BR112021014236A2 - Anticorpo, composição farmacêutica, kit e método para predizer ou avaliar a eficácia - Google Patents

Anticorpo, composição farmacêutica, kit e método para predizer ou avaliar a eficácia Download PDF

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Carine Paturel
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Abstract

anticorpo, composição farmacêutica, kit e método para predizer ou avaliar a eficácia. a presente invenção diz respeito a métodos para o tratamento de linfomas de células t usando compostos que se ligam especificamente ao kir3dl2 em combinação com agentes quimioterápicos, notavelmente gemcitabina e/ou oxaliplatina. os tratamentos são particularmente úteis no tratamento de linfomas de células t periféricas, por exemplo, ptcl-nos.

Description

“ANTICORPO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, KIT E MÉTODO PARA PREDIZER OU AVALIAR A EFICÁCIA” REFERÊNCIA CRUZADA PARA OS PEDIDOS RELACIONADOS
[001] O presente pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório Norte-Americano n° US 62/795.194, depositado em 22 de janeiro de 2019, que é integralmente incorporado ao presente por referência, incluindo quaisquer desenhos.
REFERÊNCIA À LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS
[002] O presente pedido de patente está sendo depositado juntamente com uma Listagem de Sequências em formato eletrônico. A Listagem de Sequências é fornecida como um arquivo intitulado “KIR-9 PCT _ST25”, criado em 14 de janeiro de 2020, com 54 KB de tamanho. As informações no formato eletrônico da Listagem de Sequências são integralmente incorporadas ao presente por referência.
CAMPO DA INVENÇÃO
[003] Esta invenção refere-se ao uso de agentes que visam KIR3DL2 para o diagnóstico e tratamento de linfomas de células T.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[004] O KIR3DL2/CD158k é um receptor de superfície celular expresso em subpopulações de linfócitos T NK e CD8+ circulantes saudáveis.
No entanto, KIR3DL2 também foi encontrado na superfície de células T malignas, particularmente células T CD4+ malignas e, consequentemente, também surgiu como um alvo para o tratamento de linfomas de células T (TCLs).
[005] Os linfomas de células T (TCLs) que expressam KIR3DL2 incluem linfomas de células T cutâneos (CTCLs), como Micose Fungoide (MF) e Síndrome de Sézary (SS) (vide, por exemplo, as publicações PCT WO2010/081890 (Innate Pharma) e WO02/50122 (INSERM)), bem como linfomas não–Hodgkin de células T periféricas (vide, por exemplo, a publicação PCT WO2014/128221, Innate Pharma). Enquanto MF e SS são relativamente raros, os PTCLs são responsáveis por 15% a 20% dos linfomas agressivos e por 7% a 10% de todos os linfomas não–Hodgkin (NHLs) nos países ocidentais. Eles geralmente ocorrem em pacientes de meia-idade a idosos, e as características de apresentação são caracterizadas por uma doença disseminada em 68% dos pacientes, com sintomas sistêmicos em quase metade deles (45%), envolvimento da medula óssea (MO) em um quarto (25,8%), e doença extranodal em um terço (37%). Apesar da terapia agressiva, mais da metade dos pacientes morrem da doença. Embora certas entidades de doenças distintas tenham melhorado o prognóstico se tratadas, o prognóstico para muitos PTCLs agressivos permanece relativamente inalterado pelo uso de regimes de quimioterapia de segunda e terceira geração e a sobrevida global de 5 anos (OS) ainda permanece entre 25% e 47% para PTCL-NOS, por exemplo.
[006] Os anticorpos que se ligam especificamente ao KIR3DL2 são bem conhecidos no estado da técnica. A Innate Pharma, por exemplo, descreveu numerosos anticorpos anti-KIR3DL2 direcionados a uma gama de epítopos diferentes no KIR3DL2, por exemplo, anticorpos 15C11, 19H12, 22B2, 18B10, 12B11, 13H1, 10F6, 2B12, 18C6, 9E10, 10G5, 13H1, 5H1, 1E2, 1C3 e 20E9 descritos nas publicações PCT nos. WO2014/044681 e WO2014/044686.
Os estudos clínicos da Innate Pharma demonstraram resultados positivos de um anticorpo anti-KIR3DL2 em pacientes com micose fungoide humana e síndrome de Sézary. Em particular, os dados de pacientes com SS refratários revelaram forte atividade clínica após o tratamento com administrações repetidas de agente único IPH4102 (anticorpo anti-KIR3DL2 mediador de ADCC), demonstrado por uma taxa de resposta geral (ORR) de 42,9%, duração mediana da resposta (DoR) de 13,8 meses e sobrevida livre de progressão (PFS) mediana de 11,7 meses. Esses resultados encorajadores, além disso, com poucos efeitos colaterais e a capacidade de depletar/esgotar células malignas que expressam KIR3DL2 sem causar a depleção de células NK e T que expressam KIR3DL2 saudáveis, fornecem um importante avanço no tratamento de TCLs. No entanto, alguns pacientes apresentaram progressão da doença e/ou não responderam suficientemente ao tratamento inicial.
[007] Consequentemente, há uma necessidade na técnica de benefícios aprimorados para pacientes com TCLs.
DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO
[008] A presente invenção surge, entre outros, da descoberta de que gemcitabina e oxaliplatina podem causar expressão aumentada de KIR3DL2 em células T malignas e que quando esses agentes são combinados com um anticorpo anti-KIR3DL2 depletor, levam a um aumento dramático na capacidade de células do sistema imunológico (células NK) depletar as células T malignas.
[009] De forma interessante, não apenas gemcitabina e oxaliplatina separadamente aumentaram a expressão de KIR3DL2 em células TCL, como também a combinação de gemcitabina + oxaliplatina causou um aumento ainda maior da expressão de KIR3DL2 em células TCL. Também foi observado que o tripleto de gemcitabina + oxaliplatina + anticorpo anti- KIR3DL2 levou a uma forte capacidade das células imunes (células NK) de depletar as células T malignas em comparação com os agentes quando usados de forma isolada. A gemcitabina (ou análogos de nucleosídeo) e/ou oxaliplatina (ou outros compostos de platina) podem, portanto, ser usados para potencializar a atividade de um anticorpo anti-KIR3DL2 ou, em particular, para potencializar a capacidade de um anticorpo anti-KIR3DL2 de causar a eliminação de células do TCL por linfócitos (por exemplo, células T, células
NK).
[010] A combinação de gemcitabina e/ou um composto à base de platina com um anticorpo anti-KIR3DL2 pode, portanto, fornecer um tratamento particularmente vantajoso de pacientes com um TCL (por exemplo, TCL de expressão KIR3DL2, um PTCL, um CTCL, um SS ou um MF).
[011] A gemcitabina (GEMZAR®) é aprovada como um inibidor metabólico de nucleosídeo para uma série de carcinomas, incluindo: - em combinação com carboplatina, para o tratamento de câncer de ovário avançado que recidivado pelo menos 6 meses após a conclusão da terapia à base de platina, - em combinação com paclitaxel, para tratamento de primeira linha do câncer de mama metastático após falha da quimioterapia adjuvante contendo antraciclina anterior, a menos que as antraciclinas sejam clinicamente contraindicadas, - em combinação com cisplatina, para o tratamento do câncer de pulmão de células não pequenas, e - como um agente único no tratamento do câncer de pâncreas.
[012] A oxaliplatina (ELOXATIN®) é um agente à base de platina aprovado para: - o tratamento adjuvante do câncer de cólon em estágio III em pacientes que foram submetidos à ressecção completa do tumor primário, e - o tratamento de câncer colorretal avançado.
[013] Consequentemente, em um aspecto, a presente invenção fornece métodos melhorados de mediar uma resposta imune antitumoral contra uma célula T maligna que expressa KIR3DL2, por meio do uso de anticorpos que se ligam ao KIR3DL2, em combinação com um agente ou tratamento (por exemplo, um agente quimioterápico) que induz ou aumenta a expressão de
KIR3DL2 na superfície da célula T maligna.
[014] Em um aspecto, a presente divulgação fornece métodos melhorados de intensificar uma resposta imune antitumoral, por meio do uso de um anticorpo capaz de se ligar ao KIR3DL2, em combinação com um meio para induzir ou aumentar a expressão de KIR3DL2 na superfície da célula T maligna. Em um exemplo de realização, o meio para induzir ou aumentar a expressão de KIR3DL2 é uma composição farmacêutica que compreende um agente quimioterápico (por exemplo, um análogo de nucleosídeo e/ou um agente de platina) e um veículo farmaceuticamente aceitável.
[015] Em um aspecto, é fornecido no presente documento um anticorpo que se liga ao KIR3DL2, para uso no tratamento de um TCL, em que o anticorpo que se liga ao KIR3DL2 é administrado em combinação com um agente que induz ou aumenta a expressão de KIR3DL2 na superfície da célula T maligna.
[016] Em um aspecto, é fornecido no presente documento um agente que induz ou aumenta a expressão de KIR3DL2 na superfície de uma célula T maligna, para uso no tratamento de um TCL, em que o agente que induz ou aumenta a expressão de KIR3DL2 na superfície de uma célula T maligna é administrado em combinação com um anticorpo que se liga ao KIR3DL2.
[017] Em um exemplo de realização, é fornecido um método para tratar ou prevenir uma célula TCL em um indivíduo, o método compreende a administração ao indivíduo: (a) de um agente que induz ou aumenta a expressão de KIR3DL2 na superfície de uma célula T maligna, e (b) de um anticorpo que se liga ao KIR3DL2.
[018] Em um exemplo de realização, é fornecido um método para potencializar o efeito antitumoral de um anticorpo que se liga ao KIR3DL2, cujo método compreende a administração ao indivíduo de um agente que induz ou aumenta a expressão de KIR3DL2 na superfície de uma célula T maligna.
[019] Em um exemplo de realização, o agente ou meio para induzir ou aumentar a expressão de KIR3DL2 na superfície da célula T maligna é um agente à base de platina. Em um exemplo de realização, o agente ou meio para induzir ou aumentar a expressão de KIR3DL2 na superfície da célula T maligna é um inibidor metabólico nucleosídeo, opcionalmente gemcitabina ou um análogo ou derivado deste. Em um exemplo de realização, o agente ou meio para induzir ou aumentar a expressão de KIR3DL2 na superfície da célula T maligna é uma combinação ou um agente à base de platina e um inibidor metabólico de nucleosídeo (por exemplo, gemcitabina ou um análogo ou derivado da mesma).
[020] Em um exemplo de realização, o anticorpo que se liga ao KIR3DL2 é um anticorpo que medeia ou direciona a lise mediada por células efetoras de uma célula que expressa KIR3DL2 (por exemplo, célula T maligna).
Em um exemplo de realização, o anticorpo compreende um domínio Fc capaz de mediar ADCC e/ou ADCP. Em um exemplo de realização, o anticorpo é expresso na superfície de uma célula imune efetora (por exemplo, como parte de um receptor de antígeno quimérico em uma célula imune efetora).
Opcionalmente, o anticorpo é um anticorpo monoespecífico ou multiespecífico (por exemplo, biespecífico) que direciona ADCC e/ou ADCP em direção a uma célula que expressa KIR3DL2. Em qualquer aspecto, um anticorpo que se liga a um polipeptídeo KIR3DL2 e é capaz de depletar células que expressam KIR3DL2 pode ser caracterizado como uma composição capaz de esgotar células que expressam KIR3DL2, em que a composição compreende um anticorpo que se liga a um polipeptídeo KIR3DL2. Em um exemplo de realização, o anticorpo que se liga ao KIR3DL2 é o lacutamabe.
[021] Em um aspecto de qualquer exemplo de realização da presente invenção, o indivíduo pode ser especificado como um humano.
[022] Em um exemplo de realização, o anticorpo anti-KIR3DL2 e o agente ou meio para induzir ou aumentar a expressão de KIR3DL2 na superfície da célula T maligna são administrados em uma quantidade terapeuticamente eficaz.
[023] Em um exemplo de realização, o anticorpo anti-KIR3DL2 é administrado a um indivíduo com câncer em uma quantidade e frequência suficientes para mediar a ADCC para células tumorais que expressam KIR3DL2.
[024] Em um exemplo de realização, o agente ou meio para induzir ou aumentar a expressão de KIR3DL2 na superfície da célula T maligna é administrado a um indivíduo com câncer em uma quantidade e frequência suficiente para causar um aumento na expressão de KIR3DL2 na superfície de células T malignas.
[025] Em qualquer aspecto do presente documento, um indivíduo tratado de acordo com a divulgação pode ser um indivíduo que não responde, ou que experimentou uma resposta parcial ou incompleta após o tratamento anterior para o TCL.
[026] Em outros exemplos de realização, são fornecidos métodos para predizer ou avaliar a eficácia ou adequação de um agente anticâncer para uso combinado com um anticorpo que se liga a um polipeptídeo KIR3DL2 para o tratamento de um TCL, cujo método compreende determinar ou avaliar (por exemplo, in vitro) se o agente anticâncer é capaz de induzir ou aumentar a expressão de KIR3DL2 na superfície de uma célula T maligna, em que a determinação de que o agente anticâncer é capaz de induzir ou aumentar a expressão de KIR3DL2 na superfície de uma célula T maligna indica que o agente pode ser usado para o tratamento do câncer em combinação com um anticorpo anti-KIR3DL2. Determinar ou avaliar se o agente anticâncer é capaz de induzir ou aumentar a expressão de KIR3DL2 na superfície de uma célula T maligna pode compreender, por exemplo, colocar células T que expressam KIR3DL2 malignas (por exemplo, células tumorais) em contato com o agente in vitro e avaliar a expressão de KIR3DL2. Em um exemplo de realização, o agente anticâncer é um agente quimioterápico, opcionalmente um análogo de nucleosídeo ou um agente de platina.
[027] Estes aspectos são descritos mais completamente no relatório descritivo da presente invenção e aspectos, características e vantagens adicionais serão evidentes a partir dele.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[028] A Figura 1 mostra a citotoxicidade do anticorpo anti- KIR3DL2 para a linha celular HUT78 TCL (Síndrome de Sézary). A atividade antitumoral do anti-KIR3DL2 foi aumentada por cada um dentre gemcitabina e oxaliplatina, e ainda mais pela combinação de gemcitabina e oxaliplatina.
[029] A Figura 2 mostra que a gemcitabina e a oxaliplatina aumentam a expressão de KIR3DL2 na superfície celular em células tumorais.
RAJI-KIR3DL2 (incubação de 48 horas) (Figura 2, painel esquerdo) ou Hut78 (linhagem de células B–NHL transfectadas; incubação de 24 horas (Figura 2, painel direito) foram incubadas com doses crescentes de gemcitabina e oxaliplatina. A mediana da intensidade de fluorescência de KIR3DL2 na superfície da linhagem de células tumorais foi analisada por citometria de fluxo.
[030] A Figura 3 mostra a sobrevivência de camundongos (n = 9 por grupo) enxertados I.V. com Raji-KIR3DL2 e tratados duas vezes por semana com: mAb de controle isotípico, IPH4102 (0,3 µg por injeção), gemcitabina (50 mg/kg) ou oxaliplatina (5 mg/kg), ambos IPH4102 + gemcitabina ou ambos IPH4102 + oxaliplatina.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[031] Tal como utilizado na presente invenção, os termos “um” ou “uma” podem significar um ou mais. Tal como utilizado na(s)
reivindicação(ões), quando usado em conjunção com a palavra "compreendendo", os termos "um" ou "uma" podem significar um ou mais do que um. Tal como aqui utilizado o termo "outro" pode significar pelo menos um segundo ou mais.
[032] Quando o termo “compreende” é utilizado, ele pode ser opcionalmente substituído por “consistindo essencialmente de” ou “consiste em”.
[033] Sempre que, no presente relatório descritivo, mencionar-se “tratamento de TCL” ou expressão similar com referência a agentes de ligação anti-KIR3DL2 (por exemplo, anticorpo), indica-se: (a) método de tratamento de TCL, em que o referido método compreende a etapa de administração (para pelo menos um tratamento) de agente de ligação anti-KIR3DL2 (preferencialmente em material veículo farmaceuticamente aceitável) a um indivíduo, mamífero, especialmente ser humano, necessitado desse tratamento, em dose que permita o tratamento de TCL (quantidade terapeuticamente eficaz), por exemplo, na dose (quantidade) especificada acima e abaixo; (b) uso de um agente de ligação anti-KIR3DL2 para o tratamento de TCL ou um agente de ligação anti-KIR3DL2 para uso no referido tratamento (especialmente em seres humanos); (c) uso do agente de ligação anti-KIR3DL2 para a fabricação de preparações farmacêuticas para o tratamento de TCL, um método de uso de agentes de ligação anti-KIR3DL2 para fabricação de preparações farmacêuticas para o tratamento de TCL, que compreende a mistura de um agente de ligação anti-KIR3DL2 com veículo farmaceuticamente aceitável, ou uma preparação farmacêutica que compreende uma dosagem eficaz de agente de ligação anti-KIR3DL2 que é apropriada para o tratamento de TCL; ou (d) qualquer combinação de (a), (b) e (c), de acordo com o objeto patenteável em países nos quais o presente pedido for depositado.
[034] O termo “anticorpo”, como aqui utilizado, refere-se a anticorpos policlonais e monoclonais. Dependendo do tipo de domínio constante nas cadeias pesadas, os anticorpos são atribuídos a uma de cinco classes principais: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM. Vários destes são adicionalmente divididos em subclasses ou isotipos, tais como IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 e similares. Um exemplo de unidade estrutural de imunoglobulina (anticorpo) compreende um tetrâmero. Cada tetrâmero é composto de dois pares idênticos de cadeias de polipeptídeos, em que cada par possui uma cadeia “leve” (cerca de 25 kDa) e uma cadeia “pesada” (cerca de 50-70 kDa). O N-terminal de cada cadeia define uma região variável de cerca de 100 a 110 ou mais aminoácidos que é principalmente responsável pelo reconhecimento de antígenos. As expressões “cadeia leve variável (VL)” e “cadeia pesada variável (VH)” designam essas cadeias leve e pesada, respectivamente. Os domínios constantes de cadeia pesada correspondentes às diferentes classes de imunoglobulinas são denominados “alfa”, “delta”, “épsilon”, “gama” e “mu”, respectivamente. As estruturas de subunidade e as configurações tridimensionais das diferentes classes de imunoglobulinas são bem conhecidas. As IgGs são exemplos de classes de anticorpos empregados no presente, pois são os anticorpos mais comuns na situação fisiológica e são mais facilmente preparados em ambiente laboratorial. Em um exemplo de realização, o anticorpo é um anticorpo monoclonal. São fornecidos anticorpos humanizados, quiméricos, humanos ou de outra forma-humanos-adequados.
“Anticorpos” também incluem qualquer fragmento ou derivado de qualquer um dos anticorpos aqui descritos.
[035] A expressão “região hipervariável”, quando utilizada na presente invenção, designa os resíduos de aminoácidos de um anticorpo que são responsáveis pela ligação aos antígenos. A região hipervariável geralmente compreende resíduos de aminoácidos de uma “região de determinação da complementaridade” ou “CDR” (por exemplo, resíduos 24-34 (L1), 50-56 (L2) e 89-97 (L3) no domínio variável de cadeia leve e 31-35 (H1), 50-65 (H2) e 95-102 (H3) no domínio variável de cadeia pesada; Kabat et al., 1991) e/ou os resíduos de um “circuito hipervariável” (por exemplo, resíduos 26-32 (L1), 50-52 (L2) e 91- 96 (L3) no domínio variável de cadeia leve e 26-32 (H1), 53-55 (H2) e 96-101 (H3) no domínio variável de cadeia pesada; Chothia e Lesk, J. Mol. Biol. 1987; 196: 901-917) ou um sistema similar para determinar aminoácidos essenciais responsáveis pela ligação ao antígeno. Normalmente, a numeração de resíduos de aminoácidos nessa região é realizada por meio do método descrito em Kabat et al., supra. Expressões como “posição de Kabat”, “numeração de resíduos de domínio variável como em Kabat” e “de acordo com Kabat” no presente pedido indicam este sistema de numeração para domínios variáveis de cadeia pesada ou domínios variáveis de cadeia leve.
Utilizando o sistema de numeração de Kabat, a sequência de aminoácidos linear real de um peptídeo pode conter mais ou menos aminoácidos correspondentes à redução ou inserção em uma FR ou CDR do domínio variável. Por exemplo, o domínio variável de cadeia pesada pode incluir um único aminoácido inserido (resíduo 52A de acordo com Kabat) após o resíduo 52 da CDR H2 e resíduos inseridos (por exemplo, resíduos 82a, 82b, 82c etc.
de acordo com Kabat) após o resíduo 82 da FR de cadeia pesada. A numeração de Kabat dos resíduos pode ser determinada para um dado anticorpo pelo alinhamento nas regiões de homologia da sequência do anticorpo com uma sequência numerada de Kabat “padrão”.
[036] Por resíduos de “arcabouço/região estrutural” ou “FR” (do inglês, Framework Region), conforme utilizado na presente invenção, entende- se a região de um domínio variável de anticorpo exclusivo daquelas regiões definidas como CDRs. Cada região estrutural do domínio variável de anticorpo pode ser adicionalmente subdividida em regiões contíguas separadas pelas
CDRs (FR1, FR2, FR3 e FR4). As expressões “domínio Fc”, “porção Fc" e "região Fc" designam um fragmento C-terminal de uma cadeia pesada de anticorpo, por exemplo, cerca do aminoácido (aa) 230 até cerca de aa 450 da cadeia pesada γ (gama) humana ou sua sequência correspondente em outros tipos de cadeias pesadas de anticorpos (por exemplo, α, δ, ε e µ para anticorpos humanos) ou um de seus alótipos de ocorrência natural. A menos que especificado de outra forma, a numeração de aminoácidos de Kabat comumente aceita para imunoglobulinas é utilizada ao longo de todo o relatório descritivo (vide Kabat et al. (1991), Sequences of Protein of Immunological Interest, 5ª ed., United States Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda MD).
[037] A expressão “liga-se especificamente a” indica que um anticorpo pode ligar-se em um ensaio de ligação competitiva ao parceiro de ligação, por exemplo, KIR3DL2, conforme determinado utilizando-se formas recombinantes das proteínas, seus epítopos ou proteínas nativas presentes sobre a superfície de células alvo isoladas. Os ensaios de ligação competitiva e outros métodos de determinação de ligação específica são adicionalmente descritos abaixo e são bem conhecidos no estado da técnica.
[038] Quando se afirmar que um anticorpo “compete com” um anticorpo monoclonal específico, significa que o anticorpo concorre com o anticorpo monoclonal em um ensaio de ligação utilizando moléculas KIR3DL2 recombinantes ou moléculas KIR3DL2 expressas na superfície. Por exemplo, se um anticorpo de teste reduz a ligação de AZ158, 19H12, 2B12 ou 12B11 a um polipeptídeo KIR3DL2 ou célula que expressa KIR3DL2 em um ensaio de ligação, diz-se que o anticorpo “compete” respectivamente com AZ158, 19H12, 2B12 ou 12B11.
[039] O termo “afinidade”, da forma utilizada no presente, indica a força da ligação de um anticorpo a um epítopo. A afinidade de um anticorpo é fornecida pela constante de dissociação Kd, definida como [Ab] x [Ag] / [Ab-Ag], em que [Ab-Ag] é a concentração molar do complexo de anticorpo e antígeno, [Ab] é a concentração molar do anticorpo não ligado e [Ag] é a concentração molar do anticorpo não ligado. A constante de afinidade Ka é definida por 1/Kd.
Métodos de determinação da afinidade de mAbs podem ser encontrados em Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova Iorque, 1988), Coligan et al., eds., Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. e Wiley Interscience, Nova Iorque (1992, 1993) e Muller, Meth. Enzymol. 92: 589-601 (1983) cujas referências são integralmente incorporadas ao presente como referência. Um método padrão bem conhecido na técnica para determinar a afinidade de mAbs é o uso de seleção por ressonância de plasma da superfície (SPR) (tal como por meio de análise com um dispositivo analítico SPR BIAcore®).
[040] Um “determinante” designa um sítio de interação ou ligação sobre um polipeptídeo.
[041] O termo “epítopo” designa um determinante antigênico e é a área ou região sobre um antígeno à qual se liga um anticorpo. Um epítopo de proteína pode compreender resíduos de aminoácidos envolvidos diretamente na ligação, bem como resíduos de aminoácidos que são efetivamente bloqueados pelo peptídeo ou anticorpo de ligação de antígenos específico, ou seja, resíduos de aminoácidos dentro da “pegada” do anticorpo. É a forma mais simples ou a menor área estrutural em uma molécula de antígeno de complexo que pode combinar-se, por exemplo, com um anticorpo ou receptor. Os epítopos podem ser lineares ou estruturais/conformacionais. A expressão “epítopo linear” é definida como um epítopo composto de resíduos de aminoácidos que são contíguos sobre a sequência linear de aminoácidos (estrutura primária). A expressão “epítopo estrutural ou conformacional” é definida como um epítopo composto de resíduos de aminoácidos que não são todos contíguos e, portanto, representam partes separadas da sequência linear de aminoácidos que são colocados em proximidade entre si por meio de dobra da molécula (estruturas secundárias, terciárias e/ou quaternárias). O epítopo conformacional é dependente da estrutura tridimensional. O termo “conformacional” é, portanto, frequentemente utilizado de forma intercambiável com “estrutural”.
[042] Os termos “depleção/ esgotamento” “depletar/ esgotar””, no que diz respeito a células que expressam KIR3DL2, indica um processo, método, ou um composto que pode matar, eliminar, lisar ou induzir tal morte, eliminação ou lise (por exemplo, por ADCC ou ADCP), de modo a afetar negativamente o número de células que expressam KIR3DL2 presentes em uma amostra ou sujeito.
[043] Os termos “imunoconjugado”, “conjugado de anticorpo”, “conjugado de anticorpo e fármaco” e “ADC (do inglês, Antibody Drug Conjugate)” são usados indistintamente e referem-se a um anticorpo que é conjugado a outra fração (por exemplo, qualquer fração não anticorpo, agente terapêutico, fração citotóxica ou rótulo/marcador).
[044] O termo “agente” é utilizado no presente para indicar um composto químico, mistura de compostos químicos, macromolécula biológica ou extrato feito de materiais biológicos. A expressão “agente terapêutico” indica um agente que possui atividade biológica.
[045] A expressão “citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos” ou “ADCC” é um termo bem compreendido na técnica e designa reação mediada por células na qual células citotóxicas não específicas que expressam receptores de Fc (FcRs) reconhecem anticorpo ligado sobre célula alvo e, em seguida, causam lise da célula alvo. Células citotóxicas não específicas que mediam ADCC incluem células matadoras naturais (NK, do inglês Natural Killer), macrófagos, monócitos, neutrófilos e eosinófilos.
[046] Os termos “isolado”, “purificado” ou “biologicamente puro” designam material que é substancial ou essencialmente livre de componentes que normalmente o acompanham conforme encontrado no seu estado nativo. A pureza e a homogeneidade são tipicamente determinadas pelo uso de métodos de química analítica, tais como eletroforese de gel de poliacrilamida ou cromatografia de líquidos de alto desempenho. Uma proteína que é a espécie predominante presente em uma preparação é substancialmente purificada.
[047] Os termos “polipeptídeo”, “peptídeo” e “proteína” são utilizados de forma intercambiável no presente para designar um polímero de resíduos de aminoácidos. Os termos aplicam-se a polímeros de aminoácidos nos quais um ou mais resíduos de aminoácidos são imitação química artificial de um aminoácido de ocorrência natural correspondente, bem como polímeros de aminoácidos de ocorrência natural e polímeros de aminoácidos não de ocorrência natural.
[048] O termo “recombinante”, quando utilizado com referência, por exemplo, a uma célula, ácido nucleico, proteína ou vetor, indica que a célula, ácido nucleico, proteína ou vetor foi modificado pela introdução de uma proteína ou ácido nucleico heterólogo ou pela alteração de uma proteína ou ácido nucleico nativo, ou que a célula é derivada de uma célula modificada desta forma. Assim, por exemplo, as células recombinantes expressam genes que não são encontrados dentro da forma nativa (não recombinante) da célula ou expressam genes nativos que, de outra forma, são expressos de forma anormal, subexpressos ou não são expressos.
[049] Dentro do contexto do presente pedido, o termo anticorpo que “se liga” a um polipeptídeo ou epítopo designa um anticorpo que se liga ao referido determinante com afinidade e/ou especificidade.
[050] O termo “identidade” ou “idêntico”, quando utilizado em relação entre as sequências de dois ou mais polipeptídeos, designa o grau de relação de sequências entre polipeptídeos, conforme determinado pela quantidade de correspondências entre conjuntos de dois ou mais resíduos de aminoácidos. A “identidade” mede o percentual de correspondências idênticas entre a menor dentre duas ou mais sequências com alinhamentos de intervalos (se houver) abordados por um modelo matemático ou programa de computador específico (ou seja, “algoritmos”). A identidade de polipeptídeos relacionados pode ser facilmente calculada por meio de métodos conhecidos. Esses métodos incluem, mas não se limitam a, os descritos em Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, Nova Iorque, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, Nova Iorque, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Parte 1, Griffin, A. M. e Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. e Devereux, J., eds., M.
Stockton Press, Nova Iorque, 1991; e Carillo et al., SIAM J. Applied Math. 48, 1073 (1988).
[051] Os métodos de determinação da identidade são projetados para fornecer a maior correspondência entre as sequências testadas. Os métodos de determinação da identidade são descritos em programas de computador disponíveis ao público. Os métodos de programas de computador para determinar a identidade entre duas sequências incluem o pacote de programas GCG, que inclui GAP (Devereux et al., Nucl. Acid Res. 12, 387 (1984); Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.), BLASTP, BLASTN e FASTA (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215, 403-410 (1990)).
O programa BLASTX é disponível ao público por meio do National Center for Biotechnology Information (NCBI) e outras fontes (BLAST Manual, Altschul et al., NCB/NLM/NIH, Bethesda, MD 20894; Altschul et al., supra). O algoritmo de
Smith Waterman bem conhecido também pode ser utilizado para determinar a identidade.
TRATAMENTO DE DOENÇAS MALIGNAS DE CÉLULAS T
[052] São descritos na presente invenção métodos úteis no tratamento e prevenção de um TCL em um indivíduo por meio da administração de agentes que induzem ou aumentam a expressão de KIR3DL2 na superfície de células T malignas, para potencializar a atividade de um anticorpo que se liga a um polipeptídeo KIR3DL2. Os regimes de tratamento e métodos descritos na presente invenção podem ser usados para uma variedade de linfomas de células T, particularmente, linfomas de células T CD4+. Em qualquer aspecto, um TCL pode ser especificado para ser um TCL caracterizado por células malignas que expressam KIR3DL2 em suas superfícies.
[053] Conforme mostrado na presente invenção, a gemcitabina (Gemzar®, Eli Lilly & Company) pode induzir ou aumentar a expressão de KIR3DL2 na superfície de células T malignas. A gemcitabina é um análogo de nucleosídeo aprovado como quimioterapia no tratamento de tumores sólidos.
Tal como acontece com a fluorouracila e outros análogos das pirimidinas, o fármaco substitui um dos blocos de construção dos ácidos nucleicos, neste caso a citidina, durante a replicação do DNA. Consequentemente, a gemcitabina e seus análogos e derivados podem ser usados para potencializar a atividade de um anticorpo que se liga a um polipeptídeo KIR3DL2.
[054] Como mostrado na presente invenção, a oxaliplatina pode induzir ou aumentar a expressão de KIR3DL2 na superfície de células T malignas. A oxaliplatina e outros agentes de platina são bem conhecidos no estado da técnica e incluem, por exemplo, cisplatina, carboplatina, nedaplatina, fenantriplatina, picoplatina, satraplatina. Consequentemente, os agentes de platina podem ser usados para potenciar a atividade de um anticorpo que se liga a um polipeptídeo KIR3DL2.
[055] O agente de platina e/ou agente de gemcitabina pode estar em qualquer configuração ou formulação adequada, incluindo, por exemplo, como composto livre ou como parte de um conjugado, formulação de nanopartículas, encapsulado (por exemplo, em um lipossoma), em cada caso opcionalmente ainda em uma combinação com agentes farmaceuticamente ativos adicionais.
[056] Consequentemente, em um aspecto, são fornecidos métodos para tratar um indivíduo com um TCL, cujo método compreende a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de cada um dentre: (a) um anticorpo que se liga a um polipeptídeo KIR3DL2, e (b) um agente de platina e/ou gemcitabina. Em um exemplo de realização, o método compreende a administração ao indivíduo de um anticorpo que se liga a um polipeptídeo KIR3DL2, um agente de platina (por exemplo, oxaliplatina) e gemcitabina. Em outro exemplo de realização, o método compreende a administração ao indivíduo de um anticorpo que se liga a um polipeptídeo KIR3DL2 e um agente de platina (por exemplo, oxaliplatina), sem administração combinada ou uso de gemcitabina. Em outro exemplo de realização, o método compreende a administração ao indivíduo de um anticorpo que se liga a um polipeptídeo KIR3DL2 e gemcitabina, sem administração combinada ou uso de oxaliplatina.
Em outro exemplo de realização, o método compreende a administração ao indivíduo de um anticorpo que se liga a um polipeptídeo KIR3DL2 e gemcitabina, sem administração combinada ou uso de um agente de platina.
[057] Em um exemplo de realização, o agente de platina (por exemplo, oxaliplatina) e/ou gemcitabina são administrados em uma quantidade eficaz para causar um aumento na expressão de polipeptídeos KIR3DL2 na superfície de células malignas.
[058] Em um aspecto, são fornecidos métodos para aumentar a expressão de polipeptídeos KIR3DL2 na superfície de células malignas, opcionalmente células TCL (por exemplo, de maneira in vitro ou in vivo em um indivíduo com um TCL), cujo método compreende o contato das células malignas com uma quantidade eficaz de um agente de platina e/ou gemcitabina. Em um exemplo de realização, o método compreende ainda uma etapa de deleção de células malignas que expressam KIR3DL2 (por exemplo, tendo expressão aumentada de KIR3DL2), em que a etapa compreende o contato das células malignas com uma quantidade eficaz de um anticorpo que se liga a um polipeptídeo KIR3DL2.
[059] As terapias combinadas para o tratamento do câncer fornecidas na presente invenção podem compreender a administração de: (a) um anticorpo anti-KIR3DL2 de depleção (por exemplo, um anticorpo de ligação ao KIR3DL2 ou fragmento de anticorpo, uma célula efetora expressando em sua superfície um receptor de ativação quimérico (por exemplo, receptor de célula T) compreendendo um fragmento de anticorpo de ligação ao KIR3DL2) e (b) um agente de platina, opcionalmente oxaliplatina, para tratar um indivíduo com uma malignidade de células T, opcionalmente, uma malignidade de células T CD4+.
[060] Em outro exemplo de realização, as terapias combinadas para o tratamento do câncer fornecidas na presente invenção compreendem a administração de: (a) um anticorpo anti-KIR3DL2 de depleção (por exemplo, um anticorpo de ligação ao KIR3DL2 ou fragmento de anticorpo, uma célula efetora expressando em sua superfície um receptor de ativação quimérico (por exemplo, receptor de célula T) compreendendo um fragmento de anticorpo de ligação ao KIR3DL2) e (b) um análogo de nucleosídeo, opcionalmente gemcitabina, para tratar um indivíduo com uma malignidade de células T, opcionalmente, uma malignidade de células T CD4+.
[061] Em outro exemplo de realização, as terapias combinadas para o tratamento do câncer fornecidas na presente invenção compreendem a administração de: (a) um anticorpo anti-KIR3DL2 de depleção (por exemplo, um anticorpo de ligação ao KIR3DL2 ou fragmento de anticorpo, uma célula efetora expressando em sua superfície um receptor de ativação quimérico (por exemplo, receptor de célula T) compreendendo um fragmento de anticorpo de ligação ao KIR3DL2) e (b) um agente de platina, opcionalmente oxaliplatina, e (c) um análogo de nucleosídeo, opcionalmente gemcitabina, para tratar um indivíduo com uma malignidade de células T, opcionalmente uma malignidade de células T CD4+.
[062] São fornecidos métodos terapêuticos para o tratamento de indivíduos com TCL, suscetíveis a um TCL ou que experienciaram um TCL. Em um exemplo de realização, o TCL é um TCL agressivo ou avançado (por exemplo, estádio IV, ou mais geralmente além do estádio II). Em um exemplo de realização, o paciente tem doença recorrente ou refratária. Em um exemplo de realização, o paciente tem um mau prognóstico para a progressão da doença (por exemplo, mau prognóstico para a sobrevida), tem um mau prognóstico para a resposta a uma terapia ou tem doença em progressão ou recidiva após tratamento prévio com uma terapia anterior.
[063] Em um exemplo de realização, o TCL é uma neoplasia de células T agressiva. Em um exemplo de realização, o TCL é um TCL não cutâneo agressivo. Em outro exemplo de realização, o TCL é TCL cutâneo agressivo, opcionalmente um linfoma cutâneo primário de células T pequenas/médias CD4+ ou um linfoma primário de células T pequenas/médias CD8+. Em um exemplo de realização, o TCL é um linfoma cutâneo de células T (CTCL). Em um exemplo de realização, o TCL é um linfoma de células T periféricas (PTCL), opcionalmente um PTCL não cutâneo. PTCL e PTCL-NOS podem ser opcionalmente especificados como doenças diferentes dos linfomas cutâneos de células T.
[064] O linfoma cutâneo de células T (CTCL) (veja a imagem abaixo) é um grupo de doenças linfoproliferativas caracterizadas pela localização de linfócitos T neoplásicos na pele. Coletivamente, o CTCL é classificado como um tipo de linfoma não Hodgkin (LNH). A classificação de CTCLs pela Organização Mundial da Saúde – Organização Europeia para Pesquisa e Tratamento do Câncer (OMS-EORTC) é divulgada em Willemze et al. (2005) Blood 105: 3768-3785. A OMS-EORTC divide a CTCL naqueles com comportamento clínico indolente e aqueles com subtipos agressivos. Uma terceira categoria é aquela de neoplasias hematológicas precursoras que não são linfomas de células T (neoplasia hematodérmica CD4 +/CD56+, linfoma de células blásticas natural killer (NK) ou neoplasias cutâneas primárias derivadas de células B). Os CTCLs que podem ter comportamento clínico indolente incluem Micose fungoide (MF) e suas variantes, distúrbio linfoproliferativo cutâneo primário CD30+ (por exemplo, linfoma anaplásico cutâneo primário de células grandes, papulose linfomatoide), paniculite subcutânea como linfoma de células T (provisório) e Linfoma pleomórfico de células T pequenas/médias CD4+ cutâneo primário (provisório). Os CTCLs com comportamento clínico agressivo incluem síndrome de Sézary (SS), leucemia/linfoma de células T do adulto, linfoma extranodal de células NK/T, tipo nasal, linfoma cutâneo primário de células T periféricas, não especificado, Linfoma cutâneo primário epidermotrópico de células T CD8+ agressivo (provisório) e Linfoma cutâneo de células T gama/delta positivo (provisório). Os métodos divulgados na presente invenção podem ser usados para tratar cada uma dessas condições.
[065] Os CTCLs mais comuns são MF e SS. Suas características são revisadas, por exemplo, em Willemze et al. (2005) Blood 105: 3768-3785, cuja divulgação é incorporada ao presente por referência. Na maioria dos casos de MF, o diagnóstico é feito devido às suas características clínicas, histórico da doença e achados histomorfológicos e citomorfológicos. Um critério diagnóstico adicional para distinguir CTCL de dermatoses inflamatórias é a demonstração de um clone de células T dominante em amostras de biópsia de pele por um ensaio molecular (por exemplo, Southern blot, reação em cadeia da polimerase (PCR)). Testes genéticos também podem ser considerados. A micose fungoide clássica é dividida em três estágios: (1) Mancha (atrófica ou não atrófica): Dermatite inespecífica, manchas na parte inferior do tronco e nas nádegas; prurido mínimo/ausente; (2) Placa: Placas intensamente pruriginosas, linfadenopatia e (3) Tumor: Propenso à ulceração. A síndrome de Sézary é definida por eritrodermia e leucemia. Os sinais e sintomas incluem pele edematosa, linfadenopatia, hiperceratose palmar e/ou plantar, alopecia, distrofia ungueal, ectrópio e hepatoesplenomegalia. Para um diagnóstico de síndrome de Sézary, os critérios geralmente incluem contagem absoluta de células de Sézary, anormalidades imunofenotípicas, perda de antígenos de células T e/ou um clone de células T no sangue periférico mostrado por métodos moleculares ou citogenéticos.
[066] Os estádios de CTCL incluem I, II, III e IV, de acordo com a classificação TNM e, conforme apropriado, envolvimento do sangue periférico.
O envolvimento do sangue periférico com células da micose fungoide ou da síndrome de Sézary (MF/SS) está correlacionado com o estágio mais avançado da pele, envolvimento dos linfonodos e viscerais e redução da sobrevida. MF e SS têm um sistema de estadiamento formal proposto pela Sociedade Internacional de Linfomas Cutâneos (ISCL) e pela Organização Europeia de Pesquisa e Tratamento do Câncer (EORTC). Vide, Olsen et al., (2007) Blood. 110 (6): 1713-1722; e Agar et al. (2010) J. Clin. Oncol. 28 (31): 4730-4739, cujas divulgações são incorporadas ao presente por referência.
[067] Em um exemplo de realização, o TCL é um linfoma de células T periféricas (PTCL), opcionalmente um PTCL não cutâneo. PTCL e PTCL-NOS podem ser opcionalmente especificados como doenças diferentes dos linfomas cutâneos de células T, Síndrome de Sézary e Micose fungoide, que são consideradas patologias distintas. Em um exemplo de realização, o PTCL é um PTCL nodal (por exemplo, principalmente ou predominantemente nodal). PTCLs predominantemente nodais incluem, entre outros, PTCL-NOS (linfoma de células T periféricas sem outras especificações), linfomas anaplásicos de células grandes (ALCL) e linfomas angioimunoblásticos de células T (AITL). Por exemplo, um PTCL pode ser agressivo, não cutâneo, PCTL predominantemente nodal (a doença pode, adicionalmente, ter apresentação extranodal).
[068] Em um exemplo de realização, o PTCL é um PTCL extranodal (por exemplo, principalmente extranodal). Por exemplo, um PTCL pode ser um PCTL agressivo, não cutâneo e extranodal.
[069] Em um exemplo de realização, o PTCL é uma leucemia ou linfoma de células T adultas (ATL), por exemplo, HTLV+ ATL.
[070] Em um exemplo de realização, o PTCL é um linfoma de células NK/T extranodal, tipo nasal. Em um exemplo de realização, o PTCL é um linfoma de células T associado à enteropatia.
[071] Em um exemplo de realização, o PTCL é um linfoma hepatoesplênico de células T, opcionalmente um linfoma hepatoesplênico de células T αβ, opcionalmente, um linfoma hepatoesplênico de células T γδ.
[072] Em um exemplo de realização, o PTCL é um linfoma anaplásico de células grandes (ALCL), opcionalmente um ALCL ALK +, opcionalmente um ALCL ALK-. O ALCL ALK+ geralmente desfruta de prognósticos favoráveis usando a terapia convencional (93% de sobrevida em 5 anos), mas o ALCL ALK- tem prognóstico ruim (37%). O ALCL é geralmente caracterizado pela expressão uniforme de CD30 de superfície. Em um exemplo de realização, o PTCL é um linfoma angioimunoblástico de células T (AITL), opcionalmente um AITL cutâneo, opcionalmente um linfoma cutâneo primário de células T pequenas/médias CD4+ ou um linfoma primário de células T CD8+ pequenas/médias, opcionalmente um AITL não cutâneo.
[073] Em um exemplo de realização, o PTCL é um linfoma intestinal, por exemplo, um ALCL intestinal.
[074] Em um exemplo de realização, o PTCL é uma leucemia prolinfocítica de células T.
[075] Em um exemplo de realização, um PTCL é um PTCL-NOS (linfoma de células T periféricas sem outras especificações). O PTCL-NOS, também conhecido como PCTL-U ou PTCL–não especificado, são linfomas agressivos, principalmente do tipo nodal, mas o envolvimento extranodal é comum. A maioria dos casos nodais são CD4+ e CD8-, e o CD30 pode ser expresso em variantes de células grandes. A maioria dos pacientes com PTCL- NOS apresenta envolvimento nodal; no entanto, vários locais extranodais também podem estar envolvidos (por exemplo, fígado, medula óssea, gastrointestinal, pele). Os estudos geralmente relatam uma sobrevida global em 5 anos de aproximadamente 30% – 35% usando a quimioterapia padrão.
No passado, várias entidades definidas correspondentes aos subtipos reconhecíveis de neoplasia de células T, tais como linfoma de Lennert, linfoma zona T, linfoma de célula T pleomorfo e linfoma T imunoblástico foram descritas, mas ainda faltam evidências que estes correspondam a entidades clinicopatológicas distintas. Por esta razão a recente classificação da Organização Mundial da Saúde (OMS) das neoplasias hematopoiéticas e linfoides coletou tais doenças sob a única categoria ampla de PTCL-NOS/U.
PTCL-NOS pode, portanto, ser especificado para excluir certas entidades clínico-patológicas distintas, como leucemia prolinfocítica de células T, ATL/leucemia de células T adultas, leucemia de células NK/T extranodal tipo nasal, linfoma de células T do tipo EATL/enteropatia, linfoma hepatoesplênico de células T, linfoma de células T tipo paniculite subcutânea, ALCL/linfoma anaplásico de células grandes e/ou AITL/linfoma de células T angioimunoblástico.
[076] Os critérios de diagnóstico de PTCL podem ser aqueles de diretrizes médicas padrão, por exemplo, de acordo com o sistema de classificação da Organização Mundial da Saúde (OMS) (vide, por exemplo, Organização Mundial da Saúde. Classificação da OMS de Tumores de Tecidos Hematopoiéticos e Linfoides, 4ª ed. Lyon, França: IARC Press, 2008). Veja também, por exemplo, Foss et al. (2011) Blood 117: 6756-6767, cujas divulgações são incorporadas ao presente pedido por referência.
[077] Em um exemplo de realização, um TCL é caracterizado por tumores ou células tumorais que não expressam polipeptídeos CD30 significativos e/ou detectáveis em suas superfícies (CD30–negativo). Em outros exemplos de realização, o TCL é caracterizado por tumores ou células tumorais que expressam CD30 em suas superfícies (CD30–positivo); em um exemplo de realização, o tumor ou células tumorais expressam baixos níveis de CD30 em suas superfícies; em outro exemplo de realização, os tumores ou células tumorais expressam altos níveis de CD30 em suas superfícies. Opcionalmente, a expressão de CD30 é determinada por imuno-histoquímica.
[078] Em um aspecto exemplar, é fornecido um método para reduzir a progressão de TCL em um mamífero hospedeiro (por exemplo, um paciente humano) tendo um nível detectável de células cancerosas compreendendo a administração de um anticorpo anti-KIR3DL2, uma composição de anticorpo anti-KIR3DL2 ou uma composição relacionada (por exemplo, um ácido nucleico que codifica um anticorpo anti-KIR3DL2, uma composição celular que expressa um fragmento de anticorpo anti-KIR3DL2), em uma quantidade suficiente para reduzir de forma detectável a progressão da malignidade hematológica no hospedeiro.
[079] Em um aspecto exemplar, é fornecido um método de tratamento de TCL em um indivíduo com um mau prognóstico de doença e/ou que recidivou, é resistente ou não responde (é não responsivo) à terapia com um primeiro agente terapêutico.
[080] O PTCL (por exemplo, PTCL-NOS) é normalmente baseado no exame de sangue periférico ou biópsia de tecido para características histológicas complementadas por imuno-histoquímica detalhada, citometria de fluxo, citogenética e genética molecular. O exame pode incluir, por exemplo, hemograma completo e diferencial, testes de função renal e hepática, lactato desidrogenase (LDH), beta2 microglobulina, albumina, cálcio sérico, ácido úrico, biópsia de medula óssea, raio X de tórax e varredura por tomografia computadorizada (CT) do tórax, abdômen e pelve. A progressão é opcionalmente determinada avaliando a expansão clonal seletiva de células iniciadas. Os métodos para detectar cânceres e progressão do câncer podem ser alcançados por qualquer técnica adequada, dos quais vários exemplos são conhecidos no estado da técnica. Exemplos de técnicas adequadas incluem PCR e RT-PCR (por exemplo, de genes associados às células cancerosas ou “marcadores”), biópsia, técnicas de imagem, cariótipo e outras análises cromossômicas, técnicas de detecção de imunoensaio/imunocitoquímica, ensaios histológicos e/ou histopatológicos, cinética celular estudos e análise do ciclo celular, citometria de fluxo e técnicas de exame físico (por exemplo, para sintomas físicos).
[081] Entrega de anticorpos anti-KIR3DL2 a um sujeito (seja por administração direta como um anticorpo isolado ou purificado (por exemplo, um anticorpo em solução), como um fragmento de anticorpo expresso por uma célula CAR, ou por expressão de um ácido nucleico nela, tal como de um vetor de transferência de gene poxviral compreendendo a(s) sequência(s) de ácido nucleico que codifica(m) o anticorpo anti-KIR3DL2) e a prática dos outros métodos aqui descritos podem ser usadas para reduzir, tratar, prevenir ou melhorar qualquer aspecto adequado da progressão do câncer (notavelmente progressão do TCL). Os métodos aqui descritos podem ser particularmente úteis na redução e/ou melhora do crescimento tumoral (por exemplo, porcentagem (células tumorais em comparação com células T saudáveis), número de células tumorais em circulação) e qualquer parâmetro ou sintoma associado a ele (por exemplo, biomarcadores). Métodos que reduzem, previnem ou de outra forma melhoram tais aspectos da progressão do câncer, de forma independente e coletiva, são características vantajosas.
[082] Em um aspecto adicional, é fornecido um método para promover a remissão de um TCL em um hospedeiro mamífero, como um paciente humano, compreendendo a administração de uma composição compreendendo um anticorpo anti-KIR3DL2, ao hospedeiro, de modo a promover a remissão de TCL no hospedeiro.
[083] Ainda em um aspecto adicional, é fornecido um método para reduzir o risco de desenvolver um TCL, reduzindo o tempo para o início de uma condição cancerosa e/ou reduzindo a gravidade de um TCL diagnosticado nos estágios iniciais, compreendendo a administração a um hospedeiro de uma quantidade profilaticamente eficaz de um anticorpo anti-KIR3DL2 ou composição relacionada de modo a atingir o(s) efeito(s) fisiológico(s) desejado(s).
[084] Em um aspecto adicional, é fornecido um método para aumentar a probabilidade de sobrevida ao longo de um período relevante em um paciente humano diagnosticado com TCL. Em outro aspecto, é fornecido um método para melhorar a qualidade de vida de um paciente com TCL, compreendendo a administração ao paciente de uma composição em uma quantidade eficaz para melhorar sua qualidade de vida. Em um aspecto adicional, os métodos descritos no presente documento podem ser aplicados para reduzir significativamente o número de células de TCL em um hospedeiro vertebrado, de modo que, por exemplo, o número total de células de TCL seja reduzido. Em um sentido relacionado, é fornecido um método para matar (por exemplo, causando direta ou indiretamente a morte) células de TCL em um vertebrado, tal como um paciente humano com câncer.
[085] Conforme utilizado na presente invenção, a administração adjuvante ou combinada inclui a administração simultânea dos compostos na mesma ou em diferentes formas de dosagem, ou administração separada dos compostos (por exemplo, administração sequencial). Assim, um anticorpo de ligação ao KIR3DL2 pode ser usado em combinação com um agente de platina e/ou gemcitabina. Por exemplo, um anticorpo anti-KIR3DL2 e um agente de platina e/ou gemcitabina podem ser administrados simultaneamente em uma única formulação. Alternativamente, o anticorpo anti-KIR3DL2 e o agente de platina e/ou gemcitabina podem ser formulados para administração separada e são administrados simultaneamente ou sequencialmente.
[086] Uma dose adequada para administração de gemcitabina é uma dose de 800–1.200 mg/m2, administrado por via intravenosa. A administração de gemcitabina pode ser repetida uma vez a cada 2 semanas.
Alternativamente, a gemcitabina pode ser administrada nos dias 1 e 8 de um ciclo de 3 semanas (que pode ser repetido).
[087] Uma dose adequada para administração de oxaliplatina é uma dose de 75–150 mg/m2 (por exemplo, 75 mg/m2, 100 mg/m2, 130 mg/m2, 75–130 mg/m2), administrada por via intravenosa. A administração de oxaliplatina pode ser repetida a cada 2 semanas, por exemplo, em uma dose de 75–100 mg/m2 (por exemplo, 75 mg/m2, 100 mg/m2). Alternativamente, a oxaliplatina pode ser administrada uma vez a cada três semanas (por exemplo, nos dias 1 e 8 de um ciclo de 3 semanas, onde o ciclo pode ser repetido). Quando a oxaliplatina é administrada uma vez a cada três semanas, o intervalo de dose pode ser opcionalmente maior do que quando ela é administrada 2 semanas, por exemplo, uma dose de 100-150 mg/m2 (por exemplo, 100 mg/m2, 130 mg/m2) para o regime de 3 semanas.
[088] Geralmente, o tratamento compreende pelo menos um ciclo de administração (por exemplo, um período de oito semanas ou menos), em que para cada um dos pelo menos um ciclo, duas, três ou quatro doses do anticorpo anti-KIR3DL2 são administradas e pelo menos dois, três ou quatro doses de um agente de platina (por exemplo, oxaliplatina) e/ou gemcitabina são administrados.
[089] A gemcitabina e a oxaliplatina podem ser administradas no mesmo dia (por exemplo, dia 1), ou a gemcitabina pode, por exemplo, ser administrada no primeiro dia (dia 1), seguida de oxaliplatina no dia seguinte (dia 2).
[090] Os protocolos de tratamento adequados para tratar um humano com um CTL (por exemplo, um PTCL, CTCL, MF ou SS) incluem, por exemplo, a administração ao paciente de uma quantidade eficaz de cada um dentre um anticorpo anti-KIR3DL2 e gemcitabina, em que o tratamento compreende pelo menos um ciclo de administração, em que pelo menos uma dose, opcionalmente pelo menos duas doses, do anticorpo anti-KIR3DL2 é administrada (por exemplo, todas as semanas, a cada duas semanas, a cada quatro semanas), e pelo menos uma dose, opcionalmente menos duas doses, de gemcitabina é administrada, opcionalmente em que a gemcitabina é administrada em uma dose de cerca de 800–1.200 mg/m2, opcionalmente cerca de 800–1.000 mg/m2. Opcionalmente, a gemcitabina é administrada uma vez a cada 2 semanas ou nos dias 1 e 8 de um ciclo repetido de 3 semanas.
Opcionalmente, o protocolo de tratamento é caracterizado como sendo sem tratamento combinado com um agente de platina ou oxaliplatina.
[091] Um protocolo de tratamento exemplar para tratar um ser humano com MF ou SS pode incluir, por exemplo, a administração ao paciente de uma quantidade eficaz de cada um dentre um anticorpo anti-KIR3DL2 e gemcitabina, em que o tratamento compreende pelo menos um ciclo de administração, em que pelo menos uma dose, opcionalmente pelo menos duas doses, do anticorpo anti-KIR3DL2 é administrada (por exemplo, a cada semana, a cada duas semanas, a cada quatro semanas), e pelo menos uma dose, opcionalmente pelo menos duas doses, de gemcitabina é administrada, em que o gemcitabina é administrada a uma dose de cerca de 800–1.200 mg/m2 nas semanas 1, 2 e 3 (por exemplo, por volta dos dias 1, 8 e 15) de um ciclo repetido de 4 semanas. O ciclo de 4 semanas pode ser repetido, por exemplo, por um período de 3, 4, 5, 6 ou mais meses. O protocolo pode ser caracterizado como sendo sem tratamento combinado com um agente de platina ou oxaliplatina.
[092] Outros protocolos de tratamento adequados para tratar um ser humano com um CTL (por exemplo, um PTCL) incluem, por exemplo, a administração ao paciente de uma quantidade eficaz de cada um dentre um anticorpo anti-KIR3DL2 e oxaliplatina, em que o tratamento compreende pelo menos um ciclo de administração no qual pelo menos uma dose, opcionalmente pelo menos duas doses, do anticorpo anti-KIR3DL2 é administrada (por exemplo, todas as semanas, a cada duas semanas, a cada quatro semanas), e pelo menos uma dose, opcionalmente pelo menos duas doses, de oxaliplatina é administrada, opcionalmente, em que a oxaliplatina é administrada a uma dose de cerca de 75–130 mg/m2. Opcionalmente, a oxaliplatina é administrada uma vez a cada 2 semanas ou uma vez a cada 3 semanas.
[093] Outros protocolos de tratamento adequados para tratar um humano com PCTL incluem, por exemplo, a administração ao paciente de uma quantidade eficaz de cada um dentre um anticorpo anti-KIR3DL2, gemcitabina e oxaliplatina, em que o tratamento compreende pelo menos um ciclo de administração compreendendo a administração de: - pelo menos uma dose, opcionalmente pelo menos duas doses, de anticorpo anti-KIR3DL2 (por exemplo, todas as semanas, a cada duas semanas, a cada quatro semanas), - pelo menos uma dose, opcionalmente pelo menos duas doses, de gemcitabina, opcionalmente em que a gemcitabina é administrada em uma dose de cerca de 800–1.000 mg/m2, opcionalmente, em que a gemcitabina é administrada uma vez a cada 2 semanas ou nos dias 1 e 8 de um ciclo repetido de 3 semanas, e - pelo menos uma dose, opcionalmente pelo menos duas doses, de oxaliplatina, opcionalmente em que a oxaliplatina é administrada em uma dose de cerca de 75–130 mg/m2, opcionalmente em que a oxaliplatina é administrada uma vez a cada 2 semanas ou uma vez a cada 3 semanas (por exemplo, ou no dia 1 de um ciclo repetido de 3 semanas). Em um exemplo de realização, a oxaliplatina e a gemcitabina são administradas uma vez a cada duas semanas, opcionalmente no mesmo dia. Em outro exemplo de realização, a oxaliplatina e a gemcitabina são administradas a cada 3 semanas, em que a oxaliplatina é administrada no dia 1 do período de 3 semanas e a gemcitabina é administrada nos dias 1 e 8 do período de 3 semanas.
[094] Será compreendido que um ciclo de administração pode ser um período de tempo adequado consistente com as frequências de administração aqui descritas. Por exemplo, um ciclo de administração pode ser um período de 4 semanas, 8 semanas, mais de 8 semanas, menos de 8 semanas, etc.
[095] Em um exemplo de realização, o anticorpo anti-KIR3DL2 é administrado no mesmo dia que a gemcitabina e/ou oxaliplatina. Em um exemplo de realização, o anticorpo anti-KIR3DL2 é administrado pelo menos um dia (por exemplo, um, dois, três dias) após a administração de gemcitabina.
Em um exemplo de realização, o anticorpo anti-KIR3DL2 é administrado pelo menos um dia (por exemplo, um, dois, três dias) após a administração de oxaliplatina. Em um exemplo de realização, o anticorpo anti-KIR3DL2 é administrado pelo menos um dia (por exemplo, um, dois, três, quatro, cinco, seis ou sete dias) após a administração de gemcitabina e oxaliplatina (por exemplo, pelo menos um dia após o último composto ser administrado).
[096] O anticorpo anti-KIR3DL2 (por exemplo, o anticorpo 2B12 humanizado conhecido como IPH4102 ou lacutamabe) pode ser vantajosamente administrado por infusão intravenosa a uma dose de 1-20 mg/kg de peso corporal, opcionalmente 1-10 mg/kg de peso corporal, ou a uma dose constante de 750 mg. O anticorpo anti-KIR3DL2 pode ser vantajosamente administrado 1-4 vezes por mês, por exemplo, uma vez por semana, uma vez a cada duas semanas ou uma vez a cada quatro semanas. Em um exemplo de realização, o anticorpo anti-KIR3DL2 é administrado de acordo com um regime que compreende uma primeira fase durante a qual o anticorpo anti-KIRDL2 é administrado semanalmente (por exemplo, quatro administrações semanais), seguido por uma segunda fase durante a qual o anticorpo anti-KIRDL2 é administrado pelo menos uma vez por semana, por exemplo, 1-2 vezes por mês, uma vez a cada duas semanas, uma vez por mês. Em um exemplo de realização, o anticorpo anti-KIR3DL2 é administrado de acordo com um regime que compreende uma primeira fase durante a qual o anticorpo anti-KIRDL2 é administrado semanalmente (por exemplo, quatro administrações semanais), seguido por uma segunda fase durante a qual o anticorpo anti-KIRDL2 é administrado uma vez a cada duas semanas (por exemplo, pelo menos 2 administrações sucessivas administradas a cada duas semanas, por exemplo 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 ou mais administrações administradas uma vez a cada duas semanas), seguido por uma terceira fase durante o qual o anticorpo anti-KIRDL2 é administrado uma vez por mês (por exemplo, pelo menos 2 administrações sucessivas administradas uma vez por mês, por exemplo 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 ou mais administrações administradas uma vez por mês.
[097] Quando combinado com gemcitabina e oxaliplatina, um método de tratamento pode, por exemplo, ser especificado como compreendendo pelo menos um ciclo de administração (por exemplo, um período de oito semanas ou menos, opcionalmente oito semanas, opcionalmente quatro semanas), em que para cada um dos pelo menos um ciclo, duas, três ou quatro doses do anticorpo anti-KIR3DL2 são administradas (por exemplo, anticorpo 2B12 humanizado a uma dose de 1-20 ou 1-10 mg/kg de peso corporal, a uma dose fixa de 750 mg) e pelo menos dois, três ou quatro doses de gemcitabina e oxaliplatina são administradas. A gemcitabina e a oxaliplatina podem ser especificadas como sendo administradas no mesmo dia ou em dias consecutivos (por exemplo, oxaliplatina 75–130 mg/m2 administrada no dia seguinte à administração de gemcitabina 800–1.000 mg/m2). O anticorpo de ligação ao KIR3DL2 pode ser especificado como sendo administrado no mesmo dia que a gemcitabina e/ou oxaliplatina, em dias consecutivos antes ou depois da gemcitabina e/ou oxaliplatina, ou vários dias antes ou depois da gemcitabina e/ou oxaliplatina.
[098] Nos métodos de tratamento, o anticorpo de ligação ao KIR3DL2 e os agentes de platina e/ou gemcitabina podem ser administrados separadamente, juntos ou sequencialmente, ou em um coquetel. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo de ligação ao KIR3DL2 é administrado antes da administração do(s) agente(s) de platina e/ou gemcitabina. Por exemplo, o anticorpo de ligação ao KIR3DL2 pode ser administrado aproximadamente de 0 a 30 dias, opcionalmente de 1 a 7 dias, antes da administração de gemcitabina, ou 0 a 30 dias, opcionalmente de 1 a 7 dias, antes da administração do agente de platina. Em alguns exemplos de realização, um anticorpo de ligação ao KIR3DL2 é administrado de cerca de 30 minutos a cerca de 2 semanas, de cerca de 30 minutos a cerca de 1 semana, de cerca de 1 hora a cerca de 2 horas, de cerca de 2 horas a cerca de 4 horas, de cerca de 4 horas a cerca de 6 horas, de cerca de 6 horas a cerca de 8 horas, de cerca de 8 horas a 1 dia, ou de cerca de 1 a 5 dias antes da administração de gemcitabina (ou do agente de platina). Em alguns exemplos de realização, um anticorpo de ligação ao KIR3DL2 é administrado simultaneamente com a administração do agente de platina e/ou gemcitabina.
Em alguns exemplos de realização, o anticorpo de ligação ao KIR3DL2 é administrado após a administração do(s) agente(s) de platina e/ou gemcitabina.
Por exemplo, um anticorpo de ligação ao KIR3DL2 pode ser administrado aproximadamente de 0 a 30 dias, opcionalmente de 1 a 7 dias, após a administração do(s) agente(s) de platina e/ou gemcitabina. Em alguns exemplos de realização, um anticorpo de ligação ao KIR3DL2 é administrado de cerca de 30 minutos a cerca de 2 semanas, de cerca de 30 minutos a cerca de 1 semana, de cerca de 1 hora a cerca de 2 horas, de cerca de 2 horas a cerca de 4 horas, de cerca de 4 horas a cerca de 6 horas, de cerca de 6 horas a cerca de 8 horas, de cerca de 8 horas a 1 dia, ou de cerca de 1 a 5 dias após da administração do(s) agente(s) de platina e/ou gemcitabina.
[099] Em um exemplo de realização, o anticorpo anti-KIR3DL2 e o agente de platina e/ou gemcitabina são administrados nas seguintes doses: (a) 750 mg de anticorpo anti-KIR3DL2 e (i) 75–130 mg/m2 de composto de platina (por exemplo, oxaliplatina) ou (ii) 800–1.200 mg/m2 de gemcitabina; (b) 1-10 mg/kg ou 750 mg de anticorpo anti-KIR3DL2 e 75–130 mg/m2 de oxaliplatina; (c) 1-10 mg/kg ou 750 mg de anticorpo anti-KIR3DL2 e 800–
1.200 mg/m2 de gemcitabina; (d) 1-10 mg/kg ou 750 mg de anticorpo anti-KIR3DL2, 75–100 mg/m2 de oxaliplatina e 800–1.200 mg/m2 de gemcitabina; e (e) 1-10 mg/kg ou 750 mg de anticorpo anti-KIR3DL2, 100-130 mg/m2 de oxaliplatina e 800–1.000 mg/m2 de gemcitabina.
[100] Também são fornecidos kits, por exemplo, kits que incluem: (i) uma composição farmacêutica contendo um anticorpo anti- KIR3DL2 e uma composição farmacêutica contendo gemcitabina; (ii) uma composição farmacêutica contendo um anticorpo anti- KIR3DL2 e uma composição farmacêutica contendo um agente de platina (por exemplo, oxaliplatina); (iii) uma composição farmacêutica contendo um anticorpo anti- KIR3DL2, uma composição farmacêutica contendo um agente de platina (por exemplo, oxaliplatina) e uma composição farmacêutica contendo gemcitabina; (iv) uma primeira composição farmacêutica contendo um anticorpo anti-KIR3DL2 e instruções para administrar o referido anticorpo anti- KIR3DL2 juntamente com um agente de platina (por exemplo, oxaliplatina) e/ou gemcitabina; (v) uma composição farmacêutica contendo um agente de platina (por exemplo, oxaliplatina) e/ou gemcitabina, e instruções para administrar a referida composição juntamente com um anticorpo anti-KIR3DL2; (vi) uma composição farmacêutica contendo um agente de platina (por exemplo, oxaliplatina) e instruções para administrar a referida composição juntamente com um anticorpo anti-KIR3DL2 (e opcionalmente mais gemcitabina); e (vii) uma composição farmacêutica contendo gemcitabina e instruções para administrar a referida composição juntamente com um anticorpo anti-KIR3DL2 (e opcionalmente ainda um agente de platina (por exemplo, oxaliplatina).
[101] Uma composição farmacêutica pode ser opcionalmente especificada como compreendendo um transportador farmaceuticamente aceitável. Um anticorpo anti-KIR3DL2, agente de platina e/ou gemcitabina pode ser opcionalmente especificado como presentes em uma quantidade terapeuticamente eficaz adaptada para uso em qualquer um dos métodos da presente invenção, opcionalmente uma quantidade que aumenta os níveis de KIR3DL2 na superfície das células TCL malignas. Os kits opcionalmente também podem incluir instruções, por exemplo, compreendendo cronogramas de administração, para permitir que um médico (por exemplo, um médico, enfermeiro ou paciente) administre a composição contida nele a um paciente com câncer (por exemplo, um determinado CTCL ou PTCL como divulgado na presente invenção). Em qualquer exemplo de realização, um kit também pode incluir uma seringa.
[102] Opcionalmente, os kits incluem vários pacotes das composições farmacêuticas de dose única, cada um contendo uma quantidade eficaz do anticorpo anti-KIR3DL2 e/ou o agente de platina (por exemplo, oxaliplatina) e/ou gemcitabina, para uma administração única de acordo com os métodos fornecidos acima. Instrumentos ou dispositivos necessários para administração da(s) composição(ões) farmacêutica(s) também podem estar incluídos nos kits. O kit pode, por exemplo, fornecer uma ou mais seringas previamente preenchidas que contêm uma quantidade do anticorpo anti- JIR3DL2 e agente de platina ou gemcitabina.
[103] Em um exemplo de realização, a presente invenção fornece um kit para o tratamento de um TCL em um paciente humano, em que o kit compreende: (a) uma dose de um anticorpo anti-KIR3DL2 compreendendo os domínios H-CDR1, H-CDR2 e H-CDR3 de uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência estabelecida em qualquer uma das SEQ ID NOs: 32 ou 48-51, e os domínios L-CDR1, L-CDR2 e L-CDR3 de uma região variável de cadeia leve tendo a sequência apresentada nas SEQ ID NOs: 33 ou 43-47; e/ou (b) uma dose de um agente de platina (por exemplo, oxaliplatina) e/ou uma dose de gemcitabina; e (c) opcionalmente, instruções para usar o referido anticorpo anti- KIR3DL2 e/ou o referido agente de platina (por exemplo, oxaliplatina) e/ou gemcitabina em qualquer um dos métodos descritos na presente invenção.
[104] Em um exemplo de realização, um tratamento compreende a administração de um anticorpo anti-KIR3DL2, um agente de platina (por exemplo, oxaliplatina) e gemcitabina, sem administração de qualquer(quaisquer) outro(s) agente(s) anticâncer.
[105] Será compreendido que um método de tratamento da presente divulgação pode ou não envolver uma etapa de caracterização de células tumorais para a expressão de KIR3DL2 antes do tratamento. Em qualquer exemplo de realização, a expressão de KIR3DL2 pode ser determinada por imuno-histoquímica.
[106] Em um exemplo de realização, os métodos compreendem: (a) determinar se um indivíduo tem um TCL, opcionalmente um PTCL; e (b) se o indivíduo tem TCL, opcionalmente PTCL, determinar se o indivíduo tem células TCL que expressam um polipeptídeo KIR3DL2. A determinação de que o indivíduo tem células TCL que expressam um polipeptídeo KIR3DL2 indica que o indivíduo pode ser tratado com um método de tratamento da presente divulgação. Opcionalmente, o método compreende uma etapa de administração de um tratamento da presente divulgação ao indivíduo.
[107] Em um exemplo de realização, o polipeptídeo KIR3DL2 é expresso em um número substancial de células tumorais (por exemplo, células TCL) retiradas de um determinado paciente. Por exemplo, KIR3DL2 pode estar presente em, pelo menos, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou mais das células TCL retiradas de um paciente.
[108] Um método pode opcionalmente compreender ainda uma etapa de avaliação do nível de desenvolvimento de um TCL (estadiamento da doença), permitindo a avaliação da proporção (por exemplo, porcentagem) de células TCL malignas presentes dentro de um determinado compartimento corporal de um paciente. De acordo com este método, as células de uma amostra biológica coletada do referido compartimento corporal são colocadas em contato com um anticorpo anti-KIR3DL2 e as células tumorais (por exemplo, a proporção de células) que expressam um polipeptídeo KIR3DL2 em suas superfícies são medidas. As células podem ser, por exemplo, células CD4+ ou células CD4- CD8+. Uma descoberta de que as células tumorais expressam, ou expressam predominantemente, KIR3DL2 indica que o TCL é um TCL agressivo ou avançado (por exemplo, estádio IV, ou mais geralmente além do estádio II). Tal TCL pode ser tratado com vantagem usando os métodos de tratamento da divulgação.
[109] Em qualquer exemplo de realização, um método pode compreender uma etapa de diagnóstico de TCL, compreendendo colocar células de uma amostra biológica de um indivíduo em contato com um anticorpo anti-KIR3DL2 e a proporção (por exemplo, porcentagem) de células T que expressam um polipeptídeo KIR3DL2 em suas superfícies é medida, e tal proporção é comparada com a proporção média (por exemplo, porcentagem) de células T que expressam um polipeptídeo KIR3DL2 em suas superfícies observada em humanos sem TCL (por exemplo, em humanos saudáveis), em que um diagnóstico TCL–positivo é feito quando a referida proporção medida é significativamente maior do que a referida proporção média.
[110] Em outro exemplo de realização, os métodos compreendem uma etapa de determinação do nível de expressão de um ácido nucleico KIR3DL2 ou polipeptídeo em uma amostra biológica de um indivíduo que recebeu uma administração de um agente de platina ou gemcitabina, por exemplo, em células tumorais encontradas em uma amostra biológica.
[111] Em outro exemplo de realização, os métodos compreendem uma etapa para determinar se um agente anticâncer (por exemplo, um agente de platina ou gemcitabina) aumenta o nível de expressão de um ácido nucleico ou polipeptídeo KIR3DL2 em uma amostra biológica de um indivíduo, por exemplo, em células tumorais encontradas em uma amostra biológica.
[112] A determinação do nível de expressão de um ácido nucleico ou polipeptídeo KIR3DL2 em uma amostra biológica pode compreender a comparação do nível com um nível de referência (por exemplo, um valor, coloração de superfície celular fraca, etc.) correspondente a um indivíduo saudável ou indivíduo antes do tratamento com o agente anticâncer (por exemplo, agente do tratamento com platina ou gemcitabina). A determinação de que uma amostra biológica expressa um ácido nucleico ou polipeptídeo KIR3DL2 em um nível que é aumentado em comparação com o nível de referência indica que o indivíduo tem um TCL que pode se beneficiar pelo tratamento com um anticorpo anti-KIR3DL2 ou, opcionalmente, que o indivíduo tem um TCL que pode se beneficiar pelo tratamento com um anticorpo anti-KIR3DL2 em combinação com o agente anticâncer (por exemplo, um agente de platina e/ou gemcitabina, respectivamente). Opcionalmente, a detecção de um polipeptídeo KIR3DL2 em uma amostra biológica compreende a detecção do polipeptídeo KIR3DL2 expresso na superfície de um linfócito maligno.
PRODUÇÃO DE ANTICORPOS
[113] O KIR3DL2 (CD158k) é um homodímero ligado por dissulfeto, com três moléculas de domínio Ig de cerca de 140 kD, descrito por Pende et al. (1996) J. Exp. Med. 184: 505-518, cuja divulgação é incorporada ao presente por referência. Diversas variantes alélicas foram relatadas para os polipeptídeos KIR3DL2, cada uma destas estando englobada pelo termo KIR3DL2. A sequência de aminoácidos do KIR3DL2 humano maduro (alelo *002) é mostrada na SEQ ID NO: 1, que corresponde ao Genbank com nº. de acesso AAB52520 na qual a sequência líder de 21 resíduos de aminoácidos foi omitida:
LMGGQDKPF LSARPSTVVP RGGHVALQCH YRRGFNNFML YKEDRSHVPI FHGRIFQESF IMGPVTPAHA GTYRCRGSRP HSLTGWSAPS NPLVIMVTGN HRKPSLLAHP GPLLKSGETV ILQCWSDVMF EHFFLHRDGI SEDPSRLVGQ IHDGVSKANF SIGPLMPVLA GTYRCYGSVP HSPYQLSAPS DPLDIVITGL YEKPSLSAQP GPTVQAGENV TLSCSSWSSY DIYHLSREGE AHERRLRAVP KVNRTFQADF PLGPATHGGT YRCFGSFRAL PCVWSNSSDP LLVSVTGNPS SSWPSPTEPS SKSGICRHLH VLIGTSVVIF LFILLLFFLL YRWCSNKKNA AVMDQEPAGD RTVNRQDSDE QDPQEVTYAQ
LDHCVFIQRK ISRPSQRPKT PLTDTSVYTE LPNAEPRSKV VSCPRAPQSG LEGVF (SEQ ID NO: 1).
[114] O DNAc de KIR3DL2 (alelo *002) é mostrado no nº de acesso Genbank U30272. A sequência de aminoácidos de um KIR3DL2 humano alelo *003 é mostrada abaixo, correspondendo ao número de acesso do Genbank: AAB36593:
MSLTVVSMAC VGFFLLQGAW PLMGGQDKPF LSARPSTVVP RGGHVALQCH YRRGFNNFML YKEDRSHVPI FHGRIFQESF IMGPVTPAHA GTYRCRGSRP HSLTGWSAPS NPVVIMVTGN HRKPSLLAHP GPLLKSGETV ILQCWSDVMF EHFFLHREGI SEDPSRLVGQ IHDGVSKANF SIGPLMPVLA GTYRCYGSVP HSPYQLSAPS DPLDIVITGL YEKPSLSAQP GPTVQAGENV TLSCSSWSSY DIYHLSREGE AHERRLRAVP KVNRTFQADF PLGPATHGGT YRCFGSFRAL PCVWSNSSDP LLVSVTGNPS SSWPSPTEPS SKSGICRHLH VLIGTSVVIF LFILLLFFLL YRWCSNKKNA AVMDQEPAGD RTVNRQDSDE
QDPQEVTYAQ LDHCVFIQRK ISRPSQRPKT PLTDTSVYTE LPNAEPRSKV VSCPRAPQSG LEGVF (SEQ ID NO: 2).
[115] Também estão abrangidas quaisquer sequências de ácido nucleico ou proteína que compartilham uma ou mais propriedades ou funções biológicas com KIR3DL2 tipo selvagem de comprimento total, respectivamente, e compartilham pelo menos 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidade de sequência de nucleotídeo ou aminoácido ou mais.
[116] O KIR3DL1 (CD158e1) intimamente relacionado é uma molécula monomérica de cerca de 70 kD, descrita em Colonna e Samaridis (1995) Science 268 (5209), 405-408. O cDNA que codifica um polipeptídeo KIR3DL1 (CD158e2) (alelo *00101) é mostrado no número de acesso Genbank: L41269; a sequência de aminoácidos codificada é mostrada no número de acesso Genbank: AAA69870. Em um exemplo de realização, um polipeptídeo KIR3DL1 aqui referido é o alelo *00101.
[117] Exemplos de anticorpos que se ligam ao KIR3DL2 humano incluem os anticorpos 19H12, 12B11, 10F6, 2B12, 9E10, 10G5, 13H1, 5H1, 1E2, 1C3 ou 20E9. Estes e outros anticorpos são fornecidos nas publicações PCT/EP2013/069302 e PCT/EP2013/069293, ambas depositadas em 17 de setembro de 2013, cujas divulgações são incorporadas ao presente por referência. Esses anticorpos ligam-se seletivamente ao KIR3DL2 e não se ligam ao KIR3DL1 (ou KIR3DS1). Embora o anticorpo 10F6, 2B12, 9E10, 10G5, 13H1, 5H1, 1E2, 1C3 ou 20E9 possa ser usado, por exemplo, como agente terapêutico administrado a um indivíduo para a depleção de um alvo que expressa KIR3DL2, por exemplo, por indução de ADCC em direção a uma célula que expressa KIR3DL2 patogênica, o anticorpo 12B11 e 19H12 será vantajoso para uso na detecção (por exemplo, ensaios in vitro) da expressão de KIR3DL2 na superfície das células, pois 12B11 e 19H12 são particularmente eficientes na detecção de células positivas para KIR3DL2 em ensaios de detecção, 12B11 é vantajoso para ensaios de imuno-histoquímica usando cortes de tecido congelados, enquanto 19H12 é vantajoso para detecção por citometria de fluxo.
[118] Cada um dos anticorpos 2B12, 10G5, 19H12 e 12B11 também é adequado para uso como agente terapêutico administrado a um indivíduo para a eliminação de células alvo que expressam KIR3DL2. 19H12 e 12B11, bem como outros anticorpos divulgados no PCT/EP2013/069293 são capazes de ser internalizados em células via KIR3DL2 e podem ser usados vantajosamente como um anticorpo de depleção configurado como um conjugado anticorpo-fármaco, por exemplo, quando o anticorpo é conjugado a uma porção tóxica. 2B12 e outros anticorpos descritos no PCT/EP2013/069302 não induzem qualquer internalização KIR3DL2 em células tumorais, proporcionando assim o uso vantajoso quando a atividade mediada por célula efetora é buscada, por exemplo, para anticorpos de depleção que induzem a ADCC.
[119] A sequência de aminoácidos das regiões variáveis de cadeia pesada e leve dos anticorpos 10F6, 9E10, 10G5, 13H1, 1E2, 1C3 ou 20E9 estão listadas na Tabela A.
TABELA A Anticorpo SEQ ID NO Sequência de aminoácidos 10F6 VH 27 QIQLVQSGPELKKPGETVRISCKASGYTFTIAGMQWVQKMPGKGLK
WIGWINTHSGVPKYAEDFKGRFAFSLETSANIAYLQISNLKNEDTATY
FCARGGDEGVMDYWGQGTSVTVS 10F6 VL 28 DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITCKASQDVSTAVAWYHQKPGQSPKLL
IYWASTRHTGVPDRFSGSGSGTDYTLTISALQAEDLALYYCQQHYNT
PWTFGGGTKLEIK 9E10 VH 29 QVQLQQSAAELARPGASVKMSCKASGYTFTSYTMHWVKQRPGQGL
EWIGYINPSSGYTDYNQKFKDKTTLTADRSSSTAYMQLSSLTSEDSA
VYYCARLGKGLLPPFDYWGQGSTLTVSS 9E10 VL 30 EIVLTQSIPSLTVSAGERVTISCKSNQNLLWSGNQRYCLVWHQWKPG
QTPTPLITWTSDRYSGVPDRFIGSGSVTDFTLTISSVQAEDVAVYFCQ
QHLHIPYTFGGGTKLEIK 13H1 VH 31 EVQLQQSGPELVKPGASMKISCKASHYSFIGYTMNWVKQRHGKNLE
WIGLINPYNGDTTYNQKFKGKASLTVDKSSSTAYMEILSLTSEDSAVY YCARENWGYPYAMDYWGQGTSVTVS
Anticorpo SEQ ID NO Sequência de aminoácidos 13H1 VL 62 DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDNFGISFMNWFQQKPGQP
PKLLIYAASNQGSGVPARFSGSRSGTDFSLNIHPMEEDDTAMYFCQQ
SKEVPYTFGGGTKLEIK 1E2 VH 63 QVQLQQSGAELVRPGVSVKISCKGSGYTFTDYAMNWVKQSHAKSLE
WIGVISTYYGDANYNQKFKGKATMTVDKSSSTAYMELARLTSEDSAIY
YCALIYYDYDGSYWGQGTTLTVS 1E2 VL 64 DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPG
QSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCS
QSTHVPPYTFGGGTKLEIK 1C3 VH 65 QVQLQQSGAELARPGASVKLSCKASGYTFTSYWMQWVKQRPGQGL
EWIGAIYPGDGDTRYTQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLASEDSA
VYYCARRYDGYYHFDYWGQGTTLTVS 1C3 VL 66 DIVMTQSPSSLAVTAGEKVTMSCKSSQSLLWSVNQKNYLSWYQQKQ
RQPPKLLIYGASIRESWVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVHAEDLAVYYC
QHNHGSFLPLTFGSGTKLEIK 20E9 VH 67 QVQLQQSGAEVARPGASVKLSCKSSGFTFTTYWMQWVKQRPGQGL
EWIGAIYPGDGDTRYTQKFKGKATLTADKSSITAYMQLSSLASEDSAV
YYCARRGDYGNYGMDYWGQGTSVTVSS 20E9 VL 68 DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQ
SPKLLIYKVSNHFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQ
GSHVPPTFGGGTKLEIK 10G5 VH 69 QVQLQQSAAELARPGASVKMSCKASGYTFTSYTMHWVKQRPGQGL
EW IGYINPSSGYTENNRKFKDKTTLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYY
CARLGKGLLPPFDYWGQGTTLTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQT 10G5 VL 70 DIQMTQSPASLSVSVGETVTITCRASENIYSNLAWYQQKQGKSPQLL
VYAATNLADGVPSRFSGSGSGTQYSLKINSLQSEDFGSYYCQHFWG TPYTFGGGTKLEIK
[120] Em um exemplo de realização específico, é fornecido um anticorpo que se liga essencialmente ao mesmo epítopo ou determinante que qualquer um dos anticorpos monoclonais AZ158, 19B12, 10G5, 12B11, 10G5 ou 2B12; opcionalmente, o anticorpo compreende uma região de ligação ao antígeno do anticorpo AZ158, 10G5, 19B12, 12B11 ou 2B12. Em qualquer um dos exemplos de realização da presente invenção, o anticorpo AZ158, 19B12, 12B11, 10G5 ou 2B12 pode ser caracterizado por sua sequência de aminoácidos e/ou sequência de ácidos nucleicos que o codifica. Em um exemplo de realização, o anticorpo monoclonal compreende a porção Fab ou F (ab')2 de AZ158, 19B12, 12B11, 10G5 ou 2B12. Também é fornecido um anticorpo monoclonal que compreende a região variável de cadeia pesada de AZ158, 19B12, 12B11, 10G5 ou 2B12. De acordo com um exemplo de realização, o anticorpo monoclonal compreende as três CDRs da região variável de cadeia pesada de AZ158, 19B12, 12B11, 10G5 ou 2B12. Também é fornecido um anticorpo monoclonal que compreende ainda a região variável de cadeia leve variável de AZ158, 19B12, 12B11, 10G5 ou 2B12 ou uma, duas ou três das CDRs da região variável de cadeia leve de AZ158, 19B12, 12B11, 10G5 ou 2B12. Opcionalmente, qualquer uma ou mais dessas CDRs de cadeia leve ou pesada pode conter uma, duas, três, quatro ou cinco ou mais modificações de aminoácidos (por exemplo, substituições, inserções ou deleções). Opcionalmente, é fornecido um anticorpo onde qualquer uma das regiões variáveis da cadeia leve e/ou pesada compreendendo parte ou a totalidade de uma região de ligação ao antígeno do anticorpo AZ158, 19B12, 12B11, 10G5 ou 2B12 é fundida a uma região constante de imunoglobulina do tipo IgG humana, opcionalmente uma região constante humana, opcionalmente um isotipo IgG1 ou IgG3 humano.
[121] Um anticorpo de ligação KIR3DL2 (ou fragmento de anticorpo) para uso no tratamento de TCL pode, por exemplo, estar na forma de uma composição de proteína isolada e/ou purificada, ou pode estar presente ou ligado à superfície de uma célula (por exemplo, uma célula CAR efetora, tal como uma célula T, célula NK ou célula NKT), ou ainda na forma de um ácido nucleico que codifica o anticorpo, tal como a partir de um vírus varíola ou outro vetor de transferência de gene viral compreendendo a sequência de ácido nucleico que codifica o anticorpo anti-KIR3DL2. Uma célula que expressa um receptor de antígeno quimérico (CAR) pode ser construída. CARs exemplares são projetados para compreender um anticorpo extracelular de cadeia única (scFv) fundido ao domínio de sinalização intracelular da cadeia zeta do complexo receptor de antígeno de células T e têm a capacidade, quando expressos em células efetoras, como células T, células NKT ou células NK, para redirecionar o reconhecimento do antígeno (ou seja, reconhecimento
KIR3DL2) com base na especificidade do anticorpo monoclonal. Em um aspecto, são fornecidas células imunes geneticamente modificadas que expressam e carregam na membrana da superfície celular um receptor imune quimérico específico de KIR3DL2 compreendendo um domínio de sinalização intracelular, um domínio transmembranar (TM) e um domínio extracelular específico de KIR3DL2 (por exemplo, um domínio derivado de regiões variáveis de cadeia pesada e leve de um anticorpo monoclonal que se liga especificamente ao KIR3DL2, por exemplo, um dos anticorpos aqui divulgados). Também são fornecidos os receptores imunes quiméricos específicos para KIR3DL2, construções de DNA que codificam os receptores e vetores de expressão plasmidiais contendo as construções na orientação adequada para expressão.
[122] Em um exemplo de realização, o anticorpo de ligação ao KIR3DL2 compreende um anticorpo ou fragmento de anticorpo que direciona ADCC e opcionalmente ainda ADCP em direção a uma célula que expressa KIR3DL2.
[123] Em um exemplo de realização, o anticorpo usado em qualquer exemplo de realização da presente invenção liga-se a um polipeptídeo KIR3DL2, opcionalmente em que o anticorpo não se liga substancialmente a um polipeptídeo KIR3DL1, é caracterizado pela afinidade de ligação (KD) para um polipeptídeo KIR3DL2 humano inferior a (melhor que) 100 ng/mL, opcionalmente entre 1 e 100 ng/mL.
[124] O anticorpo é opcionalmente caracterizado por um EC50 em um ensaio de liberação 51Cr para lise de células tumorais HuT78 por PBMCs de voluntários saudáveis, de menos de 100 ng/mL, opcionalmente entre 1 e 100 ng/mL, opcionalmente entre 1 e 50 ng/mL, opcionalmente entre 25 e 75 ng/mL, opcionalmente cerca de 50 ng/mL. O anticorpo é opcionalmente caracterizado por um EC50 em um ensaio de liberação 51Cr para lise de células tumorais
HuT78 por PBMCs de voluntários saudáveis comparável à de um anticorpo anti-KIR3DL2 divulgado na presente invenção (por exemplo, com um valor EC50 que é inferior ou dentro de 1-log ou 0,5 log do EC50 de um anticorpo 2B12 divulgado no presente documento que possui uma VH de SEQ ID NO 49: e uma VL de SEQ ID NOs: 44 ou 45, compreendendo um domínio Fc tipo selvagem ou do isotipo IgG1 humano modificado, e que medeia a ADCC.
ANTICORPO AZ158
[125] AZ158 liga-se a polipeptídeos KIR3DL2 humanos, bem como polipeptídeos KIR3DL1 humanos (vide a publicação PCT WO2010/081890). A VH do AZ158 é mostrada abaixo, com as CDRs 1, 2 e 3 sublinhadas, respectivamente:
QVQLKESGPG LVAPSQSLSI TCTVSGFSLT SFGVHWVRQP PGKGLEWLGV IWAGGSTNYN SALMSRLSIS KDNSKSQVFL KMNSLQNDDT
AMYYCARGNS NHYVSSFYYF DYWGQGTTLT VSS (SEQ ID NO: 3).
[126] A VL do AZ158 é mostrada abaixo com as CDRs 1, 2 e 3 sublinhadas, respectivamente:
DIQMTQSPSS LSASLGGKVT ITCKASQDIN KYIAWYQHKP GKGPRLLIHY TSTLQPGIPS RFSGSGSGRD YSFSISNLEP EDITTYYCLQ
YDNLWTFGGG TKLEIK (SEQ ID NO: 4).
[127] Os anticorpos anti-KIR3DL2 podem incluir anticorpos com região variável ou sequências de CDR de tais anticorpos AZ158 (por exemplo, uma região variável de cadeia pesada e/ou leve fundida a uma região constante humana; uma região variável de cadeia pesada fundida a uma região constante de cadeia pesada de IgG1 humana); alternativamente, os anticorpos anti-KIR3DL2 podem ser um anticorpo diferente dos anticorpos com região variável ou sequências CDR de um anticorpo AZ158.
ANTICORPO 19H12
[128] A sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada do anticorpo 19H12 está listada abaixo:
QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNFGMNWVKQAPGK GLKWMGWINTYTGEPTYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDMATYF
CARNGNFGYYFDYWGQGTTLTVSS (SEQ ID NO: 5).
[129] A sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve do anticorpo 19H12 está listada abaixo:
DVLMTQTPLSLPVSLGDQASFSCRSSQNIVHSNGNTYLEWYLQ KPGQSPSLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKITRVEAEDLGVYYCFQG
SHVPFTFGSGTKLEIK (SEQ ID NO: 6).
[130] Em um aspecto, é fornecido um polipeptídeo purificado que codifica um anticorpo, em que o anticorpo compreende: uma região HCDR1 compreendendo uma sequência de aminoácidos GYTFTNFGMN conforme estabelecida na SEQ ID NO: 9, ou uma sequência de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos contíguos da mesma (por exemplo, NFGMN (SEQ ID NO: 7), GYTFTN (SEQ ID NO: 8)), uma região HCDR1 compreendendo uma sequência de aminoácidos GYTFTNFGMN conforme estabelecida na SEQ ID NO: 9, ou uma sequência de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos contíguos da mesma (e.g., NFGMN (SEQ ID NO: 7), GYTFTN (SEQ ID NO: 8)), em que um ou mais desses aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido diferente; uma região HCDR2 compreendendo uma sequência de aminoácidos WINTYTGEPTYADDF conforme estabelecida na SEQ ID NO: 10, ou uma sequência de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos contíguos da mesma (por exemplo, WINTYTGE (SEQ ID NO: 11)), em que um ou mais desses aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido diferente; uma região HCDR3 compreendendo uma sequência de aminoácidos NGNFGYYFDY conforme estabelecida na SEQ ID NO: 12, ou uma sequência de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos contíguos da mesma, em que um ou mais desses aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido diferente; uma região LCDR1 compreendendo uma sequência de aminoácidos RSSQNIVHSNGNTYLE conforme estabelecida na SEQ ID NO: 13, ou uma sequência de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos contíguos da mesma, em que um ou mais desses aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido diferente; uma região LCDR2 compreendendo uma sequência de aminoácidos KVSNRFS conforme estabelecida na SEQ ID NO: 14, ou uma sequência de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos contíguos da mesma, em que um ou mais desses aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido diferente; e/ou uma região LCDR3 compreendendo uma sequência de aminoácidos FQGSHVPFT conforme estabelecida na SEQ ID NO: 15, ou uma sequência de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos contíguos da mesma, em que um ou mais desses aminoácidos podem ser deletados ou substituídos por um aminoácido diferente, ou em que a sequência pode compreender uma inserção de um ou mais aminoácidos.
[131] Em outro aspecto, é fornecido um anticorpo que se liga ao KIR3DL2 humano, compreendendo: (a) a região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO:5, em que um, dois, três ou mais resíduos de aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido diferente; e/ou (b) a região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 6, em que um, dois, três ou mais resíduos de aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido diferente; e/ou (c) a região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 5, em que um, dois, três ou mais resíduos de aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido diferente; e a região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 6, em que um ou mais desses aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido diferente; e/ou
(d) a sequência de aminoácidos da a CDR 1, 2 e 3 de cadeia pesada (HCDR1, HCDR2, HCDR3) como mostrada nas SEQ ID NOs: 7-9, 10-
11 e 12, respectivamente, em que um, dois, três ou mais resíduos de aminoácidos de qualquer CDR pode ser substituído por um aminoácido diferente; e/ou
(e) a sequência de aminoácidos da CDR 1, 2 e 3 de cadeia leve
(LCDR1, LCDR2, LCDR3) como mostrada nas SEQ ID NOs: 13, 14 ou 15,
respectivamente, em que um, dois, três ou mais resíduos de aminoácidos de qualquer CDR pode ser substituído por um aminoácido diferente; e/ou
(f) a sequência de aminoácidos da a CDR 1, 2 e 3 de cadeia pesada (HCDR1, HCDR2, HCDR3) como mostrada nas SEQ ID NOs: 7, 8 ou 9,
10 ou 11 e 12, respectivamente, em que um, dois, três ou mais resíduos de aminoácidos de qualquer CDR pode ser substituído por um aminoácido diferente; e a sequência de aminoácidos da CDR 1, 2 e 3 de cadeia leve
(LCDR1, LCDR2, LCDR3) como mostrada nas SEQ ID NOs: 13, 14 ou 15, em que um, dois, três ou mais resíduos de aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido diferente; e/ou
(g) a região variável de cadeia pesada que é pelo menos 60%,
70%, 80%, 85%, 90% ou 95% idêntica à região variável que possui uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, em que um, dois, três ou mais resíduos de aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido diferente;
e/ou
(h) a região variável de cadeia leve que é pelo menos 60%, 70%, 80%, 85%, 90% ou 95% idêntica à região variável que possui uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, em que um, dois, três ou mais resíduos de aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido diferente.
ANTICORPO 12B11
[132] A sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada do anticorpo 12B11 está listada abaixo:
QLVQSGPELKNPGETVKISCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGL KWMGWINTYTGEPTYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFCAH
GPWLAYWGQGTLVTVS (SEQ ID NO: 16).
[133] A sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve do anticorpo 12B11 está listada abaixo:
DIKMTQSPSSMYASLGERVTITCKASQDINVYLSWFQQKPGKSP KTLIYRAIRLVDGVPSRFSGSGSGQDYSLTISSLDYEDMGIYYCLQYDELPYTF
GGGTKLEIE (SEQ ID NO: 17).
[134] Em um aspecto, é fornecido um polipeptídeo purificado que codifica um anticorpo, em que o anticorpo compreende: uma região HCDR1 compreendendo uma sequência de aminoácidos GYTFTNYGMN conforme estabelecida na SEQ ID NO: 20, ou uma sequência de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos contíguos da mesma (por exemplo, NYGMN (SEQ ID NO: 18), GYTFTN (SEQ ID NO: 19)), em que um ou mais desses aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido diferente; uma região HCDR2 compreendendo uma sequência de aminoácidos WINTYTGEPTYADDFKG conforme estabelecida na SEQ ID NO: 21, ou uma sequência de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos contíguos da mesma (por exemplo, WINTYTGEPT (SEQ ID NO: 22)), em que um ou mais desses aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido diferente; uma região HCDR3 compreendendo uma sequência de aminoácidos GPWLAY conforme estabelecida na SEQ ID NO: 23, ou uma sequência de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8,
9 ou 10 aminoácidos contíguos da mesma, em que um ou mais desses aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido diferente; uma região LCDR1 compreendendo uma sequência de aminoácidos KASQDINVYLS conforme estabelecida na SEQ ID NO: 24, ou uma sequência de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos contíguos da mesma, em que um ou mais desses aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido diferente; uma região LCDR2 compreendendo uma sequência de aminoácidos RAIRLVD conforme estabelecida na SEQ ID NO: 25, ou uma sequência de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos contíguos da mesma, em que um ou mais desses aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido diferente; uma região LCDR3 compreendendo uma sequência de aminoácidos LQYDELPYT conforme estabelecida na SEQ ID NO: 26, ou uma sequência de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos contíguos da mesma, em que um ou mais desses aminoácidos podem ser deletados ou substituídos por um aminoácido diferente.
[135] Em outro aspecto, é fornecido um anticorpo que se liga ao KIR3DL2 humano, compreendendo: (a) a região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO:16, em que um, dois, três ou mais resíduos de aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido diferente; e/ou (b) a região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 17, em que um, dois, três ou mais resíduos de aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido diferente; e/ou (c) a região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 16, em que um ou mais resíduos de aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido diferente; e a região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 17, em que um, dois, três ou mais desses aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido diferente; e/ou
(d) a sequência de aminoácidos da CDR 1, 2 e 3 de cadeia pesada (HCDR1, HCDR2, HCDR3) como mostrada na SEQ ID NO: 18, 19 ou 20, 21 ou 22 e 23, respectivamente, em que um, dois, três ou mais resíduos de aminoácidos de qualquer CDR podem ser substituídos por um aminoácido diferente; e/ou (e) a sequência de aminoácidos da CDR 1, 2 e 3 de cadeia leve (LCDR1, LCDR2, LCDR3) como mostrada na SEQ ID NO: 24, 25 e 26, em que um, dois, três ou mais resíduos de aminoácidos de qualquer CDR podem ser substituídos por um aminoácido diferente; e/ou (f) a sequência de aminoácidos da CDR 1, 2 e 3 de cadeia pesada (HCDR1, HCDR2, HCDR3) como mostrada na SEQ ID NO: 18, 19 ou 20, 21 ou 22 e 23, respectivamente, em que um ou mais resíduos de aminoácidos de qualquer CDR podem ser substituídos por um aminoácido diferente; e as sequências de aminoácidos das CDRs 1, 2 e 3 de cadeia leve (LCDR1, LCDR2, LCDR3) como mostradas nas SEQ ID NOs: 24, 25 e 26, onde um, dois, três ou mais resíduos de aminoácidos de qualquer CDR podem ser substituídos por um aminoácido diferente; e/ou (g) a região variável de cadeia pesada que é pelo menos 60%, 70%, 80%, 85%, 90% ou 95% idêntica à região variável que possui uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16, em que um, dois, três ou mais resíduos de aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido diferente; e/ou (h) a região variável de cadeia leve que é pelo menos 60%, 70%, 80%, 85%, 90% ou 95% idêntica à região variável que possui uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17, em que um, dois, três ou mais resíduos de aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido diferente. ANTICORPO 2B12
[136] A sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada do anticorpo 2B12 está listada abaixo (CDRs de acordo com Kabat sublinhadas):
QIQLVQSGPELKKPGETVRISCKASGYTFTTA GMQWVQKTPGKGLKWIGWINSHSGVPKYAEDFKGRF AFSLETSASTAYLQISTLKNEDTATYFCARGGDEGVM
DYWGQGTSVTVS (SEQ ID NO: 32).
[137] A sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve do anticorpo 2B12 está listada abaixo (CDRs de acordo com Kabat sublinhadas):
DIVMTQSHKFMSTSLGDRVSFTCKASQDVST AVAWYQQKPGQSPKLLIYWTSTRHTGVPDRFTGSGS GTDYTLTISSVQAEDLALYYCQQHYSTPWTFGGGTKL
EIK (SEQ ID NO: 33).
[138] Em um aspecto, é fornecido um polipeptídeo purificado que codifica um anticorpo, em que o anticorpo compreende: uma região HCDR1 compreendendo uma sequência de aminoácidos GYTFTTAGMQ conforme estabelecida na SEQ ID NO: 36, ou uma sequência de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos contíguos da mesma (por exemplo, GYTFTT (SEQ ID NO: 34), TAGMQ (SEQ ID NO: 35)), em que um ou mais desses aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido diferente; uma região HCDR2 compreendendo uma sequência de aminoácidos WINSHSGVPKYAEDFKG conforme estabelecida na SEQ ID NO: 37, ou uma sequência de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos contíguos da mesma (por exemplo, WINSHSGVP (SEQ ID NO: 38)), em que um ou mais desses aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido diferente; uma região HCDR3 compreendendo uma sequência de aminoácidos GGDEGVMDY conforme estabelecida na SEQ ID NO: 39 (opcionalmente compreendendo ainda um resíduo triptofano), ou uma sequência de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos contíguos da mesma, em que um ou mais desses aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido diferente; uma região LCDR1 compreendendo uma sequência de aminoácidos KASQDVSTAVA conforme estabelecida na SEQ ID NO: 40, ou uma sequência de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos contíguos da mesma, em que um ou mais desses aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido diferente; uma região LCDR2 compreendendo uma sequência de aminoácidos WTSTRHT conforme estabelecida na SEQ ID NO: 41, ou uma sequência de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos contíguos da mesma, em que um ou mais desses aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido diferente; uma região LCDR3 compreendendo uma sequência de aminoácidos QQHYSTPWT conforme estabelecida na SEQ ID NO: 42, ou uma sequência de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos contíguos da mesma, em que um ou mais desses aminoácidos podem ser deletados ou substituídos por um aminoácido diferente.
[139] Em outro aspecto, é fornecido um anticorpo que se liga ao KIR3DL2 humano, compreendendo: (a) a sequência de aminoácidos da CDR 1, 2 e 3 de cadeia pesada (HCDR1, HCDR2, HCDR3) como mostrada na SEQ ID NO: 34, 35 ou 36 (HCDR1), 37 ou 38 (HCDR2) e 39 (HCDR3), respectivamente, em que um, dois, três ou mais resíduos de aminoácidos de qualquer CDR podem ser substituídos por um aminoácido diferente; e/ou (b) as sequências de aminoácidos das CDRs 1, 2 e 3 de cadeia leve (LCDR1, LCDR2, LCDR3) como mostradas nas SEQ ID NOs: 40, 41 e 42, em que um, dois, três ou mais resíduos de aminoácidos de qualquer CDR podem ser substituídos por um aminoácido diferente; e/ou
(c) as sequências de aminoácidos das CDRs 1, 2 e 3 de cadeia pesada (HCDR1, HCDR2, HCDR3) como mostradas nas SEQ ID NOs: 34, 35 ou 36 (HCDR1), 37 ou 38 (HCDR2) e 39 (HCDR3), respectivamente, em que um ou mais resíduos de aminoácidos de qualquer CDR podem ser substituídos por um aminoácido diferente; e as sequências de aminoácidos das CDRs 1, 2 e 3 de cadeia leve (LCDR1, LCDR2, LCDR3) como mostradas nas SEQ ID NOs: 40, 41 e 42, em que um, dois, três ou mais resíduos de aminoácidos de qualquer CDR podem ser substituídos por um aminoácido diferente; e/ou (d) a região variável de cadeia pesada que é pelo menos 60%, 70%, 80%, 85%, 90% ou 95% idêntica à região variável que possui uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 32 ou 48-51, em que um, dois, três ou mais resíduos de aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido diferente; e/ou (e) a região variável de cadeia leve que é pelo menos 60%, 70%, 80%, 85%, 90% ou 95% idêntica à região variável que possui uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 33 ou 43-47, em que um, dois, três ou mais resíduos de aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido diferente.
[140] Em outro aspecto de qualquer um dos exemplos de realização da presente divulgação, qualquer uma das CDRs 1, 2 e 3 de cadeias pesadas e leves pode ser caracterizada por uma sequência de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos contíguos da mesma, e/ou como tendo uma sequência de aminoácidos que compartilha pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90% ou 95% de identidade de sequência com a CDR particular ou conjunto de CDRs listadas nas SEQ ID NOs correspondentes.
[141] Em outro aspecto, é fornecido um anticorpo que compete pela ligação ao KIR3DL2 com um anticorpo monoclonal de (a) a (h), por qualquer um dos anticorpos acima.
ANTICORPOS HUMANIZADOS
[142] Em outro aspecto, um anticorpo anti-KIR3DL2 usado nos presentes métodos de tratamento é um anticorpo humanizado, por exemplo, um anticorpo humanizado 2B12 ou 10G5 com uma VH e VL selecionada a partir das regiões variáveis do 2B12 e 10G5 mostradas na Tabela B, abaixo.
[143] Por exemplo, um anticorpo 2B12 humanizado pode compreender: (a) uma CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34, 35 ou 36; (b) uma CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 37 ou 38; (c) uma CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 39; (d) uma CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 40; (e) uma CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 41; (f) uma CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 42; e (g) sequências da região estrutural (framework) humana.
[144] Em um exemplo de realização, um anticorpo humanizado compreende uma estrutura de cadeia pesada do subgrupo humano VH1 e/ou VH7 juntamente com JH6, opcionalmente, os anticorpos compreendem IGHV7- 4-1*02 e/ou IGHV1-c*01, juntamente com IGHJ6*01. Em um exemplo de realização, um anticorpo humanizado compreende uma estrutura de cadeia leve do subgrupo humano VK1 e/ou VK4, opcionalmente IGKV4-1*01 e/ou IGKV1-39*01, juntamente com JH4, opcionalmente IGKJ4*01.
[145] Opcionalmente, uma região estrutural/arcabouço (framework) humano compreende uma ou mais mutações, por exemplo, mutação reversa (back mutation).
[146] Em outro aspecto, os anticorpos humanizados compreendem um domínio VH com pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos cerca de 85%, 90%, 95%, 97%, 98% de identidade ou mais) com o domínio VH do 2B12 humanizado de SEQ ID NOs: 48-51. Em outro aspecto particular, um anticorpo humanizado compreende: (a) um domínio VH que compreende resíduos de CDR não humana incorporados em um domínio VH humano, em que o domínio VH é pelo menos cerca de 80% (tal como pelo menos 90%, 95%, 97%, 98%) idêntico ao VH de 2B12 humanizado de SEQ ID NOs: 48-51, e (b) um domínio VL que compreende resíduos de CDR não humana incorporados em um domínio VL humano, em que o domínio VL é pelo menos cerca de 80% (tal como pelo menos 90%, 95%, 97%, 98%) idêntico ao VL de 2B12 humanizado de SEQ ID NOs: 43-47.
[147] Em outro aspecto, os anticorpos humanizados compreendem um domínio VH com pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos cerca de 85%, 90%, 95%, 97%, 98% de identidade ou mais) com o domínio VH do 10G5 humanizado de SEQ ID NOs: 57-61. Em outro aspecto particular, um anticorpo humanizado compreende: (a) um domínio VH que compreende resíduos de CDR não humana incorporados em um domínio VH humano, em que o domínio VH é pelo menos cerca de 80% (tal como pelo menos 90%, 95%, 97%, 98%) idêntico ao VH de 10G5 humanizado de SEQ ID NOs: 57-61, e (b) um domínio VL que compreende resíduos de CDR não humana incorporados em um domínio VL humano, em que o domínio VL é pelo menos cerca de 80% (tal como pelo menos 90%, 95%, 97%, 98%) idêntico ao VL de 10G5 humanizado de SEQ ID NOs: 52-56.
[148] O anticorpo 10G5 ou 2B12 pode compreender ainda um domínio constante de IgG humana nativo ou modificado. Opcionalmente, o domínio constante é um domínio IgG1, opcionalmente compreendendo ainda uma modificação para aumentar a ligação ao receptor Fc.
TABELA B Domínio de Sequência de aminoácidos (SEQ ID NO) anticorpo 2B12-L0 DIQMTQSPSFLSASVGDRVTITCKASQDVSTAVAWYQQKPGQPPKLLIYWTSTRHTGVPD
RFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQHYSTPWTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 43) 2B12-L1 DIQMTQSPSFLSASVGDRVTITCKASQDVSTAVAWYQQKPGQPPKLLIYWTSTRHTGVPD
RFSGSGSGTDYTLTISSLQAEDVAVYYCQQHYSTPWTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 44) 2B12-L2 DIVMTQSPSFLSASVGDRVTITCKASQDVSTAVAWYQQKPGQPPKLLIYWTSTRHTGVPD
RFSGSGSGTDYTLTISSVQAEDVAVYYCQQHYSTPWTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 45) 2B12-L3 DIVMTQSPSFLSASVGDRVTFTCKASQDVSTAVAWYQQKPGQSPKLLIYWTSTRHTGVPD
RFSGSGSGTDYTLTISSVQAEDVAVYYCQQHYSTPWTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 46) 2B12-L4 DIVMTQSHKFLSASVGDRVTFTCKASQDVSTAVAWYQQKPGQSPKLLIYWTSTRHTGVPD
RFSGSGSGTDYTLTISSVQAEDVAVYYCQQHYSTPWTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 47) 2B12-H1 QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTTAGMQWVQKSPGQGLEWMGWINSHSGVPKY
AEDFKGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYFCARGGDEGVMDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 48) 2B12-H2 QIQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTTAGMQWVRQAPGQGLEWIGWINSHSGVPKY
AEDFKGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYFCARGGDEGVMDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 49) 2B12-H3 QIQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTTAGMQWVQKSPGQGLEWIGWINSHSGVPKY
AEDFKGRFAFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYFCARGGDEGVMDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 50) 2B12-H4 QIQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTTAGMQWVQKTPGKGLEWIGWINSHSGVPKY
AEDFKGRFAFSLDTSASTAYLQISSLKAEDTAVYFCARGGDEGVMDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO: 51) 10G5-L0 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENIYSNLAWYQQKPGKAPKLLLYAATNLADGVPS
RFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQHFWGTPYTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 52) 10G5-L2 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENIYSNLAWYQQKPGKAPQLLVYAATNLADGVPS
RFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQHFWGTPYTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 53) 10G5-L3 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENIYSNLAWYQQKPGKAPQLLVYAATNLADGVPS
RFSGSGSGTQYTLTISSLQPEDFATYYCQHFWGTPYTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 54) 10G5-L4 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENIYSNLAWYQQKQGKAPQLLVYAATNLADGVPS
RFSGSGSGTQYTLTINSLQPEDFATYYCQHFWGTPYTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 55) 10G5-L5 DIQMTQSPSSLSASVGETVTITCRASENIYSNLAWYQQKQGKAPQLLVYAATNLADGVPS
RFSGSGSGTQYTLTINSLQPEDFATYYCQHFWGTPYTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 56) 10G5-H0 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYTMHWVRQAPGQGLEWMGYINPSSGYTEN
NRKFKDRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARLGKGLLPPFDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 57) 10G5-H3 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYTMHWVRQAPGQGLEWIGYINPSSGYTEN
NRKFKDKTTMTADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARLGKGLLPPFDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 58) 10G5-H4 QVQLQQSGAEVKKPGASVKMSCKASGYTFTSYTMHWVRQAPGQGLEWIGYINPSSGYTEN
NRKFKDKTTLTADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARLGKGLLPPFDYWGQGTTLTVSS (SEQ ID NO: 59) 10G5-H5 QVQLVQSGAELARPGASVKVSCKASGYTFTSYTMHWVRQAPGQGLEWIGYINPSSGYTEN
NRKFKDKTTLTADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARLGKGLLPPFDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 60) 10G5-H6 QVQLQQSGAEVKKPGASVKMSCKASGYTFTSYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSSGYTEN
NRKFKDKTTLTADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARLGKGLLPPFDYWGQGTTLTVSS (SEQ ID NO: 61)
[149] Em um exemplo de realização, um anticorpo monoclonal
2B12 humanizado compreende: (a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 49, e (b) uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 44.
[150] Em um exemplo de realização, um anticorpo monoclonal 2B12 humanizado compreende: (a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 49, e (b) uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 45.
[151] Em um exemplo de realização, um anticorpo monoclonal 10G5 humanizado compreende: (a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 58, e (b) uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 53.
[152] Em um exemplo de realização, um anticorpo monoclonal 10G5 humanizado compreende: (a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 59, e (b) uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 53.
[153] Em um exemplo de realização, o anticorpo 2B12 humanizado é ou compreende a sequência de aminoácidos de cadeia pesada e leve do anticorpo IPH4102 (Innate Pharma, França), também conhecido como lacutamabe (consulte o WHO Drug Information, Vol. 32, No. 4, 2018). O lacutamabe é um anticorpo 2B12 humanizado (possuindo as CDRs 1, 2 e 3 das cadeias leve e pesada de acordo com Kabat do 2B12) e compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 49 e uma região variável de cadeia leve compreendendo um aminoácido sequência de SEQ ID NO: 44.
[154] Embora seja apreciado que qualquer anticorpo adequado pode ser usado, em um aspecto, os anticorpos que são usados ligam-se à mesma área ou região que um anticorpo anti-KIR3DL2 conhecido, incluindo qualquer um dos anticorpos anti-KIR3DL2 descritos na presente invenção. Os anticorpos anti-KIR3DL2 podem se ligar a um epítopo que se sobrepõe pelo menos parcialmente, ou inclui pelo menos um resíduo no segmento correspondente aos resíduos 1-192, resíduos 1-98 ou resíduos 99-192 do polipeptídeo KIR3DL2 de SEQ ID NO: 1 (ou uma subsequência do mesmo).
Em um exemplo de realização, todos os resíduos–chave do epítopo estão em um segmento correspondente aos resíduos 1-192, resíduos 1-98 ou resíduos 99-192 do polipeptídeo KIR3DL2 de SEQ ID NO: 1. Em um exemplo de realização, os anticorpos ligam-se a um epítopo compreendendo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou mais resíduos no segmento correspondente aos resíduos 1-192, 1-98 ou 99-192 do polipeptídeo KIR3DL2 de SEQ ID NO: 1. De preferência, os resíduos ligados por os anticorpos estão presentes na superfície do polipeptídeo KIR3DL2.
[155] Opcionalmente, os anticorpos ligam-se a um epítopo compreendendo os resíduos P179 e/ou o resíduo S181 da SEQ ID NO: 1.
Opcionalmente, os anticorpos ligam-se a um epítopo compreendendo 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 ou mais resíduos selecionados a partir de grupo que consiste em: N99, H100, E130, H131, F132, V178, P179, H180, S181, P182, Y183 e/ou resíduo Q184 de SEQ ID NO: 1.
[156] PCT/EP2013/069302 e PCT/EP2013/069293 descreve o teste de uma série de polipeptídeos KIR3DL2 humanos mutantes. A ligação de anticorpos anti-KIR3DL2 às células transfectadas com os mutantes KIR3DL2 foi medida e comparada com a capacidade do anticorpo anti-KIR3DL2 de se ligar ao polipeptídeo KIR3DL2 tipo selvagem (SEQ ID NO: 1). Uma redução na ligação entre um anticorpo anti-KIR3DL2 e um polipeptídeo KIR3DL2 mutante, conforme usado na presente invenção, significa que há uma redução na afinidade de ligação (por exemplo, como medida por métodos conhecidos com ensaio FACS de células que expressam um determinado mutante, ou por ensaio BIAcore de ligação a polipeptídeos mutantes) e/ou uma redução na capacidade de ligação total do anticorpo anti-KIR3DL2 (por exemplo, como evidenciado por uma diminuição em Bmáx em um gráfico de concentração de anticorpo anti-KIR3DL2 versus concentração de polipeptídeo). Uma redução significativa na ligação indica que o resíduo mutado está diretamente envolvido na ligação ao anticorpo anti-KIR3DL2 ou está em estreita proximidade com a proteína de ligação, quando o anticorpo anti-KIR3DL2 está ligado ao KIR3DL2.
Um epítopo de anticorpo pode, assim, incluir esse resíduo e pode incluir resíduos adicionais espacialmente adjacentes a esse resíduo.
[157] Em alguns exemplos de realização, uma redução significativa na ligação significa que a afinidade de ligação e/ou capacidade entre um anticorpo anti-KIR3DL2 e um polipeptídeo KIR3DL2 mutante é reduzida em mais de 40%, mais de 50%, mais de 55%, mais de 60%, mais de 65%, mais de 70%, mais de 75%, mais de 80%, mais de 85%, mais de 90% ou mais de 95% em relação à ligação entre o anticorpo e um polipeptídeo KIR3DL2 tipo selvagem (por exemplo, o polipeptídeo mostrado na SEQ ID NO: 1). Em certos exemplos de realização, a ligação é reduzida abaixo do limite detectável. Em alguns exemplos de realização, uma redução significativa na ligação é evidenciada quando a ligação de um anticorpo anti-KIR3DL2 a um polipeptídeo KIR3DL2 mutante é inferior a 50% (por exemplo, inferior a 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20 %, 15% ou 10%) da ligação observada entre o anticorpo anti-KIR3DL2 e um polipeptídeo KIR3DL2 tipo selvagem (por exemplo, o domínio extracelular mostrado na SEQ ID NO: 1). Essas medições de ligação podem ser feitas usando uma variedade de ensaios de ligação conhecidos no estado da técnica. Um exemplo específico de tal ensaio é descrito na seção de Exemplo.
[158] Em alguns exemplos de realização, os anticorpos anti- KIR3DL2 exibem ligação significativamente mais baixa para um polipeptídeo KIR3DL2 mutante no qual um resíduo em um polipeptídeo KIR3DL2 tipo selvagem (por exemplo, de SEQ ID NO: 1) é substituído. Na notação abreviada usada na presente invenção, o formato é: Resíduo de tipo selvagem: Posição no polipeptídeo: Resíduo mutante, com a numeração dos resíduos conforme indicado na SEQ ID NO: 1.
[159] Opcionalmente, os anticorpos têm ligação reduzida a um polipeptídeo KIR3DL2 com uma substituição nos resíduos N99, H100, E130, H131, F132, V178, P179, H180, S181, P182, Y183 e/ou resíduo Q184 da SEQ ID NO: 1.
[160] Em alguns exemplos de realização, um anticorpo anti- KIR3DL2 liga-se a um polipeptídeo KIR3DL2 tipo selvagem que possui uma sequência de SEQ ID NO: 1, mas diminuiu a ligação a um polipeptídeo KIR3DL2 mutante que possui qualquer uma ou mais (por exemplo, 1, 2, 3 ou 4) das seguintes mutações: P179T e/ou S181T (com referência à SEQ ID NO: 1).
Em um exemplo de realização, a ligação ao KIR3DL2 mutante é significativamente reduzida em comparação com a ligação ao KIR3DL2 tipo selvagem.
[161] Em alguns exemplos de realização, os anticorpos anti- KIR3DL2 exibem uma ligação significativamente mais baixa para um polipeptídeo KIR3DL2 mutante em que um resíduo em um segmento correspondente aos resíduos 1-98, resíduos 99-292 ou resíduos 99-192 (ou uma subsequência dos mesmos) em um polipeptídeo KIR3DL2 tipo selvagem (por exemplo, SEQ ID NO: 1) é substituído por um aminoácido diferente.
[162] Em um aspecto, um anticorpo pode competir com o anticorpo monoclonal AZ158, 10G5, 19H12, 2B12 ou 12B11 e reconhece a ligação, ou tem imunoespecificidade para o mesmo epítopo ou substancialmente ou essencialmente o mesmo epítopo ou “sítio epitópico” em uma molécula KIR3DL2, assim como o anticorpo monoclonal AZ158, 10G5, 19H12, 2B12 ou 12B11. Em outros exemplos de realização, o anticorpo monoclonal consiste em, ou é um derivado ou fragmento do anticorpo AZ158, 10G5, 19H12, 2B12 ou 12B11.
[163] Será reconhecido que, embora os anticorpos possam ligar- se ao mesmo epítopo que o anticorpo AZ158, 10G5, 19H12, 2B12 ou 12B11, os anticorpos adequados podem reconhecer e ser criados contra qualquer parte do polipeptídeo KIR3DL2, desde que o anticorpo se ligue ao KIR3DL2 e tenha a funcionalidade desejada. Por exemplo, qualquer fragmento de KIR3DL2, por exemplo, KIR3DL2 humano ou qualquer combinação de fragmentos KIR3DL2, pode ser usado como imunógeno para criar anticorpos, e os anticorpos podem reconhecer epítopos em qualquer sítio dentro do polipeptídeo KIR3DL2, desde que possam fazê-lo em células NK que expressam KIR3DL2, conforme descrito no presente documento. Em um exemplo de realização, os epítopos reconhecidos estão presentes na superfície da célula, ou seja, eles são acessíveis a anticorpos presentes fora da célula.
Opcionalmente, o epítopo é o epítopo especificamente reconhecido pelo anticorpo AZ158, 10G5, 19H12, 2B12 ou 12B11. Além disso, os anticorpos que reconhecem epítopos distintos dentro de KIR3DL2 podem ser usados em combinação, por exemplo, para se ligar a polipeptídeos KIR3DL2 com eficácia máxima e amplitude entre diferentes indivíduos.
[164] Os anticorpos podem ser produzidos por meio de uma série de métodos conhecidos na técnica. Normalmente, eles são produzidos por imunização de um animal não humano, opcionalmente um camundongo, com um imunógeno compreendendo um polipeptídeo KIR3DL2, opcionalmente um polipeptídeo KIR3DL2 humano. O polipeptídeo KIR3DL2 pode compreender a sequência de comprimento total (completa) de um polipeptídeo KIR3DL2 humano, ou um fragmento ou derivado do mesmo, tipicamente um fragmento imunogênico, isto é, uma porção do polipeptídeo compreendendo um epítopo exposto na superfície das células que expressam um polipeptídeo KIR3DL2, opcionalmente o epítopo é reconhecido pelo anticorpo AZ158, 10G5, 19H12, 2B12 ou 12B11. Esses fragmentos contêm tipicamente pelo menos cerca de sete aminoácidos consecutivos da sequência de polipeptídeos madura, ou pelo menos cerca de 10 de seus aminoácidos consecutivos. Tipicamente os fragmentos são essencialmente derivados do domínio extracelular do receptor.
Em um exemplo de realização, o imunógeno compreende um polipeptídeo KIR3DL2 humano tipo selvagem em uma membrana de lipídios, tipicamente na superfície de uma célula. Em um exemplo de realização, o imunógeno compreende células intactas, particularmente células humanas intactas, opcionalmente tratadas ou lisadas. Em outro exemplo de realização, o polipeptídeo é um polipeptídeo KIR3DL2 recombinante.
[165] A etapa de imunização de mamíferos não humanos com um antígeno pode ser conduzida de qualquer forma bem conhecida no estado técnica para estimular a produção de anticorpos em camundongos (vide, por exemplo, E. Harlow e D. Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1988), cuja descrição completa é incorporada ao presente como referência). O imunógeno é suspenso ou dissolvido em tampão, opcionalmente com um adjuvante, tal como adjuvante de Freund completo ou incompleto. Métodos de determinação da quantidade de imunógeno, tipos de tampões e quantidades de adjuvante são bem conhecidos pelos técnicos no assunto e não são limitados de nenhuma forma. Esses parâmetros podem ser diferentes para diferentes imunógenos, mas são facilmente elucidados.
[166] De forma similar, o local e a frequência de imunização suficientes para estimular a produção de anticorpos também são bem conhecidos na técnica. Em protocolos de imunização típicos, os animais não humanos recebem injeção intraperitoneal com antígeno no dia 1 e novamente cerca de uma semana mais tarde. Isso é seguido por injeções adicionais do antígeno perto do dia 20, opcionalmente com um adjuvante tal como adjuvante incompleto de Freund. As injeções adicionais são realizadas por via intravenosa e podem ser repetidas por vários dias consecutivos. Isso é seguido por uma injeção de reforço no dia 40, por via intravenosa ou intraperitoneal, tipicamente sem adjuvante. Este protocolo resulta na produção de células B produtoras de anticorpos antígeno-específicos após cerca de 40 dias. Outros protocolos podem também ser utilizados, desde que resultem na produção de células B que expressam anticorpos direcionados ao antígeno utilizado na imunização.
[167] Para a preparação de anticorpo policlonal, soro é obtido de um animal não humano imunizado e os anticorpos aí presentes isolados pelas técnicas bem conhecidas. O soro pode ser purificado por afinidade usando qualquer um dos imunógenos apresentados acima ligados a um suporte sólido de modo a obter anticorpos que reagem com os polipeptídeos KIR3DL2.
[168] Em um exemplo de realização alternativo, os linfócitos de mamíferos não humanos não imunizados são isolados, cultivados in vitro e em seguida expostos ao imunógeno em cultivo celular. Em seguida os linfócitos são coletados e a etapa de fusão descrita abaixo é realizada.
[169] Para anticorpos monoclonais exemplares, a etapa seguinte é o isolamento de esplenócitos do mamífero não humano imunizado e fusão subsequente desses esplenócitos com células imortalizadas, a fim de formar um hibridoma produtor de anticorpos. O isolamento de esplenócitos a partir de mamíferos não humanos é bem conhecido no estado da técnica e envolve tipicamente a remoção do baço de mamíferos não humanos anestesiados, seu corte em pequenos pedaços e compressão dos esplenócitos da cápsula esplênica através de uma tela de nylon de um coador celular para um tampão apropriado, de forma a produzir uma suspensão de células isoladas. As células são lavadas, centrifugadas e novamente suspensas em um tampão que lise quaisquer glóbulos vermelhos do sangue. A solução é novamente centrifugada e os linfócitos remanescentes na pelota são finalmente suspensos novamente em tampão fresco.
[170] Uma vez isolados e presentes em uma suspensão de células únicas, os linfócitos podem ser fundidos a uma linhagem celular imortal.
Esta é tipicamente uma linhagem de células de mieloma de camundongos, embora várias outras linhagens celulares imortais úteis para a criação de hibridomas sejam conhecidas no estado da técnica. As linhagens de mieloma murino incluem, mas sem limitações, as derivadas de tumores de camundongos MOPC-21 e MPC-11 disponíveis por meio do Centro de Distribuição de Células do Instituto Salk, San Diego, Estados Unidos, e células X63 Ag8653 e SP-2 disponíveis por meio da Coleção Norte-Americana de Cultivos de Tipos, Rockville, Maryland, Estados Unidos. A fusão é realizada utilizando-se polietileno glicol ou similares. Os hibridomas resultantes são cultivados em seguida em meios de cultivo que contêm uma ou mais substâncias que inibem o crescimento ou a sobrevivência das células de mieloma parentais não fundidas. Por exemplo, se as células de mieloma parentais não possuem a enzima hipoxantina-guanina-fosforribosiltransferase (HGPRT ou HPRT), o meio de cultura para os hibridomas incluirá tipicamente hipoxantina, aminopterina e timidina (meio HAT), substâncias que evitam o crescimento de células com deficiência em HGPRT.
[171] Os hibridomas são tipicamente cultivados sobre uma camada alimentadora de macrófagos. Os macrófagos podem ser de ninhadas do mamífero não humano utilizado para isolar esplenócitos e tipicamente recebem a imunização inicial (priming) com adjuvante de Freund incompleto ou similar vários dias antes da colocação dos hibridomas em placas. Os métodos de fusão são descritos em Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, págs. 59-103 (Academic Press, 1986), cujo relatório descritivo é incorporado ao presente como referência.
[172] As células são mantidas em crescimento nos meios de seleção por tempo suficiente para a formação de colônias e produção de anticorpos. Isso normalmente ocorre entre cerca de 7 e cerca de 14 dias.
[173] As colônias de hibridoma são então testadas quanto à produção de anticorpos que se ligam especificamente aos produtos do gene do polipeptídeo KIR3DL2, opcionalmente o epítopo especificamente reconhecido pelo anticorpo AZ158, 19H12, 2B12 ou 12B11. O ensaio é tipicamente um ensaio do tipo ELISA colorimétrico, embora qualquer ensaio possa ser empregado que possa ser adaptado aos poços em que os hibridomas são cultivados. Os poços positivos para a produção de anticorpos desejada são examinados para determinar se uma ou mais colônias distintas estão presentes. Se mais do que uma colônia estiver presente, as células podem ser reclonadas e cultivadas para garantir que apenas uma única célula deu origem à colônia produzindo o anticorpo desejado. Normalmente, os anticorpos também serão testados quanto à capacidade de ligação a polipeptídeos KIR3DL2, por exemplo, células que expressam KIR3DL2.
[174] Os hibridomas que são confirmados para produzir anticorpos monoclonais podem ser cultivados em quantidades maiores em meio apropriado, tal como DMEM ou RPMI-1640. Alternativamente, as células de hibridoma podem ser cultivadas in vivo na forma de tumores ascíticos em animais. Após o crescimento suficiente para produzir o anticorpo monoclonal desejado, os meios de crescimento que contêm anticorpo monoclonal (ou o líquido ascítico) são separados das células e o anticorpo monoclonal aí presente é purificado. A purificação é tipicamente conseguida por eletroforese em gel, diálise, cromatografia utilizando proteína A ou proteína G-Sepharose ou anti-Ig de camundongo ligado a um suporte sólido tal como esferas de Sepharose ou agarose (todos descritos, por exemplo, em Antibody Purification Handbook, Biosciences, publicação n° 18-1037-46, Edição AC, cuja descrição é incorporada ao presente como referência). O anticorpo ligado sofre tipicamente eluição de colunas de proteína A/proteína G, utilizando tampões de baixo pH (tampões de acetato ou glicina com pH 3,0 ou menos) com neutralização imediata de frações que contêm anticorpos. Essas frações são reunidas, sofrem diálise e são concentradas conforme o necessário.
[175] Os poços positivos com uma única colônia aparente são tipicamente clonados novamente e novamente testados para garantir que um único anticorpo monoclonal seja detectado e produzido.
[176] Os anticorpos podem também ser produzidos por meio de seleção de bibliotecas combinatórias de imunoglobulinas, conforme descrito, por exemplo, em Ward et al., Nature, 341 (1989), pág. 544, cuja descrição é integralmente incorporada ao presente como referência).
[177] A identificação de um ou mais anticorpos que se liga(m) ao antígeno de interesse, ou seja, KIR3DL2, particularmente ou essencialmente a mesma região, determinante ou epítopo como o anticorpo monoclonal AZ158, 19H12, 2B12 ou 12B11, pode ser facilmente determinada usando qualquer um dentre uma variedade de ensaios de triagem imunológica em que a competição de anticorpos pode ser avaliada. Muitos desses ensaios são praticados rotineiramente e são bem conhecidos no estado da técnica (consulte, por exemplo, a Patente US 5.660.827, emitida em 26 de agosto de 1997, que é especificamente incorporada ao presente documento por referência).
[178] Por exemplo, quando os anticorpos teste a serem examinados são obtidos de diferentes fontes animais, ou ainda são de um isotipo de Ig diferente, um ensaio de competição simples pode ser empregado no qual o controle (por exemplo, AZ158, 19H12, 2B12 ou 12B11) e os anticorpos de teste são misturados (ou pré-adsorvidos) e aplicados a uma amostra contendo polipeptídeos KIR3DL2. Os protocolos baseados em Western blotting e o uso da análise BIACORE são adequados para uso em tais estudos de competição.
[179] Em certos exemplos de realização, um pré-mistura os anticorpos de controle (por exemplo, AZ158, 19H12, 2B12 ou 12B11) com quantidades variáveis dos anticorpos teste (por exemplo, cerca de 1:10 ou cerca de 1:100) por um período de tempo antes de aplicar à amostra de antígeno KIR3DL2. Em outros exemplos de realização, o controle e as quantidades variáveis de anticorpos teste podem simplesmente ser misturados durante a exposição à amostra com antígeno KIR3DL2. Contanto que seja possível distinguir anticorpos ligados de anticorpos livres (por exemplo, usando técnicas de separação ou lavagem para eliminar anticorpos não ligados) e anticorpos 2B12 dos anticorpos teste (por exemplo, usando anticorpos secundários específicos para espécie ou específicos para isotipo ou marcando especificamente AZ158, 19H12, 2B12 ou 12B11 com um marcador detectável) pode-se determinar se os anticorpos teste reduzem a ligação de AZ158, 19H12, 2B12 ou 12B11 aos antígenos. A ligação dos anticorpos controle (marcados) na ausência de um anticorpo completamente irrelevante pode servir como o controle de valor alto. O controle de valor baixo pode ser obtido incubando os anticorpos marcados (AZ158, 19H12, 2B12 ou 12B11) com anticorpos não marcados exatamente do mesmo tipo (AZ158, 19H12, 2B12 ou
12B11), onde a competição ocorreria e reduziria a ligação dos anticorpos marcados. Em um ensaio teste, uma redução significativa na reatividade do anticorpo marcado na presença de um anticorpo teste é indicativa de um anticorpo teste que “reage de forma cruzada” ou compete com o anticorpo marcado (AZ158, 19H12, 2B12 ou 12B11). Qualquer anticorpo teste que reduza a ligação de AZ158, 19H12, 2B12 ou 12B11 aos antígenos KIR3DL2 em pelo menos cerca de 50%, tal como pelo menos cerca de 60%, ou mais preferencialmente pelo menos cerca de 80% ou 90% (por exemplo, cerca de 65 – 100%), em qualquer proporção de AZ158, 19H12, 2B12 ou 12B11:anticorpo teste entre cerca de 1:10 e cerca de 1:100 pode ser selecionado. Em um exemplo de realização, tal anticorpo teste irá reduzir a ligação de AZ158, 19H12, 2B12 ou 12B11 ao antígeno KIR3DL2 em pelo menos cerca de 90% (por exemplo, cerca de 95%).
[180] A competição também pode ser avaliada, por exemplo, por um teste de citometria de fluxo. Em tal teste, as células que carregam um determinado polipeptídeo KIR3DL2 podem ser primeiro incubadas com 2B12, por exemplo, e depois com o anticorpo teste marcado com um fluorocromo ou biotina. O anticorpo é dito competir com 2B12 se a ligação obtida na pré- incubação com uma quantidade saturante de 2B12 for de cerca de 80%, preferivelmente cerca de 50%, cerca de 40% ou menos (por exemplo, em torno de 30%, 20% ou 10%) da ligação (como medido pela média da fluorescência) obtida pelo anticorpo sem pré-incubação com 2B12. Alternativamente, um anticorpo é dito competir com 2B12 se a ligação obtida com um anticorpo 2B12 rotulado (por um fluorocromo ou biotina) nas células pré-incubadas com uma quantidade saturante de anticorpo teste é de cerca de 80%, preferivelmente cerca de 50%, cerca de 40%, ou menos (por exemplo, em torno de 30%, 20% ou 10%) da ligação obtida sem pré-incubação com o anticorpo de teste.
[181] A determinação de se um anticorpo liga-se dentro de uma região de epítopo pode ser realizada em maneiras conhecidas pela pessoa habilitada na técnica.
Como um exemplo de tais métodos de mapeamento/caracterização, uma região de epítopo para um anticorpo anti-
KIR3DL2 pode ser determinada pela “pegada” de epítopo usando modificação química das aminas/carboxilas expostas na proteína de KIR3DL2. Um exemplo específico de tal técnica de pegada (foot-printing) é o uso de HXMS (troca de hidrogênio-deutério detectada pela espectrometria de massa) em que uma troca de hidrogênio/deutério de prótons da amida do receptor e proteína ligante, ligação, e retro troca ocorrem, em que os grupos amida da cadeia principal que participam na ligação da proteína são protegidos da retro troca e,
portanto, permanecerão deuterados.
As regiões relevantes podem ser identificadas neste ponto pela proteólise péptica, a separação pela cromatografia líquida de alto desempenho de microssondagem rápida, e/ou espectrometria de massa com ionização por eletropulverização.
Veja, por exemplo, Ehring H, Analytical Biochemistry, Vol. 267 (2) pp. 252-259 (1999)
Engen, J.
R. e Smith, D.
L. (2001) Anal.
Chem. 73, 256A-265A.
Outro exemplo de uma técnica de identificação de epítopo adequada é o mapeamento de epítopo pela ressonância magnética nuclear (RMN), onde tipicamente a posição dos sinais nos espectros de RMN bidimensionais do antígeno livre e do antígeno complexado com o peptídeo de ligação de antígeno, tal como um anticorpo, são comparados.
O antígeno tipicamente é isotopicamente rotulado de modo seletivo com 15N de modo que apenas sinais que correspondem ao antígeno e nenhum dos sinais do peptídeo de ligação de antígeno são observados no espectro de RMN.
Os sinais de antígeno que se originam dos aminoácidos envolvidos na interação com o peptídeo de ligação de antígeno tipicamente mudarão de posição no espectro do complexo comparado com o espectro do antígeno livre, e os aminoácidos envolvidos na ligação podem ser identificados deste modo.
Veja, por exemplo, Ernst Schering Res Found
Workshop. 2004; (44): 149-67; Huang et al., Journal of Molecular Biology, Vol.
281 (1) pp. 61-67 (1998); e Saito e Patterson, Methods. Jun de 1996; 9 (3): 516-24.
[182] O mapeamento/caracterização de epítopo também pode ser realizado usando métodos de espectrometria de massa. Vide, por exemplo, Downward, J Mass Spectrom. Abr de 2000; 35 (4): 493-503 e Kiselar e Downard, Anal Chem. 1 de maio de 1999; 71 (9): 1792-801. As técnicas de digestão da protease também podem ser úteis no contexto de mapeamento e identificação de epítopo. As regiões/sequências antigênicas determinantes relevantes podem ser determinadas pela digestão com protease, por exemplo, usando-se tripsina em uma razão de cerca de 1:50 para KIR3DL2 ou digestão durante a noite e no pH 7 a 8, seguido pela análise de espectrometria de massa (MS) para a identificação de peptídeo. Os peptídeos protegidos da clivagem com tripsina pelos ligantes anti-KIR3DL2 podem ser subsequentemente identificados pela comparação de amostras individualizadas para a digestão com tripsina e amostras incubadas com anticorpo e depois individualizadas para a digestão, por exemplo, pela tripsina (revelando deste modo uma pegada para o ligante). Outras enzimas como quimiotripsina, pepsina, etc., também ou alternativamente podem ser usadas em métodos de caracterização de epítopo similares. Além disso, a digestão enzimática pode fornecer um método rápido para analisar se uma sequência determinante antigênica potencial está dentro de uma região do polipeptídeo KIR3DL2 que não está exposta na superfície e, consequentemente, mais provavelmente não relevante em termos de imunogenicidade/antigenicidade.
[183] A mutagênese sítio-dirigida é outra técnica útil para a elucidação de um epítopo de ligação. Por exemplo, na “varredura de alanina”, cada resíduo dentro de um segmento de proteína é substituído com um resíduo de alanina, e as consequências para a afinidade de ligação medidas. Se a mutação leva a uma redução significante na afinidade de ligação, ela está mais provavelmente envolvida na ligação. Os anticorpos monoclonais específicos para epítopos estruturais (isto é, anticorpos que não se ligam à proteína não enovelada) podem ser usados para verificar que a substituição da alanina não influencia o enovelamento (dobra) completo da proteína. Vide, por exemplo, Clackson e Wells, Science 1995; 267: 383-386; e Wells, Proc Natl Acad Sci USA 1996; 93: 1–6.
[184] A microscopia eletrônica também pode ser usada para a “pegada” de epítopo. Por exemplo, Wang et al., Nature 1992; 355: 275–278 usado a aplicação coordenada da microscopia crioeletrônica, reconstrução de imagem tridimensional, e cristalografia de raio X para determinar a pegada física de um fragmento de Fab na superfície do capsídio do vírus do mosaico do feijão-caupi nativo.
[185] Outras formas de ensaio “sem rótulo” / “sem marcador” para a avaliação de epítopo incluem a ressonância plasmônica de superfície (SPR, BIACORE) e espectroscopia de interferência reflectométrica (RifS). Veja, por exemplo, Fägerstam et al., Journal Of Molecular Recognition 1990;3:208- 14; Nice et al., J. Chromatogr. 1993; 646:159–168; Leipert et al., Angew. Chem.
Int. Ed. 1998; 37:3308–3311; Kröger et al., Biosensors and Bioelectronics 2002; 17:937-944.
[186] Também deve ser mencionado que em uma ligação de anticorpo o mesmo ou substancialmente o mesmo epítopo como um anticorpo descrito na presente invenção pode ser identificado em um ou mais dos ensaios competitivos exemplares aqui descritos.
[187] Uma vez que são identificados os anticorpos capazes de se ligar ao KIR3DL2 e/ou que possuem outras propriedades desejadas (por exemplo, a capacidade de mediar a ADCC e/ou fagocitose celular dependente de anticorpos (ADCP)), eles também serão tipicamente avaliados, usando métodos padrão, incluindo aqueles descrito na presente invenção, por sua capacidade de se ligar a outros polipeptídeos, incluindo polipeptídeos não relacionados. Idealmente, os anticorpos ligam-se apenas com afinidade substancial ao KIR3DL2, por exemplo, KIR3DL2 humano, e não se ligam em um nível significativo a polipeptídeos não relacionados. No entanto, será compreendido que, contanto que a afinidade para o KIR3DL2 seja substancialmente maior (por exemplo, 5x, 10x, 50x, 100x, 500x, 1000x,
10.000x ou mais) do que para outros polipeptídeos não relacionados, então os anticorpos são adequados para uso nos métodos da presente invenção.
[188] A ligação dos anticorpos às células que expressam KIR3DL2 também pode ser avaliada em primatas não humanos, por exemplo, macacos cinomolgos ou outros mamíferos, como camundongos. É fornecido um anticorpo, bem como fragmentos e derivados dos mesmos, em que o referido anticorpo, fragmento ou derivado liga-se especificamente ao KIR3DL2 e que, além disso, liga-se ao KIR3DL2 de primatas não humanos, por exemplo, de macacos cinomolgos.
[189] Após a imunização e produção de anticorpos em um vertebrado ou célula, podem ser realizadas etapas de seleção específicas para isolar anticorpos como reivindicado. A este respeito, em um exemplo de realização específico, são fornecidos métodos de produzir tais anticorpos, compreendendo: (a) imunizar um mamífero não humano com um imunógeno compreendendo um polipeptídeo KIR3DL2; e (b) preparar anticorpos a partir do referido animal imunizado; e (c) selecionar anticorpos da etapa (b) que são capazes de ligar ao KIR3DL2.
[190] Em um aspecto de qualquer um dos exemplos de realização, os anticorpos preparados de acordo com os presentes métodos são anticorpos monoclonais. Em outro aspecto, o animal não humano usado para produzir anticorpos de acordo com os métodos da invenção é um mamífero, tal como um roedor, bovino, porcino, galinha, cavalo, coelho, cabra ou ovelha.
[191] De acordo com um exemplo de realização alternativo, o DNA que codifica um anticorpo que se liga a um epítopo presente nos polipeptídeos KIR3DL2 é isolado do hibridoma e colocado em um vetor de expressão apropriado para transfecção em um hospedeiro apropriado. O hospedeiro é utilizado em seguida para produção recombinante do anticorpo ou suas variantes, tais como versão humanizada daquele anticorpo monoclonal, fragmentos ativos do anticorpo, anticorpos quiméricos que compreendem a parte de reconhecimento de antígenos do anticorpo ou versões que compreendem uma porção detectável.
[192] O DNA codificante de um anticorpo monoclonal pode ser facilmente isolado e sequenciado pelo uso de procedimentos convencionais (empregando-se, por exemplo, sondas de oligonucleotídeos que sejam capazes de ligar-se especificamente a genes codificantes das cadeias leve e pesada de anticorpos murinos). Uma vez isolado, o DNA pode ser colocado em vetores de expressão, que são transfectados em seguida para células hospedeiras, tais como células de E. coli, células COS de símios, células de ovário de hamster chinês (CHO) ou células de mieloma que, de outra forma, não produzem proteína de imunoglobulina para obter a síntese de anticorpos monoclonais nas células hospedeiras recombinantes. Conforme descrito em outros pontos do presente relatório descritivo, essas sequências de DNA podem ser modificadas para qualquer um dentre um grande número de propósitos, tal como para humanização de anticorpos, produção de fragmentos ou derivados, ou para modificar a sequência do anticorpo, por exemplo, no sítio de ligação de antígenos, a fim de otimizar a especificidade de ligação do anticorpo.
[193] A expressão recombinante em bactérias de DNA que codificam o anticorpo é bem conhecida no estado da técnica (vide, por exemplo, Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5, pág. 256 (1993); e Plückthun, Immunol. 130, pág. 151 (1992).
[194] Uma vez que um composto de ligação ao antígeno é obtido ele geralmente será avaliado quanto à sua capacidade de induzir ADCC, DPC e/ou CDC contra, e/ou depletar células alvos que expressam KIR3DL2. Avaliar a capacidade do composto de ligação ao antígeno de induzir a ADCC, ADPC e/ou CDC (citotoxicidade dependente de complemento) ou geralmente levar à eliminação ou inibição da atividade de células alvos que expressam KIR3DL2, pode ser realizado em qualquer estágio adequado do método. Esta avaliação pode ser útil em uma ou mais das várias etapas envolvidas na identificação, produção e/ou desenvolvimento de um anticorpo (ou outro composto) destinado ao uso terapêutico. Por exemplo, a atividade pode ser avaliada no contexto de um método de triagem para identificar compostos de ligação ao antígeno candidatos ou em métodos onde um composto de ligação ao antígeno é selecionado e tornado adequado ao ser humano (por exemplo, tornado quimérico ou humanizado no caso de um anticorpo), onde uma célula que expressa o composto de ligação ao antígeno (por exemplo, uma célula hospedeira que expressa um composto de ligação ao antígeno recombinante) foi obtida e é avaliada quanto à sua capacidade de produzir anticorpos funcionais (ou outros compostos), e/ou onde uma quantidade de composto de ligação ao antígeno foi produzida e deve ser avaliada quanto à atividade (por exemplo, para testar porções ou lotes de produto). Geralmente o composto de ligação ao antígeno será conhecido por se ligar especificamente a um polipeptídeo KIR3DL2. A etapa pode envolver testar uma pluralidade (por exemplo, um número muito grande usando métodos de triagem de alto rendimento ou um número menor) de compostos de ligação ao antígeno.
[195] O teste de ADCP, CDC e ADCC pode ser realizado e pode ser determinado por vários ensaios incluindo aqueles conhecidos no estado da técnica e aqueles descritos nos exemplos experimentais da presente invenção.
O teste de ADCC tipicamente envolve avaliar a citotoxicidade mediada por célula em que uma célula alvo que expressa KIR3DL2 (por exemplo, uma célula TCL ou outra célula que expressa KIR3DL2) com anticorpo anti-KIR3DL2 ligado é reconhecida por uma célula efetora que carrega receptores Fc, sem o envolvimento do complemento. Uma célula que não expressa um antígeno de KIR3DL2 pode opcionalmente ser usada como controle. A ativação de citotoxicidade de célula NK é avaliada medindo-se um aumento na produção de citocina (por exemplo, produção de IFN-γ) ou marcadores de citotoxicidade (por exemplo, mobilização de CD107). Em um exemplo de realização, o anticorpo induzirá um aumento na produção de citocina, expressão de marcadores de citotoxicidade, ou lise de célula alvo de pelo menos 20%, 50%, 80%, 100%, 200% ou 500% na presença de células alvos, comparado a um anticorpo controle (por exemplo, um anticorpo que não se liga ao KIR3DL2, um anticorpo para KIR3DL2 que possui regiões constantes murinas). Em outro exemplo, a lise de células alvo é detectada, por exemplo, em um ensaio de liberação de cromo, preferivelmente o anticorpo induzirá a lise de pelo menos 10%, 20%, 30%, 40% ou 50% das células alvos.
[196] Fragmentos e derivados de anticorpos (que são englobados pelo termo “anticorpo” ou “anticorpos”, da forma utilizada no presente pedido, a menos que indicado em contrário ou claramente contradito pelo contexto) podem ser produzidos por meio de métodos conhecidos na técnica. “Fragmentos” compreendem uma parte do anticorpo intacto, geralmente o sítio de ligação de antígenos ou região variável. Exemplos de fragmentos de anticorpos incluem fragmentos de Fab, Fab’, Fab’-SH, F(ab’)2 e Fv; diacorpos; qualquer fragmento de anticorpo que seja um polipeptídeo que possui estrutura primária que consiste em uma sequência ininterrupta de resíduos de aminoácidos contíguos (indicada no presente “fragmento de anticorpo de cadeia única” ou “polipeptídeo de cadeia única”), incluindo, sem limitações, (1) moléculas Fv de cadeia única, (2) polipeptídeos de cadeia única que contêm apenas um domínio variável de cadeia leve ou um de seus fragmentos que contém as três CDRs do domínio variável de cadeia leve, sem uma porção de cadeia pesada associada e (3) polipeptídeos de cadeia única que contêm apenas uma região variável de cadeia pesada ou um de seus fragmentos que contêm as três CDRs da região variável de cadeia pesada, sem uma porção de cadeia leve associada; e anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpos. São incluídos, entre outros, um nanocorpo (nanobody), anticorpo de domínio único, ou um “dAb”.
[197] Em certos exemplos de realização, o DNA de um hibridoma produtor de anticorpos pode ser modificado antes da inserção em um vetor de expressão, por exemplo, substituindo-se a sequência codificantes para domínios constantes de cadeia leve e pesada humana no lugar das sequências não humanas homólogas (por exemplo, Morrison et al, PNAS págs. 6851 (1984)), ou por meio de ligação covalente à sequência codificante de imunoglobulina da sequência de codificação para um polipeptídeo não de imunoglobulina, no todo ou em parte. Desta forma, são preparados anticorpos “quiméricos” ou “híbridos” que possuem a especificidade de ligação do anticorpo original. Tipicamente, esses polipeptídeos não de imunoglobulina são substituídos pelos domínios constantes de um anticorpo.
[198] Assim, de acordo com outro exemplo de realização, o anticorpo é humanizado. Formas “humanizadas" de anticorpos consequentemente são imunoglobulinas quiméricas específicas, cadeias de imunoglobulina ou seus fragmentos (tais como Fv, Fab, Fab’, F(ab’)2 ou outras subsequências de ligação de antígenos de anticorpos) que contêm sequência mínima derivada da imunoglobulina murina. Em sua maior parte, os anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas (anticorpo receptor) nas quais resíduos de uma região de determinação da complementaridade (CDR) do paciente são substituídos por resíduos de uma CDR do anticorpo original (anticorpo doador), mantendo-se ao mesmo tempo a especificidade, afinidade e capacidade desejadas do anticorpo original.
[199] Em alguns casos, resíduos da região estrutural Fv da imunoglobulina humana são substituídos por resíduos não humanos correspondentes. Além disso, anticorpos humanizados podem compreender resíduos que não são encontrados no anticorpo receptor nem nas sequências de região estrutural (framework) ou CDR importadas. Estas modificações são feitas para refinar e otimizar o desempenho do anticorpo. De forma geral, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todos dentre pelo menos um, tipicamente dois domínios variáveis, nos quais todas ou substancialmente todas as regiões CDR correspondem às do anticorpo original e todas ou substancialmente todas as regiões FR são as de uma sequência de consenso de imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado opcionalmente também compreenderá de pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente a de uma imunoglobulina humana. Para detalhes adicionais, vide Jones et al, Nature 321 págs. 522 (1986); Reichmann et al, Nature, 332, págs. 323 (1988); Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2, pág. 593 (1992); Verhoeyen et al, Science, 239, pág. 1534; e Patente Norte-Americana US 4.816.567, cujas descrições são integralmente incorporadas ao presente como referência). Os métodos de humanização dos anticorpos são bem conhecidos no estado da técnica.
[200] A seleção de domínios variáveis humanos, tanto leves quanto pesados, a serem utilizados na fabricação dos anticorpos humanizados é muito importante para reduzir a antigenicidade. De acordo com o então chamado método de “melhor adequação”, a sequência do domínio variável de um anticorpo é selecionada em comparação com toda a biblioteca de sequências de domínio variável humano conhecido. A sequência humana que é mais próxima do que a do camundongo é então aceita como a região estrutural humana (FR) para o anticorpo humanizado (Sims et al., J. Immunol.
151, pág. 2296 (1993); Chothia e Lesk, J. Mol. 196, 1987, pág. 901). Outro método utiliza uma região estrutural específica a partir da sequência de consenso de todos os anticorpos humanos de um subgrupo específico de cadeias leve ou pesada. A mesma região estrutural (framework) pode ser utilizada para diversos anticorpos humanizados diferentes (Carter et al, PNAS 89, pág. 4285 (1992); Presta et al, J. Immunol., 151, pág. 2623 (1993)).
[201] É adicionalmente importante que os anticorpos sejam humanizados mantendo a alta afinidade para receptores KIR3DL2 e outras propriedades biológicas favoráveis. Para atingir este objetivo, de acordo com um método, os anticorpos humanizados são preparados por meio de um processo de análise das sequências parentais e diversos produtos humanizados conceituais, utilizando modelos tridimensionais das sequências parental e humanizada. Modelos de imunoglobulina tridimensionais estão comumente disponíveis e são familiares para os técnicos do assunto.
Programas de computador estão disponíveis e mostram e ilustram a provável estrutura tridimensional de sequências de imunoglobulina candidatas selecionadas. A inspeção dessas exibições permite a análise da provável função dos resíduos no funcionamento da possível sequência de imunoglobulina, isto é, a análise de resíduos que influenciam a capacidade da imunoglobulina candidata de se ligar ao seu antígeno. Desta forma, os resíduos de FR podem ser selecionados e combinados a partir das sequências importada e de consenso, de forma que seja atingida a característica desejada do anticorpo, tal como maior afinidade para o(s) antígeno(s) alvo(s). Geralmente, os resíduos CDR estão diretamente e mais substancialmente envolvidos na influência da ligação aos antígenos.
[202] Outro método de preparação de anticorpos monoclonais humanos ou humanizados é o uso de camundongos geneticamente modificados para a imunização. Vários hospedeiros murinos que tiveram seus genes de imunoglobulina substituídos por genes de imunoglobulina humana funcional são conhecidos. Portanto, os anticorpos produzidos por esse camundongo ou em hibridomas preparados a partir das células B desse camundongo já são humanos ou humanizados. Animais exemplares são descritos na Patente Norte-Americana US 6.162.963 e em Jakobovitz et al., Nature 362 (1993) 255, que são incorporadas como referência. Os anticorpos humanos também podem ser produzidos de acordo com várias outras técnicas, tais como seleção de repertórios de anticorpos usando métodos de exibição em fagos. Essas técnicas são conhecidas pelos técnicos no assunto e podem ser implementadas a partir de anticorpos monoclonais, conforme descrito no presente pedido de patente.
[203] Um composto de ligação ao KIR3DL2, por exemplo, um anticorpo anti-KIR3DL2, pode ser adicionalmente ligado a uma segunda porção, em que o anticorpo é capaz de entregar a segunda porção a uma célula que expressa KIR3DL2. Opcionalmente, a segunda porção é um agente terapêutico, um agente tóxico e/ou um agente detectável.
[204] Embora seja esperado que os anticorpos na forma não derivatizada ou não modificada, particularmente do tipo IgG1 ou IgG3, inibam a proliferação de células superproliferantes ou sejam citotóxicos para células superproliferantes, como as de um paciente com PTCL, por exemplo, direcionando ADCC, ADCP e/ou CDC contra as células PTCL que expressam KIR3DL2, também é possível preparar imunoconjugados de anticorpos derivados que são citotóxicos. Em um exemplo de realização, uma vez que os anticorpos específicos para KIR3DL2 são isolados e opcionalmente modificados de outra forma (por exemplo, humanizados), eles serão derivatizados para torná-los tóxicos para as células. Desta forma, a administração do anticorpo a pacientes com PTCL levará à ligação relativamente específica do anticorpo às células em proliferação excessiva, matando ou inibindo diretamente as células subjacentes ao distúrbio.
[205] Em vista da capacidade dos anticorpos anti-KIR3DL2 de induzir a ADCC e CDC, os anticorpos também podem ser feitos com modificações que aumentam sua capacidade de se ligar a receptores Fc que podem afetar funções efetoras, como citotoxicidade dependente de anticorpos, desgranulação de mastócitos e fagocitose, bem como sinais imunomoduladores, como regulação da proliferação de linfócitos e secreção de anticorpos. As modificações típicas incluem regiões constantes de IgG1 humana modificada compreendendo pelo menos uma modificação de aminoácido (por exemplo, substituição, deleções, inserções) e/ou tipos alterados de glicosilação, por exemplo, hipofucosilação.
[206] Os anticorpos anti-KIR3DL2 podem compreender um domínio Fc (ou porção do mesmo) do isotipo IgG1 ou IgG3 humano, opcionalmente modificado.
[207] Em certos exemplos de realização, um domínio CH2 e/ou CH3 (ou domínio Fc compreendendo o mesmo) pode compreender uma ou mais modificações de aminoácidos (por exemplo, substituições de aminoácidos) que aumentam a ligação ao CD16 humano e, opcionalmente, outro receptor, como FcRn. Opcionalmente, as modificações não irão diminuir substancialmente ou abolir a capacidade do polipeptídeo derivado de Fc de se ligar ao receptor Fc neonatal (FcRn), por exemplo, FcRn humano. As modificações típicas incluem regiões constantes derivadas de IgG1 humana modificada compreendendo pelo menos uma modificação de aminoácido (por exemplo, substituição, deleções, inserções) e/ou tipos alterados de glicosilação, por exemplo, hipofucosilação. Essas modificações podem afetar a interação com os receptores de Fc: FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) e FcγRIII (CD16). FcγRI (CD64), FcγRIIA (CD32A) e FcγRIII (CD16) são ativados (isto é, há um aumento no sistema imunológico), enquanto os receptores FcγRIIB (CD32B) são receptores de inibição (isto é, redução do sistema imunológico). A modificação pode, por exemplo, aumentar a ligação do domínio Fc ao FcγRIIIa de células efetoras (por exemplo, células NK) e/ ou diminuir a ligação ao FcγRIIB. Exemplos de modificações são fornecidos na publicação PCT WO2014/044686, cuja divulgação é incorporada ao presente por referência.
Mutações específicas (em domínios Fc de IgG1) que afetam (aumentam) a ligação ao FcγRIIIa ou FcRn também são apresentadas abaixo. Efeito da Isotipo Espécie Modificação Função Efetora modificação Ligação ao FcRn Meia-vida IgG1 Humana T250Q/M428L aumentada aumentada 1M252Y/S254T/T256E + Ligação ao FcRn Meia-vida IgG1 Humana H433K/N434F aumentada aumentada Ligação ao FcγRIIIa ADCC e CDC IgG1 Humana E333A aumentada aumentadas S239D/I332E ou Ligação ao FcγRIIIa IgG1 Humana ADCC aumentada S239D/A330L/I332E aumentada Ligação ao FcRn Meia-vida IgG1 Humana P257I/Q311 aumentada inalterada Razão Aumento da IgG1 Humana S239D/I332E/G236A FcγRIIa/FcγRIIb fagocitose por aumentada macrófagos
[208] Uma região Fc variante pode compreender pelo menos uma modificação de aminoácido (por exemplo, possuindo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou mais modificações de aminoácidos) no domínio CH2 e/ou CH3 da região Fc, em que a modificação aumenta a ligação a um polipeptídeo CD16 humano. Em outros exemplos de realização, uma região Fc compreende pelo menos uma modificação de aminoácido (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou mais modificações de aminoácidos) no domínio CH2 da região Fc dos aminoácidos 237-341, ou dentro da região de dobradiça inferior-CH2 que compreende os resíduos 231-341. Em alguns exemplos de realização, uma região Fc compreende pelo menos duas modificações de aminoácidos (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou mais modificações de aminoácidos), em que pelo menos uma dessas modificações está dentro a região CH3 e pelo menos uma dessas modificações está dentro da região CH2. Também estão incluídas as modificações de aminoácidos na região da dobradiça. Em um exemplo de realização, estão abrangidas as modificações de aminoácidos no domínio CH1, opcionalmente na região de dobradiça superior que compreende os resíduos 216-230 (numeração EU de Kabat). Qualquer combinação funcional adequada de modificações Fc pode ser feita, por exemplo, qualquer combinação das diferentes modificações Fc que são divulgadas em qualquer uma das Patentes Norte-Americanas de números US 7.632.497; US 7.521.542; US 7.425.619; US
7.416.727; US 7.371.826; US 7.355.008; US 7.335.742; US 7.332.581; US
7.183.387; US 7.122.637; US 6.821.505 e 6.737.056; e/ou nas publicações PCT WO2011/109400; WO 2008/105886; WO 2008/002933; WO 2007/021841; WO 2007/106707; WO 06/088494; WO 05/115452; WO 05/110474; WO 04/1032269; WO 00/42072; WO 06/088494; WO 07/024249; WO 05/047327; WO 04/099249 e WO 04/063351; e/ou em Lazar et al. (2006) Proc. Nat. Acad.
Sci. USA 103(11): 405-410; Presta, L.G. et al. (2002) Biochem. Soc. Trans.
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EXEMPLOS EXEMPLO 1
ESTUDOS DE COMBINAÇÃO IN VITRO COM AGENTES QUIMIOTERÁPICOS
[209] Sabe-se que os agentes quimioterápicos podem afetar negativamente o sistema imune do hospedeiro e, consequentemente, inibir a eficácia dos anticorpos terapêuticos que medeiam a ADCC. Consequentemente, os inventores do presente pedido procuraram avaliar se agentes quimioterápicos afetam a atividade de ADCC mediada por células NK do anticorpo humanizado 2B12 lacutamabe do isotipo IgG1 humano e as sequências de aminoácidos de VH e VL mostradas nas SEQ ID NOs: 49 e 44, respectivamente. Os agentes quimioterápicos foram adicionados, sozinhos ou em combinação, em um ensaio de citotoxicidade celular (ADCC) in vitro com células NK alogênicas e linhagem de células da Síndrome de Sézary que expressa KIR3DL2 (Hut78), na presença de concentrações crescentes do anticorpo anti-KIR3DL2.
[210] Os resultados são exibidos na Figura 1. Neste cenário experimental, nem a gemcitabina nem a oxaliplatina interferiram com a ADCC induzida pelo anticorpo anti-KIR3DL2 contra a linhagem celular HUT78 CTCL.
Na verdade, a atividade antitumoral anti-KIR3DL2 foi surpreendentemente aumentada pela gemcitabina e oxaliplatina, e ainda mais pela combinação de gemcitabina e oxaliplatina.
EXEMPLO 2 A GEMCITABINA E A OXALIPLATINA AUMENTAM, CADA UMA, A EXPRESSÃO DE KIR3DL2
[211] A fim de estudar as possíveis razões para o aumento da ADCC induzida pelo anticorpo anti-KIR3DL2 contra a linhagem de células HUT78 CTCL, avaliamos se a expressão de KIR3DL2 poderia ser modulada pelos mesmos agentes de quimioterapia in vitro.
[212] Resumidamente, células Hut78 (linhagem de células da Síndrome de Sézary) ou células RAJI-KIR3DL2 (linhagem de células RAJI B- NHL transfectadas com KIR3DL2 humano) foram incubadas com doses crescentes de gemcitabina e oxaliplatina. A mediana da intensidade de fluorescência de KIR3DL2 na superfície da linhagem de células tumorais foi analisada por citometria de fluxo.
[213] Os resultados são exibidos na Figura 2. As células RAJI- KIR3DL2 são mostradas no Painel A (lado esquerdo) e as células Hut78 são mostradas no Painel B (lado direito). Tanto a oxaliplatina quanto a gemcitabina aumentam a expressão de superfície KIR3DL2, em ambas as linhagens de células, de uma forma dependente da dose, até um patamar de 2 a 3 vezes em comparação com a linha basal (Figura 2). Estas figuras são representativas de dois experimentos independentes. É importante notar que outros agentes quimioterápicos, como a ciclofosfamida, não aumentaram a expressão de KIR3DL2 nas mesmas condições experimentais.
[214] Em conjunto, estes resultados suportam a exploração da combinação do anticorpo anti-KIR3DL2 com gemcitabina e oxaliplatina, particularmente em pacientes com recidiva de PTCL que podem ter uma necessidade particular de tratamentos melhorados.
EXEMPLO 3
EFICÁCIA IN VIVO
[215] Um modelo de xenoenxerto no camundongo CB17-SCID imunocomprometido que retém células NK e macrófagos totalmente funcionais.
Além disso, os receptores Fc de camundongo ligam-se efetivamente ao Fc humano, permitindo que as células efetoras murinas sejam recrutadas por mAb humanizado e realizem a ADCC ou ADCP in vivo. A linhagem de células B- NHL RAJI foi transfectada para expressar estavelmente KIR3DL2 (RAJI- KIR3DL2) e os transfectantes foram inoculados (5x10 6 células) nos camundongos SCID por I.V., proporcionando assim um modelo de tumor disseminado. Inicialmente, doses individuais de gemcitabina e oxaliplatina foram estabelecidas neste modelo de xenoenxerto. No entanto, embora a gemcitabina e a oxaliplatina possam ser usadas juntas em humanos, não foi possível encontrar doses de gemcitabina e oxaliplatina que pudessem ser combinadas para fornecer substâncias ativas, mas toleradas nesses camundongos. Consequentemente, o anticorpo anti-KIR3DL2 (lacutamabe) foi combinado com gemcitabina ou oxaliplatina separadamente.
[216] Neste modelo de tumor disseminado (n = 9 camundongos por grupo), os grupos de camundongos foram tratados duas vezes por semana com os seguintes tratamentos: - anticorpo monoclonal (mAb) de controle isotípico, - anticorpo anti-KIR3DL2 (lacutamabe), - gemcitabina (50 mg/kg) - oxaliplatina (5 mg/kg), - anticorpo anti-KIR3DL2 (lacutamabe) + gemcitabina (50 mg/kg), ou - anticorpo anti-KIR3DL2 (lacutamabe) + oxaliplatina (5 mg/kg).
[217] Tanto o anticorpo anti-KIR3DL2 quanto o controle isotípico foram administrados a 0,3 µg por injeção.
[218] Os resultados são exibidos na Figura 3. A combinação de anticorpo anti-KIR3DL2 e oxaliplatina foi pelo menos tão ativa quanto o anticorpo anti-KIR3DL2 sozinho (oxaliplatina teve efeito antitumoral muito limitado, se é que teve algum, quando usada isoladamente no modelo).
Curiosamente, o anticorpo anti-KIR3DL2 e a gemcitabina mostraram atividade antitumoral sinérgica in vivo. Os camundongos tratados com anticorpo anti- KIR3DL2 e gemcitabina tiveram uma sobrevida significativamente melhorada em comparação com camundongos tratados com cada agente separadamente.
Os efeitos exibidos acima foram reproduzidos em 2 experimentos independentes, com 9 camundongos por grupo de cada vez.
[219] Estes resultados, juntamente com dados de combinação in vitro e potencial indução de KIR3DL2 por gemcitabina e oxaliplatina, suportam a combinação terapêutica de anticorpos anti-KIR3DL2 com gemcitabina e oxaliplatina em pacientes com TCL. Embora a combinação com o 2B12 humanizado tenha sido particularmente potente como um tratamento anticâncer, a capacidade da gemcitabina e/ou oxaliplatina de aumentar a expressão de KIR3DL2 também pode ser útil para o propósito de aumentar anticorpos antitumorais que sozinhos são menos potentes do que o 2B12. As combinações podem ser particularmente eficazes em pacientes com recidiva de PTCL.
[220] Todas as referências, incluindo publicações, pedidos de patente e patentes, mencionados na presente invenção são integralmente incorporados ao presente por referência e na mesma medida como se cada referência fosse individual e especificamente indicada como incorporada por referência e fossem aqui descritas integralmente (até a extensão máxima permitida por lei), independentemente de qualquer incorporação fornecida separadamente de documentos específicos realizada em outros pontos do presente pedido.
[221] A menos que de outra forma indicado, todos os valores exatos fornecidos no presente são representativos de valores aproximados correspondentes (por exemplo, todos os exemplos de valores exatos fornecidos com relação a um fator ou medição específica podem ser considerados como também fornecendo medição aproximada correspondente, modificada por “cerca de”, quando apropriado).
[222] A descrição de qualquer aspecto ou realização na presente invenção, utilizando expressões como “que compreende”, “que possui”, “que inclui” ou “que contém”, com referência a um ou mais elementos, destina-se a fornecer apoio para um aspecto ou exemplo de realização similar da presente invenção que “consiste de”, “consiste essencialmente de” ou “compreende substancialmente” daquele(s) elemento(s) específico(s), a menos que indicado em contrário ou em clara contradição pelo contexto (por exemplo, uma composição descrita no presente pedido como compreendendo um elemento específico deverá ser compreendida como também descrevendo uma composição que consiste daquele elemento, a menos que indicado de outra forma ou em clara contradição pelo contexto).
[223] O uso de todo e qualquer exemplo ou linguagem exemplificativa (por exemplo, “tal como”) fornecido no presente documento pretende simplesmente ilustrar melhor a presente invenção e não representa uma limitação sobre o escopo da presente invenção, a menos que de outro modo reivindicado. Nenhuma expressão ou linguagem no presente relatório descritivo deverá ser interpretada como indicando qualquer elemento não reivindicado como essencial para a prática da presente invenção.

Claims (15)

REIVINDICAÇÕES
1. ANTICORPO que se liga a um polipeptídeo KIR3DL2, para uso no tratamento de um TCL, caracterizado pelo anticorpo ser usado em combinação com a gemcitabina e um agente de platina.
2. ANTICORPO para uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela gemcitabina ser administrada em uma dose de 800–1.000 mg/m2 uma vez a cada duas semanas e a oxaliplatina ser administrada em uma dose de 75–100 mg/m2 uma vez a cada duas semanas.
3. ANTICORPO para uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela gemcitabina ser administrada em uma dose de 800–1.000 mg/m2 uma vez a cada duas semanas e a oxaliplatina ser administrada em uma dose de 75–130 mg/m2 uma vez a cada três semanas.
4. ANTICORPO para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo anticorpo ser administrado de uma vez por semana a uma vez a cada quatro semanas.
5. ANTICORPO para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo anticorpo ser administrado uma vez por semana, em que, opcionalmente, o anticorpo é administrado uma vez por semana em uma primeira fase seguida por uma segunda fase na qual o anticorpo é administrado uma vez a cada duas semanas ou uma vez por mês.
6. ANTICORPO para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicação anteriores, caracterizado pelo TCL ser um linfoma de células T periféricas (PTCL), de preferência leucemia de células T adultas (ATL), linfoma de células T associado à enteropatia (EATL), PTCL-NOS ou linfoma anaplásico de grandes células (ALCL).
7. ANTICORPO para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo anticorpo ser administrado em uma dose de 1-20 mg/kg, opcionalmente uma dose de 750 mg.
8. ANTICORPO para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo anticorpo ser administrado em um regime que compreende pelo menos um ciclo de administração, em que para cada um do pelo menos um ciclo de administração, duas, três ou quatro doses do anticorpo anti-KIR3DL2 são administradas, e pelo menos duas, três ou quatro doses de gemcitabina são administradas, e opcionalmente oxaliplatina é administrada, em que a gemcitabina é administrada em uma dose de 800–
1.000 mg/m2 uma vez a cada duas semanas e em que a oxaliplatina é administrada em uma dose de 75–130 mg/m2 uma vez a cada duas semanas.
9. ANTICORPO para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo tratamento de um TCL em um indivíduo compreender: a) determinar o status do polipeptídeo KIR3DL2 em células malignas dentro do indivíduo com TCL, e b) após a determinação de que o indivíduo tem polipeptídeo KIR3DL2 expresso na superfície de células malignas, administrar ao indivíduo o anticorpo que se liga a um polipeptídeo KIR3DL2 em combinação com o agente de platina e gemcitabina.
10. ANTICORPO para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo anticorpo que se liga a um polipeptídeo KIR3DL2 compreender: (a) um domínio VH compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 85% idêntica a uma VH de 2B12 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 48-51, e (b) um domínio VL compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 85% idêntica a uma VL de 2B12 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 43-47.
11. ANTICORPO para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo anticorpo que se liga a um polipeptídeo KIR3DL2 compreender: (a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 49, e (b) uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 44 ou 45.
12. ANTICORPO para uso, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 26, caracterizado pelo referido anticorpo KIR3DL2 e o referido agente de platina e gemcitabina serem administrados de forma simultânea, separada, ou sequencial.
13. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA compreendendo gemcitabina e um agente de platina, caracterizada por ser para uso no tratamento de um TCL, em combinação com um anticorpo que se liga a um polipeptídeo KIR3DL2 e é capaz de depletar células que expressam KIR3DL2.
14. KIT, caracterizado por compreender uma composição farmacêutica contendo um anticorpo anti-KIR3DL2, uma composição farmacêutica contendo um agente de platina, preferencialmente oxaliplatina, e uma composição farmacêutica contendo gemcitabina;
15. MÉTODO PARA PREDIZER OU AVALIAR A EFICÁCIA ou adequação de um agente anticâncer para uso combinado com um anticorpo que se liga a um polipeptídeo KIR3DL2 para o tratamento de um TCL, caracterizado por compreender a etapa de determinar ou avaliar se o agente anticâncer é capaz de induzir ou aumentar a expressão de KIR3DL2 na superfície de uma célula T maligna; em que a determinação de que o agente anticâncer é capaz de induzir ou aumentar a expressão de KIR3DL2 na superfície de uma célula T maligna indica que o agente pode ser usado para o tratamento do câncer em combinação com um anticorpo anti-KIR3DL2.
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