PT2045322E

PT2045322E - Musculatura dupla em mamíferos

Info

Publication number: PT2045322E
Application number: PT80065543T
Authority: PT
Inventors: Luc Grobet; Michel Georges; Dominique Poncelet
Original assignee: Université de Liège
Priority date: 1997-07-14
Filing date: 1998-07-14
Publication date: 2015-10-16
Also published as: WO1999002667A1; AU8457198A; EP2045322A1; NZ502523A; DE69841139D1; EP2045322B1; JP2001509378A; ES2547858T3; ATE442436T1; EP1002068A1; DK2045322T3; CA2296434C; EP1002068B1; CA2296434A1; US20030129171A1; JP4368522B2; AU756620B2; CY1116682T1

Description

DESCRIÇÃO MUSCULATURA DUPLA EM MAMÍFEROS Campo da invenção

Esta invenção refere-se a fatores que afetam o desenvolvimento muscular em mamíferos, especialmente no gado. Em particular, esta invenção refere-se à clonagem de um método para determinar os genótipos de miostatina. Descrição da tecnologia relacionada A superfamília TGF-β consiste de um grupo de polipéptidos multifuncionais que controlam uma grande variedade de processos de diferenciação em muitos tipos de células de mamíferos. 0 GDF-8 é um membro da superfamília TGF-β. Todos os membros desta superfamília partilham uma estrutura comum, incluindo um pequeno péptido sinal para secreção e um fragmento do terminal-N do péptido que está separado do fragmento do terminal carboxilo bioativo por clivagem proteolítica num local de clivagem proteolítica altamente conservado. 0 domínio do terminal carboxilo bioativo é caracterizado por resíduos de cisteína em posições altamente conservadas que estão envolvidas em pontes dissulfureto intra e intermoleculares. As moléculas funcionais são dímeros ligados covalentemente (através de uma ligação S-S) do domínio do terminal carboxilo (Masterson et ai., 1996).

Recentemente, foi relatado que os ratinhos deficientes no gene que codifica para o GDF-8 foram caracterizados por uma hiperplasia muscular generalizada (McPherron et ai., 1997). Os ratinhos deficientes em GDF-8 foram produzidos por direcionamento genético usando recombinação homóloga em células estaminais embrionárias, um método referido como "knock-out de genes". A hiperplasia muscular generalizada de murino parece ser muito semelhante na sua expressão à hiperplasia muscular que caracteriza o gado com "musculatura dupla". Esta observação levantou a possibilidade intrigante de que o gene de bovinos que codifica para o GDF-8 (ou seja, o homólogo bovino evolutivo do gene do GDF-8 de ratinho) está envolvido no fenótipo de musculatura dupla de bovinos. Também levantou a possibilidade de que o gene de humano que codifica para o GDF-8 (ou seja, o homólogo humano evolutivo do gene do GDF-8 de ratinho) está envolvido na regulação do desenvolvimento muscular em seres humanos, especificamente na génese do músculo esquelético. 0 isolamento do gene do GDF-8 humano pode ter usos terapêuticos / aplicações no tratamento de doenças degenerativas do músculo através do aumento ou diminuição da expressão do GDF-8. A ocorrência de animais caracterizadas por uma hipertrofia muscular generalizada distinta, vulgarmente conhecidos como animais com "musculatura dupla", tem sido relatada em várias raças de gado em todo o mundo. A primeira descrição documentada de gado com musculatura dupla remonta tão cedo quanto 1807 (Culley, 1807) . Uma das raças em que esta característica tem sido mais exaustivamente analisada é na raça de gado Belgian Blue ("Raça Belgian Blue"). Esta é uma das únicas raças onde o traço de musculatura dupla tem sido sistematicamente selecionado, e onde o fenótipo de musculatura dupla é praticamente fixo. Uma comparação dos animais com musculatura dupla e animais convencionais dentro da raça Belgian Blue mostrou um aumento na massa muscular em 20 % em média, enquanto que todos os outros órgãos foram reduzidos em tamanho (Hanset, 1986 e 1991). A hipertrofia muscular foi mostrada ser uma hiperplasia histológica que afeta principalmente os músculos superficiais, acompanhada por uma redução de 50 % no teor total de lípidos e de uma redução na fração de tecido conjuntivo, tal como medido pelo teor de hidroxiprolina (Hanset et ai., 1982) . Os animais com musculatura dupla foram mostrados ter um reduzido consumo de alimentos com uma razão de conversão de alimentos melhorada (Hanset et al., 1987). Um beneficio económico importante dos animais com musculatura dupla, em contraste com os animais convencionais, é o aumento substancial no preço de venda e do lucro liquido para o agricultor (Hanset et al., 1987).

Uma das séries mais completa de estudos sobre a musculatura dupla é a de Hanset e colegas na raça Belgian Blue. Foram medidos em cerca de 150 animais selecionados aleatoriamente criados em condições padronizadas critérios objetivos de desenvolvimento muscular, tais como a percentagem de dressing-out, a percentagem magra e de gordura, as concentrações de plasma e de creatina em células de vermelhas e de creatinina. Estes estudos revelaram claramente distribuições bimodais anormais do fenótipo de musculatura dupla e confirmaram objetivamente a classificação visual tradicionalmente realizada por criadores de animais com musculatura dupla e convencionais. A distribuição fenotipica foi resolvida através de um processo de probabilidade máxima em duas populações normais de componentes com uma variância comum que revelou diferenças médias de três a quatro desvios padrão, dependendo da caracteristica. Isto sugeriu a

presença de um alelo que tem um efeito importante no desenvolvimento muscular, com uma frequência de população perto de 50 % (Hanset e Michaux, 1985b) . A evidência mais convincente em favor de um tal alelo veio porém de cruzamentos experimentais envolvendo touros Belgian Blue com musculatura dupla e vacas leiteiras Holstein Friesian (tendo os últimos animais um desenvolvimento muscular muito fraco). Enquanto que a descendência F1 apresentava uma distribuição fenotipica muito semelhantes às suas fêmeas Holstein Friesian, o retrocruzamento destes F1 com touros com musculatura dupla, produziu uma geração BC bimodal, apontando claramente para a segregação mendeliana de um alelo " mh" recessivo (hipertrofia muscular) (Hanset e Michaux, 1985a). 0 mesmo tipo de cruzamentos experimentais foram utilizados posteriormente para realizar um rastreio do genoma inteiro usando um mapa marcador baseado em microssatélites. Para realizar a análise de ligação, os animais foram classificados como com musculatura dupla ou convencionais. Foram obtidas pontuações de logaritmo das probabilidades (lodscores) muito significativas no cromossoma 2 (> 17), e a análise de ligação de vários pontos posicionou o locus mh na extremidade centromérica deste cromossoma, a [2] centimorgan do marcador microssatélite mais próximo: TGLA44. A região cromossómica correspondente responsável por toda a variância da característica foi assumida como sendo completamente penetrante nesta experiência (Charlier et ai., 1995) .

Em humanos, foram isolados os genes que codificam para algumas formas de anomalias musculares, por exemplo a distrofia muscular. A divulgação proporciona para o gene que regula apenas o desenvolvimento do músculo esquelético, em oposição a outros tipos de músculo, por exemplo, o músculo liso ou cardíaco. A divulgação pode proporcionar um entendimento do papel do gene GDF-8 ou do seu recetor no novo crescimento do músculo esquelético em seres humanos, que apenas são submetidos a uma resposta hiperplásica.

Sumário da invenção

Os presentes inventores identificaram e sequenciaram um gene (ADNc e genómico) que codifica para uma proteína de miostatina bovina. A sequência de codificação de ácido nucleico é identificada como SEQ ID NO: 1 e a sequência da proteína é identificada como SEQ ID NO: 2. A sequência genómica bovina i é identificada como SEQ ID NO: 54. Foi sequenciado um gene mutante (SEQ ID NO: 3) no qual a sequência de codificação não tem uma sequência de 11 pares de bases consecutivas (SEQ ID NO: 11) da sequência que codifica para a proteína bovina que possui atividade de miostatina. Tem sido demonstrado que o gado da raça Belgian Blue homozigótico para o gene mutante sem a atividade de miostatina tem musculatura dupla. Também foram determinadas outras mutações de bovinos que levam a musculatura dupla, sendo aqui identificadas como nt419(del7-insl0), Q204X, E226X e C313Y, respetivamente.

Num aspeto, tal como definido nas reivindicações, a presente invenção proporciona assim um método para a determinação da presença de hiperplasia muscular num mamífero. 0 método inclui a obtenção de uma amostra de material que contém ADN do mamífero e determinar se está presente uma sequência de ADN que codifica para (a) uma proteína que possui atividade biológica de miostatina, e se está presente uma sequência de ADN que codifica para (b) uma proteína alélica com ausência da atividade de (a) . A ausência de (a) e a presença de (b) indica a presença de hiperplasia muscular no mamífero.

Claro que, a mutação responsável pela falta de atividade pode ser uma mutação de ocorrência natural, tal como é o caso para as raças Belgian Blue, Asturiana, Parthenaise ou Rubia Gallega, aqui mostradas. 0 mamífero pode ser um bovino, etc.

Existem vários métodos conhecidos para determinar se uma sequência de nucleótidos particular está presente numa amostra. Um método comum é a reação em cadeia da polimerase. Um aspeto preferido da invenção inclui assim uma etapa em que a determinação de se está presente uma sequência de ADN que codifica para (a) , e se está presente uma sequência de ADN que codifica para (b) inclui a amplificação do ADN na presença de oligonucleótidos iniciadores com base numa sequência de nucleótidos que codifica para uma proteína que possui atividade biológica de miostatina.

Um oligonucleótido iniciador da presente invenção, utilizado, por exemplo em PCR, é uma molécula de ácido nucleico suficientemente complementar à sequência em que se baseia e de comprimento suficiente para hibridar seletivamente com a porção correspondente de uma molécula de ácido nucleico que se destina a ser amplificada e a iniciar a síntese da mesma sob condições in vitro normalmente utilizadas em PCR. Da mesma forma, uma sonda da presente invenção, é uma molécula, por exemplo, uma molécula de ácido nucleico de comprimento suficiente e suficientemente complementar à molécula de ácido nucleico de interesse, que se liga seletivamente, sob condições de alto ou baixo rigor, com a sequência de ácido nucleico de interesse para a deteção da mesma, na presença de moléculas de ácido nucleico que possuem sequências diferentes.

Os oligonucleótidos iniciadores podem ser baseados na sequência identificada como SEQ ID NO: 7 (sequência de ADNc humano) ou SEQ ID NO: 54. É descrito um método para determinar a presença de hiperplasia muscular num mamífero que inclui a obtenção de uma amostra de material que contém ARNm do mamífero. Este método inclui determinar se está presente uma sequência de ARNm que codifica para (A) uma proteína que possui atividade biológica de miostatina, e se está presente uma sequência de ARNm que codifica para (B) uma proteína pelo menos parcialmente codificada por uma sequência nucleotídica truncada que corresponde substancialmente à sequência do ARNm e que com ausência da atividade de (A) . A ausência de (A) e a presença de (B) indica a presença de hiperplasia muscular no mamífero. 0 ARNm que codifica para (A) e a sequência truncada podem corresponder a alelos do ADN do mamífero.

Mais uma vez, se um método de amplificação tal como a PCR é utilizado para determinar se está presente uma sequência de ARNm que codifica para (A), e se está presente uma sequência de ARNm que codifica para (B) , o método inclui a amplificação do ARNm na presença de um par de oligonucleótidos iniciadores complementares a uma sequência nucleotidica que codifica para uma proteína que possui atividade biológica de miostatina. Cada um dos referidos oligonucleótidos iniciadores pode conter uma sequência de nucleótidos substancialmente complementar, por exemplo, à sequência identificada como SEQ ID NO: 7. A sequência truncada pode conter, por exemplo pelo menos 50 nucleótidos consecutivos correspondendo substancialmente a 50 nucleótidos consecutivos da SEQ ID NO: 7.

Num outro aspeto, a invenção é um método para determinar a presença de hiperplasia muscular em mamíferos descritos, o que inclui a obtenção de uma amostra de tecido que contém ARNm do mamífero e determinar se está presente um ARNm que codifica para uma proteína de miostatina do tipo mutante sem atividade biológica da miostatina. A presença de um tal ARNm que codifica para uma proteína de miostatina do tipo mutante indica a presença de hiperplasia muscular no mamífero.

Num outro aspeto, a invenção proporciona um método para determinar a presença de hiperplasia muscular num animal bovino. O método inclui a obtenção de uma amostra de material que contém ADN do animal e determinar se está presente ADN que possui uma sequência nucleotidica que codifica para uma proteína que possui atividade biológica de miostatina. A ausência de ADN que possui uma referida sequência de nucleótidos indica a presença de hiperplasia muscular no animal. Determinar se o ADN que tem uma sequência de nucleótidos que codifica para uma proteína que possui atividade biológica de miostatina pode incluir a amplificação do ADN na presença de oligonucleótidos iniciadores com base numa sequência de nucleótidos que codifica para uma proteína que possui atividade biológica de miostatina.

Em particular, o método pode ser realizado utilizando uma amostra de um animal em que o referido animal bovino não exibe hiperplasia muscular é conhecido por ter uma sequência de nucleótidos que é capaz de hibridar com uma molécula de ácido nucleico que possui a sequência identificada como SEQ ID NO: 1 sob condições de hibridação rigorosas. É possível que determinar se está presente o ADN que tem uma sequência de nucleótidos que codifica para uma proteína que possui atividade biológica de miostatina inclui amplificar o ADN na presença de oligonucleótidos iniciadores com base numa sequência de nucleótidos que codifica para o terminal-N e o terminal-C, respetivamente, da proteína que possui atividade biológica de miostatina.

Os oligonucleótidos iniciadores, ou seja, o primeiro e o segundo oligonucleótidos iniciadores, podem basear-se em primeira e segunda sequências de nucleótidos que codificam regiões espaçadas da proteína, em que as regiões ladeiam uma mutação conhecida por ocorrer naturalmente e que, quando presente em ambos os alelos de um referido animal resulta em hiperplasia muscular.

Também pode ser que o ADN de um referido animal que não exibe hiperplasia muscular contém uma sequência de nucleótidos que híbrida sob condições rigorosas com uma sequência de nucleótidos que codifica para uma proteína que possui uma sequência identificada como SEQ ID NO: 2 e a sequência de codificação do ADN de um referido animal que exibe hiperplasia muscular é conhecida por conter uma deleção de 11 pares de bases com inicio no par de bases n.° 821 da sequência de codificação, e o referido primeiro oligonucleótido iniciador é selecionado para estar a montante do codão que codifica para o ácido glutâmico n.° 275 e o segundo oligonucleótido iniciador é selecionado para estar a jusante do codão que codifica para o ácido aspártico n.° 274.

Para além disso, um ADN de um referido animal que não exibe hiperplasia muscular pode conter uma sequência de nucleótidos que híbrida sob condições rigorosas com uma sequência de nucleótidos que codifica para uma proteína que possui uma sequência identificada como SEQ ID NO: 2. A sequência de codificação do ADN de um referido animal que exibe hiperplasia muscular pode ser conhecida por conter uma deleção de 11 pares de bases com início no par de bases n.° 821. Um oligonucleótido iniciador pode ser selecionado para abranger a sequência de nucleótidos que inclui os pares de bases n.os 820 e 821 da sequência de ADN que contém a deleção. O animal pode ser da raça Belgian Blue.

Num aspeto particular, determinar se está presente o ADN que tem uma sequência de nucleótidos que codifica para uma proteína que possui atividade biológica de miostatina inclui amplificar o ADN na presença de um oligonucleótido iniciador que contém pelo menos uma porção de uma mutação conhecida por ocorrer naturalmente e que, quando presente em ambos os alelos de um referido animal resulta em hiperplasia muscular.

Em outro aspeto, é descrito um método para determinar a presença de hiperplasia muscular num animal bovino, que inclui a obtenção de uma amostra do animal contendo o ARNm e determinar se está presente na amostra um ARNm que codifica para uma proteína que possui atividade biológica de miostatina. A ausência do referido ARNm indica a presença de hiperplasia muscular no animal.

Uma amostra que contém ARNm pode ser de tecido do músculo, particularmente, tecido do músculo esquelético.

Num aspeto particular, a invenção é um método para determinar a presença de musculatura dupla num animal bovino, o que envolve a obtenção de uma amostra de material que contém ADN do animal e verificar se o ADN contém a sequência de nucleótidos identificada como SEQ ID NO: 11, em que a ausência da sequência indica musculatura dupla no animal.

Num aspeto particular, o animal é de raça Belgian

Blue .

Num outro aspeto, a invenção é um método para a determinação do genótipo de miostatina de um mamífero, tal como pode ser desejável saber para fins de reprodução. 0 método inclui a obtenção de uma amostra de material que contém o ácido nucleico do mamífero, em que o ácido nucleico não está contaminado por ácido nucleico heterólogo; determinar se a amostra contém uma (i) molécula de ácido nucleico que codifica para uma proteína que possui atividade biológica de miostatina; e determinar se a amostra contém uma (ii) molécula de ácido nucleico alélico que codifica para uma proteína com ausência da atividade biológica de miostatina. 0 mamífero pode ser bovino. A invenção inclui um kit de diagnóstico para determinar a presença de hiperplasia muscular num mamífero a partir do qual foi obtida uma amostra que contém ADN do mamífero. 0 kit inclui um primeiro e segundo oligonucleótidos iniciadores para amplificar o ADN, sendo os oligonucleótidos iniciadores complementares às sequências de nucleótidos do ADN a montante e a jusante, respetivamente, de uma mutação na porção de ADN que codifica para a miostatina que resulta em hiperplasia muscular do mamífero, em que pelo menos uma das sequências de nucleótidos é selecionada para ser de uma região não codificante do gene da miostatina. 0 kit pode também incluir um terceiro oligonucleótido iniciador complementar a uma mutação de ocorrência natural de uma porção codificante do gene da miostatina.

Um kit de diagnóstico particular, para a determinação do genótipo de uma amostra de material genético de mamífero, em particular de material de bovino inclui um par de oligonucleótidos iniciadores para a amplificação de uma porção do material genético que corresponde a uma sequência de nucleótidos que codifica para pelo menos uma porção de uma proteína de miostatina, em que um primeiro dos oligonucleótidos iniciadores inclui uma sequência de nucleótidos suficientemente complementar a uma mutação da SEQ ID NO: 1 para iniciar a amplificação de uma molécula de ácido nucleico que contém a mutação, sendo a mutação selecionada a partir do grupo de mutações que resultam de: (a) deleção de 11 nucleótidos com início no nucleótido 821 da porção de codificação da SEQ ID NO: 1; (b) deleção de 7 nucleótidos com início no nucleótido 419 da sequência de codificação e a inserção da sequência AAGCATACAA no lugar dos mesmo; (c) deleção do nucleótido 610 da sequência de codificação e a inserção de T no lugar do mesmo; (d) deleção do nucleótido 676 da sequência de codificação e a inserção de T no lugar do mesmo; e (e) e combinações das mesmas. O segundo do par de oligonucleótidos iniciadores está preferivelmente inteiramente localizado a montante ou inteiramente a jusante da mutação ou mutações selecionadas. Em um kit, um primeiro referido oligonucleótido iniciador abrange a mutação (a) e compreende ainda um terceiro oligonucleótido iniciador que é suficientemente complementar à sequência de nucleótidos identificada como SEQ ID NO: 11 para iniciar a amplificação de um molécula de ácido nucleico que contém a SEQ ID NO: 11. Em um outro (ou no mesmo kit), um primeiro referido oligonucleótido iniciador é suficientemente complementar à sequência inserida da mutação (b) para iniciar a amplificação de uma molécula de ácido nucleico que contém a mutação (b), e que compreende ainda um terceiro oligonucleótido iniciador que é suficientemente complementar à sequência que corresponde à deleção de 7 nucleótidos da mutação (b) para iniciar a amplificação de um molécula de ácido nucleico que contém a deleção de 7 nucleótidos da mutação (b) . Em um outro (ou no mesmo kit) , um primeiro referida oligonucleótido iniciador abrange a mutação (c) e compreende ainda um terceiro oligonucleótido iniciador que é suficientemente complementar à sequência que abrange a região correspondente sem a mutação (c) para iniciar a amplificação de uma molécula de ácido nucleico sem a mutação (c) . Em um outro (ou no mesmo kit) , um primeiro referido oligonucleótido iniciador abrange a mutação (d) e compreende ainda um terceiro oligonucleótido iniciador que é suficientemente complementar à sequência que abrange a região correspondente sem a mutação (d) para iniciar a amplificação de uma molécula de ácido nucleico sem a mutação (d) . Em um outro (ou no mesmo kit) , um primeiro referido oligonucleótido iniciador abrange a mutação (e) e compreende ainda um terceiro oligonucleótido iniciador que é suficientemente complementar à sequência que abrange a região correspondente sem a mutação (e) para iniciar a amplificação de uma molécula de ácido nucleico sem a mutação (e). E descrita uma proteína purificada que possui atividade biológica de miostatina, e que possui uma sequência de aminoácidos identificada como SEQ ID NO: 2, ou uma variante conservadora substituída da mesma. É descrita uma proteína purificada de bovino que possui atividade biológica de miostatina ou uma proteína purificada de humano (SEQ ID NO: 8) que possui atividade biológica de miostatina. É descrita uma molécula de ácido nucleico isolada que codifica uma proteína que precede. É descrita uma molécula de ácido nucleico isolada que compreende uma molécula de ADN que possui a sequência de nucleótidos identificada como SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 7, ou que varia da sequência devido à degenerescência do código genético, ou uma cadeia de ácido nucleico capaz de hibridar com pelo menos uma referida molécula de ácido nucleico, sob condições de hibridação rigorosas. É divulgada uma sonda que contém uma molécula de ácido nucleico suficientemente complementar a uma sequência identificada como SEQ ID NO: 1, ou o seu complemento, de modo a ligar-se à mesma sob condições rigorosas. A sonda pode ser uma sequência que se situa entre cerca de 8 e cerca de 1195 nucleótidos de comprimento. É divulgada uma composição de oligonucleótidos iniciadores útil para a deteção da presença do ADN que codifica para a miostatina em gado. A composição pode incluir um oligonucleótido iniciador de ácido nucleico substancialmente complementar a uma sequência de ácido nucleico que codifica para um miostatina bovina. A sequência de ácido nucleico pode ser a identificada como SEQ ID NO: 1. A invenção inclui um método para a identificação de uma sequência de nucleótidos de um gene mutante que codifica para uma proteína de miostatina de um mamífero que exibe hiperplasia muscular. 0 método inclui a obtenção de uma amostra de material que contém ADN do mamífero e colocar a amostra em contacto com a sonda, utilizando uma sonda de ácido nucleico com base numa sequência de nucleótidos de um gene conhecido que codifica para a miostatina, a fim de identificar a sequência de nucleótidos do gene mutante. Numa abordagem particular, a sonda é baseada numa sequência de nucleótidos identificada como SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 7. De preferência, a sonda é de pelo menos 8 ácidos nucleicos de comprimento. A etapa de colocar a amostra em contacto com a sonda pode incluir a exposição do ADN à sonda sob condições de hibridação e compreender ainda o isolamento de moléculas de ácidos nucleicos hibridadas. 0 método pode ainda incluir a etapa de sequenciação do ADN isolado. 0 método pode incluir a etapa de isolamento e de sequenciação de um ADNc ou de um ARNm que codifica para a proteína completa de miostatina mutante. 0 método pode incluir uma etapa de isolamento e de sequenciação de uma miostatina funcional de tipo selvagem do mamífero que não exibe hiperplasia muscular. 0 método pode incluir a comparação da sequência de codificação completa da proteína de miostatina mutante completa com, se é previamente conhecida a sequência de codificação para uma miostatina funcional de tipo de selvagem de um referido mamífero, (1) a sequência conhecida, ou se é previamente desconhecida a sequência de codificação para uma miostatina funcional de tipo selvagem de um referido mamífero, com (2) a sequência determinada de acordo com a reivindicação 63 ou a reivindicação 66, para determinar a localização de qualquer mutação no gene mutante. A invenção inclui uma composição de oligonucleótidos iniciadores útil para a deteção de uma sequência de nucleótidos que codifica para uma miostatina que contém uma primeira molécula de ácido nucleico com base numa sequência de nucleótidos localizada a montante de uma mutação determinada de acordo com um método da invenção e uma segunda molécula de ácido nucleico com base numa sequência de nucleótidos situada a jusante da mutação.

Uma sonda da invenção pode incluir uma molécula de ácido nucleico com base numa sequência de nucleótidos que abrange uma determinada mutação de acordo com a invenção. É descrito um método para determinar se uma amostra de material genético de mamífero é capaz de conferir um fenótipo caracterizado por hiperplasia muscular, que compreende determinar se o material genético contém uma sequência de nucleótidos que codifica para uma proteína que possui atividade biológica de miostatina, em que a ausência da referida sequência indica a presença de hiperplasia muscular no animal.

As formas de realização adicionais da invenção são tal como descritas nas reivindicações.

Breve descrição dos desenhos

Ao descrever aspetos particulares da invenção, é feita referência aos desenhos em anexo, nos quais: A figura 1 é um resumo esquemático das informações de mapeamento genético, físico e comparativo em torno do locus mh de bovino. É mostrada uma curva lodscore de múltiplos pontos obtida para o locus mh no que diz respeito ao mapa de marcador de microssatélite. Os marcadores que não foram informativos no pedigree usado são mostrados entre parênteses; a sua posição no mapa é inferida a partir de dados de mapeamento publicados. Os marcadores e os YAC a partir dos quais eles foram isolados estão ligados por setas. É mostrado o mapa-RH da secção relevante do HSA2 humano, com a posição relativa em cR das EST utilizadas. As linhas pontilhadas conectam os microssatélites e os marcadores do tipo I com os seus respetivos YAC positivos. Os YAC que mostram produtos SINE-PCR de hibridação cruzada estão ligados pelas caixas vermelhas. A figura 2 (a) mostra electroferogramas obtidos por sequenciação em ciclo da sequência de ADNc da miostatina de um animal com musculatura dupla e de um animal convencional, que mostra a deleção nt821del(11) (SEQ ID NO: 11) no animal com musculatura dupla. Os oligonucleótidos iniciadores utilizados para amplificar o fragmento que abrange a deleção do ADN genómico são espaçados dos nucleótidos restantes. A figura 2 (b) mostra a sequência de aminoácidos de murino (linha de cima), do alelo normal de bovino (linha do meio) e do alelo nt821del (11) de bovino (linha de baixo). 0 local putativo de processamento proteolítico é colocado em caixa, enquanto que as nove cisteínas conservadas na região do terminal carboxilo estão sublinhadas. As diferenças entre o alelo normal e o nt821del (11) de bovino estão indicadas pelo sublinhado duplo. A figura 3 é uma representação esquemática do gene da miostatina bovina com a posição e a definição dos polimorfismos de sequências de ADN identificados. As caixas "A" (sem enchimento) correspondem às sequências líder não traduzidas e sequências de reboque (diâmetro grande), e às sequências intrónicas (diâmetro pequeno), respetivamente. As caixas "B", "C" e "D" correspondem às sequências que codificam para o péptido líder, o péptido associado a latência do terminal-N e o domínio do terminal carboxilo bioativo da proteína, respetivamente. As setas pequenas "e", "f" e "g" apontam para as posições dos oligonucleótidos iniciadores utilizados para a amplificação do intrão, amplificação e sequenciação do exão e sequenciação do exão, respetivamente; as sequências do oligonucleótido iniciador correspondente são referidas na tabela 1. As posições dos polimorfismos da sequência de ADN identificados são indicadas como linhas "h", "i" ou "j" no gene da miostatina para mutações silenciosas, conservadoras e perturbadoras, respetivamente. Cada mutação é ligada através de uma seta com uma caixa relatando os detalhes da sequência de ADN correspondente e eventualmente da sequência do péptido codificado. Em cada caixa, a sequência variante é comparada com a sequência do controlo Holstein-Friesian e as diferenças estão representadas a cores. A figura 4 mostra a distribuição das mutações identificadas nas várias raças examinadas. A ordem das mutações de miostatina correspondem à figura 3. Todos os animais analisados tinham musculatura dupla, exceto para os dois Holstein-Friesian e dois Jerseys utilizados como controlos (coluna 1).

Descrição detalhada das formas de realização preferidas 0 método usado para o isolamento dos genes que provocam fenótipos específicos é conhecido como clonagem posicionai de candidato. Envolve: (i) a localização cromossómica do gene que provoca o fenótipo específico utilizando marcadores genéticos numa análise de ligação; e (ii) a identificação do gene que provoca o fenótipo específico entre os genes "candidatos" que se sabem estar localizados na região correspondente. Na maioria das vezes estes genes candidatos são selecionados a partir de informação de mapeamento disponível em seres humanos e ratinhos.

As ferramentas necessárias para fazer a localização inicial (etapa (i) acima) são mapas de marcadores microssatélites, que estão disponíveis para as espécies de gado e são encontrados no domínio público (Bishop et al., 1994; Barendse et al., 1994; Georges et al., 1995; e Kappes, 1997) . As ferramentas necessárias para a clonagem posicionai de candidato, particularmente as bibliotecas de YAC, (etapa (ii) acima) estão parcialmente disponíveis no domínio público. As bibliotecas genómicas com grandes inserções construídas com cromossomas artificiais de levedura ("YAC") estão disponíveis no domínio público para a maioria das espécies de gado, incluindo bovinos. Ao cruzar o mapa de humano e de ratinhos, é necessário identificar o candidato posicionai, que está disponível em baixa resolução, mas precisa ser refinado em cada momento específico para obter o nível adequado de alta resolução. São aqui descritos um certo número de estratégias originais para alcançar este último objetivo. Para princípios gerais de clonagem posicionai de candidato, veja-se Collins, 1995 e Georges e Andersson, 1996. A fim de permitir a referência cruzada entre o mapa genético de bovinos e humano como parte da abordagem de clonagem posicionai de candidato, HSA2q31-32 (mapa do braço longo do cromossoma humano 2, bandas citogenéticas q31-32) e BTA2ql2-22 (mapa do braço do cromossoma bovino 2, bandas citogenéticas ql2-22) foram integrados na base de YAC de coincidência bovina, tal como descrito em seguida.

Usando uma população experimental descrita anteriormente de retrocruzamento de [ (normal x musculatura dupla) x musculatura dupla] que compreende 108 indivíduos de retrocruzamento, o locus mh foi recentemente mapeado por análise de ligação à ponta centromérica do cromossoma bovino 2 (BTA2), a 3,1 centiMorgan proximal a partir do último marcador no mapa de ligação: TGLA44 (Charlier et ai., 1995) . Foi também conhecido a partir de trabalho anterior que o colagénio pro-OC(III) (Col3AI) estava localizado na mesma região cromossómica que o locus mh. Col3AI foi mapeado para BTA2ql2-22 por hibridação in situ (Solinas-Toldo et al. , 1995), enquanto que um marcador RFLP Col3AI foi mostrado estar intimamente ligado a TGLA44 (Θ = 2 %) (Fisher et al., 1996) . Isto identifica a região que flanqueia Col3AI no mapa humano, ou seja, HSA2q31-32, como o segmento de cromossoma humano ortólogo provável. Esta hipótese é compatível com dados de experiências Zoo-FISH (Solinas-Toldo et al., 1995), bem como com dados de mapeamento de marcadores do tipo I em híbridos de células somáticas (O'Brien et al., 1993), que estabelecem uma correspondência evolutiva entre segmentos de HSA2q e BTA2. A fim de refinar a correspondência entre os mapas de HSA2q31-33 e BTA2ql2-22, foram desenvolvidas sequências marcadas, ancoradas, comparativas ou CATS, ou seja, pares de oligonucleótidos iniciadores que iriam amplificar um local de sequência marcada ou STS do gene ortólogo em diferentes espécies (Lyons et ai., 1996), para uma série de genes que flanqueiam Col3Al no mapa humano e para os quais estava disponível informação sobre a sequência em mais de um mamífero. Para além de Col3AI, foram obtidas CATS de trabalho para o colagénio CC2 (V) {Col5A2) , fosfatase inositol polifosfato-1 (INPP1), precursor do inibidor da via do fator de tecido (TFPI), titina (TTN) , n-chimaerin (CHN) , glutamato descarboxilase 67 (GAD1), proteína 4 associada a linfócitos T citotóxicos (CTLA4) e glicoproteína CD28 de membrana de células T (CD28) . As sequências de oligonucleótidos iniciadores correspondentes são apresentadas na tabela 1.

Estas CATS foram usadas para rastrear uma biblioteca de YAC bovina equivalente a genoma-6 por PCR, utilizando uma estratégia de agrupamento tridimensional tal como descrita por Libert et al., 1993. A mesma biblioteca de YAC foi também rastreada com todos os marcadores microssatélites disponíveis para BTA2 proximal, ou seja, TGLA44, BM81124, BM3627, ILSTS026, INRA40 e TGLA431 (Kappes et al., 1997).

A potencial sobreposição entre os YAC obtidos com este painel de STS foi explorada com base no teor de STS comum, bem como pela hibridação cruzada entre o produto SINE-PCR de YAC individuais. A partir desta análise, emergiram três YAC independentes contíguos na região de interesse: (i) A contíguo que contém os microssatélites TGLA44, BM81124 e marcador INPP1 do tipo I; (ii) B contíguo que contém Col3AI e Col5A2; e (iii) C contíguo que contém os marcadores microssatélite BM3627, ILSTS026 e INRA40, e o marcador TFPI do tipo I.

Nenhum dos microssatélites disponíveis mapeou para B contíguo, por conseguinte, este conjunto de YAC não poderia ser posicionado em bovinos em relação aos outros dois contíguos. No entanto, informações de mapeamento disponíveis em humano permitiram a previsão da posição do B contíguo entre o A e o C contíguos. Para testar esta hipótese, foram isolados dois novos marcadores microssatélites a partir do B contíguo, BULGE20 e BULGE28. BULGE20 provou ser polimórfico, permitindo a genotipagem da população experimental de retrocruzamento.

Para além disso, para aumentar a capacidade informativa dos marcadores disponíveis para o A contíguo, foram desenvolvidos dois novos marcadores microssatélites a partir deste contíguo: BULGE23 e BULGE27. BULGE23 provou ser polimórfico e foi usado para marcar o material do mesmo pedigree.

Todos os genótipos resultantes foram utilizados para construir um mapa de ligação utilizando o programa ILINK (Lathrop e Lalouel, 1984). Foi obtida a seguinte ordem mais provável e taxas de recombinação média de sexo entre marcadores adjacentes: [TGLA44 - (0 %) - BULG23] - (6,1 %) - BULG20 - (1,6 %) - ILSTS02 6 - (2,3 %) - INRA40 - (7,1 %) - TGLA431. A posição de BULGE20 entre TGLA44 e ILSTS026 confirmou a ordem antecipada dos três contíguos. A figura 1 resume a informação de mapeamento resultante.

Foi realizada uma análise de ligação de múltiplos pontos usando LINKMAP, para posicionar o locus mh no que diz respeito ao novo mapa do marcador. A análise de ligação foi realizada sob um modelo recessivo simples, assumindo penetrância completa para indivíduos mh/mh e penetrância zero para os outros dois genótipos. A curva de pontuação LOD mostrada na figura 1 foi obtida colocando o locus mh no intervalo TGLA44-BULGE20 com uma pontuação LOD máxima associada de 26,4. Três indivíduos de retrocruzamento foram mostrados recombinar com BULGE20 e marcadores distais, mas não com TGLA44 e BULGE23, colocando portanto o locus mh proximal deste marcador. Um indivíduo mostrou recombinar com TGLA44 e BULGE23, mas não com os marcadores mais distais, posicionando portanto o locus mh distal de TGLA44 e BULGE23. Dada a posição relativa destes marcadores microssatélites em relação a INPP1 e Col3AI tal como deduzida a partir da integração do mapa humano e bovino, estes resultados indicaram que o gene mh está provavelmente localizado num segmento de cromossoma delimitado por INPP1 e Col3AI.

Recentemente, McPherron et al. (1997) demonstraram que os ratinhos homozigóticos para uma deleção de knockout de GDF-8 ou miostatina, foram caracterizados por um aumento generalizado da massa muscular esquelética. Usando a sequência de 2676 pb de ADNc de miostatina de murino publicada (número de acesso GenBank U84005), foi identificado um conjunto de consenso humano experimental

(THC) na base de dados Unigene que representou três clones de ADNc (221299, 300367, 308202) e seis sequências EST (marcador de sequência expressa) (H92027, H92028, N80248, N95327, W07375, W24782) . O THC correspondente abrangia 1296 pb do gene da miostatina humana, mostrando uma homologia de 78,1 % com a sequência de murino, quando feita uma média ao longo de toda a sequência, e 91,1 % quando se considera apenas as partes traduzidas dos genes de humano e murino (566 pb) . Este THC, por conseguinte, corresponde muito provavelmente ao ortólogo humano do gene da miostatina de murino. Foram então preparados os oligonucleótidos iniciadores (5'-GGCCCAACTATGGATATATTTG-3' (SEQ ID NO: 9) e 5 ' -GGTCCTGGGAAGGTTACAGCA-3 ' (SEQ ID NO: 10)) para amplificar um fragmento de 272 pb do segundo exão da miostatina humana e foram usados para genotipar o genoma inteiro do painel híbrido de radiação GeneBridge-4 (Walter et al., 1994). O programa RHMapper (Slonim et al., não publicado) foi usado para posicionar o gene da miostatina no que diz respeito ao mapa híbrido de radiação da estrutura Whitehead / MIT, colocando-o na posição 948.7 cR do mapa HSA2 com um lodscore associado > 3. Um exame mais detalhado do vetor de segregação da miostatina e a sua confrontação com os vetores de todos os marcadores localizados nessa região (Data Release 11.9, maio de 1997) mostraram-no como sendo idêntico ao EST SGC38239 colocado no mapa híbrido de radiação Whitehead / MIT (Hudson et al. , 1995) na posição 946.8 cR HSA2. Isto coloca o gene da miostatina humana no mapa RH no intervalo entre Col3AI (EST WI16343 - 942.5 cR) e INPP1 (EST L08488 - 950.2 a 951.2 cR) (Figura 1). A miostatina, por conseguinte, apareceu como um candidato posicionai muito forte para o gene mh.

Para testar o potencial envolvimento da miostatina no determinismo da musculatura dupla em bovinos, foram concebidos pares de oligonucleótidos iniciadores com base na sequência disponível da miostatina de ratinho e humana, com o objetivo de amplificar toda a sequência de codificação do ADNc de bovinos por meio de PCR (reação em cadeia da polimerase). Sempre que possível, os oligonucleótidos iniciadores foram, portanto, posicionados em porções da sequência da miostatina que mostra 100 % de homologia entre ratinho e humano. Foram identificados dois pares de oligonucleótidos iniciadores que amplificaram o que foi previsto para representar 98,4 % da sequência de codificação de bovino mais 74 pb da sequência 3' não traduzida, em dois fragmentos de ADN que se sobrepõem, respetivamente de 660 (oligonucleótidos iniciadores GDF8.19 - GDF8.12) e 724 pb (oligonucleótidos iniciadores GDF8.11 - GDF8.21) de comprimento. Os produtos de ADN esperados foram amplificados com sucesso a partir do ADNc gerado a partir de músculo esquelético tanto de um animal normal (homozigót ico +/ + ) (SEQ ID NO: 1) como de um com musculatura dupla (homozigótico mh/mh) (SEQ ID NO: 3), e foram sequenciados em ciclo em ambas as cadeias. A sequência de nucleótidos correspondente ao alelo normal apresentou 88, 9 % de identidade com a sequência da miostatina de ratinho (SEQ ID NO: 5) ao longo de uma sobreposição de 1067 pb, e continha o quadro de leitura aberta esperado que codifica para uma proteína (SEQ ID NO: 2) que mostra 92,9 % de identidade numa sobreposição de 354 aminoácidos com a miostatina de ratinho (SEQ ID NO: 6) . Tal como esperado para um membro da superfamília de TGFB, o gene da miostatina de bovino é caracterizado por um local de processamento proteolítico pensado mediar a clivagem do domínio do terminal carboxilo bioativo a partir do fragmento mais longo do terminal-N, e por nove resíduos de cisteína separados por um espaçamento característico e que se suspeita estarem envolvidos em pontes dissulfureto intra e intermoleculares (McPherron e Lee, 1996). A sequência de nucleótidos obtida do alelo mh era idêntica ao alelo normal ao longo de todo o seu comprimento, exceto por uma deleção de 11 pb envolvendo os nucleótidos 821 a 831 (contando a partir do codão de iniciação) . Esta deleção que desloca o quadro, que ocorre após o primeiro resíduo de cisteína do domínio do terminal carboxilo, interrompe drasticamente a sequência de aminoácidos a jusante e revela um codão de paragem prematuro, depois de 13 aminoácidos, veja-se a figura 2. A sequência de aminoácidos codificada pela sequência de ácido nucleico mutante é identificada como SEQ ID NO: 4.

Esta mutação perturba a parte bioativa da molécula e, portanto, é muito provável que seja a causa do fenótipo de musculatura dupla recessivo. Seguindo a nomenclatura convencional, esta mutação vai ser referida como nt829 (delll).

Para fortalecer ainda mais a assunção da causalidade desta mutação, foram preparados pares de oligonucleótidos iniciadores flanqueando a deleção (figura 2) , e foi amplificado o segmento de ADN correspondente de todos os animais da população experimental de retrocruzamento. A PCR foi realizada na presença de dCTP de forma a marcar radioativamente o produto de amplificação. Os produtos de amplificação foram separados em géis de poliacrilamida desnaturalizante e foram detetados por autorradiografia. Seria esperado um produto de 188 pb que para o alelo normal e um produto de 177 pb para o alelo nt821 (delll). A correlação entre o fenótipo e o genótipo foi acompanhada por todo o pedigree. Todos os dez touros BBCB com musculatura dupla foram encontrados ser homozigóticos para a mutação nt821 (delll), todas as 41 fêmeas F1 foram encontradas ser heterozigóticas, enquanto que 53 descendência com musculatura dupla foram encontrados ser homozigóticos para a mutação, sendo os restantes 55 animais convencionais heterozigóticos.

Para examinar a distribuição da mutação nt821 (delll) em diferentes raças convencionais e com musculatura dupla, uma coorte de 25 indivíduos normais foi genotipada representando duas raças leiteiras (Holstein-Friesian, Red-and-White) e uma coorte de 52 animais com musculatura dupla representando quatro raças (BBCB, Asturiana, Maine-Anjou e Piémontese). Os resultados encontram-se resumidos na tabela 2. Todos as raças leiteiras eram homozigóticas normais exceto para um touro Red-and-White mostrado ser heterozigótico. A ocorrência de uma pequena fração de indivíduos portadores da mutação no gado leiteiro não é inesperada, uma vez que o fenótipo é ocasionalmente descrito nesta raça. Em BBCB e Asturiana, todos os animais com musculatura dupla eram homozigóticos para a deleção nt821(delll), apontando para a homogeneidade alélica nestas duas raças. Os animais Maine-Anjou e Piémontese com musculatura dupla eram homozigóticos "normais", ou seja, não mostraram a deleção nt821 (delll), mas foi descoberta uma substituição distinta de cisteína para tirosina (C313Y) em animais Piedmontese com musculatura dupla identificada por outros (Kambadur et al., 1997) .

Foi também determinada toda a sequência de codificação para o gene da miostatina em indivíduos com musculatura dupla de dez raças de gado europeias e foram identificadas uma série de mutações que perturbam a função da miostatina. A sequência de codificação de quatro indivíduos controlo Holstein-Friesian e Jersey era idêntica ao alelo de tipo selvagem descrito anteriormente (Grobet et al. , 1997), indicando ainda mais que foi a verdadeira sequência codificante da miostatina a ser amplificada, e não um pseudogene não-funcional.

Entre os 32 animais com musculatura dupla, foram encontradas sete variantes da sequência de ADN dentro da região de codificação, tal como resumido na figura 3.

Para além da mutação nt821 (delll) no terceiro exão, descrita acima, foram encontradas quatro novas mutações que seriam esperadas perturbar a função da miostatina. Uma inserção / deleção na posição 419 a contar a partir do codão de iniciação, substituindo 7 pares de bases com um conjunto aparentemente não relacionado de 10 pares de bases, revela um codão de paragem prematuro no péptido associado à latência no terminal-N na posição do aminoácido 140. Esta mutação é referida como nt419 (del7-inslO). As substituições de dois pares de bases no segundo exão, uma transição de C -> T na posição nucleotídica 610 e uma transversão de G -> T na posição nucleotídica 676, produzem cada uma um codão de paragem prematuro no mesmo péptido associado à latência do terminal-N nas posições dos aminoácidos 204 e 226, respetivamente. Estas mutações são chamadas Q204X e E226X, respetivamente. Finalmente, uma transição de G -> A na posição nucleotídica 938 resulta na substituição de uma cisteína por uma tirosina. Esta mutação é referida como C313Y. Esta cisteína é o quinto de nove resíduos de cisteína altamente conservados típicos dos membros da superfamília TGF-β e partilhados em particular por TGF-βΙ, -β2 e -β3, e inibina-βΑ e -βΒ (McPherron e Lee, 1996). Pensa-se estar envolvida numa ponte dissulfureto intramolecular que estabiliza a conformação tridimensional do péptido do terminal carboxilo bioativo. A sua substituição é, por conseguinte, capaz de afetar a estrutura e a função da proteína. Esta C313Y foi também recentemente descrita por Kambadur et al. (1997).

Foi também encontrada uma substituição conservadora de fenilalanina para leucina na posição do aminoácido 94 no primeiro exão, devida a uma transversão de C -> A na posição nucleotídica 282 do gene da miostatina. Dada a natureza conservadora da substituição do aminoácido, a sua localização no péptido associado à latência do terminal-N menos conservado, e como esta mutação foi observada na condição homozigótica em animais que não apresentavam qualquer sinal de desenvolvimento muscular excecional, esta mutação provavelmente não interfere drasticamente com a função miostática da proteína codificada, se interferir de algum modo. Esta mutação é referida como F94L. A proteína de murino é caracterizada por uma tirosina na posição de aminoácido correspondente.

Também foi identificada uma transição C -> T silenciosa na terceira posição do codão citosina 138 no segundo exão, referida como nt414 (C-T).

Para além destes polimorfismos da sequência do ADN detetados na região de codificação do gene da miostatina, também foram encontradas quatro variantes da sequência de ADN em sequências intrónicas, que são provavelmente polimorfismos neutros e aos quais foram atribuídos os seguintes símbolos: nt374-51 (T-C), nt374-50 (G-A), nt374- 16 (dell) no intrão 1, e nt748-78 (dell) no intrão 2 (figura 3) . A figura 4 mostra a distribuição de mutações observadas na amostra analisada classificadas por raça.

Para a maioria das raças estudadas, os animais analisados com musculatura dupla eram homozigóticos para uma das cinco mutações descritas esperadas perturbar a função de miostatina ou heterozigóticos compostos para duas destas mutações. Isto é compatível com a hipótese de que a condição de musculatura dupla tem um modo de herança recessivo em todas estas raças. Só em Limousin e Blonde d'Aquitaine não houve nenhuma evidência clara para o papel da miostatina em mutações de perda de função no determinismo da hipertrofia muscular observada. A maioria dos animais Limousin eram homozigóticos para a substituição conservadora F94L que não é provável que cause a hipertrofia muscular que caracteriza estes animais, tal como discutido anteriormente. Um animal Limousin provou ser heterozigótico para esta mutação, sendo o outro alelo do "tipo selvagem". Todos os animais Blonde d'Aquitaine eram homozigóticos do "tipo selvagem". Estes dados indicam que ou o gene da miostatina não está possivelmente envolvido na condição de musculatura dupla que caracteriza estas duas raças, ou que existem mutações adicionais de miostatina fora da região de codificação. A condição de musculatura dupla é muitas vezes considerada ser menos pronunciada em animais Limousin em comparação com outras raças.

Os dados indicam que algumas mutações, tal como nt821del (11) e C313Y, são partilhadas por várias raças o que aponta para a migração de genes entre as populações correspondentes, enquanto outras parecem estar confinadas a raças específicas. Para além disso, enquanto algumas raças (a raça Belgian Blue, em particular) parecem ser essencialmente geneticamente homogéneas, outras mostram evidências claras de heterogeneidade de alelos (por exemplo, Maine-Anjou). A observação de heterogeneidade alélica contradiz a visão clássica de que uma mutação única mh se espalhou pelo continente europeu no inicio do século 19, com a divulgação da raça Shorthorn das Ilhas Britânicas (Ménissier, 1982) . Pelo menos duas das mutações são partilhadas por mais do que uma raça, indicando algum grau de migração de genes, mas definitivamente não de uma única origem.

Em ratinhos, e para além do ratinho knock-out da miostatina gerado in vitro (McPherron e Lee, 1997), a mutação compact pode ser devida a uma mutação que ocorre naturalmente no gene da miostatina. 0 locus compact foi mapeado para o intervalo DlMit375-DlMit21 no cromossoma 1 do ratinho, conhecido por ser ortólogo a HSA2q31-32 e BTA2ql2-22 (Varga et al. , 1997) .

De um ponto de vista aplicado, a caracterização de um painel de mutações no gene da miostatina associado a musculatura dupla contribui para o estabelecimento de um sistema de triagem de diagnóstico que permite a seleção assistida por marcadores a favor ou contra esta condição no gado.

Exemplo 1

Mapeamento físico e genético A integração dos mapas HSA2q31-32 e BTA2ql2-22 foi feita usando YAC coincidentes e o locus mh foi posicionado no intervalo flanqueado por Col3AI e INPP1 tal como se segue. 0 mapeamento genético foi realizado utilizando uma população experimental de retrocruzamento (Holstein-Friesian x Belgian Blue) x Belgian Blue descrita anteriormente, que conta com 108 indivíduos informativos (Charlier et al. , 1995) . A genotipagem por microssatélites foi realizada de acordo com procedimentos padrão (Georges et al., 1995), usando as sequências de oligonucleótidos

iniciadores apresentadas na tabela 1. As análises de ligação foram realizadas com os programas MLINK, ILINK e LINKMAP dos pacotes LINKAGE (versão 5.1) e FASTLINK (versão 2.3P, junho de 1995) (Lathrop & Lalouel, 1984; Cottingham et al. , 1993) . A biblioteca YAC foi rastreada por PCR usando um esquema de mistura tridimensional tal como descrito em Libert et al., 1993. Os pares de oligonucleótidos iniciadores que correspondem aos CATS utilizados para rastrear a biblioteca são referidos na tabela 1. A hibridação cruzada entre os produtos SINE-PCR dos YAC individuais foi realizada de acordo com Hunter et al. (1996), utilizando os oligonucleótidos iniciadores relatados em Lenstra et al. (1993) . Os microssatélites foram isolados a partir dos YAC de acordo com Cornells et al. (1992) .

Exemplo 2

Mapeamento do gene da miostatina humana em Genebridge-4-panel 0 ADN do Genebridge-4-panel (Walter et al., 1994) foi adquirido a Research Genetics (Huntsville, Alabama), e foi genotipado por PCR usando procedimentos padrão e o seguinte par de oligonucleótidos iniciadores da miostatina humana (5'-GGCCCAACTATGGATATATTTG-3' e 5'- GGTCCTGGGAAGGTTACAGCA-3'). 0 mapeamento foi realizado através do servidor de Internet do Whitehead Institute / MIT Center for Genome Research utilizando o seu programa RH-mapper (Slonim, D.; Stein, L.; Kruglyak, L.; Lander, E., não publicado), para posicionar os marcadores com respeito ao mapa da estrutura. Os vetores de segregação dos marcadores de consulta foram comparados com os vetores de todos os marcadores na região de interesse nos Data Release 11.9 completos (maio de 1997) para se obter uma posição mais precisa. Isto posiciona a miostatina em INPPl-Col3AI no mapa humano com pontuação LOD superior a 3.

Exemplo 3 RT—PCR

Para clonar o ortólogo da miostatina bovina foi escolhida uma estratégia baseada na amplificação por RT-PCR a partir de ADNc do músculo esquelético. Foi extraído ARN total do músculo esquelético (Triceps brachialis) de acordo com Chirgwin et ai. (1979) . A RT-PCR foi realizada utilizando o kit Gene-Amp RNA PCR (Perkin-Elmer) e os oligonucleótidos iniciadores são apresentados na tabela 1. Os produtos de PCR foram purificados utilizando o kit QiaQuick PCR Purification (Qiagen) e foram sequenciados utilizando Dye terminator Cycle Sequencing Ready Reaction (Perkin-Elmer) e um sequenciador automático ABI373, utilizando os oligonucleótidos iniciadores apresentados na tabela 2 .

Exemplo 4

Diagnóstico da deleção nt821(delll)

Para o diagnóstico de nt821(delll) foram concebidas as seguintes sequências de oligonucleótidos iniciadores que flanqueia a deleção nt821 (delll): 5'- TCTAGGAGAGATTTTGGGCTT-3' (SEQ ID NO: 53) e 5- GATGGGTATGAGGATACTTTTGC-3' (SEQ ID NO: 52). Estes oligonucleótidos iniciadores amplificam um fragmento de 188 pb de indivíduos normais e um fragmento de 177 pb de indivíduos com musculatura dupla. Os indivíduos heterozigóticos mostram os dois produtos de amplificação. Estes produtos de amplificação podem ser detetados utilizando uma variedade de métodos. Neste exemplo, o produto de PCR foi marcado por incorporação de dCTP32, foi separado num gel de acrilamida desnaturante e foi revelado por autoradiografia. Outras abordagens que podem ser utilizadas para distinguir os três genótipos diferentes são conhecidas dos peritos na tecnologia e incluem a separação em géis de agarose e a visualização com brometo de etídio, a sequenciação direta, os ensaios de TaqMan, a hibridação com oligonucleótidos específicos de alelos, o dot-blot inverso, a análise RFLP e vários outros. A especificidade dos testes está ligada à mutação detetada e não aos oligonucleótidos iniciadores utilizados no método de deteção. Isso significa que podem ser facilmente concebidos outros oligonucleótidos iniciadores com base na referida sequência de miostatina bovina que cumpririam os mesmos requisitos.

Exemplo 5

Determinação de mutações em outras raças

Foram amostrados um total de 32 animais com desenvolvimento muscular extremo de dez raças europeias de bovinos em que são conhecidas ocorrer animais com musculatura dupla a frequência alta a moderada: (i) Bélgica: Belgian Blue (4), (ii) França: Blonde d'Aquitaine (5), Charolais (2), Gasconne (2), Limousin (5), Maine-Anjou (4), Parthenaise (3), (ii) Espanha: Asturiana (2),

Rubia Gallega (2), (iv) Itália: Piedmontese (2). A determinação do fenótipo de musculatura dupla dos animais amostrados foi realizada visualmente por observadores experientes. Foram analisados como controlos quatro animais com fenótipo convencional, provenientes de leiteiras de Holstein-Friesian (2) e Jersey (2). A fim de facilitar o estudo da sequência de codificação da miostatina a partir de ADN genómico, foram determinadas as sequências das fronteiras exão - intrão do gene bovino. Em ratinhos, o gene da miostatina é conhecido por ser interrompido por dois intrões, respetivamente «1,5 e 2,4 kb de comprimento (McPherron & Lee, 1997) . Foram então concebidos dois pares de oligonucleótidos iniciadores, respetivamente, nos exões 1 e 2 de bovino, e nos exões 2 e 3, que foram previstos flanquear os dois intrões, assumindo a conservação da organização de genes entre o ratinho e o bovino (figura 3 e tabela 3). Utilizando estes conjuntos de oligonucleótidos iniciadores foram gerados dois produtos de PCR, respetivamente, 2 Kb e 3,5 kb de comprimento a partir de um clone YAC (179A3) contendo o gene da miostatina bovina (Grobet et al., 1997) . Os produtos de PCR foram purificados utilizando o kit de QiaQuick PCR Purification (Qiagen) e foram parcialmente sequenciados usando Dye terminator Cycle Sequencing Ready Reaction (Perkin-Elmer) e urn sequenciador automático ABI373. 0 alinhamento com a sequência de ADNc de bovino identificou os quatro limites previstos exão -intrão. A sequência de nucleótidos que corresponde ao ADN genómico de bovino é identificada como SEQ ID NO: 54.

Com base nas sequências exónicas e intrónicas disponíveis do gene da miostatina bovina, foram concebidos três pares de oligonucleótidos iniciadores que permitem em conjunto a amplificação conveniente de toda a sequência de codificação do ADN genómico. A posição dos oligonucleótidos iniciadores correspondentes é mostrada na figura 3, e as sequências correspondentes são apresentadas na tabela 3.

Após a amplificação por PCR de toda a sequência de codificação do ADN genómico nos três fragmentos descritos, estes foram purificados utilizando o kit QiaQuick PCR

Purification (Qiagen) e foram sequenciados utilizando Dye terminator Cycle Sequencing Ready Reaction (Perkin-Elmer) e um sequenciador automático ABI373, utilizando-se os oligonucleótidos iniciadores utilizados para a amplificação, bem como uma série de oligonucleótidos iniciadores agrupados (figura 3 e tabela 3) . Os ficheiros chromat produzidos com o sequenciador ABI373 foram analisados com a aplicação Polyphred (D. Nickerson, comunicação pessoal), que faz parte de uma série de programas de análise de sequências, incluindo Phred (Ewing, B. & Green, P. (1992), não publicado), Phrap (Green, P. (1994), não publicado) e Consed (Gordon, D. (1995), não publicado), mas qualquer programa de sequenciação adequado seria suficiente, tal como é conhecido por uma pessoa perita na tecnologia.

Os anticorpos monoclonais (Mab) específicos para a miostatina podem ser úteis. No caso da proteína bovina que possui a sequência de aminoácidos identificada como SEQ ID NO: 2, por exemplo, os anticorpos podem ser utilizados para fins de diagnóstico, tais como para determinar os níveis da proteína de miostatina no tecido muscular. Para produzir estes anticorpos, é preparada miostatina purificada. A miostatina pode ser produzida em células bacterianas como uma proteína de fusão com a glutationa-S-transferase utilizando o vetor pGEX2 (Pharmacia). Isto permite a purificação da proteína de fusão por cromatografia de afinidade GSH. Numa outra abordagem, a miostatina é expressa como uma proteína de fusão com o domínio de ligação da maltose bacteriana. A proteína de fusão é então recuperada a partir de extratos bacterianos, passando o extrato sobre uma coluna de resina de amilose, seguido por eluição da proteína de fusão com a maltose. Para esta construção de fusão, pode ser utilizado o vetor pMalC2, disponível comercialmente a partir de New England Biolabs. A preparação de uma segunda proteína de fusão pode ser útil no rastreio preliminar de Mab. A produção de hibridomas que expressam anticorpos monoclonais que reconhecem a proteína de miostatina é levada a cabo tal como se segue: os ratinhos BALB/c são injetados por via intraperitoneal com a proteína / adjuvante três vezes, em intervalos de um mês, seguido de um injeção final na veia da cauda imediatamente antes da fusão celular. As células do baço são recolhidas e são fusionadas com células de mieloma NS-1 (American Type Culture Collection, Rockville, MD) usando polietileno glicol 4000 de acordo com protocolos padrão (Kennett, 1979; Mirski, 1989) . O processo de fusão celular é realizado tal como descrito em mais detalhe em seguida.

As células fusionadas são plaqueadas em placas de 96 poços com células de exsudado peritoneal e células de baço irradiadas a partir de ratinhos BALB/Cc como camadas alimentadoras e é realizada a seleção com hipoxantina, aminopterina e timidina (meio HAT). É utilizado como um procedimento de rastreio inicial um ensaio de ELISA. São usadas 1 - 10 yg de miostatina purificada (clivada a partir da proteína de fusão) em PBS para revestir poços individuais, e são incubados 50 - 100 μΐ por poço de sobrenadantes de hibridoma. São utilizados para o ensaio colorimétrico anticorpos antirrato conjugados com peroxidase de rábano.

Os hibridomas positivos são clonados por diluição limitante e crescidos em grande escala para congelação e produção de anticorpos. São selecionados vários hibridomas positivos para serem úteis em western blotting e imuno-histoquímica, bem como para a reatividade cruzada com proteínas de miostatina a partir de espécies diferentes, por exemplo, as proteínas do ratinho e de humano.

Em alternativa, pode ser levada a cabo a imunização ativa através da geração de um anticorpo endógeno, através de exposição direta do animal hospedeiro a pequenas quantidades de antigénio. A imunização ativa envolve a injeção de pequenas quantidades do antigénio (g), que provavelmente não induzirá uma resposta fisiológica e será rapidamente degradado. 0 antigénio só precisa de ser administrado como imunizações de estimulo e de reforço em muito da mesma maneira como as técnicas utilizadas para conferir resistência a doenças (Pell et al., 1997) .

Deve evidentemente ser entendido, que é possível uma variedade de substituições de aminoácidos, preservando ao mesmo tempo a estrutura responsável pela atividade da miostatina das proteínas aqui divulgadas. As substituições conservativas são descritas na literatura de patentes, tal como, por exemplo, na patente dos Estados Unidos n.° 5 264 558 ou 5 487 983. É deste modo esperado, por exemplo, que seja possível o intercâmbio entre aminoácidos neutros, alifáticos, não polares, glicina, alanina, prolina, valina e isoleucina. De igual modo, poderiam ser feitas substituições entre os aminoácidos neutros, alifáticos, polares, serina, treonina, metionina, asparagina e glutamina. Poderiam provavelmente ser feitas substituições entre os aminoácidos acídicos, carregados, ácido aspártico e ácido glutâmico, bem como substituições entre os aminoácidos básicos, carregados, lisina e arginina. Também seriam provavelmente possíveis as substituições entre os aminoácidos aromáticos incluindo a fenilalanina, a histidina, o triptofano e a tirosina. Estes tipos de substituições e intercâmbios são bem conhecidos pelos peritos na tecnologia. Poderiam ser perfeitamente possíveis outras substituições. É claro que também seria de esperar que quanto maior for a percentagem de homologia, isto é, a semelhança da sequência, de uma proteína variante com uma proteína que ocorre naturalmente, maior a retenção da atividade metabólica. Claro que, como as variantes da proteína que têm a atividade de miostatina tal como se descreve aqui destinam-se a estar dentro do âmbito da presente invenção, também o estão os ácidos nucleicos que codificam para tais variantes.

Pode ser obtida uma vantagem adicional por meio de formas quiméricas da proteína, tal como é conhecido na tecnologia. Uma sequência de ADN que codifica para toda a proteína, ou para uma porção da proteína, pode, assim, ser ligada, por exemplo, com uma sequência que codifica para a porção do terminal-C da β-galactosidase de E. coli para produzir uma proteína de fusão. Um sistema de expressão de glicoproteínas F e G do vírus sincicial respiratório humano é descrito, por exemplo, na patente dos Estados Unidos n.° 5 288 630 emitida em 22 de fevereiro de 1994.

Um vetor de expressão recombinante pode ser um plasmídeo, tal como descrito anteriormente. O vetor de expressão recombinante da invenção também pode ser um vírus, ou uma porção do mesmo, o que permite a expressão de um ácido nucleico introduzido no ácido nucleico virai. Por exemplo, podem ser utilizados retrovirus, adenovirus e vírus adenoassociados defeituosos na replicação. É descrito um kit de diagnóstico para a identificação de células que compreende uma molécula que se liga a uma proteína que compreende uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 2, por exemplo, para incubação com uma amostra de células de tumor; meios para a deteção da molécula ligada à proteína, à proteína que não reagiu ou a molécula não ligada; meios para determinar a quantidade de proteína na amostra; e meios para comparar a quantidade de proteína presente na amostra com um padrão. A molécula pode ser um anticorpo monoclonal. A deteção da molécula que se liga à miostatina pode ser ativada pela referida ligação (por exemplo, mudança no espectro de fluorescência, a perda do marcador radioisotópico). O kit de diagnóstico também pode conter um manual de instruções para a utilização do kit. É ainda divulgado um kit de diagnóstico para a identificação de células que compreende uma sonda de nucleótidos complementar à sequência, ou um fragmento de oligonucleót ido da mesma, mostrado na SEQ ID NO: 1, por exemplo, para hibridação com o ARNm de uma amostra de células, por exemplo, células musculares; meios para detetar a sonda de nucleótidos ligada ao ARNm na amostra com um padrão. Num aspeto particular, a invenção é uma sonda que possui uma molécula de ácido nucleico suficientemente complementar com uma sequência identificada como SEQ ID NO: 1, ou o complemento da mesma, de modo a ligar-se à mesma sob condições rigorosas. "Condições de hibridação rigorosas" tem o seu significado comum para uma pessoa perita na tecnologia. As condições rigorosas apropriadas que promovem a hibridação do ácido nucleico, por exemplo, 6x de cloreto de sódio / citrato de sódio (SSC) a cerca de 45 °C, são conhecidas pelos peritos na tecnologia. Os exemplos que se seguem são encontrados em Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nova Iorque (1989), 6.3.1 - 6.3.6: Para 50 ml de uma primeira solução de hibridação adequada, misturar 24 ml de formamida, 12 ml de 20x de SSC, 0,5 ml de 2 M de Tris-HCl, pH 7,6, 0,5 ml de lOOx de solução de Denhardt, 2,5 ml de H20 desionizada, 10 ml de 50 % de sulfato de dextrano, e 0,5 ml de 10 % de SDS. Uma segunda solução de hibridação adequada pode ser de 1 % de BSA cristalino (fração V) , 1 mM de EDTA, 0,5 M de Na2HP04, pH 7,2, 7 % de SDS. A concentração de sal na etapa de lavagem pode ser selecionada a partir de uma baixa restringência de cerca de 2x de SSC a 50 °C, a uma elevada restringência de cerca de 0,2X de SSC a 50 °C. Ambas as soluções de lavagem podem conter 0,1 % de SDS. Para além disso, a temperatura na etapa de lavagem pode ser aumentada desde condições de baixa restringência à temperatura ambiente, cerca de 22 °C, para condições de elevada restringência, a cerca de 65 °C. A referência citada dá mais detalhes, mas a lavagem rigorosa apropriada depende do grau de homologia e do comprimento da sonda. Se a homologia é de 100 %, pode ser usada uma temperatura elevada (65 °C a 75 °C) . Se a homologia é baixa, devem ser usadas temperaturas de lavagem mais baixas. No entanto, se a sonda é muito curta (< 100 pb) , devem ser usadas temperaturas baixas, mesmo com 100 % de homologia. Em geral, começa-se a lavagem a temperaturas baixas (37 °C a 40 °C), e aumenta-se a temperatura em intervalos de 3 - 5 °C, até que o fundo é suficientemente baixo para não ser um fator importante na autorradiografia. O kit de diagnóstico também pode conter um manual de instruções para a utilização do kit. A invenção fornece um kit de diagnóstico, tal como definido nas reivindicações, que pode ser utilizado, por exemplo, para determinar o genótipo de material genético de mamíferos. Um kit inclui um conjunto de oligonucleótidos iniciadores utilizados para amplificar o material genético. Um kit pode conter um oligonucleótido iniciador que inclui uma sequência de nucleótidos para a amplificação de uma região do material genético que contém uma das mutações de ocorrência natural aqui descritas. Um tal kit pode também incluir um oligonucleótido iniciador para amplificar a região correspondente do gene normal que produz a miostatina funcional. Normalmente, um referido kit incluiria também outro oligonucleótido iniciador a montante ou a jusante da região de interesse complementar a uma porção codificante e/ou não codificante do gene. Um kit particular inclui um oligonucleótido iniciador selecionado a partir de uma sequência não codificante de um gene da miostatina. Os exemplos de tais oligonucleótidos iniciadores são fornecidos na tabela 3, designados como Exão 1 - 5', Exão 1 - 3', Exão 2 - 5',

Exão 3-5' e Exão 3 - 3'. Estes oligonucleótidos iniciadores são utilizados para amplificar o segmento que contém a mutação de interesse. A genotipagem é levada a cabo utilizando oligonucleótidos iniciadores que têm como alvo as mutações especificas aqui descritas e que podem funcionar como oligonucleótidos específicos para o alelo na hibridação convencional, ensaios de Taqman, ensaios OLE, etc. Alternativamente, os oligonucleótidos iniciadores podem ser concebidos para permitir a genotipagem por microssequenciação.

Um kit de oligonucleótidos iniciadores inclui, assim, primeiro, segundo e terceiro oligonucleótidos iniciadores, (a) , (b) e (c) , respetivamente. 0 oligonucleótido iniciador (a) é baseado numa região que contém uma mutação de miostatina, por exemplo, uma região do gene da miostatina que abrange a deleção nt821del (11). 0 oligonucleótido iniciador (b) codifica para uma região a montante ou a jusante da região a ser amplificada pelo oligonucleótido iniciador (a) de modo a que é amplificado o material genético que contém a mutação, por PCR, por exemplo, na presença dos dois oligonucleótidos iniciadores. 0 oligonucleótido iniciador (c) é baseado na região correspondente à qual é baseada o oligonucleótido iniciador (a), mas sem a mutação. Assim, o material genético que contém a região sem mutação irá ser amplificado na presença dos oligonucleótidos iniciadores (b) e (c). 0 material genético homozigótico para o gene de tipo selvagem irá assim fornecer produtos amplificados na presença dos oligonucleótidos iniciadores (b) e (c) . 0 material genético homozigótico para o gene mutado irá assim proporcionar produtos amplificados na presença dos oligonucleótidos iniciadores (a) e (b) . 0 material genético heterozigótico irá fornecer produtos amplificados em ambos os casos. São descritas proteínas purificadas que possuem a atividade biológica da miostatina. Os termos "isolada" e "purificada" referem-se cada um a uma proteína substancialmente livre de material celular ou de meio de cultura quando produzida por técnicas de ADN recombinante, ou precursores químicos ou outros produtos químicos quando sintetizada quimicamente. Em certos aspetos, a proteína que possui atividade biológica de miostatina compreende uma sequência de aminoácidos identificada como SEQ ID NO: 2. Para além disso, estão englobadas as proteínas que têm atividade biológica de miostatina que são codificadas por ácidos nucleicos que hibridam sob condições rigorosas, tal como discutido anteriormente, com um ácido nucleico que compreende uma sequência de nucleótidos identificada como SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 7.

As proteínas que têm a atividade da miostatina podem ser obtidas por expressão numa célula hospedeira adequada utilizando técnicas conhecidas na tecnologia. As células hospedeiras adequadas incluem organismos procariotas ou eucariotas ou linhas de células, por exemplo, leveduras, E. coli, células de inseto e células COS 1. São divulgados os itens que se seguem: 1. Um método de aumentar a massa muscular de um mamífero que possui células musculares em que a miostatina é expressa, em que o método compreende a administração ao mamífero de uma quantidade eficaz de uma molécula de ácido nucleico substancialmente complementar a pelo menos uma porção do ARNm que codifica para a miostatina e sendo de comprimento suficiente para reduzir suficientemente a expressão da miostatina para aumentar a massa muscular. 2. 0 método do item 1, em que o mamífero é bovino. 3. Um método de aumentar a massa muscular de um mamífero, em que o método compreende a administração ao mamífero de uma quantidade eficaz de uma molécula de ácido nucleico com atividade de ribozima e uma sequência de nucleótidos substancialmente complementar a pelo menos uma porção do ARNm que codifica para a miostatina e sendo de comprimento suficiente para se ligar seletivamente à mesma, para reduzir suficientemente a expressão da miostatina, de modo a aumentar a massa muscular. 4. 0 método do item 3, em que o mamífero é bovino. 5. Um kit de diagnóstico para a determinação da presença de hiperplasia muscular num mamífero a partir do qual foi obtida uma amostra que contém ADN do mamífero, em que o kit compreende: primeiro e segundo oligonucleótidos iniciadores para amplificar o ADN, sendo os oligonucleótidos iniciadores complementares às sequências de nucleótidos do ADN a montante e a jusante, respetivamente, de uma mutação na porção de ADN que codifica para a miostatina que resulta na hiperplasia muscular do mamífero, em que pelo menos uma das sequências de nucleótidos é selecionada para ser de uma região não codificante do gene da miostatina. 6. 0 kit de diagnóstico do item 5, que compreende ainda um terceiro oligonucleótido iniciador complementar a uma mutação de ocorrência natural de uma porção codificadora do gene da miostatina. 7. Um kit de diagnóstico para a determinação do genótipo de uma amostra de material genético de mamífero, em que o kit compreende: um par de oligonucleótidos iniciadores para a amplificação de uma porção do material genético que corresponde a uma sequência de nucleótidos que codifica para pelo menos uma porção de uma proteína miostatina, em que um primeiro dos oligonucleótidos iniciadores inclui uma sequência de nucleótidos suficientemente complementar a uma mutação da SEQ ID NO: 1 para iniciar a amplificação de uma molécula de ácido nucleico que contém a mutação, sendo a mutação selecionada a partir do grupo de mutações que resultam de: (a) deleção de 11 nucleótidos que começa no nucleótido 821 da porção de codificação da SEQ ID NO: 1; (b) deleção de 7 nucleótidos que começa no nucleótido 419 da sequência de codificação e a inserção da sequência AAGCATACAA no lugar dos mesmos; (c) deleção do nucleótido 204 da sequência de codificação e a inserção de T no lugar do mesmo; (d) deleção do nucleótido 226 da sequência de codificação e a inserção de T no lugar do mesmo; e (e) deleção do nucleótido 313 da sequência de codificação e a inserção de A no lugar do mesmo; e combinações das mesmas. 8. O kit de diagnóstico do item 7, em que um segundo do par de oligonucleótidos iniciadores está localizado inteiramente a montante ou inteiramente a jusante da mutação ou mutações selecionadas. 9. O kit de diagnóstico do item 8, em que um primeiro referido oligonucleótido iniciador abrange a mutação (a) e que compreende ainda um terceiro oligonucleótido iniciador que é suficientemente complementar à sequência de nucleótidos identificada como SEQ ID NO: 11 para iniciar a amplificação de uma molécula de ácido nucleico que contém a SEQ ID NO: 11. 10. O kit de diagnóstico do item 8, em que um primeiro referido oligonucleótido iniciador é suficientemente complementar à sequência inserida da mutação (b) para iniciar a amplificação de uma molécula de ácido nucleico que contém a mutação (b) , e que compreende ainda um terceiro oligonucleótido iniciador que é suficientemente complementar à sequência que corresponde à deleção de 7 nucleótidos da mutação (b) para iniciar a amplificação de uma molécula de ácido nucleico que contém a deleção de 7 nucleótidos da mutação (b). 11. 0 kit de diagnóstico do item 8, em que um primeiro referido oligonucleótido iniciador abrange a mutação (c) e que compreende ainda um terceiro oligonucleótido iniciador que é suficientemente complementar à sequência que abrange a região correspondente sem a mutação (c) para iniciar a amplificação de uma molécula de ácido nucleico sem a mutação (c). 12. 0 kit de diagnóstico do item 8, em que um primeiro referido oligonucleótido iniciador abrange a mutação (d) e que compreende ainda um terceiro oligonucleótido iniciador que é suficientemente complementar à sequência que abrange a região correspondente sem a mutação (d) para iniciar a amplificação de uma molécula de ácido nucleico sem a mutação (d). 13. 0 kit de diagnóstico do item 8, em que um primeiro referido oligonucleótido iniciador abrange a mutação (e) e que compreende ainda um terceiro oligonucleótido iniciador que é suficientemente complementar à sequência que abrange a região correspondente sem a mutação (e) para iniciar a amplificação de uma molécula de ácido nucleico sem a mutação (e). 14. Um método para a determinação da presença de hiperplasia muscular num animal bovino, em que o método compreende: obter uma amostra de material que contém ADN do referido animal; e determinar se está presente o ADN que tem uma sequência de nucleótidos que codifica para uma proteína que possui atividade biológica de miostatina, em que a ausência de ADN que possui a referida sequência de nucleótidos indica a presença de hiperplasia muscular no animal. 15. 0 método do item 14, em que determinar se o ADN que tem uma sequência de nucleótidos que codifica para uma proteína que possui atividade biológica de miostatina inclui amplificar o ADN na presença de oligonucleótidos iniciadores com base na sequência de nucleótidos que codifica para uma proteína que possui atividade biológica de miostatina. 16. 0 método do item 15, em que o ADN de um referido animal bovino que não apresenta hiperplasia muscular tem uma sequência de nucleótidos que é capaz de hibridar com uma molécula de ácido nucleico que possui a sequência identificada como SEQ ID NO: 1, sob condições de hibridação rigorosas. 17. 0 método do item 14, em que determinar se está presente o ADN que tem uma sequência de nucleótidos que codifica para uma proteína que possui atividade biológica de miostatina inclui amplificar o ADN na presença de oligonucleótidos iniciadores com base numa sequência de nucleótidos que codifica para o terminal-N e o terminal-C, respetivamente, da proteína que possui atividade biológica de miostatina. 18. 0 método do item 14, em que determinar se está presente o ADN que tem uma sequência de nucleótidos que codifica para uma proteína que possui atividade biológica de miostatina inclui a amplificação do ADN na presença do primeiro e segundo oligonucleótidos iniciadores com base na primeira e segunda sequências de nucleótidos que codificam para regiões espaçadas da proteína, em que as referidas regiões ladeiam uma mutação conhecida por ocorrer naturalmente e que, quando presente em ambos os alelos de um referido animal resulta na referida hiperplasia muscular. 19. 0 método do item 18, em que um ADN do referido animal que não apresenta hiperplasia muscular contém uma sequência de nucleótidos que híbrida sob condições rigorosas com uma sequência de nucleótidos que codifica para uma proteína que possui uma sequência identificada como SEQ ID NO: 2 e a sequência de codificação de ADN de um referido animal que exibe hiperplasia muscular é conhecida por conter uma deleção de 11 pares de bases com inicio no par de bases n.° 821, e o referido primeiro oligonucleótido iniciador é selecionado para estar a montante do codão que codifica para o ácido glutâmico n.° 275 e o segundo oligonucleótido iniciador é selecionado para estar a jusante do codão que codifica para o ácido aspártico n.° 274. 20. O método do item 14, em que um ADN do referido animal que não exibe hiperplasia muscular contém uma sequência de nucleótidos que híbrida sob condições rigorosas com uma sequência de nucleótidos que codifica para uma proteína que possui uma sequência identificada como SEQ ID NO: 2 e a sequência de codificação de ADN de um referido animal que exibe hiperplasia muscular é conhecida por conter uma deleção de 11 pares de bases com início no par de bases n.° 821, e o referido oligonucleótido iniciador é selecionado para abranger a sequência de nucleótidos que inclui os de pares de bases n.° 820 e 821 da sequência de ADN que contém a referida deleção. 21. O método do item 19, em que o animal é de uma raça selecionada de Belgian Blue, Asturiana, Parthenaise e Rubia Gallega. 22. O método do item 20, em que o animal é de uma raça selecionada de Belgian Blue, Asturiana, Parthenaise e Rubia Gallega. 23. O método do item 14, em que determinar se está presente o ADN que tem uma sequência de nucleótidos que codifica para uma proteína que possui atividade biológica de miostatina inclui a amplificação do ADN na presença de um oligonucleótido iniciador que contém pelo menos uma porção de uma mutação conhecida por ocorrer naturalmente e que, quando presente em ambos os alelos de um referido animal resultada na referida hiperplasia muscular. 24. Um método para a determinação da presença de hiperplasia muscular num animal bovino, em que o método compreende: obter uma amostra de material que contém ADN do referido animal; e determinar se está presente o ADN que tem uma mutação tal como definida no item 7; e determinar se está presente o ADN que tem uma sequência de nucleótidos que codifica para uma proteína que possui atividade biológica de miostatina, em que a ausência de ADN que possui a referida sequência de nucleótidos e a presença da referida mutação indica a presença de hiperplasia muscular no animal. 25. Um método para determinar a presença de hiperplasia muscular num animal bovino, em que o método compreende: a obtenção de uma amostra do animal que contém o ARNm; e determinar se está presente na amostra um ARNm que codifica para uma proteína que possui atividade biológica de miostatina, em que a ausência do referido ARNm indica a presença de hiperplasia muscular no animal. 26. 0 método do item 25, em que a amostra é de tecido de músculo ou em que o tecido é tecido do músculo esquelético. 27. 0 método do item 25, em que determinar se o ARNm que tem uma sequência de nucleótidos que codifica para uma proteína que possui atividade biológica de miostatina inclui a amplificação do ARNm na presença de oligonucleótidos iniciadores substancialmente complementares à sequência de nucleótidos que codifica para a proteína. 28. 0 método do item 27, em que o ARNm de um referido animal bovino que não exibe hiperplasia muscular tem uma sequência de nucleótidos que é capaz de hibridar com uma molécula de ácido nucleico que possui a sequência identificada como SEQ ID NO: 1, sob condições de hibridação rigorosas. 29. 0 método do item 25, em que determinar se está presente o ARNm que tem uma sequência de nucleótidos que codifica para uma proteína que possui atividade biológica de miostatina inclui a amplificação do ARNm na presença de oligonucleótidos iniciadores substancialmente complementares a uma sequência de nucleótidos que codifica para o terminal-N e o terminal-C, respetivamente, da proteína que possui atividade biológica de miostatina. 30. O método do item 25, em que determinar se está presente o ARNm que tem uma sequência de nucleótidos que codifica para uma proteína que possui atividade biológica de miostatina inclui a amplificação do ARNm na presença do primeiro e segundo oligonucleótidos iniciadores substancialmente complementares à primeira e segunda sequências de nucleótidos que codificam para regiões espaçadas da proteína, em que as referidas regiões ladeiam uma mutação conhecida por ocorrer naturalmente e que, quando presente em ambos os alelos de um referido animal resulta na referida hiperplasia muscular. 31. O método do item 30, em que um ARNm do referido animal que não exibe hiperplasia muscular contém uma sequência de nucleótidos que híbrida sob condições rigorosas com uma sequência de nucleótidos que codifica para uma proteína que possui uma sequência identificada como SEQ ID NO: 2 e a sequência de codificação de ADN de um referido animal que exibe hiperplasia muscular é conhecida por conter uma deleção de 11 pares de bases com inicio no par de bases n.° 821, e o referido primeiro oligonucleótido iniciador é selecionado para estar a montante do codão que codifica para o ácido glutâmico n.° 275 e o segundo oligonucleótido iniciador é selecionado para estar a jusante do codão que codifica para o ácido aspártico n.° 274. 32. 0 método do item 25, em que determinar se está presente o ARNm que tem uma sequência de nucleótidos que codifica para uma proteína que possui atividade biológica de miostatina inclui a amplificação do ARNm na presença de um oligonucleótido iniciador que contém uma sequência de nucleótidos complementar a pelo menos uma porção de uma mutação conhecida por ocorrer naturalmente num referido animal e que, quando presente em ambos os alelos de um referido animal resulta na referida hiperplasia muscular. 33. 0 método do item 32, em que um ARNm do referido animal que não exibe hiperplasia muscular contém uma sequência de nucleótidos que híbrida sob condições rigorosas com uma sequência de nucleótidos que codifica para uma proteína que possui uma sequência identificada como SEQ ID NO: 2 e a sequência de codificação de ADN de um referido animal que exibe hiperplasia muscular é conhecida por conter uma deleção de 11 pares de bases com inicio no par de bases n.° 821, e o referido oligonucleótido iniciador é selecionado para abranger a parte excluída. 34. 0 método do item 31, em que o animal é de uma raça selecionada de Belgian Blue, Asturiana, Parthenaise e Rubia Gallega. 35. Um método para determinar a presença de hiperplasia muscular num mamífero, em que o método compreende : a obtenção de uma amostra de material que contém ADN do mamífero; e determinar se está presente uma sequência de ADN que codifica para (a) uma proteína que possui atividade biológica de miostatina, e se está presente uma sequência de ADN que codifica para (b) uma proteína alélica que não possui a atividade de (a) ; em que a ausência de (a) e a presença de (b) indica a presença de hiperplasia muscular no mamífero. 36. 0 processo do item 35, em que (b) contém uma mutação que ocorre naturalmente responsável pela falta de atividade. 37. 0 método do item 35, em que o mamífero é um ser humano. 38. 0 método do item 37, em que determinar se está presente uma sequência de ADN que codifica para (a), e se está presente uma sequência de ADN que codifica para (b) inclui amplificar o ADN na presença de oligonucleótidos iniciadores com base numa sequência de nucleótidos que codifica para uma proteína que possui atividade biológica de miostatina. 39. 0 método do item 38, em que os referidos oligonucleótidos iniciadores são baseados na sequência identificada como SEQ ID NO: 7. 40. Um método para determinar a presença de hiperplasia muscular num mamífero, em que o método compreende: a obtenção de uma amostra de material que contém ARNm do mamífero; e determinar se está presente uma sequência de ARNm que codifica para (a) uma proteína que possui atividade biológica de miostatina, e se está presente uma sequência de ARNm que codifica para (b) uma proteína pelo menos parcialmente codificada por uma sequência nucleotídica truncada que corresponde substancialmente à sequência do ARNm e com ausência da atividade de (a); em que a ausência de (a) e a presença de (b) indica a presença de hiperplasia muscular no mamífero. 41. 0 método do item 40, em que o ARNm que codifica para (a) e a sequência truncada correspondem aos alelos do ADN do mamífero. 42. O método do item 40, em que o mamífero é um ser humano. 43. O método do item 42, em que determinar se está presente uma sequência de ARNm que codifica para (a) , e se está presente uma sequência de ARNm que codifica para (b) inclui a amplificação do ARNm na presença de um par de oligonucleótidos iniciadores complementares a uma sequência nucleotídica que codifica para uma proteína que possui atividade biológica de miostatina. 44. O método do item 43, em que cada referido oligonucleótido iniciador contém uma sequência nucleotídica truncada substancialmente complementar a uma porção da sequência identificada como SEQ ID NO: 7 . 45. O método do item 44, em que a sequência truncada contém pelo menos 50 nucleótidos consecutivos que correspondem substancialmente a cerca de 10, ou entre cerca de 10 e 20, ou entre cerca de 20 e 30, ou entre cerca de 30 e 40, ou entre cerca de 40 e 50 nucleótidos consecutivos da SEQ ID NO: 7. 46. Um método para a determinação da presença de hiperplasia muscular num mamífero, em que o método compreende: a obtenção de uma amostra de tecido que contém ARNm do mamífero; e determinar se está presente um ARNm que codifica para uma proteína de miostatina de tipo mutante com ausência de atividade biológica da miostatina, em que a presença de um referido ARNm que codifica para uma proteína de miostatina do tipo mutante indica a presença de hiperplasia muscular no mamífero. 47. 0 método do item 46, em que a proteína de miostatina do tipo mutante com ausência da atividade biológica é codificada por um alelo de ADN de ocorrência natural que codifica para o ARNm. 48. Um método para a determinação da presença de musculatura dupla num animal bovino, em que o método compreende: a obtenção de uma amostra de material que contém ADN o animal; e determinar se o ADN contém a sequência de codificação de nucleótidos identificada como SEQ ID NO: 11, em que a ausência da sequência indica musculatura dupla no animal. 49. 0 método do item 34, em que o animal é de uma raça selecionada de Belgian Blue, Asturiana, Parthenaise e Rubia Gallega. 50. Um método para a determinação do genótipo da miostatina de um mamífero, que compreende: a obtenção de uma amostra de material que contém o ácido nucleico do mamífero, em que o ácido nucleico não está contaminado por ácidos nucleicos heterólogos; determinar se a amostra contém uma (i) molécula de ácido nucleico que codifica para uma proteína que possui atividade biológica de miostatina; e determinar se a amostra contém uma (ii) molécula de ácido nucleico alélico que codifica para uma proteína com ausência de atividade biológica de miostatina. 51. 0 método do item 50, em que o mamífero é um ser humano e (i) compreende uma sequência de ácidos nucleicos substancialmente homóloga à sequência identificada como SEQ ID NO: 7. 52. A proteína purificada que possui atividade biológica de miostatina, e que tem uma sequência de aminoácidos identificada como SEQ ID NO: 2, ou uma variante conservadora substituída da mesma. 53. Uma molécula de ácido nucleico isolada que codifica para uma proteína do item 52. 54. Uma molécula de ácido nucleico isolada que compreende uma molécula de ADN que possui a sequência de nucleótidos identificada como SEQ ID NO: 1 ou que varia da sequência devido à degenerescência do código genético, ou uma cadeia de ácido nucleico capaz de hibridar com pelo menos uma referida molécula de ácido nucleico sob condições de hibridação rigorosas. 55. O ARNm isolado transcrito a partir de ADN que possui uma sequência que corresponde a uma molécula de ácido nucleico de acordo com o item 54. 56. O ADN isolado que possui uma sequência de acordo com o item 54, num vetor recombinante de clonagem. 57. Uma célula microbiana que contém e que expressa o ADN heterólogo que é complementar a uma molécula de ácido nucleico do item 54. 58. Uma linha celular transfectada a qual expressa uma proteína do item 52. 59. Um processo para produzir a proteína do item 52, que compreende: a preparação de um fragmento de ADN que inclui uma sequência de nucleótidos que codifica para a referida proteína; a incorporação do fragmento de ADN num vetor de expressão para se obter uma molécula de ADN recombinante que inclui o fragmento de ADN e é capaz de sofrer replicação; a transformação de uma célula hospedeira com a referida molécula de ADN recombinante para produzir um transformante que pode expressar a referida proteína; a cultura do transformante para produzir a referida proteína; e a recuperação da referida proteína a partir da mistura de cultura resultante. 60. Um método de aumentar a massa muscular num mamífero, que compreende a administração de uma quantidade eficaz de um anticorpo para a miostatina ao referido mamífero. 61. Um método de aumentar a massa muscular num mamífero, que compreende o aumento de um autoanticorpo para a miostatina no mamífero. 62. O método do item 61, em que o aumento do autoanticorpo inclui a administração de uma proteína que possui atividade de miostatina ao mamífero. 63. Um método de aumentar a massa muscular num mamífero em necessidade da mesma, que compreende a administração ao mamífero de uma quantidade eficaz de um ácido nucleico antissentido ou oligonucleótido substancialmente complementar a pelo menos uma porção da sequência identificada como SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 7. 64. O método do item 63, em que a porção é de pelo menos 5 bases de nucleótidos de comprimento. 65. O método do item 64, em que o mamífero é um bovino e a sequência é a sequência identificada como SEQ ID NO: 1. 66. Um método de aumentar a massa muscular num mamífero, que compreende a administração ao mamífero de uma quantidade eficaz de um anticorpo para a miostatina. 67. Uma sonda que compreende uma molécula de ácido nucleico suficientemente complementar com uma sequência identificada como SEQ ID NO: 1, ou o seu complemento, de modo a ligar-se à mesma sob condições rigorosas . 68. A sonda do item 67, em que a sequência é entre cerca de 8 e cerca de 1195 nucleótidos de comprimento, ou entre cerca de 15 e 1195 nucleótidos de comprimento, ou entre cerca de 25 e 1195 nucleótidos de comprimento, ou entre cerca de 35 e 1195 nucleótidos de comprimento, ou entre cerca de 45 e 1195 nucleótidos de comprimento, ou entre cerca de 55 e 1195 nucleótidos de comprimento, ou entre cerca de 65 e 1195 nucleótidos de comprimento, ou entre cerca de 75 e 1195 nucleótidos de comprimento, ou entre cerca de 75 e 1195 nucleótidos de comprimento, ou entre cerca de 85 e 1195 nucleótidos de comprimento, ou entre cerca de 95 e 1195 nucleótidos de comprimento, ou entre cerca de 105 e 1195 nucleótidos de comprimento, ou entre cerca de 115 e 1195 nucleótidos de comprimento. 69. Um método para a identificação de uma sequência de nucleótidos de um gene mutante que codifica para uma proteína de miostatina de um mamífero que exibe hiperplasia muscular, em que o método compreende: a obtenção de uma amostra de material que contém ADN do mamífero; e colocar a amostra em contacto com a sonda, utilizando uma sonda de ácido nucleico com base numa sequência de nucleótidos de um gene conhecido que codifica para a miostatina, a fim de identificar a sequência de nucleótidos do gene mutante. 70. O método do item 69, em que a sonda é baseada numa sequência de nucleótidos de uma região não codificante do gene . 71. 0 método do item 70, em que a sonda é baseada na SEQ ID NO: 54. 72. O método do item 71, em que a sonda é de pelo menos 8 ácidos nucleicos de comprimento. 73. O método do item 69, em que a etapa de colocar a amostra em contacto com a sonda inclui expor o ADN à sonda sob condições de hibridação e que compreende ainda o isolamento de moléculas de ácidos nucleicos hibridadas. 74. O método do item 73, que compreende ainda a etapa de sequenciação do ADN isolado. 75. O método do item 69, em que o mamífero é um mamífero bovino e a sonda é baseada numa referida sequência de nucleótidos identificada como SEQ ID NO: 1. 76. O método do item 74, que compreende ainda a etapa de isolamento e sequenciação de um ADNc ou ARNm que codifica para a proteína de miostatina mutante completa. 77. O método do item 71, que compreende ainda a etapa de isolamento e sequenciação de uma miostatina funcional do tipo selvagem a partir de um referido mamífero que não exibe hiperplasia muscular. 78. O método do item 7 6, que compreende ainda a comparação da sequência de codificação completa da proteína de miostatina mutante completa com, se a sequência de codificação para uma miostatina funcional do tipo selvagem de um referido mamífero é previamente conhecida, (1) a sequência conhecida, ou se a sequência de codificação para uma miostatina funcional do tipo selvagem do referido mamífero é previamente desconhecida, (2) a sequência determinada de acordo com o item 74 ou com o item 77, para determinar a localização de qualquer mutação no gene mutante. 79. Um método para a determinação do genótipo da miostatina de um mamífero, em que a miostatina do tipo selvagem do mamífero é substancialmente a do item 78, que compreende: a obtenção de uma amostra de material que contém ADN do mamífero; e determinar se o ADN contém uma referida mutação determinada de acordo com o item 78. 80. Um método para a determinação do genótipo da miostatina de um mamífero, em que a miostatina do tipo selvagem do mamífero é substancialmente a do item 78, que compreende: a obtenção de uma amostra de material que contém ARNm do mamífero; e determinar se o ARNm contém uma referida mutação determinada de acordo com o item 78. 81. Uma composição de oligonucleótidos iniciadores para a deteção de uma sequência de nucleótidos que codifica para a miostatina que compreende uma primeira molécula de ácido nucleico com base numa sequência de nucleótidos localizada a montante de uma referida mutação determinada de acordo com o item 7 8 e uma segunda molécula de ácido nucleico com base numa sequência de nucleótidos localizada a jusante da mutação. 82. Uma sonda que compreende uma molécula de ácido nucleico com base numa sequência de nucleótidos do item 74 ou do item 7 6 e que abrange uma referida mutação determinada de acordo com o item 78. 83. Um mamífero transgénico que possui um fenótipo caracterizado por hiperplasia muscular, sendo o referido fenótipo conferido por um transgene contido nas células somáticas e germinais do mamífero, em que o transgene codifica para uma proteína de miostatina que possui uma mutação negativa dominante. 84. 0 mamífero transgénico do item 83, em que ο mamífero é do sexo masculino e não-humano e o transgene está localizado no cromossoma Y. 85. 0 mamífero transgénico do item 83, em que o mamífero é bovino e o transgene está localizado para estar sob o controlo de um promotor que é normalmente um promotor de um gene da miosina. 86. Um mamífero transgénico que possui um fenótipo caracterizado por hiperplasia muscular, sendo o referido fenótipo conferido por um transgene que possui uma sequência antissentido àquela que codifica para uma proteína de miostatina do mamífero. 87. 0 mamífero transgénico do item 86, em que o mamífero é bovino e o transgene está localizado no cromossoma Y. 88. 0 mamífero transgénico do item 86, em que o transgene compreende ainda uma sequência que, quando transcrita obtém um ARNm que possui atividade de ribozima. 89. Um mamífero não-humano transgénico que possui um fenótipo caracterizado por hiperplasia muscular, sendo o referido fenótipo capaz de ser induzido e sendo conferido por um gene da miostatina flanqueado pelos locais J oxP e um transgene Cre sob a dependência de um promotor induzível. 90. Um mamífero do sexo masculino não-humano transgénico que possui um fenótipo caracterizado por hiperplasia muscular, sendo o referido fenótipo conferido por um gene da miostatina flanqueado pelos locais J oxP e um transgene Cre localizado no cromossoma Y. 91. Um método para determinar se uma amostra de material genético de mamífero é capaz de conferir um fenótipo caracterizado por hiperplasia muscular, que compreende determinar se o material genético contém uma sequência de nucleótidos que codifica para uma proteína que possui atividade biológica de miostatina, em que a ausência da referida sequência indica a presença de hiperplasia muscular no animal. 92. Um bovino transgénico que possui um genoma com ausência de um gene que codifica para uma proteína que possui atividade biológica de miostatina. 93. Um ratinho transgénico que possui um genoma que contém um gene que codifica para uma proteína humana que possui atividade biológica da miostatina ou que contém um gene que codifica para uma proteína de bovino que possui atividade biológica de miostatina. 94. Um bovino transgénico que possui um gene que codifica para uma proteína de bovino que possui atividade biológica de miostatina e uma sequência de nucleótidos heteróloga antissentido para o gene. 95. Um bovino transgénico do item 94, que compreende ainda um gene que codifica para uma sequência de ácido nucleico que possui atividade de ribozima e em associação de transcrição com a sequência de nucleótidos antissentido para o gene.

REFERÊNCIAS

As informações relativas às referências citadas acima são dadas em seguida. Todas as referências listadas são aqui incorporadas por referência.

Barendse, W., S.M. Armitage, L.M. Kossarek, A. Shalom, B.W. Kirkpatrick, A.M. Ryan, D. Clayton, L. Li, H.L. Neibergs, N. Zhang, W.M. Grosse, J. Weiss, P. Creighton, F. McCarthy, M. Ron, A.J. Teale, R. Fries, R. A. McGraw, S.S. Moore, M. Georges, M. Soller, J.E. Womack, e D.J.S. Hetzel. 1994. A genetic linkage map of the bovine genome. Nature Genet. 6: 227-235.

Bishop, M.D., S.M. Kappes, J.W. Keele, R.T. Stone,

S. L.F. Sunden, G.A. Hawkins, S. Solinas Toldo, R. Fries, M.D. Grosz, J. Yoo, e C.W. Beattie. 1994. A genetic linkage map for cattle. Genetics 136: 619-639. Boss et al., patente US n.° 4 816 397.

Cabilly et al. patente US n.° 4 816 567.

Charlier, C.; Coppieters, W.; Farnir, F.; Grobet, L.; Leroy, P.; Michaux, C.; Mni, M.; Schwers, A.; Vanmanshoven, P.; Hanset, R. & Georges, M. (1995) The mh gene causing double-muscling in cattle maps to bovine chromosome 2. Mammalian Genome 6: 788-792. Chirgwin, J.M.; Przybyla, A.E.; MacDonald, R.J.; Rutter, W.J. (1979) Isolation of biologically active ribonucleic acid from sources enriched in ribonuclease. Biochemistry 18: 5294-5299.

Cockett, N.E.; Jackson, S.P.; Shay, T.D.; Nielsen, D.; Green, R.D.; Georges, M. (1994) . Chromosomal localization of the callipyge gene in sheep (Ovis aries) using bovine DNA markers. Proceedings of the National Academy of Sciences, US, 91: 3019-3023. Cockett, N.E.; Jackson, S.P.; Shay, T.D.; Farnir, F.; Berghmans, S.; Snowder, G.; Nielsen, D.; Georges, M. (1996) . Polar overdominance at the ovine callipyge locus. Science 273: 236-238.

Cole et al. (1985) . Monoclonal Antibodies in Cancer

Therapy. Allen R. Bliss, Inc.

Collins, F.S. 1995. Positional cloning moves from perditional to traditional. Nature Genet. 9: 347-350. Cornells, F.; Hashimoto, L.; Loveridge, J.; MacCarthy, A.; Buckle, V.; Julier, C.; Bell, J. (1992) . Identification of a CA repeat at the TCRA locus using YACs: a general method for generating highly polymorphic markers at chosen loci. Genomics 13: 820- 825.

Cottingham, R.W.; Idury, R.M.; Schaffer, A.A. (1993). Faster sequential genetic linkage computations. Am. J. Hum. Genet. 53: 252-263.

Culley, G. (1807) . Observations on livestock. 4th ed., (London, G. Woodfall).

Fisher, S.R.; Beever, J.E.; Lewin, H.A. (1996). Genetic mapping of C0L3AI to bovine chromosome 2. Mammalian Genome 8: 76-77.

Fuji, J.; Otsu, K.; Zorzato, F.; Deleon, S.; Khanna, V.K.; Weiler, J.E. O'Brien, P.J.; MacLennan, D.H. (1991). Identification of a mutation in the porcine ryanodine receptor associated with malignant hyperthermia. Science 253: 448-451.

Georges, M.; Andersson, L. (1996) . Livestock genomics comes of age. Genome Research 6: 907-921.

Georges, M.; Nielsen, D.; Mackinnon, M.; Mishra, A.; Okimoto, R.; Pasquino, A.T.; Sargeant, L.S.; Sorensen, A.; Steele, M.R.; Zhao, X.; Womack, J.E.; Hoeschele, I. (1995). Mapping quantitative trait loci controlling milk production by exploiting progeny testing. Genetics 139: 907-920.

Gossen, M. & Bujard, H. (1992) . Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promotors. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 89: 5547-5551.

Grobet, L.; Royo Martin, L.J.; Poncelet, D.; Pirottin, D.; Brouwers, B.; Riquet, J.; Schoeberlein, A.; Dunner, S.; Menissier, F.; Massabanda, J.; Fries, R.; Hanset, R.; Georges, M. (1997) A deletion in the myostatin gene causes double-muscling in cattle. Nature Genetics 17: 71-74.

Gu, H.; Marth, J.D.; Orban, P.C.; Mossmann, H.; Rajewsky, K. (1994). Deletion of a DNA polymerase beta gene segment in T cells using cell type-specific gene targetting. Science 265: 103-106.

Hanset, R. and Michaux, C. (1985a) . On the genetic determinism of muscular hypertrophy in the Belgian White and Blue cattle breed. I. Experimental data. Génét. Sél. Evol. 17: 359-368.

Hanset, R. and Michaux, C. (1985b) . On the genetic determinism of muscular hypertrophy in the Belgian White and Blue cattle breed. II. Population data. Génét. Sél. Evol. 17: 369-386.

Hanset, R. (1991) . The major gene of muscular hypetrophy in the belgian Blue Cattle Breed. In Breeding for Disease Resistance in Farm Animals, Owen, Axford, eds. C.A.B. International, pp. 467-478. Herskowitz, I. (1987). Functional inactivation of genes by dominant negative mutations. Nature 329: 219-222 .

Hogan, B. et al. , (1986) . A Laboratory Manual, Cold

Spring Harbor, N.Y., Cold Spring Harbor Laboratory. Hoess, R.H.; Ziese, M.; Sternberg, N. (1982). Pi site-specific recombination: nucleotide sequence of the recombining sites. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 3398-3402 .

Houbenwcyl, (1987) . Methods of Organic Chemistry, ed. E. Wansch. Vol. 15 I e II. Thieme, Estugarda.

Hudson et al. (1995) Science 270: 1945-1954 com dados adicionais do Whitehead Institute / MIT Center for Genome Research, Human Genetic Mapping Project, publicação dos dados 11.9 (maio de 1997) .

Hunter, K.; Riba, L.; Schalkwyk, L.; Clark, M.; Resenchuk, S.; Beeghly, A.; Su, J.; Tinkov, F.; Lee, P.; Ramu, E.; Lehrach, H. e Housman, D. (1996) . Toward the Construction of Integrated Physical and Genetic Maps of the Mouse Genome Using Interspersed Repetitive Sequence PCR (IRS\NPCR) Genomics. Genome Research 6: 290-299.

Huse et al., (1989). Science 246: 1275 -1281.

Kambadur, R.; Sharma, M.; Smith, T.P.L.; Bass, J.J. (1997) . Mutations in myostatin (GDF8) in doublemuscled Belgian Blue Cattle. Genome Research 7: 910- 916 .

Kappes, S.M.; Keele, J.W.; Stone, R.T.; McGraw, R.A.; Sonstegard, T.S.; Smith, T.P.L.; Lopez-Corrales, N.L. e Beattie, C.W. (1997) . A Second-Generation Linkage Map of the Bovine Genome. Genome Research 7: 235-249. Kennett, R. (1979) . Cell fusion. Methods Enzymol. 58: 345-359.

Kohler e Milstein. (1975). Nature 256: 495-497.

Kozbor et al. (1983). Immunol. Today 4: 72.

Lathrop, M.; Lalouel, J.M. (1984). Easy calculations of lodscores and genetic risk on small computers. American Journal of Human Genetics 36: 460-465. Lenstra, J.A.; van Boxtel, J.A.F.; Zwaagstra, K.A.; Schwerin, M. (1993) . Short interspersed nuclear element (SINE) sequences of the Bovidae. Animal Genetics 24: 33-39.

Libert, F.; Lefort, A.; Okimoto, R.; Georges, M. (1993) Construction of a bovine genomic library of large yeast artificial chromosome clones. Genomics 18: 270-276.

Lopez, A.R.; Cook, J.; Deininger, P.L.; Derynck, R. (1992). Dominant negative mutants of transforming growth fator-betal inhibit the secretation of different transforming growth factor-beta isoforms. Molecular and Cellular biology 12(4) : 1674-1679.

Lyons, A.L.; Laughlin, T.F.; Copeland, N.G.; Jenkins, N.A.; Womack, J.E.; O'Brien, S.J. (1996). Comparative Anchor tagged Sequences for Integrative mapping of Mammalian Genomes. Nature Genetics 15: 47-56. McPherron, A.C.; Lee, S.-J. (1996). The transforming growth factor β superfamily, em Growth Factors and Cytokines in Health and Disease, Volume IB, páginas 357-393. JAI press Inc.

McPherron, A.C.; Lawler, A.M.; Lee, S.-J. (1997).

Regulation of skeletal muscle mass in mice by a new TGFp superfamily member. Nature 387: 83-90.

Menissier, F. (1982). Present state of knowledge about the genetic determination of muscular hypertrophy or the double muscled trait in cattle, em Current Topics in Veterinary Medicine and Animal Science, vol. 16: Muscle hypertrophy of genetic origin and its use to improve beef production, pp. 387-428. Ed. King e Menissier, Martinus Nijhoff.

Merrifield, (1964). J. Am. Chem. Assoc. 85: 2149-2154. McCafferty et al., (1990). Nature 348: 552-554.

Mirski, S. e Cole, S. P. C. (1989). Antigens associated with multidrug resistance in H69AR, a small cell lung cancer cell line. Cancer Res. 49: 5719-5724. Morrison et al., (1985) . Proceedings of the National

Academy of Sciences, USA, 81: 6851. O'Brien, S.J.; Womack, J.E.; Lyons, L.A.; Moore, K.J.; Jenkins, N.A.; Copeland, N.G. (1993) . Anchored reference loci for comparative genome mapping in mammals. Nature Genetics 3: 103-112.

Old, R.W. e Primrose, S.B., em: Principles of Gene Manipulation. An Introduction to Genetic Engineering, 4a ed. Oxford University Press. 63-66.

Pell, J.M.; Flint, D.J.; (1997). em: Milk Composition,

Production and Biotechnology, Ed. Welch et al., Capitulo 19.

Sambrook, J., Fritsch E.F. e Maniatis, T. (1989) . Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring

Harbor Lab Press, Cold Spring Harbor, Nova Iorque. Shockett, P.E.; Schatz, D.G. (1996). Diverse strategies for tetracycline-regulated inducible gene expression. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 93: 5173-5176.

Solinas-Toldo, S.; Lengauer, C; Fries, R. (1995) . Comparative genome map of man and cattle. Genomics 27: 489-496 .

Staerz & Bevan (1986a). Proceedings of the National

Academy of Sciences, USA, 83: 1453.

Staerz & Bevan (1986b). Immunology Today 7: 241. Stewart, A.J., Canitrot, Y., Baracchini, E., Dean, N.M., Deeley, R.G., e Cole, S.P.C. (1996). Reduction of Expression of the multidrug resistance protein (MRP) in human tumor cells by antisense phophorothioate oligonucleotides. Biochem. Pharamcol. 51: 461-469.

Takeda et al., (1985). Nature 314: 452.

Tanaguchi et al., publicação de patente Europeia EP171496.

Teng, et al., (1982) Meth. Enzymol. 92: 3-16.

Varga, L.; Szabo, G.; Darvasi, A.; MuDller, G.; Sass, M.; Soller, M. (1997) . Inheritance and mapping of compact (Cmpt), a new mutation causing hypermuscularity in mice. Genetics, em publicação. Walter, M.A.; Spillett, D.J.; Thomas, P.; Weissenbach, J.; Goodfellow, P.N. (1994) . A method for constructing radiation hybrid maps of whole genomes. Nature Genetics 7: 22-28.

Ward et al., (1989). Nature 341: 544-546. SEQUÊNCIA ID NO. 1 [

1 AGGAAGAATA AGAACAAGGG AAAAQATTGT Α^ΓΟΑΤΤΤΤΑ AAACCATGCA, 51 AAAACTGCAA ATCTCTGTTT ATATTTACCT ATTTATGCTG ATTCTO'SCTO 101 GCCCASTGGA TCTGAATGAG AACAGCGAGC AGAAGGAAAA TGTGCAAAAA 151 GAGGGGCTCT GtAATGCATG TTTGTGCAGG GAAAACAOIA C&TCCTGAAG 201 ACTAGAAGCC ATAAAAATCC AAATCCTCAG rAAAC'iTCOC CTGGAAACAG 251 CTCCTAACAT CAGCAAAGAT GCTATCAGAC AACíTTTGCC CAAGGCTCCT 301 CCACTCCTGG AACTGATTGA TCAGTTCGAT GTCCAGAGAG ATCCCAGCAG 351 TGACGGCTCC TTGGAAGACG ATGACTACCA CGCCACCACG GAAACCGTCA 401 . TTACCATGCC CACGGAGTCT GATCTTCTAA CGCAAGTGQA AGCAAAACCC 451 AAATGTTGCT TCTTTAAATT TAGCTCTAAG ATACAATACA ATAAACTAGT SOI AAAGGCCCAA C1OTGGATAT ATCTSAGGCC TGTCAAGACT CCTGCGACAG 5 SI TGTTTGTQCA AATCCTGACA CTCATCAAAC CCA'l'GAAAGA CGGTACAAGG 601 TATACTGGAA TCCGATCTCT GAAACTTGAC ATGAACCCAG GCACTGGTAT 651 TTCCCAOAGC ATTGATGTGA AGACAGTCTT GCAGAACTGG CTGAAACAAC 701 CTGAATCCAA CTTAGCCATT GAAATCAAAG C*!«JTAGATGA GAATGGCCAT 751 GATCTTGCTQ TAACCTTCCC AGAACCAGGA SAAGATGGAC TGACTCCTTT SOI TTTAGAAGTC AAGGrTAACAG ACACACCAAA AAGATCTAGG AGÂGATTTFG 851 GGCTTGATTG TGATSAACAC TCCACAGAAT CTCGATGGTG TCGTTACCCT 901 CTAACTCTGG ATTTTGAAGC TTTTGGATGG GACTCJGATTA TTGCAÇCTAA 953 AAGATATAAG QCCAATTACT GCTCTGGAGA ATGTGAA'iTT GTATTITl'GC 1001 AAAAGTATCC TCATACCCAI CTTGTGCACC AAGCAAACCC CAGAGCTTCA 1051 CCCGGCCCCT GCTGTACTCC TACAAAGATG-TCTCCAATTA ATATGCTATA HOI TTTTAATGGC CAAGGACAAA TAATATACGG GAAGATTCCA GCCA*I*CGTA5 1151 TAGATCGCTG TGGGTGTTCA TGAGTCTATA TTtOGgTTCA TAAGC SEQUÊNCIA ID NO. 2 1 jWQKLQISVY lYLFttLIVAG PVDLNENSEQ KmVEKUULC NACI.WRENTT 51 SSRLEATKIQ ILSKI-R^ETA PNIRKDAIRQ LLPKAPPIXE LIDQFDVQRD 101 ASSDGSLEDD DYIIARTETVI TMPTESDLLT QVEGKPKCCP FKFSSKIQIN 151 KT,VKAQLWIY LRFVKTFATV FVQXLRr.TKP KUCLXJTRYTGI K6XK3jDMNPG 201 TGIWQSIDVK TVLQNWLKQP ESNLGIETKA LDUNGHDLAV TPPSPGEDGL 251 TPFLEVKVTD TPKRSRRDfC LDCDEHSTPS HCCRYPLTVT) FJEAFGWDWII 301 APKRYKANYC SCECEFVFLQ KYPHTHDVHQ ANPRGSAGPC CTFTKMLSPIN 351 MLYFNGEGQI TYGKIPAMW DRCGCS* SEQUÊNCIA ID NO. 3

l AGGAAGAATA AGAACAAGGG AAAAGATTQT ATTGATYTTA AAACCATGC 51 AAAACTCCAA ATCTCTGTTT ATATTTACCT ATTTATGCrtJ ATTGTTGCl 101 GCCCAGXCCA TCTGAATGAG AACAGCGAGC AGAAGGAAAA ’ifJTGGAAAi IS’ CACGGGCTGT GTAATGCATG TTTGTGGAGG GAAAAOACTA CATCCTCAA 201 ACTACAAGCC ATAAAAATCC AAATCCTCAG TAAACTTCGC CTGGAAACA 2SI CTCCTAAGAT GAÍ3CAAAGAT GCTATCAGAC AACTTTTfJCC CAAGGCTCO 301 CCACTCCTGG AACTGATTGA TCAGTTCGAT GTCCAGAGAC ATGCCAGCAi 351 TGACGGCXCC TTGGAAGACG ATGACTACCA CGCCAGGACG CAAACGGTCJ 401 TTACCATGCC CACGGAGTCT GATCTTCTAA CGCAAGTGGA AGGAAAACCC 451 AAATGTTGCT TCTTTAAATT TAGOTCTAAG ATACAATACA AfAAACTAGT 501 AAACGCCCAA CTGTGGATAT ATCTGAGGCC TGTCAAGACT CCTGCGACAG 551 TGTTTGTGCA AATCCTCaCA CTCA1CAAAÇ CÇATGAAAGA CGGTACAAGC 601 TATACTGGAA TCCGATCTCT GAAACTTGAC ATGAAÇCCAG GCACTGGTAT 551 TTGGCAGAOC ATTOATCTCA AGACAGTGTT GCACAACTGC CTCAAACAAC 701 CTGAATCCAA CTTAGGCATT GAAATCAAAG CTTTAGATGA GAATGQCCAT 751 GATCTTGCTG TAACCTTCCC AGAACCAGGA GAAGATGGAC TOACTCCTTT 801 TTTAGAAGTC AAGGTAACAG ACACACCAAA aagatctagg aoagattttg 851 GGCTTGATTG TGACAGAATC TCGATGCTGT CGTTACCCTC TAACTGTGGA 901 TTTTGAAGCT TTTGGATGGG ATTGGATTAT TCCACCTAAA AGATATAAGG 951 CCAATTACTG CTCTGGAGAA TOTGAATTTG TATTTTTGCA AAAGTATCCT 1001 CATACCCATC XTGTGCACCA AGCAAACCCC AGAGGTTCAG CCGGCCCCTC 1051 CTGTACTCCT ACAAAGATGT CTCCAA'FTAA TATGCTATAT TTTAATGGCG 1101 AAGGACAAAT AATATACGGG AAGATTCCAG CCATGGTAGT AAATCgCTGT 1151 QGGXGTTCAT GAGGTCTATA TTTGGTTÇAT AGCTTCCTCA AACATGGAAG 1201 GTCTTCCCCT CAACAATTTT GAAACTGTTG AAATTATGT SEQUÊNCIA ID NO. 4 1 «WQKLQI5VY IYDFMLIVAG PVDLNENSEQ KENVEKEGLC NACLWKKNTT 51 SSRLEAIKIQ ILSKLRLETA PNISKDAIRQ I.LPKATPLLK DiL^FDVQRD 101 ASSDGSLEDD DTHAKTSTVI TMPTEfiDLLT QVE®Rf«€€F PK ΚΕΕΚΙβΥΝ 151 KLVKAQLWIY LRPVKTPATV FVQIDRLrKP MKDGTRYTGI RSÍ.KUWNPG 201 TGIWQSIDVK TVLQNWLKQP EÍJNItGTEIKA LDENGHDLAV TFPEPG&ÍXÍL 251 TPFLEVKVTD TPKR.SRRDFG TJXDRISKLS LPSNCGF 301 351 SEQUÊNCIA ID NO. 5

1 GTCTCTCOGA CGGTACATGC ACTAATATTT CACTTGGCAT TACTCAAAAG si caaaaagaag aaataagaac aagcgaaaaa aaaagattgt gctqattttt 201 AAAATGATGÇ AAAAAGTGCA AATGTATGTT TAIATTTAjCC TQTTCAÍGÇT 151 GATTGCTCCT GGCCCACTGG atctaaatga gggcagtgag agagaagaaa 201 A'F'GTGGAAAA AGAGGGGCTC TÚTAATGCAT GltiCGTOGAG ACAAAACACG 251 AGGTACSCCA GAATAGAACC CASAAAAATT CAAATCCTCA GTAAGCTGCG ' 301 CCTGGAAACA GCTCCTAACA TCAGCARAGA TÇCTATAAGA CAACTTCTGC .152 CAAGACCGCC TCCACTCCCG GAACTOATCC ATCAGXACGA CGTCCAGAGG 401 GATGACAGCA GTGATGGCTC TTTGGAAGAT GACGATTATC ACGC2ÍACCÀC 451 GGAAACAATC ATTACCAXGC CTACACAGTC ΤβΑΟΤΤΓΟΤΑ ATGCAAGCGG 501 ATGGCAAGCC CAAATGTTCC ΓΤΓΤΧΤΑΑΑΤ' TTAGCTCTAA AATACAGTAC 551 AACAAACTAG TAAAAGCCCA ACTGTGGATA TATCTCAGAC CCGTCAAGAC SOI TCCTACAACA GTOTTTGTGC AAATCCTGAG ACTCATCAAA CCCATGAAAG SSI ACCGTACAAO GTATACTCOA A'TCCGATC’rC TGAAACTTGA CATGAQCCCA 701 OOCAÇTCfOTA TTTGGCAGAG TATTGATGTG AAGACAG'l'GT TGCAAAATTC 751 GC1CAAACAG CCTOAATCCA ACTTAGGCAT TGAAATCAAA GCTTTGGATG 801 AGAATGGfCCA TGATCTTCCT GTAACCTTCC CAGGACCAGG AGAAGATGGG 851 CTSAATCCCT TTTTAGAACT CAAGGTGAÇA GACACACCCA AGAQCTCCCG - 901 GAGAGACTTT GGGCTTGACT CCGATGAGCA CTCCACGGAA TCCCGGTGCT 951 GCCGGTACCC CCTCACGGTC GATTTTGAAG CCTTTGGATG GOaCTOGATT 1001 ATCGCACCCA AAAGATATAA GGCCAATTAC TGCTCAGGAG ÀGXGTGAATT 1051 TGTCTTtTTA CAAAAATATC CGCATACTCA TCTTGTGCAC CAAGCAAACC 1101 CCAGAGGCTC AGCAGGCCCT TGCTGCACTC CGACAAAAAT GTCTCCCATT 1151 AATATGCXAT ATTTTAATGG CAAAGAACAA ATAATATATG GUAAAATTCC 1201 AGCCATGGTA GTAGACCGCX CtGGGTGCTC ATGAGCTTTG CATTAGGTTA 1251 GAAACTTC CC AAGTCATGGA aggtcttcgc cigaatttcg aaactgtgaa.

1301 TTCAAOCACC ACAGGCTGTA GGCCTTGAGT ATGCTCTACT AACGTAAGCA 13 SI CAAGCTACAÇ TGTATGAACT AAAAGAGAGA ATAGATGCAA TGGTTGGCJVT 1401 TCAACCACCA AAATAAACCA TACTATAGGA TGTTQTATQA TTTCCAGAG1 1451 TTTTGAAATA CATGGAGATC AAATTACATT TATGTCCATA TATCTTATATT 1501 ACAACTACAA TCTAGGCAAG GAAGTGAGAG CACATCTTGT GGTCTGCfGA 1531 GTTAGGAGGG TATGATTAAA AGGTAAAGTC TTATTTCCTA ACAGTTTCAC 1601 ΓΤΑΑΤΑΤΤΤΑ CAGAACAATC TATATGTAGC CPTTGTAAAG TGTAGGATTG 1651 TTATCATTTA AAAACATCA7 GTACACTTAT ATT^GTATTG TAÍAÇTTGGT 1701 ΑΑΟΑΤΛΛΛΑΤ TCCACAAAGT AGGAATGGGS CCTCACATAC ACATTGCCAT 1751 TCCTATTATA ATTGGACAAT CCACCACGST GCTAATGCAG TGCrCAATGG 1901 CTCCTACTGG ACCTCTCGAT AQAACACTCT ACAAAGTACG AGTCTCTCTC 1951 TCCCTTCCAG GTGCATCTCC ACACACACAG CACTAAGTGT TCAA75CATT 1901 TTCTTTAAGG AAAGAAGAA7 CTTTTTTTCT AGAGGTCAAC TTTCAGTCAA 1951 CTOTAGCACA GCGGGAGTGA CTGCTGCATC TTAAAAGGCA GCCAAACAGT 2001 ATTCATTTTT TAATCTAAAT TTCAAAATCA CTGTCTGCCT TTATCACATG 2051 GCAATTTTGT GGTAAAATAA TGGAAATGAC TGGTTCTATC AATATTGTAT 2101 AAAAGACTCT CAAACAATTA CATTTATATA ATATGTATAC AATA7TGTTT 2151 TGTAAATAAG TGTCTCC77T TATATTTACT TTGGTÃTATT TTTACACTAA 2201 ΤβΑΑΑΤΤΤΟΑ AATCATTAAA GTACAAAGAC ATGTCATGTA TCACAAAAAA 2251 GGTGACTGCT TCTATTTCAG AGTGAATTAG CAGATTCAAT AGTGGTCTTA 2301 AAACTCTGTA TGTTAAGATT AGAAGGTTAT ATTACAATCA ATTTATGTAT 2351 TTTTTACATT ATCAACTTAT GGTTTCATGG TGGCTGTATC TATGAATGTG 2401 GCTCCCAGTC AAAT77CAAT GCCCCACCAT TTTAAAAATT ACAAGCATTA 2451 CTAAAGATAC CAACATGTAT CTAAAGAAAT ACAAATATGG TATCTCAATA 2501 ACAGCTACTT TTTTATTTTA TAATTTGACA ATGAATACAT TTCTTTTATT

2551 TACTtCAGTT 7TATAAATTG GAACTTTGTT TATCAAATQT ATTGTACTCA

2601 TAGCTAAATG AAATTATT7C TTACATAAAA ATGTGTAGAA ACTATAAATT

3651 MÀGTGTTTT CACATTTTTG AAACCC SEQUÊNCIA ID NO. 6 1 MMQKLQMYVY IYLFMLIAAG PVDLNEGSER EENVEKEGDC NACAWRQNTR 51 YSRIEAIKIQ ILSKt^RDETA PNISKDAIRQ LLPRAPPLKS 1IDQYDVQRD 101 DSSDGST.EDD ΠΥΚΑΤΤΕΤΙΙ TMFTESDFLM QADGKPKCCF FKFSSKIQYN 151 KWKAQLWIY LRPVKTFTTV PVQII*Rl»IKP MKDGTRYTGI RST.KT,UMSFG 201 TGJWQSIDVK TVLQNWDKQP ESNLGIEIKA LDENGHDLAV TFPGPGEDGL 251 NPFLEVKVTD TPKRSRRDFG LDCDEHSTES RCCKYPLTVD ΈEAFGWDWII 301 APKRYKANYC 5GECEFVFDQ KYPHTHLVHQ ANPRGSAGPC CTFTKKSFIN 351 MLYPNGKEOI IYGKIPAMW DRCGCS+ SEQUÊNCIA ID NO. 7

ha37$J »aATTTTCTAATf»CAAírrGGArCCAAAACCC

}>c3753 AAATCTTGCTTCTTTAAAnTAeCTCTAAAATACAATACAATAAACTACTAAAGGCCCAA

b*3.7S J CTATCCATATATTTGACACCCGTCQAGACTCCTACAACAQTQTTTGTGCAAATCCTGAGA hfi3753 CTCATCAAACCTATQAAAOACOaTACAACCTATACTGGAATCCCIVTCTCTGAAACTTGAC

b*3?53 AT<àAegCJuSOOACTa3TATTTCflCÍAflA HXTtttàTOT<mi ι-ftiTTffi^'OKlAAft.ftΤΤϋQ

fc*3*S3 {rrcAiULCXWCTOAMrscMCTTxwcATTawu^AJL^fflrmACATOXi^'fatm^^ h*37S3 RRTOTTOOTOTAfcCCTTCOC^OCfcfirtAOGAKiSAJkCUVtiCiOCTtWATÇCÇITírMflVLAOAA

hKSVS'j COrrCXASOTAACAGACACAOCA ΑΑΑΛΟΑίΡΤCCACMA<W<^TriTGtoT,C77yT'GACT0tCrrGA H«3753 T<»ôc*^í^c*ifi^TeAC<SATccTtmx^AccxwOTJuicTSfi^cKiATrrr<àiAccc3? »ιβϊ?ϊ? wc<>3awpeecA'W«aA'TAí,c<í he 7β a ? AacajiTeaTAeTAaAccocTeTaoarrecrc

h«7«23 ATClACATTTATATTAAGCCTTCAtAACTPCCTAAAACATaGAAGCTTTTCCCCTCAACAA

à*7823 !TPTOCAXí3C,W!T<yiAA,PTAA<?TACÇACA(WC?rATAOOCOTAaACíTAT3CTACAt;TCACTT he?823 AAOCa.TAAOCTACACTAT<7rAAACrAAAAGaG<5GAAlfeeGAATATAT<3CAAXGCTrGOCA h«7023 TTTAACCATCCAAACAAATCATAC- ·CAGAAAGTTTTATGATTTCCAJraSTTTTTTNAO<S C^OAAAOOAOGAOXCAAAWTTTCANTCTTATacrr i _ .

Í19ZQ27 ATTTCGCCACA«5TKAAACACTTaAATTTATArn»rATaeTAGTATA

hS2027 CTOOGTAACATAAAATTCCACAAAAATAOOdATOaTOCAOGATATaGA ATTTCCATTCC Π92Α27 TATTATAATTCACACAGTACATrAACAATCCAT5CCAACO«TCCTAATACCATAOOCT<3A

«*95327 YAAATCICAACCWfTCCATTATTTTAWCACTTeCAAAAACATTACTAAOTATACCAAAATA »9532? ATrOACTCtfATTAXC *Τβ· ΑΑΑΧΟΑΛα - AAXAAACTaAXOCXAXCXÇaUiCAATAACTeTT n95327 ΑβΤΓΧΤΓΑΤΤΤΤΑΙΑΑΤΤΤαλΤΑΑΤΟΑΑΤΑΤΑΤΤΤ^ΤΠΚΑΤΊΤΑΤΤΧΑΟΤΤΟΤβΤΤΤϊνίίΤΑ »95327 AAWS<J<SATTXTeTTAATCAAATTXATTffrACr * ÀTGACTAAAT GAAATTATTTCTTACA

»9 5 3 27 T - CTAATTTOTAaAAACAOTATAAaTTATATTAAAOTCTTTTCACATTTTTTT<3AAAíÍAC SEQUÊNCIA ID NO, 8

1 MQKLQLCVYI YLFMLXVAGP VDLNENSEQX ENVEK2GLCN ACTWRQNTKS 51 SRIEAIKIQI LSKLRLETAP NISKDVIRQL LPKAPPLREL IDQYDVQRDD 101 SSDGSLEDDD YHATTETIIT MPTESDFLMQ VDGKFKCCFF KFSSKIQTÍNK 151 WKAQLWIYL RFVETPTTVF VQILRLIKPM KDGTRYTGIR SLKLDKNPGT 201 GIWQSIDVXT VLQNWLKQPE SNLGXEIKAL DENGHDLAVT FPGPGEDGLN

251 PFLEVKVTDT PRRSRRDFGL DCDEHSTESR CCRYPLTVDF EAFGWDWIIA

301 PKRYKANYCS GECEFVFLQK YPHTHLVHQA NPRGSAGPCC TPTKMSPINM 351 LYFNGKEQII YGKIPAKVVD RCGCS* SEQUÊNCIA ID NO. 54

1 GCGGCCGCCC GGGCAGGTAT CGAAAGTTTC ACATATAAAG ATGAATAAGA 51 TCTAAGTGTA TATGTTATTG TTAATAAAGT TTTTAATTTT TCGAATGTCA 101 CAXACAGCCT TTATTATTCA TAGATTTATT CCTTTTAAGA AGTAGTCAAA 151 TGAÂTCAGCT CACCCTTGAC TGTAACAAAA TACTGTTTGG TGACTTGTGA 201 CAGACAGGGT TTTAACCTCT GACAGCGAGA TTCATTGTGG AGCAAGAGCC 251 AATCACAGAT CCCGACGACA CTTGTCTCATCAAAGTTGGA ATATAAAAAG 301 CCACTTGGAA TACAGTATAAAAGATTCACT GGTGTGGCAA GTT'GTCTCTA 351 ' GACTGGGCAG 6CATTAACGT TTGGCTTGGC GTTACTCAAA AGCAAAAGAA 4 01 AAGTAAAAGG' AAGAAGTAAG AACAAGGGAA AAGATTGTAT TGATTTTAAA 4 51 ACCATGCAAA AACTGCAAAT CTCTGTTTAT ATTTACCTAT TTATGCTGAT 501 TGTTGCTGGC CCAGTGGATC TGAATGAGAA CAGCGAGCAG AAGGAAAATG 551 TGGAAAAAGA GGGGCIGTGT AATGCATGTT TGTGGAGGGA AAACACTACA 601 TCCTCAAGAC TAGAAGCCAT AAAAATCCAA ATCCTGAGTA AACTTCGCCT 651 GGÂAACAGCT CCTAACATCA GCAAAGATGC TATCAGACAA CTTTTGCCCA 701 AGGCTCCTCC ACTCCTGGAA CTGATTGATC AGTTCGATGT CCAGAGAGAT 751 GCCAGCAGTG ACGGC7CCTT GGAAGACGAT GACTACCACG CCAGGACGGA 801 AACGGTCATT ACCATGCCCA CGGAGT/GTGA GTAGTCCTGCTGGTGCAAAG 851 CAACGACTCT GCTGACTGCT GTTCTAGTGT TCATGAAAAA CCGATCTATT 901 TTCAGGCTCT TTTAACAAGC TGCTGGCTTG TATGTAAGGA GGAGGGGAAA 951 GAGCTTTTTT CAAGATTTCA TGAGAAATAG ACCAATGAGA CTGAAAGCTG 1001 CTACTTTATT TGTTTCCTTA GAGAGCTAAA AAGCTAAAAA TÇAAAAATGA 1051 AATGCTTGCA TAGCATTCAT GTTATATAGT TTAGTATGAC AACTATAACA 1101 TGTTTATGTT TTCACAGCTT AATGCTACCA AGGTAAAGGA TTGGGAAACA 1151 GTATCAGCAA TGTGAAAAAT TTACATCAAA TTTCCTAATT’GCATTTGGTT

1201 GCCTGAAATA TSCATTTATA ATAACAGGTT TTTTTTTTTT CATTAATAAA 1251 AGAGAAAGGA AGAAATCTGT AGAGGTTGAA GCCTATCTGG GCATTTGCTG 1301 AACACTTAGA ATGACTTCTG TTATTCAAAA CTATTTCTCA TAGGGTTTTT 1351 ATGGTCTTCA CAGAGTATCT AATTTTGAAA GCTATTAGAG TGGAAAGGAT 14 01 AAAAGAATAT TCTTAATAAA CTTAATGTAT TAGTAAGAGC AATAAGGAAG 14 51 TAAACACAGC ATAGTGAAAA ATCATGAGCT AATCAGCAGA AAATTCTAAG 1501 AAATAAACAT TTTAATTACA AAGTTCCACT TATACCCTGA CCATGGTACT 1551 ATTGTTGAGA GTACCTTGTC TGGACATATC TAGGAGGCAC ATGCTTAATA 1601 ACCT7CTÀAA ATATTATTGT ATTCCTCATA GGAGGGAGAA C7ATTACCTA 1651 TATGTAGTAC CTATGTTGTT TCTGAAAGA? AATATGTTTC ATGTATTTCT 1701 GTTGCAGTCA CTTCAAACCT ATACTCAAGG AAAG6GAGAC AGGCATCTCA 1751 ACAGAGAAGG CATGACCAGA AAGAGTTTTG TGCCATGTGT CTGCGATCTT 1801 GCTTTATACA GGGCTCTACC CACTTTAAAC TGGACTCAAA ACAGTTTCAA 1851 , AATACTGCTT TTTCTTATTA'AGTAACTAGT TTATAAGGGA,ACAAATAAAT 1901 TTCCTTTAAG ACTGTGCTAT CAGATAATCC TGGAATAGAT TTGCCTTACT 1951 TATAAACAAT CTTGAGAAAA CAAAAAGGCA AGAAATTGCT AAGTGCTTCT 2001 GCTTACAATG ACAGCCTGGC CCTAAAGACA ATGTTTTCTA AGTTTTGAAA 2051 CAGCTTGAAT ACAACATCTA AGTTTTGGTG CTAATTACCT GCTAGTTTTT

See.

2101 TTATTTTTTT CCTTTAAAAG GCTGTCCCAG CGTCCTAACATAACAGATGC 2151 ACTATATTTT CTGCTAATTC CCGAGGCTCA GTTAGTTGCT CACTGTGTCT 2201 TGTCCCCAGG TAATTCAGGC CTGGGGGAAG GGTTCCTTCC TCCAGACTGA 2251 TTGGTACAGC TGCTCAGTAA GTGTAACTAC TCAGATTCCC AAAGAATTCT 2301 AAGTGGATGT TCTTCCACAG TGTCTCTTGT TCTCTCTAAT CATCATCATT 2351 TTAAAATTTC ATCCACTTTT CATTCCTTAA, TAGAATTTTC CTTAGTCCAC 2401 AGTTCTCTGG AAAGGAAGTA GGCTTCTCAT AACAGCTGAA AAAACATATA 2451 CCTAAAAGAT TCTGAAAAGC TGTAATAACT GTTATACTTG ATATTTTGCT * - 2501 gttatgaatg aaatgctaca tatttttcca ttttaaaaga ctaaatatgc

*2551' ACACATTATTCCftATTAARA AATGTTCATA GATTGATATGGAGGTGTTCG 2601 TTCATTTTTC ATAAAAATGA TCTTAGTAAC' TTTTTTTCTT ATTCATTTAI 2651 AG/CTGATCTT CTAACGCAAGTGGAAGGAAA ACCCAAATGT TGCTTCTTTA 2701 AATTTAGCTC TAAGATACAA TACAATAAAC TAGTAAAGGC CCAACTGTGG 2751 ATATATCTGA GGCCTGTCAA GACTCCTGCG ACAGTGTTTG TGCAAATCCT 2801 GAGACTCATC AAACCCATGA AAGACGGTAC AAGGTATACT GGAATCCGAT 2851 CTCTGAAACT TGACATGAAC CCAGGCACTG GTATTTGGCA GAGCATTGAT 2901 gtgaagacag TGTTGCAGAA CTGGCTCAAA CAACCTGAAT ccaacttagg 2951 CATTGAAATC AAAGCTTTAG ATGAGAATGG CCATGATCTT GCTGTAACCT 3001 TCCCAGAACC AGGAGAAGAT GGACTG/GTAA GTGATTACTGAAAATAACAT 3051 GCTAAAAACC TTGTTATGTG TTTATTCATA ATGTGAATGA ATAGTAGTGA 3101 AAAATAACTA CCAGTTTCCT GTGCTTATAA GCCAGACAAA GGCACCTTAC 3151 CCCAGTGGTA GCCCTGTACT CAATAAAAGT AG6TGTCCCA TTTCACATCC 3201 TATGAAACAC TCTCTTGATA CTTTGACTTT GCATGAGGAT TTAAAAGAAA 3251 AAAAGTTATA CCATGGTCCT TAAGTTTTTA GGGAATTCTT TGGAATTGAG 3301 AATGAAATAT AAAATGCTTT CCGTTGATGT GCTACATGAT TATATAAATA 3351 AAAACATGAA GTCTTCACAG TGGATTCTAG TACTCACCCA ACAACACATT 3401 TTTTCCCCCA GAAGAGTGAC CAATTTGTTA AAATTCTTTT GCTTAATAAG 3451 GCAGAAAAAT GAACTCTACA AGTTATAATT AAAATAAAAT GCTTTTACTT 3 501 ATAGAAATTA ACTAGATATA TGTTCAGGTT TATATACTAT TAAATATACT 3551 ATATTTAAGA TCTCTCATGA TAAATATGTT CCTTGTTTTA TAGACTATTG 3601 ATGCACTGAT GTATATGTGG ATTACTTTGT GAATTACCCC TGGTAAAATT 3651 AAAAATTTCA GGCTAGTTAA CTTGTACTAC TTAGCTATTT TCTGAACTGT 3701 CTTACTGTTC TTTAACAGGA GTTAACTTAG GTAATGTCAA CTAATTTAAT

-3751 ATAAAGTCAA ACAGAAAATA ATGCCTTATA TATTATAAAA ΆΤΤΑΑΤΑΑΑΑ 3801 AACCATTTTA AAATCTAGTA TAAGTTTAGA GCTACTCACT CTTCTGGCTT 3851 ATCTATGCTT GTATTTACTT CTGTTTTCAA AAAATTTTTT'AATG'TGACCA 3901 TACCTTTTAT TTCCAGTTAT TGATATAATT TACAACAAAÃ GAT TAT ACT? 3951 GCAAGCTTTA TAGTTTTTAA ATGGTCTTAT TTGTAGTGAA TATCATATCT 4 001 AAATGATATC TAAATGTAAA GTAAATCATA CCTAAATGAA AACATATTCT 4051 TTAAGTCATT ATAAAATTTT CCAGGTGATC AATTTTTCTT TAAATATACT 4101 ACATAAAATG TTATTGACTC CCAAAATGAT GTTATTTTGT ATAATCTTAA 4151 ATACCAATAA TTACCAGGTC. TATTTTGGTT TTAGTGTAGG ATAAAAAAGA 4201 ATGTGTTCTT TTTTCTAGGT AGCATTTTAA TGATCAAAGT TGGTGACGTG

42 51 ACAGAGGTCT TAAGTATTAT TAAACAGATG ATTAATAAGA TGTATTCCTC 4301 AGACTTTTCC ATA1AAAAGG AAAAATGTCT CAAATTCATG AAAAGATTGG

43 51 TACAGGAGGA GGATTAGCAA ATTGTAGTTT AAATATCTGA ATGGAAACAC 4401 TTTTTAGTGA AAGAATAAAG GGAATATCA? TGTATCTTCT TCTGAGTCTG 4451 TGCCTCTCTC TCTTGGAGTT AGTCTTTCCÁ ACCCTATATA CTTACCACTA 4501 TCTTCATCCC TCTACCTTCC TTTTTCCCAT TACATCTGTG CAGTACTGGG 4551 TGGCAACTÀT TGTGTTTCGG TGTTAATATC CAAGTTTCCC TGAATAAGAC 4601 CAAGTGAATG GAGGATGAAT GAGTATACCT ATCCCTCCAG GGGTCATCAG 4 651 ACATATTTAG CCACCATATT TAATCAATAA GCAGGAAGAC ATAAGCTAGC 4701 CTTGTCCTTC TTCTTTCCTC CCTGCTCCTT TCTCTTCTCT TCCCCCTCTC 4751 CCTTTACTGT CATCCATCAG TATTTTCAGA GCATCTATTA TGTGTCAGGC 4801 ATTCAGATAC TCAAACGGAG GAAAACAAGA ATAAACAAGA CAAAGATCTG 4 8 51 ACCACAGGGG AATCCCTATG GCTACTGTAG ACTTTTGAGC CATAAAGGAA 4 901 GA4.TCAAGCC TAGTGTAAAT GAAAATTCCT TAATGCTGTG CCTT^TAAAA 4951 AGAAATGTGA CATAAGCAAA ATGftTTAGTTTCTTTCTTTA ATAATGAGTC 5001 CTTGAGGTAG GAGAGTGTTT TGGGATCTATTATTAACTCT TCTTTCCTTT

5051 CCATACAG/AC TCCTTTTTTA GAAGTCAAGG TAACAGACAC ACCAAAAAGA 5101 TCTAGGAGAG ATTTTGGGCT TGATTGTGAT GAACACTCCA CAGAATCTCG 5151 ATGCTGTCGT TACCCTCTAA CTGTGGATTT TGAAGCTTTT GGATGGGATT 5201 GGATTATTGC ACCTAAAÀGA TATAAGGCCA ATTACTGCTC TGGAGAATGT 5251 GAATTTGTAT TTTTGCAAAA GTATCCTCAT ACCCATCTTG TGCÀCCAAGC 5301 AAACCCCAGA GGTTCAGCCG GCCCCTGCTG TACTCCTACA AAGATGTCTC 5351 CAAT.TAATAT GCTATATTTT AATGGCGAAG GACAAATAAT ATACGGGAAG 54 01 ATTCCAGCCA TGGTAGTAGA TCGCTGTGGGTGTTCATGAG GTCTATATTT 54 51 GGTTCATAGC TTCCTCAAAC ATGGAAGGTC TTCGCCTCAA CAATTTTGAA 5501 ACTGTGAAAT TATGTACCAC AGGCTATAAG CCTAGAGTAT GCTACAGTCA 5551 CTTAAGÇACA AGCTACAGTA ' TATGAGCTAA AAAGAGA'GAA TATATGCAAT 5601 GGTTGGCATT TAACCATCCA AACAAATCGT ATAATAAAAA GTTTTATGAT 5651 TTCCAGAGTT TTTGAACTAG GAGATCAAAT TCCATTTATG TTGAAATATA 5701 TTACAACACA TGCAGGTGAA TGAAAGCAAT TCTCCTTGTC TTCTGGTGAA 5751 TTAAAGGAGT ATGCTTTAAA ATCTATTTCT CTACAGTTTC

LISTA DE SEQUÊNCIAS LISTA DE SEQUÊNCIAS

<110> UNIVERSITY OF LIEGE

<120> MUSCULATURA DUPLA EM MAMÍFEROS <130> C2087 EP/1 S3 <150> EP 98 93 5228.1 <151> 14-07-1998 <150> US 19970891789 <151> 14-07-1997 <15Ο> US 19980007761 <151> 15-01-1998 <160> 54 <170> Patentln ver. 2.0 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°: 1 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 1196 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 1 AGGAAAAAGT AAGAACAAGG GAAAAGATTG TATTGAIΤΪΤ AAAACC ATG CAA AAA 55

Met Gin Lys 1 CTG CAA ATC TCT GTT TAT ATT TAC CTA TTT ATG CTG ATT GTT GCT GGC 103

Leu Gin lie ser vai Tyr lie Tyr Leu Phe Met Leu Ile Vai Ala Gly S 10 15 CCA GTG GAT CTG AAT GAG AAC AGC GAG CAG AAG GAA AAT GTG CAA AAA 151

Pro val Asp Leu Asn Glu Asn ser Glu Gin Lys Glu Asn vai Glu Lys 20 25 30 35 GAG GGG CTG TGT AAT GCA TGT TTG TGG AGG GAA AAC ACT ACA TCC TCA 199

Glu Gly Leu Cys Asn Ala Cys Leu Trp Arg Glu Asn Thr Thr Ser Ser 40 45 50 AGA CTA GAA GCC ATA AAA ATC CAA ATC CTC AGT AAA CTT CGC CTG GAA 247

Arg Leu Glu Ala'lle Lys lie Gin lie Leu ser Lys Leu Arg Leu Glu 55 60 65 ACA GCT CCT AAC ATC AGC AAA GAT GCT ATC AGA CAA CTT TTG CCC AAG 295

Thr Ala pro Asn ile ser Lys Asp Ala lie Arg Gin Leu Leu Pro Lys > 70 75 80 GCT CCT CCA CTC CTG GAA CTG ATT GAT CAG TTC GAT GTC CAG AGA GAT 343

Ala Pro Pro Leu Leu Glu Leu Ile Asp Gin Phe Asp val Gin Arg Asp 85 90 95 GCC AGC AGT GAC GGC TCC TTG GAA GAC GAT GAC TAC CAC GCC AGG ACG 391

Ala Ser Ser Asp Gly Ser Leu Glu Asp Asp Asp Tyr his Ala Arg Thr 100 105 110 115 GAA ACG GTC ATT ACC ATG CCC ACG GAG TCT GAT CTT CTA ACG CAA GTG 439

Glu Thr val lie Thr Met Pro Thr Glu Ser Asp Leu Leu Thr Gin val 120 125 130 GAA GGA AAA CCC AAA TGT TGC TTC TTT AAA TTT AGC TCT AAG ATA CAA 491

Glu Gly Lys Pro Lys Cys Cys Phe Phe Lys Phe Ser Ser Lys lie Gin IB 5 140 145 TAC AAT AAA CTA GTA AAG GCC CAA CTG TGG ATA TAT CTG AGG CCT GTC 539

Tyr Asn Lys Leu Val Lys Ala Gin Leu Trp lie Tyr Leu Arg pro Val 150 155 160 AAG ACT CCT GCG ACA GTG TTT GTG CAA ATC CTG AGA CTC ATC AAA CCC 583

Lys Thr Pro Ala Thr Val Phe val Gin lie Leu Arg Leu lie Lys Pro 165 170 175 ATG AAA GAC GGT ACA AGG TAT ACT GGA ATC CGA TCT CTG AAA CTT GAC 631

Met Lys Asp Gly Thr Arg Tyr Thr Gly lie Arg ser Leu Lys Leu Asp 180 185 190 195 ATG AAC CCA GGC ACT GGT ATT TGG CAG AGC ATT GAT GTG AAG ACA GTG 679

Met Asn Pro Gly Thr Gly lie Trp Gin Ser lie Asp val Lys Thr val 200 205 210 TTG CAG AAC TGG CTC AAA CAA CCT GAA TCC AAC TTA GGC ATT GAA ATC 727

Leu Gin Asn Trp Leu Lys Gin Pro Glu Ser Asn Leu Gly lie Glu lie 215 220 225 AAA GCT TTA GAT GAG AAT GGC CAT GAT CTT GCT GTA ACC TTC CCA GAA 775

Lys Ala Leu Asp Glu Asn Gly His Asp Leu Ala Val Thr Phe Pro Glu 230 235 240 CCA GGA GAA GAT GGA CTG ACT CCT TTT TTA GAA GTC AAG GTA ACA GAC 823

Pro Gly Glu Asp Gly Leu Thr Pro Phe Leu Glu Val Lys Val Thr Asp 245 250 255 ACA CCA AAA AGA TCT AGG AGA GAT TTT GGG CTT GAT TGT GAT GAA CAC 871

Thr Pro Lys Arg ser Arg Arg Asp Phe Gly Leu Asp Cys Ásp Glu His 260 265 270 275 TCC ACA GAA TCT CGA, TGC TGT CGT TAC CCT CTA ACT GTG GAT TTT GAA 919

Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys Arg Tyr Pro Leu Thr Val Asp Phe Glu 280 285 290 GCT TTT GGA TGG GAT TGG ATT ATT GCA CCT AAA AGA TAT AAG GCC AAT 967

Ala Phe Gly Trp Asp Trp lie lie Ala Pro Lys Arg Tyr Lys Ala Asn 295 300 305 TAC TGC TCT GGA GAA TGT GAA TTT GTA TTT TTG CAA AAG TAT CCT CAT 1015

Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu Phe val Phe Leu Gin Lys Tyr Pro His 310 315 320 ACC CAT CTT GTG CAC CAA GCA AAC CCC AGA GGT TCA GCC GGC CCC TGC 1063

Thr His Leu val His Gin Ala Asn pro Arg Gly ser Ala Gly Pro Cys 325 330 335 TGT ACT CCT ACA AAG ATG TCT CCA ATT AAT ATG CTA TAT TTT AAT GGC 1111

Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser Pro lie Asn Met Leu Tyr Phe Asn Gly 340 345 350 355 GAA GGA CAA ATA ATA TAC GGG AAG ATT CCA GCC ATG GTA GTA GAT CGC 1159

Glu Gly Gin lie lie Tyr Gly Lys lie Pro Ala Met Val Val Asp Arg 360 365 370 TGT GGG TGT TCA TGAGTCTATA TTTGGGTTCA TAAGC 1196 cys Gly Cys ser 375 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°: 2 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) LONGITUDE: 375 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (Xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 2

Met Gin Lys Leu Gin lie ser val Tyr lie Tyr Leu Phe Met Leu . Lle. 15 10 15

Val Ala Gly Pro Val Asp Leu Asn Glu Asn Ser Glu Gin Lys Glu Asn 20 25 30 val Glu Lys Glu,Gly Leu cys Asn Ala Cys Leu Trp Arg Glu Asn Thr 35 . 40 45

Thr ser ser Arg Leu Glu Ala lie Lys lie Gin lie Leu Ser Lys Leu 50 55 60

Arg Leu Glu Thr Ala Pro Asn lie Ser Lys Asp Ala lie Arg Gin Leu 65 70 75 80

Leu Pro Lys Ala Pro Pro Leu Leu Glu Leu lie Asp Gin Phe Asp val 85 90 95

Gin Arg Asp Ala Ser Ser Asp Gly Ser Leu Glu Asp Asp Asp Tyr His 100 105 110

Ala Arg Thr Glu Thr val lie Thr Met Pro Thr Glu Ser Asp Leu Leu 115 120 125

Thr Gin val Glu Gly Lys Pro Lys cys Cys Phe Phe Lys Phe Ser ser 130 135 140

Lys lie Gin Tyr Asn Lys Leu val Lys Ala Gin Leu Trp lie Tyr Leu 145 150 155 160

Arg Pro val Lys Thr Pro Ala Thr val Phe val Gin lie Leu Arg Leu 165 170 175 lie Lys Pro Met Lys Asp Gly Thr Arg Tyr Thr Gly lie Arg Ser Leu 180 185 190

Lys Leu Asp Met Asn Pro Gly Thr Gly lie Trp Gin ser lie Asp Val 195 200 205

Lys Thr val Leu Gin Asn Trp Leu Lys Gin Pro Glu Ser Asn Leu Gly 210 215 220 lie Glu lie Lys Ala Leu Asp Glu Asn Gly His Asp Leu Ala val Thr 225 230 235 240

Phe Pro Glu Pro Gly Glu Asp Gly Leu Thr Pro Phe Leu Glu val Lys 245 250 255 val Thr Asp Thr Pro Lys Arg ser Arg Arg Asp Phe Gly Leu Asp Cys 260 265 270

Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys Arg Tyr Pro Leu Thr Val 275 280 285

Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp lie lie Ala pro Lys Arg Tyr 290 295 300

Lys Ala Asn Tyr cys Ser Gly Glu Cys Glu Phe Val Phe Leu Gin Lys 305 310 315 320

Tyr Pro His Thr His Leu Val His Gin Ala Asn Pro Arg Gly Ser Ala 325 330 335

Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser Pro lie Asn Met Leu Tyr 340 345 350

Phe Asn Gly Glu Gly Gin lie lie Tyr Gly Lys lie Pro Ala Met val 355 360 365

Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser 370 375 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°: 3 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) LONGITUDE: 1240 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 3 AGGAAAAAGT AAGAACAAGG GAAAAGATTG TATTGATTTT AAAACC ATG CAA AAA 55

Met Gin Lys 1 CTG CAA ATC TCT GTT TAT ATT TAC CTA TTT ATG CTC ATT GTT GCT GGC 103

Leu Gin lie ser val Tyr lie Tyr Leu Phe Met Leu lie val Ala Gly 5 10 15 CCA GTG GAT CTG AAT GAG AAC AGC GAG CAG AAG GAA AAT GTG GAA AAA 151

Pro Val Asp Leu Asn Glu Asn ser Glu Gin Lys Glu Asn val Glu Lys 20 25 30 35 GAG GGG CTG TGT AAT GCA TGT TTG TGG AGG GAA AAC ACT ACA TCC TCA 199

Arg Leu Glu Ala lie Lys lie Gin lie Leu ser Lys Leu Arg Leu Glu 55 60 65 ACA GCT CCT AAC ATC AGC AAA GAT GCT ATC AGA CAA CTT TTG CCC AAG 295

Thr Ala Pro Asn lie ser Lys Asp Ala lie Arg Gin Leu Leu Pro Lys 70 75 80 GCT CCT CCA CTC CTG GAA CTG ATT GAT CAG TTC GAT GTC CAG AGA GAT 343

Ala Pro Pro Leu Leu Glu Leu lie Asp Gin Phe Asp val Gin Arg Asp 85 90 95 GCC AGC AGT GAC GGC TCC TTG GAA GAC GAT GAC TAC CAC GCC AGG ACG 391

Glu Thr val lie Thr Met Pro Thr Glu ser Asp Leu Leu Thr Gin val 120 125 130 GAA GGA AAA CCC AAA TGT TGC TTC TTT AAA TTT AGC TCT AAG ATA CAA 487

Glu Gly Lys Pro Lys Cys Cys Phe Phe Lys Phe Ser Ser Lys lie Gin 135 140 145 TAC AAT AAA CTA GTA AAG GCC CAA CTG TGG ATA TAT CTG AGG CCT GTC 535

Tyr Asn Lys Leu val Lys Ala Gin Leu Trp lie Tyr Leu Arg Pro val 150 155 160 AAG ACT CCT GCG ACA GTG TTT GTG CAA ATC CTC AGA CTC ATC AAA CCC 583

Lys Thr Pro Ala Thr val Phe val Gin lie Leu Arg Leu lie Lys Pro 16S 170 175 ATG AAA GAC GGT ACA AGG TAT ACT GGA ATC CGA TCT CTG AAA CTT GAC 631

Pro Gly Glu Asp Gly Leu Thr Pro Phe Leu Glu Val Lys val Thr Asp 245 250 255 ACA CCA AAA AGA TCT AGG AGA GAT TTT GGG CTT GAT TGT GAC AGA ATC 871

Thr Pro Lys Arg ser Arg Arg Asp Phe Gly Leu Asp Cys Asp Arg lie 260 265 270 275 TCG ATG CTG TCG TTA CCC TCT AAC TGT GGA TTT TGAAGCTTTT 914 ser Met Leu Ser Leu Pro ser Asn cys Gly Phe 280 285 GGATGGGATT GGATTATTGC ACCTAAAAGA TATAAGGCCA ATTACTGCTC TGGAGAATGT 974 GAATTTGTAT TTTTGCAAAA GTATCCTCAT ACCCATCTTG TGCACCAAGC AAACCCCAGA 1034 GGTTCAGCCG GCCCCTGCTG TACTCCTACA AAGATGTCTC CAATTAATAT GCTATATTTT 1094 AATGGCGAAG GACAAATAAT ATACGGGAAG ATTCCAGCCA TGGTAGTAAA TCGCTGTGGG 1154 TGTTCATGAG GTCTATATTT GGTTCATAGC TTCCTCAAAC ATGGAAGGTC TTCCCCTCAA 1214 CAAI I I IGAA ACTGTTGAAA TTATGT 1240 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°: 4 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) LONGITUDE: 286 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 4

Met Gin Lys Leu Gin lie Ser val Tyr lie Tyr Leu Phe Met Leu lie 15 10 15 val Ala Gly Pro val Asp Leu Asn Glu Asn Ser Glu Gin Lys Glu Asn 20 25 30 val Glu Lys Glu Gly Leu Cys Asn Ala Cys Leu Trp Arg Glu Asn Thr 35 40 45

Thr Ser Ser Arg Leu Glu Ala lie Lys lie Gin lie Leu Ser Lys Leu 50 55 60

Arg Leu Glu Thr Ala Pro Asn lie Ser Lys Asp Ala lie Arg Gin Leu 65 70 75 80

Leu Pro Lys Ala Pro Pro Leu Leu Glu Leu lie Asp Gin Phe Asp Val 85 90 95

Gin Arg Asp Ala Ser Ser Asp Gly Ser Leu Glu Asp Asp Asp Tyr His 100 105 110

Ala Arg Thr Glu Thr val lie Thr Met pro Thr Glu Ser Asp Leu Leu 115 120 125

Thr Gin val Glu Gly Lys pro Lys Cys Cys Phe Phe Lys Phe ser ser 130 135 140

Lys lie Gin Tyr Asn Lys Leu val Lys Ala Gin Leu Trp lie Tyr Leu 145 150 155 160

Lys Leu Asp Met Asn Pro Gly Thr Gly lie Trp Gin Ser lie Asp Val 195 200 205

Asp Arg lie Ser Met Leu Ser Leu Pro Ser Asn Cys Gly Phe 275 280 285 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°: 5 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) LONGITUDE: 2676 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 5 GTCTCTCGGA CGGTACATGC ACTAATATTT CACTTGGCAT TACTCAAAAG CAAAAAGAAG 60 AAATAAGAAC AAGCGAAAAA AAAAGATTGT GCTGAII I I I AAA ATG ATG CAA AAA 115

Met Met Gin Lys 1 CTG CAA ATG TAT GTT TAT ATT TAC CTC TTC ATG CTG ATT GCT GCT GGC 163

Leu Gin Met Tyr Val Tyr lie Tyr Leu Phe Met Leu lie Ala Ala Gly 5 10 15 20 CCA GTG GAT CTA AAT GAG GGC AGT GAG AGA GAA GAA AAT GTG GAA AAA 211 pro Val Asp Leu Asn Glu Gly ser Glu Arg Glu Glu Asn val Glu Lys 25 30 35 GAG GGG CTG TGT AAT GCA TGT GCG TGG AGA CAA AAC ACG AGG TAC TCC 259

Glu Gly Leu Cys Asn Ala Cys Ala Trp Arg Gin Asn Thr Arg Tyr ser 40 45 50 AGA ATA GAA GCC ATA AAA ATT CAA ATC CTC AGT AAG CTG CGC CTG GAA 307

Arg lie Glu Ala lie Lys lie Gin lie Leu ser Lys Leu Arg Leu Glu 55 60 65 AC A GCT CCT AAC ATC AGC AAA GAT GCT ATA AGA CAA CTT CTG CCA AGA 35 5

Thr Ala Pro Asn lie Ser Lys Asp Ala lie Arg Gin Leu Leu Pro Arg 70 75 80 GCG CCT CCA CTC CGG GAA CTG ATC GAT CAG TAC GAC GTC CAG AGG GAT 403

Ala Pro Pro Leu Arg Glu Leu lie Asp Gin Tyr Asp val Gin Arg Asp 85 90 95 100 GAC AGC AGT GAT GGC TCI TTG GAA GAT GAC GAT TAT CAC GCT ACC ACG 451

Asp Ser ser Asp Gly Ser Leu Glu Asp Asp Asp Tyr His Ala Thr Thr 105 110 115 GAA ACA ATC ATT ACC ATG CCT ACA GAG TCT GAC TTT CTA ATG CAA GCG 499

Glu Thr lie lie Thr Met Pro Thr Glu Ser Asp Phe Leu Met Gin Ala 120 125 130 GAT GGC AAG CCC AAA TGT TGC TTT TTT AAA TTT AGC TCT AAA ATA CAG 547

Asp Gly Lys pro Lys Cys Cys Phe Phe Lys Phe ser ser Lys lie Gin 135 140 145 TAC AAC AAA GTA GTA AAA GCC CAA CTG TGG ATA TAT CTC AGA CCC GTC 595

Tyr Asn Lys val val Lys Ala Gin Leu Trp lie Tyr Leu Arg Pro val 150 155 160 AAG ACT CCT ACA ACA GTG TTT GTG CAA ATC CTG AGA CTC ATC AAA CCC 643

Lys Thr Pro Thr Thr val Phe val Gin lie Leu Arg Leu lie Lys pro 165 170 175 180 ATG AAA GAC GGT ACA AGG TAT ACT GGA ATC CGA TCT CTG AAA CTT GAC 691

Met Lys Asp Gly Thr Arg Tyr Thr Gly lie Arg Ser Leu Lys Leu Asp 185 190 195 Λ T/- --/- A --/-y. » /—1- AW AW AW w/· a 1 y wy Μ I U nuv. UUU Ml. 1 uu I Mil I ΰυ LHO MU I MI I UH t UIU MM 13 Ml_M 13 I 13 / J 3»

Met Ser pro Gly Thr Gly lie Trp Gin ser lie Asp val Lys Thr val 200 205 210 TTG CAA AAT TGG CTC AAA CAG CCT GAA TCC AAC TTA GGC ATT GAA ATC 787

Leu Gin Asn Trp Leu Lys Gin Pro Glu ser Asn Leu Gly lie Glu lie 215 220 225 AAA GCT TTG GAT GAG AAT GGC CAT GAT CTT GCT GTA ACC TTC CCA GGA 835

Lys Ala Leu Asp Glu Asn Gly His Asp Leu Ala val Thr Phe Pro Gly 230 235 240 CCA GGA GAA GAT GGG CTG AAT CCC TTT TTA GAA GTC AAG GTG ACA GAC 883

Pro Gly Glu Asp Gly Leu Asn Pro Phe Leu Glu Val Lys Val Thr Asp 245 250 255 260 ACA CCC AAG AGG TCC CGG AGA GAC TTT GGG CTT GAC TGC GAT GAG CAC 931

Thr Pro Lys Arg ser Arg Arg Asp Phe Gly Leu Asp cys Asp Glu His 265 270 275 TCC ACG GAA TCC CGG TGC TGC CGC TAC CCC CTC ACG GTC GAT TTT GAA 979

Ser Thr Glu ser Arg Cys cys Arg Tyr Pro Leu Thr val Asp Phe Glu 280 285 290 GCC TTT GGA TGG GAC TGG ATT ATC GCA CCC AAA AGA TAT AAG GCC AAT 1027

Ala Phe Gly Trp Asp Trp lie lie Ala Pro Lys Arg Tyr Lys Ala Asn 295 300 305 TAC TGC TCA GGA GAG TGT GAA TTT GTG TTT TTA CAA AAA TAT CCG CAT 1075

Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu Phe Val Phe Leu Gin Lys Tyr Pro His 310 315 320 ACT CAT CTT GTG CAC CAA GCA AAC CCC AGA GGC TCA GCA GGC CCT TGC 1123

Thr His Leu Val His Gin Ala Asn Pro Arg Gly Ser Ala Gly Pro Cys 325 330 335 340 TGC ACT CCG ACA AAA ATG TCT CCC ATT AAT ATG CTA TAT TTT AAT GGC 1171

Cys Tbr Pro Thr Lys Met Ser Pro lie Asn Met Leu Tyr Phe Asn Gly . 345 350 355 AAA GAA CAA ΑΤΑ ATA TAT GGC AAA ATT CCA GCC ATG GTA GTA GAC CGC 1219

Lys Glu Gin lie lie Tyr Gly Lys lie Pro Ala Met Val val Asp Arg 360 365 370 TGT GGG TGC TCA TGAGCTTTGC ATTAGGTTAG AAACTTCCCA AGTCATGGAA 1271 cys Gly Cys ser 375. GGTCTTCCCC TCAATTTCGA AACTGTGAAT TCAAGCACCA CAGGCTGTA6 GCCTTGAGTA 1331 TGCTCTACTA ACGTAAGCAC AAGCTACAGT GTATGAACTA AAAGAGAGAA TAGATGCAAT 1391 GGTTGGCATT CAACCACCAA AATAAACCAT ACTATAGGAT GTTGTAT6AT TTCCAGAGTT 1451 TTTGAAATAG ATGGAGATCA AATTACATTT ATGTCCATAT ATGTATATTA CAACTACAAT 1511 CTAGGCAAGG AAGTGAGAGC ACATCTTGTG GTCTGCTGAG TTAGGAGGGT ATGATTAAAA 1571 GGTAAAGTCT TATTTCCTAA CAGTTTCACT TAATATTTAC AGAACAATÇT ATATGTAGCC 1631 TTTGTAAAGT GTAGGATTGT TATCATTTAA AAACATCATG TACACTTATA TTTGTATTGT 1691 ATACTTGGTA AGATAAAATT CCACAAAGTA GGAATGGGGC CTCACATACA CATTGCCATT 1751 CCTATTATAA TTGGACAATC CACCACGGTG CTAATGCAGT GCTCAATGGC TCCTACTGGA 1811 CCTCTCGATA GAACACTCTA CAAAGTACGA GTCTCTCTCT CCCTTCCAGG TGCATCTCCA 1871 CACACACAGC ACTAAGTGTT CAATGCATTT TCTTTAAGGA AAGAAGAATC IT 1 ITTTCTA 1931 GAGGTCAACT TTCAGTCAAC TCTAGCACAG C6GGAGTGAC TGCTGCATCT TAAAAGGCAG 1991 CCAAACAGTA TTCATTTTTT AATCTAAATT TCAAAATCAC TGTCTGCCTT TATCACATGG 2051 CAATTTTGTG GTAAAATAAT GGAAATGACT GGTTCTATCA ATATTGTATA AAAGACTCTG 2111 AAACAATTAC ATTTATATAA TATGTATACA ATATTGTTTT GTAAATAAGT GTCTCCI Π I 2171 ATATTTACTT TGGTATATTT TTACACTAAT GAAATTTCAA ATCATTAAAG TACAAAGACA 2231 TGTCATGTAT CACAAAAAAG GTGACTGCTT CTATTTCAGA GTGAATTAGC AGATTCAATA 2291 GTGGTCTTAA AACTCTGTAT GTTAAGATTA GAAGGTTATA TTACAATCAA TTTATGTATT 2351 TTTTACATTA TCAACTTATG GTTTCATGGT GGCTGTATCT ATGAATGTGG CTCCCAGTCA 2411 AATTTCAATG CCCCACCATT TTAAAAATTA CAAGCATTAC TAAACATACC AACATGTATC 2471 TAAAGAAATA CAAATATGGT ATCTCAATAA CAGCTACTTT TTTAI I I 1 AT AATTTGACAA 2531 TGAATACATT TCTTTTATTT ACTTCAGTTT TATAAATTGG AACTTTGTTT ATCAAATGTA 2591 TTGT ACT CAT AGCTAAATGA AATTATTTCT TACATAAAAA TGTGTAGAAA CTATAAATTA 2651 AAGTGTTTTC ACAI I II IGA AAGGC 2676 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°: 6 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) LONGITUDE: 376 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 6

Met Met Gin Lys Leu Gin Met Tyr val Tyr lie Tyr Leu Phe Met Leu 15 10 15 lie Ala Ala Gly Pro val Asp Leu Asn Glu Gly Ser Glu Arg Glu Glu 20 25 30

Asn val Glu Lys Glu Gly Leu Cys Asn Ala Cys Ala Trp Arg Gin Asn 35 40 45

Thr Arg Tyr ser Arg lie Glu Ala lie Lys lie Gin lie Leu Ser Lys 50 55 60

Leu Arg Leu Glu Thr Ala Pro Asn lie Ser Lys Asp Ala lie Arg Gin 65 70 75 80

Leu Leu Pro Arg Ala Pro Pro Leu Arg Glu Leu lie Asp Gin Tyr Asp 85 90 95 val Gin Arg Asp Asp Ser Ser Asp Gly Ser Leu Glu Asp Asp Asp Tyr 100 105 110

His Ala Thr Thr Glu Thr lie lie Thr Met Pro Thr Glu Ser Asp Phe 115 120 125

Leu Met Gin Ala Asp Gly Lys Pro Lys Cys Cys Phe Phe Lys Phe Ser 130 135 140 ser Lys lie Gin Tyr Asn Lys val val Lys Ala Gin Leu Trp lie Tyr 145 150 155 160

Leu Arg pro val Lys Thr Pro Thr Thr val Phe val Gin lie Leu Arg 165 170 175

Leu lie Lys Pro Met Lys Asp Gly Thr Arg Tyr Thr Gly lie Arg Ser 180 185 190

Leu Lys Leu Asp Met Ser Pro Gly Thr Gly lie Trp Gin Ser lie Asp 195 200 205 val Lys Thr val Leu Gin Asn Trp Leu Lys Gin Pro Glu Ser Asn Leu 210 215 220

Gly lie Glu lie Lys Ala Leu Asp Glu Asn Gly His Asp Leu Ala val 225 230 235 240

Thr Phe Pro Gly Pro Gly Glu Asp Gly Leu Asn Pro Phe Leu Glu val 245 250 255

Lys Val Thr Asp Thr Pro Lys Arg Ser Arg Arg Asp Phe Gly Leu Asp 260 265 270

Cys Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg cys Cys Arg Tyr Pro Leu Thr 275 280 285

Val Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp lie lie Ala Pro Lys Arg 290 295 300

Tyr Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu Phe Val Phe Leu Gin 305 310 315 320

Lys Tyr pro His Thr His Leu val His Gin Ala Asn Pro Arg Gly ser 325 330 335

Ala Gly Pro Cys Cys Thr pro Thr Lys Met Ser Pro lie Asn Met Leu 340 345 350

Tyr phe Asn Gly Lys Glu Gin lie lie Tyr Gly Lys lie Pro Ala Met 355 360 365 val val Asp Arg cys Gly c^s Ser (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°: 7 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) LONGITUDE: 2215 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 7 NGATTTTCTA ATGCAAGTGG ATGGAAAACC CAAATGTTGC TTCTTTAAAT TTAGCTCTAA 60 AATACAATAC AATAAAGTAG TAAAGGCCCA ÂCTATCCATA TATTTGAGAC CCGTCGAGAC 120 TCCTACAACA GTGTTTGTGC AAATCCTGAG ACTCATCAAA CCTATGAAAG ACGGTACAAG 180 GTATCTGGAA TCCGATCTCT GAAACTTGAC ATGAACCCAG GCACTGGTAT TTGGGCAGAN 240 ATTGATGTGA AGACACTGTT GCAAAATTGG CTCAAACAAC CTGAATCCAA CTTAGGCATT 300 GAAATAAAAG CTTTACATGA GAATGGTCAT GATCTTGCTG TAACCTTCCC AGGACCAGGA 360 AGAAGATGGG CTGAATCCCT TTTTTAAGAA GGTCAAGGTA ACAGACACAC CAAAAAGATT 420 CCAGAAGGGA TTTTGGGTCT TGACTGGTGA TGAGCACTCA ACAGAATCAC gatcctgtCG 480 TTACCCCCTA ACTGGTGGAT TTTGAAGCCT TTGGGATGGG ATTGGATATC GNNNNNNNNN 540 NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN 600 NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN 660 NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN 720 NNNNNNNNNN NA6CGATGGT AGTAGACCGC TGTGGGTGCT CAGCGATGGT AGTAGACCGC 780 TGTGGGTGCT CTTTTCAAGC TGTGAAATTA AGTACCACAG GCTATAGGCC TAGAGTATGC 840 TACAGTCACT TAAGCATAAG CTACAGTATG TAAACTAAAA GGGGGAANGG GAATATATGC 900 AATGGTTGGC ATTTAACCAT CCAAACAAAT CATACCAGAA AGTTTTATGA TTTCCANAGT 960 till!NAGGC NAGAAAGGAG GAGTCAAANT TTCANTCTTA TGGTNNNNNN NNNNNNNNNN 1020 NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN 1080 NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN 1140 NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNATTTCG GCACAGGTNA AACACTTGAA 1200 TTTATATTGT ATGGTAGTAT ACTTGGTAAG ATAAAATTCC ACAAAAATAG GGATGGTGCA 1260 GCATATGCAA TTTCCATTCC TATTATAATT GACACAGTAC ATTAACAATC CATGCCAACG 1320 GTGCTAATAC GATAGGCTGA NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN 1380 NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN 1440 NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN 1500 NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN 1560 NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN 1620 NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN 1680 NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN 1740 NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN 1800 NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN 1860 NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN 1920 TAAATCTCAA CGTTCCATTA TTTTAATACT TGCAAAAACA TTACTAAGTA TACCAAAATA 1980 ATTGACTCTA TTATCTGAAA TGAAGAATAA ACTGATGCTA TCTCAACAAT AACTGTTACT 2040 TTTATTTTAT AATTTGATAA TGAATATATT TCTGCATTTA TTTACTTCTG TTTTGTAAAT 2100 TGGGATTTTG TTAATCAAAT TTATTGTACT ATGACTAAAT GAAATTATTT CTTACATCTA 2160 ATTTGTAGAA ACAGTATAAG TTATATTAAA GTGTTTTCAC AI I I I I I IGA AAGAC 2215 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°: 8 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) LONGITUDE: 375 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 8

Met Gin Lys Leu Gin Leu Cys val Tyr lie Tyr Leu Phe wet Leu lie l 5 10 15

Val Ala Gly Pro Val Asp Leu Asn Glu Asn Ser Glu Gin Lys Glu Asn 20 25 30

Val Glu Lys Glu Gly Leu cys Asn Ala cys Thr Trp Arg Gin Asn Thr 35 40 45

Lys Ser Ser Arg lie Glu Ala lie Lys lie Gin lie Leu ser Lys Leu 50 55 60

Arg Leu Glu Thr Ala Pro Asn lie Ser Lys Asp Val lie Arg Gin Leu 65 70 75 80

Leu Pro Lys Ala Pro Pro Leu Arq Glu Leu lie Asp Gin Tyr Asp val 85 90 95

Gin Arg Asp Asp ser ser Asp Gly ser Leu Glu Asp Asp asp Tyr His 100 105 110

Ala Thr Thr Glu Thr lie lie Thr Met Pro Thr Glu Ser Asp Phe Leu 115 120 125

Met Gin val Asp Gly Lys Pro Lys cys cys Phe Phe Lys Phe ser ser 130 135 140

Lys lie Gin Tyr Asn Lys Val val Lys Ala Gin Leu Trp lie Tyr Leu 145 150 155 160

Arg pro val Glu Thr Pro Thr Thr val Phe val Gin He Leu Arg Leu 165 170 , 175 lie Lys pro Met Lys Asp Gly Thr Arg Tyr Thr Gly lie Arg ser Leu 180 185 190

Lys Leu Asp Met Asn Pro Gly Thr Gly lie Trp Gin Ser lie Asp Val 195 200 205

Phe Pro Gly Pro Gly Glu Asp Gly Leu Asn Pro Phe Leu Glu Val Lys 245 250 255

Val Thr Asp Thr pro Lys Arg Ser Arg Arg Asp Phe Gly Leu Asp Cys 260 265 270

Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys Arg Tyr Pro Leu Thr val 275 280 285

Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp lie lie Ala Pro Lys Arg Tyr 290 295 300

Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu Phe val Phe Leu Gin Lys 305 310 315 320

Tyr Pro His Thr His Leu Val His Gin Ala Asn Pro Arg Gly Ser Ala 325 330 335

Gly Pro Cys cys Thr Pro Thr Lys Met ser Pro lie Asn Met Leu Tyr 340 345 350

Phe Asn Gly Lys Glu Gin lie lie Tyr Gly Lys lie Pro Ala Met Val 355 360 365 val Asp Arg Cys Gly Cys Ser 370 375 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°: 9 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) LONGITUDE: 22 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 9 GGCCCAACTA TGGATATATT TG 22 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°: 10 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) LONGITUDE: 21 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 10 GGTCCTGGGA AGGTTACAGC A 21 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°: 11 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) LONGITUDE: 11 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 11 ATGAACACTC C 11 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°: 12 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) LONGITUDE: 26 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 12 CAGCAAAGTC CTTAATGGTA ACAAGC 26 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°: 13 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) LONGITUDE: 23 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (Xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 13 GGGTCACTGA AGAAAACGTC CTG 23 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°: 14 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) LONGITUDE: 23 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 14 CCCCATATTA TGGAGATGAA CCG 23 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°: 15 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) LONGITUDE: 23 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 15 AGTTCAGGAT GGCAGAATTT CAG 23 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°: 16 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) LONGITUDE: 23 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 16 GCAAACTGGG YGGRAGCAAG ACC 23 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°: 17 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) LONGITUDE: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (Xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 17 TTSTTCCTGG GCTTTTATTG AGAC 24 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°: 18 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) LONGITUDE: 26 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 18 AAGCCWGAT TTCTGCTTYT TGGAAG 26 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°: 19 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) LONGITUDE: 25 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 19 TGCCMAGGCA HCCRCCRTAC TTGAA 25 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°: 20 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) LONGITUDE: 19 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 20 GGTCGTCCTA CACCAGAAG19 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°: 21 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) LONGITUDE: 22 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (Xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 21 GGTTGACATT GTCAAGAACA AG 22 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°: 22 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) LONGITUDE: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 22 TCTCMAAAGT CGTCTGTGAC AATC 24 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°: 23 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) LONGITUDE: 23 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 23 TGYTCRTTTT CTTTCAGAGT TGC 23 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°: 24 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) LONGITUDE: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADEIA: simples (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 24 RCTGGTCCT CTTCACCTCA GAAC 24 (D) TOPOLOGIA: linear (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°: 25 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) LONGITUDE: 23 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 25 ACATTGTCVG TTCCAAAGCC AAG 23 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°: 26 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) LONGITUDE: 21 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 26 AGGTYCGGGT GACDGTGCTK C 21 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°: 27 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) LONGITUDE: 23 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 27 TGGRTACATG AGYTCCACCT TGC 23 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°: 28 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) LONGITUDE: 23 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 28 AGCTGCARGT ATWCCTACAA YCT 23 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°: 29 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) LONGITUDE: 23 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 29 GTYCCRTTGC TCYTCTCRTT GYC 23 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°: 30 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) LONGITUDE: 25 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 30 AACTGTATAT TGAGAGCCTA CCATG 25 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°: 31 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) LONGITUDE: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 31 CACACCTTAG CGACTAAACC ACCA 24 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°: 32 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) LONGITUDE: 25 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 32 CTACCTAACA GAATGATTTT GTAAG 25 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°: 33 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) LONGITUDE: 25 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 33 AGTGTTCTTG CCTAGAGAAT CCCAG 25 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°: 34 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) LONGITUDE: 25 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 34 ACATTCTCTC ACCAATATGA CATAC 25 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°: 35 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) LONGITUDE: 25 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 35 TAAGTCACCA TTACATCCTT AGAAC 25 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°: 36 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) LONGITUDE: 25 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 36 GCTGTAAGAA TCTTCATTAA GCACT 25 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°: 37 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) LONGITUDE: 25 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 37 CCTGATACAT GCTAAGGTTA AAAAC 25 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°: 38 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) LONGITUDE: 25 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 38 AGGCATACAT CTGGAGAGAA ACATG 25 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°: 39 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) LONGITUDE: 25 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 39 CAGAGGAGCC TAGCAGGCTA CCGTC 25 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°: 40 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) LONGITUDE: 25 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 40 CAGCAGGTCT GTTGAAGTGT ATCAG 25 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°: 41 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) LONGITUDE: 25 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 41 AGTGGTAGCA TTCACAGGTA GCCAG 25 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°: 42 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) LONGITUDE: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 42 CAGTCCATGG CACCATAAAG 20 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°: 43 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) LONGITUDE: 22 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 43 TCCGTTAGTA CTGGCTAATT GC 22 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°: 44 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) LONGITUDE: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 44 CTGAATTGGC TCCAAAGGCC 20 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°: 45 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) LONGITUDE: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 45 AAACAGAAGT CCAGGGCTGC 20 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°: 46 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) LONGITUDE: 21 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 46 TCAGTCTCCA GGAGAGAAAA C 21 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°: 47 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) LONGITUDE: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 47 CTCTGCCCTG GGGATGATTG 20 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°: 48 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) LONGITUDE: 28 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 48 AATGTATGTT TATATTTACC TGTTCATG 28 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°: 49 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) LONGITUDE: 25 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 49 ACAGTGTTTG TGCAAATCCT GAGAC 25 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°: 50 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) LONGITUDE: 25 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 50 CAATGCCTAA GTTGGATTCA GGTTG 25 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°: 51 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) LONGITUDE: 25 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 51 CTTGCTGTAA CCTTCCCAGG ACCAG 25 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°: 52 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) LONGITUDE: 23 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 52 TCCCATCCAA AGGCTTCAAA ATC 23 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°: 53 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) LONGITUDE: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 53

ATACTCWAGG CCTAYAGCCT GTGGT (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°: 54 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) LONGITUDE: 5790 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 54 GCGGCCGCCC GGGCAGGTAT CGAAAGTTTC ACATATAAAG ATGAATAAGA TCTAAGTGTA 60 . TATGTTATTG TTAATAAAGT TTTTAATTTT TCGAATGTCA CATACAGCCT TTATTATTCA 120 TAGATTTATT CCTTT'IAAGA AGTAGTCAAA TGAATCAGCT CACCCTTGAC TGTAACAAAA 180 TACTGTTTGG TGACTTGTGA CAGACAGGGT TTTAACCTCT GACAGCGAGA TTCATTGTGG 240 AGCAAGAGCC AATCACAGAT CCCGACGACA CTTGTCTCAT CAAAGTTGGA ATATAAAAAG 300 CCACTTGGAA TACAGTATAA AAGATTCACT GGTGTGGCAA GTTGTCTCTA GACTGGGCAG 360 GCATTAACGT TTGGCTTGGC GTTACTCAAA AGCAAAAGAA AAGTAAAAGG AAGAAGTAAG 420 AACAAGGGAA AAGATTGTAT TGATTTTAAA ACC ATG CAA ;AAA CTG CAA ATC TCT 474

Met Gin Lys Lèu Gin lie Ser 1 5 GTT TAT ATT TAC CTA TTT ATG CTG ATT GTT GCT GGC CCA GTG GAT CTG 522 val Tyr lie Tyr Leu Phe Met Leu lie Val Ala Gly Pro Val Asp Leu 10 15 20 AAT GAG AAC AGC GAG CAG AAG GAA AAT GTG GAA AAA GAG GGG CTG TGT 570

Asn Glu Asn Ser Glu Gin Lys Glu Asn val Glu Lys Glu Gly Leu cys 25 30 35 AAT GCA TGT TTG TGG AGG GAA AAC ACT ACA TCC TCA AGA CTA GAA GCC 618

Asn Ala Cys Leu Trp Arg Glu Asn Thr Thr Ser ser Arg Leu Glu Ala 40 45 50 55 ATA AAA ATC CAA ATC CTC ACT AAA CTT CGC CTG GAA ACA GCT CCT AAC 666 lie Lys lie Gin lie Leu Ser Lys Leu Arg Leu Glu Thr Ala Pro Asn 60 65 70 ATC AGC AAA GAT GCT ATC AGA CAA CTT TTG CCC AAG GCT CCT CCA CTC 714 lie Ser Lys Asp Ala lie Arg Gin Leu Leu pro Lys Ala Pro Pro Leu 75 80 85 CTG GAA CTG ATT GAT CAG TTC GAT GTC CAG AGA GAT GCC AGC AGT GAC 762

Leu Glu Leu lie Asp Gin Phe Asp Val Gin Arg Asp Ala Ser Ser Asp 90 95 100 GGC TCC TTG GAA GAC GAT GAC TAC CAC GCC AGG ACG GAA ACG GTC ATT 810

Gly Ser Leu Glu Asp Asp Asp Tyr His Ala Arg Thr Glu Thr val lie 105 110 115 ACC ATG CCC ACG GAG T GTGAGTAGTC CTGCTGGTGC AAAGCAACGA CTCTGCTGAC 866

Thr Met Pro Thr Glu 120 TGCTGTTCTA GTGTTCATGA AAAACCGATC TATTTTCAGG CTCTTTTAAC AAGCTGCTGG 926 CTTGTATGTA AGGAGGAGGG GAAAGAGCTT TTTTCAAGAT TTCATGAGAA ATAGACCAAT 986 GAGACTGAAA GCTGCTACTT TATTTGTTTC CTTAGAGAGC TAAAAAGCTA AAAATCAAAA 1046 ATGAAATGCT TGCATAGCAT TCATGTTATA TAGTTTAGTA TGACAACTAT AACATGTTTA 1106 TGTTTTCACA GCTTAATGCT ACCAAGGTAA AGGATTGGGA AACAGTATCA GCAATGTGAA 1166 AAATTTACAT CAAATTTCCT AATTGCATTT GGTTGCCTGA AAT AT GCATT TATAATAACA 1226 GGTTTTTTTT TTTTCATTAA TAAAAGAGAA AGGAAGAAAT CTGTAGAGGT TGAA6CCTAT 1286 CTGGGCATTT GCTGAACACT TAGAATGACT TCTGTTATTC AAAACTATTT CTCATAGGGT 1346 TTTTATGGTC TTCACAGAGT ATCTAATTTT GAAAGCTATT AGAGTGGAAA GGATAAAAGA 1406 ATATTCTTAA TAAACTTAAT GTATTAGTAA GAGCAATAAG GAAGTAAACA CAGCATAGTG 1466 AAAAATCATG AGCTAATGAG CAGAAAATTC TAAGAAATAA ACÁTTTTAAT TACAAAGTTC 1526 CACTTATACC CTGACCATGG TACTATTGIT GAGAGTACCT TGTCTGCACA TATCTAGGAG 1586 GCACATGCTT AATAACCTTC TAAAATATTA TTGTATTCCT CATAGGAGGG AGAACTATTA 1646 CCTATATGTA GTACCTATGT TGTTTCTGAA AGATAATATG TTTCATGTAT TTCTGTTGCA 1706 GTCACTTCAA ACCTATACTC AAGGAAAGGG AGACAGGCAT CTCAACAGAG AAGGCATGAC 1766 CAGAAAGAGT TTTGTGCCAT GTGTCTGCGA TCTTGÇTTTA TACAGGGCTC TACCCACTTT 1826 AAACTGGACT CAAAACAGTT TCAAAATACT GCTTTTTCTT ATTAAGTAAC TAGTTTATAA 1886 GGCAACAAAT AAATTTCCTT TAAGACTGTG CTATCAGATA ATCCTGGAAT AGATTTGCCT 1946 TACTTATAAA CAATCTTGAG AAAACAAAAA GGCAAGAAAT TGCTAAGTGC TTCTGCTTAC 2006 AATGACAGCC TGGCCCTAAA GACAATGTTT TCTAAGTTTT GAAACAGCTT GAATACAACA 2066 tctaagtttt ggtgctaatt acctgctagt ττττττΑτττ ttttccttta aaaggctgtc 2126 CCAGCGTCCT AACATAACAG ATGCACTATA TTTTCTGCTA ATTCCCGAGG CTCAGTTAGT 2186 TGCTCACTGT GTCTTGTCCC CAGGTAATTC AGGCCTGGGG GAAGGGTTCC TTCCTCCAGA 2246 CTGATTGGTA CAGCTGCTCA GTAAGTGTAA CTACTCAGAT TCCCAAAGAA TTCTAAGTGG 2306 ATGTTCTTCC ACAGTGTCTC TTGTTCTCTC T AAT CAT CAT CATTTTAAAA TTTCATCCAC 2366 TTTTCATTCC TTAATAGAAT TTTCCTTAGT CCACAGTTCT CTGGAAAGGA AGTAGGCTTC 2426 TCATAACAGC TGAAAAAACA TATACCTAAA AGATTCTGAA AAGCTGTAAT AACTGTT AT A 2486 CTTGATATTT TGCTGTTATG AATGAAATGC TACATATTTT TCCATTTTAA AAGACTAAAT 2546 ATGCACACAT TATTCCAATT AAAAAATGTT CATAGATTGA TATGGAGGTG TTCGTTCATT 2606 TTTCATAAAA ATGATCTTAG TAACTTTTTT TCTTATTCAT TTATAG CT GAT CTT CTA 2663 ser Asp Leu Leu 125 ACG CAA GTG GAA GGA AAA CCC AAA TGT TGC TTC TTT AAA TTT AGC TCT 2711

Thr Gin val Glu Gly Lys pro Lys Cys Cys Phe Phe Lys Phe Ser ser 130 13Ϊ 140 AAG ATA CAA TAC AÁT AAA CTA GTA AAG GCC CAA CTG TGG ATA TAT CTG 2759

Lys lie Gin Tyr Asn Lys Leu val Lys Ala Gin Leu Trp lie Tyr Leu 145 150 155 160 AGG CCT GTC AAG ACT CCT GCG ACA GTG TTT GTG CAA ATC CTG AGA CTC 2807

Arg Pro val Lys Thr Pro Ala Thr Val Phe Val Gin lie Leu Arg Leu 165 170 175 ATC AAA CCC ATG AAA GAC GGT ACA AGG TAT ACT GGA ATC CGA TCT CTG 2855 lie Lys Pro Met Lys Asp Gly Thr Arg Tyr Thr Gly lie Arg Ser Leu 180 185 190 AAA CTT GAC ATG AAC CCA GGC ACT GGT ATT TGG CAG AGC ATT GAT GTG 2903

Lys Leu Asp Met Asn Pro Gly Thr Gly lie Trp Gin Ser lie Asp val 195 200 205 AAG ACA GTG TTG CAG AAC TGG CTC AAA CAA CCT GAA TCC AAC TTA GGC 2951

Lys Thr Val Leu Gin Asn Trp Leu Lys Gin Pro Glu ser Asn Leu Gly 210 215 220 ATT GAA ATC AAA GCT TTA GAT GAG AAT GGC CAT GAT CTT GCT GTA ACC 2999 lie Glu lie Lys Ala Leu Asp Glu Asn Gly His Asp Leu Ala val Thr 225 230 235 240 TTC CCA GAA CCA GGA GAA GAT GGA CTG GTAAGTGATT ACTGAAAATA 3046

Phe Pro Glu pro Gly Glu Asp Gly Leu 245 ACATGCTAAA AACCTTGTTA TGTGTTTATT CATAATGTGA ATGAATAGTA GTGAAAAATA 3106 ACTACCAGTT TCCTGTGCTT ATAAGCCAGA CAAAGGCACC TTACCCCAGT GGTAGCCCTG 3166 TACTCAATAA AAGTAGGTGT CCCATTTCAC ATCCTATGAA ACACTCTCTT GATACTTTGA 3226 CTTTGCATGA GGATTTAAAA GAAAAAAAGT TATACCATGG TCCTTAAGTT TTTAGGGAAT 3286 TCTTTGGAAT TGAGAATGAA ATATAAAATG CTTTCCGTTG ATGTGCTACA TGATTATATA 3346 AATAAAAACA TGAAGTCTTC ACAGTGGATT CTAGTACTCA CCCAACAACA CATTTTTTCC 3406 CCCAGAAGAG TGACCAATTT GTTAAAATTC TTTTGCTTAA TAAGGCAGAA AAATGAACTC 3466 TACAAGTTAT AATTAAAATA AAATGCTTTT ACTTATAGAA ATTAACTAGA TATATGTTCA 3526 GGTTTATATA CTATTAAATA TACTATATTT AAGATCTCTC ATGATAAATA TGTTCCTTGT 3586 TTTATAGACT ATTGATGCAC TGATGTATAT GTGGATTACT TTGTGAATTA CCCCTGGTAA 3646 AATTAAAAAT TTCAGGCTAG TTAACTTGTA CTACTTAGCT ATTTTCTGAA CTGTCTTACT 3706 GTTCTTTAAC AGGAGTTAAC TTAGGTAATG TCAACTAATT TAATATAAAG TCAAACAGAA 3766 AATAATGCCT TATATATTAT AAAAATTAAT AAAAAACCAT TTTAAAATCT AGTATAAGTT 3826 TAGAGCTACT CACTCTTCTG GCTTATCTAT GCTTGTATTT ACTTCTGTTT TCAAAAAATT 3886 TTTTAATGTG ACCATACCTT TTATTTCCAG TTATTGATAT AATTTACAAC AAAAGATTAT 3946 ACTTGCAAGC TTTATAGTTT TTAAATGGTC TTATTTGTAG TGAATATCAT ATCTAAATGA 4006 TATCTAAATG TAAAGTAAAT CATACCTAAA TGAAAACATA TTCTTTAAGT CATTATAAAA 4066 TTTTCCAGGT GATCAATTTT TCTTTAAATA TACTACATAA AATGTTATTG ACTCCCAAAA 4126 TGATGTTATT TTGTATAATC TTAAATACCA ATAATTACCA GGTCTATTTT GGTTTTAGTG 4186 TAGGATAAAA AAGAATGTGT TCTTTTTTCT AGGTAGCATT TTAATGATCA AAGTTGGTGA 4246 CGTGACAGAG GTCTTAAGTA TTATTAAACA GATGATTAAT AAGATGTATT CCTCAGACTT 4306 TTCCATATAA AAGGAAAAAT GTCTCAAATT CATGAAAAGA TTGGTACAGG AGGAGGATTA 4366 GCAAATTGTA GTTTAAATAT CTGAATGGAA ACACTTTTTA GTGAAAGAAT AAAGGGAATA 4426 TCATTGTATC TTCTTCTGAG TCTGTGCCTC TCTCTCTTGG AGTTAGTCTT TCCAACCCTA 4486 TATACTTACC ACTATCTTCA TCCCTCTACC TTCCTTTTTC CCATTACATC TGTGCAGTAC 4546 TGGGTGGCAA CTATTGTGTT TCGGTGTTAA TATCCAAGTT TCCCTGAATA AGACCAAGTG 4606 AATGGAGGAT GAATGAGTAT ACCTATCCCT CCAGGGGTCA TCAGACATAT TTAGCCACCA 4666 TATTTAATCA ATAAGCAGGA AGACATAAGC TAGCCTTGTC CTTCTTCTTT CCTCCCTGCT 4726 CCTTTCTCTT CTCTTCCCCC TCTCCCTTTA CTGTCAT CCA TCAGTATTTT CAGAGCATCT 4786 ATTATGTGTC AGGCATTCAG ATACTCAAAC GGAGGAAAAC AAGAATAAAC AAGACAAAGA 4846 TCTGACCACA GGGGAATCCC TATGGCTACT GTAGACTTTT GAGCCATAAA GGAAGAATCA 4906 AGCCTAGTGT AAATGAAAAT TCCTTAATGC TGTGCCTTTT AAAAA6AAAT GTGACATAAG 4966 CAAAATGATT AGTTTCTTTC TTTAATAATG AGTCCTTGAG GTAGGAGAGT GTTTTGGGAT 5026 CTATTATTAA CTCTTCTTTC CTTTCCATAC AG ACT CCT TTT TTA GAA GTC AAG 5079

Thr Pro Phe Leu Glu val Lys 250 255 GTA ACA GAC ACA CCA AAA AGA TCT AGG AGA GAT TTT GGG CTT GAT TGT 5127 val Thr Asp Thr Pro Lys Arg Ser Arg Arc Asp Phe Gly Leu Asp Cys 260 265 270 GAT GAA CAC TCC ACA GAA TCT CGA TGC TGT CGT TAC CCT CTA ACT GTG 5175

Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg: cys Cys Arg Tyr pro Leu Thr Val 275 280 285 GAT TTT GAA GCT TTT GGA TGG GAT TGG ATT ATT GCA CCT AAA AGA TAT 5223

Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp lie lie Ala pro Lys Arg Tyr 290 295 300 AAG GCC AAT TAC TGC TCT GGA GAA TGT GAA TTT GTA TTT TTG CAA AAG 5271

Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu Phe Val Phe Leu Gin Lys 305 310 315 320 TAT CCT CAT ACC CAT CTT GTG CAC CAA GCA AAC CCC AGA GGT TCA GCC 5319

Tyr Pro His Thr His Leu val His Gin Ala Asn pro Arg Gly ser Ala 325 330 335 GGC CCC TGC TGT ACT CCT ACA AAG ATG TCT CCA ATT AAT ATG CTA TAT S367

Gly Pro cys Cys Thr Pro Thr Lys Met ser pro lie Asn Met Leu Tyr 340 345 350 TTT AAT GGC GAA GGA CAA ΑΤΑ ATA TAC GGG AAG ATT CCA GCC ATG GTA 5415

Phe Asn Gly Glu Gly Gin lie lie Tyr Gly Lys lie Pro Ala Met Val 355 360 365 GTA GAT CGC TGT GGG TGT TCA TGÀGGTCTAT ATTTGGTTCA TAGCTTCCTC 5466 val Asp Arg cys Gly Cys ser 370 375 AAACATGGAA GGTCTTCCCC TCAACAATTT TGAAACTGTG AAATTATGTA CCACAGGCTA 5526 TAAGCCTAGA GTATGCTACA GTCACTTAAG CACAAGCTAC AGTATATGAG CTAAAAAGAG 5586 AGAATATATG CAATGGTTGG CATTTAACCA TCCAAACAAA TCGTATAATA AAAAGTTTTA 5646 TGATTTCCAG AG I I Π IGAA CTAGGAGATC AAATTCCATT TATGTTGAAA TATATTACAA 5706 CACATGCAGG TGAATGAAAG CAATTCTCCT TGTCTTCTGG TGAATTAAAG GAGTATGCTT 5766 TAAAATCTAT TTCTCTACAG TTTC 5790

DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.

Documentos de patente referidos na descrição • US 5264558 A [0088] • US 5487983 A [0088] • US 5288630 A [0089] • US 4816397 A [0098] • US 4816567 A [0098] • EP 171496 A [0098] • EP 98935228 A [0099] • US 19970891789 A [0099] • US 19980007761 A [0099]

Documentos de não patente citados na descrição • Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, 1989, 6.3.1-6.3.6 [0093] • BARENDSE, W. ; S.M. ARMITAGE ; L.M. KOSSAREK ; A. SHALOM ; B.W. KIRKPATRICK ; A.M. RYAN ; D. CLAYTON ; L. LI ; H.L. NEIBERGS ; N. ZHANG. A genetic linkage map of the bovine genome. Nature Genet, 1994, vol. 6, 227-235 [0098] • BISHOP, M.D. ; S.M. KAPPES ; J.W. KEELE ; R.T. STONE ; S.L.F. SUNDEN ; G.A. HAWKINS ; S. SOLINAS TOLDO ; R. FRIES ; M.D. GROSZ ; J. YOO. A genetic linkage map for cattle. Genetics, 1994, vol. 136, 619-639 [0098] • CHARLIER, C. ; COPPIETERS, W. ; FARNIR, F. ; GROBET, L. ; LEROY, P. ; MICHAUX, C. ; MNI, M. ; SCHWERS, A. ; VANMANSHOVEN, P. ; HANSET, R. The mh gene causing double-muscling in cattle maps to bovine chromosome 2. Mammalian Genome, 1995, vol. 6, 788-792 [0098] • CHIRGWIN, J.M. ; PRZYBYLA, A. E. ; MACDONALD, R.J. ; RUTTER, W.J. Isolation of biologically active ribonucleic acid from sources enriched in ribonuclease. Biochemistry, 1979, vol. 18, 5294-5299 [0098] • COCKETT, N.E. ; JACKSON, S.P. ; SHAY, T.D. ; NIELSEN, D. ; GREEN, R.D. ; GEORGES, M. Chromosomal localization of the callipyge gene in sheep (Ovis aries) using bovine DNA markers. Proceedings of the National Academy of Sciences, 1994, vol. 91, 3019-3023 [0098] • COCKETT, N.E. ; JACKSON, S.P. ; SHAY, T.D. ; FARNIR, F. ; BERGHMANS, S. ; SNOWDER, G. ; NIELSEN, D. ; GEORGES, M. Polar overdominance at the ovine callipyge locus. Science, 1996, vol. 273, 236-238 [0098] • COLE et al. Monoclonal Antibodies in Cancer Therapy. Allen R. Bliss, Inc, 1985 [0098] • COLLINS, F.S. Positional cloning moves from perditional to traditional. Nature Genet, 1995, vol. 9, 347-350 [0098] • CORNELIS, F. ; HASHIMOTO, L. ; LOVERIDGE, J. ; MACCARTHY, A. ; BUCKLE, V. ; JULIER, C. ; BELL, J.

Identification of a CA repeat at the TCRA locus using YACs: a general method for generating highly polymorphic markers at chosen loci. Genomics, 1992, vol. 13, 820-825 [0098] • COTTINGHAM, R.W. ; IDURY, R.M. ; SCHAFFER, A.A. Faster sequential genetic linkage computations. Am. J. Hum. Genet, 1993, vol. 53, 252-263 [0098] • CULLEY, G. Observations on livestock [0098] • FISHER, S.R. ; BEEVER, J.E. ; LEWIN, H.A. Genetic mapping of C0L3AI to bovine chromosome 2. Mammalian Genome, 1996, vol. 8, 76-77 [0098] • FUJI, J.; OTSU, K. ; ZORZATO, F. ; DELEON, S. ; KHANNA, V.K. ; WEILER, J.E. ; O'BRIEN, P.J. ; MACLENNAN, D.H. Identification of a mutation in the porcine ryanodine receptor associated with malignant hyperthermia. Science, 1991, vol. 253, 448-451 [0098] • GEORGES, M. ; ANDERSSON, L. Livestock genomics comes of age. Genome Research, 1996, vol. 6, 907-921 [0098] • GEORGES, M. ; NIELSEN, D. ; MACKINNON, M. ; MISHRA, A. ; OKIMOTO, R. ; PASQUINO, A. T. ; SARGEANT, L.S. ; SORENSEN, A. ; STEELE, M.R. ; ZHAO, X. Mapping quantitative trait loci controlling milk production by exploiting progeny testing. Genetics, 1995, vol. 139, 907-920 [0098] • GOSSEN, M. ; BUJARD, H. Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promotors. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 1992, vol. 89, 5547-5551 [0098] • GROBET, L. ; ROYO MARTIN, L.J. ; PONCELET, D. ; PIROTTIN, D. ; BROUWERS, B. ; RIQUET, J. ; SCHOEBERLEIN, A. ; DUNNER, S. ; MENISSIER, F. ; MASSABANDA, J. A deletion in the myostatin gene causes double-muscling in cattle. Nature Genetics, 1997, vol. 17, 71-74 [0098] • GU, H. ; MARTH, J.D. ; ORBAN, P.C. ; MOSSMANN, H. ; RAJEWSKY, K. Deletion of a DNA polymerase beta gene segment in T cells using cell type-specific gene targetting. Science, 1994, vol. 265, 103-106 [0098] • HANSET, R. ; MICHAUX, C. On the genetic determinism of muscular hypertrophy in the Belgian White and Blue cattle breed. I. Experimental data. Génét. Sél. Evol., 1985, vol. 17, 359-368 [0098] • HANSET, R. ; MICHAUX, C. On the genetic determinism of muscular hypertrophy in the Belgian White and Blue cattle breed. II. Population data. Génét. Sél. Evol., 1985, vol. 17, 369-386 [0098] • The major gene of muscular hypetrophy in the belgian Blue Cattle Breed. HANSET, R. Breeding for Disease Resistance in Farm Animals. C.A.B. International, 1991, 467-478 [0098] • HERSKOWITZ, I. Functional inactivation of genes by dominant negative mutations. Nature, 1987, vol. 329, 219-222 [0098] • HOGAN, B et al. A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, 1986 [0098] • HOESS, R.H. ; ZIESE, M. ; STERNBERG, N. PI site- specific recombination: nucleotide sequence of the recombining sites. Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 1982, vol. 79, 3398-3402 [0098] • HOUBENWCYL. Methods of Organic Chemistry. Thieme, 1987, vol. 151, II [0098] • HUDSON et al. Science, 1995, vol. 270, 1945-1954 [0098] • Human Genetic Mapping Project. May 1997 [0098] • HUNTER, K ; RIBA, L. ; SCHALKWYK, L. ; CLARK, M. ; RESENCHUK, S. ; BEEGHLY, A. ; SU, J. ; TINKOV, F. ; LEE, P. ; RAMU, E. Toward the Construction of Integrated Physical and Genetic Maps of the Mouse Genome Using Interspersed Repetitive Sequence PCR (IRS\NPCR) . Genomics. Genome Research, 1996, vol. 6, 290-299 [0098] • HUSE et al. Science, 1989, vol. 246, 1275-1281 [0098] • KAMBADUR, R. ; SHARMA, M. ; SMITH, T.P.L. ; BASS, J.J.

Mutations in myostatin (GDF8) in double- muscled Belgian Blue Cattle. Genome Research, 1997, vol. 7, 910-916 [0098] • KAPPES, S.M. ; KEELE, J.W. ; STONE, R.T. ; MCGRAW, R.A. ; SONSTEGARD, T.S. ; SMITH, T.P.L. ; LOPEZ- CORRALES, N.L. ; BEATTIE, C.W. A Second-Generation Linkage Map of the Bovine Genome. Genome Research, 1997, vol. 7, 235-249 [0098] • KENNETT, R. Cell fusion. Methods Enzymol., 1979, vol. 58, 345-359 [0098] • KOHLER; MILSTEIN. Nature, 1975, vol. 256, 495-497 [0098] • KOZBOR et al. Immunol. Today, 1983, vol. 4, 72 [0098] • LATHROP, M. ; LALOUEL, J.M. Easy calculations of lodscores and genetic risk on small computers. American Journal of Human Genetics, 1984, vol. 36, 460-465 [0098] • LENSTRA, J.A. ; VAN BOXTEL, J.A.F. ; ZWAAGSTRA, K.A. ; SCHWERIN, M. Short interspersed nuclear element (SINE) sequences of the Bovidae. Animal Genetics, 1993, vol. 24, 33-39 [0098] • LIBERT, F. ; LEFORT, A. ; OKIMOTO, R. ; GEORGES, M.

Construction of a bovine genomic library of large yeast artificial chromosome clones. Genomics, 1993, vol. 18, 270-276 [0098] • LOPEZ, A.R. ; COOK, J. ; DEININGER, P.L. ; DERYNCK, R.

Dominant negative mutants of trnasforming growth factor-betal inhibit the secretation of different transforming growth factor beta isoforms. Molecular and Cellular biology, 1992, vol. 12 (4), 1674-1679 [0098] • LYONS, A.L. ; LAUGHLIN, T.F. ; COPELAND, N.G. ; JENKINS, N. A. ; WOMACK, J.E. ; O'BRIEN, S.J.

Comparative Anchor tagged Sequences for Integrative mapping of Mammalian Genomes. Nature Genetics, 1996, vol. 15, 47-56 [0098] • The transforming growth factor β superfamily. MCPHERRON, A.C. ; LEE, S.-J. Growth Factors and Cytokines in Health and Disease. JAI press Inc, 1996, vol. IB, 357-393 [0098] • MCPHERRON, A.C. ; LAWLER, A.M. ; LEE, S.-J. Regulation of skeletal muscle mass in mice by a new TGFp superfamily member. Nature, 1997, vol. 387, 83-90 [0098] • Present state of knowledge about the genetic determination of muscular hypertrophy or the double muscled trait in cattle. MENISSIER, F. Current Topics in Veterinary Medicine and Animal Science, vol. 16: Muscle hypertrophy of genetic origin and its use to improve beef production. 1982, vol. 16, 387-428 [0098] • MERRIFIELD. J. Am. Chem. Assoc., 1964, vol. 85, 2149- 2154 [0098] • MCCAFFERTY et al. Nature, 1990, vol. 348, 552-554 [0098] • MIRSKI, S; COLE, S. P. C. Antigens associated with multidrug resistance in H69AR, a small cell lung cancer cell line. Cancer Res., vol. 49, 5719-5724 [0098] • MORRISON et al. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 1985, vol. 81, 6851 [0098] • O'BRIEN, S.J. ; WOMACK, J.E. ; LYONS, L.A. ; MOORE, K.J. ; JENKINS, N. A ; COPELAND, N.G. Anchored reference loci for comparative genome mapping in mammals. Nature Genetics, 1993, vol. 3, 103-112 [0098] • OLD, R.W.; PRIMROSE, S.B. Principles of Gene

Manipulation. An Introduction to Genetic Engineering. Oxford University Press, 63-66 [0098] • PELL, J.M. ; FLINT, D.J. et al. Milk Composition,

Production and Biotechnology. 1997 [0098] • SAMBROOK, J. ; FRITSCH E.F. ; MANIATIS, T. Molecular

Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Lab

Press, 1989 [0098] • SHOCKETT, P.E. ; SCHATZ, D.G. Diverse strategies for tetracycline-regulated inducible gene expression. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 1996, vol. 93, 5173-5176 [0098] • SOLINAS-TOLDO, S. ; LENGAUER, C ; FRIES, R.

Comparative genome map of man and cattle. Genomics, 1995, vol. 27, 489-496 [0098] • STAERZ; BEVAN. Proceedings of the National Academy of Sciences, 1986, vol. 83, 1453 [0098] • STAERZ; BEVAN. Immunology Today, 1986, vol. 7, 241 [0098] • STEWART, A. J. ; CANITROT, Y. ; BARACCHINI, E. ; DEAN, N.M. ; DEELEY, R.G. ; COLE, S.P.C. Reduction of Expression of the multidrug resistance protein (MRP) in human tumor cells by antisense phophorothioate oligonucleotides. Biochem. Pharamcol., 1996, vol. 51, 461-469 [0098] • TAKEDA et al. Nature, 1985, vol. 314, 452 [0098] • TENG et al. Meth. Enzymol., 1982, vol. 92, 3-16 [0098] • VARGA, L. ; SZABO, G. ; DARVASI, A. ; MÚLLER, G. ; SASS, M. ; SOLLER, M. Inheritance and mapping of compact (Cmpt), a new mutation causing hypermuscularity in mice. Genetics, 1997 [0098] • WALTER, M.A. ; SPILLETT, D.J. ; THOMAS, P. ; WEISSENBACH, J. ; GOODFELLOW, P.N. A method for constructing radiation hybrid maps of whole genomes.

Nature Genetics, 1994, vol. 7, 22-28 [0098] • WARD et al. Nature, 1989, vol. 341, 544-546 [0098]

Lisboa, 21 de Setembro de 2015

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Um kit de diagnóstico para a determinação do genótipo de uma amostra de material genético de mamífero, em que o kit compreende: um par de oligonucleótidos iniciadores, em que um primeiro dos oligonucleótidos iniciadores inclui uma sequência de nucleótidos de comprimento suficiente e suficientemente complementar a uma mutação da SEQ ID NO: 1 e que se liga sob condições de elevado rigor a uma sequência de ácido nucleico que contém a referida mutação, sendo a mutação selecionada a partir do grupo de mutações que resultam de: (a) deleção de 11 nucleótidos que começa no nucleótido 821 da porção codificante da SEQ ID NO: i; (b) deleção de 7 nucleótidos que começa no nucleótido 419 da sequência de codificação e a inserção da sequência AAGCATACAA no lugar dos mesmos; (c) deleção do nucleótido 610 da sequência de codificação e a inserção de T no lugar do mesmo; (d) deleção do nucleótido 676 da sequência de codificação e a inserção de T no lugar do mesmo; e (e) combinações de mutações de (a) a (d).
2. O kit de diagnóstico da reivindicação 1, em que um segundo do par de oligonucleótidos iniciadores está localizado inteiramente a montante ou inteiramente a jusante da mutação ou mutações selecionadas.
3. O kit de diagnóstico da reivindicação 2, em que um primeiro referido oligonucleótido iniciador abrange a mutação (a) e que compreende ainda um terceiro oligonucleótido iniciador que é suficientemente complementar à sequência de nucleótidos identificada como SEQ ID NO: 11 para iniciar a amplificação de uma molécula de ácido nucleico que contém a SEQ ID NO: 11.
4. 0 kit de diagnóstico da reivindicação 2, em que um primeiro referido oligonucleótido iniciador é suficientemente complementar à sequência inserida da mutação (b) para iniciar a amplificação de uma molécula de ácido nucleico que contém a mutação (b) , e que compreende ainda um terceiro oligonucleótido iniciador que é suficientemente complementar à sequência que corresponde à deleção de 7 nucleótidos da mutação (b) para iniciar a amplificação de uma molécula de ácido nucleico que contém a deleção de 7 nucleótidos da mutação (b).
5. 0 kit de diagnóstico da reivindicação 2, em que um primeiro referido oligonucleótido iniciador abrange a mutação (c) e que compreende ainda um terceiro oligonucleótido iniciador que é suficientemente complementar à sequência que abrange a região correspondente sem a mutação (c) para iniciar a amplificação de uma molécula de ácido nucleico sem a mutação (c).
6. 0 kit de diagnóstico da reivindicação 2, em que um primeiro referido oligonucleótido iniciador abrange a mutação (d) e que compreende ainda um terceiro oligonucleótido iniciador que é suficientemente complementar à sequência que abrange a região correspondente sem a mutação (d) para iniciar a amplificação de uma molécula de ácido nucleico sem a mutação (d) .
7. Um método para a determinação da presença de hiperplasia muscular num animal bovino, em que o método compreende : determinar se o ADN que tem uma mutação tal como definida na reivindicação 1 está presente numa amostra de material que contém ADN do referido animal utilizando os oligonucleótidos iniciadores tal como definidos na reivindicação 1, ou uma sonda de comprimento suficiente e suficientemente complementar a uma molécula de ácido nucleico que contém a referida mutação e que se liga sob elevadas condições de rigor a uma sequência de ácido nucleico que contém a referida mutação; e determinar se está presente o ADN que tem uma sequência de nucleótidos que codifica para uma proteína que possui atividade biológica de miostatina, em que a ausência de ADN que possui a referida sequência de nucleótidos e a presença da referida mutação indica a presença de hiperplasia muscular no animal.
8. 0 método da reivindicação 7, em que o animal é uma raça selecionada de Belgian Blue, Asturiana, Parthenaise e Rubia Gallega. Lisboa, 21 de Setembro de 2015