CN116396381A - 人腺相关病毒(aav)单域抗体制备及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了人腺相关病毒(AAV)单域抗体制备及其应用。具体地，本发明的单域抗体能够高亲和力地结合AAV，并且对包括AAV5、AAV8、AAV9在内的多种血清型AAV具有优秀的广谱结合能力。本发明的单域抗体还具有优秀的酸碱耐受性，具备rAAV相关的纯化、生产、实际开发等应用前景。

Description

人腺相关病毒(AAV)单域抗体制备及其应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域。具体地说，本发明涉及人腺相关病毒(AAV)单域抗体制备及其应用。
背景技术
腺相关病毒(Adeno-Associated Virus，AAV)是一种复制缺陷型病毒，其基因组是一条长约4.7kb的单链DNA，且DNA两端有长为145个核苷酸的末端反转重复序列(ITRs)。AAV的核苷酸序列已经明确，并且明确了ITR内包括了指导腺相关病毒DNA复制、病毒包装和发生宿主细胞基因组整合的顺式作用元件。p5、p19和p40三个启动子驱动腺相关病毒基因组内两个编码rep基因和cap基因的开放阅读框的表达。p40启动子作用于cap基因，不同的翻译启始位点产生VP1、VP2、VP3三个相关的衣壳蛋白。AAV血清型种类众多，其衣壳蛋白氨基酸序列、结构以及它们与宿主细胞因子相互作用的差异性导致不同血清型AAV对不同的组织和细胞感染效率不同。目前已发现12种人类AAV血清型(AAV1至AAV12)和100多种非人类灵长动物AAV血清型。
腺相关病毒所拥有的一个性质即能够作为一个载体将外源DNA转移到细胞内。当前已有多款AAV为载体的基因治疗产品批准上市，如2012年，被EMA批准Glybera用于治疗脂蛋白脂肪酶缺乏症，2017年底，FDA批准Spark Therapeutics公司的Luxturna用于治疗遗传性视网膜疾病等。目前重组腺相关病毒(rAAV)载体已被用于上百个临床实验项目，但尚未有统一的，高效的体内外检测手段。
AAV颗粒对极端的条件，如pH、清洁剂以及温度，具有较高的耐受性。所以，多种基于化学或机械裂解的方法可用于从细胞收获rAAV载体。常用的基本机械方法是冻/融循环后，低速离心澄清，但这种方法不适合大规模的纯化。目前工业界常用的一些纯化方法，例如protein A,利用其与蛋白的高亲和力及特异性结合来进行纯化，同样地，抗体也具有同蛋白高亲和力与特异性的特征。
单域抗体是指一类在骆驼科动物体内发现的天然缺失抗体轻链和重链恒定区的重链抗体。单域抗体可变区VHH，因具有较小的相对分子质量，高特异性、亲和力及高稳定性使其适用于疾病诊断、治疗等诸多领域。然而本领域尚缺乏令人满意的针对人腺相关病毒(AAV)，特别是针对多种血清型AAV的单域抗体，以应用于诸如rAAV体内外诊断试剂的开发，rAAV相关的纯化，生产等。
因此，本领域迫切需要开发新的有效针对人腺相关病毒的单域抗体，尤其是能够高亲和力、广谱地结合多种血清型AAV的单域抗体。
发明内容
本发明的目的就是提供能够高亲和力、广谱地结合多种血清型AAV的单域抗体。
在本发明的第一方面，提供了一种抗腺相关病毒(AAV)的单域抗体，其特征在于，所述抗AAV的单域抗体的VHH链的互补决定区CDR选自下组：
(1)SEQ ID NO:1所示的CDR1、SEQ ID NO:2所示的CDR2、和SEQ ID NO:3所示的CDR33(Kabat编号系统)；
SEQ ID NO:4所示的CDR1、SEQ ID NO:5所示的CDR2、和SEQ ID NO:6所示的CDR3(IMGT编号系统)；
(2)SEQ ID NO:8所示的CDR1、SEQ ID NO:9所示的CDR2、和SEQ ID NO:10所示的CDR33(Kabat编号系统)；
SEQ ID NO:11所示的CDR1、SEQ ID NO:12所示的CDR2、和SEQ ID NO:13所示的CDR3(IMGT编号系统)；
(3)SEQ ID NO:15所示的CDR1、SEQ ID NO:16所示的CDR2、和SEQ ID NO:17所示的CDR33(Kabat编号系统)；
SEQ ID NO:18所示的CDR1、SEQ ID NO:19所示的CDR2、和SEQ ID NO:20所示的CDR3(IMGT编号系统)；
(4)SEQ ID NO:22所示的CDR1、SEQ ID NO:23所示的CDR2、和SEQ ID NO:24所示的CDR33(Kabat编号系统)；
SEQ ID NO:25所示的CDR1、SEQ ID NO:26所示的CDR2、和SEQ ID NO:27所示的CDR3(IMGT编号系统)；或
(5)SEQ ID NO:29所示的CDR1、SEQ ID NO:30所示的CDR2、和SEQ ID NO:31所示的CDR33(Kabat编号系统)；
SEQ ID NO:32所示的CDR1、SEQ ID NO:33所示的CDR2、和SEQ ID NO:34所示的CDR3(IMGT编号系统)。
在另一优选例中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个(如1-3个，较佳地1-2个，更佳地1个)氨基酸并能保留与AAV特异性结合能力的衍生序列。
在另一优选例中，所述VHH链的互补决定区CDR包含选自下组的CDR1、CDR2和CDR3：
Figure BDA0003440811980000031
在另一优选例中，所述抗AAV的单域抗体能够与AAV特异性结合。
在另一优选例中，所述的CDR1、CDR2和CDR3由VHH链的框架区FR1、FR2、FR3和FR4所隔开。
在另一优选例中，所述抗AAV的单域抗体还包括框架区FR。
在另一优选例中，所述的框架区FR1、FR2、FR3和FR4具有衍生自SEQ ID NO:7、14、21、28或35的序列。
在另一优选例中，所述的抗AAV的单域抗体的VHH链的氨基酸序列选自SEQ ID NO:7、14、21、28或35所示的序列。
在另一优选例中，所述的抗AAV的单域抗体包括人源化抗体、骆驼源抗体、嵌合抗体。
在另一优选例中，所述的抗AAV的单域抗体特异性结合AAV。
在另一优选例中，所述的抗AAV的单域抗体对AAV具有广谱结合能力。
在另一优选例中，所述的“广谱结合能力”指所述抗AAV的单域抗体能够结合多种血清型的AAV。
在另一优选例中，所述的抗AAV的单域抗体能够结合的AAV血清型包括：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10。
在另一优选例中，能够与所述的抗AAV的单域抗体能够结合的AAV血清型包括：AAV5、AAV8、AAV9。
在另一优选例中，所述的抗AAV的单域抗体对AAV具有高亲和力。
在另一优选例中，所述的高亲和力指，所述抗AAV的单域抗体对AAV的亲和力EC50≤800ng/mL，优选地≤500ng/mL，更优选地≤250ng/mL，进一步优选地≤100ng/mL。
在另一优选例中，所述的抗AAV的单域抗体对AAV具有适中的亲和力。
在另一优选例中，所述适中的亲和力指，所述抗AAV的单域抗体对AAV的亲和力EC50范围为＞800ng/ml，且≤2000ng/mL，优选地为≤1500ng/mL，更优选地为≤1000ng/mL。
在本发明的第二方面，提供了一种抗AAV的抗体，所述抗体包括一个或多个如本发明第一方面所述的抗AAV的单域抗体的VHH链。
在另一优选例中，所述的抗AAV的单域抗体的VHH链的氨基酸序列选自SEQ ID NO:7、14、21、28或35所示的序列。
在另一优选例中，所述的抗AAV的抗体，可以为单体、二价抗体、和/或多价抗体。
在本发明的第三方面，提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸编码选自下组的蛋白质：如本发明第一方面所述的抗AAV的单域抗体、或如本发明第二方面所述的抗体。
在另一优选例中，本发明涉及编码本发明的抗AAV的单域抗体的核酸分子。本发明的核酸可为RNA、DNA或cDNA。
在本发明的第四方面，提供了一种表达载体，所述表达载体含有如本发明第三方面所述的多核苷酸。
在另一优选例中，所述的表达载体选自下组：DNA、RNA、病毒载体、质粒、转座子、其他基因转移系统、或其组合。优选地，所述表达载体包括病毒载体，如慢病毒、腺病毒、AAV病毒、逆转录病毒、或其组合。
在另一优选例中，所述的表达载体为pHT43质粒。
在本发明的第五方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有如本发明第四方面所述的表达载体，或其基因组中整合有如本发明第三方面所述的多核苷酸。
在另一优选例中，所述的宿主细胞包括原核细胞或真核细胞。
在另一优选例中，所述的宿主细胞选自下组：枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、酵母细胞、哺乳动物细胞。
在本发明的第六方面，提供了一种产生抗AAV的单域抗体的方法，包括步骤：
(a)在适合产生单域抗体的条件下，培养如本发明第五方面所述的宿主细胞，从而获得含所述抗AAV的单域抗体的培养物；
(b)从所述培养物中分离和/或回收所述的抗AAV的单域抗体；和
(c)任选地，对步骤(b)获得的抗AAV的单域抗体进行纯化和/或修饰。
在本发明的第七方面，提供了一种免疫偶联物，所述免疫偶联物含有：
(a)如本发明第一方面所述的抗AAV的单域抗体、或如本发明第二方面所述的抗AAV的抗体；和
(b)选自下组的偶联部分：可检测标记物、药物、细胞因子、放射性核素、酶、金纳米颗粒/纳米棒、纳米磁粒、病毒外壳蛋白或VLP，或其组合。
在另一优选例中，所述的放射性核素包括：
(i)诊断用同位素，所述的诊断用同位素选自下组：Tc-99m、Ga-68、F-18、I-123、I-125、I-131、In-111、Ga-67、Cu-64、Zr-89、C-11、Lu-177、Re-188，或其组合；和/或
(ii)治疗用同位素，所述的治疗用同位素选自下组：Lu-177、Y-90、Ac-225、As-211、Bi-212、Bi-213、Cs-137、Cr-51、Co-60、Dy-165、Er-169、Fm-255、Au-198、Ho-166、I-125、I-131、Ir-192、Fe-59、Pb-212、Mo-99、Pd-103、P-32、K-42、Re-186、Re-188、Sm-153、Ra223、Ru-106、Na24、Sr89、Tb-149、Th-227、Xe-133、Yb-169、Yb-177，或其组合。
在另一优选例中，所述偶联部分为可检测标记物。
在另一优选例中，所述偶联部分为可定量检测的标记物。
在另一优选例中，所述偶联部分选自下组：荧光或发光标记物、放射性标记物、MRI(磁共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂，或能够产生可检测产物的酶、放射性核素、生物毒素、细胞因子(如IL-2等)、抗体、抗体Fc片段、抗体scFv片段、金纳米颗粒/纳米棒、病毒颗粒、脂质体、纳米磁粒、前药激活酶(例如，DT-心肌黄酶(DTD)或联苯基水解酶-样蛋白质(BPHL))或任何形式的纳米颗粒。
在另一优选例中，所述免疫偶联物含有：多价(如二价)的如本发明第一方面所述的抗AAV的单域抗体。
在另一优选例中，所述多价是指，在所述免疫偶联物的氨基酸序列中包含多个如本发明第一方面所述的抗AAV的单域抗体。
在另一优选例中，所述的多个如本发明第一方面所述的抗AAV的单域抗体是相同的，或是不同的。
在本发明的第八方面，提供了如本发明第一方面所述的抗AAV的单域抗体，如本发明第二方面所述的抗AAV的抗体，或如本发明第九方面所述的免疫偶联物的用途，其特征在于，用于制备：
i)用于分离、纯化AAV的试剂；
ii)用于检测AAV的试剂；
iii)治疗和/或缓解AAV相关疾病的药物。
在另一优选例中，所述的AAV相关疾病包括AAV相关基因治疗引起的副作用与并发症，尤其是高剂量AAV相关基因治疗引起的副作用与并发症。
在另一优选例中，所述的分离、纯化AAV的试剂可用于AAV的实验室制备或工业生产。
在另一优选例中，所示检测AAV的试剂为诊断试剂，较佳地，所述的诊断试剂为检测片或检测板。
在另一优选例中，所述诊断试剂用于：检测样品中的AAV病毒或其片段。
在另一优选例中，所述的检测包括流式检测、细胞免疫荧光检测。
在另一优选例中，所述AAV的血清型包括：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10。
在本发明的第九方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物含有：
(i)如本发明第一方面所述的抗AAV的单域抗体、如本发明第二方面所述的抗AAV的抗体，或如本发明第七方面所述的免疫偶联物；和
(ii)药学上可接受的载体。
在本发明的第十方面，提供了一种重组蛋白，所述的重组蛋白具有：
(i)如本发明第一方面所述的抗AAV的单域抗体、或如本发明第二方面所述的抗AAV的抗体；和
(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。
在另一优选例中，所述的标签序列包括Fc标签、HA标签和His标签。
在另一优选例中，所述的重组蛋白特异性结合于AAV。
在本发明的第十一方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒含有如本发明第一方面所述的抗AAV的单域抗体、如本发明第二方面所述的抗AAV的抗体，或如本发明第七方面所述的免疫偶联物。
在本发明的第十二方面，提供了一种治疗和或缓解AAV相关疾病的方法，所述方法包括，给需要的对象施用如本发明第一方面所述的抗AAV的单域抗体、如本发明第二方面所述的抗AAV的抗体，或如本发明第七方面所述的免疫偶联物。
在另一优选例中，所述的AAV相关疾病包括AAV相关基因治疗引起的副作用与并发症，尤其是高剂量AAV相关基因治疗引起的副作用与并发症。
在另一优选例中，所述的对象包括哺乳动物，如人。
在本发明的第十三方面，提供了一种体外检测样品中AAV或其片段的方法，所述方法包括步骤：
(1)在体外，将所述样品与如本发明第一方面所述的抗AAV的单域抗体、如本发明第二方面所述的抗AAV的抗体，或如本发明第七方面所述的免疫偶联物接触；
(2)检测是否形成抗原-抗体复合物，其中形成复合物就表示样品中存在AAV或其片段。
在另一优选例中，所述AAV的血清型包括：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10。
在另一优选例中，所述的AAV的血清型包括：AAV5、AAV8、AAV9。
在另一优选例中，所述的检测包括诊断性的或非诊断性的。
在本发明的第十四方面，提供了一种检测板，所述的检测板包括：基片(支撑板)和测试条，所述的测试条含有如本发明第三方面所述的抗体或如本发明第九方面所述的免疫偶联物。
在本发明的第十五方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒含有如本发明第一方面所述的抗AAV的单域抗体、如本发明第二方面所述的抗AAV的抗体、或如本发明第七方面所述的免疫偶联物。
在本发明的第十六方面，提供了一种针对AAV的检测方法，包括步骤：
(i)从诊断对象获取一样品，将所述的样品与如本发明第一方面所述的抗AAV的单域抗体、如本发明第二方面所述的抗AAV的抗体、或如本发明第七方面所述的免疫偶联物接触；和
(ii)检测是否形成抗原-抗体复合物，其中形成复合物就表示所述的对象体内存在AAV。
在另一优选例中，所述的对象为接受AAV载体基因治疗的患者。
在另一优选例中，所述步骤(i)中，将所述样品与如本发明第七方面所述的免疫偶联物接触，其中所述偶联部分为可定量检测的标记物，并且，所述方法可选地进一步包括步骤：
(iii)定量检测标记物的含量，从而得到诊断对象体内AAV的含量。
在另一优选例中，所述的样品包括：血液、体液、组织样本、或其组合。
在本发明的第十七方面，提供了一种重组多肽的制备方法，所述的重组多肽是如本发明第一方面所述的抗AAV的单域抗体、如本发明第二方面所述的抗AAV的抗体，所述的方法包括：
(a)在适合表达的条件下，培养如本发明第五方面所述的宿主细胞；和
(b)从培养物中分离出所述的重组多肽。
在本发明的第十八方面，提供了一种放射性免疫成像方法，包括使用如本发明第一方面所述的抗AAV的单域抗体、如本发明第二方面所述的抗AAV的抗体、或如本发明第七方面所述的免疫偶联物进行成像。
在另一优选例中，所述的放射性免疫成像方法用于AAV的检测和示踪。
在另一优选例中，所述的AAV示踪包括体内示踪。
在本发明的第十九方面，提供了一种纯化AAV的方法，其特征在于，使用如本发明第一方面所述的抗AAV的单域抗体、如本发明第二方面所述的抗AAV的抗体、或如本发明第七方面所述的免疫偶联物进行AAV的纯化。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。
图1显示了抗AAV的单域抗体文库筛选噬菌体与AAV5、AAV8、AVV9的结合。
图2A显示了骆驼抗体2-F4,1-A4，2-F10,2-B11与AAV5的亲和力检测结果。
图2B显示了骆驼抗体2-F4,1-A4,2-F10,2-B11与AAV8的亲和力检测结果。
图2C显示了骆驼抗体2-F4,1-A4与AAV9的亲和力检测结果。
图2D显示了骆驼抗体2-B11与AAV9的亲和力检测结果。
图2E显示了骆驼抗体2-F10与AAV9的亲和力检测结果。
图3A显示了骆驼抗体2-E5与AAV5的亲和力检测结果。
图3B显示了骆驼抗体2-E5与AAV6的亲和力检测结果。
图3C显示了骆驼抗体2-E5与AAV7的亲和力检测结果。
图3D显示了骆驼抗体2-E5与AAV8的亲和力检测结果。
图3E显示了骆驼抗体2-E5与AAV9的亲和力检测结果。
图4显示了骆驼抗体2-E5耐受处理后与AAV5的亲和力检测结果。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次筛选得到了人腺相关病毒(AAV)单域抗体制备及其应用。实验证明，本发明的单域抗体能够高亲和力地结合AAV，并且对包括AAV5、AAV8、AAV9在内的多种血清型AAV均具有优秀的广谱结合能力。此外，本发明的单域抗体还具有优秀的酸碱耐受性，适合用于工业生产。在此基础上，完成了本发明。
缩略词
本说明书中使用的缩略词对应含义如下表1所示。
表1 缩略词表
AAV 腺相关病毒
rAAV 重组腺病毒
CDR 互补决定区
VHH 单重链可变区
Kabat 由Elvin A.Kabat提出的免疫球蛋白比对及编号系统
IMGT 基于由Lefranc等人发起的国际免疫遗传学信息系统的编号系统
EC50 半最大效应浓度，即能引起50％最大效应的浓度
ELISA 酶联免疫吸附
PCR 聚合酶链式反应
HRP 辣根过氧化物酶
序列表
本发明涉及的氨基酸序列如下表2所示。
术语
如本文所用，术语“本发明单域抗体”、“本发明的单域抗体”、“本发明的抗AAV的单域抗体”、“抗AAV的单域抗体”可互换使用，均指特异性识别和结合于AAV(包括各种血清型的AAV)的单域抗体。
本发明单域抗体的VHH链、及根据不同CDR计算算法得到的CDR区序列如下表2所示。
表2 氨基酸序列表
Figure BDA0003440811980000091
Figure BDA0003440811980000101
Figure BDA0003440811980000111
如本文所用，术语“单域抗体”、“VHH”、“纳米抗体(nanobody)”、“单域抗体”(single domain antibody,sdAb，或纳米抗体nanobody)具有相同的含义并可互换使用，指克隆抗体重链的可变区，构建仅由一个重链可变区组成的单域抗体(VHH)，它是具有完整功能的最小的抗原结合片段。通常先获得天然缺失轻链和重链恒定区1(CH1)的抗体后，再克隆抗体重链的可变区，构建仅由一个重链可变区组成的单域抗体(VHH)。
如本文所用，术语“抗体”或“免疫球蛋白”是有相同结构特征的约150000道尔顿的异四聚糖蛋白，其由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而不同免疫球蛋白同种型的重链间的二硫键数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链的一端有可变区(VH)，其后是多个恒定区。每条轻链的一端有可变区(VL)，另一端有恒定区；轻链的恒定区与重链的第一个恒定区相对，轻链的可变区与重链的可变区相对。特殊的氨基酸残基在轻链和重链的可变区之间形成界面。
如本文所用，术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成了各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。它集中于轻链和重链可变区中称为互补决定区(CDR)或超变区中的三个片段中。可变区中较保守的部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个FR区，它们大致上呈β-折叠构型，由形成连接环的三个CDR相连，在某些情况下可形成部分β折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成了抗体的抗原结合部位(参见Kabat等,NIH Publ.No.91-3242,卷I，647-669页(1991))。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。
如本领域技术人员所知，免疫偶联物及融合表达产物包括：药物、毒素、细胞因子(cytokine)、放射性核素、酶和其他诊断或治疗分子与本发明的抗体或其片段结合而形成的偶联物。本发明还包括与所述的抗AAV的单域抗体或其片段结合的细胞表面标记物或抗原。
如本文所用，术语“重链可变区”与“VH”可互换使用。
如本文所用，术语“可变区”与“互补决定区(Complementarity DeterminingRegion，CDR)”可互换使用。
在本发明的一个优选的实施方式中，所述抗体的重链可变区包括三个互补决定区CDR1、CDR2、和CDR3。
在本发明的一个优选的实施方式中，所述抗体的重链包括上述重链可变区和重链恒定区。
在本发明中，术语“本发明抗体”、“本发明蛋白”、或“本发明多肽”可互换使用，都指特异性结合AAV蛋白的多肽，例如具有重链可变区的蛋白或多肽。它们可含有或不含起始甲硫氨酸。
本发明还提供了具有本发明抗体的其他蛋白质或融合表达产物。具体地，本发明包括具有含可变区的重链的任何蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物(即免疫偶联物及融合表达产物)，只要该可变区与本发明抗体的重链可变区相同或至少90％同源性，较佳地至少95％同源性。
一般，抗体的抗原结合特性可由位于重链可变区的3个特定区域来描述，称为可变区域(CDR)，将该段间隔成4个框架区域(FR)，4个FR的氨基酸序列相对比较保守，不直接参与结合反应。这些CDR形成环状结构，通过其间的FR形成的β折叠在空间结构上相互靠近，重链上的CDR和相应轻链上的CDR构成了抗体的抗原结合位点。可以通过比较同类型的抗体的氨基酸序列来确定是哪些氨基酸构成了FR或CDR区域。
本发明抗体的重链的可变区特别令人感兴趣，因为它们中至少部分涉及结合抗原。因此，本发明包括那些具有带CDR的抗体重链可变区的分子，只要其CDR与此处鉴定的CDR具有90％以上(较佳地95％以上，最佳地98％以上)的同源性。
本发明不仅包括完整的抗体，还包括具有免疫活性的抗体的片段或抗体与其他序列形成的融合蛋白。因此，本发明还包括所述抗体的片段、衍生物和类似物。
如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明抗体相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与6His标签形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
本发明抗体指具有AAV蛋白结合活性的、包括上述CDR区的多肽。该术语还包括具有与本发明抗体相同功能的、包含上述CDR区的多肽的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括本发明抗体的活性片段和活性衍生物。
该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与本发明抗体的编码DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗本发明抗体的抗血清获得的多肽或蛋白。
本发明还提供了其他多肽，如包含单域抗体或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了本发明单域抗体的片段。通常，该片段具有本发明抗体的至少约50个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。
在本发明中，“本发明抗体的保守性变异体”指与本发明抗体的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表A进行氨基酸替换而产生。
表A
Figure BDA0003440811980000131
Figure BDA0003440811980000141
本发明还提供了编码上述抗体或其片段或其融合蛋白的多核苷酸分子。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。
编码本发明的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与成熟多肽有相同的生物学功能和活性。
本发明的抗体的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。一种可行的方法是用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。此外，还可将重链的编码序列和表达标签(如6His)融合在一起，形成融合蛋白。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。本发明所涉及的生物分子(核酸、蛋白等)包括以分离的形式存在的生物分子。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞，优选为枯草芽孢杆菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS7、293细胞的动物细胞等。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔，脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
本发明的抗体可以单独使用，也可与可检测标记物(为诊断目的)、PK(蛋白激酶)修饰部分或任何以上这些物质的组合结合或偶联。
用于诊断目的可检测标记物包括但不限于：荧光或发光标记物、放射性标记物、MRI(磁共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶。
可与本发明抗体结合或偶联的治疗剂包括但不限于：1.放射性核素；2.生物毒；3.细胞因子如IL-2等；4.金纳米颗粒/纳米棒；5.病毒颗粒；6.脂质体；7.纳米磁粒；8.药激活酶(例如，DT-心肌黄酶(DTD)或联苯基水解酶-样蛋白质(BPHL))；9.疗剂(例如，顺铂)或任何形式的纳米颗粒等。
AAV与抗AAV的单域抗体
如本文所用，术语“腺相关病毒(Adeno-Associated Virus，AAV)”是一种复制缺陷型病毒，其基因组是一条长约4.7kb的单链DNA，且DNA两端有长为145个核苷酸的末端反转重复序列(ITRs)。AAV血清型种类众多，不同血清型的AAV具有不同的衣壳蛋白氨基酸序列和结构，这些差异以及它们与宿主细胞因子相互作用的差异性导致不同血清型AAV对不同的组织和细胞感染效率不同。目前已发现12种人类AAV血清型(AAV1至AAV12)和100多种非人类灵长动物AAV血清型。
如本文所用，“副作用与并发症”、“AAV相关基因治疗引起的副作用与并发症”是指在AAV基因治疗(即以AAV作为载体的基因治疗方法)中，可能出现的与非预期的作用或并发症，其可以包括(但不限于)：免疫反应、肝胆毒性(通常与高剂量给药相关)及其引起的肝脏和/或胆道损伤，及进而引起的感染和/或败血症。在一些实施方式中，副作用与并发症指高剂量AAV相关基因治疗引起的副作用与并发症，即应用了超出治疗所需量的AAV相关基因治疗药物而导致的副作用与并发症。
本发明提供了能够结合多种血清型AAV的单域抗体。所述血清型包括：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10。
在本发明中，所述抗AAV的抗体包括单体、二价体(二价抗体)、四价体(四价抗体)、和/或多价体(多价抗体)。
在本发明的一个优选例中，所述的抗AAV的抗体具有一条或多条选自SEQ ID NO:7、14、21、28或35所示的氨基酸序列的VHH链。
本发明提供了具有优秀的酸碱耐受性的抗AAV抗体。其在极端的酸碱条件下，经过长时间处理后，仍能保持与未处理前基本相同的亲和力。
标记的单域抗体
在本发明的一个优选例中，所述单域抗体带有可检测标记物。更佳地，所述的标记物选自下组：同位素、胶体金标记物、有色标记物或荧光标记物。
优选地，所述单域抗体带有可定量检测的标记物。
胶体金标记可采用本领域技术人员已知的方法进行。在本发明的一个优选的方案中，抗AAV的单域抗体用胶体金标记，得到胶体金标记的单域抗体。在本发明的另一个优选的方案中，抗AAV的单域抗体用放射性同位素标记，得到同位素标记的单域抗体。
本发明的抗AAV的单域抗体具有很好的特异性，可用于针对AAV的定位、示踪和检测。
本发明的标记的抗AAV的单域抗体可用于检测对象(例如接受AAV载体基因治疗的患者)体内AAV的存在，较佳地，用于检测对象体内AAV的含量，进而评估AAV基因治疗的效果、及后续发生副作用与并发症的风险。
药物组合物
本发明还提供了一种组合物。优选地，所述的组合物是药物组合物，它含有上述的抗体或其活性片段或其融合蛋白，以及药学上可接受的载体。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：腹膜内、静脉内、或局部给药。
本发明的药物组合物含有安全有效量(如0.001-99wt％,较佳地0.01-90wt％，更佳地0.1-80wt％)的本发明上述的抗体(或其偶联物)以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约10微克/千克体重-约50毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。
使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明的抗体或其免疫偶联物施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约50毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约10毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
检测方法
本发明还涉及体外检测AAV的方法。该方法步骤大致如下：获得细胞和/或组织样本；将样本溶解在介质中；检测在所述溶解的样本中AAV的水平。
在本发明的检测方法中，所使用的样本没有特别限制，代表性的例子是外周血样本、或存在于细胞保存液中的含细胞的样本。
试剂盒
本发明还提供了一种含有本发明的抗体(或其片段)或检测板的试剂盒，在本发明的一个优选例中，所述的试剂盒还包括容器、使用说明书、缓冲剂等。
本发明还提供了用于检测AAV的检测试剂盒，该试剂盒包括识别AAV的抗体，用于溶解样本的裂解介质，检测所需的通用试剂和缓冲液，如各种缓冲液、检测标记、检测底物等。该检测试剂盒可以是体外检测装置。
应用
如上所述，本发明的单域抗体有广泛的工业应用价值和生物医药应用价值，其应用涉及到与AAV相关的基础医学研究、生物学研究等多个领域。具体地，本发明的单域抗体具有以下用途：
i)用于AAV的生产、制备、分离、纯化、或其组合；
ii)用于AAV的体内外定位、示踪、检测、或其组合。
iii)用于AAV相关疾病的诊断、治疗、或其组合。
在本发明的一个优选实施方式中，本发明的单域抗体用于检测接受AAV基因治疗的患者体内的AAV含量，进而评估AAV基因治疗的效果、及引起副作用与并发症的风险。
在本发明的一个优选实施方式中，本发明的单域抗体用于治疗AAV相关疾病，所述疾病包括(但不限于)因AAV相关基因治疗产生的副作用与并发症。
本发明的主要优点包括：
(a)本发明首次研发了针对AAV的单域抗体；
(b)本发明的单域抗体具有与AAV结合的适中的亲和力；
(c)本发明的单域抗体具有广谱结合能力，能够结合AAV的多种血清型；
(d)本发明的单域抗体具有优秀的酸碱耐受性，能够应用于工业用途；
(e)本发明的单域抗体制备方法简单，易于大量生产。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明结果。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围结果。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件结果。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数结果。
实施例1 抗AAV的单域抗体文库的构建
为获得针对AAV广谱的纳米抗体，将高纯度1×1013滴度的AAV5,AAV8,AAV9(广州派真生物技术有限公司)进行1：1：1的混合。首次免疫采用AAV混合液与CFA(完全弗氏佐剂)1：1进行混合，免疫10只美洲驼，加强免疫采用IFA(非完全弗氏佐剂)进行1：1混合，每两周一次，共免疫5次以刺激B细胞表达特异性单域抗体；5次免疫结束后，每只羊驼提取50ml美洲驼外周血,获得淋巴细胞并抽提总RNA；通过逆转录及PCR克隆并扩增VHH基因；利用限制性内切酶分别酶切VHH基因及pComb3载体，使用T4连接酶连接载体与VHH基因片段；将连接产物转化至电转细菌感受态TG1中，构建抗AAV的单域抗体文库并测定库容。
结果：经测定，库容为1011,随机挑选48克隆进行菌落PCR检测，所建文库的插入率为95％。
实施例2 抗AAV的单域抗体文库的筛选
将AAV9采用CBS包被液(PH9.6)稀释加入100ul至酶标板中上，4℃放置过夜；第二天加入100ul 0.1％BSA,室温封闭2h；2h后，加入100ul噬菌体，室温放置1h；用0.05％PBS+Tween-20洗5遍，以洗掉非特异性的噬菌体；甘氨酸-盐酸溶液(pH2.2)将特异性结合的噬菌体洗脱下来，并感染处于对数生长期的大肠杆菌TG1细胞，37℃培养1h，收集培养物，涂布2YT固体培养基培养皿过夜；用2YT液体培养基洗脱培养皿上菌落，加入辅助噬菌体，过夜收集包装后的成熟噬菌体。相同筛选过程重复3轮使阳性克隆被富集。从富集后含有噬菌体的培养皿中，挑选184个单菌落分别培养，生产并纯化噬菌体。
将AAV5、AAV8、AAV9(广州派真生物技术有限公司)分别采用CBS包被液稀释至510滴度，加入100ul至96孔酶标板4℃过夜，再使用100ul PBS(含2％BSA)进行封闭，将获得的样品噬菌体加入100uL至96孔板中，室温下反应1小时。PBST洗涤3次后加入1：10000HRP标记的Anti-M13二抗稀释液(成都阿帕克生物技术有限公司)，37℃孵育1h并使用PBST洗涤5次。加入100uL TMB显色液(湖州英创)显色5分钟，加入终止液，使用酶标仪450nm进行读数。阳性克隆定义为OD450nM读值高于本底信号10倍(其中AAV5、AAV8、AAV9本底信号值分别是0.077、0.081、0.074)。
结果：OD450nM读数结果如图1所示，统计分析表明：结合AAV9阳性克隆为161个，结合率达到87.5％，结合AAV8阳性克隆为158个，结合率达到85.9％，结合AAV5阳性克隆为149个，结合率达到81.0％，同时结合AAV5、AAV8、AAV9的克隆有137个，结合率达到74.45％。
实施例3 抗AAV的单域抗体噬菌体广谱结合能力检测
在本实施例中，验证了抗AAV的单域抗体噬菌体针对各类型AAV的广谱结合能力。将AAV1、AAV2(广州派真生物技术有限公司)、AAV8、AAV9(上海吉凯生物技术有限公司)分别采用CBS包被液稀释至5E10滴度，加入100ul至96孔酶标板4℃过夜，再使用100ul PBS(含2％BSA)进行封闭，从实施例2中同时结合AAV5、AAV8、AAV9的噬菌体中挑选40个克隆噬菌体加入100uL至96孔板中，室温下反应1小时。PBST洗涤3次后加入1：10000HRP标记的Anti-M13二抗稀释液(成都阿帕克生物技术有限公司)，37℃孵育1h并使用PBST洗涤5次。加入100uLTMB显色液(湖州英创)显色5分钟，加入终止液，使用酶标仪450nm进行读数。
结果：OD450nM读数结果如表3所示。
表3 抗AAV的单域抗体噬菌体结合能力检测
Figure BDA0003440811980000201
Figure BDA0003440811980000211
本实施例检测的40个克隆中，除1-E1不结合AAV1，2-C10不结合AAV2外，其余38个克隆均能同时结合AAV8、AAV9、AAV1、AAV2。并且，本实施例使用的AAV8、AAV9与实施例2的AAV8、AAV9来自不同厂家，但这38个克隆仍然能够与之结合。该结果说明了其对不同类型AAV均具有优秀的结合能力。
该实施例验证了筛选得到的抗AAV的单域抗体噬菌体对不同类型AAV的广谱结合能力。
实施例4 抗AAV的单域抗体的序列测定
将实施例2中137株与AAV5、AVV8、AVV9同时结合的阳性克隆菌液转移至含有100ug/ml氨苄霉素的LB液体培养基中培养，提取质粒；送样北京擎科生物技术有限公司进行测序，通过IMGT网址分析，排除CDR相同及异常序列，最终测得5个完整骆驼抗体2-F4、1-A4、2B11、2E5、2-F10，抗体序列如表4所示。
表4 候选驼源抗体序列表
Figure BDA0003440811980000212
实施例5 抗AAV的单域抗体的制备
将实施例4中抗AAV的单域抗体2-F4、1-A4、2B11、2E5、2-F10氨基酸序列通过密码子优化，C末端连接His标签序列，通过基因合成(安徽通用生物技术有限公司)，构建到枯草芽孢杆菌表达载体pHT43质粒上，将连接产物转化至氨苄青霉素的培养基，37℃过夜培养，提取质粒。加电转感受态到提前预冷的电击杯中，加入质粒，冰上预冷5分钟；擦干电击杯电转，并立即加入1ml培养基，转移到离心管；37℃培养2小时，离心弃上清，重悬后涂布平板。7℃过夜培养，挑取2-3个克隆，接种到2ml培养基中，37℃培养3小时，吸取一定量菌液进行PCR鉴定。将阳性克隆的菌液1ml接种到200ml培养基中，30℃培养72小时；4℃离心收集上清，使用AKTA系统镍柱进行纯化并超滤到PBS溶液中。
实施例6 抗AAV的单域抗体的结合活性
将AAV5、AAV6、AAV7、AAV8以及AAV9病毒液分别采用CBS包被液稀释，加入100ul/孔至96孔酶标板中4℃抗原过夜；PBST清洗一遍，加入100ul/孔PBS(含2％BSA)37℃孵育1小时；加入100ul/孔的100ug/ml起始4倍稀释的候选抗体37℃孵育2小时；PBST清洗3次，加入HRP-抗HIS二抗(南京Genscript，货号2101K，003，1：4000稀释)，37℃孵育1小时，PBST清洗5次；加入100ul/孔TMB显色液显色后加入终止液，使用酶标仪450nm进行读数。将原始数据导入Graph-prism，计算EC50亲和力。
结果：如图2A-2E，3A-3E以及表5所示。
表5 驼源抗体评价结果汇总表
Figure BDA0003440811980000221
该结果表明，本发明的抗AAV的单域抗体对AAV具有合适的亲和力，并且对多种类型的AAV均能高效结合，具有优秀的广谱结合能力。
实施例7 抗AAV的单域抗体的酸碱耐受性测试
抗AAV抗体用于后期AAV病毒纯化需要经历碱性环境的清洗以及酸性环境的洗脱。因此，在本实施例中检测抗AAV的单域抗体的酸碱耐受性。
在分别调到PH9.8和PH3.0的缓冲液体系中，分别加入1mg/mL的抗AAV驼源抗体2-E5，取处理4小时和处理18小时的抗体，分别中和至中性环境，然后检测其与AAV5的结合能力。
采用CBS(PH9.6)稀释AAV5病毒液，4℃包被过夜；加入PBST洗一遍，洗脱后用PBS(含2％BSA)37℃封闭1小时；加入100ul/孔100ug/mL起始，4倍稀释的2-E5以及在PH9.8和PH3.0环境中处理过的抗体样品，37℃孵育2小时；PBST洗3次，加入HPR-抗HIS二抗(南京Genscript，货号2101K003，1：4000稀释)，37℃孵育1小时，采用PBST清洗5次；加入100ulTMB显色液(湖州英创)显色后加入终止液，使用酶标仪450nm进行读数。将数据导入Graph-prism计算EC50。
结果：如图4及表6所示，抗AAV驼源抗体2-E5在极端的酸碱条件(PH9.8和PH3.0环境)下，处理长达18小时后，仍能保持与未处理前基本相同的亲和力，证明其具有优秀的酸碱耐受性，可以用于后期工业化填料的应用。
表6 驼源抗体酸碱耐受性评价结果
Figure BDA0003440811980000231
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样结果。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围结果。
序列表
<110> 成都思柏沃生物技术有限公司
<120> 人腺相关病毒（AAV）单域抗体制备及其应用
<130> P2021-2928
<160> 35
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Asn Tyr Asp Met Ser
1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
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1 5 10 15
Gly
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Gly Arg Ile Phe Ser Asn Tyr Asp
1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Ile Asn Lys Tyr Gly Gly Arg Leu
1 5
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<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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1 5 10
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<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Glu Val Gln Val Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ile Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Asp Met Ser Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Phe Ile Asn Lys Tyr Gly Gly Arg Leu Tyr Tyr Ala Asp Pro Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Asp Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Asn Ala Asn Arg Arg Arg Ile Trp Gly Lys Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
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1 5
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<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Ala Ser Ser Arg Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Gly Arg Tyr Ser His Thr Arg His Tyr
1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr Ala
1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Ser Ser Arg Ser Gly Gly Ser Thr
1 5
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Asn Ala Gly Arg Tyr Ser His Thr Arg His Tyr
1 5 10
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Asp
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Ile
35 40 45
Ala Ala Ser Ser Arg Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Thr Lys Thr Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Asn Ala Gly Arg Tyr Ser His Thr Arg His Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Arg Val Thr Val Ser Ser
115
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
Asn Ser Asp Met Ala
1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Arg Ile Lys Asn Arg Trp Arg Trp Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala
1 5 10 15
Asp Ser Val Lys Gly
20
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
Ala Val Gly Pro Leu Val Arg Thr Tyr
1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
Gly Arg Thr Ile Ser Asn Ser Asp
1 5
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<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
Ile Lys Asn Arg Trp Arg Trp Ser Gly Gly Ser Thr
1 5 10
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
Thr Arg Ala Val Gly Pro Leu Val Arg Thr Tyr
1 5 10
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<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Ile Ser Asn Ser
20 25 30
Asp Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Arg Ile Lys Asn Arg Trp Arg Trp Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr
50 55 60
Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Glu
65 70 75 80
Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Val Glu Asp Thr Ala
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100 105 110
Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 22
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
Ser Ala Ala Met Ala
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
Phe Ile Ser Pro Ser Gly Gly Ser Thr Arg Tyr Thr Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
Arg Arg Phe Val Leu Ser Tyr
1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
Arg Trp Thr Phe Ser Ser Ala Ala
1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
Ile Ser Pro Ser Gly Gly Ser Thr
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
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1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Met Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg Trp Thr Phe Ser Ser Ala
20 25 30
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Phe Ile Ser Pro Ser Gly Gly Ser Thr Arg Tyr Thr Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Met Ser Ser Leu Ile Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Asn Ala Arg Arg Phe Val Leu Ser Tyr Trp Gly Lys Gly Ala Gln Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
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<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
Phe Ile Asn Lys Tyr Ser Gly Arg Leu Tyr Tyr Ala Asp Pro Val Lys
1 5 10 15
Gly
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Gly Arg Ile Phe Ser Asn Tyr Asp
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
Ile Asn Lys Tyr Ser Gly Arg Leu
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
Asn Ala Asn Arg Arg Arg Ile Trp Gly Lys Tyr Asp Tyr
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<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
Glu Val Gln Val Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Thr Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ile Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
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50 55 60
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65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Asp Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Asn Ala Asn Arg Arg Arg Ile Trp Gly Lys Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120

Claims (10)

1.一种抗腺相关病毒(AAV)的单域抗体，其特征在于，所述抗AAV的单域抗体的VHH链的互补决定区CDR选自下组：
(1)SEQ ID NO:1所示的CDR1、SEQ ID NO:2所示的CDR2、和SEQ ID NO:3所示的CDR33(Kabat编号系统)；
SEQ ID NO:4所示的CDR1、SEQ ID NO:5所示的CDR2、和SEQ ID NO:6所示的CDR3(IMGT编号系统)；
(2)SEQ ID NO:8所示的CDR1、SEQ ID NO:9所示的CDR2、和SEQ ID NO:10所示的CDR33(Kabat编号系统)；
SEQ ID NO:11所示的CDR1、SEQ ID NO:12所示的CDR2、和SEQ ID NO:13所示的CDR3(IMGT编号系统)；
(3)SEQ ID NO:15所示的CDR1、SEQ ID NO:16所示的CDR2、和SEQ ID NO:17所示的CDR33(Kabat编号系统)；
SEQ ID NO:18所示的CDR1、SEQ ID NO:19所示的CDR2、和SEQ ID NO:20所示的CDR3(IMGT编号系统)；
(4)SEQ ID NO:22所示的CDR1、SEQ ID NO:23所示的CDR2、和SEQ ID NO:24所示的CDR33(Kabat编号系统)；
SEQ ID NO:25所示的CDR1、SEQ ID NO:26所示的CDR2、和SEQ ID NO:27所示的CDR3(IMGT编号系统)；或
(5)SEQ ID NO:29所示的CDR1、SEQ ID NO:30所示的CDR2、和SEQ ID NO:31所示的CDR33(Kabat编号系统)；
SEQ ID NO:32所示的CDR1、SEQ ID NO:33所示的CDR2、和SEQ ID NO:34所示的CDR3(IMGT编号系统)。
2.如权利要求1所述的抗AAV单域抗体，其特征在于，所述的抗AAV的单域抗体的VHH链的氨基酸序列如SEQ ID NO:7、14、21、28或35所示。
3.如权利要求1所述的抗AAV单域抗体，其特征在于，所述的抗AAV的单域抗体为人源化抗体、骆驼源抗体、嵌合抗体。
4.一种抗AAV的抗体，所述抗体包括一个或多个如权利要求1所述的抗AAV的单域抗体的VHH链。
5.一种多核苷酸，所述多核苷酸编码选自下组的蛋白质：如权利要求1所述的抗AAV的单域抗体、或如权利要求2所述的抗体。
6.一种表达载体，所述表达载体含有如权利要求5所述的多核苷酸。
7.一种宿主细胞，所述宿主细胞含有如权利要求6所述的表达载体，或其基因组中整合有如权利要求5所述的多核苷酸。
8.一种产生抗AAV的单域抗体的方法，包括步骤：
(a)在适合产生单域抗体的条件下，培养如权利要求7所述的宿主细胞，从而获得含所述抗AAV的单域抗体的培养物；
(b)从所述培养物中分离和/或回收所述的抗AAV的单域抗体；和
(c)任选地，对步骤(b)获得的抗AAV的单域抗体进行纯化和/或修饰。
9.一种免疫偶联物，所述免疫偶联物含有：
(a)如权利要求1所述的抗AAV的单域抗体、或如权利要求2所述的抗AAV的抗体；和
(b)选自下组的偶联部分：可检测标记物、药物、细胞因子、放射性核素、酶、金纳米颗粒/纳米棒、纳米磁粒、病毒外壳蛋白或VLP，或其组合。
10.一种药物组合物，所述药物组合物含有：
(i)如权利要求1所述的抗AAV的单域抗体、如权利要求2所述的抗AAV的抗体，或如权利要求7所述的免疫偶联物；和
(ii)药学上可接受的载体。
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