TWI784322B - 標靶cldn18.2的抗體及其製備方法和應用 - Google Patents
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Abstract
本發明公開了標靶CLDN18.2的抗體或其抗原結合片段及其製備方法和應用。所述抗體包含輕鏈可變區和/或重鏈可變區,所述重鏈可變區包含HCDR1、HCDR2和HCDR3,所述的輕鏈可變區包含LCDR1、LCDR2和LCDR3;其中:所述HCDR1~3以及LCDR1~3所包含的序列詳見本發明。本發明抗體與現有技術相比,結合親和力、ADCC、CDC、生長抑制效應、內吞活性等都有明顯的優勢。
Description
本申請要求申請日為2019/9/30的中國專利申請2019109413163的優先權。本申請引用上述中國專利申請的全文。
本發明涉及生物醫藥領域,尤其涉及一種標靶CLDN18.2的抗體及其製備方法和應用。
癌症是現今人類頭號致命疾病之一。據2018世界衛生組織(WHO)報告稱,每年約新發生1807萬例癌症病患。癌症每年約有955萬例死亡。根據WHO的估計,胃癌是全世界排名第五大最普遍被診斷的癌症。胃癌是癌症相關死亡的第三(對於男性而言)和第四大(對於女性而言)病因。全球每年有100萬新診斷罹患胃癌的患者,美國約35%初次診斷罹患胃癌的患者為轉移性胃癌。確診晚期胃癌5年存活率為5%,中位數生存期約為6個月。治療轉移/復發性胃癌患者的第一線用藥分做兩種情況:(1) HER2-neu試驗陽性病患,使用曲妥珠單抗(Transtuzumab)合併化療藥治療;(2) HER2-neu試驗陰性病患,僅可以化療藥治療,其治療效果不佳(Front Pharmacol. 2018 Sep 13; 9: 404)。
CLDN18 (密連蛋白18,Claudin18)分子剪接變異體1 (CLD18A1,即CLDN18.1)的Genbank登錄編號為NP_057453、NM016369,剪接變異體2 (CLD18A2,即CLDN18.2)的Genbank登錄編號為NM_001002026、NP_001002026)是分子量約27.9/27.72kD的內在跨膜蛋白。密連蛋白是位於上皮和內皮的緊密連接中的內在膜蛋白。另兩個主要的緊密結合家族蛋白是閉合蛋白(occluding)和連接粘合分子(JAM)。密連蛋白是緊密結合的必需成分,在保持上皮細胞極性、控制細胞旁擴散、以及調控細胞生長分化方面起到重要作用。據推測,密連蛋白在構造良好的上皮中幾乎無法接近抗體,但在腫瘤細胞中則變得暴露出來。密連蛋白分子跨細胞膜四次,N端和C端均落在細胞質中。其中,人CLDN18.2 (密連蛋白18.2,Claudin 18.2)蛋白是一個跨膜蛋白,全長261個胺基酸,其中1-23為信號胜肽;其有兩個膜外區域分別為信號胜肽後面大約55個胺基酸的胞外區1 (Extracellular loop 1,ECL1)和23個胺基酸ECL2。CLDN18.1 (密連蛋白18.1,Claudin 18.1)和CLDN18.2在包括第一個TM和環1 (即ECL1)的N端前21個胺基酸中存在差異,而C端的一級蛋白質序列相同。人CLDN18.2和人CLDN18.1的ECL1區域非常相似,而且人CLDN18.2和人CLDN18.1的ECL2區域則完全相同。因而針對人CLDN18.2蛋白標的抗體的開發,需要尋找針對人CLDN18.2蛋白的ECL1區域或空間結構的抗體。這使得這方面的工作變得更加困難。CLDN18.1在正常肺和胃的上皮中選擇性表現(Mol Cell Biol. 2001 Nov;21(21):7380-90.)。CLDN18.2在正常組織中的表現高度受限,僅限於胃上皮的分化細胞中,而不存在於胃幹細胞區。但在若干癌症類型中強烈表現,包括胃、食管、胰腺和肺腫瘤以及人癌症細胞株。該蛋白質的分子量在一些癌症和鄰近的正常組織中存在差異。在健康組織中觀察到的較高分子量的蛋白質可以透過用去糖基化化合物PNGaseF處理組織裂解液而轉變成與癌症中所觀察到相同的分子量。這提示與其正常組織對應物相比,密連蛋白在癌症中N-糖基化較少。這種結構差異很可能產生改變的表位。經典的N-糖基化基序在該分子環D3結構域的116位胺基酸中(CN103509110B)。
目前針對人CLDN18.2抗體研究只有Claudiximab (IMAB362)抗體(參見WO 2014/146672)在臨床試驗階段。IMAB362能夠誘導ADCC (antibody-dependentcell-mediated cytotoxicity,抗體依賴的細胞介導的細胞毒殺作用)效應和CDC (complement dependent cytotoxicity,補體依賴細胞毒殺作用)效應,及介導腫瘤殺傷。IMAB362在治療胃食道癌晚期的I期和II期臨床試驗中表現出鼓舞人心的效力(Eur J Cancer. 2018 Sep;100:17-26)。但IMAB362是人、鼠源嵌合抗體,存在免疫原性風險,親和力不是很高。細胞學實驗證明其僅有微弱的內吞活性,不適合做ADC開發,且治療效果極為有限。由於大量惡性腫瘤的未被滿足的醫學需求,對具有更多可取的藥學特徵的其他CLDN18.2抗體存在需求。因此,本領域缺乏有效的標靶人CLDN18.2蛋白的抗體特別是全人源的抗體,以及細胞結合活性、ADCC活性、CDC活性、生長抑制效應、內吞活性等更好的抗體。
本發明所要解決的技術問題是為了克服本領域缺乏標靶CLDN18.2的抗體的缺陷,提供了一種標靶CLDN18.2 (人密連蛋白18.2)的抗體及其製備方法和應用。
為解決上述技術問題,本發明的第一方面提供了一種標靶CLDN18.2的抗體或其抗原結合片段,其包含輕鏈可變區(VL)和/或重鏈可變區(VH),所述重鏈可變區包含HCDR1、HCDR2和HCDR3,所述的輕鏈可變區包含LCDR1、LCDR2和LCDR3;其中:所述HCDR1包含如SEQ ID NO: 8所示的胺基酸序列或其變異體1,所述HCDR2包含選自SEQ ID NO: 16及其變異體2、SEQ ID NO: 18及其變異體3中的胺基酸序列,所述HCDR3包含SEQ ID NO: 26~29中的任一個所示的胺基酸序列,所述LCDR1包含SEQ ID NO: 42所示的序列或其變異體4,所述LCDR2包含SEQ ID NO: 47所示的序列或其變異體5,所述LCDR3包含SEQ ID NO: 55所示的序列或其變異體6;所述變異體為在原始序列基礎上進行1個、2個或3個胺基酸的取代、缺失或添加,包含上述變異體的抗體或抗原結合片段保持與CLDN18.2結合能力。
在類似“具有3、2或1個胺基酸突變”中“胺基酸突變”是指相較於原胺基酸序列而言,變異體的序列存在胺基酸的突變,包括在原胺基酸序列的基礎上發生胺基酸的插入、缺失或替換。示例性的解釋是對CDR的突變可以包含3個、2個或1個胺基酸的突變,這些CDR之間可以任選地選擇相同或不同數目的胺基酸殘基進行突變,例如可以是對CDR1進行1個胺基酸的突變,對CDR2和CDR3不進行胺基酸突變。
本發明中,所述突變可以包括目前如本領域技術人員公知的突變,例如在抗體的生產或者應用過程中,可能會對抗體進行的一些突變,例如對可能存在的,特別是CDR區的轉錄後修飾(Potential post-translational modifications, PTMs)的位點進行突變,包括抗體的聚集、天冬醯胺酸脫醯胺基(asparagine deamidation)敏感位點(NG,NS,NH等)、天冬胺酸異構(DG,DP)敏感位點、N糖基化(N-{P}S/T)敏感位點及氧化敏感位點等相關突變。
關於如上所述的”變異體”,其中:
所述變異體1的突變優選至少發生於SEQ ID NO:8所示胺基酸序列的第6位和/或第7位。
所述變異體2的突變優選至少發生於SEQ ID NO:16所示胺基酸序列的第5位。
所述變異體3的突變優選至少發生於SEQ ID NO:18所示胺基酸序列的第3位。
所述變異體4的突變優選至少發生於SEQ ID NO:42所示胺基酸序列的第8位和/或第9位。
所述變異體5的突變優選至少發生於SEQ ID NO:47所示胺基酸序列的第1位和/或第4位。
所述變異體6的突變優選至少發生於SEQ ID NO:55所示胺基酸序列的第3~5位中的一位或者多位。
較佳地,所述變異體1含有突變S6G和/或Y7F,所述變異體2含有突變G5R,所述變異體3含有突變D3E,所述變異體4含有突變S8R和/或N9Y,所述變異體5含有突變G1D和/或T4N,所述變異體6含有突變Y3R/N、N4S以及N5Y中的一個或多個。
在本發明一較佳實施方案中,所述變異體1的胺基酸序列如SEQ ID NO:6或7所示。
在本發明一較佳實施方案中,所述變異體2的胺基酸序列如SEQ ID NO:17所示;
在本發明一較佳實施方案中,所述變異體3的胺基酸序列如SEQ ID NO: 19所示;
在本發明一較佳實施方案中,所述變異體4的胺基酸序列如SEQ ID NO: 40或41所示;
在本發明一較佳實施方案中,所述變異體5的胺基酸序列如SEQ ID NO: 48所示;
在本發明一較佳實施方案中,所述變異體6的胺基酸序列如SEQ ID NO: 56~58任一所示。
在本發明一更佳實施方案中,所述HCDR1的胺基酸序列如SEQ ID NO: 7所示、所述HCDR2的胺基酸序列如SEQ ID NO: 17所示且所述HCDR3的胺基酸序列如SEQ ID NO: 27所示;所述HCDR1的胺基酸序列如SEQ ID NO: 8所示、所述HCDR2的胺基酸序列如SEQ ID NO: 18所示且所述HCDR3的胺基酸序列如SEQ ID NO: 28所示;所述HCDR1的胺基酸序列如SEQ ID NO: 8所示、所述HCDR2的胺基酸序列如SEQ ID NO: 16所示且所述HCDR3的胺基酸序列如SEQ ID NO: 29所示;或者,所述HCDR1的胺基酸序列如SEQ ID NO: 8所示、所述HCDR2的胺基酸序列如SEQ ID NO: 19所示且所述HCDR3的胺基酸序列如SEQ ID NO: 28所示;
和/或,所述LCDR1的胺基酸序列如SEQ ID NO: 41所示、所述LCDR2的胺基酸序列如SEQ ID NO: 48所示且所述LCDR3的胺基酸序列如SEQ ID NO: 56所示;所述LCDR1的胺基酸序列如SEQ ID NO: 42所示、所述LCDR2的胺基酸序列如SEQ ID NO: 47所示且所述LCDR3的胺基酸序列如SEQ ID NO: 57所示;所述LCDR1的胺基酸序列如SEQ ID NO: 42所示、所述LCDR2的胺基酸序列如SEQ ID NO: 47所示且所述LCDR3的胺基酸序列如SEQ ID NO: 55所示;或者,所述LCDR1的胺基酸序列如SEQ ID NO: 42所示、所述LCDR2的胺基酸序列如SEQ ID NO: 47所示且所述LCDR3的胺基酸序列如SEQ ID NO: 58所示。
優選地,所述VH還包括重鏈可變區框架區(VH FWR),和/或,所述VL還包括輕鏈可變區框架區(VL FWR);
更優選地,所述VH FWR為人抗體的重鏈可變區框架區,所述VL FWR為人抗體的輕鏈可變區框架區。其中:
編碼所述重鏈可變區框架區的基因優選來源於生殖系V基因IGHV3-23;較佳地,所述重鏈可變區框架區中,HFR1包含如SEQ ID NO: 2~4任一所示的胺基酸序列或其變異體,HFR2包含如SEQ ID NO: 10~14任一所示的胺基酸序列或其變異體,HFR3包含如SEQ ID NO: 21~24任一所示的胺基酸序列或其變異體,HFR4包含如SEQ ID NO: 31~33任一所示的胺基酸序列或其變異體。
編碼所述輕鏈可變區框架區的基因優選來源於生殖系V基因IGKV3-11或者IGKV3-15;
較佳地,所述輕鏈可變區框架區中,LFR1包含如SEQ ID NO: 35~38任一所示的胺基酸序列或其變異體,LFR2包含如SEQ ID NO: 44或45所示的胺基酸序列或其變異體,LFR3包含如SEQ ID NO: 50~53任一所示的胺基酸序列或其變異體,LFR4包含如SEQ ID NO: 60或61所示的胺基酸序列或其變異體。
在本發明一最佳實施方案中,所述HCDR1的胺基酸序列如SEQ ID NO: 7所示、所述HCDR2的胺基酸序列如SEQ ID NO: 17所示、所述HCDR3的胺基酸序列如SEQ ID NO: 27所示、所述LCDR1的胺基酸序列如SEQ ID NO: 41所示、所述LCDR2的胺基酸序列如SEQ ID NO: 48所示且所述LCDR3的胺基酸序列如SEQ ID NO: 56所示;
所述HCDR1的胺基酸序列如SEQ ID NO: 8所示、所述HCDR2的胺基酸序列如SEQ ID NO: 18所示、所述HCDR3的胺基酸序列如SEQ ID NO: 28所示、所述LCDR1的胺基酸序列如SEQ ID NO: 42所示、所述LCDR2的胺基酸序列如SEQ ID NO: 47所示且所述LCDR3的胺基酸序列如SEQ ID NO: 57所示;
所述HCDR1的胺基酸序列如SEQ ID NO: 8所示、所述HCDR2的胺基酸序列如SEQ ID NO: 16所示、所述HCDR3的胺基酸序列如SEQ ID NO: 29所示、所述LCDR1的胺基酸序列如SEQ ID NO: 42所示、所述LCDR2的胺基酸序列如SEQ ID NO: 47所示且所述LCDR3的胺基酸序列如SEQ ID NO: 55所示;
所述HCDR1的胺基酸序列如SEQ ID NO: 8所示、所述HCDR2的胺基酸序列如SEQ ID NO: 16所示、所述HCDR3的胺基酸序列如SEQ ID NO: 29所示、所述LCDR1的胺基酸序列如SEQ ID NO: 42所示、所述LCDR2的胺基酸序列如SEQ ID NO: 47所示且所述LCDR3的胺基酸序列如SEQ ID NO: 58所示;
或者,所述HCDR1的胺基酸序列如SEQ ID NO: 8所示、所述HCDR2的胺基酸序列如SEQ ID NO: 19所示、所述HCDR3的胺基酸序列如SEQ ID NO: 28所示、所述LCDR1的胺基酸序列如SEQ ID NO: 42所示、所述LCDR2的胺基酸序列如SEQ ID NO: 47所示且所述LCDR3的胺基酸序列如SEQ ID NO: 57所示。
在本發明一具體實施方案中,所述重鏈可變區包含如SEQ ID NO: 64所示的胺基酸序列或其變異體,且所述輕鏈可變區包含如SEQ ID NO: 71所示的胺基酸序列或其變異體;
所述重鏈可變區包含如SEQ ID NO: 67所示的胺基酸序列或其變異體,且所述輕鏈可變區包含如SEQ ID NO: 73所示的胺基酸序列或其變異體;
所述重鏈可變區包含如SEQ ID NO: 65所示的胺基酸序列或其變異體,且所述輕鏈可變區包含如SEQ ID NO: 72所示的胺基酸序列或其變異體;
所述重鏈可變區包含如SEQ ID NO: 68所示的胺基酸序列或其變異體,且所述輕鏈可變區包含如SEQ ID NO: 74所示的胺基酸序列或其變異體;
或者,所述重鏈可變區包含如SEQ ID NO: 66所示的胺基酸序列或其變異體,且所述輕鏈可變區包含如SEQ ID NO: 72所示的胺基酸序列或其變異體;
其中,所述變異體至少保留突變前序列的功能,且所述變異體與突變前序列的同一性至少為85%,優選至少90%,更優選至少95%,進一步更優選至少99%。
在本申請中,上述所列CDR的胺基酸序列均是按照Chothia定義規則所示出的(本發明的申請專利範圍中也是按照Chothia定義規則所示出的序列)。但是,本領域人員公知,在本領域中可以透過多種方法來定義抗體的CDR,例如基於序列可變性的Kabat定義規則[參見,Kabat等人,免疫學的蛋白質序列,第五版,美國國立衛生研究院,貝塞斯達,馬裡蘭州(1991)]和基於結構環區域位置的Chothia定義規則(參見JMol Biol 273:927-48,1997)。在本申請中,還可以使用包含了Kabat定義和Chothia定義的Combined定義規則確定可變結構域序列中的胺基酸殘基。其中Combined定義規則即是將Kabat定義和Chothia定義的範圍相結合,基於此取了一個更大的範圍,詳見表1-1。本領域技術人員應當理解的是,除非另有規定,否則術語給定抗體或其區(例如可變區)的“CDR”及“互補決定區”應瞭解為涵蓋如透過本發明描述的上述已知方案中的任何一種界定的互補決定區。雖然本發明的申請專利範圍中請求保護的範圍是基於Chothia定義規則所示出的序列,但是根據其他CDR的定義規則所對應的胺基酸序列也應當落在本發明的保護範圍中。
表1-1 本申請抗體CDR定義方法(可參見http://bioinf.org.uk/abs/)
Kabat | Chothia | Combined | |
VL CDR1 | L24--L34 | L24--L34 | L24-L34 |
VL CDR2 | L50--L56 | L50--L56 | L50-L56 |
VL CDR3 | L89--L97 | L89--L97 | L89-L97 |
VH CDR1 | H31--H35 | H26--H32 | H26-H35 |
VH CDR2 | H50--H65 | H52--H56 | H50-H65 |
VH CDR3 | H95--H102 | H95--H102 | H95-H102 |
其中,Laa-Lbb可以指從抗體輕鏈的N端開始,第aa位至第bb位的胺基酸序列;Haa-Hbb可以指從抗體重鏈的N端開始,第aa位至第bb位的胺基酸序列。例如,L24-L34可以指從抗體輕鏈N端開始,按照Chothia編碼規則的從第24位至第34位的胺基酸序列;H26-H32可以指從抗體重鏈N端開始,按照Chothia編碼規則的從第26位至第32位的胺基酸序列。本領域技術人員公知,在用Chothia編碼CDR時,有些位置會有插入位點的情況,例如以本發明中如SEQ ID NO: 17所示的VH CDR2胺基酸序列為例,其在第52位後有52A插入的情況,如下表1-2中所示。
表1-2
胺基酸位置編號 | 52 | 52A | 53 | 54 | 55 | 56 |
VH CDR2(SEQ ID NO: 17) | S | G | S | G | R | S |
優選地,所述標靶CLDN18.2的抗體還包括抗體重鏈恆定區和抗體輕鏈恆定區;
更優選地,所述重鏈恆定區選自hIgG1、hIgG2、hIgG3或hIgG4或其突變,所述輕鏈恆定區選自人源抗體輕鏈κ鏈或者λ鏈或其突變;
進一步更優選地,所述重鏈恆定區為hIgG1,且所述輕鏈恆定區為人源抗體的輕鏈κ鏈。
優選地,所述標靶CLDN18.2的抗體為全長抗體、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFv (single chain antibody fragment,單鏈抗體)、雙特異性抗體、多特異性抗體、重鏈抗體或單域抗體,或由上述抗體製得的單株抗體或多株抗體。所述單株抗體可以由多種途徑和技術進行研製,包括雜交瘤技術、噬菌體展示技術、單淋巴細胞基因選殖技術等,主流是透過雜交瘤技術從野生型或基因轉殖小鼠製備單株抗體。
當所述標靶CLDN18.2的抗體為雙特異性抗體時,其可以包括第一蛋白功能區和第二蛋白功能區。所述第一蛋白功能區可以為上述的蛋白質,其標靶結合CLDN18.2;所述第二蛋白功能區為非標靶結合CLDN18.2的蛋白質或者為同樣標靶結合CLDN18.2但非本發明所述的標靶CLDN18.2的抗體。其中,所述第一蛋白功能區可以為免疫球蛋白,所述第二蛋白功能區可以為一個或多個scFv;或者,所述第二蛋白功能區可以為免疫球蛋白,所述第一蛋白功能區可以為一個或多個scFv。
優選地,所述標靶CLDN18.2的抗體是全長抗體,所述全長抗體包括重鏈和輕鏈,所述重鏈包含如SEQ ID NO: 77~90中任一所示的胺基酸序列,所述輕鏈包含如SEQ ID NO: 93~96任一所示的胺基酸序列。
在一更具體的實施方案中,所述重鏈包含如SEQ ID NO: 77所示的胺基酸序列,所述輕鏈包含如SEQ ID NO: 93所示的胺基酸序列;所述重鏈包含如SEQ ID NO: 78所示的胺基酸序列,所述輕鏈包含如SEQ ID NO: 94所示的胺基酸序列;所述重鏈包含如SEQ ID NO: 79所示的胺基酸序列,所述輕鏈包含如SEQ ID NO: 93所示的胺基酸序列;所述重鏈包含如SEQ ID NO: 85所示的胺基酸序列,所述輕鏈包含如SEQ ID NO: 93所示的胺基酸序列;所述重鏈包含如SEQ ID NO: 83所示的胺基酸序列,所述輕鏈包含如SEQ ID NO: 93所示的胺基酸序列;所述重鏈包含如SEQ ID NO: 84所示的胺基酸序列,所述輕鏈包含如SEQ ID NO: 93所示的胺基酸序列;所述重鏈包含如SEQ ID NO: 81所示的胺基酸序列,所述輕鏈包含如SEQ ID NO: 95所示的胺基酸序列;所述重鏈包含如SEQ ID NO: 82所示的胺基酸序列,所述輕鏈包含如SEQ ID NO: 96所示的胺基酸序列;所述重鏈包含如SEQ ID NO: 80所示的胺基酸序列,所述輕鏈包含如SEQ ID NO: 94所示的胺基酸序列;所述重鏈包含如SEQ ID NO: 86所示的胺基酸序列,所述輕鏈包含如SEQ ID NO: 95所示的胺基酸序列;所述重鏈包含如SEQ ID NO: 87所示的胺基酸序列,所述輕鏈包含如SEQ ID NO: 96所示的胺基酸序列;所述重鏈包含如SEQ ID NO: 88所示的胺基酸序列,所述輕鏈包含如SEQ ID NO: 94所示的胺基酸序列;所述重鏈包含如SEQ ID NO: 89所示的胺基酸序列,所述輕鏈包含如SEQ ID NO: 95所示的胺基酸序列;或者,所述重鏈包含如SEQ ID NO: 90所示的胺基酸序列,所述輕鏈包含如SEQ ID NO: 96所示的胺基酸序列。以下使用表1-3匯總示例抗體的序列編號。
表1-3
註:上表中數字代表各抗體或其功能片段在序列表中的SEQ ID NO:,抗體名稱不對抗體結構起任何限定作用。
抗體名稱 | 輕重鏈類型 | 鏈 | Fv | FR1 | CDR1 | FR2 | CDR2 | FR3 | CDR3 | FR4 |
PR000400 | HC | 75 | 62 | 1 | 5 | 9 | 15 | 20 | 25 | 30 |
PR000400 | LC | 91 | 69 | 34 | 39 | 43 | 46 | 49 | 54 | 59 |
PR002725 | HC | 76 | 63 | 2 | 6 | 10 | 16 | 21 | 26 | 31 |
PR002725 | LC | 92 | 70 | 35 | 40 | 44 | 47 | 50 | 55 | 60 |
PR002726 | HC | 77 | 64 | 2 | 7 | 11 | 17 | 22 | 27 | 31 |
PR002726 | LC | 93 | 71 | 36 | 41 | 45 | 48 | 51 | 56 | 60 |
PR002727 | HC | 78 | 65 | 3 | 8 | 12 | 18 | 21 | 28 | 32 |
PR002727 | LC | 94 | 72 | 37 | 42 | 45 | 47 | 50 | 57 | 60 |
PR003197 | HC | 79 | 64 | 2 | 7 | 11 | 17 | 22 | 27 | 31 |
PR003197 | LC | 93 | 71 | 36 | 41 | 45 | 48 | 51 | 56 | 60 |
PR003340 | HC | 85 | 64 | 2 | 7 | 11 | 17 | 22 | 27 | 31 |
PR003340 | LC | 93 | 71 | 36 | 41 | 45 | 48 | 51 | 56 | 60 |
PR003292 | HC | 83 | 64 | 2 | 7 | 11 | 17 | 22 | 27 | 31 |
PR003292 | LC | 93 | 71 | 36 | 41 | 45 | 48 | 51 | 56 | 60 |
PR003293 | HC | 84 | 64 | 2 | 7 | 11 | 17 | 22 | 27 | 31 |
PR003293 | LC | 93 | 71 | 36 | 41 | 45 | 48 | 51 | 56 | 60 |
PR003289 | HC | 81 | 67 | 4 | 8 | 13 | 16 | 23 | 29 | 31 |
PR003289 | LC | 95 | 73 | 38 | 42 | 45 | 47 | 52 | 55 | 61 |
PR003291 | HC | 82 | 68 | 2 | 8 | 14 | 16 | 24 | 29 | 33 |
PR003291 | LC | 96 | 74 | 38 | 42 | 45 | 47 | 53 | 58 | 60 |
PR003240 | HC | 80 | 66 | 3 | 8 | 12 | 19 | 21 | 28 | 32 |
PR003240 | LC | 94 | 72 | 37 | 42 | 45 | 47 | 50 | 57 | 60 |
PR003890 | HC | 86 | 67 | 4 | 8 | 13 | 16 | 23 | 29 | 31 |
PR003890 | LC | 95 | 73 | 38 | 42 | 45 | 47 | 52 | 55 | 61 |
PR003891 | HC | 87 | 68 | 2 | 8 | 14 | 16 | 24 | 29 | 33 |
PR003891 | LC | 96 | 74 | 38 | 42 | 45 | 47 | 53 | 58 | 60 |
PR003894 | HC | 88 | 66 | 3 | 8 | 12 | 19 | 21 | 28 | 32 |
PR003894 | LC | 94 | 72 | 37 | 42 | 45 | 47 | 50 | 57 | 60 |
PR003897 | HC | 89 | 67 | 4 | 8 | 13 | 16 | 23 | 29 | 31 |
PR003897 | LC | 95 | 73 | 38 | 42 | 45 | 47 | 52 | 55 | 61 |
PR003898 | HC | 90 | 68 | 2 | 8 | 14 | 16 | 24 | 29 | 33 |
PR003898 | LC | 96 | 74 | 38 | 42 | 45 | 47 | 53 | 58 | 60 |
所述突變為所述VL和/或VH的胺基酸序列上發生了一個或多個胺基酸殘基的缺失、取代或添加,且所述突變的胺基酸序列與所述VL和/或VH的胺基酸序列具有至少85%序列同一性,並保持或改善了所述抗體與CLDN18.2的結合;所述至少85%序列同一性優選為至少90%序列同一性;更優選為至少95%序列同一性;最優選為至少99%序列同一性。
本發明中,“Fab片段”由一條輕鏈和一條重鏈的CH1及可變區組成。Fab分子的重鏈不能與另一個重鏈分子形成二硫鍵。“Fc”區含有包含抗體的CH1和CH2結構域的兩個重鏈片段。兩個重鏈片段由兩個或多個二硫鍵並透過CH3結構域的疏水作用保持在一起。“Fab’片段”含有一條輕鏈和包含VH結構域和CH1結構域以及CH1和CH2結構域之間區域的一條重鏈的部分,由此可在兩個Fab’片段的兩條重鏈之間形成鏈間二硫鍵以形成F(ab’)2
分子。“F(ab’)2
片段”含有兩條輕鏈和兩條包含CH1和CH2結構域之間的恆定區的部分的重鏈,由此在兩條重鏈間形成鏈間二硫鍵。因此F(ab’)2
片段由透過兩條重鏈間的二硫鍵保持在一起的兩個Fab’片段組成。術語“Fv”意指向抗體的單臂的VL和VH結構域組成的抗體片段,但缺少恆定區。
本發明中,所述的scFv (single chain antibody fragment,單鏈抗體)可為本領域常規的單鏈抗體,其包括重鏈可變區、輕鏈可變區和15~20個胺基酸的短肽。其中VL和VH結構域透過使其能夠產生為單個多肽鏈的連接體配對形成單價分子[參見,例如,Bird等人,Science 242:423-426 (1988) 和Huston等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883(1988)]。此類scFv分子可具有一般結構:NH2-VL-連接子-VH-COOH或NH2-VH-連接子-VL-COOH。合適的現有技術連接子由重複的G4
S胺基酸序列或其變異體組成。例如,可使用具有胺基酸序列(G4
S)4
或(G4
S)3
連接子,但也可使用其變異體。
術語“多特異性抗體”按其最廣義使用,涵蓋具有多表位特異性的抗體。這些多特異性抗體包括但不限於:包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)的抗體,其中該VH-VL單元具有多表位特異性;具有兩個或多個VL和VH區的抗體,每個VH-VL單元與不同的標的或同一個標的的不同表位結合;具有兩個或更多個單可變區的抗體,每個單可變區與不同的標的或同一個標的的不同的表位結合;全長抗體、抗體片段、雙特異性抗體(diabodies)、和三抗體(triabodies)、共價或非共價連接在一起的抗體片段等。
本發明的抗體包括單株抗體。本發明所述的單株抗體或mAb或Ab,指由單一的選殖細胞株得到的抗體,所述的細胞株不限於真核的,原核的或噬菌體的選殖細胞株。
本發明中,所述的“重鏈抗體”指的是只包含一個重鏈可變區(VHH)和兩個常規的CH2與CH3區的抗體,又稱為HCAbs。
本發明中,所述的“單域抗體”,又稱為“奈米抗體”,指的是從重鏈抗體中選殖出來的VHH結構,是已知的可結合目標抗原的最小單位。
為解決上述技術問題,本發明的第二方面提供了一種分離的核酸,其編碼如本發明第一方面所述的標靶CLDN18.2的抗體。
所述核酸的製備方法為本領域常規的製備方法,較佳地,包括以下的步驟:透過基因選殖技術獲得編碼上述抗體的核酸分子,或者透過人工全序列合成的方法得到編碼上述抗體的核酸分子。
本領域技術人員知曉,編碼上述抗體的胺基酸序列的鹼基序列可以適當引入替換、缺失、改變、插入或增加來提供一個多聚核苷酸的同系物。本發明中多聚核苷酸的同系物可以透過對編碼該抗體序列基因的一個或多個鹼基在保持抗體活性範圍內進行替換、缺失或增加來製得。
為解決上述技術問題,本發明的第三方面提供了一種重組表現載體,其包含如本發明第二方面所述的分離的核酸。
所述重組表現載體可透過本領域常規方法獲得,即:將本發明所述的核酸分子連接於各種表現載體上構建而成。所述的表現載體為本領域常規的各種載體,只要其能夠容載前述核酸分子即可。
優選地,所述重組表現載體為質體、黏接質體、噬菌體或病毒載體,所述病毒載體優選反轉錄病毒載體、慢病毒載體、腺病毒載體或腺相關病毒載體。
為解決上述技術問題,本發明的第四方面提供了一種轉形株,其在宿主細胞中包含如本發明第三方面所述的重組表現載體。
所述重組表現轉形株的製備方法可為本領域常規的製備方法,例如為:將上述重組表現載體轉形至宿主細胞中製得。所述的宿主細胞為本領域常規的各種宿主細胞,只要能滿足使上述重組表現載體穩定地自行複製,且所攜帶所述的核酸可被有效表現即可。優選地,所述宿主細胞為E.coli
TG1或BL21細胞(表現單鏈抗體或Fab抗體),或者CHO-K1細胞(表現全長IgG抗體)。將前述重組表現質體轉形至宿主細胞中,即可得本發明優選的重組表現轉形株。其中所述轉形方法為本領域常規轉形方法,較佳地為化學轉形法,熱激法或電轉法。
本發明中,所述的標靶CLDN18.2的抗體可以用於製備成嵌合抗原受體(CAR)等從而將其修飾在例如T細胞或NK細胞等細胞上面。本發明因此提供一種包含如本發明第一方面所述的標靶CLDN18.2的抗體或其抗原結合片段。例如其為利用上述標靶CLDN18.2的抗體的scFv作為胞外抗原結合結構域的嵌合抗原受體。因此,為解決上述技術問題,本發明的第五方面提供了一種基因修飾的細胞,其包含如本發明第一方面所述的標靶CLDN18.2的抗體。
優選地,所述基因修飾的細胞為真核細胞,優選分離的人細胞;更優選免疫細胞如T細胞(例如以CAR-T的形式),或NK細胞。
為解決上述技術問題,本發明的第六方面提供了一種標靶CLDN18.2的抗體的製備方法,其包含培養如本發明第四方面所述的轉形株,從培養物中獲得標靶CLDN18.2的抗體。
為解決上述技術問題,本發明的第七方面提供了一種抗體藥物偶聯物(ADC),其包含細胞毒劑,以及如本發明第一方面所述的標靶CLDN18.2的抗體。
所述細胞毒劑優選細胞毒素、化學治療劑、放射性同位素、治療性核酸、免疫調節劑、抗血管生成劑、抗增殖促凋亡劑或細胞溶解酶;更優選地,所述細胞毒劑為微管蛋白合成酶抑制劑—甲基奧瑞他汀F (MMAF),或者為甲基奧瑞他汀E (MMAE)。
所述的抗體藥物偶聯物的製備方法可為本領域常規,較佳地採用Doronina , 2006 , Bioconjugate Chem.17,114-124
所記載的製備方法。優選地,所述的製備方法產生具有最低限度的低偶聯級分(LCF)小於10%的抗體藥物偶聯物。
所述的抗體藥物偶聯物能夠以本領域所知的任何物理形態而存在,較佳地為澄清溶液。
為解決上述技術問題,本發明的第八方面提供了一種藥物組成物,其包含如本發明第一方面所述的標靶CLDN18.2的抗體和/或如本發明第七方面所述的抗體藥物偶聯物,和藥學上可接受的載體。
所述的藥物組成物較佳地還包括其他抗腫瘤抗體作為活性成分,和/或含有由激素製劑、標靶小分子製劑、蛋白酶體抑制劑、成像劑、診斷劑、化療劑、溶瘤藥物、細胞毒性劑、細胞因子、共刺激分子的活化劑、抑制性分子的抑制劑以及疫苗組成的群組中的一種或多種。
所述的藥學上可接受的載體可為本領域常規的載體,所述的載體可以為任意合適的生理學或藥學上可接受的藥物輔料。所述的藥物輔料為本領域常規的藥物輔料,較佳地包括藥學上可接受的賦形劑、填充劑、穩定劑或稀釋劑等。更佳地,所述的藥物組成物包括0.01~99.99%的上述蛋白質和/或上述的抗體藥物偶聯物,和0.01~99.99%的藥用載體,所述百分比為占所述藥物組成物的質量百分比。
較佳地,所述的藥物組成物是抗腫瘤的藥物。更佳地為治療胃癌、食管癌、肺癌、卵巢癌、黑色素瘤、腎癌、乳腺癌、結腸直腸癌、肝癌、胰腺癌、膀胱癌、頭頸癌、支氣管癌、神經膠質瘤和/或白血病的藥物。
本發明所述的藥物組成物的給藥途徑較佳地為腸胃外施用、注射給藥或口服給藥。所述注射給藥較佳地包括靜脈注射、肌肉注射、腹腔注射、皮內注射或皮下注射等途徑。所述的藥物組成物為本領域常規的各種劑型,較佳地為固體、半固體或液體的形式,即可以為水溶液、非水溶液或懸浮液,更佳的為片劑、膠囊、顆粒劑、注射劑或輸注劑等。更佳地為經由血管內、皮下、腹膜內或肌內施用。較佳地,所述藥物組成物還可以作為氣霧劑或粗噴霧劑施用,即經鼻施用;或者,鞘內、髓內或心室內施用。更佳地,所述的藥物組成物還可以透皮、經皮、局部、腸內、陰道內、舌下或經直腸施用。
本發明所述的藥物組成物的給藥劑量水平可以根據達到所需診斷或治療結果的組成物量而調整。施用方案也可以為單次注射或多次注射,或進行調整。所選擇的劑量水平和方案依賴於包括所述藥物組成物的活性和穩定性(即,半衰期)、製劑、施用途徑、與其他藥物或治療的組合、待檢測和/或治療的疾病或病症、以及待治療的受試者的健康狀況和先前醫療史等各種因素而進行合理地調整。
對於本發明的所述藥物組成物的治療有效劑量可以最初在細胞培養實驗或動物模型例如齧齒類動物、兔、犬、豬和/或靈長類動物中進行估計。動物模型也可以用於測定合適的施用濃度範圍和途徑。隨後可以用於確定在人中施用的有用劑量和途徑。一般地,施用有效量或劑量的確定和調整以及何時和如何進行此類調整的評估為本領域技術人員已知。
對於組合療法,上述標靶CLDN18.2的抗體、上述抗體藥物偶聯物和/或另外的治療或診斷劑可以各自作為單一藥劑,在適合於執行預期治療或診斷的任何時間範圍內進行使用。因此,這些單一藥劑可以基本上同時(即作為單一制劑或在數分鐘或數小時內)或以按順序連續施用。例如,這些單一藥劑可以在一年內,或10、8、6、4或2個月內,或4、3、2、或1周內,或5、4、3、2或1天內施用。
關於製劑、劑量、施用方案和可測量的治療結果的另外指導,參見Berkow等人(2000) The Merck Manual of Medical Information (Merck醫學信息手冊)和Merck&Co.Inc., Whitehouse Station, New Jersey; Ebadi (1998) CRC Desk Reference of Clinical Pharmacology (臨床藥理學手冊)等著作。
為解決上述技術問題,本發明的第九方面提供了如本發明第一方面所述的標靶CLDN18.2的抗體、本發明第七方面所述的抗體藥物偶聯物和/或本發明第八方面所述的藥物組成物在製備診斷、預防和/或治療腫瘤的藥物中的應用。
優選地,所述腫瘤為CLDN18.2陽性腫瘤;更優選地,所述腫瘤為胃癌、食管癌、肺癌、黑色素瘤、腎癌、乳腺癌、結腸直腸癌、肝癌、胰腺癌、膀胱癌、神經膠質瘤和/或白血病。
為解決上述技術問題,本發明還提供了如本發明第一方面所述的標靶CLDN18.2的抗體、本發明第七方面所述的抗體藥物偶聯物和/或本發明第八方面所述的藥物組成物在診斷、預防和/或治療腫瘤中的應用。優選地,所述腫瘤如本發明第九方面所述。
為解決上述技術問題,本發明的第十方面提供一種套裝藥盒,其包含藥盒A和藥盒B,所述的藥盒A為本發明第一方面所述的標靶CLDN18.2的抗體、和/或本發明第七方面所述的抗體藥物偶聯物、和/或本發明第八方面所述的藥物組成物;所述的藥盒B含有其他抗腫瘤抗體或者包含所述其他抗腫瘤抗體的藥物組成物,所述藥盒B也可含化療劑、溶瘤藥物、細胞毒性劑、細胞因子、共刺激分子的活化劑、抑制性分子的抑制劑、疫苗、成像劑、診斷劑、激素製劑、標靶小分子製劑、蛋白酶體抑制劑等等,或者所述藥盒B同時含其他抗腫瘤抗體或者包含所述其他抗腫瘤抗體的藥物組成物,以及激素製劑、標靶小分子製劑、蛋白酶體抑制劑、成像劑、診斷劑、化療劑、溶瘤藥物、細胞毒性劑、細胞因子、共刺激分子的活化劑、抑制性分子的抑制劑、疫苗等等。所述的藥盒A和藥盒B可以同時使用,也可以先使用藥盒A再使用藥盒B,還可以先使用藥盒B再使用藥盒A,可以根據具體應用時的實際需求而定。
為了解決上述技術問題,如本發明第一方面所述的標靶CLDN18.2的抗體或其抗原結合片段、如本發明如上所述的嵌合抗原受體、如本發明第五方面所述的基因修飾的細胞、本發明第七方面所述的抗體藥物偶聯物和/或如本發明第八方面所述的藥物組成物還可以與其他藥物進行聯合用藥,例如可以與激素製劑、標靶小分子製劑、蛋白酶體抑制劑、成像劑、診斷劑、化療劑、溶瘤藥物、細胞毒性劑、細胞因子、共刺激分子的活化劑、抑制性分子的抑制劑、疫苗等和/或其他抗腫瘤抗體(或者包含所述其他抗腫瘤抗體的藥物組成物)進行聯合用藥。本發明所述的“CLDN18.2陽性”的細胞即為過表現CLDN18.2蛋白的細胞,如NUGC4_D8細胞株;反之,則稱為“CLDN18.2陰性”的細胞。
本發明的第十一方面提供一種診斷、治療和/或預防CLDN18.2介導的疾病或病症的方法,所述方法包括向有需要的患者施用治療有效量的如第一方面所述的標靶CLDN18.2的抗體或其抗原結合片段、如第七方面所述的抗體藥物偶聯物或如第八方面所述的藥物組成物,或者使用如第十方面所述的套裝藥盒治療有需要的患者。
其中所述CLDN18.2介導的疾病或病症可為腫瘤,優選CLDN18.2陽性腫瘤,更優選胃癌、食管癌、肺癌、卵巢癌、黑色素瘤、腎癌、乳腺癌、結腸直腸癌、肝癌、胰腺癌、膀胱癌、頭頸癌、支氣管癌、神經膠質瘤和/或白血病。
本發明的第十二方面提供免疫檢測或者測定CLDN18.2的方法,其包括使用如第一方面所述的標靶CLDN18.2的抗體或其抗原結合片段、如第七方面所述的抗體藥物偶聯物或如第八方面所述的藥物組成物。
本發明的第十三方面提供種聯合療法,其包括分別向有需要的患者施用如第一方面所述的標靶CLDN18.2的抗體或其抗原結合片段、如第七方面的抗體藥物偶聯物或如第八方面所述的藥物組成物,和第二治療劑;所述第二治療劑較佳地包含其他抗腫瘤抗體或者包含所述其他抗腫瘤抗體的藥物組成物,和/或由激素製劑、標靶小分子製劑、蛋白酶體抑制劑、成像劑、診斷劑、化療劑、溶瘤藥物、細胞毒性劑、細胞因子、共刺激分子的活化劑、抑制性分子的抑制劑以及疫苗組成的群組中的一種或多種。
在本發明中,除非另有說明,否則本文中使用的科學和技術名詞具有本領域技術人員所通常理解的含義。並且,本文中所用的細胞培養、分子遺傳學、核酸化學、免疫學實驗室操作步驟均為相應領域內廣泛使用的常規步驟。同時,為了更好地理解本發明,下面提供相關術語的定義和解釋。
在本發明中,術語“可變”通常是指這樣的事實,即抗體的可變結構域的序列的某些部分變化強烈,它形成各種特定抗體對其特定抗原的結合和特異性。然而,變異性並非均勻地分佈在抗體的整個可變區中。它集中在輕鏈和重鏈可變區中的三個區段,被稱為互補決定區(CDR)或高變區(HVR)。可變域中更高度保守的部分被稱為框架(FWR)。天然重鏈和輕鏈的可變結構域各自包含四個FWR區,大部分採用β-折疊構型,透過三個CDRs連接,形成環連接,並且在一些情況下形成β-折疊結構的一部分。每條鏈中的CDRs透過FWR區緊密靠近在一起,並與來自另一條鏈的CDR一起形成抗體的抗原結合位點,恆定區不直接參與抗體與抗原的結合,但是它們表現出不同的效應功能,例如參與抗體的依賴於抗體的細胞毒性。
本發明所用胺基酸三字母代碼和單字母代碼如本領域技術人員知曉,或J. Biol. Chem, 243, p3558 (1968)中所述。
如本文使用的,術語“包括”或“包含”旨在表示組成物和方法包括所述的元素但不排除其他元素,但根據上下文的理解,也包括“由……組成”的情況。
術語“CLDN18.2”包括同種型、哺乳動物(例如人)的CLDN18.2、人CLDN18.2的物種同源物和包含至少一個與CLDN18.2的共同表位的類似物。CLDN18.2 (例如人CLDN18.2)的胺基酸序列是本領域中己知的,如NCBI數據庫顯示。
術語“CLDN18.1”包括同種型、哺乳動物(例如人)的CLDN18.1、人CLDN18.1的物種同源物和包含至少一個與CLDN18.1的共同表位的類似物。CLDN18.1 (例如人CLDN18.1)的胺基酸序列是本領域中己知的,如NCBI數據庫顯示。
術語“表位”指抗原(例如,人CLDN18.2)中與抗體分子特異性相互作用的部分。術語“競爭”在本發明中指抗體分子干擾抗CLDN18.2抗體分子與標的 (例如,人CLDN18.2) 結合的能力。對結合作用的干擾可以是直接或間接的 (例如,透過抗體分子或標的的別構調節作用)。可以使用競爭結合測定法(例如,FACS測定法、ELISA或BIACORE測定法)確定抗體分子是否能夠干擾另一種抗體分子與其標的結合的程度。
本發明所述的術語“抗體”包括免疫球蛋白,是由兩條相同的重鏈和兩條相同的輕鏈透過鏈間二硫鍵連接而成的四肽鏈結構。免疫球蛋白重鏈恆定區的胺基酸組成和排列順序不同,故其抗原性也不同。據此,可將免疫球蛋白分為五類,或稱為免疫球蛋白的同種型,即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE,其相應的重鏈分別為µ鏈、δ鏈、γ鏈、α鏈和ε鏈。同一類Ig根據其鉸鏈區胺基酸組成和重鏈二硫鍵的數目和位置的差別,又可分為不同的亞類,如IgG可分為IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。輕鏈透過恆定區的不同分為κ鏈或λ鏈。五類Ig中第每類Ig都可以有κ鏈或λ鏈。
在本發明中,本發明所述的抗體輕鏈可變區可進一步包含輕鏈恆定區,所述的輕鏈恆定區包含人源的κ、λ鏈或其變異體。在本發明中,本發明所述的抗體重鏈可變區可進一步包含重鏈恆定區,所述的重鏈恆定區包含人源的IgG1、2、3、4或其變異體。
抗體重鏈和輕鏈靠近N端的約110個胺基酸的序列變化很大,為可變區(V區);靠近C端的其餘胺基酸序列相對穩定,為恆定區(C區)。可變區包括3個高變區(HVR)和4個序列相對保守的骨架區(FWR)。3個高變區決定抗體的特異性,又稱為互補性決定區(CDR)。每條輕鏈可變區(VL)和重鏈可變區(VH)由3個CDR區4個FWR區組成,從氨基端到羧基端依次排列的順序為:FWR1、CDR1、FWR2、CDR2、FWR3、CDR3、FWR4。輕鏈的3個CDR區指LCDR1、LCDR2和LCDR3;重鏈的3個CDR區指HCDR1、HCDR2和HCDR3。
在輕鏈和重鏈內,可變區和恆定區透過大約12或更多個胺基酸的“J”區連接,重鏈還包含大約3個或更多個胺基酸的“D”區。各重鏈由重鏈可變區(VH)和重鏈恆定區(CH)組成。重鏈恆定區由3個結構域(CH1、CH2和CH3)組成。各輕鏈由輕鏈可變區(VL)和輕鏈恆定區(CL)組成。輕鏈恆定區由一個結構域CL組成。抗體的恆定區可介導免疫球蛋白與宿主組織或因子,包括免疫系統的各種細胞(例如,效應細胞)和經典補體系統的第一組分(C1q)的結合。VH和VL區還可被細分為具有高變性的區域[稱為互補決定區 (CDR)],其間散佈有較保守的稱為構架區(FWR)的區域。各VH和VL由按下列順序:FWR1、CDR1、FWR2、CDR2、FWR3、CDR3、FWR4從胺基末端至羧基末排列的3個CDR和4個FWR組成。各重鏈/輕鏈對應的可變區(VH和VL)分別形成抗體結合部位。特別地,重鏈還可以包含3個以上CDR,例如6、9或12個。例如在本發明的雙特異性抗體中,重鏈可以是IgG抗體的重鏈的N端連接另一個抗體的ScFv,這種情況下重鏈含有9個CDR。
術語“人源抗體”包括具有人種系免疫球蛋白序列的可變和恆定區的抗體。本發明的人抗體可包括不由人種系免疫球蛋白序列編碼的胺基酸殘基(如透過體外隨機或位點特異性誘變或透過體內體細胞突變所引入的突變)。然而,術語“人抗體”不包括這樣的抗體,即其中已將衍生自另一種哺乳動物物種(諸如小鼠)種系的CDR序列移植到人骨架序列上(即“人源化抗體”)。
如本發明所用,關於抗體的術語“特異性”意指識別特異性抗原但基本上不識別或結合樣品中的其他分子的抗體。例如,特異性結合來自一個物種的抗原的抗體也可以結合來自一個或更多個物種的該抗原。但是,這種種間交叉反應性本身不改變抗體根據特異性的分類。在另一個實例中,特異性結合抗原的抗體也可以結合該抗原的不同等位基因形式。然而,這種交叉反應性本身不改變抗體根據特異性的分類。在一些情況下,術語“特異性”或“特異性結合”可用於指抗體、蛋白質或肽與第二化學物質的相互作用,意味著該相互作用取決於化學物質上特定結構(例如,抗原決定位或表位)的存在;例如,抗體一般識別並結合特定的蛋白質結構,而不是蛋白質。如果抗體對表位“A”具有特異性,則在含有經標記的“A”和抗體的反應中,含有表位A的分子(或游離的,未標記的A)的存在將減少結合於抗體的標記的A的量。
本文中使用的術語“嵌合抗原受體”或“CAR”指:包含能夠結合抗原的胞外域(胞外結合結構域)、鉸鏈結構域、跨膜結構域(跨膜區)和使細胞質信號傳到結構域的多肽(即胞內信號域)。鉸鏈結構域可以被認為是用於向細胞外抗原結合區提供柔性的一部分。胞內信號域指經由確定的信號傳導途徑透過產生第二信使而將信息傳遞到細胞內以調節細胞活性的蛋白質、或透過相應於此類信使而作為效應子發揮作用的蛋白質,產生可以促進CAR的細胞(例如CART細胞)的免疫效應子功能的信號。胞內信號域包含信號傳導結構域,還可以包括源自共刺激分子的共刺激胞內結構域。
“同一性”、“變異序列”、“突變”是指兩個多核苷酸序列之間或兩個多肽之間的序列相似性。當兩個比較序列中的位置均被相同鹼基或胺基酸單體亞基佔據時,例如如果兩個DNA分子的每一個位置都被腺嘌呤佔據時,那麼所述分子在該位置是同源的。兩個序列之間的同一性百分率是兩個序列共有的匹配或同源位置數除以比較的位置數×100的函數。例如,在序列最佳比對時,如果兩個序列中的10個位置有6個匹配或同源,那麼兩個序列為60%同源。一般而言,當比對兩個序列而得到最大的同一性百分率時進行比較。“優化”指保持或改善了所述抗體與抗原結合的突變,在本發明中,指保持、維持或改善了與CLDN18.2的結合的突變。
術語“多肽”、“肽”和“蛋白質”(如果為單鏈)在本發明中互換地使用。術語“核酸”、“核酸序列”,“核苷酸序列”或“多核苷酸序列”和“多核苷酸”互換使用。
術語“突變”包括胺基酸或核苷酸的取代、添加和/或缺失,“胺基酸取代”和“保守性胺基酸取代”分別是其中胺基酸殘基以另一種胺基酸殘基置換和以具有相似側鏈的胺基酸殘基置換。
本文所使用的“慢病毒”是指反轉錄病毒科(Retroviridae family)的屬。慢病毒在反轉錄病毒中是獨特的,其能夠感染非分裂細胞;它們可以將顯著量的遺傳信息遞送到宿主細胞的DNA中,因此它們是基因遞送載體的一種最有效方法。HIV、SIV和FIV都是慢病毒的實例。來自慢病毒的載體提供了在體內實現顯著水平基因轉移的手段。
本文使用的術語“載體”是包含分離的核酸並可用於將分離的核酸遞送至細胞內部的組成物。在本領域中已知許多載體,包括但不限於線性多核苷酸、與離子或兩親化合物相關的多核苷酸、質體和病毒。因此,術語“載體”包括自主複製的質體或病毒。該術語還應被解釋為包括促進核酸轉移到細胞中的非質體和非病毒化合物,例如聚賴氨酸化合物、脂質體等。病毒載體的實例包括但不限於腺病毒載體、腺相關病毒載體、反轉錄病毒載體等。
本發明使用的表述“細胞”、“細胞株”可互換使用,並且所有這類名稱都包括後代。術語“宿主細胞”是指,可用於導入載體的細胞,其包括但不限於,如大腸桿菌等原核細胞,如酵母細胞等的真菌細胞,或者如纖維原細胞、CHO細胞、COS細胞、NSO細胞、HeLa細胞、BHK細胞、HEK 293細胞或人細胞等的動物細胞。
術語“轉染”是指將外源核酸引入真核細胞。轉染可以透過本領域已知的各種手段來實現,包括磷酸鈣-DNA共沉澱、DEAE-葡聚糖介導的轉染、聚凝胺介導的轉染、電穿孔、顯微注射、脂質體融合、脂質轉染、原生質體融合、反轉錄病毒感染和生物彈道技術(biolistics)。
術語“免疫細胞”指可以引發免疫應答的細胞,“免疫細胞”及其語法上的其他形式可以指任何來源的免疫細胞。“免疫細胞”包括例如衍生自在骨髓中產生的造血幹細胞(HSC)的白血細胞(白細胞)、淋巴細胞(T細胞、B細胞、自然殺傷(NK)細胞和骨髓來源的細胞(嗜中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、嗜鹼性粒細胞、單核細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞)。術語“免疫細胞”也可以是人或非人的。
如本文使用的,術語“T細胞”是指在胸腺中成熟的一類淋巴細胞。T細胞在細胞介導的免疫中起重要作用,並且與與其他淋巴細胞(例如B細胞)的不同點在於細胞表面上存在T細胞受體。“T細胞”包括表現CD3的所有類型的免疫細胞,包括T輔助細胞(CD4+細胞)、細胞毒性T細胞(CD8+細胞)、自然殺傷T細胞、T調節細胞(Treg)和γ-δT細胞。“細胞毒性細胞”包括CD8+T細胞、自然殺傷(NK)細胞和嗜中性粒細胞,這些細胞能夠介導細胞毒性反應。如本文使用的,術語“NK細胞”是指起源於骨髓並且在先天免疫系統中起重要作用的一類淋巴細胞。NK細胞提供針對病毒感染的細胞、腫瘤細胞或其他應激細胞的快速免疫反應,即使是細胞表面上不存在抗體和主要組織相容性複合體。
例如,免疫細胞可以是來自血液的,如自體的T細胞、異體T細胞、自體NK細胞、異體NK細胞,也可以來源自細胞株,如利用EBV病毒感染來製備NK細胞株,從胚胎幹細胞和iPSC誘導分化來的NK細胞以及NK92細胞株等。
“任選”、“任一”、“任意”或“任一項”意味著隨後所描述地事件或環境可以但不必發生,該說明包括該事件或環境發生或不發生地場合。例如,“任選包含1個抗體重鏈可變區”意味著特定序列的抗體重鏈可變區可以但不必須存在。本發明所用,“一個”和“一種”在本發明中用來指的一個或多於一個的語法對象。除非內容明確提示,否則術語“或”在本發明中用來意指術語“和/或”並且與之互換使用。“約”和“大約”應當通常意指鑒於測量的性質或精度,所測量的量的可接受誤差程度。示例性誤差程度一般在其10%範圍內和更一般在其5%範圍內。本發明公開的方法和組成物涵蓋這樣的多肽和核酸,它們具有指定的序列,變異序列或與其基本上相同或相似的序列,例如,與序列指定至少85%、90%、95%、99%或更多相同的序列。在胺基酸序列的情況下,術語“基本上相同”在本發明中用來指第一胺基酸序列。
如本文中所使用的,術語EC50
是指半最大效應濃度(concentration for 50% of maximal effect),即能引起50%最大效應的濃度。
本發明的藥物組成物可根據需要製成各種劑型,並可由醫師根據患者種類、年齡、體重和大致疾病狀況、給藥方式等因素確定對病人有益的劑量進行施用。給藥方式例如可以採用注射或其它治療方式。
如本發明所用,術語“抗體藥物偶聯物”或“ADC”可互換使用。
澳瑞他汀是全合成藥物,化學結構式相對容易改造,以便優化其物理性質和成藥特性。用於和抗體偶聯的澳瑞他汀衍生物主要包括單甲基澳瑞他汀E (MMAE)和單甲基澳瑞他汀F (MMAF),前者是由天然微管蛋白聚合酶抑制劑尾海兔素10 (dolastatin-10)衍生出的合成五肽,在C-端加上一個2-胺基-1-苯基丙基-1-醇而合成。MMAE對多種人類腫瘤細胞株的抑制活性小於一奈米莫耳。為了降低MMAE自身細胞毒活性,MMAF在尾海兔素10的C-端加上一個苯丙胺酸,因為在結構上引入一個羧基,MMAF的細胞膜通過性較差,因此對細胞的生物活性顯著降低,但是和抗體偶聯後對細胞的抑制活性大幅度提高(US 7750116)。
在有些實施方案中,抗體細胞毒性藥物偶聯物或其可藥用鹽或溶劑化合物包含偶聯有一個或多個美登木素生物鹼分子的本發明抗體。美登木素生物鹼是透過抑制微管蛋白多聚化未發揮作用的有絲分裂抑制劑。美登素最初從東非灌木齒葉美登木(Maytenus serrata
)分離得到(美國專利No.3,896,111)。隨後發現某些微生物也生成美登木素生物鹼,諸如美登醇和C-3美登醇醋(美國專利No.4,151,042)。美登木素生物鹼藥物模組在抗體-藥物偶聯物中是有吸引力的藥物模組,因為它們:(i)相對易於透過發酵或發酵產物的化學修飾或衍生化來製備;(ii)易於用適於透過非二硫化物連接子偶聯至抗體的官能團衍生化;(iii)在血漿中穩定;且(iv)有效針對多種腫瘤細胞株。適於用作美登木素生物鹼藥物模組的美登素化合物是本領域公知的,而且可以依照已知方法從天然來源分離,或是使用遺傳工程技術生產(參見Yu等(2002) PNAS99:7968-7973)。美登醇和美登醇類似物也可以依照已知方法合成製備。美登木素生物鹼藥物模組的例示性實施方案包括:DM1、DM3和DM4,正如本文中所公開的。
本發明所述的方法、組成物、聯合治療可以與其他活性劑或治療方式,所述的方法包括向對象以有效治療或預防疾病(例如,癌症)的量,施用本發明所述的抗CLDN18.2抗體分子,任選地,與PD-1、PD-L1、PD-L2、LAG-3、CTLA-4、Tim-3抗體(免疫治療)或其它腫瘤治療抗體,Her-2、EGFR、VEGF、VEGFR抗體等,以及ADC (如T-DM1),雙特異抗體,化療藥物等的一種或多種抑制劑的組合,還包括施用抗CLDN18.2抗體分子、額外的活性劑或全部可以按這樣的量或劑量施用,所述量或劑量高於、低於或等於單獨(例如,作為單一療法)使用的每種活性劑的量或劑量。抗CLDN18.2抗體,額外的活性劑或全部的施用量或劑量比單獨(例如,作為單一療法)使用的每種活性劑的量或劑量低(例如,至少20%、至少30%、至少40%或至少50%)。
此外,正如本發明的實施例中描述的那樣,抗CLDN18.2抗體以及CLDN18.2抗體的藥物偶聯物可以結合CLDN18.2誘導標的細胞(腫瘤細胞)凋亡,抑制腫瘤細胞生長,增加體內效應細胞對腫瘤細胞ADCC,CDC殺傷作用來達到治療癌症患者的目的。因此,在某些實施方案中,本發明所描述的抗CLDN18.2抗體以及CLDN18.2抗體的藥物偶聯物透過這些機理顯示本發明抗體抗腫瘤效應,以及抑制腫瘤細胞生長的方法,包括將治療有效量的本發明中所述的抗CLDN18.2抗體以及CLDN18.2抗體的藥物偶聯物施用於受試者。該方法適用於癌症的體內治療。為了獲得標靶特異治療效果,抗CLDN18.2抗體分子可以與其它抗體一起施用。在將CLDN18.2抗體以及CLDN18.2抗體的藥物偶聯物組合一種或多種活性劑施用時,該組合可以以任何順序或同時施用癌症類型,特別是CLDN18.2高表現的腫瘤患者。在某些方面中,提供在對象中治療對象(例如,減少或緩解)過度增生性病狀或疾病(例如,癌症)。該方法包括向對象單獨或與其他活性劑或治療方式組合地施用本發明所述的一種或多種抗CLDN18.2抗體或CLDN18.2抗體的藥物偶聯物。
使用單獨的或與另一種免疫調節劑(例如抗LAG-3、抗Tim-3、抗PD-l或抗PD-L1、抗CTLA-4抗體分子)組合的抗CLDN18.2抗體分子來治療胃癌、胰腺癌、肺癌、食管道癌、卵巢癌等。抗CLDN18.2抗體分子可以與以下一者或多者組合施用:基於免疫的策略、標靶藥物(例如,VEGF抑制劑如針對VEGF的單株抗體);VEGF酪氨酸激酶抑制劑如舒尼替尼、索拉非尼、阿帕替尼;RNAi抑制劑或VEGF信號傳導的下游介導物的抑制劑,例如,雷帕黴素哺乳動物標的(mTOR)的抑制劑。
如本發明所用,術語“癌”、“癌症”、“癌症病人”意在包括全部類型的癌性生長物或致瘤過程、轉移性組織或惡性轉化的細胞、組織或器官,無論其組織病理學類型或侵襲力階段。例子包括但不限於實體瘤、血液學癌、軟組織腫瘤和轉移性病灶。
可以利用本發明中公開的標靶CLDN18.2的抗體適合治療的癌症的非限定性的實例包括,胃癌、食管癌、肺癌、黑色素瘤、腎癌、乳腺癌、結腸直腸癌、肝癌、胰腺癌、膀胱癌、神經膠質瘤和/或白血病等,或其轉移性病灶。
需知:本發明中提及“變異體1”、“變異體2”等時,術語後的阿拉伯數字“1”、“2”沒有實際意義,僅為指代相同術語。
在符合本領域常識的基礎上,上述各優選條件,可任意組合,即得本發明各較佳實例。本發明所用試劑和原料均市售可得。
本發明的積極進步效果在於:
本發明的抗體與現有技術相比,其結合親和力、ADCC (antibody-dependentcell-mediated cytotoxicity,抗體依賴的細胞介導的細胞毒殺作用)、CDC(complement dependent cytotoxicity,補體依賴細胞毒殺作用)、生長抑制效應、內吞活性等都有明顯的優勢,從而具有極大的治療腫瘤的潛力。在本發明某一較佳實施例中,HBM1029抗體、PR003197、PR003340、PR003292、PR003293、PR003240、PR003291、PR003289、PR003890、PR003891、PR003894、PR003897以及PR003898與IMAB362類似物相比對內生性表現CLDN18.2的NUGC4_D8細胞呈現更高的結合親和力;本發明的HBM1029、PR003197、PR003340、PR003240、PR003894抗體能以劑量依賴方式特異性地於NUGC4_D8誘導較IMAB362類似物強的ADCC效應;HBM1029、PR003197、PR003340抗體能以劑量依賴方式於HEK293 hCLDN18.2誘導較IMAB362類似物強的CDC效應;HBM1029抗體能以劑量依賴方式於HEK293 hCLDN 18.2誘導較IMAB362類似物強的生長抑制效應;HBM1029抗體能以劑量依賴方式於NUGC4_D8誘導較IMAB362類似物強的內吞活性;HBM1029抗體與MMAF耦合的抗人IgG抗體共培養時,能以劑量依賴方式於NUGC4_D8細胞和HEK293 hCLDN18.2細胞產生較IMAB362類似物強的細胞毒殺效應。
具體實施方式
下面透過實施例的方式進一步說明本發明,但並不因此將本發明限制在所述的實施例範圍之中。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法,按照常規方法和條件,或按照商品說明書選擇。實施例 1 抗原製備、小鼠免疫及雜交瘤製備
a. 免疫小鼠的表現載體製備
免疫全人源化的基因轉殖小鼠的人CLDN18.2表現載體製備方法為:合成編碼人CLDN18.2 (Uniprot ID P56856-iso2)的cDNA序列,透過酶切將上述基因的編碼序列選殖到pCAGGS質體(YOUBIO,VT1076)中。
b. 穩轉細胞株的製備
穩定表現人CLDN18.1或CLDN18.2的HEK293 (ATCC, Cat#:CRL-1573)細胞株的構建具體為:將編碼人CLDN18.1 (GenScript, OHu29174D)或CLDN18.2(GenScript, OHu03374D)質體轉染至HEK293細胞,生成過表現人CLDN18.1或CLDN18.2的穩定細胞株。CLDN18.1和CLDN18.2的表現經螢光激發細胞分選術(FACS)檢測。具體而言,20,000個轉染細胞在96孔盤的各孔中貼附,並在之後加入市售兔抗人CLDN18抗體(LifeSpan Bio,Cat#:LS-C168812-400)。4℃培育1小時後,孔盤用PBS洗滌2遍,再加入AF-680耦聯的山羊抗兔IgG二抗(Invitrogen,Cat#:A21109)。4℃培育1小時後,孔盤用PBS洗滌3遍,之後使用FACS儀器(IntelliCytiQue Plus BR)監測細胞螢光度。實施例 2 CLDN18.2 單株抗體的生成和篩選
用上述製得的人CLDN18.2表現載體和上述製得的表現人CLDN18.2的HEK293細胞(HEK293 hCLDN18.2細胞)免疫全人源化的基因轉殖小鼠(HarbourH2L2小鼠,為商購化小鼠,購於和鉑生物)。將人CLDN18.2載體與金粉做成基因槍的子彈,用基因槍對小鼠腹部進行多點免疫。表現載體DNA每次免疫50μg,每次間隔2周,免疫三次後,接著用HEK293 hCLDN18.2細胞進行免疫,每隻小鼠每次免疫4×106
個細胞,每次間隔2周,細胞免疫2次後小鼠采血測效價。小鼠血清的結合親和力透過FACS使用表現人CLDN18.2的CHO K1細胞(CHOK1 hCLDN18.2,購買自kyinno (KC-1180)或CLDN18.1的CHO K1細胞[CHOK1 hCLDN18.1,購買自kyinno(KC-1181)]進行檢測。根據免疫小鼠血清效價的檢測結果,挑選小鼠進行雜交瘤融合,融合前3天對小鼠進行追加免疫,免疫原為HEK293 hCLDN18.2細胞,劑量為4×106
個細胞。取小鼠的脾細胞和淋巴結細胞與小鼠的骨髓瘤細胞SP2/0按2:1 (細胞數量比)的比例混合,混合後的細胞用電融合儀(BTX ECM2001)進行細胞融合,將融合後的細胞鋪在96孔細胞培養盤,在二氧化碳培養箱中37℃培養10天後進行雜交瘤的初篩。初篩透過Mirrorball使用表現人CLDN18.2的CHO K1細胞進行檢測,具體為:細胞用含培養基(F12K 10 % FBS)重新懸浮,將細胞的密度調整到5×104
細胞/ml,在384孔盤的各孔內加入40 μl細胞懸浮液,於二氧化碳培養箱37℃培養過夜。在孔中加入核染料DRAQ5進行染色,然後棄掉孔盤的上清液,取出雜交瘤培養盤的上清液50μl加入到384微孔盤中,4℃培育2個小時後,加入AF488偶聯的螢光二抗(invitrogen,Cat#:A11006) 4℃培育過夜,然後將384微孔盤進行Mirrorball的上機檢測。挑選出陽性的雜交瘤,從96孔培養盤中轉到24孔培養盤擴大培養,5天後對24孔培養盤孔中的上清液進行複篩。複篩透過FACS使用CHOK1hCLDN18.1和CHOK1hCLDN18.2細胞進行檢測。細胞於300 g離心5分鐘,然後用FACS緩衝液(含2%FBS的PBS)重新懸浮。將細胞的密度調整到106
細胞/ml,在96孔盤的各孔內加入50 μl細胞懸浮液。在96孔盤的各孔內加入50 μl上清液。於4℃培育2小時後,孔盤用FACS緩衝液洗滌2遍。之後,加入含APC耦合的山羊抗大鼠IgG二抗的FACS緩衝液(Biolegend Cat#:405407)。在4℃培育1小時後,孔盤用FACS緩衝液洗滌2遍。細胞用固定液重新懸浮,之後使用FACS儀(ACEA NovoCyte)監測細胞螢光。對特異性佳的雜交瘤採用有限稀釋法進行次選殖,在二氧化碳培養箱中37℃培養7天後進行次選殖的初篩。次選殖初篩透過Mirrorball使用表現人CLDN18.2的CHO K1細胞進行檢測。根據檢測結果和在顯微鏡下觀察,挑出既是單選殖株又是與CHOK1/CLDN18.2陽性結合的選殖株,擴大到24孔細胞培養盤中,在二氧化碳培養箱中37℃培養3天後再對孔中的上清液進行複篩。複篩透過FACS(同上述複篩步驟)使用CHOK1hCLDN18.1和CHOK1hCLDN18.2細胞株進行檢測。特異性結合的單選殖株,用亞型鑒定試劑盒(invitrogen,Cat#:88-50640-88)進行亞型鑒定。挑選抗體亞型為IgG2b的細胞進行測序(測序公司為金唯智生物科技有限公司)。
本領域人員公知,在本領域中可以透過多種方法來定義抗體的CDR,例如基於序列可變性的Kabat定義規則(參見,Kabat等人,免疫學的蛋白質序列,第五版,美國國立衛生研究院,貝塞斯達,馬裡蘭州(1991))和基於結構環區域位置的Chothia定義規則(參見JMol Biol 273:927-48,1997)。在本申請中,還可以使用包含了Kabat定義和Chothia定義的Combined定義規則確定可變結構域序列中的胺基酸殘基。其中Combined定義規則即是將Kabat定義和Chothia定義的範圍相結合,基於此取了一個更大的範圍,詳見發明內容部分的表1-1。該實施例經測序後所得的生殖系基因分析和PTM位點分析如下表2所示。抗原結合蛋白突變位點設計信息如下表3所示。抗原結合蛋白序列編號表信息如下表4所示。表 2 抗體的生殖系基因分析和 PTM 位點分析
表 3 抗原結合蛋白突變位點設計
表 4 抗原結合蛋白序列編號表
註:以上表格中提及的PR002726C即為HBM1029,本發明中兩者指代相同的抗體;PR000400即為IMAB362類似物,本發明中兩者指代相同的抗體。實施例 3 全長 CLDN18.2 單株抗體的表現、純化和表徵
選殖株編號 | VH生殖系V基因 | VL生殖系V基因 | VH PTM | VL PTM | 重組抗體 | 重組抗體亞型 |
11C12-13C2 | VH3-23 | VK3-15 | 無 | 無 | PR002725 | 人 IgG1 |
13E6F4 | VH3-23 | VK3-11 | 無 | 無 | PR002726 | 人 IgG1 |
31H3E2 | VH3-30 | VK3-15 | DG (HCDR2), DG (HCDR3) | 無 | PR002727 | 人 IgG1 |
205A7F1D3 | VH3-23 | VK3-15 | 無 | 無 | PR003289 | 人 IgG1 |
214C4G11 | VH3-23 | VK3-15 | 無 | 無 | PR003291 | 人 IgG1 |
初始抗體 | 變異體 | 可變區突變 | 重組抗體亞型 | Fc 突變 |
PR002726 | PR003197 | 無 | 人 IgG1 | S239D, I332E |
PR002726 | PR003292 | 無 | 人 IgG1 | M252Y, S254T, T256E |
PR002726 | PR003293 | 無 | 人 IgG1 | S239D, I332E, M252Y, S254T, T256E |
PR002726 | PR003340 | 無 | 人 IgG1 | S239D, I332E, K274Q, Y300F, L309V, Y296F, A339T, V397M |
PR003289 | PR003890 | 無 | 人 IgG1 | S239D, I332E |
PR003289 | PR003897 | 無 | 人 IgG1 | S239D, I332E, K274Q, Y300F, L309V, Y296F, A339T, V397M |
PR003291 | PR003891 | 無 | 人 IgG1 | S239D, I332E |
PR003291 | PR003898 | 無 | 人 IgG1 | S239D, I332E, K274Q, Y300F, L309V, Y296F, A339T, V397M |
PR002727 | PR003240 | VH:D54E | 人 IgG1 | S239D, I332E |
PR002727 | PR003894 | VH:D54E | 人 IgG1 | S239D, I332E, K274Q, Y300F, L309V, Y296F, A339T, V397M |
抗體編號 | 輕鏈 | 重鏈 | VL | VH | LCDR1 | LCDR2 | LCDR3 | HCDR1 | HCDR2 | HCDR3 |
PR000400 | 91 | 75 | 69 | 62 | 39 | 46 | 54 | 5 | 15 | 25 |
PR002725 | 92 | 76 | 70 | 63 | 40 | 47 | 55 | 6 | 16 | 26 |
PR002726 | 93 | 77 | 71 | 64 | 41 | 48 | 56 | 7 | 17 | 27 |
PR002727 | 94 | 78 | 72 | 65 | 42 | 47 | 57 | 8 | 18 | 28 |
PR003197 | 93 | 79 | 71 | 64 | 41 | 48 | 56 | 7 | 17 | 27 |
PR003340 | 93 | 85 | 71 | 64 | 41 | 48 | 56 | 7 | 17 | 27 |
PR003292 | 93 | 83 | 71 | 64 | 41 | 48 | 56 | 7 | 17 | 27 |
PR003293 | 93 | 84 | 71 | 64 | 41 | 48 | 56 | 7 | 17 | 27 |
PR003289 | 95 | 81 | 73 | 67 | 42 | 47 | 55 | 8 | 16 | 29 |
PR003291 | 96 | 82 | 74 | 68 | 42 | 47 | 58 | 8 | 16 | 29 |
PR003240 | 94 | 80 | 72 | 66 | 42 | 47 | 57 | 8 | 19 | 28 |
PR003890 | 95 | 86 | 73 | 67 | 42 | 47 | 55 | 8 | 16 | 29 |
PR003891 | 96 | 87 | 74 | 68 | 42 | 47 | 58 | 8 | 16 | 29 |
PR003894 | 94 | 88 | 72 | 66 | 42 | 47 | 57 | 8 | 19 | 28 |
PR003897 | 95 | 89 | 73 | 67 | 42 | 47 | 55 | 8 | 16 | 29 |
PR003898 | 96 | 90 | 74 | 68 | 42 | 47 | 58 | 8 | 16 | 29 |
在得到編碼抗體分子的輕、重鏈可變結構域序列以後,可以採用常規的重組DNA技術,將輕、重鏈可變結構域序列和相應的人的抗體輕、重鏈恆定結構域序列進行融合表現,得到重組抗體分子。在本實施例中,抗體重鏈可變結構域序列(VH)透過基因合成並選殖到編碼人IgG1抗體重鏈恆定結構域序列的哺乳動物細胞表現質體載體中,以編碼產生IgG1抗體的全長重鏈。抗體輕鏈可變結構域序列(VL)透過基因合成並選殖到編碼人抗體Igκ輕鏈恆定結構域序列的哺乳動物細胞表現質體載體中,以編碼產生抗體的全長輕鏈。在本實施例中,由於從免疫的Harbour H2L2小鼠得到的單株抗體分子可變結構域的序列是人源抗體序列,因而本實施例也得到全人源的抗CLDN18.2重組IgG1抗體。
將編碼抗體重鏈的質體(Genscript US)和編碼抗體輕鏈的質體(Genscript US)同時轉染哺乳動物宿主細胞(如人胚腎細胞HEK293),利用常規的重組蛋白表現和純化技術,可以得到具有輕重鏈正確配對組裝的純化的重組抗體。具體來說,將HEK293細胞在FreeStyle™ F17 Expression Medium培養基(Thermo,Cat#:A1383504)中擴充培養。瞬時轉染開始之前,調節細胞濃度至6~8×105
細胞/ml,於37℃ 8% CO2
搖床中培養24小時,細胞濃度在1.2×106
細胞/ml。準備30 ml培養的細胞。將上述編碼抗體重鏈的質體和編碼抗體輕鏈的質體以2:3 (質量比)的比例混合共計30 μg質體溶解於1.5 ml Opti-MEM減血清培養基(Thermo,Cat#:31985088),並用0.22 µm濾膜過濾除菌。再取1.5 ml Opti-MEM 溶入1 mg/ml PEI (Polysciences,Cat#:23966-2) 120 µl,靜置5分鐘。把PEI緩慢加入質體中,室溫培育10分鐘,邊搖晃培養瓶邊緩慢滴入質體PEI混合溶液,於37℃ 8% CO2
搖床中培養5天。5天後觀測細胞活率。收集培養物,以3300g轉速離心10分鐘後取上清液;然後將上清液高速離心去除雜質。用PBS (pH7.4)平衡含有MabSelect ™ (GE Healthcare Life Science,Cat#:71-5020-91 AE)的重力管柱(Bio-Rad,Cat#:7311550),2-5倍管柱體積沖洗。將上清液樣品過管柱;用5-10倍管柱體積的PBS沖洗管柱,再用pH3.5的0.1M甘胺酸洗脫目的蛋白,後用pH 8.0的Tris-HCl調節至中性,最後用超濾管(Millipore,Cat#:UFC901024)濃縮換液至PBS緩衝液,得到純化的抗體溶液。最後用NanoDrop(Thermo Scientific™ NanoDrop™ One)測定濃度,分裝、存儲備用。
取上述純化的樣品適量分別上樣至分析型SEC管柱TSKgel G3000SWxl (HPLC儀器型號: 安捷倫1260 Infinity II),檢測樣品的純度,保證均一樣品的純度在95%以上。該方法流動相為1×PBS,pH7.4 (生工,Cat#:E607016),室溫,流速 1.0 ml/min,樣品濃度1 mg/ml,進樣體積 20 μl,檢測波長280nm。採集後用ChemStation軟體對層析圖進行積分並計算相關數據。取上述純化的樣品適量分別上樣至分析型HIC管柱TSKge1 Buty1-NPR 4.6*35 (HPLC儀器型號: 安捷倫1260 Infinity II),檢測樣品的純度及疏水性。該方法由16分鐘內從100%流動相A (20 mM PB,1.8 M (NH4
)2
SO4
, pH6.0)至100%流動相B (20 mM PB,pH6.0)的線性梯度組成。流速設定為0.7 ml/min,樣品濃度1 mg/ml,進樣體積 20 μl,檢測波長280nm。採集後用ChemStation軟體對層析圖進行積分並計算相關數據。差示掃描螢光法(Differential Scanning Fluorimetry, DSF)是一種常用的高通量的用來測定蛋白質熱穩定性的方法。它使用實時螢光定量PCR儀器透過監測與去折疊的蛋白分子結合的染料的螢光強度的變化,來反應蛋白質的變性的過程,從而反應出蛋白分子的熱穩定性。本實施例利用DSF方法來測定蛋白分子熱變性溫度™。10 μg蛋白加入96-孔PCR孔盤(Thermo,Cat#:AB-0700/W),接著加入2 μl 100×稀釋的染料SYPROTM (Invitrogen,2008138),然後加入緩衝液使得終體積為40 μl每孔。將PCR孔盤密封,放置於實時螢光定量PCR儀器(Bio-Rad CFX96 PCR System),先於25℃培育5 min,然後以0.2℃ /0.2 min的梯度逐漸從25℃升溫至95℃,在測試結束時將溫度降至25℃。使用FRET掃描模式並使用Bio-Rad CFX Maestro軟體進行數據分析並計算出樣品的Tm。所得結果如下表5所示。
表5
實施例 4 CLDN18.2 單株抗體的結合親和力
SEC-HPLC純度(%) | HIC-HPLC純度(%) | HIC-HPLC 滯留時間 (min) | Tm1 (℃) | Tm2 (℃) | |
HBM1029 | 98 | 100 | 15.653 | 62.8 | 68.2 |
抗體的結合親和力透過FACS使用表現人CLDN18.2或CLDN18.1的HEK293細胞及內生性表現人CLDN18.2的NUGC4_D8細胞(NUGC細胞株購買自JCRB(Cat#:JCRB0834),用有限稀釋法篩選得到NUGC4_D8次選殖細胞)進行檢測,具體是:細胞於300 g離心5分鐘,然後用FACS緩衝液(含2%FBS的PBS)重新懸浮。將細胞的密度調整到106
細胞/ml,在96孔盤的各孔內加入50 μl細胞懸浮液。抗體以FACS緩衝液稀釋成不同濃度,在96孔盤的各孔內加入50 μl抗體稀釋液。於4℃培育2小時後,孔盤用FACS緩衝液洗滌2遍。之後,加入含APC耦合的山羊抗人IgG二抗的FACS緩衝液(終濃度為1.5 μg/ml,JacksonCat#:109-605-098)。在4℃培育1小時後,孔盤用FACS緩衝液洗滌2遍。細胞用固定液重新懸浮,之後使用FACS儀(ACEA NovoCyte)監測細胞螢光。IMAB362類似物(IMAB362類似物為自製所得,重鏈胺基酸序列如SEQ ID NO: 75所示,輕鏈胺基酸序列如SEQ ID NO: 91所示(由Genscript生物公司合成),其與IMAB362的可變區完全相同,恆定區上僅有個別胺基酸不同,兩者活性類似)作為陽性對照,human Iso IgG1 (CrownBio,Cat#:C0001-4)抗體作為陰性對照。圖1示出HBM1029抗體對內生性表現CLDN18.2的NUGC4_D8細胞及過表現人CLDN18.2的HEK293細胞(HEK293 hCLDN 18.2)或過表現人CLDN18.1的HEK293細胞(HEK293 hCLDN18.1)的結合親和力。PR002727抗體能以劑量依賴方式結合於NUGC4_D8細胞。HBM1029抗體能以劑量依賴方式結合於HEK293 hCLDN18.2及NUGC4_D8細胞。HBM1029抗體對HEK293 hCLDN18.2細胞的結合親和力與IMAB362類似物相當;HBM1029抗體與IMAB362類似物相比對內生性表現CLDN18.2的NUGC4_D8細胞呈現更高的結合親和力。HBM1029的EC50
值顯示在表7中,HBM1029對內生性表現CLDN18.2的NUGC4_D8細胞結合親和力的EC50
值較IMAB362類似物低。HBM1029與HEK293 hCLDN18.1細胞結合親低。同時可推知HBM1029結合於人CLDN18.2蛋白的ECL1 (胞外區1,Extracellular loop 1)而非ECL2。圖2、圖3和圖4示出CLDN18.2抗體對內生性表現CLDN18.2的NUGC4_D8細胞或過表現人CLDN18.2的HEK293細胞(HEK293 hCLDN 18.2)或過表現人CLDN18.1的HEK293細胞(HEK293 hCLDN18.1)的結合親和力。結果顯示:HBM1029、PR003197、PR003340、PR003292、PR003293、PR003240、PR003291、PR003289、PR003890、PR003891、PR003894、PR003897、PR003898抗體與IMAB362類似物相比對內生性表現CLDN18.2的NUGC4_D8細胞呈現更高的結合親和力,與HEK293 hCLDN18.1細胞結合親和力低,而PR002725與HEK293 hCLDN18.1親和力高。
表6 IMAB362類似物的胺基酸序列(由Genscript生物公司合成)
表7 HBM1029抗體的結合親和力EC50
實施例 5 CLDN18.2 抗體的 ADCC 活性
重鏈胺基酸序列 | SEQ ID NO: 75 |
輕鏈胺基酸序列 | SEQ ID NO: 91 |
細胞 | HBM1029 | IMAB362類似物 | |
HEK293 hCLDN18.2 | Max Binding (MFI) | 976,754 | 1,022,190 |
EC50 (nM) | 3.8 | 4.0 | |
NUGC4_D8 | Max Binding (MFI) | 490,220 | 313,021 |
EC50 (nM) | 4.4 | 20.7 |
使用CytoTox 96®非放射性細胞毒性分析試劑盒(Promega,Cat#:G1780),檢測CLDN18.2抗體針對內生性表現人CLDN18.2的NUGC4_D8細胞及HEK293 hCLDN 18.1引發ADCC效應的活性。人PBMC (Miaotong)以300 g離心5分鐘,並在培養基(RPMI1640+10% FBS)中培養過夜。標的細胞及人PBMC於300 g離心5分鐘,然後用培養基(RPMI1640+2% FBS)重新懸浮。將標的細胞的密度調整到2×105
細胞/ml,PBMC的細胞密度調整至少為6×106
細胞/ml,兩種細胞各加50μl到96孔盤的孔中(效靶比至少是30:1)。將待測抗體以培養基(RPMI1640+2% FBS)稀釋成不同濃度加入各孔。樣本在37℃培育至少4小時,然後於標的細胞最大LDH釋放對照孔和體積校正對照孔(Volume correction control)加入10倍Triton-X 100裂解液(RPMI1640 + 2% FBS + 10% Triton-X 100),混合均勻在37℃培育0.5小時。96孔盤於300 g離心5分鐘,取出50μl上清液液,然後以50μl/孔的濃度加入LDH顯色液。混合物避光常溫放置20分鐘後,孔盤在MD StakMax上進行讀數(OD490)。IMAB362類似物作為陽性對照,human Iso IgG1(CrownBio,Cat#:C0001-4)抗體作為陰性對照。結果先計算校正讀數,將實驗孔、標的細胞自發性釋放LDH對照孔、效應細胞自發性釋放LDH對照孔的讀數減去培養基背景對照孔讀數,其次將標的細胞最大LDH釋放對照孔讀數減去體積校正對照孔讀數。ADCC活性(%) = (實驗孔校正讀數-效應細胞自發性釋放LDH對照孔校正讀數-標的細胞自發性釋放LDH對照孔校正讀數) / (標的細胞最大LDH釋放對照孔校正讀數-標的細胞自發性釋放LDH對照孔校正讀數) × 100。圖5示出HBM1029抗體對內生性表現CLDN18.2的NUGC4_D8細胞及HEK293 hCLDN18.1的ADCC活性。HBM1029抗體能以劑量依賴方式特異性地於NUGC4_D8誘導較IMAB362類似物強ADCC效應,而在過表現CLDN18.1的HEK-293細胞上沒有觀察到細胞毒性效果。HBM1029的EC50
值顯示在表8中,HBM1029於NUGC4_D8誘導ADCC的EC50
值較IMAB362類似物低。
表8 HBM1029的ADCC活性
細胞 | HBM1029 | IMAB362類似物 | |
NUGC4_D8 | Max Lysis (%) | 20.9 | 26.9 |
EC50 (nM) | 0.05 | 0.91 |
圖6示出HBM1029、PR003197、PR003340、PR003240、PR003894對內生性表現CLDN18.2的NUGC4_D8細胞的ADCC活性,HBM1029、PR003197、PR003340、PR003240、PR003894能以劑量依賴方式特異性地於NUGC4_D8誘導較IMAB362類似物強ADCC效應。
使用Jurkat FcγRIIIa-V158/NFAT-Luc細胞,檢測CLDN18.2抗體針對NUGC4_D8及HEK293 hCLDN18.1引發ADCC效應的活性。NUGC4_D8及HEK293 hCLDN18.1於300 g離心5分鐘,然後用RPMI1640 + 4% FBS血清培養基重新懸浮。將細胞的密度調整到6×105
細胞/ml,在96孔盤的各孔內加入50 μl細胞懸浮液,於37℃培育過夜。Jurkat FcγRIIIa-V158/NFAT-Luc細胞於400 g離心4分鐘,然後用RPMI1640 + 4% FBS血清培養基重新懸浮。將細胞的密度調整到3×106
細胞/ml,在96孔盤的各孔內加入50 μl細胞懸浮液。抗體以RPMI1640 + 4% FBS培養基稀釋成不同濃度,在96孔盤的各孔內加入50μl抗體稀釋液。細胞與抗體於37℃培育5小時。將96孔盤於常溫靜置30分鐘,添加60μl/孔之常溫One-Glo顯色液(Promega)。之後樣品避光常溫培育10分鐘。用PE Enspire讀盤。IMAB362類似物作為陽性對照,human Iso IgG1(CrownBio,Cat#:C0001-4)抗體作為陰性對照。圖7示出CLDN18.2抗體對內生性表現CLDN18.2的NUGC4_D8細胞的ADCC活性,HBM1029、PR003197、PR003340、PR003240、PR003894、PR003891、PR003898能以劑量依賴方式特異性地於NUGC4_D8誘導較IMAB362類似物強ADCC效應。實施例 6 CLDN18.2 抗體的 CDC 活性
使用CellTiter-Glo發光法細胞活力檢測試劑盒(Promega,Cat#:G7573),檢測CLDN18.2抗體針對HEK293 hCLDN18.1、HEK293 hCLDN18.2及NUGC4_D8細胞引發CDC效應的能力。標的細胞HEK293 hCLDN18.1及HEK293 hCLDN18.2於300 g離心5分鐘,然後用DMEM無血清培養基重新懸浮。標的細胞NUGC4_D8於300 g離心5分鐘,然後用RPMI1640無血清培養基重新懸浮。將標的細胞的密度調整到4×105
細胞/ml,在96孔盤的各孔內加入25 μl細胞懸浮液。抗體以無血清培養基稀釋成不同濃度,在96孔盤的各孔內加入25 μl抗體稀釋液。加入50 μl的正常人血清(GemCell,Cat#:100-512),終濃度為50%,獲得的混合物於37℃培育24小時。將96孔盤於常溫靜置30分鐘,添加100 μl/孔之常溫CellTiter-Glo顯色液。之後樣品避光常溫培育10分鐘。用PE Enspire讀盤。CDC活性(%)=[ 1 - (luminescent sample) / (luminescent mock control) ]×100。IMAB362類似物作為陽性對照,human Iso IgG1(CrownBio,Cat#:C0001-4)抗體作為陰性對照。圖8示出HBM1029抗體對內生性表現CLDN18.2的NUGC4_D8細胞、過表現人CLDN18.1的HEK293細胞及過表現人CLDN18.2的HEK293細胞的CDC活性。HBM1029抗體能以劑量依賴方式於HEK293 hCLDN18.2誘導較IMAB362類似物強CDC效應,而在NUGC4_D8細胞和過表現人CLDN18.1的HEK293細胞上沒有觀察到CDC活性。HBM1029的EC50
值顯示在表9中,HBM1029於HEK293 hCLDN18.2誘導CDC的EC50
值較IMAB362類似物低。
表9 HBM1029的CDC活性
細胞 | HBM1029 | IMAB362類似物 | |
HEK293 hCLDN18.2 | Max Lysis (%) | 100.0 | 100.9 |
EC50 (nM) | 0.42 | 1.07 |
圖9示出PR003197、PR003340對過表現人CLDN18.2的HEK293細胞的CDC活性。PR003197、PR003340抗體能以劑量依賴方式於HEK293 hCLDN18.2誘導較IMAB362類似物強的CDC效應。實施例 7 CLDN18.2 抗體的生長抑制活性
使用CellTiter-Glo發光法細胞活力檢測試劑盒(Promega,Cat#:G7573),檢測CLDN18.2抗體針對HEK293 hCLDN18.1及HEK293 hCLDN18.2引發生長抑制的能力。細胞HEK293 hCLDN18.1及HEK293 hCLDN18.2於300 g離心5分鐘,然後用DMEM+0.5% FBS血清培養基重新懸浮。將細胞的密度調整到1.2×105
細胞/ml,在96孔盤的各孔內加入50 μl細胞懸浮液,於37℃培育過夜。抗體以培養基稀釋成不同濃度,在96孔盤的各孔內加入50μl抗體稀釋液。HEK293 hCLDN18.1及HEK293 hCLDN18.2細胞與抗體於37℃培育3天。將96孔盤於常溫靜置30分鐘,添加100 μl/孔之常溫CellTiter-Glo顯色液。之後樣品避光常溫培育10分鐘。用PE Enspire讀盤。生長抑制活性(%) = [ 1-(luminescent sample) / (luminescent mock control) ] × 100。IMAB362類似物作為陽性對照,human Iso IgG1 (CrownBio,Cat#:C0001-4)抗體作為陰性對照。圖10示出HBM1029抗體對HEK293 hCLDN18.1及HEK293 hCLDN18.2引發的生長抑制活性。HBM1029抗體能以劑量依賴方式於HEK293 hCLDN 18.2誘導較IMAB362類似物強生長抑制效應。HBM1029的EC50
值顯示在表10中。
表10 HBM1029的生長抑制活性。
實施例 8 CLDN18.2 抗體的內吞 (internalization) 活性 (FACS-based assay)
細胞 | HBM1029 | IMAB362類似物 | |
HEK293 hCLDN18.2 | Max生長抑制(%) | 25.0 | N/A |
EC50 (nM) | 1.45 | N/A |
抗體的內吞活性透過FACS使用NUGC4_D8細胞進行檢測。以胰酶消化細胞,並用FACS緩衝液(含2%FBS的 PBS)洗滌1次。細胞於300 g離心5分鐘,然後用FACS緩衝液重新懸浮。將細胞的密度調整到4×106
細胞/ml,並置於冰上預冷30分鐘。抗體以FACS緩衝液稀釋成不同濃度,並置於冰上預冷30分鐘。在預冷的深孔盤的孔內加入700 μl細胞懸浮液,及700 μl抗體稀釋液。於4℃培育2小時後,孔盤用預冷的FACS緩衝液洗滌3遍。用250 μl預冷的FACS緩衝液重新懸浮細胞,在37℃預熱的深孔盤的孔內加入100μl細胞懸浮液,及1.1 ml 37℃預熱的FACS緩衝液,在4℃預冷的深孔盤的孔內加入100 μl細胞懸浮液,及1.1 ml 4℃預冷的FACS緩衝液。獲得的混合物分別在0,30,60,120和240分鐘取50 μL細胞懸浮液(105
細胞/孔)置於提前預冷的深孔盤(含1.2 mL FACS緩衝液)中。細胞於300 g離心5分鐘,之後加入含AF647耦合的山羊抗人IgG二抗的FACS預冷緩衝液(終濃度為1.5 μg/ml,Jackson,Cat#:109-605-088)。在4℃培育1小時後,孔盤用FACS預冷緩衝液洗滌2遍。細胞用固定液重新懸浮,之後使用FACS儀(BD Canto II)檢測細胞螢光。內吞活性(%)= (1-MFI37 ℃
/MFI4 ℃
)×100。IMAB362類似物作為陽性對照,human Iso IgG1 (CrownBio,Cat#:C0001-4)抗體作為陰性對照。圖11示出培育不同時間的HBM1029抗體對NUGC4_D8細胞的內吞活性。HBM1029抗體培育30分鐘後誘導約50%內吞活性。圖11還示出HBM1029抗體能以劑量依賴方式於NUGC4_D8誘導較IMAB362類似物強的內吞活性。HBM1029的EC50
值顯示在表11中,HBM1029於NUGC4_D8誘導內吞的EC50
值較IMAB362類似物低。
表11 HBM1029的內吞活性。
實施例 9 CLDN18.2 抗體的內吞活性 (cytotoxicity-based method)
細胞 | HBM1029 | IMAB362類似物 | |
NUGC4_D8 | Max內吞 (%) | 45.4 | 64.1 |
EC50 (nM) | 0.05 | 0.40 |
使用CellTiter-Glo發光法細胞活力檢測試劑盒(Promega,Cat#:G7573),針對HEK293 hCLDN18.1,HEK293 hCLDN18.2及NUGC4_D8細胞,檢測HBM1029抗體與MMAF耦合的抗人IgG抗體(Moradec,Cat#:AH-102-AF)共培養引發細胞毒殺的能力。細胞HEK293 hCLDN18.1及HEK293 hCLDN18.2於300 g離心5分鐘,然後用DMEM + 10 % FBS血清培養基重新懸浮,將細胞的密度調整到4×104
細胞/ml。細胞NUGC4_D8於300 g離心5分鐘,然後用RPMI1640+10% FBS血清培養基重新懸浮,將細胞的密度調整到2×104
細胞/ml,在96孔盤的各孔內加入50 μl細胞懸浮液,於37℃培育過夜。HBM1029抗體以培養基稀釋成不同濃度,在96孔盤的各孔內加入25 μl抗體稀釋液。MMAF耦合的抗人IgG抗體以培養基稀釋,在96孔盤的各孔內加入25 μl抗體稀釋液,終濃度為6.6 nM。細胞與抗體於37℃培育3天。將96孔盤於常溫靜置30分鐘,添加100 μl/孔之常溫CellTiter-Glo顯色液。之後樣品避光常溫培育10分鐘。用PE Enspire讀盤。細胞存活率(%) = [ (luminescent sample) / (luminescent mock control) ] × 100。IMAB362類似物作為陽性對照,human Iso IgG1(CrownBio,Cat#:C0001-4)抗體作為陰性對照。圖12示出HBM1029抗體與MMAF耦合的抗人IgG抗體共培養時標的細胞的存活率。HBM1029抗體與MMAF耦合的抗人IgG抗體共培養時,能以劑量依賴方式於NUGC4_D8細胞和HEK293 hCLDN18.2細胞產生較IMAB362類似物強的細胞毒殺效應,但於HEK293 hCLDN18.1細胞則未產生細胞毒殺效應。實施例 10 HBM1029 抗體的競爭結合活性
抗體的競爭結合親和力透過FACS使用表現人CLDN18.2的HEK293細胞進行檢測。IMAB362類似物使用FITC螢光耦聯試劑盒(Abcam,Cat#:ab188285)耦合為IMAB362-FITC類似物。細胞於300 g離心5分鐘,然後用FACS緩衝液(含2%FBS的PBS)重新懸浮。將細胞的密度調整到106
細胞/ml,在96孔盤的各孔內加入50 μl細胞懸浮液。FITC耦聯抗體以FACS緩衝液稀釋,在96孔盤的各孔內加入50 μl耦聯抗體稀釋液。欲進行競爭結合的抗體以FACS緩衝液稀釋成不同濃度,在96孔盤的各孔內加入50 μl抗體稀釋液。於4℃培育2小時後,孔盤用FACS緩衝液洗滌2遍。細胞用固定液重新懸浮,之後使用FACS儀(ACEA NovoCyte)監測細胞螢光。human Iso IgG1 (CrownBio,Cat#:C0001-4)抗體作為陰性對照。圖13示出HBM1029抗體對IMAB362-FITC類似物於HEK293 hCLDN 18.2細胞的競爭結合親和力。HBM1029抗體能以劑量依賴方式競爭結合於HEK293 hCLDN18.2細胞,推測HBM1029抗體與IMAB362類似物結合表位相似。HBM1029可與IMAB362類似物競爭,抑制其結合於CLDN18.2表現的細胞;而已知IMAB362類似物只結合CLDN18.2,不結合CLDN18.1。故推測HBM1029結合於人CLDN18.2蛋白的ECL1 (胞外區1,Extracellular loop 1)而非ECL2。實施例 11 CLDN18.2 抗體的藥代動力學研究
CLDN18.2抗體的藥代動力學,方法如下,選取體重18~22克的雌性BALB/c nude小鼠6隻,按5 mg/kg的劑量透過靜脈注射給與抗體藥物;一組3隻於給藥前以及給藥後15分鐘、24小時(1天)、第4天、和第10天採集全血,另一組3隻給藥前以及給藥後5小時、第2天、第7天、和第14天採集全血。將全血靜置30分鐘使其凝固,隨後在4℃下以2,000 rpm離心5分鐘並將分離的血清樣品在-80℃下凍存直至分析。本實施例採用ELISA方法來定量測定小鼠血清中的藥物濃度。ELISA方法,透過塗佈於96孔盤的山羊抗人Fc多株抗體來捕獲小鼠血清中的含有人Fc的抗體,然後加入HRP標記的山羊抗人Fc第二抗體來檢測。使用Phoenix WinNonlin軟體8.2版,選用非室性模型(NCA)對血藥濃度數據進行分析以評價其藥代動力學參數。
圖14和表12顯示的是IMAB362類似物、HBM1029的藥代動力學參數。結果表明,IMAB362類似物、HBM1029在小鼠體內的半衰期分別為248、282小時。
表12 IMAB362類似物、HBM1029藥代動力學參數
實施例 11 CLDN18.2 抗體的體內藥效學研究
IMAB362類似物 | HBM1029 | |
T1/2 (hr) | 248 | 282 |
Vd (mL/kg) | 112 | 94 |
AUCall (µg/mL hr) | 9,542±385 | 12,062±418 |
Cl (mL/hr/kg) | 0.32 | 0.24 |
C0 (µg/mL) | 90 | 104 |
CLDN18.2抗體的體內藥效學研究,方法如下,細胞接種當天每隻NCG小鼠皮下接種5×106
NUGC4_D8腫瘤細胞,腫瘤細胞首先重新懸浮在PBS與Matrigel (1:1) 的混合液中(0.1ml),然後與PBMC (重新懸浮在0.05mL的PBS)混合,皮下接種。當各組小鼠平均瘤體積在90 mm3
時進行分組給藥,18隻小鼠被分為3組,分組後開始給藥,給藥週期為一周兩次,共進行了6次給藥,給藥方式為尾靜脈注射。開始給藥後,每週秤量體重及腫瘤體積兩次,腫瘤體積計算方式為:腫瘤體積(mm3
)= 0.5×腫瘤長徑×腫瘤短徑2。給藥後第21天結束實驗觀察,隨後所有小鼠進行安樂處理。數據分析採用t-test。圖15顯示的是IMAB362類似物、HBM1029的體內藥效學研究結果。給藥後第21天,對照組小鼠的平均腫瘤體積為1526 mm3
。測試藥IMAB362類似物(50mg/kg)治療組在給藥後第21天平均腫瘤體積為728 mm3
,相較溶媒對照組有顯著性差異(p值為0.0052),腫瘤抑制率TGI(%)為52.29%。測試藥HBM1029 (50mg/kg)治療組在給藥後第21天平均腫瘤體積為618 mm3
,相較溶媒對照組有顯著的腫瘤抑制作用(p值為0.0009),腫瘤抑制率TGI(%)為59.47%。整個治療給藥期間,動物均表現出良好的藥物耐受,未出現嚴重的體重下降及動物死亡現象。
雖然以上描述了本發明的具體實施方式,但是本領域的技術人員應當理解,這些僅是舉例說明,在不背離本發明的原理和實質的前提下,可以對這些實施方式做出多種變更或修改。因此,本發明的保護範圍由所附申請專利範圍限定。
圖1中A、B、C分別示出HBM1029以及PR002727抗體對NUGC4_D8、HEK293 hCLDN18.2、HEK293 hCLDN18.1細胞的結合親和力。
圖2中A、B示出PR003197、PR003292、PR003293、PR003340抗體對NUGC4_D8、HEK293 hCLDN18.2細胞的結合親和力;圖2C示出了PR003197、PR003292、PR003293、PR003340、PR002725抗體對HEK293 hCLDN18.1細胞的結合親和力。
圖3的A、B分別示出PR003240、PR003291、PR003289以及HBM1029抗體對NUGC4_D8、HEK293 hCLDN18.1細胞的結合親和力。
圖4的A、B分別示出PR003890、PR003891、PR003894、PR003897、PR003898抗體對NUGC4_D8、HEK293 hCLDN18.2細胞的結合親和力;C示出PR003890、PR003891、PR003894、PR003897、PR003898、PR002725以及HBM1029抗體對HEK293 hCLDN18.1細胞的結合親和力。
圖5示出HBM1029抗體透過人PBMC表現出對NUGC4_D8、HEK293 hCLDN 18.1細胞的ADCC活性。
圖6示出PR003894、PR003240、PR003340、PR003197以及HBM1029透過人PBMC表現出對NUGC4_D8細胞的ADCC活性。
圖7示出HBM1029、PR003894、PR003240、PR003340、PR003197、PR003891、PR003898透過reporter細胞表現出對NUGC4_D8細胞的ADCC活性。
圖8為HBM1029抗體於HEK293 hCLDN18.2細胞、HEK293 hCLDN18.1細胞及NUGC4_D8細胞引發CDC效應。
圖9為HBM1029、PR003197、PR003340於HEK293 hCLDN18.2細胞引發CDC效應。
圖10為HBM1029抗體於HEK293 hCLDN18.1及HEK293 hCLDN18.2引發的生長抑制活性。
圖11為HBM1029抗體於NUGC4_D8細胞的內吞活性。其中,(A)為NUGC4_D8細胞與200 nM抗體混合培育不同時間段,(B)為NUGC4_D8細胞與不同濃度抗體混合培育1小時。
圖12為HBM1029抗體與MMAF耦合的抗人IgG抗體共培養時標的細胞的存活率。
圖13為HBM1029抗體對IMAB362-FITC類似物於HEK293 hCLDN18.2細胞的競爭結合親和力。不同濃度的HBM1029抗體、20 nM IMAB362-FITC類似物、HEK293 hCLDN18.2細胞混合培育。
圖14為IMAB362類似物、HBM1029藥代動力學輪廓。
圖15為IMAB362類似物、HBM1029的體內藥效學研究。
Claims (24)
- 一種標靶CLDN18.2的抗體或其抗原結合片段,其特徵在於,其包含輕鏈可變區和重鏈可變區,所述重鏈可變區包含HCDR1、HCDR2和HCDR3,所述的輕鏈可變區包含LCDR1、LCDR2和LCDR3;其中:所述HCDR1的胺基酸序列如SEQ ID NO:7所示、所述HCDR2的胺基酸序列如SEQ ID NO:17所示、所述HCDR3的胺基酸序列如SEQ ID NO:27所示、所述LCDR1的胺基酸序列如SEQ ID NO:41所示、所述LCDR2的胺基酸序列如SEQ ID NO:48所示且所述LCDR3的胺基酸序列如SEQ ID NO:56所示。
- 如請求項1所述的標靶CLDN18.2的抗體或其抗原結合片段,其特徵在於,所述重鏈可變區包含如SEQ ID NO:64所示的胺基酸序列或其變異體,且所述輕鏈可變區包含如SEQ ID NO:71所示的胺基酸序列或其變異體;其中,所述變異體至少保留突變前序列的功能,且所述變異體與突變前序列的同一性至少為85%。
- 如請求項1所述的標靶CLDN18.2的抗體或其抗原結合片段,其特徵在於,所述標靶CLDN18.2的抗體還包含抗體重鏈恆定區和抗體輕鏈恆定區;所述重鏈恆定區選自hIgG1、hIgG2、hIgG3或hIgG4,所述輕鏈恆定區選自人源抗體的κ鏈或者λ鏈。
- 如請求項1~3任一項所述的標靶CLDN18.2的抗體或其抗原結合片段,其特徵在於,所述標靶CLDN18.2 的抗體為全長抗體、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFv、雙特異性抗體或多特異性抗體,或由上述抗體製得的單株抗體或多株抗體。
- 如請求項4所述的標靶CLDN18.2的抗體或其抗原結合片段,其特徵在於,其是全長抗體,所述全長抗體包括重鏈和輕鏈;其中:所述重鏈包含如SEQ ID NO:77所示的胺基酸序列,所述輕鏈包含如SEQ ID NO:93所示的胺基酸序列;或者,所述重鏈包含如SEQ ID NO:79所示的胺基酸序列,所述輕鏈包含如SEQ ID NO:93所示的胺基酸序列;或者,所述重鏈包含如SEQ ID NO:85所示的胺基酸序列,所述輕鏈包含如SEQ ID NO:93所示的胺基酸序列;或者,所述重鏈包含如SEQ ID NO:83所示的胺基酸序列,所述輕鏈包含如SEQ ID NO:93所示的胺基酸序列;或者,所述重鏈包含如SEQ ID NO:84所示的胺基酸序列,所述輕鏈包含如SEQ ID NO:93所示的胺基酸序列。
- 一種分離的核酸,其編碼如請求項1~5任一項所述的標靶CLDN18.2的抗體或其抗原結合片段。
- 一種重組表現載體,其包含如請求項6所述的分離的核酸。
- 如請求項7所述的重組表現載體,其特徵在於,所述重組表現載體為質體、黏接質體、噬菌體或病毒載體,其中,所述病毒載體為反轉錄病毒載體、慢病毒載體、腺病毒載體或腺相關病毒載體。
- 一種轉形株,其在宿主細胞中包含如請求項7或8所述的重組表現載體;其特徵在於,所述宿主細胞為E.coli TG1、BL21細胞,或者CHO-K1細胞。
- 一種嵌合抗原受體,其包含如請求項1~5任一項所述的標靶CLDN18.2的抗體或其抗原結合片段。
- 一種基因修飾的細胞,其特徵在於,其包含如請求項1~5任一項所述的標靶CLDN18.2的抗體或其抗原結合片段。
- 一種標靶CLDN18.2的抗體或其抗原結合片段的製備方法,其包含培養如請求項9所述的轉形株,從培養物中獲得標靶CLDN18.2的抗體或其抗原結合片段。
- 一種抗體藥物偶聯物,其包含細胞毒性劑,以及如請求項1~5任一項所述的標靶CLDN18.2的抗體或其抗原結合片段。
- 一種藥物組成物,其包含如請求項1~5任一項所述的標靶CLDN18.2的抗體或其抗原結合片段和/或如請求項13所述的抗體藥物偶聯物,以及藥學上可接受的載體。
- 如請求項14所述的藥物組成物,其特徵在於,所述藥物組成物還含有由激素製劑、標靶小分子製劑、蛋白酶體抑制劑、成像劑、診斷劑、化療劑、溶瘤藥物、細胞毒性劑、細胞因子、共刺激分子的活化劑、抑制性分子的抑制劑以及疫苗組成的群組中的一種或多種。
- 一種如請求項1~5任一項所述的標靶CLDN18.2的抗體或其抗原結合片段、請求項13所述的抗體藥物偶聯物和/或請求項14或15所述的藥物組成物在製備診斷、預防和/或治療腫瘤的藥物中的應用。
- 如請求項16所述的應用,其特徵在於,所述腫瘤為CLDN18.2陽性腫瘤。
- 如請求項16所述的應用,其特徵在於,所述腫瘤為胃癌、食管癌、肺癌、卵巢癌、黑色素瘤、腎癌、乳腺癌、結腸直腸癌、肝癌、胰腺癌、膀胱癌、頭頸癌、支氣管癌、神經膠質瘤或白血病。
- 一種試劑盒,其包括如請求項1~5任一項所述的標靶CLDN18.2的抗體或其抗原結合片段、如請求項10所述的嵌合抗原受體、如請求項11所述的基因修飾的細胞、或如請求項13中所述的抗體藥物偶聯物或如請求項14或15所述的藥物組成物。
- 如請求項19所述的試劑盒,其特徵在於,所述試劑盒還包括(i)施用抗體或其抗原結合片段或抗體藥物偶聯物或藥物組成物的裝置;和/或(ii)使用說明。
- 一種套裝藥盒,其包含藥盒A和藥盒B,其中: 所述藥盒A含有如請求項1~5任一項所述的標靶CLDN18.2的抗體或其抗原結合片段、如請求項10所述的嵌合抗原受體、如請求項11所述的基因修飾的細胞、如請求項13所述的抗體藥物偶聯物和/或如請求項14或15所述的藥物組成物;所述藥盒B含有其他抗腫瘤抗體或者包含所述其他抗腫瘤抗體的藥物組成物,和/或由激素製劑、標靶小分子製劑、蛋白酶體抑制劑、成像劑、診斷劑、化療劑、溶瘤藥物、細胞毒性劑、細胞因子、共刺激分子的活化劑、抑制性分子的抑制劑以及疫苗組成的群組中的一種或多種。
- 一種免疫檢測或者測定CLDN18.2的方法,其包括使用如請求項1~5任一項所述的標靶CLDN18.2的抗體或其抗原結合片段、如請求項10所述的嵌合抗原受體、如請求項13所述的抗體藥物偶聯物或如請求項14或15所述的藥物組成物;所述檢測為非診斷和/或治療目的的。
- 一種如請求項1~5任一項所述的標靶CLDN18.2的抗體或其抗原結合片段、如請求項10所述的嵌合抗原受體、如請求項13所述的抗體藥物偶聯物或如請求項14或15所述的藥物組成物,和第二治療劑聯合,在製備診斷、預防和/或治療腫瘤的藥物中的應用。
- 如請求項23所述的應用,其特徵在於,所述第二治療劑包含其他抗腫瘤抗體或者包含所述其他抗腫瘤抗體 的藥物組成物,和/或由激素製劑、標靶小分子製劑、蛋白酶體抑制劑、成像劑、診斷劑、化療劑、溶瘤藥物、細胞毒性劑、細胞因子、共刺激分子的活化劑、抑制性分子的抑制劑以及疫苗組成的群組中的一種或多種。
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