BR112015009003B1

BR112015009003B1 - Receptores de antígeno quiméricos que se ligam especificamente a cd22, ácido nucleico, vetor de expressão recombinante, microrganismo transgênico, composição farmacêutica, e uso dos mesmos

Info

Publication number: BR112015009003B1
Application number: BR112015009003-6A
Authority: BR
Inventors: Rimas J. Orentas; Ira H. Pastan; Dimiter S. Dimitrov; Crystal L. Mackall
Original assignee: The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services
Priority date: 2012-10-24
Filing date: 2013-09-18
Publication date: 2023-01-31
Also published as: US11807682B2; US10072078B2; ES2718903T3; JP2018153186A; JP2016502512A; CN104822705B; CA2889055A1; BR112015009003A2; WO2014065961A1; AU2018204257A1; US20240084008A1; HK1213922A1; US20190085078A1; CN104822705A; CN110229834A; AU2013335180A1; JP6338252B2; RU2015117237A; US20150299317A1; US20200283522A1

Abstract

RECEPTORES DE ANTÍGENO QUIMÉRICOS M971. A invenção refere-se a um receptor de antígeno quimérico (CAR) compreendendo um domínio de ligação ao antígeno que compreende as SEQ ID NOs: 1 a 6, um domínio da transmembrana, e um domínio de sinalização da célula T intracelular. Ácidos nucleicos, vetores de expressão recombinantes, células hospedeiras, populações de células, anticorpos, ou as suas partes de ligação ao antígeno, e composições farmacêuticas relativos aos CARs são divulgados. Métodos de detecção da presença de câncer em um mamífero e métodos de tratamento ou prevenção de câncer em um mamífero também são divulgados.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDO RELACIONADO

[001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório U.S. No. 61/717.960, depositado em 24 de outubro de 2012, cujos conteúdos inteiros são aqui incorporados por referência.

INCORPORAÇÃO POR REFERÊNCIA DO MATERIAL ELETRONICAMENTE APRESENTADO

[002] Incorporada aqui por referência na sua totalidade é uma listagem de sequência de nucleotídeo/aminoácido legível por computador apresentada concorrentemente com esta e identificada como se segue: um arquivo de 31786 bytes ASCII (texto) chamado "714144_ST25.txt", datado de 30 de agosto de 2013.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[003] O câncer é um problema de saúde pública. Apesar dos avanços nos tratamentos tais como a quimioterapia, o prognóstico para muitos cânceres, incluindo as malignidades hematológicas, pode ser fraco. Por exemplo, estima-se que mais de 45.000 mortes foram esperadas do linfoma de não Hodgkin e leucemia nos Estados Unidos em 2000 (Greenlee et al., CA Cancer J. Clin., 50:7-33 (2000)). Consequentemente, existe uma necessidade não atendida para tratamentos adicionais para o câncer, particularmente as malignidades hematológicas.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[004] Uma modalidade da invenção fornece um receptor de antígeno quimérico (CAR) que compreende um domínio de ligação ao antígeno compreendendo as SEQ ID NOs: 1 a 6, um domínio da transmembrana, e um domínio de sinalização da célula T intracelular.

[005] Outras modalidades da invenção fornecem ácidos nucleicos relacionados, vetores de expressão recombinantes, células hospedeiras, populações de células, anticorpos ou suas partes de ligação ao antígeno, e composições farmacêuticas relacionadas com os CARs da invenção.

[006] As modalidades adicionais da invenção fornecem métodos para detectar a presença de câncer em um mamífero e métodos para tratar ou prevenir o câncer em um mamífero.

BREVE DESCRIÇÃO DAS DIVERSAS VISTAS DOS DESENHOS

[007] As Figuras de 1A a 1G são gráficos que mostram a % de lise das linhagens celulares de leucemia rotuladas 51Cr alvos REH (A), SEM (B), NALM6-GL (C), KOPN8 (D), Daudi (E), Raji (F) e K562 (G) através das células T humanas efetoras que não foram transduzidas (transfectadas com o vetor vazio, •; círculos) ou transduzidas com os seguintes CARs: HA22-SH-segunda geração, versão 1 (▼), m971- segunda geração, versão 1 (▲; triângulo aberto), ou CAR específico de CD19 (■; quadrados) em vários efetores para direcionar as relações (E:T).

[008] As Figuras de 2A a 2C são gráficos que mostram a porcentagem de lise das linhagens celulares de leucemia alvo Raji (A), NALM6-GL (B), ou células K562 (C) por células T não transduzidas efetoras (transfectadas com o vetor vazio, •; círculos), m971-segunda geração, versão 1 CAR (▲) ou m971-terceira geração CAR (▼) em várias relações E:T.

[009] As figuras de 3A a 3C são gráficos que mostram as quantidades de interferon (IFN)-Y (pg/ml) segregadas pelas células T que não foram transduzidas (transfectadas com o vetor vazio) ou transduzidas com um dos seguintes CARs: anti-CD19, m971-segunda geração versão 1 (SEQ ID NO: 23), m971-terceira geração (SEQ ID NO: 24), HASH22-segunda geração versão 1, HASH22-segunda geração versão 2, ou HASH22-terceira geração após a cocultura com as linhagens celulares de leucemia NALM6-GL (CD22low) (A), Raji (CD22hi) (B), ou K562 (CD22-negativa) (C).

[0010] As figuras de 3D a 3F são gráficos que mostram as quantidades de interleucina (IL)-2 (pg/ml) segregadas pelas células T que não foram transduzidas (transfectadas com o vetor vazio) ou transduzidas com um dos seguintes CARs: anti-CD19, m971-segunda geração versão 1 (SEQ ID NO: 23), m971-terceira geração (SEQ ID NO: 24), HASH22-segunda geração versão 1, HASH22-segunda geração versão 2, ou HASH22-terceira geração após a cocultura com as linhagens celulares de leucemia NALM6-GL (CD22low) (A), Raji (CD22hi) (B), ou K562 (CD22-negativa) (C).

[0011] As Figuras de 3G a 3I são gráficos que mostram as quantidades de fator da necrose tumoral (TNF)-α (pg/ml) segregadas por células T que não foram transduzidas (transfectadas com o vetor vazio) ou transduzidas com um dos seguintes CARs: anti-CD19, m971-segunda geração versão 1 (SEQ ID NO: 23), m971-terceira geração (SEQ ID NO: 24), HASH22-segunda geração versão 1, HASH22-segunda geração versão 2, ou HASH22-terceira geração após a cocultura com linhagens celulares de leucemia NALM6-GL (CD22low) (A), Raji (CD22hi) (B), ou K562 (CD22-negativa) (C).

[0012] A Figura 4A é um gráfico que mostra os sinais bioluminescentes (fótons/s/cm2/sr) gerados pela reação da luciferase (transfectada em células de leucemia, que foram injetadas em camundongos) com luciferina que foi injetada nos camundongos, durante um período de tempo de 30 dias. Os camundongos foram tratados com células T de controle ("transfectadas com o vetor vazio", não transduzidas, •; círculos) ou células T transduzidas com CAR HASH22-segunda geração, versão 1 (■; quadrados) ou m971-segunda geração versão 1 (triângulos, SEQ ID NO : 23). Valores superiores de fótons/s/cm2/sr indicam maior carga tumoral.

[0013] A Figura 4B é um gráfico que mostra a porcentagem de sobrevivência de camundongos tratados com células T de controle ("transfectadas com o vetor vazio", não transduzidas, quadrados) ou células T transduzidas com CAR HASH22-segunda geração versão 1 (círculos) ou CAR 971-segunda geração versão 1 (triângulos, SEQ ID NO: 23) ao longo de 30 dias. (Mock v. HA22, p=0.0019; mock v. m971, p=0.0019; m971 v. HA22, p=0,003).

[0014] A Figura 5 é uma tabela que mostra imagens bioluminescentes de camundongos tendo leucemia de três, cinco e oito dias após o tratamento com as células T não transduzidas (transfectadas com o vetor vazio) ou 15 x 106, 5 x 106, 1 x 106 ou 1 x 105 células T que foram transduzidas com uma sequência de nucleotídeo que codifica um CAR m971-segunda geração, versão 2 (SEQ ID NO: 22). Uma mudança no sombreamento de cinza para branco indica aumento de carga tumoral.

[0015] A Figura 6 é um gráfico que mostra o número total de fótons emitidos na bioluminescência dos camundongos mostrados na Figura 5 durante um período de 44 dias. O número total de fótons foi quantificado e traçado em gráfico, e as médias e desvios padrão são mostrados para cada momento. Os camundongos foram tratados com as células T não transduzidas (transfectadas com o vetor vazio) (sinal mais) ou 15 x 106 (losango), 5 x 106 (flor), 1 x 106 (cruz), ou 1 x 105 (asterisco) células T que foram transduzidas com um sequência de nucleotídeo que codifica para um CAR m971-segunda geração, versão 2 (SEQ ID NO: 22).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0016] Uma modalidade da invenção fornece um receptor de antígeno quimérico (CAR) que compreende um domínio de ligação ao antígeno compreendendo as SEQ ID NOs: 1 a 6, um domínio da transmembrana, e um domínio de sinalização da célula T intracelular.

[0017] Um CAR é uma proteína híbrida construída artificialmente ou polipeptídeo contendo os domínios de ligação ao antígeno de um anticorpo (por exemplo, um fragmento variável de cadeia única (scFv)) ligado aos domínios de sinalização da célula T. As características dos CARs incluem a sua capacidade de redirecionar a especificidade e a reatividade das células T para um alvo selecionado de uma maneira não restrita ao MHC, explorando as propriedades de ligação ao antígeno de anticorpos monoclonais. O reconhecimento de antígeno não restrito ao MHC fornece CARs que expressam nas células T a capacidade de reconhecer o antígeno independente do processamento de antígenos, ignorando assim um importante mecanismo de escape do tumor. Além do mais, quando expressos nas células T, os CARs vantajosamente não dimerizam com as cadeias alfa e beta do receptor de célula T endógeno (TCR).

[0018] As expressões "possuem especificidade de antígeno" e "extraem a resposta especifica do antígeno", como aqui utilizadas, significam que o CAR pode especificamente ligar e imunologicamente reconhecer um antígeno, de tal modo que a ligação do CAR ao antígeno induz uma resposta imune.

[0019] Os CARs da invenção possuem especificidade de antígeno CD22. CD22 é um antígeno de célula B restrito da linhagem que pertence à superfamília de imunoglobulina (Ig). O CD22 é expresso em 60 a 70 % dos linfomas e leucemias de células B (por exemplo, leucemia B-linfocítica crônica, leucemia de células pilosas, leucemia linfocítica aguda (LLA), e linfoma de Burkitt) e não está presente na superfície das células nos estágios iniciais de desenvolvimento de células B ou sobre as células troncos. Vaickus et al., Crit. Rev. Oncol./Hematol., 11:267-297 (1991); Bang et al., Clin. Cancer Res., 11: 1545-50 (2005).

[0020] Sem estar ligado a uma teoria ou mecanismo particular, acredita-se que por extrair uma resposta específica do antígeno contra o CD22, os CARs da invenção fornecem um ou mais de qualquer um dos seguintes: direcionamento e destruição das células cancerosas que expressam CD22, redução ou eliminação das células de câncer, o que facilita a infiltração de células imunes nos sítios de tumor, e intensificação/extensão das respostas anticâncer. Visto que o CD22 não é expresso nos estágios iniciais do desenvolvimento de células B ou sobre as células estaminais, contempla-se que os CARs da invenção vantajosamente de forma substancial evitam o direcionamento/destruição das células troncos e/ou células B nos estágios iniciais de desenvolvimento.

[0021] Uma modalidade da invenção fornece um CAR que compreende um domínio de ligação ao antígeno do anticorpo m971 ("m971"). O domínio de ligação ao antígeno de m971 especificamente se liga ao CD22. A este respeito, uma modalidade preferida da invenção fornece CARs compreendendo um domínio de ligação ao antígeno que compreende, consiste ou consiste essencialmente de um fragmento variável de cadeia única (scFv) do domínio de ligação ao antígeno de m971. O anticorpo m971 fornece uma melhor ligação ao CD22 em comparação com a imunotoxina HA22 e também se liga a um epitopo de CD22 diferente. Xiao et al., mAbs 1:3, 297-303 (2009).

[0022] O domínio de ligação ao antígeno pode compreender uma região variável da cadeia leve e/ou uma região variável da cadeia pesada. Em uma modalidade da invenção, a região variável de cadeia pesada compreende uma região CDR1, uma região CDR2 e uma região CDR3. A este respeito, o domínio de ligação ao antígeno pode compreender um ou mais de uma região CDR1 de cadeia pesada que compreende a SEQ ID NO: 1; uma região CDR2 de cadeia pesada que compreende a SEQ ID NO: 2; e uma região CDR3 de cadeia pesada que compreende a SEQ ID NO: 3. Preferivelmente, a cadeia pesada compreende a totalidade das SEQ ID NOs: 1 a 3.

[0023] Em uma modalidade da invenção, a região variável de cadeia leve pode compreender uma região CDR1 de cadeia leve, uma região CDR2 de cadeia leve e uma região CDR3 de cadeia leve. A este respeito, o domínio de ligação ao antígeno pode compreender um ou mais de uma região CDR1 de cadeia leve que compreende a SEQ ID NO: 4; uma região CDR2 de cadeia leve que compreende a SEQ ID NO: 5; e uma região CDR3 de cadeia leve compreendendo a SEQ ID NO: 6. Preferivelmente, a cadeia leve compreende a totalidade das SEQ ID NOs: 4 a 6. Em uma modalidade especialmente preferida, o domínio de ligação ao antígeno compreende a totalidade da SEQ ID NO: 1 a 6.

[0024] A região variável de cadeia leve do domínio de ligação ao antígeno pode compreender, consistir, ou consistir essencialmente na SEQ ID NO: 7. A região variável de cadeia pesada do domínio de ligação ao antígeno pode compreender, consistir ou consistir essencialmente na SEQ ID NO: 8. Consequentemente, em uma modalidade da invenção, o domínio de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia leve que compreende a SEQ ID NO: 7 e/ou uma região variável de cadeia pesada que compreende a SEQ ID NO: 8. De preferência, o domínio de ligação ao antígeno compreende ambas as SEQ ID NOs: 7 e 8.

[0025] Em uma modalidade da invenção, a região variável de cadeia leve e a região variável de cadeia pesada podem ser ligadas por um ligante. O ligante pode compreender qualquer sequência de aminoácido adequada. Em uma modalidade da invenção, o ligante pode compreender, consistir ou consistir essencialmente na SEQ ID NO: 11.

[0026] Em uma modalidade, o domínio de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia leve e uma região variável de cadeia pesada. A este respeito, uma modalidade do domínio de ligação ao antígeno compreendendo tanto uma região variável de cadeia leve quanto uma região variável d e cadeia pesada compreende, consiste ou consiste essencialmente na SEQ ID NO: 9.

[0027] Em uma modalidade, o domínio de ligação ao antígeno compreende uma sequência líder. A sequência líder pode ser posicionada no terminal de amino da região variável de cadeia leve. A sequência líder pode compreender qualquer sequência líder adequada. Em uma modalidade, a sequência líder é uma sequência de receptor do fator estimulante de colônias granulócitas-macrófagas humanas (GM-CSF). A este respeito, o domínio de ligação ao antígeno compreende uma sequência líder compreendendo, consistindo ou consistindo essencialmente na SEQ ID NO: 10. Em uma modalidade da invenção, embora a sequência líder possa facilitar a expressão do CAR na superfície da célula, a presença da sequência líder em um CAR expresso não é necessária para o CAR funcionar. Em uma modalidade da invenção, após a expressão do CAR na superfície da célula, a sequência líder pode ser clivada fora do CAR. Consequentemente, em uma modalidade da invenção, o CAR carece de uma sequência líder.

[0028] Em uma modalidade da invenção, o CAR compreende um domínio da transmembrana. Em uma modalidade da invenção, o domínio da transmembrana compreende i) CD8 e/ou ii) CD28. Em uma modalidade preferida, o CD8 e o CD28 são humanos. O CD8 ou CD28 pode compreender menos do que todo o CD8 ou CD28, respectivamente. A este respeito, o CAR compreende um domínio da transmembrana CD8 compreendendo, consistindo ou consistindo essencialmente na SEQ ID NO: 12 ou 18 e/ou um domínio da transmembrana CD28 compreendendo, consistindo ou consistindo essencialmente na SEQ ID NO: 15.

[0029] Em uma modalidade da invenção, o CAR compreende um domínio de sinalização da célula T intracelular que compreende qualquer um ou mais de i) CD28, ii) CD137, e/ou iii) CD3 zeta (Z). Em uma modalidade preferida, o CD28, CD137 e CD3 zeta são humanos. O CD28 é um marcador de células T importante na coestimulação da célula T. O CD137, também conhecido como 4-1BB, transmite um sinal coestimulador potente às células T, o que promove a diferenciação e melhora a longo prazo da sobrevivência de linfócitos T. O CD3Z se associa com as TCRs para produzir um sinal e contém motivos de ativação baseados na tirosina imunorreceptora (ITAMs). Os CD28, CD137 ou CD3 zeta pode compreender menos do que a totalidade de CD28, CD137 ou CD3 zeta, respectivamente. A este respeito, o domínio de sinalização da célula T intracelular compreende uma sequência de aminoácido de CD28 compreendendo, consistindo ou consistindo essencialmente na SEQ ID NO: 16 ou 19, uma sequência de aminoácido de CD137 compreendendo, consistindo ou consistindo essencialmente na SEQ ID NO: 13 ou 20, e/ou uma sequência de aminoácido de CD3 zeta compreendendo, consistindo, ou consistindo essencialmente na SEQ ID NO: 14, 17, ou 21.

[0030] Em uma modalidade da invenção, o CAR compreende um domínio da transmembrana compreendendo CD28 e um domínio de sinalização de célula T intracelular compreendendo CD28 e CD3 zeta. A este respeito, o CAR pode compreender cada uma das SEQ ID NOs: 15 a 17. De preferência, o CAR compreende a) cada uma das SEQ ID NOs: 1 a 6 e 15 a 17; b) 7 a 8 e 15 a 17; c) 9 e 15 a 17; ou d) 9 a 10 e 15 a 17.

[0031] Em uma modalidade da invenção, o CAR compreende um domínio da transmembrana compreendendo CD8 e um domínio de sinalização de célula T intracelular compreendendo CD28, CD137 e CD3 zeta. A este respeito, o CAR pode compreender cada uma das SEQ ID NOs: 18 a 21. De preferência, o CAR compreende a) cada uma das SEQ ID NOs: 1 a 6 e 18 a 21; b) 7 a 8 e 18 a 21; c) 9 e 18 a 21; ou d) 9 a 10 e 18 a 21.

[0032] Em uma modalidade da invenção, o CAR compreende um domínio da transmembrana compreendendo CD8 e um domínio de sinalização de célula T intracelular que compreende CD137 e CD3 zeta. A este respeito, o CAR pode compreender cada uma das SEQ ID NOs: 12 a 14. De preferência, o CAR compreende a) cada uma das SEQ ID NOs: 1 a 6 e 12 a 14; b) 7 a 8 e 12 a 14; c) 9 e 12 a 14; ou d) 9 a 10 e 12 a 14.

[0033] As modalidades adicionais da invenção fornecem CARs compreendendo, consistindo ou consistindo essencialmente em qualquer uma das sequências de aminoácido apresentadas na Tabela 1. TABELA 1

[0034] Incluído no escopo da presente invenção são as partes funcionais dos CARs da invenção aqui descritos. O termo "parte funcional" quando utilizado em referência a um CAR refere-se a qualquer parte ou fragmento do CAR da invenção, cuja parte ou fragmento retém a atividade biológica do CAR da qual é uma parte (o CAR de origem). As partes funcionais abrangem, por exemplo, àquelas partes de um CAR que retêm a capacidade de reconhecer as células alvo, ou detectar, tratar ou prevenir uma doença, em uma extensão semelhante, na mesma extensão medida, ou em uma maior extensão, tal como o CAR de origem. Em referência ao CAR de origem, a parte funcional pode compreender, por exemplo, cerca de 10 %, 25 %, 30 %, 50 %, 68 %, 80 %, 90 %, 95 % ou mais, do CAR de origem.

[0035] A parte funcional pode compreender aminoácidos adicionais no terminal amino ou carbóxi da parte, ou em ambos os terminais, em que os aminoácidos adicionais não são encontrados na sequência de aminoácido do CAR de origem. Desejavelmente, os aminoácidos adicionais não interferem com a função biológica da parte funcional, por exemplo, reconhecem as células alvo, detectam o câncer, tratam ou previnem o câncer, etc. Mais desejavelmente, os aminoácidos adicionais intensificam a atividade biológica, em comparação com a atividade biológica do CAR de origem.

[0036] Incluídas no escopo da invenção estão as variantes funcionais dos CARs da invenção aqui descritos. O termo "variante funcional" como aqui utilizado refere-se a um CAR, um polipeptídeo ou proteína tendo uma identidade de sequências substancial ou significativa ou similaridade com um CAR de origem, cuja variante funcional retém a atividade biológica do CAR da qual é uma variante. As variantes funcionais abrangem, por exemplo, aquelas variantes do CAR aqui descrito (o CAR de origem) que retêm a capacidade de reconhecer as células alvos em uma extensão semelhante, na mesma extensão, ou em uma maior extensão, tal como o CAR de origem. Em referência ao CAR de origem, a variante funcional pode, por exemplo, ser pelo menos ao redor de 30 %, ao redor de 50 %, ao redor de 75 %, ao redor de 80 %, ao redor de 90 %, ao redor de 98 %, ao redor de 99 % ou mais idêntica na sequência de aminoácido ao CAR de origem.

[0037] Uma variante funcional pode, por exemplo, compreender a sequência de aminoácido do CAR de origem com pelo menos uma substituição de aminoácido conservativa. Alternativa ou adicionalmente, as variantes funcionais podem compreender a sequência de aminoácido do CAR de origem com pelo menos uma substituição de aminoácidos não conservativa. Neste caso, é preferível com relação à substituição de aminoácidos não conservativa não interferir ou inibir a atividade biológica da variante funcional. A substituição de aminoácidos não conservativa pode aumentar a atividade biológica da variante funcional, de tal modo que a atividade biológica da variante funcional seja aumentada em comparação com o CAR de origem.

[0038] As substituições de aminoácido dos CARs da invenção são de preferência substituições de aminoácido conservativas. As substituições de aminoácido conservativas são conhecidas na técnica, e incluem substituições de aminoácido em que um aminoácido tendo certas propriedades físicas e/ou químicas é trocado por outro aminoácido que possui as mesmas propriedades químicas ou físicas ou semelhantes. Por exemplo, a substituição de aminoácido conservativa pode ser um aminoácido polar acídico/negativamente carregado substituído por outro aminoácido polar acídico/negativamente carregado (por exemplo, Asp ou Glu), um aminoácido com uma cadeia lateral não polar substituído por outro aminoácido com uma cadeia lateral não polar (por exemplo, Ala, Gly, Val, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Trp, Cys, Val, etc.), um aminoácido polar básico/positivamente carregado substituído por outro aminoácido polar básica/positivamente carregado (por exemplo, Lys, His, Arg, etc.), um aminoácido não carregado com uma cadeia lateral polar substituído por outro aminoácido não carregado com uma cadeia lateral polar (por exemplo, Asn, Gln, Ser, Thr, Tyr, etc.), um aminoácido com uma cadeia lateral beta-ramificada substituído por outro aminoácido com uma cadeia lateral beta-ramificada (por exemplo, Ile, Thr e Val), um aminoácido com uma cadeia lateral aromática substituída por outro aminoácido com uma cadeia lateral aromática (por exemplo, His, Phe, Trp e Tyr), etc.

[0039] O CAR pode consistir essencialmente na sequência de aminoácido específica ou sequências aqui descritas, tal que outros componentes, por exemplo, outros aminoácidos, não alteram fisicamente a atividade biológica da variante funcional.

[0040] Os CARs das modalidades da invenção (incluindo as partes funcionais e variantes funcionais) podem ser de qualquer comprimento, isto é, podem compreender qualquer número de aminoácidos, contanto que os CARs (ou suas partes funcionais ou variantes funcionais) retenham a sua atividade biológica, por exemplo, a capacidade de especificamente se ligar ao antígeno, detectar as células doentes em um mamífero, ou tratar ou prevenir a doença em um mamífero, etc. Por exemplo, o CAR pode ser de cerca de 50 a cerca de 5000 aminoácidos de comprimento, tal como 50, 70, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 ou mais aminoácidos de comprimento.

[0041] Os CARs das modalidades da invenção (incluindo as partes funcionais e as variantes funcionais da invenção) podem compreender os aminoácidos sintéticos em vez de um ou mais aminoácidos de ocorrência natural. Tais aminoácidos sintéticos são conhecidos na técnica, e incluem, por exemplo, ácido aminociclohexano carboxílico, norleucina, ácido α-amino n-decanoico, homosserina, S- acetilaminometil-cisteína, trans-3- e trans-4-hidroxiprolina, 4- aminofenilalanina, 4-nitrofenilalanina, 4-clorofenilalanina, 4- carboxifenilalanina, β-fenilserina β-hidroxifenilalanina, fenilglicina, α- naftilalanina, ciclo-hexilalanina, ciclo-hexilglicina, ácido indolina-2- carboxílico, ácido 1,2,3,4-tetra-hidroisoquinolina-3-carboxílico, ácido aminomalônico, monoamida de ácido aminomalônico, N'-benzil-N'- metil-lisina, N',N'-dibenzil-lisina, 6-hidroxilisina, ornitina, ácido α- aminociclopentano carboxílico, ácido α-aminociclo-hexano carboxílico, ácido α-aminociclo-heptano carboxílico, ácido α-(2-amino-2- norbornano)-carboxílico, ácido a,Y—diaminobutírico, ácido α,β- diaminopropiônico, homofenilalanina, e α-terc-butilglicina.

[0042] Os CARs das modalidades da invenção (incluindo as partes funcionais e as variantes funcionais) podem ser glicosilados, amidados, carboxilados, fosforilados, esterificados, N-acilados, ciclizados através de, por exemplo, uma ponte de dissulfeto, ou convertidos em um sal de adição de ácido e/ou, opcionalmente, dimerizados ou polimerizados, ou conjugados.

[0043] Os CARs das modalidades da invenção (incluindo as suas partes funcionais e variantes funcionais) podem ser obtidos por métodos conhecidos na técnica. Os CARs podem produzidos por qualquer método adequado de produção de polipeptídeos ou proteínas. Os métodos adequados de novo de sintetização de polipeptídeos e proteínas são descritos nas referências, tais como Chan et al., Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis, Oxford University Press, Oxford, United Kingdom, 2000; Peptide and Protein Drug Analysis, ed. Reid, R., Marcel Dekker, Inc., 2000; Epitope Mapping, ed. Westwood et al., Oxford University Press, Oxford, United Kingdom, 2001; e Patente U.S. 5.449.752. Da mesma forma, os polipeptídeos e as proteínas podem ser produzidos de forma recombinante utilizando os ácidos nucleicos aqui descritos que utilizam os métodos recombinantes padrão. Ver, por exemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY 2001; and Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons, NY, 1994. Além disso, alguns dos CARs da invenção (incluindo as suas partes funcionais e variantes funcionais) podem ser isolados e/ou purificados a partir de uma fonte, tal como uma planta, uma bactéria, um inseto, um mamífero, por exemplo, um rato, um ser humano, etc. Os métodos de isolamento e purificação são bem conhecidos na técnica. Alternativamente, os CARs aqui descritos (incluindo as suas partes funcionais e variantes funcionais) podem ser comercialmente sintetizados por empresas, tais como Synpep (Dublin, CA), Peptide Technologies Corp. (Gaithersburg, MD), e Multiple Peptide Systems (San Diego, CA). A este respeito, os CARs da invenção podem ser sintéticos, recombinantes, isolados e/ou purificados.

[0044] Uma modalidade da invenção fornece ainda um anticorpo, ou sua parte de ligação ao antígeno, que especificamente se liga a um epitopo dos CARs da invenção. O anticorpo pode ser qualquer tipo de imunoglobulina que é conhecido na técnica. Por exemplo, o anticorpo pode ser de qualquer isótipo, por exemplo, IgA, IgD, IgE, IgG, IgM, etc. O anticorpo pode ser monoclonal ou policlonal. O anticorpo pode ser um anticorpo de ocorrência natural, por exemplo, um anticorpo isolado e/ou purificado a partir de um mamífero, por exemplo, rato, coelho, cabra, cavalo, frango, hamster, ser humano, etc. Alternativamente, o anticorpo pode ser um anticorpo geneticamente planejado, por exemplo, um anticorpo humanizado ou um anticorpo quimérico. O anticorpo pode estar em forma monomérica ou polimérica. Da mesma forma, o anticorpo pode ter qualquer nível de afinidade ou avidez com relação à parte funcional do CAR da invenção.

[0045] Os métodos de teste de anticorpos para a capacidade de se ligar a qualquer parte funcional do CAR da invenção são conhecidos na técnica e incluem qualquer ensaio de ligação de anticorpo-antígeno, tal como, por exemplo, radioimunoensaio (RIA), ELISA, Western blot, imunoprecipitação, e ensaios de inibição competitiva (ver, por exemplo, Janeway et al., infra, and U.S. Patent Application Publication No. 2002/0197266 A1).

[0046] Os métodos adequados de produção de anticorpos são conhecidos na técnica. Por exemplo, os métodos de hibridoma padrão são descritos em, por exemplo, Kohler and Milstein, Eur. J. Immunol., 5, 511-519 (1976), Harlow and Lane (eds.), Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press (1988), e C.A. Janeway et al. (eds.), Immunobiology, 5th Ed., Garland Publishing, New York, NY (2001)). Alternativamente, outros métodos, tais como os métodos de EBV- hibridoma (Haskard and Archer, J. Immunol. Methods, 74(2), 361-67 (1984), e Roder et al., Methods Enzymol., 121, 140-67 (1986)), e sistemas de expressão do vetor bacteriófago (ver, por exemplo, Huse et al., Science, 246, 1275-81 (1989)) são conhecidos na técnica. Além disso, métodos de produção de anticorpos em animais não humanos são descritos, por exemplo, nas Patentes U.S. 5.545.806, 5.569.825 e 5.714.352, e Publicação do Pedido de Patente U.S. 2002/0197266 A1.

[0047] A exibição de fagos, além disso, pode ser utilizada para gerar um anticorpo. A este respeito, as bibliotecas de fagos que codificam os domínios variáveis (V) de ligação ao antígeno de anticorpos podem ser geradas utilizando métodos de biologia molecular padrão e técnicas de DNA recombinante (ver, por exemplo, Sambrook et al., supra, e Ausubel et al., supra). Os fagos que codificam uma região variável com a especificidade desejada são selecionados para a ligação específica ao antígeno desejado, e um anticorpo completo ou parcial é reconstituído compreendendo o domínio variável selecionado. As sequências de ácido nucleico que codificam o anticorpo reconstituído são introduzidas em uma linhagem celular adequada, tal como uma célula de mieloma utilizada para a produção de hibridomas, de tal modo que os anticorpos tendo as características dos anticorpos monoclonais são secretados pela célula (ver, por exemplo, Janeway et al., supra, Huse et al., supra, e Patente U.S. 6.265.150).

[0048] Os anticorpos podem ser produzidos por camundongos transgênicos que são transgênicos com relação aos genes específicos de imunoglobulina de cadeia pesada e leve. Tais métodos são conhecidos na técnica e descritos, por exemplo, nas Patentes U.S. 5.545.806 e 5.569.825, e Janeway et al., supra.

[0049] Os métodos para a geração de anticorpos humanizados são bem conhecidos na técnica e são descritos com detalhes em, por exemplo, Janeway et al., supra, Patentes U.S. 5.225.539, 5.585.089 e 5,693,761, Patente Europeia No. 0239400 B1, e Patente do Reino Unido No. 2188638. Os anticorpos humanizados também podem ser gerados utilizando a tecnologia de recapeamento de anticorpo descrita na Patente U.S. 5.639.641 e Pedersen et al., J. Mol. Biol., 235, 959973 (1994).

[0050] Uma modalidade da invenção também fornece partes de ligação ao antígeno de qualquer um dos anticorpos aqui descritos. A parte de ligação ao antígeno pode ser qualquer parte que possui pelo menos um sítio de ligação ao antígeno, tal como Fab, F(ab')2, dsFv, sFv, diacorpos e triacorpos.

[0051] Um fragmento da região variável de cadeia única (sFv), fragmento de anticorpo, que é um fragmento Fab truncado incluindo o domínio variável (V) de uma cadeia pesada de anticorpo ligada a um domínio V de uma cadeia de anticorpo leve através de um peptídeo sintético, pode ser gerado utilizando técnicas da tecnologia de DNA recombinante de rotina (ver, por exemplo, Janeway et al., supra). Similarmente, os fragmentos da região variável estabilizada por dissulfeto (dsFv) podem ser preparados pela tecnologia de DNA recombinante (ver, por exemplo, Reiter et al., Protein Engineering, 7, 697-704 (1994)). Os fragmentos de anticorpo da invenção, no entanto, não são limitados a estes tipos exemplares de fragmentos de anticorpos.

[0052] Da mesma forma, o anticorpo, ou a sua parte de ligação ao antígeno, pode ser modificado para compreender um rótulo detectável, tal como, por exemplo, um radioisótopo, um fluoróforo (por exemplo, isotiocianato de fluoresceína (FITC), ficoeritrina (PE)), uma enzima (por exemplo, fosfatase alcalina, peroxidase de rábano picante), e partículas elementares (por exemplo, partículas de ouro).

[0053] Ainda fornecido por uma modalidade da invenção é um ácido nucleico que compreende uma sequência de nucleotídeo que codifica qualquer um dos CARs aqui descritos (incluindo as suas partes funcionais e variantes funcionais). Os ácidos nucleicos da invenção podem compreender uma sequência de nucleotídeo que codifica qualquer uma das sequências líder, domínios de ligação ao antígeno, domínios da transmembrana e/ou domínios de sinalização das células T intracelulares aqui descritos.

[0054] Uma modalidade da invenção fornece um ácido nucleico que compreende uma sequência de nucleotídeo que codifica uma sequência líder e um domínio de ligação ao antígeno (incluindo uma região variável de cadeia leve e uma região variável de cadeia pesada). A este respeito, o ácido nucleico pode compreender, consistir ou consistir essencialmente da SEQ ID NO: 25.

[0055] Os ácidos nucleicos da invenção podem compreender uma sequência de nucleotídeo que codifica qualquer um dos domínios da transmembrana e/ou domínios de sinalização da célula T intracelulares aqui descritos. Uma modalidade da invenção fornece um ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeo que codifica um domínio da transmembrana que compreende CD28, de um domínio de sinalização da célula T intracelular compreendendo CD28, e um domínio de sinalização da célula T intracelular compreendendo CD3Z. A este respeito, o ácido nucleico pode compreender, consistir ou consistir essencialmente da SEQ ID NO: 27. Outra modalidade da invenção fornece um ácido nucleico que compreende uma sequência de nucleotídeo que codifica um domínio da transmembrana compreendendo CD8, um domínio de sinalização da célula T intracelular compreendendo CD28, um domínio de sinalização da célula T intracelular domínio compreendendo CD137, e um domínio de sinalização da célula T intracelular compreendendo CD3Z. Sob esse aspecto, o ácido nucleico pode compreender, consistir ou consistir essencialmente na SEQ ID NO: 28. Mais outra modalidade da invenção fornece um ácido nucleico que compreende uma sequência de nucleotídeo que codifica um domínio da transmembrana compreendendo CD8, uma domínio de sinalização da célula T intracelular compreendendo CD137, e um domínio de sinalização da célula T intracelular compreendendo CD3Z. A este respeito, o ácido nucleico pode compreender, consistir ou consistir essencialmente da SEQ ID NO: 26.

[0056] Em uma modalidade da invenção, o ácido nucleico compreende uma sequência de nucleotídeo que codifica uma sequência líder, um domínio de ligação ao antígeno (incluindo uma região variável de cadeia leve e uma região variável da cadeia pesada), um domínio da transmembrana compreendendo CD28, um domínio de sinalização da célula T intracelular compreendendo CD28, e um domínio de sinalização da célula T intracelular compreendendo CD3Z. Sob esse aspecto, o ácido nucleico pode compreender, consistir ou consistir essencialmente de ambas as SEQ ID NOs: 25 e 27.

[0057] Em uma modalidade da invenção, o ácido nucleico compreende uma sequência de nucleotídeo que codifica uma sequência líder, um domínio de ligação ao antígeno (incluindo uma região variável de cadeia leve e uma região variável da cadeia pesada), um domínio da transmembrana compreendendo CD8, um domínio de sinalização da célula T intracelular compreendendo CD28, um domínio de sinalização da célula T intracelular compreendendo CD137, e um domínio de sinalização da célula T intracelular compreendendo CD3Z. A este respeito, o ácido nucleico pode compreender, consistir ou consistir essencialmente de ambas as SEQ ID NOs: 25 e 28.

[0058] Em uma modalidade, o ácido nucleico compreende uma sequência de nucleotídeo que codifica uma sequência líder, um domínio de ligação ao antígeno (incluindo uma região variável de cadeia leve e uma região variável da cadeia pesada), um domínio da transmembrana compreendendo CD8, um domínio de sinalização da célula T intracelular compreendendo CD137, e um domínio de sinalização da célula T intracelular compreendendo CD3Z. Sob esse aspecto, o ácido nucleico pode compreender, consistir ou consistir essencialmente de ambas as SEQ ID NOs: 25 e 26.

[0059] "Ácido nucleico" como aqui utilizado inclui "polinucleotídeo", "oligonucleotídeo" e "molécula de ácido nucleico", e geralmente significa um polímero de DNA ou RNA, que pode ser de filamento único ou filamento duplo, sintetizado ou obtido (por exemplo, isolado e/ou purificado) de fontes naturais, que podem conter nucleotídeos naturais, não naturais ou alterados, e que podem conter uma ligação de internucleotídeo natural, não natural ou modificada, tal como uma ligação de fosforoamidato ou uma ligação de fosforotioato, em lugar de fosfodiéster encontrado entre os nucleotídeos de um oligonucleotídeo não modificado. Em algumas modalidades, o ácido nucleico não contém quaisquer inserções, anulações, inversões e/ou substituições. No entanto, pode ser adequado em alguns casos, como aqui debatido, o ácido nucleico compreender uma ou mais inserções, anulações, inversões e/ou substituições. Em algumas modalidades, o ácido nucleico pode codificar as sequências de aminoácido adicionais que não afetam a função do CAR e que podem ou não ser transladadas após a expressão do ácido nucleico por uma célula hospedeira.

[0060] Os ácidos nucleicos de uma modalidade da invenção podem ser recombinantes. Como aqui utilizado, o termo "recombinante" refere-se a (i) moléculas que são construídas fora das células vivas através da união de segmentos de ácido nucleico naturais ou sintéticos com as moléculas de ácido nucleico que podem replicar em uma célula viva, ou (ii) moléculas que resultam da replicação daquelas descritas em (i) acima. Para os propósitos aqui, a replicação pode ser a replicação in vitro ou a replicação in vivo.

[0061] Um ácido nucleico recombinante pode ser aquele que possui uma sequência que não é de ocorrência natural ou possui uma sequência que é produzida por uma combinação artificial de dois segmentos separados de outro modo da sequência. Esta combinação artificial é frequentemente executada pela síntese química ou, mais vulgarmente, pela manipulação artificial de segmentos isolados de ácidos nucleicos, por exemplo, por técnicas de engenharia genética, tais como aquelas descritas em Sambrook et al., supra. Os ácidos nucleicos podem ser construídos com base na síntese química e/ou reações de ligação enzimáticas utilizando procedimentos conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Sambrook et al., supra e Ausubel et al., supra. Por exemplo, um ácido nucleico pode ser quimicamente sintetizado utilizando nucleotídeos de ocorrência natural ou nucleotídeos modificados de modo variado projetados para aumentar a estabilidade biológica das moléculas ou para aumentar a estabilidade física do duplex formado após a hibridação (por exemplo, derivados de fosforotioato e nucleotídeos substituídos por acridina). Exemplos de nucleotídeos modificados que podem ser utilizados para gerar os ácidos nucleicos incluem, mas não são limitados a estes, 5- fluorouracila, 5-bromouracila, 5-clorouracila, 5-iodouracila, hipoxantina, xantina, 4-acetilcitosina, 5-(carboxiidroximetil)uracila, 5- carboximetilaminometil-2-tiouridina, 5-carboximetilaminometiluracila, diidrouracila, beta-D-galactosilqueosina, inosina, N6- isopenteniladenina, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, adenina N6-substituída, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracila, 5- metoxiaminometil-2-tiouracila, beta-D-manosilqueosina, 5'- metoxicarboximetiluracila, 5-metoxiuracila, 2-metiltio-N6- isopenteniladenina, ácido uracil-5-oxiacético (v), wybutoxosina, pseudouracila, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracila, 2-tiouracila, 4-tiouracila, 5-metiluracila, éster metílico de ácido uracil-5-oxiacético, 3-(3-amino-3-N-2-carboxipropil)uracila, e 2,6-diaminopurina. Alternativamente, um ou mais dos ácidos nucleicos da invenção podem ser adquiridos a partir de empresas tais como Macromolecular Resources (Fort Collins, CO) e Synthegen (Houston, TX).

[0062] O ácido nucleico pode compreender qualquer sequência de nucleotídeo isolada ou purificada que codifica qualquer um dos CARs ou suas partes funcionais ou variantes funcionais. Alternativamente, a sequência de nucleotídeo pode compreender uma sequência de nucleotídeo que é degenerada com qualquer uma das sequências ou uma combinação de sequências degeneradas.

[0063] Uma modalidade da invenção também fornece um ácido nucleico isolado ou purificado compreendendo uma sequência de nucleotídeo que é complementar à sequência de nucleotídeo de qualquer um dos ácidos nucleicos aqui descritos ou uma sequência de nucleotídeo que hibrida sob condições rigorosas com a sequência de nucleotídeo de qualquer um dos ácidos nucleicos aqui descritos.

[0064] A sequência de nucleotídeo que hibrida sob condições rigorosas pode hibridar sob condições de elevado rigor. Por "condições de elevado rigor" entende-se que a sequência de nucleotídeo especificamente hibrida com uma sequência alvo (a sequência de nucleotídeo de qualquer um dos ácidos nucleicos aqui descritos) em uma quantidade que é detectavelmente mais forte do que a hibridização não específica. Condições de elevado rigor incluem as condições que devem distinguir um polinucleotídeo com uma sequência complementar exata, ou uma contendo apenas algumas ligações imperfeitas dispersas a partir de uma sequência aleatória que ocorreu de ter algumas pequenas regiões (por exemplo, 3 a 10 bases) que combinavam com a sequência de nucleotídeo. Tais pequenas regiões de complementaridade são mais facilmente fundidas do que um complemento de comprimento total de 14 a 17 ou mais bases, e a elevada hibridação rigorosa o torna facilmente distinguível. As condições rigorosas relativamente elevadas incluem, por exemplo, as condições de baixo teor de sal e/ou de alta temperatura, tais como fornecidas por cerca de 0,02 a 0,1 M de NaCl ou o equivalente, nas temperaturas de cerca de 50 a 70 °C. Tais condições de elevado rigor toleram pouca, talvez nenhuma, ligação imperfeita entre a sequência de nucleotídeo e o modelo ou filamento alvo, e são particularmente adequadas para a detecção da expressão de qualquer um dos CARs da invenção. É geralmente observado que as condições podem ser apresentadas mais rigorosas pela adição de quantidades crescentes de formamida.

[0065] A invenção também fornece um ácido nucleico que compreende uma sequência de nucleotídeo que é pelo menos ao redor de 70 % ou mais, por exemplo, ao redor de 80 %, ao redor de 90 %, ao redor de 91 %, ao redor de 92 %, ao redor de 93 %, ao redor de 94 %, ao redor de 95 %, ao redor de 96 %, ao redor de 97 %, ao redor de 98 %, ou ao redor de 99 % idêntica a qualquer um dos ácidos nucleicos aqui descritos.

[0066] Em uma modalidade, os ácidos nucleicos da invenção podem ser incorporados em um vetor de expressão recombinante. A este respeito, uma modalidade da presente invenção fornece vetores de expressão recombinantes compreendendo qualquer um dos ácidos nucleicos da invenção. Para os propósitos da presente invenção, o termo "vetor de expressão recombinante" significa uma construção de oligonucleotídeo ou polinucleotídeo geneticamente modificada que permite a expressão de um mRNA, proteína, polipeptídeo ou peptídeo por uma célula hospedeira, quando a construção compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica o mRNA, proteína, polipeptídeo ou peptídeo, e o vetor é colocado em contato com a célula sob condições suficientes para ter o mRNA, proteína, polipeptídeo ou peptídeo expresso dentro da célula. Os vetores da invenção não são de ocorrência natural como um todo. No entanto, partes dos vetores podem ser de ocorrência natural. Os vetores de expressão recombinantes da invenção podem compreender qualquer tipo de nucleotídeo, incluindo, mas não limitando a estes, DNA e RNA, que podem ser de filamento único ou filamento duplo, sintetizados ou obtidos em parte de fontes naturais, e que podem conter nucleotídeos naturais, não naturais ou alterados. Os vetores de expressão recombinantes podem compreender ligações de internucleotídeo de ocorrência natural ou de ocorrência não natural, ou ambos os tipos de ligações. Preferivelmente, os nucleotídeos ou as ligações de internucleotídeo de ocorrência não natural ou alterados não impedem a transcrição ou a replicação do vetor.

[0067] Em uma modalidade, o vetor de expressão recombinante da invenção pode ser qualquer vetor de expressão recombinante adequado, e pode ser utilizado para transformar ou transfectar uma célula hospedeira adequada. Os vetores adequados incluem aqueles designados para a propagação e expansão ou para a expressão ou ambos, tais como plasmídeos e vírus. O vetor pode ser selecionado do grupo que consiste da série pUC (Fermentas Life Sciences, Glen Burnie, MD), da série pBluescript (Stratagene, LaJolla, CA), da série pET (Novagen, Madison, WI), da série pGEX ( Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden), e da série pEX (Clontech, Palo Alto, CA). Os vetores bacteriófagos, tais como ÀGT10, ÀGT11, ÀZapII (Stratagene), ÀEMBL4 e ÀNM1149, também podem ser utilizados. Exemplos de vetores de expressão de vegetais incluem pBI01, pBI101.2, pBI101.3, pBI121 e pBIN19 (Clontech). Exemplos de vetores de expressão de animais incluem pEUK-Cl, pMAM e pMAMneo (Clontech). O vetor de expressão recombinante pode ser um vetor viral, por exemplo, um vetor retroviral ou um vetor lentiviral. Em algumas modalidades, o vetor pode ser um transpóson.

[0068] Várias técnicas de transfecção são geralmente conhecidas na especialidade (ver, por exemplo, Graham et al., Virology, 52: 456467 (1973); Sambrook et al., supra; Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier (1986); and Chu et al., Gene, 13: 97 (1981)). Os métodos de transfecção incluem a coprecipitação de fosfato de cálcio (ver, por exemplo, Graham et al., supra), microinjeção direta nas células cultivadas (ver, por exemplo, Capecchi, Cell, 22: 479-488 (1980)), eletroporação (ver, por exemplo, Shigekawa et al., BioTechniques, 6: 742-751 (1988)), transferência de gene mediada por lipossomas (ver, por exemplo, Mannino et al., BioTechniques, 6: 682690 (1988)), transdução mediada por lipídeo (ver, por exemplo, Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 7413-7417 (1987)), e a liberação de ácido nucleico utilizando microprojéteis de alta velocidade (ver, por exemplo, Klein et al., Nature, 327: 70-73 (1987)).

[0069] Em uma modalidade, os vetores de expressão recombinantes da invenção podem ser preparados utilizando técnicas de DNA recombinante padrão descritas em, por exemplo, Sambrook et al., supra e Ausubel et al., supra. As construções de vetores de expressão, que são circulares ou lineares, podem ser preparadas para conter um sistema de replicação funcional em uma célula hospedeira procariótica ou eucariótica. Os sistemas de replicação podem ser derivados, por exemplo, de ColEl, 2 μ plasmídeo, À, SV40, vírus do papiloma bovino, e outros mais.

[0070] O vetor de expressão recombinante pode compreender sequências reguladoras, tais como a transcrição e início da translação e os códons de terminação, que são específicos para o tipo de célula hospedeira (por exemplo, bactéria, fungo, planta ou animal) em que o vetor deve ser introduzido, conforme apropriado, e levando em consideração se o vetor se baseia em DNA ou RNA. Exemplos de sequências incluindo códons de terminação incluem as SEQ ID Nos: 32 a 33. O vetor de expressão recombinante pode compreender sítios de restrição para facilitar a clonagem. Exemplos de sequências que incluem os sítios de restrição incluem as SEQ ID Nos: 29 a 31.

[0071] O vetor de expressão recombinante pode incluir um ou mais genes marcadores, que levam em conta a seleção de células hospedeiras transformadas ou transfectadas. Os genes marcadores incluem resistência a biocidas, por exemplo, resistência a antibióticos, metais pesados, etc., complementação em um hospedeiro auxotrófico para fornecer prototrofia, e outros mais. Os genes marcadores adequados para os vetores de expressão da invenção incluem, por exemplo, genes de resistência à neomicina/G418, genes de resistência à higromicina, genes de resistência a histidinol, genes de resistência à tetraciclina e genes de resistência à ampicilina.

[0072] O vetor de expressão recombinante pode compreender um promotor nativo ou não nativo operativamente ligado à sequência de nucleotídeo que codifica o CAR (incluindo as suas partes funcionais e variantes funcionais), ou à sequência de nucleotídeo que é complementar ou que hibrida com a sequência de nucleotídeos que codifica o CAR. A seleção de promotores, por exemplo, fortes, fracos, induzíveis, específicos do tecido e específicos do desenvolvimento, está dentro da habilidade prática do artífice. Similarmente, a combinação de uma sequência de nucleotídeo com um promotor, também está dentro da habilidade do artífice. O promotor pode ser um promotor não viral ou um promotor viral, por exemplo, um promotor de citomegalovírus (CMV), um promotor de SV40, um promotor de RSV ou um promotor encontrado na repetição terminal longa do vírus de célula-tronco de murino.

[0073] Os vetores de expressão recombinantes da invenção podem ser concebidos para a expressão transitória, para expressão estável, ou para ambas. Também, os vetores de expressão recombinantes podem ser produzidos para a expressão constitutiva ou para a expressão induzível.

[0074] Além disso, os vetores de expressão recombinantes podem ser produzidos para incluir um gene suicida. Como aqui utilizado, o termo "gene suicida" refere-se a um gene que faz com que a célula que expressa o gene suicida morra. O gene suicida pode ser um gene que confere sensibilidade a um agente, por exemplo, um fármaco, sobre a célula na qual o gene é expresso, e provoca a morte da célula quando a célula for colocada em contato ou exposta ao agente. Os genes suicidas são conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Suicide Gene Therapy: Methods and Reviews, Springer, Caroline J. (Cancer Research UK Centre for Cancer Therapeutics at the Institute of Cancer Research, Sutton, Surrey, UK), Humana Press, 2004) e incluem, por exemplo, o gene timidina cinase (TK) do vírus do herpes simples (HSV), citosina daminase, purina nucleosídeo fosforilase, e nitrorredutase.

[0075] Incluídos no escopo da presente invenção estão conjugados, por exemplo, os bioconjugados, compreendendo qualquer um dos CARs da invenção (incluindo qualquer uma das partes funcionais ou das suas variantes), ácidos nucleicos, vetores de expressão recombinantes, células hospedeiras, populações de células hospedeiras, ou anticorpos, ou suas porções de ligação ao antígeno. Os conjugados, assim como os métodos de sintetização dos conjugados em geral, são conhecidos na técnica (Ver, por exemplo, Hudecz, F., Methods Mol. Biol. 298: 209-223 (2005) e Kirin et al., Inorg Chem. 44(15): 5405-5415 (2005)).

[0076] Uma modalidade da invenção ainda fornece uma célula hospedeira que compreende qualquer um dos vetores de expressão recombinantes aqui descritos. Como aqui utilizado, o termo "célula hospedeira" refere-se a qualquer tipo de célula que pode conter o vetor de expressão recombinante da invenção. A célula hospedeira pode ser uma célula eucariótica, por exemplo, de plantas, animais, fungos ou algas, ou pode ser uma célula procariótica, por exemplo, de bactérias ou protozoários. A célula hospedeira pode ser uma célula de cultura ou uma célula primária, isto é, isolado diretamente de um organismo, por exemplo, um ser humano. A célula hospedeira pode ser uma célula aderente ou uma célula em suspensão, isto é, uma célula que cresça em suspensão. As células hospedeiras adequadas são conhecidas na técnica e incluem, por exemplo, células de E. coli DH5α, células do ovário de hamster chinês, células VERO de macaco, células COS, células HEK293, e outras mais. Para os propósitos de amplificação ou replicação do vetor de expressão recombinante, a célula hospedeira pode ser uma célula procariótica, por exemplo, uma célula DH5α. Para os propósitos de produção de um CAR recombinante, a célula hospedeira pode ser uma célula de mamífero. A célula hospedeira pode ser uma célula humana. Embora a célula hospedeira possa ser de qualquer tipo de célula, ela pode originar-se de qualquer tipo de tecido, e pode ser de qualquer estágio de desenvolvimento, a célula hospedeira pode ser um linfócito do sangue periférico (PBL), ou uma célula mononuclear do sangue periférico (PBMC). A célula hospedeira pode ser uma célula T.

[0077] Para os propósitos inclusos, a célula T pode ser qualquer célula T, tal como uma célula T cultivada, por exemplo, uma célula T primária, ou uma célula T de uma linhagem celular T cultivada, por exemplo, Jurkat, SupT1, etc., ou uma célula T obtida de um mamífero. Se obtida de um mamífero, a célula T pode ser obtida de numerosas fontes, incluindo, mas não limitadas a estas, sangue, medula óssea, nódulo linfático, o timo, ou outros tecidos ou fluidos. As células T também podem ser enriquecidas ou purificadas. A célula T pode ser uma célula T humana. A célula T pode ser uma célula T isolada de um ser humano. A célula T pode ser qualquer tipo de célula T e pode estar em qualquer estágio de desenvolvimento, incluindo, mas não limitado a estas, células T positivas duplas CD4+/CD8+, células T auxiliares CD4+, por exemplo, células Th1 e Th2, células T CD8+ (por exemplo, células T citotóxicas), células de infiltração de tumores, células T de memória, células T simples, e outras mais. A célula T pode ser uma célula T CD8+ ou uma célula T CD4+.

[0078] Também fornecido por uma modalidade da invenção é uma população de células compreendendo pelo menos uma célula hospedeira aqui descrita. A população de células pode ser uma população heterogênea compreendendo a célula hospedeira que compreende qualquer um dos vetores de expressão recombinantes descritos, além de pelo menos uma outra célula, por exemplo, uma célula hospedeira (por exemplo, uma célula T), que não compreende qualquer um dos vetores de expressão recombinantes, ou uma célula diferente de uma célula T, por exemplo, uma célula B, um macrófago, um neutrófilo, um eritrócito, um hepatócito, uma célula endotelial, uma célula epitelial, uma célula muscular, uma célula do cérebro, etc. Alternativamente, a população de células pode ser uma população substancialmente homogênea, em que a população compreende principalmente as células hospedeiras (por exemplo, que consiste essencialmente de) compreendendo o vetor de expressão recombinante. A população pode também ser uma população clonal de células, em que todas as células da população são clones de uma única célula hospedeira que compreende um vetor de expressão recombinante, de tal modo que todas as células da população compreendem o vetor de expressão recombinante. Em uma modalidade da invenção, a população de células é uma população clonal que compreende células hospedeiras compreendendo um vetor de expressão recombinante como aqui descrito.

[0079] Os CARs (incluindo as suas partes e variantes funcionais), ácidos nucleicos, vetores de expressão recombinantes, células hospedeiras (incluindo as suas populações), e anticorpos (incluindo as suas partes de ligação ao antígeno), todos dos quais são coletivamente referidos como "materiais de CAR da invenção" em seguida, podem ser isolados e/ou purificados. O termo "isolado" como aqui utilizado significa que foi removido do seu ambiente natural. O termo "purificado" ou "isolado" não requer uma pureza ou isolamento absoluto; de preferência, é planejado como um termo relativo. Assim, por exemplo, uma preparação de célula hospedeira purificada (ou isolada) é aquela em que a célula hospedeira é mais pura do que as células no seu ambiente natural dentro do corpo. Tais células hospedeiras podem ser produzidas, por exemplo, por técnicas de purificação padrão. Em algumas modalidades, uma preparação de uma célula hospedeira é purificada de tal modo a que a célula hospedeira representa pelo menos cerca de 50 %, por exemplo, pelo menos cerca de 70 %, do conteúdo total de células da preparação. Por exemplo, a pureza pode ser pelo menos cerca de 50 %, pode ser maior do que cerca de 60 %, cerca de 70 % ou cerca de 80 %, ou pode ser ao redor de 100 %.

[0080] Os materiais de CAR da invenção podem ser formulados em uma composição, tais como uma composição farmacêutica. A este respeito, uma modalidade da invenção fornece uma composição farmacêutica compreendendo qualquer um dos CARs, partes funcionais, variantes funcionais, ácidos nucleicos, vetores de expressão, células hospedeiras (incluindo as suas populações), e anticorpos (incluindo as suas partes de ligação ao antígeno), e um veículo farmaceuticamente aceitável. As composições farmacêuticas da invenção contendo qualquer um dos materiais de CAR da invenção podem compreender mais do que um material de CAR da invenção, por exemplo, um CAR e um ácido nucleico, ou dois ou mais CARs diferentes. Alternativamente, a composição farmacêutica pode compreender um material de CAR da invenção em combinação com outros agentes ou fármacos farmaceuticamente ativos, tais como agentes quimioterapêuticos, por exemplo, asparaginase, bussulfano, carboplatina, cisplatina, daunorrubicina, doxorrubicina, fluorouracila, gencitabina, hidroxiureia, metotrexato, paclitaxel, rituximab, vimblastina, vincristina, etc. Em uma modalidade preferida, a composição farmacêutica compreende a célula hospedeira da invenção ou suas populações.

[0081] Os materiais de CAR da invenção podem ser fornecidos na forma de um sal, por exemplo, um seu sal farmaceuticamente aceitável. Os sais de adição de ácido farmaceuticamente aceitáveis adequados incluem aqueles derivados de ácidos minerais, tais como os ácidos clorídrico, bromídrico, fosfórico, metafosfórico, nítrico e sulfúrico, e ácidos orgânicos, tais como os ácidos tartárico, acético, cítrico, málico, láctico, fumárico, benzoico, glicólico, glucônico, succínico e arilsulfônico, por exemplo, ácido p-toluenossulfônico.

[0082] No que diz respeito às composições farmacêuticas, o veículo farmaceuticamente aceitável pode ser qualquer um daqueles convencionalmente utilizados e é limitado apenas pelas considerações físico-químicas, tais como a solubilidade e a carência de reatividade com os agentes ativos, e pela via de administração. Os veículos farmaceuticamente aceitáveis aqui descritos, por exemplo, veículos, adjuvantes, excipientes e diluentes, são bem conhecidos daqueles versados na técnica e estão facilmente disponíveis ao público. É preferível que o veículo farmaceuticamente aceitável seja aquele que é quimicamente inerte em relação aos agentes ativos e aquele que não possui nenhum efeito colateral prejudicial ou toxicidade nas condições de uso.

[0083] A escolha do veículo será determinada em parte pelo material de CAR da invenção particular, assim como pelo método particular utilizado para administrar o material de CAR da invenção. Consequentemente, existe uma grande variedade de formulações adequadas da composição farmacêutica da invenção. Os conservantes podem ser utilizados. Os conservantes adequados podem incluir, por exemplo, metilparabeno, propilparabeno, benzoato de sódio e cloreto de benzalcônio. Uma mistura de dois ou mais conservantes opcionalmente pode ser utilizada. O conservante ou suas misturas estão tipicamente presentes em uma quantidade de cerca de 0,0001 % a cerca de 2 % em peso da composição total.

[0084] Os agentes tamponantes adequados podem incluir, por exemplo, ácido cítrico, citrato de sódio, ácido fosfórico, fosfato de potássio, e vários outros ácidos e sais. Uma mistura de dois ou mais agentes tamponantes opcionalmente pode ser utilizada. O agente tamponante ou suas misturas estão tipicamente presentes em uma quantidade de cerca de 0,001 % a cerca de 4 % em peso da composição total.

[0085] A concentração de material de CAR da invenção nas formulações farmacêuticas pode variar, por exemplo, de menos do que cerca de 1 %, geralmente em ou pelo menos cerca de 10 %, até tanto quanto cerca de 20 % a cerca de 50 % ou mais em peso, e pode ser selecionada principalmente por volumes de fluido e viscosidades, em conformidade com o modo particular de administração selecionado.

[0086] Os métodos para a preparação de composições administráveis (por exemplo, parentericamente administráveis) são conhecidos ou evidentes para aqueles versados na técnica e são descritos com maiores detalhes em, por exemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins; 21st ed. (May 1, 2005).

[0087] As seguintes formulações para administração oral, aerossol, parenteral (por exemplo, subcutânea, intravenosa, intraarterial, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal e intratecal) e tópica são meramente exemplares e não são de modo algum limitativas. Mais do que uma via pode ser utilizada para administrar os materiais de CAR da invenção, e em certos casos, uma via particular pode fornecer uma reação mais imediata e mais eficaz do que outra via.

[0088] As formulações adequadas para a administração oral podem compreender ou consistir em (a) soluções líquidas, tais como uma quantidade eficaz do material de CAR da invenção dissolvida em diluentes, tais como água, salina, ou suco de laranja; (b) cápsulas, saches, comprimidos, pastilhas e trociscos, cada um contendo uma quantidade predeterminada do ingrediente ativo, como sólidos ou grânulos; (c) pós; (d) suspensões em um líquido apropriado; e (e) emulsões adequadas. As formulações líquidas podem incluir diluentes, tais como água e álcoois, por exemplo, etanol, álcool benzílico e os álcoois de polietileno, com ou sem a adição de um tensoativo farmaceuticamente aceitável. As formas em cápsula podem ser do tipo usual de gelatina de estrutura sólida ou macia contendo, por exemplo, tensoativos, lubrificantes, e cargas inertes, tais como lactose, sacarose, fosfato de cálcio, e amido de milho. As formas em comprimido podem incluir um ou mais de lactose, sacarose, manitol, amido de milho, amido de batata, ácido algínico, celulose microcristalina, acácia, gelatina, goma guar, dióxido de silício coloidal, croscarmelose sódico, talco, estearato de magnésio, estearato de cálcio, estearato de zinco, ácido esteárico, e outros excipientes, corantes, diluentes, agentes tamponantes, agentes desintegrantes, agentes umectantes, conservantes, agentes flavorizantes, e outros excipientes farmacologicamente compatíveis. As formas em pastilha podem compreender o material de CAR da invenção em um flavorizante, geralmente sacarose e acácia ou tragacanto, assim como pastilhas compreendendo o material de CAR da invenção em uma base inerte, tal como gelatina e glicerina, ou sacarose e acácia, emulsões, géis, e outros mais contendo, além destes, tais excipientes como são conhecidos na técnica.

[0089] As formulações adequadas para a administração parenteral incluem soluções para injeção aquosas e não aquosas isotônicas estéreis, que podem conter antioxidantes, tampões, bacteriostáticos e solutos que tornam a formulação isotônica com o sangue do receptor pretendido, e suspensões estéreis aquosas e não aquosas que podem incluir agentes de suspensão, solubilizantes, agentes espessantes, estabilizantes e conservantes. O material de CAR da invenção pode ser administrado em um diluente fisiologicamente aceitável com um veículo farmacêutico, tal como um líquido estéril ou uma mistura de líquidos, incluindo água, salina, dextrose aquosa e soluções de açúcar relacionadas, um álcool, tal como etanol ou álcool hexadecílico, um glicol, tal como propileno glicol ou polietileno glicol, sulfóxido de dimetila, glicerol, cetais tais como 2,2-dimetil-1,3-dioxolano-4-metanol, éteres, poli(etileno glicol) 400, óleos, ácidos graxos, ésteres de ácido graxo ou glicerídeos, ou glicerídeos de ácido graxo acetilados com ou sem a adição de um tensoativo farmaceuticamente aceitável, tal como um sabão ou um detergente, agente de suspensão, tal como pectina, carbômeros, metilcelulose, hidroxipropilmetilcelulose, ou carboximetilcelulose, ou agentes emulsificantes e outros adjuvantes farmacêuticos.

[0090] Os óleos, que podem ser utilizados nas formulações parenterais, incluem petróleo, óleo animal, óleo vegetal ou óleo sintético. Exemplos específicos de óleos incluem de amendoim, soja, gergelim, semente de algodão, milho, azeite, vaselina e mineral. Os ácidos graxos adequados para uso nas formulações parenterais incluem ácido oleico, ácido esteárico e ácido isoesteárico. Oleato de etila e miristato de isopropila são exemplos de ésteres de ácido graxo adequados.

[0091] Os sabões adequados para uso nas formulações parenterais incluem metal alcalino graxo, amônio e sais de trietanolamina, e os detergentes adequados incluem (a) detergentes catiônicos tais como, por exemplo, haletos de dimetil dialquil amônio, e haletos de alquil piridínio, (b) detergentes aniônicos tais como, por exemplo, sulfonatos de alquila, arila e olefina, sulfatos de alquila, olefina, éter e monoglicerídeo, e sulfossuccinatos, (c) detergentes não iônicos tais como, por exemplo, óxidos de amina graxa, alcanolamidas de ácido graxo e copolímeros de polioxietilenopolipropileno, (d) detergentes anfotéricos tais como, por exemplo, alquil-β- aminopropionatos e sais de amônio quaternário de 2-alquil- imidazolina, e (e) suas misturas.

[0092] As formulações parenterais tipicamente conterão, por exemplo, de cerca de 0,5 % a cerca de 25 % em peso do material de CAR da invenção em solução. Os conservantes e tampões podem ser utilizados. A fim de minimizar ou eliminar a irritação no local da injeção, tais composições podem conter um ou mais agentes tensoativos não iônicos tendo, por exemplo, um equilíbrio hidrófilo- lipófilo (HLB) de cerca de 12 a cerca de 17. A quantidade de tensoativo em tais formulações tipicamente irá variar, por exemplo, de cerca de 5 % a cerca de 15 % em peso. Os tensoativos adequados incluem ésteres de ácido graxo de polietileno glicol sorbitano, tais como mono-oleato de sorbitano e os adutos de peso molecular elevado de óxido de etileno com uma base hidrofóbica, formados pela condensação de óxido de propileno com propileno glicol. As formulações parenterais podem ser apresentadas em recipientes lacrados de múltiplas doses, tais como ampolas e frascos, e podem ser armazenadas em uma condição secada por congelamento ((liofilizada) que requer apenas a adição do excipiente líquido estéril, por exemplo, água para injeções, imediatamente antes do uso. As soluções e suspensões de injeção extemporâneas podem ser preparadas a partir de pós, grânulos e comprimidos estéreis do tipo anteriormente descrito.

[0093] As formulações injetáveis estão de acordo com uma modalidade da invenção. Os requisitos com relação aos veículos farmacêuticos eficazes para composições injetáveis são bem conhecidos daqueles de habilidade prática na técnica (ver, por exemplo, Pharmaceutics and Pharmacy Practice, J.B. Lippincott Company, Philadelphia, PA, Banker and Chalmers, eds., pages 238250 (1982), e ASHP Handbook on Injectable Drugs, Toissel, 4th ed., pages 622-630 (1986)).

[0094] As formulações tópicas, incluindo aquelas que são úteis para a liberação transdérmica de fármaco, são bem conhecidas aqueles de habilidade na técnica e são adequadas no contexto de modalidades da invenção para aplicação na pele. O material de CAR da invenção, isolado ou em combinação com outros componentes adequados, pode ser preparado em formulações de aerossol para serem administradas por meio de inalação. Estas formulações de aerossol podem ser colocadas em propulsores pressurizados aceitáveis, tais como diclorodifluorometano, propano, nitrogênio e outros mais. Elas também podem ser formuladas como produtos farmacêuticos para preparações não pressurizadas, tais como em um nebulizador ou um atomizador. Tais formulações para pulverização também podem ser utilizadas para pulverizar mucosas.

[0095] Uma "quantidade eficaz" ou "uma quantidade eficaz para tratar" refere-se a uma dose que é adequada para prevenir ou tratar câncer em um indivíduo. Quantidades eficazes para um uso terapêutico ou profilático irão depender, por exemplo, do estágio e da gravidade da doença ou distúrbio a ser tratado, da idade, peso, e estado geral de saúde do paciente, e o discernimento do médico que prescreve. O tamanho da dose será também determinado pelo produto ativo selecionado, método de administração, tempo e frequência de administração, a existência, natureza e extensão de quaisquer efeitos colaterais adversos que possam acompanhar a administração de um produto ativo particular, e o efeito fisiológico desejado. Será observado por uma pessoa de habilidade na técnica que várias doenças ou distúrbios podem requerer tratamento prolongado envolvendo múltiplas administrações, talvez utilizando os materiais de CAR da invenção em cada um ou vários ciclos de administração. Por meio de exemplo e não com a intenção de limitar a invenção, a dose do material de CAR da invenção pode ser de cerca de 0,001 a cerca de 1000 mg/kg de peso corporal do indivíduo sendo tratado/dia, de cerca de 0,01 a cerca de 10 mg/kg de peso corporal/dia, de cerca de 0,01 mg a cerca de 1 mg/kg de peso corporal/dia. Quando o material de CAR da invenção for uma célula hospedeira, uma dose exemplar de células hospedeiras pode ser um mínimo de um milhão de células (1 mg de células/dose). Quando o material de CAR da invenção for um ácido nucleico acondicionado em um vírus, uma dose exemplar de vírus pode ser 1 ng/dose.

[0096] Para os propósitos da invenção, a quantidade ou dose do material de CAR da invenção administrado deve ser suficiente para efetuar uma resposta terapêutica ou profilática no indivíduo ou animal ao longo de um período de tempo razoável. Por exemplo, a dose do material de CAR da invenção deve ser suficiente para se ligar ao antígeno, ou detectar, tratar ou prevenir a doença em um período de cerca de 2 horas ou mais, por exemplo, de cerca de 12 a cerca de 24 ou mais horas, a partir do momento da administração. Em certas modalidades, o período de tempo pode ser ainda mais longo. A dose será determinada pela eficácia do material de CAR da invenção particular e pela condição do animal (por exemplo, ser humano), assim como o peso corporal do animal (por exemplo, ser humano) a ser tratado.

[0097] Para os propósitos da invenção, um ensaio, o qual compreende, por exemplo, a comparação da extensão em que as células alvos são submetidas a lise e/ou IFN-Y é secretado pelas células T que expressam a CAR da invenção após a administração de uma dose determinada de tais células T a um mamífero, entre um conjunto de mamíferos dos quais é cada um administrado com uma dose diferente das células T, pode ser utilizado para determinar uma dose de partida a ser administrada a um mamífero. A extensão em que as células alvo são submetidas à lise e/ou IFN-Y é secretado após administração de uma certa dose, pode ser avaliada por métodos conhecidos na técnica.

[0098] Além das composições farmacêuticas anteriormente descritas, os materiais de CAR da invenção podem ser formulados como complexos de inclusão, tais como complexos de inclusão de ciclodextrina, ou lipossomas. Os lipossomas podem servir para direcionar os materiais de CAR da invenção para um tecido particular. Os lipossomas também podem ser utilizados para aumentar a meia- vida dos materiais de CAR da invenção. Muitos métodos estão disponíveis para a preparação de lipossomas, como descrito em, por exemplo, Szoka et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng., 9, 467 (1980) e Patentes U.S. 4.235.871, 4.501.728, 4.837.028 e 5.019.369.

[0099] Os sistemas de liberação úteis no contexto das modalidades da invenção podem incluir sistemas de liberação por tempo, de liberação retardada e de liberação sustentada de tal modo que a liberação da composição da invenção ocorre antes, e com tempo suficiente para provocar a sensibilização do local a ser tratado. A composição da invenção pode ser utilizada em conjunto com outros agentes terapêuticos ou terapias. Tais sistemas podem evitar administrações repetidas da composição da invenção, aumentando assim a conveniência para o indivíduo e para o médico, e podem ser particularmente adequados para certas modalidades da composição da invenção.

[00100] Muitos tipos de sistemas de liberação são disponíveis e conhecidos daqueles de habilidade prática na técnica. Eles incluem sistemas de base polimérica tais como poli(lactídeo-glicolídeo), copolioxalatos, policaprolactonas, poliesteramidas, poliortoésteres, ácido poliidroxibutírico e polianidridos. As microcápsulas dos polímeros anteriores contendo fármacos são descritas, por exemplo, na Patente U.S. 5.075.109. Os sistemas de liberação também incluem sistemas não poliméricos que são lipídeos incluindo esteróis tais como colesterol, ésteres de colesterol e ácidos graxos ou gorduras neutras, tais como mono-, di- e tri-glicerídeos; sistemas de liberação de hidrogel; sistemas silásticos; sistemas com base em peptídeo; revestimentos de cera; tabletes comprimidos que utilizam aglutinantes e excipientes convencionais; implantes parcialmente fundidos; e outros mais. Os exemplos específicos incluem, mas não são limitados a estes: (a) sistemas de erosão em que a composição ativa está contida em uma forma dentro de uma matriz tal como aquelas descritas nas Patentes U.S. 4.452.775, 4.667.014, 4.748.034 e 5.239.660 e (b) sistemas difusionais em que um componente ativo permeia em uma taxa controlada a partir de um polímero tal como descrito nas Patentes U.S. 3.832.253 e 3.854.480. Além disso, os sistemas de liberação de hardware à base de bomba podem ser utilizados, alguns dos quais são adaptados para implantação.

[00101] Uma pessoa de habilidade prática na técnica observará de imediato que os materiais de CAR da invenção podem ser modificados em qualquer número de formas, de tal modo que a eficácia terapêutica ou profilática dos materiais de CAR da invenção é aumentada através da modificação. Por exemplo, os materiais de CAR da invenção podem ser conjugados direta ou indiretamente através de um ligante em um componente de direcionamento. A prática de conjugar compostos, por exemplo, os materiais de CAR da invenção, para direcionar os componentes, é conhecida na técnica. Ver, por exemplo, Wadwa et al., J. Drug Targeting 3: 111 (1995) e Patente U.S. 5.087.616.

[00102] Alternativamente, os materiais de CAR da invenção podem ser modificados para uma forma de depósito, de tal modo que a maneira pela qual os materiais de CAR da invenção são liberados para dentro do corpo em que são administrados é controlada em relação ao tempo e localização dentro do corpo (ver, por exemplo, a Patente U.S. 4.450.150). As formas de depósito de materiais de CAR da invenção podem ser, por exemplo, uma composição implantável que compreende os materiais de CAR da invenção e um material poroso ou não poroso, tal como um polímero, em que os materiais de CAR da invenção são encapsulados ou difusos por todo o material e/ou degradação do material não poroso. O depósito é então implantado no local desejado dentro do corpo e os materiais de CAR da invenção são liberados do implante em a uma taxa predeterminada.

[00103] Quando os materiais de CAR da invenção são administrados com um ou mais agentes terapêuticos adicionais, o um ou mais agentes terapêuticos adicionais podem ser coadministrados ao mamífero. Por "coadministração" significa a administração de um ou mais agentes terapêuticos adicionais e os materiais de CAR da invenção suficientemente se aproximam do momento tal que os materiais de CAR da invenção podem aumentar o efeito de um ou mais agentes terapêuticos adicionais, ou vice-versa. A este respeito, os materiais de CAR da invenção podem ser administrados em primeiro lugar e o um ou mais agentes terapêuticos adicionais podem ser administrados em segundo lugar, ou vice-versa. Alternativamente, os materiais de CAR da invenção e o um ou mais agentes terapêuticos adicionais podem ser administrados simultaneamente. Um agente terapêutico exemplar que pode ser coadministrado com os materiais de CAR é IL-2. Acredita-se que a IL-2 acentua o efeito terapêutico dos materiais de CAR da invenção. Para os propósitos dos métodos da invenção, em que as células hospedeiras ou populações de células são administradas ao mamífero, as células podem ser células que são alogênicas ou autólogas para o mamífero.

[00104] Considera-se que as composições farmacêuticas da invenção, os CARs, ácidos nucleicos, vetores de expressão recombinantes, células hospedeiras, ou populações de células podem ser utilizados nos métodos de tratamento ou prevenção de uma doença em um mamífero. Sem estar ligado a uma teoria ou mecanismo em particular, os CARs da invenção possuem atividade biológica, por exemplo, capacidade de reconhecer o antígeno, por exemplo, CD22, de tal modo que o CAR quando expresso por uma célula é capaz de mediar uma resposta imune contra a célula que expressa o antígeno, por exemplo, CD22, para o qual o CAR é específico. A este respeito, uma modalidade da invenção fornece um método de tratamento ou prevenção do câncer em um mamífero, compreendendo a administração ao mamífero dos CARs, dos ácidos nucleicos, dos vetores de expressão recombinantes, das células hospedeiras, da população de células, dos anticorpos e/ou das suas partes de ligação ao antígeno, e/ou das composições farmacêuticas da invenção em uma quantidade eficaz para tratar ou prevenir o câncer no mamífero.

[00105] Uma modalidade da invenção ainda compreende a linfodepleção do mamífero antes de administrar os materiais de CAR da invenção. Exemplos de linfodepleção incluem, mas não são limitados a estes, quimioterapia de linfodepleção não mieloablativa, quimioterapia de linfodepleção mieloablativa, irradiação total do corpo, etc.

[00106] Para os propósitos dos métodos da invenção, em que as células hospedeiras ou populações de células são administradas, as células podem ser células que são alogênicas ou autólogas para o mamífero. De preferência, as células são autólogas para o mamífero.

[00107] O mamífero aqui referido pode ser qualquer mamífero. Como aqui utilizado, o termo "mamífero" refere-se a qualquer mamífero, incluindo, mas não limitado a estes, os mamíferos da ordem Rodentia, tais como camundongos e hamsters, e mamíferos da ordem Logomorpha, tais como coelhos. Os mamíferos podem ser da ordem Carnivora, incluindo felinos (gatos) e caninos (cães). Os mamíferos podem ser da ordem Artiodactyla, incluindo Bovinos (vacas) e suínos (porcos) ou da ordem Perssodactyla, incluindo Equinos (cavalos). Os mamíferos podem ser da ordem Primata, Ceboids ou Simoids (macacos) ou da ordem Anthropoids (humanos e macacos). De preferência, o mamífero é um ser humano.

[00108] No que diz respeito aos métodos da invenção, o câncer pode ser qualquer câncer, incluindo qualquer um de câncer linfocítico agudo, leucemia mieloide aguda, rabdomiossarcoma alveolar, câncer da bexiga (por exemplo, carcinoma da bexiga), câncer dos ossos, câncer cerebral (por exemplo, meduloblastoma), câncer da mama, câncer do ânus, canal anal, ou anorreto, câncer do olho, câncer do duto biliar intra-hepático, câncer das articulações, câncer do pescoço, vesícula biliar, ou pleura, câncer do nariz, cavidade nasal, ou ouvido médio, câncer da cavidade oral, câncer da vulva, leucemia linfocítica crônica, câncer mieloide crônico, câncer de cólon, câncer de esôfago, câncer cervical, fibrossarcoma, tumor carcinoide gastrointestinal, câncer de cabeça e pescoço (por exemplo, carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço), linfoma de Hodgkin, câncer da hipofaringe, câncer do rim, câncer da laringe, leucemia, tumores líquidos, câncer do fígado, câncer do pulmão (por exemplo, carcinoma do pulmão de células não pequenas), linfomas, mesotelioma maligno, mastocitoma, melanoma, mieloma múltiplo, câncer da nasofaringe, linfoma de não Hodgkin, leucemia linfocítica B-crônica, leucemia de células pilosas, leucemia linfocítica aguda (ALL), e linfoma de Burkitt, câncer de ovário, câncer pancreático, câncer do peritônio, omento e mesentério, câncer de faringe, câncer de próstata, câncer retal, câncer renal, câncer de pele, câncer do intestino delgado, câncer de tecidos moles, tumores sólidos, câncer de estômago, câncer testicular, câncer de tireoide e câncer de ureter. Preferivelmente, o câncer é uma doença maligna hematológica (por exemplo, leucemia ou linfoma, incluindo, mas não limitado a linfoma de Hodgkin, linfoma de não Hodgkin, leucemia linfocítica crônica, câncer linfocítico agudo, leucemia mieloide aguda, leucemia linfocítica B-crônica, leucemia de células pilosas, leucemia linfocítica aguda (ALL), e linfoma de Burkitt). De preferência, o câncer caracteriza-se pela expressão de CD22.

[00109] Os termos "tratar" e "prevenir", assim como palavras deles resultantes, como aqui utilizados, não implicam necessariamente ao tratamento ou prevenção de 100 % ou completo. De preferência, existem graus variáveis de tratamento ou prevenção dos quais uma pessoa de habilidade prática na técnica reconhece como tendo um benefício potencial ou efeito terapêutico. A este respeito, os métodos da invenção podem fornecer qualquer quantidade de qualquer nível de tratamento ou prevenção de câncer em um mamífero. Além disso, o tratamento ou prevenção fornecida pelo método da invenção pode incluir o tratamento ou prevenção de uma ou mais condições ou sintomas da doença, por exemplo, o câncer sendo tratado ou prevenido. Da mesma forma, para os propósitos aqui, "prevenção" pode abranger o retardo do início da doença, ou um sintoma ou condição desta.

[00110] Outra modalidade da invenção fornece um uso dos CARs da invenção, ácidos nucleicos, vetores de expressão recombinantes, células hospedeiras, populações de células, anticorpos ou suas partes de ligação ao antígeno, ou composições farmacêuticas, para o tratamento ou prevenção de câncer em um mamífero.

[00111] Uma outra modalidade da invenção fornece um método de detectar a presença de câncer em um mamífero, compreendendo: (a) o contato de uma amostra que compreende uma ou mais células do mamífero com os CARs, os ácidos nucleicos, os vetores de expressão recombinantes, as células hospedeiras, a população de células, os anticorpos e/ou as suas partes de ligação ao antígeno da invenção, formando assim um complexo, (b), e detecção do complexo, em que a detecção do complexo é indicativa da presença de câncer no mamífero.

[00112] A amostra pode ser obtida por qualquer método adequado, por exemplo, biópsia ou necropsia. A biópsia é a remoção do tecido e/ou células de um indivíduo. Tal remoção pode ser para coletar o tecido e/ou as células do indivíduo a fim de executar as experiências no tecido e/ou células removidas. Esta experimentação pode incluir experiências para determinar se o indivíduo possui e/ou sofre de uma certa condição ou estado doentio. A condição ou doença pode ser, por exemplo, câncer.

[00113] No que diz respeito a uma modalidade do método da invenção para a detecção da presença de câncer em um mamífero, a amostra compreendendo as células do mamífero pode ser uma amostra que compreende células inteiras, seus lisados, ou uma fração dos lisados de células inteiras, por exemplo, uma fração nuclear ou citoplasmática, uma fração de proteína inteira, ou uma fração de ácido nucleico. Se a amostra compreende células inteiras, as células podem ser quaisquer células do mamífero, por exemplo, as células de qualquer órgão ou tecido, incluindo as células sanguíneas ou as células endoteliais.

[00114] Para os propósitos do método de detecção da invenção, o contato pode ocorrer in vitro ou in vivo no que diz respeito ao mamífero. De preferência, o contato é in vitro.

[00115] Também, a detecção do complexo pode ocorrer através de qualquer número de maneiras conhecidas na técnica. Por exemplo, os TCRs da invenção, polipeptídeos, proteínas, ácidos nucleicos, vetores de expressão recombinantes, células hospedeiras, populações de células, ou anticorpos, ou suas partes de ligação ao antígeno, aqui descritos, podem ser rotulados com um rótulo detectável tal como, por exemplo, um radioisótopo, um fluoróforo (por exemplo, isotiocianato de fluoresceína (FITC), ficoeritrina (PE)), uma enzima (por exemplo, fosfatase alcalina, peroxidase de rábano picante), e partículas elementares (por exemplo, partículas de ouro).

[00116] Os métodos de teste de um CAR com relação à capacidade de reconhecer as células alvos e para a especificidade do antígeno são conhecidos na técnica. Por exemplo, Clay et al., J. Immunol., 163: 507-513 (1999), ensina métodos de medição da liberação de citocinas (por exemplo, interferon-Y, fator de estimulação da colônia granulócita/monócita (GM-CSF), fator de necrose tumoral (TNF-α) ou interleucina 2 (IL-2)). Além disso, a função de CAR pode ser avaliada pela medição da citotoxicidade celular, como descrito em Zhao et al., J. Immunol., 174: 4415-4423 (2005).

[00117] Os seguintes exemplos ilustram ainda mais a invenção, mas, naturalmente, não devem ser interpretados como limitativos do seu escopo em qualquer caso.

EXEMPLO 1

[00118] Este exemplo demonstra a síntese dos CARs anti-CD22, a transdução de PBMC com os CARs anti-CD22, e a análise da expressão de superfície do CAR sobre a PBMC transduzida.

[00119] As sequências de codificação do CAR foram sintetizadas utilizando algoritmos de otimização de códon (Mr. Gene GmbH, Regensburg, Germany) e subclonadas nos vetores de "destino" como descritos em (Zhao et al., J. Immunol., 183(9):5563-74 (2009)) que codificam as sequências de CAR de segunda geração primeira versão (domínios de sinalização da célula T da transmembrana e intracelular CD28 e domínio de sinalização da célula T intracelular cadeia CD3- zeta), CAR de segunda geração segunda versão (domínio da transmembrana de CD8 ligado aos domínios de sinalização da célula T CD137 e CD3-zeta), ou um CAR de terceira geração (domínio da transmembrana CD8 ligado aos domínios de sinalização da célula T intracelular CD28, CD137 e CD3-zeta) como apresentadas na Tabela A. TABELA A

[00120] Os sobrenadantes de vetor retroviral foram criados pela transfecção de células 293GP com plasmídeos que codificam os vetores retrovirais do CAR e a glicoproteína do envoltório RD114, que coleta os sobrenadantes de cultura (s/n) 48 a 72 horas mais tarde. Os sobrenadantes de cultura foram congelados e utilizados imediatamente para transduzir a PBMC humana ativada por OKT3 e IL-2 utilizando o método "sobre placa" durante 2 dias consecutivos (cultura de linfócitos sobre as placas revestidas com RECTRONECTIN (Takara Bio Inc., Shiga, Japan) pré-expostos a diluições de vetor contendo s/n) como anteriormente descrito em Y. Zhao et al., J. Immunol, 183: 5563 (2009). Também utilizado neste estudo foi o retroviral s/n contendo um CAR específico de CD19 de uma linhagem celular produtora permanente (Kochenderfer et al., Blood, 116: 4099 (2010)).

[00121] A expressão de CAR nas células T transduzidas foi determinada pela citometria de fluxo. Para diretamente medir o número de células capazes de ligar CD22 em virtude do domínio CH2CH3, IgG anti-humano de cabra (H & L) (Invitrogen, Grand Island, NY) foi utilizado. Para detectar CARs que codificam sem CH2CH3, CD22-Fc (R&D Systems) seguido por anti IgG-Fc PE (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA). O CAR HA22SH expressa uma sequência curta de domínio constante de imunoglobulina em lugar de CH2CH3. O CD19-CAR foi detectado utilizando a proteína Protein L. Biotinylated L (50 ng/ul, Thermo Scientific, Waltham, MA) ligada, as células lavadas, depois detectada com SA-PE (4 ug/ml, BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ). Para comparação, um vetor CD19- CAR s/n também foi avaliado. As experiências de citometria de fluxo confirmaram a expressão do CAR nas células T transduzidas. Os CARs de segunda geração demonstraram aumento dos níveis de expressão de superfície em comparação com os CARs de terceira geração como medido pela intensidade de fluorescência média (MFI).

EXEMPLO 2

[00122] Este exemplo demonstra a expressão dos antígenos CD22 e CD19 nas linhagens celulares de leucemia.

[00123] As linhagens celulares de leucemia humana (REH, SEM, NALM6, KOPN8, Daudi, Raji e K562) foram avaliadas quanto ao nível de expressão de CD19 e CD22 na superfície das células utilizando glóbulos QUANTI-BRITE PE (BD Biosciences) e anticorpo anti-CD19 e anti-CD22 rotulado por PE (Tabela 2). O "número de receptor por célula" indica o número absoluto aproximado de moléculas por célula em cada uma das linhagens celulares indicadas. Os dados foram calculados pela determinação de anticorpos ligados por célula (ABC) utilizando as ferramentas de análise de dados de software CELLQUEST (BD) de acordo com as instruções do fabricante. TABELA 2

EXEMPLO 3

[00124] Este exemplo demonstra a atividade lítica das células que expressam o CAR de segunda geração (versão 1) m971.

[00125] Para determinar a atividade lítica, as linhagens celulares de leucemia (REH, SEM, NALM6, KOPN8, Daudi, Raji e K562) foram rotuladas 51Cr e utilizadas como alvos nos ensaios de citotoxicidade. As células eram não transduzidas (transfectadas com o vetor vazio) ou foram transduzidas com o CAR de segunda geração (versão 1) m971 (SEQ ID NO: 23), o CAR anti-CD19, ou o CAR de segunda geração (versão 1) HASH22 e foram utilizadas como células efetoras na várias relações de efetor para alvo nos ensaios de citotoxicidade. A porcentagem de lise das células alvos foi medida e é apresentada nas Figuras 1A-1G.

[00126] Como mostrado nas Figuras 1A-1G, as células transduzidas com o CAR de segunda geração (versão 1) m971 (SEQ ID NO: 23), linhagens celulares de leucemia que expressam CD22 submetidas à lise REH, SEM, NALM6, KOPN8, Daudi e Raji, e a linhagem celular que não expressa CD22 não submetida à lise K562. As células transduzidas com o CAR de segunda geração (versão 1) m971 (SEQ ID NO: 23) demonstraram capacidade lítica superior em comparação com as células transduzidas com o CAR de segunda geração (versão 1) HASH22.

[00127] Sete amostras de paciente BCP-ALL foram analisadas com relação à expressão de CD22 e CD19. Uma ampla faixa de expressão de antígeno foi vista, como demonstrada pela análise citométrica de fluxo. Alguns pacientes apresentaram forte positividade para ambos os antígenos, enquanto que outros tiveram coloração reduzida de CD22. Em cada caso, os CARs específicos de CD22 conferiram atividade lítica antileucêmica em linfócitos de terceiros.

EXEMPLO 4

[00128] Este exemplo demonstra a atividade lítica das células T que expressam um CAR m971.

[00129] Para determinar se as construções de CAR de segundo ou terceiro geração forneceram aumento da atividade lítica, as linhagens celulares de leucemia Raji (CD22hi), NALM6-GL (CD22low) ou K562 (CD22-negativo) foram rotuladas 51Cr e utilizadas como alvos em ensaios de citotoxicidade. As células efetoras foram células T humanas que foram não transduzidas (transfectadas com o vetor vazio) ou transduzidas com o CAR de segunda geração, versão 1 m971 (SEQ ID NO: 23) ou CAR de terceira geração m971 (SEQ ID NO: 24). As células efetoras foram cocultivadas com células alvo em várias relações de efetor para alvo (E:T). Os resultados são apresentados nas Figuras 2A-2C.

[00130] Como mostrado nas Figuras 2A-2C, os CARs de segunda geração m971 demonstraram atividade lítica superior em comparação com os CARs de terceira geração m971.

EXEMPLO 5

[00131] Este exemplo demonstra a reatividade das células T que expressam um CAR m971.

[00132] As células T que foram não transduzidas (transfectadas com o vetor vazio) ou transduzidas com um dos seguintes CARs: anti- CD19, segunda geração versão 1 m971 (SEQ ID NO: 23), terceira geração m971 (SEQ ID NO: 24), segunda geração a versão 1 HASH22, segunda geração versão 2 HASH22, ou terceira geração HASH22, foram cocultivadas com linhagens celulares de leucemia Raji (CD22hi), NALM6-GL (CD22low), ou K562 (CD22 negativo), e as quantidades de interferon (IFN)-Y, fator de necrose tumoral (TNF) α, e interleucina (IL)-2 secretada foram medidas. Os resultados são mostrados nas Figuras 3A-3I.

[00133] Como mostrado nas Figuras 3A-3I, as células transduzidas com CAR de segunda geração, versão 1 m971, secretaram quantidades mais elevadas de IFN-Y, IL-2, e TNFα em resposta à cocultura com linhagens celulares que expressam CD22, em comparação com os CARs de terceira geração m971.

EXEMPLO 6

[00134] Este exemplo demonstra que as células transduzidas com o CAR m971 retarda a progressão da doença e prolonga a duração da sobrevivência in vivo em comparação com um CAR HA22.

[00135] Camundongos NOD scid gama, imunodeficientes (NSG) foram injetados no dia 0 com 0,5 x 106 NALM6-GL (NAML6 transfectado com luciferase). No Dia 3, os camundongos foram tratados com 1 x 107 células T não transduzidas (transfectadas com o vetor vazio) ou células T transduzidas com CAR de segunda geração, versão 1 HASH22 ou CAR de segunda geração, versão 1 m971 (SEQ ID NO: 23). A carga de tumor foi medida em termos de sinais bioluminescentes para cada camundongo como fótons/s/cm2/sr com formação de imagem bioluminescente utilizando o instrumento Xenogen IVIS. Os camundongos foram injetados por via intraperitoneal (i.p.) com 3 mg de D-luciferina (Caliper Life Sciences, Inc., Hopkinton, MA) e 4 minutos após a injeção, os camundongos anestesiados formaram imagens com um tempo de exposição de 30 segundos. O software LIVING IMAGE foi utilizado para analisar os sinais bioluminescentes para cada camundongo como fótons/s/cm2/sr nos dias 3, 7 e 15. A intensidade de sinal foi representada graficamente ao longo do tempo, e os resultados são apresentados na Figura 4A.

[00136] Como mostrado na Figura 4A, todos os camundongos tinham doença equivalente no dia 3. Os camundongos tratados com as células T transduzidas com CAR de segunda geração, versão 1 m971 (SEQ ID NO: 23) reduziram a carga tumoral nos camundongos em comparação com camundongos tratados com as células de controle ou células transduzidas com CAR HA22.

[00137] A sobrevivência dos camundongos foi medida durante 50 dias, as estatísticas de sobrevivência foram calculadas utilizando a análise Log-rank (Mantel-Cox), e os resultados de sobrevivência são apresentados na Figura 4B. Como mostrado na Figura 4B, os camundongos tratados com as células T transduzidas com o CAR de segunda geração, versão 1 m971 (SEQ ID NO: 23) demonstraram um aumento de sobrevivência em comparação com os camundongos tratados com as células de controle transduzidas com CAR HA22.

[00138] Para determinar se a falha do tratamento foi devido à perda antigênica, os camundongos foram submetidos à eutanásia devido à carga da doença de acordo com o protocolo institucional, e os baços analisadas por citometria de fluxo. Antes da terapia, níveis elevados de expressão do CAR foram vistos em células T transduzidas HASH-28z e m971-28z, e as células NALM6-GL expressaram tanto CD19 quanto CD22. Após o sacrifício, os baços foram analisados em primeiro lugar com relação à expressão de CD45 e GFP humanos. As células positivas GFP ativadas representam o tumor, e após uma outra análise esta população ativa continuou a expressar GFP. No entanto, quaisquer células CD45 positivas e GFP negativas remanescentes não mais expressaram o CAR anti-CD22. Isto indica que a leucemia continuou a expressar CD22 e que as células T do CAR persistiram no momento do sacrifício. Quando a experiência foi repetida e os camundongos sacrificados no dia 12, quando as células T terapêuticas ainda tiveram um efeito, elas puderam ser facilmente detectadas no sangue, baço e medula óssea. O CAR m971-28z (segunda geração, versão 1) apresentou uma capacidade muito maior de se infiltrar na medula óssea.

EXEMPLO 7

[00139] Este exemplo demonstra uma curva de resposta à dose para a transferência adotiva de células que expressam um CAR m971.

[00140] Os camundongos NSG (imunodeficientes) foram injetados com 0,5 x 106 células NALM6-GL no dia 0. No dia 3, os animais formaram imagens utilizando o substrato luciferina para confirmar a presença de leucemia. No dia 3, os camundongos veículos de leucemia foram injetados por via intravenosa (i.v.) com células T não transduzidas (transfectadas com o vetor vazio) ou 15 x 106, 5 x 106, 1 x 106, ou 1 x 105 células T transduzidas com uma sequência de nucleotídeo que codifica um CAR de segunda geração, versão 2 m971 (SEQ ID NO: 22). A eficiência de transdução do CAR das células T transduzidas foi de 90 %. As células T foram estimuladas com glóbulos anti-CD3/CD28 (1:1), cultivadas em 40 unidades/ml de interleucina-2, e injetadas nos camundongos 10 dias após o estímulo inicial. Os camundongos formaram imagens novamente no dia 5 e dia 8. Os resultados são mostrados nas Figuras 5 e 6. Uma alteração no sombreado de cinza para branco indica aumento da carga de tumor na Figura 5. Na Figura 6, uma diminuição nos fótons indica uma diminuição na carga de tumor. Como mostrado nas Figuras 5 e 6, a eliminação completa da leucemia foi observada com o nível de dose mais elevado no dia 8.

[00141] Todas as referências, incluindo as publicações, pedidos de patentes e patentes aqui citadas, são por meio desta incorporadas por referência na mesma medida como se cada referência fosse individual e especificamente indicada para ser incorporada por referência e foram aqui apresentadas na sua totalidade.

[00142] O uso dos termos "um" e "uma" e "o" e "a" e "pelo menos um" e similares referentes no contexto da descrição da invenção (especialmente no contexto das seguintes reivindicações), deve ser interpretado de cobrir tanto o singular quanto o plural, a não ser que de outra maneira aqui indicada ou claramente contradito pelo contexto. O uso do termo "pelo menos um" seguido por uma lista de um ou mais artigos (por exemplo, "pelo menos um de A e B") deve ser interpretado de significar um item selecionado dos itens listados (A ou B ) ou qualquer combinação de dois ou mais dos itens listados (A e B), a não ser que de outra maneira aqui indicada ou claramente contradito pelo contexto. Os termos "compreendendo", "tendo", "incluindo" e "contendo" devem ser interpretados como termos abertos (isto é, o que significa "incluindo, mas não limitado a,"), a não ser que de outra maneira mencionada. A recitação aqui de faixas de valores é meramente destinada a servir como um método abreviado de se referir individualmente cada valor separado que cai dentro da faixa, a não ser que de outra maneira aqui indicada, e cada valor separado é incorporado no relatório descritivo como se fosse aqui individualmente descrito. Todos os métodos aqui descritos podem ser executados em qualquer ordem adequada, a não ser que de outra maneira aqui indicada ou de outro modo claramente contradito pelo contexto. O uso de qualquer um e todos os exemplos, ou linguagem exemplar (por exemplo, "tal como") aqui fornecida, destina-se simplesmente a melhor esclarecer a invenção e não propõe uma limitação no escopo da invenção a não ser que de outra maneira reivindicada. Nenhuma linguagem no relatório descritivo deve ser interpretada como indicando qualquer elemento não reivindicado como essencial para a prática da invenção.

[00143] As modalidades preferidas desta invenção são aqui descritas, incluindo o melhor modo conhecido pelos inventores para realizar a invenção. Variações destas modalidades preferidas podem tornar-se evidentes para aqueles de habilidade prática na técnica após a leitura da descrição anterior. Os inventores esperam que os técnicos versados empreguem tais variações conforme apropriado, e os inventores pretendem que a invenção seja praticada de outro modo do que como aqui especificamente descrita. Consequentemente, esta invenção inclui todas as modificações e equivalentes do assunto em questão recitado nas reivindicações anexas, conforme permitido pela lei aplicável. Além do mais, qualquer combinação dos elementos acima descritos em todas as suas possíveis variações é incluída pela invenção, a não ser que de outra maneira aqui indicada ou de outro modo claramente contradito pelo contexto.

DECLARAÇÃO SOBRE PESQUISA E DESENVOLVIMENTO PATROCINADO FEDERALMENTE

[00144] Esta invenção foi feita com o apoio do governo sob o projeto número ZIA BC 010701 do National Institute of Health, National Cancer Institute. O Governo tem certos direitos sobre a invenção.

Claims

1. Receptor de antígeno quimérico (CAR) que se liga especificamente a CD22, caracterizado por um domínio de ligação ao antígeno compreendendo uma CDR1 de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 1, uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 2, uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 3, uma CDR1 de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 4, uma CDR2 de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 5, uma CDR3 de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 6, um domínio transmembrana e um domínio de sinalização de célula T intracelular.

2. CAR, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o domínio de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido que compreende a SEQ ID NO: 7.

3. CAR, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o domínio de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácido compreendendo a SEQ ID NO: 8.

4. CAR, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o domínio de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácido compreendendo a SEQ ID NO: 9.

5. CAR, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o domínio de ligação ao antígeno compreende um ligante compreendendo a SEQ ID NO: 11.

6. CAR, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma sequência líder compreendendo a SEQ ID NO: 10.

7. CAR, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o domínio transmembrana compreende um domínio transmembrana de (i) CD8 e/ou (ii) CD28, em que o domínio transmembrana compreende uma sequência de aminoácido que compreende a SEQ ID NO: 12 ou 18 e/ou uma sequência de aminoácido que compreende a SEQ ID NO: 15.

8. CAR, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o domínio de sinalização de células T intracelular compreende um domínio de sinalização intracelular de CD28, em que o domínio de sinalização de célula T intracelular compreende uma sequência de aminoácido compreendendo a SEQ ID NO: 16 ou 19.

9. CAR, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o domínio de sinalização de células T intracelular compreende um domínio de sinalização intracelular de CD137, em que o domínio de sinalização de célula T intracelular compreende uma sequência de aminoácido compreendendo a SEQ ID NO: 13 ou 20.

10. CAR, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o domínio de sinalização de células T intracelular compreende um domínio de sinalização intracelular de CD3 zeta, em que o domínio de sinalização da célula T intracelular compreende uma sequência de aminoácido compreendendo a SEQ ID NO: 14, 17 ou 21.

11. CAR, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o domínio de sinalização de célula T intracelular compreende a sequência de aminoácidos do domínio de sinalização intracelular de CD28 ou CD137.

12. CAR, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de aminoácido compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs: 22 a 24.

13. CAR, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 11, caracterizado pelo fato de que o domínio de sinalização intracelular compreende a sequência de aminoácidos do domínio de sinalização intracelular de CD137 e CD3 zeta.

14. Ácido nucleico, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de nucleotídeo que compreende a SEQ ID NO: 25.

15. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma sequência de nucleotídeo selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 26 a 28.

16. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que compreende a sequência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 25 e a sequência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 26.

17. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que compreende a sequência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 25 e a sequência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 27.

18. Vetor de expressão recombinante, caracterizado pelo ácido nucleico, como definido em qualquer uma das reivindicações de 14 a 17.

19. Microrganismo transgênico, caracterizado pelo vetor de expressão recombinante, como definido na reivindicação 18.

20. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o CAR, como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 13, o ácido nucleico como definido em qualquer uma das reivindicações de 14 a 17, o vetor de expressão recombinante, como definido na reivindicação 18, ou o microrganismo transgênico, como definido na reivindicação 19, e um veículo farmaceuticamente aceitável.

21. Uso do CAR, como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 13, do ácido nucleico, como definido em qualquer uma das reivindicações de 14 a 17, do vetor de expressão recombinante, como definido na reivindicação 18, do microrganismo transgênico, como definido na reivindicação 19, ou da composição farmacêutica, como definida na reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que é na fabricação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de câncer.

22. Uso, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o câncer é definido por um linfoma de células B ou uma leucemia de células B.