EA021600B1

EA021600B1 - Антитела к csf-1r

Info

Publication number: EA021600B1
Application number: EA201270732A
Authority: EA
Inventors: Жаклин Франсуа Дуди; Яньси Ли
Original assignee: Имклон Ллк
Priority date: 2010-04-01
Filing date: 2011-03-28
Publication date: 2015-07-30
Also published as: JP2013529183A; HRP20171153T1; EP2552966A1; AU2011232850B2; BR112012024564A2; TW201138824A; CY1119324T1; SI2552966T1; CN102834414A; JO3291B1; RS56219B1; SG183829A1; PT2552966T; TWI402078B; HUE036379T2; AR080698A1; ME02806B; DK2552966T3; US8263079B2; CN102834414B

Abstract

Согласно изобретению предложено антитело, которое связывает CSF-1R человека с высокой аффинностью. Антитела согласно изобретению обладают значительными преимуществами по сравнению с антителами, известными в данной области техники, благодаря своей многофункциональности: ингибированию передачи сигнала от CSF-1R, интернализации и стимулированию разрушения CSF-1R, а также стимулированию антителозависимой клеточной цитотоксичности в клетках, включая опухоли, макрофаги и моноциты. Также была продемонстрирована их эффективность в лечении лейкемии, рака молочной железы, эндометрия и предстательной железы по отдельности или в сочетании с доцетакселем, паклитакселем, герцептином® или доксорубицином.

Description

Настоящее изобретение относится к областям иммунологии и лечения рака. Более конкретно, настоящее изобретение относится к антителам человека, которые связываются с рецептором колониестимулирующего фактора-1 (С8Р-1К).

Рецептор колониестимулирующего фактора-1 (С8Р-1К), также называемый С8РК или СО-115 (вариант С8Р-1К человека; 8ЕЦ ГО N0: 15) (С8Р-1К человека; 8ЕЦ ГО N0: 16; номер доступа в системе υηίρτοΐ Р07333), кодируемый геном е-Гтк. представляет собой тирозинкиназный рецептор, селективно экспрессируемый на линиях макрофагов и гранулоцитов у здоровых людей и на клетках раковых опухолей. Известны два лиганда: колониестимулирующий фактор-1 (С8Р-1) (С8Р-1 человека; 8ЕЦ ГО N0: 17; номер доступа в системе υηίρτοΐ Р09603), также именуемый М-С8Р, и Ш-34 (интерлейкин-34) (Ш-34 человека; 8ЕЦ ГО N0: 18; номер доступа в системе υηίρτοΐ Ο6ΖΜΪ4), которые связываются с внеклеточным доменом С8Р-1К. При связывании с С8Р-1 или Ш-34 С8Р-1К димеризуется, что приводит к трансфосфорилированию рецептора, а также фосфорилированию и активации молекул, расположенных ниже в сигнальном пути, таких как МАРК (митоген-активируемая протеинкиназа) и АкЕ Фосфорилирование С8Р-1К приводит к (1) пролиферации и дифференцировке макрофагов из гематопоэтических стволовых клеток-предшественников и (2) выживанию и миграции макрофагов в разные органы и ткани организма, в частности в строму опухоли. Также С8Р-1К может экспрессироваться на поверхности клеток опухоли.

Антитела к С8Р-1К мыши не обладают перекрестной реактивностью в организме человека и, следовательно, были бы неэффективны в качестве средств для лечения рака у людей.

Антитела человека к С8Р-1К описаны в публикации \Υ0 2009/026303 (Бгаке1, с1 а1.). Такие антитела не вызывают антителозависимой клеточной цитотоксичности (АЗЦТ) в отношении клеток, связываемых указанными антителами. АЗЦТ возникает, когда указанное антитело связывается с клеткой, экспрессирующей антиген (клетка-мишень), в ходе чего Рс-область указанного антитела становится доступна для связывания с рецептором Рс на клетках - естественных киллерах, моноцитах, нейтрофилах и дендритных клетках (клетки-эффекторы). Антитела, раскрытые у Вгаке1, не способны сблизить клетку-мишень и клетку-эффектор, чтобы инициировалось уничтожение клетки-мишени.

Антитела к указанному лиганду не обладают перекрестной реактивностью. Следовательно, антитела к С8Р-1 не ингибируют связывания Ш-34 с С8Р-1К, а антитела к Ш-34 не ингибируют связывания С8Р-1 с С8Р-1К. Связывание лиганда с рецептором может оказывать определенное действие на рост раковой опухоли. Кроме того, антитела к указанному лиганду не интернализуются, не вызывают разрушения С8Р-1К и не стимулируют АЗЦТ в отношении клеток.

Существует потребность во многофункциональных антителах, которые блокировали бы связывание указанных лигандов с С8Р-1К, а также обусловливали АЗЦТ активность в отношении клеток, с которыми связались эти антитела.

Антитела согласно настоящему изобретению имеют преимущество перед известными антителами, поскольку они обладают различными функциями. Антитела согласно настоящему изобретению блокируют связывание С8Р-1 и Ш-34 с рецептором, благодаря чему препятствуют димеризации рецептора и последующему фосфорилированию внутриклеточных остатков тирозина - функции, которые исключительно важны для предотвращения роста опухоли, индуцированного макрофагами. Антитела согласно настоящему изобретению интернализуются и вызывают разрушение С8Р-1К. Важно, что, помимо блокирования связывания лиганда, антитела согласно настоящему изобретению усиливают активность АЗЦТ, стимулируя уничтожение клеток опухоли и ассоциированных с опухолью макрофагов и моноцитов. Антитела согласно настоящему изобретению также одновременно воздействуют на активность макрофагов - активность, которая играет ключевую роль в прогрессировании опухоли. Благодаря разнообразным терапевтическим функциям, которыми обладают антитела согласно настоящему изобретению, они имеют значительное преимущество перед антителами, известными в данной области техники.

Сущность изобретения

Одним аспектом настоящего изобретения является антитело или его фрагмент, которые специфически связываются с вариантом С8Р-1К человека (8ЕЦ ГО N0: 15), содержащие

СОКН1, имеющий последовательность 8ΥΟΜΗ (8ЕЦ ГО N0: 1),

СОКН2, имеющий последовательность νΐΑΥΟΟ8\ΚΥΥΑΟ8νΚΟ (8ЕС ГО N0: 2),

СОКН3, имеющий последовательность ΟΥΡνΟΥΟΜΟν (8ЕЦ ГО N0: 3),

СОКЬ1, имеющий последовательность РА8СО18КАЕА (8ЕЦ ГО N0: 4),

СОКЬ2, имеющий последовательность ОА88ЬЕ8 (8ЕЦ ГО N0: 5), и

СОКЬ3, имеющий последовательность ΟΟΕ^ΥΡΧΥΤ (8ЕЦ ГО N0: 6).

Другим аспектом настоящего изобретения является антитело или его фрагмент, которые специфически связываются с вариантом С8Р-1К человека (8ЕЦ ГО N0: 16), содержащее

СОКН2, имеющий последовательность νΐΑΥΟΟ8\ΚΥΥΑΟ8νΚΟ (8ЕЦ ГО N0: 2),

СОКН3, имеющий последовательность Ο^ΥΡV^ΥΟΜ^V (8ЕЦ ГО N0: 3),

СОКЬ1, имеющий последовательность ΚА8^ΟI8NА^А (8ЕЦ ГО N0: 4),

- 1 021600

СЭРЕ2, имеющий последовательность ΌΆδδΕΕδ (8ЕЦ ΙΌ N0: 5), и

СОРЕЗ, имеющий последовательность 0ΡΡΝδΥΡ\νΤ (8ЕЦ ΙΌ N0: 6).

Одним из аспектов настоящего изобретения является антитело или его фрагмент, которые специфически связываются с вариантом С8Р-1Р человека (8ЕЦ ГО N0: 15), содержащие

СГОРН1, имеющий последовательность 8ΥΟΜΗ (8ЕЦ ΙΌ N0: 1),

СЭРН2, имеющий последовательность У1\\У1)СЕ\1ЮАЛ1)5УКС. (8ЕЦ ГО N0: 2),

СГОРНЗ, имеющий последовательность С^ΥΕV^ΥСΜ^V (8ЕЦ ГО N0: 3),

СГОРЬ-Р имеющий последовательность РЛ5>ОС15>КЛРЛ (8ЕЦ ГО N0: 4),

С0РЬ2, имеющий последовательность ПЛ§§ЬЕ§ (8ЕЦ ГО N0: 5), и

СОРЬЗ, имеющий последовательность ΟΟΡΉδΥΡνΤ (8ЕЦ ΙΌ N0: 6).

Антитела согласно настоящему изобретению также могут содержать замены аминокислот в одном из указанных СОР. Согласно другому аспекту вышеуказанные СЭР не содержат замен аминокислот в последовательностях одной из СЭР.

Другим аспектом настоящего изобретения является антитело или его фрагмент, которые связываются с вариантом С8Р-1Р человека и содержат УН, имеющую последовательность аминокислот:

Ρϋ<3ΕνΕ8000νν(}Ρ0Κ8ΕΚΕ5εΑΑ50ΡΤΡ83ΥΟΜΗ5Υν]<(3ΑΡ0Ε0ΕΕ\νν ΑνΐΐνΥΙΧΪ5ΝΚΥΥΑ05νκαΚΡΤΙ5ΚΟΝ3ΚΝΤΕΥΕ9ΜΝ5ΕΚΑΕΟΤΑνΥΥ€Α ΚΟΟΥΕνθΥΟΜϋν\νθΟΟΤΤντνΑ8 (8Е(? ГО №:7), или УЪ, содержащую последовательность аминокислот:

Α[ΟΕΤφ5Ρ33Ε5Α5νθΟΚνΤΙΤ€ΚΑ5θαΐ5ΝΑΕΑν7ΥΟρΚΡΟΚΑΡΚΕΕΙΥΟΑ 85ΕΕ56νΡ5Μ^;8Ο5Ο8ΟΊΌΡΤΕΤΙ55Ε<3ΡΕΟΡΑΤΥΥ€0<2ΡΝ3ΥΡΥ'ΤΡΟ0ΟΤΚ УЕ1К (5ЕрГО№:Х).

Другим аспектом настоящего изобретения является антитело или его фрагмент, которые связываются с вариантом С8Р-1Р человека и содержат легкую цепь, имеющую последовательность аминокислот 8Е0 ГО N0: 10, и тяжелую цепь, содержащую последовательность аминокислот ЗЕЦ ГО N0: 9. Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения указанное антитело содержит две легкие цепи, каждая из которых имеет последовательность аминокислот ЗЕЦ ГО N0: 10, и две тяжелые цепи, каждая из которых имеет последовательность аминокислот ЗЕЦ ГО N0: 9.

СЗР-1Р-связывающие фрагменты таких антител являются частью настоящего изобретения.

Также согласно настоящему изобретению предложены изолированные ДНК и полинуклеотиды/полинуклеиновые кислоты, кодирующие антитела или их фрагменты, описанные выше, векторы экспрессии, содержащие указанные полинуклеотиды, и клетки-хозяева, содержащие указанные полинуклеотиды. Также согласно настоящему изобретению предложены способы очистки указанных антител или их фрагментов. Также согласно настоящему изобретению предложены композиции, содержащие указанные антитела или их фрагменты, полинуклеотиды, векторы или клетки-хозяева согласно настоящему изобретению, одни или с фармацевтически приемлемой основой, растворителем или наполнителем. Согласно настоящему изобретению предложены фармацевтические композиции, содержащие указанные антитела или их фрагменты согласно настоящему изобретению вместе с фармацевтически приемлемой основой, растворителем или наполнителем.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способам подавления роста клеток опухоли и к способам лечения лейкемии, карцином молочной железы и предстательной железы, у млекопитающих, путем введения эффективного количества антитела. Другой аспект настоящего изобретения относится к способам подавления роста клеток опухоли и к способам лечения лейкемии, карцином эндометрия, молочной железы и предстательной железы у млекопитающих путем введения эффективного количества антитела. Еще один аспект настоящего изобретения относится к способам подавления роста клеток опухоли, и к способам лечения лейкемии, карцином эндометрия, молочной железы и предстательной железы, а также рака яичников, прямой и ободочной кишки, печеночно-клеточного рака, рака почек, множественной миеломы и лимфомы Ходжкина. Антитела согласно настоящему изобретению можно применять для лечения новообразований, включая солидные опухоли, и для лечения карцином молочной железы и предстательной железы. Согласно другому аспекту настоящего изобретения указанные антитела можно применять для лечения новообразований, включая солидные опухоли, и для лечения карцином эндометрия, молочной железы и предстательной железы. Согласно другому аспекту настоящего изобретения указанные антитела можно применять для лечения новообразований, включая солидные опухоли, и для лечения карцином эндометрия, а также карциномы яичников, прямой и ободочной кишки, печеночно-клеточной карциномы и карциномы почек,

Одним из аспектов настоящего изобретения является антитело или его фрагмент для применения при терапии, или для применения в лечении, или для применения в качестве лекарственного средства. Согласно еще одному аспекту описанные выше антитела или их фрагменты применяют в лечении рака. Настоящее изобретение можно применять в лечении типов рака, которые включают лейкемию, рак молочной железы и рак предстательной железы, но не ограничиваются ими. Согласно одному аспекту настоящее изобретение можно применять в лечении типов рака, которые включают лейкемию, рак молоч- 2 021600 ной железы, рак эндометрия и рак предстательной железы, но не ограничиваются ими. Согласно другому аспекту настоящее изобретение можно применять в лечении типов рака, которые включают лейкемию, рак молочной железы, рак эндометрия, рак предстательной железы, рак яичника, рак прямой и ободочной кишки, печеночно-клеточный рак, рак почек, множественную миелому и лимфому Ходжкина, но не ограничиваются ими.

Также настоящее изобретение включает антитело или его фрагмент согласно настоящему изобретению для применения в лечении рака, включая обеспечение или введение эффективного количества другого противоракового средства, причем указанное противораковое средство включает антиангиогенный агент, химиотерапевтический агент или антинеопластический агент, но не ограничиваясь ими. Также антинеопластические агенты включают доцетаксел, паклитаксел, герцептин® и доксорубицин, но не ограничиваются ими. Указанный противораковый агент вводят пациенту в дополнение к антителу или его фрагменту, раскрываемым в настоящем изобретении. Указанное антитело или его фрагмент вводят перед, во время, в существенной степени одновременно или после начала терапии другим противораковым препаратом или другим антинеопластическим агентом.

Также согласно настоящему изобретению предложено применение антитела согласно настоящему изобретению в изготовлении лекарственного препарата для лечения рака. Согласно одному аспекту указанный рак - это лейкемия, рак молочной железы, рак эндометрия или рак предстательной железы. Согласно другому аспекту настоящего изобретения указанный рак - это лейкемия, рак молочной железы, рак эндометрия, рак предстательной железы, рак яичника, рак прямой и ободочной кишки, печеночноклеточный рак, рак почек, множественная миелома или лимфома Ходжкина. Применение указанного антитела включает обеспечение или введение эффективного количества другого противоракового препарата, причем указанный противораковый агент включает антиангиогенный агент, химиотерапевтический агент или антинеопластический агент, но не ограничиваясь ими. Также антинеопластические агенты включают доцетаксел, паклитаксел, герцептин® и доксорубицин, но не ограничиваются ими. Указанный противораковый агент вводят пациенту в дополнение к антителу или его фрагменту согласно настоящему изобретению. Указанное антитело или его фрагмент вводят перед, во время, по существу, одновременно или после начала терапии другим противораковым средством или другим антинеопластическим агентом.

Также согласно настоящему изобретению предложен способ лечения рака у млекопитающего, включающий введение указанному млекопитающему, нуждающемуся в нем, эффективного количества антитела или его фрагмента согласно настоящему изобретению. Указанный рак выбран из группы, состоящей из лейкемии, рака молочной железы, рака эндометрия и рака предстательной железы. Согласно другому аспекту указанный рак выбирают из группы, состоящей из лейкемии, рака молочной железы, рака эндометрия, рака предстательной железы, рака яичника, рака прямой и ободочной кишки, печеночно-клеточноо рака, рака почек, множественной миеломы и лимфомы Ходжкина. Кроме того, указанный способ может включать введение другого противоракового препарата указанному млекопитающему. Указанный противораковый агент выбирают из группы, включающей антиангиогенный агент, химиотерапевтический агент или антинеопластический агент. Также антинеопластические агенты включают доцетаксел, паклитаксел, герцептин® и доксорубицин.

Также согласно настоящему изобретению предложены способы применения антител в лечении млекопитающего, нуждающегося в таком лечении, например, для подавления ангиогенеза или метастазов в костях или для подавления роста опухоли или пролиферативного роста, или для лечения воспалительных заболеваний. Также согласно настоящему изобретению предложены антитела для лечения млекопитающего, нуждающегося в лечении, например, для подавления ангиогенеза или метастазов в костях или для угнетения опухоли или пролиферативного роста, или воспалительных заболеваний.

Также настоящее изобретение относится к продукту или фармацевтической композиции, содержащим антитело или его фрагмент согласно настоящему изобретению. Кроме того, указанный продукт или фармацевтическая композиция может включать дополнительный фармацевтический агент, антибластомный агент или средство, включая доцетаксел, паклитаксел, герцептин® и доксорубицин, но не ограничиваясь ими, в сочетании с раскрываемым в настоящем описании антителом одновременно, раздельно или последовательно в ходе терапии.

Согласно настоящему изобретению предложено применение уровня С8Р-1 в пробах крови, сыворотки, плазмы, клеток опухоли или циркулирующих клеток опухоли в качестве индикатора успешности лечения антителами к С8Р-1К согласно настоящему изобретению, или его фрагментами, у пациентов, если указанная раковая опухоль экспрессирует на поверхности ассоциированных с опухолью макрофагов С8Р-1К. Также согласно настоящему изобретению предложен способ лечения рака у пациента, включающий следующие этапы:

(1) измерение уровня С8Р-1 в пробе, взятой у пациента, причем пробу выбирают из группы, состоящей из крови, сыворотки, плазмы, опухолевых клеток и циркулирующих опухолевых клеток; и (2) введение пациенту антитела или фрагмента антитела согласно настоящему изобретению, если уровень С8Р-1 выше, чем уровень С8Р-1, определяемый у контрольной популяции.

- 3 021600

Согласно настоящему изобретению предложено применение уровня 1Ь-34 в пробах крови, сыворотки, плазмы, клеток опухоли или циркулирующих клеток опухоли в качестве индикатора успешности лечения антителами к С8Р-1Р согласно настоящему изобретению, или его фрагментами, у пациентов. Также согласно настоящему изобретению предложен способ лечения рака у пациента, включающий следующие этапы:

(1) измерение уровня 1Ь-34 в пробе, взятой у пациента, причем пробу выбирают из группы, состоящей из крови, сыворотки, плазмы, опухолевых клеток и циркулирующих опухолевых клеток; и (2) введение пациенту антитела или фрагмента антитела согласно настоящему изобретению, если уровень 1Ь-34 выше, чем уровень 1Ь-34, определяемый у контрольной популяции.

Одним из аспектов настоящего изобретения является способ определения, является ли субъект, страдающий раком, кандидатом на противораковую терапию с применением анти-С8Р-1Р антител, причем указанное антитело - это антитело согласно настоящему изобретению, и при этом способ включает:

(1) определение уровня С8Р-1 ех νίνο или ίη νίίτο в пробе пациента, причем указанную пробу выбирают из группы, состоящей из крови, сыворотки, плазмы, опухолевых клеток и циркулирующих опухолевых клеток; и (2) повышение уровня С8Р-1 по сравнению с уровнем С8Р-1 у лиц, не страдающих раком, которое указывает на то, что указанный субъект является кандидатом на противораковую терапию с применением анти-С8Р-1Р антител.

Другим аспектом настоящего изобретения является способ определения, является ли субъект, страдающий раком, кандидатом на противораковую терапию с применением анти-С8Р-1Р антител, причем указанное антитело - это антитело согласно настоящему изобретению, и при этом способ включает:

(1) определение уровня 1Ь-34 ех νίνο или ίη νίίτο в пробе пациента, причем указанную пробу выбирают из группы, состоящей из крови, сыворотки, плазмы, опухолевых клеток и циркулирующих опухолевых клеток; и (2) повышение уровня 1Ь-34 по сравнению с уровнем 1Ь-34 у лиц, не страдающих раком, которое указывает на то, что указанный субъект является кандидатом на противораковую терапию с применением анти-С8Р-1Р антител.

Также согласно настоящему изобретению предложены антитела, специфично связывающиеся с С8Р-1Р. Указанные антитела обладают по меньшей мере одним свойством, выбранным из следующей группы:

(a) ингибирование связывания С8Р-1 или 1Ь-34 с С8Р-1Р;

(b) ингибирование активации С8Р-1Р;

(c) уменьшение уровня фосфорилирования С8Р-1Р;

(б) снижение активации МАРК;

(е) снижение активации Ак1;

(ί) сокращение количества С8Р-1Р и (д) индукция АЗЦТ.

Предпочтительный вариант реализации настоящего изобретения обладает свойствами (а)-(д).

Одним из аспектов настоящего изобретения является антитело или его фрагмент, которые специфически связываются с вариантом С8Р-1Р человека (ЗЕО ГО N0: 15) или с С8Р-1Р человека (ЗЕО ГО N0: 16) и ингибируют передачу сигнала через СЗР-1Р, интернализуются и вызывают разрушение СЗР-1Р, а также стимулируют антителозависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (АЗЦТ) в отношении целого ряда клеток, включая клетки опухоли, макрофаги и моноциты. Последовательности 8Е0 ГО N0: 15 и 8Е0 ГО N0: 16 различаются по одной аминокислоте в положении 54, находящемся за пределами области связывания.

В настоящем описании термин антитело включает молекулы иммуноглобулинов, содержащие четыре полипептидных цепи, две тяжелых (Н) и две легкие цепи (Ь), связанные друг с другом дисульфидными связями. Индивидуальные цепи могут скручиваться в домены сходного размера (110-125 аминокислот) и структуры, но с разными функциями.

Указанная легкая цепь может содержать вариабельную область (обозначаемую в настоящем описании УЪ) и/или один константную область (обозначаемую в настоящем описании СЬ). Легкие цепи антитела человека (иммуноглобулинов) представляют собой либо каппа (к) легкие цепи, либо лямбда (λ) легкие цепи. Термин экспрессия УЪ в настоящем описании включает вариабельные области как из легких цепей каппа-типа (Ук), так и из легких цепей лямбда-типа (νλ). Указанная тяжелая цепь может также содержать вариабельную область (обозначаемую в настоящем описании УН) и/или, в зависимости от класса или изотипа антитела, три или четыре константных домена (СН1, СН2, СН3 и СН4) (вместе обозначаемые в настоящем описании как СН). У людей указанные изотипы включают 1дА, 1дЭ. 1дЕ, 1дС и 1дМ, причем 1дА и 1дС также подразделяют на подклассы или подтипы (1дА1-2 и 1дС1-4). Настоящее изобретение включает антитела любого из вышеперечисленных классов или подклассов. Для антител согласно настоящему изобретению предпочтительным изотипом является 1дС1 человека.

- 4 021600

В каждом УЪ или УН находятся три участка, называемые гипервариабельными или определяющими комплементарность участками (СОР), которые поддерживаются менее вариабельными областями, называемыми каркасными (сокращенно в настоящем описании обозначаются РК). Согласно правилу КаЬа1 аминокислоты относят к конкретной области или домену СОК (КаЬар с1 а1., Αηη. ΝΥ Асай. δοί. 190:382-93 (1971); КаЬа1, с1 а1., Зесщенсех οί РгоЮйъ οί 1ттипо1одюа1 ОНегеШ ίίίΐΗ Еййюп, И.8. Оерайтей οί НеаИЪ апй Нитап §егуюе8, ΝΙΗ РиЫюайоп Νο. 91-3242 (1991).). Каждая УН и УЪ состоит из трех СОК и четырех РК, которые расположены от Ν-конца к С-концу в следующем порядке: РК1-СОК1-РК2-СОК2-РК3-СОК3-РК4. Часть антитела, состоящая из областей УЪ и УН, обозначают Ρν (вариабельный фрагмент), и она образует собой антигенсвязывающий сайт. Одноцепочечный Ρν ЦсРу) представляет собой фрагмент антитела, содержащий область УЪ и область УН в одной полипептидной цепи, причем Ν-конец одной области и С-конец другой области соединены гибким линкером.

Изолированное антитело - это антитело, которое (1) было частично, в существенной степени или полностью очищено из смеси компонентов; (2) было идентифицировано и выделено и/или восстановлено из какого-либо компонента его естественного окружения; (3) является моноклональным; (4) не содержит других белков из того же вида; (5) экспрессируется клеткой другого вида или (6) не существует в природе. Термин компоненты в контексте настоящего описания не включает антитело согласно настоящему изобретению. Загрязняющие компоненты его (антитела) естественного окружения - это материалы, которые могут мешать при диагностическом или терапевтическом применении указанного антитела, и они могут включать ферменты, гормоны и другие белковоподобные или небелково-подобные растворимые вещества. Примеры изолированных антител включают антитело, которое было афинно очищено, антитело, которое было получено посредством гибридомы или другой линии клеток ίη νίίτο, и антитело человека, полученной из трансгенных мышей.

В настоящем описании термин моноклональное антитело относится к антителу, полученному из популяции в существенной степени однородных антител, например из индивидуальных антител, составляющих одну популяцию, которые в существенной степени идентичны за исключением возможных возникающих в природе мутаций или минорных посттрансляционных вариантов, которые могут присутствовать. Моноклональные антитела высокоспецифичны и направлены к одному антигенному сайту (также называемому детерминантой или эпитопом). Кроме того, в отличие от препаратов традиционного (поликлонального) антитела, которые обычно включают разные антитела, направленные против разных детерминант, каждое моноклональное антитело направлено против одной детерминанты на антигене. Определение моноклональное указывает на свойство антитела, полученного в существенной степени из однородной популяции антител, но ни в какой мере не требует, чтобы указанное антитело было получено каким-либо конкретным способом.

В настоящем описании термин антитело человека включает антитела, содержащие вариабельные и константные области, соответствующие последовательности иммуноглобулина человека эмбрионального типа (как описано у КаЬа! е1 а1., 8ирга). Антитела человека согласно настоящему изобретению могут включать остатки аминокислот, не кодируемые последовательностями иммуноглобулина человека эмбрионального типа (например, мутации, полученные путем случайного или сайт-специфичного мутагенеза ίη νίίτο или за счет соматических мутаций), например в СОК. В антителе человека может содержаться замена по меньшей мере в одном положении на определенный остаток аминокислоты, например, остаток аминокислоты, повышающий активность, который не кодируется последовательностью иммуноглобулина человека эмбрионального типа. Однако в настоящем описании термин антитело человека не включает антитела, в которых последовательности СОК, полученные из эмбриона или от другого вида млекопитающих, таких как мышь, было привито в каркасные последовательности. Не предполагается, что способы получения антител человека, применяемых в настоящем описании, включают антитела, полученные от людей.

Фраза рекомбинантное антитело человека включает антитела человека, которые готовят, экспрессируют, создают или выделяют посредством рекомбинантных способов, такие как антитела, экспрессируемые при помощи рекомбинантного вектора экспрессии, трансфицированного в клетку-хозяина, антитела, выделенные из библиотеки рекомбинантных, гибридных антител человека, антитела, выделенные у животного, которое трансгенно по генам иммуноглобулина человека, или антитела, которые готовят, экспрессируют, создают или выделяют любыми другими способами, включающими сплайсинг последовательностей генов иммуноглобулинов человека с получением других последовательностей ДНК. Такие рекомбинантные антитела человека содержат вариабельные и константные области, полученные из последовательностей иммуноглобулина человека эмбрионального типа Рс (фрагмент, кристаллизуемая область) - это обозначение части или фрагмента антитела, которая содержит парные константные области тяжелых цепей. Например, в антителе 1§О Рс состоит из доменов тяжелых цепей СН2 и СН3. Рс антитела 1дА или 1дМ также содержит домен СН4. Рс ассоциирован со связыванием рецептора к Рс, активацией антителозависимой клеточной цитотоксичности (АЗЦТ) и/или клеточной цитотоксичности (ЦТ). Для таких антител, как 1§А и 1дМ, которые представляют собой комплексы или множественные 1§Оподобные белки, образование комплекса требует константных доменов Рс.

- 5 021600

Таким образом, антитела согласно настоящему изобретению включают изолированные антитела, антитела человека, гуманизированные антитела, рекомбинантные антитела человека, моноклональные антитела, фрагменты расщепления, специфические их части и варианты, включая миметики антител или части антител, которые имитируют структуру и/или функцию антитела, или специфический его фрагмент или часть, но не ограничиваются ими; каждое из которых содержит по меньшей мере один СГОК Функциональные фрагменты включают антигенсвязывающие фрагменты, которые связывают антиген С8Р-1К. Например, фрагменты антител, способные связываться с С8Р-1К, или их часть, и которые попадают в область настоящего изобретения, включают двухвалентные фрагменты, такие как (РаЬ')₂ с интактными межцепьевыми дисульфидными связями, одновалентные фрагменты, такие как РаЬ (фрагмент, антигенсвязывающий), которые относятся к фрагментам антител, содержащим домены УЪ-СЬ и УН-СН1, и не сохраняют шарнирной области тяжелой цепи (например, посредством расщепления папаином), РаЬк, которые сохраняют шарнирную область тяжелой цепи, РасЬ (например, полученные посредством расщепления папаином), Р(аЬ')₂, РаЬ', которые не имеют дисульфидных связей, рРс' (например, полученные посредством расщепления пепсином или плазмином), Рй (например, полученные посредством расщепления пепсином, частичного восстановления или повторной агрегации) и Ρν или 8сРу (например, полученные посредством методов молекулярной биологии). Фрагменты антител также должны включать, например, антитела с удаленными доменами, линейные антитела, одноцепочечные антитела, δсΡν, антитела с одним доменом, поливалентные одноцепочечные антитела, мультиспецифичные антитела, образованные из фрагментов антител, включая диатела, триатела и подобные, которые специфично связываются с антигенами.

Шарнирная область разделяет части РаЬ и Рс в антителе, обеспечивая подвижность РаЬ относительно друг друга и относительно Рс, также включающего множество дисульфидных связей для ковалентного связывания с двумя тяжелыми цепями.

Были разработаны такие формы антител, которые сохраняют специфичность связывания, но обладают другими характеристиками, которые могут быть желательны, включая, например, двойную специфичность, поливалентность (более двух связывающих сайтов) и компактный размер (например, только связывающие домены). Антитела согласно настоящему изобретению специфичны по отношению к С8Р-1К Термин специфичность антитела относится к селективному распознаванию антителом какоголибо конкретного эпитопа на антигене. Например, антитела согласно настоящему изобретению могут быть моноспецифичным или биспецифичным. Биспецифичные антитела (ВкАЬ) - это антитела, которые обладают двумя разными антигенсвязывающими видами специфичности или сайтами. Когда антитело имеет более одной специфичности, распознаваемые эпитопы могут быть ассоциированы с одним антигеном или с более чем одним антигеном. Таким образом, согласно настоящему изобретению предложены биспецифичные антитела, которые связываются с двумя разными антигенами, причем по меньшей мере одна специфичность - это специфичность к С8Р-1К. Как было указано выше, такие антитела включают любые их фрагменты.

Специфичность настоящих антител или их фрагментов в отношении С8Р-1К можно определить на основании аффинности или авидности. Аффинность, выражаемая константой равновесия для диссоциации антигена с антителом (К_с), характеризует силу связывания между антигенной детерминантой и связывающим сайтом антитела.

Антитела или их фрагменты согласно настоящему изобретению связываются с эпитопом С8Р-1К, расположенным на сегментах внеклеточного домена (здесь и далее обозначается просто как домены или ЕСО). В настоящем описании термин эпитоп относится к дискретным трехмерным сайтам на антигене, которые распознаются антителами согласно настоящему изобретению. Эпитопы - это иммунологически активные области в сложном антигене, области, которые на самом деле связываются с рецептором В-клеток и которые на самом деле связываются образующимися в результате молекулами антител, вырабатываемых В-клетками. В целом антигены содержат по меньшей мере один эпитоп и обычно более одного эпитопа. Эпитопы белковых антигенов могут быть линейными или нелинейными. Линейные эпитопы - это эпитопы, содержащие смежные остатки аминокислот в последовательности аминокислот белка. Линейным эпитопам может требоваться, а может и не требоваться конформационное скручивание, чтобы они приобрели нативную трехмерную структуру и могли вызывать иммунный ответ, при котором образуются антитела со специфическим связыванием указанного антигена. Нелинейные эпитопы состоят из несмежных остатков аминокислот. Так, нелинейным эпитопам всегда требуется некоторая степень скручивания белка, чтобы сблизить необходимые остатки аминокислот для образования нативной трехмерной структуры и способности вызывать иммунный ответ, при котором образуются антитела со специфическим связыванием указанного антигена.

Антитела согласно настоящему изобретению также включают антитела, у которых характеристики связывания улучшены посредством прямой мутации, методом созревания аффинности, фагового дисплея или перетасовки цепей. Аффинность и специфичность можно модифицировать или повысить путем мутирования остатков СОК и/или РА и скрининга с отбором антигенсвязывающих сайтов, обладающих желаемыми характеристиками (например, см. Уаид с1 а1., 1. Μοί. ΒίοΙ., 254:392-403(1995)). Мутирование СОК осуществляют разными способами. Один из способов - это случайный выбор отдельных остатков,

- 6 021600 или сочетания остатков, при котором в популяции в остальном идентичных антигенсвязывающих сайтов подгруппы из двух-двадцати аминокислот находились в конкретных положениях. В качестве альтернативы можно осуществлять мутации по широкому диапазону остатков путем ПЦР с внесением ошибок (например, см. На\уки15 е! а1., 1. Μοί. ΒίοΙ., 226:889-96 (1992)). В другом примере, можно воспроизводить в штаммах-мутаторах Е. соН векторы фагового дисплея, содержащие гены вариабельных областей тяжелых и легких цепей (например, см. Ьо№ е! а1., 1. Μοί. Βίοί., 250:359-68 (1996)). Указанные способы мутагенеза иллюстрируют тот факт, что специалистам в данной области известно множество способов.

Удобным способом получения вариантов-заместителей является созревание аффинности с применением фагового дисплея. Вкратце, несколько сайтов области СЭР подвергают мутированию в целях генерирования всех возможных замен аминокислот в каждом сайте. Варианты антител, сгенерированные таким образом, отображают в одновалентной форме на частицах нитевидных фагов в виде гибридов с продуктом гена ΙΙΙΜ13, упакованного в каждую частицу. Несомые фагом варианты затем отбирают либо по биологической активности (например, аффинность связывания (К_с)), специфичность, ЕС₅₀ - концентрация, которая приводит к 50% максимального эффекта), как раскрывается в настоящем описании. Чтобы определить кандидаты на модификацию среди сайтов участков СЛВ. можно проводят мутагенез со сканированием по аланину для идентификации остатков в области СЛР, вносящих значительный вклад в связывание антигена. В качестве альтернативы или в дополнение можно проводить случайный мутагенез на одной или более последовательностях СЭР в одном или более положениях либо пока СЭР функционально связана с вариабельной областью, либо пока СЭР не зависит от последовательности другой вариабельной области, и затем измененную СЭР возвращают в вариабельную область при помощи технологии рекомбинантных ДНК. После генерации и экспрессии таких вариантов антител указанный набор вариантов подвергают скринингу, как описано в настоящем описании, и при помощи одного или более проб тестов отобрать антитела с лучшими свойствами для дальнейшей разработки.

Помимо антител, конкретно описанных в настоящем описании, можно с легкостью разработать и производить другие по существу, гомологичные модифицированные антитела при помощи разных технологий рекомбинантных ДНК, хорошо известных специалистам в данной области техники. Например, каркасные участки могут варьировать в диапазоне от нативных последовательностей на уровне первичной структуры до нескольких замен аминокислот, концевых и промежуточных вставок и делеций и т.п. Кроме того, в качестве основы для гуманизированных иммуноглобулинов согласно настоящему изобретению можно применять разные каркасные области человека по отдельности или в сочетании. В целом модификации генов можно легко получить при помощи разных хорошо известных способов, таких как сайт-направленный мутагенез.

Настоящее изобретение включает последовательности нуклеиновых кислот, которые кодируют тяжелую цепь анти-СЗР-1Р антитела, содержащую любую одну из областей УН или ее часть, или любой одну из СЭР УН, включая любые их варианты, которые раскрыты в настоящем описании. Также настоящее изобретение включает молекулы нуклеиновых кислот, которые кодируют легкую цепь анти-СЗР-1Р антитела, содержащую любую одну из областей УЪ или ее часть, или любой один из СЭР УЪ, включая любые их варианты, которые раскрыты в настоящем описании. Также настоящее изобретение включает молекулы нуклеиновых кислот антитела 1, ЗЕЦ ГО N0: 13 и 14 для тяжелой и легкой цепей соответственно. Антитела согласно настоящему изобретению включают антитела, содержащие те же участки СЛР, что и в антителе 1, и/или ту же вариабельную область легкой цепи или вариабельную область тяжелой цепи, что и в антителе 1.

Антитела согласно настоящему изобретению можно получить способами, известными в технике. Указанные способы включают иммунологический способ, описанный у ΚοΙιΚγ апб ΜΕκ^ω, №!иге, 256:495-497 (1975); ΡγΦοηιΙοιύ ТесЕпщиек ίη ВюсНетМгу апб Μο^^Πγ Вюкду, Уο1ите 13 (ΒηγΕοπ е! а1. еб8., Е18еу1ег Зшепсе РиЬИкЕещ, Ат8!егбат) ίη ΜοηοΠοη·ι1 Ληΐί6οά\· ТесЕмк^у, ТЬе РгоДис1юп апб С11агас1еп/а1юп οί Рοбеη! апб Нитап Η\·6πύοιη35 (СатрЬе11 еб., 1984); а также способом рекомбинантных ДНК, описанным у Нике е! а1., Зшепсе, 246:1275-1281 (1989). Также указанные антитела можно получить из библиотек, содержащих сочетания областей УН и УЪ в форме 5сРу или РаЬ. Области УН и УЪ могут кодироваться нуклеотидами, которые являются синтетическими, частично синтетическими или полученными из природных источников. Настоящее изобретение можно осуществить при помощи библиотек фагового дисплея, которые содержат фрагменты антител человека. Другие источники антител человека включают трансгенных мышей, модифицированных для экспрессии генов иммуноглобулинов человека.

Согласно одному варианту реализации для получения антител применяют экспрессию нуклеиновой кислоты, кодирующей антитело согласно настоящему изобретению, в организме трансгенного животного, которому ввели существенную часть генома, продуцирующего антитело человека, и которое дефектно по выработке эндогенных антител. Трансгенные животные включают мышей, коз и кроликов, но не ограничиваются ими. Еще один вариант реализации настоящего изобретения включает экспрессию кодирующего антитело гена, например, в молочных железах животного для секреции полипептида в ходе лактации.

Распространенный способ получения гуманизированных антител - это прививка последовательностей СЭР из МАТ (полученных путем иммунизации грызуна-хозяина) в остов 1д человека и трансфек- 7 021600 ция указанных химерных генов в клетки яичника китайского хомячка (СНО), которые, в свою очередь, будут вырабатывать функциональное антитело, секретируемое клетками СНО.

Ясно, что остатки аминокислот, являющиеся основными детерминантами связывания однодоменных антитела, могут входить в состав СЭК определенных по КаЬа! или СЪо!Ыа, но могут также включать и другие остатки, например остатки, которые могут быть в другом случае были бы заглублены в границе УН-УЪ гетеродимера УН-УЪ.

Белок, применяемый для идентификации С8Р-1К-связывающих антител согласно настоящему изобретению, предпочтительно представляет собой С8Р-1К и более предпочтительно - внеклеточный домен С8Р-1К. Внеклеточный домен С8Р-1К может не содержать другой молекулы или может быть конъюгирован с другой молекулой. Антитела согласно настоящему изобретению могут быть соединены с дополнительными остатками аминокислот. Такие остатки аминокислот могут быть пептидной меткой, возможно, облегчающей выделение части РС 1д для оптимизации димеризации. Также рассматриваются другие остатки аминокислот для хоминга антител в специфических органах или тканях.

Фрагменты антител можно получить путем расщепления целого антитела или путем экспрессии ДНК, которая кодирует указанный фрагмент. Фрагменты антител можно приготовить при помощи способов, описанных у Ъатоу1 е! а1., 1. 1ттипо1. МеОюбк. 56:235-243 (1983) и у РагЬат, 1. 1ттипо1. 131:2895-2902 (1983). Такие фрагменты могут содержать один или более фрагментов Р(аЬ')₂. Также такие фрагменты могут содержать одноцепочечные фрагменты вариабельных областей антител, т.е. 8сРу, диатела или другие фрагменты антител. Способы получения таких функциональных эквивалентов раскрыты в публикации заявки на Европейский патент № ЕР 239400 (ХУиНег); публикации в соответствии с РСТ \УО 89/09622 (Напп, е! а1.); публикации заявки на Европейский патент № ЕР 338745 (О^епк, е! а1.) и публикации заявки на Европейский патент № 332424 (Ве1б1ег, е! а1.). В данном описании термин антитела согласно настоящему изобретению включает любые их фрагменты, независимо от того, есть в отношении этого особое указание.

Предпочтительными клетками-хозяевами для трансформации векторов и экспрессии антител согласно настоящему изобретению являются клетки млекопитающих, например клетки N80 (несекретирующие (0) клетки миеломы мыши), 293, 8Р20 и СНО, а также другие линии клеток лимфоидного происхождения, такие как клетки лимфомы, миеломы или гибридомы. В качестве альтернативы можно применять клетки других эукариот, таких как дрожжи.

Антитела согласно настоящему изобретению можно выделить или очистить любыми способами, известными в данной области техники, включая осаждение сульфатом аммония или сульфатом натрия, после которого проводят диализ с физиологическим раствором, ионообменную хроматографию, аффинную или иммуноаффинную хроматографию, а также гель-фильтрацию или зональный электрофорез. Предпочтительным способом очистки антител согласно настоящему изобретению является аффинная хроматография с белком А.

ДНК, кодирующую антитела человека, можно получить из рекомбинантной ДНК, кодирующей константные области человека и вариабельные области, отличные от СОК, полученных в существенной степени или исключительно из соответствующих областей антител человека, и ДНК, кодирующей СОК, полученной из антител человека.

Подходящие источники ДНК, кодирующей фрагменты антител, включают любые клетки, такие как гибридомы и клетки селезенки, которые экспрессируют полноразмерное антитело. Указанные фрагменты можно применять сами по себе в качестве эквивалентов антител или их можно рекомбинировать в эквиваленты, как описано выше. Рекомбинацию ДНК и другие методики, описываемые в настоящем описании, можно реализовывать при помощи известных способов. Другим источником ДНК является библиотека отображения фагов, которая известна в технике.

Кроме того, согласно настоящему изобретению предложены векторы экспрессии, содержащие последовательности описанных выше полинуклеотидов, функционально связанные с регуляторной последовательностью, такой как последовательность экспрессии, последовательность промотора и/или энхансера.

Были разработаны различные векторы экспрессии для эффективного синтеза полипептидов антител в прокариотических системах, таких как бактерии, и эукариотических системах, включая системы на основе культуры клеток дрожжей и млекопитающих, но не ограничиваясь ими. Векторы согласно настоящему изобретению могут содержать сегменты последовательностей хромосомной, внехромосомной и синтетической ДНК.

Можно применять любые подходящие векторы экспрессии. Например, клонирующие векторы прокариот включают плазмиды из Е.соН, такие как со1Е1, рСК1, рВК322, рМВ9, рИС, рК8М и КР4. Также векторы прокариот включают производные фагов, такие как М13 и другие нитевидные одноцепочечные ДНК-фаги. Примером вектора, применяемого у дрожжей, может служить плазмида 2 μ. Подходящие векторы для экспрессии в клетках млекопитающих включают хорошо известные производные 8У-40, СМУ (цитомегаловируса), аденовируса, полученные из ретровируса последовательности ДНК, и бифункциональные векторы, полученные путем комбинирования функциональных векторов млекопитающих, таких как векторы, описанные выше, и функциональных плазмид и ДНК фагов. В технике известны и другие

- 8 021600 векторы экспрессии у эукариот (например, Р.1. 8ои1Ьетп апй Р. Ветд, 1. Μοί. Арр1. Сепе! 1:327-41 (1982); 8иЬгатап1 е! а1., Μοί. Се11. Βίοί. 1:854-64 (1981); КаиТтапп апй 8Ьагр, 1. Μοί. Βίοί. 159:601-21 (1982); 8еаЫ11 е! а1., Ргос. ЫаП Асай. δει. υδΑ 80:4654-59 (1983); иг1аиЬ апй Сйавш, Ргос. ЫаП Асай. δα. υδΑ, 77:4216-20) (1980).

Векторы экспрессии, которые можно применять в рамках настоящего изобретения, содержат по меньшей мере одну последовательность для регуляции экспрессии, которая функционально связана с последовательностью или фрагментом ДНК, которые требуется экспрессировать. Указанную регуляторную последовательность вводят в вектор в целях регулирования экспрессии клонированной последовательности ДНК. Примеры применимых последовательностей, регулирующих экспрессию, включают 1ас-систему, ίτρ-систему, !ас-систему, 1тс-систему, области главного оператора и промотора фага лямбда, регуляторную область белка козы й, промоторы генов гликолиза у дрожжей, например, промотор 3-фосфоиназы, промоторы кислой фосфатазы дрожжей, например, Р1ю5. промоторы факторов спаривания альфа у дрожжей и промоторы, полученные из полиомы, аденовируса, ретровируса и вируса обезьян, например ранние и поздние промоторы или δν40, и другие последовательности с установленными свойствами регуляции экспрессии генов прокариотических или эукариотических клеток и их вирусов, или их сочетания.

В тех случаях, когда желательно экспрессировать генный конструкт в дрожжах, подходящим геном селекции для применения в дрожжах является ген ίτρί, присутствующий в плазмиде дрожжей УКр7. Ген 1гр1 обеспечивает наличие селектируемого маркера для мутантного штамма дрожжей, утратившего способность к росту на триптофане, например № 44076 в АТСС (Американской коллекции типовых культур). Наличие повреждения 1тр1 в геноме клеток-хозяев дрожжей в дальнейшем обусловливает эффективное окружение для выявления трансформации на основании роста в отсутствии триптофана. Аналогично, штаммы дрожжей, дефицитные по Ьеи2 (АТСС 20 622 или 38 626), дополняют известными плазмидами, содержащими ген Ьеи2.

Также согласно настоящему изобретению предложены рекомбинантные клетки-хозяева, содержащие рекомбинантные векторы, которые описывались выше. Антитела согласно настоящему изобретению можно экспрессировать в линиях клеток, отличных от гибридом. Для трансформации подходящих клеток-хозяев млекопитающих можно применять нуклеиновые кислоты, которые содержат последовательность, кодирующую полипептид согласно настоящему изобретению. Наиболее предпочтительные линии клеток выбирают на основании высокого уровня экспрессии, конститутивной экспрессии рассматриваемого белка и минимального загрязнения белками клетки-хозяина. Линии клеток млекопитающих, подходящие в качестве хозяев для экспрессии, хорошо известны в технике и включают многие бессмертные линии клеток, такие как клетки С0δ-7, клетки яичника китайского хомячка (СНО), клетки почек новорожденного хомячка (ВНК) и многие другие линии лимфоидного происхождения, такие как клетки лимфомы, миеломы или гибридомы, но не ограничиваясь ими. Дополнительные подходящие клетки эукариот включают дрожжи и другие грибы. Применимые клетки-хозяева прокариот включают, например, Ε.ςοίΐ, такие как Ε.ςοίΐ δΟ-936, Ε.ςοίΐ НВ101, Ε.ςοίΐ №3110, Ε.ςοίΐ Χ1776, Ε.ςοίΐ Χ2282, Ε.ςοίΐ ΌΗΙ и Ε.ςοίΐ МКС1, Рδеийοтοηаδ, ВасШи8, такие как ВасШи8 8иМШ8 и δί^ерίοтусе8.

Указанные рекомбинантные клетки-хозяева можно применять для получения антитела или его фрагмента посредством культивирования клеток в условиях, допускающих экспрессию указанного антитела или его фрагмента, и очистки указанного антитела или его фрагмента от клетки-хозяина или среды, окружающей клетку-хозяина. Направленную доставку экспрессируемого антитела или его фрагмента для секреции из рекомбинантных клеток-хозяев можно стимулировать посредством введения последовательности, кодирующей сигнальный или секреторный лидерный пептид, на 5'-конце кодирующего антитело гена. Такие элементы, соответствующие секреторному лидерному пептиду, можно получить из последовательностей прокариот либо эукариот. Соответственно, применяют подходящие секреторные лидерные пептиды, которые представляют собой аминокислоты, присоединенные к Ν-концу полипептида для направленного выхода указанного полипептида из цитозоля клетки-хозяина и его секреции в среду.

Трансформированные клетки-хозяева культивируют с использованием способов, известных в технике, в жидкой среде, содержащей усваиваемые источники углерода (углеводы, такие как глюкоза или лактоза), азота (аминокислоты, пептиды, белки или продукты их расщепления, такие как пептоны, соли аммония или подобные) и неорганических солей (сульфаты, фосфаты и/или карбонаты натрия, калия, магния и кальция). Также указанная среда содержит, например, способствующие росту вещества, такие как микроэлементы, например железо, цинк, марганец и подобные.

Также согласно настоящему изобретению предложен способ лечения опухолевого роста у млекопитающих, основанный на введении указанному млекопитающему эффективного количества антитела. Патологические состояния, которые можно лечить согласно настоящему изобретению, сопряжены с наличием клеток, экспрессирующих СδΡ-1Κ. Хотя настоящие способы не предполагают связи с каким-либо конкретным механизмом, они обеспечивают средство против раковых клеток, например включая состояния, при которых рост новообразований, метастазирование в кости, отторжение трансплантата органов или иммунные нарушения, например аутоиммунные заболевания, стимулируются через СδΡ-1Κ.

- 9 021600

Термины лечение или лечить в контексте настоящего изобретения относятся к терапевтическому лечению, включая угнетение, замедление, ослабление или обращение прогрессирования основного заболевания или нежелательного физиологического изменения, ассоциированного с заболеванием или нарушением, облегчение клинических симптомов патологического состояния или предупреждение симптомов указанного состояния. Полезные или желаемые клинические результаты включают облегчение клинических симптомов патологического состояния или предупреждение появления клинических симптомов указанного состояния, снижение выраженности заболевания или нарушения, стабилизацию заболевания или нарушения (т.е. когда указанное заболевание или нарушение не усугубляется), отсрочивание или замедление прогрессирования заболевания или нарушения, облегчение или смягчение заболевания или нарушения и ремиссию (частичную либо полную) заболевания или нарушения, выявляемые или невыявляемые. Также термин лечение может обозначать продление выживания по сравнению с ожидаемым выживанием при отсутствии лечения. Субъекты, нуждающиеся в лечении, включают субъектов, которые уже страдают указанным заболеванием. Согласно одному варианту реализации настоящее изобретение можно применять в качестве лекарственного препарата.

Способы согласно настоящему изобретению основаны на введении терапевтически эффективного количества антитела согласно настоящему изобретению млекопитающему или пациенту, нуждающемуся в нем. Кроме того, фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению могут включать терапевтически эффективное количество анти-С8Р-1К антитела согласно настоящему изобретению. Термин терапевтически эффективное количество относится к количеству, позволяющему достичь желаемого терапевтического результата при необходимых дозировках и периодах времени. Терапевтически эффективное количество антитела может варьировать в зависимости от таких факторов, как стадия заболевания, возраст, пол и масса субъекта и способность указанного антитела или его части вызывать желаемую реакцию у указанного субъекта. К другим факторам можно отнести путь введения, органмишень, физиологическое состояние пациента, является ли пациент человеком или животным, другие вводимые препараты, и является ли данное воздействие профилактическим или лечебным. Хотя антитела человека согласно настоящему изобретению особенно полезны при введении их человеку, их также можно вводить и другим млекопитающим. В настоящем описании термин млекопитающее должен включать людей, лабораторных животных, домашних животных и сельскохозяйственных животных, но не ограничивается ими. Терапевтически эффективное количество также подразумевает такое количество, при котором любые токсическое или вредное действие указанного антитела или части антитела менее значимо, чем терапевтически полезные эффекты.

Для обеспечения оптимального желаемого эффекта (например, терапевтического или профилактического эффекта) можно корректировать режим введения средства. Для оптимизации безопасности и эффективности можно титровать дозировки лекарственного средства при помощи стандартных способов, известных специалистам в данной области техники. Режимы введения средства обычно варьируют в диапазоне от однократной дозы в форме болюса или непрерывной инфузии до многократного введения в течение дня (например, каждые 4-6 ч) или зависят от назначения лечащего врача и состояния пациента. Примерный, не накладывающий ограничений, диапазон терапевтически эффективных количеств антитела согласно настоящему изобретению составляет 0,1-50 мг/кг, более предпочтительно 3-35 мг/кг и более предпочтительно 5-20 мг/кг. Дозировки и частоту введения определяет лечащий врач пациента, и они могут включать дозы от менее 1 до более 100 мг/кг раз в день, три раза в неделю, раз в неделю, раз в две недели или реже. Однако следует иметь в виду, что настоящее изобретение не ограничивается какойлибо конкретной дозой.

Анти-С8Р-1К антитела можно вводить в сочетании с одним или более другими противораковыми средствами, включая антиангиогенный агент, химиотерапевтический агент или антинеопластический агент, но не ограничиваясь ими. Можно применять любое подходящее средство лечения рака, такое как химиотерапевтический агент, облучение, антитело или их сочетание.

Противораковые средства включают антинеопластические агенты, антитела, адъюванты и пролекарства. Антинеопластические агенты, которые в настоящее время известны в технике или в настоящее время проходят оценку, можно подразделить на несколько классов, включая, например, ингибиторы митоза, алкилирующие агенты, антиметаболиты, интеркалирующие антибиотики, ингибиторы факторов роста, ингибиторы клеточного цикла, ферменты, ингибиторы топоизомеразы, препараты против приживления, модификаторы биологического отклика, антигормоны и препараты против ангиогенеза. Примеры алкилирующих агентов включают цисплатин, циклофсофамид, мелфалан и дакарбазин, но не ограничиваются ими. Примеры антиметаболитов включают доксорубицин, даунорубицин, паклитаксел, гемцитабин, АЫМТА® и ингибиторы топоизомеразы - иринотекан (СРТ-11), аминокамптотецин, камптотецин, ΌΧ-895Π, топотекан (топоизомераза I), этопозид (УР-16) и тенипозид (УМ-26) (топоизомераза II), но не ограничиваются ими. Когда анитинеопластичесим средством лечения является облучение, источник излучения может быть либо внешним (наружная дистанционная лучевая терапия - ЕВК.Т), либо внутренним (близкофокусная лучевая терапия - ВТ) по отношению к пациенту, которого лечат. Доза вводимого антибластомного препарата зависит от разных факторов, включая, например, тип препарата, тип и тяжесть опухоли, которую лечат, и путь введения указанного препарата. Однако следует подчеркнуть, что

- 10 021600 настоящее изобретение не ограничивается какой-либо конкретной дозой. Согласно одному аспекту предпочтительным антинеопластическим агентом согласно настоящему изобретению является доцетаксел. Согласно другому аспекту настоящего изобретения предпочтительными антинеопластическими агентами являются паклитаксел, герцептин® и доксорубицин.

Анти-С8Р-1К антитела согласно настоящему изобретению можно вводить с антителами, которые нейтрализуют другие рецепторы, участвующие в росте опухоли или ангиогенезе. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения анти-С8Р-1К антитело применяют в сочетании с антагонистом рецептора, который специфически связывается с рецептором Нег2. Другим примером такого рецептора является УЕСРР (рецептор фактора роста эндотелия сосудов). Анти-С8Р-1К антитело можно применять в сочетании с антагонистом УЕОРК. Анти-С8Р-1К антитело также можно вводить в сочетании с одним или более подходящих адъювантов, например, таких как цитокины (например, 1Ь-10, 1Ь-4 и 1Ь-13) или другие иммунные стимуляторы, такие как хемокины, опухолеспецифические антигены и пептиды, но не ограничиваясь ими.

Согласно настоящему изобретению можно применять любой подходящий способ или путь введения для введения анти-С8Р-1К антител, и по выбору, для совместного введения антинеопластических препаратов и/или антагонистов других рецепторов. При комбинированной терапии согласно настоящему изобретению анти-С8Р-1К антитело можно вводить до, во время, по существу, одновременно или после начала терапии другим средством, включая доцетаксел, паклитаксел, герцептин® или доксорубицин, а также их сочетание, но не ограничиваясь ими. Режимы введения антинеопластических препаратов согласно настоящему изобретению включают любой режим, который считают оптимальным для лечения новообразования у пациента. Разные злокачественные опухоли могут требовать применения специфических направленных против опухоли антител и специфических антибластомных агентов, что определяется индивидуально для каждого пациента. Пути введения включают, например, пероральное, внутривенное, внутрибрюшинное, подкожное или внутримышечное введение. Доза вводимого антагониста зависит от разных факторов, включая, например, тип антагониста, тип и тяжесть опухоли, которую лечат, и путь введения указанных антагонистов. Однако следует подчеркнуть, что настоящее изобретение не ограничивается каким-либо конкретным способом или путем введения.

Для применения у млекопитающего в целях профилактики или лечения анти-С8Р-1К антитела согласно настоящему изобретению предпочтительно преобразовывать в фармацевтическую композицию. Такие фармацевтические композиции и способы их получения тождественны хорошо известным в данной области техники. Например, см. Решешфоп: ТЬе 8с1еисе апб Ргаебее о£ РЬагтасу (Оеииаго А., е1 а1., ебк., 19* еб., Маск РиЬЬзйид Со., 1995).

Согласно другому аспекту настоящего изобретения данные антитела можно вводить совместно, в химической или биосинтетической связи с противораковыми агентами, антинеопластическими агентами, препаратами против ангиогенеза, или препаратами, дающими различимый сигнал. Противоопухолевые агенты, связанные с антителом, включают любые агенты, которые разрушают или повреждают новообразованные сосуды или опухоль, или макрофаги, с которыми связалось указанное антитело, или окружение клетки, с которым связалось указанное антитело. Настоящее изобретение может включать анти-С8Р-1К антитело в виде конъюгата, включая иммуноконъюгат, который специфически связывается с рецептором и доставляет токсин посредством интернализации комплекса лиганд-токсин, но не ограничиваясь им. Указанный конъюгат антитело-препарат может непосредственно конъюгировать посредством линкера, пептидного или непептидного. Например, противоопухолевый препарат или препарат против макрофагов являются токсичными препаратами, такими как антинеопластические агенты или радиоизотоп. Подходящие антинеопластические агенты, включая химиотерапевтические агенты, известны специалистам в данной области техники и обсуждаются далее. Также в настоящем изобретении рассматриваются анти-С8Р-1К антитела, связанные с целевыми компонентами или компонентами-репортерами, включая только в качестве примера антинеопластические агенты, другие антитела или репортеры, такие как радиоизотопы, в диагностической системе, в которой препарат, дающий различимый сигнал, конъюгирован с указанным антителом.

Согласно настоящему изобретению способ подавления ангиогенеза включает введение композиции, содержащей антитело или фрагмент антитела согласно настоящему изобретению, млекопитающему в течение времени и в количестве, которые эффективны для подавления ангиогенеза. Аналогично, указанные антитела и фрагменты антител можно применять при реализации способов подавления метастазирования опухоли у млекопитающего путем введения композиции, содержащей антитело или фрагмент антитела согласно настоящему изобретению, в течение времени и в количестве, которые эффективны в отношении подавления метастазирования опухоли.

Согласно настоящему изобретению способ подавления инфильтрации макрофагов в строму опухоли включает введение композиции, содержащей антитело или фрагмент антитела согласно настоящему изобретению, млекопитающему в течение времени и в количестве, которые эффективны в отношении подавления эффектов макрофагов на рост опухоли. Аналогично, указанные антитела и фрагменты антител можно применять при реализации способов сокращения эрозий костной ткани и метастазирования

- 11 021600 опухоли у млекопитающего путем введения композиции, содержащей антитело или фрагмент антитела согласно настоящему изобретению, в течение времени и в количестве, которые эффективны в отношении подавления эрозии костной ткани.

Согласно настоящему изобретению предложено применение лиганда С8Р-1Е (С8Р-1 или 10-34) в качестве биологического маркера в крови, сыворотке, плазме, клетках опухоли или циркулирующих клетках опухоли пациентов, страдающих раком, которые реагируют на лечение, когда в указанной опухоли ассоциированные с ней макрофаги экспрессирует на своей поверхности С8Р-1Е. Также согласно настоящему изобретению предложен способ прогнозирования успешности лечения пациента антителом или фрагментом антитела согласно настоящему изобретению на основании измерения уровня С8Р-1Е в пробе, где указанную пробу выбирают из группы, включающей сыворотку, плазму, клетки опухоли или циркулирующие клетки опухоли. Еще одним аспектом настоящего изобретения является способ лечения рака у пациента, включающий следующие этапы:

(1) измерение уровня С8Р-1 в пробах, отобранных у пациента, где указанную пробу выбирают из группы, включающей сыворотку, плазму, клетки опухоли или циркулирующие клетки опухоли; и (2) введение указанному пациенту антитела или его фрагмента согласно настоящему изобретению, если уровень С8Р-1 выше, чем уровень С8Р-1, определяемый у контрольной популяции.

Также в настоящем изобретении предусмотрен способ прогнозирования успешности лечения пациента антителом или фрагментом антитела согласно настоящему изобретению на основании измерения уровня 1Ь-34 в пробе, где указанную пробу выбирают из группы, включающей сыворотку, плазму, клетки опухоли или циркулирующие клетки опухоли.

Еще одним аспектом настоящего изобретения является способ лечения рака у пациента, включающий следующие этапы:

(1) измерение уровня 1Ь-34 в пробах, отобранных у пациента, где указанную пробу выбирают из группы, включающей сыворотку, плазму, клетки опухоли или циркулирующие клетки опухоли; и (2) введение указанному пациенту антитела или его фрагмента согласно настоящему изобретению, если уровень 1Ь-34 выше, чем уровень 1Ь-34, определяемый у контрольной популяции.

Также согласно настоящему изобретению предложен способ определения, является ли субъект, страдающий раком, кандидатом на противораковую терапию с применением анти-С8Р-1Е антител, где указанное антитело - это антитело согласно настоящему изобретению, способ, включающий:

(1) определение уровня С8Р-1 ех νΐνο или ίη νίίτο в пробе пациента, где указанную пробу выбирают из группы, состоящей из крови, сыворотки, плазмы, опухолевых клеток и циркулирующих опухолевых клеток; и (2) повышение уровня С8Р-1 по сравнению с уровнем С8Р-1 у лиц, не страдающих раком, которое указывает на то, что указанный субъект является кандидатом на противораковую терапию с применением анти-С8Р-1Е антител.

Также согласно настоящему изобретению предложен способ определения, является ли субъект, страдающий раком, кандидатом на противораковую терапию с применением анти-С8Р-1Е антител, где указанное антитело - это антитело согласно настоящему изобретению, включающий:

(1) определение уровня 1Ь-34 ех νΐνο или ίη νίίτο в пробе пациента, где указанную пробу выбирают из группы, состоящей из крови, сыворотки, плазмы, опухолевых клеток и циркулирующих опухолевых клеток; и (2) повышение уровня 1Ь-34 по сравнению с уровнем 1Ь-34 у лиц, не страдающих раком, которое указывает на то, что указанный субъект является кандидатом на противораковую терапию с применением анти-С8Р-1Е антител.

(1) определение уровня С8Р-1 или 1Ь-34, или их обоих ех νΐνο или ίη νίίτο в пробе пациента, где указанную пробу выбирают из группы, состоящей из крови, сыворотки, плазмы, опухолевых клеток и циркулирующих опухолевых клеток; и (2) повышение уровня С8Р-1 или 1Ь-34, или их обоих по сравнению с уровнем С8Р-1 или 1Ь-34, или их обоих у лиц, не страдающих раком, которое указывает на то, что указанный субъект является кандидатом на противораковую терапию с применением анти-С8Р-1Е антител.

Уровень С8Р-1 или 1Ь-34 могут быть измерен разными способами, включая коммерческие наборы (Ε&Ό §у8ίет8 для С8Р-1 и υδί',’Ν Ы1с Зшепсез, 1пс. для 10-34). Согласно одной такой методике стандарты или пробы С8Р-1 или 1Ь-34 добавляют в планшет с предварительно нанесенными антителами к С8Р-1 или 1Ь-34 человека, что делает возможным связывание С8Р-1 или 1Ь-34 с указанными антителами. После отмывки не связавшихся С8Р-1 или 1Ь-34 и других белков добавляют вторичное антитело, которое распознает анти-С8Р-1 или анти-1Ь-34 антитело соответственно. Указанное вторичное антитело соединено с пероксидазой хрена, которая создает синеватое окрашивание при добавлении субстрата в указанные лунки. Интенсивность окраски зависит от количества С8Р-1 или 1Ь-34, находящихся в планшете.

- 12 021600

Поскольку С8Р-1 или 1Ь-34 существуют в организме здорового человека, базальный уровень С8Р-1 или ГО-34 необходимо определять у контрольной популяции. Такая контрольная популяция может включать группу субъектов, у которых не диагностировано онкологическое заболевание или признаки инфекции. Соответственно, в контрольной популяции определяют диапазон уровней С8Р-1 или 1Ь-34, который является нормальным или базальным для здоровых субъектов. Например, уровень С8Р-1 в сыворотке пациентов с раком молочной железы или раком ободочной и прямой кишки выше на 68 или 77% соответственно, чем в сыворотке контрольных групп ГОщуЫй с1 а1., СПп. СПш. Лс1а. 317:112-116 (2006); Мгос/1ю с1 а1., СПп. СПш. Лс1а, 380:208-212 (2007)). Согласно одному аспекту настоящего изобретения уровень лиганда С8Р-1Р в пробах пациентов, страдающих раком, должен быть по меньшей мере на 50% выше, чем в пробах контрольной популяции. Диапазон уровней С8Р-1 и/или 1Ь-34 в контрольной популяции следует сравнивать с уровнем С8Р-1 и/или 1Ь-34, выявляемым в пробе или пробах пациентов, чтобы определить, выше ли уровень С8Р-1 и/или 1Ь-34 у пациента, чем базальный диапазон для контрольной популяции.

Согласно одному аспекту антитела согласно настоящему изобретению применяют в лечении рака, в случае когда раковые клетки секретируют лиганд. Согласно другому аспекту антитела согласно настоящему изобретению следует применять в лечении рака, в случае когда раковые клетки секретируют С8Р-1. Согласно еще одному аспекту антитела согласно настоящему изобретению следует применять для лечения рака, где раковые клетки секретируют 1Ь-34.

Также настоящее изобретение включает наборы для подавления роста опухоли и/или ангиогенеза, включающие терапевтически эффективное количество анти-С8Р-1Р антитела человека. Указанные наборы также могут включать указанное антитело или его фрагмент и дополнительный агент, включая дополнительные противораковые препараты, антинеопластические агенты или средства, включая доцетаксел, паклитаксел, герцептин® или доксорубицин, но не ограничиваясь ими. В качестве альтернативы или дополнительно указанные наборы могут содержать любые подходящие антагонисты, например, рецепторов другого фактора роста, участвующих в онкогенезе или ангиогенезе, которые обсуждаются далее. Наборы согласно настоящему изобретению также могут включать адъювант.

Соответственно, антитела к настоящему рецептору можно применять ίη νίνο и ίη νίίτο для осуществления способов исследования, диагностики профилактики или лечения, которые хорошо известны в технике. Специалист в данной области техники может вносить видоизменения в принципы изобретения, раскрываемого здесь, и предполагается, что такие модификации должны включаться в область настоящего изобретения.

Следует понимать и предполагается, что специалист в данной области техники может вносить изменения в принципы изобретения, раскрываемого здесь, и предполагается, что такие модификации также включены в область настоящего изобретения.

Примеры

Следующие примеры дополнительно иллюстрируют настоящее изобретение, но их не следует воспринимать в качестве ограничения объема настоящего изобретения и не предполагается, что они какимлибо образом ограничивают широкий объем настоящего изобретения. Подробное описание обычных методов, таких как методы конструирования векторов и плазмид, встраивания генов, кодирующих полипептиды, в такие векторы и плазмиды, введения плазмид в клетки-хозяева, а также способы экспрессии генов и продуктов генов и ее определения, можно найти в многочисленных публикациях, включая 8атЬгоок, 1. с1 а1., Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЪогаФгу Мапиа1, 2'¹ ей., Со1й 8рппд НагЬог ЬаЪогаФгу Рге§8 (1989) и Сойдап, 1. е1 а1. Сиггеп! РгоЮсоР ίη 1штипо1оду, \УПеу & 8опз, 1псогрога1ей (2007).

Экспрессия и очистка анти-С8Р-1Р антител человека.

Для каждого антитела встраивают соответствующую последовательность нуклеотидов для тяжелой цепи, например 8Еф ГО N0: 13 для антитела 1, в соответствующую экспрессионную плазмиду, например в рС8НС, и встраивают соответствующую последовательность нуклеотидов для легкой цепи, например 8Еф ГО N0: 14 для антитела 1, в соответствующую экспрессионную плазмиду, такую как рС8ЬС, с использованием соответствующего метода, такого как ПЦР-клонирование. Для получения стабильной линии клеток осуществляют совместную трансфекцию линии клеток-хозяев, таких как клетки N80 или СНО, линеаризованными плазмидами для тяжелой и легкой цепей посредством электропорации и культивируют их в соответствующей среде, такой как модифицированная по способу Дульбекко среда Игла без глутамина с добавлением диализированной эмбриональной телячьей сыворотки и глутаминсинтетазы. Проводят скрининг клонов на экспрессию антител при помощи твердофазного иммуноферментного анализа (ЕЬ18А) и отбирают максимальных продуцентов для дальнейшего культивирования в роллерных колбах. Антитела очищают соответствующим методом, таким как аффинная хроматография с белком А.

В табл. 1 приведены последовательности аминокислот и 8Еф ГО N0: для разных СЭР антитела 1 согласно настоящему изобретению. Все последовательности СИР определены по правилам КаЬаО В табл. 2 представлены 8Еф ГО N0 для разных последовательностей, относящихся к настоящему изобретению. Последовательности нуклеиновых кислот, которые кодируют последовательности аминокислот, раскрываемые далее, также включены в объем настоящего изобретения.

- 13 021600

Таблица 1

Последовательность аминокислот антитела 1 СЭР вариабельных областей тяжелых и легких цепей

	Тяжелая цепь	8Е<Э Ю №>	Легкая цепь	8Εζ)ΙΟ №
С1ЭК1	3ΥΟΜΗ	1	ΚΑδΟΟΙδΝΑίΑ	4
СОК2	νΐΐνΥϋΟ8ΝΚΥΥΑϋ8νΚΟ	2	ΟΑδδΙΈδ	5
сокз	ουγτνογαΜον	3	ΟΟΡΝδΥΡλΥΤ	6

Таблица 2

Номера в перечне последовательностей для последовательностей аминокислот антитела 1

	Тяжелая цепь	Легкая цепь
	Вариабе льная область	Абсолюта о без сигнала	Абсолюты о с сигналом	Вариабел ьная область	Абсолюта о без сигнала	Абсолют но с сигналом
Антитело 1	7	9	11	8	10	12

Анализ связывания методом твердофазного иммуноферментного анализа (ЕЬ1§А).

Для анализа связывания С8Р-1К планшет на 96 лунок покрывают растворимым рекомбинантным гибридным белком С8Р-1К человека-Ре (Κ&Ό 8у81еш5) (1 мкг/млх100 мкл), закрывают планшет пленкой и инкубируют его в течение ночи при 4°С. Далее промывают указанные лунки 3 раза с применением ФСБ (фосфатно-солевого буфера), содержащего 0,2% Твин-20® (ФСБ/Т), затем блокируют лунки в течение 1 ч при комнатной температуре (20-25°С) (КТ) ФСБ, содержащим 3% бычьего сывороточного альбумина (БСА). Удаляют аспирацией смесь ФСБ-БСА и промывают планшеты трижды ФСБ/Т. Делают серийные разведения антитела 1 или контрольного 1дО (начиная с 3 мкг/мл и разводят в 3 раза) и добавляют по 100 мкл в лунку, оставив их на 1 ч при КТ. Трижды промывают лунки ФСБ/Т. После промывки инкубируют планшет с 100 мкл конъюгата антитела к Р(аЪ')₂-фрагменту человека с пероксидазой хрена (1аск8ои 1ттипоКе8еагеЬ) в ФСБ (разведение 1:5000) при КТ в течение 1 ч. Пять раз промывают планшеты ФСБ/Т и затем инкубируют со 100 мкл препарата субстрата пероксидазы ТМВ и раствора пероксидазы В (КРЬ) в соотношении 1:1 в течение 15 мин при КТ. Останавливают колориметрическую реакцию путем добавления 100 мкл 0,1 М Н₂§0₄. Считывают данные при помощи ридера для микропланшетов на длине волны 450 нм. Анализируют данные о поглощении при помощи программы ОтарЬРаб и рассчитывают ΕΌ₅₀. ΕΌ₅₀ или половина максимально эффективной дозы - это доза, которая обеспечивает 50% максимального связывания.

ΕΌ₅₀ для связывания антитела 1 с С8Р-1К человека составляет 8,7х10^-11 М, т.е. 0,09 нМ. Антитело 1 проявляет сильное связывание с С8Р-1К.

Анализ блокирования методом твердофазного иммуноферментного анализа (ЕЬ1§А).

ЕЬ1§А для демонстрации того, что антитела блокируют взаимодействие С8Р-1/С8Р-1К. Титрационный микропланшет на 96 лунок покрывают С8Р-1К (0,5 мкг/млх100 мкл) (Κ&Ό

8у81ет8) и инкубируют его в течение ночи при 4°С. Далее трижды промывают указанные лунки ФСБ/Т, затем блокируют 100 мкл 3% БСА/ФСБ в течение 1 ч при КТ. Повторно промывают 3 раза ФСБ/Т. Разводят растворимый гибридный белок тк-С8Р-1К человека-Рс (Κ&Ό БуЧепъ) до конечной концентрации 0,250 мкг/мл в ФСБ. Одновременно разводят антитело 1 в ФСБ до конечной концентрации 200 нМ. Делают серийные разведения антитела в соотношении 1:3 от исходной концентрации 200 нМ до 3 х 10^-12 М. Объединяют 100 мкл тк-С8Р-1К-Рс со 100 мкл каждого из разведений антитела 1 и инкубируют в течение 30 мин при КТ. Далее инкубируют 100 мкл смеси антитела 1: С8Р-1К-Рс в течение 1 ч при КТ в лунках, покрытых С8Р-1. После инкубации в течение 1 ч при КТ промывают лунки 3 раза ФСБ/Т и добавляют разведение 1:5000 анти-ЫдО-Рс-антитела, конъюгированного с НРР, в планшеты и инкубируют их в течение 1 ч при КТ. Пять раз промывают планшеты ФСБ/Т и затем инкубируют со 100 мкл препарата субстрата пероксидазы ТМВ и раствора пероксидазы В (КРЬ) в соотношении 1:1 в течение 15 мин при КТ. Останавливают колориметрическую реакцию путем добавления 100 мкл 0,1 М Н₂§0₄. Регистрируют данные на ридере для микропланшетов на длине волны 450 нм. Анализируют данные о поглощении при помощи программы ОтарЬРаб Ргйт и рассчитывают 1С₅₀. 1С₅₀ или половина максимально ингибирующей концентрации - это концентрация, которая обеспечивает 50% максимального ингибирования связывания лиганда с рецептором.

1С₅₀ для связывания антитела 1 с С8Р-1К человека составляет 8,1х10^-10 М, т.е. 0,81 нМ. Антитело 1 ингибирует связывание С8Р-1 с С8Р-1К и тем самым предотвращает активацию С8Р-1К лигандом С8Р-1.

ЕЬ1§А для демонстрации того, что антитела блокируют взаимодействие 1Ь-34/С8Р-1К. Титрационный микропланшет на 96 лунок покрывают 1Б-34 (0,5 мкг/млх100 мкл) (Κ&Ό БуЧепъ) и инкубируют его в течение ночи при 4°С. Далее трижды промывают указанные лунки ФСБ/Т, затем блокируют 100 мкл 3% БСА/ФСБ в течение 1 ч при КТ. Повторно промывают 3 раза ФСБ/Т. Разводят растворимый гибридный белок тк-С8Р-1К человека-Рс (Κ&Ό БуЧепъ) до конечной концентрации

- 14 021600

0,250 мкг/мл в ФСБ. Одновременно разводят антитело 1 в ФСБ до конечной концентрации 200 нМ. Делают серийные разведения антитела 1 в соотношении 1:3 от исходной концентрации 200 нМ до 3х10^-12 М. Объединяют 100 мкл гЬ-С8Р-1Р-Рс со 100 мкл каждого из разведений антитела 1 и инкубируют в течение 30 мин при КТ. Далее инкубируют 100 мкл смеси антитела 1:С8Р-1Р-Рс в течение 1 ч при КТ в лунках, покрытых 1Ь-34. После инкубации в течение 1 ч при КТ промывают лунки 3 раза ФСБ/Т и добавляют разведение 1:5000 анти-ЫдО-Рс-антитела, конъюгированного с НКР, в планшеты, и инкубируют их в течение 1 ч при КТ. Пять раз промывают планшеты ФСБ/Т и затем инкубируют со 100 мкл препарата субстрата пероксидазы ТМВ и раствора пероксидазы В (КРЬ) в соотношении 1:1 в течение 15 мин при КТ. Останавливают колориметрическую реакцию путем добавления 100 мкл 0,1 М Н₂§0₄. Регистрируют данные на ридере для микропланшетов на длине волны 450 нм. Анализируют данные о поглощении при помощи программы ОгарЬРай Рпкт и рассчитывают 1С₅₀. 1С₅₀ или половина максимально ингибирующей концентрации - это концентрация, которая приводит к 50% максимального ингибирования связывания лиганда с рецептором.

1С₅₀ для связывания антитела 1 с С8Р-1Р человека составляет 7,0^-10 М, т.е. 0,71 нМ. Антитело 1 ингибирует связывание 1Ь-34 с С8Р-1Р и тем самым предотвращает активацию С8Р-1Р лигандом 1Ь-34.

Анализ кинетики связывания при помощи поверхностного плазмонного резонанса/анализа В1асоге®.

Кинетику связывания антитела 1 с С8Р-1Р-Рс измеряют при 25°С на биосенсоре В1асоге® 2000 §РР (ОЕ НеаЪЬсаге). Иммобилизуют растворимый гибридный белок С8Р-1Р-Рс (в концентрации 10 мкг/мл и рН 5) в диапазоне от 395 до 1200 единиц ответа на чипе СМ5 с применением стандартного протокола присоединения аминов. Во время измерений аффинности связывания в качестве подвижного буфера используют НВ8-ЕР (0,01 Н НЕРЕ8 (рН 7,4), 0,15 мМ ЫаС1 и 3 мМ ЕИТА, 0,05% (объемные проценты) поверхностно-активного вещества Р20). Проводят анализ взаимодействия с введением антител в растворе в концентрациях от 1,5 до 100 нМ на подготовленную поверхность сенсорного чипа СМ15. Антитела вводят в течение 3 мин для связывания и оставляют диссоциировать в течение 15 мин. Проводят регенерацию иммобилизованного белка путем введения 20 мМ соляной кислоты со скоростью 10 мкл/мин. Для определения К_а (к_ои) и К_й (к_о££) образования комплекса используют программу В1Аеуа1иайои, версия 4.1, и одновременно проводят общую аппроксимацию данных в соответствии с моделью Ленгмюра 1:1. Рассчитывают константу равновесия для связывания (К_А) как отношение 1/К_с, измеряемое в молях (1/М). Рассчитывают константу равновесия для диссоциации (К_с) как отношение К_й/К_а, измеряемое в молях (М).

Средние значения для К_а, К_й и К_с для нескольких анализов В1асоге® для связывания антитела 1 с С8Р-1Р в обобщенном виде представлены в табл. 3.

Таблица 3

Кинетика связывания антитела с рекомбинантным С8Р-1Р человека

Антитело	К_а(1/Мс) Р-ОП	Кй(1Ю	Κϋ (М)
Антитело 1	3,7 х ί О⁵	3,3 х 10-⁴	8,0 х ΙΟ'¹⁰

Антитело 1 демонстрирует высокую аффинность связывания с С8Р-1Р.

Фосфорилирование С8Р-1Р, определяемое методом вестерн-блоттинга.

Клетки №Н3Т3, стабильно трансфицированные С8Р-1Р, высевают в планшет на 12 лунок с плотностью 5х10⁵ клеток/лунку в лунке объемом 1 мл, заполненной модифицированной по способу Дульбекко средой Игла (ИМЕМ), содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) и 1 мг/мл генетицина; инкубируют планшет в течение 5 ч. Дважды промывают монослои ФСБ и культивируют в течение ночи в 0,9 мл/лунку ИМЕМ с 1% ЭТС. Делают серийные разведения антитела 1 в ИМЕМ (начиная с 1 мкг/мл и разводя в 3 раза) и добавляют по 100 мкл на лунку; инкубируют в течение 2 ч при 37°С. Стимулируют клетки с применением 100 нг/мл лиганда С8Р-1 или 1Ь-34 в течение 10 мин, а затем кладут на лед и промывают ледяным ФСБ. Клетки лизируют в 100 мкл 50 мМ НЕРЕЗ (рН 7,5 150 мМ ЫаС1, 0,5% Тритона Х100, 1 мМ Ν;·ι₃,νθ₄. 10 мМ ЫаРР1, 50 мМ ЫаР) и с добавлением таблетки ингибиторов протеаз (РосЬе) на льду в течение 10 мин. Очищают лизат от лизированных клеток путем центрифугирования при 4°С. Загружают 20 мкл лизата на денатурирующий гель для проведения электрофореза и проводят блоттинг на нитроцеллюлозной мембране. Определяют фосфорилированный по тирозину С8Р-1Р на блоте с применением антифосфо-С8Р-1Р антитела в концентрации 1 мкг/мл (Се11 81диа1шд). Определить передачу сигнала с С8Р-1Р путем анализа блоттинга антителами либо антифосфо-МАРК (разведение 1:500), либо антифосфо-Ак! (1:1000) (Се11 81диаЬид). Чтобы гарантировать одинаковую загрузку на дорожки, анализируют блот с использованием анти-С8Р-1Р антител (1 мкг/мл; Р&И §ук1етк) или антител к актину (1:2000; §1дта). Инкубируют все первичные антитела на качалке в течение 1 ч при КТ; после чего добавляют соответствующее вторичное антитело, конъюгированное с пероксидазой хрена, и инкубируют также при встряхивании в течение 1 ч при КТ. Визуализируют полосы при помощи хемилюминесцентно- 15 021600 го реагента (СЕ НеаИЬсате).

Клетки №Н-3Т3, стабильно трансфицированные С8Р-1Р, демонстрируют быстрое фосфорилирование С8Р-1Р при их стимуляции либо С8Р-1, либо 1Ь-34. Присутствие антитела-1 приводит к ингибированию фосфорилирования С8Р-1Р, даже когда уровень антител составляет 1 мМ, что указывает на то, что связывание антитела 1 с С8Р-1Р препятствует активации указанного рецептора как С8Р-1, так и 1Ь-34. Ингибирование фосфорилирования С8Р-1Р также приводит к снижению фосфорилирования сигнальных молекул, применяемых в сигнальном пути С8Р-1 или 1Ь-34. И для Акт, и для МАРК, которые в сигнальном пути стоят после С8Р-1Р, уровень фосфорилирования снижается, когда клетки инкубируют со 100-1 нМ антитела 1. Следовательно, антитело 1 препятствует активации С8Р-1Р и активации каскада киназ, который включается вслед за стимуляцией С8Р-1Р. Различий в уровне белка для актина и С8Р-1Р между дорожками не было, что подтверждается одинаковым сигналом хемилюминесценции на каждой дорожке, выявляемым, когда блоты тестировали с антителами к указанным молекулам. Следовательно, ингибирование фосфорилирования С8Р-1Р возникает не вследствие технических трудностей, связанных с неравномерной загрузкой белковых проб, а является истинным отражением снижающегося сигнала.

Анализ интернализации и разрушения.

Антитело 1 вызывает интернализацию рецептора С8Р-1Р.

Клетки №Н-3Т3-С8Р-1Р высевают на предметные стекла, заключенные в камеру, на 8 лунок (’^ипс) и инкубируют при 37°С до тех пор, пока клетки не покроют 50% площади поверхности лунок. Перед началом эксперимента охлаждают предметные стекла до 4°С в суспензионной смеси воды и льда. Инкубируют клетки с 5 мкг/мл антитела 1 и сразу же переносятся в температуру 37°С, где выдерживают от 15 мин до 4 ч, чтобы произошла интернализация. В качестве контроля проводят инкубацию отдельного набора предметных стекол в суспензионной смеси воды и льда в течение 15 мин-4 ч с 5 мкг/мл антитела 1. Инкубация при 4°С препятствует интернализации рецептора С8Р-1, следовательно, любой сигнал в указанных клетках будет артефактом. После инкубации дважды промывают клетки ФСБ, после чего фиксируют клетки при помощи ледяного 1% параформальдегида в течение 15 мин. После трехкратной промывки холодным ФСБ пермеабилизируют клетки в ФСБ, содержащем 0,5% сапонина и 1% БСА, в течение 5 мин, затем повторно промывают в ФСБ, содержащем 1% БСА. В течение 1 ч проводят мечение антителом козы Су3 против 1дС человека (разведение 1:5000), которое будет служить флуоресцентной меткой антитела 1. Проводят окончательную трехкратную промывку с применением ФСБ, после чего помещают в среду Се1Мοиηί (Вютеба) и накрывают полученные препараты покровными стеклами. Антитело 1 с флуоресцентной меткой можно наблюдать визуально под микроскопом, чтобы определить клеточную локализацию в разных условиях, описанных выше.

При микроскопическом исследовании антитело 1 в препаратах при 4°С перед началом эксперимента видно на периферии клетки. Перевод клеток в температуру 37°С создает возможность быстрой интернализации комплекса антитело 1/СЗР-1Р, которую обычно можно увидеть через 15 мин. После инкубации с антителом 1 в течение 1 или 2 ч все комплексы антитело 1/С8Р-1Р переходят в перинуклеарную область, и лишь очень маленькая часть видна на плазматической мембране, что указывает на то, что связывание антитела 1 с С8Р-1Р вызывает быструю интернализацию рецептора и его удержание внутри клетки. Клетки, инкубируемые в течение 2 ч при 4°С, демонстрируют только периферическое окрашивание клетки, и интернализации антитела 1 не происходит. Таким образом, интернализация антитела/С8Р1Р является АТФ-зависимым процессом, который происходит в течение 15 мин после добавления антитела к клеткам.

Антитело 1 вызывает разрушение рецептора С8Р-1Р.

Клетки №Н-3Т3-С8Р-1Р высевают с плотностью 5х 10⁵ клеток/лунку в планшеты на 12 лунок в 1 мл среды ЭМЕМ, содержащей 10% ЭТС м 1 мг/мл геницитина. После инкубации клеток в течение 5 ч при 37°С в планшет добавляют либо 100 нг/мл С8Р-1, либо 15 мкг/мл антитела 1. Известно, что С8Р-1 вызывает интернализацию и разрушение С8Р-1Р, следовательно, он может выступать в качестве положительного контроля в данном эксперименте. Перед сбором клеток оставляют их на 1 и 5 ч, чтобы С8Р-1 в течение указанного времени оставался в клетках. Для других лунок перед сбором клеток инкубируют их в течение 24 и 48 ч с антителом 1. Отбирают среду, лизируют клетки и наносят осветленные лизаты на гели (как описано выше). Анализируют перенесенные белки с анти-С8Р-1Р антителами с целью определения количества рецепторов для каждых условий. Анализируют те же блоты с антителами к актину для нормировки уровня белка. Осуществляют количественное определение уровня С8Р-1Р и актина при помощи программы МиШ-Саиде, измерив плотность полос на вестерн-блоте. Относительный суммарный уровень белка С8Р-1Р получают путем деления общей плотности полосы С8Р-1Р на соответствующую плотность полосы актина.

Инкубация клеток №Н-3Т3-С8Р-1Р с С8Р-1 приводит к разрушению С8Р-1Р при обработке в течение 1 ч, а уровень С8Р-1Р снижается вдвое через 5 ч. Разрушение С8Р-1Р при инкубации клеток с антителом 1 не было таким же выраженным; антитело 1 снижает уровень С8Р-1Р на одну четверть. Через 48 ч уровень разрушения остается таким же, что указывает на то, что скорость разрушения остается постоянной. Следовательно, связывание антитела 1 с С8Р-1Р приводит к разрушению указанного рецепто- 16 021600 ра в клетках.

Антителозависимая клеточная цитотоксичность (АЗЦТ), вызываемая антителом 1.

Помимо ингибирования связывания С8Р-1 с С8Р-1К и индукции интернализации и разрушения С8Р-1К, антитело 1 также ингибирует С8Р-1К, запуская реакцию АЗЦТ.

Клетки лейкемии человека ΝΚΜ-1 засевают с плотностью 2х 10⁵ клеток/лунку в 25 мкл среды ΚΡΜΙ, содержащей 10% ЭТС со сверхнизким уровнем 1дО и 3 нг/мл 1Ь-2 человека, в планшет на 96 лунок. Делают серийные разведения 1 мкг/мл антитела 1 в соотношении 1:3 на основе 1дО1 или 1дО2 и добавляют в планшет в количестве 25 мкл/лунку. После инкубации в течение 15 мин высевают по 25 мкл клеток ΝΚ человека ('Έοη/а) с плотностью 2х10⁶ клеток/лунку и инкубируют их еще в течение 4 ч при 37°С. Добавляют 10 мкл лизирующего буфера из набора аСе11а-ТОХ (Се11 ТесЬио1оду) и оставляют при КТ на 15 мин. Добавляют 125 мкл ЭТС с низким уровнем 1дО и центрифугируют планшеты в течение 1 мин при 750д. В планшеты ОрДр1а(е (Регкш Е1тег) добавляют 50 мкл раствора для разведения при ферментном анализе из набора аСе11а-ТОХ и аккуратно переносят 50 мкл надосадочной жидкости из культуры клеток на планшеты ОрДр1а(е. Готовят реагент для ферментного анализа и реагент для детекции в соответствии с инструкцией к набору, добавляют в планшеты ОрДр1а(е 100 мкл реагента для ферментного анализа, после чего сразу же добавляют 50 мкл реагента для детекции. Считывают показатели с планшетов на люминометре через 20 мин после добавления указанных реагентов.

Активность АЗЦТ увеличивается при повышении дозы антитела 1, причем, когда концентрация антитела 1 достигает 1 мкг/мл, погибает 9% клеток ΝΚΜ-1. В отличие от этого, когда антитело 1 клонируют в остов 1дО2, изменения активности АЗЦТ при увеличении количества антитела 1 не происходит. Следовательно, антитело 1 - молекула 1дО1 - вызывает АЗЦТ в отношении клеток, с которыми оно связывается.

Картирование эпитопов.

В более ранних публикациях было определено, что С8Р-1 связывается с первыми тремя доменами 1д С8Р-1К (Аапд е! а1., Μο1. Се11. Βίο1. 13:5348 (1993)). Антитело 1 связывается с С8Р-1К и ингибирует связывание С8Р-1 с С8Р-1К человека, таким образом, оно должно связываться с первыми тремя доменами 1д С8Р-1К или рядом с ними. Чтобы определить эпитопы, с которыми связывается антитело 1 в молекуле С8Р-1К, первые три домена 1д мыши и человека заменяют (см. табл. 4). Антитело 1 не распознает С8Р-1К мыши, следовательно, если домен 1д мыши ввести в критическую связывающую область С8Р-1К человека, связывания указанных антител не произойдет.

Встраивают модификации первых трех доменов 1д в остов С8Р-1К человека, содержащего оставшиеся два наиболее С-концевых домена 1д во внеклеточном домене. Гибридизуют указанные конструкции с частью Рс молекулы 1дО для облегчения выработки белка и повышения стабильности указанных молекул.

Таблица 4

Определенные домены 1д С8Р-1К | Домен 1д | № аминокислоты |

1	21-107
2	108-201
3	202-292
4	293-402
5	401-512

Таким образом, химера 1 содержит домен 1д 1 мыши, домен 1д человека 2 и домен 1д человека 3 (м, ч, ч), домены 1д человека 4 и 5, соединенные с меткой Рс. Химеры 2-7 следующие: м, м, ч (химера 2), м, м, м (химера 3), ч, м, ч (химера 4), ч, м, м (химера 5), ч, ч, м (химера 6) и м, ч, м (химера 7), соединенные с последними двумя доменами 1д С8Р-1К человека, а затем с меткой Рс.

Связывание антитела 1 с химерными белками С8Р-1К определяют методом ЕЬ18А и Вхатоге®, как было описано выше. Вкратце, покрывают планшеты 100 мкл белками человека, мыши или химерными белками (1-7) в концентрации 200 нг/мл и оставляют на ночь. После промывки и блокирования планшетов добавляют антитело 1 в нескольких повторах в концентрации 100 нМ. Добавляют вторичное антитело против РаЬ человека, конъюгированное с пероксидазой хрена, в концентрации 1:10000 для определения связывания антитела 1 с молекулами С8Р-1К.

Как и ожидалось, в анализе связывания методом ЕЬ18А антитело 1 связывается с С8Р-1К человека, но не мыши. Антитело 1 слабо связывается с химерами, содержащими первый или второй домен 1д человека, но не с химерами, содержащими первый или второй домен 1д мыши. Антитело 1 сильно связывается с химерами, содержащими и первый, и второй домен 1д С8Р-1К человека. Все прочие конструкции не связываются с антителом 1. Следовательно, антитело 1 связывается с доменами 1д один или два, но для сильного связывания антитела с С8Р-1К человека требуются оба домена, когда оценку проводят в ходе анализа связывания. Данные анализа Β^асο^е® соответствуют данным ЕЬ18А. Любые химерные конструкции, которые не содержат второго домена 1д человека, не связываются с антителом 1, даже когда уровень указанного антитела составляет 1 мкМ, что указывает на то, что для связывания с антителом 1 тре- 17 021600 буется второй домен 1д. Связывание с антителом 1 также усиливалось, когда первый домен 1д также был от молекулы человека. Следовательно, антитело 1 первично связывается со вторым доменом 1д С8Р-1К, но образует некоторые полезные контакты с первым доменом 1д.

Анализ дифференцировки и пролиферации.

Дифференцировка макрофагов под действием С8Р-1.

Моноциты (Боп/а) высевают с плотностью 4х10⁵ клеток/мл в каждую камеру предметного стекла на 8 лунок, в 900 мкл среды Онкологического института Розуэлла Парка (КРМ1) 1640, содержащей 10% ЭТС и 100 нг/мл НС8Р-1. Делают серийные разведения антитела 1 в КРМ1 (начиная с 1 мкг/мл и разводя в 3 раза) и добавляют по 100 мкл в каждую лунку. Инкубируют при 37°С, заменяя среду каждые 3 дня, до тех пор, пока моноциты (на основании визуальной оценки) не прикрепятся к планшетам и не удлинятся, что характерно для дифференцировки в макрофаги.

Моноциты, обработанные антителом 1 в концентрации 2 нМ или выше в присутствии С8Р-1, не дифференцировались в макрофаги, сохраняя округлую форму, характерную для моноцитов. Индукцию лигандом С8Р-1 дифференцировки моноцитов в макрофаги можно подавить антителом 1 с 1С₅₀ 0,25 нМ. Кроме того, многие моноциты погибают во время обработки, не имея способности к выживанию без постоянной стимуляции С8Р-1.

Моноциты (Боп/а) высевают с плотностью 4х10⁵ клеток/мл в каждую камеру предметного стекла на 8 лунок, в 900 мкл среды Онкологического института Розуэлла Парка (КРМ1) 1640, содержащей 10% ЭТС и 100 нг/мл ЫБ-34. Делают серийные разведения антитела 1 в КРМ1 (начиная с 1 мкг/мл и разводя в 3 раза) и добавляют по 100 мкл в каждую лунку. Инкубируют при 37°С, заменяя среду каждые 3 дня, до тех пор, пока моноциты (на основании визуальной оценки) не прикрепятся к планшетам и не удлинятся, что характерно для дифференцировки в макрофаги.

Моноциты, обработанные антителом 1 в концентрации 2 нМ или выше, в присутствии ББ-34 не дифференцировались в макрофаги, сохраняя округлую форму, характерную для моноцитов. Индукцию лигандом ББ-34 дифференцировки моноцитов в макрофаги можно подавить антителом 1 с 1С₅₀ 0,3 нМ. Кроме того, многие моноциты погибают во время обработки, не имея способности к выживанию без постоянной стимуляции С8Р-1.

Пролиферация моноцитов под действием С8Р-1.

Высевают моноциты (Бопга) с плотностью 3000 клеток/лунку в планшет на 96 лунок в присутствии среды КРМ1 1640, содержащей 10% ЭТС и 100 нг/мл С8Р-1. На следующий день заменяют среду и добавляют антитело 1, последовательно разведенное с 20 до 0,01 нМ (разведения 1:3). Через три дня заменяют среду свежей средой, содержащей 10% ЭТС и 100 нг/мл С8Р-1, а также антитело, и дают клеткам расти еще 5 дней. При добавлении 100 мкл люминесцентного буфера СеИТЬег С1о и субстрата (Рготеда) проводят встряхивание клеток в течение 10 мин и осуществляют считывание люминесценцию в качестве показателя жизнеспособности.

1С₅₀ для ингибирования роста моноцитов антителом 1 составляет 1,4х10^-10 М, т.е. 0,1 нМ. 1С₅₀ для индукции роста моноцитов С8Р-1 в присутствии антитела 1 показывает, что антитело 1 угнетает пролиферацию моноцитов в культуре.

Пролиферация моноцитов под действием ББ-34.

Высевают моноциты (Бопга) с плотностью 3000 клеток/лунку в планшет на 96 лунок в присутствии среды КРМ1 1640, содержащей 10% ЭТС и 100 нг/мл 1Б-34. На следующий день заменяют среду и добавляют антитело 1, последовательно разведенное с 20 до 0,01 нМ (разведения 1:3). Через три дня заменяют среду свежей средой, содержащей 10% ЭТС и 100 нг/мл ББ-34, а также антитело, и оставляют клетки расти еще 5 дней. При добавлении 100 мкл люминесцентного буфера С.'е11ТПег С1о и субстрата (Рготеда) осуществляют встряхивание клеток в течение 10 мин и регистрируют люминесценцию в качестве показателя жизнеспособности.

1С₅₀ для ингибирования роста моноцитов антителом 10,5 нМ. 1С₅₀ для индукции роста моноцитов лигандом ББ-34 в присутствии антитела 1 показывает, что антитело 1 подавляет пролиферацию моноцитов в культуре.

Пролиферация линий клеток опухоли под действием С8Р-1.

Высевают клетки лейкемии ИКМ-1 с плотностью 1 х 10⁴ клеток/мл в планшет на 96 лунок в 100 мкл среды КРМ1 1640, содержащей 1% ЭТС, и оставляют на одну ночь. Добавляют 20 нг/мл С8Р-1 к клеткам в среде КРМ1 1640, содержащей 1% ЭТС и 20-0,01 нМ последовательно разведенного антитела 1 (разведения 1:3). Инкубируют еще 3 дня при 37°С. Добавив 100 мкл люминесцентного буфера Се11ТЬег С1о и субстрата (Рготеда) осуществляют встряхивание клеток в течение 10 мин и регистрируют люминесценцию (в качестве показателя жизнеспособности).

1С₅₀ для ингибирования роста клеток ИКМ-1 антителом 1 составляет 7,6х10^-11 М, т.е. 0,7 нМ. Это показывает, что антитело 1 угнетает пролиферацию клеток ИКМ-1 в культуре.

Модели опухолей ίη У1уо, в которых С8Р-1К экспрессируется на поверхности опухоли.

Более длительное выживание мышей с клетками лейкемии человека ИКМ-1 при лечении

- 18 021600 антителом 1.

Облучают мышей Νπ/пи сублетальными дозами 200 рад/мышь за 24 ч перед внутривенным введением 2,5х 10⁶ клеток лейкемии ΝΙ<Μ-1. Еще через 24 ч случайным образом делят мышей на 4 группы для получения 60 мг/кг 1§О человека, 60, 20 или 5 мг/кг антитела 1 два раза в неделю. Ежедневно следят за выживанием указанных мышей. Определяют значение Р по логарифмическому ранговому критерию Кокса-Мантеля.

Таблица 5

Увеличение выживаемости мышей, зараженных клетками лейкемии ΝΙ<Μ-1, при их лечении антителом 1

Лечение	Медиана выживания (дни)	Сравнение когорт	Значение Р относительно контроля
1&С человека	35	НП	НП
Антитело 1 (5 мг/кг)	55	Контроль ΙβΟ человека	<0,0001
Антитело 1 (20 мг/кг)	46	Контроль ΙβΟ человека	<0,0001
Антитело 1 (60 мг/кг)	46	Контроль ΙβΟ человека	<0,0001

НП = не применимо.

Объем опухоли рассчитывают по формуле

Объем = [(Ρί/6)1 х V], где Ρί=3,14;

№ - ширина;

- длина.

Процент от контроля или %Т/С = 100* (объем при лечении)/(объем в контроле). Различия признавали статистически значимыми, если значение р было меньше либо равно 0,05.

Антитело 1 повышает выживаемость мышей, зараженных клетками лейкемии МКМ-1, как показывают данные в табл. 5.

Модели опухолей ίη νίνο, в которых С8Р-1К экспрессируется на поверхности ассоциированных с опухолью макрофагов.

Анти-С8Р-1К антитело 1 представляет собой полностью человеческое антитело, которое распознает свойственную человеку форму С8Р-1К, но не форму указанного рецептора, свойственную мыши. Следовательно, для проведения исследования по подтверждению концепции ίη νίνο, в котором С8Р-1К экспрессируется на поверхности макрофага, требуется антимышиное антитело. Указанные исследования должны ответить на вопрос о роли макрофагов мыши в росте опухолей человека в моделях ксенотрансплантата у мышей. Антимышиные антитела могут влиять на макрофаги мышей, но не на опухоль, что позволило бы оценить эффект стромальных макрофагов на рост опухоли. Следующие эксперименты проводили с антителом 2 - антимышиным антителом крысы против С8Р-1К.

Эффективность антимышиного тАЬ против С8Р-1К в модели ксенотрансплантата ΑΝ3ΕΑ карциномы эндометрия человека.

Следует подкожно ввести мышам Νυ/ηυ (самкам, возраст 7-8 недель) 5х10⁶ клеток АЫ3СА/мышь, в левый бок. Когда опухоль достигнет приблизительного размера 200 мм³, разделить мышей случайным образом на группы по 12 мышей/группу лечения.

Г отовят антитело 2 и 1§О крысы в физиологическом растворе в концентрации 6 мг/мл и вводят мышам подкожно три раза в неделю в дозе 40 мг/кг. На 15-й день регистрируют объем и рассчитывают % Т/С. Анализируют объем опухоли при помощи КМ ΑΝΘΥΑ (дисперсионного анализа). Т/С% для группы лечения, получавшей антитело 2, составил 66% по сравнению с контрольной группой, получавшей 1§О крысы. Указанные результаты демонстрируют значимое подавление роста опухоли (р=0,045) у животных, получавших антитело 2.

Эффективность антимышиного тАЬ против С8Р-1К в модели ксенотрансплантата НСС1954 карциномы молочной железы человека.

Мышам Νυ/ηυ (самкам, возраст 7-8 недель; СЬаг1е8 ККег ΡιώοκιΙο^δ) подкожно вводят 1х10⁷клеток НСС1954/мышь. Когда опухоли достигнут приблизительного размера 300 мм³, мышей рандомизируют в зависимости от размера опухоли на группы по 12 мышей в каждую группу лечения. Готовят 1§С и антитело 2 крысы в физиологическом растворе в концентрации 6 мг/мл и вводят мышам подкожно три раза в неделю. 1§С крысы вводят животным в количестве 40 мг/кг, а антитело 2 вводят животным в количестве 40 или 10 мг/кг в каждой инъекции. Регистрируют размеры опухоли два раза в неделю; через 37 дней после первой инъекции рассчитывают Т/С%. Анализируют объем опухоли при помощи КМ АЫОУА.

- 19 021600

Как показано в табл. 6, Т/С% в группе лечения, получавшей 10 мг/кг через 37 дней, составил 77%, а в группе лечения, получавшей 40 мг/кг, составил 56%, по сравнению с объемом опухоли в контрольной группе, получавшей физиологический раствор. Полученные результаты указывают на значимое подавление роста опухоли (р=0,0014) у животных, получавших 40 мг/кг антитела 2.

Противоопухолевое действие тАЬ против С8Р-1К мыши в модели ксенотрансплантата Όυ145 рака предстательной железы человека.

Подкожно вводят мышам Nи/ηи (самцы, возраст 7-8 недель) 15х10⁶ клеток ОШ45/мышь, в левый бок. Когда опухоль достигнет приблизительного размера 250 мм, мышей разделяют случайным образом на группы по 12 мышей/группу лечения.

Приготавливают антитело 2 и Ι§Ο крысы в физиологическом растворе в концентрации 6 мг/мл и вводят мышам подкожно три раза в неделю в дозе 40 и 10 мг/кг. На 21-й день регистрируют объем и рассчитывают % Т/С для групп, получавших 10 и 40 мг/кг. Анализируют объем опухоли при помощи КМ АN0VА.

Как показано в табл. 6, Т/С% для групп лечения, получавших антитело 2 в дозах 10 и 40 мг/кг, составил 50 и 43 соответственно, по сравнению с контрольной группой, получавшей Ι§Ο крысы. Указанные результаты демонстрируют значимое подавление роста опухоли (р<0,0001 для обеих концентраций) у животных, получавших антитело 2.

Таблица 6

Подавление роста опухоли из ксенотрансплантата опухоли человека антителом 2

Описание модели	Лечение	%Т/С	Сравнение когорт	Значение Р относитель но контроля
НСС 1954 (молочная железа)	Антитело 2 (10 мг/кг)	77	Контроль 1&С крысы	0,4543
НСС1954 (молочная железа)	Антитело 2 (40 мг/кг)	56	Контроль ϊβΟ крысы	0,0014
Р1Л45 (предстатель ная железа)	Антитело 2 (10 мг/кг)	50	Контроль 1§С крысы	<0,0001
ουΐ45 (предстатель ная железа)	Антитело 2 (40 мг/кг)	43	Контроль 1§С крысы	<0,0001

Уменьшение инфильтрации макрофагов в опухоли молочной железы НСС1954 и предстательной железы Όυ145 при лечении тАЬ к С8Р-1К мыши.

Удаляют опухоль у животного, использовавшегося в исследованиях на животных с опухолями НСС1954 (молочная железа) и Όυ145 (предстательная железа), описанных выше. Разрезают опухоль вдоль длинной оси и помещают в 10% формалин на одну ночь при 4°С и встряхивании. Через 24 ч 2 раза промывают в ФСБ в течение 20 мин, затем добавляют растворы с прогрессивно возрастающей концентрацией этанола, пока в опухоли концентрация этанола не достигнет 100%. Заменяют этанол ксилолом посредством нескольких инкубации в 100% ксилоле и запечатывают опухоль в парафин. Делают срезы парафинового блока толщиной 4 мкм и кладут их на предметные стекла. Освобождают от парафина и регидратируют ткань посредством последовательных инкубаций в ксилоле, после чего увеличивают концентрацию воды в этаноле. Нагревают препараты опухоли в буфере для демаскировки (Эако) в течение 3 мин в микроволновой печи, после чего блокируют эндогенные пероксидазы 3% Н₂О₂ в течение 10 мин при КТ. Блокируют неспецифическое связывание белков посредством белкового блока (Оако) в течение 10 мин, после чего добавляют специфичное антитело крысы к макрофагам мыши Ε4/80 (2 мкг/мл 8его(ес), конъюгированное с биотином, и инкубируют в течение ночи при 4°С. Инкубируют в преоксидазе хрена-стрептавидине (разведение 1:1000 'Часккоп 1ттипоКе8еагсЬ) в течение 45 мин при КТ, затем промывают 3 раза. Проводят реакцию в диаминобензидине (Эако) в соответствии с инструкцией к набору, останавливая реакцию посредством двукратной промывки в воде. Осуществляют быстрое контрастирующее окрашивание гематоксилином Майера (10 мин; Пако), после чего промывают водой, погружают в кислоту+спирт, вторично промывают водой и стимулируют развитие синей окраски при помощи водного раствора аммиака. Дегидатируют, осветляют и накрывают покровным стеклом, применяя перманентную заливочную среду. Анализируют по 5 изображений от трех животных на каждую группу лечения. Определяют количество/площадь макрофагов для каждой группы лечения при помощи программы 1тадеРго.

- 20 021600

Таблица 7

Инфильтрация макрофагов в опухоли при лечении антимышиным тАЬ против С8Р-1К - антителом 2

Описание модели	Лечение	Среднее количество/ площадь макрофагов	Сравнение когорт	Значение Р относите льно контроля
НСС1954 (молочная железа)	1дС крысы	664	НП	НП
НСС 1954 (молочная железа)	Антитело 2 (10 мг/кг)	82	Контроль 1§О крысы	<0,0001
НСС 1954 (молочная железа)	Антитело 2 (40 мг/кг)	76	Контроль 1§О крысы	<0,0001
ОТ 145 (предстатель ная железа)	1§О крысы	84	НП	НП
ОТ 145 (предстатель ная железа)	Антитело 2 (10 мг/кг)	5	Контроль 1§О крысы	<0,0001
Би 145	Антитело 2	0.5	Контроль	<0,0001

(предстатель ная железа)

(40 мг/кг)

ЦС крысы

НП = не применимо.

Как показано в табл. 7, количество макрофагов уменьшается в опухолях обеих моделей, особенно по периферии. Таким образом, лечение антителом 2 приводит к снижению инфильтрации макрофагов в опухоли, что указывает на то, что антимышиное антитело против С8Р-1К обусловливает сокращение популяции макрофагов в указанных опухолях.

Значимость макрофагов и уровня С8Р-1 для прогрессирования опухоли.

Введение антитела 1 может оказывать положительное действие на подавление роста опухолей, а также на лечение многих типов рака, помимо рака молочной и предстательной железы. Некоторые типы опухолей, такие как рак почек, экспрессируют С8Р-1К на поверхности своих клеток, и лечение антителом 1 может непосредственно подавлять рост указанных опухолей (8оагек, е! а1., Мобегп Ра!Ьо1. 22:744752 (2009)). Борьба с другими типами опухолей, такими как лимфома Ходжкина и множественная миелома, которые включают большую популяцию ассоциированных с опухолью макрофагов, могла бы быть улучшена путем лечения антителом 1, при котором антитело 1 могло бы уничтожать макрофаги, которые индуцируют рост опухоли (8!е1б1, е! а1. Νον Епд1. I. Меб. 362:875-885 (2010); 2Ьепд, е! а1., В1ооб 114:3625-3628 (2009)). Кроме того, к анти-С8Р-1 или С8Р-1К лечению чувствительны опухоли, которые секретируют С8Р-1, такие как рак прямой и ободочной кишки (АЬагше.)аб, е! а1., Сапсег Кек. 62:5317-5324 (2002)), и при них может быть полезно проводить лечение антителом 1. Кроме того, кандидатами на лечение антителом 1 могут быть рак яичника, печеночно-клеточная карцинома и почечно-клеточная карцинома, при которых высокий уровень экспрессии С8Р-1 коррелирует с плохим прогнозом (Тоу, е! а1., Суп. Опсо1. 80:194-200 (2001); /Ьищ е! а1., Суп. Опсо1. 107:526-531 (2007); 2Ьи, е! а1., I. СЬп. Опсо1. 26:2707-2716 (2008); СегЬиг/. е! а1., Иго1. 58:821-827 (2001)).

Рост опухолей, не экспрессирующих С8Р-1К, но характеризующихся ассоциированными с опухолью макрофагами, подавляется анти-С8Р-1К антителами, только если они секретируют С8Р-1.

Высевают линии клеток опухолей НСС1954 (молочная железа), Όυ145 (предстательная железа) и Рс3 (предстательная железа) в концентрации 5х10⁵ клеток/мл и культивируют в течение 48 ч в среде для роста, содержащей 1% ЭТС. Отбирают, осветляют и анализируют указанную среду при помощи набора Κ&Ό ОнапЫбпе Нитап М-С8Р Аккау (Κ&Ό 8ук!етк). Определяют уровень С8Р-1 в момент времени 0 и 48 ч, выразить в пг/мл.

В момент времени 0, как и ожидалось, в среде не выявляется С8Р-1. Однако за 48 ч клетки НСС1954 секретировали 3613 пг/мл С8Р-1, а клетки Όυ145 выработали 4019 пг/мл. Напротив, среда клеток Рс3 содержала только 39 пг/мл С8Р-1.

Линию клеток рака предстательной железы выращивают в мышах, чтобы проверить, коррелирует ли отсутствие экспрессии С8Р-1 с устойчивостью к анти-С8Р-1К лечению.

Подкожно водят клетки предстательной железы Рс3 в количестве 5х10⁶ бестимусным мышам (самцы, возраст 7-8 недель) и позволяют опухоли вырасти до размера 300 мм³, после чего делят мышей на группы лечения по 12 животных в каждой группе. Вводят животным 40 мг/кг 1§О крысы, 40 мг/кг антитела 2 или 10 мг/кг антитела 2 три раза в неделю, пока опухоли в контроле не достигнут размера 2000 мм³. На 18-й день измеряют объем опухоли и рассчитывают Т/С% для каждой группы лечения как

- 21 021600 отношение объема опухоли к объему опухоли в контрольной группе, получавшей 1§С крысы. Анализируют объем опухоли при помощи КМ ΑΝΟνΑ.

Таблица 8

Корреляция С8Р-1 и устойчивости к анти-С8Р-1К препаратам

Лечение	Т/С%	Сравнение когорт	Значение Р относите льно контроля
Антитело 2	101	Контроль	0,95
(10 мг/кг)	1дС крысы
Антитело 2	102	Контроль	0,53

(40 мг/кг)	I Ικθ крысы (

Различий в росте опухоли между контрольными группами, получавшими 1§С крысы, и группами, получавшими антитело 2, нет, что указывает на то, что повышенный уровень С8Р-1 может быть биологическим маркером для лечения анти-С8Р-1К антителами.

Секреция С8Р-1 коррелирует с чувствительностью к анти-С8Р-1К препаратам, когда С8Р-1К экспрессируется на поверхности ассоциированных с опухолью макрофагов.

Бестимусным мышам подкожно вводят клетки, как описано в табл. 9 и 10 далее, и дают опухоли вырасти до размера 300 мм³, после чего делят мышей на группы лечения, по 12 животных в каждой группе. Вводят животным препарат в соответствии с данными в табл. 9 и 10 три раза в неделю, пока опухоли в контроле не достигнут размера 2000 мм³. Измеряют объем опухоли и рассчитывают Т/С% для каждой группы лечения как отношение относительного объема опухоли к объему опухоли в контрольной группе, получавшей 1§С крысы. Аанализируют объем опухоли при помощи КМ ΑΝΟνΑ.

Таблица 9

Чувствительность в моделях опухолей, секретирующих С8Р-1

Описание модели	Тип опухоли	Вид	Лечение	%Т/С	Сравнение когорт	Значение Р относите льно контроля
МПА-МВ231 ЬЗ-ОРРТ	Молочн ая железа	Человек	40 мг/кг 3 р/нед	51	Контроль 1§О крысы	0,0002
НСС-1954	Молочн ая железа	Человек	40 мг/кг 3 р/нед	56	Контроль 1§О крысы	0,0014
04145	Предст ательна я железа	Человек	40 мг/кг 3 р/нед	43	Контроль 1дО крысы	<0,0001
4Т1	Молочн ая железа	Мышь	40 мг/кг 3 р/нед	54	Контроль ΙβΟ крысы	0,0001
ЕМТ6	Молочн	Мышь	40 мг/кг	42	Контроль	<0,0001
	ая железа		3 р/нед		1иО крысы

р/нед = три раза в неделю.

Таблица 10

Чувствительность в моделях опухолей, не секретирующих С8Р-1

Описание модели	Тип опухоли	Вид	Лечение	% Т/С	Сравнение когорт	Значение Р относите льно контроля
МСЕ-7	Молочн ая железа	Человек	60 мг/кг 2 р/нед	70	Контроль 1§О крысы	0,0166
ЛтТ1	Молочн ал железа	Человек	40 мг/кг 3 р/нед	93	Контроль 1дО крысы	0,23
РСЗ	Предста тельная железа	Человек	40 мг/кг 3 р/нед	102	Контроль 1дО крысы	0,53

р/нед = три раза в неделю.

- 22 021600

Все секретирующие СδΡ-1 опухоли (табл. 9) реагируют на анти-СδΡ-1Κ лечение антителом 2, а опухоли, которые не секретируют СδΡ-1 (табл. 10), не реагируют или очень плохо реагируют на антиСδΡ-1Κ лечение антителом 2. Секреция СδΡ-1 коррелирует с чувствительностью к анти-СδΡ-1Κ лечению в тех моделях опухолей, в которых СδΡ-1Κ экспрессируется на поверхности ассоциированных с опухолью макрофагов. Соответственно, повышенный уровень СδΡ-1 может служить потенциальным индикатором чувствительности или биологическим маркером того, что СδΡ-1Κ экспрессируется на поверхности ассоциированных с опухолью макрофагов.

СδΡ-1Κ также экспрессируется на поверхности клеток опухоли. Секреция СδΡ-1 не коррелирует с чувствительностью к анти-СδΡ-1Κ препаратам в случае экспрессии СδΡ-1Κ на поверхности клеток опухоли.

Уровень 1Ь-34 в пробах ткани опухоли и сыворотки пациентов.

Помимо СδΡ-1, с СδΡ-1Κ может связываться и 1Ь-34, вызывая фосфорилирование указанного рецептора и активацию стоящих ниже сигнальных молекул, что приводит к дифференцировке и выживанию макрофагов. СδΡ-1 и 1Ь-34 связываются с доменами 1§О во внеклеточной области СδΡ-1Κ (Ьт, е! а1., δ^ι^, 320:807-11 (2008)), и оба эти лиганда можно ингибировать путем связывания СδΡ-1Κ с антителом 1 (1С₅₀=0,81 нМ и 1С₅₀=0,71 нМ для ингибирования связывания СδΡ-1 и 1Ь-34 с антителом 1 соответственно, как было описано выше). Обработка клеток ΝΙΗ-3Τ3, стабильно трансфицированных СδΡ-1Κ, антителом 1 приводит к ингибированию фосфорилирования СδΡ-1Κ, запускаемого лигандом 1Ь-34 (как было описано выше). Кроме того, индукцию лигандом 1Ь-34 дифференцировки моноцитов в макрофаги и пролиферации макрофагов можно ингибировать антителом 1 с 1С₅₀=0,3 и 0,5 нМ соответственно (как было описано выше), что сопоставимо с результатами, полученными для СδΡ-1. Следовательно, активность 1Ь-34 и ее ингибирование антителом 1 аналогичны тем, которые отмечаются для С8Р-1.

Уровень 1Ь-34 повышен в клетках многих опухолей, включая линии клеток опухолей молочной железы, предстательной железы и эндометрия. Кроме того, определенные субпопуляции пациентов с раком предстательной и молочной железы имеют высокий уровень белка 1Ь-34 в своей сыворотке. Соответственно, поскольку функции 1Ь-34 практически идентичны функциям СδΡ-1, а секреция СδΡ-1 коррелирует с чувствительностью к анти-СδΡ-1Κ препаратам, повышенный уровень 1Ь-34 также может служить индикатором чувствительности или биологическим маркером.

Комбинированные исследования опухолей молочной железы.

Вводят подкожно мышам Νιι/пи (самки, возраст 7-8 недель) клетки молочной железы НСС-1954 в количестве 1х10⁷/мышь и дают опухоли достигнуть размеров 300 мм³ перед началом лечения. Случайным образом делят мышей на группы по 12 животных и осуществляют следующее лечение.

- 23 021600

Таблица 11

Комбинированные исследования опухолей молочной железы

Лечение	Доза	% Т/С	Сравнение когорт	Значение Р относител
				ьно
				контроля

40 мг/кг ΙβΟ человека + 40 мг/кг Антитела 2	3 р/нед	44	40 мг/кг 1§С человека + контроль 40 мг/кг 1§О крысы	0,0002
40 мг/кг Герцептина® + 40 мг/кг 1§<3 крысы	3 р/нед	46	40 мг/кг 1§О человека + контроль 40 мг/кг 1§С крысы	<0,0001
40 мг/кг Герцептина ® + 40 мг/кг Антитела 2	3 р/нед	26	40 мг/кг 1цО человека + контроль 40 мг/кг 1§О крысы	<0,0001

40 мг/кг Антитела 2	3 р/нед	42	контроль физиологический раствор	0,006
8 мг/кг ΙΡ Доксорубицина	I р/нед х2	50	контроль физиологический раствор	0,008
40 мг/кг Антитела 2 8 мг/кг Доксорубицин	3 р/нед, 1 р/нед х2	28	контроль физиологический раствор	0,0005

40 мг/кг Антитела 2	3 р/нед	38	контроль физиологический раствор	<0,0001
10 мг/кг ΙΡ Паклитаксела	1 р/нед хЗ	60	контроль физиологический раствор	<0,01
40 мг/кг Антитела 2 10 мг/кг Паклитаксела	3 р/нед, 1 р/нед хЗ	23	контроль физиологический раствор	<0,0001

р/нед = три раза в неделю;

р/нед х2 = один раз в неделю, дважды;

р/нед х3 = один раз в неделю, три раза.

Измеряют объем опухоли и рассчитывают Т/С% для каждой группы лечения как отношение относительного объема опухоли к объему опухоли в контрольной группе. Анализируют объем опухоли при помощи РМ АЯ0УА.

Во всех исследованиях, представленных в табл. 11, антитело 2, герцептин®, доксорубицин и паклитаксел подавляли рост опухоли при монотерапии указанными препаратами. Однако сочетание антитела 2 с препаратом, обеспечивающим направленную доставку к опухоли, обеспечивает аддитивное действие, что указывает на то, что сочетание анти-С8Р-1Р антитела с химиотерапией или другими препаратами, воздействующими на опухоль, будет более эффективным, чем указанные препараты по отдельности.

Комбинированные исследования опухолей предстательной железы.

Водят подкожно мышам Nи/ηи (самцы, возраст 7-8 недель) клетки предстательной железы ИШ45 в количестве 1,5х10⁷/мышь и дают опухоли достигнуть размеров 300 мм³ перед началом лечения. Случайным образом делят мышей на группы по 10 животных и осуществляют следующее лечение.

- 24 021600

Комбинированные исследования опухолей предстательной железы

Таблица 12

Лечение	Доза	%Т/С	Сравнение когорт	Значение Р относител ьно контроля
40 мг/кг Антитела 2	3 р/нед	50	контроль физиологиче ский раствор	0,03
12 мг/кг Доцетаксела	1 р/нед хЗ	59	контроль физиологиче ский раствор	0,15
40 мг/кг Антитела 2 12 мг/кг Доцетаксела	3 р/нед, 1 р/нед хЗ	29	контроль физиологиче ский раствор	<0,0001

р/нед = три раза в неделю;

р/недх3 = один раз в неделю, три раза.

Измеряют объем опухоли и рассчитывают Т/С% для каждой группы лечения как отношение относительного объема опухоли к объему опухоли в контрольной группе. Анализируют объем опухоли при помощи КМ ΑΝΟνΑ. Сочетание антитела 2 с доцетакселем оказывает аддитивное действие, что указывает на то, что сочетание химиотерапевтических препаратов при раке предстательной железы может быть более эффективным, чем химиотерапевтические препараты по отдельности.

Дополнительные последовательности 5ΕΟΙΡΜ» 9

ΟΙη Авр 61п Ьеи Уа101и Зег О1у О1у О1у Уа1 Уа101п Рго О1у Агд 15 10 15

Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зет С1у РЬе ТЬг РЬе Зег Зег Туг 20 25 30

О1у Ме1 Шз Тгр Уа1 Агд О1п А1а Рго О1у О1и О1у Ьеи О1и Тгр Уа1 35 40 45

А1а Уа1 Не Тгр Туг Авр О1у Зег Азп Ьуз Туг Туг А1а Азр Зег Уа1 50 55 60

Ьуз О1у Агд РЬе ТЬг Не Зег Агд Азр Азп Зег Ьуз Азп ТЬг Ьеи Туг

70 75 80

Ьеи О1п Ме( Азп Зег Ьеи Агд А1а О1и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз

90 95

А1а Агд О1у Азр Туг О1и Уа1 Азр Туг О1у Ме1 Азр Уа1 Тгр О1у О1п 100 105 110

О1у ТЬг ТЬг Уа1 ТЬг Уа1 А1а Зег А1а Зег ТЬг Ьуз О1у Рго Зег Уа1 115 120 125

РЬе Рго Ьеи А1а Рго Зег Зег Ьуз Зег ТЬг Зег С1у С1у ТЬг А1а А1а 130 135 140

Ьеи С1у Суз Ьеи Уа1 Ьуз Азр Туг РЬе Рго О1и Рго Уа1 ТЬг Уа1 Зег

145 150 155 160

Тгр Азп Зег <31у А1а Ьеи ТЬг Зег О1у Уа1 Шз ТЬг РЬе Рго А1а Уа1

165 170 175

Ьеи О1п Зег Зег О1у Ьеи Туг Зег Ьеи Зег Зег Уа1 Уа1 ТЬг Уа1 Рго 180 185 190

Зет Зег Зег Ьеи С1у ТЬг О1п ТЬг Туг Не Суз Азп Уа1 Азп Шз Ьуз 195 200 205

Рго Зег Азп ТЬг Ьуз Уа1 Азр Ьуз Агд Уа1 О1и Рго Ьуз Зег Суз Азр 210 215 220

Ьуз ТЬг Шз ТЬг Суз Рго Рго Суз Рго А1а Рго О1и Ьеи Ьеи О1у С1у

225 230 235 240

Рго Зег Уа1 РЬе Ьеи РЬе Рго Рго Ьуз Рго Ьуз Азр ТЬг Ьеи Ме1 Не

245 250 255

Зег Агд ТЬг Рго О1и Уа1 ТЬг Суз Уа! Уа1 Уа1 Азр Уа1 Зег Шз О1и 260 265 270

Азр Рго О1и Уа] Ьуз РЬе Азп Тгр Туг Уа1 Азр С1у Уа1 С1и Уа1 Шз 275 280 285

Азп А1а Ьуз ТЬг Ьуз Рго Агд С1и С1и С1п Туг Азп Зег ТЬг Туг Агд 290 295 300

Уа1 Уа1 Зег Уа1 Ьеи ТЬг Уа1 Ьеи Шз О1п Азр Тгр Ьеи Азп С1у Ьуз

305 310 315 320

С1и Туг Ьуз Суз Ьуз Уа1 Зег Азп Ьуз А1а Ьеи Рго А1а Рго Не О1и

325 330 335

Ьуз ТЬг Не Зег Ьуз А1а Ьуз С1у С1п Рго Агд О1и Рго О1п Уа1 Туг 340 345 350

- 25 021600

ТЬг Ьеи Рго Рго Зег Аг§ СПи С1и Ме1 ТЬг Ьуз Азп О1п Уа] Зег Ьеи 355 360 365

ТЬг Суз Ьеи Уа1 Ьуз СПу РЬе Туг Рго Бег Азр Пе А1а Уа1 С1и Тгр 370 375 380

С1и Зег Азп О1у О1п Рго О1и Азп Азп Туг Ьуз ТЬг ТЬг Рго Рго Уа1

385 390 395 400

Ьеи Азр Зег Азр СПу Зет РЬе РЬе Ьеи Туг Зег Ьуз Ьеи ТЬг Уа! Азр

405 410 415

Ьуз Зег Аг£ Тгр СПп О1п СПу Азп Уа1 РЬе Зег Суз Зег Уа1 Ме1 Из 420 425 430

О1и А1а Ьеи Из Азп Из Туг ТЬг О1п Ьуз Зег Ьеи Зег Ьеи Зег Рго 435 440 445

СПу Ьуз 450

ЗЕО1Р№ 10

А1а Пе С1п Ьеи ТЬг О1п Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег А1а Зег Уа1 С1у

10 15

Азр Аг§ Уа1 ТЬг Не ТЬг Суз Аг§ А1а Зег О1п О1у Пе Зег Азп А1а

25 30

Ьеи А1а Тгр Туг О1п О1п Ьуз Рго С1у Ьуз А1а Рго Ьуз Ьеи Ьеи Не 35 40 45

Туг Азр А1а Зег Зег Ьеи СПи Зег СПу Уа1 Рго Зег Аг§ РЬе Зег СПу 50 55 60

Зег О1у Зег О1у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Ие Зег Зег Ьеи СПп Рго

70 75 80

О1и Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз С1п С1п РЬе Азп Зег Туг Рго Тгр

90 95

ТЬг РЬе СПу СПп С1у ТЬг Ьуз Уа1 С1и Пе Ьуз Ατβ ТЬг Уа1 А1а А1а 100 105 110

Рго Зег Уа1 РЬе Пе РЬе Рго Рго Зег Азр О1и О1п Ьеи Ьуз Зег С1у 115 120 125

ТЬг А1а Зег Уа1 Уа1 Суз Ьеи Ьеи Азп Азп РЬе Туг Рго Аг§ С1и А1а 130 135 140

Ьуз Уа1 С1п Тгр Ьуз Уа1 Азр Азп А1а Ьеи СПп Зег СПу Азп Зег О1п

145 150 155 160

СПи Зег Уа1 ТЬг СПи СПп Азр Зег Ьуз Азр Зег ТЬг Туг Зег Ьеи Зег

165 170 175

Зег ТЬг Ьеи ТЬг Ьеи Зег Ьуз А1а Азр Туг СПи Ьуз Из Ьуз Уа1 Туг 180 185 190

А1а Суз СПи Уа! ТЬг Из СПп С!у Ьеи Зег Зег Рго Уа1 ТЬг Ьуз Зег 195 200 205

РЬе Азп Аг§ СПу С1и Суз 210

8ΕΟΙΡΚ» 11

Ме1 С1у Тгр Зег Суз Пе Пе Ьеи РЬе Ьеи Уа] А1а ТЬг А1а ТЬг СПу

- 26 021600

10 15

Уа1 Шз Зег О1п Азр ΟΙη Ьеи Уа1О1и Зег С1у СНу О1у Уа| Уа101п 20 25 30

Рго СНу Агд Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег О1у РЬе ТЬг РЬе 35 40 45

Зег Зег Туг О1у Ме1 Ηίϊ Тгр Уа| Агд О1п А1а Рго О1у О1и О1у Ьеи 50 55 60

О1и Тгр Уа1 А1а Уа1 Пе Тгр Туг Азр С1у Зег Азп Ьуз Туг Туг А1а

70 75 80

Азр Зег Уа1 Ьуз О1у Агд РЬе ТЬг Не Зег Агд Азр Азп Зег Ьуз Азп

90 95

ТЬг Ьеи Туг Ьеи О1п МеС Азп Зег Ьеи Агд А1а С1и Азр ТЬг А1а Уа1 100 105 110

Туг Туг Суз А1а Агд О1у Азр Туг О1и Уа! Азр Туг О1у МеС Азр Уа1 115 120 125

Тгр С1у О1п О1у ТЬг ТЬг Уа1 ТЬг Уа1 А1а Зег А1а Зег ТЬг Ьуз С1у 130 135 140

Рго Зег Уа1 РЬе Рго Ьеи А1а Рго Зег Зег Ьуз Зег ТЬг Зег С1у О1у

145 150 155 160

ТЬг А1а А1а Ьеи О1у Суз Ьеи Уа1 Ьуз Азр Туг РЬе Рго О1и Рго Уа1

165 170 175

ТЬг Уа1 Зег Тгр Азп Зег С1у А1а Ьеи ТЬг Зег С1у Уа1 Шз ТЬг РЬе 180 185 190

Рго А1а Уа1 Ьеи О1п Зег Зег О1у Ьеи Туг Зег Ьеи Зег Зег Уа1 Уа1 195 200 205

ТЬг Уа1 Рго Зег Зег Зег Ьеи О1у ТЬг О1п ТЬг Туг Не Суз Азп Уа1 210 215 220

Азп Шз Ьуз Рго Зег Азп ТЬг Ьуз Уа1 Азр Ьуз Агд Уа1О1и Рго Ьуз

225 230 235 240

Зег Суз Азр Ьуз ТЬг Шз ТЬг Суз Рго Рго Суз Рго А1а Рго С1и Ьеи

245 250 255

Ьеи С1у С1у Рго Зег Уа1 РЬе Ьеи РЬе Рго Рго Ьуз Рго Ьуз Азр ТЬг 260 265 270

Ьеи МеС Не Зег Агд ТЬг Рго О1и Уа1 ТЬг Суз Уа1 Уа1 Уа1 Азр Уа1 275 280 285

Зег Шз О1и Азр Рго О1и Уа1 Ьуз РЬе Азп Тгр Туг Уа1 Азр О1у Уа1 290 295 300

С1и Уа1 Шз Азп А1а Ьуз ТЬг Ьуз Рго Агд О1и С1и С1п Туг Азп Зег

305 310 315 320

ТЬг Туг Агд Уа1 Уа1 Зег Уа1 Ьеи ТЬг Уа1 Ьеи Шз С1п Азр Тгр Ьеи

325 330 335

Азп О1у Ьуз СНи Туг Ьуз Суз Ьуз Уа1 Зег Азп Ьуз А1а Ьеи Рго А1а 340 345 350

Рго Пе СНи Ьуз ТЬг Не Зег Ьуз А1а Ьуз О1у О1п Рго Агд СНи Рго 355 360 365

С1п Уа1 Туг ТЬг Ьеи Рго Рго Зег Агд СНи СНи МеС ТЬг Ьуз Азп О1п 370 375 380

- 27 021600

Уа1 Зег Ьеи ТНг Суз Ьеи Уа1 Ьуз 01у РЬе Туг Рго Зег Азр Не А1а

385 390 395 400

Уа1 С1и Тгр С1и Зег Азп С1у О1п Рго О1и Азп Азп Туг Ьуз ТЬг ТЬг

405 410 415

Рго Рго Уа1 Ьеи Азр Зег Азр О1у Зег РЬе РЬе Ьеи Туг Зег Ьуз Ьеи 420 425 430

ТЬг Уа1 Азр Ьуз Зег Лгц Тгр С1п О1п С1у Азп Уа1 РЬе Зег Суз Зег 435 440 445

Уа1 Ме£ Н1з (Ни А1а Ьеи Шз Азп Из Туг ТЬг С1п Ьуз Зег Ьеи Зег 450 455 460

Ьеи Зег Рго О1у Ьуз

465

ЗЕОГОХе 12

Ме£ С1у Тгр Зег Суз Пе Пе Ьеи РЬе Ьеи Уа1 А1а ТЬг А1а ТЬг О1у 15 10 15

Уа! ΗΪ3 Зег А1а Пе О1п Ьеи ТЬг С1п Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег А1а 20 25 30

Зег Уа! С1у Азр Аг§ Уа1 ТЬг Не ТЬг Суз Аге: А1а Зег О1п С1у Пе 35 40 45

Зег Азп А1а Ьеи А1а Тгр Туг С1п С1п Ьуз Рго С1у Ьуз А1а Рго Ьуз 50 55 60

Ьеи Ьеи Пе Туг Азр А1а Зег Зег Ьеи О1и Зег С1у Уа1 Рго Зег Аг§

70 75 80

РЬе Зег С1у Зег С1у Зег С1у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Не Зег Зег

90 95

Ьеи О1п Рго О1и Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз О1п О1п РЬе Азп Зег 100 105 ПО

Туг Рго Тгр ТЬг РЬе О1у С1п О1у ТЬг Ьуз Уа] С1и Не Ьуз Аг§ ТЬг 115 120 125

Уа1 А1а А1а Рго Зег Уа1 РЬе Не РЬе Рго Рго Зег Азр О1и О1п Ьеи 130 135 140

Ьуз Зег С1у ТЬг А1а Зег Уа1 Уа1 Суз Ьеи Ьеи Азп Азп РЬе Туг Рго

145 150 155 160

Аг§ О1и А1а Ьуз Уа1 С1п Тгр Ьуз Уа1 Азр Азп А1а Ьеи О1п Зег О1у

165 170 175

Азп Зег СПп (Ни Зег Уа1 ТЬг <31и С1п Азр Зег Ьуз Азр Зег ТЬг Туг 180 185 190

Зег Ьеи Зег Зег ТЬг Ьеи ТЬг Ьеи Зег Ьуз А1а Азр Туг О1и Ьуз Шз 195 200 205

Ьуз Уа1 Туг А1а Суз О1и Уа1 ТЬг НЬз О1п О1у Ьеи Зег Зег Рго Уа1 210 215 220

ТЬг Ьуз Зег РЬе Азп Аг§ С1у О1и Суз

225 230

5ЕО1Р№13 агс£2а£ер£ са£§£а£са£ сс£П£1с(§ ц£а@саас£и, саас(ПЁац£ асаПсасац 60

- 28 021600 дассадсХдд £ддад£с£дд дддаддсдгд д£ссадсс£д §дадд£ссс£ дадас£с£сс 120 £д£дсадсд£ с£ддайсас сйсад1адс (а(ддса£дс ас£ддд4сс§ ссаддс£сса 180 ддсдаддддс £§дад£ддд£ ддсадйага £дд£а£да£д даад£аа£аа а£ас£а£дса 240 дас£ссд£да адддссдай сасса£с£сс ададасаай ссаадаасас ас£д1а£с1д 300 сааахдааса дсс£дададс сдаддасасд дс£д£д£ай ас£д£дсдад а§д(дас1ас 360 дадд£с§ас£ асадаагдда сдййддддс саадддасса сдд£сассд£ сдсс£садс( 420 адсассаадд ассса(с§д£ сйссссс£д дсассс£сс£ ссаададсас сййдддддс 480 асадсддссс (дддс£дсс£ ддхсааддас хасйссссд аассддгдас дд£д£сд£дд 540 аас£саддсд ссс£дассад сддсд£дсас ассйсссдд с£д£сс£аса д£сс£садда 600 с(сгас£ссс (садсадсд! дд1дассд(д сссХссадса дсйдддсас ссадассгас 660 а(с£дсаасд 1даа(сасаа дсссадсаас ассааад£дд асаададад£хдадсссааа 720 £сйд£даса ааасХсасас а£дсссассд (дсссадсас с(даас1сс( ддддддассд 780 тсад£сйсс Юйсссссс аааасссаад дасассс£са £да£с(сссд дасссстдад 840 д1саса!дсд £де£дс1д§а сдхдадссас даадассад а§д£саадй саас1дд£а£ 900 дХддасддсд 1ддадд1дса £аа£дссаад асааадссдс дддаддадса д(асаасадс 960 асд! ассд(д 1дд(садсд£ сс£сассд£с с£асассаа§ ас£ддс( даа Хддсааадад 1020 1асаад£дса адд£с£ссаа сааадссс(с ссадссссса 1сдадаааас саХсХссааа 1080 дссааадддс адссссдада ассасаддхд £асассс£дс сссса£сссд ддаддада£§ 1140 ассаадаасс аад£садсс£ дасс(дсс£§ д£саааддс£ £сга£сссад сдаса£сдсс 1200 д£ддад£ддд ааадсаа£дд дсадссддад аасаас£аса адассасдсс £сссд£дс£д 1260 дас£сс§ас§ дсхссйсй сс£с£айсс аадсхсассд гадасаадад садд1ддсад 1320 саддддаасд £сйс£са£д с£ссд£да£д са(даддс(с Хдсасаасса с£асасдсад 1380 аададсс£с£ ссс£д(с£сс дддсааа 1407

5ЕО1Р№ 14 а£ддда(дд£ са£д£а£са! ссй£йс£а дтаасаасхд саас£ддад£ асайсадсс 60 ахссадйда сссад£с!сс а£сс£ссс£д £с(дса!с£д (аддадасад ад£сасса£с 120 асйдссддд саадхсаддд сайадсаа! дсШаасс! дд£а£садса дааассаддд 180 ааадс(сс(а адс£сс£да£ с£а£да£дсс £ссад£йдд ааад£дддд£ ссса£саадд 240 Псадсддса д(дда£с(дд дасадаШс ас(с(сасса (садсадсс! дсадсс£даа 300 даййдсаа сйайас£д ХсаасадШ аа£адйасс сдгддасдй сддссааддд 360 ассааддхдд ааа£сааасд £дадйс£ад адда(сса£с £ддда£аадс агдсХдйй 420 с£д£с£д£сс с£ааса(дсс с£д£дайа£ ссдсааасаа сасасссаад ддсадаасй 480 £д££ас££аа асасса£сс£ дШдсйс! йсс£садда ас£д£ддс£д сасса£с£д£ 540 сйсагсйс ссдсса£с£д а(дадсадй дааа£с£дда ас£дсс£с£д йд(д£дсс£ 600 дс£даа£аас йс£а(ссса дададдссаа ад£асад£дд аадд£дда£а асдсссгсса 660 а£сддд£аас (сссаддада д£д£сасада дсаддасадс ааддасадса сс(асадсс£ 720 садсадсасс с£дасдс£да дсааадсада с£асдадааа сасааадСс! асдсс£дсда 780 ад£сассса£ садддсс(да дс(сдсссд£ сасааададс йсаасаддд дадад£д£ 838

5ЕО1Р№ 15

Ме£ О1у Рго О1у Уа1 Ьеи Ьеи Ьеи Ьеи Ьеи Уа1 А1а ТНг А1а Тгр Ηίδ

10 15

С1у О1п О1у Не Рго Уа1 Пе С1и Рго 8ег Уа1 Рго О1и Ьеи Уа1 Уа!

25 30

Ьуз Рго С1у А1а ТНг Уа1 ТНг Ьеи Агд Суз Уа1 С1у Азп С1у 8сг Уа1

- 29 021600

40 45

ΟΙιι Тгр Азр О1у Рго А1а Зег Рго Шз Тгр ТЬг Ьеи Туг Зег Азр СЬу 50 55 60

Зег Зег Зег Пе Ьеи Зег ТЬг Азп Азп А1а ТЬг РЬе С1п Азп ТЬг С1у

70 75 80

ТЬг Туг Агд Суз ТЬг О1и Рго О1у Азр Рго Ьеи О1у О1у Зег А1а А1а

90 95

Не ЬПз Ьеи Туг Уа1 Ьуз Азр Рго А1а Агд Рго Тгр Азп Уа1 Ьеи А1а 100 105 ПО

О1п О1и Уа1 Уа1 Уа1 РЬе С1и Азр О1п Азр А1а Ьеи Ьеи Рго Суз Ьеи 115 120 125

Ьеи ТЬг Азр Рго Уа1 Ьеи О1и А1а О1у Уа1 Зег Ьеи Уа! Агд Уа1 Агд 130 135 140

О1у Аг§ Рго Ьеи Мс( Агд Шз ТЬг Азп Туг Зег РЬе Зег Рго Тгр Шз

145 150 155 160

О1у РЬе ТЬг Не Шз Агд А1а Ьуз РЬе Пе О1п Зег О1п Азр Туг О1п

165 170 175

Суз Зег А1а Ьеи МеГ01у О1у Аг§ Ьуз Уа1 Мег Зег Не Зег Пе Агд 180 185 190

Ьеи Ьуз Уа! С1п Ьуз Уа1 Пе Рго С1у Рго Рго А1а Ьеи ТЬг Ьеи Уа1 195 200 205

Рго А1а О1и Ьеи Уа1 Агд Пе Агд О1у О1и А1а А1а С1п Пе Уа1 Суз 210 215 220

Зег А1а Зег Зег Уа1 Азр Уа1 Азп РЬе Азр Уа1 РЬе Ьеи О1п Шз Азп

225 230 235 240

Азп ТЬг Ьуз Ьеи А1а Не Рго О1п О1п Зег Азр РЬе Шз Азп Азп Агд

245 250 255

Туг О1п Ьуз Уа1 Ьеи ТЬг Ьеи Азп Ьеи Азр О1п Уа1 Азр РЬе О1п Шз 260 265 270

А1а <31у Азп Туг Зег Суз Уа1 А1а Зег Азп Уа] С1п С!у Ьуз Шз Зег 275 280 285

ТЬг Зег МеГ РЬе РЬе Агд Уа1 Уа101и Зег А1а Туг Ьеи Азп Ьеи Зег 290 295 300

Зег О1и С1п Азп Ьеи Пе С1п О1и Уа1 ТЬг Уа101у О1и О1у Ьеи Азп

305 310 315 320

Ьеи Ьуз Уа1 МеГ Уа1 О1и А1а Туг Рго О1у Ьеи С1п О1у РЬе Азп Тгр

325 330 335

ТЬг Туг Ьеи О1у Рго РЬе Зег Азр Шз С1п Рго С1и Рго Ьуз Ьеи А1а 340 345 350

Азп А1а ТЬг ТЬг Ьуз Азр ТЬг Туг Агд Шз ТЬг РЬе ТЬг Ьеи Зег Ьеи 355 360 365

Рго Агд Ьеи Ьуз Рго Зег С1и А1а С1у Агд Туг Зег РЬе Ьеи А1а Агд 370 375 380

Азп Рго О1у С1у Тгр Агд А1а Ьеи ТЬг РЬе О1и Ьеи ТЬг Ьеи Агд Туг

385 390 395 400

Рго Рго О1и Уа1 Зег Уа1 Пе Тгр ТЬг РЬе Пе Азп С1у Зег О1у ТЬг

405 410 415

- 30 021600

Ьеи Ьеи Суа А1а А1а Зег 01у Туг Рго С1п Рго Азп Уа1 ТНг Тгр Ьеи 420 425 430

О1п Суа Зег О1у Ηίδ ТЬг Аар Аг§ Суа Аар С1и А1а О1п Уа1 Ьеи О1п 435 440 445

Уа1 Тгр Аар Азр Рго Туг Рго О1и Уа[ Ьеи Зег О1п О1и Рго РЬе Ηίδ 450 455 460

Ьуз Уа1 ТЬг Уа101п Зег Ьеи Ьеи ТЬг Уа] С1и ТЬг Ьеи О1и Ηί3 Азп

465 470 475 480

С1п ТЬг Туг С1и Суа Аг§ А1а Из Азп Зег Уа1 С1у Зег С1у 8ег Тгр

485 490 495

А1а Иге Не Рго Пе Зег А1а О1у А1а ΗΪ3 ТЬг Ηίδ Рго Рго Азр О1и

500 505 510

РНе Ьеи РЬе ТНг Рго Уа1 Уа1 Уа1 А1а Суа Ме1 Зег Не МеГ А1а Ьеи 515 520 525

Ьеи Ьеи Ьеи Ьеи Ьеи Ьеи Ьеи Ьеи Ьеи Туг Ьуз Туг Ьуз О1п Ьуз Рго 530 535 540

Ьуз Туг О1п Уа1 Агц Тгр Ьуз Пе Пе О1и 8ег Туг <31 и О1у Азп 5ег

545 550 555 560

Туг ТЬг РЬе Пе Азр Рго ТЬг О1п Ьеи Рго Туг Азп О1и Ьуа Тгр О1и

565 570 575

РЬе Рго Агй Азп Азп Ьеи С1п РЬе С1у Ьуз ТЬг Ьеи С1у А1а С1у А1а 580 585 590

РЬе О1у Ьуз Уа1 Уа101и А1а ТЬг А1а РЬе (Ну Ьеи С1у Ьуз С1и Азр 595 600 605

А1а Уа1 Ьеи Ьуз Уа1 А1а Уа1 Ьуз МеГ Ьеи Ьуз Зег ТЬг А1а Н|з А1а 610 615 620

Азр О1и Ьуз С1и А1а Ьеи МеГ Зег О1и Ьеи Ьуз Пе МеГ Зег Из Ьеи

625 630 635 640

С1у О1п ΗΪ3 С1и Азп Не У а1 Азп Ьеи Ьеи (Ну А1а Суз ТЬг Ηίδ О1у

645 650 655

О1у Рго Уа1 Ьеи Уа1 Не ТЬг О1и Туг Суз Суз Туг СНу Азр Ьеи Ьеи 660 665 670

Азп РЬе Ьеи Аг§ Аге Ьуз А1а О1и А1а МеГ Ьеи С1у Рго Зег Ьеи Зег 675 680 685

Рго О1у О1п Азр Рго О1и О1у О1у Уа] Азр Туг Ьуз Азп Не Ηίδ Ьеи 690 695 700

С1и Ьуз Ьуз Туг Уа! Агд Аг§ Азр Зег С1у РЬе Зег Зег С1п С1у Уа1

705 710 715 720

Азр ТЬг Туг Уа1 (Ни МеГ Аг§ Рго Уа! Зег Ткг Зег Зег Азп Азр Зег

725 730 735

РЬе Зег О1и О1п Аар Ьеи Азр Ьуа О1и Азр О1у Аг§ Рго Ьеи О1и Ьеи 740 745 750

А и* Азр Ьеи Ьеи Ηίδ РЬе Зег Зег О1п Уа1 А1а О1п СНу МеГ А1а РЬе 755 760 765

Ьеи А1а Зег Ьуз Азп Суз Не Ηίδ Аг§ Азр Уа1 А1а А1а Лг§ Азп Уа1 770 775 780

Ьеи Ьеи ТЬг Азп О1у Ηίδ Уа1 А1а Ьуз Не С1у Азр Иге СНу Ьеи А1а

- 31 021600

785 790 795 800

Аг§ Азр Пе Ме1 Азп Азр Зег Азп Туг Не Уа1 Ьуз О1у Азп А1а Агц 805 810 815

Ьеи Рго Уа1 Ьуз Тгр Ме1 А1а Рго С1и Зег Пе РЬе Азр Суз Уа1 Туг 820 825 830

ТЬг Уа1 О1п Зег Азр Уа1 Тгр Зег Туг С1у Пе Ьеи Ьеи Тгр О1и Не 835 840 845

РЬе Зег Ьеи С1у Ьеи Азп Рго Тут Рго С1у Не Ьеи Уа1 Азп Зег Ьуз 850 855 860

РЬе Туг Ьуз Ьеи Уа1 Ьуз Азр О1у Туг О1п Ме1 А1а О1п Рго А1а РЬе

865 870 875 880

А1а Рго Ьуз Азп Пе Туг Зег Не Ме1 С1п А1а Суз Тгр А1а Ьеи О1и

885 890 895

Рго ТЬг Шз Аг§ Рго ТЬг РЬе О1п С1п Не Суз Зег РЬе Ьеи С1п О1и 900 905 910

С1п А1а О1п 01и Азр Аг§ Аг§ С1и Лг£ Азр Туг ТЬг Азп Ьеи Рго Зег 915 920 925

Зег Зег Аг§ Зег О1у 01у Зег О1у Зег Зег Зег Зег О1и Ьеи О1и С1и 930 935 940

О1и Зег Зег Зег С1и Шз Ьеи ТЬг Суз Суз О1и О1п О1у Азр Пе А1а 945 950 955 960

О1п Рго Ьеи Ьеи О1п Рго Азп Азп Туг С1п РЬе Суз

965 970

5ЕО1Р№ 16

Ме1 С1у Рго С1у Уа1 Ьеи Ьеи Ьеи Ьеи Ьеи Уа1 А1а ТЬг А1а Тгр Шз

10 15

О1у О1п О1у Пе Рго Уа1 Пе О1и Рго Зег Уа1 Рго О1и Ьеи Уа1 Уа1

25 30

Ьуз Рго О1у А1а ТЬг Уа1 ТЬг Ьеи Ага; Суз Уа101у Азп О1у Зег Уа1 35 40 45

О1и Тгр Азр О1у Рго Рго Зег Рго Шз Тгр ТЬг Ьеи Туг Зег Азр О1у 50 55 60

Зег Зег Зег Пе Ьеи Зег ТЬг Азп Азп А1а ТЬг РЬе С1п Азп ТЬг О1у

70 75 80

ТЬг Тут Аг£ Суз ТЬг О1и Рго С1у Азр Рго Ьеи О1у О1у Зег А1а А1а

90 95

Не Шз Ьеи Туг Уа1 Ьуз Азр Рго А1а Аг§ Рго Тгр Азп Уа1 Ьеи А1а 100 105 110

О1п О1и Уа1 Уа1 Уа1 РЬе О1и Азр О1п Азр А1а Ьеи Ьеи Рго Суз Ьеи 115 120 125

Ьеи ТЬг Азр Рго Уа1 Ьеи С1и А1а О1у Уа! Зег Ьеи Уа1 Аг§ Уа1 Аг§ 130 135 140

О1у Аг° Рго Ьеи Ме1 Аг§ Шз ТЬг Азп Туг Зег РЬе Зег Рго Тгр Шз

145 150 155 160

О1у РЬе ТЬг Пе Шз Аг£ А1а Ьуз РЬе Пе С1п Зег С1п Азр Туг С1п

165 170 175

- 32 021600

Суз Зег А1а Ьеи МеГ О1у 01у Агд Ьуз Уа1 Ме1 Зег Пе Зег Пе Агд 180 185 190

Ьеи Ьуз Уа1 СПп Ьуз Уа1 Не Рго О1у Рго Рго А1а Ьеи ТЬг Ьеи Уа1 195 200 205

Рго А1а С1и Ьеи Уа! Агд Пе Агд О!у СПи А1а А1а СПп Пе Уа! Суз 210 215 220

Зег А1а Зег Зег Уа! Азр Уа1 Азп РЬе Азр Уа1 РЬе Ьеи О1п Из Азп

225 230 235 240

Азп ТЬг Ьуз Ьеи А1а Не Рго С1п С1п Зег Азр РЬе ΗΪ5 Азп Азп Агд

245 250 255

Туг О1п Ьуз Уа1 Ьеи ТЬг Ьеи Азп Ьеи Азр О1п Уа1 Азр РЬе О1п Из 260 265 270

А1а СПу Азп Туг Зег Суз Уа1 А1а Зег Азп Уа1 СПп СПу Ьуз Из Зег 275 280 285

Зег СПи С1п Азп Ьеи Пе СПп СПи Уа1 ТЬг Уа1 СПу О1и СПу Ьеи Азп

305 310 315 320

Ьеи Ьуз Уа1 МеГ Уа! О1и А!а Туг Рго О1у Ьеи О1п О1у РЬе Азп Тгр

325 330 335

ТЬг Туг Ьеи (Ну Рго РЬе Зег Азр ΗΪ5 (Пп Рго О1и Рго Ьуз Ьеи А1а 340 345 350

Азп А1а ТЬг ТЬг Ьуз Азр ТЬг Туг Агд Из ТЬг РЬе ТЬг Ьеи Зег Ьеи 355 360 365

Рго Агд Ьеи Ьуз Рго Зег СПи А!а СПу Агд Туг Зег РЬе Ьеи А1а Агд 370 375 380

Азп Рго СПу СПу Тгр Агд А1а Ьеи ТЬг РЬе СПи Ьеи ТЬг Ьеи Агд Туг

385 390 395 400

Рго Рго (Ии Уа! Зег Уа1 Не Тгр ТЬг РЬе Пе Азп О1у Зег (Пу ТЬг

405 410 415

Ьеи Ьеи Суз А1а А!а Зег О1у Туг Рго С1п Рго Азп Уа1 ТЬг Тгр Ьеи 420 425 430

О1п Суз Зег О1у ΗΪ3 ТЬг Азр Агд Суз Азр СПи А!а СПп Уа! Ьеи О1п 435 440 445

Уа1 Тгр Азр Азр Рго Туг Рго С1и Уа1 Ьеи Зег С1п СПи Рго РЬе Ηί5 450 455 460

Ьуз Уа1 ТЬг Уа101п Зег Ьеи Ьеи ТЬг Уа! С)и ТЬг Ьеи С1и Из Азп

465 470 475 480

О1п ТЬг Туг СПи Суз Агд А1а Из Азп Зег Уа! О1у Зег О1у Зег Тгр

485 490 495

А1а РЬе Пе Рго Пе Зег А1а СПу А1а Из ТЬг Из Рго Рго Азр СПи 500 505 510

РЬе Ьеи РЬе ТЬг Рго Уа1 Уа1 Уа1 А1а Суз Мег Зег Ие Мег А1а Ьеи 515 520 525

Ьеи Ьеи Ьеи Ьеи Ьеи Ьеи Ьеи Ьеи Ьеи Туг Ьуз Туг Ьуз С1п Ьуз Рго 530 535 540

Ьуз Туг (Пп Уа! Агд Тгр Ьуз Пе Пе СПи Зег Туг О1и СПу Азп Зег

- 33 021600

545 550 555 560

Туг ТЬг РЬе Не Азр Рго ТЬг О1п Ьеи Рго Туг Азп 01ц Ьуз Тгр О1и 565 570 575

РЬе Рго Агд Азп Азп Ьеи С1п РЬе С1у Ьуз ТЬг Ьеи С1у А1а С1у А1а 580 585 590

РЬе С1у Ьуз Уа1 Уа1 С1и А1а ТЬг А!а РЬе С1у Ьеи С1у Ьуз С1и Азр 595 600 605

А1а Уа1 Ьеи Ьуз Уа1 А1а Уа1 Ьуз Ме[ Ьеи Ьуз Зег ТЬг А1а Н1з А1а 610 615 620

Азр О1и Ьуз О1и А1а Ьеи Мег Зег О1и Ьеи Ьуз Не Мег Зег Нгз Ьеи

625 630 635 640

О1у С1п Нгз С1и Азп Не Уа1 Азп Ьеи Ьеи С1у А1а Суз ТЬг ΗΪ5 С1у

645 650 655

О1у Рго Уа1 Ьеи Уа1 Не ТЬг С1и Туг Суз Суз Туг С1у Азр Ьеи Ьеи 660 665 670

Азп РЬе Ьеи Агд Агд Ьуз А1а О1и А1а МеГ Ьеи С1у Рго Зег Ьеи Зег 675 680 685

Рго О1у С1п Азр Рго О1и С1у О1у Уа1 Азр Туг Ьуз Азп Пе Н1з Ьеи 690 695 700

С1и Ьуз Ьуз Туг Уа1 Агд Агд Азр 8ег С1у РЬе 8ег 8ег С1п С1у Уа1

705 710 715 720

Азр ТЬг Туг Уа1 О1и Мег Агд Рго Уа! Зег ТЬг 8ег 5ег Азп Азр 8ег

725 730 735

РЬе Зег О1и О1п Азр Ьеи Азр Ьуз С1и Азр С1у Агд Рго Ьеи С1и Ьеи 740 745 750

Агд Азр Ьеи Ьеи Из РЬе 8ег 8ег О1п Уа! А1а О1п О1у МеГ А1а РЬе 755 760 765

Ьеи А1а Зег Ьуз Азп Суз Не ΗΪ3 Агд Азр Уа1 А1а А1а Агд Азп Уа1 770 775 780

Ьеи Ьеи ТЬг Азп О1у ΗΪ5 Уа1 А1а Ьуз Пе О1у Азр РЬе С1у Ьеи А1а

785 790 795 800

Агд Азр Пе МеГ Азп Азр 8ег Азп Туг Не Уа1 Ьуз О1у Азп А1а Агд

805 810 815

Ьеи Рго Уа1 Ьуз Тгр МеГ А1а Рго С!и 8ег Не РЬе Азр Суз Уа1 Туг 820 825 830

ТЬг Уа1 С1п Зег Азр Уа1 Тгр Зег Туг О1у Пе Ьеи Ьеи Тгр О1и Пе 835 840 845

РЬе Зег Ьеи О1у Ьеи Азп Рго Туг Рго О1у Пе Ьеи Уа1 Азп Зег Ьуз 850 855 860

РЬе Туг Ьуз Ьеи Уа1 Ьуз Азр О1у Туг О1п МеГ А1а С1п Рго А1а РЬе

865 870 875 880

А1а Рго Ьуз Азп Пе Туг Зег Пе Мег О1п А1а Суз Тгр А1а Ьеи С1и

885 890 895

Рго ТЬг ΗΪ5 Агд Рго ТЬг РЬе О1п С1п Пе Суз Зег РЬе Ьеи С1п С1и 900 905 910

О1п А1а О1п О1и Азр Агд Агд О1и Агд Азр Туг ТЬг Азп Ьеи Рго Зег 915 920 925

- 34 021600

Зег Зег Аг® Зег 01у 01у Зег О1у Зег Зег Зег Зег 01и Ьеи 01и 01и 930 935 940

С1и Зег Зег Зег О1и ΗΪ5 Ьеи ТЬг Суз Суз С1и С1п С1у Азр Пе А1а 945 950 955 960

О1п Рго Ьеи Ьеи О1о Рго Азп Азп Туг О1п РЬе Суз

965 970

ЗЕО1Р№ 17

МеГ ТЬг А1а Рго О1у А1а А1а О1у Аг® Суз Рго Рго ТЬг ТЬг Тгр Ьеи 15 10 15

О1у Зег Ьеи Ьеи Ьеи Ьеи Уа1 Суз Ьеи Ьеи А1а Зег Аг® Зег Не ТЬг 20 25 30

С1и О1и Уа1 Зег О1и Туг Суз Зег Шз МеГ Не С1у Зег С1у Шз Ьеи 35 40 45

С1п Зег Ьеи С1п Аг® Ьеи Пе Азр Зег С1п Ме1 С1и ТЬг Зег Суз С1п 50 55 60

Не ТЬг РЬе С1и РЬе Уа1 Азр О1п О1и О1п Ьеи Ьуз Азр Рго Уа1 Суз

70 75 80

Туг Ьеи Ьуз Ьуз А1а РЬе Ьеи Ьеи Уа1 С1п Азр Пе Ме1 С1и Азр ТЬг

90 95

Ме1 Аг® РЬе Аг® Азр Азп ТЬг Рго Азп А1а Пе А1а Пе Уа1 С1п Ьеи 100 105 110

С1п С1и Ьеи Зег Ьеи Аг® Ьеи Ьуз Зег Суз РЬе ТЬг Ьуз Азр Туг С1и 115 120 125

С1и Шз Азр Ьуз А1а Суз Уа1 Аг® ТЬг РЬе Туг С1и ТЬг Рго Ьеи О1п 130 135 140

Ьеи Ьеи О1и Ьуз Уа1 Ьуз Азп Уа1 РЬе Азп О1и ТЬг Ьуз Азп Ьеи Ьеи

145 150 155 160

Азр Ьуз Азр Тгр Азп Пе РЬе Зег Ьуз Азп Суз Азп Азп Зег РЬе А1а

165 170 175

О1и Суз Зег Зег О1п Азр Уа! Уа1 ТЬг Ьуз Рго Азр Суз Азп Суз Ьеи 180 185 190

Туг Рго Ьуз А1а Не Рго Зег Зег Азр Рго А1а Зег Уа1 Зет Рго Шз 195 200 205

О1п Рго Ьеи А1а Рго Зег Ме1 А1а Рго Уа1 А1а О1у Ьеи ТЬг Тгр С1и 210 215 220

Азр Зег О1и О1у ТЬг О1и О1у Зег Зег Ьеи Ьеи Рго С1у С1и С1п Рго

225 230 235 240

Ьеи Шз ТЬг Уа1 Азр Рго О1у Зег А1а Ьуз С1п Аг® Рго Рго Аг® Зег

245 250 255

ТЬг Суз С1п Зег РЬе С1и Рго Рго С1и ТЬг Рго Уа1 Уа1 Ьуз Азр Зег 260 265 270

ТЬг Пе О1у <31у Зег Рго О1п Рго Аг® Рго Зег Уа1 О1у А1а РЬе Азп 275 280 285

Рго О1у Мег С1и Азр Не Ьеи Азр Зег А1а Мег О1у ТЬг Азп Тгр Уа1 290 295 300

Рго С1и О1и А1а Зег С1у С1и А1а Зег С1и Пе Рго Уа1 Рго С1п С1у

- 35 021600

305 310 315 320

ТЬг О1и Ьеи Зег Рго Зег Агд Рго О1у О1у О1у Зег Ме10!п ТЬг О1и 325 330 335

Рго А1а Агд Рго Зег Азп РЬе Ьеи Зег А1а Зег Зег Рго Ьеи Рго А1а 340 345 350

Зег А1а Ьуз О1у О1п С1п Рго А1а Азр Уа1 ТЬг О1у ТЬг А1а Ьеи Рго 355 360 365

Агд Уа101у Рго Уа1 Агд Рго ТЬг О1у О1п Азр Тгр Азп Из ТЬг Рго 370 375 380

О1п Ьуз ТЬг Азр ΗΪ3 Рго Зег А1а Ьеи Ьеи Агд Азр Рго Рго О1и Рго

385 390 395 400

С1у Зег Рго Агд Не Зег Зег Ьеи Агд Рго О1п О1у Ьеи Зег Азп Рго

405 410 415

Зег ТЬг Ьеи Зег А1а О1п Рго О1п Ьеи Зег Агд Зег ЬЬз Зег Зег С1у 420 425 430

Зег Уа1 Ьеи Рго Ьеи О1у О1и Ьеи СНи О1у Агд Агд Зег ТЬг Агд Азр 435 440 445

Агд Агд Зег Рго А1а О1и Рго С1и О1у О1у Рго А1а Зег О1и С1у А1а 450 455 460

А1а Агд Рго Ьеи Рго Агд РЬе Азп Зег Уа1 Рго Ьеи ТЬг Азр ТЬг О1у

465 470 475 480

Шз О1и Агд О1п Зег СНи О1у Зег РЬе Зег Рго О1п Ьеи О1п С1и Зег

485 490 495

Уа1 РЬе ΗΪ5 Ьеи Ьеи Уа1 Рго Зег Уа1 Не Ьеи Уа1 Ьеи Ьеи А1а Уа1 500 505 510

О1у О1у Ьеи Ьеи РЬе Туг Агд Тгр Агд Агд Агд Зег ΗΪ3 О1п О1и Рго 515 520 525

О1п Агд А1а Азр Зег Рго Ьеи С1и СНп Рго С1и С1у Зег Рго Ьеи ТЬг 530 535 540

О1п Азр Азр Агд О1п Уа1 СНи Ьеи Рго Уа1

545 550

3ΕΟΙΡΝ» 18

МеТ Рго Агд С1у РЬе ТЬг Тгр Ьеи Агд Туг Ьеи С1у Не РЬе Ьеи О1у 15 10 15

Уа1 А1а Ьеи О1у Азп О1и Рго Ьеи О1и МеТ Тгр Рго Ьеи ТЬг О1п Азп 20 25 30

О1и О1и Суз ТЬг Уа1 ТЬг С1у РЬе Ьеи Агд Азр Ьуз Ьеи О1п Туг Агд 35 40 45

Зег Агд Ьеи С1п Туг Мет Ьуз №з Туг РЬе Рго Не Азп Туг Ьуз Не 50 55 60

Зег Уа1 Рго Туг СНи О1у Уа1 РЬе Агд Не А1а Азп Уа1 ТЬг Агд Ьеи

70 75 80

СНп Агд А1а О1п Уа1 Зег О1и Агд О1и Ьеи Агд Туг Ьеи Тгр Уа1 Ьеи

90 95

Уа! Зег Ьеи Зег А1а ТЬг С1и Зег Уа1 С1п Азр Уа1 Ьеи Ьеи СНи О1у 100 105 110

Шз Рго Зег Тгр Ьуз Туг Ьеи С1п О1и Уа] О1и ТЬг Ьеи Ьеи Ьеи Азп 115 120 125

Уа101п О1п О1у Ьеи ТЬг Азр Уа101и Уа1 Зег Рго Ьуз Уа101и Зег 130 135 140

Уа1 Ьеи Зег Ьеи Ьеи Азп А1а Рго С1у Рго Азп Ьеи Ьуз Ьеи Уа1 Агд

145 150 155 160

Рго Ьуз А1а Ьеи Ьеи Азр Азп Суз РЬе Агд Уа! МеТ О1и Ьеи Ьеи Туг

165 170 175

Суз Зег Суз Суз Ьуз О1п Зег Зег Уа1 Ьеи Азп Тгр О1п Азр Суз СНи 180 185 190

Уа1 Рго Зег Рго О1п Зег Суз Зег Рго С1и Рго Зег Ьеи С1п Туг А1а 195 200 205

А1а ТЬг О1п Ьеи Туг Рго Рго Рго Рго Тгр Зег Рго Зег Зег Рго Рго 210 215 220

Шз Зег ТЬг О1у Зег Уа1 Агд Рго Уа1 Агд А1а О1п О1у СНи СНу Ьеи 225 230 235 240

Ьеи Рго

- 36 021600

<110>	Эли Лили	Перечень последовательностей
энд 1	Компани
<120>	АНТИТЕЛА	К СЗЕ-1К
<130>	Х18903
<160>	18
<170>	РаСепНп	νθΓ3ίοη 3.5
<210> <211> <212> <213>	1 5 БЕЛОК Искусственная	последовательность
<220> <223>	Синтетическая	конструкция
<400>	1
Зег Туг С1у МеС 1	Н±5 5
<210> <211> <212> <213>	2 17 БЕЛОК Искусственная	последовательность
<220> <223>	Синтетическая	конструкция

<400> 2

Уа1 Не Тгр Туг Азр С1у Зег Азп Ьуз Туг Туг А1а Азр Зег Уа1 Ьуз 15 10 15

С1у <210> 3 <211> 11 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетическая конструкция <400> 3

С1у Азр Туг С1и Уа1 Азр Туг С1у Мет Азр Уа1 15 10 <210> 4 <211> 11 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

- 37 021600 <223> Синтетическая конструкция <400> 4

Агд А1а Зег С1п 51у Не Зег Азп А1а Ьеи А1а 15 10 <210> 5 <211> 7 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетическая конструкция <400> 5

Азр А1а Зег Зег Ьеи С1и Зег

5 <210> б <211> 9 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетическая конструкция <400 6

С1п С1п РНе Азп Зег Туг Рго Тгр ТЬг 1 5 <210> 7 <211> 120 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетическая конструкция <400> 7

С1п Αερ С1п Ьеи Уа1 С1и Зег С1у С1у С1у Уа1 Уа1 С1п Рго С1у Агд 15 10 15

Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег С1у РЬе ТЬг РЬе Зег Зег Туг 20 25 30 б1у МеН ΗΪ5 Тгр νδΐ Агд С1п А1а Рго О1у 01и С1у Ьеи О1и Тгр Уа1 35 40 45

А1а Уа1 Не Тгр Туг Азр С1у Зег Азп Ьуз Туг Туг А1а Азр Зег Уа1 50 55 60

Ьуз 61у Агд РЬе ТЬг Не Зег Агд Азр Азп Зег Ьуз Азп ТЬг Ьеи Туг 65 70 75 80

- 38 021600

Ьеи 61η. МеС Азп Зег	Ьеи Агд А1а	С1и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз
	85	90	95
А1а	Агд С1у Азр Туг	С1и Уа1 Азр Туг С1у МеЬ Азр Уа1 Тгр	С1у С1п
	100		105 НО
С1у	ТЬг ТЬг Уа1 ТЬг	Уа1 А1а Зег
	115	120
<210> 8
<211> 107
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 8
А1а	Не 61п Ьеи ТЬг	С1п Зег Рго	Зег Зег Ьеи Зег А1а Зег	Уа1 61у
1	5		10	15
Азр	Агд Уа1 ТЬг Не	ТЬг Суз Агд	А1а Зег С1п 61у Не Зег	Азп А1а
	20		25 30
Ьеи	А1а Тгр Туг 61п	С1п Ьуз Рго	61у Ьуз А1а Рго Ьуг Ьеи	Ьеи Не
	35	40	45
Туг	Азр А1а Зег Зег	Ьеи 61и Зег	61у Уа1 Рго Зег Агд РЬе	Зег С1у
	50	55	60
Зег	С1у Зег С1у ТЬг	Азр РЬе ТЬг	Ьеи ТЬг Не Зег Зег Ьеи	С1п Рго
65		70	75	80
61 и	Азр РЬе А1а ТЬг	Туг Туг Суз	61п С1п РЬе Азп Зег Туг	Рго Тгр
	85		90	95
ТЬг	РЬе 61у С1п 61у	ТЬг Ьуз Уа1	61и 11е Ьуз
	100		105
<210> Э
<211> 450
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 9
С1п	Азр 61п Ьеи Уа1	61и Зег С1у С1у С1у Уа1 Уа1 С1п Рго	01у Агд
1	5		10	15

- 39 021600

- 40 021600

Азр Рго СЬи	УаЬ Ьуз	РЬе	Азп	Тгр Туг 280	УаЬ Азр СЬу	УаЬ СЬи 285	УаЬ	НЬз
	275
Азп	А1а Ьуз	ТЬг Ьуз	Рго	Агд	СЬи С1и	СЬп Туг Азп	Зег ТЬг	Туг	Агд
	290			295		300
УаЬ	УаЬ Зег	УаЬ Ьеи	ТЬг	УаЬ	Ьеи НЬз	СЬп Азр Тгр	Ьеи Азп	СЬу	Ьуз
305			310			315			320
61и	Туг Ьуз	Суз Ьуз	УаЬ	Зег	АЗп Ьуз	АЬа Ьеи Рго	АЬа Рго	Пе	СЬи
		325				330		335
Ьуз	ТЬг Не	Зег Ьуз	АЬа	Ьуз	СЬу СЬп	Рго Агд СЬи	Рго СЬп	УаЬ	Туг
		340			345		350
ТЬг	Ьеи Рго	Рго Зег	Агд	СЬи	С1и МеС	ТЬг Ьуз Азп	СЬп УаЬ	Зег	Ьеи
	355				360		365
ТЬг	Суг Ьеи	УаЬ Ьуз	СЬу	РЬе	Туг Рго	Зег Азр Не	АЬа УаЬ	С1и	Тгр
	370			375		330
С1и	Зег Азп	СЬу СЬп	Рго	СЬи	Азп Азп	Туг Ьуз ТЬг	ТЬг Рго	Рго	УаЬ
385			390			395			400
Ьеи	Азр Зег	Азр С1у	Зег	РЬе	РЬе Ьеи	Туг Зег Ьуз	Ьеи ТЬг	УаЬ	Азр
		405				410		415
Ьуз	Зег Агд	Тгр СЬп	СЬп	СЬу	Азп УаЬ	РЬе Зег Суз	Зег УаЬ	ней	НЬз
		420			425		430
СЬи	А1а Ьеи	НЬз Азп	НЬз	Туг	ТЬг СЬп	Ьуз Зег Ьеи	$ег Ьеи	Зег	Рго
	435				440		445
СЬу	Ьуз
	450
<2Ь0> 10
<211> 214
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220
<223> Синтетическая конструкция
<400> 10
АЬа	Не СЬп	Ьеи ТЬг	СЬп	Зег	Рго Зег	Зег Ьеи Зег	АЬа Зег	УаЬ	СЬу

10 15

- 41 021600

Азр

Агд

У ,71 ТНг 20

Не

ТНг

Суз Агд А1а Зег С1п С1у Не Зег Азп

АЬа

25

30

Ьеи

А1а

Тгр

Туг

С1п

Ьуз

Рго

С1у

Ьуз

АЬа

Рго

Ьуз

Ьеи

Не

35

40

45

Туг

Азр

АЬа

Зег

Ьеи

СЬи

Зег

С1у

Уа1

Рго

Зег

Агд

РЬе

Зег

С1у

50

55

60

Бег

С1у

Зег

СЬу

ТЬг

Азр

РНе

ТНг

Ьеи

ТНг

Не

Зег

Ьеи

С1п

Рго

65

70

75

80

СЬи

Азр

РНе

А1а

ТЬг

Туг

Суз

С1п

РНе

Азп

Зег

Туг

Рго

Тгр

85

90

95

ТНг

РНе

01у

С1п

Е1у

ТНг

Ьуз

Уа1

С1и

Не

Ьуэ

Агд

ТНг

Уа1

АЬа

А1а

100

105

но

Рго

Зег

Уа1

РНе

Не

РНе

Рго

Зег

Азр

С1и

С1п

Ьеи

Ьуз

Зег

СЬу

115

120

125

ТНг

АЬа

Зег

Уа1

Суз

Ьеи

Азп

АЗП

РНе

Туг

Рго

Агд

СЬи

АЬа

130

135

140

Ьуз

Уа1

С1п

Тгр

Ьуз

Уа1

Азр

Азп

А1а

Ьеи

С1п

Зег

С1у

Азп

Зег

С1п

145

150

155

160

СЬи

Зег

Уа1

ТНг

С1и

С1п

Азр

Зег

Ьуз

Азр

Зег

ТНг

Туг

Зег

Ьеи

Зег

165

170

175

Зег

ТНг

Ьеи

ТНг

Ьеи

Зег

Ьуз

АЬа

Азр

Туг

С1и

Ьуз

ΗΪ3

Ьуз

Уа1

Туг

180

185

190

А1а

Суз

СЬи

Уа1

ТНг

Н1з

С1п

61у

Ьеи

Зег

Рго

Уа1

ТЬг

Ьуз

Зег

195

200

205

РНе

Азп

Агд

С1у

61и

Суз

210 <210> 11 <211> 469 <212> БЕЛОК

<213>	Искусственная	последовательность
<220> <223>	Синтетическая	конструкция
<400>	11
Мер С1у Тгр Зег Суз	11е 11е Ьеи РЬе	Ьеи	Уа1 АЬа ТНг АЬа ТНг С1у
1	5		10	15

- 42 021600

- 43 021600

Ьеи МеЕ

Не 275

Зег Агд

ТЬг

Рго

С1и УаХ ТЬг Су5 \7а1 УаХ УаХ Азр УаХ

280

285

Зег

Нхз

С1и

Азр

Рго

С1и

7а1

Ьуз

РЬе

Азп

Тгр

Туг

Уа1

Агр

СХу

7аХ

290

295

300

С1и

УаХ

Ηίδ

Азп

АХа

Ьуз

ТЬг

Ьуз

Рго

Агд

СХи

СХп

Туг

Азп

Зег

305

310

315

320

ТЬг

Туг

Агд

УаХ

Уа1

Зег

УаХ

Ьеи

ТЬг

УаХ

Ьеи

ΗΪ3

СХп

Азр

Тгр

Ьеи

325

330

335

Αδη

СХу

Ьуз

СХи

Туг

Ьуз

Суз

Ьуз

УаХ

Зег

Азп

Ьуз

АХа

Ьеи

Рго

АХа

340

345

350

Рго

Не

СХи

Ьуз

ТЬг

Не

Зег

Ьуз

АХа

Ьуз

С1у

С1п

Рго

Агд

СХи

Рго

355

360

365

СХп

УаХ

Туг

ТЬг

Ьеи

Рго

Зег

Агд

СХи

МеЕ

ТЬг

Ьуз

Азп

С1п

370

375

330

УаХ

Зег

Ьеи

ТЬг

Суз

Ьеи

УаХ

Ьуз

СХу

РЬе

Туг

Рго

Зег

Азр

Не

А1а

385

390

395

400

Уа1

СХи

Тгр

СХи

Зег

Азп

СХу

СХп

Рго

С1и

Азп

Туг

Ьуз

ТЬг

405

410

415

Рго

νβΐ

Ьеи

Азр

Зег

Азр

СХу

Зег

РЬе

Ьеи

Туг

Зег

Ьуз

Ьеи

420

425

430

ТЬг

7а1

Азр

Ьуз

Зег

Агд

Тгр

СХп

СХу

Азп

\7а1

РЬе

Зег

Суз

Зег

435

440

445

Уа1

МеЕ

Нхз

СХи

АХа

Ьеи

Нхз

Азп

Нхз

Туг

ТЬг

СХп

Ьуз

Зег

Ьеи

Зег

450

455

460

Ьеи

Зег

Рго

СХу

Ьуз

465 <210> 12 <211> 233 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетическая конструкция <400> 12

- 44 021600

МеГ С1у Тгр Зег Суз Не 11е Ьеи РЬе Ьеи Уа! АЬа ТЬг АЬа ТЬг СЬу 15 10 15

Уа1 Шз Зег А1а 11е С1п Ьеи ТЬг С1п Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег А1а 20 25 30

Зег Уа1 С1у Азр Агд Уа1 ТЬг 11е ТЬг Суз Агд А1а Зег С1п С1у 11е 35 40 45

Зег Азп А1а Ьеи А1а Тгр Туг СЬп СЬп Ьуз Рго С1у Ьуз АЬа Рго Ьуз 50 55 60

Ьеи Ьеи 11е Туг Азр АЬа Зег Зег Ьеи СЬи Зег СЬу УаЬ Рго Зег Агд 65 70 75 80

РЬе Зег С1у Зег СЬу Зег СЬу ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг 11е Зег Зег 85 90 95

Ьеи С1п Рго С1и Азр РЬе АЬа ТЬг Туг Туг Суз С1п С1п РЬе Азп Зег 100 105 110

Туг Рго Тгр ТЬг РЬе С1у С1п С1у ТЬг Ьуз Уа1 С1и Не Ьуз Агд ТЬг 115 120 125

Уа1 А1а А1а Рго Зег Уа1 РЬе 11е РЬе Рго Рго Зег Азр С1и С1п Ьеи 130 135 140

Ьуз Зег С1у ТЬг АЬа Зег УаЬ Уа1 Суз Ьеи Ьеи Азп Азп РЬе Туг Рго 145 150 155 160

Агд С1и А1а Ьуз Уа1 СЬп Тгр Ьуз УаЬ Азр Азп А1а Ьеи СЬп Зег С1у 165 ПО 175

Азп Зег О1п СЬи Зег УаЬ ТЬг С1и С1п Азр Зег Ьуз Азр Зег ТЬг Туг 180 185 190

Зег Ьеи Зег Зег ТЬг Ьеи ТЬг Ьеи Зег Ьуз АЬа Азр Туг С1и Ьуз НЬз 195 200 205

Ьуз УаЬ Туг АЬа Суз СЬи УаЬ ТЬг Н1з СЬп СЬу Ьеи Зег Зег Рго УаЬ 210 215 220

ТЬг Ьуз Зег РЬе Агп Агд СЬу С1и Суз 225 230 <210> 13 <211> 1407 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность

- 45 021600 <220>

<223> Синтетическая конструкция <400> 13

аРдддаРддР саРдРаРсаР ссРРРРРсРд дРадсаасРд саасРддадР асаРРсасад	60
дассадсРдд РддадРсРдд дддаддсдрд дРссадссРд ддаддРсссР дадасРсРсс	120
рдрдсадсдр срддаррсас сррсадрадс рарддсардс асрдддРссд ссаддсрсса	180
ддсдаддддс РддадРдддР ддсадРРаРа РддРаРдаРд даадРааРаа арасрардса	240
дасРссдРда адддссдаРР сассаРсРсс ададасааРР ссаадаасас асРдраРсРд	300
саааРдааса дссРдададс сдаддасасд дсРдРдРаРР асРдРдсдад аддРдасРас	360
даддРсдасР асддаардда сдРсРддддс саадддасса сддрсассдр сдссРсадсР	420
адсассаадд дсссаРсддР сРРсссссРд дсасссРссР ссаададсас сРсРдддддс	480
асадсддссс РдддсрдссР ддРсааддас РасРРссссд аассддрдас ддрдрсдрдд	540
аасРсаддсд сссРдассад сддсдрдсас ассРРсссдд сРдРссРаса дРссРсадда	600
сРсРасРссс РсадсадсдР ддрдассдрд сссрссадса дсРРдддсас ссадассРас	660
аРсРдсаасд РдааРсасаа дсссадсаас ассааддрдд асаадададр Рдадсссааа	720
РсРРдРдаса ааасРсасас аРдсссассд Рдсссадсас сРдаасРссР ддддддассд	780
РсадРсРРсс РсРРсссссс аааасссаад дасасссРса РдаРсРсссд дассссрдад	840
дРсасаРдсд РддРддРдда сдрдадссас даадасссРд аддРсаадРР саасРддРаР	900
дрддасддсд РддаддРдса РааРдссаад асааадссдс дддаддадса дРасаасадс	960
асдРассдРд РддРсадсдР ссРсассдРс сРдсассаад асРддсРдаа Рддсааддад	1020
РасаадРдса аддРсРссаа сааадсссРс ссадссссса Рсдадаааас саРсРссааа	1080
дссааадддс адссссдада ассасаддрд РасасссРдс ссссаРсссд ддаддадаРд	1140
ассаадаасс аадРсадссР дассРдссРд дРсаааддсР РсРаРсссад сдасаРсдсс	1200
дрддадрддд ададсааРдд дсадссддад аасаасРаса адассасдсс РсссдРдсРд	1260
дасРссдасд дсРссРРсРР ссРсРаРРсс аадсРсассд Рддасаадад саддрддсад	1320
саддддаасд РсРРсРсаРд сРссдРдаРд саРдаддсРс Рдсасаасса сРасасдсад	1380
аададссРсР сссРдРсРсо дддсааа	1407

<210> 14 <211> 838 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<22 3> Синтетическая конструкция <400> 14 аРдддаРддР саРдРаРсаР ссРРРРРсРа дРадсаасРд саасРддадР асаРРсадсс 60

- 46 021600

аЪссадЪЬда	сссадСсЬсс	аЬссЬсссЬд	ЬсСдса'ЬсЬд	Ьаддадасад	адбсассаЬс	120
асЬЬдссддд	саадЬсаддд	са!£адсаа1:	дсМьСадссЬ	дд£а1:садса	дааассаддд	180
ааадсЪссЬа	адсЪссЬда£	сЪа£да1:дсс	Сссад£££дд	ааад£ддддЪ	ссса£саадд	240
СЛсадсддса	д£дда1:сЬдд	дасадаЪЬЬс	асСсЬсасса	ЬсадсадссЬ	дсадссЬдаа	300
даЪЪЬЬдсаа	сСЬаЬСасЬд	СсаасадЬЬЬ	ааЬадЬЪасс	сд£ддасд£С	сддссааддд	360
ассааддЬдд	аааСсааасд	ЬдадСХсЬад	аддаЬссаЬс	£дддаЬаадс	аЬдсЬдЬЬЬЬ	420
с!д£с£д1:сс	с£ааса£дсс	с1д£да£Са£	ссдсааасаа	сасасссаад	ддсадаасЫ:	480
ЬдЫзасЬЬаа	асассаЪссЪ	дЬССдсЬЬсЪ	ььссЪсадда	ас£д£ддс£д	сассаЪсЪдЬ	540
сЬИсаСсЪСс	ссдссаЬсЬд	аЬдадсадЪЪ	даааЬсЬдда	асЪдссЬсЬд	ЪЪдЪдЬдссЬ	Й00
дс€даа£аас	££с£аСссса	дададдссаа	адЪасадЪдд	ааддСддаСа	асдсссЪсса	660
аЪсдддЬаас	Ъсссаддада	дЪдЬсасада	дсаддасадс	ааддасадса	сс^асадссХ	720
садсадсасс	с£дасдсСда	дсааадсада	сЪасдадааа	сасааад^сс	асдссСдсда	780
адЪсасссаЬ	садддссЬда	дсЬсдсссдЬ	сасааададс	£Ъсаасаддд	дададЪдЪ	838

<210> 15 <211> 972 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетическая конструкция <400> 15

МеЬ С1у 1

Рго

С1у

Уа1 Ьеи Ьеи Ьеи Ьеи Ьеи Уа1 А1а ТЬг А1а Тгр НЬз

5

10

15

С1у

С1п

сьу

11е

Рго

Уа1

11е

С1и

Рго

Зег

Уа1

Рго

С1и

Ьеи

Уа1

20

25

30

Ьуз

Рго

61у

А1а

ТЬг

Уа1

ТЬг

Ьеи

Агд

Суз

Уа1

СЬу

Азп

С1у

Зег

Уа1

35

40

45

61и

Тгр

Азр

С1у

Рго

А1а

Зег

Рго

Н1з

Тгр

ТЬг

Ьеи

Туг

Зег

Азр

СЬу

50

55

60

Зег

11е

Ьеи

Зег

ТЬг

Азп

ДЬа

ТЬг

РЬе

С1п

Азп

ТЬг

СЬу

65

70

75

80

ТЬг

Туг

Агд

Суз

ТЬг

С1и

Рго

<31у

Азр

Рго

Ьеи

С1у

61у

Зег

А1а

АЬа

85

90

95

Не

ΗΪΞ

Ьеи

Туг

Уа1

Ьуз

Азр

Рго

АЬа

Агд

Рго

Тгр

АЗП

Уа1

Ьеи

АЬа

100

105

110

- 48 021600

- 49 021600

Азр СЬи Ьуз СЬи АЬа Ьеи МеН Зег 625 630

СЬи Ьеи Ьуз ЬЬе МеН Зег НЬз Ьеи 635 640

СЬу С1п НЬз СЬи Азп Не УаЬ Азп 645

Ьеи Ьеи СЬу АЬа Суз ТЬг НЬз СЬу 650 655

СЬу Рго УаЬ Ьеи УаЬ Не ТЬг СЬи 660

Туг Суз Суз Туг СЬу Азр Ьеи Ьеи 665 670

Азп РЬе Ьеи Агд Агд Ьуз А1а СЬи 675 680

АЬа МеН Ьеи СЬу Рго Зег Ьеи Зег 685

Рго СЬу СЬп Азр Рго СЬи СЬу СЬу 690 695

УаЬ Азр Туг Ьуз Азп 1Ье НЬз Ьеи 700

СЬи Ьуз Ьуз Туг УаЬ Агд Агд Азр 705 710

Зег СЬу РЬе Зег Зег СЬп СЬу УаЬ 715 720

Азр ТЬг Туг УаЬ СЬи МеН Агд Рго 725

Уа1 Зег ТЬг Зег Зег Азп Азр Зег 730 735

РЬе Зег С1и СЬп Азр Ьеи Азр Ьуз 740

С1и Азр СЬу Агд Рго Ьеи СЬи Ьеи 745 750

Агд Азр Ьеи Ьеи ΗΪ5 РЬе Зег Зег 755 760

СЬп УаЬ АЬа СЬп СЬу МеН АЬа РЬе 765

Ьеи АЬа Зег Ьуз Азп Суз ЬЬе НЬз 770 775

Агд Азр УаЬ АЬа АЬа Агд Азп УаЬ 780

Ьеи Ьеи ТЬг Азп СЬу НЬз УаЬ АЬа 785 790

Ьуз Ые СЬу Азр РЬе СЬу Ьеи АЬа 795 800

Агд Азр ЬЬе МеН Аэп Азр Зег Азп 805

Туг ЬЬе УаЬ Ьуз СЬу Азп АЬа Агд 810 815

Ьеи Рго УаЬ Ьуз Тгр МеН АЬа Рго 820

СЬи Зег Ые РЬе Азр Суз УаЬ Туг 825 830

ТЬг УаЬ СЬп Зег Азр УаЬ Тгр Зег 835 840

Туг СЬу 11е Ьеи Ьеи Тгр СЬи Ые 845

РЬе Зег Ьеи СЬу Ьеи Азп Рго Туг 850 855

Рго СЬу Ые Ьеи УаЬ Азп Зег Ьуз 860

РЬе Туг Ьуз Ьеи УаЬ Ьуз Азр СЬу 865 870

Туг СЬп МеН АЬа СЬп Рго АЬа РЬе 875 880

- 50 021600

АЬа Рго

Ьуз

Азп

Не 885

Туг

Зег

Не

Ме£ С1п А1а Суз 890

Тгр

А1а

Ьеи 695

С1и

Рго

ТЬг

НЬз

Агд

Рго

ТЬг

РЬе

С1п

61η

Не

Суз

Бег

РЬе

Ьеи

С1п

СЬи

900

905

ЭЮ

01п

А1а

61п

С1и

Азр

Агд

01и

Агд

Азр

Туг

ТЬг

Азп

Ьеи

Рго

Бег

915

920

925

Зег

Бег

Агд

Бег

С1у

Бег

С1у

Зег

$ег

Бег

С1и

Ьеи

С1и

СЬи

930

935

940

С1и

Бег

Зег

Бег

С1и

НЬз

Ьеи

ТЬг

Суз

С1и

СЬп

С1у

Азр

Не

АЬа

945

950

955

960

С1п

Рго

Ьеи

С1п

Рго

АЗП

АЗЫ

Туг

С1п

РЬе

Суз

965 970 <210> 16 <211> 972 <212> БЕЛОК

<213> Ното

зар±епз

<4оо> :

16

МеЬ

СЬу

Рго

С1у

Уа1

Ьеи

Уа1

А1а

ТЬг

А1а

Тгр

ΗΪΞ

1

5

10

15

С1у

С1п

СЬу

11е

Рго

ν&ι

11е

СЬи

Рго

5ег

Уа1

Рго

С1и

Ьеи

Уа1

ν₉1

20

25

30

Ьуз

Рго

СЬу

А1а

ТЬг

Уэ1

ТЬг

Ьеи

Агд

Суз

Уа1

С1у

Азп

51у

Зег

Уа1

35

40

45

СЬи

Тгр

Азр

51у

Рго

Зег

Рго

Η15

Тгр

ТЬг

Ьеи

Туг

Зег

Азр

61у

50

55

60

Бег

Пе

Ьеи

Зег

ТЬг

Азп

А1а

ТЬг

РЬе

С1п

Азп

ТЬг

61у

65

70

75

80

ТЬг

Туг

Агд

Суз

ТЬг

С1и

Рго

СЬу

Азр

Рго

Ьеи

С1у

Зег

А1а

85

90

95

11е

НЬз

Ьеи

Туг

Уа1

Ьуз

Азр

Рго

А1а

Агд

Рго

Тгр

Азп

Уа1

Ьеи

А1а

100

105

но

СЬп

СЬи

УаЬ

Уа1

РЬе

СЬи

Азр

С1п

Азр

А1а

Ьеи

Рго

Суз

Ьеи

115

120

125

- 51 021600

- 52 021600

Азп Рго СЬу СЬу Тгр Агд АЬа Ьеи 385 390

Ткг Рке СЬи Ьеи Ткг Ьеи Агд Туг 395 400

Рго Рго СЬи УаЬ Зег УаЬ Не Тгр 405

Ткг Рке Не Азп С1у Зег СЬу Ткг 410 415

Ьеи Ьеи Суз АЬа АЬа Ног СЬу Туг 420

Рго СЬп Рго Азп УаЬ Ткг Тгр Ьеи 425 430

СЬп Суз Зег СЬу НЬз Ткг Азр Агд 435 440

Суз Азр СЬи АЬа СЬп УаЬ Ьеи СЬп 445

УаЬ Тгр Азр Азр Рго Туг Рго СЬи 450 455

УаЬ Ьеи Зег СЬп СЬп Рго Рке НЬз 460

Ьуз УаЬ Ткг УаЬ СЬп Зег Ьеи Ьеи 465 470

Ткг УаЬ СЬи Ткг Ьеи СЬи НЬз Азп 475 480

СЬп Ткг Туг С1и Суз Агд АЬа НЬз 485

Азп Зег УаЬ СЬу Зег СЬу Зег Тгр 490 495

АЬа Рке Не Рго Не Зег АЬа СЬу 500

АЬа НЬз Ткг НЬз Рго Рго Азр С1и 505 510

Рке Ьеи Рке Ткг Рго УаЬ УаЬ УаЬ 515 520

АЬа Суз МеЬ Зег 11е Мек АЬа Ьеи 525

Ьеи Ьеи Ьеи Ьеи Ьеи Ьеи Ьеи Ьеи 530 535

Ьеи Туг Ьуз Туг Ьуз СЬп Ьуз Рго 540

Ьуз Туг СЬп УаЬ Агд Тгр Ьуз ЬЬе 545 550

11е СЬи Зег Туг СЬи СЬу Азп Зег 555 560

Туг Ткг Рке ЬЬе Азр Рго Ткг СЬп 565

Ьеи Рго Туг Азп С1и Ьуз Тгр С1и 570 575

Рке Рго Агд Азп Азп Ьеи СЬп Рке 580

СЬу Ьуз Ткг Ьеи СЬу АЬа СЬу АЬа 585 590

Рке СЬу Ьуз УаЬ УаЬ СЬи АЬа Ткг 595 600

АЬа Рке СЬу Ьеи СЬу Ьуз С1и Азр 605

АЬа УаЬ Ьеи Ьуз УаЬ АЬа УаЬ Ьуз 610 615

Мек Ьеи Ьуз Зег Ткг АЬа НЬз АЬа 620

Азр С1и Ьуз С1и АЬа Ьеи Мек Зег 625 630

С1и Ьеи Ьуз 11е Мек Зег НЬз Ьеи 635 640

- 53 021600

СЬу СЬп НЬз СЬи Азп Не УаЬ Азп 645

Ьеи Ьеи СЬу АЬа Суз ТЬг НЬз СЬу 650 655

СЬу Рго УаЬ Ьеи УаЬ Не ТНг СЬи 660

Туг Суз Суз Туг СЬу Азр Ьеи Ьеи 665 670

Азп РЬе Ьеи Агд Агд Ьуз АЬа СЬи 675 680

АЬа Мер Ьеи СЬу Рго Зег Ьеи Зег 685

Рго СЬу СЬп Азр Рго СЬи СЬу СЬу 690 695

УаЬ Азр Туг Ьуз Азп 11е НЬз Ьеи 700

СЬи Ьуз Ьуз Туг УаЬ Агд Агд Азр 705 710

Зег СЬу РЬе Зег Зег СЬп СЬу УаЬ 715 720

Азр ТЬг Туг УаЬ СЬи Мер Агд Рго 725

УаЬ Зег ТЬг Зег Зег Азп Азр Зег 730 735

РЬе Зег СЬи СЬп Азр Ьеи Азр Ьуз 740

СЬи Азр СЬу Агд Рго Ьеи СЬи Ьеи 745 750

Агд Азр Ьеи Ьеи НЬз РЬе Зег Зег 755 760

СЬп УаЬ АЬа СЬп СЬу Мер АЬа РЬе 765

Ьеи АЬа Зег Ьуз Азп Суз Не НЬз 770 775

Агд Азр УаЬ АЬа АЬа Агд Азп УаЬ 780

Ьеи Ьеи ТЬг Азп СЬу НЬз УаЬ АЬа 785 7Э0

Ьуз 11е СЬу Азр РЬе СЬу Ьеи АЬа 795 800

Агд Азр ЬЬе Мер Азп Азр Зег Азп 305

Туг 11е УаЬ Ьуз СЬу Азп АЬа Агд 810 815

Ьеи Рго УаЬ Ьуз Тгр Мер АЬа Рго 820

СЬи Зег 11е РЬе Азр Суз Уа1 Туг 825 830

ТЬг УаЬ СЬп Зег Азр УаЬ Тгр Зег 835 340

Туг С1у 11е Ьеи Ьеи Тгр С1и 11е 845

РЬе Зег Ьеи СЬу Ьеи Азп Рго Туг 850 855

Рго СЬу 11е Ьеи УаЬ Азп Зег Ьуз 860

РЬе Туг Ьуз Ьеи УаЬ Ьуз Азр СЬу 865 870

Туг С1п Мер АЬа С1п Рго А1а РЬе 875 880

АЬа Рго Ьуз Азп Ые Туг Зег 11е 835

Мер СЬп АЬа Суз Тгр АЬа Ьеи СЬи 890 895

- 54 021600

Рго

ТЬг

ΗΪ3

Агд Рго ТЬг 900

РЬе

С1п

СЬп 905

11е Суз Зег

РЬе

Ьеи 910

С1п

<31и

СЬп

АЬа

СЬп

С1и

Азр

Агд

61и

Агд

Азр

Туг

ТЬг

Азп

Ьеи

Рго

Зес

915

920

925

Ёег

Зег

Агд

Зег

61у

<31у

Зег

61у

Зег

01и

Ьеи

СЬи

С1и

930

935

940

С1и

Зег

О1и

Н1з

Ьеи

ТЬг

Суз

С1и

С1п

61у

Азр

Не

А1а

945

950

955

960

С1п

Рго

Ьеи

С1п

Рго

Азп

Туг

С1п

РЬе

Суз

965 970 <210> 17 <211> 554 <212> БЕЛОК

<213> Ното

зартепз

<400> :

ί7

МеС

ТЬг

А1а

Рго

СЬу

А1а

СЬу

Агд

Су5

Рго

ТЬг

Тгр

Ьеи

1

5

10

15

СЬу

Зег

Ьеи

νβΐ

Суз

Ьеи

А1а

Зег

Агд

Зег

Не

ТЬг

20

25

30

С1и

СЬи

7а 1

Зег

СЬи

Туг

Суз

Зег

ΗΪ3

МеС

11е

СЬу

Зег

СЬу

НЬз

Ьеи

35

40

45

СЬп

Зег

Ьеи

СЬп

Агд

Ьеи

Не

Азр

Зег

С1п

МеС

СЬи

ТЬг

Зег

Суз

СЬп

50

55

60

Не

ТЬг

РЬе

СЬи

РЬе

7а1

Азр

СЬп

СЬи

СЬп

Ьеи

Ьуз

Азр

Рго

Уа1

Суз

65

70

75

80

Туг

Ьеи

Ьуз

А1а

РЬе

Ьеи

Уа1

С1п

Азр

Не

МеС

СЬи

Азр

ТЬг

35

90

95

МеС

Агд

РЬе

Агд

Азр

Азп

ТЬг

Рго

Азп

А1а

Не

АЬа

Не

Уа1

С1п

Ьеи

100

105

110

С1п

СЬи

Ьеи

Зег

Ьеи

Агд

Ьеи

Ьуз

Зег

Суз

РЬе

ТЬг

Ьуз

Азр

Туг

СЬи

115

120

125

СЬи

ΗΪΞ

Азр

Ьуз

А1а

Суз

ν₉ι

Агд

ТЬг

РЬе

Туг

С1и

ТЬг

Рго

Ьеи

С1п

130

135

140

- 55 021600

Ьеи Ьеи 61и Ьуз Уа1 Ьуз Азп УаЬ РЬе Азп СЬи ТЬг Ьуз Азп Ьеи Ьеи 145 150 155 160

Азр Ьуз Азр Тгр Азп Не РЬе Зег Ьуз Азп Суз Азп Азп Зег РЬе АЬа 165 170 175

СЬи Суз Зег Зег СЬп Азр УаЬ УаЬ ТЬг Ьуз Рго Азр Суз Азп Суз Ьеи 180 185 190

Туг Рго Ьуз АЬа 11е Рго Зег Зег Азр Рго АЬа Зег УаЬ Зег Рго Шз 195 200 205

СЬп Рго Ьеи АЬа Рго Зег МеС АЬа Рго УаЬ А1а СЬу Ьеи ТЬг Тгр СЬи 210 215 220

Азр Зег СЬи СЬу ТЬг СЬи СЬу Зег Зег Ьеи Ьеи Рго СЬу СЬи СЬп Рго 225 230 235 240

Ьеи НЬз ТЬг УаЬ Азр Рго СЬу Зег А1а Ьуз СЬп Агд Рго Рго Агд Зег 245 250 255

ТЬг Суз СЬп Зег РЬе СЬи Рго Рго СЬи ТЬг Рго УаЬ УаЬ Ьуз Азр Зег 260 265 270

ТЬг Не 61у СЬу Зег Рго СЬп Рго Агд Рго Зег УаЬ С1у А1а РЬе Азп 275 280 285

Рго С1у МеС 61и Азр Не Ьеи Азр Зег АЬа МеС СЬу ТЬг Азп Тгр УаЬ 290 295 300

Рго СЬи СЬи АЬа Зег СЬу С1и АЬа Зег С1и Не Рго УаЬ Рго С1п С1у 305 310 315 320

ТЬг С1и Ьеи Зег Рго Зег Агд Рго С1у СЬу С1у Зег МеС СЬп ТЬг СЬи 325 330 335

Рго А1а Агд Рго Зег Азп РЬе Ьеи Бег АЬа Зег Зег Рго Ьеи Рго А1а 340 345 350

Зег А1а Ьуз СЬу С1п СЬп Рго А1а Азр УаЬ ТЬг С1у ТЬг А1а Ьеи Рго 355 360 365

Агд УаЬ 61у Рго Уа1 Агд Рго ТЬг СЬу С1п Азр Тгр Азп НЬз ТЬг Рго 370 375 ЗЭО

СЬп Ьуз ТЬг Азр НЬз Рго Зег АЬа Ьеи Ьеи Агд Азр Рго Рго СЬи Рго 385 390 395 400

- 56 021600

61у

Зег

Рго Агд

11е Зег Зег Ьеи Агд Рго <31п С1у Ьеи. Зег Азп Рго

405

410

415

Зег

ТЬг

Ьеи

Зег

АЬа

СЬп

Рго

СЬп

Ьеи

Зег

Агд

Зег

ΗΪ3

Зег

С1у

420

425

430

Зег

УаЬ

Ьеи

Рго

Ьеи

СЬу

СЬи

Ьеи

СЬи

СЬу

Агд

Зег

ТЬг

Агд

Азр

435

440

445

Агд

Зег

Рго

АЬа

СЬи

Рго

СЬи

СЬу

Рго

АЬа

Зег

СЬи

СЬу

А1а

450

455

4 60

АЬа

Агд

Рго

Ьеи

Рго

Агд

РЬе

Азп

Зег

УаЬ

Рго

Ьеи

ТЬг

Азр

ТЬг

С1у

465

470

475

430

ΗΪ5

СЬи

Агд

СЬп

Зег

СЬи

СЬу

Зег

РЬе

Зег

Рго

СЬп

Ьеи

СЬп

СЬи

Зег

485

490

495

УаЬ

РЬе

НЬз

Ьеи

УаЬ

Рго

Зег

УаЬ

ЬЬе

Ьеи

УаЬ

Ьеи

АЬа

Уа1

500

505

510

СЬу

Ьеи

РЬе

Туг

Агд

Тгр

Агд

Зег

НЬз

СЬп

СЬи

Рго

515

520

525

СЬп

Агд

АЬа

Агр

Зег

Рго

Ьеи

СЬи

СЬп

Рго

СЬи

СЬу

Зег

Рго

Ьеи

ТЬг

530

535

540

СЬп

Азр

Агд

СЬп

УаЬ

СЬи

Ьеи

Рго

УаЬ

545 550 <210> 18 <211> 242 <212> БЕЛОК

<213>

Ното

зарЬепэ

<400>

18

МеЬ

Рго

Агд

СЬу

РЬе

ТЬг

Тгр

Ьеи

Агд

Туг

Ьеи

С1у

Не

РЬе

Ьеи

С1у

1

5

10

15

УаЬ

А1а

Ьеи

СЬу

Азп

С1и

Рго

Ьеи

С1и

МеЪ

Тгр

Рго

Ьеи

ТЬг

С1п

Азп

20

25

30

СЬи

С1и

Суз

ТЬг

Уа1

ТЬг

С1у

РЬе

Ьеи

Агд

Азр

Ьуз

Ьеи

СЬп

Туг

Агд

35

40

45

Зег

Агд

Ьеи

СЬп

Туг

МеЪ

Ьу5

ΗΪ5

Туг

РЬе

Рго

11е

Азп

Туг

Ьу5

11е

50

55

60

Зег

Уа1

Рго

Туг

С1и

С1у

Уа1

РЬе

Агд

11е

АЬа

Азп

Уа1

ТЬг

Агд

Ьеи

- 57 021600

65

70

75

80

С1п

Агд

А1а

С1п

УаЬ

Зег

СЬи

Агд

СЬи

Ьеи

Агд

Туг

Ьеи

Тгр

УаЬ

Ьеи

85

90

95

Уа1

Зег

Ьеи

Зег

АЬа

ТЬг

СЬи

Зег

УаЬ

СЬп

Азр

УаЬ

Ьеи

СЬи

СЬу

100

105

110

ΗΪ5

Рго

Зег

Тгр

Ьуз

Туг

Ьеи

С1п

СЬи

УаЬ

б1и

ТЬг

Ьеи

Азп

115

120

125

Уа1

С1п

СЬу

Ьеи

ТЬг

Азр

Уа1

СЬи

УаЬ

Зег

Рго

Ьуз

УаЬ

СЬи

Зег

130

135

140

ν_θι

Ьеи

Зег

Ьеи

Азп

А1а

Рго

31у

Рго

Азп

Ьеи

Ьуз

Ьеи

УаЬ

Агд

145

150

155

160

Рго

Ьуз

А1а

Ьеи

Азр

Азп

Суз

РЬе

Агд

УаЬ

МеЬ

61и

Ьеи

Туг

165

170

175

Суз

5ег

Суз

Ьуз

СЬп

Зег

УаЬ

Ьеи

Азп

Тгр

СЬп

Азр

Суз

СЬи

130

185

190

Уа1

Рго

Зег

Рго

СЬп

Зег

Суз

Зег

Рго

СЬи

Рго

Зег

Ьеи

СЬп

Туг

АЬа

195

200

205

АЬа

ТЬг

С1п

Ьеи

Туг

Рго

Тгр

Зег

Рго

Зег

Рго

210

215

220

НЬз

Зег

ТЬг

СЬу

Зег

УаЬ

Агд

Рго

УаЬ

Агд

А1а

СЬп

СЬу

СЬи

СЬу

Ьеи

225

230

235

240

Ьеи Рго

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Антитело или его фрагмент, которые специфически связываются с вариантом С8Р-1К человека (8ЕЦ ГО N0: 15), содержащие

СГОКН1. имеющий последовательность 8УСМН (8ЕЦ ГО N0: 1),

СИКН2, имеющий последовательность У1\\'¥1)С.8\к¥¥Л1)8УКС, (81 У) ГО N0: 2),

СИКН3, имеющий последовательность ОУЕУОУСМЭУ (8ЕЦ ГО N0: 3),

СИЛЫ, имеющий последовательность КА8ОС18УАБА (8ЕЦ ГО N0: 4),

СПКЬ2, имеющий последовательность ИА88ЬЕ8 (8ЕЦ ГО N0: 5), и

СПКЬ3, имеющий последовательность 00Ж8УР\¥Т (8ЕЦ ГО N0: 6).
2. Антитело или его фрагмент по п.1, содержащее

УЪ, имеющую последовательность аминокислот:

ΑΙ(ΚΤ05Ρ98ί5Α8νθΟΚνΤ1Τ€ΚΑ30(;ΐ3ΝΑίΑ\\Υ09ΚΡΟΚΑΡΚ1ΕΙΥΟΑ58ίΕ3Ο νΡ8ΚΡ8Ο866ΟΊΊ)ΡΤί_ΤΙ88Εί)ΡΕΟΡΑΤΥΥΕ()(}ΕΝΚΥΡ\νΤΡΟ<ΧϊΓΚνΕΙΚ (5Е0 Ιϋ N0:8),

УН, имеющую последовательность аминокислот:

р0()ЬЧЕ8000УУ9РОК8ЬКЕ8САА8СРТГ88УОМтУУ1ЩАРСЕ0ЬЕ\¥УАУ1\УУ0 ΟδΝΚΥΥΑΟενΚΟΚΡΌδΚΟΝδΚΝΤΕΥίΟΝΡΝδΕΚΑΕΟτΑνΥΥεΑϋΟΟΥΕνΟΥΟΜΟ ν\ΥΟΚ)ΟΤΤντνΑδ (КЕ(3 ГО N0:7).
3. Антитело или его фрагмент по любому из пп.1 или 2, содержащие тяжелую цепь, имеющую последовательность аминокислот 8ЕЦ ГО N0: 9, и легкую цепь, имеющую последовательность аминокислот 81 У) ГО N0: 10.
4. Антитело или его фрагмент по любому из пп.1-3, содержащие две тяжелые цепи, каждая из которых имеет последовательность аминокислот 8ЕЦ ГО N0: 9, и две легкие цепи, каждая из которых имеет последовательность аминокислот 8ЕЦ ГО N0: 10.
5. Фармацевтическая композиция для лечения лейкоза, карциномы эндометрия, карциномы молочной железы и карциномы предстательной железы, содержащая антитело или его фрагмент по любому из пп.1-4 в сочетании с фармацевтически приемлемой основой, растворителем или наполнителем.
6. Фармацевтическая композиция по п.5, также содержащая дополнительный фармацевтический агент, выбранный из доцетаксела, паклитаксела, герцептина® или доксорубицина.

- 58 021600
7. Применение антитела или его фрагмента по любому из пп.1-4 для изготовления лекарственного средства для лечения рака, выбранного из лейкоза, карциномы эндометрия, карциномы молочной железы и карциномы предстательной железы.
8. Применение антитела или его функционального фрагмента по любому из пп.1-4 в качестве лекарственного препарата для лечения рака, выбранного из лейкоза, карциномы эндометрия, карциномы молочной железы и карциномы предстательной железы.
9. Способ лечения рака, выбранного из лейкоза, карциномы эндометрия, карциномы молочной железы и карциномы предстательной железы, включающий введение антитела или его функционального фрагмента по любому из пп.1-4, где указанное антитело или его фрагмент вводят перед, во время, по существу, одновременно или после начала терапии другим противораковым средством.
10. Способ по п.9, где указанное противораковое средство выбирают из группы, состоящей из антиангиогенного агента, химиотерапевтического агента и антинеопластического агента.
11. Способ по п.10, где указанный антинеопластический агент выбирают из группы, состоящей из доцетаксела, паклитаксела, герцептина® и доксорубицина.
12. Способ определения, является ли субъект, страдающий раком, кандидатом на противораковую терапию с применением анти-С8Р-1К антител, где указанное антитело представляет собой антитело по любому из пп.1-4, при этом указанный способ включает определение уровня С8Р-1 или 1Ь-34 или их обоих, ех νίνο или ίη νίίΓΟ в пробе пациента, причем указанную пробу выбирают из группы, состоящей из крови, сыворотки, плазмы, клеток опухоли и циркулирующих клеток опухоли, при этом повышение уровня С8Р-1 или 1Ь-34 или их обоих по сравнению с уровнем С8Р-1 или 1Ь-34 или их обоих у лиц, не страдающих раком, указывает на то, что указанный субъект является кандидатом на противораковую терапию с применением анти-С8Р-1К антител.