ES2547858T3

ES2547858T3 - Doble musculación en mamíferos

Info

Publication number: ES2547858T3
Application number: ES08006554.3T
Authority: ES
Inventors: Luc Grobet; Michel Georges; Dominique Poncelet
Original assignee: Universite de Liege
Current assignee: Universite de Liege
Priority date: 1997-07-14
Filing date: 1998-07-14
Publication date: 2015-10-09
Anticipated expiration: 2018-07-14
Also published as: WO1999002667A1; AU8457198A; EP2045322A1; NZ502523A; DE69841139D1; EP2045322B1; JP2001509378A; PT2045322E; ATE442436T1; EP1002068A1; DK2045322T3; CA2296434C; EP1002068B1; CA2296434A1; US20030129171A1; JP4368522B2; AU756620B2; CY1116682T1

Abstract

Un kit de diagnóstico, para determinar el genotipo de una muestra de material genético de mamífero, comprendiendo el kit: un par de cebadores, en donde un primero de los cebadores incluye una secuencia nucleotídica de suficiente longitud y suficientemente complementaria a una mutación de la SEC ID Nº 1 y que se une en condiciones de alta rigurosidad a una secuencia de ácido nucleico que contiene dicha mutación, seleccionándose la mutación entre el grupo de mutaciones resultantes de: (a) deleción de 11 nucleótidos empezando en el nucleótido 821 de la parte codificante de la SEC ID Nº 1; (b) deleción de 7 nucleótidos empezando en el nucleótido 419 de la secuencia codificante e inserción de la secuencia AAGCATACAA en su lugar; (c) deleción del nucleótido 610 de la secuencia codificante e inserción de T en su lugar; (d) deleción del nucleótido 676 de la secuencia codificante e inserción de T en su lugar; y (e) combinaciones de las mutaciones (a) a (d).

Description

Doble musculación en mamíferos

5 Campo de la invención

La presente invención se refiere a factores que afectan al desarrollo muscular en mamíferos, especialmente ganado. En particular, la presente invención se refiere a la clonación de un procedimiento para determinar genotipos de miostatina.

Descripción de la técnica relacionada

La superfamilia de TGF-β consiste en un grupo de polipéptidos multifuncionales que controlan un amplio intervalo de procesos de diferenciación en muchos tipos celulares de mamífero. GDF-8 es un miembro de la superfamilia de

15 TGF-β. Todos los miembros de esta superfamilia comparte una estructura común que incluye una corta señal peptídica para la secreción y un fragmento peptídico N-terminal que se separa del fragmento carboxi-terminal bioactivo por escisión proteolítica en un sitio de escisión proteolítica altamente conservado. El dominio carboxiterminal bioactivo se caracteriza por restos de cisteína en posiciones altamente conservadas que están implicados en puentes disulfuro intra-e intermoleculares. Las moléculas funcionales son dímeros covalentemente unidos (mediante un enlace S-S) del dominio carboxi-terminal (Masterson y col., 1996).

Recientemente, se informó de que ratones deficientes en el gen que codifica GDF-8 se caracterizaban por una hiperplasia muscular generalizada (McPherron y col., 1997). Los ratones GDF-8 deficientes se produjeron por direccionamiento génico usando recombinación homóloga en células madre embrionarias, un procedimiento

25 mencionado como "desactivación génica". La hiperplasia muscular generalizada murina pareció ser muy similar en su expresión a la hiperplasia muscular que caracteriza al ganado bovino de "doble musculación". Esta observación planteó la intrigante posibilidad de que el gen bovino que codifica GDF-8 (es decir, el homólogo evolutivo bovino del gen de GDF-8 de ratón) esté implicado en el fenotipo bovino de doble musculación. También planteó la posibilidad de que el gen humano que codifica GDF-8 (es decir, el homólogo evolutivo humano del gen de GDF-8 de ratón) esté implicado en la regulación del desarrollo muscular en seres humanos, específicamente la génesis del músculo esquelético. El aislamiento del gen de GDF-8 humano puede tener usos/aplicaciones terapéuticas en el tratamiento de enfermedades musculodegenerativas a través de la regulación positiva o regulación negativa de la expresión de GDF-8.

35 Se ha informado de la existencia de animales caracterizados por una hipertrofia muscular generalizada distinta, habitualmente conocidos como animales de "doble musculación", en varias razas de ganado bovino en todo el mundo. La primera descripción documentada de ganado bovino de doble musculación data de tan pronto como 1807 (Culley, 1807). Una de las razas en que esta característica ha sido más minuciosamente estudiada es la raza Azul Belga de ganado bovino ("raza Azul Belga"). Ésta es una de las pocas razas en las que se ha seleccionado sistemáticamente el rasgo de doble musculación, y en las que el fenotipo de doble musculación es casi fijo. Una comparación de animales de doble musculación y convencional dentro de la raza Azul Belga, mostró un aumento en la masa muscular del 20% de promedio, mientras que todos los demás órganos estaban reducidos en tamaño (Hanset, 1986 y 1991). Se demostró que la hipertrofia muscular era una hiperplasia histológica que afectaba principalmente a músculos superficiales, acompañada por una reducción del 50% en el contenido total de lípidos y

45 una reducción en la fracción de tejido conectivo medida por contenido de hidroxiprolina (Hanset y col., 1982). Los animales de doble musculación demostraron tener una ingesta reducida de pienso con tasa mejorada de conversión del pienso (Hanset y col., 1987). Un importante beneficio económico de los animales de doble musculación, en contraste con los animales convencionales, es el aumento sustancial en el precio de venta y los ingresos netos para el ganadero (Hanset y col., 1987).

Una de las series de estudios más minuciosos sobre musculación doble es la de Hanset y colaboradores en la raza Azul Belga. Se midieron los criterios objetivos de desarrollo muscular, tales como porcentaje de desollamiento, el porcentaje de magro y grasa, las concentraciones de creatina y creatinina en plasma y glóbulos rojos, en casi 150 animales seleccionados aleatoriamente criados en condiciones normalizadas. Estos estudios revelaron claramente 55 distribuciones bimodales anormales del fenotipo de doble musculación y confirmaron objetivamente la clasificación visual tradicionalmente realizada por los criadores sobre animales de doble musculación y convencionales. La distribución fenotípica se resolvió usando un procedimiento de probabilidad máxima en dos poblaciones normales componentes con una varianza común que reveló diferencias en la media de tres a cuatro desviaciones típicas dependiendo del rasgo. Esto sugirió la presencia de un alelo que tenía un efecto principal sobre el desarrollo muscular con una frecuencia de población cercana al 50% (Hanset y Michaux, 1985b). La evidencia más convincente a favor de dicho alelo, sin embargo, proviene de cruces experimentales que implican toros Azul Belga de doble musculación y vacas lecheras Holstein Friesian (teniendo los últimos animales un desarrollo muscular muy pobre). Aunque la descendencia F1 mostró una distribución fenotípica muy similar a sus hembras Holstein Friesian, el retrocruzamiento de estos F1 con toros de doble musculación produjo una generación BC bimodal, que apunta

65 claramente hacia una segregación mendeliana de un alelo "mh" (hipertrofia muscular) recesivo (Hanset y Michaux., 1985a).

Posteriormente se usó el mismo tipo de cruces experimentales para realizar una exploración de genoma completo usando un mapa de marcadores basado en microsatélites. Para realizar el análisis de vinculación, los animales se clasificaron como de doble musculación o convencionales. Se obtuvieron valores muy significativos del logaritmo de la probabilidad (valores lod) en el cromosoma 2 (> 17), y un análisis de vinculación de múltiples puntos posicionó el

5 locus mh en el extremo centromérico de este cromosoma, a [2]centimorgan del marcador más cercano de microsatélite: TGLA44. La región cromosómica correspondiente justificó toda la varianza del rasgo asumido como completamente penetrante en este experimento (Charlier y col., 1995).

En seres humanos, se han aislado los genes que codifican algunas formas de anormalidades musculares, por ejemplo distrofia muscular. La divulgación proporciona el gen que regula el desarrollo del músculo esquelético solamente, en oposición a otros tipos de músculo, por ejemplo músculo liso o cardiaco. La divulgación puede proporcionar una comprensión del papel del gen de GDF-8 o su receptor en el recrecimiento de músculo esquelético en seres humanos que solamente experimentan una respuesta hiperplásica.

15 Sumario de la invención

Los presentes inventores han identificado y secuenciado un gen (ADNc y genómico) que codifica una proteína miostatina bovina. La secuencia codificante de ácido nucleico se identifica como SEC ID Nº 1 y la secuencia proteica se identifica como SEC ID Nº 2. La secuencia i bovina genómica se identifica como SEC ID Nº 54. Se ha secuenciado un gen mutante (SEC ID Nº 3) en que la secuencia codificante carece de una secuencia consecutiva de 11 pares de bases (SEC ID Nº 11) de la secuencia que codifica la proteína bovina que tiene actividad miostatina. Se ha demostrado que ganado bovino de la raza Azul Belga homocigóticos para el gen mutante que carece de actividad miostatina son de doble musculación. También se han determinado otras mutaciones bovinas que conducen a doble musculación, identificándose en el presente documento como nt419(del7-ins10), Q204X, E226X y C313Y,

25 respectivamente. En un aspecto, como se define en las reivindicaciones, la presente invención por tanto proporciona un procedimiento para determinar la presencia de hiperplasia muscular en un mamífero. El procedimiento incluye obtener una muestra de material que contiene ADN del mamífero y averiguar si está presente una secuencia del ADN que codifica (a) una proteína que tiene actividad biológica de miostatina, y si está presente una secuencia del ADN que codifica (b) una proteína alélica que carece de la actividad de (a). La ausencia de (a) y la presencia de (b) indican la presencia de hiperplasia muscular en el mamífero.

Por supuesto, la mutación responsable de la ausencia de actividad puede ser una mutación de origen natural, como es el caso para las razas Azul Belga, Asturiana, Parthenaise o Rubia Gallega, aquí mostradas.

35 El mamífero puede ser un bovino, etc.

Existes varios procedimientos conocidos para determinar si una secuencia nucleotídica particular está presente en una muestra. Un procedimiento común es la reacción en cadena de la polimerasa. Un aspecto preferido de la invención por tanto incluye una etapa en que averiguar si una secuencia del ADN que codifica (a) está presente, y si una secuencia del ADN que codifica (b) está presente incluye amplificar el ADN en presencia de cebadores basados en una secuencia nucleotídica que codifica una proteína que tiene actividad biológica de miostatina.

Un cebador de la presente invención, usado en PCR por ejemplo, es una molécula de ácido nucleico suficientemente complementaria a la secuencia en la que está basada y de longitud suficiente para hibridar

45 selectivamente con la parte correspondiente de una molécula de ácido nucleico pretendida para amplificarse y para cebar la síntesis de la misma en condiciones in vitro habitualmente usadas en PCR. Asimismo, una sonda de la presente invención, es una molécula, por ejemplo una molécula de ácido nucleico de suficiente longitud y suficientemente complementaria a la molécula de ácido nucleico de interés, que se une selectivamente, en condiciones de rigurosidad elevada o baja con la secuencia de ácido nucleico de interés para la detección de la misma en presencia de moléculas de ácido nucleico que tienen secuencias diferentes.

Los cebadores pueden basarse en la secuencia identificada como SEC ID Nº 7 (secuencia de ADNc humano) o SEC ID Nº 54.

55 Se describe un procedimiento para determinar la presencia de hiperplasia muscular en un mamífero que incluye obtener una muestra de material que contiene ARNm del mamífero. Dicho procedimiento incluye averiguar si está presente una secuencia del ARNm que codifica (A) una proteína que tiene actividad biológica de miostatina, y si está presente una secuencia del ARNm que codifica (B) una proteína al menos parcialmente codificada por una secuencia nucleotídica truncada correspondiente a sustancialmente la secuencia del ARNm y que carece de la actividad de (A). La ausencia de (A) y la presencia de (B) indican la presencia de hiperplasia muscular en el mamífero.

El ARNm que codifica (A) y la secuencia truncada pueden corresponder a alelos de ADN del mamífero.

65 De nuevo, si se usa un procedimiento de amplificado tal como PCR en averiguar si está presente una secuencia del ARNm que codifica (A), y si está presente una secuencia del ARNm que codifica (B), el procedimiento incluye

amplificar el ARNm en presencia de un par de cebadores complementarios a una secuencia nucleotídica que codifica una proteína que tiene actividad biológica de miostatina. Cada uno de estos cebadores puede contener una secuencia nucleotídica sustancialmente complementaria, por ejemplo, a la secuencia identificada como SEC ID Nº 7. La secuencia truncada puede contener al menos 50 nucleótidos consecutivos sustancialmente correspondientes a

5 50 nucleótidos consecutivos de la SEC ID Nº 7, por ejemplo.

En otro aspecto, la invención es un procedimiento para determinar la presencia de hiperplasia muscular en un mamífero descrito que incluye obtener una muestra tisular que contiene ARNm del mamífero y averiguar si está presente un ARNm que codifica una proteína miostatina de tipo mutante que carece de actividad biológica de miostatina. La presencia de dicho ARNm que codifica una proteína miostatina de tipo mutante indica la presencia de hiperplasia muscular en el mamífero.

En otro aspecto, la invención proporciona un procedimiento para determinar la presencia de hiperplasia muscular en un animal bovino. El procedimiento incluye obtener una muestra de material que contiene ADN del animal y

15 averiguar si está presente ADN que tiene una secuencia nucleotídica que codifica una proteína que tiene actividad biológica de miostatina. La ausencia de ADN que tiene dicha secuencia nucleotídica indica la presencia de hiperplasia muscular en el animal. Averiguar si está presente ADN que tiene una secuencia nucleotídica que codifica una proteína que tiene actividad biológica de miostatina puede incluir la amplificación del ADN en presencia de cebadores basados en una secuencia nucleotídica que codifica una proteína que tiene actividad biológica de miostatina.

En particular, el procedimiento puede realizarse usando una muestra de un animal en que dicho animal bovino que no presenta hiperplasia muscular se sabe que tiene una secuencia nucleotídica que es capaz de hibridar con una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia identificada como SEC ID Nº 1 en condiciones rigurosas de

25 hibridación.

Es posible que averiguar si está presente ADN que tiene una secuencia nucleotídica que codifica una proteína que tiene actividad biológica de miostatina incluya amplificar el ADN en presencia de cebadores basados en una secuencia nucleotídica que codifica el extremo N-terminal y C-terminal, respectivamente, de la proteína que tiene actividad biológica de miostatina.

Los cebadores, es decir primero y segundo cebadores, pueden basarse en la primera y segunda secuencias nucleotídicas que codifican regiones apartadas entre ellas de la proteína, en las que las regiones flanquean una mutación que se sabe que sucede de forma natural y que cuando está presente en ambos alelos de dicho animal

35 provoca hiperplasia muscular.

También puede ser que el ADN de dicho animal que no presenta hiperplasia muscular contenga una secuencia nucleotídica que hibrida en condiciones rigurosas con una secuencia nucleotídica que codifica una proteína que tiene una secuencia identificada como SEC ID Nº 2 y la secuencia codificante de ADN de dicho animal que presenta hiperplasia muscular se sabe que contiene una deleción de 11 pares de bases que comienza en el par de bases nº 821 de la secuencia codificante, y dicho primer cebador se selecciona para que esté cadena arriba del codón que codifica el ácido glutámico nº 275 y el segundo cebador se selecciona para que esté cadena abajo del codón que codifica el ácido aspártico nº 274.

45 Además, un ADN de dicho animal que no presenta hiperplasia muscular podría no contener una secuencia nucleotídica que hibride en condiciones rigurosas con una secuencia nucleotídica que codifica una proteína que tiene una secuencia identificada como SEC ID Nº 2. La secuencia codificante de ADN de dicho animal que presenta hiperplasia muscular podría saberse que contiene una deleción de 11 pares de bases que comienza en el par de bases nº 821. Puede seleccionarse un cebador que abarque la secuencia nucleotídica que incluye los pares de bases nº 820 y 821 de la secuencia de ADN que contiene la deleción.

El animal puede ser de la raza Azul Belga.

En un aspecto particular, averiguar si está presente ADN que tiene una secuencia nucleotídica que codifica una

55 proteína que tiene actividad biológica de miostatina incluye amplificar el ADN en presencia de un cebador que contiene al menos una parte de una mutación que se sabe que sucede de forma natural y que cuando está presente en ambos alelos de dicho animal provoca hiperplasia muscular.

En otro aspecto, se describe un procedimiento para determinar la presencia de hiperplasia muscular en un animal bovino que incluye obtener una muestra del animal que contiene ARNm y averiguar si está presente un ARNm que codifica una proteína que tiene actividad biológica de miostatina en la muestra. La ausencia de dicho ARNm indica la presencia de hiperplasia muscular en el animal.

Una muestra que contiene ARNm puede ser tejido muscular, particularmente, tejido de músculo esquelético.

65 En un aspecto particular, la invención es un procedimiento para determinar la presencia de doble musculación en un animal bovino, que implica obtener una muestra de material que contiene ADN del animal y averiguar si el ADN

contiene la secuencia nucleotídica identificada como SEC ID Nº 11 en que la ausencia de la secuencia indica doble musculación en el animal.

En un aspecto particular, el animal es de la raza Azul Belga.

5 En otro aspecto, la invención es un procedimiento para determinar el genotipo de miostatina de un mamífero, que puede ser deseable saber con fines de cría. El procedimiento incluye obtener una muestra de material que contiene ácido nucleico del mamífero, en el que el ácido nucleico no está contaminado el ácido nucleico heterólogo; averiguar si la muestra contiene (i) una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína que tiene actividad biológica de miostatina; y averiguar si la muestra contiene (ii) una molécula de ácido nucleico alélico que codifica una proteína que carece de actividad biológica de miostatina. El mamífero puede ser bovino.

La invención incluye un kit de diagnóstico, para determinar la presencia de hiperplasia muscular en un mamífero del cual se ha obtenido una muestra que contiene ADN del mamífero. El kit incluye un primer y segundo cebadores para

15 amplificar el ADN, siendo los cebadores complementarios a las secuencias nucleotídicas del ADN cadena arriba y cadena abajo, respectivamente, de una mutación en la parte del ADN que codifica miostatina que provoca hiperplasia muscular del mamífero, en el que al menos una de las secuencias nucleotídicas se selecciona para que sea de una región no codificante del gen de miostatina. El kit también puede incluir un tercer cebador complementario a una mutación de origen natural de una parte codificante del gen de miostatina.

Un kit de diagnóstico particular, para determinar el genotipo de una muestra de material genético de mamífero, particularmente material bovino incluye un par de cebadores para amplificar una parte del material genético correspondiente a una secuencia nucleotídica que codifica al menos una parte de una proteína miostatina, en el que un primero de los cebadores incluye una secuencia nucleotídica suficientemente complementaria a una mutación de 25 la SEC ID Nº 1 para cebar la amplificación de una molécula de ácido nucleico que contiene la mutación, seleccionándose la mutación entre el grupo de mutaciones resultante de: (a) deleción de 11 nucleótidos empezando en el nucleótido 821 de la parte codificante de la SEC ID Nº 1; (b) deleción de 7 nucleótidos empezando en el nucleótido 419 de la secuencia codificante e inserción de la secuencia AAGCATACAA en el lugar de los mismos; (c) deleción del nucleótido 610 de la secuencia codificante e inserción de T en el lugar del mismo; (d) deleción del nucleótido 676 de la secuencia codificante e inserción de T en el lugar del mismo; y (e) y combinaciones de los mismos. El segundo del par de cebadores se localiza preferentemente cadena arriba completamente o cadena abajo completamente de la mutación o mutaciones seleccionadas. En un kit, uno de dicho primer cebador abarca la mutación (a) y comprende adicionalmente un tercer cebador que es suficientemente complementario a la secuencia nucleotídica identificada como SEC ID Nº 11 para cebar la amplificación de una molécula de ácido nucleico que 35 contiene la SEC ID Nº 11. En otro (o el mismo kit), uno de dicho primer cebador es suficientemente complementario a la secuencia insertada de la mutación (b) para cebar la amplificación de una molécula de ácido nucleico que contiene la mutación (b) y comprende adicionalmente un tercer cebador que es suficientemente complementario a la secuencia correspondiente a la deleción de 7 nucleótidos de la mutación (b) para cebar la amplificación de una molécula de ácido nucleico que contiene la deleción de 7 nucleótidos de la mutación (b). En otro (o el mismo kit), uno de dicho primer cebador abarca la mutación (c) y comprende adicionalmente un tercer cebador que es suficientemente complementario a la secuencia que abarca la correspondiente región que carece de la mutación (c) para cebar la amplificación de una molécula de ácido nucleico que carece de la mutación (c). En otro (o el mismo kit), uno de dicho primer cebador abarca la mutación (d) y comprende adicionalmente un tercer cebador que es suficientemente complementario a la secuencia que abarca la correspondiente región que carece de la mutación (d)

45 para cebar la amplificación de una molécula de ácido nucleico que carece de la mutación (d). En otro (o el mismo kit), uno de dicho primer cebador abarca la mutación (e) y comprende adicionalmente un tercer cebador que es suficientemente complementario a la secuencia que abarca la correspondiente región que carece de la mutación (e) para cebar la amplificación de una molécula de ácido nucleico que carece de la mutación (e).

Se describe una proteína purificada que tiene actividad biológica de miostatina, y que tiene una secuencia de aminoácidos identificada como SEC ID Nº 2, o una variante sustituida de forma conservativa de la misma. Se describe una proteína bovina purificada que tiene actividad biológica de miostatina o una proteína humana purificada (SEC ID Nº 8) que tiene actividad biológica de miostatina.

55 Se describe una molécula aislada de ácido nucleico que codifica una proteína anterior. Se describe una molécula aislada de ácido nucleico que comprende una molécula de ADN que tiene la secuencia nucleotídica identificada como SEC ID Nº 1 o SEC ID Nº 3 o SEC ID Nº 7 o que varía de la secuencia debido a la degeneración del código genético, o una hebra de ácido nucleico capaz de hibridar con al menos una de dicha molécula de ácido nucleico en condiciones rigurosas de hibridación.

Se desvela una sonda que contiene una molécula de ácido nucleico suficientemente complementaria a una secuencia identificada como SEC ID Nº 1, o su complemento, de modo que se una a la misma en condiciones rigurosas. La sonda puede ser una secuencia que es entre aproximadamente 8 y aproximadamente 1195 nucleótidos de longitud.

65 Se desvela una composición de cebadores útil para la detección de la presencia de ADN que codifica miostatina en

ganado bovino. La composición puede incluir un cebador de ácido nucleico sustancialmente complementario a una secuencia de ácido nucleico que codifica una miostatina bovina. La secuencia de ácido nucleico puede identificarse como SEC ID Nº 1.

5 La invención incluye un procedimiento para identificar una secuencia nucleotídica de un gen mutante que codifica una proteína miostatina de un mamífero que presenta hiperplasia muscular. El procedimiento incluye obtener una muestra de material que contiene ADN del mamífero y sondear la muestra usando una sonda de ácido nucleico basada en una secuencia nucleotídica de un gen conocido que codifica miostatina para identificar la secuencia nucleotídica del gen mutante. En un enfoque particular, la sonda se basa en una secuencia nucleotídica identificada como SEC ID Nº 1, SEC ID Nº 5 o SEC ID Nº 7. Preferentemente, la sonda es de al menos 8 ácidos nucleicos de longitud. La etapa de sondear la muestra puede incluir la exposición del ADN a la sonda en condiciones de hibridación y comprender adicionalmente el aislamiento de moléculas hibridadas de ácido nucleico. El procedimiento puede incluir adicionalmente la etapa de secuenciar ADN aislado. El procedimiento puede incluir la etapa de aislar y secuenciar un ADNc o ARNm que codifica la proteína miostatina mutante completa. El procedimiento puede incluir

15 una etapa de aislar y secuenciar una miostatina de tipo silvestre funcional del mamífero que no presenta hiperplasia muscular.

El procedimiento puede incluir la comparación de la secuencia codificante completa de la proteína miostatina mutante completa con, si la secuencia codificante para la miostatina de tipo silvestre funcional de dicho mamífero es previamente conocida, (1) la secuencia conocida, o si la secuencia codificante para una miostatina de tipo silvestre funcional de dicho mamífero es previamente desconocida, (2) la secuencia determinada de acuerdo con la reivindicación 63 o reivindicación 66, para determina la localización de cualquier mutación en el gen mutante.

La invención incluye una composición de cebadores útil para la determinación de una secuencia nucleotídica que

25 codifica una miostatina que contiene una primera molécula de ácido nucleico basada en una secuencia nucleotídica localizada cadena arriba de una mutación determinada de acuerdo con un procedimiento de la invención y una segunda molécula de ácido nucleico basada en una secuencia nucleotídica localizada cadena abajo de la mutación.

Una sonda de la invención puede incluir una molécula de ácido nucleico basada en una secuencia nucleotídica que abarca una mutación determinada de acuerdo con la invención.

Se describe un procedimiento para determinar si una muestra de material genético de mamífero es capaz de conferir un fenotipo caracterizado por hiperplasia muscular, que comprende averiguar si el material genético contiene una secuencia nucleotídica que codifica una proteína que tiene actividad biológica de miostatina, en el que la ausencia

35 de dicha secuencia indica la presencia de hiperplasia muscular en el animal.

Realizaciones adicionales de la invención son como se describe en las reivindicaciones.

Breve descripción de los dibujos

Al describir aspectos particulares de la invención, se hace referencia a los dibujos adjuntos, en donde:

La Figura 1 es un resumen esquemático de información de mapeo genético, físico y comparativo alrededor del locus mh bovino. Se muestra una curva de valor lod de múltiples puntos obtenida para el locus mh con respecto

45 al mapa de marcadores de microsatélite. Los marcadores que no fueron informativos en la genealogía usada se muestran entre paréntesis; su posición en el mapa se infiere de los datos de mapeo publicados. Los marcadores y los YAC de los cuales se aislaron están conectados por flechas. Se muestra el mapa RH de la sección relevante de HSA2 humano, con la posición relativa en cR de los EST usados. Las líneas punteadas conectan marcadores de microsatélite y Tipo I con sus respectivos YAC positivos. Los YAC que muestran productos de SINE-PCR de hibridación cruzada están conectados por los recuadros rojos. La Figura 2(a) muestra electroferogramas obtenidos por secuenciación cíclica de la secuencia de ADNc de miostatina a partir de un animal de doble musculación y uno convencional, que muestra la deleción nt821del(11) (SEC ID Nº11) en el animal de doble musculación. Los cebadores usados para amplificar el fragmento que abarca la deleción del ADN genómico están apartados de los nucleótidos restantes.

55 La Figura 2(b) muestra la secuencia de aminoácidos del alelo nt821del(11) murino (fila superior), bovino normal (fila central) y bovino (fila inferior). El sitio putativo de procesamiento proteolítico está recuadrado, mientras que las nueve cisteínas conservadas en la región carboxi-terminal están subrayadas. Las diferencias entre el alelo bovino normal y nt821del(11) se indican por el doble subrayado. La Figura 3 es una representación esquemática del gen de miostatina bovina con la posición y definición de los polimorfismos de secuencia de ADN identificados. Los recuadros "A" (transparentes) corresponden a las secuencias líder y tráiler no traducidas (diámetro grande), y las secuencias intrónicas (diámetro pequeño) respectivamente. Los recuadros "B", "C", y "D" corresponden a las secuencias que codifican el péptido líder, el péptido asociado a latencia N-terminal y el dominio carboxi-terminal bioactivo de la proteína respectivamente. Las flechas pequeñas "e", "f" y "g" apuntan hacia las posiciones de los cebadores usados para la amplificación

65 de intrones, la amplificación y secuenciación de exones y la secuenciación de exones respectivamente; las correspondientes secuencias cebadoras se presentan en la Tabla 1. Las posiciones de los polimorfismos de

secuencia de ADN identificados se muestran como líneas "h", "i" o "j" en el gen de miostatina para mutaciones silenciosas, conservativas y de interrupción respectivamente. Cada mutación está conectada mediante una flecha con un recuadro que presenta los detalles de la correspondiente secuencia de ADN y la secuencia peptídica finalmente codificada. En cada recuadro, la secuencia variante se compara con la secuencia de control

5 de Holstein-Friesian y las diferencias están resaltadas en color. La Figura 4 muestra la distribución de mutaciones identificadas en las diversas razas examinadas. El orden de las mutaciones de miostatina corresponde a la Figura 3. Todos los animales analizados fueron de doble musculación excepto para los dos Holstein-Friesian y los dos Jersey usados como controles (columna 1).

10 Descripción detallada de las realizaciones preferidas

El procedimiento usado para aislar genes que causan fenotipos específicos es conocido como clonación de candidatos posicionales. Implica: (i) la localización cromosómica del gen que causa el fenotipo específico usando marcadores genéticos en un análisis de vinculación; y (ii) la identificación del gen que causa el fenotipo específico

15 entre los genes "candidatos" que se sabe que están localizados en la región correspondiente. La mayor parte de las veces estos genes candidatos se seleccionan entre información de mapeo disponible en seres humanos y ratones.

Las herramientas necesarias para realizar la localización inicial (etapa (i) anterior) son mapas de marcadores de microsatélite, que están disponibles para especies de ganadería y se encuentran en el dominio público (Bishop y 20 col., 1994; Barendse y col., 1994; Georges y col., 1995; y Kappes, 1997). Las herramientas necesarias para la clonación de candidatos posicionales, particularmente las bibliotecas de YAC (etapa (ii) anterior) están parcialmente disponibles en el dominio público. Están disponibles bibliotecas genómicas con grandes insertos construidas con cromosomas artificiales de levadura ("YAC") en el dominio público para la mayoría de las especies de ganadería incluyendo ganado bovino. Cuando se hace referencia cruzada al mapa humano y de ratón, es necesario identificar

25 el candidato posicional, que está disponible a baja resolución pero tiene que refinarse en cada caso específico para obtener el nivel apropiado de alta resolución. Se describen varias estrategias originales en el presente documento para conseguir este último objetivo. Para los principios generales de clonación de candidatos posicionales, véase Collins, 1995 y Georges y Andersson, 1996.

30 Para permitir una referencia cruzada entre el mapa génico bovino y humano como parte del enfoque de clonación de candidatos posicionales, HSA2q31-32 (mapa del brazo largo del cromosoma humano 2, bandas citogenéticas q3132) y BTA2q12-22 (mapa del brazo del cromosoma bovino 2, bandas citogenéticas q12-22) se integraron basándose en YAC bovinos de coincidencia como se describe a continuación.

35 Usando una población de retrocruzamiento experimental descrita anteriormente [(normal x doble musculación) x doble musculación] que comprende 108 individuos de retrocruzamiento, se mapeó recientemente el locus mh por análisis de vinculación con la punta centromérica del cromosoma bovino 2 (BTA2), a 3,1 centiMorgan proximal del último marcador en el mapa de vinculación: TGLA44 (Charlier y col., 1995). También se supo a partir de trabajos previos que el pro-α(III) colágeno (Col3Al) estaba localizado en la misma región cromosómica que el locus mh.

40 Col3Al se ha mapeado en BTA2q12-22 por hibridación in situ (Solinas-Toldo y col., 1995), mientras que se demostró que un marcador RFLP de Col3Al estaba estrechamente vinculado con TGLA44 (θ=2%) (Fisher y col., 1996). Esto identifica la región que flanquea Col3Al en el mapa humano, es decir HSA2q31-32, como el segmento cromosómico humano probablemente ortólogo. Esta suposición es compatible con los datos de experimentos Zoo-FISH (Solinas-Toldo y col., 1995) así como los datos de mapeo de marcadores Tipo I sobre híbridos de células somáticas (O'Brien

45 ycol., 1993), que establecen una correspondencia evolutiva entre segmentos de HSA2q y BTA2.

Para refinar la correspondencia entre los mapas de HSA2q31-33 y BTA2q12-22, se desarrollaron secuencias marcadas ancladas comparativas o CATS, es decir pares de cebadores que amplificarían un sitio marcador con secuencia o STS del gen ortólogo en diferentes especies (Lyons y col., 1996), para una serie de genes que

50 flanquean Col3A1 en el mapa humano y para los cuales hay información de secuencia disponible en más de un mamífero. Además de Col3Al, se obtuvieron CATS de trabajo para α2(V) colágeno (Col5A2), inositol polifosfato-1 fosfatasa (INPP1), precursor de inhibidor de la vía del factor tisular (TFPI), titina (TTN), n-quimerina (CHN), glutamato descarboxilasa 67 (GAD1), proteína 4 asociada a linfocitos T citotóxicos (CTLA4) y glucoproteína CD28 de membrana celular de linfocitos T (CD28). Las secuencias cebadores correspondientes se dan en la Tabla 1.

Tabla 1:

CATS

INPP1: UP: 5' CAGCAAAGTCCTTAATGGTAACAAGC 3' DN: 5' GGGTCACTGAAGAAAACGTCCTG 3'

COL3A1: UP: 5' CCCCATATTATGGAGATGAACCG 3' DN: 5' AGTTCAGGATGGCAGAATTTCAG 3'

COL5A2: UP: 5' GCAAACTGGGYGGRAGCAAGACC 3' DN: 5' TTSTTCCTGGGCTTTTATTGAGAC 3'

TFPI: UP: 5' AAGCCWGATTTCTGCTTYTTGGAAG 3' DN: 5' TGCCMAGGCAHCCRCCRTACTTGAA 3'

TTN: UP: 5' GGTCGTCCTACACCAGAAG 3' DN: 5' GGTTGACATTGTCAAGAACAAG 3'

CHN: UP: 5' TCTCMAAAGTCGTCTGTGACAATC 3' DN: 5' TGYTCRTTTTCTTTCAGAGTTGC 3'

GAD1: UP: 5' RCTGGTCCTCTTCACCTCAGAAC 3' DN: 5' ACATTGTCVGTTCCAAAGCCAAG 3'

CTLA4: UP: 5' AGGTYCGGGTGACDGTGCTKC 3' DN: 5' TGGRTACATGAGYTCCACCTTGC 3'

CD28: UP: 5' AGCTGCARGTATWCCTACAAYCT 3' DN: 5' GTYCCRTTGCTCYTCTCRTTGYC 3'

Marcadores de microsatélite

TGLA44: UP:5' AACTGTATATTGAGAGCCTACCATG 3' DN: 5' CACACCTTAGCGACTAAACCACCA 3'

BULGE27: UP: 5' CTACCTAACAGAATGATTTTGTAAG 3' DN: 5' AGTGTTCTTGCCTAGAGAATCCCAG 3'

BULGE23: UP: 5' ACATTCTCTCACCAATATGACATAC 3' DN: 5' TAAGTCACCATTACATCCTTAGAAC 3'

BM81124: UP: 5' GCTGTAAGAATCTTCATTAAGCACT 3' DN: 5' CCTGATACATGCTAAGGTTAAAAAC 3'

BULGE28: UP: 5' AGGCATACATCTGGAGAGAAACATG 3' DN: 5' CAGAGGAGCCTAGCAGGCTACCGTC 3'

BULGE20: UP: 5' CAGCAGGTCTGTTGAAGTGTATCAG 3' DN: 5' AGTGGTAGCATTCACAGGTAGCCAG 3'

BM3627: UP: 5' CAGTCCATGGCACCATAAAG 3' DN: 5' TCCGTTAGTACTGGCTAATTGC 3'

ILSTS026: UP: 5' CTGAATTGGCTCCAAAGGCC 3' DN: 5' AAACAGAAGTCCAGGGCTGC 3'

INRA40: UP: 5' TCAGTCTCCAGGAGAGAAAAC 3' DN: 5' CTCTGCCCTGGGGATGATTG 3'

Cebadores de miostatina bovina

GDF8,19: 5' AATGTATGTTTATATTTACCTGTTCATG 3'

GDF8,11: 5' ACAGTGTTTGTGCAAATCCTGAGAC 3'

GDF8,12: 5' CAATGCCTAAGTTGGATTCAGGTTG 3'

GDF8,25: 5' CTTG CTGTAACCTTCCCAG GACCAG 3'

GDF8,15: 5' TCCCATCCAAAGGCTTCAAAATC 3'

GDF8,21: 5' ATACTCWAGGCCTAYAGCCTGTGGT 3'

Lectura de izquierda a derecha de y hacia abajo en la tabla, las secuencias dadas en la Tabla 1 se identifican como SEC ID Nº 12 a SEC ID Nº 53, respectivamente.

Estas CATS se usaron para seleccionar una biblioteca de YAC bovino equivalente de 6 genomas por PCR usando una estrategia de combinación tridimensional como se describe por Libert y col., 1993. La misma biblioteca de YAC también se seleccionó con todos los marcadores de microsatélite disponibles para BTA2 proximal, es decir TGLA44,

5 BM81124, BM3627, ILSTS026, INRA40 y TGLA431 (Kappes y col., 1997).

El solapamiento potencial entre los YAC obtenidos con este panel de STS se exploró basándose en el contenido de STS común, así como hibridación cruzada entre el producto de SINE-PCR de los YAC individuales. A partir de este análisis, surgieron tres cóntigos independientes de YAC en la región de interés: (i) el cóntigo A que contiene los

10 microsatélites TGLA44, BM81124 y el marcador Tipo I INPP1; (ii) el cóntigo B que contiene Col3Al y Col5A2; y (iii) el cóntigo C que contiene los marcadores de microsatélite BM3627, ILSTS026 y INRA40, y el marcador Tipo I TFPI.

Ninguno de los microsatélites disponibles mapearon en el cóntigo B, por lo tanto este grupo de YAC no pudo posicionarse en ganado bovino con respecto a los otros dos cóntigos. La información de mapeo disponible en el ser

15 humano, sin embargo, permitió la predicción de la posición del cóntigo B entre los cóntigos A y C. Para ensayar esta hipótesis, se aislaron dos nuevos marcadores de microsatélite del cóntigo B, BULGE20 y BULGE28. BULGE20 demostró ser polimórfico, permitiendo el genotipado de la población experimental de retrocruzamiento.

Además, para aumentar la capacidad informativa de los marcadores disponibles para el cóntigo A, se desarrollaron

20 dos nuevos marcadores de microsatélite a partir de este cóntigo: BULGE23 y BULGE27. BULGE23 demostró ser polimórfico y se usó para tipar el mismo material de genealogía.

Todos los genotipos resultantes se usaron para construir un mapa de vinculación usando el programa ILINK (Lathrop y Lalouel, 1984). Se obtuvo el siguiente orden más probable y tasas de recombinación promediadas por sexo entre

25 marcadores adyacentes: [TGLA44-(0%)-BULG23]-(6,1%)-BULG20-(1,6%)-ILSTS026-(2,3%)-INRA40-(7,1%)-TGLA431. La posición de BULGE20 entre TGLA44 e ILSTS026 confirmó el orden previsto de los tres cóntigos. La Figura 1 resume la información de mapeo resultante.

Se emprendió un análisis de vinculación de múltiples puntos usando LINKMAP, para posicionar el locus mh con

30 respecto al nuevo mapa de marcadores. El análisis de vinculación se realizó en un modelo recesivo simple, suponiendo penetrancia completa para individuos mhlmh y penetrancia cero para los otros dos genotipos. Se obtuvo la curva de valores LOD mostrada en la Figura 1, que sitúa el locus mh en el intervalo TGLA44-BULGE20 con un valor LOD máximo asociado de 26,4. Tres individuos de retrocruzamiento demostraron recombinar con los marcadores BULGE20 y distal, pero no con TGLA44 y BULGE23, situando por lo tanto el locus mh proximal de este

35 marcador. Un individuo demostró recombinar con TGLA44 y BULGE23, pero no con los marcadores más distales, posicionando por lo tanto el locus mh distal de TGLA44 y BULGE23. Dada la posición relativa de estos marcadores de microsatélite con respecto a INPP1 y Col3Al deducida de la integración del mapa humano y bovino, estos resultados indicaron que el gen mh está probablemente localizado en un segmento cromosómico unido por INPP1 y Col3Al.

40 Recientemente, McPherron y col. (1997) demostraron que ratones homocigóticos para una deleción de desactivación de GDF-8 o miostatina, se caracterizaban por un aumento generalizado en la masa de músculo esquelético. Usando la secuencia publicada del ADNc de miostatina murina de 2676 pb (número de acceso a GenBank U84005), se identificó un grupo consenso humano provisional (THC) en la base de datos Unigene que

45 representaba tres clones de ADNc (221299, 300367, 308202) y seis secuencias EST (marca de secuencia

expresada) (H92027, H92028, N80248, N95327, W07375, W24782). El THC correspondiente cubría 1296 pb del gen de miostatina humana, que muestra una homología del 78,1% con la secuencia murina cuando se promedia sobre la secuencia completa, y del 91,1% cuando se consideran solamente las partes traducidas de los genes humano y murino (566 pb). Este THC por lo tanto corresponde muy probablemente al ortólogo humano del gen de miostatina 5 murina. Por tanto se prepararon los cebadores (5'-GGCCCAACTATGGATATATTTG-3' (SEC ID Nº 9) y 5'-GGTCCTGGGAAGGTTACAGCA-3' (SEC ID Nº 10)) para amplificar un fragmento de 272 pb desde el segundo exón de miostatina humana y se usaron para genotipar el panel de híbridos de radiación Genebridge-4 de genoma completo (Walter y col., 1994). Se usó el programa RHMapper (Slonim y col., no publicado) para posicionar el gen de miostatina con respecto al mapa de híbridos de radiación flanqueante WhiteheadlMIT, situándolo en la posición 948,7 cR del mapa de HSA2 con un valor lod asociado > 3. Un examen más cercano del vector de segregación de miostatina y su confrontación con los vectores de todos los marcadores localizados en esa región (cesión de datos 11.9, mayo de 1997) demostró que era idéntico a EST SGC38239 situado en el mapa de híbridos de radiación WhiteheadlMIT (Hudson y col., 1995) en la posición 946,8 cR de HSA2. Esto sitúa el gen de miostatina humana en el mapa RH en el intervalo entre Col3Al (EST WI16343 -942,5 cR) e INPP1 (EST L08488 -950,2 a 951,2 cR)

15 (Figura 1). La miostatina por lo tanto pareció un candidato posicional muy fuerte para el gen mh.

Para ensayar la implicación potencial de miostatina en la determinación de la doble musculación en ganado bovino, se diseñaron pares de cebadores basados en la secuencia disponible de miostatina de ratón y humana, con el objetivo de amplificar la secuencia codificante completa a partir del ADNc bovino usando PCR (reacción en cadena de la polimerasa). Siempre que fue posible, los cebadores se posicionaron por lo tanto en partes de la secuencia de miostatina que mostraban un 100% de homología entre ratón y ser humano. Se identificaron dos pares de cebadores que amplificaban los que se predijo que representaba el 98,4% de la secuencia codificante bovina más 74 pb de la secuencia no traducida 3', en dos fragmentos de ADN solapantes, respectivamente de 660 (cebadores GDF8.19 -GDF8.12) y 724 pb (cebadores GDF8.11 -GDF8.21) de longitud. Los productos esperados de ADN se

25 amplificaron satisfactoriamente a partir de ADNc generado a partir de músculo esquelético tanto de un animal normal (homocigótico (SEC ID Nº 1) como uno de doble musculación (homocigótico mhlmh) (SEC ID Nº 3), y se secuenciaron cíclicamente en ambas hebras.

La secuencia nucleotídica correspondiente al alelo normal presentaba una identidad del 88,9% con la secuencia de miostatina de ratón (SEC ID Nº 5) sobre un solapamiento de 1067 pb, y contenía la fase de lectura abierta esperada que codifica una proteína (SEC ID Nº 2) que muestra una identidad del 92,9% en un solapamiento de 354 aminoácido con miostatina de ratón (SEC ID Nº 6). Como se esperaba para un miembro de la superfamilia de TGFβ, el gen de miostatina bovina se caracteriza por un sitio de procesamiento proteolítico que se cree que media la escisión del dominio carboxi-terminal bioactivo del fragmento N-terminal más largo, y mediante nueve restos de

35 cisteína separados por un espaciado característico y sospechoso de estar implicado en puentes disulfuro intra-e inter-moleculares (McPherron y Lee, 1996).

La secuencia nucleotídica obtenida del alelo mh fue idéntica al alelo normal sobre su longitud completa, excepto por una deleción de 11 pb que implica los nucleótidos 821 a 831 (a partir del codón de inicio). Esta deleción de desplazamiento de fase, que sucede después del primer resto de cisteína del dominio carboxi-terminal, altera drásticamente la secuencia de aminoácidos cadena abajo y revela un codón de parada prematura después de 13 aminoácidos, véase la Figura 2. La secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia mutante de ácido nucleico se identifica como SEC ID Nº 4. Esta mutación altera la parte bioactiva de la molécula y por lo tanto es muy probable que sea la causa del fenotipo recesivo de doble musculación. Siguiendo la nomenclatura convencional, esta

45 mutación se mencionará como nt829(del11).

Para reforzar adicionalmente la suposición de la causalidad de esta mutación, se prepararon pares de cebadores que flanquean la deleción (Figura 2) y se amplificó el segmento correspondiente de ADN de todos los animales de la población de retrocruzamiento experimental. Se realizó PCR en presencia de dCTP32 para marcar de forma radiactiva el producto de amplificación. Los productos de amplificación se separaron en geles desnaturalizantes de poliacrilamida y se detectaron por auto-radiografía. Se esperaría un producto de 188 pb para el alelo normal y un producto de 177 pb para el alelo nt821(del11). La correlación entre el fenotipo y el genotipo se ajustó para la genealogía completa. Se descubrió que los diez toros de doble musculación BBCB eran homocigóticos para la mutación nt821(del11), las 41 hembras F1 eran heterocigóticas, mientras que los 53 descendientes de doble

55 musculación eran homocigóticos para la mutación, los 55 animales convencionales restantes eran heterocigóticos.

Para examinar la distribución de la mutación nt821(del11) en diferentes razas convencionales y de doble musculación, se genotipó una cohorte de 25 individuos normales que representa dos razas lecheras (Holstein-Friesian, Roja-y-Blanca) y una cohorte de 52 animales de doble musculación que representa cuatro razas (BBCB, Asturiana, Maine-Anjou y Piémontese). Los resultados se resumen en la Tabla 2. Todos los animales lecheros eran normales homocigóticos excepto un toro Rojo-y-Blanco que demostró ser heterocigótico. La aparición de una pequeña fracción de individuos que portaban la mutación ganado bovino lechero no es inesperada ya que el fenotipo está ocasionalmente descrito en esta raza. En BBCB y Asturiana, todos los animales de doble musculación fueron homocigóticos para la deleción nt821(del11), lo que apunta hacia homogeneidad alélica en estas dos razas. Se 65 descubrió que los animales Maine-Anjou y Piémontese de doble musculación eran "normales" homocigóticos, es decir no mostraron la deleción nt821(del11) sino una sustitución distinta de cisteína a tirosina (C313Y) en animales

Piémontese de doble musculación identificados por otros (Kambadur y col., 1997).

Tabla 2:

Raza: Fenotipo +/+ Genotipo +/nt821(del11) nt821(del11)/nt821(del11)

Azul Belga: DM 29

Asturiana: DM 10

Piémontese: DM 8

Maine-Anjou: DM 4

Holstein-Friesian: Normal 13

Roja-y-Blanca: Normal 12 1

5 También se determinó la secuencia codificante completa para el gen de miostatina en individuos de doble musculación a partir de diez razas europeas de ganado bovino y se identificó una serie de mutaciones que alteraba la función miostatina.

La secuencia codificante de cuatro individuos de control Holstein-Friesian y Jersey fue idéntica al alelo de tipo

10 silvestre previamente descrito (Grobet y col., 1997), lo que indica adicionalmente que era la secuencia codificante de genuina de miostatina la que se estaba amplificando, y no un pseudogén no funcional.

Entre los 32 animales de doble musculación, se encontraron siete variantes de secuencia de ADN dentro de la región codificante, como se resume en la Figura 3.

15 Además de la mutación nt821(del11) en el tercer exón, descrita anteriormente, se encontraron cuatro nuevas mutaciones que se esperaría que alteraran la función miostatina. Una inserción/deleción en la posición 419 a partir del codón de inicio, que remplaza 7 pares de bases con un tramo aparentemente no relacionado de 10 presente de bases, revela un codón de parada prematura en el péptido asociado a latencia N-terminal en la posición de

20 aminoácido 140. Esta mutación se menciona como nt419(del7-ins10). Dos sustituciones de pares de bases en el segundo exón, una transición C→T en la posición de nucleótido 610 y una transversión G→T en la posición de nucleótido 676, produjeron, cada una, un codón de parada prematura en el mismo péptido asociado a latencia Nterminal en las posiciones de aminoácido 204 y 226 respectivamente. Estas mutaciones se llaman Q204X y E226X respectivamente. Finalmente, una transición G→A en la posición de nucleótido 938 provoca la sustitución de una

25 cisteína por una tirosina. Esta mutación se menciona como C313Y. Esta cisteína es la quinta de nueve restos de cisteína altamente conservados típicos de los miembros de la superfamilia de TGF-β y compartidos en particular por TGF-β1, -β2y -β3, e inhibina-βA y -βB (McPherron y Lee, 1996). Se cree que están implicados en un puente disulfuro intramolecular que estabiliza la conformación tridimensional del péptido carboxi-terminal bioactivo. Su sustitución por lo tanto probablemente afecte a la estructura y función de la proteína. Esta C313Y recientemente

30 también se ha descrito por Kambadur y col. (1997).

También se encontró una sustitución conservativa de fenilalanina a leucina en la posición de aminoácido 94 en el primer exón, debida a una transversión C→A en la posición de nucleótido 282 del gen de miostatina. Dada la naturaleza conservativa de la sustitución de aminoácido, su localización en el péptido asociado a latencia N-terminal

35 menos conservado, y como se observó esta mutación en condiciones homocigóticas en animales que no estaba mostrando ningún síntoma de desarrollo muscular excepcional, esta mutación probablemente no interfiere drásticamente con la función miostática de la proteína codificada, en caso de hacerlo. Esta mutación se menciona como F94L. La proteína murina se caracteriza por una tirosina en la posición de aminoácido correspondiente.

40 También se identificó una transición silenciosa C→T en la tercera posición del 138º codón de citosina en el segundo exón, mencionada como nt414(C-T).

Además de estos polimorfismos de secuencia de ADN detectados en la región codificante del gen de miostatina, también se encontraron cuatro variantes de secuencia de ADN en secuencias intrónicas que son probablemente

45 polimorfismos neutros y a las que se han asignado los siguientes símbolos: nt374-51(T-C), nt374-50(G-A), nt37416(del1) en el intrón 1, y nt748-78(del1) en el intrón 2 (Figura 3).

La Figura 4 muestra la distribución observada de mutaciones en la muestra analizada clasificadas por raza. Para la mayoría de las razas estudiadas, los animales analizados de doble musculación fueron homocigóticos para una de

50 las cinco mutaciones descritas que se espera que alteren la función miostatina o heterocigóticos compuestos para dos de estas mutaciones. Esto es compatible con la hipótesis de que la condición de doble musculación tiene un modo recesivo de herencia en todas estas razas.

Solamente en Limousin y Blonde d'Aquitaine no hubo evidencias claras para el papel de las mutaciones de pérdida

55 de función de miostatina en el determinismo de la hipertrofia muscular observada. La mayoría de los animales Limousin fueron homocigóticos para la sustitución conservativa F94L que es improbable que cause la hipertrofia muscular que caracteriza estos animales, como se ha analizado anteriormente. Un animal Limousin demostró ser

heterocigótico para esta mutación, siendo el otro alelo el de "tipo silvestre". Todos los animales Blonde d'Aquitaine fueron homocigóticos de "tipo silvestre". Estos datos indican que el gen de miostatina posiblemente no está implicado en la condición de doble musculación que caracteriza estas dos razas, o que existen mutaciones adicionales de miostatina fuera de la región codificante. La condición de doble musculación a menudo se considera

5 menos pronunciada en animales Limousin en comparación con otras razas.

Los datos indican que algunas mutaciones, tales como nt821del(11) y C313Y, están compartidas por varias razas, lo que apunta hacia migración génica entre las correspondientes poblaciones, mientras que otras parecen estar confinadas a razas específicas. Además, aunque algunas razas (la raza Azul Belga en particular) parece ser esencialmente homogénea genéticamente otras muestras evidencias claras de heterogeneidad alélica (por ejemplo, Maine-Anjou).

La observación de heterogeneidad alélica desmiente la visión clásica de que una única mutación mh se propagó a través del continente europeo a principios del siglo 19º con la diseminación de la raza Shortorn desde las Islas

15 Británicas (Ménissier, 1982). Dos de las mutaciones al menos están compartidas por más de una raza, lo que indica algún grado de migración génica pero definitivamente no desde un único origen.

En ratones, y además de los ratones knock-out para miostatina generados in vitro (McPherron y Lee, 1997), la mutación compact podría deberse a una mutación de origen natural en el gen de miostatina. El locus compact se ha mapeado en el intervalo D1Mit375-D1Mit21 en el cromosoma 1 de ratón que se sabe que es ortólogo a HSA2q31-32 y BTA2q12-22 (Varga y col., 1997).

Desde una perspectiva aplicada, la caracterización de un panel de mutaciones en el gen de miostatina asociadas con doble musculación contribuye al establecimiento de un sistema de selección de diagnóstico que permite la

25 selección asistida por marcadores de o frente a esta condición en ganado bovino.

Ejemplo 1

Mapeo genético y físico

La integración de los mapas de HSA2q31-32 y BTA2q12-22 se hizo usando YAC coincidentes y el locus mh se posicionó en el intervalo flanqueado por Col3Al y INPP1 del siguiente modo. El mapeo genético se realizó usando una población de retrocruzamiento experimental previamente descrita (Holstein-Friesian x Azul Belga) x Azul Belga a partir de 108 individuos informativos (Charlier y col., 1995). El genotipado de microsatélites se realizó de acuerdo

35 con procedimientos convencionales (Georges y col., 1995), usando las secuencias cebadoras presentadas en la Tabla 1. Los análisis de vinculación se realizaron con los programas MLINK, ILINK y LINKMAP de los paquetes LINKAGE (versión 5.1) y FASTLINK (versión 2.3P, junio de 1995) (Lathrop y Lalouel, 1984; Cottingham y col., 1993). La biblioteca de YAC se seleccionó por PCR usando un esquema de combinación tridimensional como se describe en Libert y col., 1993. Los pares de cebadores correspondientes a las CATS usadas para seleccionar la biblioteca se presentan en la Tabla 1. La hibridación cruzada entre los productos de SINE-PCR de YAC individuales se realizó de acuerdo con Hunter y col. (1996), usando cebadores presentados en Lenstra y col. (1993). Los microsatélites se aislaron de YAC de acuerdo con Cornelis y col. (1992).

Ejemplo 2

Mapeo del gen de miostatina humana sobre el panel Genebridge-4

El ADN del panel Genebridge-4 (Walter y col., 1994) se adquirió de Research Genetics (Huntsville, Alabama), y se genotipo por PCR usando procedimientos convencionales y el siguiente par de cebadores de miostatina humana (5'-GGCCCAACTATGGATATATTTG-3' y 5'-GGTCCTGGGAAGGTTACAGCA-3'). El mapeo se realizó mediante el servidor WWW del Whitehead Institute/MIT Center for Genome Research usando su programa RH-mapper (Slonim, D.; Stein, L.; Kruglyak, L.; Lander, E., no publicado) para posicionar los marcadores con respecto al mapa flanqueante. Se compararon vectores de segregación de los marcadores de consulta con los vectores de todos los marcadores en la región de interés en la cesión de datos completa 11.9 (mayo de 1997) para obtener una posición

55 más precisa. Esto posiciona la miostatina en el INPP1-Col3Al en el mapa humano con valor LOD superior a 3.

Ejemplo 3

RT-PCR

Para clonar el ortólogo de miostatina bovina se escogió una estrategia basada en amplificación por RT-PCR de ADNc de músculo esquelético. Se extrajo el ARN total de músculo esquelético (Triceps brachialis) de acuerdo con Chirgwin y col. (1979). Se realizó RT-PCR usando el kit de PCR de ARN Gene-Amp (Perkin-Elmer) y los cebadores presentados en la Tabla 1. Los productos de PCR se purificaron usando el kit de purificación por PCR QiaQuick

65 (Qiagen) y se secuenciaron usando la reacción lista para secuenciación cíclica con terminador con colorante (Perkin-Elmer) y un secuenciador automático ABI373, usando los cebadores presentados en la Tabla 2.

Ejemplo 4

Diagnóstico de la deleción nt821(del11)

5 Para diagnosticar nt821(del11) se diseñaron las siguientes secuencias cebadoras que flanquean la deleción nt821(del11): 5'-TCTAGGAGAGATTTTGGGCTT-3' (SEC ID Nº 53) y 5'-GATGGGTATGAGGATACTTTTGC-3' (SEC ID Nº 52). Estos cebadores amplifican un fragmento de 188 pb de individuos normales y un fragmento de 177 pb de individuos de doble musculación. Los individuos heterocigóticos muestran los dos productos de amplificación. Estos productos de amplificación pueden detectarse usando una diversidad de procedimientos. En este ejemplo el

10 producto de PCR se marcó por incorporación de dCTP32, se separó en un gel desnaturalizante de acrilamida y se reveló por auto-radiografía. Otros enfoques que podrían usarse para distinguir los tres fenotipos diferentes son conocidos para los especialistas en la técnica e incluirían separación en geles de agarosa y visualización con bromuro de etidio, secuenciación directa, ensayos TaqMan, hibridación con oligonucleótidos específicos de alelo, dot-blot inversa, análisis de RFLP y varios otros. La especificidad del ensayo está ligada a la mutación detectada y

15 no a los cebadores usados en el procedimiento de detección. Eso significa que pueden diseñarse fácilmente otros cebadores basándose en dicha secuencia de miostatina bovina que cumplirían los mismos requisitos.

Ejemplo 5

20 Determinación de mutaciones en otras razas

Se muestreó un total de 32 animales con desarrollo muscular extremo a partir de diez razas europeas de ganado vacuno en que se sabe que la doble musculación sucede a frecuencia alta a moderada: (i) Bélgica: Azul Belga (4),

(ii) Francia: Blonde d'Aquitaine (5), Charolais (2), Gasconne (2), Limousin (5), Maine-Anjou (4), Parthenaise (3), (ii)

25 España: Asturiana (2), Rubia Gallega (2), (iv) Italia: Piedmontese (2). La determinación del fenotipo de doble musculación de los animales muestreados se realizó visualmente por observadores experimentados. Se analizaron cuatro animales con fenotipo convencional muestreados de las poblaciones lecheras Holstein-Friesian (2) y Jersey

(2) como controles.

30 Para facilitar el estudio de la secuencia codificante de miostatina a partir de ADN genómico, se determinaron las secuencias de los límites exón-intrón del gen bovino. En ratones, se sabe que el gen de miostatina está interrumpido por dos intrones, respectivamente ≈ 1,5 y 2,4 kb de longitud (McPherron y Lee, 1997). Por tanto se diseñaron dos pares de cebadores, respectivamente, en los exones bovinos 1 y 2, y los exones 2 y 3, que se había predicho que flanquean los dos intrones, suponiendo la conservación de la organización génica entre ratón y ganado bovino

35 (Figura 3 y Tabla 3). Usando estos conjuntos de cebadores, se generaron dos productos de PCR respectivamente de 2 kb y 3,5 kb de longitud a partir de un clon YAC (179A3) que contenía el gen de miostatina bovina (Grobet y col., 1997). Los productos de PCR se purificaron usando el kit de purificación por PCR QiaQuick (Qiagen) y se secuenciaron parcialmente usando la reacción lista para secuenciación cíclica con terminador con colorante (Perkin-Elmer) y un secuenciador automático ABI373. La alineación con la secuencia de ADNc bovina identificó los cuatro

40 límites predichos exón-intrón. La secuencia nucleotídica correspondiente al ADN genómico bovino se identifica como SEC ID Nº 54.

Tabla 3: Cebadores usados para amplificación por PCR y secuenciación cíclica.

Intrón1-5': 5'-GAAGACGATGACTACCAC GCCAGGACG-3' Intrón1-3' 5'-CTAGTTTATTGTATTGTATCTT AGAGC-3'

Intrón2-5': 5'-AGACTCCTACAACAGTGT TTGT-3' Intrón2-3' 5'-ATACTCWAGGCCTAYAGCCT GTGGT-3'

Exón1-5': 5'-ATTCACTGGTGTGGCAAG TTGTCTCTCAGA-3' Exón1-3' 5'-CCCTCCTCCTTACATACAAGC CAGCAG-3'

Exón2-5': 5'-GTTCATAGATTGATATGG AGGTGTTCG-3' Exón2-3' 5'-ATAAGCACAGGAAACTGGTAG TTATT-3'

Exón3-5': 5'-GAAATGTGACATAAGCAA AATGATTAG-3' Exón3-3' 5'-ATACTCWAGGCCTAYAGCCT GTGGT-3'

Exón1-Sec1: 5'-TTGAGGATGTAGTGTTTT CC-3' Exón1-Sec2 5'-GCCATAAAAATCCAAATCCTC AG-3'

Exón2-Sec1: 5'-CATTTATAGCTGATCTTC TAACGCAAG-3' Exón2-Sec2 5'-TGTCGCAGGAGTCTTGACAG GCCTCAG-3'

Exón2-Sec3: 5'-GTACAAGGTATACTGGAA TCCGATCTC-3'

Exón3-Sec1: 5'-AGCAGGGGCCGGCTGAA CCTCTGGG-3' Exón3-Sec2 5'-CCCCAGAGGTTCAGCCGGCC CCTGC-3'

Basándose en las secuencias exónicas e intrónicas disponibles del gen de miostatina bovina, se diseñaron tres pares de cebadores que permiten de forma conjunta la amplificación conveniente de la secuencia codificante completa a partir del ADN genómico. La posición de los cebadores correspondientes se muestra en la Figura 3, y las secuencias correspondientes se presentan en la Tabla 3.

5 Después de amplificación por PCR de la secuencia codificante completa a partir del ADN genómico en los tres fragmentos descritos, éstos se purificaron usando el kit de purificación por PCR QiaQuick (Qiagen) y se secuenciaron usando la reacción lista para secuenciación cíclica con terminador con colorante (Perkin-Elmer) y un secuenciador automático ABI373, usando los cebadores usados para la amplificación así como una serie de cebadores anidados (Figura 3 y Tabla 3). Los archivos con coloración producidos con el secuenciador ABI373 se analizaron con la aplicación Polyphred (D. Nickerson, comunicación personal), que es parte de una serie de programas de análisis de secuencia incluyendo Phred (Ewing, B. y Green, P. (1992), no publicado), Phrap (Green,

P. (1994), no publicado) y Consed (Gordon, D. (1995), no publicado), pero lo haría cualquier programa de secuenciación adecuado, como saben los especialistas en la técnica.

15 Pueden ser útiles anticuerpos monoclonales (Mab) específicos para miostatina. En el caso de la proteína bovina que tiene la secuencia de aminoácidos identificada como SEC ID Nº 2, por ejemplo, pueden usarse anticuerpos con fines de diagnóstico tal como para determinar los niveles de proteína miostatina en tejido muscular. Para producir estos anticuerpos, se prepara miostatina purificada. La miostatina puede producirse en células bacterianas como una proteína de fusión con glutatión-S-transferasa usando el vector pGEX2 (Pharmacia). Esto permite la purificación de la proteína de fusión por cromatografía de afinidad a GSH. En otro enfoque, la miostatina se expresa como una proteína de fusión con el dominio bacteriano de unión a maltosa. La proteína de fusión por tanto se recupera de extractos bacterianos pasando el extracto sobre una columna de resina de amilosa seguido de elución de la proteína de fusión con maltosa. Para esta construcción de fusión, puede usarse el vector pMalC2, disponible en el mercado

25 en New England Biolabs. Puede ser útil la preparación de una segunda proteína de fusión en la selección preliminar de Mab.

La generación de hibridomas que expresan anticuerpos monoclonales que reconocen la proteína miostatina se realiza del siguiente modo: a ratones BALBlc se les inyecta por vía intraperitoneal adyuvante proteico tres veces a intervalos de un mes, seguido de una inyección final en la vena de la cola poco antes de la fusión celular. Se recogen células del bazo y se fusionan con células de mieloma NS-1 (American Type Culture Collection, Rockville, MD) usando polietilenglicol 4000 de acuerdo con protocolos convencionales (Kennett, 1979; Mirski, 1989). El proceso de fusión celular se realiza como se describe en más detalle a continuación.

35 Las células fusionadas se siembran en placas de 96 pocillos con células de exudado peritoneal y esplenocitos irradiados de ratones BALBlCc como capas de alimentación y se realiza selección con hipoxantina, aminopterina, y timidina (medio HAT).

Se usa un ensayo ELISA como procedimiento de selección inicial. Se usan 1-10 µg de miostatina purificada (escindida de la proteína de fusión) en PBS para recubrir pocillos individuales, y se incuban 50-100 µl por pocillo de sobrenadantes de hibridoma. Se usan anticuerpos anti-ratón conjugados con peroxidasa de rábano rusticano para el ensayo colorimétrico.

Los hibridomas positivos se clonan por dilución limitante y se cultivan a gran escala para congelación y producción

45 de anticuerpos. Se seleccionan diversos hibridomas positivos por su utilidad en transferencia de western e inmunohistoquímica, así como para reactividad cruzada con proteínas miostatina de diferentes especies, por ejemplo las proteínas de ratón y humana.

Como alternativa, puede realizarse inmunización activa mediante la generación de un anticuerpo endógeno por exposición directa del animal huésped a pequeñas cantidades de antígeno. La inmunización activa implica la inyección de cantidades insignificantes de antígeno (g) que probablemente no inducirán una repuesta fisiológica y se degradarán rápidamente. El antígeno solamente tendrá que administrarse como inmunizaciones de sensibilización y refuerzo de forma muy parece a las técnicas usadas para conferir resistencia a enfermedades (Pell y col., 1997).

55 Por supuesto se entenderá que es posible una diversidad de sustituciones de aminoácidos conservando al mismo tiempo la estructura responsable de la actividad miostatina de las proteínas desveladas en el presente documento. Se describen sustituciones conservativas en la bibliografía de patentes, como por ejemplo, en la patente de Estados Unidos Nº 5.264.558 o 5.487.983. Por tanto se espera, por ejemplo, que fuera posible intercambio entre aminoácidos neutros alifáticos no polares, glicina, alanina, prolina, valina e isoleucina. Asimismo, podría ser posible hacer sustituciones entre los aminoácidos neutros alifáticos polares, serina, treonina, metionina, asparagina y glutamina. Probablemente podrían hacerse sustituciones entre los aminoácidos ácidos cargados, ácido aspártico y ácido glutámico, como también sustituciones entre los aminoácidos básicos cargados, lisina y arginina. Probablemente también serían posibles sustituciones entre los aminoácidos aromáticos, incluyendo fenilalanina, histidina, triptófano y tirosina. Estas clases de sustituciones e intercambios son bien conocidos para los especialistas en la técnica.

65 Podrían ser también posibles otras sustituciones. Por supuesto, también se esperaría que cuanto mayor sea el porcentaje de homología, es decir, la similitud de secuencia, de una proteína variante con una proteína de origen

natural, mayor será la retención de la actividad metabólica. Por supuesto, como las variantes proteicas que tienen la actividad de miostatina como se describe en el presente documento pretenden estar dentro del alcance de la presente invención, también los ácidos nucleicos que codifican dichas variantes.

5 Puede obtenerse una ventaja adicional a través de formas quiméricas de la proteína, como se sabe en la técnica. Por tanto podría ligarse una secuencia de ADN que codifica la proteína completa, o una parte de la proteína, por ejemplo, con una secuencia que codifica la parte C-terminal de β-galactosidasa de E. coli para producir una proteína de fusión. Se describe un sistema de expresión para las glucoproteínas F y G del virus sincitial respiratorio humano en la patente de Estados Unidos Nº 5.288.630 expedida el 22 de febrero de 1994, por ejemplo.

Un vector de expresión recombinante puede ser un plásmido, como se ha descrito anteriormente. El vector de expresión recombinante de la invención puede ser adicionalmente un virus, o parte del mismo, que permite la expresión de un ácido nucleico introducido en el ácido nucleico viral. Por ejemplo, pueden usarse retrovirus deficientes en replicación, adenovirus y virus adeno-asociados.

15 Se describe un kit de diagnóstico para identificar células que comprenden una molécula que se une a una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº 2, por ejemplo, para su incubación con una muestra de células tumorales; un medio para detectar la molécula unida a la proteína, proteína sin reaccionar o molécula no unida; un medio para determinar la cantidad de proteína en la muestra; y un medio para comparar la cantidad de proteína en la muestra con un patrón. La molécula puede ser un anticuerpo monoclonal.

La detectabilidad de la molécula que se une a miostatina puede activarse mediante dicha unión (por ejemplo, cambio en el espectro de fluorescencia, pérdida de marcador radioisotópico). El kit de diagnóstico también puede contener un manual de instrucciones para el uso del kit.

25 Se desvela adicionalmente un kit de diagnóstico para identificar células que comprende una sonda nucleotídica complementaria a la secuencia, o un fragmento oligonucleotídico de la misma, mostrada en la SEC ID Nº 1, por ejemplo, para su hibridación con ARNm de una muestra de células, por ejemplo, células musculares; un medio para detectar la sonda nucleotídica unida al ARNm en la muestra con un patrón. En un aspecto particular, la invención es una sonda que tiene una molécula de ácido nucleico suficientemente complementaria a una secuencia identificada como SEC ID Nº 1, o su complemento, de modo que se una a la misma en condiciones rigurosas. "Condiciones rigurosas de hibridación" adopta su significado común para un especialista en la técnica aquí. Las condiciones rigurosas apropiadas que promueven la hibridación de ácidos nucleicos, por ejemplo, cloruro sódico 6x/citrato sódico (SSC) a aproximadamente 45ºC son conocidas para los especialistas en la técnica. Los siguientes ejemplos se

35 encuentran en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1989), 6.3.1-6.3.6: Para 50 ml de una primera solución de hibridación adecuada, mezclar juntos 24 ml de formamida, 12 ml de SSC 20x, 0,5 ml de Tris-HCl 2 M pH 7,6, 0,5 ml de solución de Denhardt 100x, 2,5 ml de H2O desionizada, 10 ml de sulfato de dextrano al 50%, y 0,5 ml de SDS al 10%. Una segunda solución de hibridación adecuada puede ser BSA cristalina al 1% (fracción V), EDTA 1 mM, Na2HPO4 0,5 M pH 7,2, SDS al 7%. La concentración salina en la etapa de lavado puede seleccionarse entre una baja rigurosidad de aproximadamente SSC 2x a 50ºC hasta una elevada rigurosidad de aproximadamente SSC 0,2x a 50ºC. Estas dos soluciones de lavado pueden contener SDS al 0,1%. Además, la temperatura en la etapa de lavado puede aumentarse desde condiciones de baja rigurosidad a temperatura ambiente, aproximadamente 22ºC, hasta condiciones de alta rigurosidad, a aproximadamente 65ºC. La referencia citada da más detalles, pero la rigurosidad apropiada del lavado depende del grado de homología y longitud de la sonda. Si la

45 homología es del 100%, puede usarse una alta temperatura (65ºC a 75ºC). Si la homología es baja, deben usarse temperaturas inferiores de lavado. Sin embargo, si la sonda es muy corta (<100 pb), deben usarse temperaturas inferiores incluso con homología del 100%. En general, se empieza el lavado a bajas temperaturas (37ºC a 40ºC), y se eleva la temperatura en intervalos de 3-5ºC hasta que el fondo es suficientemente bajo para no ser un factor principal en auto-radiografía. El kit de diagnóstico también puede contener un manual de instrucciones para el uso del kit. La invención proporciona un kit de diagnóstico definido en las reivindicaciones que puede usarse para determinar el genotipo de material genético de mamífero, por ejemplo. Un kit incluye un conjunto de cebadores usados para amplificar el material genético. Un kit puede contener un cebador que incluye una secuencia nucleotídica para amplificar una región del material genético que contiene una de las mutaciones de origen natural descritas en el presente documento. Dicho kit también podría incluir un cebador para amplificar la región

55 correspondiente del gen normal que produce miostatina funcional. Habitualmente, dicho kit también incluiría otro cebador cadena arriba o cadena abajo de la región de interés complementaria a una parte codificante y/o no codificante del gen. Un kit particular incluye un cebador seleccionado entre una secuencia no codificante de un gen de miostatina. Ejemplos de dichos cebadores se proporcionan en la Tabla 3, denominados como Exón1-5', Exón1-3', Exón2-5', Exón3-5' y Exón3-3'. Estos cebadores se usan para amplificar el segmento que contiene la mutación de interés. El genotipado real se realiza usando cebadores que abordan mutaciones específicas descritas en el presente documento y que podrían funcionar como oligonucleótidos específicos de alelo en hibridación convencional, ensayos Taqman, ensayos OLE, etc. Como alternativa, los cebadores pueden diseñarse para permitir el genotipado por microsecuenciación.

65 Un kit de cebadores por tanto incluye un primer, segundo y tercer cebadores, (a), (b) y (c), respectivamente. El cebador (a) se basa en una región que contiene una mutación de miostatina, por ejemplo una región del gen de

miostatina que abarca la deleción nt821del(11). El cebador (b) codifica una región cadena arriba o cadena abajo de la región a amplificar por el cebador (a) de modo que se amplifique el material genético que contiene la mutación, por PCR, por ejemplo, en presencia de los dos cebadores. El cebador (c) se basa en la región correspondiente a aquella en que se basa el cebador (a), pero que carece de la mutación. Por tanto, se amplificará el material genético

5 que contiene la región no mutada en presencia de los cebadores (b) y (c). El material genético homocigótico para el gen de tipo silvestre por tanto proporcionará productos amplificados en presencia de los cebadores (b) y (c). El material genético homocigótico para el gen mutado por tanto proporcionará productos amplificados en presencia de los cebadores (a) y (b). El material genético heterocigótico proporcionará productos amplificados en ambos casos.

Se describen proteínas purificadas que tienen actividad biológica de miostatina. Los términos "aislado" y "purificado" se refieren cada uno a una proteína sustancialmente libre de material celular o medio de cultivo cuando se produce por técnicas de ADN recombinante, o precursores químicos u otros agentes químicos cuando se sintetiza de forma química. En ciertos aspectos, la proteína que tiene actividad biológica de miostatina comprende una secuencia de aminoácidos identificada como SEC ID Nº 2. Además, se abarcan proteínas que tienen actividad biológica de

15 miostatina que están codificadas por ácidos nucleicos que hibridan en condiciones rigurosas, como se ha analizado anteriormente, con una ácido nucleico que comprende una secuencia nucleotídica identificada como SEC ID Nº 1 o SEC ID Nº 7.

Pueden obtenerse proteínas que tienen actividad miostatina por expresión en una célula huésped adecuada usando técnicas conocidas en la técnica. Las células huésped adecuadas incluyen organismos o líneas celulares procariotas

o eucariotas, por ejemplo, levaduras, E. coli, células de insecto y células COS 1.

Se desvelan los siguientes puntos:

25 1. Un procedimiento para aumentar la masa muscular de un mamífero que tiene células musculares en que se expresa miostatina, comprendiendo el procedimiento administrar al mamífero una cantidad eficaz de una molécula de ácido nucleico sustancialmente complementaria a al menos una parte de ARNm que codifica la miostatina y que es de suficiente longitud para reducir suficientemente la expresión de la miostatina para aumentar la masa muscular.

2.: El procedimiento del punto 1 en el que el mamífero es bovino.

3.: Un procedimiento para aumentar la masa muscular de un mamífero, comprendiendo el procedimiento administrar al mamífero una cantidad eficaz de una molécula de ácido nucleico que tiene actividad ribozima y

35 una secuencia nucleotídica sustancialmente complementaria a al menos una parte de ARNm que codifica miostatina y que es de suficiente longitud para unirse selectivamente a la misma para reducir suficientemente la expresión de la miostatina para aumentar la masa muscular.

4.: El procedimiento del punto 3 en el que el mamífero es bovino.

5.: Un kit de diagnóstico, para determinar la presencia de hiperplasia muscular en un mamífero del cual se ha obtenido una muestra que contiene ADN del mamífero, comprendiendo el kit:

primer y segundo cebadores para amplificar el ADN, siendo los cebadores complementarios a secuencias

45 nucleotídicas del ADN cadena arriba y cadena abajo, respectivamente, de una mutación en la parte del ADN que codifica miostatina que provoca hiperplasia muscular del mamífero, en el que al menos una de las secuencias nucleotídicas se selecciona para que sea de una región no codificante del gen de miostatina.

6.: El kit de diagnóstico del punto 5, que comprende adicionalmente un tercer cebador complementario a una mutación de origen natural de una parte codificante del gen de miostatina.

7.: Un kit de diagnóstico, para determinar el genotipo de una muestra de material genético de mamífero, comprendiendo el kit: un par de cebadores para amplificar una parte del material genético correspondiente a una secuencia nucleotídica que codifica al menos una parte de una proteína miostatina, en el que un primero de los

55 cebadores incluye una secuencia nucleotídica suficientemente complementaria a una mutación de la SEC ID Nº 1 para cebar la amplificación de una molécula de ácido nucleico que contiene la mutación, seleccionándose la mutación entre el grupo de mutaciones resultantes de: (a) deleción de 11 nucleótidos empezando en el nucleótido 821 de la parte codificante de la SEC ID Nº 1; (b) deleción de 7 nucleótidos empezando en el nucleótido 419 de la secuencia codificante e inserción de la secuencia AAGCATACAA en el lugar de la misma;

(c) deleción del nucleótido 204 de la secuencia codificante e inserción de T en el lugar de la misma; (d) deleción del nucleótido 226 de la secuencia codificante e inserción de T en el lugar de la misma; y (e) deleción del nucleótido 313 de la secuencia codificante e inserción de A en el lugar de la misma; y combinaciones de las mismas.

65 8. El kit de diagnóstico del punto 7 en el que un segundo del par de cebadores está localizado completamente cadena arriba o completamente cadena abajo de la mutación o mutaciones seleccionadas.

9.: El kit de diagnóstico del punto 8 en el que un dicho primer cebador abarca la mutación (a) y que comprende adicionalmente un tercer cebador que es suficientemente complementario a la secuencia nucleotídica identificada como SEC ID Nº 11 para cebar la amplificación de una molécula de ácido nucleico que contiene la SEC ID Nº 11.

10.: El kit de diagnóstico del punto 8 en el que un dicho primer cebador es suficientemente complementario a la secuencia insertada de la mutación (b) para cebar la amplificación de una molécula de ácido nucleico que contiene la mutación (b) y que comprende adicionalmente un tercer cebador que es suficientemente complementario a la secuencia correspondiente a la deleción de 7 nucleótidos de la mutación (b) para cebar la amplificación de una molécula de ácido nucleico que contiene la deleción de 7 nucleótidos de la mutación (b).

11.: El kit de diagnóstico del punto 8 en el que un dicho primer cebador abarca la mutación (c) y que comprende adicionalmente un tercer cebador que es suficientemente complementario a la secuencia que abarca la región correspondiente que carece de la mutación (c) para cebar la amplificación de una molécula de ácido nucleico que carece de la mutación (c).

12.: El kit de diagnóstico del punto 8 en el que un dicho primer cebador abarca la mutación (d) y que comprende adicionalmente un tercer cebador que es suficientemente complementario a la secuencia que abarca la región correspondiente que carece de la mutación (d) para cebar la amplificación de una molécula de ácido nucleico que carece de la mutación (d).

13.: El kit de diagnóstico del punto 8 en el que un dicho primer cebador abarca la mutación (e) y que comprende adicionalmente un tercer cebador que es suficientemente complementario a la secuencia que abarca la región correspondiente que carece de la mutación (e) para cebar la amplificación de una molécula de ácido nucleico que carece de la mutación (e).

14.: Un procedimiento para determinar la presencia de hiperplasia muscular en un animal bovino, comprendiendo el procedimiento:

obtener una muestra de material que contiene ADN de dicho animal; y averiguar si está presente ADN que tiene una secuencia nucleotídica que codifica una proteína que tiene actividad biológica de miostatina, en el que la ausencia de ADN que tiene dicha secuencia nucleotídica indica la presencia de hiperplasia muscular en el animal.

15.: El procedimiento del punto 14 en el que averiguar si está presente ADN que tiene una secuencia nucleotídica que codifica una proteína que tiene actividad biológica de miostatina incluye amplificar el ADN en presencia de cebadores basados en una secuencia nucleotídica que codifica una proteína que tiene actividad biológica de miostatina.

16.: El procedimiento del punto 15 en el que el ADN de dicho animal bovino que no presenta hiperplasia muscular tiene una secuencia nucleotídica que es capaz de hibridar con una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia identificada como SEC ID Nº 1 en condiciones rigurosas de hibridación.

17.: El procedimiento del punto 14, en el que averiguar si está presente ADN que tiene una secuencia nucleotídica que codifica una proteína que tiene actividad biológica de miostatina incluye amplificar el ADN en presencia de cebadores basados en una secuencia nucleotídica que codifica el extremo N-terminal y el Cterminal, respectivamente, de la proteína que tiene actividad biológica de miostatina.

18.: El procedimiento del punto 14, en el que averiguar si está presente ADN que tiene una secuencia nucleotídica que codifica una proteína que tiene actividad biológica de miostatina incluye amplificar el ADN en presencia de un primer y segundo cebadores basados en una primera y segunda secuencias nucleotídicas que codifican regiones apartadas entre sí de la proteína, en el que dichas regiones flanquean una mutación que se sabe que sucede de forma natural y que cuando está presente en ambos alelos de dicho animal provoca dicha hiperplasia muscular.

19.: El procedimiento del punto 18 en el que un ADN de dicho animal que no presenta hiperplasia muscular contiene una secuencia nucleotídica que hibrida en condiciones rigurosas con una secuencia nucleotídica que codifica una proteína que tiene una secuencia identificada como SEC ID Nº 2 y la secuencia codificante de ADN de dicho animal que presenta hiperplasia muscular se sabe que contiene una deleción de 11 pares de bases que empieza en el par de bases nº 821, y dicho primer cebador se selecciona para estar cadena arriba del codón que codifica el ácido glutámico nº 275 y el segundo cebador se selecciona para estar cadena abajo del codón que codifica el ácido aspártico nº 274.

20.: El procedimiento del punto 14 en el que un ADN de dicho animal que no presenta hiperplasia muscular contiene una secuencia nucleotídica que hibrida en condiciones rigurosas con una secuencia nucleotídica que codifica una proteína que tiene una secuencia identificada como SEC ID Nº 2 y la secuencia codificante de ADN

de dicho animal que presenta hiperplasia muscular se sabe que contiene una deleción de 11 pares de bases que empieza en el par de bases nº 821, y dicho cebador se selecciona para abarcar la secuencia nucleotídica que incluye los pares de bases nº 820 y 821 de la secuencia de ADN que contiene dicha deleción.

21.: El procedimiento del punto 19 en el que el animal es de una raza seleccionada entre Azul Belga, Asturiana, Parthenaise y Rubia Gallega.

22.: El procedimiento del punto 20 en el que el animal es una raza seleccionada entre Azul Belga, Asturiana, Parthenaise y Rubia Gallega.

23.: El procedimiento del punto 14 en el que averiguar si está presente ADN que tiene una secuencia nucleotídica que codifica una proteína que tiene actividad biológica de miostatina incluye amplificar el ADN en presencia de un cebador que contiene al menos una parte de una mutación que se sabe que sucede de forma natural y que cuando está presente en ambos alelos de dicho animal provoca dicha hiperplasia muscular.

24.: Un procedimiento para determinar la presencia de hiperplasia muscular en un animal bovino, comprendiendo el procedimiento:

obtener una muestra de material que contiene ADN de dicho animal; y averiguar si está presente ADN que tiene una mutación definida en el punto 7; y averiguar si está presente ADN que tiene una secuencia nucleotídica que codifica una proteína que tiene actividad biológica de miostatina, en el que la ausencia de ADN que tiene dicha secuencia nucleotídica y la presencia de dicha mutación indica la presencia de hiperplasia muscular en el animal.

25.: Un procedimiento para determinar la presencia de hiperplasia muscular en un animal bovino, comprendiendo el procedimiento:

obtener una muestra del animal que contiene ARNm; y averiguar si está presente un ARNm que codifica una proteína que tiene actividad biológica de miostatina en la muestra, en el que la ausencia de dicho ARNm indica la presencia de hiperplasia muscular en el animal.

26.: El procedimiento del punto 25 en el que la muestra es de tejido muscular o en el que el tejido es tejido de músculo esquelético.

27.: El procedimiento del punto 25 en el que averiguar si está presente ARNm que tiene una secuencia nucleotídica que codifica una proteína que tiene actividad biológica de miostatina incluye amplificar el ARNm en presencia de cebadores sustancialmente complementarios a la secuencia nucleotídica que codifica la proteína.

28.: El procedimiento del punto 27 en el que el ARNm de dicho animal bovino que no presenta hiperplasia muscular tiene una secuencia nucleotídica que es capaz de hibridar con una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia identificada como SEC ID Nº 1 en condiciones rigurosas de hibridación.

29.: El procedimiento del punto 25, en el que averiguar si está presente ARNm que tiene una secuencia nucleotídica que codifica una proteína que tiene actividad biológica de miostatina incluye amplificar el ARNm en presencia de cebadores sustancialmente complementarios a una secuencia nucleotídica que codifica el extremo N-terminal y el C-terminal, respectivamente, de la proteína que tiene actividad biológica de miostatina.

30.: El procedimiento del punto 25, en el que averiguar si está presente ARNm que tiene una secuencia nucleotídica que codifica una proteína que tiene actividad biológica de miostatina incluye amplificar el ARNm en presencia de un primer y segundo cebadores sustancialmente complementarios a una primera y segunda secuencias nucleotídicas que codifican regiones apartadas entre sí de la proteína, en el que dichas regiones flanquean una mutación que se sabe que sucede de forma natural y que cuando está presente en ambos alelos de dicho animal provoca dicha hiperplasia muscular.

31.: El procedimiento del punto 30 en el que un ARNm de dicho animal que no presenta hiperplasia muscular contiene una secuencia nucleotídica que hibrida en condiciones rigurosas con una secuencia nucleotídica que codifica una proteína que tiene una secuencia identificada como SEC ID Nº 2 y la secuencia codificante de ADN de dicho animal que presenta hiperplasia muscular se sabe que contiene una deleción de 11 pares de bases que empieza en el par de bases nº 821, y dicho primer cebador se selecciona para estar cadena arriba del codón que codifica el ácido glutámico nº 275 y el segundo cebador se selecciona para estar cadena abajo del codón que codifica el ácido aspártico nº 274.

32.: El procedimiento del punto 25 en el que averiguar si está presente ARNm que tiene una secuencia nucleotídica que codifica una proteína que tiene actividad biológica de miostatina incluye amplificar el ARNm en presencia de un cebador que contiene una secuencia nucleotídica complementaria a al menos una parte de una mutación que se sabe que sucede de forma natural en dicho animal y que cuando está presente en ambos alelos

de dicho animal provoca dicha hiperplasia muscular.

33.: El procedimiento del punto 32 en el que un ARNm de dicho animal que no presenta hiperplasia muscular contiene una secuencia nucleotídica que hibrida en condiciones rigurosas con una secuencia nucleotídica que codifica una proteína que tiene una secuencia identificada como SEC ID Nº 2 y la secuencia codificante de ADN de dicho animal que presenta hiperplasia muscular se sabe que contiene una deleción de 11 pares de bases que empieza en el par de bases nº 821, y dicho cebador se selecciona para abarcar la parte delecionada.

34.: El procedimiento del punto 31 en el que el animal es de una raza seleccionada entre Azul Belga, Asturiana, Parthenaise y Rubia Gallega.

35.: Un procedimiento para determinar la presencia de hiperplasia muscular en un mamífero, comprendiendo el procedimiento:

obtener una muestra de material que contiene ADN del mamífero; y averiguar si está presente una secuencia del ADN que codifica (a) una proteína que tiene actividad biológica de miostatina, y si está presente una secuencia del ADN que codifica (b) una proteína alélica que carece de la actividad de (a); en el que la ausencia de (a) y la presencia de (b) indica la presencia de hiperplasia muscular en el mamífero.

36.: El procedimiento del punto 35 en el que (b) contiene una mutación de origen natural responsable de la ausencia de actividad.

37.: El procedimiento del punto 35 en el que el mamífero es un ser humano.

38.: El procedimiento del punto 37 en el que averiguar si está presente una secuencia del ADN que codifica (a), y si está presente una secuencia del ADN que codifica (b) incluye amplificar el ADN en presencia de cebadores basados en una secuencia nucleotídica que codifica una proteína que tiene actividad biológica de miostatina.

39.: El procedimiento del punto 38 en el que dichos cebadores se basan en la secuencia identificada como SEC ID Nº 7.

40.: Un procedimiento para determinar la presencia de hiperplasia muscular en un mamífero, comprendiendo el procedimiento:

obtener una muestra de material que contiene ARNm del mamífero; y averiguar si está presente una secuencia del ARNm que codifica (a) una proteína que tiene actividad biológica de miostatina, y si está presente una secuencia del ARNm que codifica (b) una proteína al menos parcialmente codificada por una secuencia nucleotídica truncada correspondientes a sustancialmente la secuencia del ARNm y que carece de la actividad de (a); en el que la ausencia de (a) y la presencia de (b) indica la presencia de hiperplasia muscular en el mamífero.

41.: El procedimiento del punto 40 en el que el ARNm que codifica (a) y la secuencia truncada corresponden a alelos de ADN del mamífero.

42.: El procedimiento del punto 40 en el que el mamífero es humano.

43.: El procedimiento del punto 42 en el que averiguar si está presente una secuencia del ARNm que codifica (a), y si está presente una secuencia del ARNm que codifica (b) incluye amplificar el ARNm en presencia de un par de cebadores complementarios a una secuencia nucleotídica que codifica una proteína que tiene actividad biológica de miostatina.

44.: El procedimiento del punto 43 en el que cada uno de dichos cebadores contiene una secuencia nucleotídica truncada sustancialmente complementaria a una parte de la secuencia identificada como SEC ID Nº 7.

45.: El procedimiento del punto 44 en el que la secuencia truncada contiene al menos 50 nucleótidos consecutivos sustancialmente correspondientes a aproximadamente 10, o entre aproximadamente 10 y 20, o entre aproximadamente 20 y 30, o entre aproximadamente 30 y 40, o entre aproximadamente 40 y 50 nucleótidos consecutivos de la SEC ID Nº 7.

46.: Un procedimiento para determinar la presencia de hiperplasia muscular en un mamífero, comprendiendo el procedimiento:

obtener una muestra tisular que contiene ARNm del mamífero; y averiguar si está presente un ARNm que codifica una proteína miostatina de tipo mutante que carece de actividad biológica de miostatina, en el que la presencia de dicho ARNm que codifica una proteína miostatina

de tipo mutante indica la presencia de hiperplasia muscular en el mamífero.

47. El procedimiento del punto 46 en el que la proteína miostatina de tipo mutante que carece de actividad

biológica está codificada por un alelo de origen natural de ADN que codifica el ARNm. 5

48. Un procedimiento para determinar la presencia de doble musculación en un animal bovino, comprendiendo el procedimiento:

obtener una muestra de material que contiene ADN del animal; y 10 averiguar si el ADN contiene la secuencia nucleotídica codificante identificada como SEC ID Nº 11, en el que la ausencia de la secuencia indica doble musculación en el animal.

49. El procedimiento del punto 34 en el que el animal es de una raza seleccionada entre Azul Belga, Asturiana,

Parthenaise y Rubia Gallega. 15

50. Un procedimiento para determinar el genotipo de miostatina de un mamífero, que comprende:

obtener una muestra de material que contiene ácido nucleico del mamífero, en el que el ácido nucleico está sin contaminar por ácido nucleico heterólogo;

20 averiguar si la muestra contiene (i) una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína que tiene actividad biológica de miostatina; y averiguar si la muestra contiene (ii) una molécula de ácido nucleico alélico que codifica una proteína que carece de actividad biológica de miostatina.

25 51. El procedimiento del punto 50 en el que el mamífero es humano y (i) comprende una secuencia de ácido nucleico sustancialmente homóloga a la secuencia identificada como SEC ID Nº 7.

52. Una proteína purificada que tiene actividad biológica de miostatina, y que tiene una secuencia de

aminoácidos identificada como SEC ID Nº 2, o una variante sustituida de forma conservativa de la misma. 30

53.: Una molécula aislada de ácido nucleico que codifica una proteína del punto 52.

54.: Una molécula aislada de ácido nucleico que comprende una molécula de ADN que tiene la secuencia nucleotídica identificada como SEC ID Nº 1 o que varía de la secuencia debido a la degeneración del código

35 genético, o una hebra de ácido nucleico capaz de hibridar con al menos una dicha molécula de ácido nucleico en condiciones rigurosas de hibridación.

55. ARNm aislado transcrito de ADN que tiene una secuencia que corresponde con una molécula de ácido

nucleico de acuerdo con el punto 54. 40

56.: ADN aislado que tiene una secuencia de acuerdo con el punto 54 en un vector de clonación recombinante.

57.: Una célula microbiana que contiene y que expresa ADN heterólogo que es complementario a una molécula

de ácido nucleico del punto 54. 45

58.: Una línea celular transfectada que expresa una proteína del punto 52.

59.: Un proceso para producir la proteína del punto 52 que comprende:

50 preparar un fragmento de ADN que incluye una secuencia nucleotídica que codifica dicha proteína; incorporar el fragmento de ADN en un vector de expresión para obtener una molécula de ADN recombinante que incluye el fragmento de ADN y es capaz de experimentar replicación; transformar una célula huésped con dicha molécula de ADN recombinante para producir un transformante que puede expresar dicha proteína;

55 cultivar el transformante para producir dicha proteína; y recuperar dicha proteína de la mezcla cultivada resultante.

60. Un procedimiento para aumentar la masa muscular en un mamífero, que comprende administrar una

cantidad eficaz de un anticuerpo contra miostatina a dicho mamífero. 60

61. Un procedimiento para aumentar la masa muscular en un mamífero, que comprende crear un auto-anticuerpo contra la miostatina en el mamífero.

62. El procedimiento del punto 61 en el que la creación del auto-anticuerpo incluye administrar una proteína que 65 tiene actividad miostatina al mamífero.

63.: Un procedimiento para aumentar la masa muscular en un mamífero que lo necesite, que comprende administrar al mamífero una cantidad eficaz de un ácido nucleico antisentido u oligonucleótido sustancialmente complementario a al menos una parte de la secuencia identificada como SEC ID Nº 1 o SEC ID Nº 5, o SEC ID Nº 7.

64.: El procedimiento del punto 63 en el que la parte es de al menos 5 bases nucleotídicas de longitud.

65.: El procedimiento del punto 64 en el que el mamífero es un bovino y la secuencia es la secuencia identificada como SEC ID Nº 1.

66.: Un procedimiento para aumentar la masa muscular en un mamífero, que comprende administrar al mamífero una cantidad eficaz de un anticuerpo contra la miostatina.

67.: Una sonda que comprende una molécula de ácido nucleico suficientemente complementaria con una secuencia identificada como SEC ID Nº 1, o su complemento, de modo que se una a la misma en condiciones rigurosas.

68.: La sonda del punto 67 en el que la secuencia es entre aproximadamente 8 y aproximadamente 1195 nucleótidos de longitud, o entre aproximadamente 15 y 1195 nucleótidos de longitud, o entre aproximadamente 25 y 1195 nucleótidos de longitud, o entre aproximadamente 35 y 1195 nucleótidos de longitud, o entre aproximadamente 45 y 1195 nucleótidos de longitud, o entre aproximadamente 55 y 1195 nucleótidos de longitud, o entre aproximadamente 65 y 1195 nucleótidos de longitud, o entre aproximadamente 75 y 1195 nucleótidos de longitud, o entre aproximadamente 75 y 1195 nucleótidos de longitud, o entre aproximadamente 85 y 1195 nucleótidos de longitud, o entre aproximadamente 95 y 1195 nucleótidos de longitud, o entre aproximadamente 105 y 1195 nucleótidos de longitud, o entre aproximadamente 115 y 1195 nucleótidos de longitud.

69.: Un procedimiento para identificar una secuencia nucleotídica de un gen mutante que codifica una proteína miostatina de un mamífero que presenta hiperplasia muscular, comprendiendo el procedimiento:

obtener una muestra de material que contiene ADN del mamífero; y sondear la muestra usando una sonda de ácido nucleico basada en una secuencia nucleotídica de un gen conocido codificante de miostatina para identificar la secuencia nucleotídica del gen mutante.

70.: El procedimiento del punto 69, en el que la sonda se basa en una secuencia nucleotídica de una región no codificante del gen.

71.: El procedimiento del punto 70 en el que la sonda se basa en la SEC ID Nº 54.

72.: El procedimiento del punto 71 en el que la sonda es de al menos 8 ácidos nucleicos de longitud.

73.: El procedimiento del punto 69, en el que la etapa de sondear la muestra incluye exponer el ADN a la sonda en condiciones de hibridación y que comprende adicionalmente aislar moléculas hibridadas de ácidos nucleicos.

74.: El procedimiento del punto 73, que comprende adicionalmente la etapa de secuenciar ADN aislado.

75.: El procedimiento del punto 69, en el que el mamífero es un mamífero bovino y la sonda se basa en una dicha secuencia nucleotídica identificada como SEC ID Nº 1.

76.: El procedimiento del punto 74, que comprende adicionalmente la etapa de aislar y secuenciar un ADNc o ARNm que codifica la proteína miostatina mutante completa.

77.: El procedimiento del punto 71, que comprende adicionalmente la etapa de aislar y secuenciar una miostatina de tipo silvestre funcional de dicho mamífero que no presenta hiperplasia muscular.

78.: El procedimiento del punto 76, que comprende adicionalmente comparar la secuencia codificante completa de la proteína miostatina mutante completa con, si la secuencia codificante para una miostatina de tipo silvestre funcional de dicho mamífero es previamente conocida, (1) la secuencia conocida, o si la secuencia codificante para una miostatina de tipo silvestre funcional de dicho mamífero es previamente desconocida, (2) la secuencia determinada de acuerdo con el punto 74 o punto 77, para determinar la localización de cualquier mutación en el gen mutante.

79.: Un procedimiento para determinar el genotipo de miostatina de un mamífero, en el que la miostatina de tipo silvestre del mamífero es sustancialmente la del punto 78, que comprende:

obtener una muestra de material que contiene ADN del mamífero; y

averiguar si el ADN contiene dicha mutación determinada de acuerdo con el punto 78.

80. Un procedimiento para determinar el genotipo de miostatina de un mamífero, en el que la miostatina de tipo silvestre del mamífero es sustancialmente la del punto 78, que comprende:

5 obtener una muestra de material que contiene ARNm del mamífero; y averiguar si el ARNm contiene dicha mutación determinada de acuerdo con el punto 78.

81. Una composición de cebadores útil para la detección de una secuencia nucleotídica que codifica una miostatina que comprende una primera molécula de ácido nucleico basada en una secuencia nucleotídica localizada cadena arriba de dicha mutación determinada de acuerdo con el punto 78 y una segunda molécula de ácido nucleico basada en una secuencia nucleotídica localizada cadena abajo de la mutación.

82.: Una sonda que comprende una molécula de ácido nucleico basada en una secuencia nucleotídica del punto 15 74 o punto 76 y que abarca dicha mutación determinada de acuerdo con el punto 78.

83.: Un mamífero transgénico que tiene un fenotipo caracterizado por hiperplasia muscular, estando dicho fenotipo conferido por un transgén contenido en las células somáticas y germinales del mamífero, codificando el transgén una proteína miostatina que tiene una mutación negativa dominante.

84.: El mamífero transgénico del punto 83 en el que el mamífero es masculino y no humano y el transgén está localizado en el cromosoma Y.

85.: El mamífero transgénico del punto 83 en el que el mamífero es bovino y el transgén está localizado para 25 estar bajo el control de un promotor que es normalmente un promotor de un gen de miosina.

86.: Un mamífero transgénico que tiene un fenotipo caracterizado por hiperplasia muscular, estando dicho fenotipo conferido por un transgén que tiene una secuencia antisentido a la que codifica una proteína miostatina del mamífero.

87.: El mamífero transgénico del punto 86 en el que el mamífero es bovino y el transgén está localizado en el cromosoma Y.

88. El mamífero transgénico del punto 86 en el que el transgén comprende adicionalmente una secuencia que 35 cuando se transcribe obtiene un ARNm que tiene actividad ribozima.

89.: Un mamífero no humano transgénico que tiene un fenotipo caracterizado por hiperplasia muscular, siendo dicho fenotipo inducible y estando conferido por un gen de miostatina flanqueado por lados JoxP y un transgén Cre bajo la dependencia de un promotor inducible.

90.: Un mamífero masculino no humano transgénico que tiene un fenotipo caracterizado por hiperplasia muscular, estando dicho fenotipo conferido por un gen de miostatina flanqueado por lados JoxP y un transgén Cre localizado en el cromosoma Y.

45 91. Un procedimiento para determinar si una muestra de material genético de mamífero es capaz de conferir un fenotipo caracterizado por hiperplasia muscular, que comprende averiguar si el material genético contiene una secuencia nucleotídica que codifica una proteína que tiene actividad biológica de miostatina, en el que la ausencia de dicha secuencia indica la presencia de hiperplasia muscular en el animal.

92.: Un bovino transgénico que tiene un genoma que carece de un gen que codifica una proteína que tiene actividad biológica de miostatina.

93.: Un ratón transgénico que tiene un genoma que contiene un gen que codifica una proteína humana que tiene

actividad biológica de miostatina o que contiene un gen que codifica una proteína bovina que tiene actividad 55 biológica de miostatina.

94.: Un bovino transgénico que tiene un gen que codifica una proteína bovina que tiene actividad biológica de miostatina y secuencia nucleotídica heteróloga antisentido al gen.

95.: Un bovino transgénico del punto 94, que comprende adicionalmente un gen que codifica una secuencia de ácido nucleico que tiene actividad ribozima y en asociación transcripcional con la secuencia nucleotídica antisentido al gen.

Referencias

65 A continuación se dan referencias concretas citadas anteriormente. Todas las referencias enumeradas se incorporan

en el presente documento por referencia.

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25 CA repeat at the TCRA locus using YACs: a general method for generating highly polimorphic markers at chosen loci. Genomics 13: 820-825. Cottingham, R.W.; Idury, R.M.; Schäffer, A.A. (1993). Faster sequential genetic linkage computations. Am. J. Hum. Genet. 53: 252-263. Culley, G. (1807). Observations on livestock. 4ª ed., (Londres, G. Woodfall). Fisher, S.R.; Beever, J.E.; Lewin, H.A. (1996). Genetic mapping of COL3AI to bovine chromosome 2. Mammalian Genome 8: 76-77. Fuji, J.; Otsu, K.; Zorzato, F.; Deleon, S.; Khanna, V.K.; Weiler, J.E. O'Brien, P.J.; MacLennan, D.H. (1991). Identification of a mutation in the porcine ryanodine receptor associated with malignant hiperthermia. Science

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35 Georges, M.; Andersson, L. (1996). Livestock genomics comes of age. Genome Research 6: 907-921. Georges, M.; Nielsen, D.; Mackinnon, M.; Mishra, A.; Okimoto, R.; Pasquino, A.T.; Sargeant, L.S.; Sorensen, A.; Steele, M.R.; Zhao, X.; Womack, J.E.; Hoeschele, I. (1995). Mapping quantitative trait loci controlling milk production by exploiting progeny testing. Genetics 139: 907-920. Gossen, M. y Bujard, H. (1992). Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracicline-responsive promotors. Proceedings of the National Academy of Sciences, EEUU, 89: 5547-5551. Grobet, L.; Royo Martin, L.J.; Poncelet, D.; Pirottin, D.; Brouwers, B.; Riquet, J.; Schoeberlein, A.; Dunner, S.; Menissier, F.; Massabanda, J.; Fries, R.; Hanset, R.; Georges, M. (1997) A deletion in the myostatin gene causes double-muscling in cattle. Nature Genetics 17: 71-74. Gu, H.; Marth, J.D.; Orban, P.C.; Mossmann, H.; Rajewsky, K. (1994). Deletion of a DNA polimerase beta gene

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65 Belgian Blue Cattle. Genome Research 7: 910-916. Kappes, S.M.; Keele, J.W.; Stone, R.T.; McGraw, R.A.; Sonstegard, T.S.; Smith, T.P.L.; Lopez-Corrales, N.L. y

Beattie, C.W. (1997). A Second-Generation Linkage Map of the Bovine Genome. Genome Research 7: 235-249. Kennett, R. (1979). Cell fusion. Methods Enzymol. 58: 345-359. Kohler y Milstein. (1975). Nature 256: 495-497. Kozbor y col. (1983). Immunol. Today 4: 72. Lathrop, M.; Lalouel, J.M. (1984). Easy calculations of lodscores and genetic risk on small computers. American Journal of Human Genetics 36: 460-465. Lenstra, J.A.; van Boxtel, J.A.F.; Zwaagstra, K.A.; Schwerin, M. (1993). Short interspersed nuclear element (SINE) sequences of the Bovidae. Animal Genetics 24: 33-39. Libert, F.; Lefort, A.; Okimoto, R.; Georges, M. (1993) Construction of a bovine genomic library of large yeast artificial chromosome clones. Genomics 18: 270-276. Lopez, A.R.; Cook, J.; Deininger, P.L.; Derynck, R. (1992). Dominant negative mutants of transforming growth factor-beta1 inhibit the secretation of different transforming growth factor beta isoforms. Molecular and Cellular biology 12(4): 1674-1679. Lyons, A.L.; Laughlin, T.F.; Copeland, N.G.; Jenkins, N.A.; Womack, J.E.; O'Brien, S.J. (1996). Comparative Anchor tagged Sequences for Integrative mapping of Mammalian Genomes. Nature Genetics 15: 47-56. McPherron, A.C.; Lee, S.-J. (1996). The transforming growth factor β superfamily. En Growth Factors and Cytokines in Health and Disease, Volumen 1B, páginas 357-393, JAI press Inc. McPherron, A.C.; Lawler, A.M.; Lee, S.-J. (1997). Regulation of skeletal muscle mass in mice by a new TGFβ superfamily member. Nature 387: 83-90. Menissier, F. (1982). Present state of knowledge about the genetic determination of muscular hypertrophy or the double muscled trait in cattle. En Current Topics in Veterinary Medicine and Animal Science, vol. 16: Muscle hipertrophy of genetic origin and its use to improve beef production, pág. 387-428. Ed. King y Menissier, Martinus Nijhoff. Merrifield, (1964]. J. Am. Chem. Assoc. 85: 2149-2154. McCafferty y col., (1990). Nature 348: 552-554. Mirski, S. y Cole, S. P. C. (1989). Antigens associated with multidrug resistance in H69AR, a small cell lung cancer cell line. Cancer Res. 49: 5719-5724. Morrison y col., (1985). Proceedings of the National Academy of Sciences, EEUU, 81: 6851. O'Brien, S.J.; Womack, J.E.; Lyons, L.A.; Moore, K.J.; Jenkins, N.A.; Copeland, N.G. (1993). Anchored reference loci for comparative genome mapping in mammals. Nature Genetics 3: 103-112. Old, R.W. y Primrose, S.B., En: Principles of Gene Manipulation. An Introduction to Genetic Engineering, 4ª ed. Oxford University Press. 63-66. Pell, J.M.; Flint, D.J.; (1997). En: Milk Composition, Production and Biotechnology, Ed. Welch y col., Capítulo 19. Sambrook, J., Fritsch E.F. y Maniatis, T. (1989). Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Lab Press, Cold Spring Harbor, Nueva York. Shockett, P.E.; Schatz, D.G. (1996). Diverse strategies for tetracicline-regulated inducible gene expression. Proceedings of the National Academy of Sciences, EEUU, 93: 5173-5176. Solinas-Toldo, S.; Lengauer, C; Fries, R. (1995). Comparative genome map of man and cattle. Genomics 27: 489-496. Staerz y Bevan (1986a). Proceedings of the National Academy of Sciences, EEUU, 83: 1453. Staerz y Bevan (1986b). Immunology Today 7: 241. Stewart, A.J., Canitrot, Y., Baracchini, E., Dean, N.M., Deeley, R.G., y Cole, S.P.C. (1996). Reduction of Expression of the multidrug resistance protein (MRP) in human tumor cells by antisense phophorotioate oligonucleotides. Biochem. Pharamcol. 51: 461-469. Takeda y col., (1985). Nature 314: 452. Tanaguchi y col., publicación de patente europea EP171496. Teng, y col., (1982) Meth. Enzymol. 92: 3-16. Varga, L.; Szabo, G.; Darvasi, A.; Muller, G.; Sass, M.; Soller, M. (1997). Inheritance and mapping of compact (Cmpt), a new mutation causing hipermuscularity in mice. Genetics, en la prensa. Walter, M.A.; Spillett, D.J.; Thomas, P.; Weissenbach, J.; Goodfellow, P.N. (1994). A method for constructing radiation hybrid maps of whole genomes. Nature Genetics 7:22-28. Ward y col., (1989). Nature 341: 544-546.

SECUENCIA ID Nº 1

SECUENCIA ID Nº 2

SECUENCIA ID Nº 3

SECUENCIA ID Nº 4

SECUENCIA ID Nº 5

SECUENCIA ID Nº 6

SECUENCIA ID Nº 7

SECUENCIA ID Nº 8

SECUENCIA ID Nº 54

LISTADO DE SECUENCIAS 5 <110> UNIVERSITY OF LIEGE

<120> DOBLE MUSCULACIÓN EN MAMÍFEROS

<130> C2087 EP/1 S3 10

<150> EP 98 93 5228.1

<151>

<150> US 19970891789 15 <151>

<150> US 19980007761

<151> 20 <160> 54

<170> PatentIn ver. 2.0

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 1 25

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 1196 pares de base

(B): TIPO: ácido nucleico 30 (C) CADENA: sencilla

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 1

5 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 2

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 375 aminoácidos 10 (B) TIPO: aminoácido

(C) CADENA: sencilla

(D) TOPOLOGÍA: lineal (Xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 2

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 3 5 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 1240 pares de base

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): CADENA: sencilla 10 (D) TOPOLOGÍA: lineal

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 3

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 4 5 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 286 aminoácidos

(B): TIPO: aminoácido

(C): CADENA: sencilla 10 (D) TOPOLOGÍA: lineal

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 4

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 5 5 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 2676 pares de base

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): CADENA: sencilla 10 (D) TOPOLOGÍA: lineal

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 5

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 6 5 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 376 aminoácidos

(B): TIPO: aminoácido

(C): CADENA: sencilla 10 (D) TOPOLOGÍA: lineal

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 6

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 7 5 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 2215 pares de base

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): CADENA: sencilla 10 (D) TOPOLOGÍA: lineal

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 7

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 8 5 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 375 aminoácidos

(B): TIPO: aminoácido

(C): CADENA: sencilla 10 (D) TOPOLOGÍA: lineal

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 8

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 9 5 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 22 pares de base

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): CADENA: sencilla 10 (D) TOPOLOGÍA: lineal

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 9 GGCCCAACTA TGGATATATT TG 22

15 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 10

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 21 pares de base 20 (B) TIPO: ácido nucleico

(C): CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 10 25 GGTCCTGGGA AGGTTACAGC A 21

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 11

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 11 pares de base

(B): TIPO: ácido nucleico

(C) CADENA: sencilla 5 (D) TOPOLOGÍA: lineal

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 11 ATGAACACTC C 11

10 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 12

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 26 pares de base 15 (B) TIPO: ácido nucleico

(C): CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 12 20 CAGCAAAGTC CTTAATGGTA ACAAGC 26

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 13

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 25

(A): LONGITUD: 23 pares de base

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

30 (Xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 13 GGGTCACTGA AGAAAACGTC CTG 23

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 14 35

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 23 pares de base

(B): TIPO: ácido nucleico 40 (C) CADENA: sencilla

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 14

CCCCATATTA TGGAGATGAA CCG 23 45

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 15

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

50 (A) LONGITUD: 23 pares de base

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

55 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 15 AGTTCAGGAT GGCAGAATTT CAG 23

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 16

60 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 23 pares de base

(B): TIPO: ácido nucleicos

(C) CADENA: sencilla 65 (D) TOPOLOGÍA: lineal

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 16 GCAAACTGGG YGGRAGCAAG ACC 23

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 17 5

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 24 pares de base

(B): TIPO: ácido nucleico 10 (C) CADENA: sencilla

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(Xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 17 TTSTTCCTGG GCTTTTATTG AGAC 24

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 18

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

20 (A) LONGITUD: 26 pares de base

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 18 AAGCCWGAT TTCTGCTTYT TGGAAG 26

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 19 30

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 25 pares de base

(B): TIPO: ácido nucleico 35 (C) CADENA: sencilla

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 19

TGCCMAGGCA HCCRCCRTAC TTGAA 25 40

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 20

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

45 (A) LONGITUD: 19 pares de base

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

50 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 20 GGTCGTCCTA CACCAGAAG 19

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 21

55 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 22 pares de base

(B): TIPO: ácido nucleico

(C) CADENA: sencilla 60 (D) TOPOLOGÍA: lineal

(Xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 21 GGTTGACATT GTCAAGAACA AG 22

65 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 22

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 24 pares de base

(B) TIPO: ácido nucleico 5 (C) CADENA: sencilla

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 22 TCTCMAAAGT CGTCTGTGAC AATC 24

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 23

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

15 (A) LONGITUD: 23 pares de base

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 23 TGYTCRTTTT CTTTCAGAGT TGC 23

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 24

25 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 24 pares de base

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 24 RCTGGTCCT CTTCACCTCA GAAC 24

35 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 25

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 23 pares de base

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 25 45 ACATTGTCVG TTCCAAAGCC AAG 23

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 26

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 21 pares de base

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal 55

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 26 AGGTYCGGGT GACDGTGCTK C 21

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 27

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 23 pares de base

(B): TIPO: ácido nucleico 65 (C) CADENA: sencilla

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 27 TGGRTACATG AGYTCCACCT TGC 23

5 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 28

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 23 pares de base 10 (B) TIPO: ácido nucleico

(C): CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 28 15 AGCTGCARGT ATWCCTACAA YCT 23

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 29

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 20

(A): LONGITUD: 23 pares de base

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal 25

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 29 GTYCCRTTGC TCYTCTCRTT GYC 23

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 30 30

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 25 pares de base

(B): TIPO: ácido nucleico 35 (C) CADENA: sencilla

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 30

AACTGTATAT TGAGAGCCTA CCATG 25 40

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 31

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

45 (A) LONGITUD: 24 pares de base

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

50 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 31 CACACCTTAG CGACTAAACC ACCA 24

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 32

55 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 25 pares de base

(B): TIPO: ácido nucleico

(C) CADENA: sencilla 60 (D) TOPOLOGÍA: lineal

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 32 CTACCTAACA GAATGATTTT GTAAG 25

65 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 33

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 25 pares de base

(B) TIPO: ácido nucleico 5 (C) CADENA: sencilla

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 33 AGTGTTCTTG CCTAGAGAAT CCCAG 25

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 34

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

15 (A) LONGITUD: 25 pares de base

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 34 ACATTCTCTC ACCAATATGA CATAC 25

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 35

25 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 25 pares de base

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 35 TAAGTCACCA TTACATCCTT AGAAC 25

35 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 36

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 25 pares de base

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 36 45 GCTGTAAGAA TCTTCATTAA GCACT 25

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 37

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 25 pares de base

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal 55

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 37 CCTGATACAT GCTAAGGTTA AAAAC 25

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 38

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 25 pares de base

(B): TIPO: ácido nucleico 65 (C) CADENA: sencilla

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 38 AGGCATACAT CTGGAGAGAA ACATG 25

5 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 39

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 25 pares de base 10 (B) TIPO: ácido nucleico

(C): CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 39 15 CAGAGGAGCC TAGCAGGCTA CCGTC 25

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 40

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 20

(A): LONGITUD: 25 pares de base

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal 25

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 40 CAGCAGGTCT GTTGAAGTGT ATCAG 25

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 41 30

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 25 pares de base

(B): TIPO: ácido nucleico 35 (C) CADENA: sencilla

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 41

AGTGGTAGCA TTCACAGGTA GCCAG 25 40

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 42

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

45 (A) LONGITUD: 20 pares de base

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

50 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 42 CAGTCCATGG CACCATAAAG 20

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 43

55 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 22 pares de base

(B): TIPO: ácido nucleico

(C) CADENA: sencilla 60 (D) TOPOLOGÍA: lineal

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 43 TCCGTTAGTA CTGGCTAATT GC 22

65 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 44

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 20 pares de base

(B) TIPO: ácido nucleico 5 (C) CADENA: sencilla

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 44 CTGAATTGGC TCCAAAGGCC 20

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 45

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

15 (A) LONGITUD: 20 pares de base

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 45 AAACAGAAGT CCAGGGCTGC 20

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 46

25 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 21 pares de base

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 46 TCAGTCTCCA GGAGAGAAAA C 21

35 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 47

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 20 pares de base

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 47 45 CTCTGCCCTG GGGATGATTG 20

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 48

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 28 pares de base

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal 55

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 48 AATGTATGTT TATATTTACC TGTTCATG 28

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 49

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 25 pares de base

(B): TIPO: ácido nucleico 65 (C) CADENA: sencilla

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 49 ACAGTGTTTG TGCAAATCCT GAGAC 25

5 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 50

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 25 pares de base 10 (B) TIPO: ácido nucleico

(C): CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 50 15 CAATGCCTAA GTTGGATTCA GGTTG 25

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 51

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 20

(A): LONGITUD: 25 pares de base

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal 25

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 51 CTTGCTGTAA CCTTCCCAGG ACCAG 25

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 52 30

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 23 pares de base

(B): TIPO: ácido nucleico 35 (C) CADENA: sencilla

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 52

TCCCATCCAA AGGCTTCAAA ATC 23 40

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 53

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

45 (A) LONGITUD: 24 pares de base

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

50 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 53 ATACTCWAGG CCTAYAGCCT GTGGT

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 54

55 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 5790 pares de base

(B): TIPO: ácido nucleico

(C) CADENA: sencilla 60 (D) TOPOLOGÍA: lineal

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 54

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un kit de diagnóstico, para determinar el genotipo de una muestra de material genético de mamífero, comprendiendo el kit:

un par de cebadores, en donde un primero de los cebadores incluye una secuencia nucleotídica de suficiente longitud y suficientemente complementaria a una mutación de la SEC ID Nº 1 y que se une en condiciones de alta rigurosidad a una secuencia de ácido nucleico que contiene dicha mutación, seleccionándose la mutación entre el grupo de mutaciones resultantes de:

(a)

deleción de 11 nucleótidos empezando en el nucleótido 821 de la parte codificante de la SEC ID Nº 1;

(b)

deleción de 7 nucleótidos empezando en el nucleótido 419 de la secuencia codificante e inserción de la secuencia AAGCATACAA en su lugar;

(c)

deleción del nucleótido 610 de la secuencia codificante e inserción de T en su lugar;

(d)

deleción del nucleótido 676 de la secuencia codificante e inserción de T en su lugar; y

(e)

combinaciones de las mutaciones (a) a (d).
2.

El kit de diagnóstico de la reivindicación 1 en el que un segundo del par de cebadores está localizado completamente cadena arriba o completamente cadena abajo de la mutación o de las mutaciones seleccionadas.
3.

El kit de diagnóstico de la reivindicación 2 en el que un dicho primer cebador abarca la mutación (a) y que comprende adicionalmente un tercer cebador que es suficientemente complementario a la secuencia nucleotídica identificada como SEC ID Nº 11 para cebar la amplificación de una molécula de ácido nucleico que contiene la SEC ID Nº 11.
4.

El kit de diagnóstico de la reivindicación 2 en el que un dicho primer cebador es suficientemente complementario a la secuencia insertada de la mutación (b) para cebar la amplificación de una molécula de ácido nucleico que contiene la mutación (b) y que comprende adicionalmente un tercer cebador que es suficientemente complementario a la secuencia correspondiente a la deleción de 7 nucleótidos de la mutación (b) para cebar la amplificación de una molécula de ácido nucleico que contiene la deleción de 7 nucleótidos de la mutación (b).
5.

El kit de diagnóstico de la reivindicación 2 en el que un dicho primer cebador abarca la mutación (c) y que comprende adicionalmente un tercer cebador que es suficientemente complementario a la secuencia que abarca la región correspondiente que carece de la mutación (c) para cebar la amplificación de una molécula de ácido nucleico que carece de la mutación (c).
6.

El kit de diagnóstico de la reivindicación 2 en el que un dicho primer cebador abarca la mutación (d) y que comprende adicionalmente un tercer cebador que es suficientemente complementario a la secuencia que abarca la región correspondiente que carece de la mutación (d) para cebar la amplificación de una molécula de ácido nucleico que carece de la mutación (d).
7.

Un procedimiento para determinar la presencia de hiperplasia muscular en un animal bovino, comprendiendo el procedimiento:

averiguar si está presente ADN que tiene una mutación definida en la reivindicación 1 en una muestra de material que contiene ADN de dicho animal usando cebadores definidos en la reivindicación 1 o una sonda de longitud suficiente y suficientemente complementaria a una molécula de ácido nucleico que contiene dicha mutación y que se une en condiciones de alta rigurosidad a una secuencia de ácido nucleico que contiene dicha mutación; y averiguar si está presente ADN que tiene una secuencia nucleotídica que codifica una proteína que tiene actividad biológica de miostatina, en donde la ausencia de ADN que tiene dicha secuencia nucleotídica y la presencia de dicha mutación indican la presencia de hiperplasia muscular en el animal.
8.

El procedimiento de la reivindicación 7 en el que el animal es una raza seleccionada entre Azul Belga, Asturiana, Parthenaise y Rubia Gallega.