KR20240041935A - 항-trop2 단일 도메인 항체 및 이의 응용 - Google Patents

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충 림 웡
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나노맵 테크놀로지 리미티드
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Abstract

본 발명은 항체 약물 기술분야에 관한 것이며, TROP2에 대한 특이적 단일 도메인 항체 코딩 서열 그룹 및 이의 응용을 제공한다. 본 발명에서 제공되는 항-TROP2 단일 도메인 항체는 TROP2 항원에 효과적으로 결합할 수 있어, 핵종 접합 약물, 항체 접합 약물 및 다중 특이적 항체 약물 등을 포함하는 TROP2을 표적으로 하는 약물의 개발을 위해 기반을 제공한다.

Description

항-TROP2 단일 도메인 항체 및 이의 응용
본 발명은 항체 분야에 관한 것으로, 구체적으로 TROP2에 대한 특이적 단일 도메인 항체 및 이의 코딩 서열과 질환 진단 및 치료에서의 응용에 관한 것이다.
영양막 세포 표면 항원 2(TROP2)는 표피 당단백질 1(EGP-1), 위장 종양 관련 항원(GA733-1), 표면 마커 1(M1S1), 종양 관련 칼슘 신호 변환자 2(TACSTD2)로도 알려져 있다. TROP2는 시스테인 풍부 도메인(CRD), 티로신 글로불린 1형 도메인(TY-1) 및 시스테인 결핍 도메인(CPD)을 포함하는 35kDa 단일 통과 막횡단 당단백질이다. TROP2는 주로 칼슘 신호 전달 경로, Wnt 신호 전달 경로, 세포 주기 단백질 발현을 조절하고 피브로넥틴 접착을 감소시켜 종양 세포의 성장, 증식 및 전이를 촉진한다.
연구에 따르면, TROP2는 유방암, 폐암, 위암, 췌장암, 자궁경부암, 전립선암, 결장암 등 종양을 포함한 다양한 상피암에서 모두 풍부하게 발현되며, 그 과발현은 불량한 예후 및 전이 위험 증가와 관련이 있는 것으로 나타났다. TROP2는 정상 조직에서 제한된 발현을 가지며, 잠재적인 치료 독성을 효과적으로 감소시킬수 있어 표적화 치료의 천연 후보 표적이 된다. TROP2를 표적으로 하는 항체, 항체 접합체 및 복합제 등 다양한 형태의 약물은 임상 개발 중에 있다(Zaman, 2019). 그 중, 인간화 항체 hRS7을 표적화 벡터로 이용하여 이리노테칸의 활성 대사산물인 SN38과 접합한 새로운 항체 접합 약물(ADC)인 트로델비(Trodelvy)(Sacituzumab govitecan)는 전이성 삼중음성유방암 및 전이성 요로상피세포암의 치료를 위해 FDA로부터 승인을 받았다. 그 중 3상 ASCENT 연구의 데이터에 따르면, 트로델비(Trodelvy)는 질환 진행 또는 사망 위험(무진행 생존 기간(PFS))을 57% 효과적으로 감소시켜 PFS 중앙값을 화학요법 후 1.7개월에서 4.8개월로 연장하였다(HR: 0.43; 95% 신뢰 구간: 0.35-0.54; p < 0.0001). 또한, 사망 위험을 49% 감소시키고, 전체 생존 기간(OS) 중앙값을 6.9개월에서 11.8개월로 연장하였다(HR: 0.51; 95% 신뢰 구간: 0.41-0.62; p < 0.0001)(Bardia, 2021). 이 밖에, RS7 항체 또는 항체 단편을 방사성 동위원소 Lu177로 표지된 TROP2 표적화 벡터로 이용하는 방사 면역 요법은 다양한 종양 세포주(Calu-3 및 B×PC-3)의 이종이식 모델에서 유의미한 특이적 항암 작용를 갖는다(Van Rij, 2014).
현재 시중에는 TROP2 표적에 대한 단일 도메인 항체 약물이 없으며, 단일 도메인 항체, 즉 낙타 중쇄 단일 도메인 항체 VHH(variable domain of heavy-chain antibody)는 현재 얻을 수 있는 완전한 기능을 가지고 안정적이며 항원에 결합할 수 있는 최소의 단위이다. 단일 도메인 항체의 분자량은 기존 항체의 1/10로, 높은 안정성, 우수한 수용성, 간단한 인간화, 높은 표적화, 강한 침투성 등 특성을 가지고 있다. 방사성 동위원소 표적화 벡터로서 단일 도메인 항체는 종양 조직에 신속하고 특이적으로 침투하여 표적에 결합할 수 있는 반면, 결합되지 않은 항체는 혈액에서 신속하게 제거되어 체내 방사성 용량을 감소시킬 수 있으며, 기존 항체에 비해 방사 면역 영상 및 방사 면역 요법을 개발하는 데 많은 분명한 장점이 있다(D’Huyvetter, 2014).
따라서, 본 분야에서는 항-TROP2 단일 도메인 항체, 특히 TROP2에 단일하고 효과적으로 결합할 수 있는 특이적 단일 도메인 항체를 개발하고 차세대 방사 면역 영상 및 방사 면역 요법을 개발할 필요가 있다.
본 발명의 목적은 우수한 TROP2 항원 결합 특성을 갖는 항-TROP2 단일 도메인 항체를 제공하는 것이다.
본 발명의 제1 양태는 항-TROP2 단일 도메인 항체 VHH 사슬의 상보성 결정 영역(CDR)을 제공하며, 상기 VHH 사슬의 상보성 결정 영역(CDR)은,
서열번호 17-23으로 표시되는 CDR1;
서열번호 24-29로 표시되는 CDR2; 및
서열번호 30-35로 표시되는 CDR3을 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 CDR1, CDR2 및 CDR3은 VHH 사슬의 프레임워크 영역 FR1, FR2, FR3 및 FR4에 의해 분리된다.
다른 바람직한 예에서, 상기 VHH 사슬의 상보성 결정 영역(CDR)은,
서열번호 17로 표시되는 CDR1;
서열번호 24로 표시되는 CDR2; 및
서열번호 30으로 표시되는 CDR3을 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 VHH 사슬의 상보성 결정 영역(CDR)은,
서열번호 20으로 표시되는 CDR1;
서열번호 27로 표시되는 CDR2; 및
서열번호 33으로 표시되는 CDR3을 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 VHH 사슬의 상보성 결정 영역(CDR)은,
서열번호 23으로 표시되는 CDR1;
서열번호 29로 표시되는 CDR2; 및
서열번호 35로 표시되는 CDR3을 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 VHH 사슬의 상보성 결정 영역(CDR)은 하기 그룹으로 이루어진 군으로터 선택되는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다.
본 발명의 제2 양태는 항-TROP2 단일 도메인 항체의 VHH 사슬을 제공하며, 상기 VHH 사슬은 프레임워크 영역(FR) 및 본 발명의 제1 양태에 따른 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 프레임워크 영역은,
(Z1) 서열번호 36으로 표시되는 FR1, 서열번호 43으로 표시되는 FR2, 서열번호 48로 표시되는 FR3, 및 서열번호 54로 표시되는 FR4로 구성된다.
다른 바람직한 예에서, 상기 프레임워크 영역은,
(Z2) 서열번호 39로 표시되는 FR1, 서열번호 45로 표시되는 FR2, 서열번호 51로 표시되는 FR3, 및 서열번호 54로 표시되는 FR4로 구성된다.
다른 바람직한 예에서, 상기 프레임워크 영역은,
(Z3) 서열번호 40으로 표시되는 FR1, 서열번호 44로 표시되는 FR2, 서열번호 53으로 표시되는 FR3, 및 서열번호 54로 표시되는 FR4로 구성된다.
다른 바람직한 예에서, 상기 프레임워크 영역은 하기 그룹으로 이루어진 군으로터 선택되는 FR1, FR2, FR3 및 FR4로 구성된다.
다른 바람직한 예에서, 상기 항-TROP2 단일 도메인 항체의 VHH 사슬은 서열번호 1-8 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 갖는다.
다른 바람직한 예에서, 상기 항-TROP2 단일 도메인 항체의 VHH 사슬은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는다.
다른 바람직한 예에서, 상기 항-TROP2 단일 도메인 항체의 VHH 사슬은 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 갖는다.
다른 바람직한 예에서, 상기 항-TROP2 단일 도메인 항체의 VHH 사슬은 서열번호 8로 표시되는 아미노산 서열을 갖는다.
본 발명의 제3 양태는 항-TROP2 단일 도메인 항체를 제공하며, 상기 단일 도메인 항체는 TROP2 단백질에 대한 단일 도메인 항체이고, 서열번호 1-8 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열의 VHH 사슬을 갖는다.
다른 바람직한 예에서, 상기 단일 도메인 항체는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 VHH 사슬을 갖는다.
다른 바람직한 예에서, 상기 단일 도메인 항체는 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열의 VHH 사슬을 갖는다.
다른 바람직한 예에서, 상기 단일 도메인 항체는 서열번호 8로 표시되는 아미노산 서열의 VHH 사슬을 갖는다.
본 발명의 제4 양태는 폴리뉴클레오티드를 제공하며, 상기 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 제1 양태에 따른 CDR 영역, 본 발명의 제2 양태에 따른 항-TROP2 단일 도메인 항체의 VHH 사슬 또는 본 발명의 제3 양태에 따른 항-TROP2 단일 도메인 항체로 이루어진 군으로터 선택되는 단백질을 코딩한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 9-16 중 어느 하나로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 갖는다.
다른 바람직한 예에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 DNA, cDNA 또는 RNA를 포함한다.
본 발명의 제5 양태는 본 발명의 제4 양태에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 제공한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 발현 벡터는 박테리아 플라스미드, 파지, 효모 플라스미드, 식물 세포 바이러스, 및 아데노바이러스, 레트로바이러스와 같은 포유동물 세포 바이러스, 또는 다른 벡터를 포함한다.
본 발명의 제6 양태는 본 발명의 제5 양태에 따른 발현 벡터를 포함하거나, 이의 게놈에 본 발명의 제4 양태에 따른 폴리뉴클레오티드가 통합되어 있는 숙주 세포를 제공한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 숙주 세포는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 숙주 세포는 대장균, 효모 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 제7 양태는,
(a) 단일 도메인 항체를 생성하기 적합한 조건에서, 본 발명의 제6 양태에 따른 숙주 세포를 배양하여 상기 항-TROP2 단일 도메인 항체를 포함하는 배양물을 얻는 단계; 및 (b) 상기 배양물로부터 상기 항-TROP2 단일 도메인 항체를 분리하거나 회수하는 단계를 포함하는 항-TROP2 단일 도메인 항체의 생성 방법을 제공한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 항-TROP2 단일 도메인 항체는 서열번호 1-8 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 갖는다.
본 발명의 제8 양태는,
(a) 본 발명의 제2 양태에 따른 항-TROP2 단일 도메인 항체의 VHH 사슬, 또는 본 발명의 제3 양태에 따른 항-TROP2 단일 도메인 항체; 및 (b) 검출 가능한 마커, 약물, 독소, 시토카인, 방사성 핵종 또는 효소로 이루어진 군으로터 선택되는 접합 부분을 포함하는 면역 접합체를 제공한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 접합 부분은 약물 또는 독소이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 접합 부분은 검출 가능한 마커이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 접합체는 형광 또는 발광 마커, 방사성 마커, MRI(자기 공명 영상) 또는 CT(전자 컴퓨터 X선 단층 촬영 기술) 조영제 또는 검출 가능한 생성물을 생성할 수 있는 효소, 방사성 핵종, 생물 독소, 시토카인(IL-2 등), 항체, 항체 Fc 단편, 항체 scFv 단편, 금 나노입자/나노막대, 바이러스 입자, 리포솜, 나노 자성 입자, 전구약물 활성화 효소(예를 들어, DT-디아포라제(DTD) 또는 바이페닐 가수분해효소 유사 단백질(BPHL)), 화학요법제(예를 들어, 시스플라틴) 또는 모든 형태의 나노입자 등으로부터 선택된다.
다른 바람직한 예에서, 상기 면역 접합체는 다가(예를 들어, 2가) 의 본 발명의 제2 양태에 따른 항-TROP2 단일 도메인 항체의 VHH 사슬, 본 발명의 제3 양태에 따른 항-TROP2 단일 도메인 항체를 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 다가는 상기 면역 접합체의 아미노산 서열에 복수의 반복된 본 발명의 제2 양태에 따른 항-TROP2 단일 도메인 항체의 VHH 사슬, 본 발명의 제3 양태에 따른 항-TROP2 단일 도메인 항체가 포함되는 것을 의미한다.
본 발명의 제9 양태는, (a) TROP2 분자의 검출을 위한 시약; 및 (b) 종양의 치료를 위한 약물을 제조하는 데 사용되는 것을 특징으로 하는 본 발명의 제2 양태에 따른 VHH 사슬, 본 발명의 제3 양태에 따른 항-TROP2 단일 도메인 항체, 또는 본 발명의 제8 양태에 따른 면역 접합체의 용도를 제공한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 검출은 유세포 분석 검출, 세포 면역 형광 검출을 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 종양은 TROP2 고발현 상피 종양이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 종양은 위암, 췌장암, 자궁경부암, 유방암, 폐암, 전립선암, 결장암, 유두상 장액성 자궁내막암, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 제10 양태는, (i) 본 발명의 제3 양태에 따른 단일 도메인 항체 또는 본 발명의 제8 양태에 따른 면역 접합체; 및 (ii) 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 약학적 조성물은 주사 제형이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 약학적 조성물은 종양을 치료하기 위한 약물을 제조하는 데 사용되며, 상기 종양은 위암, 췌장암, 자궁경부암, 유방암, 폐암, 전립선암, 결장암, 유두상 장액성 자궁내막암, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 제11 양태는,
(1) 샘플을 본 발명의 제3 양태에 따른 단일 도메인 항체 또는 본 발명 제8 양태의 면역 접합체와 접촉시키는 단계; 및
(2) 항원-항체 복합체가 형성되는지 여부를 검출하되, 복합체가 형성되면 샘플 중 TROP2 단백질이 존재한다는 것을 나타내는 단계를 포함하는 샘플 중 TROP2 단백질의 체외(진단적 및 비진단적) 검출 방법을 제공한다.
본 발명의 제12 양태는, 본 발명의 제3 양태에 따른 단일 도메인 항체, 본 발명의 제8 양태에 따른 면역 접합체, 또는 본 발명의 제10 양태에 따른 약학적 조성물을 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 종양의 치료 방법을 제공한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 종양은 TROP2 고발현 상피 종양이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 종양은 위암, 췌장암, 자궁경부암, 유방암, 폐암, 전립선암, 결장암, 유두상 장액성 자궁내막암, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 바람직한 예에서, 상기 대상은 인간 또는 비인간 포유동물을 포함한다.
본 발명의 범위 내에서 본 발명의 상기 각 기술특징과 아래(예를 들어, 실시예)에서 구체적으로 설명되는 각 기술특징은 서로 조합되어 새롭거나 바람직한 기술적 해결수단을 구성할 수 있음을 이해해야 할 것이다. 편폭의 제한으로, 여기서 더 이상 일일이 반복하지 않는다.
도 1은 인간 TROP2-Fc 단백질 항원의 검출 결과이다. 결과, SDS-PAGE에서 상기 단백질의 순도가 90% 이상에 도달하였다.
도 2는 2개의 항-TROP2 단일 도메인 항체 파지 디스플레이 라이브러리 구축 및 품질 검출 결과이다. 도 2의 A는 2개의 라이브러리의 1차 및 2차 PCR 증폭 산물의 PCR 동정 도면이고, 결과, 최종적으로 약 400bp 크기의 VHH 유전자 단편을 얻었으며; 도 2의 B는 2개의 라이브러리의 라이브러리 용량 검출 도면이고, 결과, 2개의 라이브러리의 라이브러리 용량은 각각 7.1×108 및 5.0×108 CFU이며; 도 2의 C는 2개의 라이브러리의 삽입률 검출 도면이고, 결과, 2개의 라이브러리의 VHH 삽입률은 각각 96% 및 88%이며; 도 D는 2개의 라이브러리의 농축 검출 도면이고, 결과, 2개의 라이브러리의 특이적 파지는 3라운드 선별 후에 각각 24배 및 150배 농축되었다.
도 3은 TROP2 양성 발현 BxPc3 세포에 대한 항-TROP2 단일 도메인 항체의 결합 활성의 유세포 분석 검출 결과이다. 결과, 8개의 단일 도메인 항체는 모두 BxPc3 세포 표면의 TROP2 단백질에 효과적으로 결합할 수 있었다.
본 발명자는 광범위하고 심층적인 연구와 대량의 선별을 통해 최초로 항-TROP2 단일 도메인 항체 그룹을 성공적으로 개발하였다. 실험 결과에 따르면, 본 발명에서 얻은 8개의 TROP2 단일 도메인 항체는 모두 인간 또는 원숭이의 TROP2 단백질에 높은 친화력으로 특이적 결합할 수 있다. 또한, 본 발명의 단일 도메인 항체는 서로 다른 TROP2 도메인에 결합할 수 있고, 적용 범위가 더욱 넓다.
구체적으로, 본 발명은 인간화 TROP2 세포외 세그먼트 항원 단백질을 이용하여 낙타를 면역화함으로써, 고품질의 면역 단일 도메인 항체 유전자 라이브러리를 얻었다. 그런 다음 TROP2 단백질 분자를 ELISA 플레이트에 접합하여, TROP2 단백질의 정확한 공간 구조를 디스플레이하며, 이러한 형태의 항원에 대해 파지 디스플레이 기술을 이용하여 면역 단일 도메인 항체 유전자 라이브러리(낙타 중쇄 항체 파지 디스플레이 유전자 라이브러리)를 선별함으로써, TROP2 특이적 단일 도메인 항체 유전자를 얻었다. 그런 다음 해당 유전자를 대장균에 전달하여 대장균에서 효율적으로 발현될 수 있으며 특이성이 높은 단일 도메인 항체 균주를 얻었다.
용어
본문에 사용된 바와 같이, 용어 "본 발명의 단일 도메인 항체”, "본 발명의 항-TROP2 단일 도메인 항체”, "본 발명의 TROP2 단일 도메인 항체”는 서로 교환하여 사용될 수 있고, 모두 TROP2(인간 TROP2 포함)를 특이적으로 인식하고 결합하는 단일 도메인 항체를 의미한다. 특히 바람직하게는, VHH 사슬의 아미노산 서열은 서열번호 1, 4, 8로 표시되는 단일 도메인 항체이고, 가장 바람직하게는, 서열번호 1로 표시되는 VHH 사슬을 갖는 단일 도메인 항체이다.
본문에 사용된 바와 같이, 용어 "단일 도메인 항체”, "VHH", "나노항체”(nanobody)는 동일한 의미를 가지고 서로 교환하여 사용될 수 있으며, 항체 중쇄의 가변 영역을 클로닝하여 단 하나의 중쇄 가변 영역으로 구성된 단일 도메인 항체(VHH)를 구축하는 것을 의미하며, 이는 완전한 기능을 가진 최소의 항원 결합 단편이다. 일반적으로 먼저 경쇄 및 중쇄 불변 영역 1(CH1)이 자연적으로 결실된 항체를 얻은 후, 다시 항체 중쇄의 가변 영역을 클로닝하여 단 하나의 중쇄 가변 영역으로 구성된 단일 도메인 항체(VHH)를 구축한다.
본문에 사용된 바와 같이, 용어 "항체” 또는 "면역글로불린”은 2개의 동일한 경쇄(L) 및 2개의 동일한 중쇄(H)로 구성된 동일한 구조적 특징을 갖는 약 150000 달톤의 이종사량체 당단백질이다. 각각의 경쇄는 공유 이황화 결합을 통해 중쇄에 연결되며, 상이한 면역글로불린 동형의 중쇄 사이의 이황화 결합의 수는 상이하다. 각각의 중쇄 및 경쇄에도 규칙적으로 간격을 둔 사슬 내 이황화 결합이 있다. 각각의 중쇄의 일단에는 가변 영역(VH)이 있고, 그 뒤에는 복수의 불변 영역이 있다. 각각의 경쇄의 일단에는 가변 영역(VL)이 있고 타단에는 불변 영역이 있으며; 경쇄의 불변 영역과 중쇄의 첫 번째 불변 영역은 상대적이고, 경쇄의 가변 영역과 중쇄의 가변 영역은 상대적이다. 특수한 아미노산 잔기는 경쇄와 중쇄의 가변 영역 사이에 경계면을 형성한다.
본문에 사용된 바와 같이, 용어 "가변”은 항체 중 가변 영역의 일부 부분이 서열에서 다소 상이한 것을 나타내며, 이는 특정 항원에 대한 다양한 특정 항체의 결합 및 특이성을 형성한다. 그러나, 가변성은 전체 항체 가변 영역에 균일하게 분포되지 않는다. 이는 경쇄와 중쇄 가변 영역에서 상보성 결정 영역(CDR) 또는 초가변 영역으로 지칭되는 3개의 단편에 집중되어 있다. 가변 영역에서 비교적 보존적인 부분은 프레임워크 영역(FR)으로 지칭된다. 천연 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 각각에는 4개의 FR 영역이 포함되며, 이들은 대략적으로 β-병풍 구조를 나타내고, 연결 고리를 형성하는 3개의 CDR에 의해 연결되며, 일부 경우에 부분적인 β-병풍 구조를 형성할 수 있다. 각각의 사슬 중의 CDR은 FR 영역을 통해 밀접하게 결합되어 있으며 다른 사슬의 CDR와 함께 항체의 항원 결합 부위를 형성한다(Kabat 등, NIH Publ. No. 91-3242, Vol. I, 647-669 페이지(1991) 참조바람). 불변 영역은 항체와 항원의 결합에 직접 참여하지 않지만, 이들은 상이한 효과기 기능을 나타내며, 예를 들어, 항체의 항체 의존적 세포 독성에 참여한다.
본문에 사용된 바와 같이, 용어 "중쇄 가변 영역”과 “VH"는 서로 교환하여 사용될 수 있다.
본문에 사용된 바와 같이, 용어 "가변 영역”과 “상보성 결정 영역(Complementarity Determining Region, CDR)"은 서로 교환하여 사용될 수 있다.
본 발명의 바람직한 일 실시형태에서, 상기 항체의 중쇄 가변 영역은 3개의 상보성 결정 영역 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함한다.
본 발명의 바람직한 일 실시형태에서, 상기 항체의 중쇄는 상기 중쇄 가변 영역 및 중쇄 불변 영역을 포함한다.
본 발명에서, 용어 "본 발명의 항체”, "본 발명의 단백질”, 또는 “본 발명의 폴리펩티드”는 서로 교환하여 사용될 수 있고, 모두 TROP2 단백질에 특이적 결합하는 폴리펩티드를 의미하며, 예를 들어 중쇄 가변 영역을 갖는 단백질 또는 폴리펩티드이다. 이들은 개시 메티오닌을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다.
본 발명은 본 발명의 항체를 갖는 다른 단백질 또는 융합 발현 산물을 더 제공한다. 구체적으로, 본 발명은 가변 영역을 포함하는 중쇄를 갖는 임의의 단백질 또는 단백질 접합체 및 융합 발현 산물(즉 면역 접합체 및 융합 발현 산물)을 포함하며, 상기 가변 영역은 본 발명의 항체의 중쇄 가변 영역과 동일하거나 적어도 90% 상동성, 바람직하게는 적어도 95% 상동성을 가지기만 하면 된다.
일반적으로, 항체의 항원 결합 특성은 중쇄 가변 영역에 위치한 3개의 특정 영역으로 설명할 수 있으며, 가변 영역(CDR)으로 지칭되는 이 부분을 4개의 프레임워크 영역(FR)으로 나누고, 4개의 FR의 아미노산 서열은 상대적으로 비교적 보존적이며, 결합 반응에 직접 참여하지 않는다. 이러한 CDR은 고리형 구조를 형성하고, 그 사이의 FR에 의해 형성된 β-병풍은 공간 구조에서 서로 가까우며, 중쇄의 CDR과 대응하는 경쇄의 CDR은 항체의 항원 결합 부위을 구성한다. 동일한 유형의 항체의 아미노산 서열을 비교하여 FR 또는 CDR 영역을 구성한 아미노산을 결정할 수 있다.
본 발명의 항체의 중쇄의 가변 영역은 이들 중 적어도 일부가 결합 항원에 관여되므로 특히 관심을 가지게 된다. 따라서, 본 발명은 CDR이 여기에서 동정된 CDR과 90% 이상(바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상)의 상동성을 갖는 한, CDR을 갖는 항체 중쇄 가변 영역을 갖는 분자를 포함한다.
본 발명은 완전한 항체를 포함할 뿐만 아니라, 면역 활성을 갖는 항체의 단편 또는 항체와 다른 서열로 형성된 융합 단백질을 더 포함한다. 따라서, 본 발명은 상기 항체의 단편, 유도체 및 유사체를 더 포함한다.
본문에 사용된 바와 같이, 용어 "단편”, "유도체” 및 "유사체”는 기본적으로 본 발명의 항체와 동일한 생물학적 기능 또는 활성을 유지하는 폴리펩티드를 의미한다. 본 발명의 폴리펩티드 단편, 유도체 또는 유사체는 (i) 하나 이상의 보존적 또는 비보존적 아미노산 잔기(바람직하게는, 보존적 아미노산 잔기)가 치환된 폴리펩티드일 수 있고, 이러한 치환된 아미노산 잔기는 유전자 코드에 의해 코딩되거나 코딩되지 않은 것일 수도 있으며, 또는 (ii) 하나 이상의 아미노산 잔기에 치환기가 있는 폴리펩티드, 또는 (iii) 성숙한 폴리펩티드와 다른 화합물(예를 들어, 폴리에틸렌글리콜과 같은 폴리펩티드의 반감기를 연장시키는 화합물)의 융합에 의해 형성된 폴리펩티드, 또는 (iv) 부가적인 아미노산 서열을 해당 폴리펩티드 서열에 융합하여 형성된 폴리펩티드(예를 들어, 리더 서열 또는 분비 서열 또는 해당 폴리펩티드를 정제하기 위한 서열 또는 단백질 서열, 또는 6His 태그와 형성된 융합 단백질)일 수 있다. 본문의 교시에 따르면, 이러한 단편, 유도체 및 유사체는 당업자에게 공지된 범위에 속한다.
본 발명의 항체는 TROP2 단백질 결합 활성을 가지며, 상기 CDR 영역을 포함하는 폴리펩티드를 의미한다. 상기 용어는 본 발명의 항체와 동일한 기능을 가지며, 상기 CDR 영역을 포함하는 폴리펩티드의 변이 형태를 더 포함한다. 이러한 변이 형태는 하나 이상의 아미노산의 결실, 삽입 및/또는 치환, 및 C-말단 및/또는 N-말단에 대한 하나 이상의 아미노산의 추가를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 예를 들어, 본 분야에서, 성능이 비슷하거나 유사한 아미노산으로 치환할 경우, 일반적으로 단백질의 기능은 변경되지 않는다. 다른 예를 들어, C-말단 및/또는 N-말단에 하나 이상의 아미노산을 추가하여도 단백질의 기능은 일반적으로 변경되지 않는다. 상기 용어는 본 발명의 항체의 활성 단편 및 활성 유도체를 더 포함한다.
상기 폴리펩티드의 변이 형태는 상동성 서열, 보존적 변이체, 대립유전자 변이체, 천연 돌연변이체, 유도 돌연변이체, 높거나 낮은 엄격도 조건에서 본 발명의 항체의 코딩 DNA와 혼성화될 수 있는 DNA에 의해 코딩된 단백질 및 본 발명의 항체에 대한 항혈청을 이용하여 얻은 폴리펩티드 또는 단백질을 포함한다.
본 발명은 단일 도메인 항체 또는 이의 단편을 포함하는 융합 단백질과 같은 다른 폴리펩티드를 더 제공한다. 거의 전장의 폴리펩티드 외에도, 본 발명은 본 발명의 단일 도메인 항체의 단편을 더 포함한다. 일반적으로, 상기 단편은 본 발명의 항체의 적어도 약 50개의 연속 아미노산, 바람직하게는 적어도 약 50개의 연속 아미노산, 보다 바람직하게는 적어도 약 80개의 연속 아미노산, 가장 바람직하게는 적어도 약 100개의 연속 아미노산을 갖는다.
본 발명에서, "본 발명의 항체의 보존적 변이체”는 본 발명의 항체의 아미노산 서열에 비해, 최대 10개, 바람직하게는 최대 8개, 보다 바람직하게는 최대 5개, 가장 바람직하게는 최대 3개의 아미노산이 성질이 유사하거나 비슷한 아미노산에 의해 대체되어 형성된 폴리펩티드를 의미한다. 이러한 보존적 변이 폴리펩티드는 표 A에 따른 아미노산 대체에 의해 생성되는 것이 바람직하다.
표 A
본 발명은 상기 항체 또는 이의 단편 또는 이의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 분자를 더 제공한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 DNA 형태 또는 RNA 형태일 수 있다. DNA 형태는 cDNA, 게놈 DNA 또는 인공 합성 DNA를 포함한다. DNA는 단일 사슬 또는 이중 사슬일 수 있다. DNA는 코딩 사슬 또는 비코딩 사슬일 수 있다.
본 발명의 성숙한 폴리펩티드을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 성숙한 폴리펩티드만 코딩하는 코딩 서열; 성숙한 폴리펩티드의 코딩 서열 및 다양한 부가적인 코딩 서열; 성숙한 폴리펩티드의 코딩 서열(및 선택적인 부가적인 코딩 서열) 및 비코딩 서열을 포함한다.
용어 "폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드”는 해당 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것일 수도 있고, 부가적인 코딩 및/또는 비코딩 서열을 더 포함하는 폴리뉴클레오티드일 수도 있다.
본 발명은 또한 상기 서열과 혼성화되고 2개의 서열 사이에 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 70%, 보다 바람직하게는 적어도 80%의 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 본 발명은 특히 엄격한 조건에서 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드와 혼성화될 수 있는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 본 발명에서, "엄격한 조건”은 (1) 0.2ХSSC, 0.1% SDS, 60℃와 같은 비교적 낮은 이온 강도 및 비교적 높은 온도에서 혼성화 및 용출; 또는 (2) 혼성화할 때 50%(v/v) 포름아미드, 0.1% 송아지 혈청/0.1% Ficoll, 42℃ 등과 같은 변성제의 첨가; 또는 (3) 두 서열 사이의 동일성이 적어도 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상일 때에만 혼성화가 발생하는 것을 의미한다. 또한, 혼성화될 수 있는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 폴리펩티드는 성숙한 폴리펩티드와 동일한 생물학적 기능 및 활성을 갖는다.
본 발명의 항체의 뉴클레오티드 전장 서열 또는 이의 단편은 일반적으로 PCR 증폭법, 재조합법 또는 인공 합성 방법으로 얻을 수 있다. 실행 가능한 방법은 특히 단편 길이가 비교적 짧을 경우 인공 합성 방법에 의해 관련 서열을 합성하는 것이다. 일반적으로, 먼저 복수의 작은 단편을 합성한 다음 연결하여 서열이 매우 긴 단편을 얻을 수 있다. 이 밖에, 중쇄의 코딩 서열 및 발현 태그(예를 들어, 6His)를 함께 융합하여 융합 단백질을 형성할 수 있다.
일단 관련 서열을 얻으면 재조합법으로 관련 서열을 일괄적으로 얻을 수 있다. 일반적으로 이를 벡터로 클로닝한 후 세포에 형질전환한 다음 통상적인 방법으로 증식된 숙주 세포로부터 관련 서열을 분리하여 얻는 것이다. 본 발명에 관여되는 생물 분자(핵산, 단백질 등)는 분리된 형태로 존재하는 생물 분자를 포함한다.
현재, 본 발명의 단백질(또는 이의 단편, 또는 이의 유도체)을 코딩하는 DNA 서열은 화학 합성을 통해 완전히 얻을 수 있다. 그런 다음 상기 DNA 서열을 본 분야에 공지된 다양한 기존의 DNA 분자(또는 예를 들어 벡터)와 세포에 도입할 수 있다. 이 밖에, 화학 합성을 통해 돌연변이를 본 발명의 단백질 서열에 도입할 수도 있다.
본 발명은 또한 상기 적절한 DNA 서열 및 적절한 프로모터 또는 제어 서열을 포함하는 벡터에 관한 것이다. 이러한 벡터는 적절한 숙주 세포를 형질전환하여 단백질을 발현할 수 있도록 한다.
숙주 세포는 박테리아 세포와 같은 원핵 세포; 또는 효모 세포와 같은 하등 진핵 세포; 또는 포유동물 세포와 같은 고등 진핵 세포일 수 있다. 대표적인 예로는 대장균, 스트렙토미세스; 살모넬라 티피무리움과 같은 박테리아 세포; 효모와 같은 진균 세포; 초파리 S2 또는 Sf9와 같은 곤충 세포; CHO, COS7, 293 세포와 같은 동물 세포 등이 있다.
재조합 DNA에 의한 숙주 세포의 형질전환은 당업자에게 알려진 일반 기술을 사용하여 수행될 수 있다. 숙주가 대장균과 같은 원핵 생물인 경우, DNA를 흡수할 수 있는 수용성 세포는 지수 성장기 후에 수확될 수 있고 CaCl2 방법으로 처리하며, 당업계에 잘 알려진 단계를 사용한다. 다른 방법은 MgCl2를 사용하는 것이다. 필요하면, 형질전환은 전기천공법으로도 수행될 수 있다. 숙주가 진핵 생물인 경우 인산칼슘 공침법, 일반 기계적 방법(예를 들어, 미세주입, 전기천공), 리포솜 포장 등과 같은 DNA 형질전염 방법을 사용할 수 있다.
얻은 형질전환체는 통상적인 방법으로 배양할 수 있고, 본 발명의 유전자에 의해 코딩된 폴리펩티드를 발현한다. 사용되는 숙주 세포에 따라 배양에 사용되는 배지는 다양한 일반 배지로부터 선택될 수 있다. 숙주 세포가 성장하기에 적합한 조건에서 배양한다. 숙주 세포가 적절한 세포 밀도로 성장한 후, 적합한 방법(예를 들어, 온도 전환 또는 화학적 유도)으로 선택된 프로모터를 유도하고 세포를 일정한 시간 동안 더 배양한다.
상기 방법에서 재조합 폴리펩티드는 세포내 또는 세포막에서 발현되거나, 세포외로 분비될 수 있다. 필요하면, 이의 물리적, 화학적 및 다른 특성을 이용하여 다양한 분리 방법으로 재조합 단백질을 분리하고 정제할 수 있다. 이러한 방법은 당업자에게 알려져 있다. 이러한 방법의 예는 일반 재생 처리, 단백질 침전제를 이용한 처리(염석법), 원심분리, 삼투압 파괴, 초처리, 초원심분리, 분자체 크로마토그래피(겔 여과), 흡착 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 고성능 액상 크로마토그래피(HPLC) 및 다른 다양한 액체 크로마토그래피 기술 및 이러한 방법의 조합을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 항체는 단독으로 사용되거나 검출 가능한 마커(진단 목적용), 치료제, PK(단백질 키나아제) 변형 부분 또는 이러한 물질들의 임의의 조합과 결합되거나 접합될 수도 있다.
진단 목적을 위한 검출 가능한 마커는 형광 또는 발광 마커, 방사성 마커, MRI(자기 공명 영상) 또는 CT(전자 컴퓨터 X선 단층 촬영 기술) 조영제 또는 검출 가능한 생성물을 생성할 수 있는 효소를 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 항체에 결합되거나 접합될 수 있는 치료제는 1. 방사성 핵종; 2. 생물 독소; 3. IL-2 등과 같은 시토카인; 4. 금 나노입자/나노막대; 5. 바이러스 입자; 6. 리포솜; 7. 나노 자성 입자; 8. 전구약물 활성화 효소(예를 들어, DT-디아포라제(DTD) 또는 바이페닐 가수분해효소 유사 단백질(BPHL)); 9. 치료제(예를 들어, 시스플라틴) 또는 모든 형태의 나노입자 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
약학적 조성물
본 발명은 조성물을 더 제공한다. 바람직하게는, 상기 조성물은 약학적 조성물로, 상기 항체 또는 이의 활성 단편 또는 이의 융합 단백질 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다. 일반적으로, 이러한 물질을 무독성, 불활성 및 약학적으로 허용 가능한 수성 담체 매질로 조제할 수 있으며, 여기서 pH는 일반적으로 약 5-8이고, 바람직하게는 pH는 약 6-8이며, pH값은 조제 물질의 성질 및 치료할 병증에 따라 변화될 수 있다. 조제된 약학적 조성물은 일반 경로를 통해 투여될 수 있으며, 여기서 종양내, 복강내, 정맥내, 또는 국소 투여가 포함되지만 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 약학적 조성물은 TROP2 단백질 분자의 결합에 직접적으로 사용될 수 있으므로, 종양의 치료에 사용될 수 있다. 이 밖에, 다른 치료제도 동시에 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 안전 유효량(예를 들어, 0.001-99wt%, 바람직하게는 0.01-90wt%, 보다 바람직하게는 0.1-80wt%)의 본 발명에 따른 단일 도메인 항체(또는 이의 접합체) 및 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 포함한다. 이러한 담체는 염수, 완충액, 포도당, 물, 글리세롤, 에탄올, 및 이들의 조합을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 약물 제형은 투여 방식과 일치해야 한다. 본 발명의 약학적 조성물은 주사제 형태로 제조될 수 있으며, 예를 들어 생리식염수 또는 포도당 및 다른 보조제를 포함하는 수용액을 사용하여 통상적인 방법으로 제조될 수 있다. 주사제, 용액과 같은 약학적 조성물은 멸균 조건에서 제조되어야 한다. 활성 성분의 투여량은 치료 유효량으로서, 예를 들어 1일 약 10μg/kg 체중 내지 약 50mg/kg 체중이다. 이 밖에, 본 발명의 폴리펩티드는 다른 치료제와 함께 사용될 수도 있다.
약학적 조성물을 사용할 경우, 안전 유효량의 면역 접합체를 포유동물에게 투여하며, 여기서 상기 안전 유효량은 일반적으로 적어도 약 10μg/kg 체중이고, 대부분의 경우 약 50mg/kg 체중을 초과하지 않으며, 바람직하게는 상기 투여량은 약 10μg/kg 체중 내지 약 10mg/kg 체중이다. 물론, 구체적인 투여량은 투여 경로, 환자 건강 상황 등 요소를 고려해야 하며, 이는 모두 숙련된 의사의 기술 범위 내에 있다.
표지된 단일 도메인 항체
본 발명의 바람직한 일 예에서, 상기 단일 도메인 항체는 검출 가능한 마커를 갖는다. 보다 바람직하게는, 상기 마커는 동위원소, 콜로이드 금 마커, 착색 마커 또는 형광 마커로 이루어진 군으로부터 선택된다.
콜로이드 금 표지는 당업자에게 공지된 방법으로 수행될 수 있다. 본 발명의 바람직한 일 해결수단에서, 항-TROP2의 단일 도메인 항체를 콜로이드 금으로 표지하여 콜로이드 금으로 표지된 단일 도메인 항체를 얻는다. 본 발명의 바람직한 다른 해결수단에서, 항-TROP2 의 단일 도메인 항체를 방사성 동위원소로 표지하여 동위원소로 표지된 단일 도메인 항체를 얻는다.
본 발명의 항-TROP2 단일 도메인 항체는 우수한 특이성과 높은 역가를 갖는다.
검출 방법
본 발명은 또한 TROP2 단백질 검출 방법에 관한 것이다. 상기 방법의 단계는 대략 다음과 같다. 세포 및/또는 조직 샘플을 얻고; 샘플을 매질에 용해시키며; 상기 용해된 샘플에서 TROP2 단백질의 수준을 검출한다.
본 발명의 검출 방법에서, 사용되는 샘플은 특별히 제한되지 않으며, 대표적인 예로는 세포 보존액에 존재하는 세포 함유 샘플이다.
키트
본 발명은 본 발명의 항체(또는 이의 단편) 또는 검출 플레이트를 포함하는 키트를 더 제공하며, 본 발명의 바람직한 일 예에서, 상기 키트는 용기, 사용 설명서, 완충제 등을 더 포함한다.
본 발명은 TROP2 수준을 검출하기 위한 검출 키트를 더 제공하며, 상기 키트는 TROP2 단백질을 인식하는 항체, 샘플을 용해하기 위한 용해 매질, 검출에 필요한 일반 시약 및 완충액, 예를 들어 다양한 완충액, 검출 마커, 검출 기질 등을 포함한다. 상기 검출 키트는 체외 진단 장치일 수 있다.
응용
상술한 바와 같이, 본 발명의 단일 도메인 항체는 광범위한 생물학적 및 임상적 응용 가치를 가지며, 그 응용은 TROP2 관련 질환의 진단 및 치료, 기초 의학 연구, 생물학적 연구 등 여러 분야에 관여된다. 바람직한 일 응용은 TROP2에 대한 임상 진단 및 표적 치료이다.
본 발명은 종양의 진단 및 치료에서 항-TROP2 단일 도메인 항체의 응용을 제공하며, 상기 종양은 TROP2의 발현이 비정상적으로 높은(mRNA 및/또는 단백질 수준을 포함) 상피 종양이고, 구체적으로, 상기 종양은 위암, 췌장암, 자궁경부암, 유방암, 폐암, 전립선암, 결장암, 유두상 장액성 자궁내막암 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 주요 장점은 다음을 포함한다.
(a) 본 발명은 최초로 TROP2 표적에 대한 단일 도메인 항체를 개발하였다.
(b) 본 발명의 단일 도메인 항체는 TROP2 단백질에 대한 결합 친화력이 높다.
(c) 본 발명의 단일 도메인 항체는 상이한 표적에 결합할 수 있고 3개의 상이한 TROP2 도메인에 결합할 수 있다.
(d) 본 발명의 단일 도메인 항체는 우수한 특이성을 가지며, 인간 및 붉은털 원숭이의 TROP에만 결합한다.
(e) 본 발명의 단일 도메인 항체는 TROP2 고발현 종양 모델에서 효과적으로 축적될 수 있으며, TROP2 표적화 암 진단 및 효능 평가에 적용될 수 있을 뿐만 아니라 차세대 TROP2 표적화 치료의 개발에 사용될 수 있다.
(f) 본 발명의 단일 도메인 항체의 제조 방법은 간단하고, 대량 생산에 용이하다.
아래에서는 구체적인 실시예를 결합하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 이러한 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위를 한정하려는 것이 아님을 이해해야 한다. 아래 실시예에서 상세한 조건을 명시하지 않은 실험 방법은 일반적으로 미국 Sambrook. J 등 《분자 클로닝 실험실 가이드》(Huang Peitang 등 번역, 베이징: 과학 출판사, 2002년)에 따른 조건과 같은 통상적인 조건, 또는 제조업체에서 권장하는 조건을 따른다. 달리 설명되지 않는 한, 백분율과 분량은 중량에 따라 계산한다. 이하 실시예에서 사용되는 실험 재료와 시약은 특별히 설명되지 않는 한 모두 상업적인 출처에서 얻을 수 있다.
실시예 1: 인간 TROP2-Fc 단백질 항원의 발현
포유동물 세포 HEK293F를 이용한 인간 TROP2 세포외 세그먼트 단백질의 일시적인 발현: 인간 TROP2 세포외 세그먼트 유전자를 FUSE-IgG 재조합 플라스미드에 클로닝하고, 형질감염 시약 PEI 1:3과 혼합한 후 HEK293F 세포에 형질감염시키며; 37℃, 6% CO2의 조건에서 쉐이커 인큐베이터에서 6일 동안 배양한 후; 세포 상청액을 수집하고, Protein A 비드와 실온에서 1시간 동안 결합한 다음; pH 7.0 인산염 완충액으로 비드를 세척한 후, pH 3.0 글리신 용액 0.1M으로 단백질을 용출한 다음; 용출된 단백질을 PBS용액에 한외여과하여, 수율을 측정한 후 SDS-PAGE 검출을 위해 샘플을 채취한다.
검출 결과는 도 1에 도시된 바와 같고, TROP2-Fc 단백질 항원의 순도는 90% 이상이며, 낙타 면역화 및 항체 선별에 사용될 수 있다.
실시예 2: 인간 TROP2 세포외 세그먼트 단백질 면역 라이브러리의 구축 및 선별
정제된 TROP2-Fc 단백질로 신장 쌍봉낙타 2마리를 면역화하고, 7회 면역화 후 낙타 말초혈액에서 전체 RNA를 분리한 후, 역전사 및 PCR를 통해 VHH 유전자를 증폭시키고(도 2의 A), 그런 다음 VHH 유전자를 파지 벡터 pMECS에 클로닝하고, TG1 숙주 세포에 형질전환시켜 파지 디스플레이 라이브러리를 구축하였다. 구축된 2개의 라이브러리가 구배 희석된 후 플레이팅하여 라이브러리 용량를 측정하는 동시에 구축된 각각의 라이브러리에서 24개의 클론을 무작위로 선택하여 콜로니 PCR 검출을 수행하였다.
결과, 구축된 2개의 라이브러리의 라이브러리 용량은 각각 7.1×108 및 5.0×108 CFU(도 2의 B)이고, 라이브러리 삽입률은 91.6%로 각각 96% 및 88%(도 2의 C)이다.
그 후 파지 디스플레이 기술을 이용하여 "흡착-세척-농축”을 3라운드 수행하였으며, 최종적으로 2개의 라이브러리의 특이적 파지가 각각 24배 및 150배 농축에 도달하였다(도 2의 D). 상기 농축된 파지 클론에서 600개를 무작위로 선택하여 인간 TROP2-Fc에 대한 PE-ELISA 동정을 수행함으로써 얻은 모든 양성 클론(비율＞3)에 대해 시퀀싱 동정을 수행하였으며, 서열이 상이한 모든 단일 도메인 항체(101개)를 후보 대상으로 하였다.
실시예 3: 항-TROP2 단일 도메인 항체의 발현 및 정제
실시예 2에서 시퀀싱 분석을 통해 얻은 항체 클론에서 48개를 선택하고, 각 플라스미드를 대장균 WK6에 전기 도입하여 LA+ 포도당 배양 플레이트에 도말한 후, 37℃에서 밤새 동안 배양하고; 단일 콜로니를 선택하여 암피실린이 포함된 LB 배양액 5mL에 접종하고, 37℃의 쉐이커에서 밤새 동안 배양하였으며; 330mL의 TB 배양액에 하룻밤을 경과한 균주 1mL를 접종한 후 37℃의 쉐이커에서 배양하고, OD 0.6-1로 배양될 경우, IPTG를 첨가하여, 28℃의 쉐이커에서 밤새 동안 배양하였으며; 원심분리하여 균주를 수집하고, 삼투법을 이용하여 조항체 추출액을 얻은 후; 니켈 컬럼 이온 친화성 크로마토그래피를 통해 정제된 단일 도메인 항체를 제조하였다.
검출을 통해 발현 및 정제된 단일 도메인 항체의 순도는 90% 이상으로, 후보 기능 활성 연구에 사용되였으며, 최종적으로 아래 8개의 리드 단일 도메인 항체를 얻었다.
표 1 TROP2 단일 도메인 항체 서열번호
8개의 단일 도메인 항체의 서열은 다음과 같으며, 3개의 CDR 영역에는 각각 밑줄이 그어져 있다.
서열번호 1
QVQLQESGGGSVLAGGSLRLSCTVSGSFVSSRSMAWFRQTPGKEREGVAAISQYGDPKYAGSVKGRFTMSRDNAKNTLLLQMNSLKPEDTAIYYCAAGEAWELATLSRSDYIYWGQGTQVTVSS
서열번호 2
QVQLQESGGGSVQAGGSLRLSCVVSGYTTTRYSMAWFRQAPGKEREGVAGIDTDVLTTYKPSVEGRFTISRDSAKRTLYLQMNSLKPEDTAMYYCATGTGNFLALDPVWYNTWGQGTQVTVSS
서열번호 3
QVQLQESGGGSVQAGGSLRLSCAVSGLTSSTTCMGWFRQAPGKEREGVAVIRSSGETTAADSVKGRFTISRDNAKNTLSLQMTSLKPEDTAMYYCAAAWPYSGCLLPLSSGDFTYWGQGTQVTVSS
서열번호 4
QVQLQESGGGSVQAGGSLKLSCVVSGYTVSSVCMAWFRQAPGMERELVAGFYHSGGTYYGDSVKGRFTASQDNAKNTLYLQMNSLKPEDTATYYCARARYPSSACGTSPSNYNIWGQGTQVTVSS
서열번호 5
QVQLQESGGGSVQAGGSLRLSCAASGFSVSTTWMHWVRQAPGKGLEWVSRIAINDHTFYAESVKGRFTMSTDNAKNTVYLQMTSLKPEDTAVYYCSPYSDYRIRGQGTQVTVSS
서열번호 6
QVQLQESGGGSVQPGGSLRLSCVVSGYTVSSVCMAWFRQAPGMERELVAGFYHSGGTYYGDSVKGRFTASQDNAKNTLYLQMNSLKPEDTATYYCARARYPSSACGTSPSNYNIWGQGTQVTVSS
서열번호 7
QVQLQESGGGSVQPGGSLRLSCVASGYTASSVCMAWFRQAPGKERELVAGYYHSGGTYYGDSVKGRFTASQDNAKNTLYLQMNSLKPEDTATYYCARARYPSSACGTSPSNYNIWGQGTQVTVSS
서열번호 8
QVQLQESGGGSVQAGGSLRLSCAASGFPYSSYSMGWFRQAPGKEREGVAAIYTGGGSTYYAGSVKGRFTISQEHATNTLYLQMNSLKPEDTAMYYCAANMVDNGVISGIQALGVRYYNYWGQGTQVTVSS
서열번호 9
CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGAGGAGGCTCGGTGCTGGCTGGAGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTACAGTCTCTGGATCGTTCGTCAGCAGCCGCTCCATGGCCTGGTTCCGCCAGACTCCAGGGAAGGAGCGCGAGGGGGTCGCAGCTATTTCTCAGTATGGGGACCCAAAGTACGCAGGCTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATGTCTCGAGACAACGCCAAGAACACTCTCTTGCTACAAATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACTGCCATCTACTACTGTGCGGCAGGCGAGGCTTGGGAGTTGGCTACGTTGTCCAGGAGCGACTATATCTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA
서열번호 10
CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGGGGAGGCTCGGTGCAGGCTGGAGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGTAGTCTCTGGATACACCACCACCCGGTACTCCATGGCTTGGTTCCGCCAGGCTCCTGGGAAGGAGCGCGAGGGGGTCGCAGGTATTGATACTGATGTTCTTACAACCTACAAACCGTCTGTTGAGGGCCGATTCACCATCTCCCGAGACAGCGCCAAGAGAACTCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACTGCCATGTACTACTGTGCGACAGGGACTGGAAATTTCTTGGCACTGGATCCGGTCTGGTATAATACCTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA
서열번호 11
CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGGGGAGGCTCGGTGCAGGCTGGAGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGTCTCTGGACTCACCAGCAGTACCACCTGCATGGGCTGGTTCCGACAGGCTCCAGGGAAGGAGCGCGAGGGGGTCGCAGTTATTAGAAGTTCTGGTGAGACAACCGCCGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCCGAGACAACGCCAAGAACACTCTGTCTTTGCAAATGACCAGCCTGAAACCTGAGGACACTGCCATGTACTACTGTGCGGCAGCGTGGCCGTATAGTGGTTGCCTACTCCCCCTGTCGTCGGGGGACTTTACTTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA
서열번호 12
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서열번호 13
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서열번호 14
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서열번호 15
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서열번호 16
CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGAGGAGGCTCGGTGCAGGCTGGAGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTTCCCTACAGTAGCTACTCGATGGGCTGGTTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGAGCGCGAGGGGGTCGCAGCTATTTATACTGGTGGTGGTAGCACATACTATGCCGGCTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCCAAGAGCACGCCACGAACACACTGTATCTGCAGATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACTGCCATGTACTACTGTGCGGCAAATATGGTAGATAACGGCGTTATCTCTGGTATTCAGGCTCTTGGTGTTAGGTACTATAACTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA
실시예 4: 항-TROP2 단일 도메인 항체 및 상이한 종의 TROP2의 효소 결합 면역 흡착 분석법(ELISA) 검출
인간, 마우스 및 붉은털 원숭이 종의 TROP2-Fc 항원 단백질을 이용하여 ELISA 플레이트를 코팅하고, 4℃에서 밤새 동안 배양하였으며; 다음날 PBS-T로 4회 세척하고, 1%의 BSA를 첨가하여, 실온에서 2시간 동안 밀폐시켰으며; PBS-T로 4회 세척하고, 구배 희석된 항-TROP2 단일 도메인 항체를 첨가하여, 37℃에서 1시간 동안 방치하였으며; PBS-T로 4회 세척하고, 마우스 항-His-HRP 항체를 첨가하여, 37℃에서 1시간 동안 방치하였으며; PBS-T로 4회 세척하고, TMB 수용성 기질을 첨가하여, 실온에서 10분 동안 방치하였으며; 450nm 파장에서 흡수값을 판독하고, 흡수값에 따라 각 단일 도메인 항체의 Kd값을 계산하였다.
검출 결과는 표 2와 같으며, 본 발명의 항-TROP2 단일 도메인 항체는 인간 및 붉은털 원숭이 기원의 TROP에만 결합한다.
표 2 항-TROP2 단일 도메인 항체 ELISA 결과
실시예 5: 항-TROP2 단일 도메인 항체와 인간 TROP2의 단백질 결합 동역학(Biacore 8K) 검출
카르복실 아미노 반응을 이용하여 고정상 인간 TROP2-Fc 항원 단백질을 CM-5 센서 칩의 표면에 고정시키고; 항-TROP2 단일 도메인 항체를 HBS 완충액으로 상이한 농도로 희석하였으며, 항-TROP2 단일 도메인 항체를 30ul/분의 유속으로 첨가하여, 90초 동안 결합한 후 600초 동안 해리시키고, 항-TROP2 단일 도메인 항체와 항원의 결합 과정을 관찰하였으며; 10mM의 글리신 용액으로 세척하여 칩을 재생한 후, 다음 항-TROP2 단일 도메인 항체의 측정을 수행하였다.
검출 결과는 표 3과 같으며, 본 발명의 항-TROP2 단일 도메인 항체와 TROP2-Fc 단백질의 결합은 모두 nM에 도달할 수 있다.
표 3 항-TROP2 단일 도메인 항체 Biacore 8K 결과
실시예 6: 항-TROP2 단일 도메인 항체와 인간 TROP2 도메인의 결합에 대한 ELISA 검출
상이한 인간 TROP2 도메인의 Fc 항원 단백질을 이용하여 ELISA 플레이트를 코팅하고, 4℃에서 밤새 동안 배양하였으며; 다음날 PBS-T로 4회 세척하고, 1%의 BSA를 첨가하여, 실온에서 2시간 동안 밀폐시켰으며; PBS-T로 4회 세척하고, 구배 희석된 항-TROP2 단일 도메인 항체를 첨가하여, 37℃에서 1시간 동안 방치하였으며; PBS-T로 4회 세척하고, 마우스 항-His-HRP 항체를 첨가하여, 37℃에서 1시간 동안 방치하였으며; PBS-T로 4회 세척하고, TMB 수용성 기질을 첨가하여, 실온에서 10분 동안 방치하였으며; 450nM 파장에서 흡수값을 판독하고, 흡수값에 따라 각 단일 도메인 항체 Kd값을 계산하였다. 검출 결과는 표 4와 같으며, 본 발명의 항-TROP2 단일 도메인 항체는 상이한 TROP2 도메인에 결합한다.
표 4 항-TROP2 단일 도메인 항체 ELISA 결과
실시예 7: 항-TROP2 단일 도메인 항체 및 인간 TROP2 에피토프 동정 그룹의 ELISA 검출
상이한 항-TROP2 단일 도메인 항체를 이용하여 ELISA 플레이트를 코팅하고, 4℃에서 밤새 동안 배양하였으며; 다음날 PBS-T로 4회 세척하고, 13%의 BSA를 첨가하여, 실온에서 1시간 동안 밀폐시켰으며; PBS-T로 5회 세척하고, 인간 TROP2-Fc 및 항-TROP2 단일 도메인 항체를 첨가하여, 37℃에서 1시간 동안 방치하였으며; 항-인간 Fc-HRP 항체를 첨가하여, 37℃에서 1시간 동안 방치하였으며; PBS-T로 5회 세척하고, TMB 수용성 기질을 첨가하여, 실온에서 2분 동안 방치하였으며; 450nM파장에서 흡수값을 판독하고, 흡수값에 따라 각 단일 도메인 항체의 경쟁 결과를 계산하였다.
검출 결과는 표 5와 같으며, 본 발명의 항-TROP2 단일 도메인 항체는 결합 에피토프에 따라 4개의 그룹으로 나눌 수 있으며, 그 중 MY1530-1-20, MY1530-1-26 및 MY1530-2-53은 그룹 1이고, MY1530-4-22, MY1530-5-17 및 MY1530-5-54는 그룹 2이며, MY1530-4-28은 그룹 3이고, MY1530-6-1은 그룹 4이다.
표 5 항-TROP2 단일 도메인 항체 에피토프 동정 ELISA 결과
실시예 8: 항-TROP2 단일 도메인 항체와 종양 세포의 유세포 분석법(FACS) 검출
TROP2 고발현 종양 세포 BxPc3을 이용하여 항체 결합 기능 검증을 수행하고: 배양된 BxPc3 세포를 트립신으로 소화시키고 완전 배지로 중화시킨 후, PBS로 세포를 1회 세척한 다음 세포를 수집하고; 96웰 플레이트에 고르게 나누고, 인간 Fc 차단 항체를 첨가하여, 4℃에서 15분 동안 배양하였으며; 원심분리 후 PBS로 세포를 1회 세척하고, 항-TROP2 단일 도메인 항체 또는 비표적화 단일 도메인 항체(음성 대조군)를 첨가하여, 4℃에서 30분 동안 배양하였으며; 원심분리 후 PBS로 세포를 1회 세척한 다음 anti-HA-Alexa Fluor 488 또는 마우스 및 토끼 항-TROP2 -FITC 항체(양성 대조군)를 첨가하여, 4℃에서 20분 동안 배양하였으며; PBS로 세포를 1회 세척한 후, 4℃에서 5분 동한 원심분리하고, 상청액을 버리고, 200ul의 PBS 를 첨가하여 세포를 재현탁하며, 각각의 샘플의 Alexa Fluor 488 신호를 유세포 분석으로 검출한다.
결과는 도 3에 도시된 바와 같고, 본 발명의 항-TROP2 단일 도메인 항체는 종양 세포 표면의 TROP2 단백질에 효과적으로 결합할 수 있다.
실시예 9: 항-TROP2 단일 도메인 항체의 마우스 종양 이종이식 모델에서의 SPECT/CT 영상화
트리카보닐 키트에 퍼테크네테이트를 첨가하고, 99℃에서 20분 동안 배양하였으며; 시약병을 실온으로 냉각시키고, 염산을 첨가하여, 트리카보닐 테크네튬을 pH7-7.5로 중화시키고; 항-TROP2 단일 도메인 항체를 첨가하고, 37℃에서 1시간 동안 배양하였으며; 박층 크로마토그래피로 테크네튬 표지 항-TROP2 단일 도메인 항체에 대해 방사선 순도를 동정하였다.
1Х107개의 TROP2 고발현(BxPc3) 세포를 누드 마우스의 오른쪽 등에 피하 접종하고, 종양이 150-200mm3까지 자라면 정식 실험 연구에 사용되며; 종양 보유 마우스를 이소플루란으로 마취시키고, 테크네튬 표지된 항-TROP2 단일 도메인 항체(~10ug, 37MBq)를 꼬리 정맥에 주사하였으며; 투여한 후 90분 후에 스캔을 수행하였고, 수집 방식으로는 정적 15분 SPECT, 중해상도 전신 CT를 사용하였다.
본 발명의 항-TROP2 단일 도메인 항체는 TROP2 고발현 종양 모델에서 효과적으로 축적될 수 있고, TROP2 표적화 암 진단 및 효능 평가에 적용될 수 있는 동시에 차세대 TROP2 표적화 치료의 개발에 사용될 수 있다.
본 발명의 아미노산 서열 정보
본 발명에서 언급된 모든 문헌은 각 문헌이 단독으로 참조로서 인용된 것처럼 본 발명에 참조로서 인용된다. 이 밖에, 본 발명의 상기 교시 내용을 열독한 후, 당업자는 본 발명에 대해 다양한 변경 또는 수정을 가할 수 있으며, 이러한 등가 형태도 본 발명의 첨부된 특허청구범위에 의해 한정된 범위 내에 속함을 이해해야 한다.
Sequence listing <110> NANOMAB TECHNOLOGY LIMITED <120> ANTI-TROP2 SINGLE-DOMAIN ANTIBODY AND USE THEREOF <130> P2022-1254 <150> CN2021107508486 <151> 2021-07-02 <160> 55 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 124 <212> PRT <213> Camelus bactrianus <400> 1 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Leu Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Val Ser Gly Ser Phe Val Ser Ser Arg 20 25 30 Ser Met Ala Trp Phe Arg Gln Thr Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val 35 40 45 Ala Ala Ile Ser Gln Tyr Gly Asp Pro Lys Tyr Ala Gly Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Met Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Leu Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Ala Gly Glu Ala Trp Glu Leu Ala Thr Leu Ser Arg Ser Asp Tyr Ile 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 2 <211> 123 <212> PRT <213> Camelus bactrianus <400> 2 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Val Ser Gly Tyr Thr Thr Thr Arg Tyr 20 25 30 Ser Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val 35 40 45 Ala Gly Ile Asp Thr Asp Val Leu Thr Thr Tyr Lys Pro Ser Val Glu 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ser Ala Lys Arg Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Thr Gly Thr Gly Asn Phe Leu Ala Leu Asp Pro Val Trp Tyr Asn Thr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 3 <211> 126 <212> PRT <213> Camelus bactrianus <400> 3 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Leu Thr Ser Ser Thr Thr 20 25 30 Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val 35 40 45 Ala Val Ile Arg Ser Ser Gly Glu Thr Thr Ala Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Ser Leu 65 70 75 80 Gln Met Thr Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Ala Ala Trp Pro Tyr Ser Gly Cys Leu Leu Pro Leu Ser Ser Gly Asp 100 105 110 Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 4 <211> 125 <212> PRT <213> Camelus bactrianus <400> 4 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Val Val Ser Gly Tyr Thr Val Ser Ser Val 20 25 30 Cys Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Met Glu Arg Glu Leu Val 35 40 45 Ala Gly Phe Tyr His Ser Gly Gly Thr Tyr Tyr Gly Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ala Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Ala Arg Tyr Pro Ser Ser Ala Cys Gly Thr Ser Pro Ser Asn Tyr 100 105 110 Asn Ile Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 5 <211> 114 <212> PRT <213> Camelus bactrianus <400> 5 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Val Ser Thr Thr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Arg Ile Ala Ile Asn Asp His Thr Phe Tyr Ala Glu Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Met Ser Thr Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Thr Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser 85 90 95 Pro Tyr Ser Asp Tyr Arg Ile Arg Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val 100 105 110 Ser Ser <210> 6 <211> 125 <212> PRT <213> Camelus bactrianus <400> 6 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Val Ser Gly Tyr Thr Val Ser Ser Val 20 25 30 Cys Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Met Glu Arg Glu Leu Val 35 40 45 Ala Gly Phe Tyr His Ser Gly Gly Thr Tyr Tyr Gly Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ala Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Ala Arg Tyr Pro Ser Ser Ala Cys Gly Thr Ser Pro Ser Asn Tyr 100 105 110 Asn Ile Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 7 <211> 125 <212> PRT <213> Camelus bactrianus <400> 7 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Tyr Thr Ala Ser Ser Val 20 25 30 Cys Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Val 35 40 45 Ala Gly Tyr Tyr His Ser Gly Gly Thr Tyr Tyr Gly Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ala Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Ala Arg Tyr Pro Ser Ser Ala Cys Gly Thr Ser Pro Ser Asn Tyr 100 105 110 Asn Ile Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 8 <211> 130 <212> PRT <213> Camelus bactrianus <400> 8 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Pro Tyr Ser Ser Tyr 20 25 30 Ser Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val 35 40 45 Ala Ala Ile Tyr Thr Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Gly Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Glu His Ala Thr Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Asn Met Val Asp Asn Gly Val Ile Ser Gly Ile Gln Ala Leu 100 105 110 Gly Val Arg Tyr Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val 115 120 125 Ser Ser 130 <210> 9 <211> 372 <212> DNA <213> Camelus bactrianus <400> 9 caggtgcagc tgcaggagtc tggaggaggc tcggtgctgg ctggagggtc tctgagactc 60 tcctgtacag tctctggatc gttcgtcagc agccgctcca tggcctggtt ccgccagact 120 ccagggaagg agcgcgaggg ggtcgcagct atttctcagt atggggaccc aaagtacgca 180 ggctccgtga agggccgatt caccatgtct cgagacaacg ccaagaacac tctcttgcta 240 caaatgaaca gcctgaaacc tgaggacact gccatctact actgtgcggc aggcgaggct 300 tgggagttgg ctacgttgtc caggagcgac tatatctact ggggccaggg gacccaggtc 360 accgtctcct ca 372 <210> 10 <211> 369 <212> DNA <213> Camelus bactrianus <400> 10 caggtgcagc tgcaggagtc tgggggaggc tcggtgcagg ctggagggtc cctgagactc 60 tcctgtgtag tctctggata caccaccacc cggtactcca tggcttggtt ccgccaggct 120 cctgggaagg agcgcgaggg ggtcgcaggt attgatactg atgttcttac aacctacaaa 180 ccgtctgttg agggccgatt caccatctcc cgagacagcg ccaagagaac tctgtatctg 240 caaatgaaca gcctgaaacc tgaggacact gccatgtact actgtgcgac agggactgga 300 aatttcttgg cactggatcc ggtctggtat aatacctggg gccaggggac ccaggtcacc 360 gtctcctca 369 <210> 11 <211> 378 <212> DNA <213> Camelus bactrianus <400> 11 caggtgcagc tgcaggagtc tgggggaggc tcggtgcagg ctggagggtc tctgagactc 60 tcctgtgcag tctctggact caccagcagt accacctgca tgggctggtt ccgacaggct 120 ccagggaagg agcgcgaggg ggtcgcagtt attagaagtt ctggtgagac aaccgccgca 180 gactccgtga agggccgatt caccatctcc cgagacaacg ccaagaacac tctgtctttg 240 caaatgacca gcctgaaacc tgaggacact gccatgtact actgtgcggc agcgtggccg 300 tatagtggtt gcctactccc cctgtcgtcg ggggacttta cttactgggg ccaggggacc 360 caggtcaccg tctcctca 378 <210> 12 <211> 375 <212> DNA <213> Camelus bactrianus <400> 12 caggtgcagc tgcaggagtc tgggggaggc tcggtgcagg ctggagggtc tctgaaactc 60 tcctgtgtag tctctggata caccgttagt agcgtctgca tggcctggtt ccgccaggcg 120 ccagggatgg agcgcgaact ggtcgcaggt ttttatcata gtgggggcac ttactatggc 180 gactccgtga agggccgatt caccgcctcc caagacaacg ccaagaacac gctgtatctg 240 caaatgaaca gcctgaaacc tgaggacact gccacatact actgtgcgcg cgcacgttac 300 ccgtcatctg cctgcggcac ttcaccatca aattataaca tctggggcca ggggacccag 360 gtcaccgtct cctca 375 <210> 13 <211> 342 <212> DNA <213> Camelus bactrianus <400> 13 caggtgcagc tgcaggagtc tgggggaggc tcggtgcagg ctggagggtc tctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cagcgtcagt accacctgga tgcactgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggcttgagtg ggtctcgcgt attgctatta atgatcacac attctatgca 180 gagtcagtga agggccgatt caccatgtcc acagacaacg ccaagaatac ggtgtatctg 240 caaatgacca gcctgaaacc tgaggacacg gccgtgtatt actgtagtcc atatagtgac 300 tatcgaattc gtggccaggg gacccaggtc accgtctcct ca 342 <210> 14 <211> 375 <212> DNA <213> Camelus bactrianus <400> 14 caggtgcagc tgcaggagtc tgggggaggc tcggtgcagc ctggagggtc tctgagactc 60 tcctgtgtag tctctggata caccgttagt agcgtctgca tggcctggtt ccgccaggcg 120 ccagggatgg agcgcgaact ggtcgcaggt ttttatcata gtgggggcac ttactatggc 180 gactccgtga agggccgatt caccgcctcc caagacaacg ccaagaacac gctgtatctg 240 caaatgaaca gcctgaaacc tgaggacact gccacatact actgtgcgcg cgcacgttac 300 ccgtcatctg cctgcggcac ttcaccatca aattataaca tctggggcca ggggacccag 360 gtcaccgtct cctca 375 <210> 15 <211> 375 <212> DNA <213> Camelus bactrianus <400> 15 caggtgcagc tgcaggagtc tgggggaggc tcggtgcagc ctggagggtc tctgagactc 60 tcctgtgtag cctctggata caccgcgagt agtgtctgca tggcctggtt ccgccaggcg 120 ccagggaagg agcgcgaact ggtcgcaggg tattatcata gtgggggcac ttactatggc 180 gactccgtga agggccgatt caccgcctcc caagacaacg ccaagaacac gctgtatctg 240 caaatgaaca gcctgaaacc tgaggacact gccacatact actgtgcgcg cgcacgttat 300 ccgtcatctg cctgcggcac ttcaccatca aattataaca tctggggcca ggggacccag 360 gtcaccgtct cctca 375 <210> 16 <211> 390 <212> DNA <213> Camelus bactrianus <400> 16 caggtgcagc tgcaggagtc tggaggaggc tcggtgcagg ctggagggtc tctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt tccctacagt agctactcga tgggctggtt ccgccaggct 120 ccagggaagg agcgcgaggg ggtcgcagct atttatactg gtggtggtag cacatactat 180 gccggctccg tgaagggccg attcaccatc tcccaagagc acgccacgaa cacactgtat 240 ctgcagatga acagcctgaa acctgaggac actgccatgt actactgtgc ggcaaatatg 300 gtagataacg gcgttatctc tggtattcag gctcttggtg ttaggtacta taactactgg 360 ggccagggga cccaggtcac cgtctcctca 390 <210> 17 <211> 10 <212> PRT <213> Camelus bactrianus <400> 17 Gly Ser Phe Val Ser Ser Arg Ser Met Ala 1 5 10 <210> 18 <211> 10 <212> PRT <213> Camelus bactrianus <400> 18 Gly Tyr Thr Thr Thr Arg Tyr Ser Met Ala 1 5 10 <210> 19 <211> 10 <212> PRT <213> Camelus bactrianus <400> 19 Gly Leu Thr Ser Ser Thr Thr Cys Met Gly 1 5 10 <210> 20 <211> 10 <212> PRT <213> Camelus bactrianus <400> 20 Gly Tyr Thr Val Ser Ser Val Cys Met Ala 1 5 10 <210> 21 <211> 10 <212> PRT <213> Camelus bactrianus <400> 21 Gly Phe Ser Val Ser Thr Thr Trp Met His 1 5 10 <210> 22 <211> 10 <212> PRT <213> Camelus bactrianus <400> 22 Gly Tyr Thr Ala Ser Ser Val Cys Met Ala 1 5 10 <210> 23 <211> 10 <212> PRT <213> Camelus bactrianus <400> 23 Gly Phe Pro Tyr Ser Ser Tyr Ser Met Gly 1 5 10 <210> 24 <211> 8 <212> PRT <213> Camelus bactrianus <400> 24 Ala Ile Ser Gln Tyr Gly Asp Pro 1 5 <210> 25 <211> 8 <212> PRT <213> Camelus bactrianus <400> 25 Gly Ile Asp Thr Asp Val Leu Thr 1 5 <210> 26 <211> 8 <212> PRT <213> Camelus bactrianus <400> 26 Val Ile Arg Ser Ser Gly Glu Thr 1 5 <210> 27 <211> 8 <212> PRT <213> Camelus bactrianus <400> 27 Gly Phe Tyr His Ser Gly Gly Thr 1 5 <210> 28 <211> 8 <212> PRT <213> Camelus bactrianus <400> 28 Arg Ile Ala Ile Asn Asp His Thr 1 5 <210> 29 <211> 9 <212> PRT <213> Camelus bactrianus <400> 29 Ala Ile Tyr Thr Gly Gly Gly Ser Thr 1 5 <210> 30 <211> 16 <212> PRT <213> Camelus bactrianus <400> 30 Gly Glu Ala Trp Glu Leu Ala Thr Leu Ser Arg Ser Asp Tyr Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 31 <211> 15 <212> PRT <213> Camelus bactrianus <400> 31 Gly Thr Gly Asn Phe Leu Ala Leu Asp Pro Val Trp Tyr Asn Thr 1 5 10 15 <210> 32 <211> 18 <212> PRT <213> Camelus bactrianus <400> 32 Ala Trp Pro Tyr Ser Gly Cys Leu Leu Pro Leu Ser Ser Gly Asp Phe 1 5 10 15 Thr Tyr <210> 33 <211> 17 <212> PRT <213> Camelus bactrianus <400> 33 Ala Arg Tyr Pro Ser Ser Ala Cys Gly Thr Ser Pro Ser Asn Tyr Asn 1 5 10 15 Ile <210> 34 <211> 6 <212> PRT <213> Camelus bactrianus <400> 34 Tyr Ser Asp Tyr Arg Ile 1 5 <210> 35 <211> 21 <212> PRT <213> Camelus bactrianus <400> 35 Asn Met Val Asp Asn Gly Val Ile Ser Gly Ile Gln Ala Leu Gly Val 1 5 10 15 Arg Tyr Tyr Asn Tyr 20 <210> 36 <211> 25 <212> PRT <213> Camelus bactrianus <400> 36 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Leu Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Val Ser 20 25 <210> 37 <211> 25 <212> PRT <213> Camelus bactrianus <400> 37 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Val Ser 20 25 <210> 38 <211> 25 <212> PRT <213> Camelus bactrianus <400> 38 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser 20 25 <210> 39 <211> 25 <212> PRT <213> Camelus bactrianus <400> 39 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Val Val Ser 20 25 <210> 40 <211> 25 <212> PRT <213> Camelus bactrianus <400> 40 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser 20 25 <210> 41 <211> 25 <212> PRT <213> Camelus bactrianus <400> 41 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Val Ser 20 25 <210> 42 <211> 25 <212> PRT <213> Camelus bactrianus <400> 42 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser 20 25 <210> 43 <211> 14 <212> PRT <213> Camelus bactrianus <400> 43 Trp Phe Arg Gln Thr Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala 1 5 10 <210> 44 <211> 14 <212> PRT <213> Camelus bactrianus <400> 44 Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala 1 5 10 <210> 45 <211> 14 <212> PRT <213> Camelus bactrianus <400> 45 Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Met Glu Arg Glu Leu Val Ala 1 5 10 <210> 46 <211> 14 <212> PRT <213> Camelus bactrianus <400> 46 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser 1 5 10 <210> 47 <211> 14 <212> PRT <213> Camelus bactrianus <400> 47 Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Val Ala 1 5 10 <210> 48 <211> 40 <212> PRT <213> Camelus bactrianus <400> 48 Lys Tyr Ala Gly Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Met Ser Arg Asp Asn 1 5 10 15 Ala Lys Asn Thr Leu Leu Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp 20 25 30 Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Ala 35 40 <210> 49 <211> 40 <212> PRT <213> Camelus bactrianus <400> 49 Thr Tyr Lys Pro Ser Val Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ser 1 5 10 15 Ala Lys Arg Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp 20 25 30 Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Thr 35 40 <210> 50 <211> 40 <212> PRT <213> Camelus bactrianus <400> 50 Thr Ala Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn 1 5 10 15 Ala Lys Asn Thr Leu Ser Leu Gln Met Thr Ser Leu Lys Pro Glu Asp 20 25 30 Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Ala 35 40 <210> 51 <211> 40 <212> PRT <213> Camelus bactrianus <400> 51 Tyr Tyr Gly Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ala Ser Gln Asp Asn 1 5 10 15 Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp 20 25 30 Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg 35 40 <210> 52 <211> 40 <212> PRT <213> Camelus bactrianus <400> 52 Phe Tyr Ala Glu Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Met Ser Thr Asp Asn 1 5 10 15 Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Thr Ser Leu Lys Pro Glu Asp 20 25 30 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Pro 35 40 <210> 53 <211> 40 <212> PRT <213> Camelus bactrianus <400> 53 Tyr Tyr Ala Gly Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Glu His 1 5 10 15 Ala Thr Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp 20 25 30 Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Ala 35 40 <210> 54 <211> 11 <212> PRT <213> Camelus bactrianus <400> 54 Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 55 <211> 11 <212> PRT <213> Camelus bactrianus <400> 55 Arg Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 1 5 10

Claims (15)

  1. 항-TROP2 단일 도메인 항체 VHH 사슬의 상보성 결정 영역(CDR)으로서,
    상기 VHH 사슬의 상보성 결정 영역(CDR)은,
    서열번호 17-23으로 표시되는 CDR1;
    서열번호 24-29로 표시되는 CDR2; 및
    서열번호 30-35로 표시되는 CDR3을 포함하는 것을 특징으로 하는 VHH 사슬의 상보성 결정 영역(CDR).
  2. 제1항에 있어서,
    상기 VHH 사슬의 상보성 결정 영역(CDR)은 하기 그룹으로 이루어진 군으로터 선택되는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VHH 사슬의 상보성 결정 영역(CDR).
  3. 항-TROP2 단일 도메인 항체의 VHH 사슬로서,
    상기 VHH 사슬은 프레임워크 영역(FR) 및 제1항에 따른 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 항-TROP2 단일 도메인 항체의 VHH 사슬.
  4. 항-TROP2 단일 도메인 항체로서,
    상기 단일 도메인 항체는 TROP2 단백질에 대한 단일 도메인 항체이고, 서열번호 1-8 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열의 VHH 사슬을 갖는 것을 특징으로 하는 항-TROP2 단일 도메인 항체.
  5. 폴리뉴클레오티드로서,
    상기 폴리뉴클레오티드는 제1항에 따른 CDR, 제3항에 따른 항-TROP2 단일 도메인 항체의 VHH 사슬 또는 제4항에 따른 항-TROP2 단일 도메인 항체로 이루어진 군으로터 선택되는 단백질을 코딩하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
  6. 발현 벡터로서,
    상기 발현 벡터는 제5항에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
  7. 숙주 세포로서,
    상기 숙주 세포는 제6항에 따른 발현 벡터를 포함하거나, 이의 게놈에 제5항에 따른 폴리뉴클레오티드가 통합되어 있는 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
  8. 항-TROP2 단일 도메인 항체의 생성 방법으로서,
    (a) 단일 도메인 항체를 생성하기 적합한 조건에서, 제7항에 따른 숙주 세포를 배양하여 상기 항-TROP2 단일 도메인 항체를 포함하는 배양물을 얻는 단계; 및 (b) 상기 배양물로부터 상기 항-TROP2 단일 도메인 항체를 분리하거나 회수하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 항-TROP2 단일 도메인 항체의 생성 방법.
  9. 면역 접합체로서,
    상기 면역 접합체는,
    (a) 제3항에 따른 항-TROP2 단일 도메인 항체의 VHH 사슬 또는 제4항에 따른 항-TROP2 단일 도메인 항체; 및 (b) 검출 가능한 마커, 약물, 독소, 시토카인, 방사성 핵종 또는 효소로 이루어진 군으로터 선택되는 접합 부분을 포함하는 것을 특징으로 하는 면역 접합체.
  10. 제3항에 따른 VHH 사슬, 제4항에 따른 항-TROP2 단일 도메인 항체 또는 제9항에 따른 면역 접합체의 용도로서,
    (a) TROP2 분자의 검출을 위한 시약; 및 (b) 종양의 치료를 위한 약물을 제조하는 데 사용되는 것을 특징으로 하는 용도.
  11. 약학적 조성물로서,
    상기 약학적 조성물은, (i) 제4항에 따른 단일 도메인 항체 또는 제9항에 따른 면역 접합체; 및 (ii) 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  12. 샘플 중 TROP2 단백질의 체외(진단적 및 비진단적) 검출 방법으로서,
    (1) 샘플을 제4항에 따른 단일 도메인 항체와 접촉시키는 단계; 및
    (2) 항원-항체 복합체가 형성되는지 여부를 검출하되, 복합체가 형성되면 샘플 중 TROP2 단백질이 존재한다는 것을 나타내는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 샘플 중 TROP2 단백질의 체외(진단적 및 비진단적) 검출 방법.
  13. 종양의 치료 방법으로서,
    제4항에 따른 단일 도메인 항체, 제9항에 따른 면역 접합체 또는 제11항에 따른 약학적 조성물을 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 종양은 TROP2 고발현 상피 종양인 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 종양은 위암, 췌장암, 자궁경부암, 유방암, 폐암, 전립선암, 결장암, 유두상 장액성 자궁내막암, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
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