BR112020008438A2

BR112020008438A2 - anticorpos e métodos de uso

Info

Publication number: BR112020008438A2
Application number: BR112020008438-7A
Authority: BR
Inventors: Arnima BISHT; Rachel Dusek; Haining Huang; Chuck HANNUM; James Ackroyd; Livija DEBAN
Original assignee: Oxford Biotherapeutics Ltd
Priority date: 2017-11-02
Filing date: 2018-11-01
Publication date: 2020-10-20
Also published as: US20200262927A1; CA3079313A1; JP2021501583A; WO2019086878A1; IL274376A; CN111295395A; JP7430137B2; KR20200074127A; MX2020004431A; AU2018361819A1; US11673963B2; EP3704154A1; ZA202002144B

Abstract

São divulgados aqui anticorpos direcionados contra CRTAM, ácidos nucleicos que codificam esses anticorpos, células hospedeiras que compreendem esses ácidos nucleicos que codificam o anticorpo, métodos para a preparação de anticorpos anti-CRTAM e métodos para o tratamento de doenças, por exemplo, cânceres humanos, incluindo mas não limitado a câncer de pulmão de pequenas células, câncer de pulmão de células não pequenas (incluindo carcinomas escamosos e adenocarcinomas) câncer de pele, incluindo melanoma, câncer de mama (incluindo TNBC), câncer colorretal, câncer gástrico, câncer de ovário, câncer cervical, câncer de próstata, câncer de rim, câncer de fígado, incluindo carcinoma hepatocelular, câncer pancreático, câncer de cabeça e pescoço, câncer nasofaríngeo, câncer de esôfago, câncer de bexiga e outros cânceres uroepiteliais, câncer de estômago, glioma, glioblastoma, testículo, tireoide, osso, vesícula biliar e dutos biliares, cânceres de útero e de adrenais, sarcomas, GIST, tumores neuroendócrinos e neoplasias hematológicas.

Description

“ANTICORPOS E MÉTODOS DE USO” CAMPO DA INVENÇÃO

[0001] A presente invenção refere-se a anticorpos que são capazes de se ligar a uma proteína CRTAM e usos dos mesmos.

INTRODUÇÃO

[0002] Os aspectos da invenção incluem anticorpos e outras proteínas terapêuticas direcionadas contra CRTAM, ácidos nucleicos que codificam esses anticorpos e proteínas terapêuticas, métodos para preparar anticorpos e outras proteínas terapêuticas e métodos para o tratamento de doenças, como cânceres, usando anticorpos e outras proteínas terapêuticas direcionadas contra CRTAM.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0003] O antígeno alvo, CRTAM, é uma proteína de membrana tipo | de passagem única da família das nectinas com domínios lg do tipo V e C1 (Yeh et al., Cell. 7 de março de 2008; 132 (5): 846-5). O gene foi identificado pela primeira vez em células NKT ativadas em camundongos e humanos (Kennedy et al., J Leukoc Biol. maio de 2000; 67 (5): 725 a 734) com estudos subsequentes que mostram sua expressão sendo fortemente regulada pela ativação e restrita às células restritas ao MHC de classe | ativadas, incluindo células T NKT e CD8 (Patiho-Lopez et al., J. Neuroimmunol. Fevereiro de 2006; 171 (1-2): 145 a 155).

[0004] O único ligante conhecido de CRTAM é Necl2 (Galibert et al., J Biol Chem. 10 de junho de 2005; 280 (23): 21955 a 21964), e acredita-se que a interação entre o ligante e o receptor seja preferida em relação às interações homofílicas de qualquer molécula (Zhang et al., Structure. 6 de agosto de 2013; 21 (8): 1430 a 1439). A interação CRTAM-Necl2 é proposta para ajudar a estabelecer uma sinapse imune madura e melhorar a estimulação de células T por APCs não profissionais. Essa função também foi observada nas células NK, onde os anticorpos direcionados ao CRTAM estimularam a citotoxicidade das células NK (Boles et al., Blood. 1 de agosto de 2005; 106 (3):

779 a 786) O documento WOZ2009/029883 divulga que o CRTAM é supraregulado em um conjunto específico de células T e regula seletivamente certas citocinas, incluindo IFNy, 1122 e IL17. O documento WO2016/154341 divulga que os anticorpos anti-cCRTAM agonísticos podem ser úteis para o tratamento de câncer, aumentando a capacidade ADCC de células efetoras imunes, como células NK.

SUMÁRIO

[0005] Aspectos da invenção incluem anticorpos específicos direcionados contra CRTAM, ácidos nucleicos que codificam esses anticorpos da invenção, células hospedeiras que compreendem esses ácidos nucleicos que codificam um anticorpo da invenção, métodos para a preparação de anticorpos anticCRTAM e métodos para o tratamento de doenças, por exemplo, cânceres humanos, incluindo mas não se limitando a câncer de pulmão de células pequenas, câncer de pulmão de células não pequenas (incluindo carcinomas e adenocarcinomas escamosas) câncer de pele, incluindo melanoma, câncer de mama (incluindo TNBC), câncer colorretal, câncer gástrico, câncer de ovário, câncer cervical, câncer de próstata, câncer de rim, câncer de fígado, incluindo carcinoma hepatocelular, câncer de pâncreas, câncer de cabeça e pescoço, câncer nasofaríngeo, câncer de esôfago, câncer de bexiga e outros cânceres uroepiteliais e câncer de estômago, glioma, glioblastoma, testículo, tireoide, osso, vesícula biliar e dutos biliares, câncer de útero, de adrenal, sarcomas, GIST, tumores neuroendócrinos e neoplasias hematológicas.

[0006] Aqui descrito, é fornecido um anticorpo que se liga ao CRTAM (SEQ ID NO: 11). De preferência, o dito anticorpo se liga ao domínio extracelular de CRTAM (SEQ ID NO: 12). Aspectos da invenção incluem um anticorpo, ou um fragmento de ligação a antígeno, que se liga a um epítopo da proteína CRTAM reconhecido por um anticorpo aqui descrito, ou que concorre cruzadamente pela ligação com um anticorpo aqui descrito e que preferencialmente retém pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%,

pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98% ou pelo menos cerca de 99% da afinidade de ligação ao CRTAM humano de um anticorpo aqui descrito. Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo isolado.

[0007] Os aspectos da invenção incluem um anticorpo, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que se liga ao CRTAM, o dito anticorpo que compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende: uma sequência de CDR-H1 que compreende a sequência da SEQ ID NO: 5; uma sequência de CDR-H2 que compreende SEQ ID NO: 6; e uma sequência de CDR-H3 que compreende a sequência da SEQ ID NO: 7. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende ainda uma região variável da cadeia leve que compreende pelo menos uma sequência de CDR selecionada do grupo que consiste em: CDR-L1 que compreende qualquer uma das sequências da SEQ ID NO: 8 ou SEQ ID NO: 15; CDR-L2 que compreende a sequência da SEQ ID NO: 9; e CDR-L3 que compreende qualquer uma das sequências da SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO:

16.

[0008] Em algumas modalidades, o anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que se liga ao CRTAM compreende uma região variável da cadeia pesada e uma região variável da cadeia leve que compreende uma das 4 combinações de CDRs da cadeia pesada e leve, como mostrado na Tabela 1.

TABELA 1 | | er dessiaramáterdo | CDRs de região variável de cadeia pesada cadeia leve TER Ec

NO: 5 NO: 6 NO: 7 NO: 8 NO: 9 NO: 10 NO: 5 NO: 6 NO: 7 NO: 15 NO: 9 NO: 16 NO: 5 NO: 6 NO: 7 NO: 8 NO: 9 NO: 16 NO: 5 NO: 6 NO: 7 NO: 15 NO: 9 NO: 10

[0009] Em algumas modalidades preferidas, o anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que se liga ao CRTAM compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende uma CDR-H1 que compreende a SEQ ID NO: 5; um CDR-H2 que compreende SEQ ID NO: 6; e um CDR-H3 que compreende a SEQ ID NO: 7; e uma região variável de cadeia leve que compreende um CDR-L1 que compreende SEQ ID NO: 8; uma CDR-L2 que compreende SEQ ID NO: 9; e um CDR-L3 que compreende SEQ ID NO: 10.

[0010] Em outra modalidade preferida, o anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que se liga ao CRTAM compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende uma CDR- H1 que compreende a SEQ ID NO: 5; um CDR-H2 que compreende SEQ ID NO: 6; e um CDR-H3 que compreende SEQ ID NO: 7; e uma região variável de cadeia leve que compreende um CDR-L1 que compreende SEQ ID NO: 15; um CDR-L2 que compreende SEQ ID NO: 9; e um CDR-L3 que compreende a SEQ ID NO: 16.

[0011] Em um aspecto adicional, os anticorpos, ou fragmentos de ligação ao antígeno do mesmo, da invenção compreendem CDRs variáveis em comparação com o anticorpo parental aqui descrito. Assim, a invenção fornece anticorpos variantes, ou fragmentos de ligação ao antígeno do mesmo, que compreendem regiões variáveis variantes de um anticorpo parental, em que o anticorpo parental, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende: uma sequência CDR-H1 que compreende a sequência da SEQ ID NO: 5; uma sequência de CDR-H2 que compreende a sequência da SEQ ID NO: 6; e uma sequência de CDR-H3 que compreende a sequência da SEQ ID NO: 7; e uma região variável de cadeia leve que compreende um CDR-L1 que compreende a sequência da SEQ ID NO: 15; CDR-L2 que compreende a sequência da SEQ ID NO: 9; e CDR-L3 que compreende a sequência da SEQ ID NO: 16, e em uma modalidade o anticorpo variante, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, tem 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 substituições, adições e ou deleções de aminoácidos em qualquer um ou mais de; ou 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 substituições, adições e/ou deleções de aminoácidos coletivamente; o conjunto de CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3, com 1a 5o0u1a 4 ou 1 a 3 substituições ou adições ou exclusões de uso particular e em que o anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, retém a ligação específica ao CRTAM. Preferencialmente, as variações são substituições, preferencialmente, as substituições são substituições conservativas ou substituições para reverter um aminoácido na região variável de volta ao aminoácido correspondente da germinativa humana. Em uma outra modalidade, o anticorpo variante, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, da invenção compreende: uma sequência de CDR-H1 que compreende a sequência da SEQ ID NO: 5; uma sequência de CDR-H2 que compreende a sequência da SEQ ID NO: 6; e uma sequência de CDR-H3 que compreende a sequência da SEQ ID NO: 7; e uma região variável da cadeia leve que compreende uma CDR-L1 que compreende a sequência da SEQ ID NO: 15; CDR-L2 que compreende a sequência da SEQ ID NO: 9; e CDR-L3 que compreende a sequência da SEQ ID NO: 16, em que uma ou mais das referidas sequências de CDR são alteradas de modo que sejam cerca de 70, 75, 80, 85, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% idênticas à sequência parental correspondente da CDR recitada acima.

[0012] Em algumas modalidades, é fornecido um anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compreende uma região variável de cadeia pesada descrita na SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO:

13, ou uma sequência que é cerca de 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% idêntica à SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 13 e/ou uma região variável de cadeia leve descrita em SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 14, ou uma sequência que é cerca de 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% idêntica à SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 14,. Em outras modalidades, é fornecido um anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 substituições, adições e/ou deleções de aminoácidos em comparação com a SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 13 e/ou uma região variável da cadeia leve que compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 substituições de aminoácidos em comparação com a SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 14. Preferencialmente, substituições, mais preferencialmente substituições conservativas.

[0013] Será ainda aparente que as substituições, adições e/ou deleções de aminoácidos podem estar dentro das regiões estruturais e/ou dentro das CDRs.

[0014] Em uma modalidade, é fornecido um anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência da SEQ ID NO: 1 e uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência da SEQ ID NO: 2.

[0015] Em uma modalidade, é fornecido um anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência da SEQ ID NO: 13 e uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência da SEQ ID NO: 14.

[0016] Em uma modalidade, é fornecido um anticorpo de comprimento total que compreende uma sequência de cadeia pesada que compreende SEQ ID NO: 17 e uma sequência de cadeia leve que compreende SEQ ID NO: 18.

[0017] Em um aspecto adicional da presente invenção, é fornecido um anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que se liga especificamente a CRTAM, o dito anticorpo que compreende as 3 CDRs de cadeia pesada da SEQ ID NO: 1 ou SEQID NO: 13 e as 3 CDRs de cadeia leve da SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 14 em que as CDRs são definidas pelo sistema de numeração Kabat ou Chothia. Preferencialmente, o dito anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que se liga especificamente ao CRTAM, compreende as 3 CDRs de cadeia pesada da SEQ ID NO: 13 e as 3 CDRs de cadeia leve ou SEQ ID NO: 14 definidas pela numeração de Kabat ou Chothia sistema.

[0018] SEQ ID NOs: 13 a 18 são sequências de anticorpos humanizados com base nas sequências das SEQ ID Nos: 162. O versado compreenderia prontamente que as SEQ ID Nos: 17 a 18 são sequências de cadeia pesada e leve de comprimento total, incluindo as regiões que não sejam as regiões variáveis necessárias para produzir um anticorpo funcional de comprimento total, isto é, as regiões constante e Fc. O versado compreenderá que as sequências são humanizadas substituindo aminoácidos da região variável do organismo em que o anticorpo é produzido com aminoácidos da sequência da linha germinativa humana, em um esforço para minimizar os efeitos imunogênicos dos anticorpos quando estes são administrados a seres humanos. A maioria das substituições de aminoácidos ocorre na região estrutural, no entanto, vários aminoácidos das CDRs, que ocorrem em posições não críticas, podem ser substituídos; essas substituições são de preferência conservativas por natureza ou revertem um aminoácido em uma posição particular ao aminoácido presente na germinativa humana correspondente. No presente caso, os aminoácidos das CDRs que foram substituídos foram identificados usando modelos estruturais para discriminar entre resíduos paratópicos e não paratópicos na região CDR. Isso permite que os anticorpos sejam humanizados em um grau mais alto do que por enxerto simples de CDR.

[0019] Na presente invenção, a SEQ ID NO: 14 compreende 3 substituições de aminoácidos na CDR 1 (SEQ ID NO: 15) quando comparada à CDR1 da SEQ ID NO: 2 (SEQ ID NO: 8). Especificamente, há uma substituição de VS na posição 1 da SEQ ID NO: 8; uma substituição EV na posição 4 da SEQ ID NO: 8; e uma substituição de VA na posição 10 da SEQ ID NO: 8. A SEQ ID NO: 14 compreende ainda 1 substituição de aminoácidos na CDR3 (SEQ ID NO: 16) quando comparada à CDR3 da SEQ ID NO: 2 (SEQ ID NO: 10). Especificamente, há uma substituição de SA na posição 5 da SEQ ID NO: 10.

[0020] Será entendido pelo versado que essas sequências humanizadas não representam anticorpos diferentes e alternativos quando comparadas com o anticorpo parental, mas se relacionam com o mesmo anticorpo com as mesmas características que foram apenas alteradas para corresponder mais de perto à germinativa humana usando modelagem estrutural para minimizar a imunogenicidade.

[0021] Em algumas modalidades, o anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno possui uma afinidade de ligação (Ko) de 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, 1 NM ou menos, em uma modalidade preferida, a afinidade de ligação é 0,75nM, 0,5 nM ou menos.

[0022] Em algumas modalidades, o anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno, da invenção é um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno que compete pela ligação ao CRTAM com seu ligante necl2.

[0023] Em algumas modalidades, um anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno, é um anticorpo monocilonal. Em algumas modalidades, um anticorpo é um anticorpo quimérico, humanizado ou humano. Em algumas modalidades, uma região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de estrutura. Em algumas modalidades, pelo menos uma porção da sequência de estrutura compreende uma sequência de estrutura de consenso humano. Em algumas modalidades, uma região variável de cadeia leve compreende uma sequência de estrutura. Em algumas modalidades, pelo menos uma porção da sequência de estrutura compreende uma sequência de estrutura de consenso humano.

[0024] Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno é uma variante de Fc modificada geneticamente para aumentar a ligação a FcgRIla. Em uma modalidade preferida, a variante Fc compreende substituições de aminoácidos S267E e/ou L328F. Em uma modalidade, o Fc é uma região IgG1 Fc. Em uma outra modalidade, o Fc é uma região IgG4 Fc. Em uma modalidade preferida, quando a região Fc é uma região IgG4 Fc, a região Fc compreenderá ainda uma substituição S228P. Em uma modalidade, a cadeia pesada compreende uma sequência que compreende SEQ ID NO: 17.

[0025] Em algumas modalidades, o anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno, é um anticorpo IgG1 modificado geneticamente e silenciado por Fc ou fragmento de ligação ao antígeno com ligação reduzida ou inexistente a um ou mais receptores Fc. Em outra modalidade, o anticorpo é um anticorpo I9G4.

[0026] Em algumas modalidades, o anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno, é um anticorpo biespecífico ou fragmento de ligação ao antígeno que media a citotoxicidade das células T e/ou citotoxicidade das células NK.

[0027] Em algumas modalidades, o anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno, é capaz de induzir e/ou melhorar a ativação de uma célula imune. Em uma modalidade, a célula imune é preferencialmente uma célula T. Em outra modalidade, a célula imune é preferencialmente uma célula NK. O versado entenderá que o termo indução e/ou aumento pode se referir à indução e/ou aumento da liberação de citocinas por uma célula imune e/ou indução e/ou aumento da proliferação da dita célula imune e/ou indução e/ou aumento da atividade de morte celular. Será prontamente aparente para o versado que o termo induzir ou indução, conforme usado no presente contexto, significa causar a ativação de uma célula imune ou aumentar a ativação de uma célula imune acima do nível de ativação observado na ausência do anticorpo ou antígeno fragmento de ligação. O termo aprimoramento usado no presente contexto refere-se ao aumento do nível de ativação de uma célula imune já ativada.

[0028] Em algumas modalidades, o anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno, é um anticorpo biespecífico ou multiespecífico ou fragmento de ligação ao antígeno que se liga a uma proteína CRTAM e se liga a um ou mais alvos de ligação adicionais, de preferência os ditos alvos de ligação adicionais são um ou mais antígenos tumorais. Em uma modalidade adicional, um ou mais alvos de ligação adicionais são moléculas imunomoduladoras.

[0029] Em algumas modalidades, um fragmento de ligação ao antígeno é selecionado a partir do grupo que consiste em: Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, Fv, scFv, dAb e anticorpo de domínio único.

[0030] Em outro aspecto da presente invenção, é fornecido um ou mais ácidos nucleicos que codificam uma cadeia pesada de um anticorpo da invenção e/ou uma cadeia leve de um anticorpo da invenção. Será entendido que as cadeias pesada e leve do anticorpo da invenção podem ser codificadas em conjunto em uma única molécula de ácido nucleico ou por duas moléculas separadas de ácido nucleico.

[0031] Em outro aspecto, são fornecidos vetores que compreendem um ou mais dos ácidos nucleicos da invenção.

[0032] Em outro aspecto da presente invenção, é fornecida uma célula hospedeira que contém um ou mais ácidos nucleicos que codificam a cadeia pesada e/ou leve, ou ambas, dos anticorpos da invenção. Em algumas modalidades, a dita célula hospedeira é cultivada sob condições em que o ácido (ou ácidos) nucleico é expresso. Em outras modalidades, é fornecido um método de recuperação do anticorpo da invenção.

[0033] Os aspectos da invenção incluem métodos para fabricar um anticorpo, ou um fragmento de ligação a antígeno, os métodos que compreendem a cultura de uma célula hospedeira sob condições em que o anticorpo, ou o fragmento de ligação a antígeno, é expresso na célula hospedeira e, opcionalmente, o isolamento do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno.

[0034] Aspectos da invenção incluem composições farmacêuticas que compreende um anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno, como aqui descrito, e um veículo farmaceuticamente aceitável.

[0035] Em algumas modalidades, uma composição farmacêutica ou medicamento compreende ainda uma quantidade eficaz de um segundo agente terapêutico.

[0036] Em um aspecto adicional da presente invenção, é fornecido um método de tratamento de um distúrbio, sendo que o dito método compreende a administração a um paciente em necessidade de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno da invenção que se liga ao CRTAM (SEQ ID NO: 11). Em uma modalidade, o distúrbio é câncer.

[0037] Em um aspecto adicional, é fornecido um método de tratamento de câncer que compreende a administração de uma quantidade eficaz de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno da invenção a um sujeito em necessidade.

[0038] Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende uma CDR-H1 que compreende a SEQ ID NO: 5; uma CDR-H2 que compreende SEQ ID NO: 6 e uma CDR-H3 que compreende SEQ ID NO: 7 e uma região variável de cadeia leve que compreende uma CDR-1 que compreende SEQ ID NO: 8 ou SEQ ID NO: 15, uma CDR-L2 que compreende SEQ ID NO: 9 e um CDR-L3 que compreende SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO:

16. Preferencialmente, a região variável de cadeia leve compreende uma CDR- 1 que compreende SEQ ID NO: 15, uma CDR-L2 que compreende SEQ ID NO: 9 e uma CDR-L3 que compreende SEQ ID NO: 16.

[0039] Em algumas modalidades, é fornecido um método de tratamento de câncer, em que um paciente em necessidade do mesmo é administrado com um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno da invenção e em que o dito anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno da invenção induz e/ou aprimora uma resposta imune, por exemplo, uma resposta de células T citotóxicas e/ou uma resposta de células NK.

[0040] Em algumas modalidades, o câncer é selecionado a partir do grupo que consiste em câncer de pulmão de células pequenas, câncer de pulmão de células não pequenas (incluindo carcinomas escamosos e adenocarcinomas), câncer de pele incluindo melanoma, câncer de mama (incluindo TNBC), câncer colorretal, câncer gástrico, câncer de ovário, câncer cervical, câncer de próstata, câncer de rim, câncer de fígado, incluindo carcinoma hepatocelular, câncer pancreático, câncer de cabeça e pescoço, câncer nasofaríngeo, câncer de esôfago, câncer de bexiga e outros cânceres uroepiteliais, câncer de estômago, glioma, glioblastoma, testículo, tireoide, osso, vesícula biliar e dutos biliares, câncer de útero, adrenal, sarcomas, GIST, tumores neuroendócrinos e neoplasias hematológicas.

[0041] De acordo com um aspecto adicional da invenção, é fornecido um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno da presente invenção para uso em profilaxia ou terapia.

[0042] Preferencialmente, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno é para uso na profilaxia ou terapia do câncer.

[0043] De acordo com um aspecto adicional da presente invenção, é fornecida o uso de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno de acordo com a presente invenção na fabricação de um medicamento para o tratamento de câncer.

[0044] Em algumas modalidades, o câncer de acordo com os aspectos anteriores é selecionado a partir do grupo que consiste em câncer de pulmão de células pequenas, câncer de pulmão de células não pequenas (incluindo carcinomas escamosos e adenocarcinomas) câncer de pele incluindo melanoma, câncer de mama (incluindo TNBC), câncer colorretal, câncer gástrico, câncer de ovário, câncer de colo do útero, câncer de próstata, câncer de rim, câncer de fígado, incluindo carcinoma hepatocelular, câncer pancreático, câncer de cabeça e pescoço, câncer nasofaríngeo, câncer de esôfago, câncer de bexiga e outros cânceres uroepiteliais, câncer de estômago, glioma, glioblastoma, testicular, tireoide, osso, vesícula biliar e dutos biliares, câncer de útero, adrenal, sarcomas, GIST, tumores neuroendócrinos e neoplasias hematológicas.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0045] A Figura la mostra a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada do anticorpo parental 5A11 (SEQ ID NO: 1).

[0046] A Figura 1b mostra a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve do anticorpo parental SA11 (SEQ ID NO: 2).

[0047] A Figura 2a mostra a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada do anticorpo humanizado 5A11 (SEQ ID NO: 13).

[0048] A Figura 2b mostra a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve do anticorpo humanizado 5A11 (SEQ ID NO: 14).

[0049] A Figura 3 mostra a ligação específica relacionada à dose do anticorpo 5A11 e o anticorpo anti-cCRTAM CR24.1 disponível comercialmente às células T ativadas.

[0050] A Figura 4 mostra que o anticorpo 5A11 reage com o homólogo de CRTAM de macaco cinomólogo, enquanto o anticorpo CR24.1 não.

[0051] A Figura 5 mostra a capacidade aprimorada do anticorpo 5A11 para mediar a produção de IFNy em comparação com CR24.1 após a ativação de células T.

[0052] A Figura 6a mostra um alinhamento de sequência da região variável de cadeia pesada da sequência de anticorpo parental 5A11 e a sequência 5A11 da região variável de cadeia pesada humanizada.

[0053] A Figura 6b mostra um alinhamento de sequência da região variável de cadeia leve da sequência de anticorpo parental 5A11 e a sequência da região variável humanizada 5A11 de cadeia leve.

[0054] A Figura 7 mostra que o anticorpo 5A11 pode ativar células T in vitro para produzir perforina de uma maneira dependente da dose.

[0055] A Figura 8 mostra que o anticorpo 5A11 pode ativar células T in vitro para produzir granzima B de uma maneira dependente da dose.

[0056] A Figura 9 mostra que o anticorpo 5SA11 pode induzir citotoxicidade mediada por células T in vitro em células tumorais MCF7.

[0057] A Figura 10 mostra que o anticorpo 5A11 pode induzir linfócitos infiltrantes de tumor (TILs) isolados de amostras primárias de tumor NSCLC para produzir interferon gama em ensaios ex vivo. Este ensaio mostra que o anticorpo SA11 aumentou a atividade quando comparado ao anticorpo comercialmente disponível CR24.1.

[0058] A Figura 11 mostra que o anticorpo 5A11 pode induzir TILs isolados de amostras primárias de câncer de mama para produzir interferon gama em ensaios ex vivo.

[0059] A Figura 12 mostra que o anticorpo 5A11 induz TILs a produzir interferon gama de uma maneira dependente da dose.

[0060] A Figura 13 mostra que o anticorpo 5A11 pode causar lise mediada por NK de células K562.

[0061] A Figura 14 mostra que o anticorpo 5A11 pode reduzir significativamente o crescimento de tumores em ratos em comparação com animais tratados com um anticorpo de controle de isotipo.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0062] Aspectos da invenção incluem anticorpos direcionados contra CRTAM, ácidos nucleicos que codificam esses anticorpos, células hospedeiras que compreendem esses ácidos nucleicos que codificam um anticorpo da invenção, métodos para a preparação de anticorpos anti- CRTAM e métodos para o tratamento de doenças, como mediada por CRTAM distúrbios, por exemplo, cânceres humanos, incluindo, entre outros, câncer de pulmão de pequenas células, câncer de pulmão de células não pequenas (incluindo carcinomas escamosos e adenocarcinomas) câncer de pele incluindo melanoma, câncer de mama (incluindo TNBC), câncer colorretal, câncer gástrico, câncer de ovário câncer cervical, câncer de próstata, câncer de rim, câncer de fígado, incluindo carcinoma hepatocelular, câncer pancreático, câncer de cabeça e pescoço, câncer nasofaríngeo, câncer de esôfago, câncer de bexiga e outros cânceres uroepiteliais, câncer de estômago, glioma, glioblastoma, testículo, tireoide, osso, vesícula biliar e dutos biliares, câncer de útero, adrenal, sarcomas, GIST, tumores neuroendócrinos e neoplasias hematológicas.

[0063] É observado que, conforme usado aqui e nas reivindicações anexas, as formas singulares “um”, “uma” e “o/a” incluem referências plurais, a menos que o contexto indique claramente o contrário. Observa-se ainda que as reivindicações podem ser elaboradas para excluir qualquer elemento opcional. Como tal, esta declaração pretende servir como base antecedente para o uso de terminologia exclusiva como "exclusivamente", "somente" e similares em conexão com a recitação de elementos de reivindicação, ou uso de uma limitação "negativa".

[0064] Como será evidente para os versados na técnica após a leitura desta divulgação, cada um dos aspectos individuais descritos e ilustrados neste documento tem componentes e características distintas que podem ser prontamente separadas ou combinadas com as características de qualquer um dos outros vários aspectos sem sair do escopo ou espírito da presente invenção. Qualquer método recitado pode ser realizado na ordem dos eventos recitados ou em qualquer outra ordem que seja logicamente possível.

DEFINIÇÕES

[0065] Para fins de interpretação deste relatório descritivo, as seguintes definições serão aplicadas e, sempre que apropriado, os termos usados no singular também incluirão o plural e vice-versa.

[0066] O termo "CRTAM", como aqui utilizado, refere- se a qualquer proteina CRTAM nativa de qualquer fonte de vertebrados, incluindo mamíferos como primatas (por exemplo, humanos, primatas e roedores (por exemplo, camundongos e ratos)), a menos que indicado de outra forma. A proteína CRTAM também pode ser dita como uma proteína semelhante a CRTAM. A sequência de aminoácidos do CRTAM humano é fornecida aqui na SEQ ID NO: 11.

[0067] O termo "CRTAM" abrange CRTAM não processado "de comprimento total", bem como qualquer forma de CRTAM resultante do processamento na célula. O termo também abrange variantes de CRTAM que ocorrem naturalmente, por exemplo, variantes de emenda, variantes alélicas e isoformas. O termo inclui especificamente formas truncadas ou segregadas de ocorrência natural do polipeptideo CRTAM (por exemplo, uma sequência de domínio extracelular). Os polipeptídeos de CRTAM aqui descritos podem ser isolados de uma variedade de fontes, como tipos de tecidos humanos ou de outra fonte, ou preparados por métodos recombinantes ou sintéticos. Um "polipeptídeo CRTAM de sequência nativa" compreende um polipeptídeo com a mesma sequência de aminoácidos que o polipeptideo CRTAM correspondente derivado da natureza. Tais polipeptídeos de CRTAM de sequência nativa podem ser isolados da natureza ou podem ser produzidos por meios recombinantes ou sintéticos. O termo "epítopo CRTAM", conforme usado aqui, refere-se a um epítopo ligado por um anticorpo que compreende pelo menos uma ou mais das sequências CDR aqui descritas e/ou como exemplificado pelo perfil de ligação de um anticorpo anti-cCRTAM, como ilustrado nos exemplos.

[0068] O termo "anticorpo" é usado no sentido mais amplo e abrange especificamente, por exemplo, anticorpos monocionais anti- CRTAM únicos (incluindo agonista, antagonista, anticorpos neutralizantes, anticorpos monoclonais inteiros ou intactos), composições de anticorpos anti- CRTAM com especificidade poliepitópica, anticorpos policlonais, anticorpos multivalentes, — anticorpos — multiespecíficos — (por exemplo, anticorpos biespecíficos, desde que exibam a atividade biológica desejada), formados a partir de pelo menos dois anticorpos intactos, anticorpos anti-cCRTAM de cadeia única e fragmentos de ligação a antígenos de anticorpos anti-CRTAM, incluindo fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 e Fv, diabetes, anticorpos de domínio único (sdAbs), desde que exibam a atividade biológica ou imunológica desejada. O termo "imunoglobulina" (Ig) é usado de forma intercambiável com o termo "anticorpo" neste documento. Um anticorpo pode ser quimérico, humano, humanizado e/ou amadurecido por afinidade. Será apreciado por aqueles versados na técnica que em algumas modalidades, no mínimo, os anticorpos contêm um conjunto de 6 CDRs como aqui definido; eles incluem, mas não estão limitados a, anticorpos tradicionais (incluindo anticorpos monoclonais e policlonais), anticorpos humanizados, humanos e/ou quiméricos, fragmentos de anticorpos, anticorpos modificados geneticamente (por exemplo, com modificações de aminoácidos conforme descrito abaixo), anticorpos multiespecíficos (incluindo anticorpos biespecíficos) e outros análogos conhecidos na técnica e discutidos aqui.

[0069] Será entendido que em outras modalidades o termo anticorpo, como aqui utilizado, refere-se a estruturas que não compreendem 6 CDRs; incluindo, entre outros, fragmentos Nanobody€O, UnibodyO e scFv.

[0070] O termo “anticorpo anti-cCRTAM”, “anticorpo CRTAM” ou “um anticorpo que se liga ao CRTAM” refere-se a um anticorpo capaz de se ligar ao CRTAM com afinidade suficiente para que o anticorpo seja útil como agente de diagnóstico e/ou terapêutico na segmentação de CRTAM.

Em certas modalidades, um anticorpo anti-CRTAM se liga a um epítopo de CRTAM que é conservado entre CRTAM de diferentes espécies.

[0071] Um “anticorpo isolado” é aquele que foi identificado e separado e/ou recuperado de um componente do seu ambiente. Os componentes contaminantes de seu ambiente são materiais que interferem nos usos terapêuticos do anticorpo e podem incluir enzimas, hormônios e outros solutos proteicos ou não proteicos.

[0072] Com relação à ligação de um anticorpo a uma molécula alvo, o termo “ligação específica” ou “liga-se especificamente a” ou é “específico para” um polipeptídeo específico ou um epítopo em um alvo polipeptídico específico significa a ligação que é mensurável diferente de um interação inespecífica. A ligação específica pode ser medida, por exemplo, determinando a ligação de uma molécula em comparação com a ligação de uma molécula de controle, que geralmente é uma molécula de estrutura semelhante que não tem atividade de ligação.

[0073] O termo "antagonista" é utilizado no sentido mais amplo e inclui qualquer molécula que bloqueia parcial ou totalmente, inibe ou neutraliza uma atividade biológica de um polipeptíideo CRTAM nativo. Moléculas antagonistas adequadas incluem especificamente anticorpos antagonistas ou fragmentos de anticorpos, fragmentos ou variantes de sequência de aminoácidos de polipeptideos CRTAM nativos, peptídeos, oligonucleotídeos antisense, pequenas moléculas orgânicas, etc. Métodos para identificar antagonistas de um polipeptíideo CRTAM, podem compreender o contato de um polipeptideo CRTAM com um molécula antagonista candidata e medindo uma alteração detectável em uma ou mais atividades biológicas normalmente associadas ao polipeptíideo CRTAM.

[0074] O termo "agonista" é utilizado no sentido mais amplo e inclui qualquer molécula que aumenta a atividade biológica de um polipeptideo CRTAM nativo. Moléculas agonistas adequadas incluem especificamente anticorpos agonistas ou fragmentos de anticorpos, fragmentos ou variantes de sequência de aminoácidos de polipeptídeos do ligante CRTAM, peptídeos, oligonucleotídeos antissenso, pequenas moléculas orgânicas, etc. Métodos para identificar agonistas de um polipeptideco CRTAM, podem compreender o contato de um polipeptíideo CRTAM com um molécula agonista candidata e medindo uma alteração detectável em uma ou mais atividades biológicas normalmente associadas ao polipeptíideo CRTAM.

[0075] "Tumor", como aqui utilizado, refere-se a todo crescimento e proliferação de células neoplásicas, malignas ou benignas, e todas as células e tecidos pré-cancerosos e cancerosos. Os termos "preditivo" e "prognóstico", conforme usados aqui, também são intercambiáveis, no sentido de que os métodos de previsão ou prognóstico são para permitir que a pessoa que pratica o método selecione pacientes considerados (geralmente antes do tratamento, mas não necessariamente) mais propensos a responder ao tratamento com um agente anticâncer, incluindo um anticorpo anti-cCRTAM.

PROTEINAS CRTAM

[0076] De acordo com o SWISS-PROT, o CRTAM é uma proteína de membrana tipo | da família das nectinas. A proteína consiste em um domínio do tipo V do tipo lg (semelhante à imunoglobulina), um domínio do tipo C do tipo lg (semelhante à imunoglobulina) (Yeh et al., Cell. 7 de março de 2008; 132 (5): 846-5), uma região transmembranar e uma cauda extracelular entre os aminoácidos 18 a 287 da SEQ ID No: 11.

[0077] O gene foi identificado pela primeira vez em células NKT ativadas em camundongos e humanos (Kennedy et al., J Leukoc Biol. 2000 maio; 67 (5): 725 a 734) com estudos subsequentes mostrando sua expressão fortemente regulada pela ativação e restrita à classe | ativada Células restritas ao MHC, incluindo células T NKT e CD8 (Patifo-Lopez et al, J. Neuroimmunol. Fevereiro de 2006; 171 (1-2): 145 a 155). O único ligante conhecido de CRTAM é Necl2 (Galibert et al., J Biol Chem. 2005 Jun 10; 280 (23): 21955 a 21964), e acredita-se que a interação entre o ligante e o receptor seja preferida em relação às interações homofílicas de ambos. molécula (Zhang et al., Estrutura. 6 de agosto de 2013; 21 (8): 1430 a 1439). A interação CRTAM- Necl2 é proposta para ajudar a estabelecer uma sinapse imune madura e melhorar a estimulação de células T por APCs não profissionais. Essa função também foi observada nas células NK, onde os anticorpos direcionados ao CRTAM estimularam a citotoxicidade das células NK (Boles et al., Blood. 1 de agosto de 2005; 106 (3): 779 a 786).

[0078] Em algumas modalidades, um anticorpo da invenção se liga ao CRTAM humano. "CRTAM humano" ou "proteína CRTAM humana", conforme aqui utilizado, refere-se à proteína da SEQ ID NO: 11, conforme aqui definido.

[0079] Um anticorpo de acordo com as modalidades da invenção pode, em certos casos, reagir de maneira cruzada com uma proteína CRTAM de uma espécie diferente de um ser humano. Por exemplo, para facilitar o teste pré-clínico e toxicológico, um anticorpo da invenção pode reagir de maneira cruzada com proteínas CRTAM murinas ou primatas. Alternativamente, em certas modalidades, um anticorpo pode ser específico para uma proteína CRTAM humana e pode não exibir espécies ou outros tipos de reatividade cruzada não humana.

ANTICORPOS

[0080] Os aspectos da invenção incluem anticorpos anti-CRTAM, geralmente anticorpos terapêuticos e/ou de diagnóstico, como aqui descrito. Os anticorpos que encontram uso nos métodos da presente invenção podem assumir qualquer um dos vários formatos descritos aqui, incluindo anticorpos tradicionais, bem como derivados de anticorpos, fragmentos de ligação ao antígeno e miméticos, conforme descrito aqui mais adiante. Em algumas modalidades, um anticorpo tem uma ou mais CDRs selecionadas a partir de um conjunto de 6 CDRs, conforme definido aqui (incluindo um pequeno número de alterações de aminoácidos, conforme descrito aqui). Como revisado acima, o termo "anticorpo", conforme aqui utilizado, refere-se a uma variedade de estruturas.

[0081] Em algumas modalidades, isotipos de IgG são usados na presente invenção. Em uma modalidade, são utilizados anticorpos isotípicos de IgG1 silenciados por Fc. Em uma outra modalidade, são utilizados anticorpos do isotipo IgG4.

[0082] A porção amino-terminal de cada cadeia de um anticorpo inclui uma região variável de cerca de 100 a 110 ou mais aminoácidos principalmente responsáveis pelo reconhecimento de antígeno. Na região variável, três laços são reunidos para cada um dos domínios V de cadeia pesada e de cadeia leve para formar um local de ligação ao antígeno. Cada uma das alças é dita como uma região determinante da complementaridade (doravante denominada "CDR"), na qual a variação na sequência de aminoácidos é mais significativa. “Variável” refere-se ao fato de que certos segmentos da região variável diferem extensivamente em sequência entre os anticorpos. A variabilidade na região variável não é distribuída igualmente. Em vez disso, as regiões V consistem em trechos relativamente invariantes chamados regiões estruturais (FRs) de 15 a 30 aminoácidos separados por regiões mais curtas de extrema variabilidade chamadas "regiões hipervariáveis" que têm 9 a 15 aminoácidos de comprimento ou mais.

[0083] Cada VH e VL é composto de três regiões hipervariáveis (“regiões determinantes complementares”, “CDRs”) e quatro FRs, dispostas do amino-terminal ao carbóxi-terminal na seguinte ordem: FR1-CDR1- FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4.

[0084] A região hipervariável geralmente abrange resíduos de aminoácidos de cerca de resíduos de aminoácidos 24 a 34 (CDR- L1; “L” denota cadeia leve), 50 a 56 (CDR-L2) e 89 a 97 (CDR-L3) na região variável de cadeia leve e em torno de 31 a 35B (CDR-H1; “H” denota cadeia pesada), 50 a 65 (CDR-H2) e 95 a 102 (CDR-H3) na região variável de cadeia pesada; Kabat et al, SEQUÊNCIAS DE PROTEÍNAS DE INTERESSE IMUNOLÓGICO, 5º ed. Serviço de Saúde Pública, Institutos Nacionais de Saúde, Bethesda, Md. (1991) e/ou os resíduos que formam uma alça hipervariável (por exemplo, resíduos 26 a 32 (CDR-L1), 50 a 52 (CDR-L2) e 91 a 96 (CDR-L3) na região variável de cadeia leve e 26 a 32 (CDR-H1), 58 a 55 (CDR-H2) e 96 a 101 (CDR-H3) na região variável de cadeia pesada; Chothia e Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196:901 a 917. CDRs específicas da invenção são descritas abaixo.

[0085] Em todo o presente relatório descritivo, o sistema de numeração Kabat é geralmente usado quando se refere a um resíduo no domínio variável (aproximadamente, resíduos 1 a 107 da região variável de cadeia leve e resíduos 1 a 113 da região variável de cadeia pesada) (por exemplo, Kabat et al., supra (1991)).

[0086] As CDRs contribuem para a formação do local de ligação ao antígeno, ou mais especificamente, o local de ligação ao epítopo dos anticorpos. Um único antígeno pode ter mais de um epítopo.

[0087] Na subclasse IgG de imunoglobulinas, existem vários domínios de imunoglobulina na cadeia pesada. Por “domínio de imunoglobulina (lg)' neste documento entende-se uma região de uma imunoglobulina tendo uma estrutura terciária distinta. De interesse na presente invenção são os domínios de cadeia pesada, incluindo os domínios de constante pesada (CH) e os domínios de articulação. No contexto dos anticorpos IgG, cada um dos isotipos IgG possui três regiões CH.

[0088] Outro tipo de domínio de lg da cadeia pesada é a região de articulação. Por “articulação” ou “região de articulação” ou “região de articulação de anticorpo” ou “região de dobradiça de imunoglobulina” neste documento significa o polipeptídeo flexível que compreende os aminoácidos entre o primeiro e o segundo domínios constantes de um anticorpo.

[0089] De interesse particular na presente invenção são as regiões Fc. Por “Fc” ou “Fc region” ou “domínio Fc”, conforme usado aqui, significa que o polipeptídeo compreende a região constante de um anticorpo excluindo o primeiro domínio de imunoglobulina da região constante e, em alguns casos, parte da articulação. Assim, Fc refere-se aos dois últimos domínios de imunoglobulina da região constante de IgA, IgD e IgG, os três últimos domínios de imunoglobulina da região constante de IgE e IgM eo terminal N de articulação flexível para esses domínios. Para IgA e IgM, Fc pode incluir a cadeia J. Para IgG, o domínio Fc compreende os domínios de imunoglobulina Cy2 e Cy3 (Cy2 e Cy3) e a região inferior da articulação entre Cy1 (Cy1) e Cy2 (Cy2). Embora os limites da região Fc possam variar, a região Fc da cadeia pesada de IgG humana é geralmente definida para incluir os resíduos C226 ou P230 em seu terminal carboxila, em que a numeração está de acordo com o índice EU como em Kabat. Em algumas modalidades, as modificações de aminoácidos são feitas na região Fc, por exemplo, para alterar a ligação a um ou mais receptores FcyR ou ao receptor FcRn. Em algumas modalidades, os anticorpos são de comprimento total. Por “anticorpo de comprimento total” neste documento entende-se a estrutura que constitui a forma biológica natural de um anticorpo, incluindo regiões variáveis e constantes, opcionalmente incluindo uma ou mais modificações, conforme descrito aqui.

[0090] Alternativamente, os anticorpos podem ser uma variedade de estruturas, incluindo, entre outros, fragmentos de ligação a antígenos, anticorpos monoclonais, anticorpos biespecíficos, minicorpos, anticorpos de domínio, anticorpos sintéticos (algumas vezes referidos aqui como “miméticos de anticorpos”), anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados, fusões de anticorpos (às vezes chamados de “conjugados de anticorpos”) e fragmentos de ligação ao antígeno de cada um, respectivamente. As estruturas que dependem do uso de um conjunto de CDRs estão incluídas na definição de “anticorpo”.

[0091] Em uma modalidade, um anticorpo é um fragmento de ligação ao antígeno. Os fragmentos de anticorpo específicos de ligação ao antígeno incluem, mas não estão limitados a: (i) o fragmento Fab que consiste nos domínios VL, VH, CL e CH1, (ii) o fragmento Fd que consiste nos domínios VH e CH1, (ili) o fragmento Fv consistindo nos domínios VL e VH de um único anticorpo; (iv) o fragmento dAb (Ward et al., 1989, Nature 341: 544 a

546, inteiramente incorporado por referência) que consiste em uma única região variável, (v) regiões CDR isoladas, (vi) fragmentos F(ab')2, um fragmento bivalente que compreende dois fragmentos Fab ligados (vii) moléculas de Fv de cadeia única (scFv), em que um domínio VH e um domínio VL são ligados por um ligante peptídico que permite que os dois domínios se associem para formar um local de ligação ao antígeno (Bird et al., 1988, Science 242: 423 a 426, Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879 a 5883, inteiramente incorporado por referência), (viii) Fv biespecífico de cadeia única (WO 03/11161, aqui incorporado por referência) e (ix) “diacorpos" ou “triacorpos", fragmentos multivalentes ou multiespecíficos construídos por fusão de genes (Tomlinson et al., 2000, Methods Enzymol. 326: 461 a 479; WO94/13804; Holliger et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444 a 6448, todos incorporados por referência na sua totalidade).

ANTICORPOS QUIMÉRICOS E HUMANIZADOS

[0092] Em algumas modalidades, um anticorpo pode ser uma mistura de diferentes espécies, por exemplo, um anticorpo quimérico e/ou um anticorpo humanizado. Isto é, na presente invenção, os conjuntos de CDR podem ser utilizados com estrutura e regiões constantes diferentes daquelas especificamente descritas pela sequência aqui.

[0093] Em geral, “anticorpos quiméricos" e “anticorpos humanizados” referem-se a anticorpos que combinam regiões de mais de uma espécie. Por exemplo, “anticorpos quiméricos” tradicionalmente compreendem regiões variáveis de um camundongo (ou rato, em alguns casos) e a região (ou regiões) constante de um ser humano. “Anticorpos humanizados” geralmente se referem a anticorpos não humanos que tiveram as regiões estruturais de domínio variável trocadas por sequências encontradas em anticorpos humanos. Geralmente, em um anticorpo humanizado, o anticorpo inteiro, exceto as CDRs, é codificado por um polinucleotídeo de origem humana ou é idêntico a esse anticorpo, exceto dentro de suas CDRs. As CDRs, algumas ou todas codificadas por ácidos nucleicos originários de um organismo não humano, são enxertadas na estrutura da folha beta de uma região variável de anticorpo humano para criar um anticorpo, cuja especificidade é determinada pelas CDRs enxertadas. A criação de tais anticorpos é descrita em, por exemplo, WO 92/11018, Jones, 1986, Nature 321: 522 a 525, Verhoeyen et al., 1988, Science 239: 1534 a 1536, todos inteiramente incorporados por referência. "Em uma modalidade, os anticorpos da invenção podem ser anticorpos multiespecíficos, e notavelmente anticorpos biespecíficos, também às vezes chamados de “diacorpos”. Estes são anticorpos que se ligam a dois (ou mais) antígenos diferentes ou epítopos diferentes no mesmo antígeno. Os diacorpos podem ser fabricados de várias maneiras conhecidas na técnica (Holliger e Winter, 1993, Current Opinion Biotechnol. 4:446 a 449, inteiramente incorporado por referência), por exemplo, preparado quimicamente ou a partir de hibridomas híbridos.

[0094] Em uma modalidade, o anticorpo é um minicorpo. Os minicorpos são proteínas semelhantes a anticorpos minimizados que compreende um scFv ligado a um domínio CH3. Hu et al., 1996, Cancer Res. 56:3055 a 3061, inteiramente incorporado por referência. Em alguns casos, o scFv pode ser unido à região Fc e pode incluir algumas ou toda a região de articulação. Deve-se notar que os minicorpos estão incluídos na definição de “anticorpo”, apesar de não possuir um conjunto completo de CDRs.

[0095] Os anticorpos da presente invenção são geralmente isolados ou recombinantes.

[0096] Em algumas modalidades, os anticorpos da invenção são proteínas recombinantes, proteínas isoladas ou proteínas substancialmente puras. Uma proteína “isolada” é desacompanhada de pelo menos parte do material com o qual está normalmente associada em seu estado natural, por exemplo, constituindo pelo menos cerca de 5% ou pelo menos cerca de 50% em peso da proteína total em uma determinada amostra. Entende-se que a proteína isolada pode constituir de 5 a 99,9% em peso do conteúdo total de proteína, dependendo das circunstâncias. Por exemplo, a proteína pode ser produzida em uma concentração significativamente maior através do uso de um promotor induzível ou de alta expressão, de modo que a proteína seja produzida em níveis de concentração aumentados. No caso de proteínas recombinantes, a definição inclui a produção de um anticorpo em uma ampla variedade de organismos e/ou células hospedeiras conhecidas na técnica em que não é produzido naturalmente. Normalmente, um polipeptídeo isolado será preparado por pelo menos uma etapa de purificação. Um “anticorpo isolado” refere-se a um anticorpo que está substancialmente livre de outros anticorpos com especificidades antigênicas diferentes. Por exemplo, um anticorpo isolado que se liga especificamente ao CRTAM está substancialmente livre de anticorpos que se ligam especificamente a outros antígenos que não o CRTAM.

[0097] Os anticorpos monocionais isolados, com diferentes especificidades, podem ser combinados em uma composição bem definida. Assim, por exemplo, um anticorpo da invenção pode ser, opcional ou individualmente, incluído ou excluído de uma formulação, como será discutido mais adiante.

[0098] A ligação específica para um antígeno ou um epítopo específico pode ser exibido, por exemplo, por um anticorpo que possui uma Ko para um antígeno ou epítopo de, pelo menos, cerca de 10-14 M, pelo menos cerca de 10-5 M, pelo menos, cerca de 10-6 M, pelo menos cerca de 10-7 M, pelo menos cerca de 10.8 M, pelo menos cerca de 10-9 M, alternativamente, pelo menos, cerca de 10-10 M, pelo menos cerca de 10-11 M, pelo menos cerca de 10-12 M, ou maior, em que Kp refere-se a uma taxa de dissociação de uma interação anticorpo-antígeno específica. Tipicamente, um anticorpo que se liga especificamente a um antígeno tem uma Kp que é 20-, 50-, 100-, 500-, 1000-,

5.000, 10.000 ou mais vezes menor para o antígeno ou epítopo em relação a uma molécula de controle.

[0099] Além disso, a ligação específica para um antígeno ou epítopo específico pode ser exibida, por exemplo, por um anticorpo com um Ka ou Ka para um antígeno ou epítopo de pelo menos 20-, 50-, 100-,

500-, 1000 -, 5.000 -, 10.000 - ou mais vezes para o epítopo em relação a um controle, em que Ka ou Ka se refere a uma taxa de associação de uma interação anticorpo-antígeno específica.

[0100] Os ensaios padrão para avaliar a capacidade de ligação dos anticorpos ao CRTAM podem ser realizados no nível da proteína ou celular e são conhecidos na técnica, incluindo, por exemplo, ELISAs, Western blots, RIAs, Octet&, BIAcoreO& e análise por citometria de fluxo. Ensaios adequados são descritos em detalhes nos Exemplos. A cinética de ligação (por exemplo, afinidade de ligação) dos anticorpos também pode ser avaliada por ensaios padrão conhecidos na técnica, como por análise de sistema Biacoree ou OctetO.

ANTICORPOS CRTAM

[0101] A presente invenção fornece anticorpos CRTAM que se ligam a um polipeptídeo CRTAM ou a uma porção do mesmo. Um exemplo de uma sequência de aminoácidos CRTAM é fornecido na SEQ ID NO: 11. Os anticorpos CRTAM sujeitos podem induzir ou melhorar a ativação de células imunes, por exemplo, ativação de células T e/ou ativação de células NK, para melhorar a resposta imune no tumor. Esses anticorpos são aqui referidos como anticorpos “anticCRTAM” ou, para facilitar a descrição, “anticorpos CRTAM”.

[0102] Em algumas modalidades, um anticorpo CRTAM sujeito pode induzir e/ou melhorar a liberação ou proliferação de citocinas após o contato com células T, particularmente células T CD8 + que expressam CRTAM em sua superfície. A liberação de citocinas ou proliferação de células T nesse contexto pode ser medida de várias maneiras. Em uma modalidade, um anticorpo CRTAM da invenção é contatado com células T ativadas, usando ensaios padrão, como ELISA. Em uma modalidade adicional, um anticorpo CRTAM sujeito pode induzir e/ou melhorar a ativação e morte de células NK.

[0103] Em uma modalidade, o anticorpo é um anticorpo que compreende as seguintes CDRs; Além disso, conforme discutido abaixo, essas sequências de CDR também podem conter um número limitado de variantes de aminoácidos, conforme descrito anteriormente:

[0104] Em algumas modalidades, um anticorpo compreende uma sequência de aminoácidos de pelo menos uma ou mais das sequências de CDR fornecidas na SEQ ID NOS: 5,6,7,15,9e 16. Em algumas modalidades, um anticorpo compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a uma sequência de aminoácidos de um ou mais das sequências de CDR fornecidas em SEQ ID NOS: 5, 6,7,15,9 e 16.

[0105] Também são divulgadas aqui cadeias pesadas e leves variáveis que compreendem os conjuntos de CDR da invenção, bem como cadeias pesadas e leves de comprimento total (por exemplo, que compreende também regiões constantes). Como será apreciado pelos versados na técnica, os conjuntos de CDR da invenção podem ser incorporados em regiões constantes murinas, humanizadas ou humanas (incluindo regiões estruturais). Os aspectos da invenção incluem regiões variáveis de cadeia pesada e regiões variáveis de cadeia leve que são pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idênticas à sequência da região variável de cadeia pesada (SEQ ID NO: 13) e sequência da região variável da cadeia leve (SEQ ID NO: 14) aqui divulgada.

[0106] Em algumas modalidades, a invenção fornece anticorpos que se ligam ao mesmo epítopo no CRTAM humano que, ou que competem cruzadamente com, o anticorpo monoclonal de CRTAM da invenção aqui descrito (isto é, anticorpos que têm a capacidade de competir cruzadamente pela ligação a uma proteína CRTAM com o anticorpo monoclonal da invenção aqui descrita). Em algumas modalidades, o anticorpo de referência para estudos de competição cruzada pode ser o anticorpo 5A11 como aqui definido. Tais anticorpos com competição cruzada podem ser identificados com base em sua capacidade de competir com o anticorpo SA11. Será entendido que, para um anticorpo ser considerado como competidor cruzado, ele não necessariamente bloqueia completamente a ligação do anticorpo de referência. Em algumas modalidades, a ligação de um anticorpo de referência é reduzida em pelo menos cerca de 10, 20, 30,40, 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98 ou 99%. Em algumas modalidades, a invenção fornece um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que compete pela ligação ao CRTAM com o ligante necl2.

MODIFICAÇÕES DE ANTICORPOS

[0107] A presente invenção fornece ainda anticorpos variantes, às vezes referidos como “derivados de anticorpos” ou “análogos de anticorpos”. Ou seja, existem várias modificações que podem ser feitas a um anticorpo da invenção, incluindo, entre outras, modificações de aminoácidos nas CDRs (maturação por afinidade), modificações de aminoácidos na região Fc, variantes de glicosilação e modificações covalentes de outros tipos (por exemplo, para fixação de conjugados de fármacos, etc.).

[0108] Por “variante” entende-se uma sequência polipeptídica que difere da de um polipeptídeo parental em virtude de pelo menos uma modificação de aminoácidos. Em algumas modalidades, um polipeptídeo parental é uma cadeia pesada ou leve variável de comprimento total, listada na SEQ ID NOS: 1 ou 2, 13 ou 14, ou é uma ou mais das sequências de CDR divulgadas em qualquer uma das SEQ ID NOS: 5 para 10, 150u 16. Em algumas modalidades, uma modificação de aminoácidos pode incluir uma substituição,

inserção e/ou exclusão, sendo a primeira preferida em muitos casos. Em algumas modalidades, uma substituição pode ser uma substituição conservativa.

[0109] Em geral, as variantes podem incluir qualquer número de modificações, desde que a função do anticorpo ainda esteja presente, conforme descrito nesse documento. Por exemplo, um anticorpo ainda deve se ligar especificamente ao CRTAM humano. Da mesma forma, se as variantes de aminoácidos são geradas na região Fc, por exemplo, os anticorpos variantes devem manter as funções de ligação ao receptor necessárias para a aplicação ou indicação específica do anticorpo. “Variantes” dos anticorpos em questão podem ser feitas para ter variações de aminoácidos, conforme descrito aqui, em uma ou mais das sequências de CDR listadas, em uma ou mais das regiões estruturais ou em uma ou mais das regiões constantes (por exemplo, na região Fc) do anticorpo.

[0110] Em algumas modalidades, 1, 2, 3,4,5,6,7,8, 9 ou 10 modificações de aminoácidos em comparação com a sequência parental são geralmente utilizadas, pois muitas vezes o objetivo é alterar a função com um número mínimo de modificações. Em algumas modalidades, há de 1 a 5(1, 2,3,4 ou 5) modificações (por exemplo, substituições, inserções e/ou deleções de aminoácidos individuais), com 1 a 2, 1a 3 e 1 a 4 também encontrando uso em muitas modalidades. Por exemplo, em algumas modalidades, uma ou mais das sequências de CDR dos anticorpos da invenção podem compreender individualmente uma ou mais, por exemplo, 1, 2, 3, 4 ou 5 modificações de aminoácidos, preferencialmente 1 a 4, 1 a 3, 1 ou 2 modificações. Geralmente, não são feitas mais que 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 alterações em um conjunto de CDRs.

[0111] Deve-se notar que o número de modificações de aminoácidos pode estar em domínios funcionais: por exemplo, pode ser desejável ter de 1 a 5 modificações na região Fc de uma proteína de tipo selvagem ou geneticamente modificada, bem como de 1 a 5 modificações na região Fv, por exemplo. Uma sequência polipeptídica variante deve possuir preferencialmente pelo menos cerca de 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96, 97%, 98% ou 99% de identidade para o sequências parentais (por exemplo, as sequências da região variável, as sequências da região constante e/ou as sequências das cadeias pesada e leve e/ou as CDRs de, por exemplo, anticorpo 5A11).

[0112] Por “substituição de aminoácidos" ou “substituição” neste documento, entende-se a substituição de um aminoácido em uma posição específica em uma sequência polipeptídica parental por outro aminoácido. Por “inserção de aminoácido” ou “inserção”, como aqui utilizado, significa a adição de um aminoácido em uma posição específica em uma sequência polipeptídica parental. Por “deleção de aminoácidos” ou “deleção”, conforme usado aqui, significa a remoção de um aminoácido em uma posição específica em uma sequência polipeptídica parental.

[0113] Por “polipeptíideo parental”, “proteína parental”, “polipeptídeo precursor” ou “proteína precursora”, conforme usado aqui, significa um polipeptídeo não modificado que é subsequentemente modificado para gerar uma variante. Em geral, um polipeptídeo parental como aqui utilizado pode se referir a polipeptídeos 5A11, por exemplo, as cadeias 5A11 Vr ou VL ou as sequências CDR. Por conseguinte, por "anticorpo parental", como aqui utilizado, significa um anticorpo que é modificado para gerar um anticorpo variante.

[0114] Por “tipo selvagem” ou “WT” ou “nativo” neste documento entende-se uma sequência de aminoácidos ou uma sequência nucleotídica encontrada na natureza, incluindo variações alélicas. Uma proteína WT, polipeptídeo, anticorpo, imunoglobulina, IgG, etc. tem uma sequência de aminoácidos ou uma sequência de nucleotídeos que não foi intencionalmente modificada.

[0115] Por “região Fc variante” neste documento entende-se uma sequência Fc que difere da sequência Fc de tipo selvagem em virtude de pelo menos uma modificação de aminoácidos. A variante Fc pode se referir ao próprio polipeptídeo Fc, composições que compreendem o polipeptídeo variante Fc ou a sequência de aminoácidos.

[0116] Em algumas modalidades, um anticorpo anti- CRTAM da invenção é composto por um domínio Fc variante. Como é conhecido na técnica, a região Fc de um anticorpo interage com um número de receptores e ligantes Fc, proporcionando uma série de capacidades funcionais importantes referidas como funções efetoras. Modificações adequadas podem ser feitas em uma ou mais posições e em particular para substituições específicas de aminoácidos que diminuem ou silenciam a ligação aos receptores Fc.

[0117] Além das modificações descritas acima, outras modificações podem ser feitas. Por exemplo, as moléculas podem ser estabilizadas pela incorporação de pontes de dissulfeto que ligam os domínios VH e VL (Reiter et al., 1996, Nature Biotech. 14:1239 a 1245, inteiramente incorporado por referência).

[0118] Além disso, modificações em cisteínas são particularmente úteis em aplicações de conjugado de anticorpo-fármaco (ADC), descritas mais adiante. Em algumas modalidades, a região constante dos anticorpos pode ser modificada geneticamente para conter uma ou mais cisteínas que são particularmente “reativas ao tiol”, de modo a permitir uma colocação mais específica e controlada da porção química do fármaco. Ver, por exemplo, a Patente US No. 7.521.541, incorporada por referência na sua totalidade aqui. Além disso, há uma variedade de modificações covalentes de anticorpos que podem ser feitas conforme descrito abaixo.

[0119] Modificações covalentes de anticorpos estão incluídas no escopo desta invenção e são geralmente, mas nem sempre, feitas após a tradução. Por exemplo, vários tipos de modificações covalentes do anticorpo são introduzidos na molécula reagindo resíduos específicos de aminoácidos do anticorpo com um agente derivatizante orgânico que é capaz de reagir com cadeias laterais selecionadas ou com os resíduos terminais N ou C.

[0120] Além disso, como será apreciado pelos versados na técnica, todos os marcadores (incluindo fluorescentes, enzimáticos, magnéticos, radioativos etc. podem ser adicionados aos anticorpos (bem como às outras composições da invenção).

MOLECULAS BIESPECIFICAS

[0121] Em outro aspecto, a presente invenção inclui moléculas biespecíficas e multiespecíficas que compreende um anticorpo anti- CRTAM, ou um fragmento do mesmo, da invenção. Um anticorpo da invenção, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, pode ser derivatizado ou ligado a outra molécula funcional, por exemplo, outro peptídeo ou proteína (por exemplo, outro anticorpo ou ligante para um receptor) para gerar uma molécula biespecífica que se liga a duas ligações diferentes locais ou moléculas alvo. Em algumas modalidades, um anticorpo da invenção, ou uma porção de ligação ao antígeno do mesmo, pode ser derivatizado ou ligado a pelo menos duas moléculas funcionais, por exemplo, outros peptídeos ou proteínas (por exemplo, outros anticorpos ou ligantes para um receptor) para gerar um molécula multiespecífica que se liga a pelo menos três locais de ligação diferentes ou moléculas alvo. Para criar uma molécula biespecífica ou multiespecífica da invenção, um anticorpo da invenção pode ser funcionalmente ligado (por exemplo, por acoplamento químico, fusão genética, associação não covalente ou de outra forma) a uma ou mais outras moléculas de ligação, como outro anticorpo, fragmento de anticorpo, peptídeo ou mimético de ligação, de modo que resulte em uma molécula biespecífica ou multiespecífica.

[0122] Por conseguinte, a presente invenção inclui moléculas biespecíficas que compreendem pelo menos uma primeira especificidade de ligação para um primeiro epítopo alvo (isto é, CRTAM) e uma segunda especificidade de ligação para um segundo epítopo alvo. O segundo epítopo alvo pode estar presente na mesma proteína alvo que a ligada pela primeira especificidade de ligação; ou o segundo epítopo alvo pode estar presente em uma proteína alvo diferente daquela ligada pela primeira especificidade de ligação. O segundo epítopo alvo pode estar presente na mesma célula que o primeiro epítopo alvo (isto é, CRTAM); ou o segundo epítopo alvo pode estar presente em um alvo que não é exibido pela célula que exibe o primeiro epítopo alvo. Como usado aqui, o termo “especificidade de ligação” refere-se a uma porção química que compreende pelo menos um domínio variável do anticorpo.

[0123] Em outra modalidade da invenção, o segundo epítopo alvo está presente em uma célula tumoral. Portanto, aspectos da invenção incluem moléculas biespecíficas capazes de se ligar tanto a células efetoras que expressam CRTAM (por exemplo, células T citotóxicas que expressam CRTAM) quanto a células tumorais que expressam um segundo epítopo alvo.

[0124] Em uma modalidade um anticorpo biespecífico da invenção pode ter um total de dois ou três domínios variáveis de anticorpo, em que uma primeira porção do anticorpo biespecífico é capaz de recrutar a atividade de uma célula efetora imune humana por ligação específica a um antígeno efetor localizado na célula efetora imunológica humana, na qual o antígeno efetor é CRTAM, a dita primeira porção consistindo em um domínio variável do anticorpo e uma segunda porção do anticorpo biespecífico sendo capaz de se ligar especificamente a um antígeno alvo que não seja o antígeno efetor, o dito antígeno alvo estando localizado em uma célula alvo que não a dita célula efetiva do sistema imunológico humano e a dita segunda porção que compreende um ou dois domínios variáveis do anticorpo.

[0125] Em uma modalidade da invenção em que uma proteína de ligação é multiespecífica, uma molécula pode incluir ainda uma terceira especificidade de ligação, além de uma especificidade de ligação antitumoral e uma especificidade de ligação anti-CRTAM. Em uma modalidade, uma terceira especificidade de ligação é uma porção do fator anti-melhora (EF), por exemplo, uma molécula que se liga a uma proteína de superfície envolvida na atividade citotóxica e, desse modo, aumenta a resposta imune contra a célula alvo. A “porção do fator anti-melhora” pode ser um anticorpo, fragmento de anticorpo funcional ou um ligante que se liga a uma dada molécula, por exemplo, um antígeno ou um receptor e, desse modo, resulta em um aprimoramento do efeito dos determinantes de ligação para a antígeno da célula alvo. A “porção do fator anti-melhora” pode ligar um antígeno da célula alvo. Alternativamente, a porção do fator anti-melhora pode se ligar a uma entidade que é diferente da entidade à qual a primeira e a segunda especificidades de ligação se ligam. Por exemplo, a porção do fator anti-melhora pode ligar uma célula T citotóxica (por exemplo, via CD2, CD3, CD8, CD28, CD4, CD40, ICAM-1 ou outra célula imune que resulta em uma resposta imune aprimorada contra a célula alvo).

[0126] Em uma modalidade uma proteína biespecífica da invenção compreende como especificidade de ligação pelo menos um anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo, incluindo, por exemplo, um Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fd, dAb ou uma única cadeia Fv. O anticorpo também pode ser um dímero de cadeia leve ou cadeia pesada, ou qualquer fragmento mínimo do mesmo, tal como um Fv ou uma construção de cadeia única, conforme descrito na Patente US No. 4.946.778, cujo conteúdo é expressamente incorporado por referência.

[0127] Em algumas modalidades, um anticorpo que pode ser empregado em uma molécula biespecífica da invenção é um anticorpo monoclonal murino, humano, quimérico ou humanizado.

[0128] A ligação das moléculas biespecíficas aos seus alvos específicos pode ser confirmada por, por exemplo, ensaio imunossorvente ligado a enzima (ELISA), radioimunoensaio (RIA), análise FACS, bioensaio (por exemplo, inibição do crescimento) ou ensaio Western Blot. Cada um desses ensaios geralmente detecta a presença de complexos proteína- anticorpo de interesse particular, empregando um reagente marcado (por exemplo, um anticorpo) específico para o complexo de interesse.

GLICOSILAÇÃO

[0129] Outro tipo de modificação covalente são as alterações na glicosilação. Por exemplo, um anticorpo aglicosilado pode ser produzido (isto é, um anticorpo que necessita de glicosilação). A glicosilação pode ser alterada para, por exemplo, aumentar a afinidade do anticorpo para o antígeno. Tais modificações de carboidratos podem ser realizadas, por exemplo, alterando um ou mais locais de glicosilação dentro da sequência de anticorpos. Por exemplo, podem ser feitas uma ou mais substituições de aminoácidos que resultam na eliminação de um ou mais locais de glicosilação de estrutura de região variável para eliminar assim a glicosilação nesse local. Essa aglicosilação pode aumentar a afinidade do anticorpo para o antígeno. Tal abordagem é descrita em mais detalhes nas Patentes US Nos. 5.714.350 e 6.350.861 de Co et al., e pode ser realizada removendo a asparagina na posição 297.

[0130] Outro tipo de modificação covalente do anticorpo compreende a ligação do anticorpo a vários polímeros não proteicos, incluindo, mas não se limitando a, vários polióis, como polietileno glicol, polipropileno glicol ou polioxialquilenos, da maneira estabelecida em, por exemplo, Catálogo PEG 2005-2006 da Nektar Therapeutics (disponível no site da Nektar) Patentes dos EUA 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417;

4.791.192 ou 4.179.337, todas totalmente incorporadas por referência. Além disso, como é conhecido na técnica, podem ser feitas substituições de aminoácidos em várias posições dentro do anticorpo para facilitar a adição de polímeros como o PEG. Veja, por exemplo, a Publicação US 2005/0114037A1, totalmente incorporada por referência.

[0131] Em modalidades adicionais, por exemplo, no uso dos anticorpos da invenção para fins de diagnóstico ou detecção, os anticorpos podem compreender um marcador. Por “marcado” neste documento significa que um composto possui pelo menos uma porção química, elemento, isótopo ou composto químico anexado para permitir a detecção do composto, conforme descrito na 6º Edição do Manual de Sondas Moleculares de Richard P. Haugland, aqui incorporado expressamente por referência aqui.

METODOS PARA À PRODUÇÃO DOS ANTICORPOS DA INVENÇÃO

[0132] A presente invenção fornece ainda métodos para a produção dos anticorpos anti-cCRTAM divulgados. Estes métodos englobam a cultura de uma célula hospedeira contendo ácido (ou ácidos) nucleico isolado que codifica um anticorpo da invenção. Como será apreciado pelos versados na técnica, isso pode ser feito de várias maneiras, dependendo da natureza do anticorpo. Em algumas modalidades, no caso em que os anticorpos da invenção são anticorpos tradicionais de comprimento total, por exemplo, uma célula hospedeira contém ácido nucleico que codifica uma região variável da cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve pode ser cultivada sob condições de modo que um anticorpo é produzido e pode ser isolado.

[0133] As cadeias pesadas e leves variáveis dos anticorpos da invenção são aqui divulgadas (sequências de proteínas e ácidos nucleicos); como será apreciado na técnica, estes podem ser facilmente aumentados para produzir cadeias pesadas e leves de comprimento total. Ou seja, tendo fornecido os fragmentos de DNA que codificam os segmentos VrH e VL, conforme descrito neste documento, esses fragmentos de DNA podem ser ainda mais manipulados por técnicas de DNA recombinante padrão, por exemplo, para converter os genes da região variável em genes de cadeia de anticorpo completos, em genes de fragmentos Fab ou a um gene scFv. Nestas manipulações, um fragmento de DNA que codifica VL ou Vr é operacionalmente ligado a outro fragmento de DNA que codifica outra proteína, como uma região constante de anticorpo ou um ligante flexível... O termo “operacionalmente ligado”, como usado neste contexto, pretende significar que os dois fragmentos de DNA são unidos de modo que as sequências de aminoácidos codificadas pelos dois fragmentos de DNA permaneçam na estrutura.

[0134] O DNA isolado que codifica a região VH pode ser convertido em um gene de cadeia pesada de comprimento total ligando de forma operacional o DNA que codifica VH a outra molécula de DNA que codifica para regiões constantes de cadeia pesada (Cr1, CH2 and CH3). As sequências dos genes da região constante da cadeia pesada de murinos são conhecidas na técnica (ver, por exemplo, Kabat, EA, et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, US Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242) e fragmentos de DNA que abrangem essas regiões podem ser obtidos através de amplificação por PCR padrão. À região constante de cadeia pesada pode ser uma região constante de IgG1, 19G2, I19G3, IgG4, IgA, IgE, IgM ou IMD. Em uma modalidade preferida, a região constante de cadeia pesada é uma região constante de IgG1 ou IgG4. Para um gene de cadeia pesada de fragmento Fab, o DNA codificando VH pode ser operacionalmente ligado a outra molécula de DNA que codifica apenas a região constante CH1 de cadeia pesada.

[0135] O DNA isolado que codifica a região VL pode ser convertido em um gene de cadeia leve de comprimento total (bem como um gene de cadeia leve Fab), ligando de forma operacional o DNA que codifica V.L a outra molécula de DNA que codifica a região constante da cadeia leve, CL. As sequências dos genes da região constante da cadeia leve de murinos são conhecidas na técnica (ver, por exemplo, Kabat, EA, et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, US Department of Health and Human Services, NIH Publication Nº 91-3242) e fragmentos de DNA que abrangem essas regiões podem ser obtidos através de amplificação por PCR padrão. Em uma modalidade preferida, a região constante da cadeia leve é uma região constante kappa ou lambda.

[0136] Para criar uma sequência polinucleotídica que codifica um fragmento de anticorpo scFv, os fragmentos de DNA que codificam VHr e VL são operacionalmente ligados a outro fragmento que codifica um ligante flexível, por exemplo, codificando a sequência de aminoácidos (Glys -Ser)s, de modo que as sequências Vx e VL podem ser expressas como uma proteína de cadeia única contígua, com as regiões VL e Vm unidas pelo ligante flexível (ver,

por exemplo, Bird et al. (1988) Science 242:423 a 426; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879 a 5883; McCatfferty et al., (1990) Nature 348:552 a 554).

[0137] Os aspectos da invenção incluem ácidos nucleicos que codificam os anticorpos da invenção. Tais polinucleotídeos codificam para as regiões variável e constante de cada uma das cadeias pesada e leve, embora outras combinações também sejam contempladas pela presente invenção de acordo com as composições aqui descritas. Os aspectos da invenção incluem fragmentos de oligonucleotídeos derivados dos polinucleotídeos divulgados e sequências de ácidos nucleicos complementares a esses polinucleotídeos.

[0138] Os polinucleotíidecos de acordo com as modalidades da invenção podem estar na forma de ou podem incluir RNA, DNA, CDNA, DNA genômico, análogos de ácidos nucleicos e DNA sintético. Em algumas modalidades, uma molécula de DNA pode ser de fio duplo ou fio simples e, se fio simples, pode ser o fio codificador (senso) ou o fito não codificador (antissenso). A sequência de codificação que codifica o polipeptídeo pode ser idêntica à sequência de codificação fornecida aqui ou pode ser uma sequência de codificação diferente, cuja sequência, como resultado da redundância ou degeneração do código genético, codifica os mesmos polipeptídeos que o DNA aqui fornecido.

[0139] Em algumas modalidades, o ácido (ou ácidos) nucleico que codifica os anticorpos da invenção são incorporados em vetores de expressão, que podem ser extracromossômicos ou projetados para integrar-se no genoma da célula hospedeira na qual são introduzidos. Os vetores de expressão podem conter qualquer número de sequências reguladoras apropriadas (incluindo, mas não se limitando a, sequências de controle de transcrição e tradução, promotores, locais de ligação ribossômica, acentuadores, origens de replicação etc.) ou outros componentes (genes de seleção etc.), todos os quais estão operacionalmente ligados, como é bem conhecido na técnica.

Em alguns casos, dois ácidos nucleicos são usados e cada um é colocado em um vetor de expressão diferente (por exemplo, uma cadeia pesada em um primeiro vetor de expressão, uma cadeia leve em um segundo vetor de expressão) ou, alternativamente, eles podem ser colocados no mesmo vetor de expressão. Será apreciado pelos versados na técnica que o design do vetor (ou vetores) de expressão, incluindo a seleção de sequências reguladoras, pode depender de fatores como a escolha da célula hospedeira, o nível de expressão da proteína desejada etc.

[0140] Em geral, os ácidos nucleicos e/ou expressão podem ser introduzidos em uma célula hospedeira adequada para criar uma célula hospedeira recombinante usando qualquer método apropriado para a célula hospedeira selecionada (por exemplo, transformação, transfecção, eletroporação, infecção), de modo que a molécula (ou moléculas) do ácido nucleico estejam operacionalmente ligadas a um ou mais elementos de controle de expressão (por exemplo, em um vetor, em um construto criado por processos na célula, integrados ao genoma da célula hospedeira). A célula hospedeira recombinante resultante pode ser mantida em condições adequadas para expressão (por exemplo, na presença de um indutor, em um animal não humano adequado, em meio de cultura adequado suplementado com sais apropriados, fatores de crescimento, antibióticos, suplementos nutricionais, etc.), pelo qual o polipeptídeo (ou polipeptídeos) codificado é produzido. Em algumas modalidades, uma cadeia pesada e uma cadeia leve são produzidas na mesma célula hospedeira. Em algumas modalidades, uma cadeia pesada é produzida em uma célula hospedeira e uma cadeia leve é produzida em outra célula hospedeira.

[0141] As linhas celulares de mamíferos disponíveis como hospedeiros para expressão são conhecidas na técnica e incluem muitas linhas celulares imortalizadas disponíveis na American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, incluindo, entre outras, células do ovário de hamster chinês (CHO), células HEK 293, Células NSO, células HeLa, células de rim de hamster bebê (BHK), células de rim de macaco (COS), células de carcinoma hepatocelular humano (por exemplo, Hep G2) e várias outras linhas celulares. Células não mamíferas, incluindo, mas não limitadas a bactérias, leveduras, insetos e plantas, também podem ser usadas para expressar anticorpos recombinantes. Em algumas modalidades, os anticorpos podem ser produzidos em animais transgênicos, como vacas ou galinhas.

[0142] Os métodos gerais para biologia molecular de anticorpos, expressão, purificação e triagem são bem conhecidos, por exemplo, ver as patentes US 4.816.567, 4.816.397, 6.331.415 e 7.923.221, bem como Antibody Engineering, editado por Kontermann & Dubel, Springer, Heidelberg, 2001 e 2010 Hayhurst & Georgiou, 2001, Curr Opin Chem Biol 5:683 a 689; Maynard & Georgiou, 2000, Annu Rev Biomed Eng 2:339 a 376; and Morrison, S. (1985) Science 229:1202.

COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS

[0143] Os aspectos da invenção incluem uma composição, por exemplo, uma composição farmacêutica, contendo um ou mais (ou uma combinação de) anticorpos CRTAM, ou porção (ou porções) de ligação ao antígeno do mesmo, da presente invenção, formulada em conjunto com um veículo farmaceuticamente aceitável. Tais composições podem incluir um ou uma combinação de (por exemplo, dois ou mais diferentes) anticorpos ou moléculas biespecíficas da invenção. Por exemplo, uma composição farmacêutica da invenção pode compreender uma combinação de anticorpos que se ligam a diferentes epítopos em um antígeno alvo ou que possuem atividades complementares.

[0144] As composições farmacêuticas da invenção também podem ser administradas em terapia combinada, isto é, combinadas com outros agentes. Por exemplo, a terapia de combinação pode incluir um anticorpo da presente invenção combinado com pelo menos um outro agente antitumoral, ou um agente anti-inflamatório ou imunossupressor. Exemplos de agentes terapêuticos que podem ser utilizados em terapia combinada são descritos em mais detalhes abaixo na seção sobre usos dos anticorpos da invenção.

[0145] Como usado aqui, “veículo farmaceuticamente aceitável” inclui todo e qualquer solvente, meio de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e de retardamento da absorção, e similares que sejam fisiologicamente compatíveis. De preferência, o veículo é adequado para administração intravenosa, intramuscular, subcutânea, parenteral, espinhal ou epidérmica (por exemplo, por injeção ou infusão). Dependendo da via de administração, o composto ativo, isto é, anticorpo ou fragmento de anticorpo, pode ser revestido em um material para proteger o composto da ação de ácidos e outras condições naturais que podem inativar o composto.

[0146] Os compostos farmacêuticos da invenção podem incluir um ou mais sais farmaceuticamente aceitáveis. Um “sal farmaceuticamente aceitável” refere-se a um sal que retém uma atividade biológica desejada do composto de origem e não confere efeitos toxicológicos indesejados (ver, por exemplo, Berge, SM, et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66: 1 a 19). Uma composição farmacêutica da invenção também pode incluir um antioxidante farmaceuticamente aceitável. Exemplos de veículos aquosos e não aquosos adequados que podem ser empregados nas composições farmacêuticas da invenção incluem água, etanol, polióis (como glicerol, propilenoglicol, polietilenoglicol e similares) e suas misturas adequadas, óleos vegetais, como azeite e ésteres orgânicos injetáveis, como oleato de etila. À fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de materiais de revestimento, como a lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula necessário no caso de dispersões e pelo uso de tensoativos.

[0147] Estas composições também podem conter adjuvantes, tais como conservantes, agentes umectantes, agentes emulsificantes e agentes dispersantes. A prevenção da presença de microrganismos pode ser assegurada tanto pelos procedimentos de esterilização, supra, como pela inclusão de vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabeno, clorobutanol, ácido fenol sórbico e similares. Também pode ser desejável incluir agentes isotônicos, tais como açúcares, cloreto de sódio e similares nas composições. Além disso, a absorção prolongada da forma farmacêutica injetável pode ser provocada pela inclusão de agentes que retardam a absorção, como o monoestearato de alumínio e a gelatina.

[0148] Os veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem soluções ou dispersões aquosas estéreis e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções ou dispersões injetáveis estéreis. O uso de tais meios e agentes para substâncias farmaceuticamente ativas é conhecido na técnica. Exceto na medida em que qualquer meio ou agente convencional é incompatível com o composto ativo, é contemplado o uso do mesmo nas composições farmacêuticas da invenção. Compostos ativos suplementares também podem ser incorporados nas composições.

[0149] Os regimes de dosagem são ajustados para fornecer a resposta desejada ideal (por exemplo, uma resposta terapêutica). Por exemplo, um único bolus pode ser administrado, várias doses divididas podem ser administradas ao longo do tempo ou a dose pode ser proporcionalmente reduzida ou aumentada conforme indicado pelas exigências da situação terapêutica. É especialmente vantajoso formular composições parenterais na forma de unidade de dosagem para facilitar a administração e uniformidade da dosagem. A forma de unidade de dosagem como aqui utilizada refere-se a unidades fisicamente discretas adequadas como dosagens unitárias para os indivíduos a serem tratados; cada unidade contém uma quantidade predeterminada de composto ativo calculada para produzir o efeito terapêutico desejado em associação com o veículo farmacêutico necessário. A especificação para as formas unitárias de dosagem da invenção é ditada e diretamente dependente (a) das características únicas do composto ativo e do efeito terapêutico específico a ser alcançado; e (b) das limitações inerentes à técnica de composição de tais substâncias. composto ativo para o tratamento da sensibilidade em indivíduos.

[0150] Para administração de um anticorpo, uma dosagem pode variar de cerca de 0,0001 a 100 mg/kg, cerca de 0,001 a 50 mg/kg, cerca de 0,001 a 10 mg/kg, cerca de 0,01 a 10 mg/kg e mais usualmente 0,01 a 5 mg/kg, do peso corporal do hospedeiro. Por exemplo, as dosagens podem ser 0,1 mg/kg, 0,2 mg/kg, 0,3 mg/kg, 0,4 mg/kg, 0,5 mg/kg, 0,75 mg/kg de peso corporal, 1 mg/kg de peso corporal, 3 mg/kg de peso corporal, 4 mg/kg de peso corporal, 5 mg/kg de peso corporal, 7,5 mg/kg de peso corporal ou 10 mg/kg de peso corporal ou na faixa de 0,1 a 5 mg/kg ou 1 a 10 mg/kg. Um exemplo de regime de tratamento envolve a administração diária, em dias alternados, duas vezes por semana, uma vez por semana, uma vez a cada duas semanas, uma vez a cada três semanas, uma vez a cada quatro semanas, uma vez por mês, uma vez a cada 3 meses ou uma vez a cada três a 6 meses. Os regimes de dosagem preferidos para um anticorpo anti-cCRTAM da invenção incluem 1 mg/kg de peso corporal, 3 mg/kg, 5 mg/kg ou 10 mg/kg de peso corporal por administração intravenosa, com o anticorpo sendo administrado usando um dos seguintes esquemas de dosagem: (i) toda semana, por seis doses, depois todo mês; (ii) toda semana; (iii) 3 mg/kg de peso corporal, uma vez seguido por 1 mg/kg de peso corporal todas as semanas.

[0151] Em alguns métodos, dois ou mais anticorpos monoclonais com diferentes especificidades de ligação são administrados simultaneamente; caso em que a dosagem de cada anticorpo administrado cai dentro dos limites indicados. Em algumas modalidades, um anticorpo é administrado em várias ocasiões. Os intervalos entre doses únicas podem ser, por exemplo, semanalmente, mensalmente, a cada três meses ou anualmente. Os intervalos também podem ser irregulares, conforme indicado pela medição dos níveis sanguíneos de anticorpo para o antígeno alvo no paciente. Em algumas modalidades, a dosagem é ajustada para atingir uma concentração de anticorpo no plasma de cerca de 1 a 1000 pg/ml e em alguns métodos cerca de a 300 po/ml.

[0152] Em algumas modalidades, um anticorpo pode ser administrado como uma formulação de liberação sustentada, caso em que é necessária uma administração menos frequente. A dosagem e a frequência variam dependendo da meia-vida do anticorpo no paciente. Em geral, os anticorpos humanos mostram a meia-vida mais longa, seguidos pelos anticorpos humanizados, anticorpos quiméricos e anticorpos não humanos. A dosagem e a frequência da administração podem variar dependendo se o tratamento é profilático ou terapêutico. Em aplicações profiláticas, uma dose relativamente baixa é administrada em intervalos relativamente pouco frequentes durante um longo período de tempo. Alguns pacientes continuam a receber tratamento pelo resto de suas vidas. Em aplicações terapêuticas, às vezes é necessária uma dosagem relativamente alta em intervalos relativamente curtos até que a progressão da doença seja reduzida ou terminada, e preferencialmente até que o paciente mostre melhora parcial ou completa dos sintomas da doença. Depois disso, o paciente pode receber um regime profilático.

[0153] Os níveis de dosagem reais dos ingredientes ativos nas composições farmacêuticas da presente invenção podem variar de modo a obter uma quantidade do ingrediente ativo que seja eficaz para alcançar a resposta terapêutica desejada para um paciente em particular, composição e modo de administração, sem ser tóxico para o paciente. O nível de dosagem selecionado dependerá de uma variedade de fatores farmacocinéticos, incluindo a atividade das composições particulares da presente invenção empregadas, ou o éster, sal ou amida do mesmo, a via de administração, o tempo de administração, a taxa de excreção da composto específico sendo empregado, a duração do tratamento, outros fármacos, compostos e/ou materiais utilizados em combinação com as composições específicas empregadas, idade, sexo, peso, condição, estado geral de saúde e histórico médico anterior do paciente sendo tratado, e fatores semelhantes bem conhecidos nas técnicas médicas.

[0154] Uma “dosagem terapeuticamente eficaz” de um anticorpo anticCRTAM da invenção resulta, de preferência, em uma diminuição na gravidade dos sintomas da doença, em um aumento na frequência e na duração dos períodos livres de sintomas da doença ou uma prevenção de comprometimento ou incapacidade devido à aflição da doença. Por exemplo, uma “dosagem terapeuticamente eficaz” inibe preferencialmente o crescimento celular ou tumoral em pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 30%, mais preferencialmente por pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, ainda mais preferencialmente em pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70% e ainda mais preferencialmente em pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90% ou pelo menos cerca de 95% em relação a indivíduos não tratados. A capacidade de um composto para inibir o crescimento de tumores pode ser avaliada em um sistema de modelo animal preditivo de eficácia em tumores humanos. Alternativamente, esta propriedade de uma composição pode ser avaliada examinando a capacidade do composto para inibir o crescimento celular, tal inibição pode ser medida in vitro por ensaios conhecidos por profissionais versados. Uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto terapêutico pode diminuir o tamanho do tumor ou, de outro modo, melhorar os sintomas em um sujeito. Um versado na técnica seria capaz de determinar tais quantidades com base em fatores como o tamanho do sujeito, a gravidade dos sintomas do sujeito e a composição ou via de administração específica selecionada.

[0155] Uma composição da presente invenção pode ser administrada através de uma ou mais vias de administração utilizando um ou mais de uma variedade de métodos conhecidos na técnica. Como será apreciado pelo versado, a via e/ou modo de administração variará dependendo dos resultados desejados. As vias de administração preferidas para anticorpos da invenção incluem vias de administração intravenosa, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal, subcutânea, espinal ou outras vias parenterais de administração, por exemplo, por injeção ou infusão. A frase “administração parenteral”, conforme aqui utilizada, significa modos de administração diferentes da administração enteral e tópica, geralmente por injeção, e inclui, sem limitação, intravenosa, intramuscular, intra-arterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, transtracelular, injeção e infusão subcutânea, — subcuticular, —intra-articular, — subcapsular, — subaracnóidea, intraespinal, epidural e intraesternal.

[0156] Alternativamente, um anticorpo da invenção pode ser administrado por uma via não parenteral, como uma via de administração tópica, epidérmica ou mucosa, por exemplo, intranasal, oral, vaginal, retal, sublingual ou tópica.

[0157] Os compostos ativos podem ser preparados com veículos que protegerão o composto contra liberação rápida, como uma formulação de liberação controlada, incluindo implantes, adesivos transdérmicos e sistemas de entrega microencapsulados. Podem ser utilizados polímeros biodegradáveis e biocompatíveis, tais como acetato de etileno vinil, polianidretos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres e ácido polilático. Muitos métodos para a preparação de tais formulações são patenteados ou geralmente conhecidos dos versados na técnica (ver, por exemplo, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems (1978) J.R. Robinson, ed,, Marcel Dekker, Inc., N.Y).

[0158] Em certas modalidades, um anticorpo monoclonal da invenção pode ser formulado para garantir a distribuição adequada in vivo. Por exemplo, a barreira hematoencetfálica (BBB) exclui muitos compostos altamente hidrofílicos. Para garantir que os compostos terapêuticos da invenção cruzem o BBB (se desejado), eles podem ser formulados, por exemplo, em lipossomas. Para métodos de fabricação de lipossomas, ver, por exemplo, as patentes US 4.522.811; 5.374.548; e 5.399.331. Os lipossomas podem compreender uma ou mais porções químicas que são transportadas seletivamente para células ou órgãos específicos, melhorando assim a entrega direcionada do fármaco (ver, por exemplo, V.V. Ranade (1989) J. Clin.

Pharmacol. 29: 685). Porções químicas de direcionamento exemplares incluem folato ou biotina (ver, por exemplo, Patente US 5.416.016); mannosides (Umezawa et al. (1988) Biochem. Biophys. Res. Comum. 153:1038); anticorpos (PG Bloeman et al. (1995) FEBS Lett. 357:140; M. Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180); receptor de proteína A do tensoativo (Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol. 1233:134); p120 (Schreier et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:9090); ver também K. Keinanen; M.L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346: 123; J.J. Killion; 1.J. Fidler (1994) Inmunomethods 4:273.

USOS E METODOS

[0159] Os anticorpos, composições de anticorpos e métodos da presente invenção têm numerosas utilidades de diagnóstico e terapêuticas in vitro e in vivo envolvendo o diagnóstico e tratamento de distúrbios imunomediados.

[0160] Em algumas modalidades, essas moléculas podem ser administradas a células em cultura, in vitro ou ex vivo, ou a seres humanos, por exemplo, in vivo, para tratar, prevenir e/ou diagnosticar uma variedade de distúrbios. Como aqui utilizado, o termo "sujeito" pretende incluir animais humanos e não humanos. Animais não humanos incluem todos os vertebrados, por exemplo, mamíferos, como primatas não humanos e não mamíferos. Os sujeitos preferidos incluem pacientes humanos. Quando os anticorpos para CRTAM são administrados em conjunto com outro agente, os dois podem ser administrados por ordem ou simultaneamente.

[0161] Dada a ligação específica dos anticorpos da invenção ao CRTAM, os anticorpos da invenção podem ser utilizados para detectar especificamente a expressão de CRTAM na superfície das células imunes e, além disso, podem ser utilizados para purificar o CRTAM através da purificação por imunoafinidade.

[0162] Além disso, dada a expressão de CRTAM nas células imunológicas, os anticorpos, composições de anticorpos e métodos da presente invenção podem ser utilizados para tratar um indivíduo com um distúrbio tumorigênico, por exemplo, um distúrbio caracterizado pela presença de células tumorais, por exemplo, câncer de pulmão de pequenas células, câncer de pulmão de células não pequenas (incluindo carcinomas escamosos e adenocarcinomas) câncer de pele incluindo melanoma, câncer de mama (incluindo TNBC), câncer colorretal, câncer gástrico, câncer de ovário, câncer cervical, câncer de próstata, câncer de rim, câncer de fígado, incluindo carcinoma hepatocelular, câncer pancreático, câncer de cabeça e pescoço, câncer nasofaríngeo, câncer de esôfago, câncer de bexiga e outros cânceres uroepiteliais, câncer de estômago, glioma, glioblastoma, testículo, tireoide, osso, vesícula biliar e dutos biliares, útero, câncer de adrenal, sarcomas, GIST, tumores neuroendócrinos e neoplasias hematológicas.

[0163] Em uma modalidade, os anticorpos da presente invenção são utilizados para o tratamento de câncer, por exemplo, câncer de pulmão de pequenas células, câncer de pulmão de células não pequenas (incluindo carcinomas escamosos e adenocarcinomas) câncer de pele incluindo melanoma, câncer de mama (incluindo TNBC), câncer colorretal, câncer gástrico, câncer de ovário, câncer de colo do útero, câncer de próstata, câncer de rim, câncer de fígado, incluindo carcinoma hepatocelular, câncer pancreático, câncer de cabeça e pescoço, câncer nasofaríngeo, câncer de esôfago, câncer de bexiga e outros cânceres uroepiteliais, câncer de estômago, glioma, glioblastoma, testículo, tireoide, osso, vesícula biliar e dutos biliares, útero, câncer adrenal, sarcomas, GIST, tumores neuroendócrinos e neoplasias hematológicas.

[0164] Em uma modalidade adicional, os anticorpos da invenção são utilizados na fabricação de um medicamento para o tratamento de câncer, por exemplo, câncer de pulmão de pequenas células, câncer de pulmão de células não pequenas (incluindo carcinomas escamosos e adenocarcinomas) câncer de pele incluindo melanoma, câncer de mama (incluindo TNBC), câncer colorretal, câncer gástrico, câncer de ovário, câncer cervical, câncer de próstata, câncer de rim, câncer de fígado, incluindo carcinoma hepatocelular, câncer pancreático, câncer de cabeça e pescoço, câncer de nasofaringe, câncer de esôfago, câncer de bexiga e outros tumores uroepiteliais cancros, cancro do estômago, glioma, glioblastoma, testículo, tiroide, osso, vesícula biliar e vias biliares, uterina, cancros adrenais, sarcomas, GIST, tumores neuroendócrinos e neoplasias hematológicas.

[0165] Em uma modalidade, os anticorpos (por exemplo, anticorpos monoclonais, fragmentos de anticorpos, nanocorpos, moléculas e composições multiespecíficas e biespecíficas, etc.) da invenção podem ser utilizados para detectar níveis de CRTAM ou níveis de células imunes que contêm CRTAM em sua superfície de membrana, cujos níveis podem ser associados a certos sintomas da doença para diagnóstico.

[0166] Em outra modalidade, os anticorpos (por exemplo, anticorpos monoclonais, moléculas e composições multiespecíficas e biespecíficas) da invenção podem ser inicialmente testados quanto à atividade de ligação associada ao uso terapêutico ou diagnóstico in vitro. Por exemplo, as composições da invenção podem ser testadas usando os ensaios citométricos de fluxo descritos nos exemplos abaixo.

[0167] Em algumas modalidades, os anticorpos (por exemplo, anticorpos monoclonais, moléculas e composições multiespecíficas e biespecíficas) da invenção têm utilidade adicional na terapia e diagnóstico de doenças. Por exemplo, os anticorpos monoclonais, as moléculas multiespecíficas ou biespecíficas podem ser usadas para provocar in vivo ou in vitro uma ou mais das seguintes atividades biológicas: induzir e/ou melhorar a ativação de uma célula imune; mediar a fagocitose ou ADCC de uma célula na presença de células efetoras humanas que expressam CRTAM ou bloquear um ligante de CRTAM da ligação a CRTAM.

[0168] Em uma modalidade particular, os anticorpos (por exemplo, anticorpos monoclonais, moléculas e composições multiespecíficas e biespecíficas) são utilizados in vivo para tratar, prevenir ou diagnosticar uma variedade de doenças. Exemplos de doenças relevantes incluem, entre outros, tecidos de câncer humano que representam câncer de pulmão de pequenas células, câncer de pulmão de células não pequenas (incluindo carcinomas escamosos e adenocarcinomas) câncer de pele incluindo melanoma, câncer de mama (incluindo TNBC), câncer colorretal, câncer gástrico, câncer de ovário, câncer cervical, câncer de próstata, câncer de rim, câncer de fígado, incluindo carcinoma hepatocelular, câncer pancreático, câncer de cabeça e pescoço, câncer nasofaríngeo, câncer de esôfago, câncer de bexiga e outros cânceres uroepiteliais, câncer de estômago, glioma, glioblastoma, testículo, tireoide, osso, vesícula biliar e dutos biliares, câncer uterino, adrenal, sarcomas, GIST, tumores neuroendócrinos e neoplasias hematológicas.

[0169] Vias adequadas para administtar as composições de anticorpos (por exemplo, anticorpos monocionais, moléculas e composições multiespecíficas e biespecíficas) da invenção in vivo e in vitro são bem conhecidas na técnica e podem ser selecionadas pelos versados. Por exemplo, as composições de anticorpo podem ser administradas por injeção (por exemplo, intravenosa ou subcutânea). Dosagens adequadas das moléculas utilizadas dependerão da idade e peso do sujeito e da concentração e/ou formulação da composição de anticorpos.

[0170] Como descrito anteriormente, os anticorpos anti-CRTAM da invenção podem ser coadministrados com um ou mais agentes terapêuticos adicionais, por exemplo, um agente imunoestimulador, um agente citotóxico, um agente radiotóxico ou um agente imunossupressor. Um anticorpo pode ser ligado a um agente (como um imunocomplexo) ou pode ser administrado separadamente do agente. No último caso (administração separada), o anticorpo pode ser administrado antes, depois ou simultaneamente com o agente ou pode ser coadministrado com outras terapias conhecidas, por exemplo, uma terapia anticâncer, por exemplo, terapia de radiação. Tais agentes terapêuticos incluem, entre outros, agentes antineoplásicos, como doxorrubicina (adriamicina), sulfato de cisplatina-bleomicina, carmustina, clorambucil e hidroxiureia da ciclofosfamida que, por si só, são eficazes apenas em níveis tóxicos ou subtóxicos para um paciente. Outros agentes adequados para coadministração com os anticorpos da invenção incluem outros agentes utilizados para o tratamento de cânceres, tais como Avastine, 5FU e gemcitabina. A coadministração dos anticorpos anti-CRTAM ou os fragmentos de ligação ao antígeno do mesmo da presente invenção com agentes quimioterapêuticos fornece dois agentes anticâncer que operam através de diferentes mecanismos que produzem um efeito citotóxico para as células tumorais humanas. Essa coadministração pode resolver problemas devido ao desenvolvimento de resistência a fármacos ou a uma alteração na antigenicidade das células tumorais.

[0171] As células efetoras específicas do alvo, por exemplo, células efetoras ligadas a composições (por exemplo, anticorpos monoclonais, moléculas multiespecíficas e biespecíficas) da invenção também podem ser usadas como agentes terapêuticos. As células efetoras para direcionar podem ser leucócitos humanos, como macrófagos, neutrófilos ou monócitos. Outras células incluem eosinófilos, células exterminadoras naturais e outras células portadoras de receptor de IgG ou IgA. Se desejado, células efetoras podem ser obtidas do sujeito a ser tratado. As células efetoras específicas do alvo podem ser administradas como uma suspensão de células em uma solução fisiologicamente aceitável. O número de células administradas pode ser da ordem de 1083-109, mas variará dependendo da finalidade terapêutica.

[0172] A terapia com células efetoras específicas do alvo pode ser realizada em conjunto com outras técnicas. Por exemplo, a terapia antitumoral utilizando as composições (por exemplo, anticorpos monocionais, moléculas multiespecíficas e biespecíficas) da invenção e/ou células efetoras armadas com essas composições pode ser usada em conjunto com quimioterapia. Além disso, a imunoterapia combinada pode ser usada para direcionar duas populações efetoras citotóxicas distintas para a rejeição de células tumorais.

[0173] As moléculas biespecíficas e multiespecíficas da invenção também podem ser usadas para modular os níveis de FcyR ou FeyR em células efetoras, tais como capeamento e eliminação de receptores na superfície celular. Misturas de receptores anti-Fc também podem ser usadas para esse fim.

[0174] Aspectos da invenção incluem kits que compreendem as composições de anticorpos da invenção (por exemplo, anticorpos monoclonais, moléculas biespecíficas ou multiespecíficas) e instruções para o uso das mesmas, por exemplo, no tratamento de câncer. O kit pode ainda conter um ou mais reagentes adicionais, como um reagente imunossupressor, um agente citotóxico ou um agente radiotóxico ou um ou mais anticorpos adicionais da invenção (por exemplo, um anticorpo com uma atividade complementar que se liga a um epítopo no antígeno CRTAM distinto do primeiro anticorpo).

[0175] Por conseguinte, os pacientes tratados com composições de anticorpos da invenção podem ser adicionalmente administrados (antes, simultaneamente ou após a administração de um anticorpo da invenção) outro agente terapêutico, como um agente citotóxico ou radiotóxico, que aprimora ou aumenta o efeito terapêutico dos anticorpos.

[0176] Em outras modalidades, o sujeito pode ser tratado adicionalmente com um agente que modula, por exemplo, melhora ou inibe a expressão ou atividade dos receptores Fcy ou Fcy, por exemplo, tratando o sujeito com uma citocina. As citocinas preferidas para administração durante o tratamento com a molécula multiespecífica incluem fator estimulador de colônias de granulócitos (G-CSF), fator estimulador de colônias de granulócitos e macrófagos (GM-CSF), interferon-y (IFN-y) e fator de necrose tumoral (TNF).

[0177] As composições (por exemplo, anticorpos, moléculas multiespecíficas e biespecíficas) da invenção também podem ser usadas para direcionar células que expressam FeyR ou CRTAM, por exemplo, para marcar essas células. Para tal uso, o agente de ligação pode ser ligado a uma molécula que pode ser detectada. Assim, a invenção fornece métodos para localizar células ex vivo ou in vitro que expressam receptores Fc, tais como FeyR ou CRTAM. O marcador detectável pode ser, por exemplo, um radioisótopo, um composto fluorescente, uma enzima ou um cofator enzimático.

[0178] Em uma modalidade específica, a invenção fornece métodos para detectar a presença do antígeno CRTAM em uma amostra ou medir a quantidade do antígeno CRTAM, que compreende o contato com a amostra e uma amostra de controle, com um anticorpo monoclonal ou uma porção de ligação ao antígeno do mesmo, que se liga especificamente ao CRTAM, sob condições que permitem a formação de um complexo entre o anticorpo ou porção do mesmo e o CRTAM. A formação de um complexo é então detectada, em que uma diferença na formação de complexos entre a amostra em comparação com a amostra de controle é indicativa da presença do antígeno CRTAM na amostra.

[0179] Em outras modalidades, a invenção fornece métodos para o tratamento de um distúrbio imunomediado em um sujeito, por exemplo, cânceres em humanos, câncer de pulmão de pequenas células, câncer de pulmão de células não pequenas (incluindo carcinomas escamosos e adenocarcinomas) câncer de pele incluindo melanoma, câncer de mama (incluindo TNBC), câncer colorretal, câncer gástrico, câncer de ovário, câncer cervical, câncer de próstata, câncer de rim, câncer de fígado, incluindo carcinoma hepatocelular, câncer pancreático, câncer de cabeça e pescoço, câncer nasofaríngeo, câncer de esôfago, câncer de bexiga e outros cânceres uroepiteliais, estômago câncer, glioma, glioblastoma, testicular, tireoide, osso, vesícula biliar e dutos biliares, útero, câncer adrenal, sarcomas, GIST, tumores neuroendócrinos e neoplasias hematológicas.

[0180] Todas as referências citadas neste relatório descritivo, incluindo, sem limitação, todos os artigos, publicações, patentes, pedidos de patentes, apresentações, textos, relatórios, manuscritos, brochuras, livros, publicações na Internet, artigos em periódicos, periódicos, fichas técnicas de produtos e similares, incorporados por referência a esta especificação em sua totalidade. A discussão das referências aqui contidas visa meramente resumir as afirmações feitas por seus autores e não se admite que qualquer referência constitua a técnica anterior e os Requerentes se reservam o direito de contestar a precisão e a pertinência das referências citadas.

[0181] Embora a invenção anterior tenha sido descrita em alguns detalhes a título de ilustração e exemplo para fins de clareza de entendimento, será facilmente aparente para os versados na técnica, à luz dos ensinamentos desta invenção, que certas mudanças e modificações podem ser feitas sem divergir do âmbito da invenção ou escopo das reivindicações dependentes.

[0182] A presente invenção é ainda ilustrada pelos seguintes exemplos que não devem ser interpretados como limitantes adicionais. Os exemplos, sequências e figuras a seguir são fornecidos para auxiliar o entendimento da presente invenção, cujo verdadeiro escopo é apresentado nas reivindicações anexas. Entende-se que modificações podem ser feitas nos procedimentos estabelecidos sem se afastar do espírito da invenção.

EXEMPLOS: EXEMPLO 1: GERAÇÃO E TRIAGEM DE ANTICORPOS

GERAÇÃO DE HIBRIDOMA

[0183] Os anticorpos monoclonais anticCRTAM de rato foram gerados por imunização genética. O ECD de CRTAM (SEQ ID NO: 12) foi usado para criar um plasmídeo pB8-CRTAM-hum.ECD (Aldevron, Freiburg) para imunização. O plasmídeo pB8-CRTAM-hum.ECD foi utilizado para imunizar três ratos. Os esplenócitos de ratos imunizados foram fundidos com uma linha celular de mieloma para gerar hibridomas usando técnicas padrão da indústria.

TESTE DE IMUNIZAÇÃO E TITULAÇÃO EM RATOS

[0184] Os animais foram imunizados com o vetor (pB8-CRTAM-hum.ECD). Para a detecção da presença de anticorpos específicos do alvo ("título de anticorpo") no soro dos animais imunizados, foi realizado um ensaio baseado em citometria de fluxo (teste FACS).

TELA DE HIBRIDOMA

[0185] Um ensaio de FACS foi utilizado para identificar a superexpressão de células de hibridoma. Um Cento e oito clones de hibridoma foram identificados como positivos no rastreamento primário.

TELA SECUNDÁRIA

[0186] A quimera hoRTAM/Fc recombinante (R&D Systems, catálogo 1695-CR) foi revestida a 100 ng/cavidade em placas de ensaio de alta ligação (Nº de Cat 12-565-136, Thermo Scientific) diluídas em solução salina tamponada com fosfato 1X Dulbecco (DPBS) (Nº de Cat SH30028-03, Thermo Scientific). As placas foram lavadas três vezes com tampão de lavagem, 1X DPBS e 0,05% de Tween 20 (Nº de Cat BP337-500, Fisher Scientific) usando a lavadora de placa de 96 cavidades Tecan Hydro speed.

[0187] As placas revestidas com antígeno foram bloqueadas com uma solução de superbloco (disponível na Thermo fisher) por 1 hora em temperatura ambiente (RT) após a lavagem.

[0188] Foram adicionados 100 ul de sobrenadante de hibridoma, 1:5 diluído em tampão ELISA (tampão ELISA, 1X DPBS, 0,05% de Tween 20 e 1% de albumina de soro bovino, Nº de Cat SH30574.02, Thermo Scientific) a cada cavidade. Após a incubação do anticorpo primário, as placas foram lavadas três vezes com tampão de lavagem. Um anticorpo secundário conjugado com HRP, IgG de cabra anti-rato diluído 1:5000 em tampão ELISA (Jackson Immunoresearch específico da cadeia H&L, Jackson Immunoresearch, número de catálogo 112-035-167) foi adicionado às placas durante uma hora em temperatura ambiente. A placa foi lavada três vezes em tampão de lavagem. Adicionou-se Ultra TMB-ELISA em 1 etapa (Nº de Cat 34028, Thermo Scientific) a cada cavidade para desenvolver um sinal detectável. Depois de o sinal ter sido completamente desenvolvido, foi adicionado ácido sulfúrico 2N (Nº de Cat 8140-

16, Ricca Chemical Company) a todos as cavidades para parar a reação. À Densidade Ótica (DO) de cada amostra foi determinada usando o leitor de microplacas VERSA max no comprimento de onda de 450 nm.

EXEMPLO 2: CARACTERIZAÇÃO ESTRUTURAL DE

ANTICORPOS MONOCLONAIS A CRTAM

[0189] As sequências de cDNA que codificam as regiões variáveis das cadeias pesada e leve dos anticorpos monoclonais foram obtidas utilizando técnicas padrão de PCR e foram sequenciadas usando técnicas padrão de sequenciação de DNA. As regiões variáveis da cadeia pesada e leve de 5A11 selecionadas na tela podem ser vistas na Figura 1.

[0190] As sequências nucleotídicas e de aminoácidos da região variável da cadeia pesada de 5A11 são mostradas na SEQID NO: 3 e 1, respectivamente.

[0191] As sequências nucleotídicas e de aminoácidos da região variável da cadeia leve de 5A11 são mostradas na SEQID NO: 4 e 2, respectivamente.

[0192] Análises adicionais da sequência 5A11 VH usando o sistema Kabat da determinação da região CDR levaram ao delineamento das regiões CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada, como mostrado nas SEQ ID NOs: 5, 6 e 7, respectivamente. A Figura 1a mostra sequências 5A11 VH com CDR1, CDR2 e CDR3 em caixa.

[0193] Análises adicionais da sequência VL 5A11 utilizando o sistema Kabat da determinação da região CDR levaram ao delineamento das regiões CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve, como mostrado nas SEQ ID NOs: 8, 9 e 10, respectivamente. A Figura 1b mostra sequências 5A11 VL com CDR1, CDR2 e CDR3 em caixa.

EXEMPLO 3: ESPECIFICIDADE DE ANTICORPOS

MONOCLONAIS PARA CRTAM DETERMINADOS POR ANÁLISE POR CITOMETRIA DE FLUXO PREPARAÇÃO DE CELULAS T ATIVADAS IN VITRO

[0194] As células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) foram isoladas do revestimento buffy humano como descrito acima. As 2E6 células/ml! de PBMC foram cultivadas em meio de cultura de células T (meio AIM V com 5% de FBS, Nº de Cat SH3008703, Fisher, Pittsburgh, PA) e 300 u IL2 (Nº de Cat 200-02, Peprotech, Rocky Hill, NJ) na presença de 100 ng/ml de anti-CD3 (OKT3) por 4 dias. Em seguida, as células foram cultivadas com esferas de ativação anti-CD3/anti-CD28 (Nº de Cat 11132D, Thermo Fisher, Waltham, MA) por 24 horas antes da análise FACS (dados não mostrados).

ENSAIO IMUNOSSORVENTE LIGADO A ENZIMA (ELISA)

[0195] A análise de separação celular ativada por fluorescência (FACS) foi realizada em formato de placa de 96 cavidades, de acordo com protocolos padrão. As células T ativadas foram preparadas como acima. Todas as etapas subsequentes do protocolo de coloração foram realizadas em gelo com reagentes gelados, exceto as etapas de centrifugação que foram realizadas em temperatura ambiente. Diluições em série triplas dos anticorpos foram preparadas em tampão FACS para dar uma curva de titulação de 12 pontos com concentrações finais variando de 133 nM a 1 pM. Os sobrenadantes de hibridoma correspondentes, controles de isotipo e anticorpos de controle positivo foram diluídos em tampão FACS gelado para serem testados em um único ponto com uma concentração final de 30 nM. As diluições de anticorpos foram dispensadas (100 ul/cavidade) em uma cavidade para cada linha celular. Uma cavidade foi deixada não corado no tampão FACS. Após 30 minutos de incubação com anticorpo primário ou controle, as células foram lavadas duas vezes por adição de tampão FACS seguido por centrifugação por minutos a 1200 rpm. O sobrenadante foi descartado e os péletes celulares foram retidos. O anticorpo secundário, anti-lgG de rato de cabra (H+L)-RPE foi diluído a uma concentração de trabalho de 1 vpgo/ml e aplicado a todas as cavidades, exceto uma das cavidades não coradas com anticorpo primário. O anticorpo secundário foi incubado com as células por 30 minutos. As células foram lavadas duas vezes por adição de tampão FACS seguido por centrifugação durante 5 minutos a 1200 rpm. O péletes celulares finais foram ressuspensos em 150 ul de tampão FACS + 50 ul de paraformaldeído a 4% e fixados até estarem prontos para serem adquiridos em um citômetro de fluxo. As placas foram deixadas a 4 ºC até a aquisição. A intensidade média geométrica de fluorescência (GMFI ou Geo Mean) de cada amostra foi determinada usando um citômetro de fluxo de alto rendimento Guava Easycyte Plus (placas de 96 cavidades) e os dados brutos foram analisados usando o Guava Cytosoft Pro Software Module, versão 2.2.2 (Millipore, Billerica MA). A Geo Mean foi plotada versus a concentração de anticorpos e o software GraphPad'"Y Prism foi utilizado para realizar regressão não linear, análise sigmoidal da dose-resposta e calcular ECB50 para a ligação do anticorpo às células T ativadas.

[0196] A Figura 3 mostra a ligação relacionada à dose específica de 5A11 às células T ativadas, em comparação com o anticorpo anti- CRTAM comercialmente disponível CR24.1 (BioLegend). Como pode ser visto, o anticorpo 5A11 mostra ligação superior às células T ativadas.

EXEMPLO 4 REATIVIDADE CRUZADA DE ANTICORPOS ANTI-CCRTAM

ENSAIO IMUNOSSORVENTE LIGADO A ENZIMA (ELISA)

[0197] A análise do ensaio imunossorvente ligado a enzima (ELISA) foi realizada em formato de placa de 96 cavidades, de acordo com protocolos padrão. A placa ELISA de 96 cavidades (Nº de Cat 12-565-136, Thermo Scientific) foi revestida durante a noite a 4ºC com 100 ul de 1 ug/ml de proteínas cino CRTAM HIgG1-Fc em 1X de solução salina tamponada com fosfato (DPBS) de Dulbecco (Nº de Cat SH30028-03, Thermo Scientific). A placa foi lavada três vezes com tampão de lavagem, 1X DPBS e 0,05% de Tween 20 (Nº de Cat BP337-500, Fisher Scientific), bloqueada com 250 ml de tampão superblock (Nº de Cat 37515, Thermo Scientific) por 30 minutos em temperatura ambiente, em seguida lavado novamente três vezes com tampão de lavagem.

[0198] Os anticorpos anti-cCRTAM foram diluídos em série 1:3 em tampão ELISA, 1X DPBS, 0,05% de Tween 20 e 1% de albumina de soro bovino (Nº de Cat SH30574.02, Thermo Scientific), para obter uma curva de titulação de 8 pontos com concentração final variando de 0,003 a 2 ug/ml e aplicada às cavidades em duplicata. A última cavidade foi deixada em branco no tampão ELISA. Após 60 minutos de incubação com o anticorpo primário, a placa foi lavada três vezes em tampão de lavagem.

[0199] O anticorpo secundário, AffiniPure IgG anti- rato conjugado com peroxidase (H+L) foi diluído 1:5000 em tampão ELISA e foi aplicado às cavidades com os anticorpos CRTAM e controle de isotipo por 60 minutos. O IgG anti-rato de cabra AffiniPure F(ab')2 conjugado com peroxidase também foi diluído em 1:5000 em tampão ELISA e foi aplicado às cavidades com CR24.1 por 60 minutos.

[0200] A placa foi lavada três vezes em tampão de lavagem. Adicionou-se Ultra TMB-ELISA em 1 etapa (Nº de Cat 34028, Thermo Scientific) a cada cavidade para desenvolver um sinal detectável. Depois de o sinal ter sido completamente desenvolvido, foi adicionado ácido sulfúrico 2N (Nº de Cat 8140-16, Ricca Chemical Company) a todos as cavidades para parar a reação. A Densidade Ótica (DO) de cada amostra foi determinada usando o leitor de microplacas VERSA max no comprimento de onda de 450 nm. A absorvância para cada amostra foi calculada em média a partir de cavidades duplicadas, plotada versus concentração de anticorpos, e o EC50 foi calculado usando regressão não linear e análise sigmoidal da dose-resposta.

[0201] O anticorpo anti-cCRTAM 5A11 demonstrou ligação à proteina CRTAM de cinomolgo de maneira dependente da dose, enquanto verificou-se que CR24.1 não se ligava à proteina CRTAM de cinomolgo. A Figura 4 mostra a reatividade cruzada de 5A11.

EXEMPLO 5: CAPACIDADE DE ANTICORPOS ANTI-

CRTAM PARA ATIVAR CELULAS T E ESTIMULAR A PRODUÇÃO DE IFNL

PREPARAÇÃO DE CELULAS T ATIVADAS IN VITRO POR ANTICORPOS ANTI-CCRTAM E ANTI-CD3

[0202] As placas de cultura não tecido de 96 cavidades foram revestidas com 2 ug/ml de OKT3 e diferentes concentrações de anticorpos/isotipos anti-CRTAM (tituladas de 20 pg/ml com diluição de 1:2 11 vezes) a 4 ºC durante a noite. As placas foram lavadas com PBS duas vezes, seguido de bloqueio com AIMV mais 5% de FBS por 30 min. Após o bloqueio, 0,1 milhão de células T iniciadas com OKT3 (Dia 4), produzidas como descrito no Exemplo 3, foram ressuspensas em meio AIMV fresco e adicionadas às placas. Após um dia de incubação a 37 ºC, os sobrenadantes foram coletados e diluídos para uso em um ensaio IFNy ELISA.

ENSAIO IMUNOSSORVENTE LIGADO A ENZIMA (ELISA) PARA DETERMINAÇÃO DE IFNy

[0203] O IFNy foi medido com o correspondente Ready-SET-Go! Kit ELISA da eBiosciences (Nº de Cat 50-173-24 Fischer Scientific). Seguindo as instruções do fabricante, a placa de alta ligação (Corning 3690) foi revestida com anticorpo de captura (1:250 diluído em tampão de revestimento) durante a noite a 4 ºC e depois lavada com tampão de lavagem (PBS + 0,05% Tween-20) três vezes. A placa foi bloqueada com Diluente de Ensaio durante 1 hora em um agitador. O sobrenadante da cultura de células foi adicionado às placas em diluição apropriada (1:400 para IFNy) e incubado por 2 horas em um agitador seguido de lavagem 3 vezes. Anticorpos de detecção biotinilados (fornecidos no kit) diluídos 1:250 em Diluente de Ensaio foram adicionados e incubados por 1 hora em um agitador de placas. A placa foi lavada com tampão de lavagem e foi adicionada uma Estreptavidina conjugada com HRP (fornecida no kit) diluída 1:1000 em Diluente de Ensaio. Após 30 minutos de incubação em um agitador de placas, a placa foi lavada e a solução de substrato TMB (fornecida no kit) foi adicionada. A reação de desenvolvimento foi parada após aproximadamente 5 a 10 minutos com a adição de solução de H2SO4 2N e a absorção foi lida em um leitor de placas a 450 nm (OD450).

RESULTADOS

[0204] O anticorpo 5A11 mostrou atividade aprimorada nas células T pré-ativadas OKT3 refletidas no aumento da produção de IFNy quando comparado ao anticorpo CR24.1 (Figura 5). Isso mostra que os anticorpos direcionados ao CRTAM terão efeito terapêutico em pacientes com sistema imunológico inibido.

EXEMPLO 6: HUMANIZAÇÃO DO ANTICORPO 5A11

[0205] A humanização do anticorpo monoclonal 5A11 de rato foi realizada utilizando a tecnologia de enxerto de CDR. Para guiar o processo de humanização e ajudar na decisão de conservar os resíduos parentais de ratos ou substituí-los por suas contrapartes germinativas humanas, foi construído um modelo molecular de homologia do anticorpo monoclonal Fv de 5A11.

[0206] A definição das CDRs é baseada na nomenclatura Kabat. A seleção de regiões aceitadoras de estrutura humana nas quais as regiões CDR de ratos 5A11 são enxertadas foi realizada pesquisando o banco de dados de genes V de humanos e ratos IMGT usando IgBLAST, desenvolvido na NCBI para facilitar a análise de sequências da região V de imunoglobulina, com sequências de região variável de rato SA11 como entrada. A estratégia aplicada foi usar as sequências da linha germinativa humana que são sequências humanas naturais que não contêm as mutações somáticas idiossincráticas encontradas nas sequências individuais de anticorpos humanos.

MODELO “MOLECULAR DE HOMOLOGIA DO ANTICORPO DE RATO 5A11

METODOLOGIA DA CONSTRUÇÃO DE MODELOS DE HOMOLOGIA

[0207] Um modelo do anticorpo BUH-SA11-F2 ('5A11') foi construído de acordo com protocolos estabelecidos (Ramos OHP.

Computer-assisted modeling of antibody variable domains. Methods Mol Biol 2012; 907: 39 a 55). As sequências variáveis das cadeias pesada (VH) e leve (VL) foram numeradas/anotadas separadamente de acordo com a convenção IMGT, a fim de separar a estrutura e as sequências de CDR.

[0208] Os resíduos da estrutura VL foram utilizados para pesquisar as sequências de estruturas de anticorpos resolvidas através da proteína BLAST. O maior acerto foi fornecido pelo VL da estrutura de 4AIZ (resolução de 1.75 A) (65 de 108 resíduos idênticos). Este foi selecionado como modelo, no entanto, o acerto classificado ligeiramente mais baixo fornecido pelo VL da estrutura 3G6D (resolução de 3.20 A) (64 de 107 resíduos idênticos) foi empregado para fixar a conformação da serina N terminal ausente do 4AIZ. À sequência VL CDR?2 era uma correspondência idêntica à de 4AIZ; portanto, não havia necessidade de procurar um modelo de CDR2. As sequências de VL CDR1 e CDR3, com a adição de dois resíduos em cada extremidade, foram usadas para pesquisar as sequências de estruturas de anticorpos resolvidas através de uma proteína BLAST. O principal sucesso do VL CDR3 foi a estrutura INFD (resolução de 2.80 A) (11 de 15 resíduos idênticos). Nenhuma estrutura de anticorpo de murino ou de rato combina com a sequência de CDR1 com a adição de dois resíduos em cada extremidade; procurar estruturas de anticorpo de murino ou rato com a estrutura VL também não produz bons resultados aproximados. A melhor correspondência para CDR1, pesquisando através de estruturas humanas, retornou o V-lambda humano em 4AIZ (5 de 10 resíduos idênticos) usado como modelo de VL. O PyMol (PyYMOL Molecular Graphics System, Versão 1.3r1, Schrodinger, LLC.) foi usado para ajustar o modelo CDR3 ao modelo de estrutura usando as duas saliências nas extremidades para ancorar o fragmento de modelo CDR ao modelo de estrutura VL. O modelo parcial de VL montado foi submetido manualmente a mutagênese (em PyMol), com seleção de rotâmeros ótimos, a fim de corresponder à sequência 5A11 VL.

[0209] Os resíduos da estrutura VH foram utilizados para pesquisar as sequências de estruturas de anticorpos resolvidas através da proteína BLAST.

O maior acerto foi fornecido pelo VH da estrutura de anticorpo de rato SAUM (resolução de 2.05 A) (85 de 116 resíduos idênticos); este anticorpo é da mesma linha germinativa de IGHV10-5 que 5A11 e foi, portanto, selecionado como modelo.

As sequências de VM CDR1, CDR2 e CDR3, com a adição de dois resíduos em cada extremidade, foram usadas para pesquisar as sequências de estruturas de anticorpos resolvidas através da proteína BLAST.

O maior acerto para o VH CDR1 foi fornecido pela estrutura do 4HPY (resolução de 1.50 A) (9 de 11 resíduos idênticos). O maior acerto para VH CDR?2 foi fornecido pela estrutura de SAUM (11 de 14 resíduos idênticos). O maior acerto para o VH CDR3, 1Q72, não foi selecionado como modelo devido à presença de 4 lacunas no alinhamento; em vez disso, a estrutura de acertos com classificação inferior 4BZ1 (resolução de 1.50 A) (7 de 14 resíduos idênticos) foi selecionada; isso ocorre porque uma sobreposição dos fragmentos 1072 e 4BZ1 CDR3 mostra que as seções N e C terminais combinam bem com o modelo de estrutura e entre si, enquanto o 4BZ1 proporciona fechamento satisfatório da inserção de sequência encontrada no 1Q72. Os modelos de CDR foram ajustados ao modelo de estrutura (em PyMol) usando as duas saliências nas extremidades para ancorar cada fragmento de modelo CDR ao modelo de estrutura.

Finalmente, o modelo parcial de VH montado foi submetido manualmente a mutagênese (em PyMol), com seleção de rotâmeros ótimos, a fim de coincidir com a sequência de 5A11 VH.

Posteriormente, o melhor arranjo terciário dos modelos parciais VH e VL foi selecionado para montar o modelo final.

As sequências dos modelos VH e VL foram submetidas ao PAPS (Packing Angle Prediction Server - Abhinandan KR, Martin ACR.

Análise e previsão de empacotamento vh/vl em anticorpos.

Protein Eng Des Sel 2010; 23:689 a 697), a fim de encontrar um arranjo terciário mais adequado previsto.

O servidor PAPS previu que a estrutura de anticorpos resolvida 1D5B, com um ângulo de empacotamento relativo de -44,5 graus, proporcionaria o melhor arranjo terciário de VH e VL.

Assim, o modelo final foi montado ajustando as coordenadas da coluna vertebral dos segmentos de âncora conservados (resíduos 41a 44 e 101 a 104) dos modelos parciais VH e

VL para 1D5B (em PyMol). Por fim, as coordenadas deste modelo final foram submetidas a uma rodada de minimização de energia utilizando GROMACS (Van Der Spoel D, Lindahl E, Hess B, Groenhof G, Mark AE, Berendsen HJC. Gromacs: rápido, flexível e gratuito. J] Comput Chem 2005; 26: 1701 a 1718) com o campo de força GROMOSS96 (Scott WRP, Hunenberger PH, Tironi IG, Mark AE, Billeter SR, Fennen J, Torda AE, Huber T, Kruger P, van Gunsteren WF. O pacote do programa de simulação biomolecular gromos. J. Phys. Chem. A 1999; 103: 3596 a 3607).

PROJETO DE CORRENTE PESADA

DIFERENÇAS DE AMINOÁCIDOS COM A MAIORIA DAS LINHAS GERMINATIVAS HOMOLOGAS DE RATOS, IGHV10-5 * 01

[0210] A sequência de aminoácidos da VH isolada do hibridoma 5A11 de rato (as regiões CDR de acordo com o esquema de numeração de Kabat estão em negrito). FR1 CDR1 FR2 CDR2

AVQLVESGGGLVQPKESLKISCAASGFTFSDAAMYWVR

QAPGKGLEWVARIRTKTNNYAAH FR3 CDR3 FR4

YVESVKGRFTVSRDDSKSMVYLQMDNLKTDDTAMYYC

TSVPQGTQDYWGQGVMVTVSS 91% de identidade (91 resíduos idênticos de um total de 100 aminoácidos) entre a região variável da cadeia pesada (VH) de rato SAI1 e a imunoglobulina da linha germinativa do rato VH 10-5 * 01 (IGHV10-5* 01).

<rmmmmmmmn—== FR Pon ><CDR><-----FR2----> 5A11 VH 1 AVOLVESGGGLVQPKESLKISCAASGFTFSDAAMYWVRQAPGKGLEWVA 49 IGHV10-5*01 1 oia Novi 49 <nno== CDR2-----=><--ennnennonne= ER Zone >

5A11 VH 50

RIRTKTNNYAAHYVESVKGRFTVSRDDSKSMVYLQMDNLKTDDTAMYYCTS 100 IGHV10-5*01 50.....P....TY.AD....viilencsonis Ena .A 100

SELEÇÃO DE REGIÕES VH ACEITADORAS DE ESTRUTURA HUMANA

[0211] A seleção de regiões VH aceitadoras de estrutura humana nas quais as regiões CDR de rato 5A11 são enxertadas foi realizada pesquisando o banco de dados do gene VH humano IMGT usando IGBLAST com a sequência de aminoácidos da região VH de rato como entrada. Com base no alinhamento da sequência do anticorpo Parental às linha germinativas humanas, as entradas correspondentes mais próximas foram identificadas. A identificação da linha germinativa humana ideal como aceitadora foi baseada nos seguintes critérios ordenados: identidade de sequência em toda a estrutura, conforme definido por Kabat, e identidade e/ou compatibilidade de resíduos da interface entre cadeias e loops de suporte com as conformações canônicas das CDRs parentais. A partir dessa análise, a linha germinativa humana IGHV3-73 * 01 parecia ser a melhor escolha como regiões aceitadoras da estrutura humana, com uma porcentagem geral de identidade de 75% (75 resíduos de um total de 100). Assim, esta linha germinativa humana foi usada para o design da versão humanizada. O gene J2 da linha germinativa do rato (IGHJ2*01) foi identificado como o gene do segmento mais homólogo ao correspondente gene 5A11 VH J do rato. No FRA4, a sequência do 5A11 VH é idêntica à do gene da linha germinativa IGHJ2*01 de rato. O gene do segmento J2 do rato foi comparado aos genes do segmento J humano sobre CDR3 e FRA4, e o segmento J humano IGHJ4 (IGHJ4*01) foi selecionado.

PROJETO USANDO A LINHA GERMINATIVA HUMANA 1GHV3-73*01 COMO REGIÕES ACEITADORAS DE ESTRUTURA

VERSÃO HUMANIZADA A

[0212] As CDRs de rato (negrito) como definidas pela nomenclatura Kabat foram enxertadas no IGHV3-73*01 para obter a sequência detalhada abaixo. Os resíduos sublinhados são resíduos estruturais de rato (fora dos resíduos CDR), isto é, conservados a partir da sequência VH 5A11 de rato parental; eles foram conservados porque podem ser estruturalmente importantes para manter a atividade completa do anticorpo.

VERSÃO A FR1 CDR1 FR2

EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFSDAAMYWVRQASGKGLEWVA CDR2 FR3

RIRTKTNNYAAHYVESVKGRFTVSRDDSKNTVYLQMNSLKTEDTAMYYCTS 85% de identidade (85/100) da versão humanizada A com linha germinativa humana IGHV3-73*01 <onmmemmnnmen= ER | enonnnnnn==><CDR><-----FR2----> 5A11-373-VHA 1

EVOLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFSDAAMYWVRQASGKGLEWVA 49 IGHV3-73*01 1 Lin GS. H.oo[oÀ[[1....G 49 <——ã CDR2--————=> <= R$ mn > 5A11-373-VHA 50

RIRTKTNNYAAHYVESVKGRFTVSRDDSKNTVYLQMNSLKTEDTAMYYCTS 100 IGHV3-73*01 50 ...S.A.S..TA.AA..... doll Asi V..R 100

[0213] Na estrutura 2 (FR2), o resíduo Kabat H49 Ala é conhecido como "resíduo Vernier"; é adjacente ao VH-CDR?2 e pode afetar as conformações CDR e o ajuste fino do reconhecimento de antígenos. Na estrutura 3 (FR3), os resíduos Kabat H69 Val e H78 Val são conhecidos como "resíduos Vernier". Eles são adjacentes às CDRs e podem afetar as conformações da CDR e o ajuste fino do reconhecimento de antígeno.

DESIGN DE CADEIA LEVE

DIFERENÇAS DE AMINOÁCIDOS COM A MAIORIA DAS LINHAS GERMINATIVAS HOMOLOGAS DE RATOS, IGLV4-S1*01 Sequência de aminoácidos de VL 5A11 de rato (regiões CDR destacadas) FR1 CDR1 FR2

SYELIQPPSASVTLGNTVSLTCVGDELSKRYVQWSQQKPDKTIVSVIY CDR2 FR3 CDR3 FR4

KDSERPSGISDRFSGSSSGTTATLTIHGTLAEDEADYYCLSTYSDDNLPVYFGG

GTKLTVL 97,9% (94/96) de identidade (94 resíduos idênticos de um total de 96 aminoácidos) entre a VL de rato 5A11 e a variável lambda da imunoglobulina da imunoglobulina da linha germinativa do rato IGLV4-S1*01.

<enaeneee= PR | mena ><--CDRI1 -==-><-----FR2-----> 5A11 VL 1 SYELIQPPSASVTLGNTVSLTCVGDELSKRYVQWSQQKPDKTIVSVIY 48 IGLV4-S1*011 nn A Von 48 <CDR2-><------eeno= FR3-nnnnnnnnnnnn><--CDR3-- 96 5A11 VvL 49 KDSERPSGISDRFSGSSSGTTATLTIHGTLAEDEADYYCLSTYSDDNL 96 IGLV4-S1*01 49 sis 96

SELEÇÃO DE REGIÕES VL ACEITADORAS DE ESTRUTURA HUMANA

[0214] A seleção de regiões VL aceitadoras de estrutura humana nas quais as regiões CDR de ratos 5A11 VL são enxertadas foi realizada pesquisando o banco de dados de genes VL humanos IMGT usando IgBLAST com a sequência de aminoácidos da região VL de rato como entrada. Com base no alinhamento da sequência do anticorpo Parental às linha germinativas humanas, as entradas correspondentes mais próximas foram identificadas. A identificação da linha germinativa humana ideal como aceitadora foi baseada nos seguintes critérios ordenados: identidade de sequência em toda a estrutura, conforme definido por Kabat, e identidade e/ou compatibilidade de resíduos da interface entre cadeias e loops de suporte com as conformações canônicas das CDRs parentais. A partir dessa análise, a linha germinativa humana, IGLV3-27*01, pareceu ser a melhor escolha como regiões aceitadoras da estrutura humana com uma porcentagem geral de identidade de 64,6% (62 resíduos de aminoácidos de um total de 96). Assim, esta linha germinativa humana foi usada para o projeto das versões humanizadas.

[0215] O gene J1 da linha germinativa do rato (IGKJ1*01) foi identificado como o segmento genético mais homólogo ao gene 5A11 VL JU do rato correspondente). O segmento do gene J1 do rato foi comparado aos genes do segmento J humano sobre CDR3 e FRA4, e o segmento J humano IGKJ2 (IGKJ2*01) apresentou a maior homologia geral.

PROJETO USANDO A LINHA GERMINATIVA HUMANA GLV3-27*01 COMO REGIÕES ACEITADORAS DE ESTRUTURA

VERSÃO HUMANIZADA

[0216] As CDRs de ratos, conforme definidas pela numeração de Kabat, foram enxertadas em IGLV3-27*01 para obter a sequência detalhada abaixo. Um número de resíduos de estrutura de rato estruturalmente importantes para manter a atividade completa do anticorpo foi retido. Isto deu uma versão humanizada com87,5% de identidade (84 resíduos de aminoácidos de 96) com a linha germinativa IGLV3-27*01 humana.

<ommmmem== FR Iene ><--CDR1---><-——— FR2-----> 5A11-327-VLC

SYELTQPSSVSVSPGQTARITCESGDVLSKRYAQWSQQKPGQAIVSVIY <CDR2-><---————— PR3-———-—-------><--cCDR3-- 5A11-327-VLC

KDSERPSGIPERFSGSSSGTTATLTISGAQVEDEADYYCLSTYADDNL <enenmeeeo FR enem > <--CDR1-=-><-----FR2-----> 5A11-327-VLC

SYELTQPSSVSVSPGQTARITCESGDVLSKRYAQWSQQKPGQAIVSVIY

IGLV3-27*01 Lc AKAREFooL. PL.

<CDR2-><---—-————. R QR3-------------><--CDR3-- 5A11-327-VLC

KDSERPSGIPERFSGSSSGTTATLTISGAQVEDEADYYCLSTYADDNL IGLV3-27*01 cin Mun VAN.

EXEMPLO 7 ENSAIO DE PERFORINA/GRANZIMA

[0217] O potencial citotóxico induzido por anticorpos anti-CRTAM foi avaliado medindo a produção de perforina e granzima B por linfócitos citotóxicos CD8+ após estimulação. As células T CD8 humanas foram isoladas negativamente de PBMCs de doadores saudáveis com kit comercialmente disponível (Miltenyi Biotec). As células CD8 isoladas foram estimuladas com CD3 ligado à placa (OKT3, 0,1 ug/ml) e doses diferentes de 5A11 por 4 dias. Após estimulação na placa, as células CD8 foram tratadas com PMA (25 ng/ml), lonomicina (10 pg/ml) e brefeldina (10 pug/ml) durante 4 h. As células foram então lavadas, fixadas com PFA a 4% durante 10 min e coradas com anticorpos de perforina e granzima B para citometria de fluxo diluídas em PBS contendo 0,5% de saponina por 15 min. Após a coloração, as células foram lavadas 2x em PBS contendo 0,5% de saponina e 1x em tampão FACS (PBS contendo 2% de FCS e 2 mM de EDTA). As células lavadas foram ressuspensas em tampão FACS e analisadas usando o citômetro de fluxo Attune NxT (Fisher Scientific). Conforme detalhado na Figura 7 e na Figura 8, a estimulação com doses crescentes de 5A11 aumentou o potencial citotóxico de células T CD8 de maneira dependente da dose.

EXEMPLO 8 ENSAIO DE CITOTOXICIDADE DE

CÉLULAS T

[0218] A citotoxicidade de células T contra células de câncer de mama MCF-7 usando anticorpos anti-CRTAM foi avaliada usando o anticorpo biespecífico Her2/CD3 como uma âncora para células T e células MCF-7. Foi observada citotoxicidade adicional quando foram adicionados anticorpos anti-CRTAM às cavidades de ensaio contendo células tumorais,

PBMCs e anticorpo biespecífico Her2/CD3. A porcentagem de citotoxicidade associada à ação do anticorpo anti-CRTAM foi calculada como porcentagem de morte quando comparada às células não tratadas com anticorpos anti-CRTAM.

[0219] PBMCSs isoladas de fresco foram colhidas por centrifugação durante 5 minutos a 1000 xg e diluiu-se em meio DMEM completo para 1.5E6 células/ml. As PBMCs foram aliquotadas e os anticorpos de teste adicionados (anticorpo 5A11) a 20 ug/ml. As células foram incubadas em gelo por 10 a 20 minutos. As células MCF-7 foram coletadas e diluídas a uma densidade de 1.5Es células/ml.

[0220] 50 ul das suspensões celulares resultantes de PBMCs e MCF-7 foram adicionados a cada cavidade, de modo que cada cavidade continha 75.000 células PBMCs e MCF-7. O anticorpo biespecífico Her2/CD3 foi diluído em série em meio DMEM completo e 10 ul desta diluição foram adicionados a cada cavidade para produzir 5 ug/ml de diluição final em cada cavidade de ensaio.

[0221] As cavidades não tratadas com 50 ul/cavidade de meio de cultura representaram controles negativos. As placas de ensaio foram incubadas por 96 horas a 37 ºC com 5% de CO?2. Após a incubação, as placas de ensaio foram equilibradas à TA durante 30 minutos. Os PBMCs foram removidos e descartados deixando as células MCF-7 nas cavidades de ensaio. As placas foram lavadas três vezes com PBS à RT e foram adicionados 100 ul de RT PBS a cada cavidade. O reagente Cell Titer-Glo& (Nº de Cat. 67572, Promega, Madison, WI) foi preparado de acordo com as instruções do fabricante e dispensado 100 ul/cavidade. O reagente foi pipetado dentro e fora das cavidades de ensaio várias vezes para misturar e induzir a lise celular. A placa de ensaio foi incubada durante 15 minutos no escuro. A luminescência foi registrada usando um luminômetro GloMaxO (Promega) de acordo com as recomendações do fabricante.

[0222] A contagem de células viáveis foi proporcional às unidades de luminescência e a média foi calculada para cada concentração nas cavidades analisadas. A porcentagem de viabilidade foi calculada usando cavidades sem o anticorpo de Teste como controle e foi plotada versus a concentração de anticorpos.

[0223] Como pode ser visto na Figura 9, a adição do anticorpo 5A11 aumentou significativamente o nível de citotoxicidade em comparação com o controle sem o anticorpo 5A11.

EXEMPLO 9 ELISPOT COM LINFOCITOS

INFILTRANTES TUMORAIS

[0224] Os linfócitos infiltrantes tumorais derivados de tumores primários (TlLs) de tumores NSCLC (Figura 10) ou câncer de mama (Figura 11) foram estimulados por 96 h com CR24.1, 5A11 ou pembrolizumabe diluído nas concentrações indicadas e OKT3 diluído em 1 ug/ml em meios de cultura RPMI completos. Após estimulação, as TIlLs foram colhidas, contadas e plaqueadas na placa IFNy ELISPOT (Mabtech) a 100 000 células/cavidade. À placa foi incubada a 37 ºC durante 24 horas e, subsequentemente, desenvolvida de acordo com as instruções do fabricante. O número de pontos foi lido usando o analisador ImmunoSpot& Series 5 ELISPOT; os dados foram analisados usando o software GraphPad Prism.

[0225] A Figura 10 mostra que o anticorpo 5A11 ativa um número maior de TILs derivados de NSCLC refletindo uma produção de IFNy significativamente maior do que o anticorpo comercia CR24.1 ou o pembrolizumabe.

[0226] A Figura 11 mostra que o anticorpo SAN1T e o pembrolizumabe ativam um número semelhante de TILs derivados de câncer de mama para produzir IFNy.

EXEMPLO 10 RESPOSTA DE DOSE ELISPOT COM

LINFOCITOS INFILTRANTES TUMORAIS

[0227] Os linfócitos infiltrantes de tumores derivados de tumores primários (TILs) de tumores NSCLC foram estimulados por 96 h com 5A11 a 0,1 pa/ml, 1,0 pg/ml ou 10 pg/ml, pembrolizumabe (10 ug/ml) ou OKT3 diluído a 1 ug/ml em meios de cultura RPMI completos. Após estimulação, as TILs foram colhidas, contadas e plaqueadas na placa IFNy ELISPOT (Mabtech) a 100 000 células/cavidade. A placa foi incubada a 37 ºC durante 24 horas e, subsequentemente, desenvolvida de acordo com as instruções do fabricante. O número de pontos foi lido usando o analisador ImmunoSpotO Series 5 ELISPOT; os dados foram analisados usando o software GraphPad Prism.

[0228] A Figura 12 mostra que todas as doses de 5A11 ativaram TILs para produzir quantidades mais altas de IFNy em relação à produzida por pembrolizumabe.

EXEMPLO 11 CITOTOXICIDADE MEDIADA POR PBMC

[0229] As células K562 foram coradas como descrito no kit Delfia& (Promega). As células K562 coradas como alvos foram misturadas com PBMC de doador saudável (pré-cultivado durante 72 horas com IL-2) na proporção alvo para efetor de 1:20 na presença de 5A11, CR24.1 ou pembrolizumabe diluído para 10 ug/ml. A IL-2 a 50 Ul/ml foi usada como controle positivo para o ensaio. Todas as condições foram repetidas em triplicado. À cocultura foi incubada a 37 ºC durante 3 horas. Após 3 horas, 20 ul dos sobrenadantes da cocultura foram coletados e analisados conforme as instruções do fabricante (Delfia& Promega). Os resultados foram lidos usando o leitor de placas SpectraMax M5 para Fluorescência Resolvida no Tempo (TRF) a excitação de 320 nm, emissão 615, atraso de 100 microssegundos, integração de 100 microssegundos. Todos os controles recomendados pelo fabricante para permitir o cálculo de lise específica foram incluídos no ensaio e os cálculos foram realizados conforme detalhado no manual de instruções do kit. A Figura 13 mostra que o anticorpo 5A11 provocou significativamente mais lise celular do que o anticorpo comercial CR24.1 ou pembrolizumabe.

EXEMPLO 12 AVALIAÇÃO IN VIVO DE EFICÁCIA ANTITUMORAL DO ANTICORPO 5A11, NO MODELO DE CAMUNDONGO NSCLC MIXENO NCG HUMANO DE HCC827

[0230] O controle do isotipo (10 mg/kg; BIWx3) e o anticorpo 5A11 (10 mg/kg; BIWx3) foram testados no modelo in vivo; cada coorte continha 10 camundongos. Cada coorte foi dividida ao meio, em que 5 camundongos receberam injeção intraperitoneal de PBMCs isolados e preparados a partir de um dos dois doadores humanos saudáveis. Três dias depois, os camundongos foram inoculados por via subcutânea com células tumorais HCC827. Um dia depois, o tratamento com anticorpos de teste foi iniciado no esquema de dosagem descrito acima. Os pesos corporais (PC) foram monitorados e os tumores foram medidos três vezes por semana. Os camundongos foram examinados frequentemente quanto à saúde e efeitos colaterais adversos. Os camundongos foram sacrificados mediante evidências de doença do enxerto versus hospedeiro. O resultado do tratamento foi determinado por inibição do crescimento tumoral (TGI), uma medida da diferença no volume tumoral médio em um grupo de tratamento em relação ao grupo de controle, conforme medido no dia indicado do estudo. A Figura 14 demonstra que após 15 dias, os tumores em camundongos tratados com anticorpo 5A11 eram significativamente menores do que aqueles em animais tratados com um anticorpo de controle de isotipo.

EXEMPLO 13 AFINIDADE DE LIGAÇÃO DO ANTICORPO HUMANIZADO 5A11

[0231] A afinidade de ligação do anticorpo humanizado 5A11 foi determinada por Octet& (ForteBio) empregando biossensores de captura Anti-hlgG (Nº de Cat 18-5060).

[0232] Os biossensores ForteBio de captura de IgG- Fc anti-humano (AHC) foram carregados com os anticorpos de teste a uma concentração de 1 ug/ml por 300 segundos.

[0233] Os biossensores carregados foram incubados com 5 concentrações de quimera ORTAM/Fc recombinante humana a partir de 200 nM, a qual foi diluída em série 1:3; uma cavidade de referência continha apenas tampão cinético (para corrigir a deriva).

[0234] Os dados de todas as concentrações foram ajustados usando uma curva global de 1:1 para cada amostra. Sempre que possível, as taxas de associação e de dissociação cinéticas e os valores de Ko foram determinados.

[0235] A análise mostrou que o anticorpo humanizado 5A11 tinha as características mostradas abaixo na Tabela 2.

TABELA 2 [prosa | ot Tea 79 fia] fat comico [comi [Ge Does Tao [un] em | am | 15 |

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[seg Do Deserição E Sequência

AVOLVESGGGLVOQPKESLKISCAASGFTFSDAAMYWVRQAPGKGLEWVARIRTKTNN 5A11 VH aa YAAHYVESVKGRFTVSRDDSKSMVYLOMDNLKTDDTAMYYCTSVPQGTQDYWGOG

VMVTVSS

TAN RFSGSSSGTTATLTIHGTLAEDEADYYCLSTYSDDNLPVFGGGTKLTVL atgttagtactacagtagatittagtgactactctititeaagetaticatigtacagtacagettatigagtctagtagageatiog tocagcctaaggagicatigaaaatctcatotacagectetagaticacaticagigatactgccatotacigagicogecag 5A11 VH nt getecaggaaagogtctagagtagatiacacacatacgaactaaaactaataattatacagegcattatatizagicagto aaagocagaticaccatetocagagatgaticaaaaageatogictacctacaaatogataacttgaaaactgatgacac agccatgtattactgtacgteagicccccaaggaacacaggattactagggccaagaagicatggicacagictcetca atggectagatetetettatictacctetactetetetatatacagattatataaccagetatgagitaatocaaccaceticagea tcagtcactctaggaaatactotetcactcactigtoteggagatgaatiatcaaaaagatatoticagiggtcicaacaaaa 5A11 VL nt gccagacaagaccattgtatecgtaatatacaaagatagcgagcggecctcaggacatetetgacegattctetagitoecag ctecaggacaacagecactetgacaatccatageaccctagetaaggataagactgattattactatitatcaacatatagt gatgataatctccctataticagigatagaaccaageteactatecta | 5 | SAI VA Cora UBAAM [eo sAmMECDRAaa [o RIRTKINNVARAVVESVRE o | | 8 | save cor aa O veelskava | e | sA VE CDRA aa O KBSERPS O

MWWRVLSLLAWFPLOQEASLTNHTETITVEEGQTLTLKCVTSLRKNSSLOWLTPSGFTIF LNEYPALKNSKY QLLHHSANQLSITVPNVTLODEGVYKCLHYSDSVSTKEVKVIVLATP

FKPILEASVIRKQNGEEHVVLMCSTMRSKPPPOITWLLGNSMEVSGGTLHEFETDGKK n CRTAM (095727) CNTTSTLIIHTYGKNSTVDCIIRHRGLOGRKLVAPFRFEDLVTDEETASDALERNSLSSO

DPQQPTSTVSVTEDSSTSEIDKEEKEQTTQDPDLTTEANPQYLGLARKKSGILLLTLVS FLIFILFIIVOLFIMKLRKAHVIWKKENEVSEHTLESYRSRSNNEETSSEEKNGQOSSHPM RCMNYITKLYSEAKTKRKENVOHSKLEEKHIQVPESIV

SLTNHTETITVEEGOTLTLKCVTSLRKNSSLQWLTPSGFTIFLNEYPALKNSKYQLLHHS ECD de CRTAM ANQLSITVPNVTLODEGVYKCLHYSDSVSTKEVKVIVLATPFKPILEASVIRKQNGEEHV 12 (aa18 - 287 da SEQID | VLMCSTMRSKPPPOQITWLLGNSMEVSGGTLHEFETDGKKCNTTSTLIIHTYGKNSTVD NO: 11) CIIRHRGLOGRKLVAPFRFEDLVTDEETASDALERNSLSSQDPQQPTSTVSVTEDSSTS

EIDKEEKEQTTQDPDLTTEANPOYLGLARKKSG

EVOLVESGGGLVOPGGSLKLSCAASGFTFSDAAMYWVRQASGKGLEWVARIRTKTN 13 5A11 VHA aa NYAAHYVESVKGRFTVSRDDSKNTVYLQMNSLKTEDTAMYYCTSVPOGTQDYWGAQG

TLVTVSS ERFSGSSSGTTATLTISGAQVEDEADYYCLSTYADDNLPVFGGGTKLTVL EVOLVESGGGLVOPGGSLKLSCAASGFTFSDAAMYWVRQASGKGLEWVARIRTKTN NYAAHYVESVKGRFTVSRDDSKNTVYLOMNSLKTEDTAMYYCTSVPOGTQDYWGAG

TLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVH 17 5A11 VHA Fc aa TFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQOTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTC

TS PPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVEHEDPEVKFNWYVDGVEV HNAKTKPREEQOYNSTYRVVSVLTVLHODWLNGKEYKCKVSNKAFPAPIEKTISKAKGO PREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDS DGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLSLSPGK**

SYELTQOPSSVSVSPGQTARITCSGDVLSKRYAQWSQQKPGQAIVSVIYKDSERPSGIP 5A11 VLC327 Fc aa | ERFSGSSSGTTATLTISGAQVEDEADYYCLSTYADDNLPVFGGGTKLTVLGQPKAAPS

VTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKY AASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS*

Claims

U7 REIVINDICAÇÕES

1. —Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga ao CRTAM, sendo que o dito anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno é caracterizado pelo fato de que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende: uma sequência de CDR-H1 que compreende a SEQ ID NO: 5; uma sequência de CDR-H2 que compreende a SEQ ID NO: 6; e uma sequência de CDR-H3 que compreende a SEQ ID NO: 7.

2. —Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma região variável da cadeia leve que compreende pelo menos uma sequência de CDR selecionada a partir do grupo que consiste em: sequência CDR-L1 que compreende uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 15; sequência de CDR-L2 que compreende a SEQIDNO: 9; e sequência de CDR-L3 que compreende uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 10 e SEQ ID NO: 16.

3. — Anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a região variável da cadeia leve compreende: CDR-L1 que compreende a sequência da SEQ ID NO: 8; CDR-L2 que compreende a sequência da SEQ ID NO: 9; e CDR-L3 que compreende a sequência da SEQ ID NO: 10.

4. —Anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a região variável da cadeia leve compreende:

CDR-L1 que compreende a sequência da SEQ ID NO: 15; CDR-L2 que compreende a sequência da SEQ ID NO: 9; e CDR-L3 que compreende a sequência da SEQ ID NO: 16.

5. — Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que se liga ao CRTAM, sendo que o dito anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno é caracterizado pelo fato de que compreende: uma região variável da cadeia pesada que compreende: uma CDR-H1 que compreende SEQ ID NO: 5; uma CDR-H2 que compreende SEQ ID NO: 6; e uma CDR-H3 que compreende SEQ ID NO: 7; e uma região variável da cadeia leve que compreende: uma CDR-L1 que compreende SEQ ID NO: 15; uma CDR-L2 que compreende a SEQ ID NO: 9; e uma CDR-L3 que compreende SEQ ID NO: 16; ou uma variante da mesma, em que a referida variante tem i) independentemente 1, 2, 3, 4, 5 ou 6, substituições, adições e/ou deleções de aminoácidos em qualquer uma ou mais da dita CDR-H1, da dita CDR-H2, da dita CDR-H3, da dita CDR-L1, da dita CDR-L2 e da dita CDR-L3; ou ii) coletivamente 1, 2,3,4,5,6,7,8,9 ou 10 substituições de aminoácidos, adições e/ou deleções no conjunto de CDRs que compreende a dita CDR-H1, a dita CDR-H2, a dita CDR-H3, a dita CDR-L1, a dita CDR-L2 e a dita CDR-L3.

6. —Anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, sendo que o dito anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno caracterizado pelo fato de que compreende: i) as 3 CDRs de cadeia pesada da SEQID NO: 1e as 3 CDRs de cadeia leve da SEQ ID NO: 2 ou ii) as3CDRsda cadeia pesada da SEQIDNO: 13eas3 CDRs da cadeia leve da SEQ ID NO: 14; em que as CDRs são definidas pelo sistema de numeração Kabat ou Chothia.

7. —Anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende: uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96% 97% 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO: 13 e uma região variável da cadeia leve compreendendo uma sequência que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96% 97% 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO: 14.

8. —Anticorpo, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende a SEQ ID NO: 13 e uma região variável da cadeia leve que compreende a SEQ ID NO: 14.

9. —Anticorpo, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que se liga a um epítopo em uma proteína CRTAM reconhecida por um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, ou que concorre cruzadamente pela ligação com um anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 aB.

10. Anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que retém pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98% ou pelo menos cerca de 99% da afinidade de ligação para CRTAM humano do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8.

11. Anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno é um anticorpo monocilonal.

12. Anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno é um fragmento quimérico, humanizado, biespecífico ou anticorpo humano ou fragmento de ligação ao antígeno.

13. Anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno é um anticorpo IgG1 geneticamente modificado com silenciamento Fc ou fragmento de ligação ao antígeno com ligação reduzida ou inexistente a um ou mais receptores Fc.

14. Anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno é capaz de induzir e/ou aumentar a citotoxicidade das células T.

15. Anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o fragmento de ligação ao antígeno é selecionado a partir do grupo que consiste em: Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, Fv, scFv e anticorpo de domínio único.

16. Polinucleotídeo caracterizado pelo fato de que codifica:

i) uma região variável da cadeia pesada de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores; e/ou ii) uma região variável da cadeia leve de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores.

17. Vetor de expressão caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos um polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 16.

18. Célula hospedeira caracterizada pelo fato de que compreende: i. Vetor de expressão que compreende Os polinucleotídeos, de acordo com a reivindicação 16; ou ii. Um primeiro vetor de expressão que compreende o polinucleotídeo que codifica a região variável da cadeia pesada do anticorpo ou uma porção de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 16, e um segundo vetor de expressão que compreende o polinucleotídeo que codifica a região variável da cadeia leve do anticorpo ou uma porção de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 16.

19. Método para fabricar um anticorpo, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende cultivar uma célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 18, sob condições em que o anticorpo, ou o fragmento de ligação ao antígeno, é expresso na célula hospedeira e, opcionalmente, isolando o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno.

20. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, e um veículo farmaceuticamente aceitável.

21. Método para tratar um sujeito com câncer, sendo que o método é caracterizado pelo fato de que compreende administrar uma quantidade eficaz de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo ou composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15 ou 20, ao sujeito.

22. Uso de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo ou uma composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15 ou 20, caracterizado pelo fato de que é na fabricação de um medicamento para uso no tratamento de câncer.

23. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo ou composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15 ou 20, caracterizado pelo fato de que é para uso no tratamento de câncer.

24. Método ou uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 23, caracterizado pelo fato de que o referido câncer é selecionado a partir do grupo que consiste em câncer de pulmão de pequenas células, câncer de pulmão de células não pequenas (incluindo carcinomas escamosos e adenocarcinomas) câncer de pele, incluindo melanoma, câncer de mama (incluindo TNBC), câncer colorretal, câncer gástrico, câncer de ovário, câncer cervical, câncer de próstata, câncer de rim, câncer de fígado, incluindo carcinoma hepatocelular, câncer pancreático, câncer de cabeça e pescoço, câncer nasofaríngeo, câncer de esôfago, câncer de bexiga e outros cânceres uroepiteliais, câncer de estômago, glioma, glioblastoma, câncer testicular, câncer de tireoide, câncer ósseo, câncer de vesícula biliar e duto biliar, câncer de útero, câncer de adrenal, sarcomas, GIST, tumores neuroendócrinos e neoplasias hematológicas.

25. Método ou uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 24, caracterizado pelo fato de que a composição ou medicamento farmacêutico compreende ainda uma quantidade eficaz de um segundo agente terapêutico.

26. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo ou composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15 ou 20, caracterizado pelo fato de que é para uso em terapia ou para uso como medicamento.

cadeia VH 5411, SEQID NO: 1

AVOLVESGGGLVQPKESLKISCAASGFTFSDAAMYWVROAPGKGLEWVA MESVKGRFTVSRDDSKSMVY LOMDNLKTDDTAMY YCTS[VPOGTODYINGOGVMVTVSS Figura 1a cadeia VL 5411, SEQID NO: 2 SYELIQPPSASVTLGNTVSLTCÍVGDELSKRYVOWSQOKPDKTIVSVIYIKDSERPS|GISDRFS

GSSSGTTATLTIHGTLAEDEADYYCILSTYSDDNLPVIFGGGTKLTVL Figura 1b cadeia VH 5411 (humanizada), SEQ ID NO: 13

EVOLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFSDAAMYWVROASGKGLEWVARIRTKTNNYAAH

ESVKGRFTVSRDDSKNTVY LOMNSLKTEDTAMYYCTSIVPOGTODYWGQOGTLVTVSS Figura 2a cadeia VL 5A11 (humanizada), SEQ ID NO: 14 SYELTQOPSSVSVSPGOTARITCEGDVLSKRYAQWSQOKPGEAIVSVIYKDSERPS|GIPERFS

GSSSGTTATLTISGAQVEDEADYYCILSTYADDNLPVFGGGTKLTVL Figura 2b 10000 * + CRI41 8000 + SAM " — 6000 z 4000 a % 2000 + o

0.0001 0,001 0,01 01 1 10 100 concentração (tity mi) Figura 3 e 5411] : + CRI E paes so ossaooo c FA a 2 f Ss É $ ;

Z É 207 O - < FP E O se e SS OSSSSO ooo AAA ni

1.801 nd. dt 1 10 Concentração fugâni) Figura 4 200000 nn E 160000 *- isotipo o & 100000 : & + CR241

Ê 80000 o

0.0001 0,001 001 01 1 10 100 concentração Figura 5

SEQ ID Nol 1 AVOLVESGGGLVQPKESLKISCAASGFTFSDAAMYWVRQOAPGKGLEWVAR 50 AEE EEE ES ES EEE EE rr rr rara SEQ ID Nol3 1 EVOLVESGGGLVOPGGSLKLSCAASGFTFSDAAMYWVROASGKGLEWVAR 50 SEQ ID Nol 51 IRTKTNNYAAHYVESVKGRFTVSRDDSKSMVYLOMDNLKTDDTAMYYCTS 100 VEL E rs ss ds a pr rr dd SEQ ID Nol3 51 IRTKTNNYAAHYVESVKGRFTVSRDDSKNTVYLOMNSLKTEDTAMYYCTS 100 SEQ ID Nol 101 VPOGTODYWGOGVMVTVSS 119 IANSNNNSNNNERRSENNA) SEQ ID Nol3 101 VPOGTODYWGOGTLVTVSS 119 Figura 6a SEQ ID NO2 1 SYELIQOPPSASVTLGNTVSLTCVGDELSKRYVQWSQOKPDKTIVSVIYKD 50 VIA As A Ads des A A ss A rara SEQ ID NOl4 1 SYELTOPSSVSVSPGOTARITCSGDVLSKRYAQWSQOKPGOAIVSVIYKD 50 SEQ ID NO2 51 SERPSGISDRFSGSSSGTTATLTIHGTLAEDEADYYCLSTYSDDNLPVFG 100 VELELELs EELELELEEEEEEE s EEEEEEE sra SEQ ID NOlA 51 SERPSGIPERFSGSSSGTTATLTISGAQVEDEADYYCLSTYADDNLPVFG 100 SEQ ID NO2 101 GGTKLTVL 108

VW SEQ ID NOl4 101 GGTKLTVL 108 Figura 6b

604 “ 5A11 = Isotipo E 40 e s

S E 20 o o 1 10 Concentração ug/ml Figura 7 so e 5A1I1 | ã = lIsotype E 60 'N cs õ 40 Es 1 10 Concentração (ug/ml) Figura 8 o 40 ê o o o 2 2 = o Isotipo 5A11 Figura 9 300 250 ão) Ma a 2 150 Wu z = O 4 100 E 8 == O | ue = [| F ssa — 2 QE 2Ém O & à à S à

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