EA019517B1 - Антитела к tyrp1 и их применение - Google Patents

Abstract

Согласно изобретению предложены полностью человеческие антитела и химерные антитела, которые связываются с антигеном TYRP1 человека с аффинностью, сравнимой или выше чем для ТА99, антитело мыши, специфичное к TYRP1. Согласно изобретению также предложены полинуклеиновые кислоты и клетки-хозяева, кодирующие и экспрессирующие указанные антитела. Кроме того, согласно изобретению предложены способы изменения активности TYRP1, лечения роста раковых клеток, а также лечения злокачественной меланомы у животных путем введения эффективного количества антитела, самостоятельно или в комбинации с противораковым агентом или лечением.

Description

Область техники

Настоящее изобретение относится к антителам человека и химерным антителам, в том числе к их фрагментам или частям, специфичным к тирозиназазависимому белку-1 (ТУКР1) человека. Указанные антитела применяют для лечения роста раковых клеток, самостоятельно или в комбинации с антинеопластическим агентом или лечением.

Уровень техники

Тирозиназазависимый белок-1 (ТУКР1) человека, также известный как др75 (\УО 91/14775) (8ЕС Ш N0: 28) представляет собой меланосомальный мембранный гликопротеин, участвующий в биосинтезе меланина. Данный белок обнаружен преимущественно в меланосомах меланоцитов, а также, как обнаружено, экспрессирован на поверхности клеток меланоцитов и меланом человека.

ТУКР1-антиген является высокоиммуногенным. Антитела и Т-клетки к ТУКР1 были выявлены при меланоме пациентов. Вероятно, что как клеточный, так и гуморальный ответы эффективны для устранения меланомы ίη νίνο. Адаптивный перенос меланома-реактивных Т-клеток также приводит к регрессии опухоли. Ответ антител, индуцированный ТУКР1-вакциной, также может подавлять рост меланомы и метастазирование у животных.

Несмотря на то что изучено множество различных вариантов лечения меланомы, низкомолекулярные ингибиторы, средства химиотерапии, иммунотерапии, в том числе вакцины (например, патент США 6168946), генную терапию/иммуностимуляторы и антиангиогены, в настоящее время не существует эффективных способов лечения больных меланомой. Чрезвычайно оправдана разработка новых способов лечения для данных неудовлетворенных потребностей медицины.

Исследования на животных позволили обнаружить антитело ТА99. ТА99 (1дС2а) представляет собой моноклональное антитело мыши (МЛЬ), специфичное к ТУКР1 человека и мыши, локализуется на подкожной меланоме человека ίη νίνο. См. источник \УеН с1 а1., Ргос. ΝαίΙ. Лсаб. 8сг ϋδΆ, 84:4200-4204 (1987) и патент США 4798790. Лечение ТА99 подавляло рост опухоли и метастазирование у мышей. См. ТакесЫ е1 а1., С1ш Сапсег Ке8. 2:1837-42 (1996).

Мыши, которым вводили ТА99, часто теряли окраску шерсти (депигментация) предположительно из-за разрушения меланоцитов кожи. Активация эффектора, опосредуемая Рс-рецептором, вероятно, играет критическую роль в элиминировании клеток, на которые направлено действие ТА99. Противоопухолевый эффект ТА99 был значительно ослаблен в мышах с выключенным геном РсК. См. С1упек е1 а1., Ргос. №111. Лсаб. 8сг ϋδΆ, 95:652-656 (1998). Тем не менее, мышиная природа ТА99 может быть препятствием для применения их для людей вследствие потенциальной иммуногенности, и, следовательно, способность указанных антител вызывать активацию иммунных эффекторных функций в прямом направлении (бо\\п51геат) может быть ограничена.

Таким образом, существует необходимость создания альтернативных антител к ТУКР1, эффективных для лечения меланомы. Согласно настоящему изобретению предложены альтернативные антитела к ТУКР1, которые эффективны для лечения меланомы.

Кроме того, существует необходимость создания альтернативных антител к ТУКР1, которые имеют улучшенную связывающую способность по отношению к ТУКР1 по сравнению с известными в данной области антителами. Согласно настоящему изобретению предложены альтернативные антитела к ТУКР1, которые имеют улучшенную связывающую способность по отношению к ТУКР1 по сравнению с известными антителами.

Существует также необходимость создания антител к ТУКР1, которые имеют сниженную иммуногенность для людей и улучшенную способность к активации иммунных эффекторных функций в прямом направлении, таких как антителозависимая клеточная цитотоксичность (ЛОСС). Согласно настоящему изобретению предложены химерные антитела и антитела человека к ТУКР1, которые, по сравнению с известными антителами, имеют сниженную иммуногенность для людей и улучшенную способность к активации иммунных эффекторных функций в прямом направлении, таких как антителозависимая клеточная цитотоксичность (ЛОСС).

Также остается необходимость создания альтернативных антител к ТУКР1, которые имеют повышенную стабильность за счет сокращения неправильной укладки белка и некорректного процессинга. Предпочтительные антитела согласно настоящему изобретению имеют улучшенную стабильность за счет сокращения неправильной укладки белка и некорректного процессинга.

- 1 019517

Краткое описание изобретения

Настоящее изобретение относится к человеческим или химерным моноклональным антителам или их фрагментам, которые связываются с антигеном меланомы ΤΥΚΡ1 (8ЕС ГО N0: 28).

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения предложено моноклональное антитело, которое специфически связывается с ΤΥΒΡ1 человека, с константой диссоциации К_с при комнатной температуре в лаборатории (20-25°С), находящейся в диапазоне от 0,1х10^-9 до 1,6х10^-9 М, при этом значения указанной К_с определены методом поверхностного плазмонного резонанса. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения указанное моноклональное антитело является химерным или человеческим. Фрагменты таких антител, сохраняющие способность специфически связываться с ΤΥΚΡ1 человека, являются частью изобретения, даже если константы диссоциации для таких фрагментов не находятся в указанном диапазоне.

Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения моноклональное антитело специфически связывается с ΤΥΚΡ1 человека с К_с, составляющей от приблизительно 0,1х10^-9 до приблизительно 1,2х10^-9 М, от приблизительно 0,1х10^-9 до приблизительно 0,8х10^-9 М, от приблизительно 0,1х10^-9 до приблизительно 0,4х10^-9 М, от приблизительно 0,2х10^-9 до приблизительно 1,2х10^-9 М, от приблизительно 0,2х10^-9 до приблизительно 0,8х10^-9 М, от приблизительно 0,2х10^-9 до приблизительно 0,4х10^-9 М, от приблизительно 0,2х 10^-9 до приблизительно 0,3 х 10^-9 или приблизительно 0,28х 10^-9 М.

Согласно одному из вариантов настоящего изобретения предложено антитело или его фрагмент, связывающийся с ΤΎΒΡ1, содержащие СОВН1, имеющую последовательность ΟΎΤΕΤδΥΛΜΝ (8ЕС ΙΌ N0: 1), СОВН2, имеющую последовательность \νΙ\Τ\Τ(.ι\ΡΊΎΛΟ(.ιΕΤ(.ι (8ЕС ΙΌ N0: 2), 0ΌΕΗ3. имеющую последовательность ΚΥδδδ^ΥΕΌΥ (8ЕС ΙΌ N0: 3), СГОВБЕ имеющую последовательность ΚΑ§ρ§ν88ΥΕΆ (8ЕС ΙΌ N0: 4), С0ВБ2, имеющую последовательность ^Α8NΒΑΤ (8ЕС ГО N0: 5), и С0ВБ3, имеющую последовательность ΟΡ^δ^ΥΕ-ΜΥΤ (8ЕС ΙΌ N0: 6), при этом указанное антитело дополнительно содержит замену аминокислот в одной из указанных последовательностей СОВ. Согласно другому варианту реализации указанные выше СОВ не содержат замену аминокислот в одной из последовательностей СОВ. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения указанное антитело, содержащее указанные выше СОВ, специфически связывается с ΤΥΒΡ1 человека с константой диссоциации К_с в диапазоне от 0,1 х10^-9 до 1,6х10^-9 Μ.

Согласно другому варианту настоящего изобретения указанное антитело или его фрагмент, специфически связывающийся с ΤΥΒΡ1, содержащие СОВН1, имеющую последовательность ΟΕ^ΧΟΥΤ^ (8ЕС ГО N0: 7), СОВН2, имеющую последовательность VINΡ^N6NΤVΥ^ΡКΕ^6 (8ЕС ГО N0: 8), СОВН3, имеющую последовательность ΌΥΤΥΕΚ.ΛΛΕΌΥ (8ЕС ГО N0: 9), СОВБ1, имеющую последовательность ΒΑ8СNIΥNΥ^Α (8ЕС ГО N0: 10), СОВБ2, имеющую последовательность ΌΛΚ.ΤΕΛΌ (8ЕС ГО N0: 11), и СОВБ3, имеющую последовательность 0ΗΕ\ν8ΕΡΕΤ (8ЕС ГО N0: 12), дополнительно содержат замену аминокислот в одной из указанных последовательностей СОВ. Согласно другому варианту реализации указанные выше СОВ (8ЕС ГО N0: 7-12) не содержат замен аминокислот.

Согласно другому варианту настоящего изобретения предложено антитело или его фрагмент, который связывается с ΤΥΒΡ1 и содержит ν_Ε, имеющий последовательность: Е17ЬТ03РАТЬЗЬЗРСЕРАТЬ5СЕА503УЗЗУЬАНУ00КР&2АРКЬЪ1УОА5НКАТС1РАКГЗС 363СТ0ГТЬТ133ЬЕРЕЦЕА7УУС00КЗЫИЬМУТГС0СТКЬЕ1К (ЗЕО Ю N0:16) ν_Η, имеющий последовательность:

ΟνατνοεεΞΕΙ,ΚΚΡΚΑΞνΚΙ ЗСКАЗСУТГТЗУАМЫИЧВДАРООСЬЕСМСШНТЦТСЫРТУАОСРТСНГ УГЗМОТЗУЗТАУЬОТЗЗЬКАЕЭТАТУУСАРКУЗЗЗИУЬОУКСССТЬУТУЗЗ (ЗЕО Ю N0:13) или

0ν<2Ι,νθ3Ο3ΕΕΚΚΡαΑ5νΚΙ3ΟΚΑ3εΥΤΕ’Τ3ΥΑΜΝΗνΚΰΑΡε<23Ι,Ε3ΜΕΜΙΝΤΝΤΕΝΡΤΥΑΟ<3Ε^,ΤΰΚΕ’ УГЗМОТЗУЗТАУЬОТЗЗЬКАЕОТАТУУСАРКУЗЗЗКУШУИСОбТЬУТУЗЗ (ΞΕ<2 Ю N0:14) .

Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения предложено моноклональное антитело, содержащее тяжелую цепь в соответствии с 8ЕС ГО N0: 29 и легкую цепь в соответствии с 8ЕС ГО N0: 32 или тяжелую цепь в соответствии с 8ЕС ГО N0: 30 и легкую цепь в соответствии с 8ЕС ГО N0: 32. Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения антитело содержит две тяжелые цепи в соответствии с 8ЕС ГО N0: 29 и две легкие цепи в соответствии с 8ЕС ГО N0: 32 или содержит две тяжелые цепи в соответствии с 8ЕС ГО N0: 30 и две легкие цепи в соответствии с 8ЕС ГО N0: 32. Связывающиеся с ΤΥΒΡ1 фрагменты таких антител являются частью настоящего изобретения.

Настоящее изобретение также относится к изолированным ДНК, кодирующим указанные антитела и их части. Другие варианты реализации настоящего изобретения включают изолированную полинуклеиновую кислоту, содержащую последовательность нуклеотидов, кодирующих антитело согласно изобретению или его фрагмент; вектор экспрессии, содержащий указанную последовательность нуклеотидов, связанную с последовательностью экспрессии, или рекомбинантную клетку-хозяина, содержащую

- 2 019517 указанный вектор экспрессии, или рекомбинантную клетку-хозяина или ее потомство, при этом в указанной клетке экспрессировано антитело согласно изобретению или его фрагмент. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения предложен способ получения или очистки антитела или его фрагмента, включающий культивирование указанных клеток в условиях, способствующих экспрессии антитела согласно изобретению или его фрагмента.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способам подавления роста раковых клеток и способам лечения меланомы у всех млекопитающих путем введения эффективного количества антитела. Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения предложено применение описанных ранее антител или их фрагментов в качестве лекарственного средства. Согласно другому варианту описанные ранее антитела или их фрагменты должны быть применены при лечении рака, включающего, но не ограничивающегося, злокачественную меланому.

Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения предложено применение антитела согласно изобретению для производства лекарственного средства для лечения рака. Согласно предпочтительному варианту реализации рак представляет собой злокачественную меланому.

Указанные антитела могут быть применены самостоятельно или в комбинации с антинеопластическим агентом или лечением. Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения предложено применение описанных ранее антител в комбинации с дополнительным противораковым агентом или лечением. Согласно другому варианту противораковый агент представляет собой дакарбазин.

Подробное описание изобретения

Согласно настоящему изобретению предложены человеческие и химерные антитела и их фрагменты, специфичные к антигену ТУКР1, а также последовательности изолированных или очищенных полинуклеотидов, кодирующих указанные антитела. Антитела согласно настоящему изобретению могут быть применены для лечения неопластических заболеваний, включая солидные и несолидные опухоли, а также для лечения гиперпролиферативных расстройств. Термин антитело включает фрагменты, связывающиеся с ТУКР1, если не указано иное. Параметры связывания в данном описании относятся к полноразмерным антителам, а не к фрагментам, которые будут обязательно иметь различные параметры связывания ввиду различного размера указанных фрагментов.

Существующие в природе антитела, как правило, имеют две идентичные тяжелые цепи и две идентичные легкие цепи, при этом каждая легкая цепь ковалентно связана с тяжелой цепью дисульфидной связью между цепями. Две тяжелые цепи соединены между собой множеством дисульфидных связей. Употребляемый в данном описании термин антитело включает молекулы иммуноглобулина, содержащие 4 полипептидные цепи: две тяжелые (Н) и две легкие (Ь), соединенные между собой дисульфидными связями. Отдельные цепи могут быть свернуты в домены, имеющие сходные размеры (110-125 аминокислот) и структуры, но различные функции.

Легкая цепь может содержать один вариабельный домен (обозначенный в данном описании аббревиатурой У) и/или один константный домен (обозначенный в настоящем описании аббревиатурой СД. Легкие цепи антител (иммуноглобулинов) представляют собой легкие цепи каппа (к) или лямбда (λ). Выражение в данном описании включает вариабельные участки легких цепей как каппа-типа (У_к), так и лямбда-типа (ν_λ). Константный участок легкой цепи состоит из одного домена, С_ь.

Тяжелая цепь может также содержать один вариабельный домен (обозначенный в данном описании аббревиатурой У_н) и/или, в зависимости от класса или изотипа антитела, три или четыре константных домена (СН1, СН2, СН3 и СН4) (вместе обозначенные в данном описании аббревиатурой СН). У человека такими изотипами являются: 1дА, Ι§Ό, 1дЕ, 1дС и 1дМ, при этом 1дА и 1дС дополнительно подразделяют на подклассы и подтипы (1дА_1-2 и 1дО_1-4). Настоящее изобретение включает антитела, относящиеся к любому из указанных выше классов или подклассов (изотипов). 1дС| человека является предпочтительным изотипом антител согласно настоящему изобретению.

Как правило, вариабельные домены демонстрируют значительные различия в аминокислотных последовательностях для разных антител, в частности, по расположению антигенсвязывающего сайта. В каждом Уь и У_н найдены три участка, называемые гипервариабельными, или участками, определяющими комплементарность (СЭВ), которые окружены менее вариабельными участками, называемыми каркасными участками (ЕВ). Аминокислоты относятся к конкретному СЭВ-участку или домену в соответствии с системой Кабата (КаЬаР с1 а1., Апп. ΝΥ Асай. 8сг 190:382-93 (1971); КаЬаР с1 а1., ^сцнснссь οί РгсИснъ οί 1тншпо1ощса1 1п1ете81, 5^4Ь Εάίΐίοη, И.8. ОсрайтсгИ οί Нса11й апй Нитап 8егу1се5, ΝΙΗ РиЫюайоп Νο. 91-3242 (1991)). Каждая У_н и У_ь состоит из трех СОВ и четырех ЕВ, организованных в направлении от аминоконца к карбоксиконцу в следующем порядке: ЕВ1-СЭВ1-ЕВ2-СПВ2-ЕВ3-СОВ3ЕВ4.

Часть антитела, состоящая из У_ъ и У_н доменов, обозначена Εν (Етадтеп! уапаЫе, вариабельный фрагмент) и образует антигенсвязывающий сайт. Одиночная цепь Εν (^Εν) представляет собой фрагмент антитела, содержащий домен У и домен У_н на одной полипептидной цепи, при этом Ν-конец одного домена и С-конец другого домена соединены гибким линкером (см., например, патент США № 4946778 (Ьайпег е1 а1.); \УО 88/09344 (нн^Юп е1 а1.); \УО 92/01047 (МсСаГГейу е1 а1.) описывает дисплей 5сЕу

- 3 019517 фрагментов на поверхности растворимых рекомбинантных генетических упаковок для дисплея, таких как бактериофаг.

Пептидные линкеры, применяемые для получения одноцепочечных антител, могут представлять собой гибкие пептиды, выбранные для убеждения в том, что осуществляется правильная трехмерная укладка У|, и ν_Η доменов. Такой линкер, как правило, представляет собой 10-50 аминокислотных остатков. Предпочтительно линкер представляет собой 10-30 аминокислотных остатков. Более предпочтительно линкер представляет собой 12-30 аминокислотных остатков. Наиболее предпочтительно линкер представляет собой 15-25 аминокислотных остатков. Пример таких линкерных пептидов включает (О1у-С1у-С1у-О1у-8ег)з.

Выделенное антитело представляет собой антитело, которое (1) было частично, существенно или полностью очищено от смеси компонентов; (2) было идентифицировано и отделено от и/или восстановлено из компонента, в котором оно находилось в природе; (3) является моноклональным; (4) не содержит других белков тех же видов; (5) экспрессировано в клетке из различных видов или (6) не встречается в природе. Посторонними компонентами из природной среды являются вещества, затрудняющие применение указанного антитела в диагностических или терапевтических целях, и могут включать ферменты, гормоны и другие растворы белковой и небелковой природы. Примеры выделенных антител включают антитело, очищенное аффинным методом; антитело, полученное при помощи гибридомы или другой клеточной линии ίη νίίτο, и антитело человека, полученное из трансгенной мыши.

Употребляемый в данном описании термин моноклональное антитело обозначает антитело, полученное из популяции, по существу, гомогенных антител, например индивидуальные антитела, содержащие популяцию, по существу идентичны, за исключением возможных встречающихся в природе мутаций или незначительных посттрансляционных изменений, которые могут присутствовать. Моноклональные антитела высокоспецифичны, направлены на один сайт антигена (также известный как детерминант или эпитоп). Кроме того, в отличие от препаратов традиционных (поликлональных) антител, которые, как правило, включают различные антитела, направленные на различные детерминанты, каждое моноклональное антитело направлено на один детерминант на антигене. Определение моноклональные обозначает характер антитела, как полученного, по существу, из гомогенной популяции антител, и не должно толковаться как требующего получения антитела любым конкретным способом.

В настоящем описании термин антитела также включает химерные антитела (иммуноглобулины), в которых часть тяжелой и/или легкой цепи идентична или гомологична соответствующим последовательностям антител, полученных из определенных видов или относящихся к определенному классу или подклассу антител, при этом остаток цепи (цепей) идентичен или гомологичен соответствующим последовательностям антител, полученных из других видов (например, мыши или крысы) или относящихся к другому классу или подклассу антител, а также фрагменты таких антител такой длины, чтобы они могли реализовать требуемую биологическую активность. См., например, Μοττίκοη е1 а1., Ргос. №111. Асаб. 8с1. И8Л, 82:6851-6855 (1984). Таким образом, настоящее изобретение включает, например, химерные антитела, содержащие химерную тяжелую цепь и/или химерную легкую цепь. Химерная легкая цепь может содержать любой из вариабельных участков тяжелой цепи (ν_Η), описанных в настоящем изобретении, или их мутантов или вариантов, конденсированных с тяжелой цепью константного участка антитела, не относящегося к человеку. Химерная легкая цепь может содержать любой из вариабельных участков легкой цепи (УД, описанных в настоящем изобретении, или их мутантов или вариантов, конденсированных с легкой цепью константного участка антитела, не относящегося к человеку.

Термин антитело человека (человеческое антитело) в данном описании включает антитела, имеющие вариабельные и константные участки, соответствующие последовательностям иммуноглобулина зародыша человека (как описано в источнике Кабак е1 а1. (1991), 8ес.|иепсе8 οί Рго1еш8 οί 1ттипо1ощса1 1п1еге81, 5'¹' Ебйюп, И.8. Эераг1теп1 οί НеаНП апб Нитап Зегуюез, ΝΙΗ РиЫюЩюп Νο. 91-3242). Антитела человека согласно изобретению могут включать аминокислотные остатки, не кодируемые последовательностями иммуноглобулина зародыша человека (например, мутации, вызванные случайным или сайт-специфичным мутагенезом ш νίίτο или соматической мутацией ш νΐνο), например, в участках СЭВ. Антитело человека может иметь по меньшей мере по одной позиции замещенный аминокислотный остаток, например аминокислотный остаток, увеличивающий активность, но не кодируемый последовательностью иммуноглобулина зародыша человека. Однако термин антитело человека в данном описании не включает антитела, в которых СЭВ-последовательности получены из зародышей других видов млекопитающих, таких как мышь, и внесенных в каркасные последовательности человека.

Фраза рекомбинантное антитело человека включает антитела человека, которые получены, экспрессированы, созданы или выделены рекомбинантным способом, в том числе антитела, экспрессированные с помощью рекомбинантного вектора экспрессии, перенесенного в клетку-хозяина; антитела, выделенные из рекомбинанта, библиотеки комбинаторных антител человека, антитела, выделенные из животного, которое является трансгенным для генов иммуноглобулина человека; или антитела, полученные, экспрессированные, созданные или выделенные любыми другими способами, включающими сплайсинг последовательностей генов иммуноглобулина человека с другими последовательностями ДНК. Такие рекомбинантные антитела человека имеют вариабельные и константные участки, полученные из по

- 4 019517 следовательностей иммуноглобулина зародышей человека (см. ранее указанный источник ВаЬа1, с( а1.).

Ре (кристаллизованный фрагмент) обозначает часть или фрагмент антитела, который содержит константные домены со спаренными тяжелыми цепями. В случае антитела 1дС. например, Рс содержит домены СН2 и СН3. Рс для 1дА или 1дМ антител дополнительно содержит домен СН4. Рс отвечает за связывания с Рс рецептором, активацию цитотоксичности, опосредуемой комплементом, и АЭСС. Для антител, таких как 1дА и 1дМ, которые представляют собой комплексы 1дС-подобных белков, для комплексобразования необходимы константные домены Рс.

Таким образом, антитела согласно настоящему изобретению включают, но не ограничены перечисленными, встречающиеся в природе антитела, антитела, антитела человека, гуманизированные антитела, рекомбинантные антитела человека, моноклональные антитела, расщепляемые фрагменты, специфичные части и варианты указанных антител, включая миметики антител или содержащие части антител со сходной структурой и/или функцией антитела или его специфического фрагмента или части; каждое из которых содержит по меньшей мере один участок СОВ. Функциональные фрагменты включают антигенсвязывающие фрагменты, которые связываются с антигеном ΤΥΒΡ1. Например, фрагменты антител, способные связываться с ΤΥΒΡ1 или его частью и охватываемые настоящим изобретением, включают бивалентные фрагменты, такие как (РаЬ')₂ с дисульфидными связями между цепями, моновалентные фрагменты, такие как РаЬ (антигенсвязывающий фрагмент), которыми называют фрагменты антител, состоящие из доменов У_ъ С1 У_ъ СН1, и не сохранившие шарнирный участок тяжелой цепи (например, при расщеплении папаином); РаЬ, сохранившие шарнирный участок тяжелой цепи; ГасЬ (например, при расщеплении плазмином); Р(аЬ')₂; РаЬ' с отсутствием дисульфидных связей; рРс' (например, при расщеплении пепсином или плазмином), Рб (например, при расщеплении пепсином, частичное восстановление и реагрегация) и Ру или ксРу (например, полученные с применением методов молекулярной биологии). Фрагменты антител также могут включать, например, антитела с удаленными доменами, линейные антитела, одноцепочечные антитела, зсРу, антитела с одним доменом, мультивалентные одноцепочечные антитела, мультиспецифичные антитела, образованные из фрагментов антител, включая диатела, триатела и другие, которые специфически связываются с антигенами.

Шарнирный участок разделяет РаЬ и Рс части антитела, обеспечивая подвижность РаЬ относительно друг друга и относительно Рс, а также включая множество дисульфидных связей для ковалентной связи двух тяжелых цепей.

Антитела или их фрагменты согласно настоящему изобретению специфичны в отношении ΤΥΒΡ1. Специфичностью антител называют селективное распознавание антителом конкретного эпитопа антигена. Антитела или их фрагменты согласно настоящему изобретению, например, могут быть моноспецифичными, биспецифичными и мультиспецифичными. Биспецифичные антитела (ВзАЬ) представляют собой антитела, которые имеют две различные антигенсвязывающие специфичности или сайты. Мультиспецифичные антитела имеют более двух различных антигенсвязывающих специфичностей или сайтов. Если антитело обладает более чем одной специфичностью, то распознаваемые эпитопы могут быть связаны с одним антигеном или более чем с одним антигеном. Таким образом, согласно настоящему изобретению предложены биспецифичные антитела или их фрагменты, которые связываются с двумя различными антигенами по меньшей мере с одной специфичностью к ΤΥΒΡ1.

Согласно настоящему изобретению также предложены антитела или их фрагменты, специфичные к ΤΥΒΡ1. Указанный ΤΥΒΡ1 представляет собой белок ΤΥΒΡ1 млекопитающего и предпочтительно человека. Согласно особо предпочтительному варианту реализации антитело согласно настоящему изобретению способно связываться как с ΤΥΒΡ1 человека, так и с ΤΥΒΡ1 мыши [8ЫЬайага с( а1., Ыискю Аабз Вез. 14(6):2413-2427 (1986)], а, следовательно, может быть применено как при доклинических, так и при клинических испытаниях ίη νίνο. Антитела согласно настоящему изобретению способны проявлять одну или более из следующих активностей: 1) проявлять высокую аффинность при связывании (связывающую способность) по отношению исключительно к ΤΥΒΡ1 и 2) подавлять рост опухоли ίη νίίτο и ίη νίνο.

Специфичность антител или их фрагментов согласно настоящему изобретению в отношении ΤΥΒΡ1 может быть определена на основе аффинности и/или авидности. Аффинность, выраженная константой равновесия при диссоциации антигена и антитела (К_с), служит показателем силы связывания между антигенным детерминантом и связывающим сайтом антитела.

Антитела согласно настоящему изобретению или их фрагменты также включают и такие антитела и фрагменты, для которых характеристики связывания были изменены или улучшены посредством направленной мутации, методами аффинного созревания, фагового дисплея или перестановки цепи. Аффинность и специфичность могут быть изменены или улучшены путем мутаций участков ί.ΌΒ и скрининга антигенсвязывающих сайтов с необходимыми характеристиками (см., например, Уапд еί а1., 1. Мо1. Βίο1. (1995), 254:392-403). СЭИ изменяют посредством мутаций различными способами. Один из способов представляет собой рандомизацию отдельных остатков или комбинаций остатков таким образом, что в популяции неидентичных антигенсвязывающих сайтов все двадцать аминокислот находятся в конкретных положениях. Альтернативно, мутации могут быть индуцированы в ряде СЭР-остатков путем ПЦР пониженной точности (см., например, Натектз еί а1., 1. Мо1. Βίο1. (1992), 226:889-896). Например, векторы для фагового дисплея, содержащие гены для вариабельных участков тяжелой и легкой цепей, могут

- 5 019517 быть размножены в мутаторных штаммах Е.сой (см., например, Ьо\\· е! а1., 1. Μοί. ΒίοΙ. (1996), 250:359368). Данные способы мутагенеза приведены в качестве иллюстрации большого количества способов, известных специалистам в данной области.

Удобным способом получения вариантов с заменами является аффинное созревание с фаговым дисплеем. Вкратце, различные сайты СОВ-участков подвергают мутации с получением всех возможных аминокислотных замен в каждом сайте. Варианты антител, полученные таким образом, отражают одновалентную разновидность из частиц нитевидного фага, путем слияния с продуктом гена III фага М13, собранного на каждой частице. Затем проводят скрининг таких вариантов с фаговым дисплеем на их биологическую активность (например, определяют связывающую аффинность (связывающую способность), специфичность, 1С₅₀, ЕС₅₀, К_с), как описано в настоящем изобретении. Для того чтобы идентифицировать сайты СОВ-участков - кандидаты для модификации, проводят аланин-сканирующий мутагенез для идентификации остатков участков СОВ, принимающих значительное участие в связывании антигена. Альтернативно или в дополнение к предыдущему, для одной или более СОВ-последовательностей в одном или более положений остатков может быть проведен случайный мутагенез, или если СОВ функционально связан с вариабельным участком или если СОВ не зависит от последовательности другого вариабельного участка и, таким образом, измененный СОВ возвращен в вариабельный участок посредством технологии рекомбинантных ДНК. Когда такие варианты антитела получены и экспрессированы, группу вариантов подвергают скринингу, описанному в настоящем изобретении, и антитела с наилучшими свойствами по результатам одного или более соответствующих анализов выбирают для дальнейшей разработки.

В соответствии с настоящим описанием, кроме антител, специально описанных в данном изобретении, могут быть легко созданы и произведены другие, по существу гомологичные модифицированные антитела, с использованием различных методик с участием рекомбинантной ДНК, хорошо известных специалистам в данной области. Например, каркасные участки могут отличаться от нативных последовательностей на уровне первичной структуры за счет нескольких замен аминокислот, вставок и делеций по концам и в промежуточных положениях, и т.д. Кроме того, разнообразие различных каркасных участков у человека может быть применено самостоятельно или в комбинации в качестве основы для гуманизированных иммуноглобулинов согласно настоящему изобретению. В большинстве случаев модификации генов могут легко проводиться посредством множества известных методов, таких как сайтнаправленный мутагенез.

Настоящее изобретение включает ТУВР1-связывающие полипептиды с аминокислотными последовательностями, по существу, аналогичными аминокислотным последовательностям вариабельных или гипервариабельных участков описанных полноразмерных антител к ТУВР1. По существу, аналогичная аминокислотная последовательность определена в данном описании как последовательность с гомологичностью по отношению к другой аминокислотной последовательности по меньшей мере 70%, предпочтительно по меньшей мере приблизительно 80% и более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 90, 95, 96, 97, 98 или 99%, определенной по поиску в базе данных ЕА8ТА в соответствии с методикой Пирсона (Реаткои) и Липмана (Ыртап) (Ргос. №111. Асаб. 8с1. И8А (1988), 85:2444-8).

Антитела согласно настоящему изобретению или их фрагменты включают человеческие антитела с одним, двумя, тремя, четырьмя, пятью и/или шестью участками, определяющими комплементарность (СОВ), выбранными из группы, включающей аминокислотные последовательности СОВ, представленные в табл. 1.

Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения данные антитела или их фрагменты могут иметь вариабельный участок тяжелой цепи 20Ό7 или 20Ό78 и/или вариабельный участок легкой цепи 20Ό7 или 20Ό78, рассмотренные ниже. 20Ό7 и 20Ό78 представляют собой особенно предпочтительные антитела согласно настоящему изобретению. Такие антитела содержат человеческие Ун и Уь каркасные участки (ЕВ), а также человеческие СОВ.

Настоящее изобретение включает последовательности нуклеиновых кислот, кодирующих тяжелую цепь антител к ТУВР1, содержащую любой из У_н участков или их часть или любой из У_н СОВ-участков, включая любые их варианты, описанные в данном изобретении. Настоящее изобретение также включает молекулы нуклеиновых кислот, кодирующих легкую цепь антител к ТУВР1, содержащую любой из У_ъучастков или его часть или любой из СОВ-участков, включая любые их варианты, описанные в данном изобретении.

Каждый домен антител согласно настоящему изобретению может представлять собой целое антитело с вариабельным доменом тяжелой или легкой цепи или может представлять собой функциональный эквивалент или мутант или производное встречающегося в природе домена, или домен, сконструированный синтетическим способом, например ίη уйго. с использованием методики, например, такой, как описана в \νϋ 93/11236 (ΌπίΠιΙικ е! а1.). Например, возможно соединить домены, соответствующие вариабельным доменам антитела, но с исключением по меньшей мере одной аминокислоты. Также настоящее изобретение включает антитело с одной или более аминокислотными заменами, мутациями или делециями в одной из последовательностей СОВ. Важным характеризующим признаком является способность каждого домена ассоциироваться с комплементарным доменом с образованием антигенсвязываю

- 6 019517 щего сайта. Соответственно, термины вариабельный фрагмент тяжелой и легкой цепей не должны быть сконструированы таким образом, чтобы исключить варианты, включая варианты СОВ, которые не оказывают существенного влияния на специфичность.

Антитела согласно настоящему изобретению могут быть получены известными в данной области техники способами. Такие способы включают иммунологический способ, описанный авторами Кой1ег и Μίΐκίοίη. Ыа1иге, 256:495-497 (1975) и СатрЬе11, Мопос1опа1 ЛпйЬобу Тесйпо1о§у, Тйе Ртобисйои апб С11агас1епха1юп о£ Вобеп! апб Нитап НуЬйботак, Вигбоп е! а1., Ебк., ЙаЬогаЮгу Тес11пк|иек ίη ВюсйетШту апб Мо1еси1аг Вю1о§у, уо1. 13, Е1кеу1ет 8с1епсе РиЬйкйетк, Лтк1егбат (1985); а также способ получения рекомбинантной ДНК, описанный в источнике Нике е! а1., 8с1епсе, 246:1275-1281 (1989).

Фрагменты антител могут быть получены путем расщепления целого антитела или путем экспрессии ДНК, кодирующей данный фрагмент. Фрагменты антител могут быть получены методами, описанными в источнике Ьатоу1 е! а1., 1. 1ттипо1. Ме!йобк 56:235-243 (1983) и Рагйат, 1. 1ттипо1. 131:28952902 (1983). Такие фрагменты могут содержать один или более ЕаЬ-фрагментов или фрагмент Е(аЬ')₂. Такие фрагменты могут также содержать одноцепочечный фрагмент вариабельного участка антител, т.е. ксЕу, диатела или другие фрагменты антител. Способы получения таких функциональных эквивалентов представлены в заявке РСТ №0 93/21319; заявке на европейский патент № 239400; заявке РСТ №0 89/09622; заявке на европейский патент 338745 и европейском патенте ЕР 332424.

Предпочтительные клетки-хозяева для трансформации векторов и экспрессии антител согласно настоящему изобретению представляют собой клетки млекопитающих, например ΝδΟ-клетки (несекретирующие (0) клетки миеломы мышей), 293 и СНО-клетки и другие клеточные линии лимфоидной природы, такие как клетки лимфомы, миеломы или гибридомы. Как вариант, могут применяться и другие эукариотические клетки-хозяева, такие как дрожжи.

Культивирование трансформируемых клеток-хозяев проводят известными в данной области способами в жидкой среде, содержащей ассимилируемые источники углерода (углеводы, такие как глюкоза или лактоза), азота (аминокислоты, пептиды, белки или продукты их разложения, такие как пептоны, аммониевые соли и т.п.) и неорганические соли (сульфаты, фосфаты и/или карбонаты натрия, калия, магния и кальция). Такая питательная среда дополнительно содержит, например, стимуляторы роста, такие как микроэлементы, например железо, цинк, марганец и т.п.

При необходимости экспрессии генной конструкции в клетках дрожжей необходимым геном для выбора при использовании в клетках дрожжей является ген !гр1, присутствующий в плазмиде УВр7 дрожжей. 8!шсйсотЬ е! а1. №!ите, 282:39 (1979); Кшдктап е! а1., Сепе, 7:141 (1979). Указанный ген !гр1 обеспечивает селекционный маркер для мутантного штамма дрожжей, не способного расти на триптофане, например штамма АТСС № 44076 или РЕР4-1. 1опек, Сепейск, 85:12 (1977). Наличие такого нарушения в гене !гр1 генома дрожжевой клетки-хозяина далее обеспечивает эффективную возможность для определения трансформации по росту в отсутствие триптофана. Аналогичным образом, дефицитные по Ьеи2 штаммы дрожжей (АТСС 20622 или 38626) дополняют известными плазмидами, несущими ген Ьеи2.

Антитела согласно настоящему изобретению могут быть выделены или очищены любым известным в данной области способом, включая осаждение сульфатом аммония или сульфатом натрия с последующим диализом против раствора соли, ионообменную хроматографию, аффинную или иммуноаффинную хроматографию, а также гель-фильтрацию или зональный электрофорез. Предпочтительным способом для очистки антител согласно настоящему изобретению является аффинная хроматография на протеине-А.

ДНК, кодирующая антитела человека, может быть получена рекомбинацией ДНК, кодирующей константные и вариабельные участки у человека, за исключением СЭВ, полученной в основном или исключительно из соответствующих участков антител человека, и ДНК, кодирующей СЭВ-участки, полученной из человека.

Приемлемые источники ДНК, кодирующих фрагменты антител, включают любые клетки, такие как клетки гибридомы и спленоцита, в которых экспрессированы полноразмерные антитела. Данные фрагменты могут быть применены непосредственно в качестве эквивалентов антител или могут быть рекомбинированы с другими эквивалентами, как описано выше. Делеции и рекомбинации в ДНК, описанные в данном разделе, могут быть осуществлены известными способами. Другим источником ДНК является известная в данной области библиотека фагового дисплея антител. Примеры антител согласно настоящему изобретению были получены путем гибридомной технологии из иммунизированных мышей.

Кроме того, согласно настоящему изобретению предложены векторы экспрессии, содержащие описанные ранее полинуклеотидные последовательности, функционально связанные с экспрессирующей последовательностью, промотором и последовательностью энхансера. Разработаны разнообразные векторы экспрессии для эффективного синтеза полипептида для антитела в прокариотических системах, таких как бактерии, и эукариотических системах, включающих, но не ограничивающихся, системы культур клеток дрожжей и млекопитающих. Векторы согласно настоящему изобретению могут включать сегменты последовательностей хромосомальной, нехромосомальной или синтетической ДНК.

- 7 019517

Любой приемлемый вектор экспрессии может быть применен. Например, прокариотические клонирующие векторы включают плазмиды Е сой, такие как со1Е1, рСВ1, рВВ322, рМВ9, рИС, рК8М и ВР4. Прокариотические векторы также включают производные ДНК фага, такого как М13, и других нитевидных фагов, содержащих одноцепочечную ДНК. Примером вектора, пригодного для дрожжей, является плазмида 2μ. Приемлемые векторы для экспрессии в клетках млекопитающих включают известные производные 8У-40, аденовируса, последовательности ДНК, полученной из ретровируса, а также шаттлвекторы, полученные путем комбинации функциональных векторов млекопитающих, в том числе и описанных выше, и функциональных плазмид и фаговых ДНК.

Другие эукариотические векторы экспрессии также известны в данной области (например, Р.1. 8оиШетп апй Р. Ветд, 1. Мо1. Арр1. Сепе!. 1:327-341 (1982); 8иЬтаташ е! а1., Мо1. Се11. Вю1. 1:854-864 (1981); КаиТтапп апй 8Ьагр, 1. Мо1. Вю1. 159:601-664 (1982); 8саЫ11 е! а1., Ргос. ЫаЙ. Асай. 8с1. И8А, 80: 4654-4659 (1983) и Иг1аиЬ апй СЬа8Ш, Ргос. Ыа!1. Асай. 8ск И8А, 77:4216-4220 (1980).

Векторы экспрессии, применяемые в настоящем изобретении, содержат по меньшей мере одну контрольную последовательность, которая функционально связана с последовательностью ДНК или фрагментом, который необходимо экспрессировать. Контрольную последовательность вставляют в вектор для того, чтобы контролировать регуляцию экспрессии клонированной последовательности ДНК. Примерами подходящих для экспрессии контрольных последовательностей являются 1ас-система, !гр-система, !ас-система, !гс-система, основные участки оператора и промотора фага лямбда, контрольный участок белка оболочки фага £й, промоторы, отвечающие за гликолиз в клетке дрожжей, например промотор для 3-фосфоглицераткиназы, промоторы для дрожжевой кислой фосфатазы, например Р1ю5. промоторы для факторов альфа-спаривания дрожжей и промоторы, полученные из полиомы, аденовируса, ретровируса и вируса обезьян, например ранние и поздние промоторы вируса 8У40, и другие известные последовательности для контроля экспрессии генов в прокариотических или эукариотических клетках и их вирусах или их комбинациях.

Согласно настоящему изобретению предложены рекомбинантные клетки-хозяева, содержащие описанные выше векторы экспрессии. Антитела согласно настоящему изобретению могут быть экспрессированы в клеточных линиях, но не в гибридомах. Нуклеиновые кислоты, содержащие последовательность, кодирующую полипептид согласно настоящему изобретению, могут быть использованы для трансформации приемлемых клеток-хозяев, относящихся к млекопитающим.

Особенно предпочтительные клеточные линии выбирают на основании высокого уровня экспрессии, конститутивной экспрессии необходимого белка и минимальных примесей белков хозяина. Линии клеток млекопитающих, приемлемые в качестве хозяев для экспрессии, хорошо известны в данной области техники и включают большое количество иммортализированных клеточных линий, таких как (не ограничиваясь перечисленными): ΝδΘ-клетки (несекретирующие (0) клетки миеломы мышей), клетки миеломы мышей, клетки яичников китайских хомячков (СНО), клетки почек детенышей хомяков (ВНК) и многие другие. Приемлемые дополнительные эукариотические клетки включают клетки дрожжей и других грибов. Пригодные прокариотические хозяева включают, например, Е.со11, в том числе Е.со11 8С-936, Е.со11 НВ101, Е.соЕ №3110, Е.сой Х1776, Е.сой Х2282, Е.со11 ΌΗΙ и Е.сой МВС1, Рзеийотопаз, ВасШиз, в том числе ВасШиз зиЬ!Шз и 8!тер!отусез.

Указанные рекомбинантные клетки-хозяева могут быть применены для получения антитела или его фрагмента путем культивирования данных клеток в условиях, способствующих экспрессии антитела или его фрагмента и очистки данных антитела или его фрагмента от клетки-хозяина или окружающей клетку-хозяина среды. Направленное действие экспрессированного антитела или его фрагмента на секрецию в рекомбинантных клетках-хозяевах может быть усилено за счет вставки сигнальной или секреторной последовательности, кодирующей лидерный пептид (см. 81юкп е! а1. (2003), Арр1 МютоЬю1 Вю1есЬпо1. 60(6):654-64, №е1зеп е! а1., Рго!. Епд. (1997), 10:1-6 апй уоп Неш)е е! а1. (1986), Νϋθ1. Ас1йз Вез. 14:46834690) к 5'-концу гена, кодирующего необходимое антитело. Элементы такого секреторного лидерного пептида могут быть получены как из прокариотических, так и из эукариотических последовательностей. Соответственно, приемлемо использовать секреторные лидерные пептиды, аминокислотная последовательность которых присоединена к Ν-концу полипептида для прямого извлечения данного полипептида из цитозоля клетки-хозяина и секреции в среду.

Антитела согласно настоящему изобретению могут быть конденсированы с дополнительными аминокислотными остатками. Такие аминокислотные остатки могут представлять собой короткий пептидный участок, улучшающий выделение. Также настоящее изобретение включает и другие аминокислотные остатки для хоуминга (миграции) антител к специфичным органам или тканям.

Другой вариант реализации получения антител согласно настоящему изобретению предполагает экспрессию нуклеиновой кислоты, кодирующей антитело согласно изобретению, в трансгенном животном, имеющем существенную часть вставленного генома, продуцирующего антитела человека, и не имеющем возможности продуцировать эндогенные антитела. Трансгенные животные включают, но не ограничены перечисленными, мышей, козу и кролика. Один из дополнительных вариантов реализации настоящего изобретения включает экспрессию гена, кодирующего антитела, например, в молочной железе животного для секреции полипептида в период лактации.

- 8 019517

Согласно настоящему изобретению также предложен способ лечения роста опухоли у млекопитающих путем введения млекопитающему эффективного количества антитела. Опухоли, которые приемлемо вылечить в соответствии с настоящим изобретением, предпочтительно экспрессируют ΤΥΚΡ1. Не вдаваясь в подробности конкретного механизма, данные способы обеспечивают лечение роста раковых клеток, в том числе злокачественной меланомы. Лечение или лечить в контексте настоящего изобретения относится к терапевтическому лечению, включающему подавление, замедление, уменьшение или изменение хода данного состояния или нежелательных физиологических изменений, связанных с заболеванием или расстройством, улучшению клинических симптомов состояния или предотвращению появления клинических симптомов состояния. Предпочтительные или требуемые клинические результаты включают, но не ограничены перечисленными, облегчение симптомов, снижение выраженности болезни или расстройства, стабилизацию болезни или расстройства (т.е. болезнь или расстройство не усиливается), задержка или замедление течения заболевания или расстройства, улучшение состояния или временное облегчение болезни или расстройства, как детектируемое, так и недетектируемое. Лечение может также означать увеличение времени жизни по сравнению с ожидаемым временем в случае отсутствия лечения. Нуждающиеся в лечении включают тех, кто уже имеет данное заболевание. Согласно одному из вариантов реализации настоящее изобретение может быть применено в качестве лекарственного средства.

Термин меланома включает, но не ограничен перечисленными, меланомы, метастатические меланомы, меланомы, полученные из меланоцитов или меланоцитсвязанных невусных клеток, меланокарциномы, меланоэпителиомы, меланосаркомы, меланомы ίη κίΐιι. поверхностно распространяющиеся меланомы, модульные меланомы, пигментное пятно злокачественной меланомы, акральную лентигинозную меланому, инвазивную меланому и синдром семейных атипичных родинок и меланомы (ΡΛΜ-Μ). Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения меланома представляет собой особую форму рака. Согласно другому варианту меланома может быть злокачественной. Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения для первой линии лечения меланомы, как описано ниже, следует применять описанные в настоящем изобретении антитела к ΤΎΚΡ1. Согласно другому варианту реализации описанные в настоящем изобретении антитела к ΤΥΚΡ1 являются средствами первой линии для лечения метастатической меланомы, поэтому указанные антитела необходимо применять при первом круге лечения впервые диагностированной метастатической меланомы.

При реализации способов согласно настоящему изобретению терапевтически эффективное количество антитела согласно настоящему изобретению вводят нуждающемуся млекопитающему. Эффективные дозы композиций согласно настоящему изобретению для лечения расстройств, описанных в настоящем изобретении, отличаются в зависимости от множества различных факторов, включая способы введения, сайт-мишень, физиологическое состояние пациента, в зависимости от того, является ли пациент человеком или животным, применяют ли другие лекарственные средства и является ли лечение профилактическим или терапевтическим. Термин введение в данном описании обозначает доставку антител согласно настоящему изобретению млекопитающему любым из способов, позволяющим достичь необходимого результата. Например, указанные антитела могут быть введены внутривенно или внутримышечно. Несмотря на то что антитела человека согласно настоящему изобретению особенно пригодны для введения людям, их можно вводить и другим млекопитающим. Термин млекопитающее, используемый в настоящем описании, включает, но не ограничивается перечисленными, человека, лабораторных животных, домашних животных и сельскохозяйственных животных. Терапевтически эффективное количество означает такое количество антитела согласно настоящему изобретению, которое при введении млекопитающему эффективно оказывает необходимый терапевтический эффект, такой как подавление роста опухоли. Дозы для лечения могут определяться обычными методами, известными специалистам, для оптимизации безопасности и эффективности.

Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению могут включать терапевтически эффективное количество антитела к ΤΥΚΡ1 согласно изобретению. Терапевтически эффективным количеством называют количество, эффективное в необходимых дозах и в течение необходимых периодов времени для достижения требуемого терапевтического результата. Терапевтически эффективное количество антитела может изменяться в зависимости от факторов, таких как состояние болезни, возраст, пол или вес субъекта, а также в зависимости от способности антитела или части антитела вызывать необходимый ответ у субъекта. Терапевтически эффективное количество - это также и такое количество, при котором терапевтически положительные эффекты перевешивают токсические или вредные эффекты антитела или части антитела. Режим дозировки может быть дополнен для обеспечения оптимального необходимого ответа (например, терапевтического или профилактического ответа).

Идентификация такого заболевания требует способностей и знаний специалиста в данной области. Например, людям, страдающим злокачественной меланомой или имеющим риск развития клинически значимых симптомов, подходит введение антител к ΤΥΚΡ1 согласно настоящему изобретению.

Антитела ΤΥΚΡ1 согласно настоящему изобретению вводят для терапевтического лечения пациенту, страдающему злокачественной меланомой, в количестве, достаточном для подавления или уменьшения развития опухоли или патологического состояния. Развитие включает, например, рост, инвазивность, метастазы и/или рецидив опухоли или патологического состояния. Количество, достаточное для дости

- 9 019517 жения указанной цели, определяется терапевтически эффективной дозой. Количества, эффективные для такого применения, зависят от степени тяжести заболевания и общего состояния иммунной системы пациента. Режим дозирования может также меняться в зависимости от состояния болезни и статуса пациента и, как правило, меняется от однократной болюсной дозы до продолжительного введения несколько раз в день (например, каждые 4-6 ч) или может быть обусловлен назначением врача и состоянием пациента. В качестве неограничивающего примера диапазон терапевтически эффективного количества антитела согласно настоящему изобретению составляет 0,1-50 мг/кг, более предпочтительно 3-35 мг/кг и более предпочтительно 5-20 мг/кг. Дозировки и частоту применения определяют врачи, лечащие данного пациента, и такие дозировки включают дозы от менее 1 до более 100 мг/кг, принимаемые ежедневно, три раза в неделю, еженедельно, один раз в каждые две недели или менее часто. Доза для введения может быть в диапазоне 1-100, 2-75 или 5-60 мг/кг. Следует отметить, тем не менее, что настоящее изобретение не ограничено какой-либо конкретной дозой.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения антитела к ΤΎΚΡ1 можно вводить в комбинации с одним или более других антинеопластических агентов. Можно использовать любой приемлемый антинеопластический агент, в том числе химиотерапевтический агент, радиацию или их комбинации. Данный антинеопластический агент может представлять собой алкилирующий агент или антиметаболит. Примеры алкилирующих агентов включают, но не ограничены перечисленными, цисплатин, циклофосфамид, мелфалан и дакарбазин (ЭТ1С). Проведенные ίη νίνο исследования показывают, что введение 20Ό7 в комбинации с дакарбазином (ΌΤΙΟ) демонстрирует более сильную противоопухолевую активность по сравнению с монотерапией для ксенотрансплантата человеческого 624те1. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения описанные в данном документе антитела к ΤΥΚΡ1 представлены в комбинации с дакарбазином. Примеры антиметаболитов включают, но не ограничены перечисленными, доксорубицин, даунорубицин, паклитаксел, иринотекан (СРТ-11) и топотекан. В случае, когда антинеопластический агент представляет собой радиацию, источник радиации может быть внешним (радиационная терапия внешними лучами - ЕВК.Т) или внутренним (брахитерапия - ВТ) по отношению к пациенту, подвергаемому лечению. Доза антинеопластического агента для введения зависит от многочисленных факторов, включая, например, тип агента, тип и степень тяжести опухоли, подвергаемой лечению, путь введения агента. Следует отметить, тем не менее, что настоящее изобретение не ограничено какой-либо конкретной дозой.

В настоящем изобретении любой приемлемый способ или путь может быть применен для введения антител к ΤΥΚΡ1 согласно настоящему изобретению и, возможно, для совместного введения антинеопластических агентов и/или антагонистов других рецепторов. Режимы применения антинеопластических агентов согласно настоящему изобретению включают любой режим, который считается оптимально подходящим для лечения неопластического состояния пациента. Различные злокачественные образования могут требовать применения специфичных противоопухолевых антител и специфичных антинеопластических агентов, что определяется в зависимости от пациента. Пути введения включают, например, пероральное, внутривенное, внутрибрюшинное, подкожное или внутримышечное введение. Предпочтительны парентеральные пути. Следует отметить, тем не менее, что настоящее изобретение не ограничено каким-либо конкретным способом или путем введения.

Согласно другому аспекту настоящего изобретения антитело к ΤΎΚΡ1 согласно настоящему изобретению может быть химически или биосинтетически связано с одним или более антинеопластическим или антиангиогенным агентами.

Настоящее изобретение дополнительно включает антитела к ΤΥΚΡ1, связанные с группами мишени или репортера, включая, например, только антинеопластические агенты, другие антитела или репортеры, такие как изотопы с радиоактивными метками, в диагностической системе, где агент, образующий детектируемый сигнал, соединен с антителом.

Понятно, что антитела к ΤΥΚΡ1 согласно настоящему изобретению при применении для млекопитающих в профилактических целях или при лечении необходимо вводить в форме композиции, дополнительно содержащей фармацевтически приемлемый носитель. Подходящие фармацевтически приемлемые носители включают, например, один или более из таких как вода, соль, фосфатно-солевой буферный раствор, декстроза, глицерин, этанол и т.п., а также комбинации указанных носителей. Фармацевтически приемлемые носители могут дополнительно содержать малые количества вспомогательных веществ, таких как увлажняющие агенты или эмульгаторы, консерванты или буферы, увеличивающие срок хранения или эффективность связывающих белков. Указанные композиции для инъекции могут, как известно в данной области, быть составлены так, чтобы обеспечить быстрое, замедленное или отсроченное высвобождение активного ингредиента после введения млекопитающему.

Кроме того, настоящее изобретение включает применение антител согласно настоящему изобретению ίη νίνο и ίη νίΐτο в исследовательских или диагностических методах, известных в данной области. Диагностические методы включают наборы, содержащие антитела согласно настоящему изобретению.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения предложено моноклональное антитело человека или его фрагмент, специфичный к ΤΎΚΡ1. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения предложено химерное моноклональное антитело или его фрагмент, специфич

- 10 019517 ный к ТУКР1. В другом варианте реализации СБВ-участки антитела идентичны СБВ-участкам СТА99. В различных вариантах СБИ-участки антитела идентичны СБВ-участкам 20Б7 или 20Б78.

Согласно одному из вариантов реализации антитело связывается с ТУКР1 с константой скорости диссоциации (К_б или к_о££), находящейся в диапазоне от 1,7х10^-4 до 5х10^-4 1/с(с^-1, 1/с), при этом указанную константу скорости диссоциации определяют методом поверхностного плазмонного резонанса, описанного в настоящем изобретении, при комнатной температуре в лаборатории (20-25°С). Согласно другому варианту реализации антитело связывается с ТУКР1 с константой К_б или к_о££, находящейся в диапазоне от 1,7х10^-4 до 3,5х10^-4 1/с. Согласно другому варианту антитело связывается с ТУКР1 с константой диссоциации, измеренной методом поверхностного плазмонного резонанса, которая составляет до 10% от константы скорости диссоциации, определенной для 20Б7, 20Б78 или СТА99 в тех же условиях.

Один из вариантов реализации настоящего изобретения включает моноклональное антитело или его фрагмент, специфичные к ТУКР1, содержащие один или более участков, определяющих комплементарность (СБИ), выбранных из группы, включающей СБВ, представленные в табл. 1 и 2. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения предложено моноклональное антитело или его фрагмент, специфичные к ТУКР1, содержащие СБИ1-участок легкой цепи с последовательностью: КА§р§У88УЬА (8ЕО ΙΌ N0: 4). Согласно другому варианту настоящего изобретения предложено моноклональное антитело или его фрагмент, специфичные к ТУКР1, и имеющий СБК3 легкой цепи с последовательностью: ВУ888\УУкБУ (8Е0 ΙΌ N0: 3). Согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения предложено моноклональное антитело или его фрагмент, содержащие (ί) вариабельный участок легкой цепи, выбранный из группы, включающей 20Б7, 20Б78 и СТА99, и (ίί) вариабельный участок тяжелой цепи, выбранный из группы, включающей 20Б7, 20Б78 и СТА99. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения предложено моноклональное антитело или его фрагмент, специфичные к ТУКР1, содержащие (ί) вариабельный участок легкой цепи с СТА99, (ίί) вариабельный участок тяжелой цепи с СТА99 и (ш) константные участки иммуноглобулина человека 01 (Ы§01).

Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения предложен способ лечения рака у млекопитающего, включающий введение млекопитающему эффективного количества антитела или его фрагмента, соответствующего любому из уже описанных вариантов. Согласно данному изобретению предложен способ лечения злокачественной меланомы. Другой способ лечения, предложенный согласно данному изобретению, включает комбинацию применения антител или их фрагментов согласно данному изобретению с введением дополнительного противоракового агента или лечения. В одном из способов лечения указанный противораковый агент представляет собой дакарбазин (БТ1С).

Следует понимать и предполагать, что специалистами в данной области могут быть предложены изменения к описанным в настоящем изобретении принципам изобретения, и необходимо иметь в виду, что такие модификации также должны быть включены в объем настоящего изобретения.

Все указанные ссылки полностью включены в настоящее описание.

Примеры

Приведенные ниже примеры иллюстрируют данное изобретение, но не имеют цели каким-либо образом ограничивать его объем. Однако данные примеры и не имеют цели расширить объем изобретения. Подробное описание обычных методов, применимых при конструировании векторов и плазмид, вставки генов, кодирующих полипептиды в указанные векторы и плазмиды, введение плазмид в клетки-хозяева и экспрессия и определение экспрессии генов и генных продуктов может быть получено из многочисленных публикаций, включая 8атЬтоок, 1. с1 а1. (1989), Мо1еси1аг С1опшд: А ЬаЬотаЮту Мапиа1, 2'¹ еб., Со1б 8ртшд НагЬог ЬаЬотаЮгу Ргекк.

Животные и клеточные линии.

8Кте128, 8Кте123, 624те1, 1102те1 и А375 поддерживали в ВРМ1 1640 (1пуйгодеи Ы£е Тес11по1ощек) с 10% инактивированной теплом эмбриональной бычьей сывороткой (НуС1опе ЬаЬотаЮпек, Бодаи, ИТ) и регулярно проверяли на заражение микроорганизмами Мусор1акта. 8Кте123 и 8Кте128 были предоставлены Ότ. А1ап НоидЫои (Метопа1 81оап-Кебег1пд Сапсег Сейет, №\ν Уогк, ΝΥ). 624те1 и 1102те1 были приобретены у Ότ. 81ете ВокепЬетд (№1бопа1 Сапсег 1пкШШе, ВеШекба, МБ). А375 была приобретена в Атепсап Туре Сн11нге Со11ес1юп (Мапаккак, УА). 6-8-недельные женские особи Νυ/Νυ мышей были приобретены в Тасошс Еаттк (ОегтаШо^п, ΝΥ).

Экспрессия и очистка человеческих и химерных антител к ТΥΚР1.

Для каждого антитела конструировали подходящую нуклеотидную последовательность тяжелой цепи, например 8Е0 ΙΌ N0: 21, 22 или 23 (для 20Б7, 20Б78 и СТА99 соответственно), в подходящей для экспрессии плазмиде, например рО8НС, и конструировали подходящую нуклеотидную последовательность легкой цепи, например 8Е0 ΙΌ N0: 26 или 27 (для 20Б7/20Б78 и СТА99 соответственно), в подходящей для экспрессии плазмиде, такой как рО8ЬС, любым приемлемым способом, таким как ПЦРклонирование. Для получения стабильной клеточной линии котрансфицировали подходящую линию клеток-хозяев, таких как №0-клетки, с плазмидами с линейными тяжелой и легкой цепями путем электропорации и культивировали в подходящей среде, такой как среда Би1Ьессо'к МобШеб Еад1е Мебшт, с

- 11 019517 отсутствием глутамина с добавкой диализованной эмбриональной телячьей сыворотки и глутаминсинтетазы. Проводили скрининг клонов на экспрессию антител методом твердофазного иммуноферментного анализа (ЕЬ1§А) и выбирали наилучшего продуцента для культивирования в роллерных колбах. Антитела очищали подходящим способом, таким как аффинная хроматография с протеином А.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения предложено рекомбинантное моноклональное тело человека 20Ό7, полноразмерный 1дС|_к, имеющий в качестве мишени поверхность клеток, экспрессирующих тирозиназазависимый белок-1 (ТУЕР1 или ТЕР1). Данное антитело содержит человеческую тяжелую цепь (НС) гамма-1 (подгруппа I) и человеческую легкую цепь каппа (подгруппа III). Показано, что 20Ό7 селективно связывается с ТУЕР1 человека с высокой аффинностью и опосредованной высокой противоопухолевой активностью в моделях ксенотрансплантатов за счет механизма, включающего активацию функции иммунного эффектора.

Согласно одному из вариантов настоящего изобретения предложено рекомбинантное моноклональное антитело человека 20Ό78, полноразмерный (дС_{1 к}. имеющий в качестве мишени поверхность клеток, экспрессирующих тирозиназазависимый белок-1 (ТУЕР1 или ТЕР1). Данное антитело содержит человеческую тяжелую цепь (НС) гамма-1 (подгруппа I) и человеческую легкую цепь каппа (подгруппа III). 20Ό78 создано в попытке получить более стабильную молекулу, где свободный остаток цистеина тяжелой цепи вариабельного участка (С47) преобразован в остаток серина методом сайт-направленного мутагенеза. Данный неспаренный или свободный цистеин имеет потенциал для неправильного связывания с другими цистеинами, участвующими во внутри- и межцепочечных дисульфидных мостиках между полипептидами тяжелой и легкой цепей. Неправильное связывание может потенциально привести к неправильной укладке и процессингу, увеличению неоднородности продукта и потенциальной его стабильности. Описанный в настоящем изобретении анализ методом электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (8Ό8 РАСЕ) подтвердил наличие свободной легкой цепи и свободной тяжелой цепи при получении 20Ό7, но наличие свободных легких цепей и свободных тяжелых цепей снижено или такие цепи отсутствуют при получении 20Ό78.

Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения предложено СТА99, химерное антитело с константным участком [дС₁ человека. Антитело мыши ТА99 (патент США 4798790) содержит две легкие цепи, при этом одна из легких цепей ТА99 специфична к ТУЕР1, а другая взята из исходных клеток миеломы мыши. Такое антитело проявляет пониженную активность, так как легкая цепь с примесями не способна связываться с ТУЕР1. СТА99 было сконструировано для того, чтобы устранить данный недостаток и, таким образом, увеличить активность. Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения СТА99 сконструировано из двух идентичных тяжелых цепей и двух идентичных легких цепей. Проведенные исследования показали, что СТА99 обладает повышенной активностью и повышенной связывающей способностью, а также функциями эффектора, более подходящими для человека.

В табл. 1 и 2 представлены последовательности аминокислот и номера 8ЕО ГО N0 для различных СЭЕ согласно настоящему изобретению. В табл. 3 представлены номера 8Е0 ГО N0 различных последовательностей, относящихся к настоящему изобретению. Последовательности полинуклеиновых кислот, кодирующих описанные ниже аминокислотные последовательности, также включены в объем настоящего изобретения.

Таблица 1

Последовательности аминокислот СЭЕ-участков вариабельных областей тяжелой и легкой цепей антител 20Ό7 и 20Ό78

	Тяжелая цепь	ЗЕО Ю N0:	Легкая цепь	ЗЕО Ю N0:
СЦК1	0ΥΤΕΤ3ΥΑΜΝ	1	КАЗОЗУЗЗУЬА	4

СЦК2	ИΙΝΤΝΤ6ΝРТУАОСГТС	2	ΌΆ3ΝΚΑΤ	5
сюкз	КУЗЗЗИУЬОУ	3	00Κ5ΝΚΚΜΥΤ	6

Таблица 2

Последовательность аминокислот СЭЕ-участков вариабельных областей тяжелой и легкой цепей антитела СТА99

	Тяжелая цепь	ВЕС Ю N0:	Легкая цепь	ЗЕ<2 10 ΝΟ:
Οϋκι	сгкнкоугьн	7	КАЗСШУЫУЬА	10
СЮК2	ΗΙΝΡβΝΟΝΤνΥϋΡΚΕΟΕ	В	ОАКТЪАО	11
сюкз	ϋΥΤΥΕΚΑΑΤβΥ	9	СНЕИЗЬРГТ	12

- 12 019517

Таблица 3

8ЕО ΙΌ N0 последовательностей аминокислот для антител 20Ό7, 20Ό78 и СТА99

	Тяжелая цепь	Легкая цепь
Антитело	С сиг- налом	Вариабельный участок	Без сигнала	С сигна- лом	Вариа- бельный участок	Без сигнала
20ϋ7	18	13	29	24	16	32
20Б73	19	14	30	24	16	32
СТЙ99	20	15	31	25	17	33

Антитела, используемые для экспериментов, содержали полноразмерную тяжелую и легкую цепи без сигналов, представленные в табл. 3.

Таблица 4 Сводные данные об антителах 20Ό7, 20Ό78 и СТА99

Аисс челон/о= не определено.

Сравнительный твердофазный иммуноферментный анализ (ЕЬ18А).

96-луночные плоскодонные планшеты Еа1еоп с рекомбинантным ТУЕР человека (5 мкг/млх50 мкл) выдерживали при температуре 4°С в течение ночи. На следующий день блокировали планшеты 5% эмбриональной бычьей сывороткой (ЕВ8) в фосфатно-солевом буферном растворе (РВ8), содержащем 0,1% Твин-20, в течение 2 ч при комнатной температуре. Добавляли различные количества антител в 100 мкл образцов. Планшет промывали 3 раза составом РВ8/Т\хееп и добавляли 100 мкл конъюгированного с пероксидазой хрена антитела козы к человеческому (Вюкоитсе, СататШо, СА), растворенного в соотношении 1:5000 в 100 мкл в планшете и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре (20-25°С). Планшет промывали 3 раза и добавляли в планшет по 500 мкл на лунку 3,3',5,5'-тетраметилбензилиденового (ТМВ; КРЬ, СаййеткЬигд, ΜΌ) субстрата. Проводили измерения на планшетах при 450 нм при помощи микропланшетного ридера (такого как Мо1еси1аг Цеуюек).

Таблица 5

Твердофазный иммуноферментный анализ (ЕЬ18А)

Половина минимальной эффективной концентрации (ЕС₅₀) измеряется в виде молярной концентрации (М). Антитела, включая 20Ό7 человека, 20Ό78 человека и СТА99, демонстрируют специфическое связывание с ТУЕР1 человека при анализе ЕЬ18А.

Проточная цитометрия.

Клетки 624те1 обрабатывали в течение 1 ч в ледяной бане 5 мкг/мл 1дС человека или моноклональными антителами мыши (МАЬ) к ТУЕР1 в 1%-ном В8А/РВ8. Клетки промывали трижды 1%-ным В8А/РВ8 и инкубировали в течение 1 ч в флюоресцирующем изотиоцианате (Е1ТС)-меченого 1дС козы к человеческому. Клетки промывали и анализировали на подходящем приборе проточной цитометрии, таком как Ерюк ХЬ Е1о\х Су1оте1ет (Сои11ет). Анализ методом проточной цитометрии показал, что антитела 20Ό78, как представлено в данных примерах, демонстрируют связывание нативного ТУКР1, экспрессированного в линиях клеток человека §Кте128 и §Кте123 по сравнению с контрольным 1§С₁ человека. Аналогичным образом, анализ методом проточной цитометрии показывает, что представленные в данных примерах антитела СТА99 и 20Ό7 демонстрируют связывание с нативным ТУЕРЕ экспрессированным в линии клеток человека 624те1 по сравнению с контрольным 1§С₁ человека.

- 13 019517

Поверхностный плазмонный резонанс/Анализ на приборе Биакор.

Определение кинетики связывания антител с рекомбинантным ТУКР1 человека при комнатной температуре в лаборатории (20-25°С) проводили методом поверхностного плазмонного резонанса, например, при помощи биосенсора Биакор (Рйагтас1а). Белок ТУКР1 иммобилизовали на чипе СМ5 сенсора и вводили антитела в концентрациях в диапазоне от 0,5 до 100 нМ. Снимали сенсорограммы для каждой концентрации и определяли константы скорости к_п и к^. К₃, также обозначаемую как к^ - константа скорости реакции диссоциации, при помощи программы ΒΙΑ Εναίιιαίίοηδ 3.2. К_а, также обозначаемая как ко_П, представляет собой константу скорости реакции ассоциации (соединения). К_с является мерой связывающей способности (аффинности); К_с рассчитывают из соотношения констант скоростей к_о££/к_оп измеряемых в молярных концентрациях (М). Значения К_а, К,| и К_с для антител, представленных в данных примерах, ТА99, СТА99, 20Э7 и 20Э78, сведены в табл. 6.

Таблица 6

Кинетика связывания антител с рекомбинантным

ТУКР1 человека

Антитело	Ка (1/Мз)	Кй (1/с)	Ко (М)
	^ОЛ
ТА99	9,5x10’	1,6x10·’	1,7x10’” 9
СТА99	2,8x10’	3, 0χ10”’	1, 1х10”3
2007	6,8405	1, 9x10”’	0,2θχ10”9
20075	6, 4х10:=	1, 8x10”’	0, 28*10”9

Биакор-анализ связывания показал, что 20Э7 и 20Э78 с ТУКР1 человека демонстрируют существенную специфическую связывающую способность, соответственно, 20Э7 и 20Э78 действительно являются кандидатами антител для терапии.

Анализ комплементзависимой цитотоксичности (СЭС).

Клеточную линию меланомы человека 624те1 промывали 3 раза и доводили до концентрации 10⁶ жизнеспособных клеток/мл в подходящей среде, такой как ΑΙΜ V Мей1а (1иуйгодеи Ь1£е Тес1то1още5). Помещали 100 мкл клеток в 96-луночные плоскодонные планшеты Еа1сои и инкубировали с моноклональными антителами МАЬ 20Э7 или ЫдС (1аск§оп 1ттииоге8еагсй, ХУеЧ Сгохе. РА), начиная с концентрации 3,7 мкг/мл, разбавляя 1:3, в течение 1 ч при 37°С. Добавляли комплимент кролика с низкой токсичностью (1оте-Тох-М) (Сейаг1апе ЬаЬк, ^ейЬшу, ΝΥ), разбавленный 1:5 в ΑΙΜ V по 50 мкл/лунку и инкубировали в течение 1 ч при 37°С. Проводили подсчет жизнеспособных клеток при помощи Тгурап В1ие (1пхйгодеп Ы£е Тес1то1още5).

В табл. 7 представлены процентные данные по цитотоксичности при различных концентрациях антител, полученные в результате СЭС-анализа. Полученные данные показывают, что антитела 20Э7 и СТА99 индуцируют комплементзависимую цитотоксичность по отношению к ТΥΚР1 (+) 624те1 клеткам человека ίη νίίτο. 20Э7 вызывали зависимый от дозировки лизис клеток 624те1, опосредованный комплементом, причем полный лизис клеток при данном исследовании достигался при концентрации антител 3,7 мкг/мл. Соответственно, существует сильный ответ иммунного эффектора на СЭС в случае антител 20Э7 и СТА99. % специфического лизиса = определенный % цитотоксичности - % цитотоксичности отрицательного контроля.

Таблица 7

Данные СЭС-анализа, показывающие активацию комплемента антителами 20Э7 и СТА99

Концентрация антител (мкг/мл)	СТА 9 9	20ϋ7
3,7	95%	100%
1,23	54%	84%
0, 41	53%	38%
0, 14	17%	35%
0, 05	9, 5%	24%

Антителозависимая клеточная цитотоксичность (АЭСС) в отношении меланомы человека ίη νίίτο.

Клетки 624те1 собирали и промывали в соответствующей среде, такой как среда ΑΙΜ V тей1а (1тйтодеп Ь1£е Тесйпо1од1е8), и помещали клетки в 96-луночный планшет Еа1соп с И-образным дном с плотностью 10000 клеток/лунку в объеме 100 мкл. Добавляли антитела с концентрацией 5 мкг/мл в объеме 50 мкл и инкубировали при 37°С в течение 0,5 ч с клетками-мишенями. Эффекторные клетки добавляли в объеме 50 мкл в различных соотношениях Е:Т (эффектор:мишень). Далее инкубировали планшеты в течение 4 ч при 37°С. После инкубации центрифугировали содержимое планшетов при 800 д и

- 14 019517

100 мкг супернатанта аккуратно переносили в 96-луночные плоскодонные планшеты. Добавляли реагент, определяющий лактатдегидрогеназу, указанный производителем (Коске), и проводили детектирование при 490 нм. Контроль для анализа: спонтанный лизис мишени, максимальный лизис мишени (с добавлением 50 мкл 4% тритона).

Лизис зависит от соотношения эффектора и мишени, при этом лизис 50% клеток-мишеней происходит при соотношении эффектор:мишень 100:1. При фиксированной концентрации (5 мкг/мл) 20Ό7 и СТА99 активируют лизис клеток 624те1. В табл. 8 представлен процент клеточной цитотоксичности при различных отношениях клеток эффекторов к клеткам опухолей (Е:Т) в результате АОСС-анализа. Антитела 20078, 20Ό7 и СТА99 индуцируют антителозависимую клеточную цитотоксичность в отношении ТУКР1 (+) 624те1 клеток человека ίη νίίτο. Также наблюдается сильный иммунноэффекторный ответ на АОСС для антител 20Ό78, 20Ό7 и СТА99.

% цитотоксичности = (экспериментальное значение - спонтанный лизис мишени)/(максимальный лизис - спонтанный лизис мишени) х 100.

Таблица 8

Антителозависимая клеточная цитотоксичность (АОСС) в отношении меланомы человека ίη νίίτο

	%
Соотношение Е:Т	20Ώ7
100 :1	43%
50:1	33%
25:1	31%
12.5:1	17%

цитотоксичности
20ϋ75	СТА 9 9
56%	49%
47%	39%
43%	17%
23%	12%

Анализ стабильности 20Ό78 и 20Ό7.

20Ό7 и 20Ό78 вводили в гель для 8О8-РАСЕ (электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия). Проводили электрофорез в геле с использованием прибора ВюКаб до тех пор, пока краситель бромфеноловый синий не доходил до конца гелевого блока. Проводили визуализацию разделенных белков при помощи красителя Кумасси.

При анализе методом 8Ό8 РАСЕ более стабильные молекулы проявляются в виде одной полосы с несколькими (при наличии) свободными легкими или тяжелыми цепями, присутствие свободных легких цепей и свободных тяжелых цепей является свидетельством менее стабильных молекул. Анализ методом 8Ό8 РАСЕ антител 20Ό7 показал наличие явно свободных легких и тяжелых цепей. Анализ методом 8Ό8 РАСЕ антител 20Ό78 показал наличие очень небольшого количества свободных легких и тяжелых цепей. Соответственно, 20Ό78 является более стабильной молекулой 1дС_ь чем 20Ό7.

Эффективность СТА99 и 20Ό7 в отношении лечения ксенотрансплантатов меланомы человека.

Для последующих исследований под кожей рассчитывали объемы опухолей по формуле [π/6(^1χ^2χ^2)], где \У1 представляет собой диаметр наибольшей опухоли и \У2 представляет собой диаметр наименьшей опухоли. % Т/С = 100 х (Вылеченный объем/Начальный объем)/(Объем контроля/Начальный объем). Статистический анализ проводили с использованием традиционных методов с доверительной вероятностью (р). Для исследований под кожей значение р рассчитывали на основе объема опухоли у животных, получающих антитела к ТУКР, по отношению к объему опухоли контрольных животных. Для последующих исследований метастазов измеряли подавление опухоли путем подсчета узелков на поверхности легких. % подавления = 100 х (контрольные узелки# - вылеченные узелки#)/(контрольные узелки#). Статистический анализ проводили с использованием традиционных методов с доверительной вероятностью (р). Для исследований метастазов значение р рассчитывали на основе количества наблюдаемых узелков у животных, получающих антитела к ТУКР, по отношению к количеству узелков, наблюдаемых у контрольных животных.

Активность самостоятельного действия антитела к ТУКР1 ίη νίνο на ксенотрансплантатных моделях меланомы человека.

Культивированные клетки 624те1 собирали, промывали и повторно суспендировали в растворе 50/50 Ма1пде1 и среды КРМ1 1640 (10% РВ8 инактивировано теплом). Для моделирования подкожной опухоли вводили под кожу 2х10⁶ клеток в левый бок бестимусных (шбе) мышей. Когда опухоли достигали 200 мм³, вводили мышам антитела к ТУКР1 или контроль - 1дС человека, введение антител проводили по 1 мг/мышь три раза в неделю. Измеряли опухоли при помощи штангенциркуля два раза в неделю и вычисляли % Т/С. Для оценки активности антител к ТУКР1 в качестве самостоятельного агента ίη νίνο на ксенотрансплантатных моделях меланомы человека рост 8Кте128-ксенотрансплантатов был подавлен под действием 20Ό7 по сравнению с контролем-1дС человека (Т/С=51%; Р=0,01 на 43 день). Было также показано, что созданные 624те1 опухоли были значительно подавлены под действием 20Ό7. Рост опухоли был подавлен и достигал статистической значимости на 16 день после начала лечения антите

- 15 019517 лами (Т/С=44%; Р=0,01). Также 20И7 проверяли на противоопухолевую активность по действию на дополнительные ксенотрансплантаты меланомы человека. Было показано, что клеточные линии А375 и 1102те1 были статистически значимо подавлены при самостоятельном действии 20И7 за 11 дней после начала лечения антителом (Т/С=42%; Р=0,01 и Т/С=43%; Р=0,004 для А375 и 1102те1 соответственно). Лизаты кожи различных видов инкубировали с ТА99 (5 мкг/мл) в течение 2 ч при комнатной температуре. Далее указанные лизаты осаждали протеином А и подвергали электрофорезу в геле 8И8-РА6Е в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях с использованием градиента четырех 12% гелей. После электрофореза гели переносили на ΡνϋΡ-мембрану (ЧпуЦгодеп ЫГе ТесНгю^щеО. Данную мембрану обрабатывали 20И78 (5 мкг/мл), а затем НВР-меченым 1д6 к человеческому (2утеб, δοιιΐΐι 8ап Επίπαγο, СА). Блот детектировали на хемилюминесцентном субстрате (КРЬ, СаИЬеткЬигд, МИ). Полученные данные показали, что 20И7 легко дает поперечную реакцию с ТУКР1 мыши. Тем не менее, у любых животных, получавших 20И7, не проявлялось явной токсичности. Масса тела и общий внешний вид животных, получавших 20И7, не существенно отличались по сравнению с контрольными мышами, получавшими 1§С.

Влияние дозы антитела к ТУКР1 в качестве самостоятельного агента на активность на ксенотрансплантатных моделях меланомы человека ш νΐνο.

Смешанные 8кте128-клетки в растворе 50/50 Ма1пде1 и среды ВРМ1 1640 (10% РВ8, инактивированный теплом) 2х10⁶ вводят в виде инъекции в левый бок бестимусных (пибе) мышей. Когда опухоли достигали 200 мм³, вводили мышам антитела к ТУКР1 (6, 20 или 60 мг/кг) или контроль - 1дС человека. Измеряли опухоли при помощи штангенциркуля два раза в неделю и вычисляли % Т/С. Исследование влияния дозы 20И7 на ксенотрансплантаты 8Кте128 показало зависимость противоопухолевого ответа от дозы. Даже при дозе 6 мг/кг 20И7 значительно подавляли опухоли (Т/С=69%; Р<0,0001).

Противоопухолевые эффекты при каждой дозе были статистически значимыми: 6 и 20 мг/кг (Т/С=50%; Р=0,04), 6 и 60 мг/кг (Т/С=19%; Р<0,003).

Активность самостоятельного действия антитела к ТУВР1 ш νΐνο на двух моделях метастатической меланомы.

В16ВИ6 представляет собой агрессивную и спонтанно возникающую меланому мышей. Она образует метастазы в легких бестимусных мышей после внутривенного введения. Культивированные 8Кте123 и В16ВИ6 клетки меланомы собирали, промывали и повторно суспендировали в среде ВРМ1 1640 (10% РВ8, инактивированного теплом).

Модель 1: 1х 10⁵ В16ВИ6 клеток вводили в виде инъекции внутривенно. На второй день после инъекции опухолей мышам вводили антитела к ТУВР1 или контроль - 1дС человека в трех различных концентрациях (200, 500 мкг/мышь и 1 мг/мышь). Мышей умерщвляли на 20-й день, удаляли легкие, подсчитывали узелки на поверхности легких и рассчитывали процент подавления. На поверхности легких мышей, обработанных 1дС человека, обнаружены тяжелые метастазы, сравнительно меньшие метастазы обнаружены у обработанных 20И7 животных. Все три концентрации 20И7 снижали уровень легочных метастазов (подавление = 65, 74 и 95% соответственно).

Модель 2: 1х10⁵ 8Кте123 клеток человека вводили в виде инъекции внутривенно. На второй день после инъекции опухолей мышам вводили антитела к ТУВР1 или контроль - 1дС человека в трех различных концентрациях (200 и 500 мкг/мышь). Мышей умерщвляли на 20-й день, удаляли легкие, подсчитывали узелки на поверхности легких и рассчитывали процент подавления. Количество метастатических узелков значительно снижено при лечении 20И7 или СТА99 при дозе 200 и 500 мкг/доза. 20И7 сокращали метастазы на 58 и 73% соответственно. СТА99 сокращали метастазы на 63 и 75% соответственно. Данные результаты показывают, что в двух различных моделях 20И7 и СТА99 подавляют метастазы меланомы.

Исследование по сравнению антител 20И7 и 20И78 в отношении подавления роста опухоли ш νΐνο на подкожных ксенотрансплантатах и метастатических моделях меланомы человека.

Для модели подкожной опухоли собирали, промывали и повторно суспендировали культивированные клетки 624те1 в 50/50 растворе Ма1пде1 и среды ВРМ1 1640 (10% РВ8, инактивированный теплом), затем вводили 2х10⁶ 624те1 клеток подкожно в виде инъекции в левый бок бестимусных мышей. Когда опухоли достигали 200 мм³, вводили мышам 20И7 или 20И78 40 мг/кг два раза в неделю. Измеряли опухоли при помощи штангенциркуля два раза в неделю и рассчитывали % Т/С. В модели подкожного ксенотрансплантата 624те1 антитела 20И7 подавляли рост опухоли Т/С=21%, а для 20И78 Т/С=25%. Как 20И7, так и 20И78 подавляли рост опухоли в модели ксенотрансплантата.

В случае метастатической модели собирали, промывали и повторно суспендировали культивированные клетки 888те1 в среде ВРМ1 1640 (10% РВ8, инактивированный теплом), вводили 888те1 клетки внутривенно в виде инъекции. На второй день после инъекции опухолей мышам вводили антитела к ТУКР1 или контроль - 1дС человека. Мышей умерщвляли на 20-й день, удаляли легкие, подсчитывали узелки на поверхности легких и рассчитывали процент подавления. В метастатической модели 888те1 у бестимусных мышей как 20И7, так и 20И78 значительно подавляли метастазы на поверхности легких: 20И7 ингибирование = 77%, р=0,0005; 20И78 ингибирование = 80%, р=0,0005. Как 20И7, так и 20И78

- 16 019517 уменьшали метастазы меланомы в метастатической модели.

Лечение комбинацией 20Ό7 и дакарбазином (ЦТ1С) демонстрировало более сильную противоопухолевую активность по отношению к ксенотрансплантатам человека по сравнению с монотерапией.

Для подкожной модели собирали, промывали и повторно суспендировали культивированные клетки 624те1 в растворе 50/50 Ма!пде1 и среды КРМ1 1640 (10% ЕВБ, инактивированный теплом). Вводили 2х10⁶ 624те1 клеток в виде инъекции в левый бок бестимусных мышей. Когда опухоли достигали 200 мм³, вводили мышам антитела к ТУКР1, ЭТ1С или комбинацию антител к ТУКР1 и ЭТ1С. Антитела вводили 40 мг/кг один раз в неделю. ЭТ1С вводили 5 мг/кг один раз в неделю. Измеряли опухоли при помощи штангенциркуля два раза в неделю и рассчитывали % Т/С. Для метастатической модели собирали, промывали и повторно суспендировали культивированные клетки меланомы БКте123, 888те1 и В16 в среде ЕРМ1 1640 (10% ЕВБ, инактивированный теплом). Вводили БКте123, 888те1 и В16 клетки меланомы внутривенно в виде инъекции. На второй день после инъекции опухоли вводили мышам антитела к ТУКР1 или контроль - 1дС человека. Мышей умерщвляли на 20-й день, удаляли легкие, подсчитывали узелки на поверхности легких и рассчитывали процент подавления.

Как показано на подкожной модели, лечение комбинацией 20Ό7 и ИТ1С подавляло рост опухоли значительно лучше, чем 20Ό7 (р<0,001) или ИТ1С (р<0,001) по отдельности.

Таблица 9

Сводные данные по противоопухолевым активностям 20Ό7 ίη у1уо

Модель	Опухоль	Измерение	2007	20О7+ОТ1С
Метастатическая	ЗКте123	% подавления	80%	9 9%*
Метастатическая	888 те1	% подавления	77%	96%*
Метастатическая	В16	% подавления	95%	н/о
Подкожная	62 4те1	% Т/С	50% Р=0,004	19% Р<0,0001

В табл. 9 представлены сводные данные по противоопухолевым активностям ίη у1уо для 20Ό78 по сравнению с монотерапией 20Ό7 или ИТ1С на 4 моделях. Противоопухолевые активности 20Ό7 ίη у1уо представлены в виде процента подавления в метастатических моделях (* - статистическая значимость; н/о - не определено). Противоопухолевые активности 20Ό7 ίη у1уо представлены в виде процента Т/С на подкожных моделях. Лечение комбинацией 20Ό7 и дакарбазином (ИТ1С) показало более высокую противоопухолевую активность по сравнению с монотерапией.

Claims (12)

1. Моноклональное антитело или его фрагмент, специфически связывающиеся с ТУКР1 (тирозиназазависимый белок-1) человека (ЗЕО ΙΌ N0: 28), которые содержат

Ун, имеющую последовательность аминокислот 0У0ЬУ03СЗЕЬККР0АЗУК13СКА5СУТГТЗУАМ№ТУК0АР<30<ЗЬЕЗМ6И1НТНТСНРТУА0СРТОКРУ

ЕЗМРТЗУЗТАУЬОХЗЗЦКАЕОТАХУУСАРЕУЗЗЗИУШУИОООТЦУТУЗЗ (ЗЕ<2 т N0:14) ;

СИНЫ, имеющую последовательность

КАЗОЗУЗЗУЪА (ЗЕф 1Ю N0:4);

С0ЕБ2. имеющую последовательность ϋΑ3ΝΕΑΤ (5Е0 Ю N0:5);

С0ЕБ3. имеющую последовательность

Ω2Κ3Ν№ΜΥΤ (5Е0 ΙΏ N0:6).

2. Антитело или его фрагмент по п.1, которые содержат

У_ъ, имеющую последовательность аминокислот Е1УЬТОЗРАТЬЗЬЗР<ЗЕЕАТЬЗСЕАЗОЗУЗЗУЬАНУООКРССАРЕШ1УОАЗЫЕАТ01 РАЕГЗ

С8С8СТПРГОТ188ЬЕРГОРАУУУС00Е8ЫИЬМУТР(3(2СГКЬЕ1К (5Е<2 ГО N0:16)

У_н, имеющую последовательность аминокислот 0ν06νΰ3Ο3ΕΕΚΚΡΘΑ3νΚΙ30ΚΑ3ΟΥΤΓΤ3ΥΑΜΝΝνΚ0ΑΡ<3<3ΘΒΕ3Μ<3ΝΙΝΤΝΤ0ΝΡΤΥΑ0ΟΓΤΟΚΓν

ЕЗМРТЗУЗТАУЬа133ЬКАЕОТА1УУСАРЕУЗЗЗИУЬОУИ60СТЬУТУЗЗ (ЗЕО ГО N0:14)

3. Антитело или его фрагмент по любому из предшествующих пунктов, содержащие тяжелую цепь, соответствующую ЗЕО ΙΌ N0: 30, и легкую цепь, соответствующую ЗЕО ΙΌ N0: 32.

4. Антитело или его фрагмент по любому из пп.1-3, содержащие две тяжелые цепи, соответствующие ЗЕО ΙΌ N0: 30, и две легкие цепи, соответствующие ЗЕО ΙΌ N0: 32.

5. Выделенная нуклеиновая кислота, содержащая последовательность нуклеотидов, кодирующих антитело или фрагмент по любому из пп.1-4.

6. Вектор экспрессии, содержащий нуклеиновую кислоту по п.5, функционально связанную с элементами для контроля экспрессии, так чтобы возможно было экспрессировать кодируемое антитело или фрагмент.

7. Рекомбинантная клетка, содержащая вектор экспрессии по п.6, способная продуцировать антите

- 17 019517 ло или фрагмент по любому из пп.1-4.

8. Антитело или фрагмент, получаемые посредством культивирования рекомбинантной клетки по п.7 и выделения указанного антитела или фрагмента.

9. Фармацевтическая композиция для лечения рака, содержащая антитело или фрагмент по любому из пп.1-4 или 8 в эффективном количестве и фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или эксципиент.

10. Применение антитела или фрагмента по любому из пп.1-4 или 8 в качестве лекарственного средства для лечения рака.

11. Применение антитела или фрагмента по любому из пп.1-4 или 8 при лечении рака.

12. Применение по п.11, где рак представляет собой злокачественную меланому.