JPH11146790A

JPH11146790A - Ｄｔｄｓｔ遺伝子発現ベクター

Info

Publication number: JPH11146790A
Application number: JP9335157A
Authority: JP
Inventors: Yuji Kai; 祐司開; Takaatsu Negoro; 尚温根来; Hidefumi Sato; 英史佐藤
Original assignee: Sumitomo Pharmaceuticals Co Ltd
Current assignee: Sumitomo Pharmaceuticals Co Ltd
Priority date: 1997-11-18
Filing date: 1997-11-18
Publication date: 1999-06-02

Abstract

(57)【要約】【課題】細胞の硫酸イオン取り込み能を賦活しうるＤＴ
ＤＳＴ遺伝子発現ベクター、およびそれを用いたスクリ
ーニング方法、遺伝子治療剤を提供する。【解決手段】５’非翻訳領域を除去した配列番号１また
は２のアミノ酸配列をコードするＤＴＤＳＴ遺伝子のフ
ラグメントのみを組み込んだベクターを作成すると、当
該ベクターは、動物細胞を形質転換させ、細胞の硫酸イ
オン取り込み能を増大させる。このベクターは、骨・軟
骨疾患治療剤のスクリーニング方法に使用できるのみな
らず、遺伝子治療剤としても使用できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、発現効率の高いサ
ルフェートトランスポーター遺伝子含有ベクターに関す
る。さらに、当該ベクターを用いた骨・軟骨系疾患治療
剤のスクリーニング方法、骨・軟骨系疾患の遺伝子治療
剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】軟骨組織は比較的少数の軟骨細胞と、そ
れを取り囲むこれらの軟骨細胞によって分泌された多量
の細胞外マトリックスから構成されている。軟骨の細胞
外マトリックスは主としてＩＩ型コラーゲン、硫酸化プ
ロテオグリカンならびにヒアルロン酸などから成り、こ
れらの分子が相互に結合し網目構造を形成している。軟
骨特有の物理的弾力性および生物学的機能はこうした網
目状の細胞外マトリックスにより維持されていると考え
られており、事実、細胞外マトリックス構成成分の異常
は様々な骨・軟骨の形成障害ならびに機能障害を生じ
る。

【０００３】ヒトでは１００種以上の先天性の骨・軟骨
異形成症が知られており、ＩＩ型コラーゲンの遺伝子変
異と関連付けられたｓｐｏｎｄｙｌｏｅｐｉｐｈｙｓｅ
ａｌｄｙｓｐｌａｓｉａおよびｓｔｉｃｋｌｅｒｓｙ
ｎｄｒｏｍｅ、ＩＸ型コラーゲンの遺伝子変異と関連付
けられたｍｕｌｔｉｐｌｅｅｐｉｐｈｙｓｅａｌｄｙ
ｓｐｌａｓｉａ（ＥＤＭ２）、ＦＧＦ受容体の遺伝子変
異と関連付けられたｔｈａｎａｔｏｐｈｏｒｉｃｄｙ
ｓｐｌａｓｉａ―ａｃｈｏｎｄｒｏｐｌａｓｉａ−ｈｙ
ｐｏｃｈｏｎｄｒｏｐｌａｓｉａｆａｍｉｌｙ、ＴＧ
Ｆ−βスーパーファミリーのメンバーであるＣＤＭＰ−
１の遺伝子変異と関連付けられたａｃｒｏｍｅｓｏｍｅ
ｌｉｃｃｈｏｎｄｒｏｄｙｓｐｌａｓｉａ、Ｈｕｎ
ｔｅｒＴｈｏｍｐｓｏｎｔｙｐｅ、など一部の疾患に
関してはその原因と考えられる遺伝子変異が同定されて
いるものの、原因遺伝子が判明しているものはごくわず
かである。

【０００４】Ｈａｓｔｂａｃｋａらは、ヒトの先天性の
骨・軟骨異形成症の１つであるＤｉａｓｔｒｏｐｈｉｃ
Ｄｙｓｐｌａｓｉａ（ＤＴＤ）の家系分析から、患者
では既知サルフェートトランスポーターのラット肝由来
ｓａｔ−１に類似の遺伝子（ＤＴＤＳＴ）内に変異が見
出されること、さらには患者皮膚繊維芽細胞のサルフェ
ート取り込み能が著しく低いことを報告した（Ｈａｓｔ
ｂａｃｋａ，Ｊ．，ｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ７
８：１０７３−１０８７（１９９４））。その後、さら
に、ＡｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｅｓｉｓｔｙｐｅＩＢ
（ＡＣＧ−ＩＢ）やＡｔｅｌｏｓｔｅｏｇｅｎｅｓｉｓ
ｔｙｐｅＩＩ（ＡＯＩＩ）の患者においてもＤＴＤ
ＳＴ遺伝子内に変異を有していることが報告されている
（ＳｕｐｅｒｔｉＦｕｒｇａ，Ａ．，ｅｔａ
ｌ．，ＮａｔｕｒｅＧｅｎｅｔｉｃｓ１２：１０
０−１０２（１９９６），およびＨａｓｔｂａｃｋ
ａ，Ｊ．，ｅｔａｌ．，ＡｍｅｒｉｃａｎＪｏｕ
ｒｎａｌｏｆｈｕｍａｎｇｅｎｅｔｉｃｓ５８：
２５５−２６２（１９９６））。

【０００５】一方、サルフェート（硫酸イオン）は動植
物において、ステロイドやフェノールの硫酸抱合の他
に、プロテオグリカンのグリコサミグリカンやヘパリン
などの多糖類の硫酸化に利用されている。プロテオグリ
カンの硫酸基は、その負電荷により細胞外マトリックス
の水和能を高めマトリックスに弾力性を与えるのみなら
ず、ｂＦＧＦやＴＧＦ−βなど細胞増殖に関わる種々の
因子のマトリックスへの保持や活性調節に重要な役割を
果たしていると考えられている。

【０００６】従って、前記遺伝的骨・軟骨疾患におい
て、細胞膜上にあって硫酸イオンの細胞内への取り込み
を担っているサルフェートトランスポーターの遺伝子変
異が、細胞外マトリックスの生物学的機能に影響し、軟
骨の形成障害を起こしている可能性が推測されている。

【０００７】ところが、上記のような病因仮説は有るも
のの、現在に至るまで、このｓａｔ−１類似の遺伝子が
実際にサルフェートトランスポーターとしての機能を有
するかについての直接的な証明はなされていない。第１
４回日本骨代謝学会において、小林らはマウス骨肉腫細
胞よりヒトＤＴＤＳＴと類似のｃＤＮＡを単離し、これ
を繊維芽細胞に導入することによりサルフェート輸送活
性の有無を検討し、５’非翻訳領域を含むｃＤＮＡを導
入した場合に活性が発現しないことを報告しているが、
ほぼコーディング領域のみを導入した場合でも、活性の
上昇はわずかであった。このマウス由来の遺伝子が活性
体として発現し得るということを確証するには至ってい
ない。実質的と言える程度に、サルフェートトランスポ
ーター（ＤＴＤＳＴ）をｉｎｖｉｔｒｏ、あるいは、
ｉｎｖｉｖｏで発現させる技術は未だ確立されていな
かったのである。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、発現
効率の高いサルフェートトランスポーター（ＤＴＤＳ
Ｔ）遺伝子含有ベクターを提供することである。さら
に、種々の骨・軟骨系疾患の治療に有効な薬剤のスクリ
ーニング方法を提供することである。

【０００９】

【課題を解決するための手段】発明者は、ラットより、
ＤＴＤＳＴ遺伝子のｃＤＮＡを取得することに初めて成
功した。そして、（１）生来の遺伝子のように５’非翻
訳領域とそれに続くコーディング領域を共に担持する場
合、殆ど活性発現が認められないこと、（２）５’非翻
訳領域を担持しないコーディング領域のみをベクターに
組み込むと、そのベクターを導入された細胞は、顕著に
硫酸イオン取り込み活性を発現すること、を発見した。
この新規な知見に基づいて、骨・軟骨系疾患とサルフェ
ートトランスポーター遺伝子の関連を考察した結果、本
発明を完成した。

【００１０】すなわち、本発明は、下記のベクター、ス
クリーニング方法および医薬に関するものである。（Ｉ）ほ乳類のサルフェートトランスポーター（ＤＴＤ
ＳＴ遺伝子発現産物）をコードするＤＮＡ配列を含有
し、かつ、ほ乳類のサルフェートトランスポーター遺伝
子の５’非翻訳領域のＤＮＡ配列を含まないことを特徴
とする、サルフェートトランスポーター発現用ベクタ
ー。（ＩＩ）ほ乳類のサルフェートトランスポーターが、配
列番号１または配列番号２で表されるアミノ酸配列を有
するサルフェートトランスポーターである（Ｉ）のベク
ター。（ＩＩＩ）ほ乳類のサルフェートトランスポーター遺伝
子の５’非翻訳領域のＤＮＡ配列が、配列番号３または
配列番号４で表されるラットまたはヒト遺伝子由来のＤ
ＮＡ配列である（Ｉ）のベクター。（ＩＶ）下記（１）〜（３）の工程を含むヒト骨・軟骨
疾患治療薬のスクリーニング方法：（１）（Ｉ）のベクターを用いて、動物細胞を形質転換
する工程、（２）その動物細胞を被検物質存在下に培養
する工程、（３）細胞への硫酸イオン取り込み量の増加
を検出する工程。（Ｖ）ベクターがアデノウィルスベクターであることを
特徴とする（ＩＩＩ）のヒト骨・軟骨疾患治療薬のスク
リーニング方法。（ＶＩ）（Ｉ）のベクターを有効成分として含有する、
ヒト骨・軟骨疾患遺伝子治療のための医薬製剤。（ＶＩＩ）アデノウィルスベクターを含有することを特
徴とする（ＶＩ）の医薬製剤。

【００１１】以下、詳細に本発明を説明する。（用語の定義）本明細書において、「サルフェートトラ
ンスポーター（ＤＴＤＳＴ）」とは、ヒトの先天性の骨
・軟骨異形成症の１つであるＤｉａｓｔｒｏｐｈｉｃ
Ｄｙｓｐｌａｓｉａ（ＤＴＤ）において、遺伝子変異の
見られる骨・軟骨由来の硫酸イオンの細胞取り込みに関
与するタンパクを意味する（Ｈａｓｔｂａｃｋａ，
Ｊ．，ｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ７８：１０７３−
１０８７（１９９４）前出）。この文献の図６に記載さ
れたヒト由来のタンパク（アミノ酸配列：配列番号１
２）、あるいは本明細書において初めて開示されるラッ
ト由来のタンパク（アミノ酸配列：配列番号２）、さら
に、マウス由来のＤＴＤＳＴ（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，
Ｔ．，ｅｔａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌａ
ｎｄＢｉｏｐｈｙｓｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈＣ
ｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ２３８：７３８−７４３
（１９９７））が代表的である。

【００１２】「サルフェートトランスポーター遺伝子の
５’非翻訳領域の配列」とは、天然のほ乳類ＤＴＤＳＴ
遺伝子コーディング領域の５’末端側に存在し、ＤＴＤ
ＳＴコーディング領域の翻訳を阻害するＤＮＡ配列を意
味する。代表的には、ラット由来遺伝子のコーディング
領域５’末端側ＤＮＡ配列（配列番号４）のうち、開始
コドンから少なくとも１００塩基以上上流の部分、ヒト
由来遺伝子のコーディング領域上流のＤＮＡ配列（配列
番号３）のうち、開始コドンから少なくとも２０塩基以
上上流の部分が挙げられる。

【００１３】「サルフェートトランスポーター遺伝子発
現ベクター」とは、サルフェートトランスポーター（Ｄ
ＴＤＳＴ）遺伝子を担持し、（１）ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ
細胞などのほ乳動物由来細胞などの動物細胞に導入する
ことによって、細胞表面にサルフェートトランスポータ
ーを発現させ、細胞の硫酸イオン取り込み能を増進させ
ることの出来るベクターを意味する。培養細胞などのｉ
ｎｖｉｔｒｏ発現系だけでなく、病原性は無いが、感
染力を有するウィルスを用いたウィルスベクターも、本
発明の技術範囲に含まれる。細胞の硫酸イオン取り込み
能増進作用は、公知方法（Ｂｉｓｓｉｇ，Ｍ．，ｅｔ
ａｌ．，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ
Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２６９：３０１７−３０２
１））、で評価できる。即ち、³⁵Ｓで標識されたサルフ
ェートを用いて、サルフェートトランスポーターを発現
させた細胞への取り込みを測定すればよい。

【００１４】本発明において、「ヒト骨・軟骨疾患」と
は、ＤＴＤＳＴ遺伝子の変異あるいは発現および機能不
良に起因する、骨・軟骨の形成不全を起こす疾患の総称
であり、具体的には、ＤｉａｓｔｒｏｐｈｉｃＤｙｓ
ｐｌａｓｉａ（ディアストロフィックディスプラジ
ア：ＤＴＤ）、Ａｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｅｓｉｓｔｙ
ｐｅＩＢ（アコンドロジェネシスＩ型：ＡＣＧ−Ｉ
Ｂ）やＡｔｅｌｏｓｔｅｏｇｅｎｅｓｉｓｔｙｐｅ
ＩＩ（アテロステオジェネシスＩＩ型：ＡＯＩＩ）が
挙げられる。

【００１５】（製造方法）本発明の「サルフェートトラ
ンスポーター遺伝子発現ベクター」は、一般的に下記の
ようにして製造できる。（１）ＤＴＤＳＴ遺伝子のクローニング。（ラットＤＴＤＳＴ）ラット骨芽細胞様細胞株より調製
したｃＤＮＡを鋳型とし、既知のＤＴＤＳＴ配列（Ｈａ
ｓｔｂａｃｋａ，Ｊ．，ｅｔａｌ．前出）から適
切なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、Ｐｏｌｙ
ｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ
法）によりＤＴＤＳＴｃＤＮＡの一部を増幅すること
ができる。これにより明らかになるＤＴＤＳＴｃＤＮ
Ａ配列を有するプライマーを用い、ＲＡＣＥ法（Ｍａｒ
ａｔｈｏｎｃＤＮＡＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ
Ｋｉｔ：ＣＬＯＮＴＥＣＨ＃Ｋ１８０２−１）によ
り、さらに５’側および３’側のｃＤＮＡ配列をクロー
ニングすることができる。得られるラットＤＴＤＳＴ・
ＤＮＡ配列は５’非翻訳領域（配列番号４）およびコー
ディング領域（配列番号２８）を含むものである。

【００１６】（２）ヒトＤＴＤＳＴ遺伝子の５’非翻訳
領域のクローニング。公知のヒト型ＤＴＤＳＴｃＤＮ
Ａ配列を有するプライマーを用い、ＲＡＣＥ法（Ｍａｒ
ａｔｈｏｎｃＤＮＡＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ
Ｋｉｔ：ＣＬＯＮＴＥＣＨ＃Ｋ１８０２−１）によ
り、さらに５’側のｃＤＮＡ配列をクローニングするこ
とができる。得られたＤＮＡ配列は、５’非翻訳領域
（配列番号３）およびコーディング領域（配列番号２
９）を含むものである。（２）５’非翻訳領域の除去。ＤＴＤＳＴ遺伝子より部分的あるいは完全に５’非翻訳
領域を除去するためには、以下の方法が有用である。例
えば、コーディング領域のみをＰＣＲにより増幅するこ
とにより完全に５’非翻訳領域を除去した配列を得るこ
とができる。あるいは、目的とする欠失領域ををはさむ
両端の配列に相補的な配列を合わせ持つ互いに相補的な
プライマーを用いてＰＣＲにより任意の領域を欠失させ
ることが可能である。

【００１７】（３）発現ベクターの構築。組換えアデノウイルスの作成は特許出願（特開平８−３
０８５８５、Ｙ．Ｋａｎｅｇａｅｅｔａｌ．，Ｎｕ
ｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ２３：３
８１６―３８２１（１９９５）およびＳ．Ｍｉｙａｋ
ｅｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３：１３２０―１３２４
（１９９６）に記載の方法に従って行うことができる。
即ち、ＤＴＤＳＴのコーディング領域を含むｃＤＮＡ断
片をアデノウイルスゲノムからＥ３領域とＥ１Ａ・Ｅ１
Ｂ領域を欠失させたカセットコスミドＡｘＣＡｗｔに組
み込む。次いで、リン酸カルシウム法により本組換えコ
スミドとＥｃｏＴ２２Ｉ消化した親ウイルスＤＮＡ−Ｔ
ＰＣでヒト胎児腎由来細胞株（２９３細胞）を同時トラ
ンスフェクションし、目的のＤＴＤＳＴｃＤＮＡ断片
が挿入された組換えアデノウイルスを作成する。

【００１８】（４）発現の確認（活性測定）。本発明の発現ベクターの効果は、一般的な培養動物細胞
での硫酸イオン取り込み能の測定法で確認することがで
きる。動物細胞としてはアフリカミドリザル腎由来細胞
株（ＣＯＳ−１細胞）、ＣＨＯ細胞、その他種々の細胞
種を用いることが可能である。これらの細胞にベクター
を感染させ、数日後に［³⁵Ｓ］サルフェートの取り込み
を定量する。

【００１９】（ＤＴＤＳＴ賦活物質のスクリーニング）
ＤＴＤＳＴ遺伝子に由来する細胞の硫酸イオン取り込み
能を賦活する物質は、ＤｉａｓｔｒｏｐｈｉｃＤｙｓ
ｐｌａｓｉａ（ディアストロフィックディスプラジ
ア：ＤＴＤ）などの骨疾患の治療剤として有用である。
培養細胞を、本発明のベクターで形質転換させ、硫酸イ
オン取り込み能を付与ないしは増大させ、この機能に対
する被検物質の賦活作用を検出すれば良い。培養細胞と
しては、ＣＯＳ−１細胞、ＣＨＯ細胞等の動物細胞を用
いうる。もともと、硫酸イオン取り込み能を有する細胞
でも良いが、外来ＤＴＤＳＴ遺伝子に由来する硫酸取り
込み能への影響を測定するためには、生来の硫酸イオン
取り込み能の無いあるいは、小さい細胞の方が便利であ
る。ヒト胎児腎由来細胞株（２９３細胞）は、その１例
である。細胞の形質転換には、常法（Ｍａｎｉａｔｉｓ
Ｔ．，ｅｔａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉ
ｎｇ）を用いればよい。実際のスクリーニングに際して
は、一定量の被検物質を系に添加、放射性硫酸イオンを
系に添加して、数分から数時間インキュベーション後の
細胞内放射活性を測定すればよい。被検物質存在下で、
ＤＴＤＳＴ遺伝子の細胞導入により増大した硫酸取り込
み能が、約２倍以上になれば、その被検物質はＤＴＤＳ
Ｔが関与する硫酸取り込み作用を促進する作用有りと考
えられる。

【００２０】（遺伝子治療用ウィルスベクター）本発明
の発現ベクターを、遺伝子治療に用いる場合は、レトロ
ウィルス、アデノウィルスなどの公知の遺伝子治療用ベ
クター（特開平８−３０８５８５ほか、前出）に、５’
非翻訳領域内の翻訳抑制配列を含まないヒトＤＴＤＳＴ
コーディング遺伝子（配列番号２）を担持させればよ
い。

【００２１】（ウィルスベクターの使用方法）本発明の
遺伝子治療用ウィルスベクターは、公知の遺伝子治療製
剤と同様に使用しうる。投与方法は、皮下投与、静脈投
与、筋肉内投与、関節内投与いずれも可能である。ＤＴ
Ｄ治療に用いる投与量および投与回数は、遺伝的疾患で
あるため、個人レベルでの調整が必要であるが、低投与
量から投与開始し、患者の皮膚繊維芽細胞のサルフェー
ト取り込み能を逐次測定して正常レベルへの回復する投
与量で維持するなどの方策が考えられる。

【００２２】

【実施例】以下、本発明を実施例にて説明する。実施例１（ラットＤＴＤＳＴの構造解析）（ラットｃＤＮＡの調製）ラット骨肉腫細胞に由来する
骨芽細胞様細胞株ＵＭＲ１０６細胞から、常法に従い、
ｔｏｔａｌＲＮＡを調製した。このＵＭＲ１０６細胞ｔ
ｏｔａｌＲＮＡを鋳型に、オリゴｄＴをプライマーとし
て、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ逆転写酵素を用いてＵＭＲ
１０６細胞由来ｃＤＮＡを合成した。

【００２３】（ヒト型配列プライマーの作成）既知のヒ
トＤＴＤＳＴのｃＤＮＡ配列を参考にして、ヒトＤＴＤ
ＳＴのアミノ酸（ＬｅｕＰｒｏＴｈｒＬｙｓＧｌｕＬｅ
ｕ）およびアミノ酸（ＶａｌＬｅｕＧｌｙＶａｌＩｌｅ
Ｔｈｒ）に対応する、２種類のＤＴＤＳＴプライマーＡ
およびＢ（配列番号５および６）を作成した。

【００２４】（ラットサルフェートトランスポーター部
分ｃＤＮＡ配列の増幅）ＵＭＲ１０６細胞由来ｃＤＮＡ
を鋳型にし、上記２種のヒト型ＤＴＤＳＴプライマーと
ＴａｑＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いたＰｏｌ
ｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ
法）によりＤＴＤＳＴｃＤＮＡを増幅した。反応後、
溶液を６．５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供
し、所望のサイズ（〜５００塩基対）のＤＮＡバンドを
切り出し、ＤＮＡをゲルより抽出した。

【００２５】（ラットＤＴＤＳＴｃＤＮＡのクローニ
ング）上記ＰＣＲにより得られたＤＮＡをｐＣＲＩＩベ
クターに挿入し、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換するこ
とによりクローン化した。数クローンの塩基配列を決定
したところ、ヒトＤＴＤＳＴと高い相同性を示すクロー
ンが得られたので、これをｐＵＭＲＳＴ−１と命名し
た。ｐＵＭＲＳＴ−１より得られた配列より、アミノ酸
（ＬｅｕＬｅｕＶａｌＬｅｕＬｅｕＶａｌＩｌｅ）に対
応するＤＴＤＳＴプライマーＣ（配列番号７）を作成し
た。さらに、ヒトＤＴＤＳＴのアミノ酸（ＭｅｔＳｅｒ
ＳｅｒＧｌｕＳｅｒＬｙｓＧｌｕ）に対応するヒト型Ｄ
ＴＤＳＴプライマーＤ（配列番号８）およびアミノ酸
（ＧｌｙＬｅｕＳｅｒＬｅｕＳｅｒＳｅｒＡｓｐ）に対
応するプライマーＥ（配列番号９）を作成した。これら
ＤＴＤＳＴプライマーＤとＣ、あるいはＡとＥの組み合
わせで上述の方法と同様にＵＭＲ１０６細胞由来ｃＤＮ
Ａを鋳型に用いたＰＣＲを行い、アクリルアミドゲル電
気泳動後、所望のサイズ（それぞれ、〜１４００塩基対
および〜１３００塩基対）のバンドよりＤＮＡを抽出し
た。これらの抽出された２種のＤＮＡをそれぞれｐＣＲ
ＩＩベクターに挿入し、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換
することによりクローン化した。それぞれにつき、数ク
ローンの塩基配列を決定したところ、ヒトＤＴＤＳＴと
高い相同性を示すクローンが得られたので、プライマー
ＤとＣの組み合わせにより得られたクローンをｐＵＭＲ
ＳＴ−２、プライマーＡとＥの組み合わせにより得られ
たクローンをｐＵＭＲＳＴ−３と命名した。

【００２６】さらに、判明したラット型ＤＴＤＳＴｃ
ＤＮＡ配列よりラットＤＴＤＳＴ特異的プライマーＦお
よびＧ（配列番号１０および配列番号１１）を合成し、
ＲＡＣＥ法（ＭａｒａｔｈｏｎｃＤＮＡＡｍｐｌｉ
ｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ：ＣＬＯＮＴＥＣＨ＃Ｋ１
８０２−１）による５’側および３’側のｃＤＮＡ配列
のクローニングを試みた。方法は上記ｋｉｔに添付のプ
ロトコールに従い、ＵＭＲ１０６由来ｔｏｔａｌＲＮ
Ａ１μｇを出発材料としてｄｓｃＤＮＡを合成し、
アダプターをｌｉｇａｔｉｏｎ後、アダプター特異的プ
ライマー、ＡＰ１とＤＴＤＳＴ特異的プライマーを用い
てＰＣＲ反応を行うことにより５’側および３’側のｃ
ＤＮＡ領域のクローニングを試みた。ＰＣＲ条件の詳細
は表１に示した。

【００２７】

【表１】

【００２８】さらに上記５’ｏｒ３’ＲＡＣＥ産物を
鋳型に用い、ＡＰ１のさらに内側のプライマー（ｎｅｓ
ｔｅｄプライマー）ＡＰ２およびプライマーＦ（配列
番号１０）またはプライマーＧ（配列番号１１）のさら
に内側のプライマー（ｎｅｓｔｅｄプライマー）Ｈお
よびＩ（配列番号１２および配列番号１３）を使用して
以下の２ｎｄＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件の詳細は表
２に示した。

【００２９】

【表２】

【００３０】上記反応産物を５％ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動に供した後、ＡＰ２／ＮＧＳＰ１（配列番号
１２）の組み合わせで増幅された１．５ｋｂ前後のバン
ド（ＲＡＣＥ５１断片）およびＡＰ２／ＮＧＳＰ２（配
列番号１３）の組み合わせで増幅された１．５ｋｂ前後
のバンド（ＲＡＣＥ３３断片）を切り出し、常法により
ゲルより回収した。回収した各ＲＡＣＥ断片を常法によ
りｐＣＲＩＩにクローニングした。挿入配列を解析した
結果、共に目的のクローンが得られたので、それぞれｐ
ＣＲ−ＲＡＣＥ５１およびｐＣＲ−ＲＡＣＥ３３と命名
した。

【００３１】（ラットＤＴＤＳＴのｉｎｖｉｔｒｏ転
写用プラスミドの構築）上記ＲＴ−ＰＣＲおよびＲＡＣ
Ｅ法により取得された４種の部分ｃＤＮＡ断片を制限酵
素的に組み合わせることによりラットＤＴＤＳＴ全コー
ディング領域を有するプラスミドの構築を行った（図
１）。ｉｎｖｉｔｒｏで転写するため、Ｔ３およびＴ
７ｐｒｏｍｏｔｅｒ配列を有するｐＢｌｕｅｓｃｒｉ
ｐｔをベクターとして用いた。以下に示すとおり、５’
側と３’側に分けて構築を進めた。

【００３２】（１）５’側：ヒト型およびラット型プ
ライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲにより取得したｐＵＭＲ
ＳＴ−２とＲＡＣＥ法で得たｐＣＲ−ＲＡＣＥ５１をそ
れぞれＥｃｏＲＩおよびＡｆｌＩＩで消化後、断片．１
および２をポリアクリルアミドゲルより抽出した。断
片．１および２を、ＥｃｏＲＩで消化しＢＡＰ処理した
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔと３者でライゲーションし、両
断片が連結したクローン、ｐＢｌｕｅ−ＥＥ（５’ｒＤ
ＴＤ）を選択した。

【００３３】（２）３’側：ヒト型プライマーを用い
てＲＴ−ＰＣＲにより取得したｐＵＭＲＳＴ−２とＲＡ
ＣＥ法で得たｐＣＲ−ＲＡＣＥ３１をそれぞれＥｃｏＲ
ＩおよびＳｓｐＩＩＩで消化後、断片．３および４をポ
リアクリルアミドゲルより抽出した。断片３および４
を、ＥｃｏＲＩで消化しＢＡＰ処理したｐＢｌｕｅｓｃ
ｒｉｐｔと３者でライゲーションし、両断片が連結した
クローン，ｐＢｌｕｅ−ＥＥ（３’ｒＤＴＤ）を選択し
た。

【００３４】（３）５’側および３’側断片の連結：
上記ｐＢｌｕｅ−ＥＥ（５’ｒＤＴＤ）およびｐＢｌｕ
ｅ−ＥＥ（３’ｒＤＴＤ）をそれぞれＥｃｏＲＩおよび
ＳｐｅＩＩＩで消化し、断片．３および４をポリアクリ
ルアミドゲルより抽出した。断片５および６を、Ｅｃｏ
ＲＩで消化しＢＡＰ処理したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔと
３者でライゲーションし、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転
換することにより目的のクローン，ｐＢｌｕｅ−ｒＤＴ
Ｄ（ｆｕｌｌ）を取得した。ｐＢｌｕｅ−ｒＤＴＤ（ｆ
ｕｌｌ）に含まれるラットＤＴＤＳＴのｃＤＮＡ配列を
配列番号２４に示す。

【００３５】実施例２（ヒトＤＴＤＳＴ遺伝子の５’非翻訳領域のクローニン
グ）公知のヒト型ＤＴＤＳＴｃＤＮＡ配列よりヒトＤ
ＴＤＳＴ特異的プライマーＳ（配列番号２３）を合成
し、ＲＡＣＥ法（ＭａｒａｔｈｏｎｃＤＮＡＡｍｐ
ｌｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ：ＣＬＯＮＴＥＣＨ＃
Ｋ１８０２−１）による５’側のｃＤＮＡ配列のクロー
ニングを試みた。方法はラットＤＴＤＳＴ遺伝子の５’
非翻訳領域のクローニングの場合と同様、ヒト胎盤由来
ｔｏｔａｌＲＮＡ１μｇを出発材料としてｄｓｃ
ＤＮＡを合成し、アダプターをｌｉｇａｔｉｏｎ後、ア
ダプター特異的プライマーとプライマーＳ（配列番号２
３）を用いて２ステップのＰＣＲ反応を行うことにより
行った。得られたヒトＤＴＤＳＴの５’非翻訳領域のｃ
ＤＮＡ配列を配列番号３に示す。

【００３６】実施例３（５’非翻訳領域を含むラットＤＴＤＳＴ遺伝子の卵母
細胞における機能発現）実施例１記載のプラスミド、ｐ
Ｂｌｕｅ−ｒＤＴＤ（ｆｕｌｌ）を鋳型として用い、ｉ
ｎｖｉｔｒｏでｃＲＮＡを合成した。ｃＲＮＡの合成
は、上記プラスミドを終始コドンの直後に位置する制限
酵素ＸｂａＩで完全消化後、市販のｍＣＡＰｍＲＮＡ
ｃａｐｐｉｎｇｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ＃
２００３５０）を用い、キットに添付のプロトコールに
従い、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いて行った。マイ
クロマニュピレーターを用い、このｃＲＮＡを２３ｎｌ
（０．６ｎｇ／ｏｏｃｙｔｅ）ずつアフリカツメガエル
の卵母細胞にマイクロインジェクションし、３日後に［
³⁵Ｓ］サルフェートの取り込みを調べた。先ず、卵母細
胞を２００ｍＭショ糖，１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＥ
ＰＥＳ，ｐＨ７．５からなる溶液で２回洗浄後、１００
ｍＭグルコン酸ナトリウム，１ｍＭＫ₂ＳＯ₄（４０
μＣｉ／ｍｌ［³⁵Ｓ］Ｎａ₂ＳＯ₄ ），１０ｍＭＴ
ｒｉｓ−ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．５からなる反応溶液中で
室温で１時間インキュベートした。反応後の卵母細胞を
２００ｍＭショ糖，５ｍＭＫ₂ＳＯ₄，１０ｍＭＴ
ｒｉｓ−ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．５からなる氷冷溶液で３
回洗浄した。上記洗浄および反応時の溶液量は卵母細胞
１個あたり１００μｌとした。その後、卵母細胞を１個
あたり２００μｌの１０％ＳＤＳ溶液で溶解後、３ｍｌ
の液体シンチレーターを添加し、液体シンチションカウ
ンターにより卵母細胞内に取り込まれた［³⁵Ｓ］サルフ
ェートの放射活性を測定した。その結果、殆どサルフェ
ートの取り込みは認められなかった。

【００３７】実施例４（５’非翻訳領域を含まない、ラットＤＴＤＳＴコーデ
ィング領域のみを担持するｉｎｖｉｔｒｏ転写用プラ
スミドの構築）５’非翻訳領域が蛋白の翻訳制御に関与
している可能性を考え、コーディング領域のみを発現さ
せるためのプラスミドの構築を行った。プラスミドｐＢ
ｌｕｅ−ｒＤＴＤ（ｆｕｌｌ）１μｇを鋳型にＸｂａＩ
サイトを末端に付加した２種のプライマーＪおよびＫ
（配列番号１４、１５）を用いたＰＣＲ反応により増幅
した断片をＸｂａＩで消化後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ
のＸｂａＩサイトに挿入することにより行った。ＰＣＲ
は、ｐＢｌｕｅ−ｒＤＴＤ（ｆｕｌｌ）：１μｌ、プラ
イマーＪおよびプライマーＫ：各５μｌ、１０×Ｅｘ
Ｔａｑ緩衝液：５μｌ、ｄＮＴＰ：４μｌ、ＥｘＴａ
ｑポリメラーゼ：０．４μｌ、および水：２９．６μｌ
から成る反応液を、パーキンエルマー・アプライドバイ
オシステム社製Ｇｅｎｅａｍｐ９６００に供して行っ
た。

【００３８】その結果、Ｔ３プロモーターから転写可能
な方向にＤＴＤＳＴコーディング領域のみが挿入された
クローン，ｐＢｌｕｅ−ｒＤＴＤ（ｆｕｌｌ）Ｘ２が取
得された。塩基配列を解析した結果、ＰＣＲエラーと考
えられる塩基置換が１個所認められたがアミノ酸を変化
させない同義的置換であったため、これを用いて機能解
析を行うこととした。

【００３９】実施例５（５’非翻訳領域を含まない、ラットＤＴＤＳＴコーデ
ィング領域遺伝子の卵母細胞における機能発現）実施例
３のプラスミド、ｐＢｌｕｅ−ｒＤＴＤ（ｆｕｌｌ）Ｘ
２を鋳型として用い、ｉｎｖｉｔｒｏでｃＲＮＡを合
成した。ｃＲＮＡの合成は、上記プラスミドを終始コド
ンの直後に位置する制限酵素ＥｃｏＲＩで完全消化後、
市販のｍＣＡＰｍＲＮＡｃａｐｐｉｎｇｋｉｔ
（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ＃２００３５０）を用い、キ
ットに添付のプロトコールに従い、Ｔ３ＲＮＡポリメラ
ーゼを用いて行った。このｃＲＮＡを２３ｎｌ（０．６
ｎｇ／ｏｏｃｙｔｅ）ずつアフリカツメガエルの卵母細
胞にマイクロインジェクションし、前述の方法と同様に
［³⁵Ｓ］サルフェートの取り込みを調べた。その結果、
コーディング領域のみを発現させた場合は顕著なサルフ
ェートの取り込みが認められた（図２）。

【００４０】実施例６（ラットＤＴＤＳＴ遺伝子発現に於ける５’非翻訳領域
の影響／５’非翻訳領域の欠失体の構築）５’非翻訳領
域内のどの領域が機能発現に阻害的に働いているか検討
するため、５’非翻訳領域をその５’末端から順次欠失
した欠失体の作成を試みた。プラスミドｐＢｌｕｅ−ｒ
ＤＴＤ（ｆｕｌｌ）を鋳型とし、ＡｐａＩ認識配列を付
加した欠失用プライマー、Ｌ：ｒＤＴＤ−２Ｄ０（配列
番号１６）、Ｍ：ｒＤＴＤ−２Ｄ１（配列番号１７）、
Ｎ：ｒＤＴＤ−２Ｄ２（配列番号１８）、Ｏ：ｒＤＴＤ
−２Ｄ３（配列番号１９）、Ｐ：ｒＤＴＤ−２Ｄ４（配
列番号２０）、およびＱ：ｒＤＴＤ−２Ｄ５（配列番号
２１）とＲ：ｒＤＴＤ−Ｒ６（配列番号２２）の組み合
わせでＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲは、ｐＢｌｕｅ−ｒ
ＤＴＤ（ｆｕｌｌ）：１μｌ、プライマーＬ、Ｍ、Ｎ、
Ｏ、Ｐ、ＱおよびＲ：各５μｌ、１０×ＥｘＴａｑ緩衝
液：５μｌ、ｄＮＴＰ：４μｌ、ＥｘＴａｑポリメラー
ゼ：０．４μｌ、および水：２９．６μｌから成る反応
液をＧｅｎｅａｍｐ９６００に供して行った。ＰＣＲ反
応物をＡｐａＩおよびＡｆｌＩＩで消化した後、ｐＢｌ
ｕｅ−ｒＤＴＤ（ｆｕｌｌ）を同酵素で消化し脱リン酸
化したものとライゲートすることにより、５末端から順
次欠失したＵＴＲを有するプラスミド、ｐＢｌｕｅ−２
Ｄ０〜２Ｄ５を作製した。得られたＰＣＲ断片を上述の
２種類の制限酵素で消化後、ｐＢｌｕｅ−ｒＤＴＤ（ｆ
ｕｌｌ）の同制限酵素部位で乗せ換えることにより目的
のクローン、ｐＢｌｕｅ−ｒＤＴＤ（２Ｄ０〜２Ｄ５）
を得た（図３）。

【００４１】実施例７（５’非翻訳領域が欠失したｃＲＮＡの卵母細胞におけ
る機能発現）実施例６の６種の５非翻訳領域の欠失体を
組み込んだプラスミドを鋳型として用い、前述の方法で
ｉｎｖｉｔｒｏでｃＲＮＡを合成し、これらのｃＲＮ
Ａを２３ｎｌ（０．６ｎｇ／ｏｏｃｙｔｅ）ずつ卵母細
胞にマイクロインジェクションし、３日後に［³⁵Ｓ］サ
ルフェートの取り込みを調べた。図４に示すとおり、Ｕ
ＴＲを６４ｂｐ（２Ｄ４）および１００ｂｐ（２Ｄ３）
有しても−２９８まで欠失させてもコーディング領域の
み（２Ｄ５）と同等以上の輸送活性を発現した。しかし
ながら、２９８ｂｐ以上有する場合（２Ｄ０〜２Ｄ２）
は、ｃＲＮＡをインジェクションしていない卵母細胞の
活性（Ｂ．Ｇ．）と殆ど変わらない程度の極めて低い活
性しか発現しなかった。しかしながら、−１００まで欠
失させた２Ｄ３および−６４まで欠失させた２Ｄ４はコ
ーディング領域のみ（２Ｄ５）と同等以上の輸送活性を
発現した。この結果より、１００ｂｐ以上の５’-ＵＴ
Ｒを付加すると機能発現が阻害されることが明らかとな
った。いずれも同量のＲＮＡをインジェクションしてい
ることから、翻訳が阻害されていると考えられる。

【００４２】実施例８（ＤＴＤＳＴ発現組換えアデノウイルスの作製）ｉｎ
ｖｉｖｏでＤＴＤＳＴ遺伝子を目的とする組織あるいは
細胞に導入しＤＴＤＳＴ蛋白を発現可能な組換えアデノ
ウイルスを作製した。本組換えアデノウイルスの作成
は、（特開平８−３０８５８５ほか前出）に記載の方法
に従った。即ち、まず上述のプラスミド、ｐＢｌｕｅ−
ｒＤＴＤ（ｆｕｌｌ）Ｘ２を制限酵素ＰｓｔＩおよびＥ
ｃｏＲＩで消化後、ＤＮＡＢｌｕｎｔｉｎｇｋｉｔ
（宝酒造）を用いて両端を平滑化した。５％ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動によりＤＴＤＳＴのコーディング
領域を含む約２．３ｋｂのｃＤＮＡ断片を分離した。常
法によりゲルから回収した上記ＤＴＤＳＴｃＤＮＡ断
片を抽出した。一方、アデノウイルスゲノムからＥ３領
域とＥ１Ａ・Ｅ１Ｂ領域を欠失させたカッセットコスミ
ドＡｘＣＡｗｔをＳｗａ１で消化し、フェノール抽出、
ゲル濾過精製した。以降、特開平８−３０８５８５に記
載の方法に従い、上記ＤＴＤＳＴｃＤＮＡ断片を組み
込んだカセットコスミド、ｐＡｄ−ｒＤＴＤＳＴを作製
した。次いで、リン酸カルシウム法によりｐＡｄ−ｒＤ
ＴＤＳＴとＥｃｏＴ２２Ｉ消化した親ウイルスＤＮＡ−
ＴＰＣでヒト胎児腎由来細胞株（２９３細胞）を同時ト
ランスフェクションした。３７℃で約１日間培養後、９
６穴プレート３枚にそれぞれ原液、１０倍希釈、および
１００倍希釈でまき直した。ウイルス増殖が起こり細胞
が死滅したウエルからＤＮＡを抽出し、数種の制限酵素
による消化パターンを電気泳動で調べることにより、目
的のＤＴＤＳＴｃＤＮＡ断片が挿入された組換えアデ
ノウイルスを選択した。培養液中に含まれるウイルス液
を用い、順次スケールアップし、最終的に２９３細胞に
対して３．８×１０⁸ｐｆｕ／ｍｌの力価を有する組換
えアデノウイルス、ＡｘＣＡＤＴＤＳＴを得た。

【００４３】実施例９（ＤＴＤＳＴ組換えアデノウイルスを用いた動物細胞へ
の遺伝子導入）上記ＡｘＣＡＤＴＤＳＴを用い、動物細
胞への遺伝子導入および遺伝子発現を調べた。動物細胞
としてはアフリカミドリザル腎由来細胞株（ＣＯＳ−１
細胞）を用いた。細胞を１０％あるいは５％血清を含む
ＤＭＥＭ培地で２４穴プレートに播き、ＣＯ２インキ
ュベーター内でコンフルエントに達するまで培養した。
培地を除去後、同培地で１×１０⁷ｐｆｕ／ｍｌに希釈
したＡｘＣＡＤＴＤＳＴ、同濃度のＤＴＤＳＴｃＤ
ＮＡを挿入していないアデノウイルスＡｘＣＡｗｔ、あ
るいは培地のみ（モックインフェクション）をウェルあ
たり５０μｌ添加した。ＣＯ２インキュベーター内で１
時間インキュベート後、同培地を０．４ｍｌ添加し、培
養を継続した。

【００４４】実施例１０（ＤＴＤＳＴ組換えアデノウイルス感染細胞での機能発
現）感染後３日目の細胞を用い、［３５Ｓ］サルフェー
トの取り込みを調べた。先ず、培地を除き、細胞を３０
０ｍＭｓｕｃｒｏｓｅ，１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＥ
ＰＥＳ，ｐＨ７．５からなる溶液０．５ｍｌで２回洗浄
後、０．５ｍｌの３００ｍＭｓｕｃｒｏｓｅ，１ｍＭ
Ｋ₂ＳＯ₄（４０μＣｉ／ｍｌ［³⁵Ｓ］Ｎａ₂ＳＯ₄
），１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．５
からなる反応溶液中で室温で１時間インキュベートし
た。反応後、０．５ｍｌのｉｃｅ−ｃｏｌｄの３００ｍ
Ｍｓｕｃｒｏｓｅ，５ｍＭＫ₂ＳＯ₄，１０ｍＭＴ
ｒｉｓ−ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．５からなる溶液で４回洗
浄した。ウェルあたり１ｍｌの１０％ＳＤＳ溶液で溶解
後、内３００μｌを用い、３ｍｌの液体シンチレーター
（ＡＣＳＩＩ：アマシャム）を添加し、液体シンチショ
ンカウンターにより細胞内に取り込まれた［³⁵Ｓ］サル
フェートの放射活性を測定した。図５に示すとおり、Ｄ
ＴＤＳＴ組換えアデノウイルスの感染により、サルフェ
ートの取り込みは有意に増加した。従って、本組換えア
デノウイルスを用いることにより、動物細胞でＤＴＤＳ
Ｔ遺伝子を導入し、高発現させることが可能なことが証
明された。

【００４５】

【発明の効果】本発明は、発現効率の高いサルフェート
トランスポーター（ＤＴＤＳＴ）遺伝子含有ベクターを
提供する。これを用いて、骨・軟骨系疾患の治療に有効
な薬剤のスクリーニングを行うことが出来る。また、ア
デノウィルスベクターは骨・軟骨系疾患の遺伝子治療に
持ちいうる。

【００４６】

【配列表】配列番号１配列の長さ：７３９配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド起源生物名：ヒト配列 Met Ser Ser Glu Ser Lys Glu Gln His Asn Val Ser Pro Arg Asp Ser 5 10 15 Ala Glu Gly Asn Asp Ser Tyr Pro Ser Gly Ile His Leu Glu Leu Gln 20 25 30 Arg Glu Ser Ser Thr Asp Phe Lys Gln Phe Glu Thr Asn Asp Gln Cys 35 40 45 Arg Pro Tyr His Arg Ile Leu Ile Glu Arg Gln Glu Lys Ser Asp Thr 50 55 60 Asn Phe Lys Glu Phe Val Ile Lys Lys Leu Gln Lys Asn Cys Gln Cys 65 70 75 80 Ser Pro Ala Lys Ala Lys Asn Met Ile Leu Gly Phe Leu Pro Val Leu 85 90 95 Gln Trp Leu Pro Lys Tyr Asp Leu Lys Lys Asn Ile Leu Gly Asp Val 100 105 110 Met Ser Gly Leu Ile Val Gly Ile Leu Leu Val Pro Gln Ser Ile Ala 115 120 125 Tyr Ser Leu Leu Ala Gly Gln Glu Pro Val Tyr Gly Leu Tyr Thr Ser 130 135 140 Phe Phe Ala Ser Ile Ile Tyr Phe Leu Leu Gly Thr Ser Arg His Ile 145 150 155 160 Ser Val Gly Ile Phe Gly Val Leu Cys Leu Met Ile Gly Glu Thr Val 165 170 175 Asp Arg Glu Leu Gln Lys Ala Gly Tyr Asp Asn Ala His Ser Ala Pro 180 185 190 Ser Leu Gly Met Val Ser Asn Gly Ser Thr Leu Leu Asn His Thr Ser 195 200 205 Asp Arg Ile Cys Asp Lys Ser Cys Tyr Ala Ile Met Val Gly Ser Thr 210 215 220 Val Thr Phe Ile Ala Gly Val Tyr Gln Val Ala Met Gly Phe Phe Gln 225 230 235 240 Val Gly Phe Val Ser Val Tyr Leu Ser Asp Ala Leu Leu Ser Gly Phe 245 250 255 Val Thr Gly Ala Ser Phe Thr Ile Leu Thr Ser Gln Ala Lys Tyr Leu 260 265 270 Leu Gly Leu Asn Leu Pro Arg Thr Asn Gly Val Gly Ser Leu Ile Thr 275 280 285 Thr Trp Ile His Val Phe Arg Asn Ile His Lys Thr Asn Leu Cys Asp 290 295 300 Leu Ile Thr Ser Leu Leu Cys Leu Leu Val Leu Leu Pro Thr Lys Glu 305 310 315 320 Leu Asn Glu His Phe Lys Ser Lys Leu Lys Ala Pro Ile Pro Ile Glu 325 330 335 Leu Val Val Val Val Ala Ala Thr Leu Ala Ser His Phe Gly Lys Leu 340 345 350 His Glu Asn Tyr Asn Ser Ser Ile Ala Gly His Ile Pro Thr Gly Phe 355 360 365 Met Pro Pro Lys Val Pro Glu Trp Asn Leu Ile Pro Ser Val Ala Val 370 375 380 Asp Ala Ile Ala Ile Ser Ile Ile Gly Phe Ala Ile Thr Val Ser Leu 385 390 395 400 Ser Glu Met Phe Ala Lys Lys His Gly Tyr Thr Val Lys Ala Asn Gln 405 410 415 Glu Met Tyr Ala Ile Gly Phe Cys Asn Ile Ile Pro Ser Phe Phe His 420 425 430 Cys Phe Thr Thr Ser Ala Ala Leu Ala Lys Thr Leu Val Lys Glu Ser 435 440 445 Thr Gly Cys His Thr Gln Leu Ser Gly Val Val Thr Ala Leu Val Leu 450 455 460 Leu Leu Val Leu Leu Val Ile Ala Pro Leu Phe Tyr Ser Leu Gln Lys 465 470 475 480 Ser Val Leu Gly Val Ile Thr Ile Val Asn Leu Arg Gly Ala Leu Arg 485 490 495 Lys Phe Arg Asp Leu Pro Lys Met Trp Ser Ile Ser Arg Met Asp Thr 500 505 510 Val Ile Trp Phe Val Thr Met Leu Ser Ser Ala Leu Leu Ser Thr Glu 515 520 525 Ile Gly Leu Leu Val Gly Val Cys Phe Ser Ile Phe Cys Val Ile Leu 530 535 540 Arg Thr Gln Lys Pro Lys Ser Ser Leu Leu Gly Leu Val Glu Glu Ser 545 550 555 560 Glu Val Phe Glu Ser Val Ser Ala Tyr Lys Asn Leu Gln Thr Lys Pro 565 570 575 Gly Ile Lys Ile Phe Arg Phe Val Ala Pro Leu Tyr Tyr Ile Asn Lys 580 585 590 Glu Cys Phe Lys Ser Ala Leu Tyr Lys Gln Thr Val Asn Pro Ile Leu 595 600 605 Ile Lys Val Ala Trp Lys Lys Ala Ala Lys Arg Lys Ile Lys Glu Lys 610 615 620 Val Val Thr Leu Gly Gly Ile Gln Asp Glu Met Ser Val Gln Leu Ser 625 630 635 640 His Asp Pro Leu Glu Leu His Thr Ile Val Ile Asp Cys Ser Ala Ile 645 650 655 Gln Phe Leu Asp Thr Ala Gly Ile His Thr Leu Lys Glu Val Arg Arg 660 665 670 Asp Tyr Glu Ala Ile Gly Ile Gln Val Leu Leu Ala Gln Cys Asn Pro 675 680 685 Thr Val Arg Asp Ser Leu Thr Asn Gly Glu Tyr Cys Lys Lys Glu Glu 690 695 700 Glu Asn Leu Leu Phe Tyr Ser Val Tyr Glu Ala Met Ala Phe Ala Glu 705 710 715 720 Val Ser Lys Asn Gln Lys Gly Val Cys Val Pro Asn Gly Leu Ser Leu 725 730 735 Ser Ser Asp

【００４７】配列番号２配列の長さ：７３９配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド起源生物名：ラット配列 Met Ser Ser Glu Asn Lys Glu Gln His Asn Leu Ser Pro Arg Asp Leu 5 10 15 Pro Glu Glu Ala Tyr Gly Phe Pro Pro Glu Leu Pro Leu Gly Ala Gln 20 25 30 Arg Gly Ser Ser Thr Asp Leu Arg Gln Phe Glu Pro Ser Asp Arg Arg 35 40 45 Arg Ala Phe Arg Arg Ile His Met Glu Leu His Glu Lys Pro Asp Thr 50 55 60 Asn Ile Arg Gln Leu Val Met Arg Lys Leu Gln Lys Ser Cys Gln Cys 65 70 75 80 Asn Ala Thr Lys Ile Arg Asn Arg Ile Phe Asp Phe Phe Pro Val Leu 85 90 95 Arg Trp Leu Pro Lys Tyr Asp Leu Lys Lys Asn Ile Leu Gly Asp Met 100 105 110 Met Ser Gly Leu Ile Val Gly Ile Leu Leu Val Pro Gln Ser Ile Ala 115 120 125 Tyr Ser Leu Leu Ala Gly Gln Glu Pro Ile Tyr Gly Leu Tyr Thr Ser 130 135 140 Phe Phe Ala Ser Ile Ile Tyr Phe Leu Phe Gly Thr Ser Arg His Ile 145 150 155 160 Ser Val Gly Ile Phe Gly Ile Leu Cys Leu Met Ile Gly Glu Val Val 165 170 175 Asp Arg Glu Leu His Lys Ala Cys Pro Asp Ile Asp Thr Thr Ser Ser 180 185 190 Ser Ile Ala Met Phe Ser Asn Gly Cys Val Val Val Asn His Thr Leu 195 200 205 Asp Gly Leu Cys Asp Lys Ser Cys Tyr Ala Ile Lys Ile Gly Ser Thr 210 215 220 Val Thr Phe Met Ala Gly Val Tyr Gln Val Ala Met Gly Phe Phe Gln 225 230 235 240 Val Gly Phe Val Ser Val Tyr Leu Ser Asp Ala Leu Leu Ser Gly Phe 245 250 255 Val Thr Gly Ala Ser Phe Thr Ile Leu Thr Ser Gln Ala Lys Tyr Leu 260 265 270 Leu Gly Leu Ser Leu Pro Arg Ser Asn Gly Val Gly Ser Val Ile Thr 275 280 285 Thr Trp Ile His Ile Phe Arg Asn Ile His Lys Thr Asn Ile Cys Asp 290 295 300 Leu Ile Thr Ser Leu Leu Cys Leu Leu Val Leu Val Pro Thr Lys Glu 305 310 315 320 Leu Asn Glu Tyr Phe Lys Ser Lys Leu Pro Ala Pro Ile Pro Thr Glu 325 330 335 Leu Ile Val Val Val Ala Ala Thr Leu Ala Ser His Phe Gly Lys Leu 340 345 350 Asn Glu Asn Tyr Asn Ser Ser Ile Ala Gly Gln Ile Pro Thr Gly Phe 355 360 365 Met Pro Pro Gln Ala Pro Asp Trp Ser Leu Ile Pro Asn Val Ala Val 370 375 380 Asp Ala Ile Ala Ile Ser Ile Ile Gly Phe Ala Ile Thr Val Ser Leu 385 390 395 400 Ser Glu Met Phe Ala Lys Lys His Gly Tyr Thr Val Lys Ala Asn Gln 405 410 415 Glu Met Tyr Ala Ile Gly Phe Cys Asn Ile Ile Pro Ser Phe Phe His 420 425 430 Cys Ile Thr Thr Ser Ala Ala Leu Ala Lys Thr Leu Val Lys Glu Ser 435 440 445 Thr Gly Cys Gln Thr Gln Leu Ser Ala Ile Val Thr Ser Leu Val Leu 450 455 460 Leu Leu Val Leu Leu Leu Ile Ala Pro Leu Phe Tyr Ser Leu Gln Lys 465 470 475 480 Cys Val Leu Gly Val Ile Thr Ile Val Asn Leu Arg Gly Ala Leu Leu 485 490 495 Lys Phe Arg Asp Leu Pro Lys Met Trp Arg Leu Ser Arg Met Asp Thr 500 505 510 Val Ile Trp Phe Val Thr Met Leu Ser Ser Ala Leu Leu Ser Thr Glu 515 520 525 Ile Gly Leu Leu Val Gly Val Cys Phe Ser Met Phe Cys Val Ile Leu 530 535 540 Arg Thr Gln Met Pro Lys Ile Ser Leu Leu Gly Leu Glu Glu Glu Ser 545 550 555 560 Glu Ile Phe Glu Ser Ile Ser Thr Tyr Lys Asn Leu Arg Ser Lys Ser 565 570 575 Gly Ile Lys Val Phe Arg Phe Ile Ala Pro Leu Tyr Tyr Ile Asn Lys 580 585 590 Glu Cys Phe Lys Ser Ala Leu Tyr Lys Lys Thr Leu Asn Pro Val Leu 595 600 605 Val Lys Ala Ala Trp Lys Lys Ala Ala Lys Arg Lys Leu Lys Glu Glu 610 615 620 Thr Val Thr Phe His Gly Asp Pro Asp Glu Val Ser Met Gln Leu Ser 625 630 635 640 His Asp Pro Leu Glu Leu His Thr Val Val Ile Asp Cys Ser Ala Ile 645 650 655 Gln Phe Leu Asp Thr Ala Gly Ile His Thr Leu Lys Glu Val Arg Arg 660 665 670 Asp Tyr Glu Ala Ile Gly Ile Gln Val Leu Leu Ala Gln Cys Asn Pro 675 680 685 Ser Val Arg Asp Ser Leu Ala Lys Gly Glu Tyr Cys Lys Lys Glu Glu 690 695 700 Glu Asn Leu Leu Phe Tyr Ser Leu Ser Glu Ala Val Ala Phe Ala Glu 705 710 715 720 Glu Ser Gln Lys Glu Lys Gly Val Cys Val Val Asn Gly Leu Ser Leu 725 730 735 Ser Gly Asp

【００４８】配列番号３配列の長さ：７７ｂｐ配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ起源：ヒト骨肉腫由来細胞株生物名：ヒト配列： GGAAGACGCG TGCCGCGGCG CCTGGTTGCC TGCAGCGGCC CGGACCCGAG AGGAAGCTGA 60 ACCATCTATC TCCAGAA

【００４９】配列番号４配列の長さ：３６６ｂｐ配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ起源：ラット骨肉腫由来細胞株ＵＭＲ１０６細胞生物名：ラット配列： GCCGGGTTCC TTCCGCACCT TTCCTACGGT GACCATGGCT AGCTGCTGCC TCCTTGGGGC 60 CGGACCATGG GCGGGGACGG TTGCCGGGGT ATTAAAGGGA AGCTCGCCCG CGGCCAGACT 120 GCCTGTACCC GTGCGGCGGC GTCCCTGCAG CCAAGTCTTG CCGGAGGACG TGCCGTGGGA 180 GCCCGTGTCT GGCGGACTGG AGCATTAAGG AGTAAAGTTG CTGCTTTAAA GACATCATCT 240 TCTGGCTTCC ATTAAGTCCA GGACATGTGC TGTATTCCTG TCTTTGTTCC TCCATAAGTG 300 ATGTGTGTCT GTCTTCAGAA GCACCCTCTG AGTAACAGTG ATTGGAAGTA AAGCATCTGT 360 CTCCAGA

【００５０】配列番号５配列の長さ：１８ｂｐ配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列： TTGCCAACCA AAGAACTC 18

【００５１】配列番号６配列の長さ：１８ｂｐ配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列： TGTGATCACA CCAAGGAC 18

【００５２】配列番号７配列の長さ：２０ｂｐ配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列： ATTAGCAGAA GGACCAACAG 20

【００５３】配列番号８配列の長さ：２０ｂｐ配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列： ATGTCTTCAG AAAGTAAAGA 20

【００５４】配列番号９配列の長さ：２０ｂｐ配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列： TCACTACTAA GACTCAGACC 20

【００５５】配列番号１０配列の長さ：２２ｂｐ配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列： GCAGTGGAAG AAGGAGGGTA TG 22

【００５６】配列番号１１配列の長さ：２２ｂｐ配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列： CCGGCACCAA TTCCAACTGA GC 22

【００５７】配列番号１２配列の長さ：２４ｂｐ配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列： GCATACATTT CCTGATTGGC TTTC 24

【００５８】配列番号１３配列の長さ：２２ｂｐ配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列： AGCTCATTGT CGTTGTGGCA GC 22

【００５９】配列番号１４配列の長さ：３２ｂｐ配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列： TTTCTAGAAT GTCTTCAGAA AATAAAGAGC AG 32

【００６０】配列番号１５配列の長さ：３６ｂｐ配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列： TTTCTAGATC AGTCACCAGA AAGACTCAAA CCATTG 36

【００６１】配列番号１６配列の長さ：２９ｂｐ配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列： TTTGGGCCCG CCGGGTTCCT TCTGCACCT 29

【００６２】配列番号１７配列の長さ：２９ｂｐ配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列： TTTGGGCCCG CTAGCTGCTG CCTCCTTGG 29

【００６３】配列番号１８配列の長さ：２９ｂｐ配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列： TTTGGGCCCG GCGGGGACGG TTGCCGGGG 29

【００６４】配列番号１９配列の長さ：２９ｂｐ配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列： TTTGGGCCCT GCTGTATTCC TGTCTTTGT 29

【００６５】配列番号２０配列の長さ：２９ｂｐ配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列： TTTGGGCCCT GTGTCTGTCT TCAGAAGCA 29

【００６６】配列番号２１配列の長さ：２９ｂｐ配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列： TTTGGGCCCA TGTCTTCAGA AAATAAAGA 29

【００６７】配列番号２２配列の長さ：２０ｂｐ配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列： TGGTTTCTCA TGGAGTTCCA 20

【００６８】配列番号２３配列の長さ：２４ｂｐ配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列： TACTTGATTC CCTTTGAAGT TCCAG 24

【００６９】配列番号２４配列の長さ：２７９２ｂｐ配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ起源生物名：ラット骨肉腫由来細胞株ＵＭＲ１０６細胞配列 GCCGGGTTCC TTCCGCACCT TTCCTACGGT GACCATGGCT AGCTGCTGCC TCCTTGGGGC 60 CGGACCATGG GCGGGGACGG TTGCCGGGGT ATTAAAGGGA AGCTCGCCCG CGGCCAGACT 120 GCCTGTACCC GTGCGGCGGC GTCCCTGCAG CCAAGTCTTG CCGGAGGACG TGCCGTGGGA 180 GCCCGTGTCT GGCGGACTGG AGCATTAAGG AGTAAAGTTG CTGCTTTAAA GACATCATCT 240 TCTGGCTTCC ATTAAGTCCA GGACATGTGC TGTATTCCTG TCTTTGTTCC TCCATAAGTG 300 ATGTGTGTCT GTCTTCAGAA GCACCCTCTG AGTAACAGTG ATTGGAAGTA AAGCATCTGT 360 CTCCAGA ATG TCT TCA GAA AAT AAA GAG CAG CAT AAT CTT TCA CCA AGG 409 Met Ser Ser Glu Asn Lys Glu Gln His Asn Leu Ser Pro Arg 5 10 GAC TTA CCT GAA GAA GCC TAT GGC TTC CCA CCT GAG CTC CCC CTG GGG 457 Asp Leu Pro Glu Glu Ala Tyr Gly Phe Pro Pro Glu Leu Pro Leu Gly 15 20 25 30 GCT CAA AGA GGA TCA AGC ACT GAC TTA AGG CAG TTT GAG CCC AGT GAT 505 Ala Gln Arg Gly Ser Ser Thr Asp Leu Arg Gln Phe Glu Pro Ser Asp 35 40 45 CGG AGA AGA GCT TTT CGT AGG ATC CAC ATG GAA CTC CAT GAG AAA CCA 553 Arg Arg Arg Ala Phe Arg Arg Ile His Met Glu Leu His Glu Lys Pro 50 55 60 GAT ACT AAC ATC AGA CAG CTT GTC ATG AGA AAG CTT CAG AAG AGT TGC 601 Asp Thr Asn Ile Arg Gln Leu Val Met Arg Lys Leu Gln Lys Ser Cys 65 70 75 CAG TGT AAT GCA ACC AAA ATC AGA AAT AGG ATT TTT GAT TTT TTT CCT 649 Gln Cys Asn Ala Thr Lys Ile Arg Asn Arg Ile Phe Asp Phe Phe Pro 80 85 90 GTT TTG AGG TGG CTC CCA AAA TAT GAT CTG AAG AAA AAC ATT TTA GGT 697 Val Leu Arg Trp Leu Pro Lys Tyr Asp Leu Lys Lys Asn Ile Leu Gly 95 100 105 110 GAC ATG ATG TCT GGC CTG ATT GTG GGT ATA TTG TTG GTG CCC CAG TCT 745 Asp Met Met Ser Gly Leu Ile Val Gly Ile Leu Leu Val Pro Gln Ser 115 120 125 ATT GCT TAC TCC CTG TTG GCT GGC CAG GAA CCT ATC TAT GGT CTG TAC 793 Ile Ala Tyr Ser Leu Leu Ala Gly Gln Glu Pro Ile Tyr Gly Leu Tyr 130 135 140 ACA TCA TTT TTT GCC AGC ATT ATT TAC TTC CTG TTT GGT ACC TCC CGC 841 Thr Ser Phe Phe Ala Ser Ile Ile Tyr Phe Leu Phe Gly Thr Ser Arg 145 150 155 CAC ATC TCT GTG GGC ATT TTT GGA ATA CTG TGC CTT ATG ATT GGT GAG 889 His Ile Ser Val Gly Ile Phe Gly Ile Leu Cys Leu Met Ile Gly Glu 160 165 170 GTA GTT GAC CGA GAA CTA CAT AAA GCC TGC CCT GAC ATT GAT ACT ACA 937 Val Val Asp Arg Glu Leu His Lys Ala Cys Pro Asp Ile Asp Thr Thr 175 180 185 190 TCA TCT TCC ATA GCA ATG TTT TCA AAT GGA TGT GTG GTA GTA AAC CAT 985 Ser Ser Ser Ile Ala Met Phe Ser Asn Gly Cys Val Val Val Asn His 195 200 205 ACA TTA GAC GGA CTC TGT GAC AAA AGC TGT TAT GCA ATT AAA ATT GGC 1033 Thr Leu Asp Gly Leu Cys Asp Lys Ser Cys Tyr Ala Ile Lys Ile Gly 210 215 220 AGC ACT GTG ACA TTC ATG GCT GGA GTT TAT CAG GTA GCC ATG GGC TTC 1081 Ser Thr Val Thr Phe Met Ala Gly Val Tyr Gln Val Ala Met Gly Phe 225 230 235 TTT CAA GTG GGC TTT GTG TCT GTC TAC CTC TCA GAT GCC TTG CTG AGC 1129 Phe Gln Val Gly Phe Val Ser Val Tyr Leu Ser Asp Ala Leu Leu Ser 240 245 250 GGG TTT GTC ACT GGT GCC TCC TTC ACC ATC CTC ACG TCT CAG GCC AAG 1177 Gly Phe Val Thr Gly Ala Ser Phe Thr Ile Leu Thr Ser Gln Ala Lys 255 260 265 270 TAC CTC CTG GGG CTG AGC CTT CCT CGG AGC AAT GGT GTA GGC TCA GTC 1225 Tyr Leu Leu Gly Leu Ser Leu Pro Arg Ser Asn Gly Val Gly Ser Val 275 280 285 ATT ACT ACC TGG ATC CAC ATC TTC AGA AAT ATT CAT AAG ACC AAC ATC 1273 Ile Thr Thr Trp Ile His Ile Phe Arg Asn Ile His Lys Thr Asn Ile 290 295 300 TGT GAC CTC ATC ACC AGC CTT TTG TGT CTC CTG GTC CTT GTG CCA ACC 1321 Cys Asp Leu Ile Thr Ser Leu Leu Cys Leu Leu Val Leu Val Pro Thr 305 310 315 AAA GAA CTC AAC GAA TAC TTC AAG TCC AAG CTC CCG GCA CCA ATT CCA 1369 Lys Glu Leu Asn Glu Tyr Phe Lys Ser Lys Leu Pro Ala Pro Ile Pro 320 325 330 ACT GAG CTC ATT GTC GTT GTG GCA GCC ACA TTG GCT TCT CAT TTT GGA 1417 Thr Glu Leu Ile Val Val Val Ala Ala Thr Leu Ala Ser His Phe Gly 335 340 345 350 AAA CTC AAT GAG AAT TAC AAT TCC AGT ATT GCC GGG CAA ATT CCC ACC 1465 Lys Leu Asn Glu Asn Tyr Asn Ser Ser Ile Ala Gly Gln Ile Pro Thr 355 360 365 GGG TTT ATG CCA CCC CAA GCG CCA GAC TGG AGC CTC ATT CCT AAT GTG 1513 Gly Phe Met Pro Pro Gln Ala Pro Asp Trp Ser Leu Ile Pro Asn Val 370 375 380 GCT GTT GAT GCC ATA GCT ATT TCT ATC ATT GGT TTT GCT ATC ACT GTA 1561 Ala Val Asp Ala Ile Ala Ile Ser Ile Ile Gly Phe Ala Ile Thr Val 385 390 395 TCA CTT TCT GAG ATG TTT GCC AAG AAA CAT GGC TAC ACG GTG AAA GCC 1609 Ser Leu Ser Glu Met Phe Ala Lys Lys His Gly Tyr Thr Val Lys Ala 400 405 410 AAT CAG GAA ATG TAT GCC ATT GGC TTT TGC AAT ATC ATA CCC TCC TTC 1657 Asn Gln Glu Met Tyr Ala Ile Gly Phe Cys Asn Ile Ile Pro Ser Phe 415 420 425 430 TTC CAC TGC ATA ACT ACT AGT GCC GCC CTT GCA AAG ACA CTG GTT AAA 1705 Phe His Cys Ile Thr Thr Ser Ala Ala Leu Ala Lys Thr Leu Val Lys 435 440 445 GAG TCA ACA GGT TGC CAG ACC CAA CTG TCC GCT ATA GTG ACA TCC CTC 1753 Glu Ser Thr Gly Cys Gln Thr Gln Leu Ser Ala Ile Val Thr Ser Leu 450 455 460 GTT CTT CTG TTG GTC CTT CTG CTA ATA GCT CCC TTA TTC TAT TCC CTC 1801 Val Leu Leu Leu Val Leu Leu Leu Ile Ala Pro Leu Phe Tyr Ser Leu 465 470 475 CAA AAA TGT GTC CTT GGT GTG ATC ACC ATT GTA AAT CTC CGG GGT GCA 1849 Gln Lys Cys Val Leu Gly Val Ile Thr Ile Val Asn Leu Arg Gly Ala 480 485 490 CTT CTG AAA TTT AGA GAC CTG CCA AAG ATG TGG AGG CTC AGC AGA ATG 1897 Leu Leu Lys Phe Arg Asp Leu Pro Lys Met Trp Arg Leu Ser Arg Met 495 500 505 510 GAC ACA GTT ATC TGG TTT GTG ACG ATG CTG TCC TCT GCT CTG TTA AGC 1945 Asp Thr Val Ile Trp Phe Val Thr Met Leu Ser Ser Ala Leu Leu Ser 515 520 525 ACT GAA ATA GGC CTG CTC GTT GGG GTT TGT TTT TCA ATG TTT TGT GTG 1993 Thr Glu Ile Gly Leu Leu Val Gly Val Cys Phe Ser Met Phe Cys Val 530 535 540 ATT CTC CGT ACT CAG ATG CCA AAG ATT TCA CTG CTT GGT TTG GAA GAA 2041 Ile Leu Arg Thr Gln Met Pro Lys Ile Ser Leu Leu Gly Leu Glu Glu 545 550 555 GAA TCT GAA ATC TTC GAG TCC ATC TCC ACT TAC AAG AAC CTT CGG AGT 2089 Glu Ser Glu Ile Phe Glu Ser Ile Ser Thr Tyr Lys Asn Leu Arg Ser 560 565 570 AAG TCA GGC ATC AAG GTT TTC CGC TTC ATA GCC CCT CTC TAC TAC ATA 2137 Lys Ser Gly Ile Lys Val Phe Arg Phe Ile Ala Pro Leu Tyr Tyr Ile 575 580 585 590 AAC AAA GAA TGC TTT AAA TCA GCT TTG TAC AAG AAA ACG CTA AAC CCA 2185 Asn Lys Glu Cys Phe Lys Ser Ala Leu Tyr Lys Lys Thr Leu Asn Pro 595 600 605 GTC TTG GTA AAA GCA GCC TGG AAA AAG GCA GCA AAA AGG AAA CTG AAA 2233 Val Leu Val Lys Ala Ala Trp Lys Lys Ala Ala Lys Arg Lys Leu Lys 610 615 620 GAG GAA ACA GTG ACT TTC CAT GGG GAC CCG GAT GAA GTC TCA ATG CAG 2281 Glu Glu Thr Val Thr Phe His Gly Asp Pro Asp Glu Val Ser Met Gln 625 630 635 CTT TCC CAT GAT CCC TTG GAG CTG CAC ACC GTT GTG ATT GAC TGT AGT 2329 Leu Ser His Asp Pro Leu Glu Leu His Thr Val Val Ile Asp Cys Ser 640 645 650 GCA ATA CAG TTT TTG GAT ACA GCA GGG ATC CAC ACA CTG AAA GAA GTT 2377 Ala Ile Gln Phe Leu Asp Thr Ala Gly Ile His Thr Leu Lys Glu Val 655 660 665 670 CGC CGG GAT TAT GAA GCC ATT GGT ATC CAG GTT TTA CTG GCT CAG TGC 2425 Arg Arg Asp Tyr Glu Ala Ile Gly Ile Gln Val Leu Leu Ala Gln Cys 675 680 685 AAT CCT TCT GTG AGG GAT TCC TTA GCC AAA GGA GAA TAT TGC AAA AAG 2473 Asn Pro Ser Val Arg Asp Ser Leu Ala Lys Gly Glu Tyr Cys Lys Lys 690 695 700 GAA GAA GAA AAT CTT CTC TTC TAC AGT TTG TCT GAA GCA GTA GCT TTT 2521 Glu Glu Glu Asn Leu Leu Phe Tyr Ser Leu Ser Glu Ala Val Ala Phe 705 710 715 GCA GAA GAG TCT CAG AAG GAG AAA GGA GTG TGT GTG GTC AAT GGT TTG 2569 Ala Glu Glu Ser Gln Lys Glu Lys Gly Val Cys Val Val Asn Gly Leu 720 725 730 AGT CTT TCT GGT GAC TGAGAAAATT AATGAGTCTC TCTGGTGACT GGGAAAGCTA 2624 Ser Leu Ser Gly Asp 735 ATAGAAGGAA GAAGAGTGTC TTGCCAGTTT CAGTGTGCGG CATTTTCTCC TGTGAAGGAG 2684 GAAGCAGTGT ACACGTGAGA TGGCTTCCTT TGCAGCTAGC CTTTCGATAG TCTTCCTGCT 2744 TCAGCCTCCA GGTGCTGGAG TTGACAGGCC CAGGGTGGAA TAAGCTGG 2792

【００７０】

【図面の簡単な説明】

【図１】ラット型ＤＴＤＳＴｉｎｖｉｔｒｏ転写用プ
ラスミドの構築概念図。黒塗りのボックスはラットＤＴ
ＤＳＴのコーディング領域を示す。

【図２】ラット型ＤＴＤＳＴ５’非翻訳領域による機能
発現の阻害。５’非翻訳領域を付加あるいは除去したＤ
ＴＤＳＴＲＮＡを卵母細胞にインジェクションし、
［３５Ｓ］サルフェートの取り込みを調べた。

【図３】ラットＤＴＤＳＴ・５’非翻訳領域欠失体の構
築概念図。ボックスはｃＤＮＡ領域、細線はベクター領
域を示す。塩基配列はｐＢｌｕｅ−ｒＤＴＤ（ｆｕｌ
ｌ）内の部分ｃＤＮＡ配列を示す。下波線部はＧ／Ｃ−
ｒｉｃｈな領域を示す。イタリック体のＡＴＧはＤＴＤ
ＳＴの本来の翻訳開始コドンを示す。

【図４】ラットＤＴＤＳＴ・５’非翻訳領域欠失体の発
現。５’非翻訳領域を５’末端から順次欠失させたＤＴ
ＤＳＴＲＮＡを卵母細胞にインジェクションし、［３
５Ｓ］サルフェートの取り込みを調べた。

【図５】ＤＴＤＳＴ遺伝子発現アデノウイルスを用いた
動物細胞での発現。図中ａｄｅｎｏＷＴはＤＴＤＳＴ
ｃＤＮＡを挿入していないアデノウイルスＡｘＣＡｗｔ
を、ａｄｅｎｏＤＴＤＳＴはＡｘＣＡＤＴＤＳＴを感染
させたＣＯＳ−１細胞を用いて［３５Ｓ］サルフェート
の取り込みを調べた結果を示す。Ｃｏｎｔｒｏｌはモッ
クインフェクションの場合を示す。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＧ０１Ｎ 33/50 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｐ // Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:91）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ほ乳類のサルフェートトランスポーター
（ＤＴＤＳＴ遺伝子発現産物）をコードするＤＮＡ配列
を含有し、かつ、ほ乳類のサルフェートトランスポータ
ー遺伝子の５’非翻訳領域のＤＮＡ配列を含まないこと
を特徴とする、サルフェートトランスポーター発現用ベ
クター。
【請求項２】ほ乳類のサルフェートトランスポーター
が、配列番号１または配列番号２で表されるアミノ酸配
列を有するサルフェートトランスポーターである請求項
１のベクター。
【請求項３】ほ乳類のサルフェートトランスポーター遺
伝子の５’非翻訳領域のＤＮＡ配列が、配列番号３また
は配列番号４で表されるラットまたはヒト遺伝子由来の
ＤＮＡ配列である請求項１のベクター。
【請求項４】下記（１）〜（３）の工程を含むヒト骨・
軟骨疾患治療薬のスクリーニング方法：（１）請求項１のベクターを用いて、動物細胞を形質転
換する工程、（２）その動物細胞を被検物質存在下に培
養する工程、（３）細胞への硫酸イオン取り込み量の増
加を検出する工程。
【請求項５】ベクターがアデノウィルスベクターである
ことを特徴とする請求項３のヒト骨・軟骨疾患治療薬の
スクリーニング方法。
【請求項６】請求項１のベクターを有効成分として含有
する、ヒト骨・軟骨疾患遺伝子治療のための医薬製剤。
【請求項７】アデノウィルスベクターを含有することを
特徴とする請求項６の医薬製剤。