CN112390885B - 一种trop2抗体及其制备方法、其偶联物和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种TROP2抗体及其制备方法、其偶联物和应用。所述TROP2抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包括重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3，和/或，所述轻链可变区包括轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3，其氨基酸序列分别如本发明中所述。所述TROP2抗体具有高亲和力和强特异性，与小分子药物毒素例如MMAF偶联后制得的偶联物能够对TROP2阳性的细胞有细胞毒杀伤作用，因此运用于治疗肿瘤等药物的制备中。

Description

一种TROP2抗体及其制备方法、其偶联物和应用
技术领域
本发明涉及抗体领域，具体涉及一种TROP2抗体及其制备方法、其偶联物和应用。
背景技术
在研究正常人体及癌变的滋养层细胞时，M.Lipinski等人首次发现了人滋养层细胞表面抗原2(Human trophoblast antigen 2，以下表示为hTROP2，Lipinski等，PNAS.1981；78：5147-5150)。随后，该分子也被其他研究者发现，虽然当时也被称为能被将胃癌细胞株免疫而得到的小鼠单克隆抗体GA733识别的肿瘤抗原GA733-1(Linnenbach AJ.等，PNAS.1989；86：27-31)、通过非小细胞肺癌细胞免疫而得到的小鼠单克隆抗体RS7-3G11识别的表皮糖蛋白(EGP-1，Basu A.等，Int.J.Cancer，1995；62:472-479)，但在1995年hTROP2基因被克隆后，确认它们为相同的分子(Fornaro M.等，Int.J.Cancer，1995；62：610-618)。
TROP2基因属于TACSTD基因家族，此家族的另一个成员编码与TROP2有约50％同源性的人滋养层细胞表面抗原1(hTROP1)。hTROP2为单次跨膜的I型细胞膜蛋白，其包含N末端26个氨基酸残基组成的胞内结构域，C末端248个氨基酸组成的胞外结构域，以及23个氨基酸残基组成的跨膜结构域，全长共323个氨基酸残基。已知hTROP2在第33、120、168和208位氨基酸残基处有4个N糖基化位点，表观分子量比理论分子量35千道尔顿大10千道尔顿左右。
迄今为止，hTROP2蛋白的配体未有明确鉴定，其分子功能还不十分明确。有报道显示hTROP2胞内结构域具有PIP2(4,5-二磷酸磷脂酰肌醇)结合序列，同时其第303位丝氨酸残基可被蛋白激酶C(PKC)磷酸化。第303位丝氨酸残基的磷酸化会造成hTROP2胞内构象的变化，导致与其结合的PIP2暴露后被磷脂酶C(PLC)水解为IP3(三磷酸肌醇)和DAG(二酰甘油)，进而调控细胞内钙信号传导(Miha Pavsic等，Scientific Reports，2015；5：10324)。
通过使用临床标本进行的免疫组织化学分析表明，在正常组织中hTROP2仅在某些组织的上皮细胞有有限表达，与此形成鲜明对比的是，hTROP2在乳腺癌、宫颈癌、结直肠癌、食道癌、胃癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、肾癌、胰腺癌等多种癌症种类中表达过量，且有报道显示hTROP2表达水平与肿瘤恶性程度，肿瘤侵袭能力和病人预后有密切相关性(AnnaShvartsur等，Genes&Cancer，2015；6：84-105)。
抗体药物偶联物(Antibody drug conjugate,以下称为ADC)，是由抗体与高效小分子药物通过连接物偶联而成，能够使高毒性小分子药物特异识别癌细胞上的靶点蛋白，从而特异性杀死癌细胞。基于抗体的免疫疗法与基于化学药物的化学疗法，一直是临床上治疗癌症的两大策略。抗体以肿瘤细胞特异表达或过度表达的抗原为靶点，多种治疗性单抗已经在临床上取得了巨大成功。在临床实践中，治疗性抗体虽然具有很好的靶向性，但是杀伤作用存在局限性；小分子化学药物虽然具备对癌细胞的高效杀伤作用，但是对非癌细胞也会造成同样的伤害。抗体药物和小分子药物在临床上各自不同的局限性，对药物研发提出了新的要求。新一代ADC，利用抗体对靶细胞的特异结合能力，输送高细胞毒的化学药物，实现对癌细胞的靶向高效杀伤。随着新型化学连接技术的出现，ADC在八十年代末开始进入临床研究，目前已经有4个ADC经FDA批准上市。
ADC的开发涉及：药物靶点的筛选、重组抗体的制备、连接物技术开发以及高细胞毒性化合物的筛选优化等几个方面。TROP2作为癌细胞特异高表达的蛋白，是一个极佳的ADC候选靶点。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是为了克服目前TROP2抗体的不足，提供一种亲和力高、特异性强的TROP2抗体及其制备方法和应用，所述的TROP2抗体与人源或食蟹猴源或小鼠源的TROP2蛋白具有高度亲和力。本发明还提供一种抗体药物偶联物，其包括所述的TROP2抗体和与其偶联的、具有抗肿瘤功能的小分子化合物，所述的抗体药物偶联物能够进入细胞，对TROP2表达阳性的细胞进行靶向性细胞毒杀伤作用，能够运用于治疗肿瘤等疾病的药物制备中。将本发明所述的TROP2抗体制备成人源化抗体后，能够保持与人源或食蟹猴源的TROP2蛋白具有高度亲和力，且能够很好的抑制肿瘤细胞的生长，对体重无显著影响。
本发明以hTROP2蛋白或者过表达hTROP2蛋白的重组细胞株作为免疫原，采用传统的杂交瘤制备技术(Kohler and Milstein，Nature，1975；256：495)，通过一系列的调整和改进，获得抗hTROP2的先导抗体。再通过对先导抗体的初步生产、纯化和检定，获得具备与hTROP2或cTROP2或mTROP2蛋白具有高度亲和力的TROP2抗体。然后通过分子生物学方法测序获知所得的TROP2抗体的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列。该抗体与小分子化合物如MMAF偶联得到抗体药物偶联物，所述抗体药物偶联物能够进入细胞，对TROP2表达阳性细胞有优异的细胞毒杀伤作用。
为解决上述技术问题，本发明提供一种分离的蛋白质，其包括TROP2抗体的重链可变区和/或轻链可变区，所述重链可变区包括重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3中的一种或多种，和/或，所述轻链可变区包括轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3中的一种或多种，其中，所述重链CDR1的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:26、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:66、SEQ IDNO:74、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:114、SEQID NO:122或SEQ ID NO:130所示；所述重链CDR2的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:3、SEQID NO:11、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:51、SEQID NO:59、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:99、SEQID NO:107、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:123、SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:164、SEQ ID NO:154或SEQ ID NO:159所示；所述重链CDR3的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:12、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:52、SEQ IDNO:60、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:100、SEQID NO:108、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:124或SEQ ID NO:132所示；所述轻链CDR1的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:78、SEQ IDNO:86、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:126或SEQ ID NO:134所示；所述轻链CDR2的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:103、SEQ IDNO:111、SEQ ID NO:119、SEQ ID NO:127或SEQ ID NO:135所示；所述轻链CDR3的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:128或SEQID NO:136所示；
或者，所述重链CDR1的氨基酸序列与如序列表中SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:10、SEQID NO:18、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:58、SEQID NO:66、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:122或SEQ ID NO:130所示的氨基酸序列至少有80％、85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同源性的氨基酸序列所示；和/或，所述重链CDR2的氨基酸序列与如序列表中SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:19、SEQID NO:27、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:67、SEQID NO:75、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:107、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:123、SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:164、SEQ ID NO:154或SEQ ID NO:159所示的氨基酸序列至少有80％、85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同源性的氨基酸序列所示；和/或，所述重链CDR3的氨基酸序列与如序列表中SEQ ID NO:4、SEQID NO:12、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:52、SEQID NO:60、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:124或SEQ ID NO:132所示的氨基酸序列至少有80％、85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同源性的氨基酸序列所示；和/或，所述轻链CDR1的氨基酸序列与如序列表中SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:14、SEQID NO:22、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:62、SEQID NO:70、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:126或SEQ ID NO:134所示的氨基酸序列至少有80％、85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同源性的氨基酸序列所示；和/或，所述轻链CDR2的氨基酸序列与如序列表中SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:23、SEQID NO:31、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:71、SEQID NO:79、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:119、SEQ ID NO:127或SEQ ID NO:135所示的氨基酸序列至少有80％、85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同源性的氨基酸序列所示；和/或，所述轻链CDR3的氨基酸序列与如序列表中SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:32、SEQ IDNO:40、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:80、SEQ IDNO:88、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:128或SEQ ID NO:136所示的氨基酸序列至少有80％、85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同源性的氨基酸序列所示。所述突变在所述CDR的氨基酸序列上具有一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或插入，并且保持或改善了所述蛋白质的功能。
较佳地，所述重链CDR1的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示，所述重链CDR2的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:3所示，且所述重链CDR3的氨基酸序列如序列表SEQ IDNO:4所示；所述重链CDR1的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:10所示，所述重链CDR2的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:11所示，且所述重链CDR3的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:12所示；所述重链CDR1的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:18所示，所述重链CDR2的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:19所示，且所述重链CDR3的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:20所示；所述重链CDR1的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:26所示，所述重链CDR2的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:27所示，且所述重链CDR3的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:28所示；所述重链CDR1的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:34所示，所述重链CDR2的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:35所示，且所述重链CDR3的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:36所示；所述重链CDR1的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:42所示，所述重链CDR2的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:43所示，且所述重链CDR3的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:44所示；所述重链CDR1的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:50所示，所述重链CDR2的氨基酸序列如序列表SEQID NO:51所示，且所述重链CDR3的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:52所示；所述重链CDR1的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:58所示，所述重链CDR2的氨基酸序列如序列表SEQ IDNO:59所示，且所述重链CDR3的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:60所示；所述重链CDR1的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:66所示，所述重链CDR2的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:67所示，且所述重链CDR3的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:68所示；所述重链CDR1的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:74所示，所述重链CDR2的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:75所示，且所述重链CDR3的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:76所示；所述重链CDR1的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:82所示，所述重链CDR2的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:83所示，且所述重链CDR3的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:84所示；所述重链CDR1的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:90所示，所述重链CDR2的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:91所示，且所述重链CDR3的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:92所示；所述重链CDR1的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:98所示，所述重链CDR2的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:99所示，且所述重链CDR3的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:100所示；所述重链CDR1的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:106所示，所述重链CDR2的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:107所示，且所述重链CDR3的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:108所示；所述重链CDR1的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:114所示，所述重链CDR2的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:115所示，且所述重链CDR3的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:116所示；所述重链CDR1的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:122所示，所述重链CDR2的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:123所示，且所述重链CDR3的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:124所示；所述重链CDR1的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:130所示，所述重链CDR2的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:131所示，且所述重链CDR3的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:132所示；所述重链CDR1的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:10所示，所述重链CDR2的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:164所示，且所述重链CDR3的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:12所示；所述重链CDR1的氨基酸序列如序列表SEQID NO:10所示，所述重链CDR2的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:154所示，且所述重链CDR3的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:12所示；或，所述重链CDR1的氨基酸序列如序列表SEQID NO:10所示，所述重链CDR2的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:159所示，且所述重链CDR3的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:12所示。
较佳地，所述轻链CDR1的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:6所示，所述轻链CDR2的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:7所示，且所述轻链CDR3的氨基酸序列如序列表SEQ IDNO:8所示；所述轻链CDR1的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:14所示，所述轻链CDR2的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:15所示，且所述轻链CDR3的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:16所示；或，所述轻链CDR1的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:22所示，所述轻链CDR2的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:23所示，且所述轻链CDR3的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:24所示；所述轻链CDR1的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:30所示，所述轻链CDR2的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:31所示，且所述轻链CDR3的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:32所示；所述轻链CDR1的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:38所示，所述轻链CDR2的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:39所示，且所述轻链CDR3的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:40所示；所述轻链CDR1的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:46所示，所述轻链CDR2的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:47所示，且所述轻链CDR3的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:48所示；所述轻链CDR1的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:54所示，所述轻链CDR2的氨基酸序列如序列表SEQID NO:55所示，且所述轻链CDR3的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:56所示；所述轻链CDR1的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:62所示，所述轻链CDR2的氨基酸序列如序列表SEQ IDNO:63所示，且所述轻链CDR3的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:64所示；所述轻链CDR1的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:70所示，所述轻链CDR2的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:71所示，且所述轻链CDR3的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:72所示；所述轻链CDR1的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:78所示，所述轻链CDR2的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:79所示，且所述轻链CDR3的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:80所示；所述轻链CDR1的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:86所示，所述轻链CDR2的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:87所示，且所述轻链CDR3的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:88所示；所述轻链CDR1的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:94所示，所述轻链CDR2的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:95所示，且所述轻链CDR3的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:96所示；所述轻链CDR1的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:102所示，所述轻链CDR2的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:103所示，且所述轻链CDR3的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:104所示；所述轻链CDR1的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:110所示，所述轻链CDR2的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:111所示，且所述轻链CDR3的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:112所示；所述轻链CDR1的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:118所示，所述轻链CDR2的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:119所示，且所述轻链CDR3的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:120所示；所述轻链CDR1的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:126所示，所述轻链CDR2的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:127所示，且所述轻链CDR3的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:128所示；或，所述轻链CDR1的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:134所示，所述轻链CDR2的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:135所示，且所述轻链CDR3的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:136所示。
较佳地，所述重链可变区还包括重链可变区框架区；更佳地，所述重链可变区框架区为鼠抗体的重链可变区框架区或人抗体的重链可变区框架区或其回复突变，例如IGHV1-69*08/JH6C(序列如SEQ ID NO:145所示)或IGHV3-7*01/JH4D(序列如SEQ ID NO:155所示)或在其基础上的回复突变。
较佳地，所述轻链可变区还包括轻链可变区框架区；更佳地，所述轻链可变区框架区为鼠抗体的轻链可变区框架区或人抗体的轻链可变区框架区，例如为IGKV1-39*01/JK4(序列如SEQ ID NO:150所示)或IGKV1-39*01/JK1(序列如SEQ ID NO:160所示)或在其基础上的回复突变。
较佳地，所述重链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:97、SEQ IDNO:105、SEQ ID NO:113、SEQ ID NO:121、SEQ ID NO:129、SEQ ID NO:140、SEQ ID NO:143、SEQ ID NO:144、SEQ ID NO:146、SEQ ID NO:147、SEQ ID NO:148、SEQ ID NO:149、SEQ IDNO:156、SEQ ID NO:157、SEQ ID NO:158或其突变的氨基酸序列所示；所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:29、SEQ IDNO:37、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:77、SEQ IDNO:85、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:125、SEQ ID NO:133、SEQ ID NO:151、SEQ ID NO:152、SEQ ID NO:153、SEQ ID NO:161、SEQ IDNO:162、SEQ ID NO:163或其突变的氨基酸序列所示；
所述突变在所述重链可变区或轻链可变区的氨基酸序列上具有一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或插入，并且保持或改善了所述蛋白质的功能；优选地，所述突变的氨基酸序列与所述重链可变区或轻链可变区的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、90％、95％、96％、97％、98％更优选至少99％的序列同源性。例如，当所述的蛋白质为双特异性抗体且其中一个蛋白功能区为免疫球蛋白，另一个蛋白功能区为scFv，且所述scFv连接在所述免疫球蛋白的两条重链的C末端时，所述重链的C末端可以由K突变为A。
更佳地，所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:5所示；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQID NO:9所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:13所示；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:17所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:21所示；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:25所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:29所示；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:33所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:37所示；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:41所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:45所示；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:49所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:53所示；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:57所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:61所示；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:65所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:69所示；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:73所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:77所示；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:81所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ IDNO:85所示；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:89所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:93所示；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ IDNO:97所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:101所示；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:105所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:109所示；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:113所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:117所示；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:121所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:125所示；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:129所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:133所示；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:140所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:12所示；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:143所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQID NO:12所示；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:144所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:12所示；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:146所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:151所示；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:147所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:151所示；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:148所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:151所示；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:149所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ IDNO:151所示；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:146所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:152所示；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQID NO:147所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:152所示；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:148所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:152所示；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:149所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:152所示；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:146所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:153所示；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:147所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:153所示；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ IDNO:148所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:153所示；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:149所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:153所示；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:156所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:161所示；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:157所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:161所示；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:158所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:161所示；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:156所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:162所示；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:157所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQID NO:162所示；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:158所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:162所示；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:156所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:163所示；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:157所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:163所示；或，所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:158所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:163所示。
综上所述，上述氨基酸序列的编号可以是如表1所示：
表1 TROP2抗体蛋白序列编号
其中，表1中的数字即为序列表中序列号，如10E12C10F10的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:1，而10E12C10F10的重链可变区中CDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO:2，重链CDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO:3，重链CDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO:4。其轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:5，轻链CDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO:6，轻链CDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO:7，轻链CDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO:8。
较佳地，所述分离的蛋白质为人源化抗体，其包括人抗体可变区的构架区。所述的人源化抗体中包含的上述重链CDR1、重链CDR2、和重链CDR3中的一种或多种和/或上述的轻链CDR1、轻链CDR2、和轻链CDR3时，可以在这些CDR的基础上发生部分突变；所述突变在其氨基酸序列上具有一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或插入，并且保持或改善了所述蛋白质的功能；所述突变的氨基酸序列优选与所述重链可变区或轻链可变区的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同源性。例如双特异性抗体中，当单链抗体(scFv)连接在免疫球蛋白的重链的C末端时，所述重链的C末端可以由K突变为A。更佳地，所述的人抗体可变区的构架区包括人抗体重链可变区的构架区和人抗体轻链可变区的构架区。
较佳地，所述的分离的蛋白质还包括抗体重链恒定区和抗体轻链恒定区。所述的抗体重链恒定区优选为小鼠源抗体重链恒定区或人源抗体重链恒定区；所述的抗体轻链恒定区优选为小鼠源轻链抗体恒定区或人源抗体轻链恒定区。所述的抗体重链恒定区更优选为人源抗体重链恒定区，进一步优选人源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体重链恒定区；所述的抗体轻链恒定区优选为人源抗体轻链κ或λ链恒定区。所述的分离的蛋白质的重链可变区和轻链可变区与人源重链恒定区和人源轻链恒定区构成嵌合抗体全长蛋白。所述的抗体全长蛋白优选为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
所述的分离的蛋白质可为本领域常规的蛋白质，较佳地为抗体全长蛋白、抗原结合片段、双特异性抗体、多特异性抗体、单链抗体(single chain antibody fragment，scFv)、单域抗体(single domain antibody，sdAb)和单区抗体(single-domain antibody)中的一种或多种。所述的分离的蛋白质还可以较佳地为上述抗体所制得的单克隆抗体或多克隆抗体，例如TROP2抗体；所述单克隆抗体可以由多种途径和技术进行研制，包括杂交瘤技术、噬菌体展示技术、单淋巴细胞基因克隆技术等，主流是通过杂交瘤技术从野生型或转基因小鼠制备单克隆抗体。所述的分离的蛋白质还可以较佳地为超人源化抗体。
所述的超人源化抗体为一种通过人源化抗体的制备方法所得的抗体。此方法不依赖于将人构架序列作为分析点，而是依赖于比较非人抗体的规范CDR结构类型和人抗体的CDR结构类型，尤其是人胚系序列所编码的人抗体，从中识别出可以得到适宜的人构架序列的候选的人抗体序列。例如，人残基可以置换CDRs中的非人残基。镶饰(veneering)的一个前提是鼠源抗体可变区的免疫原性起源于它的表面残基，且残基的运动性和溶剂的可及性是其成为抗原决定簇的基本条件。根据对现有的抗体晶体结构数据的分析结果统计，在序列配对位置上，人和鼠的抗体可变区残基的相对溶剂可及性分布的保真度达98％，这说明在异种间诱导免疫反应的残基是由其余的种特异性溶剂可及表面残基引起的。因此将鼠特异性表面残基换成人源性的，就可以模拟人源抗体的表面轮廓，逃避人体免疫系统的识别，达到人源化的目的。简单来说，镶饰基于通过用人氨基酸序列重建抗体的溶剂可及的表面来减少在啮齿类动物或其他非人抗体中的潜在免疫原性的氨基酸序列。参见Padlan(1991)Mol.Immunol.28:489-980。通过鉴定非人抗体中暴露在表面的溶剂可及性残基的外部构架区残基(所述残基不同于人抗体的构架区中相同位置上的那些残基)，并用人抗体中相应位置的氨基酸替换所鉴定的残基，以进行镶饰。即，镶饰的抗体，其表面残基主要是人源序列，而包裹在内部的残基主要是最初的鼠源序列。例如，根据Frankenstein方法，鉴定与相关的非人抗体的各构架区具有实质上的序列同源性的人构架区，并且将非人抗体的CDRs移植到这些不同的人构架区的复合物上。可以结合上述方法，以产生任何所需序列的抗TROP2抗体。
当所述的蛋白质为双特异性抗体时，其可以包括第一蛋白功能区和第二蛋白功能区。所述第一蛋白功能区可以为上述的蛋白质，其靶向结合TROP2；所述第二蛋白功能区为非靶向结合TROP2的蛋白质或者为同样靶向结合TROP2但非本发明所述的蛋白质。其中，所述第一蛋白功能区可以为免疫球蛋白，所述第二蛋白功能区可以为一个或多个scFv；或者，所述第二蛋白功能区可以为免疫球蛋白，所述第一蛋白功能区可以为一个或多个scFv。
所述的抗体全长蛋白可为本领域常规的抗体全长蛋白，其包括重链可变区、轻链可变区、重链恒定区和轻链恒定区。
所述的单链抗体可为本领域常规的单链抗体，其包括重链可变区、轻链可变区和15～20个氨基酸的短肽。
所述的抗原结合片段可为本领域常规的抗原结合片段，其包括轻链可变区、轻链恒定区和重链恒定区的Fd段。较佳地，所述的抗原抗体结合域蛋白质片段为Fab和F(ab’)2。
所述的单域抗体可为本领域常规的单域抗体，其包括重链可变区和重链恒定区。
所述的单区抗体可为本领域常规的单区抗体，其仅包括重链可变区。
为解决上述技术问题，本发明还提供一种核酸，其编码上述的分离的蛋白质。
所述核酸的制备方法为本领域常规的制备方法，较佳地，包括以下的步骤：通过基因克隆技术获得编码上述蛋白质的核酸分子，或者通过人工全序列合成的方法得到编码上述蛋白质的核酸分子。
本领域技术人员知晓，编码上述蛋白质的氨基酸序列的碱基序列可以适当引入替换、缺失、改变、插入或增加来提供一个多聚核苷酸的同系物。本发明中多聚核苷酸的同系物可以通过对编码该蛋白序列基因的一个或多个碱基在保持抗体活性范围内进行替换、缺失或增加来制得。
为解决上述技术问题，本发明还提供一种包含所述核酸的重组表达载体。
其中所述重组表达载体可通过本领域常规方法获得，即：将本发明所述的核酸分子连接于各种表达载体上构建而成。所述的表达载体为本领域常规的各种载体，只要其能够容载前述核酸分子即可。所述载体较佳地包括：各种质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等。
为解决上述技术问题，本发明还提供一种转化体，其在宿主细胞中包含上述的重组表达载体。
其中，所述重组表达转化体的制备方法为本领域常规的制备方法，较佳地为：将上述重组表达载体转化至宿主细胞中制得。所述的宿主细胞为本领域常规的各种宿主细胞，只要能满足使上述重组表达载体稳定地自行复制，且所携带所述的核酸可被有效表达即可。较佳地，所述宿主细胞为E.coli TG1或BL21细胞(表达单链抗体或Fab抗体)，或者CHO-K1细胞(表达全长IgG抗体)。将前述重组表达质粒转化至宿主细胞中，即可得本发明优选的重组表达转化体。其中所述转化方法为本领域常规转化方法，较佳地为化学转化法，热激法或电转法。
本发明中，所述的分离的蛋白质可以用于制备成嵌合抗原受体(CAR)等从而将其修饰在例如T细胞或NK细胞等细胞上面。所述嵌合抗原受体可为本领域常规的嵌合抗原受体，包括例如利用上述TROP2抗体的scFv作为胞外抗原结合结构域的嵌合抗原受体。因此，本发明还提供一种基因修饰的细胞，其包含上述的分离的蛋白质，较佳地，所述基因修饰的细胞为真核细胞，优选分离的人细胞；更优选免疫细胞如T细胞(例如以CAR-T的形式)，或NK细胞。
为解决上述技术问题，本发明还提供一种分离的蛋白质的制备方法，其包括如下步骤：培养上述的转化体，从培养物中获得分离的蛋白质。
为解决上述技术问题，本发明提供一种抗体药物偶联物，其包括共价附着至细胞毒剂的上述的分离的蛋白质。
较佳地，所述的抗体药物偶联物中，上述的1当量所述的分离的蛋白质通过x当量接头与y当量的细胞毒剂相连，具有如式1所示的结构，
Ab-(L)x-(D)y
式1
其中，Ab为上述的分离的蛋白质；L为接头；D为细胞毒剂；所述x为本领域常规的交联度，x为自然数，优选1-20的整数；y为自然数，优选1-20的整数；x和y各自独立地优选为2～8的整数，例如为3或4；x和y的比例优选为1:1。
所述L是本领域常规的接头(或称交联剂或偶联剂)。所述L包含2个官能团，即与抗体反应的基团，和与药物反应的基团(例如，醛或酮)。
药物经由接头分子与上述的蛋白质偶联。所述L进入细胞后释放，其包括但不限于如下的官能团，活性酯、碳酸盐类、氨基甲酸酯类、亚胺磷酸酯、肟类、腙类、缩醛类、原酸酯类、氨基类、小肽段或核苷酸片段。
较佳地，所述L主要含有式2所示结构，其为L中离去基团离去后对应的剩余部分；
(CO-Alk1-Sp1-Ar-Sp2-Alk2-C(Z1)＝Q-Sp)
式2
其中，Alk1和Alk2不存在或独立地为分支的或不分支的(C1-C10)亚烷基链；Sp1不存在，或独立地为-S-、-O-、-CONH-、-NHCO-、-NR’-、-N(CH2CH2)2N-、或-X-Ar’-Y-(CH2)n-Z，其中X、Y和Z不存在，或独立地为-NR’-、-S-或-O-，条件是当n＝0时，Y和Z中的至少一个不存在，且Ar’是由(C1-C5)烷基、(C1-C4)烷氧基、(C1-C4)硫代烷氧基、卤素、硝基、-COOR’、-CONHR’、-(CH2)nCOOR’、S(CH2)nCOOR’、-O(CH2)nCONHR’或-S(CH2)nCONHR’的1、2或3个基团任选取代的基团，当其为2个基团任选取代时其为1，2-、1，3-或1，4-亚苯基，n是0-5的整数，条件是当Alk1不存在时，Sp1不存在；R’是由-OH、(C1-C4)烷氧基、(C1-C4)硫代烷氧基、卤素、硝基、(C1-C3)二烷基氨基、或(C1-C3)三烷基铵-A的一个或2个基团任选取代的分支的或不分支的(C1-C5)链，其中A是完成盐的药学上可接受的阴离子；Ar是由(C1-C6)烷基、(C1-C5)烷氧基、(C1-C4)硫代烷氧基、卤素、硝基、-COOR’、-CONHR’、-O(CH2)nCOOR’、-S(CH2)nCOOR’、-O(CH2)nCONHR’或-S(CH2)nCONHR’的1、2或3个基团任选取代的1,2-、1,3-或1,4-亚苯基，其中n和R’如上述的定义，或Ar是1,2-、1,3-、1,4-、1,5-、1,6-、1,7-、1,8-、2,3-、2,6-或2,7-亚萘基，其中亚萘基或吩噻嗪各任选地由(C1-C6)烷基、(C1-C5)烷氧基、(C1-C4)硫代烷氧基、卤素、硝基、-COOR’、-CONHR’、-O(CH2)nCOOR’、-S(CH2)nCOOR’、或-S(CH2)nCONHR’的1、2、3或4个基团取代，其中n和R’如上文定义，条件是当Ar是吩噻嗪时，Sp1是仅与氮连接的键；所述的键的含义为共价键。
Sp2不存在，或为-S-或-O-，条件是当Alk2不存在时，Sp2不存在；
Z1是H、(C1-C5)烷基、或由(C1-C5)烷基、(C1-C5)烷氧基、(C1-C4)硫代烷氧基、卤素、硝基、-COOR’、-CONHR’、-O(CH2)nCOOR’、-S(CH2)nCOOR’、-O(CH2)nCONHR’或-S(CH2)nCONHR’的1、2、或3个基团任选取代的苯基，其中n和R’如上文定义；
Sp是直链或支链二价或三价(C1-C18)基团，二价或三价芳基或杂芳基基团，二价或三价(C3-C18)环烷基或杂环烷基基团，二价或三价芳基或杂芳基-芳基(C1-C18)基团，二价或三价环烷基或杂环烷基-烷基(C1-C18)基团，或二价或三价(C2-C18)不饱和的烷基基团，其中杂芳基优选是呋喃基、噻吩基，N-甲基吡咯基、吡啶基、N-甲基咪唑基、噁唑基、嘧啶基。喹啉基、异喹啉基、N-甲基咔唑基、氨基豆素基、或吩嗪基、并且其中如果Sp是三价基团，那么Sp还可以由低级(C1-C5)二烷基氨基、低级(C1-C5)烷氧基、羟基、或低级(C1-C5)烷硫基任选取代；且，Q是＝NHNCO-、＝NHNCS-、＝NHNCONH-、＝NHNCSNH-或＝NHO-。
优选地，Alk1是分支或不分支的(C1-C5)亚烷基链，Sp1不存在，或为-S-、-O-、-CONH-、-NHCO-或-NR’，其中R’如上文定义，条件是当Alk1不存在时，Sp1不存在；
Ar是由(C1-C6)烷基、(C1-C5)烷氧基、(C1-C4)硫代烷氧基、卤素、硝基、-COOR’、-CONHR’、-O(CH2)nCOOR’、-S(CH2)nCOOR’、-O(CH2)nCONHR’或-S(CH2)nCONHR’的1、2或3个基团任选取代的1,2-、1,3-或1,4-亚苯基，其中n和R’如上文定义，或Ar是各自由C1-C6)烷基、(C1-C5)烷氧基、(C1-C4)硫代烷氧基、卤素、硝基、-COOR’、-CONHR’、-O(CH2)nCOOR’、-S(CH2)nCOOR’、-O(CH2)nCONHR’或-S(CH2)nCONHR’的1、2、3或4个基团任选取代的1,2-、1,3-、1,4-、1,5-、1,6-、1,7-、1,8-、2,3-、2,6-或2,7-亚萘基。
Z1是(C1-C5)烷基、或由(C1-C5)烷基、(C1-C4)烷氧基、(C1-C4)硫代烷氧基、卤素、硝基、-COOR’、-CONHR’、-O(CH2)nCOOR’、-S(CH2)nCOOR’、-O(CH2)nCONHR’或-S(CH2)nCONHR’的1、2、或3个基团任选取代的苯基；Alk2和Sp2均不存在；且Sp和Q如仅在上文中所定义的。
所述L优选为马来酰亚胺基己酰(maleimidocaproyl，MC)、马来酰亚胺基己酰-L-缬氨酸-L-瓜氨酸对氨基苄醇(MC-VC-PAB)或4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(SMCC)。
所述D为本领域常规的细胞毒剂，较佳地选自细胞毒素、化学治疗剂、放射性同位素、治疗性核酸、免疫调节剂、抗血管生成剂、抗增殖促凋亡剂或细胞溶解酶。
其中，所述细胞毒素为本领域常规的细胞毒素，一般指抑制或阻止细胞功能和/或导致细胞破坏的活性剂。较佳地选自抗生素、微管蛋白聚合的抑制剂、烷化剂、蛋白合成抑制剂、蛋白激酶抑制剂、磷酸酶抑制剂、拓扑异构酶抑制剂、蛋白激酶、磷酸酶、拓扑异构酶或细胞周期蛋白。更佳地选自多柔比星、柔红霉素、依达比星、阿柔比星、佐柔比星、米托蒽醌、表柔比星、卡柔比星、诺加霉素、美诺立尔、吡柔比星、戊柔比星、阿糖胞苷、吉西他滨、曲氟尿苷、安西他滨、依诺他滨、阿扎胞苷、去氧氟尿苷、喷司他丁、溴尿苷、卡培他滨、克拉屈滨、地西他滨、氟尿苷、氟达拉滨、谷氏菌素、嘌呤霉素、替加氟、噻唑羧胺核苷、阿霉素、顺铂、卡铂、环磷酰胺、达卡巴嗪、长春碱、长春新碱、博来霉素、氮芥、强的松、甲基苄肼、氨甲喋呤、氟尿嘧啶、依托泊苷、泰素、泰素类似物、铂类(如顺铂和卡铂)、丝裂霉素、噻替派、紫杉烷、道诺红菌素、放线菌素、安曲霉素、氮丝氨酸、它莫西芬、多拉司他汀、奥瑞他汀及其衍生物、哈米特林、埃斯波霉素或美登素类化合物，最佳地选自甲基奥瑞他汀E(MMAE)、甲基奥瑞他汀F(MMAF)或N2’-脱乙酰-N2’-3-巯基-1氧代丙基-美登素(DM1)。
其中，所述化学治疗剂为本领域常规的化学治疗剂，较佳地选自烷化剂、烷基磺酸酯类化学治疗剂、氮丙啶类化学治疗剂、乙烯酰胺类和甲基密胺类化学治疗剂、氮芥、硝基脲类化学治疗剂、抗生素、抗代谢物、叶酸类化学治疗剂、嘌呤类似物、嘧啶类似物、雄激素、抗肾上腺素、叶酸补充剂、美登醇、多糖复合物、紫杉烷、铂类似物或类视黄醇，或者，其在药学上可接受的盐、酸和衍生物。
所述的烷化剂为本领域常规的烷化剂，较佳地选自噻替派或环磷酰胺。所述的烷基磺酸酯类化学治疗剂为本领域常规的烷基磺酸酯类化学治疗剂，较佳地选自白消安、英丙舒凡或哌泊舒凡。所述的氮丙啶类化学治疗剂为本领域常规的氮丙啶类化学治疗剂，较佳地选自氮丙唳如、卡巴醌、美妥替哌或乌瑞替派。所述乙烯酰胺类和甲基密胺类化学治疗剂为本领域常规的乙烯酰胺类和甲基密胺类化学治疗剂，较佳地选自六甲蜜胺、三乙撑蜜胺、三亚乙基磷酰胺，三亚乙基硫代磷酰胺或三羟甲蜜胺。所述的氮芥为本领域常规的氮芥，较佳地选自苯丁酸氮芥、萘氮芥、雌氮芥(estramustine)、异环磷酰胺、氮芥、氧氮芥盐酸盐、苯丙氨酸氮芥、新氮芥、苯芥胆甾醇、泼尼氮芥、曲磷胺或尿嘧啶氮芥。所述硝基脲类化学治疗剂为本领域常规的硝基脲类化学治疗剂，较佳地选自卡莫司汀、氯脲菌素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀或雷莫司汀。所述抗生素为本领域常规的抗生素，较佳地选自阿克拉霉素、放线菌素、安曲霉素、氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素c、加力车霉素、卡柔比星、洋红霉素、嗜癌素、色霉素、更生霉素、柔红霉素、地托比星、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星、表柔比星、依索比星、依达比星、发波霉素、丝裂霉素、霉酚酸、诺加霉素、橄榄霉素、培洛霉素、紫菜霉素、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑菌素、链脲菌素、杀结核菌素、乌苯美司、静司他丁或佐柔比星。所述的抗代谢物为本领域常规的抗代谢物，较佳地选自氨甲喋呤或5-氟尿嘧啶(5-FU)。所述的叶酸类化学治疗剂为本领域常规的叶酸类化学治疗剂，较佳地选自二甲叶酸、蝶罗呤或三甲曲沙。所述的嘌呤类似物为本领域常规的嘌呤类似物，较佳地选自氟达拉滨、6-巯嘌呤、硫咪嘌呤或硫鸟嘌呤。所述的嘧啶类似物为本领域常规的嘧啶类似物，较佳地选自安西他滨、阿扎胞苷、6-阿扎尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷或5-EU。所述的雄激素为本领域常规的雄激素，较佳地选自卡普睾酮、丙酸甲雄烷酮、环硫雄醇、美雄烷或睾内酯。所述的抗肾上腺素为本领域常规的抗肾上腺素，较佳地选自安鲁米特、米托坦或曲洛司坦。所述的叶酸补充剂为本领域常规的叶酸补充剂，较佳地选自亚叶酸、醋葡全内酯、醛磷酰胺糖苷、氨基酮戊酸、安吖啶、阿莫司汀、比生群、依达曲沙、地磷酰胺、秋水仙胺、地吖醌、依氟鸟氨酸、依利醋铵、埃坡西龙、依托格鲁、硝酸镓、羟基脲、香菇多糖或氯尼达明。所述的美登醇为本领域常规的美登醇，较佳地选自美登素、安丝菌素、米托胍腙、米托蒽醌、莫哌达醇、二胺硝吖啶、喷司他丁、蛋氨氮芥、吡柔比星、洛索蒽醌、鬼臼酸、2-乙基酰肼或丙卡巴肼。所述的多糖复合物为本领域常规的多糖复合物，较佳地选自雷佐生、根霉素、西佐喃、锗螺胺、细交链孢菌酮酸、三亚胺醌2，2′，2″-三氯三乙胺、单端孢霉烯族毒素、乌拉坦、长春地辛、达卡巴嗪、甘露莫司汀、二溴甘露醇、二溴卫矛醇、哌泊溴烷、gacytosine、阿糖胞苷、环磷酰胺或噻替派。更佳地选自T-2毒素、疣孢菌素A、杆孢菌素A或anguidine。所述紫杉烷为本领域常规的紫杉烷，较佳地选自紫杉醇、无氢化蓖麻油、紫杉醇的白蛋白工程化纳米颗粒制剂(American PharmaceuticalPartners，Schaumberg，Illinois)、多西他赛、苯丁酸氮芥、吉西他滨、6-硫代鸟嘌呤、巯嘌呤或甲氨蝶呤。所述的铂类似物为本领域常规的铂类似物，较佳地选自顺铂、卡铂、长春碱、依托泊苷、异环磷酰胺、米托蒽醌、长春新碱、诺安托、替尼泊苷、依达曲沙、道诺霉素、氨基蝶呤、卡培他滨伊班膦酸盐、CPT-11、拓扑异构酶抑制剂RFS 2000或二氟甲基鸟氨酸。所述的类视黄醇为本领域的类视黄醇，较佳地为视黄酸。
其中，所述放射性同位素为本领域常规的放射性同位素，较佳地，其与上述蛋白质直接结合，或者通过螯合剂与上述蛋白质结合。更佳地，其与所述蛋白质的半胱氨酸残基直接结合。较佳地，所述放射性同位素选自适于放射治疗的α-发射体、β-发射体和俄歇电子以及适于诊断的正电子发射体或γ-发射体。更佳地，所述放射性同位素选自18氟、64铜、65铜。67镓、68镓、77溴、80m溴、95钌、97钌、103钌、105钌、99m锝、107汞、203汞、123碘、124碘、125碘、126碘、131碘、133碘、111铟、113铟、99m铼、105铼、101铼、186铼、188铼、121m碲、99锝、122m碲、125m碲、165铥、167铥、168铥、90钇、213铋、213铅或225锕，或者其衍生的氮化物或氧化物。
其中，所述治疗性核酸为本领域常规的核酸，较佳地为编码免疫调节剂、抗血管生成剂、抗增殖剂或促凋亡剂的基因。所述治疗剂包括所述治疗剂、其衍生物和所述治疗剂在药学上可接受的盐、酸及衍生物。
其中，所述的免疫调节剂为本领域常规的免疫调节剂，即引发免疫应答，包括体液免疫应答(例如抗原特异性抗体的产生)和细胞介导的免疫应答(例如淋巴细胞增殖)的试剂。较佳地选自细胞因子、生长因子、激素、抗激素药、免疫抑制剂或皮质类固醇。所述细胞因子为本领域常规的细胞因子，较佳地选自黄嘌呤、白介素或干扰素。所述的生长因子为本领域常规的生长因子，较佳地选自TNF、CSF、GM-CSF或G-CSF。所述的激素为本领域常规的激素，较佳地选自雌激素、雄激素或孕激素。更佳地，所述的雌激素为已烯雌酚或雌二醇。更佳地，所述的雄激素为睾酮或氟甲睾酮。更佳地，所述的孕激素为乙酸甲地孕酮或乙酸甲羟孕酮。所述的皮质类固醇为本领域常规的皮质类固醇，较佳地选自强的松、地塞米松或化可的松。所述抗激素药为本领域常规的抗激素药，其能阻断激素对肿瘤的作用，抑制细胞因子生产，下调自身抗原表达、或掩蔽MHC抗原的免疫抑制剂。较佳地选自抗雌激素药、抗雄激素药或抗肾上腺素药。更佳地，所述抗雌激素药选自它莫西芬、雷洛昔芬、芳香酶抑制性4(5)-咪唑类、4-羟基它莫西芬、曲沃昔芬或托瑞米芬。所述抗雄激素药选自氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、亮丙瑞林或戈舍瑞林。所述免疫抑制剂为本领域常规的免疫抑制剂，较佳地选自2-氨基-6芳基-5取代的嘧啶类、硫唑嘌呤、环磷酰胺、溴隐亭、达那唑、氨苯砜、戊二醛、针对MHC抗原和MHC片段的抗独特型抗体、环孢菌素A、类固醇例如糖皮质类固醇、链激酶、TGFb、雷帕霉素、T细胞受体、T细胞受体片段、细胞因子受体拮抗剂或T细胞受体抗体。更佳地，所述细胞因子受体拮抗剂选自抗干扰素抗体、抗IL10抗体、抗TNFa抗体或抗IL2抗体。
其中，所述的抗血管生成剂为本领域常规的抗血管生成剂，较佳地选自法尼基转移酶抑制剂、COX-2抑制剂、VEGF抑制剂、bFGF抑制剂、类固醇硫酸酯酶抑制剂、白介素-24、凝血栓蛋白、metallospondin蛋白质、I类干扰素、白介素12、鱼精蛋白、血管他丁、层粘连蛋白、内皮他丁或催乳激素片段。更佳地为2-甲氧基雌二醇二氨基磺酸酯(2-MeOE2bisMATE)。
其中，所述抗增殖促凋亡剂为本领域常规的抗增殖促凋亡剂，较佳地选自PPAR-γ激活剂、类视黄醇、三萜类化合物、EGF受体抑制剂、端粒末端转移酶抑制剂、铁螯合剂、凋亡蛋白、Bcl-2和Bcl-X(L)的抑制剂、TNF-α/FAS配体/TNF相关的凋亡诱导配体及其信号传导的激活物或PI3K-Akt存活途径信号抑制剂。所述PPAR-γ激活剂为本领域常规的PPAR-γ激活剂，较佳地为环戊烯酮前列腺素(cyPGs)。所述三萜类化合物为本领域常规的三萜类化合物，较佳地选自环菠萝蜜烷、羽扇豆烷、乌苏烷、齐敦果烷、木栓烷、达玛烷、葫芦素、柠檬苦素类似物或三萜类化合物。所述EGF受体抑制剂为本领域常规的EGF受体抑制剂，较佳地选自HER4、雷帕霉素或1，25-二羟基胆钙化醇(维生素D)。所述的铁螯合物为本领域常规的铁螯合物，较佳地为3-氨基吡啶-2-甲醛硫代缩氨基脲。所述的凋亡蛋白为本领域常规的凋亡蛋白，较佳地为鸡贫血病病毒的病毒蛋白质3-VP3。所述PI3K-Akt存活途径信号抑制剂为本领域常规的PI3K-Akt存活途径信号抑制剂，较佳地为UCN-01或格尔德霉素。
其中，所述细胞溶解酶为本领域常规的细胞溶解酶，较佳地为RNA酶。
本发明优选地，式1中x＝y＝n；由此
在一个优选实施例中，-(L)x-(D)y为：
其中m为1～10，优选m为5。
在一个优选实施例中，-(L)x-(D)y为：
在一个优选实施例中，-(L)x-(D)y为：
最佳地，所述D为微管蛋白合成酶抑制剂——甲基奥瑞他汀F(MMAF)，且所述接头L为马来酰亚胺基己酰(maleimidocaproyl，MC)，所述抗体药物偶联物的结构如式3所示，
或者，所述L为4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯；D为N2’-脱乙酰-N2’-3-巯基-1氧代丙基-美登素(DM1)，所述抗体药物偶联物的结构如式4所示，
或者，L为马来酰亚胺基己酰-L-缬氨酸-L-瓜氨酸对氨基苄醇，D为甲基奥瑞他汀E(MMAE)，所述抗体药物偶联物的结构如式5所示，
其中，n为自然数，优选为1～20的整数，更优选为2-8的整数，例如为3或4。
所述的抗体药物偶联物的制备方法可为本领域常规，较佳地采用Doronina，2006，Bioconjugate Chem.17,114-124所记载的制备方法。较佳地，所述的制备方法产生具有最低限度的低偶联级分(LCF)小于10％的抗体药物偶联物。
为解决上述技术问题，本发明还提供上述的抗体药物偶联物的制备方法，其包括以下步骤：
a.将上述的分离的蛋白质经过硼酸钠缓冲液透析后，加入三(2-羧乙基)膦，室温下还原得反应液A；
b.将反应液A洗脱去除多余的蛋白质得反应液B；
c.向反应液B中加入上述的-(L)x-(D)y反应即得。
较佳地，所述步骤a中，所述硼酸钠缓冲液的pH值为6.5～8.5；所述三(2-羧乙基)膦(TCEP)与所述的分离的蛋白质的摩尔比比率为2～10；所述还原的时间为1～4小时；和/或，所述步骤c中，-(L)x-(D)y与所述的分离的蛋白质的摩尔比比率为5～20，所述反应的温度为10～37℃，所述反应的时间为4小时。
更佳地，所述的制备方法包括以下的步骤：将上述蛋白质经过pH 6.5～8.5的硼酸钠缓冲液透析后，加入三(2-羧乙基)膦(TCEP)，其中TCEP与上述蛋白质的摩尔比比率为2～10，室温下还原1～4小时，得反应液A。将反应液A洗脱去除多余的上述蛋白质得反应液B。向反应液B中加入MC-MMAF，其中MC-MMAF与纯化的TROP2抗体的摩尔比比率为5～20，10～37℃下反应4小时。
所述的抗体药物偶联物能够以本领域所知的任何物理形态而存在，较佳地为澄清溶液。
为解决上述技术问题，本发明还提供一种药物组合物，其包括上述的分离的蛋白质和/或上述的抗体药物偶联物，和药学可接受的载体。所述的药物组合物较佳地还包括其他抗肿瘤抗体作为活性成分。
所述的药学可接受的载体可为本领域常规的载体，所述的载体可以为任意合适的生理学或药学上可接受的药物辅料。所述的药物辅料为本领域常规的药物辅料，较佳地包括药学上可接受的赋形剂、填充剂或稀释剂等。更佳地，所述的药物组合物包括0.01～99.99％的上述蛋白质和/或上述的抗体药物偶联物，和0.01～99.99％的药用载体，所述百分比为占所述药物组合物的质量百分比。
较佳地，所述的药物组合物是抗肿瘤的药物。更佳地为抗鳞状/腺瘤性肺癌(非小细胞肺癌)、浸润性乳腺癌、结肠癌、直肠癌、胃癌、鳞状宫颈癌、浸润性子宫内膜腺癌、浸润性胰腺癌、卵巢癌、鳞状膀胱癌、绒毛膜癌、支气管癌、乳腺癌、子宫颈癌、胰腺癌或精囊癌的药物。
本发明所述的药物组合物的给药途径较佳地为肠胃外施用、注射给药或口服给药。所述注射给药较佳地包括静脉注射、肌肉注射、腹腔注射、皮内注射或皮下注射等途径。所述的药物组合物为本领域常规的各种剂型，较佳地为固体、半固体或液体的形式，即可以为水溶液、非水溶液或混悬液，更佳的为片剂、胶囊、颗粒剂、注射剂或输注剂等。更佳地为经由血管内、皮下、腹膜内或肌内施用。较佳地，所述药物组合物还可以作为气雾剂或粗喷雾剂施用，即经鼻施用；或者，鞘内、髓内或心室内施用。更佳地，所述的药物组合物还可以透皮、经皮、局部、肠内、阴道内、舌下或经直肠施用。
本发明所述的药物组合物的给药剂量水平可以根据达到所需诊断或治疗结果的组合物量而调整。施用方案也可以为单次注射或多次注射，或进行调整。所选择的剂量水平和方案依赖于包括所述药物组合物的活性和稳定性(即，半衰期)、制剂、施用途径、与其他药物或治疗的组合、待检测和/或治疗的疾病或病症、以及待治疗的受试者的健康状况和先前医疗史等各种因素而进行合理地调整。
对于本发明的所述药物组合物的治疗有效剂量可以最初在细胞培养实验或动物模型例如啮齿类动物、兔、犬、猪和/或灵长类动物中进行估计。动物模型也可以用于测定合适的施用浓度范围和途径。随后可以用于确定在人中施用的有用剂量和途径。一般地，施用有效量或剂量的确定和调整以及何时和如何进行此类调整的评估为本领域技术人员已知。
对于组合疗法，上述蛋白质、上述抗体药物偶联物和/或另外的治疗或诊断剂可以各自作为单一药剂，在适合于执行预期治疗或诊断的任何时间范围内进行使用。因此，这些单一药剂可以基本上同时(即作为单一制剂或在数分钟或数小时内)或以按顺序连续施用。例如，这些单一药剂可以在一年内，或10、8、6、4或2个月内，或4、3、2、或1周内，或5、4、3、2或1天内施用。
关于制剂、剂量、施用方案和可测量的治疗结果的另外指导，参见Berkow等人(2000)The Merck Manual of Medical Information(Merck医学信息手册)和Merck&Co.Inc.,Whitehouse Station,New Jersey；Ebadi(1998)CRC Desk Reference ofClinical Pharmacology(临床药理学手册)等著作。
为解决上述技术问题，本发明提供一种套装药盒，其包含药盒A和药盒B，所述的药盒A为上述的蛋白质、和/或上述的抗体药物偶联物、和/或上述的药物组合物，所述的药盒B为其他抗肿瘤抗体或者包含所述其他抗肿瘤抗体的药物组合物。所述的药盒A和药盒B可以同时使用，也可以先使用药盒A再使用药盒B，还可以先使用药盒B再使用药盒A，可以根据具体应用时的实际需求而定。
为解决上述技术问题，本发明提供一种上述的分离的蛋白质在制备抗肿瘤药物中的应用。
为解决上述技术问题，本发明提供一种上述的抗体药物偶联物在制备抗肿瘤药物中的应用。
为解决上述技术问题，本发明提供一种上述的药物组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
为解决上述技术问题，本发明提供一种上述的套装药盒在制备抗肿瘤药物中的应用。
为解决上述技术问题，本发明提供一种上述的分离的蛋白质在治疗肿瘤中的应用。
为解决上述技术问题，本发明提供一种上述的抗体药物偶联物在治疗肿瘤中的应用。
为解决上述技术问题，本发明提供一种上述的药物组合物在治疗肿瘤中的应用。
为解决上述技术问题，本发明提供一种上述的套装药盒在治疗肿瘤中的应用。
较佳地，本发明中，所述抗肿瘤药物为与TROP2表达或功能异常相关的疾病的药物，所述肿瘤优选与TROP2表达或功能异常相关的肿瘤；更佳地，所述与TROP2表达或功能异常相关的疾病或肿瘤为：自体免疫疾病、炎症性疾病、感染性疾病或增殖性疾病，优选非小细胞肺癌、浸润性乳腺癌、结肠癌、直肠癌、胃癌、鳞状宫颈癌、浸润性子宫内膜腺癌、浸润性胰腺癌、卵巢癌、鳞状膀胱癌、绒毛膜癌、支气管癌、乳腺癌、子宫颈癌、胰腺癌或精囊癌。
为解决上述技术问题，本发明还提供一种检测过表达TROP2蛋白的细胞的方法，其包括如下的步骤：上述的蛋白质与待检细胞样品在体外接触，检测上述的蛋白质与所述待检细胞样品的结合即可。
所述的过表达的含义为本领域常规，较佳地为待检样品中，细胞经过流式检测，上述的蛋白质的平均荧光密度(MFI)值是亚型IgG的MFI值的3倍及以上。
所述结合的检测方式是本领域常规的检测方式，较佳地为FACS检测。
本发明中，所述待测细胞样品一般为离体的待测细胞样品。
本发明所述的“TROP2阳性”的细胞即为过表达TROP2蛋白的细胞，如MDA-MB-468细胞株；反之，则称为“TROP2阴性”的细胞，如肿瘤细胞系HCC1395。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：本发明所述的TROP2抗体与hTROP2或cTROP2或mTROP2蛋白具有高度亲和力，能够在蛋白水平和细胞水平结合所述TROP2蛋白的胞外区。所述的TROP2抗体与如MC-MMAF的小分子化合物偶联后得到一抗体药物偶联物(ADC)，所述抗体药物偶联物能够有效地对TROP2阳性细胞进行细胞毒杀伤作用。此外，本发明的抗体药物偶联物中，TROP2抗体能把小分子化合物，如MMAF，通过内吞作用带入细胞，并在细胞内降解释放小分子化合物，从而起到细胞毒杀伤作用。因此所述的TROP2抗体药物偶联物，能够有效杀伤肿瘤细胞，治疗肿瘤。将本发明所述的TROP2抗体制备成人源化抗体后，能够保持与人源或食蟹猴源的TROP2蛋白具有高度亲和力，且能够很好的抑制肿瘤细胞的生长，对体重无显著影响。
附图说明
图1为人TROP2蛋白转染的HEK293细胞FACS筛选检测结果。
图2为人TROP2蛋白转染的CHOK1细胞FACS筛选检测结果。
图3为食蟹猴TROP2蛋白转染的CHOK1细胞FACS筛选检测结果。
图4为小鼠TROP2蛋白转染的CHOK1细胞FACS筛选检测结果。
图5为ELISA检测TROP2免疫后小鼠血清抗体效价情况。
图6A为ELISA检测TROP2抗体与人TROP2-hFc蛋白的结合反应；TROP2抗体的克隆号分别为10E12C10F10、11E8E6D11、21F3D6C9、31A3D11、37E6D6、44A5F9、46G12A7、52F12B3和54D10A2。
图6B为ELISA检测TROP2抗体与人TROP2-hFc蛋白的结合反应；TROP2抗体的克隆号分别为78D5C3、39E1G3、43B1G8C9、44H8E6、45C3E5、72E11H2、72E6D11和73A9G10。
图7A为FACS检测TROP2抗体与CHOK1-hTROP2的结合反应；TROP2抗体的克隆号分别为10E12C10F10、11E8E6D11、21F3D6C9、31A3D11、37E6D6、44A5F9、46G12A7和52F12B3。
图7B为FACS检测TROP2抗体与CHOK1-hTROP2的结合反应；TROP2抗体的克隆号分别为54D10A2、78D5C3、39E1G3、43B1G8C9、44H8E6、72E11H2、72E6D11和73A9G10。
图8A为FACS检测TROP2抗体与CHOK1-cTROP2的结合反应；TROP2抗体的克隆号分别为10E12C10F10、11E8E6D11、21F3D6C9、31A3D11、37E6D6、44A5F9、46G12A7和52F12B3。
图8B为FACS检测TROP2抗体与CHOK1-cTROP2的结合反应；TROP2抗体的克隆号分别为54D10A2、78D5C3、39E1G3、43B1G8C9、44H8E6、72E11H2、72E6D11和73A9G10。
图9A为FACS检测TROP2抗体与CHOK1-mTROP2的结合反应；TROP2抗体的克隆号分别为10E12C10F10、11E8E6D11、21F3D6C9、31A3D11、37E6D6、44A5F9、46G12A7和52F12B3。
图9B为FACS检测TROP2抗体与CHOK1-mTROP2的结合反应；TROP2抗体的克隆号分别为54D10A2、78D5C3、39E1G3、43B1G8C9、44H8E6、72E11H2、72E6D11和73A9G10。
图10A为FACS检测TROP2抗体与CHOK1的结合反应；TROP2抗体的克隆号分别为10E12C10F10、11E8E6D11、21F3D6C9、31A3D11、37E6D6、44A5F9、46G12A7和52F12B3。
图10B为FACS检测TROP2抗体与CHOK1的结合反应；TROP2抗体的克隆号分别为54D10A2、78D5C3、39E1G3、43B1G8C9、44H8E6、72E11H2、72E6D11和73A9G10。
图11A为TROP2抗体-MMAF抗体药物偶联物对TROP2表达阳性三阴性乳腺癌细胞株MAD-MB-468的细胞杀伤作用；TROP2抗体的克隆号分别为10E12C10F10、11E8E6D11、21F3D6C9、31A3D11和37E6D6。
图11B为TROP2抗体-MMAF抗体药物偶联物对TROP2表达阳性三阴性乳腺癌细胞株MAD-MB-468的细胞杀伤作用；TROP2抗体的克隆号分别为44A5F9、46G12A7、52F12B3、54D10A2和78D5C3。
图11C为TROP2抗体-MMAF抗体药物偶联物对TROP2表达阳性三阴性乳腺癌细胞株MAD-MB-468的细胞杀伤作用；TROP2抗体的克隆号分别为39E1G3、43B1G8C9、44H8E6、45C3E5、72E11H2、72E6D11和73A9G10。
图12A为TROP2抗体-MMAF抗体药物偶联物对TROP2表达阴性乳腺癌细胞株HCC1395的细胞杀伤作用；TROP2抗体的克隆号分别为10E12C10F10、11E8E6D11、21F3D6C9、31A3D11和37E6D6。
图12B为TROP2抗体-MMAF抗体药物偶联物对TROP2表达阴性乳腺癌细胞株HCC1395的细胞杀伤作用；TROP2抗体的克隆号分别为44A5F9、46G12A7、52F12B3、54D10A2和78D5C3。
图12C为TROP2抗体-MMAF抗体药物偶联物对TROP2表达阴性乳腺癌细胞株HCC1395的细胞杀伤作用；TROP2抗体的克隆号分别为39E1G3、43B1G8C9、44H8E6、45C3E5、72E11H2、72E6D11和73A9G10。
图13为偶联MMAF的TROP2嵌合抗体药物偶联物对TROP2阳性的肿瘤细胞系MDA-MB-468的细胞杀伤作用。TROP2嵌合抗体的克隆号分别为11E8E6D11、21F3D6C9、37E6D6、44A5F9、46G12A7、52F12B3、54D10A2和78D5C3。
图14A为偶联MMAF的TROP2嵌合抗体药物偶联物对TROP2阳性的肿瘤细胞系BxPC-3的细胞杀伤作用。TROP2嵌合抗体的克隆号分别为11E8E6D11、21F3D6C9、44A5F9、78D5C3和46G12A7。
图14B为偶联MMAF的TROP2嵌合抗体药物偶联物对TROP2阳性的肿瘤细胞系COLO205的细胞杀伤作用。TROP2嵌合抗体的克隆号分别为11E8E6D11、21F3D6C9、44A5F9、78D5C3和46G12A7。
图15A为偶联MMAF的TROP2嵌合抗体37E6的抗体药物偶联物及其裸抗的治疗后的肿瘤体积变化图。
图15B为偶联MMAF的TROP2嵌合抗体46G12的抗体药物偶联物及其裸抗的治疗后的肿瘤体积变化图。
图15C为偶联MMAF的TROP2嵌合抗体52F12的抗体药物偶联物及其裸抗的治疗后的肿瘤体积变化图。
图15D为偶联MMAF的TROP2嵌合抗体54D10的抗体药物偶联物及其裸抗的治疗后的肿瘤体积变化图。
图16A为偶联MMAF的TROP2嵌合抗体37E6的抗体药物偶联物及其裸抗的治疗后的小鼠体重变化图。
图16B为偶联MMAF的TROP2嵌合抗体46G12的抗体药物偶联物及其裸抗的治疗后的小鼠体重变化图。
图16C为偶联MMAF的TROP2嵌合抗体52F12的抗体药物偶联物及其裸抗的治疗后的小鼠体重变化图。
图16D为偶联MMAF的TROP2嵌合抗体54D10的抗体药物偶联物及其裸抗的治疗后的小鼠体重变化图。
图17A为偶联MMAE的TROP2嵌合抗体药物偶联物对TROP2阳性的肿瘤细胞系MDA-MB-468的细胞杀伤作用。TROP2嵌合抗体的克隆号分别为11E8E6D11、21F3D6C9、44A5F9、46G12A7和78D5C3。
图17B为偶联MMAE的TROP2嵌合抗体药物偶联物对TROP2阳性的肿瘤细胞系COLO205的细胞杀伤作用。TROP2嵌合抗体的克隆号分别为11E8E6D11、21F3D6C9、44A5F9、46G12A7和78D5C3。
图18A为偶联MMAE的TROP2嵌合抗体药物偶联物治疗后的肿瘤体积变化图。TROP2嵌合抗体的克隆号分别为11E8E6D11、21F3D6C9、44A5F9、46G12A7和78D5C3。
图18B为偶联MMAE的TROP2嵌合抗体药物偶联物治疗后的小鼠体重变化图。TROP2嵌合抗体的克隆号分别为11E8E6D11、21F3D6C9、44A5F9、46G12A7和78D5C3。
图19为TROP2嵌合抗体在大鼠中单次施用后血浆清除药动学图。
图20为hRS7在大鼠中单次施用后血浆清除药动学图。
图21为突变后的嵌合抗体通过FACS进行结合活性鉴定的结果图。
图22A显示了流式细胞实验(FACS)检测11E8人源化抗体与表达人源TROP2细胞的结合的结果图。
图22B显示了流式细胞实验(FACS)检测44A5F9人源化抗体与表达人源TROP2细胞的结合的结果图。
图23A显示了流式细胞实验(FACS)检测11E8人源化抗体与表达食蟹猴源TROP2细胞的结合的结果图。
图23B显示了流式细胞实验(FACS)检测44A5F9人源化抗体与表达食蟹猴源TROP2细胞的结合的结果图。
图24A显示了治疗后肿瘤的体积变化图。
图24B显示了治疗后的鼠重变化图。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例中所述的室温为本领域常规的室温，一般为10～30℃。
若无特别说明，实施例中所述的PBS为PBS磷酸缓冲液，pH7.2。
实施例1杂交瘤细胞的制备
(一)、免疫原A的制备
将含有编码人源TROP2蛋白全长氨基酸序列(如序列表SEQ ID NO:137所示)的第88-274位(Thr88-Thr274)胞外区氨基酸序列的核苷酸序列克隆到带有人IgG Fc片段(hFc)的pCpC载体(购自Invitrogen，V044-50)并按已建立的标准分子生物学方法制备质粒。具体方法参见Sambrook,J.,Fritsch,E.F.,and Maniatis,T.(1989).Molecular Cloning:ALaboratory Manual,Second Edition(Plainview,New York:Cold Spring HarborLaboratory Press)。对HEK293细胞(购自Invitrogen)进行瞬时转染(聚醚酰亚胺PEI，购自Polysciences)并使用FreeStyle TM 293(购自Invitrogen)在37℃下进行扩大培养。4天后收集细胞培养液，离心去除细胞成分，得含hTROP2蛋白胞外区的培养上清液。将培养上清液上样到蛋白A亲和层析柱(Mabselect Sure，购自GE Healthcare)，同时用紫外(UV)检测仪监测紫外吸收值(A280nm)的变化。上样后用PBS磷酸盐缓冲液(pH7.2)清洗蛋白A亲和层析柱直到紫外吸收值回到基线，然后用0.1M甘氨酸盐酸(pH2.5)洗脱，收集从蛋白A亲和层析柱上洗脱下来的带hFc标签的TROP2蛋白(即人源TROP2-hFc)。用PBS磷酸盐缓冲液(pH7.2)在4℃冰箱透析过夜。透析后的蛋白经0.22微米无菌过滤后分装于-80℃保存，即获得纯化的免疫原A(即hTROP2-hFc)。
免疫原A在使用前需要进行一系列质控检测，如检测其蛋白浓度、纯度、分子量、生物活性等，结果发现免疫原A各项指标良好，能够作为抗原进行后续制备TROP2抗体的试验。
(二)、免疫原B的制备
编码人源TROP2全长氨基酸序列的核苷酸序列被克隆到pIRES载体(购自Clontech)并制备质粒。对HEK293细胞系和CHOK1细胞系(均购自Invitrogen)进行质粒转染(PEI，购自Polysciences)后，在含0.5μg/mL puromycin(嘌呤霉素)的含10％(w/w)胎牛血清的DMEM培养基中选择性培养2周，用有限稀释法在96孔培养板中进行亚克隆，并置于37℃、5％(v/v)CO2培养，大约2周后选择部分单克隆孔扩增到6孔板中。对扩增后的克隆用已知的TROP2抗体经流式细胞分析法进行筛选。选择长势较好、荧光强度较高、单克隆的细胞系继续扩大培养并液氮冻存，即获得免疫原B(即，含人源TROP2的293F-TROP2稳定细胞系)。具体选择结果如表2和图1所示，IgG亚型对照为小鼠IgG对照。表2说明，已经制得一系列hTROP2阳性表达的HEK293细胞系。图1是克隆号为293F-TROP2 6F6的结果，其中，横坐标为细胞荧光强度，纵坐标为细胞数。表2和图1的结果说明，6F6为hTROP2高水平表达细胞株，其中TROP2抗体标记的细胞平均细胞荧光密度为3224.98，迁移率为99.69％。
表2 hTROP2蛋白转染的HEK293细胞FACS筛选检测结果
(三)、杂交瘤细胞的制备和抗体筛选
A、免疫原A免疫
采用6～8周龄BALB/cAnNCrl小鼠或SJL/JorllcoCrl小鼠(上海斯莱克公司)，小鼠在SPF条件下饲养。初次免疫时，将步骤(一)获得的免疫原A(即hTROP2-hFc)用弗氏完全佐剂乳化后腹腔注射0.25mL，即每只小鼠注射50μg免疫原A蛋白。加强免疫时，免疫原A用弗氏不完全佐剂乳化后腹腔注射0.25mL，即每只小鼠注射50微克免疫原A。初次免疫与第一次加强免疫之间间隔2周，以后每次加强免疫之间间隔3周。每次加强免疫1周后采血，用ELISA和FACS检测血清中免疫原A的抗体效价和特异性，结果如图5和表3所示。图5和表3说明，经免疫原A免疫的小鼠的免疫后血清对免疫原A均有不同程度的结合，呈现抗原抗体反应，其中最高稀释度在一百万左右。其中空白对照为1％(w/v)BSA，其中批次指第二次加强免疫后第七天的小鼠血清(Test Blood2，TB2)，表中的数据为OD450nm值。
表3 ELISA检测TROP2蛋白免疫后Balb/c小鼠血清抗体效价
B、免疫原B免疫
采用6～8周龄BALB/cAnNCrl小鼠或SJL/JorllcoCrl小鼠(均购自上海斯莱克公司)，小鼠在SPF条件下饲养。按实施例1步骤(二)中的得到的免疫原B(即，含人源TROP2的293F-TROP2稳定细胞系)在T-75细胞培养瓶中扩大培养至90％汇合度，吸尽培养基，用DMEM基础培养基(Invitrogen)洗涤2次，然后用无酶细胞解离液(Invitrogen)37℃处理直至细胞从培养皿壁上可脱落，收集细胞。用DMEM基础培养基洗涤2次，进行细胞计数后将细胞用磷酸盐缓冲液稀释至2×107细胞每mL。每只小鼠每次免疫时腹腔注射0.5mL细胞悬液。第一次与第二次免疫之间间隔2周，以后每次免疫间隔3周。除第一次免疫以外，每次免疫1周后采血，用FACS检测血清中抗体效价和特异性。在第二次加强免疫后，FACS检测血清抗体效价达到1:1000以上。
C、杂交瘤细胞的制备和筛选
A～B步骤在各自完成前，将所选择的每只小鼠进行最后一次免疫腹腔注射100微克纯化的免疫原A(针对免疫原A进行免疫反应的小鼠)或含有人源TROP2的HEK293稳定细胞系(针对免疫原B进行免疫反应的小鼠)，5天后处死小鼠，收集脾细胞。加入NH4OH至终浓度1％(v/v)，裂解脾细胞中掺杂的红细胞，获得脾细胞悬液。用DMEM基础培养基(购自invitrogen)1000转每分钟离心清洗细胞3次，然后按照活细胞数目5:1比率与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0(购自ATCC)混合，采用高效电融合方法(参见METHODS IN ENZYMOLOGY,VOL.220)进行细胞融合。融合后的细胞稀释到含20％(v/v)胎牛血清、1×HAT的DMEM培养基中。然后按1×105细胞/200微升每孔加入到96孔细胞培养板中，放入5％(v/v)CO2、37℃培养箱中培养。14天后用ELISA和Acumen(微孔板细胞检测法)筛选细胞融合板上清，将ELISA中OD450nm>1.0和Acumen中MFI值>100的阳性克隆扩增到24孔板，在含10％(v/v)HT胎牛血清的DMEM培养基中，于37℃、5％(v/v)CO2条件下扩大培养。培养3天后取24孔板中扩大培养的培养液进行离心，收集上清液，对上清液进行抗体亚型分析。用ELISA、FACS确定其对TROP2蛋白和TROP2阳性细胞的结合活性(结合活性的检测方法分别参见实施例3A和实施例3B中的相关内容)，用小鼠源TROP2抗体-MMAF间接细胞毒杀伤实验评估间接细胞毒杀伤活性(间接细胞毒杀伤活性检测方法参见实施例4中的相关内容)。根据24孔板筛选结果，挑选ELISA实验中OD450nm>1.0、FACS实验中MFI值>50和间接细胞毒杀伤实验中杂交瘤细胞培养上清对TROP2阳性细胞杀伤率达到50％的杂交瘤细胞为符合条件的阳性克隆，选择符合条件的杂交瘤细胞用有限稀释法在96孔板进行亚克隆，在含10％(v/v)胎牛血清的DMEM培养基中，37℃、5％(v/v)CO2条件下培养。亚克隆后10天用ELISA和Acumen进行初步筛选，挑选单个阳性单克隆扩增到24孔板继续培养。3天后用FACS确定抗原结合活性，并用小鼠源TROP2抗体-MMAF间接细胞毒杀伤实验评估间接细胞毒杀伤活性(评估标准为ELISA实验中OD450nm>1.0、FACS实验中MFI值>50和间接细胞毒杀伤实验中杂交瘤细胞培养上清对TROP2阳性细胞杀伤率达到50％及以上)。根据24孔板样品检测结果，挑选出最优的克隆，并于含10％(v/v)胎牛血清的DMEM培养基中，在37℃、5％(v/v)CO2条件下将该最优的克隆进行扩大培养，液氮冻存即得本发明杂交瘤细胞，并可用于后续的先导抗体生产和纯化。
实施例2先导抗体的生产和纯化
由于杂交瘤细胞产生的抗体浓度较低，大约仅1-10μg/mL，浓度变化较大，且培养基中细胞培养所产生的多种蛋白和培养基所含胎牛血清成分对很多生物活性分析方法都有不同程度的干扰，因此需要进行小规模(1-5mg)抗体生产纯化。
将实施例1所得的杂交瘤细胞接种到T-75细胞培养瓶并用生产培养基(Hybridomaserum free medium，购自Invitrogen)驯化传代3代。待其生长状态良好，接种细胞培养转瓶。每个2升的培养转瓶中加入200mL生产培养基，接种细胞密度为1.0×105/mL。盖紧瓶盖，将转瓶置于37℃培养箱中的转瓶机上，转速3转/分钟。连续旋转培养14天后，收集细胞培养液，过滤去除细胞，并用0.45μm的滤膜过滤至培养上清液澄清，得澄清的杂交瘤细胞的培养上清液。澄清的杂交瘤细胞的培养上清液可立即进行纯化或于-30℃冻存。
将获得的培养上清液(200mL)中的TROP2抗体用2mL蛋白A柱(GE Healthcare)纯化。蛋白A柱先用平衡缓冲液(PBS磷酸缓冲液，pH7.4)平衡，然后将培养上清液上样到蛋白A柱，控制流速在3mL/分钟。上样完毕后用平衡缓冲液清洗蛋白A柱，平衡缓冲液的体积为蛋白A柱柱床体积的4倍。用洗脱液(0.1M柠檬酸钠缓冲液，pH3.5)洗脱结合在蛋白A柱上的TROP2抗体，用紫外检测器监测洗脱情况(A280nm紫外吸收峰)。收集洗脱的抗体，加入10％(v/v)1.0M Tris-HCl缓冲液中和pH，然后立即用PBS磷酸缓冲液透析过夜，第二天换液1次并继续透析3小时。收集透析后的TROP2抗体，用0.22μm的滤器进行无菌过滤，无菌保存，即得纯化的TROP2抗体。将纯化的TROP2抗体进行蛋白浓度(A280nm/1.4)、纯度、内毒(Lonza试剂盒)等检测分析，结果如表4所示，表4说明，抗体最终产品内毒素浓度在1.0EU/mg以内。
表4纯化的TROP2抗体检测分析
实施例3先导抗体的检定
A、酶联免疫吸附实验(ELISA)检测TROP2抗体与TROP2蛋白的结合
对实施例2所得的纯化的TROP2抗体进行与人源TROP2-hFc蛋白(免疫原A)进行反应。
将实施例1获得的纯化的免疫原A[其制备方法参见实施例1步骤(一)]用PBS稀释到终浓度1.0μg/mL，然后以100μL每孔加到96孔ELISA板。用塑料膜封好4℃孵育过夜，第二天用洗板液[含0.01％(v/v)Tween20的PBS]洗板2次，加入封闭液[含0.01％(v/v)Tween20和1％(w/w)BSA的PBS]室温封闭2小时。倒掉封闭液，加入实施例2所得的纯化的TROP2抗体100μL每孔。37℃孵育2小时后，用洗板液[含0.01％(v/v)Tween20的PBS]洗板3次。加入HRP(辣根过氧化物酶)标记的二抗(购自Sigma，CatA0168)，37℃孵育2小时后，用洗板液[含0.01％(v/v)Tween20的PBS]洗板3次。加入TMB底物100μL每孔，室温孵育30分钟后，加入终止液(1.0N HCl)100μL每孔。用ELISA读板机(SpectraMax 384plus，购自MolecularDevice)读取A450nm数值，结果如图6A、图6B和表5所示，图6A、图6B和表5说明，纯化的TROP2抗体与TROP2重组蛋白在ELISA水平结合。表5中IgG对照(上海睿智化学研究有限公司生产)为对照小鼠IgG，表中的数据为OD450nm值，Blank的含义为板中只有PBS缓冲液时的OD450nm值。其中，hRS7序列来自专利US8758752，根据专利中制备方法由上海睿智化学研究有限公司表达生产。
表5 ELISA检测TROP2抗体与人TROP2-hFc蛋白的结合反应
B、流式细胞实验(FACS)检测TROP2抗体与TROP2表达细胞的结合
将实施例1步骤(二)中所述含有编码人源TROP2全长氨基酸序列的核苷酸序列的pIRES质粒转染CHOK1细胞株得含人源TROP2的CHOK1稳定细胞株(此处称为CHOK1-hTROP2稳定细胞株)。类似地，将带有食蟹猴TROP2全长基因(其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:138所示)的pIRES质粒(其制备方法与实施例1步骤(一)“免疫原A的制备”中带有人源IgG Fc片段(hFc)的pCpC载体的制备方法相同)转染CHOK1细胞株得含食蟹猴TROP2的CHOK1稳定细胞株(此处称为CHOK1-cTROP2稳定细胞株)。将带有小鼠源TROP2全长基因(其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:139所示)的pIRES质粒(其制备方法与实施例1步骤(一)“免疫原A的制备”中带有人源IgG Fc片段(hFc)的pCpC载体的制备方法相同)转染CHOK1细胞株得含小鼠TROP2的CHOK1稳定细胞株(此处称为CHOK1-mTROP2稳定细胞株)。
用FACS检测上述稳定细胞株中的蛋白表达情况，检测方法参见实施例1步骤(二)“免疫原B的制备”中鉴定HEK293-TROP2稳定细胞株的方法。检测结果如表6和图2～4所示，图2～4中横坐标为细胞荧光强度，纵坐标为细胞数。其中，CHOK1-hTROP2 2B2为用来筛选的人TROP2表达细胞株，其FACS筛选检测结果如图2所示；CHOK1-cTROP2 2B2C2为用来筛选的食蟹猴TROP2表达细胞株，其FACS筛选检测结果如图3所示；CHOK1-mTROP2 6F6为用来筛选的小鼠TROP2表达细胞株，其FACS筛选检测结果如图4所示。表6的结果说明，CHOK1-hTROP2稳定细胞株、CHOK1-cTROP2稳定细胞株和CHOK1-mTROP2稳定细胞株的细胞膜上分别过表达人、食蟹猴或小鼠的TROP2蛋白，其可以用于筛选TROP2抗体。
表6人/猴/小鼠TROP2转染的CHOK1细胞FACS筛选检测结果
将上述CHOk1-hTROP2稳定细胞株、CHOK1-cTROP2稳定细胞株、CHOK1-mTROP2稳定细胞株(即表6所示的CHOK1-hTROP2 2B2、CHOK1-cTROP2 2B2C2和CHOK1-mTROP2 6F6)以及CHOK1细胞分别在T-75细胞培养瓶中扩大培养至90％汇合度，吸尽培养基，用HBSS缓冲液(Hanks Balanced Salt Solution，购自Invitrogen)洗涤2次，然后用无酶细胞解离液(Versene solution，购自Life technology公司)处理和收集细胞。用HBSS缓冲液洗涤细胞2次，进行细胞计数后将细胞用HBSS缓冲液稀释至2×106个细胞/mL，加入10％山羊血清封闭液，所述百分比为质量百分比，冰上孵育30分钟，然后用HBSS缓冲液离心洗涤2次。将收集的细胞用FACS缓冲液(HBSS+1％BSA，所述百分比为质量百分比)悬浮至2×106个细胞/mL，按每孔100微升加入到96孔FACS反应板中，加入实施例2所得的纯化的TROP2抗体待测样品每孔100微升，冰上孵育2小时。用FACS缓冲液离心洗涤2次，加入每孔100微升荧光(Alexa488)标记的二抗(购自Invitrogen)，冰上孵育1小时。用FACS缓冲液离心洗涤3次，加入每孔100微升固定液[4％(v/v)多聚甲醛]重悬细胞，10分钟后用FACS缓冲液离心洗涤2次。用100微升FACS缓冲液悬浮细胞，用FACS(FACS Calibur，购自BD公司)检测和分析结果。通过软件(CellQuest)进行数据分析，得到细胞的平均荧光密度(MFI)。再通过软件(GraphPadPrism5)分析，进行数据拟合，计算EC50值。分析结果如表7以及图7～10(即，图7A、图7B、图8A、图8B、图9A、图9B、图10A和图10B)所示，图7～10的数据为细胞的平均荧光密度(MFI)。表7中的数据为根据MFI计算得到的EC50值。表7说明，实施例2所得的纯化的TROP2抗体可结合细胞表面的hTROP2和cTROP2蛋白，但基本不结合mTROP2蛋白。这些抗体的效果均优于hRS7或者与之相当。
表7 FACS分析TROP2抗体与人/猴/小鼠TROP2表达细胞株结合活性
实施例4 TROP2抗体药物偶联物的细胞杀伤活性实验
将实施例2所得的纯化的TROP2抗体经过pH 6.5～8.5的硼酸钠缓冲液透析后，加入三(2-羧乙基)膦(TCEP)，其中TCEP与纯化的TROP2抗体的摩尔比比率为2，室温下还原1小时，得反应液A。将反应液A经过G25柱脱盐(购自GE)，去除多余的TCEP，得反应液B。向反应液B中加入MC-MMAF(购自南京联宁)，其中MC-MMAF与纯化的TROP2抗体的摩尔比比率为5，室温下反应4小时。再加入半胱氨酸用以中和多余的MC-MMAF，并通过G25柱脱盐除去多余的小分子。得到纯化的TROP2抗体药物偶联物(偶联方法参见Doronina，2006，BioconjugateChem.17,114-124)。通过HPLC-HIC或LC-MS分析药物的交联率、纯度等参数后，进行细胞毒活性的分析。所有抗体药物偶联物的药物交联率(DAR)约为8(测定DAR的方法为本领域常规)。其中，DAR(drug antibody ratio)指抗体偶联后一个抗体分子上携带的小分子药物的平均数量(参考文献mAbs 3:2,161-172，DOI:10.4161/mabs.3.2.14960)。其中，HPLC-HIC,HPL-SEC和LC-Ms的分析条件如下：
A.HPLC-HIC分析条件
色谱柱：Thermol MabPac,HIC-Butyl
HPLC：E2695,Waters
流动相A：1.5M硫酸铵，0.025M磷酸钠水溶液，pH＝6.95
流动相B：0.025M磷酸钠水溶液，25％(v/v)异丙醇水溶液
流速：0.5mL/min
梯度：0～2min:80％流动相A+20％流动相B
2～15min:80％～60％流动相A+20％～40％流动相B
15～18min:60％～30％流动相A+40％～70％流动相B
18～20min:70％流动相B+30％流动相A
B.HPLC-SEC分析条件
色谱柱：TSKgel 3000SWxl
HPLC:FTN-R,Waters
流动相A：1×PBS缓冲液+10％异丙醇
流速：0.5mL/min
梯度：0～20min:100％流动相A
C.LC-MS分析条件
色谱柱：Acquity UPLC BEH200,SEC 1.7μm,4.6×300mm
HPLC:Acquity UPLC H-Class Bio,Waters
MS:Triple TOF 5600,TOF 5600,AB Sciex
流动相A：0.1％甲酸，25％乙腈水溶液。
流速：0.2mL/min
梯度：0～25min:流动相A
将获得的纯化的TROP2抗体药物偶联物分别用完全培养基进行梯度稀释，96孔细胞培养板以5000细胞/孔加入90微升TROP2阳性的MDA-MB-468细胞株(购自ATCC，货号#HTB-132)细胞悬液过夜培养后，每孔分别加入10微升不同浓度的纯化的TROP2抗体药物偶联物的稀释液，继续培养5天后，用CellTiter-Glo试剂盒(购自Promega，使用方法参照产品说明书)检测细胞活力。同时选用TROP2阴性的肿瘤细胞系HCC1395(购自ATCC，货号#CRL-2324)进行细胞杀伤活性检测，方法同上。结果如表8以及图11-12(即，图11A、11B、11C、图12A、12B和12C)所示，其中表8的EC50指药物作用后，细胞的活性受到抑制的半数有效量，能够通过检测细胞的活性从而反映细胞杀伤活性。其中，图11A、11B和11C为纯化的TROP2抗体药物偶联物对TROP2阳性的肿瘤细胞系MDA-MB-468的细胞杀伤活性检测，图12A、12B和12C为纯化的TROP2抗体药物偶联物对TROP2阴性的乳腺癌肿瘤细胞系HCC1395的细胞杀伤活性检测。结果说明，上述所得纯化的TROP2抗体药物偶联物对TROP2阳性的细胞有杀伤作用。
表8细胞杀伤实验检测纯化的TROP2抗体药物偶联物对TROP2阳性细胞的特异性杀伤作用
实施例5竞争性ELISA检测分析TROP2抗体与抗原的表位分布
为了鉴定抗体对抗原的结合位点，采用竞争性ELISA的方法对TROP2抗体进行分组。
纯化的待测抗体(即实施例2所得的纯化的TROP2抗体，其克隆号分别为10E12C10F10、11E8E6D11、21F3D6C9、31A3D11、37E6D6、44A5F9、46G12A7、52F12B3、54D10A2、78D5C3、39E1G3、43B1G8C9、44H8E6、45C3E5、72E11H2、72E6D11、73A9G10，)用PBS稀释至1μg/mL，以50μL/孔包被96孔高吸附酶标板，4℃过夜包被后用250微升封闭液[含有0.01％(v/v)Tween20和1％(w/w)BSA的PBS]进行室温一小时封闭，每孔加入0.05μg/mL的生物素标记的重组TROP2蛋白。同时加入5μg/mL的竞争抗体，即实施例2所得的纯化的TROP2抗体，其克隆号分别为10E12C10F10、11E8E6D11、21F3D6C9、31A3D11、37E6D6、44A5F9、46G12A7、52F12B3、54D10A2、78D5C3、39E1G3、43B1G8C9、44H8E6、45C3E5、72E11H2、72E6D11和73A9G10，并于25-37℃孵育1-2小时。用洗板液[含有0.01％(v/v)Tween20的PBS]洗板3次，加入HRP(辣根过氧化物酶)标记的链亲和素(购自Sigma)。37℃孵育0.5小时后，用洗板液[含有0.01％(v/v)Tween20的PBS]洗板3次。加入TMB底物100μL每孔，室温孵育30分钟后，加入终止液(1.0NHCl)100μL每孔。用ELISA读板机(SpectraMax 384plus，购自Molecular Device)读取A450nm数值。根据A450nm数值，计算出抗体相互之间的竞争率，结果如表9所示。竞争率的数值越高，表示两个抗体的抗原表面越是接近。
表9 TROP2抗体相互之间的竞争率
其中，左第一列为包被抗体，浓度为1μg/mL；上第一行为竞争抗体，浓度为5μg/mL。
结果说明，10E12C10F10、44A5F9、52F12B3、39E1G3、72E11H2、72E6D11和73A9G10可以互相竞争，为相似表位；11E8E6D11、54D10A2、43B1G8C9和45C3E5可以互相竞争，为相似表位；21F3D6C9和37E6D6可以互相竞争，为相似表位；46G12A7、78D5C3和44H8E6可以互相竞争，为相似表位。31A3D11为单独表位。
实施例6轻重链可变区氨基酸序列测定
总RNA分离：通过离心搜集实施例2所选的先导抗体所对应的实施例1所得的杂交瘤细胞5×107个，加入1mL Trizol混匀并转移到1.5mL离心管中，室温静置5分钟。加0.2mL氯仿，振荡15秒，静置10分钟后于4℃，12000g离心5分钟，取上清转移到新的1.5mL离心管中。加入0.5mL异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10分钟后于4℃，12000g离心15分钟，弃上清。加入1mL 75％(v/v)乙醇，轻轻洗涤沉淀，4℃，12000g离心5分钟后弃上清，将沉淀物晾干，加入DEPC处理过的H2O溶解(55℃水浴促进溶解10分钟)，即得总RNA。
逆转录与PCR：取1μg总RNA，配置20μL体系，加入逆转录酶后于42℃反应60分钟，于7℃反应10分钟终止反应。配置50μL PCR体系，包括1μL cDNA、每种引物25pmol、1μL DNA聚合酶以及相配的缓冲体系、250μmol dNTPs；设置PCR程序，95℃预变性3分钟，95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸35秒，35个循环后再额外于72℃延伸5分钟，得PCR产物。其中逆转录所用的试剂盒为PrimeScript RT Master Mix，购自Takara，货号RR036；PCR所用的试剂盒包括Q5超保真酶，购自NEB，货号M0492。
克隆与测序：取5μL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，将检测阳性样品使用柱回收试剂盒纯化，其中回收试剂盒为Gel&PCR Clean-up，购自MACHEREY-NAGEL，货号740609。进行连接反应：样品50ng，T载体50ng，连接酶0.5μL，缓冲液1μL，反应体系10μL，于16℃反应半小时得连接产物。其中连接的试剂盒为T4 DNA连接酶，购自NEB，货号M0402；取5μL连接产物加入100μL的感受态细胞(Ecos 101competent cells，购自Yeastern，货号FYE607)中，冰浴5分钟，而后于42℃水浴热激1分钟，放回冰上1分钟后加入650μL无抗生素SOC培养基，于37℃摇床上以200RPM的速度复苏30分钟。取出200μL涂布于含抗生素的LB固体培养基上于37℃孵箱过夜培养。次日，使用T载体上引物M13F和M13R配置30μLPCR体系，进行菌落PCR，用移液器枪头蘸取菌落于PCR反应体系中吹吸，并吸出0.5μL点于另一块含100nM氨苄青霉素的LB固体培养皿上以保存菌株。PCR反应结束后，取出5μL进行琼脂糖凝胶电泳检测，将阳性样品进行测序和分析[参见Kabat，“Sequences of Proteins ofImmunological Interest，”National Institutes of Health，Bethesda，Md.(1991)]。测序结果如表1所示，具体序列编号对应的氨基酸序列内容请参见序列表。
实施例7鼠-人嵌合抗体构建、以及抗体的生产和纯化
1.质粒构建与准备：根据实施例6的测序结果明确了TROP2抗体重链可变区和轻链可变区序列。将实施例2和实施例3所得的先导抗体的重链可变区序列重组到包含信号肽和人源重链抗体IgG1恒定区的表达载体(其中表达载体购买自Invitrogen，重组步骤也由上海睿智化学完成)中，将TROP2抗体的轻链可变区序列重组到包含信号肽和人源抗体轻链kappa恒定区的表达载体当中，得重组质粒并经测序验证(测序方法与实施例6中测序方法相同)。使用碱裂解法试剂盒(购自MACHEREY-NAGEL)中量抽提高纯度的重组质粒，质量为500μg以上，经0.22μm滤膜(购自Millopore)过滤，供转染使用。
2.细胞转染：在培养基Freestyle 293expression medium(购自Invitrogen)培养293E细胞(购自Invitrogen)。摇床设置为37℃、130RPM和8％CO2(v/v)。Freestyle293expression medium在转染时添加10％(v/v)F68(购自Invitrogen)至F68终浓度为0.1％(v/v)，得含0.1％(v/v)F68的Freestyle 293表达培养基，即培养基A。取5mL培养基A和200μg/mL PEI(购自Sigma)混匀，得培养基B。取5mL培养基A和100μg/mL步骤(1)所得的重组质粒混匀，得培养基C。5分钟后将培养基B和培养基C合并混匀，静置15分钟，得混合液D。将10mL混合液D缓缓加入100mL含293E细胞的培养基Freestyle 293expression medium中至293E的细胞密度为1.5×106个/mL，边加边振荡，避免PEI过度集中，放入摇床培养。第二天加入蛋白胨至终浓度为0.5％(w/v)。第5～7天，测培养液抗体效价。第6～7天，离心(3500RPM，30分钟)收集上清，经0.22μm滤膜过滤，得滤好的细胞上清液，以供纯化。
3.抗体纯化：对于连续生产的无内毒素的层析柱和Protein A填料，使用0.1MNaOH处理30min或者5个柱体积0.5M NaOH冲洗；对于长期未使用的柱料和层析柱至少使用1M NaOH浸泡1h，用无内毒的水冲洗至中性，用10倍柱体积的1％Triton X100对柱料清洗。使用5个柱体积的PBS进行平衡，将过滤好的细胞上清上柱，必要时收集流穿液。上柱完成后，使用5倍柱体积PBS清洗。用5倍柱体积的0.1M pH3.0的Glycine-HCl进行洗脱，收集洗脱液，并用1/10体积的pH8.5的1M Tris-HCl(1.5M NaCl)中和。收获抗体后，在1×PBS中透析过夜，避免内毒素污染。透析结束后，使用分光光度或试剂盒测定浓度，使用HPLC-SEC测定抗体纯度，使用内毒素检测试剂盒(购自Lonza)检测抗体内毒素含量。
下述实施例中嵌合抗体命名中首段字符选用对应的先导抗体克隆号的前3～5位字符，例如嵌合抗体药物偶联物12B12-MMAF对应的先导抗体克隆号为12B12C7C3，嵌合抗体药物偶联物5G4-MMAF对应的先导抗体克隆号为5G4H10G5等等。
实施例8偶联MMAF的嵌合抗体药物偶联物的体外药效实验
将实施例7所得的纯化的TROP2嵌合抗体与MC-MMAF进行偶联，方法同实施例4，经过pH 6.5～8.5的硼酸钠缓冲液透析后，加入三(2-羧乙基)膦(TCEP)，其中TCEP与纯化的TROP2抗体的摩尔比比率为2，室温下还原1小时，得反应液A。将反应液A经过G25柱脱盐(购自GE)，去除多余的TCEP，得反应液B。向反应液B中加入MC-MMAF，其中MC-MMAF与纯化的嵌合TROP2抗体的摩尔比比率为5，室温下反应4小时。再加入半胱氨酸用以中和多余的MC-MMAF，并通过G25柱脱盐除去多余的小分子。得到纯化的TROP2嵌合抗体药物偶联物(偶联方法参见Doronina，2006，Bioconjugate Chem.17,114-124)。通过HIC分析药物的交联率、通过SEC分析抗体药物偶联物的纯度等参数后，进行细胞毒活性的分析。所有抗体药物偶联物的药物交联率(DAR)为3.0-5.0，具体如表10和11所示。其中，DAR(drug antibody ratio)指抗体偶联后一个抗体分子上携带的小分子药物的平均数量。
将获得的纯化的TROP2嵌合抗体药物偶联物分别用完全培养基进行梯度稀释，96孔细胞培养板以5000细胞/孔加入90微升TROP2阳性的MDA-MB-468细胞株(购自ATCC，货号#HTB-132)细胞悬液过夜培养后，每孔分别加入10微升不同浓度的纯化的TROP2嵌合抗体药物偶联物的稀释液，继续培养5天后，用CellTiter-Glo试剂盒(购自Promega，使用方法参照产品说明书)检测细胞活力。结果如表10以及图13所示，其中表10的IC50指药物作用后，细胞的活性受到抑制的半数有效量，能够通过检测细胞的活性从而反映细胞杀伤活性。图13为纯化的TROP2嵌合抗体药物偶联物对TROP2阳性的肿瘤细胞系MDA-MB-468的细胞杀伤活性检测。此外，选用TROP2阳性的肿瘤细胞系BxPC-3(购自ATCC，货号#CRL-1687)和COLO 205(购自ATCC，货号#CCL-222)进行细胞杀伤活性检测，方法同上。结果如表11以及图14A和图14B所示，其中表11的IC50指药物作用后，细胞的活性受到抑制的半数有效量，能够通过检测细胞的活性从而反映细胞杀伤活性。图14A和图14B为纯化的TROP2嵌合抗体药物偶联物对TROP2阳性的肿瘤细胞系BxPC-3和COLO 205的细胞杀伤活性检测，结果说明，纯化的TROP2嵌合抗体药物偶联物对TROP2阳性的细胞有杀伤作用。
表10细胞杀伤实验检测纯化的TROP2嵌合抗体药物偶联物对TROP2阳性MDA-MB-468细胞的特异性杀伤作用
表11细胞杀伤实验检测纯化的TROP2嵌合抗体药物偶联物对TROP2阳性COLO205细胞、BxPC-3细胞的特异性杀伤作用
实施例9偶联MMAF的嵌合抗体药物偶联物的体内药效实验
将MDA-MB-468(三阴性乳腺癌细胞株，ATCC，HTB-132)(1X107个)200μl细胞悬液(base DMEM:Matrigel＝1:1)接种于CB17 SCID小鼠(上海灵畅生物科技有限公司提供，接种时6-8周)右后背皮下，接种后3-4周待肿瘤长至约250mm3后，去除体重、肿瘤过大和过小的，按肿瘤体积将小鼠随机分为13组，每组7只。D0开始尾静脉注射抗体，4天一次，共给药4次，每周测2次瘤体积，称鼠重，记录数据。肿瘤体积(V)计算公式为：V＝1/2×a×b2；其中a、b分别表示肿瘤的长径和短径。分组如表12。
表12 TROP2嵌合抗体及其抗体药物偶联物的体内药效实验
结果见图15A、图15B、图15C和图15D：治疗后肿瘤的体积变化图，和图16A、图16B、图16C和图16D：治疗后的鼠重变化图。其中，图15A、图15B、图15C和图15D分别是嵌合抗体37E6、嵌合抗体46G12、嵌合抗体52F12、嵌合抗体54D10的抗体药物偶联物及其裸抗的治疗后的小鼠治疗后肿瘤的体积变化图。从处理(即治疗)8天起，1mg/kg和10mg/kg偶联MMAF的嵌合抗体药物偶联物即显示出较对照组明显小约150～200mm3的肿瘤体积；在治疗12天起，本发明抗体药物偶联物治疗的小鼠肿瘤体积有明显的缩小，其中，偶联MMAF的嵌合抗体药物偶联物比溶剂对照和单纯的嵌合抗体治疗的肿瘤体积少400mm3；更令人惊奇的是，37E6-MMAF、46G12、52F12和54D10嵌合抗体及其药物偶联物治疗23天时，小鼠肿瘤几乎消失，比溶剂对照治疗的肿瘤体积少约600mm3。图16A、图16B、图16C和图16D分别是嵌合抗体37E6、嵌合抗体46G12、嵌合抗体52F12、嵌合抗体54D10的抗体药物偶联物及其裸抗的治疗后的小鼠治疗后的体重变化图。结果显示，这几种ADC可以很好的抑制肿瘤MDA-MB-468的生长，而且对小鼠的体重没有显著的影响。
实施例10偶联MMAE的嵌合抗体药物偶联物的体外药效实验
将实施例7所得的纯化的TROP2嵌合抗体与MC-VC-PAB-MMAE(凯恵科技发展(上海)有限公司)进行偶联，方法同实施例4，经过pH 6.5～8.5的硼酸钠缓冲液透析后，加入三(2-羧乙基)膦(TCEP)，其中TCEP与纯化的TROP2抗体的摩尔比比率为2，室温下还原1小时，得反应液A。将反应液A经过G25柱脱盐(购自GE)，去除多余的TCEP，得反应液B。向反应液B中加入MC-VC-PAB-MMAE，其中MC-VC-PAB-MMAE与纯化的TROP2抗体的摩尔比比率为5，室温下反应4小时。再加入半胱氨酸用以中和多余的MC-VC-PAB-MMAE，并通过G25柱脱盐除去多余的小分子。得到纯化的TROP2抗体药物偶联物(偶联方法参见Doronina，2006，BioconjugateChem.17,114-124)。通过HIC分析药物的交联率、通过SEC分析抗体药物偶联物的纯度等参数后，进行细胞毒活性的分析。所有抗体药物偶联物的药物交联率(DAR)为3.0-5.0。其中，DAR(drug antibody ratio)指抗体偶联后一个抗体分子上携带的小分子药物的平均数量。
将获得的纯化的TROP2抗体药物偶联物分别用完全培养基进行梯度稀释，96孔细胞培养板以5000细胞/孔加入90微升TROP2阳性的MDA-MB-468细胞株(购自ATCC，货号#HTB-132)细胞悬液过夜培养后，每孔分别加入10微升不同浓度的纯化的TROP2嵌合抗体药物偶联物的稀释液，继续培养5天后，用CellTiter-Glo试剂盒(购自Promega，使用方法参照产品说明书)检测细胞活力。此外，选用TROP2阳性的肿瘤细胞系COLO205(购自ATCC，货号#CCL-222)进行细胞杀伤活性检测，方法同上。结果如表13以及图17A和图17B所示，其中表13的IC50指药物作用后，细胞的活性受到抑制的半数有效量，能够通过检测细胞的活性从而反映细胞杀伤活性。图17A和图17B为纯化的TROP2嵌合抗体药物偶联物对TROP2阳性的肿瘤细胞系MDA-MB-468和COLO 205的细胞杀伤活性检测。结果说明，纯化的TROP2抗体药物偶联物对TROP2阳性的细胞有杀伤作用。
表13细胞杀伤实验检测纯化的TROP2嵌合抗体药物偶联物对TROP2阳性MDA-MB-468和COLO 205细胞的特异性杀伤作用
实施例11偶联MMAE的嵌合抗体药物偶联物的体内药效实验
将MDA-MB-468(三阴性乳腺癌细胞株，ATCC，HTB-132)(1×107个)200μl细胞悬液(base DMEM:Matrigel＝1:1)接种于CB17 SCID小鼠(上海灵畅生物科技有限公司提供，接种时6-8周)右后背皮下，接种后3-4周待肿瘤长至约250mm3后，去除体重、肿瘤过大和过小的，按肿瘤体积将小鼠随机分为6组，每组7只。D0尾静脉注射抗体，给药1次，每周测2次瘤体积，称鼠重，记录数据。肿瘤体积(V)计算公式为：V＝1/2×a×b2；其中a、b分别表示肿瘤的长径和短径。分组如表14。
表14 TROP2嵌合抗体及其抗体药物偶联物的体内药效实验
结果见图18A：治疗后肿瘤的体积变化图，和图18B：治疗后的鼠重变化图。结果显示，从处理(即治疗)10天起，上述几种偶联MMAE的嵌合抗体药物偶联物即显示出较对照组明显小约200～300mm3的肿瘤体积；当治疗21天时，44A5-MMAE和21F3-MMAE治疗的小鼠肿瘤体积仅有微弱的增长，其比对照组治疗的肿瘤体积少400mm3；更令人惊奇的是，11E8-MMAE治疗的小鼠肿瘤体积与0天时相比几乎没有变化，21天时比对照组的肿瘤体积少约500mm3，说明这几种偶联MMAE的嵌合抗体药物偶联物可以很好的抑制肿瘤MDA-MB-468的生长，而且对小鼠的体重没有显著的影响。
实施例12嵌合抗体在大鼠体内的血清稳定性
将嵌合抗体一侧尾静脉注入Sprague-Dawley大鼠(6～8周龄，每只210-235g，SLACLaboratory Animal Co.LTD)。于第0天，以3mL/kg的体积剂量通过足背静脉分别给动物施用嵌合抗体11E8、嵌合抗体21F3、嵌合抗体37E6、嵌合抗体44A5、嵌合抗体46G12、嵌合抗体52F12和嵌合抗体78D5、和hRS7。在给药后10、和30分钟；1、4、8和24小时；和2、4、7、14、21、28天的每个时间点通过尾静脉收集大约150μL全血，进行血清分析。实验方案如表15。
表15 TROP2嵌合抗体大鼠体内PK实验
结果见图19和图20。单次施用11E8E6D11、嵌合抗体21F3D6C9、嵌合抗体37E6D6、嵌合抗体44A5F9、嵌合抗体46G12A7、嵌合抗体52F12B3和嵌合抗体78D5C3后，血清中抗体随时间清除。其中嵌合抗体11E8E6D11、嵌合抗体21F3D6C9、嵌合抗体44A5F9和嵌合抗体78D5C3表现出比hRS7更好或相当的血清稳定性。
具体地，给药后，嵌合抗体11E8E6D11的总清除率(CL)为5.62mL/day/kg，稳态表观分布容积(Vss)为112mL/kg,清除半衰期为13.6天。嵌合抗体21F3D6C9的总清除率(CL)为6.22mL/day/kg，稳态表观分布容积(Vss)为97.4mL/kg,清除半衰期为11.8天。嵌合抗体44A5F9的总清除率(CL)为9.27mL/day/kg，稳态表观分布容积(Vss)为121mL/kg,清除半衰期为9.33天。嵌合抗体78D5C3的总清除率(CL)为5.05mL/day/kg，稳态表观分布容积(Vss)为93.5mL/kg,清除半衰期为13.1天。对照抗体hRS7的总清除率(CL)为8.19mL/day/kg，稳态表观分布容积(Vss)为110mL/kg，清除半衰期为9.48天。
实施例13抑制脱酰胺化、异构化、水解反应的突变的导入
通过对嵌合抗体11E8的抗体序列分析，发现嵌合抗体11E8抗体重链可变区(SEQID NO:9)CDR2(SEQ ID NO:11)的NG存在脱酰胺化反应的可能，DG存在异构化的可能，为了抑制脱酰胺化、异构化和水解，经过计算和分析，将位于嵌合抗体11E8抗体CDR2的NG突变成NA。另外，将位于CDR2的DG突变成SG；或将DG突变成EG，或将DG突变成DA，突变后嵌合抗体11E8抗体重链可变区CDR2区氨基酸序列如SEQ ID NO.140-143所示。拟通过上述定点突变实施去除作为接受脱酰胺化的位点的天冬酰胺残基和天冬酰残基的氨基酸修饰。
嵌合抗体11E8抗体重链可变区定点突变序列经基因合成后，按实施例7所述进行质粒构建、细胞转染和抗体纯化，突变后的嵌合抗体通过FACS进行结合活性鉴定，鉴定结果如图21及表16所示，其中图21是嵌合抗体11E8抗体重链可变区CDR2的NG突变成NA，和DG突变成SG、EG或DA后的突变抗体嵌合抗体11E8-1、嵌合抗体11E8-2、嵌合抗体11E8-3和嵌合抗体11E8-4及野生型抗体嵌合抗体11E8与CHOK-TROP2细胞结合活性检测。表16总结了中嵌合抗体11E8野生型抗体及突变抗体在CHOK-TROP2细胞中的结合活性。
表16.FACS检测嵌合抗体11E8嵌合抗体突变体与CHOk1-TROP2细胞的结合反应
从表16和图21来看，位于嵌合抗体11E8重链可变区CDR2的NG突变成NA(序列如SEQID NO:164所示)，DG突变成DA(序列如SEQ ID NO:154所示)的突变抗体嵌合抗体11E8-1和突变体嵌合抗体11E8-4与CHOk1-TROP2细胞的结合活性与野生型抗体嵌合抗体11E8接近，说明NG突变成NA，DG突变成DA不影响抗体与CHOK-TROP2细胞的结合。而位于CDR2的DG是突变成EG或SG后一定程度上影响了抗体与对CHOK-TROP2的结合后的最大平均荧光强度分别下降53％和23％。
因此，后续将选用CDR2的NG突变成NA以及DG突变为DA的重链CDR2(序列如SEQ IDNO:159所示)所得的嵌合抗体进行后续研究。
实施例14人源化TROP2抗体的制备
通过序列比对(NCBI-Igblast)选择与候选抗体11E8E6D11重链可变区，轻链可变区同源性最高的胚系基因序列作为可变区移植骨架：GHV1-69*08(66.0％)和IGKV1-39*01(65.7％)。在选定人抗体骨架后，通过同源建模，预测在鼠抗恒定区中可能决定结构的关键氨基酸，对嫁接的骨架区进行回复突变设计，如表17。
表17 11E8E6D11克隆的人源化骨架和回复突变设计
根据以上原则，设计4个重链可变区序列(人源化11E8VH.g0，人源化11E8VH.g1，人源化11E8VH.g2,人源化11E8VH.g3)和3个轻链可变区序列(人源化11E8VL.g0,人源化11E8VL.g1，人源化11E8VL.g2)。随后做交叉组合进行表达，共得到下列12个人源化抗体，见表18。
表18 11E8人源化抗体表达组合
另外，经过序列分析，候选抗体44A5F9重链可变区和轻链可变区均无重要的hotspot。通过序列比对(NCBI-Igblast)选择与候选抗体44A5F9重链可变区，轻链可变区同源性最高的胚系基因序列作为可变区移植骨架：IGHV3-7*01(69.4％)和IGKV1-39*01(61.6％)。在选定人抗体骨架后，通过同源建模，预测在鼠抗恒定区中可能决定结构的关键氨基酸，对嫁接的骨架区进行回复突变设计，如表19所示。
表19 44A5F9克隆的人源化骨架和回复突变设计
根据以上原则，设计3个重链可变区序列(人源化44A5VH.g0，人源化44A5VH.g1，人源化44A5VH.g2)和3个轻链可变区序列(人源化44A5VL.g0,人源化44A5VL.g1，人源化44A5VL.g2)。随后做交叉组合进行表达，共得到下列9个人源化抗体，见表20。
表20 44A5F9人源化抗体表达组合
载体构建：扩增引物由Genewiz合成，随后通过PCR方法分别扩增轻链和重链的可变区。配置50μL反应体系，包括50-100ng的重链可变区，轻链可变区、正向反向引物各1ul、1ul pfxD酶(购自invitrogen，12344-012)、10*pfx缓冲液5ul(供应商同pfx同酶)以及加水补足至50μL。设置PCR程序，预变性95℃5分钟，变性95℃30秒，退火56℃30秒，延伸68℃30秒，25个循环后再额外68℃延伸10min，得到PCR产物。取5μL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，将检测阳性样品使用回收试剂盒纯化，其中回收试剂盒为PureLink Quick Gelextraction kit，购自Qiagen，货号28706。
人源化抗体的制备：进行连接反应：插入片段20-40ng，酶切过的表达载体60-100ng，重组酶Exnase(购自Vazyme，货号C112-01/02)1μL，缓冲液2μL，反应体系10μL，于37℃反应半小时得到连接产物，即构建好的重组载体。缓冲液为该重组酶配套购买使用的缓冲液；将重链可变区定向克隆到包含信号肽和人源抗体重链IgG1恒定区的表达载体(其中表达载体购买自Invitrogen，重组步骤为常规步骤)，将轻链可变区定向克隆到包含信号肽和人源抗体轻链kappa恒定区的表达载体(其中表达载体购买自Invitrogen，重组步骤为常规步骤)中。将10μL连接产物加入100μL的感受态细胞(Ecos 101competent cells，购自Yeastern，货号FYE607)中，42℃水浴热激60秒，放回冰上3分钟，取出80μL涂布于含氨苄青霉素的LB固体培养基上，于37℃孵箱过夜培养。次日，使用表达载体上引物pEF1A和pSV40，配置30μL PCR体系，进行菌落PCR。菌落PCR的体系为：引物各1μL，15μL的PCR预混液(购自Novoprotein)，补足至30μL。用移液器枪头蘸取菌落于PCR反应体系中吹吸，并吸出0.5μL点于另一块含100μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养皿上以保存菌株。PCR反应结束后，取出4.5μL进行琼脂糖凝胶电泳检测，将阳性样品进行测序。
将序列正确的重组抗体重、轻链的表达载体进行扩增，随后瞬时转染FreeStyleTM293-F细胞(购自Invitrogen)以生产抗体。转染时，293-F细胞的密度应为1-1.2×106个/mL，100mL细胞需要100μg上述已构建好的重组载体和200μg的转染试剂聚乙烯亚胺(PEI)。将重组载体和PEI分别加入到5mL培养基中，室温静置5分钟，0.22μm滤膜过滤后，将重组载体和PEI的混合物于室温静置15分钟。然后将上述混合物缓慢地加入到细胞中，在37℃、8％(v/v)CO2培养箱中以130rpm的转速培养。每天采取培养上清和细胞沉淀检测抗体的表达。5天后，3000g离心细胞培养液30分钟，收集上清液，0.22μm滤器过滤。用1mLMabSelectTMSuReTMcolumn(购自GE Healthcare)纯化200mL澄清上清液中的单克隆抗体。MabSelectTMSuReTMcolumn先用平衡缓冲液(PBS磷酸缓冲液，pH7.2)平衡，MabSelectTMSuReTMcolumn。上样完毕后用平衡缓冲液清洗MabSelectTMSuReTMcolumn，平衡缓冲液的体积为蛋白A柱柱床体积的5倍。用洗脱液(0.1M甘氨盐酸缓冲液，pH3.0)洗脱结合在MabSelectTMSuReTMcolumn上的单克隆抗体。收集洗脱的抗体，加入10％(v/v)1.0M Tris-HCl缓冲液中和pH。然后立即用PBS磷酸缓冲液透析过夜。收集透析后的单克隆抗体，用0.22μm的滤器进行无菌过滤，无菌保存，即得纯化的TROP2人源化抗体。
实施例15人源化TROP2抗体的鉴定
A.流式细胞实验(FACS)检测抗体与表达人源TROP2细胞的结合。结果如图22A所示，所得11E8人源化抗体均可结合细胞表面的人源Trop2。如图22B所示，所得44A5F9人源化抗体均可结合细胞表面的人源Trop2。其中同型对照为人IgG1，图中的数据为所测细胞群的平均荧光强度值(MFI)。表21说明，所得的纯化的TROP2人源化抗体都可以较好的结合细胞表面的人源TROP2
表21.人源化TROP2抗体对CHOK1-hTROP2细胞表面的人源TROP2的结合反应
B.流式细胞实验(FACS)检测抗体与表达食蟹猴源TROP2细胞的结合。结果如图23A所示，所得11E8人源化抗体均可结合细胞表面的食蟹猴源Trop2。如图23B所示，所得44A5F9人源化抗体均可结合细胞表面的食蟹猴源Trop2。其中同型对照为人IgG1，图中的数据为所测细胞群的平均荧光强度值(MFI)。表22说明，所得的纯化的TROP2人源化抗体都可以较好的结合细胞表面的食蟹猴TROP2。其中，hTINA1-H1L1序列来自专利WO2015098099A1，根据专利中制备方法由上海睿智化学研究有限公司表达生产。
表22.人源化TROP2抗体对CHOK1-cTROP2细胞表面的食蟹猴TROP2的结合反应
C.人源化抗TROP2抗体的结合亲和力检测
通过Biacore进行不同人源化抗体的亲和力比较，部分数据如表23所示，具体操作和方法根据仪器说明书和厂家提供的详细方法。具体为：按照人Fab捕获试剂盒(Cat.#28-9583-25，GE)说明书中所述的方法，将人Fab捕获分子共价偶联于CM5生物传感芯片(Cat.#BR-1000-12，GE)上，从而亲和捕获待测抗体。然后于芯片表面流经人TROP2-his(CAT#10428-H08H-100,Sino biological)抗原，利用Biacore仪器实时检测反应信号，从而获得结合和解离曲线，通过拟合得到亲和力数值，见下表23。在实验中每个循环解离完成后，用人Fab捕获试剂盒里配置的再生溶液将生物芯片洗净再生。
表23.TROP2抗体对人TROP2-his抗原的亲和力
配体 ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M)
RS7 2.25E+05 2.71E-04 1.21E-09
hTINA1-H1L1 1.41E+05 2.93E-03 2.07E-08
嵌合抗体11E8(DA,NA) 1.05E+05 1.07E-03 1.03E-08
人源化抗体11E8-1 7.10E+04 1.05E-03 1.49E-08
人源化抗体11E8-2 7.76E+04 1.32E-03 1.70E-08
人源化抗体11E8-3 8.18E+04 1.48E-03 1.80E-08
人源化抗体11E8-5 1.00E+05 1.09E-03 1.08E-08
人源化44A5-1 4.46E+05 8.02E-03 1.80E-08
人源化44A5-2 4.59E+05 4.50E-03 9.81E-09
人源化44A5-4 4.26E+05 6.80E-03 1.60E-08
人源化44A5-7 6.17E+05 9.03E-03 1.46E-08
实施例16偶联Dxd的人源化抗体药物偶联物的体内药效实验
将所得的纯化的人源化抗TROP2抗体与MC-GGFG-Dxd(凯恵科技发展(上海)有限公司)进行偶联,经过pH 5.5～8.5的4×PBS缓冲液透析后，加入适量pH7.0至9.0的乙二胺四乙酸(EDTA)和7-10倍摩尔当量三(2-羧乙基)膦(TCEP)，在37摄氏度下还原反应两小时，得反应液A。将反应液A经过G25柱脱盐(购自GE)，去除多余的TCEP，得反应液B。向反应液中加入MC-GGFG-Dxd，其中MC-GGFG-Dxd与还原的TROP2抗体的摩尔比比率为8～12，室温下反应4小时。最后加入N-乙基顺丁烯二酰亚胺(N-EM)中和未反应的巯基。并通过G25柱脱盐除去多余的小分子，得到纯化的TROP2抗体药物偶联物(GGFG-Dxd)。通过LC-MS分析药物的交联率、通过SEC分析抗体药物偶联物的纯度等参数后，进行细胞毒活性的分析。所有抗体药物偶联物的药物交联率(DAR)为6.0-8.0。其中，DAR(drug antibody ratio)指抗体偶联后一个抗体分子上携带的小分子药物的平均数量。
将MDA-MB-468(三阴性乳腺癌细胞株，ATCC，HTB-132)(1×107个)200μl细胞悬液(base DMEM:Matrigel＝1:1)接种于CB17 SCID小鼠(上海灵畅生物科技有限公司提供，接种时6-8周)右后背皮下，接种后3-4周待肿瘤长至约250mm3后，去除体重、肿瘤过大和过小的，按肿瘤体积将小鼠随机分为6组，每组7只。D0尾静脉注射抗体，给药1次，每周测2次瘤体积，称鼠重，记录数据。肿瘤体积(V)计算公式为：V＝1/2×a×b2；其中a、b分别表示肿瘤的长径和短径。分组如表14。
表24 TROP2嵌合抗体及其抗体药物偶联物的体内药效实验
结果见图24A：治疗后肿瘤的体积变化图，和图24B：治疗后的鼠重变化图。结果显示，对照hIgG1-GGFG-Dxd给药的小鼠肿瘤体积一直和溶剂对照组无明显差异。但是，从处理(即治疗)7天起，上述几种偶联Dxd的人源化抗体药物偶联物即显示出较对照组明显小约100～200mm3；直至治疗28天时，上述几种偶联Dxd的人源化抗体药物偶联物治疗的小鼠肿瘤体积与0天时相比几乎没有变化，说明这几种偶联Dxd的人源化抗体药物偶联物可以很好的抑制肿瘤MDA-MB-468的生长，而且对小鼠的体重没有显著的影响。
虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是本领域的技术人员应当理解，这些仅是举例说明，在不背离本发明的原理和实质的前提下，可以对这些实施方式做出多种变更或修改。因此，本发明的保护范围由所附权利要求书限定。
SEQUENCE LISTING
<110> 凯惠科技发展（上海）有限公司
<120> 一种TROP2抗体及其制备方法、其偶联物和应用
<130> P20013612C
<150> 2019107465360
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Ser Met Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
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Ala Lys Ile Asn Tyr Glu Gly Ser Arg Thr Tyr Tyr Val Asp Ser Leu
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Lys Ser Arg Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ile Leu Tyr
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<220>
<223> 45C3E5轻链蛋白CDR1
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Arg Ala Ser Glu Thr Val Asp Asn Phe Gly Ile Ser Phe Met His
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 45C3E5轻链蛋白CDR2
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<223> 72E11H2重链蛋白可变区
<400> 113
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Phe
20 25 30
Gly Met Thr Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Ala Leu Lys Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Ser Gly Val Ser Thr Tyr Ala Asp Asp Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Thr Arg Ser Gly Phe Gly Ser Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly
100 105 110
Lys Gly Thr Thr Val Thr Ala Ser Ser
115 120
<210> 114
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 72E11H2重链蛋白CDR1
<400> 114
Thr Phe Gly Met Thr
1 5
<210> 115
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 72E11H2重链蛋白CDR2
<400> 115
Trp Ile Asn Thr Tyr Ser Gly Val Ser Thr Tyr Ala Asp Asp Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 116
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 72E11H2重链蛋白CDR3
<400> 116
Ser Gly Phe Gly Ser Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val
1 5 10
<210> 117
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 72E11H2轻链蛋白可变区
<400> 117
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ile Gly Val Pro Gly Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Ile Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Val Thr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 118
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 72E11H2轻链蛋白CDR1
<400> 118
Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Ala Val Ala
1 5 10
<210> 119
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 72E11H2轻链蛋白CDR2
<400> 119
Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ile
1 5
<210> 120
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 72E11H2轻链蛋白CDR3
<400> 120
Gln Gln His Tyr Val Thr Pro Leu Thr
1 5
<210> 121
<211> 120
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 72E6D11重链蛋白可变区
<400> 121
Glu Val Lys Leu Leu Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Ile Asp Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Arg Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn Pro Asp Ser Ser Ile Leu Ser Tyr Ala Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Asp Lys Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ala Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Lys Val Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Leu Cys
85 90 95
Ala Arg Pro Tyr Gly His Tyr Asp Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 122
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 72E6D11重链蛋白CDR1
<400> 122
Arg Tyr Trp Met Ser
1 5
<210> 123
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 72E6D11重链蛋白CDR2
<400> 123
Glu Ile Asn Pro Asp Ser Ser Ile Leu Ser Tyr Ala Pro Ser Leu Lys
1 5 10 15
Asp
<210> 124
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 72E6D11重链蛋白CDR3
<400> 124
Pro Tyr Gly His Tyr Asp Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 125
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 72E6D11轻链蛋白可变区
<400> 125
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ala Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Thr Asn Asn Leu Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 126
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 72E6D11轻链蛋白CDR1
<400> 126
Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu His
1 5 10
<210> 127
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 72E6D11轻链蛋白CDR2
<400> 127
Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser
1 5
<210> 128
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 72E6D11轻链蛋白CDR3
<400> 128
Gln Gln Thr Asn Asn Leu Pro Trp Thr
1 5
<210> 129
<211> 121
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 73A9G10重链蛋白可变区
<400> 129
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Ser Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly His Val Asn Pro Asn Asn Gly Asp Thr Thr Tyr Asn His Lys Phe
50 55 60
Met Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Gly Phe Gly Ser Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly
100 105 110
Thr Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 130
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 73A9G10重链蛋白CDR1
<400> 130
Asp Tyr Ser Met Asn
1 5
<210> 131
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 73A9G10重链蛋白CDR2
<400> 131
His Val Asn Pro Asn Asn Gly Asp Thr Thr Tyr Asn His Lys Phe Met
1 5 10 15
Gly
<210> 132
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 73A9G10重链蛋白CDR3
<400> 132
Ala Gly Phe Gly Ser Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val
1 5 10
<210> 133
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 73A9G10轻链蛋白可变区
<400> 133
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly His Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Cys Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 134
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 73A9G10轻链蛋白CDR1
<400> 134
Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Ala Val Ala
1 5 10
<210> 135
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 73A9G10轻链蛋白CDR2
<400> 135
Ser Ala Ser Tyr Arg Cys Thr
1 5
<210> 136
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 73A9G10轻链蛋白CDR3
<400> 136
Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Leu Thr
1 5
<210> 137
<211> 323
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 137
Met Ala Arg Gly Pro Gly Leu Ala Pro Pro Pro Leu Arg Leu Pro Leu
1 5 10 15
Leu Leu Leu Val Leu Ala Ala Val Thr Gly His Thr Ala Ala Gln Asp
20 25 30
Asn Cys Thr Cys Pro Thr Asn Lys Met Thr Val Cys Ser Pro Asp Gly
35 40 45
Pro Gly Gly Arg Cys Gln Cys Arg Ala Leu Gly Ser Gly Met Ala Val
50 55 60
Asp Cys Ser Thr Leu Thr Ser Lys Cys Leu Leu Leu Lys Ala Arg Met
65 70 75 80
Ser Ala Pro Lys Asn Ala Arg Thr Leu Val Arg Pro Ser Glu His Ala
85 90 95
Leu Val Asp Asn Asp Gly Leu Tyr Asp Pro Asp Cys Asp Pro Glu Gly
100 105 110
Arg Phe Lys Ala Arg Gln Cys Asn Gln Thr Ser Val Cys Trp Cys Val
115 120 125
Asn Ser Val Gly Val Arg Arg Thr Asp Lys Gly Asp Leu Ser Leu Arg
130 135 140
Cys Asp Glu Leu Val Arg Thr His His Ile Leu Ile Asp Leu Arg His
145 150 155 160
Arg Pro Thr Ala Gly Ala Phe Asn His Ser Asp Leu Asp Ala Glu Leu
165 170 175
Arg Arg Leu Phe Arg Glu Arg Tyr Arg Leu His Pro Lys Phe Val Ala
180 185 190
Ala Val His Tyr Glu Gln Pro Thr Ile Gln Ile Glu Leu Arg Gln Asn
195 200 205
Thr Ser Gln Lys Ala Ala Gly Asp Val Asp Ile Gly Asp Ala Ala Tyr
210 215 220
Tyr Phe Glu Arg Asp Ile Lys Gly Glu Ser Leu Phe Gln Gly Arg Gly
225 230 235 240
Gly Leu Asp Leu Arg Val Arg Gly Glu Pro Leu Gln Val Glu Arg Thr
245 250 255
Leu Ile Tyr Tyr Leu Asp Glu Ile Pro Pro Lys Phe Ser Met Lys Arg
260 265 270
Leu Thr Ala Gly Leu Ile Ala Val Ile Val Val Val Val Val Ala Leu
275 280 285
Val Ala Gly Met Ala Val Leu Val Ile Thr Asn Arg Arg Lys Ser Gly
290 295 300
Lys Tyr Lys Lys Val Glu Ile Lys Glu Leu Gly Glu Leu Arg Lys Glu
305 310 315 320
Pro Ser Leu
<210> 138
<211> 323
<212> PRT
<213> Macaca mulatta
<400> 138
Met Ala Arg Gly Pro Gly Leu Ala Pro Pro Pro Leu Arg Leu Pro Leu
1 5 10 15
Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ala Val Thr Gly His Thr Ala Ala Gln Asp
20 25 30
Asn Cys Thr Cys Pro Thr Asn Lys Met Thr Val Cys Ser Pro Asp Gly
35 40 45
Pro Gly Gly Arg Cys Gln Cys Arg Ala Leu Gly Ser Gly Val Ala Val
50 55 60
Asp Cys Ser Thr Leu Thr Ser Lys Cys Leu Leu Leu Lys Ala Arg Met
65 70 75 80
Ser Ala Pro Lys Asn Ala Arg Thr Leu Val Arg Pro Asn Glu His Ala
85 90 95
Leu Val Asp Asn Asp Gly Leu Tyr Asp Pro Asp Cys Asp Pro Glu Gly
100 105 110
Arg Phe Lys Ala Arg Gln Cys Asn Gln Thr Ser Val Cys Trp Cys Val
115 120 125
Asn Ser Val Gly Val Arg Arg Thr Asp Lys Gly Asp Leu Ser Leu Arg
130 135 140
Cys Asp Glu Leu Val Arg Thr His His Ile Leu Ile Asp Leu Arg His
145 150 155 160
Arg Pro Thr Ala Gly Ala Phe Asn His Ser Asp Leu Asp Ala Glu Leu
165 170 175
Arg Arg Leu Phe Arg Glu Arg Tyr Arg Leu His Pro Lys Phe Val Ala
180 185 190
Ala Val His Tyr Glu Gln Pro Thr Ile Gln Ile Glu Leu Arg Gln Asn
195 200 205
Thr Ser Gln Lys Ala Ala Gly Asp Val Asp Ile Gly Asp Ala Ala Tyr
210 215 220
Tyr Phe Glu Arg Asp Val Lys Gly Glu Ser Leu Phe Gln Gly Arg Gly
225 230 235 240
Gly Leu Asp Leu Arg Val Arg Gly Glu Pro Leu Gln Val Glu Arg Thr
245 250 255
Leu Ile Tyr Tyr Leu Asp Glu Ile Pro Pro Lys Phe Ser Met Lys Arg
260 265 270
Leu Thr Ala Gly Leu Ile Ala Val Ile Val Val Val Val Val Ala Leu
275 280 285
Val Ala Gly Val Ala Val Leu Val Ile Ser Asn Arg Arg Lys Ser Gly
290 295 300
Lys Tyr Lys Lys Val Glu Ile Lys Glu Leu Gly Glu Leu Arg Lys Glu
305 310 315 320
Pro Ser Leu
<210> 139
<211> 317
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 139
Met Ala Arg Gly Leu Asp Leu Ala Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala
1 5 10 15
Met Ala Thr Arg Phe Cys Thr Ala Gln Ser Asn Cys Thr Cys Pro Thr
20 25 30
Asn Lys Met Thr Val Cys Asp Thr Asn Gly Pro Gly Gly Val Cys Gln
35 40 45
Cys Arg Ala Met Gly Ser Gln Val Leu Val Asp Cys Ser Thr Leu Thr
50 55 60
Ser Lys Cys Leu Leu Leu Lys Ala Arg Met Ser Ala Arg Lys Ser Gly
65 70 75 80
Arg Ser Leu Val Met Pro Ser Glu His Ala Ile Leu Asp Asn Asp Gly
85 90 95
Leu Tyr Asp Pro Glu Cys Asp Asp Lys Gly Arg Phe Lys Ala Arg Gln
100 105 110
Cys Asn Gln Thr Ser Val Cys Trp Cys Val Asn Ser Val Gly Val Arg
115 120 125
Arg Thr Asp Lys Gly Asp Gln Ser Leu Arg Cys Asp Glu Val Val Arg
130 135 140
Thr His His Ile Leu Ile Glu Leu Arg His Arg Pro Thr Asp Arg Ala
145 150 155 160
Phe Asn His Ser Asp Leu Asp Ser Glu Leu Arg Arg Leu Phe Gln Glu
165 170 175
Arg Tyr Lys Leu His Pro Ser Phe Leu Ser Ala Val His Tyr Glu Glu
180 185 190
Pro Thr Ile Gln Ile Glu Leu Arg Gln Asn Ala Ser Gln Lys Gly Leu
195 200 205
Arg Asp Val Asp Ile Ala Asp Ala Ala Tyr Tyr Phe Glu Arg Asp Ile
210 215 220
Lys Gly Glu Ser Leu Phe Met Gly Arg Arg Gly Leu Asp Val Gln Val
225 230 235 240
Arg Gly Glu Pro Leu His Val Glu Arg Thr Leu Ile Tyr Tyr Leu Asp
245 250 255
Glu Lys Pro Pro Gln Phe Ser Met Lys Arg Leu Thr Ala Gly Val Ile
260 265 270
Ala Val Ile Ala Val Val Ser Val Ala Val Val Ala Gly Val Val Val
275 280 285
Leu Val Val Thr Lys Arg Arg Lys Ser Gly Lys Tyr Lys Lys Val Glu
290 295 300
Leu Lys Glu Leu Gly Glu Met Arg Ser Glu Pro Ser Leu
305 310 315
<210> 140
<211> 120
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 嵌合抗体11E8-1的重链可变区
<400> 140
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Val Ala Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Ser Asn Ala Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Phe Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Thr Arg Ile Pro Asp His Tyr Gly Ser Asp Trp Gly Tyr Phe Asp
100 105 110
Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val
115 120
<210> 141
<211> 120
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 嵌合抗体11E8-2的重链可变区
<400> 141
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Val Ala Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asp Thr Asn Ser Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Phe Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Thr Arg Ile Pro Asp His Tyr Gly Ser Asp Trp Gly Tyr Phe Asp
100 105 110
Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val
115 120
<210> 142
<211> 120
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 嵌合抗体11E8-3的重链可变区
<400> 142
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Val Ala Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Glu Gly Asp Thr Asn Ser Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Phe Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Thr Arg Ile Pro Asp His Tyr Gly Ser Asp Trp Gly Tyr Phe Asp
100 105 110
Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val
115 120
<210> 143
<211> 120
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 嵌合抗体11E8-4的重链可变区
<400> 143
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Val Ala Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Ala Asp Thr Asn Ser Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Phe Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Thr Arg Ile Pro Asp His Tyr Gly Ser Asp Trp Gly Tyr Phe Asp
100 105 110
Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val
115 120
<210> 144
<211> 124
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 11E8E6D11 重链可变区（NA, DA）
<400> 144
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Val Ala Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Ala Asp Thr Asn Ser Asn Ala Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Phe Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Thr Arg Ile Pro Asp His Tyr Gly Ser Asp Trp Gly Tyr Phe Asp
100 105 110
Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 145
<211> 124
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IGHV1-69*08/JH6C
<400> 145
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Thr Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Ile Pro Ile Leu Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Arg Ile Pro Asp His Tyr Gly Ser Asp Trp Gly Tyr Met Asp
100 105 110
Val Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 146
<211> 124
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 人源化11E8 vH g0
<400> 146
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Val Ala Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Ala Asp Thr Asn Ser Asn Ala Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Arg Ile Pro Asp His Tyr Gly Ser Asp Trp Gly Tyr Phe Asp
100 105 110
Val Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 147
<211> 124
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 人源化11E8 vH g1
<400> 147
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Val Ala Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Ala Asp Thr Asn Ser Asn Ala Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Arg Ile Pro Asp His Tyr Gly Ser Asp Trp Gly Tyr Phe Asp
100 105 110
Val Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 148
<211> 124
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 人源化11E8 vH g2
<400> 148
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Val Ala Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Ala Asp Thr Asn Ser Asn Ala Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Arg Ile Pro Asp His Tyr Gly Ser Asp Trp Gly Tyr Phe Asp
100 105 110
Val Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 149
<211> 124
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 人源化11E8 vH g3
<400> 149
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Val Ala Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Ala Asp Thr Asn Ser Asn Ala Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Arg Ile Pro Asp His Tyr Gly Ser Asp Trp Gly Tyr Phe Asp
100 105 110
Val Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 150
<211> 105
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IGKV1-39*01/JK4
<400> 150
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Leu Asn
20 25 30
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala
35 40 45
Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp
65 70 75 80
Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro Thr Phe
85 90 95
Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 151
<211> 111
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 人源化11E8vL g0
<400> 151
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg
85 90 95
Glu Leu Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 152
<211> 111
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 人源化11E8vL g1
<400> 152
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg
85 90 95
Glu Leu Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 153
<211> 111
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 人源化11E8vL g2
<400> 153
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg
85 90 95
Glu Leu Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 154
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR-H2-DG/DA
<400> 154
Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Ala Asp Thr Asn Ser Asn Gly Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 155
<211> 119
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IGHV3-7*01/JH4D
<400> 155
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ala Ala His Tyr Ser Asn Glu Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 156
<211> 121
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 人源化44A5 vH g0
<400> 156
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Gln Ile Arg Phe Lys Ser Asp Asn Tyr Ala Thr His Tyr Ala Glu
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Ala Ala His Tyr Ser Asn Glu Gly Phe Ala Phe Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 157
<211> 121
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 人源化44A5 vH g1
<400> 157
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Gln Ile Arg Phe Lys Ser Asp Asn Tyr Ala Thr His Tyr Ala Glu
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ala Lys Asn Ser
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Ala Ala His Tyr Ser Asn Glu Gly Phe Ala Phe Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 158
<211> 121
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 人源化44A5 vH g2
<400> 158
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Gln Ile Arg Phe Lys Ser Asp Asn Tyr Ala Thr His Tyr Ala Glu
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ala Lys Ser Ser
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Ala Ala His Tyr Ser Asn Glu Gly Phe Ala Phe Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 159
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR-H2-NG/NA & DG/DA
<400> 159
Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Ala Asp Thr Asn Ser Asn Ala Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 160
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IGKV1-39*01/JK1
<400> 160
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 161
<211> 111
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 人源化44A5 vL g0
<400> 161
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp His Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn
85 90 95
Lys Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 162
<211> 111
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 人源化44A5 vL g1
<400> 162
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp His Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn
85 90 95
Lys Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 163
<211> 111
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 人源化44A5 vL g2
<400> 163
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp His Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn
85 90 95
Lys Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 164
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR-H2-NG/NA
<400> 164
Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Ser Asn Ala Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly

Claims (28)

1.一种分离的蛋白质，其特征在于，其包括TROP2抗体的重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包括重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3，所述轻链可变区包括轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3，
其中，所述重链CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示；所述重链CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:164、SEQ ID NO:154或SEQ ID NO:159所示；所述重链CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示；
所述轻链CDR1的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:14所示；所述轻链CDR2的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:15所示；所述轻链CDR3的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:16所示；
所述重链可变区还包括重链可变区框架区，和所述轻链可变区还包括轻链可变区框架区；
所述重链可变区框架区为鼠抗体的重链可变区框架区或人抗体的重链可变区框架区；所述轻链可变区框架区为鼠抗体的轻链可变区框架区或人抗体的轻链可变区框架区；所述人抗体的重链可变区框架区为IGHV1-69*08/JH6C或IGHV3-7*01/JH4D，所述人抗体的轻链可变区框架区为IGKV1-39*01/JK4或IGKV1-39*01/JK1。
2.如权利要求1所述的分离的蛋白质，其特征在于，所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:9所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:13所示；或，所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:140所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:13所示；或，所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:143所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:13所示；或，所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:144所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:13所示；或，所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:146所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:151所示；或，所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:147所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:151所示；或，所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:148所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:151所示；或，所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:149所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:151所示；或，所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:146所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:152所示；或，所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:147所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:152所示；或，所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:148所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:152所示；或，所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:149所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:152所示；或，所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:146所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:153所示；或，所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:147所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:153所示；或，所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:148所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:153所示；或，所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:149所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:153所示。
3.如权利要求1所述的分离的蛋白质，其特征在于，所述的分离的蛋白质还包括抗体重链恒定区和抗体轻链恒定区，所述的抗体重链恒定区为小鼠源抗体重链恒定区或人源抗体重链恒定区；所述的抗体轻链恒定区为小鼠源轻链抗体恒定区或人源抗体轻链恒定区。
4.如权利要求3所述的分离的蛋白质，其特征在于，所述的抗体重链恒定区为人源抗体重链恒定区，所述人源抗体重链恒定区人源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体重链恒定区；所述的抗体轻链恒定区为人源抗体轻链κ或λ链恒定区。
5.一种核酸，其特征在于，其编码如权利要求1-4任一项所述的分离的蛋白质。
6.一种包含如权利要求5所述的核酸的重组表达载体。
7.如权利要求6所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体为质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体。
8.一种转化体，其在宿主细胞中包含如权利要求6所述的重组表达载体。
9.如权利要求8所述的转化体，其特征在于，所述宿主细胞为E.coliTG1、BL21细胞，或者CHO-K1细胞。
10.一种基因修饰的细胞，其特征在于，其包含如权利要求1-4任一项所述的分离的蛋白质。
11.如权利要求10所述的基因修饰的细胞，其特征在于，所述基因修饰的细胞为真核细胞。
12.如权利要求11所述的基因修饰的细胞，其特征在于，所述真核细胞为分离的人细胞。
13.如权利要求12所述的基因修饰的细胞，其特征在于，所述人细胞为免疫细胞。
14.如权利要求13所述的基因修饰的细胞，其特征在于，所述免疫细胞为T细胞，或NK细胞。
15.一种分离的蛋白质的制备方法，其包括如下步骤：培养如权利要求8所述的转化体，从培养物中获得分离的蛋白质。
16.一种抗体药物偶联物，其特征在于，其包括共价附着至细胞毒剂的如权利要求1-4任一项所述的分离的蛋白质，每1当量所述的分离的蛋白质通过x当量接头与y当量的细胞毒剂相连，其具有如式1所示的结构，
Ab-(L)x-(D)y
式1
其中，Ab为如权利要求1-4中任一项所述的分离的蛋白质；L为接头；D为细胞毒剂；x和y各自独立地为3-5的自然数；x和y的比例为1:1；
所述L为马来酰亚胺基己酰、马来酰亚胺基己酰-L-缬氨酸-L-瓜氨酸对氨基苄醇或4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯；和，所述D为甲基奥瑞他汀F、甲基奥瑞他汀E或N2’-脱乙酰-N2’-3-巯基-1氧代丙基)-美登素。
17.如权利要求16所述的抗体药物偶联物，其特征在于，所述式1中x＝y＝n；所述抗体药物偶联物的结构如式3或者如式4或者如式5所示，
式3中，m为1～10，L为马来酰亚胺基己酰；D为甲基奥瑞他汀F；
式4中，L为4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯；D为N2’-脱乙酰-N2’-3-巯基-1氧代丙基-美登素；
式5中，L为马来酰亚胺基己酰-L-缬氨酸-L-瓜氨酸对氨基苄醇，D为甲基奥瑞他汀E；
其中，n为3-5的自然数。
18.如权利要求16或17所述的抗体药物偶联物的制备方法，其包括以下步骤：
a.将如权利要求1-4中任一项所述的分离的蛋白质经过硼酸钠缓冲液透析后，加入三(2-羧乙基)膦，室温下还原得反应液A；
b.将反应液A洗脱去除多余的蛋白质得反应液B；
c.向反应液B中加入如权利要求16或17中所述的-(L)x-(D)y反应即得。
19.如权利要求18所述的抗体药物偶联物的制备方法，其特征在于，步骤a中，所述硼酸钠缓冲液的pH值为6.5～8.5；所述三(2-羧乙基)膦(TCEP)与所述的分离的蛋白质的摩尔比比率为2～10；所述还原的时间为1～4小时；和/或，步骤c中，-(L)x-(D)y与所述的分离的蛋白质的摩尔比比率为5～20，所述反应的温度为10～37℃，所述反应的时间为4小时。
20.一种药物组合物，其特征在于，其包括如权利要求1-4中任一项所述的分离的蛋白质和/或如权利要求16或17所述的抗体药物偶联物，和药学可接受的载体；所述的药物组合物还包括其他抗肿瘤抗体作为活性成分。
21.如权利要求20所述的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物包括0.01～99.99％的如权利要求1-4中任一项所述的分离的蛋白质和/或如权利要求16或17所述的抗体药物偶联物，和0.01～99.99％的药用载体，百分比为占所述药物组合物的质量百分比。
22.一种如权利要求1-4中任一项所述的分离的蛋白质、或者如权利要求16或17所述的抗体药物偶联物、或者如权利要求20所述的药物组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
23.如权利要求22所述的应用，其特征在于，所述抗肿瘤药物为与TROP2表达或功能异常相关的疾病的药物。
24.如权利要求23所述的应用，其特征在于，所述与TROP2表达或功能异常相关的疾病为自体免疫疾病、炎症性疾病、感染性疾病或增殖性疾病。
25.如权利要求24所述的应用，其特征在于，所述与TROP2表达或功能异常相关的疾病为非小细胞肺癌、结肠癌、直肠癌、胃癌、浸润性子宫内膜腺癌、卵巢癌、鳞状膀胱癌、绒毛膜癌、支气管癌、乳腺癌、子宫颈癌、胰腺癌或精囊癌。
26.如权利要求25所述的应用，其特征在于，所述与TROP2表达或功能异常相关的疾病为浸润性乳腺癌、浸润性胰腺癌或鳞状宫颈癌。
27.一种检测过表达TROP2蛋白的细胞的方法，其特征在于，其包括以下的步骤：如权利要求1-4中任一项所述的分离的蛋白质与待检细胞样品在体外接触，检测所述的分离的蛋白质与所述待检细胞样品的结合即可，所述方法为非诊断或治疗目的。
28.如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述检测为FACS检测，和/或，所述待测细胞样品为离体的待测细胞样品。
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