poliadenilação SV40 e de enlace. O gene de diidrofolato redutase possibilita a seleção das células positivamente transfectadas e a amplificação do gene transfectado com o medicamento metotrexato. As sequências não modificadas das cadeias oc e β do FSH humano foram derivadas de Fiddes e Goodman (1979) Nature 281: 351-356 e de Jameson et al. (1988) Mol. Endocrinol. 2(9): 806-815, respectivamente. Estas sequências foram otimizadas no fato de que as regiões codificadoras tenham sido adaptadas ao uso de códons nos genes de CHO frequentemente usados. Além disso, um códon de parada adicional foi introduzido para garantir a eficiente terminação da translação. As sequências de nucleotídeos otimizadas para as cadeias β ea são apresentadas nas SEQ ID NOS: 1 e 2, respectivamente, e uma comparação das sequências de ácido nucleico do tipo selvagem e as modificadas é mostrada nas Figuras la e lb. A comparação das sequências mostra que a sequências de ácido nucleico modificada e a não modificada codificando para a cadeia oc do FSH humano são 80% idênticas, enquanto a sequência de ácido nucleico modificada e a não modificada codificando para a cadeia β do FSH humano, são 85% idênticas. As sequências modificadas foram introduzidas separadamente em duas cópias da estrutura de pUC18 mediante o seu corte com as enzimas de restrição SczcII e Ncol e a ligação subsequente. O promotor do CMV e o promotor do SV40 foram amplificados do DNA gabarito adequado com os seguintes iniciadores, simultaneamente introduzindo-se um sítio de restrição Asd e um Pad (sublinhados nos seguintes iniciadores): Iniciador Asc-CMV-F 5’ - GGC GCG CCT TTT GCT CAC ATG GCT CG - 3’ (SEQ ID NO: 8) Iniciador Pac-CMV-R 5’ - CCT TAA TTA AGA GCT GTA ATT GAA CTG GGA GTG - 3’ (SEQ ID NO: 9) Iniciador Asc-SV40-F 5’ - GGC GCG CCG CAT ACG CGG ATC TG - 3’ (SEQ ID NO: 10) Iniciador Pac-SV40-R 5’ - CCT TAA TTA AGT TCG AGA CTG TTG TGT CAG AAG A - 3’ (SEQ ID NO: 11) O promotor de CMV foi introduzido no plasmídeo contendo a cadeia α do FSH humano, mediante o corte do plasmídeo com as enzimas de restrição Asd e Pad e a ligação, e o promotor do SV40 foi introduzido no plasmídeo contendo a cadeia β do FSH humano mediante o corte do plasmídeo com as enzimas de restrição Asci e Pad e a ligação. Finalmente, o cassete de expressão para a cadeia β do FSH humano, compreendendo o promotor de SV40, a sequência de ácido nucleico codificando para a cadeia β, e o sinal de poliadenilação de SV40 foi amplificado com os seguintes iniciadores, simultaneamente introduzindo um sítio de restrição Notl, tanto na extremidade 5’ quanto na extremidade 3’ do amplificado (sublinhado nos seguintes iniciadores): Iniciador beta-Notl-F 5’ - GCG GCC GCA TAC GCG GAT CTG C - 3’ (SEQ ID NO: 12) Iniciador beta-Notl-R 5’ - GCG GCC GCT CAC TCA TTA GGC ACC CCA GG - 3’ (SEQ ID NO: 13) O amplificado foi então inserido no plasmídeo de corte Notl contendo a cadeia α do FSH humano. O plasmídeo resultante contendo tanto a sequência de ácido nucleico otimizada codificando para a cadeia α quanto a sequência de ácido nucleico otimizada codificando para a cadeia β, é mostrado na Figura 2. A sequência do plasmídeo com ambas as sequências de ácido nucleico otimizadas é apresentada na SEQ ID NO: 7.

2. TRANSFECÇÃO TRANSIENTE DAS CÉLULAS DE CHO COM MOLÉCULAS DE ÁCIDO NUCLEICO RECOMBINANTES CONTENDO DIFERENTES COMBINAÇÕES DAS CADEIAS α E β DO FSH HUMANO Os plasmídeos contendo ou uma sequência de ácido nucleico otimizada codificando para a cadeia α ou uma sequência de ácido nucleico otimizada codificando para a cadeia β, em combinação com uma cadeia β ou uma cadeia α do tipo selvagem correspondente ou contendo ambas as sequências otimizadas, foram produzidos como descrito sob 1, acima. O DNA foi misturado com o meio ProCHO5 (Lonza) contendo glutamina 8 mM sem HT até um volume total de 200 μl. Depois, 20 μl do reagente SuperFect (Qiagen) foram adicionados à solução de DNA e misturados. Esta mistura foi então incubada por 5 a 10 minutos na temperatura ambiente. Alíquotas contendo 1,68 x 106 células de CHO foram centrifugadas (5 minutos, 800 rpm, 18 a 25 °C), o sobrenadante foi removido e as células foram recolocadas em suspensão em 1,1 ml de meio de cultura ProCHO5 contendo glutamina 8 mM sem HT. A suspensão foi então transferida para a mistura de DNA, depois que a mistura de DNA havia sido incubada por 5 a 10 minutos, misturada e transferida para um reservatório de uma placa de 6 reservatórios. As células foram incubadas por 3 horas em 37 °C, cuja incubação leva à aderência das células. O sobrenadante foi removido, as células foram lavadas por três vezes com 1 ml de PBS e depois meio de cultura fresco (2 ml de ProCHO5 contendo glutamina 8 mM sem HT) foi adicionado. Após incubação de 2 dias em 37 °C, o sobrenadante foi removido e centrifugado. O sobrenadante foi concentrado (fator de concentração de 16,67) e a concentração do FSH foi determinada em uma leitora ELISA (Anogen). Os resultados desta medição são mostrados na Figura 3. Os resultados mostram que a introdução de uma cadeia α modificada, em combinação com uma cadeia β do tipo selvagem, leva a uma redução da expressão de quase 50%, em comparação com uma combinação de duas cadeias do tipo selvagem. Ao contrário, a introdução de uma cadeia β modificada, tanto em combinação com uma cadeia ct do tipo selvagem quanto modificada, leva a uma expressão do FSH transiente que é intensificada por um fator de 1,5 a 3, em comparação com a combinação da cadeia o. do tipo selvatem com a cadeia β do tipo selvagem. Portanto, em particular, o uso da cadeia β modificada leva a uma intensificação significativa da expressão do FSH após a transfecção transiente, ao passo que a cadeia α não influencia positivamente a produção do FSH. BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS Figura 1: Comparação das sequências de ácido nucleico não modificadas e não modificadas, codificando para a cadeia α e a cadeia β do FSH humano a) Comparação de sequências da sequência de ácido nucleico modificadas e não modificadas codificando para a cadeia α do FSH humano pXM17ss#6: para de um plasmídeo contendo a sequência de ácido nucleico modificada codificando para a cadeia oc do FSH humano (SEQ ID NO: 2) wt cc FSH: sequência de ácido nucleico não modificada codificando para a cadeia α do FSH humano (SEQ ID NO: 3) O códon de partida e os códons de parada são mostrados em letras em negrito. Figura 2: Mapa da molécula de ácido nucleico recombinante contendo tanto a sequência de ácido nucleico modificada codificando para a cadeia ot do FSH humano quanto a sequência de ácido nucleico modificada codificando para a cadeia β do FSH humano Figura 3: Análise de expressão de diferentes combinações de cadeias α e β após a expressão transiente nas células de CHO A expressão relativa do FSH em relação às células expressando uma combinação das cadeias α e β do tipo selvagem é mostrada. w/w: cadeias a e β não modificadas s/w: cadeia a modificada e cadeia β não modificada w/s: cadeia β modificada e cadeia α não modificada s/s: cadeias α e β modificadas

Claims (14)

1. Molécula de ácido nucleico, caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência de ácido nucleico codificando para a cadeia β do hormônio estimulante de folículo humano (FSH), que é a região codificadora da sequência de ácido nucleico como definida na SEQ ID NO: 1.

2. Molécula de ácido nucleico recombinante, caracterizada pelo fato de que compreende uma primeira sequência de ácido nucleico como definida na reivindicação 1, sob o controle de um promotor que é ativo em uma célula hospedeira.

3. Molécula de ácido nucleico recombinante de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que compreende adicionalmente uma segunda sequência de ácido nucleico codificando para a cadeia α do hormônio estimulante de folículo humano (FSH), que é selecionada do grupo consistindo da região codificadora da sequência de ácido nucleico como definida na SEQ ID NO: 2.

4. Molécula de ácido nucleico recombinante de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que compreende adicionalmente uma segunda sequência de ácido nucleico que é selecionada do grupo consistindo da região codificadora da sequência de ácido nucleico como definida na SEQ ID NO: 3.

5. Molécula de ácido nucleico recombinante de acordo com as reivindicações 3 ou 4, caracterizada pelo fato de que a segunda sequência de ácido nucleico está sob o controle de um promotor separado.

6. Molécula de ácido nucleico recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 5, caracterizada pelo fato de que a primeira sequência de ácido nucleico e/ou a segunda sequência de ácido nucleico está sob o controle de um promotor viral.

7. Molécula de ácido nucleico recombinante de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que a primeira sequência de ácido nucleico está sob o controle de um promotor de SV40.

8. Molécula de ácido nucleico recombinante de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que a segunda sequência de ácido nucleico está sob o controle de um promotor de CMV.

9. Molécula de ácido nucleico recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 8, caracterizada pelo fato de que tem a sequência de ácido nucleico como definida na SEQ ID NO: 7.

10. Método para produzir FSH humano recombinante, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: - cultivar uma célula hospedeira contendo uma molécula de ácido nucleico recombinante como definida em qualquer uma das reivindicações 3 a 9, em um meio de cultura adequado; e - colher o sobrenadante da cultura de célula.

11. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente a etapa de purificar o FSH humano recombinante do sobrenadante da cultura de célula.

12. Método para produzir uma célula hospedeira contendo a molécula de ácido nucleico recombinante como definida em qualquer uma das reivindicações 3 a 9, caracterizado pelo fato de que o método compreende transfectar células na cultura em suspensão sob condições livres de soro com uma molécula de ácido nucleico recombinante como definida em qualquer uma das reivindicações 3 a 9.

13. Método para produzir uma célula hospedeira, caracterizado pelo fato de que o método compreende transfectar células na cultura em suspensão sob condições livres de soro com uma primeira molécula de ácido nucleico recombinante como definida na reivindicação 2 e uma segunda molécula de ácido nucleico recombinante compreendendo uma sequência de ácido nucleico codificando para a cadeia α do hormônio estimulante de folículo humano (FSH), que é selecionado do grupo consistindo na região codificadora da sequência de ácido nucleico como definida na SEQ ID NO: 2 e a sequência de ácido nucleico como definida na SEQ ID NO: 3.

14. Uso de uma sequência de ácido nucleico como definida nas 5 SEQ ID NOS: 1 ou de ambas as sequências de ácido nucleico como definidas nas SEQ ID NO: 1 e 2, caracterizado pelo fato de ser para a produção de FSH recombinante humano.

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