CN101970500B - 抗tyrp1抗体 - Google Patents

抗tyrp1抗体 Download PDF

Info

Publication number
CN101970500B
CN101970500B CN2009801085150A CN200980108515A CN101970500B CN 101970500 B CN101970500 B CN 101970500B CN 2009801085150 A CN2009801085150 A CN 2009801085150A CN 200980108515 A CN200980108515 A CN 200980108515A CN 101970500 B CN101970500 B CN 101970500B
Authority
CN
China
Prior art keywords
antibody
tyrp1
seq
sequence
people
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN2009801085150A
Other languages
English (en)
Other versions
CN101970500A (zh
Inventor
X·康
P·J·鲍德尔斯
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
ImClone LLC
Original Assignee
ImClone LLC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=40790741&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CN101970500(B) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by ImClone LLC filed Critical ImClone LLC
Publication of CN101970500A publication Critical patent/CN101970500A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN101970500B publication Critical patent/CN101970500B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3053—Skin, nerves, brain
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/734—Complement-dependent cytotoxicity [CDC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本发明提供了以与TYRP1特异性小鼠抗体TA99相当或更高的亲和力结合人TYRP1抗原的完全人抗体和嵌合抗体。本发明还提供了编码和表达这些抗体的多核酸和宿主细胞。本发明还提供了通过施用单独的或者与抗癌剂或治疗相组合的有效量抗体，在哺乳动物中调节TYRP1活性、治疗癌细胞生长以及治疗恶性黑素瘤的方法。

Description

抗TYRP1抗体
交叉引用
本申请要求2008年3月12日提交的美国临时申请序列号No.61/069199的权益。
技术领域
本发明涉及人抗体和嵌合抗体，包括其片段或部分，其为人酪氨酸酶相关蛋白-1(TYRP1)特异性的。该抗体用于治疗癌细胞的生长，并且可单独使用或与抗肿瘤剂或治疗联合使用。
背景技术
人酪氨酸酶相关蛋白-1(TYRP1)，也称为gp75，(WO 91/14775)(SEQID NO：28)是参与黑素生物合成的黑素体膜糖蛋白。其主要在黑素细胞的黑素体内发现，也发现在黑素细胞和人黑素瘤的细胞表面上表达。
TYRP1抗原是高度免疫原性的。已在黑素瘤患者中鉴定到针对TYRP1的抗体和T细胞。细胞和体液应答似乎在体内都有效地去除黑素瘤。黑素瘤反应性T细胞的过继转移也导致肿瘤消退。由TYRP1疫苗诱导的抗体应答也可在动物中抑制黑素瘤生长和转移。
尽管已经研究了针对黑素瘤的多种治疗选择，包括小分子抑制剂、化学治疗剂、免疫治疗，包括疫苗(例如美国专利6,168,946)、基因治疗/免疫刺激剂以及抗血管发生剂(angiogenics)，但是，目前尚没有针对黑素瘤患者的有效治疗。对于此未满足的医学需求，非常有理由开发新的治疗。
动物研究已经发现抗体TA99。TA99(IgG2a)，人和鼠TYRP1特异性的鼠单克隆抗体(MAb)，在体内定位于皮下人黑素瘤。参见Welt等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：4200-4204(1987)和美国专利4,798,790。TA99治疗在小鼠中抑制肿瘤生长和转移。参见Takechi等人，Clin CancerRes.2：1837-42(1996)。
用TA99治疗的小鼠经常失去毛色(褪色)，表明破坏了皮肤中的黑素细胞。Fc受体介导的效应器活化似乎在去除TA99靶向的细胞中起到关键的作用。TA99的抗肿瘤作用在FcR敲除小鼠中显著降低。参见Clynes等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：652-656(1998)。但是，TA99的小鼠本性意味着，由于其潜在的免疫原性问题以及其活化下游免疫效应器功能的能力会受限制，妨碍了其用作人体中的治疗。
因此，需要提供有效治疗黑素瘤的替代性抗TYRP1抗体。本发明提供了有效治疗黑素瘤的替代性抗TYRP1抗体。
另外，需要提供相比于本领域中已知的抗体而言具有对TYRP1提高的结合亲合力的替代性抗TYRP1抗体。本发明提供了相比于本领域中已知的抗体而言具有对TYRP1提高的结合亲合力的替代性抗TYRP1抗体。
另外，需要提供在人体中免疫原性降低以及活化下游免疫效应器功能的能力(例如抗体依赖性细胞毒性(ADCC))改善的替代性抗TYRP1抗体。本发明提供了相比于本领域中已知的抗体，具有在人体中免疫原性降低以及活化下游免疫效应器功能的能力(例如抗体依赖性细胞毒性(ADCC))改善的嵌合抗体和人抗TYRP1抗体。
另外还需要提供通过减少蛋白质错误折叠和错误加工来改善稳定性的替代性抗TYRP1抗体。本发明的优选抗体通过减少蛋白质错误折叠和错误加工改善了稳定性。
发明内容
本发明涉及结合黑素瘤抗原TYRP1(SEQ ID NO：28)的人和嵌合单克隆抗体，以及其片段。
本发明的一个实施方案是在环境实验室温度(20℃-25℃)下以0.1×10-9M至1.6×10-9M范围的解离常数KD特异性结合人TYRP1的单克隆抗体，其中该KD值由表面等离振子共振确定。在本发明的其他实施方案中，该单克隆抗体是嵌合的或人的。这些抗体能够保留特异性结合人TYRP1能力的片段是本发明的一部分，尽管的这些片段的解离常数不在该范围内。
在本发明的其他一些实施方案中，该单克隆抗体以约0.1×10-9M至约1.2×10-9M、约0.1×10-9M至约0.8×10-9M、约0.1×10-9M至约0.4×10-9M、约0.2×10-9M至约1.2×10-9M、约0.2×10-9M至约0.8×10-9M、约0.2×10-9M至约0.4×10-9M、约0.2×10-9M至约0.3×10-9M或约0.28×10-9M的KD特异性结合人TYRP1。
本发明的一个实施方案是结合TYRP1的抗体或其片段，该TYRP1包含具有序列GYTFTSYAMN(SEQ ID NO：1)的CDRH1，具有序列WINTNTGNPTYAQGFTG(SEQ ID NO：2)的CDRH2，具有序列RYSSSWYLDY(SEQ ID NO：3)的CDRH3，具有序列RASQSVSSYLA(SEQ ID NO：4)的CDRL1，具有序列DASNRAT(SEQ ID NO：5)的CDRL2，以及具有序列QQRSNWLMYT(SEQ ID NO：6)的CDRL3，其中该抗体还包含该CDR序列之一中的氨基酸取代。在另一个实施方案中，上述CDR在CDR序列之一中不具有氨基酸取代。在另一个实施方案中，具有上述CDR的抗体以0.1×10-9M至1.6×10-9M范围的解离常数KD特异性结合人TYRP1。
在本发明的另一个实施方案中，特异性结合TYRP1的抗体或其片段还包含下述CDR序列之一中的氨基酸取代，该TYRP1包含具有GFNIKDYFLH(SEQ ID NO：7)的CDRH1、具有序列WINPDNGNTVYDPKFQG(SEQ ID NO：8)的CDRH2、具有序列DYTYEKAALDY(SEQ ID NO：9)的CDRH3、具有序列RASGNIYNYLA(SEQ ID NO：10)的CDRL1、具有序列DAKTLAD(SEQ ID NO：11)的CDRL2，以及具有序列QHFWSLPFT(SEQ ID NO：12)的CDRL3。在另一个实施方案中，上述CDR(SEQ ID NO：7-12)没有任何氨基酸取代。
本发明的另一个实施方案是结合TYRP1的抗体或其片段，其包含
具有下述序列的VL：
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDA
SNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWLMYTFGQG
TKLEIK(SEQ ID NO：16)
以及具有下述序列的VH
QVQLVQSGSELKKPGASVKISCKASGYTFTSYAMNWVRQAPGQGLECMG
WINTNTGNPTYAQGFTGRFVFSMDTSVSTAYLQISSLKAEDTAIYYCAPRY
SSSWYLDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：13)
或
QVQLVQSGSELKKPGASVKISCKASGYTFTSYAMNWVRQAPGQGLESMG
WINTNTGNPTYAQGFTGRFVFSMDTSVSTAYLQISSLKAEDTAIYYCAPRY
SSSWYLDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：14).。
本发明的另一个实施方案是包含SEQ ID NO：29的重链和SEQ IDNO：32的轻链；或者SEQ ID NO：30的重链和SEQ ID NO：32的轻链的单克隆抗体。在一个实施方案中，抗体包含SEQ ID NO：29的两条重链和SEQID NO：32的两条轻链，或者包含SEQ ID NO：30的两条重链和SEQ IDNO：32的两条轻链。这些抗体的TYRP1结合片段是本发明的一部分。
本发明还涉及编码这些抗体及其部分的分离的DNA。本发明的其他一些实施方案包含编码该抗体或其片段的核苷酸序列的分离的多核酸；包含与表达序列连接的该核苷酸序列的表达载体或者包含该表达载体的重组宿主细胞，或者其中该细胞表达该抗体或其片段的重组宿主细胞或其后代。本发明的另一个实施方案是产生或纯化抗体或其片段的方法，其包括在允许该抗体或其片段表达的条件下培养该细胞。
另外，本发明涉及通过施用有效量抗体抑制癌细胞生长的方法，以及治疗黑素瘤的方法，其全部是在哺乳动物中。本发明的一个实施方案是使用上述抗体或其片段作为药物。在另一个实施方案中，上述抗体或其片段将用于治疗癌症，包括但不限于恶性黑素瘤。
在另一个实施方案中，本发明提供了本发明抗体在制备用于治疗癌症的药物中的用途。在一个优选实施方案中，该癌症是恶性黑素瘤。
该抗体可单独使用或与抗肿瘤剂或治疗联合使用。本发明的一个实施方案是将上述抗体与其他抗癌剂或治疗联合使用。在另一个实施方案中，该抗癌剂是达卡巴嗪(dacarbazine)。
发明详述
本发明提供了TYRP1抗原特异性的人抗体和嵌合抗体以及其片段，以及编码该抗体的分离或纯化多核苷酸序列。本发明的抗体可用于治疗肿瘤疾病，包括实体和非实体肿瘤，以及用于治疗过度增殖性疾病。除非另作说明，术语抗体包括结合TYRP-1的片段。本文的结合参数是针对全长抗体，不针对片段，其由于大小不同必然具有不同的结合参数。
天然抗体通常具有两条相同的重链和两条相同的轻链，每个轻链通过链内二硫键与重链共价相连。多个二硫键还将两条重链彼此相连。本文使用的术语“抗体”包括包含4条多肽链的免疫球蛋白分子，通过二硫键彼此相连的两条重链(H)和两条轻链(L)。各个链可折叠成具有类似大小的结构域(110-125个氨基酸)和结构，但是具有不同功能。
轻链可包含一个可变结构域(本文缩写为VL)和/或一个恒定结构域(本文缩写为CL)。抗体(免疫球蛋白)的轻链是κ或λ轻链。本文使用的表述VL旨在包括κ型轻链(Vκ)和λ型轻链(Vλ)的可变区。轻链恒定区由一个结构域CL构成。
重链也可包含一个可变结构域(本文缩写为VH)和/或根据抗体的类别或同种型，三个或四个恒定结构域(CH1、CH2、CH3和CH4)(本文总体缩写为CH)。在人中，该同种型是IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，IgA和IgG进一步又分为亚类或亚型(IgA1-2和IgG1-4)。本发明包括任意上述类型或亚类(同种型)的抗体。人IgG1是本发明抗体的优选同种型。
通常，该可变结构域在不同抗体之间显示相当多的氨基酸序列可变性，特别是在抗原结合部位处。在每个VL和VH中发现称为高可变区或者互补决定区(CDR)的三个区域，其由称为构架可变区(FR)的较少可变的区域所支持(support)。根据Kabat规则(Kabat等人Ann.NY Acad.Sci.190：382-93(1971)；Kabat，等人，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第五版，U.S.Department of Health和Human Services，NIHPublication No.91-3242(1991))将氨基酸分配给特定CDR区域或结构域。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，从氨基端到羧基端按以下顺序排列：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。
由VL和VH结构域组成的抗体的部分称为Fv(Fragment variable)并构成抗原结合部位。单链Fv(scFv)是在一条多肽链上含有VL结构域和VH结构域的抗体片段，其中一个结构域的N端和另一个结构域的C端通过柔性接头相连(参见，例如美国专利No.4,946,778(Ladner等人)；WO88/09344，(Huston等人)；WO 92/01047(McCafferty等人)描述了scFv片段在可溶性重组遗传展示包装(比如噬菌体)表面上的展示。
用于产生单链抗体的肽接头可以是柔性肽，其选择以确保VL和VH结构域发生正确的三维折叠。该接头一般为10至50个氨基酸残基。优选地，该接头一般为10至30个氨基酸残基。更优选地，该接头一般为12至30个氨基酸残基。最优选的接头是15至25个氨基酸残基。这些接头肽的实例包括(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3。
“分离抗体”是(1)从组分的混合中部分、基本上或完全纯化的抗体；(2)已从组分的天然环境中鉴定和分离和/或回收的抗体；(3)单克隆抗体；(4)不含来自相同物种的其他蛋白质的抗体；(5)由来自不同物种的细胞表达的抗体；或者(6)自然界不存在的抗体。其天然环境的杂质组分是会干扰抗体的诊断或治疗用途的物质，其可包括酶、激素及其他蛋白质或非蛋白质溶质。分离抗体的实例包括已经亲合纯化的抗体，由杂交瘤或其他细胞系体外产生的抗体，以及来自于转基因小鼠的人抗体。
本文使用的术语“单克隆抗体”指获得自基本上纯(homogeneous)的抗体群体的抗体，例如，包含基本上相同的各个抗体的群体，可能存在的可能天然突变或者次要翻译后变化除外。单克隆抗体是高度特异性的，针对单个抗原位点(也称为决定簇或表位)。此外，与通常包括针对不同决定簇的不同抗体的常规(多克隆)抗体制剂不同，每个单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。修饰形式“单克隆的”表示获得自基本上纯的抗体群体的抗体特性，不被视为需要通过任何特定方法生产抗体。
本文使用的术语“抗体”也包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中重链和/或轻链的部分与来自于特定物种或属于特定抗体类型或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而该链的其余部分与来自于另一个物种(例如小鼠或大鼠)或属于另一个抗体类型或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及这些抗体的片段，只要它们显示希望的生物学活性。参见例如Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6851-6855(1984))。因此，本发明包括，例如，包含嵌合重链和/或嵌合轻链的嵌合抗体。嵌合重链可包含与非人抗体的重链恒定区融合的本文所述的任何重链可变区(VH)或者其突变体或变体。嵌合轻链可包含与非人抗体的轻链恒定区融合的本文所述的任何轻链可变区(VL)或者其突变体或变体。
本文使用的术语“人抗体”，包括具有对应于人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体(如Kabat等人(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第五版，U.S.Department of Health和HumanServices，NIH Publication No.91-3242所述)。本发明的人抗体可包含不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如体外随机或位点特异性诱变引入或者体内体细胞突变引入的突变)，例如在CDR中。人抗体可具有至少一个由氨基酸残基替换的位置，例如不由人种系免疫球蛋白序列编码的活性增强的氨基酸残基。但是，本文使用的术语“人抗体”不旨在包括其中来自于另一个哺乳动物物种种系(例如小鼠)的CDR序列移植于人构架序列上的抗体。
短语“重组人抗体”包括通过重组方式制备、表达、产生或分离的人抗体，例如使用转染进宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体，分离自重组、组合人抗体文库的抗体，分离自人免疫球蛋白基因转基因的动物的抗体，或者通过包括将人免疫球蛋白基因序列与其他DNA序列剪接的任何其他方式制备、表达、产生或分离的抗体。这些重组人抗体具有来自于人种系源免疫球蛋白序列的可变区和恒定区(参见Kabat等人，见上文)。
Fc(片段结晶(Fragment crystallization)是包含成对重链恒定结构域的抗体部分或片段的名称。在IgG抗体中，例如，Fc包含CH2和CH3结构域。IgA或IgM抗体的Fc还包含CH4结构域。Fc与Fc受体结合、补体介导的细胞毒性和ADCC的活化相关联。对于作为多个IgG样蛋白质复合物的诸如IgA和IgM的抗体，复合物形成需要Fc恒定结构域。
因此，本发明的抗体包括但不限于天然抗体、抗体、人抗体、人源化抗体、重组人抗体、单克隆抗体、其消化片段、特定部分和变体，包括抗体模似物或者包含模拟抗体或其特定片段或部分的结构和/或功能的抗体部分；其各自含有至少一个CDR。功能性片段包括结合TYRP1抗原的抗原结合片段。例如，抗体片段能够结合TYRP1或其部分，本发明所涵盖的包括二价片段例如具有完整链内二硫键的(Fab′)2，单价片段例如Fab(抗原结合片段)，其表示由VL、CL、VL、CH1结构域组成并且未保留重链铰链区(例如通过木瓜蛋白酶消化)的抗体片段，保留重链绞链区的fabs，facb(例如通过纤维蛋白溶酶消化)，F(ab′)2，缺少二硫键的Fab′，pFc′(例如通过胃蛋白酶或纤维蛋白溶酶消化)，Fd(例如通过胃蛋白酶消化，部分还原和再聚集)以及Fv或scFv(例如通过分子生物学技术)。抗体片段还旨在包括，例如结构域缺失的抗体、线性抗体、单链抗体、scFv、单结构域抗体、多价单链抗体、由抗体片段形成的多特异性抗体，包括特异性结合抗原的双抗体、三抗体等。
绞链区将抗体的Fab和Fc部分分开，提供了Fab彼此之间以及相对于Fc的可动性，以及包括多个二硫键用以两个重链的共价连接。
本发明的抗体或其片段是TYRP1特异性的。抗体特异性指抗体选择性识别抗原的特定表位。例如，本发明的抗体或其片段，可以是单特异性的、双特异性的或者多特异性的。双特异性抗体(BsAb)是具有两种不同抗原结合特异性或位点的抗体。多特异性抗体具有超过两种不同的抗原结合特异性或位点。在抗体具有超过一种的特异性时，所识别的表位可以与单个抗原或者与多于一个的抗原相关联。因此，本发明提供了结合两种不同抗原的双特异性抗体或其片段，其具有至少一种对TYRP1的特异性。
本发明提供了TYRP1特异性的分离抗体或其片段。TYRP1蛋白是哺乳动物的，其优选是人的。在一个特别优选的实施方案中，本发明的抗体能够结合人TYRP1和小鼠TYRP1[Shibahara等人，Nucleic Acids Res.14(6)2413-2427(1986)]，因此，可用于临床前和临床体内研究。本发明的抗体能够具有一种或多种下列活性：1)显示专门对TYRP1的高结合亲和性；和2)体外和体内抑制肿瘤生长。
可以根据亲合力和/或抗体亲抗原性确定本抗体或其片段对TYRP1的特异性。由抗原与抗体解离的平衡常数(KD)代表的亲合力度量抗原决定簇与抗体结合部位之间的结合强度。
本发明的抗体或其片段还包括通过定向突变；亲合力成熟、噬菌体展示或者链改组(chain shuffling)的方法修饰或改善结合特征的那些。可通过突变CDR和筛选具有所需特征的抗体结合部位来修饰或改善亲合力和特异性(参见，例如Yang等人，J.Mol.Biol.，(1995)254：392-403)。CDR以多种方式突变。一种方式是将各个残基或残基组合随机化，使得在否则相同的抗体结合部位的群体中，所有二十种氨基酸存在于特定位置上。作为替代地，可以通过易错PCR方法在CDR残基范围内诱导突变(参见例如Hawkins等人，J.Mol.Biol.，(1992)226：889-896)。例如，含有重链和轻链可变区基因的噬菌体展示载体可以在大肠杆菌(E.coli)突变体菌株中扩增(参见，例如Low等人，J.Mol.Biol.，(1996)250：359-368)。这些诱变方法是本领域技术人员已知的许多方法中的示例。
产生取代变体的一种便利方法是使用噬菌体展示的亲和力成熟。简言之，突变几个CDR区域的位点，产生每个位点所有可能的氨基酸取代。由此产生的抗体变体作为在每个颗粒中包装的与M13的基因III产物的融合物以单价形式展示于丝状噬菌体颗粒。然后，针对本文公开的生物学活性(例如结合亲合力、特异性、IC50、EC50、KD)筛选噬菌体展示变体。为了鉴定用于修饰的候选CDR区域位点，可进行丙氨酸扫描诱变，以鉴定对抗原结合有显著贡献的CDR区域残基。作为替代地或者另外地，可在一个或多个残基位置对一个或多个CDR序列进行随机诱变，而CDR有效连接可变区或者CDR独立于其他可变区序列，然后使用重组DNA技术将改变的CDR回复到可变区。一旦产生并表达这些变体抗体，如本文所述对变体组进行筛选，可选择在一个或多个相关测定中具有优越性能的抗体用以进一步开发。
如本发明所述，除了本文具体描述的抗体之外，可利用本领域技术人员公知的多种重组DNA技术容易地设计和制备其他“基本上纯的”经修饰抗体。例如，构架区在一级结构水平上可与天然序列相差数个氨基酸取代、末端和中间添加和缺失等。此外，多种不同的人构架区可单独或组合用于本发明人源化免疫球蛋白的基础。一般说来，基因的修饰可通过多种公知方法例如定点诱变容易地实现。
本发明包括TYRP1结合多肽，其具有基本上与该全长抗TYRP1抗体的可变区或高变区相同的氨基酸序列。基本上相同的氨基酸序列在本文中定义为与另一个氨基酸序列有至少70％，优选至少约80％，更优选至少约90％、95％、96％、97％、98％或99％同源性，如根据Pearson和Lipman(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1988)85：2444-8)的FASTA检索方法所确定的。
本发明的抗体或其片段包括具有选自表1所示CDR的氨基酸序列的一个、二个、三个、四个、五个和/或六个互补决定区(CDR)的人抗体。
在另一个实施方案中，本抗体或其片段可具有下文所示的20D7或20D7S的重链可变区，和/或20D7或20D7S的轻链可变区。20D7和20D7S是特别优选的本发明抗体。这些抗体具有人VH和VL构架区(FR)以及人CDR。
本发明包括编码抗TYRP1抗体重链的核酸序列，其包含本文公开的任一VH区或其部分，或者任一VH CDR，包括其任何变体。本发明也包括编码抗TYRP1抗体轻链的核酸分子，其包含本文公开的任一VL区或其部分，或者任一VL CDR，包括其任何变体。
本发明抗体的每个结构域可以是具有重链或轻链可变结构域的完整抗体，或者可以是功能等同物或者天然结构域的突变体或衍生物，或者构建的合成结构域，例如体外使用例如WO 93/11236(Griffiths等人)所述的技术。例如，可能将缺少至少一个氨基酸的对应于抗体可变结构域的结构域连接在一起。还包括具有CDR序列之一中一个或多个氨基酸取代、突变或缺失的抗体。重要特征性特点是每个结构域与互补结构域相关联形成抗原结合部位的能力。因此，术语可变重链和轻链片段不应解释为排除不具有对特异性有作用的物质的变体，包括CDR的变体。
本发明的抗体可以通过本领域已知的方法产生。这些方法包括Kohler和Milstein，Nature 256：495-497(1975)以及Campbell，MonoclonalAntibody Technology，The Production and Characterization of Rodent andHuman Hybridomas，Burdon等人编著，Laboratory Techniques inBiochemistry and Molecular Biology，第13卷，Elsevier Science Publishers，Amsterdam(1985)所述的免疫学方法和Huse等人，Science 246：1275-1281(1989)所述的重组DNA方法。
可通过切割整个抗体或者通过表达编码该片段的DNA来产生抗体片段。可通过Lamoyi等人，J.Immunol.Methods 56：235-243(1983)和Parham，J.Immunol.131：2895-2902(1983)所述的方法制备抗体片段。这些片段可含有一个或两个Fab片段或者F(ab′)2片段。这些片段还可含有单链片段可变区抗体，即scFv、双抗体或者其他抗体片段。产生这些功能等同物的方法公开于PCT申请WO 93/21319、欧洲专利申请No.239,400；PCT申请WO 89/09622；欧洲专利申请338,745；以及欧洲专利申请EP332,424。
用于转化载体和表达本发明抗体的优选宿主细胞是哺乳动物细胞，例如NSO细胞(非分泌(0)小鼠骨髓瘤细胞)、293和CHO细胞以及其他淋巴来源的细胞系，例如淋巴瘤、骨髓瘤或杂交瘤细胞。可选择性使用其他真核宿主，例如酵母。
转化的宿主细胞通过本领域中已知的方法培养于含有可同化碳源(糖类例如葡萄糖或乳糖)、氮源(氨基酸、肽、蛋白质或其降解产物例如蛋白胨、铵盐等)以及无机盐(钠、钾、镁和钙的硫酸盐、磷酸盐和/或碳酸盐)的液体培养基中。该培养基还含有，例如，生长促进物质，例如微量元素，例如铁、锌、锰等。
当希望在酵母中表达基因构建物时，用于酵母的合适选择基因是在酵母质粒YRp7中存在的trp1基因。Stinchcomb等人Nature，282：39(1979)；Kingsman等人，Gene，7：141(1979)。trp1基因提供了缺少在色氨酸中生长的能力的突变酵母菌株的选择标记，例如ATCC No.44076或PEP4-1。Jones，Genetics，85：12(1977)。因此，酵母宿主细胞基因组中trp1损伤的存在提供了用于通过在缺乏色氨酸时生长检测转化的有效环境。类似地，Leu2缺乏酵母菌株(ATCC 20,622或38,626)由带有Leu2基因的已知质粒来补偿。
本发明的抗体可通过本领域中任何已知方法分离或纯化，包括通过硫酸铵或硫酸钠沉淀，然后对盐水进行透析；离子交换层析；亲和或免疫亲和层析以及凝胶过滤或区带电泳。本发明抗体的优选纯化方法是蛋白A亲和层析。
编码人抗体的DNA可通过重组除了CDR之外的编码基本上或排他地来源于对应人抗体区域的人恒定区和可变区的DNA以及编码来源于人的CDR的DNA来制备。
编码抗体片段的合适DNA来源包括表达全长抗体的任何细胞，例如杂交瘤和脾细胞。该片段本身可用作抗体等同物，或者可重组为如上所述的等同物。该部分中所述的DNA缺失和重组可通过公知方法进行。如本领域中已知的，另一个DNA来源是抗体的噬菌体展示文库。本发明举例的抗体通过杂交瘤技术从免疫的小鼠制备。
另外，本发明提供了含有与表达序列、启动子和增强子序列有效连接的上述多核苷酸序列的表达载体。已经开发了用于在原核体系(例如细菌)和真核体系(包括但不限于酵母和哺乳动物细胞培养体系)中有效合成抗体多肽的多种表达载体。本发明的载体可包含染色体区段、非染色体和合成DNA序列。
可使用任何合适表达载体。例如，原核克隆载体包括来自大肠杆菌的质粒，例如colE1，pCR1，pBR322，pMB9，pUC，pKSM和RP4。原核载体还包括噬菌体DNA的衍生物例如M13以及其他丝状单链DNA噬菌体。可用于酵母的载体实例有2μ质粒。用于在哺乳动物细胞中表达的合适载体包括公知的SV-40衍生物、腺病毒、反转录病毒来源的DNA序列和来源于功能性哺乳动物载体组合的穿梭载体，例如上文所述的那些，以及功能性质粒和噬菌体DNA。
其他真核表达载体是本领域中已知的(例如P.J.Southern和P.Berg，J.Mol.Appl.Genet.1：327-341(1982)；Subramani等人，Mol.Cell.Biol.1：854-864(1981)；Kaufmann和Sharp，J.Mol.Biol.159：601-664(1982)；Scahill等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：4654-4659(1983)；以及Urlaub和Chasin，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216-4220(1980)。
可用于本发明的表达载体含有至少一个表达控制序列，其有效连接待表达的DNA序列或片段。将控制序列插入载体，以控制和调节所克隆的DNA序列的表达。可用的表达控制序列实例有lac系统、trp系统、tac系统、trc系统、λ噬菌体的主要操纵子和启动子区域、fd衣壳蛋白的控制区、酵母糖酵解启动子例如3-磷酸甘油酸激酶、酵母酸式磷酸酶启动子例如Pho5、酵母α交配因子启动子、以及来源于多瘤病毒、腺病毒、反转录病毒和猿猴病毒的启动子例如早期和晚期启动子或SV40，以及已知控制原核或真核细胞以及它们的病毒表达的其他序列或者其组合。
本发明还提供了含有上述表达载体的重组宿主细胞。本发明抗体可在杂交瘤之外的细胞系中表达。包含编码本发明多肽的序列的核酸可用于转化合适的哺乳动物宿主细胞。
根据高水平表达、组成型表达目的蛋白质以及最少的来自宿主蛋白质的污染来选择具体的细胞系。可用作表达宿主的哺乳动物细胞系是本领域公知的，包括许多永生化细胞系，例如但不限于NSO细胞(非分泌(0)小鼠骨髓瘤细胞)、小鼠骨髓瘤细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞等等。其他合适真核细胞包括酵母及其他真菌。可用的原核宿主包括，例如大肠杆菌，例如大肠杆菌SG-936、大肠杆菌HB 101、大肠杆菌W3110、大肠杆菌X1776、大肠杆菌X2282、大肠杆菌DHI和大肠杆菌MRCl，假单胞菌属(Pseudomonas)，芽孢杆菌属(Bacillus)例如，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和链霉菌属(Streptomyces)。
这些本发明重组宿主细胞可用于产生抗体或其片段，其通过在允许该抗体或其片段表达的条件下培养该细胞以及从该宿主细胞或宿主细胞周围的培养基中纯化该抗体或其片段来进行。可通过在目的抗体编码基因的5’端插入信号或分泌前导肽编码序列来利于所表达的抗体或片段在重组宿主细胞中靶向分泌(参见，Shokri等人，(2003)Appl Microbiol Biotechnol.60(6)：654-64，Nielsen等人，Prot.Eng.(1997)10：1-6和von Heinje等人，(1986)Nucl.Acids Res.14：4683-4690)。这些分泌前导肽成分可来源于原核或真核序列。因此，适当地使用分泌前导肽，连接于多肽N端的氨基酸，以引导多肽从宿主细胞胞质溶胶中移出并分泌进入培养基。
本发明的抗体可以与另外的氨基酸残基融合。这些氨基酸残基可以是肽标签，可能便于分离。还可考虑其他使得该抗体归巢到具体器官或组织的氨基酸残基。
制备本发明抗体的另一个实施方案是在转基因动物中表达编码本发明抗体的核酸，该转基因动物具有插入的人抗体产生基因组的实质部分并且缺乏内源抗体的产生。转基因动物包括但不限于小鼠、山羊和兔。本发明的另一个实施方案包括在例如动物乳腺中表达抗体编码基因，从而在哺乳过程中分泌该多肽。
本发明还提供了通过向哺乳动物施用有效量抗体治疗哺乳动物中肿瘤生长的方法。本发明待治疗的合适肿瘤优选表达TYRP1。不受任何具体机制的限制，本方法提供了对包括恶性黑素瘤的癌细胞生长的治疗。本发明上下文中的“治疗”指治疗性处理，包括抑制、减缓、减轻或逆转与疾病或病症相关的下列病症或非预期生理变化的进程，改善病症的临床症状或者预防病症临床症状的出现。有益或希望的临床结果包括但不限于症状的减轻、疾病或障碍程度的降低或者、疾病或障碍稳定(即，疾病或障碍不恶化)、疾病或障碍发展延迟或减缓、疾病或障碍的改善或缓和、以及疾病或障碍的缓解(部分或全部)，不论是可检出的或不可检出的。“治疗”还可表示，与未接受治疗时的预期存活相比，存活延长。需要治疗的包括已患疾病的那些。在一个实施方案中，本发明可用作药物。
术语“黑素瘤”包括但不限于黑素瘤、转移性黑素瘤、来源于黑素细胞或黑素细胞相关色素痣细胞的黑素瘤、黑素细胞癌、黑素上皮癌、黑肉瘤、原位黑素瘤、浅表扩散性黑素瘤、葡萄膜黑素瘤(modular melanoma)、雀斑恶性黑素瘤、肢端雀斑黑素瘤、侵入性黑素瘤以及家族非典型性葡萄膜黑素瘤(familial atypical mole and melanoma，FAM-M)综合征。在本发明的一个实施方案中，黑素瘤是具体的癌症形式。在另一个实施方案中，黑素瘤可以是恶性的。如下所述，本发明的一个实施方案利用目前描述的抗TYRP1抗体治疗一线黑素瘤。在另一个实施方案中，目前描述的抗TYRP1抗体是转移性黑素瘤的一线治疗，即它们将用于新诊断的转移性黑素瘤的第一轮治疗。
在本发明方法中，向有此需要的哺乳动物施用治疗有效量的本发明抗体。用于治疗本文该疾病的本发明组合物的有效剂量根据许多不同因素而不同，所述因素包括施用方式、目标部位、患者生理状态、患者是人还是动物、施用的其他药物以及治疗是治疗性的还是预防性的。本文使用的术语施用表示通过可实现所追求结果的任何方法将本发明抗体递送至哺乳动物。它们可通过例如静脉内或肌内施用。尽管本发明的人抗体特别适合用于施用给人，但是它们也可施用给其他哺乳动物。本文使用的术语哺乳动物旨在包括但不限于人、实验动物、家庭宠物和家畜。治疗有效量表示在施用给哺乳动物时有效产生所需治疗作用例如抑制肿瘤生长的本发明抗体量。可使用本领域技术人员已知的常规方法滴定(titrate)治疗剂量，以优化安全性和有效性。
本发明的药物组合物可包括“治疗有效量”的本发明抗TYRP1抗体。“治疗有效量”表示在给药时以及所需的时间段内有效实现所需治疗结果的量。抗体的治疗有效量可根据例如下列因素而变化，该因素例如个体的疾病状态、年龄、性别和体重，以及抗体或抗体部分在个体中引发所需应答的能力。治疗有效量也为：其治疗有益作用超过了抗体或抗体部分任何有毒或有害作用。可调节给药方案以提供最佳的所需应答(例如治疗或预防性应答)。
这些疾病的鉴定也在本领域技术人员的能力和知识范围内。例如，患有恶性黑素瘤或者处于发生临床显著症状风险的人类个体适于施用本发明的抗TYRP1抗体。
以足以抑制或减少肿瘤或病理状态发展的量，向患有恶性黑素瘤的患者治疗性施用本发明的抗TYRP1抗体。发展包括，例如肿瘤或病理病症的生长、侵袭、转移和/或复发。足以实现这些的量定义为治疗有效剂量。有效实现此用途的量将基于疾病的严重程度和患者自身免疫系统的整体状态。给药方案也会随着疾病状态和患者状态的变化而变化，通常从单次浓注给药或连续输注至每天多次施用(例如每4-6小时)，或者根据给予治疗的医生和患者状态所示。本发明抗体治疗有效量的示例性非限制性范围是0.1-50mg/kg，更优选3-35mg/kg，更优选5-20mg/kg。给药量和频率将由治疗患者的医生来确定，可包括每天、每周三次、每周、每两周一次或者频率更低地给予小于1mg/kg至高于100mg/kg的剂量。每次施用的剂量可以在1-100、2-75或5-60mg/kg的范围内。然而，应当指出本发明不限于任何特定的剂量。
在本发明的一个实施方案中，抗TYRP1抗体可以与一种或多种其他抗肿瘤剂联合施用。可使用任何合适抗肿瘤剂，例如化疗剂、放射或其组合。抗肿瘤剂可以是烷化剂或抗代谢物。烷化剂的实例包括但不限于顺铂、环磷酰胺、美法仑和达卡巴嗪(DTIC)。体内研究显示对于人624mel异种移植物的20D7与达卡巴嗪(DTIC)联合施用证明了比单独治疗更强的抗肿瘤活性。在本发明的一个实施方案中，目前所述的抗TYRP1抗体与达卡巴嗪联合施用。抗代谢物的实例包括但不限于多柔比星、柔红霉素、紫杉醇、伊立替康(CPT-11)和拓扑替康。当该抗肿瘤剂是放射时，该放射的来源可以是在待治疗患者的外部(外粒子束放射疗法(external beamradiation therapy-EBRT))或者内部(近距离放射治疗(brachytherapy-BT))。所施用的抗肿瘤剂的剂量取决于多个因素，包括例如药物类型、待治疗肿瘤类型和严重程度以及该药物的施用途径。然而应强调本发明不限于任何特定的剂量。
在本发明中，可使用任何合适方法或途径施用本发明的抗TYRP1抗体，任选地，与抗肿瘤剂和/或其他受体拮抗剂共施用。本发明所用的抗肿瘤剂方案包括任何被认为最佳适用于治疗患者肿瘤病症的方案。不同的恶性肿瘤可需要使用特异性的抗肿瘤抗体和特异性的抗肿瘤剂，其将针对患者个体各个确定。施用途径包括，例如，经口、静脉内、腹膜内的、皮下或肌内施用。优选肠胃外途径。然而应强调本发明不限于任何特定的方法或施用途径。
在本发明的另一个方面中，本发明的抗TYRP1抗体可以化学地或生物合成地连接一种或多种抗肿瘤剂或抗血管发生剂。
本发明还计划在可检测信号产生剂与该抗体缀合的诊断系统中与靶向部分或报告物部分相连的抗TYRP1抗体，包括例如仅仅抗肿瘤剂、其他抗体或报告物，例如放射性标记同位素。
很清楚，本发明的抗TYRP1抗体在以预防或治疗目的用于哺乳动物中时，将以另外包含可药用载体的组合物的形式施用。合适的可药用载体包括，例如水、盐水、磷酸缓冲盐溶液、葡萄糖、甘油、乙醇等中的一种或多种以及其组合。可药用载体还可包含次要量的助剂物质，例如润湿剂或乳化剂、防腐剂或缓冲剂，其提高了结合蛋白的保存期限或有效性。如本领域中公知的，可配制注射组合物以提供在施用给哺乳动物后快速、持续或延迟释放活性成分。
此外，本发明的范围内还包含本发明抗体在体内和体外用于研究或诊断方法的用途，其是本领域中公知的。诊断方法包括含有本发明抗体的试剂盒。
在一个实施方案中，本发明是TYRP1特异性的人单克隆抗体或其片段。在另一个实施方案中，本发明是TYRP1特异性的嵌合单克隆抗体或其片段。在另一个实施方案中，该抗体的CDR区与CTA99的CDR区相同。在一个不同的实施方案中，该抗体的CDR区与20D7或30D7S的CDR区相同。
在一个实施方案中，该抗体在环境实验室温度(20℃-25℃)下以1.7×10-41/s(sec-1，1/秒)至5×10-41/s的解离速率常数(Kd或koff)接合TYRP1，如本文所述通过表面等离振子共振所测。在另一个实施方案中，该抗体以1.7×10-41/s至3.5×10-41/s的Kd或koff结合TYRP1。在另一个实施方案中，该抗体以在相同条件下所测的20D7、20D7S或CTA99的解离速率常数的10％内的解离速率常数结合TYRP1，如表面等离振子共振所测。
本发明的一个实施方案包括TYRP1特异性的单克隆抗体或其片段，其包含一个或多个选自表1和2的CDR的互补决定区(CDR)。在另一个实施方案中，本发明是具有序列为RASQSVSSYLA(SEQ ID NO：4)的轻链CDR1区域的TYRP1特异性单克隆抗体或其片段。在另一个实施方案中，本发明是具有序列为：RYSSSWYLDY(SEQ ID NO：3)的重链CDR3的TYRP1特异性单克隆抗体或其片段。在一个不同的实施方案中，本发明是下述单克隆抗体或其片段，其包含(i)选自20D7、20D7S和CTA99的轻链可变区，和(ii)选自20D7、20D7S和CTA99的重链可变区。在另一个实施方案中，本发明的下述TYRP1特异性单克隆抗体或其片段，其包含(i)CTA99的轻链可变区，(ii)CTA99的重链可变区，和(iii)人免疫球蛋白G1(hIgG1)恒定区。
本发明的另一个实施方案是治疗哺乳动物中癌症的方法，其包括向哺乳动物施用有效量的已述任意实施方案的抗体或其片段。本发明还提供了治疗恶性黑素瘤的方法。本发明提供的另一种治疗方法将使用本发明抗体或其片段与施用另外抗癌剂或治疗相组合。在一种治疗方法中，该抗癌剂是达卡巴嗪(DTIC)。
应理解并预期，本领域技术人员可对本文公开的本发明原理做出改变，并且认为这些改变包含在本发明的范围内。
本文提及的所有参考文献完整并入本文。
实施例
随后的实施例进一步阐述本发明，但不应以任何方式视为对范围的限制。但是，它们不应以任何方式解释为对本发明宽范围的限制。对常规方法的详细说明可得自许多出版物，例如用于构建载体和质粒的方法，将编码多肽的基因插入这些载体和质粒的方法，将质粒引入宿主细胞的方法，以及基因和基因产物表达和对其测定的方法，该出版物包括Sambrook，J.等人，(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版，ColdSpring Harbor Laboratory Press。
动物和细胞系
在含有10％热灭活胎牛血清(HyClone Laboratories，Logan，UT)的RPMI 1640(Invitrogen Life Technologies)中维持SKmel28、SKmel23、624mel、1102mel和A375，定期检测支原体污染。SKmel23和SKmel28由Alan Houghton博士(Memorial Sloan-Kettering Cancer Center，NewYork，NY)提供。624mel和1102mel获得自Steve Rosenberg博士(NationalCancer Institute，Bethesda，MD)。A375购自美国典型培养物保藏中心(Manassas，VA)。六至八周龄雌性Nu/Nu小鼠购自Taconic Farms(Germantown，NY)。
人和嵌合抗TYRP1抗体的表达和纯化
对于每种抗体，通过合适方法，例如PCR克隆，将合适的重链核苷酸序列，例如SEQ ID NO：21、22或23(分别针对20D7、20D7S和CTA99)，置于合适的表达质粒，例如pGSHC，并将合适的轻链核苷酸序列，例如SEQ ID NO：26或27(分别针对20D7/20D7S和CTA99)置于合适的表达质粒中，例如pGSLC。为了建立稳定细胞系，通过电穿孔用线性化重链和轻链质粒共转染合适宿主细胞系例如NSO细胞，在合适培养基例如含透析胎牛血清和谷氨酰胺合成酶添加剂的无谷氨酰胺Dulbecco′s ModifiedEagle Medium中培养。通过酶联免疫吸附测定(ELISA)针对抗体表达筛选克隆，选择最高的生产者培养于转瓶中。通过合适方法纯化抗体，例如蛋白A亲和层析法。
本发明的一个实施方案是重组人单克隆抗体20D7，靶向细胞表面表达的酪氨酸酶相关蛋白-1(TYRP1或TRP1)的全长IgG1。该抗体由人γ-1重链(HC)(亚类I)和人κ轻链(亚类III)构成。20D7显示以高亲和性选择性结合人TYRP1，通过涉及活化免疫效应器功能的机制在异种移植模型中介导有效的抗肿瘤活性。
本发明的一个实施方案是重组人单克隆抗体20D7S，靶向细胞表面表达的酪氨酸酶相关蛋白1(TYRP1或TRP1)的全长IgG1。该抗体由人γ-1重链(HC)(亚类I)和人κ轻链(亚类III)构成。20D7S的产生是为了得到更稳定的分子；通过定点诱变将重链可变区内的游离半胱氨酸残基(C47)转变为丝氨酸残基。此未成对或游离半胱氨酸具有与参与重链和轻链多肽的链内和链间二硫键桥连的其他半胱氨酸错配的潜力。错配有可能导致错误折叠和加工，增加产物的非均匀性并且可能增加其稳定性。本文所述的SDS PAGE凝胶分析证实了20D7制剂中游离轻链和游离重链的存在，但是在20D7S制剂中游离轻链和游离重链的存在减少或消除。
本发明的另一个实施方案是CTA99，具有人恒定区IgG1的嵌合抗体。小鼠抗体TA99(美国专利4,798,790)含有两条轻链；一条TA99轻链是TYRP1特异性的，另一条来自亲代小鼠骨髓瘤细胞。由于杂(contaminated)轻链不能结合TYRP1，所以活性降低。构建CTA99以消除此缺点，由此改善活性。在本发明的一个实施方案中，设计具有两条相同重链和两条相同轻链的CTA99。本文所述的研究阐明了CTA99增加的活性和结合亲合力以及更适于人的效应器功能。
表1和2提供了多个本发明CDR的氨基酸序列和SEQ ID NO。表3提供了本发明相关的多个序列的SEQ ID NO。编码下述氨基酸序列的多核酸序列也包含在本发明的范围内。
表1：20D7和20D7S抗体重链和轻链可变区CDR的氨基酸序列
  重链   SEQ ID NO.   轻链   SEQ ID NO.
  CDR1   GYTFTSYAMN   1   RASQSVSSYLA   4
  CDR2   WINTNTGNPTYAQGFTG   2   DASNRAT   5
  CDR3   RYSSSWYLDY   3   QQRSNWLMYT   6
表2：CTA99抗体重链和轻链可变区CDR的氨基酸序列
  重链   SEQ ID NO.   轻链   SEQ ID NO.
  CDR1   GFNIKDYFLH   7   RASGNIYNYLA   10
  CDR2   WINPDNGNTVYDPKFQG   8   DAKTLAD   11
  CDR3   DYTYEKAALDY   9   QHFWSLPFT   12
表3：20D7，20D7S和CTA99抗体的氨基酸序列SEQ.ID.NO
Figure BPA00001221862500211
用于实验的抗体包含不含信号的全长重链和轻链，如表3中所给出的。
表4：20D7，20D7S和CTA99抗体的数据总表
Figure BPA00001221862500212
ND＝未测得
竞争性酶联免疫吸附测定(ELISA)
在4℃下用重组人TYRP(.5ug/mL×50μL)涂覆falcon柔性96孔平底平板过夜。次日，在室温下用含有0.1％吐温-20的PBS中的5％FBS对该平板封闭2小时。在100μl样品中添加多种量的抗体。用PBS/吐温将板清洗3遍，向该平板添加100μl以1∶5000在100μl中稀释的辣根过氧化酶缀合的山羊抗人抗体(Biosource，Camarillo，CA)，在室温下(20-25℃)孵育1小时。将该平板清洗3遍，向该平板添加50μl/孔的3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB；KPL，Gaithersburg，MD)底物。使用微板读数器(例如Molecular Devices)在450nm处读取该平板。
表5：酶联免疫吸附测定(ELISA)
半最小有效浓度(EC50)以摩尔(M)度量。抗体，包括人20D7、人20D7S和CTA99，在ELISA测定中显示特异性结合人TYRP1。
流式细胞术
用1％BSA/PBS中的5μg/ml人IgG或抗TYRP1MAb在冰上处理624mel细胞1小时。用1％BSA/PBS将细胞清洗3遍，与异硫氰酸荧光素(FITC)-标记的山羊抗人IgG孵育1小时。清洗细胞，用合适的流式细胞仪分析，例如Epics XL Flow Cytometer(Coulter)。流式细胞术分析显示，与对照人IgG1相比，本文举例的20D7S抗体显示与人细胞系SKmel28和SKmel23表达的天然TYRP1结合。类似地，流式细胞术分析显示，与对照人IgG1相比，本文举例的CTA99和20D7抗体显示结合人细胞系624mel表达的天然TYRP1。
表面等离振子共振/Biacore分析
在环境实验室温度(20℃-25℃)下用表面等离振子共振测量抗体与重组人TYRP1的结合动力学，例如用Biacore生物传感器(Pharmacia)。将TYRP1蛋白固定于CM5研究级传感芯片上，以0.5nM至100nM的浓度注入抗体。获得每个浓度的传感图，使用BIA Evaluations 3.2程序进行评价，以确定速率常数kon和koff。Kd，也称为koff，是解离反应的速率常数。Ka，也称为kon，是结合反应的速率常数。KD是结合亲和力的度量，由以摩尔(M)度量的速率常数koff/kon的比值计算KD。本文举例抗体TA99、CTA99、20D7和20D7S的Ka、Kd和KD总结于下文表6中。
表6：抗体与重组人TYRP1的结合动力学
Figure BPA00001221862500231
20D7和20D7S与人TYRP1结合的Biacore分析证明显著的特异性结合亲和性，因此20D7和20D7S是治疗性抗体的有效候选者。
补体依赖性细胞毒性(CDC)测定
用合适培养基例如AIM V培养基(Invitrogen Life Technologies)将人黑素瘤细胞系624mel清洗3遍，并将其调节至106活细胞/mL的浓度。将一百微升细胞铺于96孔圆底Falcon平板，在37℃下与MAb 20D7或hIgG(Jackson Immunoresearch，West Grove，PA)一起孵育1小时，以3.7μg/mL起始，1∶3稀释。以50μl/孔添加在AIM V中1∶5稀释的low-Tox-M兔补体(Cedarlane Labs，Westbury，NY)，在37℃下孵育1小时。用台盼蓝(Invitrogen Life Technologies)对存活的细胞计数。
表7显示CDC测定中多种抗体浓度下的细胞毒性百分比。数据证明，20D7和CTA99抗体体外诱导针对TYRP1(+)人624mel细胞的CDC。20D7引发624mel细胞的剂量依赖性补体介导的细胞裂解，在该测定中使用3.7μg/mL的抗体浓度实现完全细胞裂解。因此，在20D7和CTA99中有对CDC的强免疫效应器应答。％特异性裂解＝测试％细胞毒性-阴性对照％细胞毒性。
表7：CDC数据证明20D7和CTA99引起的补体活化
针对人黑素瘤的体外抗体依赖性细胞毒性(ADCC)
收集624mel细胞，用合适培养基清洗，例如AIM V培养基(InvitrogenLife Technologies)，以10,000细胞/孔的密度100μL的体积将细胞铺于96-孔Falcon U形底平板。添加50μL体积内的5μg/mL的抗体，与靶细胞一起在37℃下孵育0.5小时。以50μL的体积，多种E∶T(效应器∶靶标)比添加效应器细胞。再将平板在37℃下孵育4小时。孵育后，以800g将平板离心，轻轻地将100μL上清转移到96孔平底平板。如制造商(Roche)所指示地，添加乳酸脱氢酶测定试剂，在490nm处读取平板。测定对照：靶标自发值和靶标最大值(添加50μL的4％triton)。
裂解依赖于效应器与靶标浓度的比，50％靶细胞裂解在E∶T比为100∶1时出现。在固定浓度下(5μg/mL)，20D7和CTA99活化624mel细胞的裂解。表8显示ADCC测定中在多种效应器细胞与肿瘤细胞比值(E∶T比)存在下细胞毒性百分比。20D7S、20D7和CTA99抗体体外诱导针对TYRP1(+)人624mel细胞的ADCC。在20D7S、20D7和CTA99中有ADCC的强免疫效应器应答。
％细胞毒性＝(实验值-靶标自发值)/
(靶标最大值-靶标自发值)X 100
表8：体外针对人黑素瘤的ADCC
Figure BPA00001221862500242
20D7S和20D7稳定性测定
将20D7和20D7S上样于SDS-PAGE凝胶(十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)。使用BioRad装置进行凝胶电泳，直至溴酚蓝染料刚刚消失。使用考马斯染料显现分离的蛋白质。
在SDS PAGE分析中，更稳定的分子视为单条带，如果有也极少游离轻链和或重链；游离轻链和游离重链的存在证明分子较不稳定。20D7的SDS PAGE显示存在明显的游离轻链和重链。20D7S的SDS PAGE显示存在非常少的游离轻链和重链。因此，20D7S是比20D7更稳定的IgG1分子。
CTA99和20D7有效治疗人黑素瘤异种移植物
对于下述皮下研究，肿瘤体积由式[π/6(W1xW2xW2)]计算，其中W1表示最大肿瘤直径，W2表示最小肿瘤直径。％T/C＝100×(治疗体积/初始体积)/(对照体积/初始体积)。统计分析使用传统p值方法进行。对于皮下研究，基于接受抗TYPR抗体的动物的肿瘤体积相比于对照动物的肿瘤体积来计算p值。对于下述转移研究，通过计算肺表面小瘤(nodule)来测量肿瘤抑制。％抑制＝100×(对照小瘤#-治疗小瘤#)/(对照小瘤#)。统计分析使用传统p值方法进行。对于转移研究，基于接受抗TYPR抗体的动物中所观察到的小瘤相比于对照动物中所观察到的小瘤来计算p值。
抗TYRP1抗体在人黑素瘤异种移植模型中的体外单一活性剂(single agent) 活性
在50/50的Matrigel和RPMI 1640培养基(10％FBS，热灭活)的溶液中收获、清洗并重悬624mel培养细胞。对于皮下肿瘤模型，将2×106个细胞皮下注射到裸鼠的左肋。当肿瘤达到200mm3时，用抗TYRP1抗体或对照人IgG治疗小鼠，每周三次以1mg/小鼠施用抗体。一周两次用游标卡尺测量肿瘤，计算％T/C。对于抗TYRP1抗体在人黑素瘤异种移植模型中的体内单一活性剂活性，与人IgG对照相比，用20D7治疗抑制SKmel28异种移植物的生长(T/C＝51％；在第43天P＝0.01)。20D7治疗还显示显著抑制已有624mel肿瘤。肿瘤生长得到抑制，并且在抗体治疗开始后第16天达到统计学显著性(T/C＝44％；P＝0.01)。对于20D7的抗肿瘤活性，评价人黑素瘤异种移植物。在抗体治疗后第11天，细胞系A375和1102mel显示受到单一活性剂20D7的显著抑制(分别对于A375和1102mel，T/C＝42％；P＝0.01以及T/C＝43％；P＝0.004)。来自不同物种的皮肤裂解物与TA99(5μg/ml)一起在室温下孵育2小时。然后，将裂解物与蛋白A一起沉淀，在还原和非还原条件下使用四块12％梯度凝胶进行SDS-PAGE。电泳之后，将凝胶转移到PVDF膜(Invitrogen LifeTechnologies)。用20D7S(5μg/ml)，然后用HRP标记的抗人IgG(Zymed，South San Francisco，CA)对膜进行检测。使用化学发光底物(KPL，Gaithersburg，MD)对印迹进行显影。数据显示20D7容易地与小鼠TYRP1交叉反应。但是，在任何用20D7治疗中动物中没有显示明显毒性。20D7治疗的动物相对于人IgG对照治疗的小鼠，体重和总体外观没有显著差异。
抗TYRP1抗体在人黑素瘤异种移植模型中的体外单一活性剂剂量应答活 性
在50/50的Matrigel和RPMI 1640培养基(10％FBS，热灭活)的溶液中混合Skmel28细胞。将2×106个细胞皮下注射到裸鼠的左肋。在肿瘤达到200mm3时，一周三次用抗TYRP1抗体(6mg/kg、20mg/kg或60mg/kg)或者对照人IgG治疗小鼠。一周两次用游标卡尺测量肿瘤，计算％T/C。20D7对SKmel28异种移植物的剂量应答研究显示了剂量依赖性抗肿瘤应答。甚至在6mg/kg剂量下，20D7也显著抑制肿瘤(T/C＝69％；P＜0.0001)。每种剂量下的抗肿瘤作用都是统计学显著性的：6mg/kg和20mg/kg(T/C＝50％；P＝0.04)，6mg/kg和60mg/kg(T/C＝19％；P＜0.003)。
抗TYRP1抗体在两个转移黑素瘤模型中的体内单一活性剂活性
B16BL6是富有侵略性的自发产生的小鼠黑素瘤。在静脉施用后，其在裸鼠中形成肺转移。用RPMI 1640培养基(10％FBS，热灭活)收获、清洗并重悬培养的SKmel23和B16BL6细胞黑素瘤细胞。
模型1：静脉内注射1×105B16BL6细胞。肿瘤注射后第二天，按照三种不同剂量浓度向小鼠施用抗TYRP1抗体或对照人IgG(200μg/小鼠，500μg/小鼠和1mg/小鼠)。在第20天处死小鼠，摘除肺，对肺表面小瘤进行计数并计算百分比抑制。在人IgG治疗的小鼠肺表面检测到严重的转移；而在20D7治疗的动物中观察到显著较少的转移。所有三种浓度的20D7均减少了肺转移的水平(分别地，抑制＝65％、74％和95％)。
模型2：静脉内注射1×105SKmel23细胞。肿瘤注射后第二天，按照两种不同剂量浓度向小鼠施用抗TYRP1抗体或对照人IgG(200μg/小鼠，500μg/小鼠和1mg/小鼠)。在第20天处死小鼠，摘除肺，对肺表面小瘤进行计数并计算百分比抑制。用200μg/剂和500μg/剂的20D7或CTA99治疗显著降低了转移小瘤。20D7分别减少了58％和73％的转移。CTA99分别减少了63％和75％的转移。这些结果证明，在两个不同的模型中，20D7和CTA99抑制黑素瘤转移。
20D7和20D7S对于人黑素瘤的皮下异种移植物和转移模型的抑制肿瘤生 长的体内比较研究
对于皮下肿瘤模型，在50/50的Matrigel和RPMI 1640培养基(10％FBS，热灭活)溶液中收获、清洗并重悬624mel培养细胞，然后将2×106个624mel细胞皮下注射到裸鼠的左肋。在肿瘤达到200mm3时，一周两次用20D7或20D7S，以40mg/kg治疗小鼠。一周两次用游标卡尺测量肿瘤，计算％T/C。在624mel皮下异种移植物模型中，20D7抑制肿瘤生长，T/C＝21％，而20D7S的T/C＝25％。在该异种移植模型中，20D7和20D7S都抑制肿瘤生长。
对于转移模型，用RPMI 1640培养基(10％FBS，热灭活)收获、清洗并重悬888mel培养细胞，静脉内注射888mel细胞。肿瘤注射后第二天，向小鼠施用抗TYRP1抗体或对照人IgG。在第20天处死小鼠，摘除肺，对肺表面小瘤进行计数并计算百分比抑制。在裸鼠中的888mel转移模型中，20D7和20D7S都显著抑制肺表面转移：20D7抑制＝77％，p＝0.0005；20D7S抑制＝80％，p＝0.0005。在该转移模型中，20D7和20D7S都减少了黑素瘤转移。
20D7和达卡巴嗪(DTIC)对人异种移植物的组合治疗证明了与单治疗相 比更强的抗肿瘤活性。
对于皮下模型，在50/50的Matrigel和RPMI 1640培养基(10％FBS，热灭活)的溶液中收获、清洗并重悬培养的624mel细胞。将2×106个细胞注射到裸鼠的左肋。当肿瘤达到200mm3时，用抗TYRP1抗体、DTIC或抗TYRP1抗体与DTIC的组合治疗小鼠。每周二次以40mg/kg施用抗体。每周一次以5mg/kg施用DTIC。一周两次用游标卡尺测量肿瘤，计算％T/C。对于转移模型，在RPMI 1640培养基(10％FBS，热灭活)中收获、清洗并重悬培养的SKmel23、888mel和B16黑素瘤细胞。静脉内注射SKmel23、888mel和B16黑素瘤细胞。在肿瘤注射后第二天，向小鼠施用抗TYRP1抗体或对照人IgG。在第20天处死小鼠，摘除肺，对肺表面小瘤进行计数，并计算百分比抑制。
如皮下模型中所证明地，20D7和DTIC组合治疗比单独20D7(p＜0.001)或DTIC(p＜0.001)明显更好地抑制肿瘤生长。
表9：20D7的体内抗肿瘤活性总结
表9汇总了在4种模型中与20D7或DTIC单一疗法相比，20D7S的体内抗肿瘤活性。20D7的体内抗肿瘤活性由转移模型中的百分比抑制显示(＊表示统计学显著的；ND表示未测得)。在皮下模型中，20D7的体内抗肿瘤活性以T/C百分比显示。20D7和达卡巴嗪(DTIC)的组合治疗证明了与单一疗法相比更强的抗肿瘤活性。
Figure IPA00001221862100011
Figure IPA00001221862100021
Figure IPA00001221862100031
Figure IPA00001221862100041
Figure IPA00001221862100051
Figure IPA00001221862100061
Figure IPA00001221862100071
Figure IPA00001221862100081
Figure IPA00001221862100091
Figure IPA00001221862100101
Figure IPA00001221862100111
Figure IPA00001221862100121
Figure IPA00001221862100131
Figure IPA00001221862100161
Figure IPA00001221862100171
Figure IPA00001221862100181
Figure IPA00001221862100191
Figure IPA00001221862100211
Figure IPA00001221862100221
Figure IPA00001221862100231
Figure IPA00001221862100241
Figure IPA00001221862100261
Figure IPA00001221862100271

Claims (10)

1.特异性结合SEQ ID NO.28所示的人TYRP1的单克隆抗体，其包含下述VH、CDRL1、CDRL2以及CDRL3，所述VH包含SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列QVQLVQSGSELKKPGASVKISCKASGYTFTSYAMNWVRQAPGQGLESMGWINTNTGNPTYAQGFTGRFVFSMDTSVSTAYLQISSLKAEDTAIYYCAPRYSSSWYLDYWGQGTLVTVSS；所述CDRL1序列为SEQ ID NO：4所示的：RASQSVSSYLA；所述CDRL2序列为SEQ ID NO：5所示的：DASNRAT；所述CDRL3序列为SEQ ID NO：6所示的：QQRSNWLMYT。
2.权利要求1的抗体，其包含下述VL和VH，所述VL包含SEQ IDNO：16所示的氨基酸序列EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWLYTFGQGTKLEIK，所述VH包含SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列QVQLVQSGSELKKPGASVKISCKASGYTFTSYAMNWVRQAPGQGLESMGWINTNTGNPTYAQGFTGRFVFSMDTSVSTAYLQISSLKAEDTAIYYCAPRYSSSWYLDYWGQGTLVTVSS。
3.权利要求1的抗体，其包含SEQ ID NO：30所示的重链以及SEQ IDNO：32所示的轻链。
4.权利要求1-3中任一项的抗体，其包含两条SEQ ID NO：30所示的重链以及两条SEQ ID NO：32所示的轻链。
5.分离的多核酸，其是编码权利要求1-4中任一项的抗体的核苷酸序列。
6.表达载体，其包含与表达控制元件有效连接的权利要求5的多核酸，使得可表达所编码的抗体。
7.重组细胞，其包含权利要求6的表达载体，所述重组细胞能够产生权利要求1-4中任一项的抗体。
8.抗体，其通过培养权利要求7的重组细胞产生，使得所述抗体产生，并从培养物中回收所述抗体。
9.药物组合物，其包含权利要求1-4或8中任一项的抗体，以及可药用载体、稀释剂或赋形剂。
10.权利要求1-4或8中任一项的抗体在制备用于治疗恶性黑素瘤的药物中的用途。
CN2009801085150A 2008-03-12 2009-03-11 抗tyrp1抗体 Expired - Fee Related CN101970500B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US6919908P 2008-03-12 2008-03-12
US61/069,199 2008-03-12
PCT/US2009/036739 WO2009114585A1 (en) 2008-03-12 2009-03-11 Anti-tyrp1 antibodies

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN101970500A CN101970500A (zh) 2011-02-09
CN101970500B true CN101970500B (zh) 2013-08-14

Family

ID=40790741

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2009801085150A Expired - Fee Related CN101970500B (zh) 2008-03-12 2009-03-11 抗tyrp1抗体

Country Status (19)

Country Link
US (1) US7951370B2 (zh)
EP (1) EP2268672A1 (zh)
JP (1) JP2011516041A (zh)
KR (1) KR101203777B1 (zh)
CN (1) CN101970500B (zh)
AR (1) AR070821A1 (zh)
AU (1) AU2009222998B2 (zh)
BR (1) BRPI0909633A2 (zh)
CA (1) CA2718289A1 (zh)
CL (1) CL2009000567A1 (zh)
EA (1) EA019517B1 (zh)
IL (1) IL207581A0 (zh)
MX (1) MX2010010021A (zh)
NZ (1) NZ587305A (zh)
PE (1) PE20091679A1 (zh)
TW (1) TWI384997B (zh)
UA (1) UA99339C2 (zh)
WO (1) WO2009114585A1 (zh)
ZA (1) ZA201006099B (zh)

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101163295B1 (ko) * 2007-06-29 2012-07-05 에프. 호프만-라 로슈 아게 향상된 면역글로불린을 생산하는 중쇄 돌연변이체
SG11201606439VA (en) 2014-02-07 2016-09-29 Dong Wha Pharm Co Ltd Anticancer adjuvant composition containing rip3 expression promoter as active ingredient, method for screening for anticancer adjuvant enhancing sensitivity of anticancer drug by promoting rip3 expression, and method for monitoring sensitivity of anticancer drug
EP3233907B1 (en) 2014-12-19 2021-03-03 Genmab A/S Rodent bispecific heterodimeric proteins
RU2630647C1 (ru) * 2016-05-27 2017-09-11 Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов" Федерального медико-биологического агентства ГУМАНИЗИРОВАННОЕ АНТИТЕЛО К КОНФОРМАЦИОННОМУ ЭПИТОПУ С3 КОМПОНЕНТА КОМПЛЕМЕНТА ЧЕЛОВЕКА, ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ ДНК (ВАРИАНТЫ), ЭКСПРЕССИОННЫЙ ВЕКТОР, СОДЕРЖАЩИЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ ДНК (ВАРИАНТЫ), И ШТАММ КЛЕТОК ЯИЧНИКОВ КИТАЙСКОГО ХОМЯЧКА CHO-humC34-ПРОДУЦЕНТ ДАННОГО ГУМАНИЗИРОВАННОГО АНТИТЕЛА
GB201613167D0 (en) 2016-07-29 2016-09-14 Univ Southampton Cancer and b-cell related disease therapy
WO2018075586A1 (en) * 2016-10-18 2018-04-26 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Antigen-binding proteins targeting melanoma differentiation antigens and uses thereof
SG11201912069VA (en) * 2017-06-14 2020-01-30 Adicet Bio Inc Antibodies capable of binding HLA-A2/TyrD in an HLA restricted manner and uses thereof
RU2687609C1 (ru) * 2018-05-30 2019-05-15 Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов" Федерального медико-биологического агентства Гуманизированное антитело к конформационному эпитопу сз компонента комплемента человека
JP7458382B2 (ja) 2018-09-27 2024-03-29 オートラス リミテッド キメラ抗原受容体
JP7440509B2 (ja) * 2018-11-09 2024-02-28 ベス イスラエル デアコネス メディカル センター Ｃｄｃｐ１－標的化療法
US20230049954A1 (en) * 2019-09-06 2023-02-16 The Regents Of The University Of California Chimeric antigen receptors and related methods and compositions for the treatment of cancer
CN118284625A (zh) * 2021-11-26 2024-07-02 豪夫迈·罗氏有限公司 抗tyrp1/抗cd3双特异性抗体与tyrp1特异性抗体的组合疗法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1294517A (zh) * 1997-11-14 2001-05-09 欧洲细胞技术有限公司 具有合成可变区和修饰特异性的免疫球蛋白分子

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4798790A (en) * 1985-07-18 1989-01-17 Sloan-Kettering Institute Monoclonal antibody specific for a pigmentation associated antigen
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
US4946778A (en) * 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
DE3856559T2 (de) 1987-05-21 2004-04-29 Micromet Ag Multifunktionelle Proteine mit vorbestimmter Zielsetzung
IL89489A0 (en) 1988-03-09 1989-09-10 Hybritech Inc Chimeric antibodies directed against human carcinoembryonic antigen
AU631545B2 (en) 1988-04-15 1992-12-03 Protein Design Labs, Inc. Il-2 receptor-specific chimeric antibodies
ES2070172T3 (es) 1988-04-16 1995-06-01 Celltech Ltd Procedimiento para producir proteinas mediante adn recombinante.
IE20000918A1 (en) * 1990-03-22 2001-05-30 Sloan Kettering Inst Cancer GP75 As a Tumor Vaccine for Melanoma
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
PT1024191E (pt) 1991-12-02 2008-12-22 Medical Res Council Produção de auto-anticorpos a partir de reportórios de segmentos de anticorpo e exibidos em fagos
AU4025193A (en) 1992-04-08 1993-11-18 Cetus Oncology Corporation Humanized C-erbB-2 specific antibodies
AU6171196A (en) 1995-06-07 1996-12-30 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Therapeutic uses of ta99
US5840839A (en) 1996-02-09 1998-11-24 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Alternative open reading frame DNA of a normal gene and a novel human cancer antigen encoded therein
IL152804A0 (en) * 2000-05-16 2003-06-24 Bolder Biotechnology Inc Methods for refolding proteins containing free cysteine residues
NZ554520A (en) * 2004-10-22 2010-03-26 Amgen Inc Methods for refolding of recombinant antibodies

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1294517A (zh) * 1997-11-14 2001-05-09 欧洲细胞技术有限公司 具有合成可变区和修饰特异性的免疫球蛋白分子

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Dipa Patel, et, al..Generation and characterization of a therapeutic human antibody to melanoma antigen TYRP1.《Human Antibodies》.IOS Press,2007,第16卷(第3-4期),127-136.
Generation and characterization of a therapeutic human antibody to melanoma antigen TYRP1;Dipa Patel, et, al.;《Human Antibodies》;IOS Press;20070101;第16卷(第3-4期);第127-136页，尤其是第127页第1段，第128页第2.3节，第130页第3.1节，第131页第3.5节 *
田方等.抗人黑(素)瘤单克隆抗体免疫组化的研究.《单克隆抗体通讯》.1991,第7卷(第4期),21-23. *

Also Published As

Publication number Publication date
MX2010010021A (es) 2011-02-15
NZ587305A (en) 2012-05-25
BRPI0909633A2 (pt) 2015-09-22
US20090232823A1 (en) 2009-09-17
TWI384997B (zh) 2013-02-11
CA2718289A1 (en) 2009-09-17
US7951370B2 (en) 2011-05-31
AU2009222998B2 (en) 2013-05-23
EA019517B1 (ru) 2014-04-30
CL2009000567A1 (es) 2010-02-26
TW200944232A (en) 2009-11-01
EA201071068A1 (ru) 2011-04-29
JP2011516041A (ja) 2011-05-26
CN101970500A (zh) 2011-02-09
KR20100113631A (ko) 2010-10-21
KR101203777B1 (ko) 2012-11-21
AR070821A1 (es) 2010-05-05
ZA201006099B (en) 2012-01-25
EP2268672A1 (en) 2011-01-05
AU2009222998A1 (en) 2009-09-17
IL207581A0 (en) 2010-12-30
UA99339C2 (ru) 2012-08-10
PE20091679A1 (es) 2009-11-04
WO2009114585A1 (en) 2009-09-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101970500B (zh) 抗tyrp1抗体
TWI402078B (zh) 抗ｃｓｆ－１ｒ抗體
CA2801264C (en) Novel anti-cmet antibody
CN104093743B (zh) 特异于her3的结合分子及其用途
US8071730B2 (en) Anti-JAM-A antibodies
BR112020022595A2 (pt) anticorpos específicos para gucy2c e usos dos mesmos
US11359021B2 (en) PD-L1 antibody, antigen-binding fragment thereof, and pharmaceutical use thereof
EP3922647A1 (en) Anti-pd-1 antibody, antigen-binding fragment thereof and pharmaceutical use thereof
CN102046659A (zh) 抗-flt3抗体
EP4112647A1 (en) Anti-cd47/anti-pd-l1 antibody and applications thereof
EP4292611A1 (en) Anti-cd112r antibody and use thereof
US8980264B2 (en) Mouse anti-Aggrus monoclonal antibodies
CN113423736A (zh) 对muc18特异性的抗体
KR20220110495A (ko) 클라우딘 18.2를 표적화하는 항체-약물 콘쥬게이트
JP2022502417A (ja) 抗ｏｘ４０抗体、その抗原結合フラグメント、および医薬用途
BR112021014236A2 (pt) Anticorpo, composição farmacêutica, kit e método para predizer ou avaliar a eficácia
TW201906869A (zh) 抗globo h之人類化抗體及其於治療癌症之用途
WO2011042534A1 (en) Chimeric antibodies specific for cd151 and use thereof in the treatment of cancer

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20130814

Termination date: 20150311

EXPY Termination of patent right or utility model