CN100374464C - 抗sars病毒的单克隆抗体、其编码序列及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种抗SARS病毒的特异性单克隆抗体。该单克隆抗体稳定性好、特异性强，特别适用于治疗非典肺炎和检测SARS病毒。本发明还提供了所述单克隆抗体的制备方法以及含有所述单克隆抗体的药物组合物。
Description
技术领域
本发明涉及医学领域。更具体地，本发明涉及抗SARS病毒的特异性单克隆抗体及其应用。本发明的抗体对于非典肺炎的治疗非常有用。
背景技术
传染性非典型肺炎是一种传染性极强的呼吸系统疾病，世界卫生组织将它称为严重急性呼吸道综合征(Severe Acute Respiratory Syndromes)，简称SARS。
SARS主要通过近距离空气飞沫和密切接触传播，其主要临床症状表现为起病急，以发热为首发症状，体温一般高于38℃；肺炎，在家庭和医院有显著的聚集现象；可有咳嗽，多为干咳、少痰；可有胸闷，严重者出现呼吸加速、气急或明显呼吸窘迫的情况。典型病例实验室检查以淋巴细胞计数减少和T淋巴细胞功能低下为其主要特点，X线检查几乎所有的SARS病人均有肺部单侧或双侧浸润性改变。由于其有高度的传染性、聚集性以及许多病例快速死亡，所以引起全球的广泛关注。迄今为止，SARS仍无特效治疗方法，SARS病人中约有10％的病人病情进行性恶化，发展为急性呼吸窘迫综合征(ARDS)，死亡率较高，尤其是伴有其他基础疾病的患者。
SARS的病原体被确认为一种新的冠状病毒(简称为“SARS病毒”)，该病毒不同于其他任何已知的人源或动物冠状病毒。
给非典型肺炎患者输入非典康复病人的血清，从而使患者产生针对SARS病毒抗体，实现病员病体的自我康复，这一方法被称为“血清疗法”。血清疗法在治疗其他人类传染性病的时就已经被尝试过，有一定的疗效，因此从理论上来看，这一疗法对非典同样也应该是有效的。在当前治疗非典没有特效药物的情况下，血清治疗是一种可以尝试的疗法，但要在临床治疗中大面积使用还有相当的难度和风险。
因此，本领域迫切需要建立可以用于临床治疗的抗SARS单克隆抗体。
发明内容
本发明的目的提供一种特异性的抗SARS病毒单克隆抗体。
本发明的另一目的是提供一种所述特异性抗SARS病毒单克隆抗体的制备方法。
本发明的另一目的是提供一种含所述抗SARS病毒单克隆抗体的药物组合物。
在本发明的第一方面，提供了一种单克隆抗体VH链，它的互补决定区CDR具有选自下组的CDR的氨基酸序列：
SEQ ID NO：5或11所示的CDR1，
SEQ ID NO：6或12所示的CDR2，
SEQ ID NO：7或13所示的CDR3。
较佳地，所述的单克隆抗体VH链具有SEQ ID NO：2中第1-128位或SEQ IDNO：4中第1-120位的氨基酸序列。
在本发明的第二方面，提供了一种单克隆抗体VL链，它的互补决定区CDR具有选自下组的CDR的氨基酸序列：
SEQ ID NO：8或14所示的CDR1，
SEQ ID NO：9或15所示的CDR2，
SEQ ID NO：10或16所示的CDR3。
较佳地，所述的单克隆抗体VL链具有SEQ ID NO：2中第144-276位或SEQ IDNO：4中第136-268位所示的氨基酸序列。
在本发明的第三方面，提供了一种单克隆抗体，其VH链具有SEQ ID NO：2中第1-128位或SEQ ID NO：4中第1-120位的氨基酸序列；
并且其VL链具有SEQ ID NO：2中第144-276位或SEQ ID NO：4中第136-268位所示的氨基酸序列。
较佳地，所述的单克隆抗体是单克隆抗体。
更佳地，所述的单克隆抗体具有SEQ ID NO：2或4所示的氨基酸序列。
在本发明的第四方面，提供了一种DNA分子，它编码选自下组的蛋白质：本发明上述的单克隆抗体VH链、单克隆抗体VL链、或单克隆抗体。
较佳地，所述的DNA分子具有选自下组的DNA序列：SEQ ID NO：1中第1-831位、SEQ ID NO：1中第1-402位，SEQ ID NO：1中第451-828位，以及SEQ IDNO：3中第1-807位，SEQ ID NO：1中第1-360位，SEQ ID NO：1中第401-804位。
在本发明的第五方面，提供了含有上述编码本发明抗体DNA的载体，以及被该载体转化或转导的宿主细胞或者被上述DNA直接转化或转导的宿主细胞。
在本发明的第六方面，提供了一种体外检测样品中是否存在SARS病毒的方法，包括步骤：
(a)将样品与本发明的SARS特异性抗体接触；
(b)检测是否形成抗原-抗体复合物，其中形成复合物就表示样品中存在SARS病毒。
在一优选例中，所述的样品为血清样品或痰液。
在本发明的第七方面，提供了一种检测试剂盒，它含有本发明的SARS特异性抗体。
在本发明的第八方面，提供了一种药物组合物，它含有单克隆抗体和药学上可接受的载体，所述单克隆抗体的VH链具有SEQ ID NO：5，6，7，11，12，或13所示的互补决定区，其VL链具有SEQ ID NO：8、9、10、14、15、或16所示的互补决定区。
在另一优选例中，所述单克隆抗体的VH链具有SEQ ID NO：2中第1-128位或SEQ ID NO：4中第1-120位的氨基酸序列；且其VL链具有SEQ ID NO：2中第144-276位或SEQ ID NO：4中第136-268位所示的氨基酸序列。
更佳地，所述的单克隆抗体具有SEQ ID NO：2或4的氨基酸序列。
附图说明
图1显示了抗体7S1的核苷酸序列和氨基酸序列。
图2显示了抗体7S2的核苷酸序列和氨基酸序列。
具体实施方式
本发明人深入而广泛的研究，通过大规模筛选人源抗体库，成功获得了对SARS病毒高特异性的单克隆抗体，在此基础上完成了本发明。
本发明提供了一种重组抗SARS病毒单克隆抗体，它具有独特的重链可变区和轻链可变区。
本发明还提供了抗SARS病毒单克隆抗体的氨基酸序列及其其可变区链，以及具有这些链的其他蛋白质或融合表达产物。具体地，本发明包括具有含超变区(互补决定区，CDR)的轻链和重链的任何蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物(即免疫偶联物及融合表达产物)，只要该超变区与本发明的轻链和重链的超变区相同或至少90％同源性，较佳地至少95％同源性。
抗体的抗原结合特性可由位于重链和轻链可变区的3个特定的区域来描述，称为超变区域(CDR)，将该段间隔成4个框架区域(FR)，4个FR的氨基酸序列相对比较保守，不直接参与结合反应。这些CDR形成环状结构，通过其间的FR形成的β折叠在空间结构上相互靠近，重链上的CDR和相应轻链上的CDR构成了抗体的抗原结合位点。可以通过比较同类型的抗体的氨基酸序列来确定是哪些氨基酸构成了FR或CDR区域。
此外，最近还发现由轻链可变区构成的相关结构，与相应的重链可变区相比，其结合的动力学比较小，分离的重链可变区域自身具有抗原结合活性。
此处鉴定的V链的超变区或互补决定区(complementarity determiningregion，CDR)特别令人感兴趣，因为它们中至少部分涉及结合抗原。因此，本发明包括那些具有带CDR的单克隆抗体轻链和重链可变链的分子，只要其CDR与此处鉴定的CDR具有90％以上(较佳地95％以上)的同源性。
本发明不仅包括完整的单克隆抗体，还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab或(Fab’)2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但保留来自人的抗体部分的抗体。
本发明还提供了编码上述单克隆抗体或其片段的DNA分子。本发明的单抗的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。一种可行的方法是用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。此外，还可将轻链和重链的编码序列融合在一起，形成单链抗体。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS7、293细胞的动物细胞等。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔，脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
本发明的SARS特异性抗体可用于检测样品中是否存在SARS病毒，从而作为检测SARS的有效指标之一。此外，本发明的SARS特异性抗体也可用于治疗SARS病症。
本发明还提供了一种治疗非典肺炎的药物组合物，它含有上述的单克隆抗体或免疫偶联物，以及药学上可接受的载体。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：腹膜内、静脉内、或局部给药。
本发明的药物组合物可直接用于治疗非典肺炎。此外，还可同时使用其他SARS治疗剂，如类固醇等。
本发明的药物组合物含有安全有效量的本发明上述的单克隆抗体以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。
使用药物组合物时，是将安全有效量的免疫偶联物施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
本发明的突出优点在于：本发明的单克隆抗体对SARS有高亲和力，因此这种高亲和力的单克隆抗体在临床上具有重要的价值。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
从抗体库中筛选抗SARS病毒抗体的可变区基因
1)抗体库的构建
本实施例中，运用体内同源重组的方法构建含有人源抗SARS病毒抗体单链可变区表达载体的文库。方法如下：
从10位SARS康复病人的血清中提取了总RNA和有Poly A+RNA。从RNA制备的第一条cDNA链使用了BD-Clonetech(Palo Atlo，CA，USA)的PowerScript反转录酶试剂盒合成，人源抗体的重链和轻链编码序列由该cDNA为模板按Sblattero和Bradbury描述的聚合酶链式反应(PCR)方法(1998年，Immunotechnology 3：271-278)制备而成，扩增后的VH和VL基因，按在美国专利6406863中描述的方法通过酵母细胞中同源重组的方法克隆到酵母双杂交载体中。PCR扩增的抗体可变区基因在500到800Bp之间。用白细胞分离的mRNA最大程度减低了非抗体的其他蛋白分子在这个抗体基因库中的比例。转化的酵母细胞涂在缺失亮氨酸的选择性酵母合成培养基的培养皿上。用此法建成的SARS特异的抗体库，库容达4x106。
2)Bait基因的选择与构建
Spike蛋白为SARS病毒表面的主要蛋白，在病毒入侵细胞中起关键作用。与典型的膜蛋白一样，Spike蛋白的纯化与表达相当困难，这就给用传统的方法和其他体系筛选抗体设下了障碍。用酵母双杂交法筛选单抗先导物的主要优点之一是不需用蛋白而是以目的基因为出发点开始筛选，故在起始点上即可领先一步。通过生物信息学分析并与已知动物冠状病毒的Spike蛋白比较，本发明人将重点放在抗原性强并最有可能产生保护性抗体的区域，同时也将不同片段进行组合以增加成功几率。病毒的核心蛋白N和膜蛋白M也是产生抗体的靶点，故在筛选中也被包括在内。
用常规方法构建编码SARS病毒Spike蛋白、核心蛋白N和膜蛋白M片段的DNA，将其转入pGBKT7载体(Clontech公司)中，获得含Bait基因的的质粒，在这些质粒中Bait基因与GAL4 DNA结合区域形成融合。
3)筛选
筛选的一般步骤分两步
A)初筛
用以下步骤进行初筛，以便获得有抗体和Bait相互作用的阳性克隆：
a.用共转化或同源重组配对的方法将Bait和抗体基因分子导入同一菌中。
b.通过报告基因的作用在选择性培养基上选出生长良好的阳性克隆。
c.用第二个报告基因B-半乳糖苷酶活性，进行验证。
d.从酵母中抽提含抗体基因的质粒DNA并在大肠杆菌中扩增，测序鉴定。
B)特异性试验
对于以上实验中双阳性的候选克隆进一步验证，即将抗体分子与一组基因(包括相应Bait和无关基因)再次共转入新一轮的报告菌株中并以选择性培养基和B-半乳糖苷酶活性鉴定抗体与Bait基因的特异性相互作用。
结果：经过几轮筛选，从大约108个克隆中得到2个抗体先导物分子7S1和7S2，这几个分子在特异性实验中只与相应Bait有结合，而与无关基因呈阴性，故为Spike蛋白特异性抗体(结果见表1)。
表1 选择性生长与半乳糖苷酶活性
| 7S1 | 7S2 | |
| Bait(pIC7) | ++ | ++ |
| PGBKT7载体 | - | - |
| Lam | - | - |
| TNFa | - | - |
| IL8 | - | - |
对7S1和7S2经DNA测序，结果表明其结构均符合标准的单链抗体分子的构成(即重链可变区+连接区+轻链可变区+HSVTag+His6Tag)。
7S1的核苷酸及氨基酸序列图1和SEQ ID NO：1和2所示。
7S2的核苷酸及氨基酸序列图2和SEQ ID NO：3和4所示。
其中重链可变区和轻链可变区以及各CDR的位置如表2所示：
表2 7S1和7S2的重链可变区和轻链可变区以及各CDR的位置
| 序列 | 重链位置 | 接头位置 | 轻链位置 | |
| 7S1 | SEQ ID NO：1 | 1-402 | 403-450 | 451-828 |
| SEQ ID NO：2 | 1-128CDR1：26-37(SEQ ID NO：5)CDR2：52-69(SEQ ID NO：6)CDR3：102-117(SEQ ID NO：7) | 129-143 | 144-276CDR1：167-177(SEQ ID NO：8)CDR2：193-199(SEQ ID NO：9)CDR3：232-240(SEQ ID NO：10) | |
| 7S2 | SEQ ID NO：3 | 1-360 | 361-400 | 401-804 |
| SEQ ID NO：4 | 1-120CDR1：26-37(SEQ ID NO：11)CDR2：52-69(SEQ ID NO：12)CDR3：102-109(SEQ ID NO：13) | 121-135 | 136-268CDR1：159-169(SEQ ID NO：14)CDR2：185-191(SEQ ID NO：15)CDR3：224-232(SEQ ID NO：16) |
实施例2
抗体分子的表达
单链抗体分子已在大肠杆菌周质腔诱导表达，并用于体外验证。方法如下：
将编码单链抗体7S1和7S2分子的DNA片段用限制性内切酶(XhoI/NcoI)切出，并克隆至表达载体pET25b(Novagen公司)中，表达质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)中，经IPTG诱导表达和渗透休克步骤，分别获得可溶性单链抗体7S1和7S2。
实施例3
抗体分子的真核表达
在本实施例中，将7S1和7S2抗体分子将在酵母中分泌型表达，和与抗体恒定区融合后转为全长抗体基因在真核细胞中的分泌表达。方法如下：
酵母中的分泌型表达通过将单链抗体分子与α多肽信号肽融合后在毕赤氏甲醇酵母中进行。将轻重链可变区分别与相对应的恒定区融合，从而将单链抗体分子复原为全长抗体分子，将含轻重链基因的质粒同时转入真核表达细胞CHO细胞，完整的抗体分子既在细胞内表达并在分泌过程中组装形成。表达的单链抗体可用其C端融合的His6标签进行亲和层析，得到较纯单抗蛋白。然后用A或G蛋白亲和层析柱纯化，获得全长7S1和7S2抗体。
结果，真核细胞中表达所获得全长抗体更稳定、更具生物活性。
实施例4
重组表达的7S1和7S2抗体分子的活性验证
本实施例中，用ELISA法进行验证。方法如下：
在ELISA中取灭活SARS病毒以及合成的S蛋白短肽作为包被的原料。被检的单链可以是实施例2中获得的单链抗体、或周质腔诱导表达的粗提物，检测抗体为鼠源HSV单克隆抗体，并最终用HRP偶联的羊抗鼠抗体(二抗)并以TMB为底物进行显色发现。
结果表明，重组表达的7S1和7S2抗体分子可特异性地与灭活SARS病毒以及合成的S蛋白短肽结合。
此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110>上海单抗制药技术有限公司
泰世基因公司(GENETASTIX INC.)
<120>抗SARS病毒的单克隆抗体、其编码序列及应用
<130>033946
<160>16
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>831
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(831）
<223>抗体7S1的编码序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(402)
<223>抗体7S1重链编码序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(451）..(828)
<223>抗体7S1轻链编码序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(403)..(450)
<223>接头序列
<400>1
caggtacagc tgcagcagtc aggtccagga ctggtgaaac cctcgcagac cctctcactc 60
acctgtgcca tctccgggga cagtgtctct agcaacagtg ctgcttggac ctggatcagg 120
cagtccccat cgagaggcct tgagtggctg ggaaggacat actataggtc caagtggtat 180
aatgattatg cagtatctgt gaaaagtcga atagacatca atccagacac atccaagaac 240
cagttctccc tgcacctgaa ctctgtgact cccgaggaca cggctgtgta ttactgtgca 300
agagagccgg gatcgggtgg atacagatat gattcagaag cttttgatgt ctggggccaa 360
gggacaatgg tcaccgtctc ttcaggcggt ggtggatcag gcggcggtgg cagcggtggt 420
ggaggcagtg acatccaggt gacccagtct ccatcctccc tgtctgcatc tgtaggagac 480
agagtcacca tcacttgccg ggcaagtcag agcattagca gctatttaaa ttggtatcag 540
cagaaaccag ggaaagcccc taagctcctg atctatgctg catccagttt gcaaagtggg 600
gtcccatcaa ggttcagtgg cagtggatct gggacagatt tcactctcac catcagcagt 660
ctgcaacctg aagattttgc aacttactac tgtcaacaga gttacagtac cccgtggacg 720
ttcggccaag ggaccaaggt ggaaatcaaa ctcgagatca aacgggctag ccagccagaa 780
ctcgccccgg aagaccccga ggatgtcgag caccaccacc accaccactg a 831
<210>2
<211>276
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1）..(276)
<223>抗体7S1
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(128)
<223>抗体7S1重链
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(144)..(276)
<223>抗体7S1轻链
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(129)..(143)
<223>接头
<400>2
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Ser Ala Ala Trp Thr Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala
50 55 60
Val Ser Val Lys Ser Arg Ile Asp Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn
65 70 75 80
Gln Phe Ser Leu His Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val
85 90 95
Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Pro Gly Ser Gly Gly Tyr Arg Tyr Asp Ser
100 105 110
Glu Ala Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp
130 135 140
Ile Gln Val Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp
145 150 155 160
Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu
165 170 175
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
180 185 190
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
195 200 205
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
210 215 220
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Trp Thr
225 230 235 240
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala
245 250 255
Ser Gln Pro Glu Leu Ala Pro Glu Asp Pro Glu Asp Val Glu His His
260 265 270
His His His His
275
<210>3
<211>807
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1）..(807)
<223>抗体7S2的编码序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1）..(360)
<223>抗体7S2重链的编码序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(401）..(804)
<223>抗体7S2轻链的编码序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(361）..(400)
<223>接头序列
<400>3
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acctgtgcca tctccgggga cagtgtctct agcaacagtg ctgcttggaa ctggatcagg 120
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aatgattatg cagtatctgt gaaaagtcga ataaccatca acccagacac atccaagaac 240
cagttctccc tgcagctgaa ctctgtgact cccgaggaca cggctgtgta ttactgtgca 300
agagagatca gtaccagccc tgactactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcctca 360
ggcggtggtg gatcaggcgg cggtggcagc ggtggtggag gcagtgacat ccgggtgacc 420
cagtctccat cctccctgtc tgcatctgta ggagacagag tcaccatcac ttgccgggca 480
agtcagagca ttagcagcta tttaaattgg tatcagcaga aaccagggaa agcccctaag 540
ctcctgatct atgctgcatc cagtttgcaa agtggggtcc catcaaggtt cagtggcagt 600
ggatctggga cagatttcac tctcaccatc agcagtctgc aacctgaaga ttttgcaact 660
tactactgcc aacagagtta cagtaccccg tggacgttcg gccaagggac caaggtggaa 720
atcaaactcg agatcaaacg ggctagccag ccagaactcg ccccggaaga ccccgaggat 780
gtcgagcacc accaccacca ccactga 807
<210>4
<211>268
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<22l>MISC_FEATURE
<222>(1）..(268)
<223>抗体7S2
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(120)
<223>抗体7S2重链
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(121）..(135)
<223>接头
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(136)..(268)
<223>接头
<400>4
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Ser Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala
50 55 60
Val Ser Val Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn
65 70 75 80
Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val
85 90 95
Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Ile Ser Thr Ser Pro Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Arg Val Thr Gln Ser Pro Ser
130 135 140
Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala
145 150 155 160
Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
165 170 175
Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly
180 185 190
Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
195 200 205
Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln
210 215 220
Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu
225 230 235 240
Ile Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Ser Gln Pro Glu Leu Ala Pro Glu
245 250 255
Asp Pro Glu Asp Val Glu His His His His His His
260 265
<210>5
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(12)
<223>重链CDR1
<400>5
Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn Ser Ala Ala Trp Thr
1 5 10
<210>6
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(18)
<223>重链CDR2
<400>6
Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala Val Ser Val
1 5 10 15
Lys Ser
<210>7
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(16)
<223>重链CDR3
<400>7
Glu Pro Gly Ser Gly Gly Tyr Arg Tyr Asp Ser Glu Ala Phe Asp Val
1 5 10 15
<210>8
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(11)
<223>轻链CDR1
<400>8
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn
1 5 10
<210>9
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(7)
<223>轻链CDR2
<400>9
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1 5
<210>10
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(9)
<223>轻链CDR3
<400>10
Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Trp Thr
1 5
<210>11
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(12)
<223>重链CDR1
<400>11
Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn Ser Ala Ala Trp Ash
1 5 10
<210>12
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(18)
<223>重链CDR2
<400>12
Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala Val Ser Val
1 5 10 15
Lys Ser
<210>13
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(8)
<223>重链CDR3
<400>13
Glu Ile Ser Thr Ser Pro Asp Tyr
1 5
<210>14
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(11)
<223>轻链CDR1
<400>14
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn
1 5 10
<210>15
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(7)
<223>轻链CDR2
<400>15
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1 5
<210>16
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(9)
<223>轻链CDR3
<400>16
Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Trp Thr
1 5
Claims (7)
1.一种单克隆抗体，其特征在于，其VH链的氨基酸序列为SEQ ID NO：2中第1-128位或SEQ ID NO：4中第1-120位，
并且所述VH链的互补决定区CDR是SEQ ID NO：5所示的CDR1，SEQ IDNO：6所示的CDR2，和SEQ ID NO：7所示的CDR3；或所述VH链的互补决定区CDR是SEQ ID NO：11所示的CDR1，SEQ ID NO：12所示的CDR2，和SEQ IDNO：13所示的CDR3；
并且其VL链的氨基酸序列为SEQ ID NO：2中第144-276位或SEQ ID NO：4中第136-268位，
并且所述VL链的互补决定区CDR是SEQ ID NO：8所示的CDR1，SEQ IDNO：9所示的CDR2，和SEQ ID NO：10所示的CDR3；或所述VL链的互补决定区CDR是SEQ ID NO：14所示的CDR1，SEQ ID NO：15所示的CDR2，和SEQ IDNO：16所示的CDR3。
2.如权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO：2或4所示。
3.一种DNA分子，其特征在于，它编码权利要求1所述的单克隆抗体。
4.如权利要求3所述的DNA分子，其特征在于，所述DNA分子的核苷酸序列选自下组：
SEQ ID NO：1中第1-831位，或
SEQ ID NO：3中第1-807位。
5.一种检测试剂盒，其特征在于，它含有权利要求1所述的单克隆抗体。
6.一种药物组合物，其特征在于，它含有权利要求1所述的单克隆抗体和药学上可接受的载体。
7.如权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，所述单克隆抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO：2或4所示。
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Applications Claiming Priority (1)
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- 2003-07-10 CN CNB031415202A patent/CN100374464C/zh not_active Expired - Fee Related
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| SARS冠状病毒刺突蛋白编码基因及氨基酸序列的同源性分析. 侯伟等.青岛大学医学院学报，第39卷第2期. 3006 * |
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