TWI402078B - 抗csf-1r抗體 - Google Patents
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Description
本發明係關於免疫學及癌症治療領域。更具體而言,本發明係關於與人類集落刺激因子-1受體(CSF-1R)結合之人類抗體。
本申請案主張2010年4月1申請之美國臨時申請案第61/319,896號之權益。
由c-fms基因編碼之集落刺激因子-1受體(CSF-1R)(亦稱為M-CSFR或CD-115)(人類CSF-1R變體;SEQ ID NO:15)(人類CSF-1R;SEQ ID NO:16;Uniprot登錄號P07333)係在正常個體之巨噬細胞及粒細胞細胞譜系上及在癌症之腫瘤細胞上選擇表現之酪胺酸激酶受體。存在兩種與CSF-1R之細胞外結構域結合之已知配體,即集落刺激因子-1(CSF-1)(人類CSF-1;SEQ ID NO:17)(Uniprot登錄號P09603)(亦稱為M-CSF)及IL-34(人類IL-34;SEQ ID NO:18)(Uniprot登錄號Q6ZMJ4)。在結合CSF-1或IL-34後,CSF-1R二聚化,從而導致受體之轉磷酸化及下游信號傳導分子(例如MAPK及Akt)磷酸化及激活。CSF-1R磷酸化導致:(1)造血袓幹細胞之巨噬細胞之增殖及分化及(2)巨噬細胞存活及遷移至機體內之各種器官及組織、尤其腫瘤間質。CSF-1R亦可在腫瘤細胞表面上表現。
鼠類CSF-1R之抗體在人類中無交叉反應且因此可係治療人類癌症之有效治療劑。
CSF-1R之人類抗體揭示於PCT公開申請案WO 2009/026303(Brasel,等人)中。此等抗體針對抗體所結合細胞不會誘導抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)活性。當抗體與抗原表現細胞(靶細胞)結合,從而使抗體之Fc區可與天然殺傷細胞、單核細胞、嗜中性粒細胞及樹突細胞(效應細胞)上之Fc受體結合時,發生ADCC。揭示於Brasel中之抗體不能將靶細胞與效應細胞結合在一起以起始對靶細胞之殺傷。
配體之抗體不會交叉反應。因此,CSF-1之抗體不會抑制IL-34與CSF-1R之結合且IL-34之抗體不會抑制CSF-1與CSF-1R之結合。與受體結合之配體可對癌症生長具有效應。另外,配體之抗體不會內化,亦不會誘導CSF-1R降解,亦不會刺激針對細胞之ADCC活性。
人們需要阻斷配體與CSF-1R之結合且亦誘導針對抗體所結合細胞之ADCC活性的多功能抗體。
本發明抗體優於已知抗體之原因在於其具有眾多種功能。本發明抗體阻斷CSF-1及IL-34與受體之結合,藉此防止受體二聚化及所產生細胞內酪胺酸殘基之磷酸化,該等功能對於防止巨噬細胞誘導之腫瘤生長至關重要。本發明抗體內化並誘導CSF-1R降解。重要的是,除阻斷配體結合以外,本發明抗體亦可藉由刺激對腫瘤細胞及腫瘤相關巨噬細胞及單核細胞之殺傷來增強ADCC活性。本發明抗體同時亦影響巨噬細胞活性,該活性在腫瘤進展中起重要作用。由於本發明抗體具有眾多種治療功能,因此其具有顯著優於業內已知抗體之優勢。
本發明之一個態樣係特異性結合人類CSF-1R變體(SEQ ID NO:15)之抗體或其片段,其包含CDRH1,包含序列SYGMH(SEQ ID NO:1);CDRH2,包含序列VIWYDGSNKYYADSVKG(SEQ ID NO:2);CDRH3,包含序列GDYEVDYGMDV(SEQ ID NO:3);CDRL1,包含序列RASQGISNALA(SEQ ID NO:4);CDRL2,包含序列DASSLES(SEQ ID NO:5);及CDRL3,包含序列QQFNSYPWT(SEQ ID NO:6)。本發明之另一態樣係特異性結合人類CSF-1R(SEQ ID NO:16)之抗體或其片段,其包含CDRH1,包含序列SYGMH(SEQ ID NO:1);CDRH2,包含序列VIWYDGSNKYYADSVKG(SEQ ID NO:2);CDRH3,包含序列GDYEVDYGMDV(SEQ ID NO:3);CDRL1,包含序列RASQGISNALA(SEQ ID NO:4);CDRL2,包含序列DASSLES(SEQ ID NO:5);及CDRL3,包含序列QQFNSYPWT(SEQ ID NO:6)。本發明之一個態樣係特異性結合人類CSF-1R(SEQ ID NO:15)之抗體或其片段,其包含CDRH1,包含序列SYGMH(SEQ ID NO:1);CDRH2,包含序列VIWYDGSNKYYADSVKG(SEQ ID NO:2);CDRH3,包含序列GDYEVDYGMDV(SEQ ID NO:3);CDRL1,包含序列RASQGISNALA(SEQ ID NO:4);CDRL2,包含序列DASSLES(SEQ ID NO:5);及CDRL3,包含序列QQFNSYPWT(SEQ ID NO:6)。本發明抗體可在該等CDR序列之一內進一步包含胺基酸取代。
在另一態樣中,上述CDR在該等CDR序列之一內不具有胺基酸取代。
本發明之另一態樣係結合CSF-1R且包含VH或VL之抗體或其片段,該VH包含胺酸序列:
該VL包含胺基酸序列:
本發明之另一態樣係結合CSF-1R且包含輕鏈及重鏈之抗體或其片段,該輕鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO: 10且該重鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO: 9。在本發明之再一態樣中,抗體包含兩條各自包含胺基酸序列SEQ ID NO: 10之輕鏈及兩條各自包含胺基酸序列SEQ ID NO: 9之重鏈。
此等抗體之CSF-1R結合片段係本發明之一部分。
本發明亦提供編碼上述抗體或其片段之經分離DNA及聚核苷酸/聚核酸、包含該等聚核苷酸之表現載體及包含該等聚核苷酸之宿主細胞。本發明進一步提供純化抗體或其片段之方法。本發明進一步提供醫藥組合物,其僅包含本發明之抗體或其片段、聚核苷酸、載體或宿主細胞或其與醫藥上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。本發明提供醫藥組合物,其包含本發明之抗體或其片段以及醫藥上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。
另外,本發明係關於抑制癌細胞生長之方法、及治療白血病、乳癌及前列腺癌之方法,該等方法係在哺乳動物中藉由投與有效量之抗體來實施。本發明之另一態樣係關於抑制癌細胞生長之方法、及治療白血病、子宮內膜癌、乳癌及前列腺癌之方法,該等方法係在哺乳動物中藉由投與有效量之抗體來實施。本發明之再一態樣係關於抑制癌細胞生長之方法、及治療以下癌症之方法:白血病、子宮內膜癌、乳癌及前列腺癌、以及卵巢癌、結腸直腸癌、肝細胞癌、腎癌、多發性骨髓瘤及霍奇金氏淋巴瘤(hodgkin's lymphoma)。本發明抗體可用於治療腫瘤性疾病(包括實體腫瘤)、及用於治療乳癌及前列腺癌。在另一態樣中,本發明抗體可用於治療腫瘤性疾病(包括實體腫瘤)、及用於治療乳癌、子宮內膜癌及前列腺癌。在另一態樣中,本發明抗體可用於治療腫瘤性疾病(包括實體腫瘤)、及用於治療乳癌、子宮內膜癌、前列腺癌、卵巢癌、結腸直腸癌、肝細胞癌及腎癌。
本發明之一個態樣係抗體或其片段,其用於療法、或用於治療或用作藥劑。在再一態樣中,先前所述抗體或其片段係用於治療癌症。本發明可用於治療癌症,包括(但不限於)白血病、乳癌及前列腺癌。在一個態樣中,本發明可用於治療癌症,包括(但不限於)白血病、乳癌、子宮內膜癌及前列腺癌。在另一態樣中,本發明可用於治療癌症,包括(但不限於)白血病、乳癌、子宮內膜癌、前列腺癌、卵巢癌、結腸直腸癌、肝細胞癌、腎癌、多發性骨髓瘤及霍奇金氏淋巴瘤。
本發明亦包括本發明抗體或其片段,其用於治療癌症,包括提供或投與有效量之另一抗癌治療劑,其中該抗癌治療劑包括(但不限於)抗血管生成劑、化學治療劑或抗腫瘤劑。另外,抗腫瘤劑包括(但不限於)多西他賽(docetaxel)、紫杉醇(paclitaxel)、赫賽汀(Herceptin)及多柔比星(doxorubicin)。將抗癌治療劑與本發明所揭示之抗體或片段投與患者。在開始使用其他抗癌治療劑或另一抗腫瘤劑之療法之前、期間、實質上同時或之後投與抗體或其片段。
本發明亦提供本發明抗體用以製造用於治療癌症之藥劑的用途。在一個態樣中,癌症係白血病、乳癌或前列腺癌。在一個態樣中,癌症係白血病、乳癌、子宮內膜癌或前列腺癌。在本發明之另一態樣中,癌症係白血病、乳癌、子宮內膜癌、前列腺癌、卵巢癌、結腸直腸癌、肝細胞癌、腎癌、多發性骨髓瘤或霍奇金氏淋巴瘤。抗體之用途包括提供或投與有效量之另一抗癌治療劑,其中該抗癌治療劑包括(但不限於)抗血管生成劑、化學治療劑或抗腫瘤劑。另外,抗腫瘤劑包括(但不限於)多西他賽、紫杉醇、赫賽汀及多柔比星。將抗癌治療劑與本發明所揭示之抗體或片段投與患者。在開始使用其他抗癌治療劑或另一抗腫瘤劑之療法之前、期間、實質上同時或之後投與抗體或其片段。
本發明進一步提供治療哺乳動物之癌症之方法,其包含向有需要之該哺乳動物投與有效量之本發明抗體或其片段。癌症選自由以下組成之群:白血病、乳癌、子宮內膜癌及前列腺癌。在另一態樣中,癌症選自由以下組成之群:白血病、乳癌、子宮內膜癌、前列腺癌、卵巢癌、結腸直腸癌、肝細胞癌、腎癌、胰腺癌、多發性骨髓瘤及霍奇金氏淋巴瘤。另外,該方法可進一步包含向該哺乳動物投與另一抗癌治療劑。抗癌治療劑選自由以下組成之群:抗血管生成劑、化學治療劑及抗腫瘤劑。抗腫瘤劑可選自由以下組成之群:多西他賽、紫杉醇、赫賽汀及多柔比星。
本發明進一步提供使用抗體或組合物之方法,用以治療有需要之哺乳動物,例如,抑制血管生成或骨轉移,或抑制腫瘤或過度增殖生長或治療炎症疾病。本發明進一步提供抗體或組合物,用於治療有需要之哺乳動物,例如,抑制血管生成或骨轉移,或抑制腫瘤或過度增殖生長或炎症疾病。
本發明亦係關於含有本發明所揭示抗體或其片段之產品或醫藥組合物。另外,該產品或醫藥組合物亦可包括額外醫藥劑、抗腫瘤劑、或抗癌劑或治療劑,包括(但不限於)多西他賽、紫杉醇、赫賽汀或多柔比星,其在療法中係與本發明所揭示之抗體同時、分開或依序組合給予。
若癌症在腫瘤相關巨噬細胞表面上表現CSF-1R,則本發明提供在患者中使用血液試樣、血清試樣、血漿試樣、腫瘤細胞試樣或循環腫瘤細胞試樣中之CSF-1量作為用本發明CSF-1R抗體或其片段成功治療之指標。本發明亦提供治療患者之癌症之方法,其包含以下步驟:(1)量測取自該患者之試樣中CSF-1之量,其中該試樣選自由血液、血清、血漿、腫瘤細胞及循環腫瘤細胞組成之群,及(2)若CSF-1量高於在對照群體中發現之CSF-1量,則向該患者投與本發明抗體或其片段。
本發明提供在患者中使用血液試樣、血清試樣、血漿試樣、腫瘤細胞試樣或循環腫瘤細胞試樣中之IL-34量作為用本發明CSF-1R抗體或其片段成功治療之指標。本發明亦提供治療患者之癌症之方法,其包含以下步驟:(1)量測取自該患者之試樣中IL-34之量,其中該試樣選自由血液、血清、血漿、腫瘤細胞及循環腫瘤細胞組成之群,及(2)若IL-34量高於在對照群體中發現之IL-34量,則向該患者投與本發明抗體或其片段。
本發明之一個態樣係確定患有癌症之個體是否為基於抗CSF-1R抗體之癌症治療方案之候選者的方法,其中該抗體係本發明抗體,該方法包含:(1)離體或活體外測定個體試樣中CSF-1之量,其中該試樣選自由血液、血清、血漿、腫瘤細胞及循環腫瘤細胞組成之群;及(2)其中CSF-1量相對於未患癌症之個體之CSF-1量有所增加指示個體為基於抗CSF-1R抗體之癌症治療方案之候選者。
本發明之另一態樣係確定患有癌症之個體是否為基於抗CSF-1R抗體之癌症治療方案之候選者的方法,其中該抗體係本發明抗體,該方法包含:(1)離體或活體外測定個體試樣中IL-34之量,其中該試樣選自由血液、血清、血漿、腫瘤細胞及循環腫瘤細胞組成之群;及(2)其中IL-34量相對於未患癌症之個體之IL-34量有所增加指示個體為基於抗CSF-1R抗體之癌症治療方案之候選者。
本發明亦提供與CSF-1R特異性結合之抗體。該等抗體具有至少一種選自以下之性質:(a)抑制CSF-1或IL-34與CSF-1R之結合;(b)抑制CSF-1R之激活;(c)減少CSF-1R之磷酸化;(d)減少MAPK之激活;(e)減少Akt之激活;(f)減少CSF-1R之量;及(g)誘導ADCC。本發明之較佳實施例具有性質(a)至(g)。
本發明之一個態樣係抗體或其片段,其特異性結合人類CSF-1R變體(SEQ ID NO:15)或人類CSF-1R(SEQ ID NO:16),且抑制CSF-1R之信號傳導,內化並誘導CSF-1R降解,並針對多種細胞(包括腫瘤、巨噬細胞及單核細胞)刺激抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)活性。SEQ ID NO:15及SEQ ID NO:16在54位相差一個胺基酸,其在結合區以外。
本文所用術語「抗體」包括包含由二硫鍵相互連接之4條多肽鏈(兩條重鏈(H)及兩條輕鏈(L))之免疫球蛋白分子。各鏈可摺疊成具有類似大小(110-125個胺基酸)及結構但不同功能之結構域。
輕鏈可包含一個可變結構域(在本文中縮寫為VL)及/或一個恆定結構域(在本文中縮寫為CL)。人類抗體(免疫球蛋白)之輕鏈為卡帕(kappa)(K)輕鏈或蘭姆達(lambda)(λ)輕鏈。本文所用措詞VL意欲包括來自K型輕鏈之可變區(VK)及來自λ型輕鏈之可變區(Vλ)二者。重鏈亦可包含一個可變結構域(在本文中縮寫為VH)及/或端視抗體類型或同種型而包含三個或四個恆定結構域(CH1、CH2、CH3及CH4)(在本文中共同縮寫為CH)。在人類中,同種型為IgA、IgD、IgE、IgG及IgM,其中IgA及IgG進一步再分成數個亞類或亞型(IgA1-2及IgG1-4)。本發明包括任何上述類型或亞類之抗體。人類IgG1
係本發明抗體之較佳同種型。
在每一VL及VH中可以發現三個稱為超變區或互補決定區(CDR)之區域,其由稱為框架區(在本文中縮寫為FR)之較不變化區域所支撐。根據Kabat條約(Kabat等人,Ann. NY Acad. Sci. 190:382-93(1971);Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,美國健康及人類服務部(U.S. Department of Health and Human Services),NIH公開案第91-3242(1991)號)將胺基酸分配至特定CDR區或結構域。每一VH及VL由3個CDR及4個FR構成,其自胺基末端至羧基末端之排列順序如下:FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。由VL及VH結構域組成之抗體部分稱為Fv(可變片段),且構成抗原結合位點。單鏈Fv(scFv)係在一條多肽鏈上含有VL結構域及VH結構域之抗體片段,其中一個結構域之N末端與另一結構域之C末端藉由撓性連接體接合。
「經分離抗體」係具有以下性質之抗體:(1) 已自組份混合物部分、實質上或完全純化;(2) 已經鑒定並自某天然環境組份分離及/或回收;(3) 單株;(4) 不含來自相同物種之其他蛋白質;(5) 由來自不同物種之細胞表現;或(6) 非天然存在。本文所用組份不包括本發明抗體。其天然環境之污染組份係會干擾抗體之診斷或治療用途之物質,且可包括酶、激素、及其他蛋白質或非蛋白質溶質。經分離抗體之實例包括經親和純化之抗體、藉由雜交瘤或其他活體外細胞系製得之抗體、及衍生自轉基因小鼠之人類抗體。
本文所用術語「單株抗體」係指自一群實質上同源之抗體獲得的抗體,例如,構成該抗體群的單個抗體除了可存在可能天然存在之突變或較少轉譯後變異外實質上相同。單株抗體具有高度特異性,其針對單個抗原位點(亦稱為決定子或抗原決定部位)。此外,與通常包括針對不同決定子之不同抗體之習用(多株)抗體製劑相比,各單株抗體僅針對抗原上之單個決定子。修飾詞「單株」表明該抗體係自實質上同源之抗體群獲得之特徵,且不能理解為需要藉助任一特定方法來生產該抗體。
本文所用術語「人類抗體」包括具有對應於人類種系免疫球蛋白序列之可變區及恆定區的抗體(如Kabat等人,見上文中所述)。本發明之人類抗體在(例如)CDR內可包括非由人類種系免疫球蛋白序列編碼之胺基酸殘基(舉例而言,藉由活體外隨機誘變或定點誘變或藉由活體內體細胞突變引入之突變)。該人類抗體之至少一個位置由胺基酸殘基、例如非由人類種系免疫球蛋白序列編碼之活性增強胺基酸殘基所置換。然而,本文所用術語「人類抗體」不欲包括衍生自另一哺乳動物物種(例如小鼠)種系之CDR序列已移植到人類框架序列上的抗體。本文所述產生「人類抗體」之方法不欲包括在人類中產生之抗體。
片語「重組人類抗體」包括藉由重組手段製備、表現、產生或分離之人類抗體,例如使用轉染至宿主細胞中之重組表現載體表現之抗體、分離自重組、組合人類抗體文庫之抗體、分離自人類免疫球蛋白基因轉基因動物之抗體、或藉由涉及將人類免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA序列之任何其他手段而製備、表現、產生或分離之抗體。此等重組人類抗體具有衍生自人類種系免疫球蛋白序列之可變區及恆定區。
Fc(片段,可結晶區域)係指由成對重鏈恆定結構域組成之抗體部分或片段。例如,在IgG抗體中,Fc由CH2及CH3結構域組成。IgA或IgM抗體之Fc進一步包含CH4結構域。Fc與Fc受體結合、抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)及/或細胞介導之細胞毒性(CMC)之激活相關。對於諸如IgA及IgM等抗體(其為多種IgG樣蛋白質之複合物)而言,複合物形成需要Fc恆定結構域。
因此,本發明抗體包括(但不限於)分離抗體、人類抗體、人類化抗體、重組人類抗體、單株抗體、消化片段、其指定部分及變體,包括抗體模擬物或包含模擬抗體或其指定片段或部分之結構及/或功能的抗體部分;皆含有至少一個CDR。功能片段包括與CSF-1R抗原結合之抗原結合片段。舉例而言,能夠結合CSF-1R或其一部分且為本發明所涵蓋之抗體片段包括二價片段,例如具有完整鏈間二硫鍵之(Fab')2
;單價片段,例如Fab(抗原結合片段),其係指由VL-CL及VL-CH1結構域組成且不保留重鏈鉸鏈區之抗體片段(例如,藉由木瓜蛋白酶消化);保留重鏈鉸鏈區之fab、facb(例如,藉由纖溶酶消化)、F(ab')2
、缺少二硫鍵之Fab'、pFc'(例如,藉由胃蛋白酶或纖溶酶消化)、Fd(例如,藉由胃蛋白酶消化、部分還原及重聚合)及Fv或scFv(例如,藉由分子生物學技術)。抗體片段亦意欲包括(例如)結構域缺失型抗體、線性抗體、單鏈抗體、scFv、單結構域抗體、多價單鏈抗體、自抗體片段形成之多特異性抗體,包括雙鏈抗體、三鏈抗體、及與抗原特異性結合之諸如此類抗體。
鉸鏈區使抗體之Fab與Fc部分分開,使Fab相對於彼此及相對於Fc具有活動性,以及包括用於使兩條重鏈共價連接之多個二硫鍵。
已研發出保留結合特異性但具有其他期望特徵之抗體形式,該等其他期望特徵包括例如雙特異性、多價(兩個以上結合位點)、及緊湊大小(例如,單獨結合結構域)。本發明抗體對CSF-1R具有特異性。抗體特異性係指抗體選擇性識別抗原之特定抗原決定部位。本發明抗體可為(例如)單特異性或雙特異性的。雙特異性抗體(BsAb)係具有兩種不同抗原結合特異性或位點的抗體。在抗體具有一種以上特異性之情形下,所識別之抗原決定部位可能與單一抗原或與一種以上抗原相關。因此,本發明提供結合兩種不同抗原且其中至少一種特異性針對CSF-1R之雙特異性抗體。如上所述,此等抗體包括其任何片段。
本發明抗體或其片段對CSF-1R之特異性可基於親和力(affinity)及/或親合力(avidity)來測定。藉由以抗原與抗體之解離平衡常數(KD
)表示之親和力來量測抗原決定子與抗體結合位點間之結合強度。
本發明抗體或其片段與位於細胞外結構域區段(下文中簡稱為「結構域」或「ECD」)上之CSF-1R之抗原決定部位結合。本文所用術語「抗原決定部位」係指由本發明抗體識別之抗原上的獨立三維位點。抗原決定部位係複合抗原上之免疫學活性區域,該等區域實際上與B細胞受體結合,且實際上與該B細胞所產生之所得抗體分子結合。抗原通常含有至少一個抗原決定部位且通常含有一個以上抗原決定部位。蛋白質抗原上之抗原決定部位可為線性或非線性的。線性抗原決定部位係彼等由蛋白質之胺基酸序列中鄰接胺基酸殘基所組成者。線性抗原決定部位可能需要或不需要構象摺疊來形成天然三維結構及引發免疫反應,產生對抗原具有結合特異性之抗體。非線性抗原決定部位係由非鄰接胺基酸殘基組成。因此,非線性抗原決定部位總是需要一定程度之蛋白質摺疊,使所需要的胺基酸殘基彼此接近來形成天然三維結構及引發免疫反應,產生對抗原具有結合特異性之抗體。
本發明抗體亦包括彼等已藉由定向突變、親和力成熟、噬菌體展示或鏈改組方法改良結合特徵者。親和力及特異性可藉由使CDR及/或FW殘基突變並篩選具有期望特徵之抗原結合位點來改變或改良(例如,參見Yang等人,J. Mol. Biol. 254: 392-403(1995))。可依多種方式使CDR突變。其中一種方式係使個別殘基或殘基組合隨機化,以使原本應具有相同抗原結合位點之群體中兩個至二十個胺基酸之子集出現於特定位置。或者,可藉由易錯PCR方法在多個殘基內引入突變(例如,參見Hawkins等人,J. Mol. Biol. 226: 889-96(1992))。在另一實例中,含有重鏈及輕鏈可變區基因之噬菌體展示載體可在大腸桿菌(E. coli)突變菌株中繁殖(例如,參見Low等人,J. Mol. Biol. 250: 359-68(1996))。該等誘變方法用於例示熟習此項技術者所習知之許多方法。
一種產生取代變體之方便方式係使用噬菌體展示之親和力成熟法。簡言之,使數個CDR區位點突變,以在每一位點上產生所有可能之胺基酸取代。由此產生之抗體變體當融合至包裹於每一粒子中之M13基因III產物上時,由絲狀噬菌體粒子以單價形式展示出來。隨後針對本文所揭示之變體生物活性(例如結合親和力KD
、特異性、EC50
)篩選經噬菌體展示之變體。為鑒定用於修飾之候選CDR區位點,可進行丙胺酸掃描誘變法,以鑒定顯著促成抗原結合性之CDR區殘基。或者(或另外),可對一或多種CDR序列,在一或多個殘基位置上進行隨機誘變,其中CDR係與可變區操作性連接,或CDR係獨立於其他可變區序列,且隨後使用重組DNA技術,將經改變之CDR送回可變區。一旦產生並表現此等變體抗體後,即可使該組變體依本文所述進行篩選,且可在一或多種相關分析中選拔具有優良特性之抗體,用於進一步研發。
除本文特別闡述之抗體外,其他經「實質上同源」修飾之抗體很容易利用彼等熟習此項技術者所熟知之多種重組DNA技術來設計及製造。舉例而言,可藉由數個胺基酸之取代、添加在末端及中間,及刪除、及諸如此類,使框架區之一級結構不同於原始序列。此外,可單獨或組合使用多種不同人類框架區作為本發明人類化免疫球蛋白之基礎。一般而言,基因之修飾法很容易藉由諸如定點誘變等多種熟知技術達成。
本發明包括編碼抗CSF-1R抗體重鏈之核酸序列,其包含任一VH區或其一部分、或任一VHCDR,包括本文所揭示之其任何變體。本發明亦包括編碼抗CSF-1R抗體輕鏈之核酸分子,其包含任一VL區或其一部分或任一VLCDR,包括本文所揭示之其任何變體。本發明亦包括抗體1之核酸序列,對於重鏈及輕鏈分別為SEQ ID NO 13及14。本發明抗體包括包含抗體1之相同CDR區、及/或抗體1之相同輕鏈可變區及/或重鏈可變區的抗體。
本發明抗體可藉由業內已知之方法來產生。該等方法包括Kohler及Milstein,Nature 256: 495-497(1975)及Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology,第13卷(Burdon等人編輯,Elsevier Science Publishers,Amsterdam)in Monoclonal Antibody Technology,The Production and Characterization of Rodent and Human Hybridomas(Campbell編輯,1984)所述之免疫學方法;以及Huse等人,Science 246: 1275-1281(1989)所述之重組DNA方法。抗體亦可自具有呈scFv或Fab形式之VH及VL結構域組合之文庫獲得。VH及VL結構域可藉由合成、部分合成、或天然衍生之核苷酸編碼。本發明可藉由具有人類抗體片段之噬菌體展示文庫製得。人類抗體之其他來源係經改造可表現人類免疫球蛋白基因之轉基因小鼠。
用於製備抗體之一個實施例係在已插入人類抗體產生基因組之實質部分且在產生內源性抗體方面具有缺陷之轉基因動物中表現編碼本發明抗體之核酸。轉基因動物包括(但不限於)小鼠、山羊、及兔。本發明抗體係用轉基因小鼠製得。本發明之又一實施例包括在(例如)分泌多肽之動物乳腺中於泌乳期間表現抗體編碼基因。
用於產生「人類化」抗體之常見方法係將來自MAb(藉由對齧齒類動物宿主實施免疫所產生)之CDR序列接枝至人類Ig骨架上,且將嵌合基因轉染至中國倉鼠卵巢(CHO)細胞中,該等細胞進而產生由CHO細胞分泌之功能抗體。
應瞭解,作為單結構域抗體結合之主要決定子之胺基酸殘基可在Kabat或Chothia定義之CDR內,但亦可包括其他殘基,例如,以其他方式隱藏於VH-VL異源二聚體之VH-VL介面中的殘基。
用於識別本發明之CSF-1R結合抗體的蛋白質較佳為CSF-1R,更佳為CSF-1R之細胞外結構域。CSF-1R細胞外結構域可游離或與另一分子偶聯。可使本發明抗體與額外胺基酸殘基融合。此等胺基酸殘基可為或許能促進分離之肽標籤或優化二聚化之IgG FC部分。本發明亦涵蓋使抗體尋靶特定器官或組織之其他胺基酸殘基。
抗體片段可藉由裂解全抗體或藉由表現編碼該片段之DNA來產生。抗體片段可藉由Lamoyi等人,J. Immunol. Methods 56: 235-243(1983)及Parham,J. Immunol. 131: 2895-2902(1983)所述之方法來製備。該等片段可含有Fab片段或F(ab')2
片段中的一種或兩種。該等片段亦可含有單鏈片段可變區抗體,即scFv、雙鏈抗體、或其他抗體片段。產生此等功能等效物之方法揭示於歐洲專利申請公開案第EP 239,400號(Winter);PCT公開案WO 89/09622(Hann等人);歐洲專利申請公開案第EP 338,745號(Owens等人);及歐洲專利申請公開案第EP 332,424號(Beldler等人)中。在整篇本說明書中,本發明之術語「抗體」包括其任何片段,無論是否特別說明。
用於轉化載體及表現本發明抗體之較佳宿主細胞係哺乳動物細胞,例如,NS0細胞(非分泌型(0)小鼠骨髓瘤細胞)、293、SP20及CHO細胞及其他淋巴樣來源細胞系,例如淋巴瘤、骨髓瘤、或雜交瘤細胞。或者,可使用諸如酵母等其他真核宿主。
本發明抗體可藉由業內已知之任何方法來分離或純化,包括藉由硫酸銨或硫酸鈉沉澱繼之對鹽水透析、離子交換層析、親和層析或免疫親和層析以及凝膠過濾或區帶電泳。純化本發明抗體之較佳方法係蛋白質A親和層析。
編碼人類抗體之DNA可藉由重組編碼實質上或專一地衍生自對應人類抗體區之人類恆定區及可變區(除CDR外)的DNA與編碼衍生自人類之CDR的DNA來製備。
編碼抗體片段之DNA的適宜來源包括表現全長抗體之任何細胞,例如雜交瘤及脾細胞。該等片段本身可作為抗體等效物使用,或可如上所述重組成等效物。本文所述之DNA重組及其他技術可藉由已知方法來實施。如業內已知,DNA之另一來源係抗體之噬菌體展示文庫。
另外,本發明提供含有先前所述與諸如表現序列、啟動子及/或增強子序列等控制序列操作性連接之聚核苷酸序列的表現載體。已研發出多種用於在諸如細菌等原核系統及包括(但不限於)酵母及哺乳動物細胞培養系統在內之真核系統中有效合成抗體多肽的表現載體。本發明載體可包含染色體、非染色體及合成DNA序列的區段。
可使用任何適宜表現載體。舉例而言,原核選殖載體包括來自大腸桿菌之質粒,例如colE1、pCR1、pBR322、pMB9、pUC、pKSM及RP4。原核載體亦包括噬菌體DNA之衍生物(例如M13)及其他絲狀單鏈DNA噬菌體。可在酵母中使用之載體之一實例係2 μ質粒。適於在哺乳動物細胞中表現之載體包括SV-40之熟知衍生物、腺病毒、逆轉錄病毒衍生DNA序列及衍生自功能哺乳動物載體組合之穿梭載體(例如彼等上文所述者)、及功能質粒及噬菌體DNA。其他真核表現載體為業內已知(例如,P.J. Southern及P. Berg,J. Mol. Appl. Genet. 1: 327-41(1982);Subramani等人,Mol. Cell. Biol. 1: 854-64(1981);Kaufmann及Sharp,J. Mol. Biol. 159: 601-21(1982);Scahill等人,Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 80: 4654-59(1983);Urlaub及Chasin,Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 77: 4216-20)(1980)。
可用於本發明之表現載體含有與擬表現DNA序列或片段操作性連接之至少一種表現控制序列。將控制序列插入載體中以控制及調節選殖DNA序列之表現。可用表現控制序列之實例係lac系統、trp系統、tac系統、trc系統、噬菌體λ之主要操縱基因及啟動子區域、fd外殼蛋白之控制區域、酵母之糖酵解啟動子,例如,3-磷酸甘油酸酯激酶之啟動子、酵母酸性磷酸酶之啟動子(例如,Pho5)、酵母α-交配因子之啟動子、及衍生自多瘤病毒、腺病毒、逆轉錄病毒、及猿猴病毒之啟動子,例如,早期及晚期啟動子或SV40、及已知可控制原核或真核細胞及其病毒或其組合之基因表現的其他序列。
在期望於酵母中表現基因構築體之情形下,適宜用於酵母中之選擇基因係存在於酵母質粒YRp7中之trp1基因。trp1基因可為缺乏在色胺酸中生長之能力之酵母突變菌株(例如,ATCC第44076號)提供選擇標記。隨後酵母宿主細胞基因組中trp1損傷的存在可提供有效環境以檢測不存在色胺酸時生長導致之轉化。同樣,Leu2缺陷型酵母菌株(ATCC 20,622或38,626)係藉由具有Leu2基因之已知質粒來補足。
本發明亦提供含有先前所述重組載體之重組宿主細胞。本發明抗體可在非雜交瘤細胞系中表現。可使用包含編碼本發明多肽之序列的核酸來轉化適宜哺乳動物宿主細胞。
基於高表現程度、所關注蛋白質之組成型表現及受宿主蛋白質最少污染來選擇尤佳之細胞系。可用作用於表現之宿主的哺乳動物細胞系已為業內所熟知,且包括許多永生化細胞系,例如(但不限於)COS-7細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、幼倉鼠腎(BHK)細胞及許多其他細胞,包括淋巴來源之細胞系,例如淋巴瘤、骨髓瘤、或雜交瘤細胞。適宜額外真核細胞包括酵母及其他真菌。可用原核宿主包括例如大腸桿菌,例如大腸桿菌SG-936、大腸桿菌HB101、大腸桿菌W3110、大腸桿菌X1776、大腸桿菌X2282、大腸桿菌DHI、及大腸桿菌MRC1、假單胞菌屬(Pseudomonas)、芽孢桿菌屬(Bacillus)(例如枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis))及鏈黴菌屬(Streptomyces)。
可使用該等重組宿主細胞來產生抗體或其片段,此係藉由在容許抗體或其片段表現之條件下培養細胞並自宿主細胞或包圍宿主細胞之培養基純化抗體或其片段來實施。可藉由在所關注抗體編碼基因之5'端插入信號或分泌型前導肽編碼序列來幫助靶向擬在重組宿主細胞中分泌的所表現抗體或片段。該等分泌型前導肽元件可衍生自原核或真核序列。因此,可使用適宜分泌型前導肽,其為接合至多肽之N末端的胺基酸,用以引導多肽移動出宿主細胞胞質溶膠並分泌至培養基中。
可藉業內已知之方法在含有可同化碳(碳水化合物,例如葡萄糖或乳糖)、氮(胺基酸、肽、蛋白質或其降解產物,例如蛋白腖、銨鹽或諸如此類)、及無機鹽(鈉、鉀、鎂及鈣之硫酸鹽、磷酸鹽及/或碳酸鹽)來源之液體培養基中培養經轉化宿主細胞。該培養基進一步含有(例如)生長促進物質,例如微量元素,例如鐵、鋅、錳及諸如此類。
本發明亦提供藉由向哺乳動物投與有效量之抗體來治療哺乳動物腫瘤生長的方法。擬根據本發明治療之適宜病況涉及較佳表現CSF-1R之細胞。儘管不欲受限於任一特定機制,但本發明方法提供治療癌細胞生長之方法,包括(例如)由CSF-1R刺激引起之腫瘤生長、骨轉移、器官移植排斥或免疫病症(例如自體免疫疾病)。
在本發明上下文中,「治療(Treatment或treat)」係指治療性治療,包括抑制、減緩、減輕潛在病況或與疾病或病症有關之不期望生理變化或逆轉其進展、改善病況之臨床症狀或預防出現病況之臨床症狀。有益或期望臨床結果包括(但不限於)緩和症狀、降低疾病或病症之程度、穩定疾病或病症(即,疾病或病症不惡化)、延遲或減緩疾病或病症之進程、改善或減輕疾病或病症、及使疾病或病症好轉(部分或完全),此等可檢測或不可檢測。治療亦可意味著與預期未接受治療者之存活期相比存活期延長。彼等需要治療者包括彼等已患有疾病者。在一個實施例中,本發明可用作藥劑。
在本發明方法中,將治療有效量之本發明抗體投與有需要之哺乳動物或患者。另外,本發明醫藥組合物可包括治療有效量之本發明抗CSF-1R抗體。「治療有效量」或「有效劑量」係指在所需時期內且以所需劑量有效達成期望治療效果之量。抗體之治療有效量可根據下述因素而有所變化:例如疾病狀態、年齡、性別、及個體體重、以及抗體或抗體部分於該個體內引發期望反應之能力。其他因素包括投與手段、目標位點、患者之生理學狀態、患者是人類還是動物、投與之其他藥物、及治療是預防性的還是治療性的。儘管本發明之人類抗體尤其可用於投與人類,但亦可將其投與其他哺乳動物。本文所用術語哺乳動物意欲包括(但不限於)人類、實驗室動物、馴養寵物及農場動物。治療有效量亦為抗體或抗體部分之治療有益效應勝過其任何毒性或有害效應的量。
可對劑量方案加以調節以提供最佳期望反應(例如,治療性或預防性反應)。治療劑量可使用彼等熟習此項技術者已知之常規方法來滴定量測以使安全性及功效最優化。投藥方案範圍通常將自單次濃注劑量或連續輸注至每天多次投與(例如,每4-6小時一次),或如治療醫師及患者病況所指示。本發明抗體之治療有效量之例示性非限制性範圍係0.1-50 mg/kg,更佳為3-35 mg/kg,且更佳為5-20 mg/kg。投藥量及頻率將由患者之治療醫師來確定,且可包括每天一次、每週三次、每週一次、每兩週一次、或更為不經常地給與自小於1 mg/kg至大於100 mg/kg之劑量。然而,應注意,本發明並不限於任一特定劑量。
抗CSF-1R抗體可一或多種其他抗癌治療劑組合投與,該等抗癌治療劑包括(但不限於)抗血管生成劑、化學治療劑及抗腫瘤劑。可使用任何適宜抗癌劑,例如化學治療劑、放射或其組合。
抗癌劑包括(但不限於)抗腫瘤劑、抗體、佐劑及前藥。可將當前業內已知或經評價之抗腫瘤劑分成多個種類,包括(例如)有絲分裂抑制劑、烷基化劑、抗代謝物、嵌入性抗生素、生長因子抑制劑、細胞週期抑制劑、酶、拓撲異構酶抑制劑、抗存活劑、生物反應調節劑、抗激素劑及抗血管生成劑。烷基化劑之實例包括(但不限於)順鉑、環磷醯胺、美法侖(melphalan)及達卡巴嗪(dacarbazine)。抗代謝物之實例包括(但不限於)多柔比星、柔紅黴素(daunorubicin)、紫杉醇、吉西他濱(gemcitabine)、力比泰(ALIMTA)及拓撲異構酶抑制劑伊立替康(irinotecan)(CPT-11)、胺基喜樹鹼(aminocamptothecin)、喜樹鹼(camptothecin)、DX-8951f、托泊替康(topotecan)(拓撲異構酶I)、依託泊苷(etoposide)(VP-16)及替尼泊苷(teniposide)(VM-26)(拓撲異構酶II)。當抗腫瘤劑係放射時,放射來源相對於所治療之患者可為外部的(外部射線束放射療法-EBRT)或內部的(近距離放射療法-BT)。所投與抗腫瘤劑之劑量端視許多因素而定,包括(例如)藥劑類型、所治療腫瘤之類型及嚴重程度及藥劑之投與途徑。然而,應強調,本發明並不限於任一特定劑量。在一個態樣中,多西他賽係本發明之較佳抗腫瘤劑。在本發明之其他態樣中,紫杉醇、赫賽汀及多柔比星係較佳抗腫瘤劑。
本發明抗CSF-1R抗體可與中和與腫瘤生長或血管生成有關之其他受體的抗體一起投與。在本發明之一實施例中,抗CSF-1R抗體係與特異性結合Her2之受體拮抗劑組合使用。此受體之另一實例係VEGFR。抗CSF-1R抗體可與VEGFR拮抗劑組合使用。CSF-1R抗體亦可與一或多種適宜佐劑組合投與,例如,細胞因子(例如,IL-10、IL-4及IL-13)或其他免疫刺激劑,例如(但不限於)趨化因子、腫瘤相關抗原及肽。
在本發明中,可使用任何適宜方法或途徑來投與本發明之抗CSF-1R抗體,且視情況共投與抗腫瘤劑及/或其他受體之拮抗劑。在本發明之組合療法中,抗CSF-1R抗體可在開始使用另一藥劑之療法之前、期間、實質上同時或之後投與,另一藥劑包括(但不限於)多西他賽、紫杉醇、赫賽汀或多柔比星、以及其任一組合。本發明使用之抗腫瘤劑方案包括鹹信最佳適於治療患者之腫瘤病況的任何方案。不同惡性腫瘤可能需要使用特定抗腫瘤抗體及特定抗腫瘤劑,此應基於患者來確定。投與途徑包括例如經口、靜脈內、腹膜內、皮下或肌內投與。所投與拮抗劑之劑量端視許多因素而定,包括(例如)拮抗劑類型、所治療腫瘤之類型及嚴重程度及拮抗劑之投與途徑。然而,應強調,本發明並不限於任何特定投與方法或途徑。
當出於預防或治療目的在哺乳動物中使用本發明之抗CSF-1R抗體時,較佳將其調配成醫藥組合物。此等醫藥組合物及製備其之方法為業內所熟知。例如,參見Remenigton: The Science and Practice of Pharmacy(Gennaro A.等人編輯,第19版,Mack Publishing公司,1995)。
在本發明之另一態樣中,本發明抗體可與抗癌劑、抗腫瘤或抗血管生成劑或可檢測信號產生劑結合投與,或將本發明抗體以化學或生物合成方式連接至抗癌劑、抗腫瘤或抗血管生成劑或可檢測信號產生劑上。與抗體連接之抗腫瘤劑包括破壞或損害抗體已結合或在細胞環境中抗體已結合之新血管系統或腫瘤或噬菌體的任何藥劑。本發明可係以偶聯物形式投與之抗CSF-1R抗體,包括(但不限於)免疫偶聯物,該偶聯物與受體特異性結合並在配體-毒素內化後遞送毒素。抗體-藥劑偶聯物可直接彼此連接或經由連接體、肽或非肽連接。舉例而言,抗腫瘤劑或抗巨噬細胞劑係諸如抗腫瘤劑或放射性同位素等毒劑。包括化學治療劑在內之適宜抗腫瘤劑為彼等熟習此項技術者已知且在下文中論述。本發明進一步涵蓋在可檢測信號產生劑與抗體偶聯之診斷系統中連接至靶或報告分子部分之抗CSF-1R抗體,靶或報告分子部分包括(例如)僅抗腫瘤劑、其他抗體或報告分子,例如經放射標記之同位素。
根據本發明,抑制血管生成之方法包含經一段時間以一定量向哺乳動物投與含有本發明抗體或抗體片段之組合物以有效抑制血管生成。同樣,可在抑制哺乳動物腫瘤轉移之方法中使用抗體及抗體片段,該等方法係藉由經一段時間以一定量向哺乳動物投與含有本發明抗體之組合物以有效抑制腫瘤轉移來達成。
根據本發明,抑制巨噬細胞浸潤至腫瘤間質中並刺激腫瘤生長之方法包含經一段時間以一定量向哺乳動物投與含有本發明抗體或抗體片段之組合物以有效抑制巨噬細胞對腫瘤生長之效應。同樣,可在緩和哺乳動物腫瘤轉移灶周圍之骨質糜爛之方法中使用抗體及抗體片段,該等方法係藉由經一段時間以一定量向哺乳動物投與含有本發明抗體之組合物以有效抑制骨質糜爛來達成。
本發明涵蓋,當癌症在腫瘤相關巨噬細胞表面上表現CSF-1R時,在對治療有反應之癌症患者之血液、血清、血漿、腫瘤細胞或循環腫瘤細胞中使用CSF-1R配體(CSF-1或IL-34)作為生物標記物。本發明進一步涵蓋藉由量測血液試樣中之CSF-1量來預測用本發明抗體或片段成功治療患者之方法,其中該試樣選自由血清、血漿、腫瘤細胞或循環腫瘤細胞組成之群。本發明之另一態樣係治療患者之癌症之方法,其包含以下步驟:(1) 量測取自該患者之試樣中CSF-1之量,其中該試樣選自由血液、血清、血漿、腫瘤細胞及循環腫瘤細胞組成之群,及(2)若CSF-1量高於在對照群體中發現之CSF-1量,則向該患者投與本發明抗體或其片段。本發明進一步涵蓋藉由量測血液試樣中之IL-34量來預測用本發明抗體或片段成功治療患者之方法,其中該試樣選自由血清、血漿、腫瘤細胞或循環腫瘤細胞組成之群。本發明之另一態樣係治療患者之癌症之方法,其包含以下步驟:(1)量測取自該患者之試樣中IL-34之量,其中該試樣選自由血液、血清、血漿、腫瘤細胞及循環腫瘤細胞組成之群,及(2)若IL-34量高於在對照群體中發現之IL-34量,則向該患者投與本發明抗體或其片段。
本發明亦涵蓋確定患有癌症之個體是否為基於抗CSF-1R抗體之癌症治療方案之候選者的方法,其中該抗體係本發明抗體,該方法包含:(1)離體或活體外測定個體試樣中CSF-1之量,其中該試樣選自由血液、血清、血漿、腫瘤細胞及循環腫瘤細胞組成之群;及(2)其中CSF-1量相對於未患癌症之個體之CSF-1量有所增加指示個體為基於抗CSF-1R抗體之癌症治療方案之候選者。
本發明進一步涵蓋確定患有癌症之個體是否為基於抗CSF-1R抗體之癌症治療方案之候選者的方法,其中該抗體係本發明抗體,該方法包含:(1)離體或活體外測定個體試樣中IL-34之量,其中該試樣選自由血液、血清、血漿、腫瘤細胞及循環腫瘤細胞組成之群;及(2)其中IL-34量相對於未患癌症之個體之IL-34量有所增加指示個體為基於抗CSF-1R抗體之癌症治療方案之候選者。
本發明亦涵蓋確定患有癌症之個體是否為基於抗CSF-1R抗體之癌症治療方案之候選者的方法,其中該抗體係本發明抗體,該方法包含:(1)離體或活體外測定個體試樣中CSF-I或IL-34或二者之量,其中該試樣選自由血液、血清、血漿、腫瘤細胞及循環腫瘤細胞組成之群;及(2)其中CSF-1或IL-34或二者之量相對於未患癌症之個體之CSF-1或IL-34或二者之量有所增加指示個體為基於抗CSF-1R抗體之癌症治療方案之候選者。
CSF-1或IL-34之量可以多種方法量測,包括市售套組(R&D Systems,用於CSF-1,及USCN Life Sciences公司,用於IL-34)。在一種此技術中,將CSF-1或IL-34標準物或試樣添加至預塗佈有針對人類CSF-1或IL-34之抗體之板中以使CSF-1或IL-34可與抗體結合。在洗滌未結合CSF-1或IL-34及其他蛋白質後,分別添加識別抗CSF-1或IL-34抗體之二級抗體。二級抗體與辣根過氧化物酶偶合,該酶在將受質添加至各孔中時發出淺藍色。顏色強度與板中所發現CSF-1或IL-34之量相關。
由於CSF-1及IL-34係天然存在於健康人體中,因此將需要在對照群體中測定CSF-1及IL-34之基線。對照群體可包括一群未診斷出患有癌症性病況或具有感染體徵之個體。因此,對照群體將建立多種CSF-1及IL-34之量,其係健康個體之正常值或基線值。舉例而言,乳癌或結腸直腸癌患者血清中CSF-1之量比對照組血清中CSF-1之量分別高68%或77%(Lawicki等人,Clin. Chim. Acta 317: 112-116(2006);Mroczho等人,Clin. Chim. Acta 380: 208-212(2007))。在本發明之一個態樣中,癌症患者試樣中CSF-1R配體之量比對照群體試樣中CSF-1R配體之量高至少50%。可比較對照群體中CSF-1及/或IL-34之量之範圍與自患者試樣或試樣所確定CSF-1及/或IL-34之量以確定患者之CSF-1及/或IL-34量是否高於對照群體之基線範圍。
在一個態樣中,本發明抗體係用於治療癌症,其中癌細胞係分泌配體。在另一態樣中,本發明抗體係用於治療癌症,其中癌細胞係分泌CSF-1。在再一態樣中,本發明抗體係用於治療癌症,其中癌細胞係分泌IL-34。
本發明亦包括用於抑制腫瘤生長及/或血管生成之套組,其包含治療有效量之人類抗CSF-1R抗體。套組可進一步包含抗體或其片段及額外藥劑,包括額外抗癌劑、抗腫瘤劑或治療劑,包括(但不限於)多西他賽、紫杉醇、赫賽汀或多柔比星。或者或另外,套組可含有(例如)下文所論述腫瘤生成或血管生成中所涉及另一生長因子受體之任一適宜拮抗劑。本發明套組可進一步包含佐劑。
因此,本發明受體抗體可在活體內及活體外用於研究、診斷、預防、或治療方法中,此已為業內所熟知。熟習此項技術者可對本文所揭示之本發明原理作出改變,且該等修改意欲包括在本發明範圍內。
應瞭解且預期,熟習此項技術者可對本文所揭示之本發明原理作出改變且該等修改意欲包括在本發明範圍內。
以下實例進一步闡釋本發明,但不應理解為以任何方式限制本發明之範圍;無論如何也不應將其理解為限制本發明之寬廣範圍。習用方法之詳細說明例如用於構建載體及質粒、將編碼多肽之基因插入該等載體及質粒中、將質粒引入宿主細胞中、及表現基因及基因產物及其測定者可自許多出版物獲得,包括Sambrook,J.等人,Molecular Cloning: A Laboratory Manual,第2版,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)及Coligan,J.等人,Current Protocols in Immunology,Wiley & Sons,Incorporated(2007)。
對於各抗體,藉由諸如PCR選殖等適宜方法,將適宜重鏈核苷酸序列(例如抗體1之SEQ ID NO. 13)工程化於適宜表現質粒(例如pGSHC)中,且將適宜輕鏈核苷酸序列(例如抗體1之SEQ ID NO. 14)工程化於適宜表現質粒(例如pGSLC)中。為建立穩定細胞系,在諸如NSO或CHO細胞等適宜宿主細胞系中藉由電穿孔用線性化重鏈及輕鏈質粒共轉染,並在適宜培養基中進行培養,適宜培養基係(例如)不含麩醯胺酸且補充有經透析胎牛血清及麩醯胺酸合成酶之杜貝克改良鷹氏培養基(Dulbecco's Modified Eagle Medium)。藉由酶聯免疫吸附分析(ELISA)針對抗體表現來篩選純系並選擇出表現量最高之生產者在旋轉燒瓶中實施培養。藉由諸如蛋白質A親和層析等適宜方法來純化抗體。
表1提供本發明抗體1之多種CDR的胺基酸序列及SEQ ID NO。使用Kabat條約確定所有CDR序列。表2提供與本發明有關之多種序列的SEQ ID NO。編碼下文所揭示胺基酸序列之聚核酸序列亦包括在本發明範圍內。
對於CSF-1R結合分析,用可溶性重組人類-CSF-1R-Fc融合蛋白(R&D Systems)(1 μg/mL×100 μL)塗佈96孔板,密封該板,且在4℃下培育過夜。用含有0.2% TWEEN-20(PBS/T)之PBS(磷酸鹽緩衝鹽水)將孔洗滌3次,隨後在室溫(20-25℃)(RT)下用含有3%牛血清白蛋白(BSA)之PBS將孔封阻1小時。抽出BSA-PBS混合物並用PBS/T將板洗滌3次。製備抗體1或對照IgG之連續稀釋液(以3 μg/mL開始並稀釋3倍)且將100 μL添加至孔中並在RT下維持1小時。用PBS/T將孔洗滌3次。洗滌後,在RT下將該板與100 μL存於PBS中之抗人類F(ab')2
片段特異性HRP偶聯物(Jackson ImmunoResearch)(1:5000稀釋液)一起培育1小時。用PBS/T將板洗滌5次且隨後在RT下將其與100 μL TMB過氧化物酶受質與過氧化物酶溶液B之1:1製劑(KPL)一起培育15分鐘。添加100 μL 0.1 M H2
SO4
以終止比色反應。使用設定在450 nm之微量板讀數器收集數據。用GraphPad Prism軟體分析吸光度數據以計算ED50
。ED50
或半數最大有效劑量係達成50%最大結合所需劑量。
抗體1對人類CSF-1R之ED50
係8.7×10-11
M,報告為0.09 nM。抗體1表現與CSF-1R之強結合。
在4℃下用(0.5 μg/mL×100 μL)CSF-1(R&D Systems)塗佈96孔微量滴定板過夜。用PBS/T將孔洗滌3次,隨後在RT下用100 μL 3% BSA/PBS封阻1小時。用PBS/T再洗滌3次。以PBS將可溶性人類rh-CSF-1R-Fc融合蛋白(R&D Systems)稀釋至0.250 μg/mL之最終濃度。同時,以PBS將抗體1稀釋至200 nM之最終濃度。以1:3增量自初始200 nM開始將抗體1連續稀釋至3×10-12
M。合併100 μL rh-CSF-1R-Fc與100 μL抗體1之每一稀釋液並在RT下維持30分鐘。在CSF-1塗佈之孔中將100 μL抗體1:CSF-1R-Fc混合物於RT下培育1小時。在RT下培育1小時後,用PBS/T洗滌3次並將抗人類IgG-Fc-HRP偶聯抗體之1:5000稀釋液添加至板中且在RT下維持1小時。用PBS/T將板洗滌5次且隨後在RT下將其與100 μL TMB過氧化物酶受質與過氧化物酶溶液B之1:1製劑(KPL)一起培育15分鐘。添加100 μL 0.1 M H2
SO4
以終止比色反應。使用設定在450 nm之微量板讀數器收集數據。用GraphPad Prism軟體分析吸光度數據以計算IC50
。IC50
或半數最大抑制濃度係造成配體與受體結合50%抑制之抗體濃度。
抗體1與人類CSF-1R結合之IC50
係8.1×10-10
M,報告為0.81 nM。抗體1抑制CSF-1與CSF-1R結合,藉此阻止CSF-1配體激活CSF-1R。
在4℃下用(0.5 μg/mL×100 μL)IL-34(R&D Systems)塗佈96孔微量滴定板過夜。用PBS/T將孔洗滌3次,隨後在RT下用100 μL 3% BSA/PBS封阻1小時。用PBS/T再洗滌3次。以PBS將可溶性人類rh-CSF-1R-Fc融合蛋白(R&D Systems)稀釋至0.250 μg/mL之最終濃度。同時,以PBS將抗體1稀釋至200 nM之最終濃度。以1:3增量自初始200 nM開始將抗體1連續稀釋至3×10-12
M。合併100 μL rh-CSF-1R-Fc與100 μL抗體1之每一稀釋液並在RT下維持30分鐘。在IL-34塗佈之孔中將100 μL抗體1-CSF-1R-Fc混合物於RT下培育1小時。在RT下培育1小時後,用PBS/T洗滌3次並將抗人類IgG-Fc-HRP偶聯抗體之1:5000稀釋液添加至板中且在RT下維持1小時。用PBS/T將板洗滌5次且隨後在RT下將其與100 μL TMB過氧化物酶受質與過氧化物酶溶液B之1:1製劑(KPL)一起培育15分鐘。添加100 μL 0.1 M H2
SO4
以終止比色反應。使用設定在450 nm之微量板讀數器收集數據。用GraphPad Prism軟體分析吸光度數據以計算IC50
。IC50
或半數最大抑制濃度係造成配體與受體結合50%抑制之抗體濃度。
抗體1與人類CSF-1R結合之IC50
係7.0×10-10
M,報告為0.71 nM。抗體1抑制IL-34與CSF-1R結合,藉此阻止IL-34配體激活CSF-1R。
在Biacore2000 SPR生物感測器(GE Healthcare)上在25℃下量測抗體1與CSF-1R-Fc之結合動力學。使用標準胺偶合方案將可溶性CSF-1R-Fc融合蛋白(濃度為10 μg/mL且pH值為5)(反應單元範圍為395至1200)固定在CM5晶片上。在結合親和力量測期間,使用HBS-EP(0.01 M HEPES(pH 7.4)、0.15 mM NaCl及3 mM EDTA、0.005% v/v表面活性劑P20)作為運行緩衝液。當以範圍為1.5-100 nM之濃度將存於溶液中之抗體注射於CM5感測器晶片之製備表面上時,實施相互作用分析。注射抗體並經3分鐘使其結合,且經15分鐘使其解離。藉由10 μL/min注射20 mM HCL來使經固定蛋白質再生。藉由將數據同時整體擬合至1:1 Langmuir模型使用BIA評估4.1版軟體來測定複合物形成之Ka
(kon
)及Kd
(koff
)。自以莫耳量測之1/KD
之比率(1/M)計算平衡締合常數(KA
)。自以莫耳量測之速率常數Kd
/Ka
之比率(M)計算平衡解離常數(KD
)。
對抗體1與人類CSF-1R實施多個Biacore分析的平均Ka
、Kd
及KD
值匯總於表3中。
抗體1顯示與CSF-1R之高結合親和力。
以5×105
細胞/孔之密度將經CSF-1R細胞穩定轉染之NIH3T3細胞接種於存於12孔板中之含有10%胎牛血清(FBS)及1 mg/mL遺傳黴素(geneticin)之1 mL孔杜貝克改良鷹氏培養基(DMEM)中並維持5小時。在PBS中將單層洗滌兩次且在0.9 mL/孔具有1% FBS之DMEM中培養過夜。在DMEM中製備抗體1之連續稀釋液(以1 μg/mL開始且稀釋3倍)並將100 μL添加至孔中且在37℃維持2小時。用100 ng/mL CSF-1或IL-34配體將細胞刺激10分鐘且隨後置於冰上並用冰冷PBS洗滌。在冰上將細胞於100 μL 50 mM Hepes(pH 7.5 150 mM NaCl,0.5% Triton X-100,1 mM Na3
VO4
,10 mM NaPPi,50 mM NaF)及蛋白酶抑制劑錠劑(Roche)中裂解10分鐘。在4℃下藉由離心澄清裂解細胞。將20 μL裂解物加載於變性電泳凝膠上且轉印至硝酸纖維素膜上。藉由使用1 μg/mL抗磷酸CSF-1R抗體(Cell Signaling)檢測印跡上之酪胺酸磷酸化CSF-1R。藉由用抗磷酸-MAPK(1:500稀釋)或抗磷酸-Akt(1:1000)(Cell Signaling)探測印跡來測定CSF-1R信號傳導。為確保等效加載泳道,用抗CSF-1R抗體(1 μg/mL;R&D Systems)或抗肌動蛋白抗體(1:2000;Sigma)探測印跡。在搖晃的同時於RT下將所有一級抗體培育1小時;隨後亦在搖晃的同時於RT下將與HRP偶聯之相應二級抗體培養1小時。藉助化學發光試劑(GE Healthcare)使區帶可視化。
經CSF-1R穩定轉染之NIH-3T3細胞當經CSF-1或IL-34刺激時,顯示CSF-1R之快速磷酸化。即使在抗體1之濃度為1 nM時,抗體1之存在亦會抑制CSF-1R磷酸化,顯示抗體1與CSF-1R之結合可阻止CSF-1或IL-34激活受體。抑制CSF-1R磷酸化亦可減少CSF-1或IL-34途徑所用信號傳導分子之磷酸化。當將細胞與100 nM至1 nM之抗體1一起培育時,在CSF-1R下游之Akt與MAPK二者均具有降低之磷酸化量。因此,抗體1可阻止CSF-1R激活及在CSF-1R刺激後之激酶級聯激活。泳道之間肌動蛋白與CSF-1R之蛋白質含量無差異,如藉由當用針對該等分子之抗體探測印跡時發現各泳道中之化學發光信號相等所證實。因此,CSF-1R磷酸化之抑制不是由於對蛋白質試樣實施不均勻加載之技術困難,而是信號傳導降低之真實呈現。
將NIH-3T3-CSF-1R細胞平鋪在8孔分室載片(Nunc)上且在37℃下培育,直至細胞覆蓋孔之50%表面區域。使載片冷卻至4℃,隨後在水:冰漿液混合物中開始實驗。將細胞與5 μg/mL抗體1一起培育且立即轉移至37℃並維持15分鐘至4小時以進行內化。將單獨組之載片在水:冰漿液混合物中繼續培育15分鐘至4小時且以5 μg/mL抗體1作為對照。4℃培育可阻止CSF-1受體之內化,因此在細胞內發現之任何信號均係假像。培育後,用冷PBS將細胞洗滌兩次,隨後用冰冷1%多聚甲醛將細胞固定15分鐘。用冷PBS洗滌3次後,在含有0.5%皂苷及1% BSA之PBS中將細胞滲透化處理5分鐘且隨後在含有1% BSA之PBS中再洗滌。用山羊Cy3抗人類IgG(1:5000稀釋液)標記1小時以對抗體1進行螢光標記。用PBS實施3次最終洗滌,隨後安放於GelMount(Biomeda)中並用蓋玻片覆蓋載片。可顯微觀察經螢光標記之抗體1以確定在上述各種條件下之細胞位置。
在顯微檢測後,在開始實驗前,在4℃下,在細胞外周發現抗體1。將細胞轉換為37℃使得抗體1/CSF-1R複合物可快速內化,一般可在15分鐘內觀察到。在與抗體1一起培育1或2小時後,所有抗體/CSF-1R複合物均在核週處,且在血漿膜上僅觀察到極少量,顯示與CSF-1R結合之抗體1誘導受體快速內化且保留在細胞內部。在4℃下保持長達2小時之細胞顯示僅細胞外周受到染色,而抗體1未內化。因此,抗體/CSF-1R之內化係在將抗體添加至細胞後15分鐘內發生的ATP依賴性過程。
以5×105
細胞/孔將NIH-3T3-CSF-1R細胞接種於存於12孔板中之含有10% FBS及1 mg/mL遺傳黴素之1 mL DMEM培養基中。在37℃下將細胞培育5小時後,將100 ng/mLCSF-1或15 μg/mL抗體1添加至板中。已知CSF-1可誘導CSF-1R之內化及降解,藉此用作實驗之陽極對照。使CSF-1在細胞上保留1小時及5小時,隨後收集細胞。在其他孔中,與抗體1一起培育24小時及48小時,隨後收集細胞。抽出培養基,裂解細胞且在凝膠上運行經澄清裂解物(如上文所述)。用抗CSF-1R抗體探測經轉移蛋白質以測定每一條件下之受體量。用抗肌動蛋白抗體探測同一印跡以將蛋白質含量標準化。使用Multi-Gauge程式來量測西方墨點上之區帶密度,從而量化CSF-1R及肌動蛋白之量。藉由用總CSF-1R區帶密度除以相應肌動蛋白區帶密度來表示相對總CSF-1R蛋白質含量。
將CSF-1與NIH-3T3-CSF-1R細胞一起培育可在1小時處理內導致CSF-1R降解且CSF-1R量在5小時內減半。當將CSF-1R與抗體1一起培育時,其降解並不同樣顯著;抗體1使CSF-1R量降低1/4。48小時後,降解量保持相同,顯示降解率保持恆定。因此,抗體1與CSF-1R之結合導致細胞內受體之降解。
除抑制CSF-1與CSF-1R結合及誘導CSF-1R之內化及降解以外,抗體1亦藉由觸發ADCC反應來抑制CSF-1R。
以2×105
細胞/mL將NKM-1人類白血病細胞接種於存於96孔板中含有10%超低IgG FBS及3 ng/mL人類IL-2之25 μL RPMI培養基中。在IgG1或IgG2骨架中製備1 μg/mL抗體1之1:3連續稀釋液,添加25 μL/孔。15分鐘培育後,接種25μL 3×106
細胞/mL人類NK細胞(Lonza)且在37℃下再培育4小時。添加來自aCella-TOX套組(Cell Technology)之10 μL裂解緩衝且使其達到RT並維持15分鐘。添加125 μL低IgG FBS且將板以750 xg離心1分鐘。將來自aCella-TOX套組之50 μL酶分析稀釋劑添加至Optiplates(Perkin Elmer)中並將50 μL細胞上清液小心地轉移至Optiplates中。根據套組說明書製備酶分析試劑及檢測試劑,添加100 μL酶分析試劑,隨後將50 μL檢測試劑立即添加至Optiplates中。在添加試劑後20分鐘,在光度計中讀取板。
ADCC活性以抗體1劑量依賴性方式增加,當抗體1濃度達到1 μg/mL時,殺傷9% NKM-1細胞。相當之下,當將抗體1選殖至IgG2骨架中時,ADCC活性隨抗體1量之增加而無變化。因此,抗體1(IgG1分子)誘導其所結合細胞之ADCC。
先前公開案已確定,CSF-1與CSF-1R之前三個Ig結構域結合(Wang等人,Mol. Cell. Biol. 13: 5348(1993))。抗體1結合CSF-1R並抑制CSF-1與人類CSF-1R結合,因此其必須在CSF-1R之前三個Ig結構域上或附近結合。為確定CSF-1R分子上與抗體1結合之抗原決定部位,交換小鼠與人類之前三個Ig結構域(參見表4)。抗體1不能識別小鼠CSF-1R,因此,若將小鼠Ig結構域插入人類CSF-1R之關鍵結合區中,則將不會發生抗體結合。
將前三個Ig結構域之修飾插入人類CSF-1R骨架中,該骨架含有細胞外結構域中C-末端之剩餘最後兩個Ig結構域。使該等構築體與IgG分子之Fc部分融合,以利於蛋白質產生及分子穩定性。
因此,嵌合體1含有與Fc標籤融合之小鼠Ig結構域1、人類Ig結構域2及人類Ig結構域3(m,h,h)、人類Ig結構域4及5。嵌合體2至嵌合體7如下:m,m,h(嵌合體2)、m,m,m(嵌合體3)、h,m,h(嵌合體4)、h,m,m(嵌合體5)、h,h,m(嵌合體6)及m,h,m(嵌合體7),其依次與人類CSF-1R之最後兩個Ig結構域及Fc標籤融合。
抗體1與嵌合CSF-1R蛋白之結合係藉由結合ELISA及Biacore來測定,如上文所述。簡言之,用100 μL 200 ng/mL人類、小鼠或嵌合體1-7蛋白將板塗佈過夜。在洗滌及封阻板後,以100 nM濃度一式兩份添加抗體1。以1:10,000之濃度添加與HRP偶聯之抗人類Fab二級抗體以檢測抗體1與CSF-1R分子之結合。
如所預期,在ELISA結合分析中,抗體1與人類而非小鼠CSF-1R結合。抗體1與含有第一或第二人類Ig結構域之嵌合體,而非彼等含有第一或第二小鼠Ig結構域者弱結合。抗體1與含有人類CSF-1R之第一及第二Ig結構域二者之嵌合體強結合。所有其他構築體均不會結合抗體1。因此,儘管抗體1與Ig結構域1及2結合,但在結合分析中進行評價時,抗體與人類CSF-1R之強結合需要該兩種結構域。Biacore數據概括ELISA數據。不含有人類第二Ig結構域之任何嵌合構築體即使在抗體濃度為1 μM時,亦不結合抗體1,顯示抗體1結合需要第二Ig結構域。當第一Ig結構域亦源自人類時,抗體1結合進一步增強。因此,儘管抗體1主要與CSF-1R之第二Ig結構域結合,但與第一Ig結構域具有一些有益接觸。
以4×105
細胞/mL之密度將單核細胞(Lonza)接種於8室載片之各室中含有10% FBS及100 ng/mL hCSF-1之900 μL Roswell Park Memorial Institute(RPMI) 1640培養基中。在RPMI中製備抗體1之連續稀釋液(以1 μg/mL開始且稀釋3倍)且將100 μL添加至孔中。在37℃下培育,每三天更換培養基,直至明顯看到細胞附著至板上並延長,此係巨噬細胞分化之特徵。
在CSF-1存在下,經2 nM或更高濃度之抗體1處理的單核細胞不能分化為巨噬細胞,且保持其作為單核細胞之圓形形態特徵。抗體1可以0.25 nM之IC50
抑制CSF-1誘導單核細胞向巨噬細胞分化。另外,許多單核細胞在處理期間死亡,其在不用CSF-1進行連續刺激時不能存活。
以4×105
細胞/mL之密度將單核細胞(Lonza)接種於8室載片之各室中含有10% FBS及100 ng/mL hIL-34之900 μL Roswell Park Memorial Institute(RPMI) 1640培養基中。在RPMI中製備抗體1之連續稀釋液(以1 μg/mL開始且稀釋3倍)且將100 μL添加至孔中。在37℃下培育,每三天更換培養基,直至明顯看到細胞附著至板上並延長,此係巨噬細胞分化之特徵。
在IL-34存在下,經2 nM或更高濃度之抗體1處理的單核細胞不能分化為巨噬細胞,且保持其作為單核細胞之圓形形態特徵。抗體1可以0.3 nM之IC50
抑制IL-34誘導單核細胞向巨噬細胞分化。另外,許多單核細胞在處理期間死亡,其在不用CSF-1進行連續刺激時不能存活。
以3000細胞/孔之密度將單核細胞(Lonza)接種於存於96孔板中含有10% FBS及100 ng/mL CSF-1之RPMI 1640培養基中。第二天,更換培養基並添加自20 nM連續稀釋至0.01 nM之抗體1(1:3倍稀釋液)。三天後,將培養基更換為含有10% FBS、100 ng/mL CSF-1及抗體之新鮮培養基,並使細胞再生長5天。在添加100 μL CellTiter Glo發光緩衝液及受質(Promega)後,將細胞振盪10分鐘並讀取發光度作為活力指標。
抗體1抑制50%單核細胞生長之IC50
係1.4×10-10
M,報告為0.1 nM。在抗體1存在下,CSF-1誘導單核細胞生長之IC50
顯示抗體1抑制培養物中單核細胞之增殖。
以3000細胞/孔之密度將單核細胞(Lonza)接種於存於96孔板中含有10% FBS及100 ng/mL IL-34之RPMI 1640培養基中。第二天,更換培養基並添加自20 nM連續稀釋至0.01 nM之抗體1(1:3倍稀釋液)。三天後,將培養基更換為含有10% FBS、100 ng/mL IL-34及抗體之新鮮培養基,並使細胞再生長5天。在添加100 μL CellTiter Glo發光緩衝液及受質(Promega)後,將細胞振盪10分鐘並讀取發光度作為活力指標。
抗體1抑制50%單核細胞生長之IC50
係0.5 nM。在抗體1存在下,IL-34誘導單核細胞生長之IC50
顯示抗體1抑制培養物中單核細胞之增殖。
以1×104
細胞/mL將NKM-1白血病細胞接種於存於96孔板中含有1% FBS之100 μL RPMI 1640培養基中過夜。將20 ng/mL CSF-1添加至存於含有1% FBS及自20 nM連續稀釋至0.01 nM之抗體1(1:3倍稀釋液)之RPMI 1640培養基中之細胞中。在37℃下再培育3天。在添加100 μL CellTiter Glo發光緩衝液及受質(Promega)後,將細胞振盪10分鐘,隨後讀取發光度(作為活力指標)。
在抗體1存在下,NKM-1生長之IC50
係7.6×10-11
M,報告為0.07 nM。此顯示,抗體1抑制培養物中NKM-1細胞之增殖。
用200 rad/小鼠之亞致死量將Nu/nu小鼠輻照24小時,隨後靜脈內注射2.5×106
NKM-1白血病細胞。再過24小時後,將小鼠隨機分成4組,其每週兩次接受60 mg/kg人類IgG、60 mg/kg、20 mg/kg或5 mg/kg抗體1。每天監測小鼠之存活情況。藉由對數秩Mantel Cox測試來確定P值。
N/A=不適用
腫瘤體積係藉由公式體積=[(Pi/6) l×w2
]來計算,其中Pi等於3.14,w代表寬度且1代表長度。對照百分比或T/C%=100*(治療體積)/(對照體積)。若p值小於或等於0.05,則認為具有統計顯著性。
抗體1延長具有NKM-1白血病細胞之小鼠之存活期,如表5中所示。
抗CSF-1R抗體1係完全人類抗體,其識別CSF-1R之人類形式但不識別該受體之鼠類形式。因此,需要抗小鼠抗體來實施概念驗證(proof of concept)活體內研究,其中在巨噬細胞上表現CSF-1R。該等研究闡明小鼠巨噬細胞在小鼠異種移植模型中對人類腫瘤生長之作用。抗小鼠抗體會影響小鼠巨噬細胞但不影響腫瘤,從而使得能夠計量間質巨噬細胞對腫瘤生長之效應。利用抗體2(大鼠抗小鼠CSF-1R抗體)實施以下實驗。
經皮下向Nu/nu小鼠(雌性,7-8週齡)之左肋注射5×106
AN3CA細胞/小鼠。當腫瘤達到約200 mm3
時,將小鼠隨機化為12只小鼠/治療組。
製備濃度為6 mg/mL之存於鹽水中之抗體2及大鼠IgG且每週3次以40 mg/kg經皮下投與。第15天記錄腫瘤體積並計算T/C%。使用RM ANOVA分析腫瘤體積。計算抗體2之治療組相對於大鼠IgG對照組之T/C%為66%。該等結果顯示經抗體2治療之動物之顯著腫瘤抑制(p=0.045)。
用1×107
HCC1954細胞/小鼠經皮下注射Nu/nu(雌性,7-8週;Charles River Laboratories)小鼠。當腫瘤大小達到300 mm3
時,根據腫瘤大小將將小鼠隨機化,每個治療組分配12只動物。製備濃度為6 mg/mL之存於鹽水中之大鼠IgG及抗體2且每週3次經皮下投與。每次注射時,以40 mg/kg將大鼠IgG給予動物且以40 mg/kg或10 mg/kg將抗體2給予動物。每週兩次記錄腫瘤量測;在第一次注射後37天計算T/C%。使用RM ANOVA分析腫瘤體積。
如表6中所顯示,在第37天,以相對腫瘤體積對鹽水對照組之比率計算接受10 mg/kg之治療組之T/C%為77%且接受40 mg/kg之治療組之T/C%為56%。結果顯示經40 mg/kg抗體2治療之動物之顯著腫瘤抑制(p=0.0014)。
經皮下向Nu/nu小鼠(雄性,7-8週齡)之左肋注射15×106
DU145細胞/小鼠。當腫瘤達到約250 mm3
時,將小鼠隨機化為12只小鼠/治療組。
製備濃度為6 mg/mL之存於鹽水中之抗體2及大鼠IgG且每週3次以40 mg/kg及10 mg/kg經皮下投與。第21天記錄腫瘤體積並計算10 mg/kg及40 mg/kg%之T/C。使用RM ANOVA分析腫瘤體積。
如表6中所顯示,計算治療組10 mg/kg及40 mg/kg對大鼠IgG對照組之T/C%分別為50及43。該等結果顯示經抗體2治療之動物之顯著腫瘤抑制(p=<0.0001,對於兩種濃度)。
自上述HCC1954(乳腺)及DU145(前列腺)動物研究中之動物移除腫瘤。沿最長軸切割腫瘤並將其置於10%甲醛中在4℃下過夜,同時搖晃。24小時後,在PBS中經20分鐘洗滌2次,隨後添加濃度逐漸升高之乙醇溶液,直至腫瘤存於100%乙醇中。藉由在100%二甲苯中培育數次將乙醇更換為二甲苯且將腫瘤包埋於石蠟中。將石蠟切成4 μm塊並置於載玻片上。藉由在二甲苯中進行逐漸培育,隨後增加存於乙醇中水之濃度來將組織去石蠟化並再水化。在微波爐中將腫瘤載片於目標回收溶液(Dako)中加熱3分鐘,隨後在RT下用3% H2
O2
將內源性過氧化物酶阻斷10分鐘。用Protein Block(Dako)將非特異性蛋白質結合阻斷10分鐘,隨後添加與生物素偶聯之大鼠抗小鼠巨噬細胞特異性抗體F4/80(2 μg/mL;Serotec)且在4℃下培育過夜。在RT下在抗生蛋白鏈菌素(HRP-Streptavidin)(1:1000稀釋液;Jackson ImmunoResearch)中培育45分鐘並洗滌3次。依照套組說明書在DAB(Dako)中顯色,藉助在水中洗滌兩次來終止反應。用Mayer's蘇木精(10分鐘;Dako)進行簡單複染色,隨後水洗,酸醇浸漬,第二次水洗及使用氨水染成藍色。脫水,透明並使用永久封固劑蓋上玻片。對於每一治療組,分析來自三隻動物之5張照片。使用ImagePro軟體,測定每一治療組之巨噬細胞數/面積。
N/A=不適用
如表7中所示,在兩種腫瘤模型中、尤其在外周處,巨噬細胞數減少。因此,抗體2治療可減少腫瘤之巨噬細胞浸潤,顯示抗小鼠CSF-1R抗體負責消耗該等腫瘤中之巨噬細胞群。
除乳腺腫瘤及前列腺腫瘤以外,藉由投與抗體1亦可有益地抑制腫瘤生長並治療許多癌症。一些腫瘤類型(例如腎癌)在其細胞表面上表現CSF-1R且用抗體1治療可直接抑制其生長(Soares等人,Modern Pathol. 22: 744-752(2009))。具有大腫瘤相關巨噬細胞群之其他腫瘤類型(例如霍奇金氏淋巴瘤及多發性骨髓瘤)可受益於抗體1治療,其中抗體1可消除誘導腫瘤生長之巨噬細胞(Steidl等人New Engl. J. Med. 362: 875-885(2010);Zheng等人,Blood 114: 3625-3628(2009))。另外,分泌CSF-1之腫瘤對抗CSF-1或CSF-1R治療敏感,例如結腸直腸癌(Aharinejad等人,Cancer Res. 62: 5317-5324(2002))且將適合於抗體1治療。此外,高CSF-1表現與差預後相關之卵巢癌、肝細胞癌及腎細胞癌均將為抗體1治療之候選者(Toy等人,Gyn. Oncol. 80: 194-200(2001);Zhang等人,Gyn. Oncol. 107: 526-531(2007);Zhu等人,J. Clin. Oncol. 26: 2707-2716(2008);Gerharz等人,Urol. 58:821-827(2001))。
以5×105
細胞/mL將腫瘤細胞系HCC1954(乳腺)、DU145(前列腺)及Pc3(前列腺)接種於含有1% FBS之生長培養基中並維持48小時。收集、澄清培養基,並使用R&D Quantikine人類M-CSF分析套組(R&D Systems)對其實施分析。在0及48 h時間以pg/mL測定CSF-1量。
在0小時時,如所預期,培養基中無可辨別CSF-1。然而,在48小時內,HCC1954細胞分泌3613 pg/mL CSF-1,同時DU145細胞產生4019 pg/mL CSF-1。相比之下,Pc3細胞培養基僅含有39 pg/mL CSF-1。
將5×106
Pc3前列腺細胞經皮下注射至裸鼠(雄性,7-8週齡)中並使腫瘤達到300 mm3
,隨後細分為每個治療組12只小鼠。每週3次給予動物40 mg/kg大鼠IgG、40 mg/kg抗體2或10 mg/kg抗體2,直至對照腫瘤達到2000 mm3
。在第18天量測腫瘤體積並以相對腫瘤體積對大鼠IgG對照組之比率計算每一治療組之T/C%。使用RM ANOVA分析腫瘤體積。
大鼠IgG治療之對照組與抗體2治療之組之間的生長無差異,顯示升高之CSF-1量可係用抗CSF-1R抗體治療的生物標記物。
將如下表9及10中所詳述之細胞經皮下注射至裸鼠中並使腫瘤達到300 m3
,然後細分為每個治療組12只小鼠。根據下表9及10中所詳述之治療方案,每週3次向動物投藥直至對照腫瘤達到2000 mm3
。量測腫瘤體積並以相對腫瘤體積對大鼠IgG對照組之比率計算每一治療組之T/C%。使用RMANOVA分析腫瘤體積。
TIW=每週3次
TIW=每週3次
分泌CSF-1之腫瘤(表9)均對用抗體2所實施之抗CSF-1R治療有反應,而彼等不分泌CSF-1之腫瘤(表10)對抗CSF-1R抗體2無反應或僅有弱反應。在腫瘤相關巨噬細胞表面上表現CSF-1R之腫瘤模型中,CSF-1分泌與抗CSF-1R治療之敏感性相關。因此,當腫瘤相關巨噬細胞表面上表現CSF-1R時,升高之CSF-1量可用作潛在敏感性指標或生物標記物。
CSF-1R亦可在腫瘤細胞表面上表現。對於CSF-1R腫瘤細胞表面表現,CSF-1分泌與抗CSF-1R治療之敏感性不相關。
除CSF-1以外,IL-34亦可與CSF-1R結合,誘導受體之磷酸化,並激活下游信號傳導分子,從而使巨噬細胞分化並存活。CSF-1與IL-34二者與CSF-1R之細胞外區域中之IgG結構域結合(Lin等人,Science,320: 807-11(2008))且抗體1可抑制此兩種配體與CSF-1R結合(IC50
=0.81 nM及IC50
=0.71 nM,就抗體1對CSF-1及IL-34結合之抑制而言,分別如上文所論述)。用抗體1治療經CSF-1R穩定轉染之NIH-3T3細胞抑制IL-34對CSF-1R之磷酸化(如上文所論述)。此外,抗體1可抑制IL-34誘導單核細胞向巨噬細胞分化及巨噬細胞增殖,IC50
分別為0.3 nM及0.5 nM(如上文所論述),此與用CSF-1所發現之結果相當。因此,IL-34活性及抗體1對其之抑制與用CSF-1所發現者相似。
IL-34量在包括乳腺、前列腺及子宮內膜腫瘤細胞系在內的許多腫瘤細胞內有所升高。另外,前列腺及乳腺患者亞群在其血清中具有高IL-34蛋白量。因此,由於IL-34之功能與CSF-1幾乎相同且CSF-1分泌與抗CSF-1R治療之敏感性相關,因此升高之IL-34量亦可用作敏感性指標或生物標記物。
向Nu/nu小鼠(雌性,7-8週齡)中經皮下注射1×107
HCC-1954乳腺細胞/小鼠且使腫瘤達到300 mm3
,然後進行治療。將小鼠隨機化為每組12只且如下進行治療:
TIW=每週3次;Q7Dx2=每7天1次,兩次;Q7Dx3=每7天1次,3次。
量測腫瘤體積並以相對腫瘤體積對對照組之比率計算每一治療組之T/C%。使用RM ANOVA分析腫瘤體積。
在表11中所顯示之所有研究中,抗體2、赫賽汀、多柔比星及紫杉醇作為單一藥劑抑制腫瘤生長。然而,組合抗體2與腫瘤靶向藥劑具有累加效應,顯示抗CSF-1R抗體與影響腫瘤之化學治療劑或其他藥劑的組合將比單獨該等試劑更為有效。
向Nu/nu小鼠(雄性,7-8週齡)中經皮下注射1.5×107
DU145前列腺細胞/小鼠且使腫瘤達到300 mm3
,然後進行治療。將小鼠隨機化為10只之組且如下進行治療:
TIW=每週3次;Q7Dx3=每7天一次,3次。
量測腫瘤體積並以相對腫瘤體積對對照組之比率計算每一治療組之T/C%。使用RM ANOVA分析腫瘤體積。
組合抗體2與多西他賽具有累加效應,顯示在前列腺癌中與化學治療劑之組合將比單獨化學治療試劑更為有效。
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Claims (15)
- 一種特異性結合人類CSF-1R變體(SEQ ID NO. 15)之抗體或其片段,其包含:CDRH1,其包含序列SYGMH(SEQ ID NO:1);CDRH2,其包含序列VIWYDGSNKYYADSVKG(SEQ ID NO:2);CDRH3,其包含序列GDYEVDYGMDV(SEQ ID NO:3);CDRL1,其包含序列RASQGISNALA(SEQ ID NO:4);CDRL2,其包含序列DASSLES(SEQ ID NO:5);及CDRL3,其包含序列QQFNSYPWT(SEQ ID NO:6)。
- 一種特異性結合人類CSF-1R(SEQ ID NO. 16)之抗體或其片段,其包含:CDRH1,其包含序列SYGMH(SEQ ID NO:1);CDRH2,其包含序列VIWYDGSNKYYADSVKG(SEQ ID NO:2);CDRH3,其包含序列GDYEVDYGMDV(SEQ ID NO:3);CDRL1,其包含序列RASQGISNALA(SEQ ID NO:4);CDRL2,其包含序列DASSLES(SEQ ID NO:5);及CDRL3,其包含序列QQFNSYPWT(SEQ ID NO:6)。
- 如請求項1或2之抗體或其片段,其包含VL,該VL包含胺基酸序列:AIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNALAWYQQKPGKAPKLLIYDASSLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQFNSYPWTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO:8);及VH,該VH包含胺基酸序列:QDQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGEGLEWVAVIWYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGDYEVDYGMDVWGQGTTVTVAS(SEQ ID NO:7)。
- 如請求項3之抗體或其片段,其包含重鏈,該重鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO:9;及輕鏈,該輕鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO:10。
- 如請求項4之抗體或其片段,其包含兩條重鏈,該兩條重鏈各自包含胺基酸序列SEQ ID NO:9;及兩條輕鏈,該兩條輕鏈各自包含胺基酸序列SEQ ID NO:10。
- 一種醫藥組合物,其包含如請求項1至5中任一項之抗體或片段以及醫藥上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。
- 如請求項6之醫藥組合物,其進一步包含額外醫藥劑。
- 一種如請求項1至5中任一項之抗體或其片段之用途,其用於製造用以治療癌症之藥劑。
- 如請求項8之用途,其中該癌症係白血病、乳癌、子宮內膜癌、前列腺癌、卵巢癌、結腸直腸癌、肝細胞癌、腎癌、多發性骨髓瘤或霍奇金氏淋巴瘤(hodgkin's lymphoma)。
- 如請求項9之用途,其中該癌症係白血病、乳癌、子宮內膜癌或前列腺癌。
- 如請求項10之用途,其中該癌症係白血病、乳癌或前列腺癌。
- 如請求項8至11之用途,其中在開始使用另一抗癌治療劑之療法之前、期間、實質上同時或之後投與該抗體或其片段。
- 如請求項12之用途,其中該抗癌治療劑選自由抗血管生成劑、化學治療劑及抗腫瘤劑組成之群。
- 如請求項13之用途,其中該抗腫瘤劑選自由多西他賽(docetaxel)、紫杉醇(paclitaxel)、赫賽汀(Herceptin)及多柔比星(doxorubicin)組成之群。
- 一種確定患有癌症之個體是否為基於抗CSF-1R抗體之癌症治療方案之候選者的方法,其中該抗體係如請求項1至5之抗體,該方法包括:於離體或活體外測定該個體試樣中CSF-1或IL-34或二者之量,其中該試樣選自由血液、血清、血漿、腫瘤細胞及循環腫瘤細胞組成之群;其中該CSF-1或IL-34或二者之量相對於未患癌症之個體之CSF-1或IL-34或二者之量有所增加時,表示該個體為該基於抗CSF-1R抗體之癌症治療方案之候選者。
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