ES2659114T3 - Anticuerpos antagonistas contra GDF-8 y usos en el tratamiento de ALS y otros trastornos asociados con GDF-8 - Google Patents

Anticuerpos antagonistas contra GDF-8 y usos en el tratamiento de ALS y otros trastornos asociados con GDF-8 Download PDF

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Abstract

Un anticuerpo humanizado que se une específicamente y antagoniza GDF-8, que comprende: una región pesada variable (VH) de anticuerpo que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7 o que difiere en no más de 2 residuos de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7, y una región ligera variable (VL) de anticuerpo que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9 o que difiere en no más de 2 residuos de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9; en la que la primera CDR de una región VH (H1) tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10, la segunda CDR de una región VH (H2) tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 11, la tercera CDR de una región VH (H3) tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 12, la primera CDR de una región VL (L1) tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 13, la segunda CDR de una región VL (L2) tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14, la tercera CDR de una región VL (L3) tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 15, o en la que la primera CDR de una región VH (H1) tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 20, la segunda CDR de una región VH (H2) tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 21, la tercera CDR de una región VH (H3) tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 22, la primera CDR de una región VL (L1) tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 23, la segunda CDR de una región VL (L2) tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 24, la tercera CDR de una región VL (L3) tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 25.

Description

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estructuras de subunidades y configuraciones tridimensionales de diferentes clases de inmunoglobulinas son bien conocidas en la técnica. Para una revisión de la estructura del anticuerpo, véase Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, eds. Harlow et al., 1988. Un experto en la técnica reconocerá que cada estructura de la subunidad, por ejemplo, una estructura CH, VH, CL, VL, CDR y/o FR, comprende fragmentos activos. Por ejemplo, los fragmentos activos pueden consistir en la porción de la subunidad VH, VL o CDR que se une al antígeno, es decir, el fragmento de unión al antígeno, o la porción de la subunidad CH que se une y/o activa un receptor Fc y/o un complemento.
Ejemplos no limitantes de fragmentos de unión abarcados dentro del término "fragmento de anticuerpo" utilizados en la presente memoria incluyen: (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios VL, VH, CL y CH1; (ii) un fragmento F(ab’)2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la región bisagra; (iii) un fragmento Fv que consiste en los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo. Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, están codificados por genes separados, pueden unirse de forma recombinante mediante un enlazador sintético, creando una única cadena de proteína en la que las regiones VL y VH se unen para formar moléculas monovalentes (conocido como Fv de cadena única (scFv). El enlazador usado más comúnmente es un péptido de 15 residuos (Gly4Ser)3, pero también se conocen otros enlazadores en la técnica. Los anticuerpos de cadena simple también están destinados ser abarcados dentro del término "anticuerpo" o "fragmento de unión al antígeno" de un anticuerpo. Estos anticuerpos se obtienen usando técnicas convencionales conocidas por los expertos en la técnica, y los fragmentos se criban para determinar su utilidad de la misma manera que los anticuerpos intactos.
La diversidad de anticuerpos se crea mediante múltiples genes de línea germinal que codifican regiones variables y una variedad de eventos somáticos. Los eventos somáticos incluyen recombinación de segmentos de genes variables con diversidad (D) y unión (J) de segmentos de genes para formar una región VH completa, y la recombinación de segmentos génicos variables y de unión para formar una región VL completa. El proceso de recombinación en sí mismo es impreciso, lo que resulta en la pérdida o adición de aminoácidos en las uniones V(D)J. Estos mecanismos de diversidad ocurren en las células B en desarrollo antes de la exposición al antígeno. Después de la estimulación antigénica, los genes de anticuerpos expresados en las células B experimentan una mutación somática. Basándose en el número estimado de segmentos de genes de línea germinal, la recombinación aleatoria de estos segmentos y el apareamiento aleatorio de VH-VL, se pueden producir hasta 1,6 x 107 anticuerpos diferentes (Fundamental Immunology, 3ª edición (1993), editor Paul, Raven Press, Nueva York, NY). Cuando se tienen en cuenta otros procesos que contribuyen a la diversidad de anticuerpos (como la mutación somática), se cree que pueden generarse más de 1 x 1010 anticuerpos diferentes (Immunoglobulin Genes, 2ª edición (1995), editores Jonio et al., Academic Press, San Diego, CA). Debido a los muchos procesos implicados en la generación de una diversidad de anticuerpos, es poco probable que los anticuerpos monoclonales derivados independientemente con la misma especificidad de antígeno tengan secuencias de aminoácidos idénticas.
Por lo tanto, se describen y/o reivindican en este documento nuevos anticuerpos que se unen a GDF-8. Los fragmentos de anticuerpo, por ejemplo, estructuras que contienen una CDR, generalmente serán una secuencia de cadena pesada
o ligera del anticuerpo, o un fragmento activo de la misma, en la que la CDR se coloca en una ubicación correspondiente a la CDR de VH y VL naturales. Las estructuras y ubicaciones de dominios variables de inmunoglobulina, por ejemplo, CDR, se pueden definir usando esquemas de numeración bien conocidos, por ejemplo, el esquema de numeración de Kabat, el esquema de numeración de Chothia, una combinación de Kabat y Chothia (AbM), etc. (véase, por ejemplo, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Departamento de Salud y Servicios Humanos de EE. UU. (1991), editores Kabat et al., Al-Lazikani et al. (1997) J. Mol. Biol. 273: 927-48).
Por lo tanto, la presente descripción proporciona además nuevas CDR. La estructura para llevar una CDR de la invención generalmente será un polipéptido, por ejemplo, una secuencia de cadena pesada o ligera de anticuerpo o una porción sustancial de la misma, en la que la CDR está situada en una posición correspondiente a la CDR de regiones VH y VL que se producen naturalmente. Las estructuras y ubicaciones de los dominios variables de inmunoglobulina se pueden determinar cómo se describe, por ejemplo, en Kabat et al., citado más arriba y Al-Lazikani et al., citado más arriba.
Las moléculas de anticuerpo (que incluyen fragmentos de anticuerpo) de la presente divulgación, es decir, moléculas de anticuerpo que antagonizan con GDF-8, incluyen, pero sin limitación, el anticuerpo monoclonal murino RK35 y sus variantes, específicamente la variante humanizada. Los antagonistas de GDF-8 descritos y/o reivindicados en la presente invención incluyen, además de RK35, otros anticuerpos que se unen eficientemente a GDF-8, incluyendo anticuerpos con alta especificidad para unirse a GDF-8 (por ejemplo, anticuerpos con una menor afinidad por otros miembros de la superfamilia de TGF-β (por ejemplo, BMP-11)). Las variantes, que incluyen variantes humanizadas, de estos anticuerpos se contemplan en los métodos para diagnosticar, pronosticar, monitorizar, tratar, mejorar y prevenir de la invención. Estas moléculas de anticuerpo pueden ser útiles para prevenir o tratar un trastorno asociado a GDF-8, por ejemplo, patologías relacionadas con el metabolismo óseo, muscular, adiposo y de glucosa. Las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de cadena ligera de RK35 murino y humanizado se exponen en las SEQ ID NOs: 5 y 9, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de cadena pesada de RK35 murino y humanizado se exponen en las SEQ ID NOs: 3 y 7, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos de las tres regiones determinantes de complementariedad (CDR) en las cadenas ligeras variables de RK35 murino y humanizado
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aminoácido específicos que podrían alterar una función efectora tal como la unión al receptor de Fc (por ejemplo, Lund et al., (1991) J. Immunol., 147: 2657-62; Morgan et al., (1995) Immunology 86: 319-24), o cambiando la especie de la cual se deriva la región constante. Los anticuerpos pueden tener mutaciones en la región CH2 de cadena pesada que reducen o alteran la función efectora, por ejemplo, unión al receptor Fc y activación del complemento. Por ejemplo, los anticuerpos pueden tener mutaciones tales como las descritas en las patentes de Estados Unidos números 5.624.821 y
5.648.260. En la cadena pesada de IgG1 o IgG2, por ejemplo, tales mutaciones pueden realizarse en los residuos de aminoácidos 117 y 120 de la SEQ ID NO: 19, que representa la porción Fc de IgG1 (estos residuos corresponden a los aminoácidos 234 y 237 en la secuencia de longitud completa de IgG1 o IgG2). Los anticuerpos pueden tener también mutaciones que estabilicen el enlace disulfuro entre las dos cadenas pesadas de una inmunoglobulina, tales como mutaciones en la región bisagra de IgG4, como se describe en, por ejemplo, Angal et al., (1993) Mol. Immunol. 30: 105
08.
Los polipéptidos y anticuerpos descritos y/o reivindicados en la presente memoria también abarcan proteínas que son estructuralmente diferentes de los polipéptidos y anticuerpos descritos, por ejemplo, que tienen una secuencia alterada pero sustancialmente las mismas propiedades bioquímicas que los polipéptidos y anticuerpos descritos, por ejemplo, tienen cambios solo en aminoácidos funcionalmente no esenciales. Dichas moléculas incluyen variantes alélicas de origen natural y variantes diseñadas deliberadamente que contienen alteraciones, sustituciones, reemplazos, inserciones o supresiones. Los expertos en la materia conocen bien las técnicas para tales alteraciones, sustituciones, reemplazos, inserciones o supresiones.
Los anticuerpos descritos y/o reivindicados en la presente memoria pueden producirse adicionalmente usando animales transgénicos no humanos que se modifican para producir anticuerpos completamente humanos en lugar de los anticuerpos endógenos del animal en respuesta a la exposición a un antígeno. Véase, por ejemplo, la publicación PCT WO 94/02602. Los genes endógenos que codifican las cadenas de inmunoglobulina pesada y ligera en el huésped no humano han sido incapacitados, y los loci activos que codifican las inmunoglobulinas de cadena pesada y ligera humanas se insertan en el genoma del huésped. Los genes humanos se incorporan, por ejemplo, usando cromosomas artificiales de levadura que contienen los segmentos de ADN humano requeridos. Entonces se obtiene un animal que proporciona todas las modificaciones deseadas como progenie mediante cruzamiento de animales transgénicos intermedios que contienen menos que el complemento completo de las modificaciones. Una realización de tal animal no humano es un ratón, y se denomina XENOMOUSEMR como se describe en las publicaciones PCT WO 96/33735 y WO 96/34096. Este animal produce células B que secretan inmunoglobulinas completamente humanas. Los anticuerpos se pueden obtener directamente del animal después de la inmunización con un inmunógeno de interés, como, por ejemplo, una preparación de un anticuerpo policlonal, o alternativamente de células B inmortalizadas derivadas del animal, tales como hibridomas que producen anticuerpos monoclonales. Adicionalmente, los genes que codifican las inmunoglobulinas con regiones variables humanas pueden recuperarse y expresarse para obtener los anticuerpos directamente, o pueden modificarse adicionalmente para obtener análogos de anticuerpos tales como, por ejemplo, moléculas de Fv de cadena simple.
En consecuencia, el término anticuerpo como se usa en el presente documento incluye anticuerpos intactos, fragmentos de anticuerpos, por ejemplo, fragmentos Fab, F(ab’)2 y scFv, y anticuerpos y fragmentos intactos que han sido mutados en sus regiones constante y/o variable (por ejemplo, mutaciones para producir anticuerpos quiméricos, parcialmente humanizados o completamente humanizados, así como para producir anticuerpos con un rasgo deseado, por ejemplo, unión mejorada de GDF-8 y/o unión de FcR reducida). Como tales, estos pueden ser anticuerpos de la invención, siempre que estén abarcados por el alcance de las reivindicaciones; estos anticuerpos se unen específicamente a GDF8, interfieren con la señalización de GDF-8 y/o neutralizan o inhiben una o más actividades asociadas a GDF-8.
Se pueden emplear también otras moléculas de unión a proteínas para modular la actividad de GDF-8. Dichas moléculas de unión a proteínas incluyen medicamentos inmunofarmacéuticos modulares pequeños (SMIPMR) (Trubion Pharmaceuticals, Seattle, WA). Los SMIP son polipéptidos monocatenarios compuestos por un dominio de unión para una estructura afín tal como un antígeno, un contrarreceptor o similar, un polipéptido de región bisagra que tiene uno o ningún residuo de cisteína, y dominios de CH2 y CH3 de inmunoglobulina (véase también www. trubion.com). Los SMIP y sus usos y aplicaciones se describen en, por ejemplo, las Solicitudes de Patente Publicadas de los Estados Unidos Nos. 2003/0118592, 2003/0133939, 2004/0058445, 2005/0136049, 2005/0175614, 2005/0180970, 2005/0186216, 2005/0202012, 2005/0202023, 2005/0202028, 2005/0202534 y 2005/0238646, y miembros relacionados de la familia de patentes.
La capacidad de unión de un anticuerpo de la invención puede medirse por los siguientes métodos: análisis Biacore, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), cristalografía de rayos X, análisis de secuencia y mutagénesis de barrido como se describe en los Ejemplos a continuación, y otros métodos que son bien conocidos en la técnica. La capacidad de un anticuerpo de la invención para neutralizar y/o inhibir una o más actividades asociadas a GDF-8 puede medirse mediante la siguiente lista no limitativa de métodos: ensayos para medir la proliferación de una línea celular dependiente de GDF-8; ensayos para medir la expresión de polipéptidos mediados por GDF-8; ensayos que miden la actividad de moléculas de señalización secuencia abajo; ensayos que prueban la eficacia de un anticuerpo de la invención para prevenir trastornos musculares en un modelo animal relevante; ensayos como se describe en los ejemplos a continuación; y otros ensayos que son bien conocidos en la técnica.
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Los polinucleótidos aislados de la presente invención se pueden usar como sondas de hibridación y cebadores para identificar y aislar ácidos nucleicos que tienen secuencias idénticas o similares a las que codifican los polinucleótidos descritos. Los polinucleótidos aislados de esta manera se pueden usar, por ejemplo, para producir anticuerpos contra GDF-8 u otros miembros de la familia de TGF-β o para identificar células que expresan tales anticuerpos. Los métodos
5 de hibridación para identificar y aislar ácidos nucleicos incluyen la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), hibridaciones Southern, hibridación in situ e hibridación Northern, y son bien conocidas por los expertos en la técnica.
Las reacciones de hibridación se pueden realizar en condiciones de diferentes rigurosidades. La rigurosidad de una reacción de hibridación incluye la dificultad con la que dos moléculas de ácido nucleico se hibridarán entre sí. 10 Preferiblemente, cada polinucleótido de hibridación se hibrida con su polinucleótido correspondiente en condiciones de rigurosidad reducidas, más preferiblemente condiciones rigurosas, y lo más preferiblemente condiciones altamente rigurosas. Ejemplos de condiciones rigurosas se muestran en la Tabla 3 a continuación: las condiciones altamente rigurosas son aquellas que son al menos tan estrictas como, por ejemplo, las condiciones A-F; las condiciones rigurosas son al menos tan estrictas como, por ejemplo, las condiciones G-L; y las condiciones de rigurosidad reducidas son al
15 menos tan estrictas como, por ejemplo, las condiciones M-R.
Tabla 3
Condición
Hibrido Longitud del híbrido (pb)1 Temperatura de hibridación y regulador2 Temperatura de lavado y regulador2
A
ADN:ADN > 50 65°C; 1X SSC o 42°C; 1X SSC, 50% de formamida 65°C; 0.3X SSC
B
ADN:ADN <50 TB*; 1X SSC TB*; 1X SSC
C
ADN:ARN > 50 67°C; 1X SSC o 45°C; 1X SSC, 50% de formamida 67°C; 0.3X SSC
D
ADN:ARN <50 TD*; 1X SSC TD*; 1X SSC
E
ARN:ARN >50 70°C; 1X SSC o 50°C; 1X SSC, 50% de formamida 70°C; 0.3X SSC
F
ARN:ARN <50 TF*; 1X SSC TF*; 1X SSC
G
ADN:ADN >50 65°C; 4X SSC o 42°C; 4X SSC, 50% de formamida 65°C; 1X SSC
H
ADN:ADN <50 TH*; 4X SSC TH*; 4X SSC
I
ADN:ARN >50 67°C; 4X SSC o 45°C; 4X SSC, 50% de formamida 67°C; 1X SSC
J
ADN:ARN <50 TJ*; 4X SSC TJ*; 4X SSC
K
ARN:ARN >50 70°C; 4X SSC o 50°C; 4X SSC, 50% de formamida 67°C; 1X SSC
L
ARN:ARN <50 TL*; 2X SSC TL*; 2X SSC
M
ADN:ADN >50 50°C; 4X SSC o 40°C; 6X SSC, 50% de formamida 50°C; 2X SSC
N
ADN:ADN <50 TN*; 6X SSC TN*; 6X SSC
O
ADN:ARN >50 55°C; 4X SSC o 42°C; 6X SSC, 50% de formamida 55°C; 2X SSC
P
ADN:ARN <50 TP*; 6X SSC TP*; 6X SSC
Q
ARN:ARN >50 60°C; 4X SSC o 45°C; 6X SSC, 50% de formamida 60°C; 2X SSC
R
ARN:ARN <50 TR*; 4X SSC TR*; 4X SSC
1La longitud del híbrido es la prevista para la región o regiones hibridadas de los polinucleótidos que se hibridan. Cuando se hibrida un polinucleótido con un polinucleótido objetivo de secuencia desconocida, se supone que la longitud del híbrido es la del polinucleótido que se hibrida. Cuando los polinucleótidos de secuencia conocida se hibridan, la longitud del híbrido puede determinarse alineando las secuencias de los polinucleótidos e identificando la región o regiones de complementariedad de secuencia óptima.
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de células huésped en las que se ha introducido el vector. Por ejemplo, típicamente el gen marcador seleccionable confiere resistencia a fármacos, tales como G418, higromicina o metotrexato, en una célula huésped en la que se ha introducido el vector. Los genes marcadores seleccionables preferidos incluyen el gen de dihidrofolato reductasa (DHFR) (para uso en células huésped de dhfr con selección/amplificación de metotrexato) y el gen neo (para selección de G418).
Se pueden elegir o construir vectores adecuados, que contienen secuencias reguladoras apropiadas, que incluyen secuencias promotoras, secuencias terminadoras, secuencias de poliadenilación, secuencias potenciadoras, genes marcadores y otras secuencias según corresponda. Los vectores pueden ser plásmidos o virales, por ejemplo, fagos o fagémidos, según sea apropiado. Para más detalles, véase, por ejemplo, Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 2ª ed., Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. Muchas técnicas y protocolos conocidos para la manipulación de ácido nucleico, por ejemplo, en la preparación de constructos de ácidos nucleicos, mutagénesis, secuenciación, introducción de ADN en células y expresión génica, y análisis de proteínas, se describen en detalle en Current Protocols in Molecular Biology, 2ª edición, Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons, 1992.
La presente invención también proporciona una célula huésped que comprende uno o más constructos como anteriormente. Un ácido nucleico que codifica cualquier CDR (H1, H2, H3, L1, L2 o L3), dominio VH o VL, o fragmento de unión a antígeno como se proporciona aquí, forma un aspecto de la presente invención.
La presente invención también incluye un método para producir un péptido mediante la expresión de la proteína a partir del ácido nucleico codificante en una célula huésped. La expresión se puede lograr cultivando células huésped recombinantes que contienen el ácido nucleico en condiciones apropiadas.
Los fragmentos de anticuerpos específicos, los dominios VH y/o VL, y las moléculas de polinucleótidos codificadores y vectores de acuerdo con la presente invención se pueden proporcionar aislados y purificados, por ejemplo, de su entorno natural, en forma sustancialmente pura u homogénea, o, en el caso de ácidos nucleicos, libres o sustancialmente libres de ácidos nucleicos o genes de origen distinto al de la secuencia que codifica un polipéptido con la función requerida.
Varias líneas celulares son células huésped adecuadas para la expresión recombinante de los polipéptidos y anticuerpos de la presente invención. Las líneas de células huésped de mamíferos incluyen, por ejemplo, células COS, células CHO, células 293T, células A431, células 3T3, células CV-1, células HeLa, células L, células BHK21, células HL-60, células U937, células HaK, Jurkat células, así como cepas celulares derivadas del cultivo in vitro de tejido primario y explantes primarios. Dichas células huésped también permiten el empalme de los polinucleótidos de la invención que consisten en ADN genómico.
Alternativamente, puede ser posible producir de forma recombinante los polipéptidos y anticuerpos de la presente invención en eucariotas inferiores tales como levadura o en procariotas. Las cepas de levadura potencialmente adecuadas incluyen Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, cepas de Kluyveromyces y cepas de Candida. Las cepas bacterianas potencialmente adecuadas incluyen Escherichia coli, Bacillus subtilis y Salmonella typhimurium. Si los polipéptidos de la presente invención se elaboran en levadura o bacterias, puede ser necesario modificarlas mediante, por ejemplo, fosforilación o glicosilación de sitios apropiados, para obtener proteínas funcionales. Tales uniones covalentes se pueden lograr usando métodos químicos o enzimáticos bien conocidos.
Los polipéptidos y anticuerpos de la presente invención también pueden producirse de forma recombinante ligando operativamente los polinucleótidos aislados de la presente invención a secuencias de control adecuadas en uno o más vectores de expresión de insectos, tales como vectores de baculovirus, y empleando un sistema de expresión de células de insectos. Los materiales y métodos para sistemas de expresión de baculovirus/Sf9 están disponibles comercialmente en forma de kit (por ejemplo, el kit MAXBAC®, Invitrogen, Carlsbad, CA).
Después de la expresión recombinante en las células huésped apropiadas, los polipéptidos y anticuerpos de la presente invención se pueden purificar a partir de medio de cultivo o extractos celulares usando procesos de purificación conocidos, tales como filtración en gel y cromatografía de intercambio iónico. La purificación también puede incluir cromatografía de afinidad con agentes que se sabe que se unen a los polipéptidos y anticuerpos de la presente invención. Estos procesos de purificación también pueden usarse para purificar los polipéptidos y anticuerpos de la presente invención a partir de fuentes naturales.
Alternativamente, los polipéptidos y anticuerpos de la presente invención pueden expresarse de forma recombinante en una forma que facilita la purificación. Por ejemplo, los polipéptidos se pueden expresar como fusiones con proteínas tales como proteína de unión a maltosa (MBP), glutatión S-transferasa (GST) o tiorredoxina (TRX). Los kits para la expresión y purificación de tales proteínas de fusión están disponibles comercialmente a través de New England BioLabs (Beverly, MA), Pharmacia (Piscataway, NJ) e Invitrogen, respectivamente. Los polipéptidos y anticuerpos de la presente invención también pueden marcarse con un epítopo pequeño y posteriormente identificarse o purificarse usando un anticuerpo específico para el epítopo. Un epítopo preferido es el epítopo FLAG, que está disponible comercialmente a través de Eastman Kodak (New Haven, CT).
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por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido, y similares), y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de la dispersión y mediante el uso de tensoactivos. La prevención de la acción de microorganismos se puede lograr mediante diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol y cloruro de sodio en la composición. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede realizarse incluyendo en la composición un agente que retrasa la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.
Cuando una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo de la invención se administra mediante, por ejemplo, inyección intravenosa, cutánea o subcutánea, el agente de unión estará en forma de una solución acuosa parenteralmente aceptable, libre de pirógenos. La preparación de tales soluciones de proteínas parenteralmente aceptables, teniendo debidamente en cuenta el pH, la isotonicidad, la estabilidad y similares, está dentro de la experiencia en la técnica. Una composición farmacéutica preferida para inyección intravenosa, cutánea o subcutánea debe contener, además de agentes aglutinantes, un vehículo isotónico tal como inyección de cloruro de sodio, inyección de Ringer, inyección de dextrosa, inyección de dextrosa y cloruro sódico, inyección de Ringer lactato u otro vehículo como se conoce en la técnica. La composición o composiciones farmacéuticas de la presente invención también pueden contener estabilizadores, conservantes, reguladores, antioxidantes u otros aditivos conocidos por los expertos en la técnica.
La cantidad de un anticuerpo de la invención (u otro antagonista de la invención) en la composición farmacéutica de la presente invención dependerá de la naturaleza y la gravedad de la afección que se trata, y de la naturaleza de los tratamientos previos experimentados por el paciente. En última instancia, el médico tratante decidirá la cantidad de anticuerpo con el que se tratará a cada paciente en particular. Inicialmente, un médico tratante administra bajas dosis de anticuerpos y observa la respuesta del paciente. Pueden administrarse dosis mayores de anticuerpo hasta que se obtenga el efecto terapéutico óptimo para el paciente, y en ese punto la dosificación generalmente no aumenta más. Se contempla que las diversas composiciones farmacéuticas utilizadas para practicar el método de la presente invención deberían contener aproximadamente 0,1 μg a 50 mg de anticuerpo por kg de peso corporal.
La duración de la terapia que usa la composición farmacéutica de la presente invención variará, dependiendo de la gravedad de la enfermedad que se está tratando y la afección y la respuesta idiosincrásica potencial de cada paciente individual. Se contempla que la duración de cada aplicación de anticuerpo será a través de, por ejemplo, la ruta subcutánea y, por ejemplo, en el intervalo de una vez por semana. Finalmente, el médico tratante decidirá la duración apropiada de la terapia usando la composición farmacéutica de la presente invención.
Las composiciones orales generalmente incluyen un diluyente inerte o un vehículo comestible. Pueden encerrarse en cápsulas de gelatina o comprimirse en tabletas. Para el propósito de la administración terapéutica oral, el antagonista de GDF-8 (por ejemplo, anticuerpo, molécula pequeña, etc.) puede incorporarse con excipientes y usarse en forma de tabletas o cápsulas. Los agentes aglutinantes farmacéuticamente compatibles y/o los materiales adyuvantes se pueden incluir como parte de la composición. Las tabletas, píldoras, cápsulas y similares pueden contener cualquiera de los siguientes ingredientes o compuestos de naturaleza similar; un aglutinante tal como celulosa microcristalina, goma de tragacanto o gelatina; un excipiente tal como almidón o lactosa; un agente disgregante tal como ácido algínico, PrimogelMR o almidón de maíz; un lubricante tal como estearato de magnesio o SterotesMR; un deslizante tal como dióxido de silicio coloidal; un agente edulcorante tal como sacarosa o sacarina; o un agente aromatizante tal como menta, salicilato de metilo o saborizante de naranja.
Cuando una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica de la invención, por ejemplo, un anticuerpo que se une a GDF-8 e interfiere con la señalización de GDF-8, se administra por vía oral, el agente de unión estará en forma de una tableta, cápsula, polvo, solución o elixir. Cuando se administra en forma de tableta, la composición farmacéutica de la invención puede contener adicionalmente un vehículo sólido tal como una gelatina o un adyuvante. La tableta, la cápsula y el polvo contienen de aproximadamente 5 a 95% de agente de unión, y preferiblemente de aproximadamente 25 a 90% de agente de unión. Cuando se administra en forma líquida, se puede agregar un vehículo líquido tal como agua, petróleo, aceites de origen animal o vegetal, tal como aceite de maní, aceite mineral, aceite de soja o aceite de sésamo, o aceites sintéticos (después de tomar en cuenta las alergias del paciente individual y/o de la vasta población de individuos a tales portadores líquidos). La forma líquida de la composición farmacéutica puede contener además solución salina fisiológica, dextrosa u otra solución de sacárido, o glicoles tales como etilenglicol, propilenglicol o polietilenglicol. Cuando se administra en forma líquida, la composición farmacéutica contiene de aproximadamente 0,5 a 90% en peso del agente de unión, y preferiblemente de aproximadamente 1 a 50% del agente de unión.
Para administración por inhalación, se administra un antagonista de GDF-8 en forma de aerosol desde un recipiente o dispensador presurizado, que contiene un propelente adecuado, por ejemplo, un gas tal como dióxido de carbono o un nebulizador. Por consiguiente, los compuestos descritos en este documento pueden administrarse por inhalación al tejido pulmonar. El término "tejido pulmonar" tal como se usa en el presente documento se refiere a cualquier tejido del tracto respiratorio e incluye tanto el tracto respiratorio superior como el inferior, excepto que se indique lo contrario. Se
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Todos los procedimientos que involucran animales fueron aprobados por el IACUC de la Universidad de Pensilvania o Wyeth. Los ratones transgénicos que expresan SODG93A humana (Gurney et al., citado más arriba) sobre un fondo híbrido B6SJL (Jackson Laboratories) se aparearon internamente con ratones reproductores hembra B6SJLF1 (Jackson Laboratories). La progenie se cribó por PCR; se utilizaron ratones negativos para el transgén como controles de tipo silvestre de camada de la misma edad. Los ratones se dividieron en cuatro grupos: 29 ratones SODG93A tratados con el anticuerpo anti-miostatina RK35, 28 ratones SODG93A tratados con solución salina regulada con fosfato (PBS) (vehículo), 23 ratones de tipo silvestre tratados con RK35 y 23 ratones de tipo silvestre tratados con PBS. Comenzando a los 28 días después del nacimiento, los ratones fueron inyectados intraperitonealmente semanalmente, con anticuerpo monoclonal anti-GDF-8 RK35 o un volumen equivalente de PBS. La primera dosis fue de 40 mg/kg; las dosis posteriores fueron de 20 mg/kg/semana siguiendo el protocolo descrito para el anticuerpo anti-miostatina JA16 (Whittemore, et al., citado más arriba). Se sacrificaron 9-12 ratones de cada grupo entre 84 y 90 días (12 semanas) de edad (media de 88 días) para evaluar la masa muscular húmeda y la histología, y los ratones restantes se monitorizaron hasta alcanzar la enfermedad en etapa terminal (~ 134 días), que se define como una falla a la derecha dentro de los 30 segundos de yacer en forma lateral izquierda y derecha.
Al mismo tiempo, se administró a ratas transgénicas (58) que expresan SODG93A humano (Howland et al., citado más arriba) en una mezcla igual de machos y hembras, PBS (vehículo) o RK35. Diez ratas en cada grupo fueron sacrificadas a los 95 días de edad para determinar el efecto de RK35 sobre la masa muscular húmeda. Las 19 ratas restantes en cada grupo continuaron hasta la etapa terminal de la enfermedad. Se usó un segundo estudio en el que se usaron ratas de control de camada hembra transgénicas y de tipo silvestre para comparar los aumentos de peso corporal y los cambios en la fuerza de prensión entre los grupos de tratamiento y el genotipo. En cada estudio, las ratas fueron inyectadas intraperitonealmente con RK35 a razón de 40 mg/kg (a las 6 semanas (~42 días) de edad) y posteriormente inyectadas con 20 mg/kg/semana o vehículo continuando bien sea hasta sacrificio a los 95 días para analizar la masa muscular o hasta la etapa terminal medida por falla refleja derecha.
Ejemplo 3.1.2: Peso corporal y mediciones de masa muscular
Los pesos corporales iniciales se usaron para distribuir equitativamente animales entre las cohortes a fin de garantizar el peso corporal promedio equivalente al inicio del estudio. El inicio de la pérdida de peso se calificó como la edad a la que se observó la primera de tres medidas consecutivas de pérdida de peso. La masa muscular húmeda se determinó en el gastrocnemio, el tibial craneal, el cuádriceps y el diafragma en un punto compatible con enfermedad temprana (88 días para ratones, 95 días para ratas) y en etapa terminal (~ 134 días para ratones y ~ 128 días para las ratas). Los animales se sacrificaron y los músculos de cada pata se diseccionaron y pesaron cuantitativamente; los valores de las patas derecha e izquierda se promediaron.
Ejemplo 3.1.3: Histopatología muscular y recuento de neuronas motoras
El gastrocnemio y el diafragma se fijaron y seccionaron para la tinción con H&E (Howland et al. (2002) Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A. 99: 1604-29). La puntuación para la atrofia y la hipertrofia fue realizada por dos patólogos independientes, sin conocimiento de la identidad de la muestra. Los diámetros de fibra se midieron por morfometría (Axiovision 4.3, Zeiss, Thornwood, NY) en músculo gastrocnemio (ratones SODG93A tratados con PBS y RK35 y ratones de tipo silvestre tratados con PBS) a los 88 días y etapa terminal, así como para el músculo del diafragma (SODG93A tratados con PBS y RK35 y ratones de tipo silvestre tratados con PBS) y etapa terminal. Se congelaron en forma instantánea tres músculos por grupo en isopentano enfriado con hielo seco, se sometieron a criosección a un espesor de 8 μm y se inmunotiñeron usando un anticuerpo anti-laminina (Sigma, St. Louis, MO; número de catálogo L9393). Se tomaron medidas lineales del diámetro máximo del eje menor de al menos doscientas fibras, utilizando el software Zeiss Axiovision. Los diámetros de fibra se agruparon en intervalos de 20 μm, y se generaron histogramas de frecuencia para cada grupo muscular.
Se realizaron recuentos de neuronas motoras en 3 ratones de cada grupo (de tipo silvestre, SODG93A tratado con PBS, y SODG93A tratado con RK35) tanto en enfermedad en etapa inicial como en la etapa terminal (se analizaron un total de 18 ratones). Las médulas espinales eliminadas de los ratones decapitados se fijaron posteriormente en paraformaldehído al 4%, luego se diseccionaron los cordones y se fijaron posteriormente durante 24 horas adicionales en paraformaldehído al 4%. Usando la tecnología MultiBrainMR (Neuroscience Associates, Knoxville, TN), se embebieron 18 médulas espinales lumbares en un solo bloque y se seccionaron transversalmente hasta 50 µm en el plano coronal a lo largo de todo el segmento (~ 6 mm) de la ampliación lumbar. Cada sexta sección (300 μm) se tiñó con tionina NISSL para revelar cuerpos celulares (Bjugn (1993) Brain Res. 627: 25-33; Kieran et al. (2004) Nat. Med. 10: 402-05). Los recuentos se realizaron utilizando dos enfoques independientes. En primer lugar, se analizaron diez secciones de la médula espinal que abarcaban L3-5 para cada uno de 18 ratones por un observador sin conocer la identidad de la muestra utilizando Zeiss Axoplan2 a 20x y 40x. Se contaron las dos astas ventrales de cada sección, identificando neuronas motoras grandes y sanas mediante la presencia de nucléolos visibles como se describió previamente (Kieran et al., citado más arriba). Los datos resultantes se representaron como el número promedio de neuronas motoras grandes por asta ventral. En segundo lugar, las secciones de la región L3-L5 se analizaron estereológicamente usando un Zeiss Axioskop2 equipado con una etapa de muestra motorizada, microcator electrónico y software de estereología (Stereo Investigator (MBF Bioscience, Williston, VT), como se describe (West et al., (1991) Anat. Rec. 231: 482-97;
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La ALS es una enfermedad mortal y progresiva en la que las neuronas motoras de la médula espinal y el tronco encefálico se degeneran con posterior atrofia muscular. Se ha prestado considerable atención a los mecanismos implicados en la muerte de las células de neuronas motoras. Varios estudios recientes han sugerido que múltiples tipos de células pueden estar involucradas en la etiología de la enfermedad al monitorizar la producción de factores clave en el microambiente extracelular de la unión neuromuscular (Bruijn et al. (2004) Annu. Rev. Neurosci. 27: 723-49). Los estudios que usan ratones quiméricos han mostrado que la presencia de células no neuronales de tipo silvestre puede extender la supervivencia de neuronas motoras que expresan SOD1 mutante (Clement et al., (2003) Science 302: 11317). Estas observaciones han conducido a la investigación de terapias que puedan ralentizar la degeneración neuronal al proporcionar un microambiente óptimo para la supervivencia. Por ejemplo, se ha demostrado que la administración en el músculo de factores de crecimiento expresados viralmente que incluyen IGF-1, GDNF y VEGF prolonga la supervivencia en el modelo de ratón SODG93A (Kaspar et al. (2003) Science 301: 839-42; Azzouz et al. (2004) Nature
429: 413-17, Wang et al. (2002) J. Neurosci. 22: 6920-28). Además, la expresión específica de músculo de IGF-1 ha demostrado estabilizar las uniones neuromusculares, mejorar la supervivencia de las neuronas motoras y retrasar el inicio y la progresión de la enfermedad en el modelo de ratón transgénico SODG93A, indicando que los efectos directos sobre el músculo pueden afectar el inicio y progresión de la enfermedad (Dobrowolny et al. (2005) J. Cell. Biol. 168: 193-99). Los cambios en el metabolismo muscular y la vulnerabilidad de las neuronas motoras también se han informado en ratones con ALS, lo que respalda aún más la hipótesis de que el músculo puede ser un conductor activo de la patología de la enfermedad (Dupois et al. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101: 11159 -64).
La miostatina o GDF-8, es un inhibidor endógeno del crecimiento muscular que provoca su función biológica, al menos en parte, mediante la activación del receptor de Activina IIb (ActRIIb), lo que produce la represión de la proliferación y diferenciación de las células de mioblastos (Langley et al. (2002) J. Biol. Chem. 277: 49831-40; Thomas et al. (2000) J. Biol. Chem. 275: 40235-43). Se ha demostrado que la inhibición de la función de GDF-8 usando anticuerpos neutralizantes anti-GDF-8 mejora la masa muscular y la fuerza en ratones adultos sanos y proporciona una mejora funcional en el modelo de ratón mdx de distrofia muscular (Whittemore et al., Biochem 2003). Biophys, Res. Commun.
300: 965-71; Bogdanovich et al. (2002) Nature 420: 418-21). Para comprender mejor el papel del músculo en la progresión de la enfermedad de las neuronas motoras, se usó un nuevo anticuerpo neutralizante para GDF-8, RK35, que se une con mayor afinidad que un reactivo descrito anteriormente (IC50 3 nM para RK35 frente a > 100 nM para JA16; Whittemore et al. (2003) Biochem. Biophys. Res. Commun. 300: 965-71; Bogdanovich et al. (2002) Nature 420: 418-21), lo que resulta en mayores aumentos en la masa muscular en ratones de tipo silvestre tratados con RK35. (datos no mostrados).
En modelos de ratón y rata SODG93A de ALS familiar, el tratamiento con RK35 dio como resultado un aumento del peso corporal y un aumento de la masa y la fuerza muscular durante las primeras fases de la enfermedad de neuronas motoras. Esta fase temprana de la enfermedad se define como la edad (56-88 días después del nacimiento) a la que los ratones SODG93A muestran una pérdida significativa de la fuerza muscular, medida por la evaluación de la fuerza de agarre (Ligon et al. (2005) Neuroreport 16: 533-36) y anormalidades de la marcha (Wooley et al. (2005) Muscle Nerve
32: 43-50), y que coincide con la denervación de las uniones neuromusculares (Frey et al. (2000) J. Neurosci. 20: 253442; Fischer et al. al (2004) Experimental Neurology 185: 232-40). Los incrementos de masa muscular resultantes de la inhibición de GDF-8 por RK35 fueron más evidentes en los músculos cuádriceps, pero también fueron pronunciados en el gastrocnemio, el tibial craneal y el diafragma en ambos modelos de roedores probados. Estos aumentos se correlacionaron bien con el aumento de la fuerza, ya que la fuerza de las extremidades traseras y anteriores disminuyeron más lentamente en los ratones tratados con RK35 en comparación con los controles. El grado de aumento de la masa muscular inducido por el tratamiento con el anticuerpo anti-GDF-8 RK35 fue similar en magnitud a un aumento del 25% en la masa muscular observada en ratones heterocigotos para la alteración del gen de GDF-8; la masa muscular de ratones que son homocigóticos nulos para GDF-8 es aproximadamente el doble de la de ratones de tipo silvestre (McPherron (1997) Nature 387: 83-90).
Aproximadamente 84-88 días después del nacimiento en ratones SODG93A, y aproximadamente 110 días para ratas SODG93A, se hacen evidentes signos de enfermedad que incluyen disminución del peso corporal, anomalías de la marcha y parálisis. El tratamiento con RK35 no extendió la supervivencia en ratones o ratas SODG93A. El aumento de la masa muscular y la fuerza inducida por el tratamiento anti-GDF-8 en la fase temprana de la enfermedad no retrasaron la aparición de anomalías de la marcha y la parálisis de las extremidades en ratones y ratas SODG93A (datos no mostrados) ni se mantuvieron la ganancia de masa muscular de las patas.
Sin embargo, se observaron aumentos significativos en la masa del diafragma en ratones y ratas SODG93A tratados con RK35 en comparación con los controles SODG93A tratados con vehículo tanto en fases de enfermedad temprana como terminal. El músculo del diafragma en ratones SODG93A tratados con RK35 en la etapa terminal fue comparable al de los controles de tipo silvestre de la misma edad tanto en la masa como en la evaluación histológica. Las ratas SODG93A tratadas con RK35 también mantuvieron un aumento significativo en la masa muscular del diafragma en etapa terminal. De acuerdo con estos cambios morfológicos, el análisis electrofisiológico de diafragmas de ratas SODG93A no tratadas indica que la expresión de SOD1 mutante produce una inhibición significativa de la función muscular, y que el tratamiento con RK35 conserva eficazmente la función muscular en el diafragma.
En este estudio, se utilizó un punto final definido (falla de la prueba refleja derecha, que indica parálisis significativa de
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