CN114728065A - 针对cd3和bcma的抗体和自其制备的双特异性结合蛋白 - Google Patents

针对cd3和bcma的抗体和自其制备的双特异性结合蛋白 Download PDF

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Abstract

公开了识别CD3和B细胞成熟因子蛋白质(BCMA)的高亲和力抗体。来自人源化抗CD3和抗BCMA抗体的结合位点并入Fab串联免疫球蛋白样式，同时结合亲和力无明显损失，并且所得到的双特异性多价结合蛋白能够同时地与CD3和BCMA二者结合。这类抗体、其抗原结合部分和双特异性FIT‑Ig结合蛋白用于治疗癌症。

Description

针对CD3和BCMA的抗体和自其制备的双特异性结合蛋白
发明领域
本发明涉及识别CD3的新抗体，识别B细胞成熟抗原(BCMA)的新抗体，和使用这些抗体产生的双特异性BCMA/CD3结合蛋白如FIT-Ig结合蛋白和MAT-Fab结合蛋白。抗体和双特异性结合蛋白可用于治疗免疫学疾病和血液学癌。
发明背景
分化抗原簇3(CD3)
T细胞受体(TCR)与主要组织相容性复合体(MHCs)展示的抗原(Ags)结合并且在T细胞功能中发挥至关重要的作用。但是TCR本身没有胞内信号传导作用。相反，TCR非共价地与分化抗原簇3(CD3)复合体缔合并通过基于免疫受体酪氨酸的CD3活化基序(ITAM)触发胞内信号传导。CD3 T细胞共受体帮助活化细胞毒T细胞(CD8+幼稚T细胞)并且还活化辅助T细胞(CD4+幼稚T细胞)。它由蛋白质复合体组成并由四条不同链组成。在哺乳动物中，该复合体含有CD3γ链、CD3δ链和两条CD3ε链。这些链与T细胞受体(TCR)和CD3δ链(δ-链)缔合以在T淋巴细胞中产生活化信号。TCRδ-链和CD3γ、δ、和ε链一起构成TCR复合体。CD3四链复合体随后按1:1:1化学计量形成CD3εγ、CD3εδ和δδ二聚体。
CD3最初表达在前胸腺细胞(胸腺中生成T细胞的干细胞)的细胞质中。前胸腺细胞分化成常见的胸腺细胞，并且随后分化成髓质胸腺细胞，并且CD3抗原正是在这后一个阶段才开始迁移至细胞膜。发现该抗原与全部成熟T细胞的胞膜结合，并且几乎不存在于其他细胞类型中，但它似乎少量存在于Purkinje细胞中。
这种高特异性，结合CD3存在于T细胞发育的全部阶段，使其成为组织切片中T细胞的可用免疫组织化学标记。该抗原在几乎全部T细胞淋巴瘤和白血病中保持存在，并且可以因此用来将它们与表面相似的B细胞和髓样肿瘤分开。已经显示一些针对CD3ε链的抗体激活TCR-CD3复合物，可能通过使T细胞上的CD3复合体簇集来激活。此外，已经研究靶向CD3和肿瘤特异性抗原的双特异性抗体用于借助T细胞的重定向肿瘤消灭。因为T细胞活化需要CD3，正在将靶向它的药物(经常为单克隆抗体)作为I型糖尿病和其他自身免疫性疾病的免疫抑制剂疗法(例如，奥昔珠单抗(otelixizumab))研究。
B细胞成熟抗原(BCMA)
B细胞成熟抗原(BCMA、TNFRSF17、CD269)是TNF受体超家族的成员。BCMA表达限于B细胞谱系，主要表达在浆细胞和浆母细胞上并且不存在于幼稚B细胞上。BCMA与以下两种配体结合：增殖诱导性配体(APRIL、TNFSF13、TALL-2、CD256)和B细胞活化因子(BAFF、BLYS、TNFSF13B、TALL-1、CD257)。相比BAFF，BCMA对APRIL具有更高结合亲和力。多发性骨髓瘤(MM)细胞表达高水平的BCMA。具有配体阻断活性的靶向BCMA的抗体可以既作为裸IgG，又作为药物-缀合物，促进MM细胞的细胞毒性。BCMA在晚期成熟B细胞上的受限表达还使其成为嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)的理想共靶，所述T细胞是经基因工程化以展示嵌合抗原受体以便将修饰的T细胞靶向至特定细胞蛋白的T细胞。CAR-T细胞为B细胞癌提供有前景的免疫疗法，然而，未充分理解其作用机理，并且CAR-T细胞疗法的副作用经常严重并且包括细胞因子释放综合征(细胞因子风暴)和神经系统毒性。
理解CD3和BCMA的作用还已导致一种相关的免疫疗法，称作双特异性T细胞重定向性抗体。靶向CD3和BCMA二者的双特异性抗体将可用于通过重定向的T细胞细胞毒性(RTCC)治疗多发性骨髓瘤。
发明简述
本发明提供以高亲和力与CD3结合的新抗体和以高亲和力与BCMA结合的新抗体。本发明也提供与CD3和BCMA二者反应的BCMA/CD3双特异性Fabs串联免疫球蛋白(FIT-Igs)。本发明也提供与CD3和BCMA二者反应的BCMA/CD3双特异性单价不对称串联Fab抗体(MAT-Fabs)。本发明的抗体和双特异性结合蛋白可以活化TCR-CD3复合物。本文所述的双特异性多价结合蛋白将可用作BCMA/CD3双特异性抑制剂，以借助重定向的T细胞细胞毒性，为治疗多发性骨髓瘤(MM)细胞提供协同组合效应。
本发明还提供了制备和使用本文所述的抗CD3和抗BCMA抗体和BCMA/CD3双特异性结合蛋白的方法，以及可用于检测样本中的CD3和/或BCMA的方法中、或用于治疗或预防与CD3和/或BCMA活性相关的个体的病症的方法中的各种组合物。
在另一个实施方案中，本发明提供了双特异性Fabs-in-Tandem免疫球蛋白(FIT-Ig)结合蛋白，其包含第一、第二和第三多肽链，
其中所述第一多肽链从氨基到羧基末端包含(i)VLA-CL-VHB-CH1-Fc，其中CL直接与VHB融合，或(ii)VHB-CH1-VLA-CL-Fc，其中CH1直接与VLA融合；
其中所述第二多肽链从氨基到羧基末端包含VHA-CH1；和
其中所述第三多肽链从氨基到羧基末端包含VLB-CL；
其中VL是轻链可变结构域，CL是轻链恒定结构域，VH是重链可变结构域，CH1是重链恒定结构域，Fc是免疫球蛋白Fc区，A是CD3或BCMA的表位，B是CD3或BCMA的表位，前提是A和B不同。根据本发明，此类FIT-Ig结合蛋白与CD3和BCMA两者结合。
在另一个实施方案中，此类FIT-Ig结合蛋白的Fab片段掺入了来自与抗原靶标CD3或BCMA之一结合的亲本抗体的VLA和VHA结构域，并且掺入了来自与抗原靶标CD3和BCMA中的另一个结合的不同亲本抗体的VLB和VHB结构域。因此，第一第二和第三多肽链的VHA-CH1/VLA-CL和VHB-CH1/VLB-CL配对将导致识别CD3和BCMA的串联Fab部分。
根据本发明，BCMA/CD3FIT-Ig结合蛋白有利地包含第一、第二和第三多肽链，其中所述第一多肽链从氨基到羧基末端包含VLCD3-CL-VHBCMA-CH1-Fc，其中CL直接与VHBCMA融合，其中所述第二多肽链从氨基到羧基末端包含VHCD3-CH1；其中所述第三多肽链从氨基到羧基末端包含VLBCMA-CL；其中VLCD3是抗CD3抗体的轻链可变结构域，CL是轻链恒定结构域，VHCD3是抗CD3抗体的重链可变结构域，CH1是重链恒定结构域，VLBCMA是抗BCMA抗体的轻链可变结构域，VHBCMA是抗BCMA抗体的重链可变结构域，并且Fc是免疫球蛋白Fc区。有利地，在第一多肽链中，结构域VLCD3-CL与抗CD3亲本抗体的轻链相同，结构域VHCD3-CH1与抗CD3亲本抗体的重链可变结构域和重链恒定结构域相同，结构域VLBCMA-CL与抗BCMA亲本抗体的轻链相同，并且结构域VHBCMA-CH1与抗BCMA亲本抗体的重链可变结构域和重链恒定结构域相同。
在可选实施方案中，BCMA/CD3 FIT-Ig结合蛋白可以有利地包含第一、第二和第三多肽链，其中所述第一多肽链从氨基端至羧基端包含VLBCMA-CL-VHCD3-CH1-Fc，其中CL与VHCD3直接融合，其中所述第二多肽链从氨基端至羧基端包含VHBCMA-CH1；并且其中所述第三多肽链从氨基端至羧基端包含VLCD3-CL；其中VLCD3是抗CD3抗体的轻链可变结构域，CL是轻链恒定结构域，VHCD3是抗CD3抗体的重链可变结构域，CH1是重链恒定结构域，VLBCMA是抗BCMA抗体的轻链可变结构域，VHBCMA是抗BCMA抗体的重链可变结构域，并且Fc是免疫球蛋白Fc区。有利地，在第一多肽链中，结构域VLBCMA-CL与抗BCMA亲本抗体轻链相同，结构域VHBCMA-CH1与抗BCMA亲本抗体的重链可变结构域和重链恒定结构域相同，结构域VCD3-CL与抗CD3亲本抗体轻链相同，并且结构域VHCD3-CH1与抗CD3亲本抗体的重链可变结构域和重链恒定结构域相同。
在可选实施方案中，BCMA/CD3 FIT-Ig结合蛋白可以有利地包含第一、第二和第三多肽链，其中所述第一多肽链从氨基端至羧基端包含VHBCMA-CH1-VLCD3-CL-Fc，其中CH1与VLCD3直接融合，其中所述第二多肽链从氨基端至羧基端包含VLBCMA-CL；并且其中所述第三多肽链从氨基端至羧基端包含VHCD3-CH1；其中VLCD3是抗CD3抗体的轻链可变结构域，CL是轻链恒定结构域，VHCD3是抗CD3抗体的重链可变结构域，CH1是重链恒定结构域，VLBCMA是抗BCMA抗体的轻链可变结构域，VHBCMA是抗BCMA抗体的重链可变结构域，并且Fc是免疫球蛋白Fc区。有利地，在第一多肽链中，结构域VLBCMA-CL与抗BCMA亲本抗体轻链相同，结构域VHBCMA-CH1与抗BCMA亲本抗体的重链可变结构域和重链恒定结构域相同，结构域VCD3-CL结构域与抗CD3亲本抗体轻链相同，并且结构域VHCD3-CH1与抗CD3亲本抗体的重链可变结构域和重链恒定结构域相同。
在可选实施方案中，BCMA/CD3 FIT-Ig结合蛋白可以有利地包含第一、第二和第三多肽链，其中所述第一多肽链从氨基端至羧基端包含VHCD3-CH1-VLBCMA-CL-Fc，其中CH1与VLBCMA直接融合，其中所述第二多肽链从氨基端至羧基端包含VLCD3-CL；并且其中所述第三多肽链从氨基端至羧基端包含VHBCMA-CH1；其中VLCD3是抗CD3抗体的轻链可变结构域，CL是轻链恒定结构域，VHCD3是抗CD3抗体的重链可变结构域，CH1是重链恒定结构域，VLBCMA是抗BCMA抗体的轻链可变结构域，VHBCMA是抗BCMA抗体的重链可变结构域，并且Fc是免疫球蛋白Fc区。有利地，在第一多肽链中，结构域VLBCMA-CL与抗BCMA亲本抗体轻链相同，结构域VHBCMA-CH1与抗BCMA亲本抗体的重链可变结构域和重链恒定结构域相同，结构域VLCD3-CL结构域与抗CD3亲本抗体轻链相同，并且结构域VHCD3-CH1与抗CD3亲本抗体的重链可变结构域和重链恒定结构域相同。
在FIT-Ig结合蛋白的第一多肽链的前述式中，Fc区可以是初始或变异Fc区。在具体的实施方案中，Fc区是来自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE或IgD的人Fc区。在具体的实施方案中，例如如下文所述，Fc是来自IgG1的人Fc：
DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:1)。
在本发明的一个实施方案中，本发明的FIT-Ig结合蛋白保留亲本抗体的一个或多个特性，其中利用来自所述亲本抗体的Fab片段的序列并且并入FIT-Ig结构。在一个另外的实施方案中，FIT-Ig将保留与亲本抗体相当的靶抗原(即，CD3和BCMA)结合亲和力，这意味着如通过表面等离子体共振或生物层干涉测量法所测量，与亲本抗体针对其相应靶抗原的结合亲和力相比，FIT-Ig结合蛋白针对CD3和BCMA抗原靶的结合亲和力变动不超过10倍。
在一个实施方案中，本发明的BCMA/CD3 FIT-Ig结合蛋白结合CD3和BCMA并且包含第一多肽链，所述第一多肽链包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成；第二多肽链，所述第二多肽链包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成；和第三多肽链，所述第三多肽链包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成。
在另一个实施方案中，本发明的BCMA/CD3 FIT-Ig结合蛋白结合CD3和BCMA并且包含第一多肽链，所述第一多肽链包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成；第二多肽链，所述第二多肽链包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成；和第三多肽链，所述第三多肽链包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成。
在另一个实施方案中，本发明的BCMA/CD3 FIT-Ig结合蛋白结合CD3和BCMA并且包含第一多肽链，所述第一多肽链包含SEQ ID NO:80的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成；第二多肽链，所述第二多肽链包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成；和第三多肽链，所述第三多肽链包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成。
在另一个实施方案中，本发明的BCMA/CD3 FIT-Ig结合蛋白结合CD3和BCMA并且包含第一多肽链，所述第一多肽链包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成；第二多肽链，所述第二多肽链包含SEQ ID NO:84的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成；和第三多肽链，所述第三多肽链包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成。
在另一个实施方案中，本发明的BCMA/CD3 FIT-Ig结合蛋白结合CD3和BCMA并且包含第一多肽链，所述第一多肽链包含SEQ ID NO:86的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成；第二多肽链，所述第二多肽链包含SEQ ID NO:87的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成；和第三多肽链，所述第三多肽链包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成。
本发明也提供一种能够结合人CD3的抗体，其中抗体的抗原结合结构域包含选自如下文限定的CDR组的一套六个CDR，即，CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3：
Figure BDA0003661442660000041
Figure BDA0003661442660000051
本发明也提供一种能够结合人BCMA的抗体，其中抗体的抗原结合结构域包含选自如下文限定的CDR组的一套六个CDR，即，CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3：
Figure BDA0003661442660000052
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白是包含两个或更多个抗原结合位点的双特异性多价免疫球蛋白结合蛋白，其中至少一个抗原结合位点包含选自上述CDR组1和2的CDR组并且至少一个抗原结合位点包含选自上述CDR组3和4的CDR组。
在一个实施方案中，本发明的抗CD3抗体包含VH结构域和VL结构域，其中两个可变结构域包含选自以下VH/VL对的氨基酸序列：
Figure BDA0003661442660000053
Figure BDA0003661442660000061
在又一个实施方案中，本发明的抗BCMA抗体包含VH结构域和VL结构域，其中两个可变结构域包含选自以下VH/VL对的氨基酸序列：
VH/VL对 VH/VL对
SEQ ID NO:29/SEQ ID NO:30 SEQ ID NO:36/SEQ ID NO:40
SEQ ID NO:31/SEQ ID NO:32 SEQ ID NO:36/SEQ ID NO:41
SEQ ID NO:34/SEQ ID NO:38 SEQ ID NO:36/SEQ ID NO:42
SEQ ID NO:35/SEQ ID NO:38 SEQ ID NO:36/SEQ ID NO:43
SEQ ID NO:36/SEQ ID NO:38 SEQ ID NO:36/SEQ ID NO:44
SEQ ID NO:37/SEQ ID NO:38 SEQ ID NO:34/SEQ ID NO:45
SEQ ID NO:34/SEQ ID NO:39 SEQ ID NO:34/SEQ ID NO:46
SEQ ID NO:35/SEQ ID NO:39 SEQ ID NO:34/SEQ ID NO:47
SEQ ID NO:36/SEQ ID NO:39 SEQ ID NO:34/SEQ ID NO:48
SEQ ID NO:37/SEQ ID NO:39 SEQ ID NO:34/SEQ ID NO:49
在另一个实施方案中，抗CD3抗体或抗BCMA抗体可以用来通过本领域充分建立的技术，产生识别相同靶抗原的衍生性结合蛋白。这种衍生物可以例如是单链抗体(scFv)、Fab片段(Fab)、Fab’片段、F(ab')2、Fv和二硫键连接的Fv。
Fab片段免疫球蛋白由共价缔合以形成抗体结合位点的两个组分组成。两个组分各自是可变结构域-恒定结构域链(VH-CH1或VL-CL)，并且因此可以将Fab的每个V-C链描述为Fab结合单元的一个“对半”。
在本发明的另一个方面，本文所述的抗体或双特异性结合蛋白能够调节CD3、BCMA或二者的生物学功能。在另一个方面，本文所述的抗CD3抗体能够抑制CD3信号传导。在另一个方面，本文所述的抗BCMA抗体能够抑制BCMA与其配体APRIL和/或BAFF相互作用，并且任选地本发明的抗BCMA抗体能够抑制BCMA介导的细胞信号传导途径。
在一个实施方案中，如通过表面等离子体共振或生物层干涉测量法所测量，本文所述的抗CD3抗体或其抗原结合片段对人CD3具有至少1×105M-1s-1、例如至少3.3×105M-1s-1或更大的结合速率常数(kon)。
在另一个实施方案中，如通过表面等离子体共振或生物层干涉测量法所测量，本文所述的抗CD3抗体或其抗原结合片段对人CD3具有小于5×10-3的脱离速率常数(koff)。
在另一个实施方案中，如通过表面等离子体共振或生物层干涉测量法所测量，本文所述的抗CD3抗体或其抗原结合片段对人CD3具有小于2×10-8M、例如小于1.5×10-8M的解离常数(KD)。
在一个实施方案中，如通过表面等离子体共振或生物层干涉测量法所测量，本文所述的抗BCMA抗体或其抗原结合片段对人BCMA具有至少4×104M-1s-1、例如至少1×105M-1s-1、至少2×105M-1s-1或更大的结合速率常数(kon)。
在另一个实施方案中，如通过表面等离子体共振或生物层干涉测量法所测量，本文所述的抗BCMA抗体或其抗原结合片段对人BCMA具有小于5×10-3s-1、小于1×10-3s-1、小于5×10-4s-1、小于2×10-5s-1或小于1×10-5s-1的脱离速率常数(koff)。
在另一个实施方案中，如通过表面等离子体共振或生物层干涉测量法所测量，本文所述的抗BCMA抗体或其抗原结合片段对人BCMA具有小于2×10-8M、小于1×10-9M或小于5×10-10M的解离常数(KD)。
在一个实施方案中，如通过表面等离子体共振或生物层干涉测量法所测量，能够结合CD3和BCMA的本发明双特异性BCMA/CD3 FIT-Ig结合蛋白对人CD3具有至少1×105M-1s-1、例如至少2×105M-1s-1或更大、或至少3×105M-1s-1或更大的结合速率常数(kon)，并且同一结合蛋白对人BCMA具有至少5×104M-1s-1、例如至少6×104M-1s-1或更大、或至少8×104M-1s-1或更大的结合速率常数(kon)。在其他实施方案中，如本文所述的能够结合CD3和BCMA的双特异性BCMA/CD3 FIT-Ig结合蛋白将对人CD3具有这样的结合速率常数(kon)，其距亲本抗CD3抗体针对CD3的kon降低不超过10倍并且距亲本抗BCMA抗体针对BCMA的kon降低不超过10倍，其中从所述亲本抗体分别衍生抗CD3特异性和抗BCMA特异性。换句话说，FIT-Ig结合蛋白将保留这样的针对每种抗原(CD3或BCMA)的结合速率常数，所述结合速率常数相比与相应CD3或BCMA抗原有反应的亲本抗体所示的结合速率常数(kon)，高于、同于或不多于不到一个数量级。如本文中公开，针对抗原的BCMA/CD3 FIT-Ig结合蛋白可以显示与亲本抗体针对相应抗原所示的kon相比，针对一种或两种抗原的kon改善，或针对一种或两种抗原的kon可以基本上分别同于亲本抗体所示的kon，或如果与亲本抗体相比，存在FIT-Ig结合蛋白针对一种或两种抗原所示的kon降低，则这种降低不多于10倍降低。例如，FIT-Ig中针对特定抗原的kon与亲本抗体对该抗原的kon相比，降低小于50％、降低小于25％。与亲本抗体的kon相比，双特异性FIT-Igs中这类高度保留的kon值是本领域令人惊讶的成就。
在一个实施方案中，如通过表面等离子体共振或生物层干涉测量法所测量，能够结合CD3和BCMA的本发明双特异性FIT-Ig结合蛋白对人CD3具有小于1×10-2s-1、小于8×10-3s-1、小于7×10-3s-1，例如小于6×10-3s-1的脱离速率常数(koff)，并且同一结合蛋白对人BCMA具有小于5×10-5s-1、小于4×10-5s-1、小于3×10-5s-1或小于5×10-6s-1的脱离速率常数(koff)。
在另一个实施方案中，能够结合CD3和BCMA的本发明双特异性BCMA/CD3 FIT-Ig结合蛋白对CD3具有小于5×10-8M、小于3×10-8M、小于2×10-8M、或小于1.75×10-8M的解离常数(KD)，并且同一结合蛋白对人BCMA具有小于1×10-9M、小于6×10-10M、小于3×10-10M、小于1×10-10M、小于8×10-11M、或小于6×10-11M的解离常数(KD)。在其他实施方案中，如本文所述的能够结合CD3和BCMA的双特异性FIT-Ig结合蛋白将对人CD3具有这样的解离常数(KD)，其距亲本抗CD3抗体针对CD3的KD差异不超过10倍并且距亲本抗BCMA抗体针对BCMA的KD差异不超过10倍，其中从所述亲本抗体分别衍生FIT-Ig结合蛋白的抗CD3特异性和抗BCMA特异性。换句话说，FIT-Ig结合蛋白将保留这样的如通过解离常数(KD)所示的亲本抗体针对每种抗原(CD3或BCMA)的结合亲和力，所述解离常数处于分别与CD3或BCMA抗原有反应的亲本抗体所示的KD的一个数量级范围内。
如本文所公开的，与亲本抗体所呈现的对相应抗原的KD相比，BCMA/CD3/FIT-Ig结合蛋白可以显示对一种或两种抗原的KD的改善(即，具有较低的KD值；更紧密地结合)，或者，对一种或两种抗原的KD可以基本上与亲本抗体分别呈现的相同，或者，与亲本抗体的KD相比，FIT-Ig结合蛋白所显示的对一种或两种抗原的KD显示降低(即，具有较高的KD值；较不紧密地结合)，但是如果FIT-Ig结合蛋白与亲本抗体的KD之间存在差异，那么该差异不超过10倍。例如，与一种或两种亲本抗体所呈现的对相应抗原的KD相比，BCMA/CD3/FIT-Ig结合蛋白对一种或两种抗原显示较低的KD(更紧密地结合)。保留亲本抗CD3和抗BCMA抗体的结合亲和力±10倍的KD变化是本领域令人惊讶的成就。
本发明还提供了药物组合物，其包含至少一种本文所述的抗CD3抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的载体。本发明还提供了药物组合物，其包含至少一种抗BCMA抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的载体。本发明还提供了药物组合物，其包含本文所述的抗CD3和抗BCMA抗体或其抗原结合片段的组合，以及药学上可接受的载体。本发明还提供了与CD3和BCMA二者具有反应性的双特异性、多价免疫球蛋白结合蛋白，该结合蛋白掺入了来自本文所述的抗CD3和抗BCMA抗体的VH/VL结合位点。特别地，本发明提供了药物组合物，其包含能够结合CD3和BCMA的至少一种FIT-Ig结合蛋白或至少一种MAT-Fab结合蛋白以及药学上可接受的载体。本发明的药物组合物可进一步包含至少一种另外的活性成分。在一个实施方案中，这种另外的成分包括，但不限于，治疗剂、成像剂、细胞毒性剂、血管生成抑制剂、激酶抑制剂、共刺激分子阻断剂、粘附分子阻断剂、不同特异性的抗体或功能性片段、可检测标记或报道分子；特定细胞因子的激动剂或拮抗剂、麻醉剂、非类固醇抗炎药(NSAID)、镇痛剂、麻醉剂、镇静剂、局部麻醉剂、神经肌肉阻断剂、抗微生物剂、皮质类固醇、同化类固醇(anabolic steroid)、促红细胞生成素、免疫原、免疫抑制剂、生长激素、激素替代药物、放射性药物、抗抑郁药、抗精神病药、兴奋剂(例如苯丙胺、咖啡因等)、β激动剂、吸入的类固醇、肾上腺素或类似物、细胞因子。
在另一个实施方案中，药物组合物还包含至少一种用于治疗病症的其他治疗剂，在所述病症中CD3介导的和/或BCMA介导的信号传导活性是有害的。
在另一个实施方案中，本发明提供了编码本发明的抗CD3抗体或其抗原结合片段的一个或多个氨基酸序列的分离核酸；编码本发明的抗BCMA抗体或其抗原结合片段的一个或多个氨基酸序列的分离核酸；和编码能够结合CD3和BCMA的双特异性Fabs-in-Tandem免疫球蛋白(FIT-Ig)结合蛋白的一个或多个氨基酸序列的分离核酸。可以将此类核酸插入载体中以进行各种遗传分析或表达、表征或改善本文所述的抗体或结合蛋白的一种或多种特性。载体可包含编码本文所述的抗体或结合蛋白的一个或多个氨基酸序列的一个或多个核酸分子，其中所述一个或多个核酸分子可操作地连接至适当的转录和/或翻译序列，以允许抗体或结合蛋白在携带载体的特定宿主细胞中表达。用于克隆或表达编码本文所述的结合蛋白的氨基酸序列的核酸的载体的实例包括但不限于pcDNA、pTT、pTT3、pEFBOS、pBV、pJV和pBJ及其衍生物。
本发明还提供了包含载体的宿主细胞，所述载体包含编码本文所述的抗体或结合蛋白的一个或多个氨基酸序列的核酸。可用于本发明的宿主细胞可以是原核或真核宿主细胞。示例性的原核宿主细胞是大肠杆菌。在本发明中用作宿主细胞的真核细胞包括原生生物细胞、动物细胞、植物细胞和真菌细胞。示例性的真菌细胞是酵母细胞，包括酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。根据本发明用作宿主细胞的示例性动物细胞包括但不限于哺乳动物细胞、禽细胞和昆虫细胞。示例性的哺乳动物细胞包括但不限于CHO细胞、HEK细胞和COS细胞。根据本发明用作宿主细胞的昆虫细胞是昆虫Sf9细胞。
另一方面，本发明提供了生产抗CD3抗体或其功能片段的方法，该方法包括在足以使宿主细胞表达能够结合CD3的抗体或片段的条件下，在培养基中培养包含编码该抗体或功能片段的表达载体的宿主细胞。另一方面，本发明提供了生产抗BCMA抗体或其功能片段的方法，该方法包括在足以使宿主细胞表达能够结合BCMA的抗体或片段的条件下，在培养基中培养包含编码该抗体或功能片段的表达载体的宿主细胞。另一方面，本发明提供了生产能够结合CD3和BCMA的双特异性、多价结合蛋白，具体是FIT-Ig结合蛋白的方法，该方法包括在足以使宿主细胞表达能够结合CD3和BCMA的结合蛋白的条件下，在培养基中培养包含编码FIT-Ig结合蛋白的表达载体的宿主细胞。可以分离如此产生的蛋白并用于本文所述的各种组合物和方法中。
在一个实施方案中，本发明提供了在有此需要的受试者中治疗癌症的方法，该方法包括向受试者施用本文所述的抗CD3抗体或其CD3结合片段，其中所述抗体或结合片段能够在表达CD3的细胞中结合CD3并抑制CD3介导的信号传导。在另一个实施方案中，本发明提供了在有此需要的受试者中治疗癌症的方法，该方法包括向受试者施用本文所述的抗BCMA抗体或其BCMA结合片段，其中所述抗体或结合片段能够在表达BCMA的细胞中结合BCMA并抑制BCMA介导的信号传导。在另一个实施方案中，本发明提供了在有此需要的受试者中治疗癌症的方法，该方法包括向受试者施用本文所述的如本文所述的能够结合CD3和BCMA二者的双特异性FIT-Ig结合蛋白，其中结合蛋白能够结合CD3和BCMA并且能够在表达CD3的细胞中抑制CD3介导的信号传导及能够在表达BCMA的细胞中抑制BCMA介导的信号传导。
在另一个实施方案中，本发明提供了在有此需要的受试者中治疗自身免疫疾病或癌症的方法，其中结合蛋白能够结合CD3和BCMA，并且其中所述自身免疫疾病或癌症通常是对免疫疗法有反应的自身免疫疾病或癌症。在另一个实施方案中，癌症是与免疫疗法无关的癌症。在另一个实施方案中，癌症是难治性或复发性恶性肿瘤。在另一个实施方案中，结合蛋白抑制肿瘤细胞的生长或存活。在另一个实施方案中，癌症选自黑色素瘤(例如，转移性恶性黑色素瘤)、肾癌(例如，透明细胞癌)、前列腺癌(例如，激素难治性前列腺腺癌)、胰腺腺癌、乳腺癌、结肠癌、肺癌(例如，非小细胞肺癌)、食道癌、头颈部鳞状细胞癌、肝癌、卵巢癌、子宫颈癌、甲状腺癌、成胶质细胞瘤、胶质瘤、白血病、淋巴瘤和其他肿瘤性恶性肿瘤。
本文所述的治疗方法可以进一步包括向有此需要的受试者施用免疫刺激性佐剂，例如包含全部或部分磷酸二酯或硫代磷酸酯骨架的CpG寡聚脱氧核苷酸(CpGODN)。例如，在本发明的治疗方法中，可以将免疫刺激性佐剂掺入包含本发明的抗体或FIT-Ig结合蛋白的组合物中，并将该组合物施用于需要治疗的受试者。在另一个实施方案中，本发明的治疗方法可以包括向需要治疗的受试者施用本文所述的抗体或FIT-Ig结合蛋白的步骤；以及在向所述受试者施用本发明的抗体或FIT-Ig结合蛋白的步骤之前、同时或之后，向所述受试者施用免疫刺激性佐剂的单独步骤。
附图简述
图1是显示针对微量平板上固定的人CD3ε/γ异二聚体-Fc融合蛋白靶的供试抗体的结合作用的一组曲线。将新分离的mAbCD3-001和mAbCD3-002的结合活性与参考抗CD3单克隆抗体(“对照α-CD3 mAb”)和作为阴性对照的不相关鼠抗体(“mIgG”)比较。
图2是显示针对微量平板上固定的食蟹猴CD3ε/γ异二聚体-Fc融合蛋白靶的供试抗体的结合作用的一组曲线。将新分离的mAbCD3-001和mAbCD3-002的结合活性与参考抗CD3单克隆抗体(“对照α-CD3 mAb”)和作为阴性对照的不相关鼠抗体(“mIgG”)比较。
图3是显示体外培养的人T细胞受抗CD3抗体mAbCD3-001(本发明)和OKT3(阳性对照)刺激而增殖的柱状图。
图4是显示体外培养的人T细胞受抗CD3抗体mAbCD3-001(本发明)和OKT3(阳性对照)刺激分泌干扰素γ(IFN-g)的柱状图。
图5A-图5H是利用mAbCD3-001的不同人源化VH变体和两种VK变体(EM0006-01VK.1或EM0006-01VK.1A，参见表2)之一，比较人源化抗CD3抗体构建体的结合活性的荧光曲线。曲线显示，VH变体对CD3结合活性重要并且不同的VL很少影响与Jurkat细胞的结合。将曲线图5A-5H上的几条曲线分组允许通过与中等亲和力和低亲和力结合物对比，鉴定亲和力极高的人源化抗体，如HuEM0006-01-8和HuEM0006-01-17。
图6是显示多种抗BCMA抗体在表达BCMA的肿瘤细胞系NCI-H929中抑制BCMA配体BAFF诱导的NF-κB磷酸化的能力的曲线。分别使用抗BAFF mAb和不相关抗RAC1鼠IgG作为阳性对照和阴性对照。本文所述的新抗BCMA抗体mAbBCMA-002和mAbBCMA-003有利地与专利文献中描述的参考抗体(图6中标记的TAB1和TAB2)比较。详情尤其参见下文实施例3.3。
图7是显示多种抗BCMA抗体在HEK293转染的表达BCMA的细胞系HEK293F-BCMA-NF-kB-luc中抑制BCMA配体BAFF诱导的NF-κB磷酸化的能力的曲线。使用抗BCMA参考抗体TAB1和TAB2作为阳性对照用于比较。使用不相关抗Ro1鼠IgG作为对照。
图8是显示抗BCMA抗体在BCMA转染的HEK293细胞中抑制BCMA配体APRIL(TNFSF13)诱导的NF-κB荧光素酶信号的能力的曲线。
图9是显示BCMA/CD3双特异性FIT-Ig Fab片段与表达BCMA的NCI-H929细胞结合的曲线。三种受测FIT-Fab具有相同的BCMA结合结构域。参见实施例4.1、4.2和4.3。
图10是显示BCMA/CD3 FIT-Ig结合蛋白与经转染以表达人T细胞受体复合体的CHO细胞(CHOK1/CD3/TCR)结合的曲线(参见实施例1.1)。三种受测FIT-Ig结合蛋白具有来自三种不同的人源化亲本抗CD3抗体的不同CD3结合位点。参见实施例4.3。
图11是显示BCMA/CD3双特异性FIT-Ig和BCMA/CD3 FIT-Fab使得与NCI-H929细胞共培养的Jurkat-NFAT细胞活化重定向的能力的曲线。测试单特异性抗CD3 IgG(HuEM1006-01-24)及其Fab片段(HuEM1006-01-24-Fab)用于比较，并且使用不相关人IgG作为阴性对照。
图12是显示BCMA/CD3双特异性FIT-Fab结合蛋白使得与NCI-H929共培养的Jurkat-NFAT细胞活化重定向的能力的曲线。使用抗BCMA和抗CD3单克隆抗体和不相关Fab(FIT1002-5a-Fab)的组合作为对照。
图13是显示多种BCMA/CD3双特异性FIT-Fab使得针对NCI-H929细胞的T细胞细胞毒性重定向的能力的曲线。使用不相关FIT-Fab(FIT1002-5a-Fab)、抗CD3 Fab和抗BCMAmAb的组合(combo)、参考抗BCMA mAb(TAB1)单独、单独的抗CD3 Fab(HuEM1006-01-24-Fab)和不相关人IgG作为对照。
图14是这样的曲线，其显示不用表达BCMA的NCI-H929靶细胞进行该测定时，人源化BCMA/CD3 FIT-Ig和BCMA/CD3 FIT-Fab展示有限的非靶标重定向的Jurkat-NFAT细胞活化作用。使用抗CD3 IgG(HuEM1006-01-24)、其Fab片段(HuEM1006-01-24-Fab)、不相关FIT-Ig(FIT1002-5a)和不相关人IgG(hIgG)作为对照。
图15是这样的曲线，其显示本发明的人源化BCMA/CD3 FIT-Ig能够使得针对NCI-H929肿瘤细胞的T细胞细胞毒性重定向。使用小鼠-人嵌合FIT-Ig(FIT1006-4b)和不相关FIT-Ig(FIT1002-5a)作为对照。
图16是显示上文描述的两种BCMA/CD3人源化双特异性FIT-Ig结合蛋白对表达BCMA的NCI-H929细胞的结合活性的曲线。使用不相关人IgG抗体(hIgG)作为对照。
图17是显示上文描述的两种BCMA/CD3人源化双特异性FIT-Ig结合蛋白对表达CD3的Jurkat细胞的结合活性的曲线。使用不相关人IgG抗体(hIgG)作为对照。
图18和19显示了与表达BCMA的靶细胞(图18)和表达CD3的靶细胞(图19)的结合活性，证实了它们都靶向具有两种替代构型的双特异性构建体。
图20显示了通过用BCMA x CD3 FIT-Ig处理实现的对植入人PBMC的NPSG小鼠中肿瘤生长的抑制。
图21显示了通过用BCMA x CD3 FIT-Ig处理诱导的B细胞耗竭。
图22显示了在FIT-Ig处理的食蟹猴中循环T细胞的瞬时损失。
发明详述
本发明涉及新的抗CD3抗体、新的抗BCMA抗体、其抗原结合部分和多价双特异性结合蛋白如Fabs串联免疫球蛋白(FIT-Igs)和“单价不对称串联Fab双特异性抗体”或“MAT-Fab双特异性抗体”或简单地“MAT-Fab抗体”。本发明的多个方面涉及与人CD3和人BCMA结合的抗CD3抗体和抗BCMA抗体及抗体片段、FIT-Ig结合蛋白和MAT-Fab结合蛋白和其药物组合物，以及产生这类抗体、功能性抗体片段和结合蛋白的核酸、重组表达载体和宿主细胞。本发明还涵盖使用本发明抗体、功能性抗体片段和双特异性结合蛋白用于检测人CD3、人BCMA或前两者；在体外或体内抑制人CD3和/或人BCMA活性；和治疗分别由CD3和/或BCMA与其配体即T细胞受体和增殖诱导性配体(APRIL)结合介导的疾病、尤其癌症的方法。
除非本文另有定义，否则本发明使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。这些术语的含义和范围应该是清楚的，但是，如果存在任何潜在的歧义，本文提供的定义优先于任何字典或外在定义。此外，除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数，且复数术语应包括单数。在本申请中，除非另有说明，否则“或”的使用意味着“和/或”。此外，术语“包括(including)”以及诸如“包括(includes)”和“包括(included)”的其他形式的使用不是限制性的。此外，除非另外特别说明，否则诸如“元件”或“组件”等术语涵盖包含一个单元的元件和组件、以及包含一个以上子单元的元件和组件。
通常，在本文中，与细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白质和核酸化学以及杂交相关使用的命名法和技术，是本领域公知和常用的那些。除非另有说明，否则本发明的方法和技术通常根据本领域公知的常规方法以及如本说明书中引用和讨论的各种一般性的和更具体的参考文献中所描述的方法来进行。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书、按照本领域通常实施的方式或按照本文所述的方式来进行。在本文中，与分析化学、合成有机化学以及药物和药物化学相关使用的术语以及实验室程序和技术，是本领域公知和常用的那些。标准技术用于化学合成、化学分析、药物制备、配制和递送以及患者的治疗。
以下定义了一些术语，以便可以更容易地理解本发明。
术语“多肽”是指氨基酸的任何聚合链。术语“肽”和“蛋白质”可与术语多肽互换使用，并且也指氨基酸的聚合链。术语“多肽”包括天然的或人工的蛋白质、蛋白质片段和蛋白质氨基酸序列的多肽类似物。术语“多肽”包括其片段和变体(包括变体片段)，除非上下文另有说明。对于抗原多肽，多肽片段任选含有至少一个连续或非线性的多肽表位。可以使用本领域普通技术确认至少一个表位片段的精确边界。该片段包含至少约5个连续氨基酸，例如至少约10个连续氨基酸，至少约15个连续氨基酸，或至少约20个连续氨基酸。多肽的变体如本文所述。
术语“分离的蛋白质”或“分离的多肽”是一种蛋白质或多肽，就其起源或衍生来源而言，其与天然状态下伴随其的天然相关组分分离，基本上不含来自同一物种的其他蛋白质，由来自不同物种的细胞表达，或在自然界中不存在。因此，化学合成的或在不同于其天然来源细胞的细胞系统中合成的多肽，将是与其天然相关组分“分离”的。还可以使用本领域公知的蛋白质纯化技术，通过分离，使蛋白质基本上不含天然相关组分。
术语“回收”是指通过分离(例如使用本领域公知的蛋白质纯化技术)使得化学物质(如多肽)成为基本上不含天然相关组分的过程。
术语“生物活性”是指本文所述的抗CD3或抗BCMA抗体的所有固有生物特性。CD3抗体的生物特性包括但不限于与CD3蛋白的结合；抗BCMA抗体的生物特性包括但不限于与例如增殖诱导性配体(APRIL)和/或B细胞活化因子(BAFF)蛋白的结合。
术语“特异性的结合”或“特异性地结合”，当涉及抗体、结合蛋白、或肽与第二个化学物质的相互作用时，表示该相互作用依赖于第二个化学物质上的特定结构(例如，抗原决定簇或表位)的存在；例如，抗体识别并结合特定的蛋白质结构，但非通常的蛋白质。如果抗体对于表位“A”是特异性的，在含有标记的“A”和抗体的反应中，含有表位A(或游离的，未标记的A)的分子的存在，将降低与抗体结合的标记的A的量。
术语“抗体”宽泛地指，由四条多肽链(两条重(H)链和两条轻(L)链)组成的任何免疫球蛋白(Ig)分子、或保留了Ig分子的必要表位结合特征的其任何功能性片段、突变体、变体或衍生物。这样的突变体、变体或衍生抗体形式是本领域已知的。以下讨论了非限制性的实施方案。
在全长抗体中，每条重链由重链可变区(在本文中缩写为VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由三个结构域CH1、CH2和CH3组成。每条轻链由轻链可变区(在本文中缩写为VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。VH和VL区可以进一步细分成超可变区，称为互补决定区(CDR)，间插更保守的区域，称为框架区(FR)。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，按照以下顺序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4，从氨基端排列至羧基端。VH结构域的第一、第二和第三个CDR通常记为CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；同样，VL结构域的第一、第二和第三个CDR通常记为CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。免疫球蛋白分子可以是任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。
术语“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链的C端区域，其可以通过完整抗体的木瓜蛋白酶消化来产生。Fc区可以是天然序列Fc区或变体Fc区。免疫球蛋白的Fc区通常包含两个恒定结构域，即，CH2结构域和CH3结构域，并且任选地包含CH4结构域，例如在IgM和IgE抗体的Fc区的情况下。IgG、IgA和IgD抗体的Fc区包含铰链区、CH2结构域和CH3结构域。相反，IgM和IgE抗体的Fc区缺乏铰链区，但是包含CH2结构域、CH3结构域和CH4结构域。Fc部分中具有氨基酸残基替换以改变抗体效应子功能的变体Fc区是本领域已知的(参见，例如，Winter等，美国专利号5,648,260和5,624,821)。抗体的Fc部分介导几种重要的效应子功能，例如细胞因子诱导、ADCC、吞噬作用、补体依赖性细胞毒性(CDC)以及抗体和抗原-抗体复合物的半衰期/清除速率。在一些情况下，这些效应子功能对于治疗性抗体是理想的，但在其他情况下可能是不必要的或甚至是有害的，这取决于治疗目的。某些人IgG同种型，特别是IgG1和IgG3，分别通过与FcγR和补体C1q的结合来介导ADCC和CDC。在另一个实施方案中，在抗体的恒定区例如抗体的Fc区中替换至少一个氨基酸残基，从而改变抗体的效应子功能。免疫球蛋白的两条相同重链的二聚化通过CH3结构域的二聚化来介导，并且通过将CH1恒定结构域连接至Fc恒定结构域(例如CH2和CH3)的铰链区中的二硫键来稳定。IgG的抗炎活性完全依赖于IgG Fc片段的N-连接聚糖的唾液酸化。已经确定了抗炎活性的精确聚糖要求，从而可以产生合适的IgG1 Fc片段，由此产生具有极大增强效力的完全重组的唾液酸化IgG1Fc(参见，Anthony等，Science，320：373-376(2008))。
术语抗体的“抗原结合部分”和“抗原结合片段”或“功能性片段”可互换使用，并且是指抗体的一个或多个片段，所述片段保留特异性地结合抗原(即，与衍生所述部分或片段的全长抗体结合相同的抗原(例如，CD3，BCMA))的能力。已经表明，可以通过全长抗体的片段来执行抗体的抗原结合功能。这样的抗体实施方案还可以是双特异性的、双重特异的、或多特异性的格式；特异性地结合两个或更多个不同的抗原(例如CD3和不同的抗原，例如BCMA)。涵盖在术语抗体的“抗原结合部分”中的结合片段的实例包括：(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab’)2片段，包括在铰链区通过二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)Fd片段，由VH和CH1结构域组成；(iv)Fv片段，由抗体的单臂的VL和VH结构域组成，(v)dAb片段(Ward等Nature 341:544-546(1989)，PCT公开WO90/05144)，其包括单个可变结构域；和(vi)分离的互补决定区(CDR)。此外，尽管Fv片段的两个结构域，VL和VH可以通过分开的基因编码，但也可以使用重组方法，通过人工接头将它们连接在一起，所述接头能使其作为单个蛋白质链产生，其中VL和VH区配对形成单价分子(称为单链Fv(scFv)；参见，例如，Bird等Science 242:423-426(1988)；和Huston等Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883(1988))。这样的单链抗体也旨在包括在术语抗体的“抗原结合部分”以及以上给出的等效术语内。该术语还包括其他形式的单链抗体，如双链抗体(diabody)。双链抗体可以是二价的、双特异性抗体，其中VH和VL结构域在单个多肽链上表达，但使用的接头太短以致不允许同一链上的两个结构域之间配对，并由此迫使这些结构域分别与另一条链的互补结构域配对，从而形成两个抗原结合位点(参见，例如，Holliger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993))。这样的抗体结合部分是本领域已知的(Kontermann和Dübel编辑，Antibody Engineering(Springer-Verlag，NewYork，2001)，p.790(ISBN 3-540-41354-5))。此外，单链抗体还包括包含一对串联Fv区段(VH-VH1-VH-CH1)的“线性抗体”，其与互补轻链多肽一起，形成一对抗原结合区(Zapata等，Protein Eng.,8(10):1057-1062(1995)；和美国专利No.5,641,870)。
免疫球蛋白恒定区(C)结构域是指重链(CH)或轻链(CL)恒定结构域。鼠和人IgG重链和轻链恒定结构域氨基酸序列是本领域已知的。
术语“单克隆抗体”或“mAb”是指从基本上同质的抗体群获得的抗体，即除了可能少量存在的可能天然发生的突变外，构成群的各个抗体是相同的。单克隆抗体是高度特异性的，针对单一抗原决定簇(表位)。此外，与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，每种mAb针对抗原上的单一决定簇。修饰语“单克隆”不应解释为需要通过任何特定方法来产生抗体。
术语“人抗体”包括具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。本发明的人抗体可以包括不是由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)，例如，在CDR中，并且特别是在CDR3中。然而，如本文中使用的，术语“人抗体”，不包括其中源自另一个哺乳动物物种(如小鼠)的种系的CDR序列已经嫁接至人框架序列上的抗体。
术语“重组人抗体”包括通过重组方式制备、表达、形成或分离的人抗体，如使用转染至宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体、从重组的组合人抗体文库分离的抗体(Hoogenboom,H.R.，Trends Biotechnol.15:62-70(1997)；Azzazy和Highsmith，Clin.Biochem.35:425-445(2002)；Gavilondo和Larrick，BioTechniques 29:128-145(2002)；Hoogenboom和Chames，Immunol.Today，21:371-378(2000))、从人免疫球蛋白基因的转基因动物(例如，小鼠)分离的抗体(参见，例如，Taylor等，Nucl.Acids Res.20:6287-6295(1992)；Kellermann等，Current Opinion in Biotechnology 13:593-597(2002)；Little等，Immunol.Today，21:364-370(2002))；或通过涉及将人免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA序列的任何其他方式制备、表达、形成或分离的抗体。这样的重组人抗体具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。然而，在某些实施方式，可以对这样的重组人抗体进行体外诱变(或，当使用人Ig序列的转基因动物时，体内体细胞诱变)，由此重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是如下序列：尽管源自并且涉及人种系VH和VL序列，但可以非天然存在于体内人抗体种系库中。
术语“嵌合抗体”是指包括来自一个物种的重链和轻链可变区序列和来自另一个物种的恒定区序列的抗体，如具有连接人恒定区的小鼠重链和轻链可变区的抗体。
术语“CDR-移植的抗体”是指包含来自一个物种的重链和轻链可变区序列的抗体，但其中VH和/或VL的一个或多个CDR区的序列被另一个物种的CDR序列替换，如具有人重链和轻链可变区的抗体，其中一个或多个人CDR已经被鼠CDR序列替代。
术语“人源化抗体”是指包含来自非人物种(例如，小鼠)的重链和轻链可变区序列的抗体，但其中VH和/或VL序列的至少一部分已被改变为更像“人”的，即更类似于人类种系可变序列。一种类型的人源化抗体是CDR-移植的抗体，其中将来自非人物种(例如小鼠)的CDR序列引入人VH和VL框架序列中。人源化抗体是免疫特异性地结合目标抗原的抗体或其变体、衍生物、类似物或片段，其中所述抗体包含基本上具有人抗体的氨基酸序列的框架区和恒定区但具有基本上是非人抗体的氨基酸序列的互补决定区(CDR)。如本文所用，术语“基本上”就CDR而言是指与非人抗体CDR的氨基酸序列至少具有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％相同的氨基酸序列的CDR。人源化抗体包含至少一个并且通常是两个可变结构域(Fab、Fab'、F(ab')2、Fv)的基本上全部，其中所有或基本上所有CDR区对应于非人免疫球蛋白(即供体抗体)的，并且所有或基本上所有框架区是人免疫球蛋白共有序列的。在一个实施方案中，人源化抗体还包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，所述免疫球蛋白恒定区通常是人免疫球蛋白的。在一些实施方案中，人源化抗体含有轻链以及至少重链的可变结构域。抗体还可包括重链的CH1、铰链、CH2、CH3和CH4区。在一些实施方案中，人源化抗体仅含有人源化轻链。在一些实施方案中，人源化抗体仅含有人源化重链。在具体的实施方案中，人源化抗体仅含有轻链的人源化可变结构域和/或人源化重链。
人源化抗体可选自任何类别的免疫球蛋白，包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE，以及任何同种型，包括不限于IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。人源化抗体可包含来自一种以上类别或同种型的序列，并且可使用本领域公知的技术，选择特定的恒定结构域以优化所需的效应子功能。
人源化抗体的框架和CDR区不需要与亲本序列精确对应，例如，可以通过至少一个氨基酸残基的置换、插入和/或缺失来诱变供体抗体CDR或受体框架，使得该位点的CDR或框架残基与供体抗体或共有框架不对应。然而，在一个示例性实施方案中，此类突变不会是大量的。通常，人源化抗体残基的至少80％，例如至少85％，至少90％或至少95％将对应于亲本FR和CDR序列。在特定框架位置的回复突变以恢复为出现在供体抗体中该位置的相同氨基酸，通常可以用于保留特定的环结构或正确定向CDR序列以与靶抗原接触。
术语“CDR”指抗体可变域序列内的互补决定区。在重链和轻链的每个可变区中存在三个CDR，其被称为CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。如本文所用的术语“CDR组”是指在能够结合抗原的单个可变区中出现的三个CDR的组。根据不同的系统，这些CDR的确切边界已被不同地定义。Kabat描述的系统(Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health，Bethesda，Maryland(1987)和(1991))不仅提供了适用于抗体的任何可变区的明确残基编号系统，而且还提供了定义三个CDR的精确残基边界。
本领域公认的术语“Kabat编号”是指，在抗体或其抗原结合部分的重链和轻链可变区中比其他氨基酸残基更可变(即，超变)的氨基酸残基的编号系统。参见，Kabat等，Ann.NY and Acad.Sci.，190：382-391(1971)；和Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，美国卫生和人类服务部，NIH公开号91-3242(1991)。
在过去的二十年中，可变重链和轻链区氨基酸序列广泛的公共数据库的增长和分析，使得人们了解了可变区序列内框架区(FR)和CDR序列之间的典型边界，并使得本领域技术人员能够根据Kabat编号、Chothia编号或其他系统准确确定CDR。参见，例如，Martin,"Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains,"Kontermann and Dübel,eds.,Antibody Engineering(Springer-Verlag,Berlin,2001),第31章,第432-433页。
术语“多价结合蛋白”表示包含两个或更多个抗原结合位点的结合蛋白。多价结合蛋白优选地被工程化为具有三个或更多个抗原结合位点，并且通常不是天然存在的抗体。术语“双特异性结合蛋白”是指能够结合两个不同特异性靶标的结合蛋白。本发明的“Fabs-in-Tandem免疫球蛋白”(FIT-Ig)结合蛋白包含两个或更多个抗原结合位点，并且通常是四价结合蛋白。FIT-Ig可以是单特异性的，即，能够结合一种抗原，或者是多特异性的，即，能够结合两种或更多种抗原。根据本发明的示例性的FIT-Ig结合CD3和BCMA两者，因此是双特异性的。包含两条长(重)V-C-V-C-Fc链多肽和四条短(轻)V-C链多肽的FIT-Ig结合蛋白形成具有四个Fab抗原结合位点的六聚体(VH-CH1与VL-CL配对，有时称为VH-CH1::VL-CL)。FIT-Ig的每一半均包含一个重链多肽和两个轻链多肽，并且三条链的VH-CH1和VL-CL元件的互补免疫球蛋白配对产生两个Fab结构的抗原结合位点，其串联排列。在本发明中，优选地包含Fab元件的免疫球蛋白结构域直接融合在重链多肽中，而不使用结构域间接头。即，长(重)多肽链的N末端V-C元件在其C末端直接融合至另一V-C元件的N末端，后者又与C末端Fc区连接。在双特异性FIT-Ig结合蛋白中，串联Fab元件将与不同的抗原反应。每个Fab抗原结合位点包含重链可变结构域和轻链可变结构域，每个抗原结合位点总共有六个CDR。在一些实施方案中，本发明的多价结合蛋白是FIT-Ig Fab片段(即，FIT-Fab)，其实际上是没有C端Fc区的FIT-Ig。这样的FIT-Fab可以通过从现有的FIT-Ig去除C末端Fc区而获得，或者可以通过本领域已知的多种技术中的任何来生产，例如，从包含编码相应的肽链的表达载体的宿主细胞中表达。
在PCT公开WO2015/103072中提供了对FIT-Ig分子的设计、表达和表征的描述。这种FIT-Ig分子的示例包括一条重链和两条不同的轻链。重链包含结构式VLA-CL-VHB-CH1-Fc，其中CL直接与VHB融合，或重链包含结构式VHB-CH1-VLA-CL-Fc，其中CH1直接与VLA融合，其中VLA是来自结合抗原A的亲本抗体的可变轻链结构域，VHB是来自结合抗原B的亲本抗体的可变重链结构域，CL是轻链恒定结构域，CH1是重链恒定结构域，而Fc是免疫球蛋白Fc区(例如，IgG1抗体重链的C末端铰链-CH2-CH3部分)。FIT-Ig的两条轻链多肽链分别具有式VHA-CH1和VLB-CL。在双特异性FIT-Ig的实施方案中，抗原A和抗原B是不同的抗原、或相同抗原的不同表位。在本发明中，A和B之一是CD3，另一个是BCMA。
如本文所用，当指多肽结构中两个结构域的线性连接时，术语“直接融合”或“直接地融合”意指不使用人工多肽接头或连接物情况下，结构域由肽键直接连接。
术语“活性”包括诸如特异性结合靶抗原的能力、抗体对抗原的亲和力、中和靶抗原的生物活性的能力、抑制靶抗原与其天然受体相互作用的能力等性质。本发明示例性的抗体和结合蛋白具有抑制CD3与其配体结合的能力、抑制BCMA与其配体结合的能力、或者在本文所述的双特异性结合蛋白的情况下，具有抑制二者的能力。
如本文中使用的，术语“kon”(也称为“Kon”，“kon”)意指结合蛋白(例如，抗体)与抗原结合形成如本领域已知的结合复合物(例如，抗体/抗原复合物)的结合速率常数。“kon”也称为术语“缔合速率常数”或“ka”，如本文中可互换使用的。该值表示抗体与其靶抗原的结合速率或抗体与抗原之间的复合物形成速率，如下式所示：
抗体(“Ab”)+抗原(“Ag”)→Ab-Ag。
如本文所用，术语“koff”(也称为“Koff”，“koff”)意指，如本领域已知的，结合蛋白(例如，抗体)从结合复合物(例如，抗体/抗原复合物)解离的速率常数、或“解离速率常数”。该值表示抗体从其靶抗原的解离速率、或Ab-Ag复合物随时间分离成游离抗体和抗原的速率，如下式所示：
Ab+Ag←Ab-Ag。
如本文中使用的，术语“KD”(也为“Kd”)旨在表示“平衡解离常数”，并且是指在平衡时滴定测量中获得的值，或者通过解离速率常数(koff)除以结合速率常数(kon)而获得的值。结合速率常数(kon)、解离速率常数(koff)和平衡解离常数(KD)用于表示抗体与抗原的结合亲和力。确定结合和解离速率常数的方法是本领域公知的。可以使用基于荧光的技术，提供高灵敏度以及在平衡状态下生理缓冲液中检查样品的能力。可以使用其他实验方法和仪器，例如BIAcore
Figure BDA0003661442660000171
(生物分子相互作用分析)测定法(例如，可从BIAcore InternationalAB，GEHealthcare公司，Uppsala，Sweden获得的仪器)。使用例如Octet
Figure BDA0003661442660000172
RED96系统(PallFortéBioLLC)的生物膜干涉(BLI)是另一种亲和力测定技术。另外，还可以使用获自SapidyneInstruments(Boise，Idaho)的KinExA
Figure BDA0003661442660000173
(动力学排除测定)试验。
术语“分离的核酸”应指，这样的(例如，基因组的、cDNA或合成来源的，或其某些组合)多核苷酸，其中所述多核苷酸通过人为干预而与在自然界与其相关的全部或部分多核苷酸分开；可操作地连接天然与其不相连的多核苷酸；或是以在自然界中不存在的更大序列的一部分出现。
如本文中使用的，术语“载体”意指能够转运与其连接的另一核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，其是指环状双链DNA环，其中可以连接另外的DNA区段。另一种类型的载体是病毒载体，其中另外的DNA区段可以连接到病毒基因组中。某些载体能够在引入它们的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其他载体(例如，非附加型哺乳动物载体)可以在引入宿主细胞时整合至宿主细胞的基因组中，并且由此与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导与它们可操作连接的基因的表达。此类载体在本文中称为“重组表达载体”(或简称为“表达载体”)。通常，在重组DNA技术中有用的表达载体常常是质粒的形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。然而，本发明旨在包括其他形式的表达载体，如病毒载体(例如，复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)，它们起到等效的作用。
术语“可操作地连接”是指并置，其中所述组分处于允许它们以其预期方式起作用的关系中。与编码序列“可操作地连接”的控制序列以这样的方式连接，即所述方式将使得在与控制序列相容的条件下实现编码序列的表达。“可操作地连接的”序列包括与目的基因邻接的表达控制序列、以及以反式或远距离起作用的方式控制目的基因的表达控制序列。如本文所用的术语“表达控制序列”是指实现与它们连接的编码序列的表达和加工所必需的多核苷酸序列。表达控制序列包括合适的转录起始序列、终止序列、启动子和增强子序列；有效的RNA加工信号，如剪接和多腺苷酸化信号；稳定胞质mRNA的序列；提高翻译效率的序列(即Kozak共有序列)；增强蛋白质稳定性的序列；以及当需要时，增强蛋白质分泌的序列。这些控制序列的性质根据宿主生物而不同；在原核生物中，这种控制序列通常包括启动子、核糖体结合位点和转录终止序列；在真核生物中，通常，这种控制序列包括启动子和转录终止序列。术语“控制序列”旨在包括其存在对于表达和加工而言是必不可少的组分，并且还可以包括其存在是有利的其他组分，例如前导或信号序列和融合伴侣序列。
如本文所定义的“转化”是指外源DNA进入宿主细胞的任何过程。可以使用本领域公知的各种方法在天然或人工条件下进行转化。转化可依赖于任何已知的方法将外源核酸序列插入原核或真核宿主细胞中。基于待转化的宿主细胞选择该方法，并且可以包括，但不限于，转染、病毒感染、电穿孔、脂质转染和粒子轰击。这种“转化的”细胞包括稳定转化的细胞，其中插入的DNA能够作为自主复制质粒或作为宿主染色体的一部分复制。也包括在有限时间内瞬时表达插入的DNA或RNA的细胞。
术语“重组宿主细胞”(或简称“宿主细胞”)意指其中已引入外源DNA的细胞。在一个实施方案中，宿主细胞包含编码抗体的两个或更多个(例如，多个)核酸，例如，如美国专利号7,262,028中描述的宿主细胞。这些术语不仅旨在指特定的主题细胞，还指这种细胞的后代。因为某些修饰可能由于突变或环境影响而在后代中发生，所以这些后代实际上可能与亲本细胞不同，但仍包括在本文所用的术语“宿主细胞”的范围内。在一个实施方案中，宿主细胞包括选自任何生命界的原核和真核细胞。在另一个实施方案中，真核细胞包括原生生物、真菌、植物和动物细胞。在另一个实施方案中，宿主细胞包括但不限于原核细胞系大肠杆菌(Escherichia coli)；哺乳动物细胞系CHO、HEK 293、COS、NS0、SP2和PER.C6；昆虫细胞系Sf9；和真菌细胞酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
标准技术可用于重组DNA、寡核苷酸合成以及组织培养和转化(例如，电穿孔、脂转染)。酶促反应和纯化技术可以根据制造商的说明书、或者按照本领域通常实施的方式或如本文所述的方式进行。前述技术和程序通常可以根据本领域公知的常规方法进行，这些方法也描述在本说明书通篇引用和讨论的各种一般性和更具体的参考文献中。参见，例如，Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版。(Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989)。
如本文中使用的，术语“激动剂”是指这样的调节剂：与不存在激动剂时观察到的活性或功能的规模相比，该调节剂与感兴趣的分子接触后导致分子的某种活性或功能的规模增加。如本文中使用的，术语“拮抗剂”和“抑制剂”是指这样的调节剂：与不存在拮抗剂时观察到的活性或功能的规模相比，所述调节剂在与感兴趣的分子接触后导致分子的某种活性或功能的规模降低。特别感兴趣的拮抗剂包括阻断或降低人CD3和人BCMA的生物学或免疫学活性的那些拮抗剂。
如本文中使用的，术语“有效量”是指治疗量，所述量足以降低或改善病症的严重性和/或持续时间或其一种或多种症状；防止疾病的进展；导致疾病消退；预防与疾病相关的一种或多种症状的复发、发展或进展；检测疾病；或增强或改善另一种疗法(例如预防剂或治疗剂)的预防或治疗效果。
抗CD3和抗BCMA抗体的产生
本发明的抗CD3和抗BCMA抗体可通过本领域已知的许多技术中的任何一种产生。例如，从宿主细胞表达，其中将编码重链和轻链的表达载体通过标准技术转染至宿主细胞中。术语“转染”的各种形式旨在涵盖通常用于将外源DNA引入原核或真核宿主细胞的多种技术，例如电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖转染等。尽管可以在原核或真核宿主细胞中表达本发明的抗体，但优选在真核细胞中表达抗体，并且例如在哺乳动物宿主细胞中，因为这样的真核细胞(并且特别是哺乳动物细胞)更可能比原核细胞组装和分泌正确折叠和免疫活性的抗体。
用于表达本发明重组抗体的示例性哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO细胞)(包括dhfr-CHO细胞，描述于Urlaub和Chasin，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77：4216-4220(1980)，与DHFR选择标记一起使用，例如，如Kaufman和Sharp，J.Mol.Biol.，159：601-621(1982)中所述)、NS0骨髓瘤细胞、COS细胞、和SP2细胞。将编码抗体基因的重组表达载体引入哺乳动物宿主细胞后，通过将宿主细胞培养足以允许抗体在宿主细胞中表达的一段时间来产生抗体，或者，抗体分泌到用于培养宿主细胞的培养基中。可以使用标准蛋白质纯化方法从培养基中收集抗体。
宿主细胞也可用于产生功能性抗体片段，例如Fab片段或scFv分子。应该理解，上述程序的变化都在本发明的范围内。例如，可能期望用编码本发明抗体的轻链和/或重链的功能片段的DNA转染宿主细胞。重组DNA技术也可用于除去编码轻链和重链之一或两者的DNA中的一些或全部，这些DNA对于结合目标抗原不是必需的。由这种截短的DNA分子表达的分子也包括在本发明的抗体中。此外，可以产生双功能抗体，其中一条重链和一条轻链是本发明的抗体，而另一重链和轻链对目标抗原之外的抗原具有特异性，可以通过标准化学交联方法将本发明的抗体与第二抗体交联。
在用于重组表达本发明的抗体或其抗原结合部分的一个示例性系统中，通过磷酸钙介导的转染，将编码抗体重链和抗体轻链的重组表达载体引入dhfr-CHO细胞中。在重组表达载体内，抗体重链和轻链基因各自与CMV增强子/AdMLP启动子调节元件可操作地连接，以驱动基因的高水平转录。重组表达载体还携带DHFR基因，其允许使用甲氨蝶呤选择/扩增来选择已经转染了载体的CHO细胞。培养选择的转染宿主细胞以允许抗体重链和轻链的表达，并从培养基中收集完整的抗体。可以将标准分子生物学技术用于制备重组表达载体、转染宿主细胞、选择转染体、培养宿主细胞以及从培养基中回收抗体。本发明还提供了通过在合适的培养基中培养本发明的转染的宿主细胞直至产生本发明的重组抗体来制备本发明的重组抗CD3或抗BCMA抗体的方法。该方法可以进一步包括从培养基中分离重组抗体。
结合CD3和BCMA的双特异性FIT-Ig的产生
本发明提供了与CD3和BCMA二者结合的Fabs-in-Tandem免疫球蛋白结合蛋白(FIT-Ig)。此类FIT-Ig分子的示例性实施例包括(1)重多肽链，其包含结构式(i)VLA-CL-VHB-CH1-Fc，其中CL直接融合至VHB，或包含结构式(ii)VHB-CH1-VLA-CL-Fc，其中CH1直接融合至VLA；(2)式VHA-CH1的轻多肽链；和(3)式VLB-CL的另一条轻多肽链，
其中VL是轻链可变结构域，CL是轻链恒定结构域，VH是重链可变结构域，CH1是重链恒定结构域，Fc是免疫球蛋白Fc区，A是CD3或BCMA的表位，B是CD3或BCMA的表位，前提是A和B不同。根据本发明，此类FIT-Ig结合蛋白与CD3和BCMA两者结合。
当在合适的宿主细胞中重组表达时，FIT-Ig的三条链通常以与天然免疫球蛋白相同的方式缔合成六条链、多价、单体蛋白，其中两条此类重链(1)、两条此类轻链(2)和两条此类轻链(3)缔合以形成呈现四功能性Fab抗原结合位点的六链结合蛋白单体。此类FIT-Ig结合蛋白包含两个相同的亚基，其中每个亚基包含一条重链(1)、一条轻链(2)和一条轻链(3)，它们一起形成一对串联排列的Fab结合位点。两个此类重链亚基的Fc区的配对产生了本发明的六链双特异性FIT-Ig结合蛋白，其具有总共四个功能性Fab结合单元。
可以在重链上使用肽接头以分隔串联连接的Fab部分，但是对于根据本发明的双特异性FIT-Ig，优选省略此类接头序列。在具有串联结合位点的多价工程化的免疫球蛋白形式中，在本领域中通常理解相邻的结合位点将相互干扰，除非使用柔性接头在空间上分隔结合位点。然而，已经发现，对于本发明的BCMA/CD3 FIT-Ig，根据以上给出的链式排列免疫球蛋白结构域，使得多肽链在转染的哺乳动物细胞中良好表达、适当组装、并作为结合靶抗原CD3和BCMA的双特异性、多价免疫球蛋白样结合蛋白被分泌。尽管在Fab结合位点之间不存在任何接头序列，但是本发明的BCMA/CD3 FIT-Ig保留了对靶抗原的结合亲和力，呈现与亲本mAb可比的结合亲和力。此外，从结合蛋白中省略合成的接头序列可避免产生哺乳动物免疫系统可识别的抗原性位点，这样，消除接头会降低FIT-Ig可能的免疫原性，并使循环中的半衰期类似天然抗体，也就是说，FIT-Ig不会通过免疫调理作用以及肝脏中的捕获而迅速清除。
FIT-Ig中的每个可变结构域(VH或VL)可从一种或多种结合靶抗原之一(即CD3或BCMA)的“亲本”单克隆抗体获得。有利地，使用本文公开的抗CD3和抗BCMA单克隆抗体的可变结构域序列产生FIT-Ig结合蛋白。例如，亲本抗体是人源化抗体。还可以制备可变结构域或使用亲和力成熟技术改善可变结构域。
本发明的一个方面涉及选择亲本抗体，所述亲本抗体具有至少一种或多种FIT-Ig分子中期望的性质。在一个实施方案中，抗体性质选自抗原特异性、对抗原的亲和力、效力、生物功能、表位识别、稳定性、溶解性、生产效率、缺乏免疫原性、药代动力学、生物利用度、组织交叉反应性、和直系同源抗原的结合。CD3和BCMA都是细胞表面蛋白，并且与它们各自的配体相互作用触发细胞内信号传导通路；因此，本发明的最佳的双特异性BCMA/CD3FIT-Ig和FIT-Fab将能够抑制或阻断CD3-介导的和/或BCMA介导的信号传导。
可以通过使用本领域可用于纯化抗体和结合蛋白的多种方法和材料中的一种或多种来纯化根据本发明的抗体、其功能片段和结合蛋白(用于预期用途)。此类方法和材料包括但不限于亲和色谱法(例如，使用与蛋白A、蛋白G、蛋白L或抗体的特定配体、其功能片段或结合蛋白缀合的树脂、颗粒或膜)、离子交换色谱法(例如，使用离子交换颗粒或膜)、疏水相互作用色谱法(“HIC”；例如，使用疏水性颗粒或膜)、超滤、纳米过滤、渗滤、尺寸排阻色谱法(“SEC”)、低pH处理(以灭活污染的病毒)及其组合，以获得预期用途可接受的纯度。用于灭活污染的病毒的低pH值处理的非限制性实例包括在18℃-25℃下，用0.5M磷酸将包含本发明的抗体、其功能片段或结合蛋白的溶液或悬浮液的pH值降低至pH3.5，持续60至70分钟。
本发明的抗体和结合蛋白的用途
鉴于它们结合人CD3和/或BCMA的能力，本文所述的抗体，其功能性片段和本文所述的双特异性多价结合蛋白可用于检测CD3或BCMA，或二者，例如在含有表达那些靶抗原的一者或二者的细胞的生物样品中。本发明的抗体、功能性片段和结合蛋白可用于常规免疫测定，例如酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)或组织免疫组织化学。本发明提供了一种检测生物样品中CD3或BCMA的方法，包括使生物样品与本发明的抗体，其抗原结合部分或结合蛋白接触，并检测是否发生与靶抗原的结合，从而检测生物样本中是否存在靶标。可以用可检测物质直接或间接标记抗体，功能性片段，或结合蛋白以便于检测结合或未结合的抗体/片段/结合蛋白。合适的可检测物质包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料和放射性材料。合适的酶的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶。合适的辅基复合物的实例包括链霉亲和素/生物素和亲和素/生物素；合适的荧光材料的实例包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材料的实例包括鲁米诺；合适的放射性物质的实例包括3H、14C、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I、177Lu、166Ho或153Sm。
本发明的抗体、其功能片段和结合蛋白优选地能够在体外和体内中和人CD3和/或人BCMA活性。因此，本发明的抗体、其功能片段和结合蛋白可用于抑制人CD3和/或人BCMA活性，例如，在包含CD3表达和/或BCMA表达细胞的细胞培养物中、在人受试者中、或在具有与本发明的抗体、其功能片段或结合蛋白交叉反应的CD3或BCMA的其他哺乳动物受试者中，抑制由CD3/T细胞相互作用和/或BCMA/B细胞相互作用介导的细胞信号传导。
在另一个实施方案中，本发明提供了用于治疗患有其中CD3和/或BCMA活性是有害的疾病或病症的受试者的方法，该方法包括向受试者施用有效量的本发明的抗体或结合蛋白，使得降低由受试者中的CD3结合和/或BCMA结合介导的活性。
如本文所用，术语“其中CD3和/或BCMA活性是有害的疾病”旨在包括这样的疾病和其他病症，其中在患有病症的受试者中CD3与CD3配体的相互作用或BCMA与BCMA配体的相互作用，是该病症病理生理学的原因或是导致该病症恶化的因素。因此，其中CD3和/或BCMA活性是有害的病症是预期抑制CD3和/或BCMA活性以减轻病症的症状和/或进展的病症。
在另一个实施方案中，本发明提供了用于在有此需要的受试者中治疗自身免疫疾病或癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用本文所述的能够结合CD3、BCMA或CD3和BCMA二者的抗体、其功能片段或结合蛋白，其中自身免疫疾病或癌症是对免疫疗法有反应的疾病。在另一个实施方案中，本发明的方法用于治疗与免疫疗法无关的自身免疫疾病或癌症。在另一个实施方案中，本发明的方法用于治疗难治性癌症或复发性恶性肿瘤。在另一个实施方案中，本发明的CD3或BCMA抗体、其功能片段或BCMA/CD3双特异性结合蛋白用于抑制肿瘤细胞生长或存活的方法中。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种治疗受试者中的癌症的方法，该方法包括以下步骤：向所述受试者施用本文所述的针对CD3或BCMA的抗体、其功能片段或本文所述的BCMA/CD3双特异性结合蛋白，例如Fabs-in-tandem免疫球蛋白(FIT-Ig)结合蛋白，或MAT-Fab结合蛋白，其中所述癌症选自：黑色素瘤(例如，转移性恶性黑色素瘤)、肾癌(例如透明细胞癌)、前列腺癌(例如激素难治性前列腺腺癌)、胰腺腺癌、乳腺癌、结肠癌、肺癌(例如非小细胞肺癌)、食道癌、头颈部鳞状细胞癌、肝癌、卵巢癌、宫颈癌、甲状腺癌、成胶质细胞瘤、胶质瘤、白血病、淋巴瘤、原发性骨癌(例如骨肉瘤、尤因肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤和软骨肉瘤)、转移性癌以及其他肿瘤性恶性肿瘤。
本发明还提供了包含本发明的抗体或其抗原结合部分或双特异性多价结合蛋白(即主要活性成分)或本发明的双特异性单价结合蛋白和药物学上可接受载体的药物组合物。包含本发明的蛋白的药物组合物用于，但不限于，诊断、检测或监测病症，治疗、控制或改善病症或其一种或多种症状，和/或研究。在一个具体实施方案中，组合物包含一种或多种本发明的抗体或结合蛋白。在另一个实施方案中，药物组合物包含一种或多种本发明的抗体或结合蛋白和除本发明抗体或结合蛋白之外的一种或多种用于治疗其中CD3和/或BCMA活性是有害的病症的预防或治疗剂。在一个实施方案中，预防剂或治疗剂已知可用于或已经或正在用于预防、治疗、控制或改善病症或其一种或多种症状。根据这些实施方案，组合物可进一步包含载体、稀释剂或赋形剂。赋形剂通常是任何化合物或化合物的组合，其为组合物提供除主要活性成分之外(即，除本发明的抗体、其功能部分或结合蛋白之外)的期望的特征。
本发明的抗体(包括其功能性片段)和/结合蛋白可以掺入适于施用于受试者的药物组合物中。通常，药物组合物包含本发明的抗体或结合蛋白和药物学上可接受的载体。如本文中使用的，“药物学上可接受的载体”包括生理上相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。药物学上可接受的载体的实例包括水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、右旋糖、甘油、乙醇等中的一种或多种，及其组合。在许多情况下，优选在组合物中包含等渗剂，例如糖、多元醇(如甘露醇或山梨糖醇)或氯化钠。药物学上可接受的载体可以进一步包含少量辅助物质，如润湿剂或乳化剂、防腐剂或缓冲剂，其可以增强组合物中存在的抗体或结合蛋白的保质期或有效性。
配制本发明的药物组合物以与其预期的给药途径相容。给药途径的实例包括，但不限于，肠胃外给药，(例如静脉内、皮内、皮下、肌内)、口服、鼻内(例如，吸入)、透皮(例如，局部)、肿瘤内、经粘膜和直肠给药。在一个具体实施方案中，该组合物按照常规方法配制成适合于对人类进行静脉内、皮下、肌内、口服、鼻内或局部给药的药物组合物。通常，用于静脉内施用的组合物是无菌等渗水性缓冲液中的溶液。必要时，该组合物还可包括增溶剂和局部麻醉剂，如利多卡因(塞罗卡因、lignocaine)，以缓解注射部位的疼痛。
本发明的方法可包括施用配制用于通过注射(例如，通过推注或连续输注)肠胃外给药的组合物。用于注射的制剂可以以单位剂型(例如，在安瓿或多剂量容器中)与添加的防腐剂一起提供。组合物可以采取如油性或水性载体中的悬浮液、溶液或乳液的形式，并且可以含有配制剂，如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。或者，主要活性成分可以是粉末形式，用于在使用前用合适的载体(例如无菌无热原水)构建。
本发明的方法可另外包括施用配制成储库型制剂(depot preparation)的组合物。这种长效制剂可以通过植入(例如，皮下或肌肉内)或通过肌内注射给药。因此，例如，组合物可以用合适的聚合或疏水材料(例如，作为可接受油中的乳液)或离子交换树脂配制，或配制成微溶衍生物(例如，作为微溶盐)。
本发明的抗体、其功能性片段或结合蛋白还可以与一种或多种用于治疗各种疾病的其他治疗剂一起施用。本文所述的抗体、其功能性片段和结合蛋白可单独使用或与另外的药剂(例如，治疗剂)组合使用，所述另外的药剂由技术人员基于其预期目的而选择。例如，另外的药剂可以是本领域公认为可用于治疗由本发明的抗体或结合蛋白治疗的疾病或病症的治疗剂。另外的药剂也可以是赋予治疗组合物有益属性的药剂，例如影响组合物粘度的药剂。
现在已经详细描述了本发明，通过参考以下实施例将更清楚地理解本发明，这些实施例仅出于举例说明的目的而包括在内，并不意图限制本发明。
实施例
实施例1：产生抗人CD3单克隆抗体
如下产生抗人CD3单克隆抗体：
实施例1.1：用人CD3抗原免疫接种
通过采用备选免疫接种策略免疫接种含十只Balb/c和SJL/J小鼠(上海实验动物中心)的组，获得抗CD3抗体。使用四种不同的CD3免疫原，其包含2个肽(CD3ε片段：LSLKEFSELEQSGYYVC(SEQ ID NO:2)和QDGNEEMGGITQTPYK(SEQ ID NO:3)；重组huCD3εγ/Fc融合蛋白(融合蛋白异二聚体：第一链，
QDGNEEMGGITQTPYKVSISGTTVILTCPQYPGSEILWQHNDKNIGGDEDDKNIGSDEDHLSLKEFSELEQSGYYVCYPRGSKPEDANFYLYLRARVCENCMEMDGSSGSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:4)和第二链，
QSIKGNHLVKVYDYQEDGSVLLTCDAEAKNITWFKDGKMIGFLTEDKKKWNLGSNAKDPRGMYQCKGSQNKSKPLQVYYRMCQNCIELNAATISGSSGSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:5))，和用全长人CD3γ链、CD3ε链、CD3δ链、CD3δ链(δ-链)、TCRα链和TCRβ链转染以表达人T细胞受体复合体的CHO细胞系(CHOK1/CD3/TCR)。
实施例1.2：产生杂交瘤
将小鼠按2周间距用免疫原之一免疫接种(某些组以异于初始免疫中所用的免疫原强化)并且在第二次注射后一周一次监测血清滴度。在4至6次免疫接种后，收获脾细胞并且使其与小鼠骨髓瘤细胞融合以形成杂交瘤细胞系。随后对huCD3/Fc二聚体靶筛选杂交瘤细胞的上清液并用不相关蛋白质/Fc二聚体反选择，以鉴定产生CD3特异性小鼠抗体的细胞系。在针对Jurkat细胞和TCR复合体转染CHO细胞靶的细胞结合测定法中测试阳性杂交瘤，以确认抗体的细胞表面结合作用。最后，则用cynoCD3εγ/Fc融合蛋白作为靶，通过ELISA对确认的细胞结合物测试食蟹猴交叉反应性，并且Jurkat-NFAT-萤光素酶报道细胞系用来表征抗CD3激动活性。仅两个以这种方式测试的杂交瘤产生在全部测定法中均测试阳性的单克隆抗体。这些单克隆抗体命名为mAbCD3-001和mAbCD3-002。
实施例1.3：重链可变区序列和轻链可变区序列
为了扩增重链可变区和轻链可变区，用TRIzolTM RNA提取试剂(Invitrogen，目录号15596018)从多于5×106个细胞分离每种杂交瘤克隆的总RNA。遵循生产商的说明，使用InvitrogenTM SuperScriptTM III第一链合成SuperMix试剂盒(ThermoFisher Scientific目录号18080)合成cDNA，并且使用MilliporeSigmaTM NovagenTM小鼠Ig-引物集合(FisherScientific目录号698313)，扩增编码小鼠免疫球蛋白轻链和重链的可变区的cDNA。通过含SYBRTM SafeDNA凝胶染料(ThermoFisher目录号S33102)的1.2％琼脂糖凝胶上电泳，分析PCR产物。使用NucleoSpin
Figure BDA0003661442660000232
凝胶和PCR纯化试剂盒(Macherey-Nagel目录号740609)根据生产商的说明，纯化大小正确的DNA片段并将其逐一亚克隆入pMD18-T载体。从每个转化选择十五个集落并且通过DNA测序分析插入物片段的序列。如果至少8个集落片段匹配VH和VL的共有序列，则确认序列。通过序列同源性比对分析鼠单克隆抗体可变区的蛋白质序列并且列于表1中。基于Kabat编号，将互补决定区(CDR)加下划线。
表1. 2种鼠抗CD3抗体的可变区序列
Figure BDA0003661442660000231
实施例1.4：抗CD3抗体结合人和食蟹猴CD3二者
用ELISA如下测量分离的鼠抗CD3抗体的结合特性：将异二聚体CD3εγ/Fc融合蛋白按1μg/mL于4℃包被在96孔板上过夜。将平板用洗涤缓冲液(含有0.05％Tween 20的PBS)洗涤一次并且在室温用ELISA封闭缓冲液(含有0.05％Tween 20的PBS中的1％BSA)封闭2小时。随后添加抗CD3抗体并且在37℃孵育1小时。用洗涤缓冲液洗涤平板三次。添加HRP标记的抗小鼠IgG第二抗体(Sigma，目录号A0168)并且将平板在37℃孵育30分钟，随后在洗涤缓冲液中洗涤5次。向每个孔添加100μl四甲基联苯胺(TMB)生色液。在显色后，用1当量HCl终止反应并且在VarioskanTM LUX酶标仪(ThermoFisher Scientific)上测量450nm处的吸光度。结合信号用GraphPad Prism 5.0软件对抗体浓度作图并且因此计算EC50。如图1和图2中所示，mAbCD3-002显示最高结合活性，而mAbCD3-001具有与使用美国专利号8,236,308中报告的可变结构域序列所表达的参考抗CD3ε抗体相似的结合EC50。
实施例1.5：抗CD3抗体在体外活化人T细胞
通过使用LymphoprepTM单核细胞分离介质(STEMCELL Technologies，目录号07851)从健康供体获得外周血单核细胞(PBMCs)并且用CD3-阴性T细胞选择试剂盒(EasySepTMSTEMCELL Technologies，目录号17951)从PBMC分离T细胞。使用以下方案获得增殖(CTG)数据和细胞因子(IFN-γ)产生数据：将100μl供试抗体(mAbCD3-001、OKT3或阴性对照IgG)于4℃包被在高结合性96孔板(NuncTM，目录号3361)上过夜，随后进行DPBS洗涤。使用市售OKT3抗体作为阳性抗CD3对照并使用不相关小鼠IgG作为阴性对照。对于每个孔，在200μl培养基(RPMI1640+10％FBS+1％青霉素-链霉素溶液+1％GlutaMAXTM补充物)中接种1×105个T细胞并在37℃孵育96小时。通过使用ATP催化的定量试剂盒(CellTiter-GloTM，Promega)，测量增殖过程。通过LANCE
Figure BDA0003661442660000242
(Lanthanide Chelate Excite)TR-FRET测定试剂盒(PerkinElmer，目录号TRF1217M)测量IFN-γ。用GraphPad Prism 5.0软件分析数据。图3和图4中显示结果。细胞增殖数据和IFN-γ产生数据显示mAbCD3-001在体外活化人T细胞。
实施例2：抗CD3抗体的人源化
实施例2.1：mAbCD3-001的人源化
使用抗CD3 mAbCD3-001可变区基因产生人源化mAb。在这个过程的第一步骤，将mAbCD3-001的VH和VK的氨基酸序列(参见上文表1)针对可用的人Ig V-基因序列数据库比较，旨在找到总体最佳匹配的人种系Ig V-基因序列。另外，将VH或VL的构架4与J-区域数据库比较，以找到分别与鼠VH区和VL区具有最高同源性的人类构架。对于轻链，最接近的人V-基因匹配是B3基因(V-碱基数据库)，而对于重链，最接近的人匹配是VH1-2基因。随后设计人源化可变结构域序列，其中将mAbCD3-001轻链的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3移植到B3基因的构架序列上，JK4构架4序列在CDR-L3之后；并将mAbCD3-001 VH的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3移植到VH1-2的构架序列上，JH6构架4序列在CDR-H3之后。随后生成并分析mAbCD3-001的3D Fv模型以确定是否存在与CDR残基相距小于
Figure BDA0003661442660000243
并很可能对支撑环结构或VH/VL界面至关重要的任何构架残基。人源化序列中的这些残基应当回复突变成相同位置处的小鼠残基以保留亲和力/活性。总是纳入Q1E突变以酌情消除N末端焦谷氨酸形成。在重链的情况下，鉴定对Y27F、T28S、V37M、M48I、V67A、M69L和R71A(Kabat编号)的潜在突变。在轻链情况下，鉴定T5S和N22T为回复突变。通过每个回复突变的重要性层级，如依据其与CDR的相互作用决定，在人源化VH序列中按照优先顺序引入最重要的回复突变，随后在后续设计中引入其他回复突变。另外，VK CDR-L1序列具有作为潜在脱酰胺化位点的NS样式。为了消除这种天冬酰胺脱酰胺化倾向，在人源化κ链中使NS突变成QS、NT或NA。表2(下文)中显示人源化VH构建体和VL构建体。(回复突变的构架氨基酸残基以双下划线指示；来自原始亲本抗体的鼠CDR加下划线。)
表2：抗CD3抗体mAbCD3-001的人源化VH/VL设计
Figure BDA0003661442660000241
Figure BDA0003661442660000251
Figure BDA0003661442660000261
注：EM0006-01VH.1或EM0006-01VK.1意指无回复突变情况下移植CDR的VH/VL。
从头合成从相应氨基酸序列设计回译的人源化VH和VK基因并且随后将其克隆入含有人IgG1和人κ恒定域(分别是SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27)的载体。
表3：抗体人源化中所用的人恒定区序列
Figure BDA0003661442660000262
人VH和人VK的配对产生27种人源化抗体，命名为HuEM0006-01-1至HuEM0006-01-27(表3)。还产生具有亲本小鼠VH/VL序列和人恒定序列的嵌合抗体(HuEM0006-01c)并且用作人源化抗体评定的阳性对照。全部重组人源化mAb均在HEK293细胞中瞬时表达并通过蛋白A色谱纯化。
表4：衍生自mAbCD3-001的人源化抗CD3抗体的产生列表
Figure BDA0003661442660000263
Figure BDA0003661442660000271
*EM0006-01VH包含mAbCD3-001的鼠可变重链区域；EM0006-01VK包含mAbCD3-001的鼠可变轻链区域。
实施例2.2：人源化抗CD3抗体显示不同的CD3结合活性
不同的人源化VH和VK组合导致具有不同CD3结合亲和力的人源化抗CD3变体。采用表达人CD3的Jurkat T细胞系，通过流式细胞术测试mAbCD3-001人源化变体的结合活性。将FACS缓冲液中的5×105个Jurkat细胞接种于96孔板的每个孔中。将细胞以400g离心5分钟，并且弃去上清液。对于每个孔，随后添加100μl连续稀释的抗体并与细胞混合。在4℃孵育后40分钟，洗涤平板数次以移除过多的抗体。随后添加荧光物质缀合的第二抗体(AlexaFluor
Figure BDA0003661442660000281
647山羊抗人IgG1 H&L；Jackson ImmunoResearch，目录号109-606-170)并且在室温与细胞孵育20分钟。在另一轮离心和洗涤步骤后，将细胞重悬于FACS缓冲液中，以在CytoFLEX流式细胞仪(Beckman Coulter)上读数。将中位荧光强度(MFI)读数用GraphPad Prism5.0软件对抗体浓度作图并分析。
如图5A-图5H中所示，人源化抗CD3抗体对Jurkat细胞上的细胞表面CD3靶显示广泛类型的亲和力。VH变体明显是这种CD3结合调节作用的关键要素，因为不同的κ链(即，在EM0006-01VK.1和EM0006-01VK.1A之间)似乎对结合作用没有显著影响。一些人源化抗体，特别是具有VH变体EM006-01VH.1H的HuEM0006-01-08和HuEM0006-01-17(参见表4和SEQ IDNO:18)，甚至显示比具有亲本小鼠VH区EM0006-01VH的嵌合对照抗体HuEM0006-01c(参见表4)高得多CD3结合作用。
实施例3：产生抗BCMA单克隆抗体
通过用重组BCMA胞外结构域/Fc二聚体免疫接种Balb/c或SJL小鼠获得抗BCMA抗体，所述二聚体通过与以下人Fc区融合的人BCMA(ECD)的同型二聚化形成：MLQMAGQCSQNEYFDSLLHACIPCQLRCSSNTPPLTCQRYCNASVTNSVKGTNAIEGRMDPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:28)。将小鼠按2周间距免疫接种并且在第二次注射后一周一次监测血清滴度。
实施例3.1：产生杂交瘤
在4至6次免疫接种后，收获脾细胞并且使其与小鼠骨髓瘤细胞融合以形成杂交瘤细胞系。将融合产物以密度1×105个脾细胞/孔铺种在96孔板中含有次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸苷(HAT)的选择培养基内。七至十天融合后，观察到肉眼可见的杂交瘤集落。随后筛选并选择杂交瘤细胞，以鉴定产生BCMA特异性小鼠抗体的细胞系。选择五种抗BCMA抗体并测序。
实施例3.2：重链可变区序列和轻链可变区序列
为了扩增重链可变区和轻链可变区，用TRIzolTM RNA提取试剂(Invitrogen，目录号15596018)从多于5×106个细胞分离每种杂交瘤克隆的总RNA。遵循生产商的说明，使用InvitrogenTM SuperScriptTM III第一链合成SuperMix试剂盒(ThermoFisher Scientific目录号18080)合成cDNA，并且使用MilliporeSigmaTM NovagenTM小鼠Ig-引物集合(FisherScientific目录号698313)，扩增编码小鼠免疫球蛋白轻链和重链的可变区的cDNA。通过含SYBRTM SafeDNA凝胶染料(ThermoFisher目录号S33102)的1.2％琼脂糖凝胶上电泳，分析PCR产物。使用NucleoSpin
Figure BDA0003661442660000282
凝胶和PCR纯化试剂盒(Macherey-Nagel目录号740609)根据生产商的说明，纯化大小正确的DNA片段并将其逐一亚克隆入pMD18-T载体。从每个转化选择十五个集落并且通过DNA测序分析插入物片段的序列。如果至少8个集落片段匹配VH和VL的共有序列，则确认序列。通过序列同源性比对，分析鼠mAb可变区的蛋白质序列。
实施例3.3：依据表面等离子体共振(SPR)的抗BCMA抗体结合动力学
在25℃，使用Biacore T200仪(GE Healthcare)，使用标准程序，通过表面等离子体共振测定抗BCMA抗体的结合亲和力和动力学常数。简而言之，将山羊抗小鼠IgG Fc抗体遍及生物传感器芯片直接固定化并且将抗体样品以5μl/min的流量注射在反应基质上方。将小鼠抗BCMA IgG供试抗体注射在固定化的表面上方并由固定化的抗Fc抗体捕获。随后将人和食蟹猴BCMA(ECD)/Fc靶多肽注射在捕获的小鼠抗BCMA IgG表面上方。以30μl/min的连续流速分别测定缔合速率常数和解离速率常数kon(M-1s-1)和koff(s-1)。通过在靶BCMA(ECD)多肽的五个不同浓度产生动力学结合量值，导出速率常数。随后使用式KD＝koff/kon从动力学速率常数计算抗体和相关靶蛋白之间反应的平衡解离常数KD(M)。通过使用Biacore分析软件，处理并针对1:1结合模型拟合数据，测定动力学常数。表7中显示结果。
表7：抗BCMA单克隆抗体的亲和力量值
Figure BDA0003661442660000291
N/A ＝未检出可度量的结合信号
TAb1是参考抗BCMA抗体，其是来自国际公开号WO 2012/163805的克隆CA8TAb2是参考抗BCMA抗体，其是来自国际公开号WO 2014/122143的克隆83A10
进一步开发并分析对人和食蟹猴BCMA靶均显示高亲和力的两种抗BCMA抗体。下表8中阐述这些选择的抗BCMA单克隆mAbBCMA-002和mAbBCMA-003的可变结构域序列。基于Kabat编号，将互补决定区(CDR)加下划线。
表8：抗BCMA抗体的可变区序列
Figure BDA0003661442660000301
实施例3.4：抗BCMA抗体显示不同的BCMA阻断活性
通过使用Phospho-NFκB(Ser536)细胞测定试剂盒(Cisbio；目录号64NFBPEG)，评估单克隆抗BMCA抗体阻断人骨髓瘤细胞系NCI-H929中BCMA配体BAFF刺激的NFκB磷酸化的能力。使NCI-H929人骨髓瘤细胞在测定培养基(RPMI1640，0.1％BSA)中于37℃饥饿过夜。将细胞洗涤、重悬并按2×105个细胞/孔接种于384孔微量平板(PerkinElmer，目录号6008280)中。随后将抗体加入各孔并且在37℃与细胞孵育约10分钟。使用抗BAFF抗体(R&DSystems，目录号BAF124)作为阳性对照，并使用不相关抗RAC1单克隆抗体作为阴性对照。测试参考抗BCMA抗体TAb1和TAb2(分别是来自国际公开号WO 2012/163805的克隆CA8和来自国际公开号WO 2014/122143的克隆83A10)用于比较。
随后将重组BAFF以5μg/ml的浓度添加至每个孔并且孵育30分钟。将细胞通过添加试剂盒裂解缓冲液来裂解并在室温振摇下孵育至少30分钟。随后将细胞裂解物转移至384孔小体积微量平板(PerkinElmer，目录号6008280)。遵循生产商的说明，配制测定试剂盒试剂并加入各孔。在室温最终孵育4小时后，读取平板在665nm和620nm波长的荧光发射。用GraphPadPrism 5.0软件计算抑制百分数并且对抗体浓度作图。如图6中所示，相比阴性对照(抗RAC)，如上文所述分离的所选抗BCMA抗体mAbBCMA-002和mAbBCMA-003显示对BAFF诱导的NF-κB磷酸化的优越抑制活性。
另一个基于报道基因的发光测定体系也用来表征针对BCMA的配体结合活性的抗体阻断作用。自行建立经转染表达BCMA并在诱导NF-κB磷酸化时发射萤光素酶信号的稳定HEK293F细胞系(HEK293F-BCMA-NF-kB-luc克隆1H2)并且用于这种发光测定法。将细胞收获、洗涤并重悬于测定培养基(含10％FBS的RPMI1640)中。随后将细胞按5×104个细胞/孔接种在96孔微量平板(Costar，目录号3903)中并且与供试抗体：mAbBCMA-002、mAbBCMA-003、TAb1(抗BCMA)、TAb2(抗BCMA)或不相关鼠IgG孵育。添加BCMA配体即BAFF或APRIL(TNFSF13，CD286)并且与抗体溶液共孵育10分钟。遵循生产商的说明，配制One-GloTM萤光素酶测定体系(Promega，目录号E6130)试剂并添加至各孔。用VarioskanTMLUX酶标仪(ThermoScientific)读取平板的发光信号。用GraphPad Prism 5.0软件计算抑制百分数并且对抗体浓度作图。如图7(BAFF阻断)和图8(APRIL阻断)中所示，mAbBCMA-002未显示活性或显示微弱阻断活性，而mAbBCMA-003显示类似于阳性参考抗体TAb1和TAb2的强力NF-κB信号途径阻断活性。
mAbBCMA-002和mAbBCMA-003的结合结构域接下来用于产生双特异性BCMA/CD3FIT-Ig结合蛋白。
实施例4：产生BCMA/CD3 Fab串联免疫球蛋白(FIT-Igs)
实施例4.1：产生BCMA/CD3 FIT-Ig结合蛋白(FIT-Igs)
构建识别人CD3和人BCMA二者的双特异性Fabs串联免疫球蛋白(FIT-Ig)结合蛋白。遵循国际公开WO 2015/103072中描述的一般方法，将FIT-Ig构建体工程化以省略免疫球蛋白结构域之间合成性接头序列的使用。
用来产生能够结合CD3和BCMA的FIT-Ig抗体的DNA构建体编码亲本抗CD3单克隆抗体和抗BCMA单克隆抗体(mAbs)的可变结构域。每种FIT-Ig结合蛋白由具有以下结构的三条多肽链组成：
链1(长链)：VLCD3-CL-VHBCMA-CH1-铰链-CH2-CH3；
链2(第一短链)：VHCD3-CH1；
链3(第二短链)：VLBCMA-CL；
其中VLBCMA是识别BCMA的单克隆抗体的轻链可变结构域，VHCD3是识别CD3的单克隆抗体的重链可变结构域，VLCD3是识别CD3的单克隆抗体的轻链可变结构域，VHBCMA是识别BCMA的单克隆抗体的重链可变结构域，每个CL是轻链恒定结构域，每个CH1是第一重链恒定结构域，和铰链-CH2-CH3是抗体C末端Fc区。
为了构建长链载体，从头合成编码VLCD3-CL-VHBCMA区段的cDNA并且插入载体的多克隆位点(MCS)中，所述载体包含人CH1-铰链-CH2-CH3的编码性序列。在所得的载体中，同源重组期间消除MCS序列，以确保全部结构域片段均处于正确的可读框中。类似地，为了构建第一和第二短链，将VHCD3结构基因和VLBCMA结构基因从头合成并插入适宜载体的MCS中，所述载体分别包含人CH1结构域和CL结构域的编码区段。
将三种质粒按1:2:1.5比率混合，随后共转染入HEK293细胞中。在7天表达后，收集细胞培养上清液并用蛋白A色谱纯化。依据A280测量纯化的FIT-Ig蛋白的浓度，并且通过大小排阻色谱(SEC)分析均匀性。
为了检验双特异性FIT-Ig样式的新型鼠抗BCMA抗体mAbBCMA-002和mAbBCMA-003的结合特征，链1多肽和链3多肽(上文)中使用的VHBCMA结构域和VLBCMA结构域是表8中所述的VH结构域和VL结构域(即，对于VH，SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:31，和对于VL，SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:32)。对于链1和链2中的VHCD3和VLCD3结构域(上文)，亲本抗CD3抗体是以下三种选定人源化抗CD3抗体之一：HuEM0006-01-24抗体(VH＝SEQ ID NO:18；VL＝SEQ ID NO:25)、HuEM0006-01-25抗体(VH＝SEQ ID NO:15；VL＝SEQ ID NO:25)或HuEM0006-01-26抗体(VH＝SEQ ID NO:12；VL＝SEQ ID NO:25)。对于FIT-Ig结构中的恒定结构域CH1-铰链-CH2-CH3和CL，使用人序列，即，SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27。利用编码前述多肽结构域的cDNA，构建FIT-Ig表达载体并用来转染HEK293细胞。培育每种无接头的FIT-Ig构建体的培养物并且如上文所述纯化FIT-Igs。向六种FIT-Ig结合蛋白给予下表9中显示的命名：
表9：huCD3/嵌合BCMA FIT-Ig结合蛋白的产生列表
Figure BDA0003661442660000311
Figure BDA0003661442660000321
实施例4.2：产生BCMA/CD3 FIT-Ig Fab片段结合蛋白(FIT-Fabs)
消化全长FIT-Ig蛋白和用PierceTM Fab制备试剂盒(ThermoFisher Scientific，目录号44985)纯化。在这个过程中，使用琼脂糖珠上的固定化木瓜蛋白酶，通过酶促裂解，移除FIT-Ig蛋白的Fc结构域。随后从来自蛋白A色谱的流通纯化FIT-Ig Fab片段(FIT-Fab)。依据A280测量纯化的FIT-Fab蛋白的浓度，并且通过大小排阻色谱(SEC)分析均一性。
实施例4.3：FIT-Ig双特异性抗体显示与CD3靶和BCMA靶二者结合
采用人CD3/TCR复合体转染的CHO细胞系(CHOK1/CD3/TCR细胞)和表达BCMA的NCI-H929细胞，通过流式细胞术测试嵌合双特异性BCMA/CD3 FIT-Ig抗体的结合活性。简而言之，将FACS缓冲液中的5×105个细胞接种于96孔平板中。将细胞以400×g离心5分钟，并且弃去上清液。对于每个孔，随后添加100μl连续稀释的FIT-Ig抗体或FIT-Fab抗体并与细胞混合。在4℃孵育后40分钟，洗涤平板数次以移除过多的抗体。随后添加第二抗体(山羊抗huIgGκ链特异性)并且在室温与细胞孵育20分钟。在另一轮离心和洗涤后，将细胞用FACS缓冲液重悬，以在CytoFLEX流式细胞仪上读数。结果用GraphPad Prism 5.0软件分析并作图。图9和图10中显示结果。
如图9中所示，当双特异性嵌合BCMA/CD3 FIT-Fab抗体的Fab片段由相同的BCMA结合结构域组成时，这些片段对BCMA的结合活性的确显示相同的结合曲线。如图10中所示，嵌合BCMA/CD3 FIT-Ig结合蛋白维持与亲本单克隆人源化CD3抗体相似的结合活性曲线(参见图5B、图5C)。
实施例4.4：嵌合FIT-Fab和FIT-Ig显示重定向的CD3活化
为了测量借助BCMA/CD3双特异性FIT-Ig和FIT-Fab抗体重定向的CD3活化，使用共培养报道基因测定法。一旦细胞表面CD3活化，Jurkat-NFAT-luc细胞将触发下游萤光素酶信号。使用NCI-H929细胞作为表达BCMA的靶细胞，所述细胞可以在BCMA结合时，借助双特异性BCMA/CD3抗体交联T细胞上的CD3/TCR复合体。将Jurkat-NFAT-luc细胞和NCI-H929细胞洗涤并分别重悬于测定培养基(含10％FBS的RPMI1640)中。两个细胞类型以1×105个细胞/孔按1:1比率接种于96孔平板(Costar#3903)中。添加FIT-Ig抗体或FIT-Fab抗体，与细胞混合并且在37℃孵育4小时。在孵育结束时，根据生产商的说明，配制ONE-GloTM发光测定试剂盒(Promega，目录号E6130)试剂并加入各孔。用VarioskanTM LUX酶标仪(ThermoFisherScientific)读取平板的发光信号。图11和图12中显示结果。
参见图11，将引起T细胞活化的FIT-Ig浓度对利用两种最高亲和力抗BCMA抗体和抗CD3抗体，即，mAbBCMA-003和HuEM0006-01-24，如实施例4.1中所述制备的FIT-Ig结合蛋白作图。在该图中，FIT1006-4a是具有结合CD3的外部Fab结合位点和结合BCMA的内部Fab结合位点的FIT-Ig(上文；参见表9)；FIT1006-4b是使用相同氨基酸序列构建但结合结构域位置反向的FIT-Ig，即，具有结合BCMA的外部Fab结合位点和结合CD3的内部Fab结合位点的FIT-Ig；并且通过木瓜蛋白酶消化，从FIT1006-4a制成FIT1006-4a-Fab(参见实施例4.2)。针对以下两种阴性对照比较这些结合蛋白的性能：(i)具有与两种不相关抗原靶反应的结合位点的FIT-Ig(“FIT1002-5a”)，和(ii)与不相关抗原反应的人源化IgG单克隆抗体(“hIgG”)。同样，还测试了两种抗CD3结合蛋白，即，人源化抗CD3单克隆抗体(HuEM0006-01-24)和从其制得的Fab片段(HuEM0006-01-24-Fab)。可以见到，与无BCMA结合活性的单特异性抗CD3结合蛋白相比，在表达BCMA的靶细胞存在下，全部双特异性BCMA/CD3结合蛋白均导致T细胞活化增加。
参考图12，在表达BCMA的靶细胞存在下引起T细胞活化的多种双特异性BCMA/CD3FIT-Fab结合蛋白的浓度对从上表9所述FIT-Ig结合蛋白制备的FIT-Fab(命名为FIT1006-3a-Fab、FIT1006-4a-Fab、FIT1006-5a-Fab、FIT1006-6a-Fab、FIT1006-7a-Fab、FIT1006-8a-Fab)作图。将这些FIT-Fab的性能比照参考抗CD3 Fab和mAbBCMA-002(一种利用在WO 2016/020332中公开的抗CD3结合区和抗BCMA结合区的命名为FIT1006-1a-Fab的参考FIT-Fab抗体)的组合和使用针对两种不相关抗原靶的亲本抗体结合位点所制备的命名为FIT1002-5a-Fab的阴性对照FIT-Fab比较。
这些结果显示，与肿瘤细胞表面上的BCMA结合时，BCMA/CD3双特异性抗体可以通过交联作用活化CD3。在这个测定法中，FIT-Ig结合蛋白(图11)和FIT-Fab结合蛋白(图12)均显示重定向的活化。另外，FIT1006-4a-Fab在低浓度显示令人惊讶陡峻的活化曲线。
实施例4.5：嵌合BCMA/CD3 FIT-Fab显示重定向的T细胞细胞毒性
使用人骨髓瘤细胞系NCI-H929作为靶细胞并使用人T细胞作为效应细胞，在T细胞重定向细胞毒性测定法中测量BCMA/CD3双特异性结合蛋白的肿瘤细胞杀伤效价。简而言之，将细胞收获、洗涤并用测定培养基(含10％FBS的RPMI1640)重悬。将NCI-H929细胞以5×104个细胞/孔接种于平底96孔平板(Corning，目录号3599)中。用商业PBMC分离试剂盒(EasySepTM，Stemcell Technologies，目录号17951)从人PBMC纯化T细胞并且按2×105个细胞/孔添加至各孔。添加供试抗体并且在37℃与细胞混合物孵育48小时。用CytoTox 96
Figure BDA0003661442660000341
细胞毒性测定试剂盒(Promega，目录号G1780)测量乳酸脱氢酶(LDH)释放。遵循生产商的说明获得OD490读数。将靶细胞NCI-H929最大裂解(100％)-最小裂解(0％)作为归一化分母展示。将LDH释放百分数对双特异性抗体浓度作图。如图13中所示，具有抗BCMA和抗CD3特异性的双特异性FIT-Fabs对NCI-H929肿瘤细胞展示重定向的T细胞细胞毒性，而单特异性人源化抗CD3 Fab以及抗CD3 Fab(Fab片段HuEM0006-01-24)和抗BCMA mAb(TAB1)组合未显示细胞毒活性。
实施例4.5：嵌合FIT-Ig在体外显示有限的非靶重定向的CD3活化
使用基于Jurkat-NFAT-luc的报道基因测定法在靶细胞不存在的情况下测试非靶重定向的CD3活化。将Jurkat-NFAT-luc细胞收获、洗涤并重悬于测定培养基(含10％FBS的RPMI1640)中，并按1×105个细胞/孔接种于中96孔平板(Costar#3903)。添加供试抗体，与细胞混合并且在37℃孵育4小时。孵育后，遵循生产商的说明，配制ONE-GloTM发光测定试剂盒(Promega，目录号E6130)试剂并加入各孔。用VarioskanTM Lux平板读数仪读取平板的发光信号。图14中显示结果。
这种测定法类似于上文实施例4.4中实施的测试，例外是不存在表达双特异性结合蛋白的共靶(在这种情况下BCMA)的细胞。结果显示，双特异性BCMA/CD3 FIT-Ig抗体(FIT1006-4a和FIT1006-4b)和命名为FIT1006-4a-Fab的BCMA/CD3 FIT-Fab，其均具有与人源化抗CD3单克隆抗体HuEM0006-01-24相同的CD3结合结构域，在表达BCMA的靶细胞不存在的情况下显示比单独抗CD3抗体小得多的非靶重定向活化(参考图11)。
实施例5：产生人源化双特异性BCMA/CD3 FIT-Ig结合蛋白
以BCMA/CD3 FIT-Ig和FIT-Fab样式使用时，抗BCMA单克隆mAbBCMA-003显示更高的BCMA结合亲和力和更好的重定向细胞杀伤作用。因此，选定mAbBCMA-003供人源化和后续用于构建人源化双特异性结合蛋白。
实施例5.1：抗BCMA抗体mAbBCMA-003的人源化
使用mAbBCMA-003可变区基因产生人源化mAb。在这个过程的第一步骤，将mAbBCMA-003的VH和VK的氨基酸序列(参见上文表8)针对可用的人Ig V-基因序列数据库比较，旨在找到总体最佳匹配的人种系Ig V-基因序列。另外，将VH或VL的构架4与J-区域数据库比较，以找到分别与鼠VH区和VL区具有最高同源性的人类构架。对于轻链，最接近的人V-基因匹配是VK1-39(02)基因，而对于重链，最接近的人匹配是VH1-03基因。随后设计人源化可变结构域序列，其中将mAbBCMA-003轻链的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3移植到VK1-39(02)基因的构架序列上，JK2构架4序列在CDR-L3之后；并将mAbBCMA-003VH的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3移植到VH1-03基因的构架序列上，JH6构架4序列在CDR-H3之后。随后生成并分析mAbBCMA-003的3D Fv模型以确定是否存在与CDR残基相距小于
Figure BDA0003661442660000342
并很可能对支撑环结构或VH/VL界面至关重要的任何构架残基。人源化序列中的这些残基应当回复突变成相同位置处的小鼠残基以保留亲和力/活性。总是纳入Q1E突变以酌情消除N末端焦谷氨酸形成。在重链的情况下，鉴定对P30T、I48M、K66R、A67V、L69I和A71R(Kabat编号)的潜在突变为合乎需要的回复突变。在轻链情况下，鉴定V58I和R69T为合乎需要的回复突变。通过每个回复突变的重要性层级，如依据其与CDR的相互作用决定，在人源化VH序列中按照优先顺序引入最重要的回复突变，随后在后续设计中引入其他回复突变。此外，在CDR-L2的C末端出现的DG二肽呈现一个潜在的天冬氨酸异构化位点，并且在轻链变体中通过以下备选置换消除该位点：D56A、D56E、D56S、D56T或G57A。表10(下文)中显示人源化VH设计构建体和VL设计构建体。(回复突变的构架氨基酸残基以双下划线指示；来自原始亲本抗体的鼠CDR加下划线。)
表10：抗BCMA mAbBCMA-003的人源化VH/VL设计
Figure BDA0003661442660000351
Figure BDA0003661442660000361
合成地产生人源化抗BCMA VH基因和VL基因并且随后分别地克隆入如实施例4.1中所述的FIT-Ig载体，所述载体还含有源自抗CD3单克隆HuEM0006-01-24的VH基因和VL基因。人源化VH和人源化VL的配对产生下表11中所列的人源化BCMA/CD3 FIT-Ig结合蛋白。还产生具有mAbBCMA-003的亲本小鼠VH/VL和人恒定序列的嵌合抗体作为人源化结合蛋白评定的阳性对照。如实施例4.1中所述那样表达并且纯化全部重组FIT-Igs。
表11：人源化BCMA/CD3 FIT-Ig产生列表
Figure BDA0003661442660000362
Figure BDA0003661442660000371
使用编码上表11中所列人源化可变结构域和如表3中所示人恒定区序列的cDNA(SEQID NO:26和SEQ ID NO:27)，按照与上文实施例4.1和4.2相同的方式构建能够结合BCMA和CD3抗原二者的双特异性FIT-Ig和FIT-Fab结合蛋白。在免疫球蛋白结构域之间不使用接头，因此可以从表11和表3中的序列信息导出FIT-Ig结合蛋白的完整序列。例如，在下表12、表13和表14中对FIT-Igs FIT1006-29b(D-A)、FIT1006-31b(D-T)和FIT1006-35b(D-T)阐述表11中公开的三种示例性的FIT-Ig结合蛋白的三条多肽链的氨基酸序列。这些FIT-Igs在已组装链的N末端位置具有BCMA结合位点，并且CD3结合位点内在位于毗邻(N末端)于Fc区、但相对于BCMA结合位点为C末端的FIT-Ig结构中。换句话说，组件多肽链的结构域布局是：
链1(长链)：VLBCMA-CL-VHCD3-CH1-铰链-CH2-CH3；
链2(第一短链)：VHBCMA-CH1；
链3(第二短链)：VLCD3-CL；
其中VLBCMA是识别BCMA的人源化单克隆抗体的轻链可变结构域，VHCD3是识别CD3的人源化单克隆抗体的重链可变结构域，VLCD3是识别CD3的人源化单克隆抗体的轻链可变结构域，VHBCMA是识别BCMA的人源化单克隆抗体的重链可变结构域，每个CL是轻链恒定结构域(SEQ ID NO:27)，每个CH1是第一重链恒定结构域，并且CH1-铰链-CH2-CH3是从CH1至Fc区末端的C末端重链恒定区(参见SEQ ID NO:26)。
表12：FIT-Ig FIT1006-29b(D-A)组件链的氨基酸序列
Figure BDA0003661442660000372
Figure BDA0003661442660000381
表13：FIT-Ig FIT1006-31b(D-T)组件链的氨基酸序列
Figure BDA0003661442660000382
Figure BDA0003661442660000391
表14：FIT-Ig FIT1006-35b(D-T)组件链的氨基酸序列
Figure BDA0003661442660000392
Figure BDA0003661442660000401
实施例5.3：人源化BCMA/CD3 FIT-Igs的结合动力学
在25℃，使用BiacoreTM T200仪(GE Healthcare)，使用标准程序，通过表面等离子体共振(SPR)测量BCMA/CD3双特异性FIT-Ig抗体的结合亲和力和动力学常数。表15中显示结果。
简而言之，将异二聚体的CD3/Fc抗原或BCMA/Fc抗原遵循常见的胺偶联方法直接固定化穿过生物芯片，并且将供试抗体以5μl/分钟的流速注射在反应基质上方并且记录结合响应。以30μl/分钟的连续流速分别测定缔合速率常数和解离速率常数kon(M-1s-1)和koff(s-1)。通过在人CD3/Fc蛋白或人BCMA/Fc蛋白的五个不同浓度求得动力学结合量值，导出速率常数。随后使用式KD＝koff/kon从动力学速率常数计算抗体和相关靶蛋白之间反应的平衡解离常数KD(M)。测量人源化抗CD3/人源化抗BCMA FIT-Ig抗体的亲和力，如下表15中所述。
表15：人源化BCMA/CD3 FIT-Ig结合蛋白的结合亲和力
Figure BDA0003661442660000402
Figure BDA0003661442660000411
实施例5.4：人源化双特异性FIT-Ig显示重定向的CD3活化和细胞毒性
使用人骨髓瘤细胞系NCI-H929作为靶细胞并使用人T细胞作为效应细胞，在T细胞重定向细胞毒性测定法中测量BCMA/CD3人源化双特异性FIT-Ig抗体的肿瘤细胞杀伤效价。简而言之，将细胞收获、洗涤并用测定培养基(含10％FBS的RPMI1640)重悬。将NCI-H929细胞以5×104个细胞/孔接种于平底96孔平板(Corning，目录号3599)中。用商业试剂盒(Stemcell#17951)从人PBMC纯化T细胞并且按2×105个细胞/孔加入相同的平板。随后添加FIT-Ig结合蛋白并且与细胞混合物孵育。在37℃孵育48小时后，用测定试剂盒(Promega#G1780)测量LDH释放。遵循生产商的说明，获得OD490读数。将靶细胞NCI-H929最大裂解(100％)-最小裂解(0％)作为归一化分母展示。将LDH释放百分数对双特异性Abs浓度作图。在这个实例中，人源化FIT-Ig显示与亲本嵌合FIT-Ig相似的重定向的T细胞细胞毒性。图15中显示结果。结果显示，本发明的人源化BCMA/CD3 FIT-Ig能够使得针对共培养的NCI-H929肿瘤细胞的T细胞细胞毒性重定向。参考图16和图17，确认本发明的两种BCMA/CD3双特异性FIT-Ig结合蛋白与表达BCMA的靶细胞和表达CD3的靶细胞结合。
制备了具有备选性布局的两种示例性BCMA/CD3 FIT-Ig结合蛋白，其中外部结合位点是串联布置的Fab区的CD3 Fab结合位点并且内部结合位点是BCMA Fab结合位点，命名为FIT1006-31a(D-T)和FIT1006-35a(D-T)。这两种FIT-Ig的多肽链样式是：
链1(长链)：VLCD3-CL-VHBCMA-CH1-铰链-CH2-CH3；
链2(第一短链)：VHCD3-CH1；
链3(第二短链)：VLBCMA-CL；
下文给出FIT1006-31a(D-T)和FIT1006-35a(D-T)的多肽链的氨基酸序列：
表16：FIT-Ig FIT1006-31a(D-T)组件链的氨基酸序列
Figure BDA0003661442660000421
表17：FIT-Ig FIT1006-35a(D-T)组件链的氨基酸序列
Figure BDA0003661442660000422
Figure BDA0003661442660000431
两种备选构型的表达BCMA和表达CD3的靶细胞的结合活性分别示于图18和图19。比较每个靶的两种构型，位于Fc远端的相应结合结构域比位于Fc近端的相同结合结构域显示相对更高的结合活性，表明构型对结合活性的某些影响。尽管如此，结果证实两种构型对BCMA和CD3都具有所需的靶结合活性。
实施例6用BCMA x CD3 FIT-Ig处理降低了人PBMC移植的NPSG小鼠中NCI-H929肿瘤体积
在NPSG小鼠中评价抗肿瘤效力，NPSG小鼠是缺乏T细胞、B细胞和自然杀伤细胞的免疫缺陷品系。将NCI-H929细胞(5×106)皮下注射到右后背侧NPSG小鼠中。在同一天，小鼠接受单次静脉内剂量的5×106人PBMC。在第11天，基于肿瘤大小(70～140mm3)随机分配动物，并在同一天开始处理。通过卡尺测量监测肿瘤生长。研究在第25天终止，当肿瘤尺寸超过3000mm3时将小鼠安乐死。通过腹膜内(i.p.)注射，用6mg/kg FIT1006-31b(D-T)或FIT1006-35b(D-T)或载体每周一次处理小鼠3周(QW×3)。如图20所示，与载体组相比，FIT-Ig处理组小鼠显示显著的肿瘤生长抑制。尤其对于FIT1006-35b(D-T)处理组，肿瘤被完全根除。
实施例7.BCMA×CD3 FIT-Ig耗尽食蟹猴中的B细胞群并显示有限的细胞因子释放曲线
据报道，食蟹猴B细胞具有比人更高的BCMA表达(Seckinger,A.等人,(2017).TargetExpression,Generation,Preclinical Activity,and Pharmacokinetics of theBCMA-T Cell BispecificAntibody EM801 for Multiple Myeloma Treatment.CancerCell,31(3),396–410)。在食蟹猴中进行了预备非GLP毒理学和药理学研究，以评价BCMA×CD3 FIT-Ig耗尽这些动物中B细胞群体的能力。该研究有三组，每组由1只雄性和1只雌性猴组成，在这些组中具有相当的体重，组1接受载体，组2接受0.5mg/kg FIT1006-31b(D-T)的单次注射，组3接受0.5mg/kgFIT1006-35b(D-T)的单次注射，所有均在第1天通过静脉内注射给药。在给药前2天(第-1天，基线)，在给药后第1天的2、4、6和24小时，以及在第8和15天经由前肢和后肢皮下静脉内采集血样。通过FACS分析血液样品中的B和T细胞标记，并通过与第-1天的基线水平比较来确定每个群体的相对百分比变化，还使用商业细胞计数珠阵列(CBA)试剂盒分析血液样品中的细胞因子水平(INFγ、IL-2、IL-6和TNFα)。
图21表明从给药后第一点(给药后2小时)至最后时间点(第15天)施用BCMA×CD3FIT-Ig导致循环B细胞超过50％的耗竭。在第二和第三时间点(第1天的2小时和4小时)也观察到载体组中的瞬时B细胞耗尽，其可能与血液取样时间表有关。但是，载体组的B细胞群显示快速恢复，到给药后6小时达到稳定水平。
如图22所示，FIT-Ig处理组中的循环T细胞水平表现出瞬时丧失，其在第8天恢复到载体组的水平并维持直到实验结束。瞬时T细胞损失被认为是由于T细胞活化和治疗后的再分布。
本发明可以以其它特定形式实施，而不脱离上述本发明的基本特征。因此，前述实施方案应被认为是说明性的，而不是限制本文所述的本发明。本发明的范围由所附权利要求书指示。
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Claims (21)

1.一种抗CD-3抗体或其抗原结合部分，其包含选自如下CDR集合的下列六个CDR的组：CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3：
Figure FDA0003661442650000011
2.根据权利要求1的抗CD3抗体或其抗原结合部分，其包含VH和VL结构域，其具有选自以下VH/VL对的氨基酸序列：
Figure FDA0003661442650000012
Figure FDA0003661442650000021
3.包含根据权利要求1或2的至少一种抗-CD3抗体或其抗原结合片段和可药用的载体的药物组合物。
4.根据权利要求1或2的抗-CD3抗体或其抗原结合片段在制备药物中的用途，所述药物用于治疗疾病或病症，其中CD3介导的活性和/或BCMA介导的活性有害。
5.根据权利要求4的用途，其中所述疾病是癌症并且任选地选自：多发性骨髓瘤、黑素瘤(例如，转移性恶性黑素瘤)、肾癌(例如，透明细胞癌)、前列腺癌(例如，激素难治性前列腺腺癌)、胰腺腺癌、乳腺癌、结肠癌、肺癌(例如，非小细胞肺癌)，食道癌、头颈部鳞状细胞癌、肝癌、卵巢癌、子宫颈癌、甲状腺癌、成胶质细胞瘤、胶质瘤、白血病、淋巴瘤或原发性骨癌(例如，骨肉瘤、尤文氏肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤或软骨肉瘤)。
6.包含第一、第二和第三多肽链的结合蛋白或其FIT-Fab片段，其中
所述第一多肽链从氨基端至羧基端包含(i)VLA-CL-VHB-CH1-Fc，其中CL与VHB直接融合，或(ii)VHB-CH1-VLA-CL-Fc，其中CH1与VLA直接与融合；
所述第二多肽链从氨基端至羧基端包含VHA-CH1；并且
所述第三多肽链从氨基端至羧基端包含VLB-CL；
其中VL是轻链可变结构域，CL是轻链恒定结构域，VH是重链可变结构域，CH1是重链恒定结构域，Fc是免疫球蛋白Fc区域，A是CD3或BCMA的表位并且B是CD3或BCMA的表位，条件是A和B不同，所述结合蛋白能够与CD3和BCMA二者结合。
7.根据权利要求6所述的结合蛋白或FIT-Fab片段，其中VLA和VHA是来自与抗原靶CD3或BCMA之一结合的亲本抗体的可变结构域，并且VLB和VHB是来自与抗原靶CD3或BCMA中另一者结合的不同亲本抗体的可变结构域。
8.根据权利要求7所述的结合蛋白或FIT-Fab片段，其中所述第一多肽链从氨基端至羧基端包含VLCD3-CL-VHBCMA-CH1-Fc，其中CL与VHBCMA直接融合，
所述第二多肽链从氨基端至羧基端包含VHCD3-CH1；并且
所述第三多肽链从氨基端至羧基端包含VLBCMA-CL；
所述第一多肽链从氨基端至羧基端包含VLBCMA-CL-VHCD3-CH1-Fc，其中CL直接与VHCD3融合,所述第二多肽链从氨基端至羧基端包含VHBCMA-CH1,并且
所述第三多肽链从氨基端至羧基端包含VLCD3-CL；
所述第一多肽链从氨基端至羧基端包含VHBCMA-CH1-VLCD3-CL-Fc，其中CH1直接与VLCD3融合,所述第二多肽链从氨基端至羧基端包含VLBCMA-CL,并且
所述第三多肽链从氨基端至羧基端包含VHCD3-CH1；或
所述第一多肽链从氨基端至羧基端包含VHCD3-CH1-VLBCMA-CL-Fc其中CH1直接与VLBCMA融合,所述第二多肽链从氨基端至羧基端包含VLCD3-CL,并且
所述第三多肽链从氨基端至羧基端包含VHBCMA-CH1；
其中VLCD3是抗CD3抗体的轻链可变结构域，CL是抗体轻链恒定结构域，VHCD3是抗CD3抗体的重链可变结构域，CH1是抗体第一重链恒定结构域，VLBCMA是抗BCMA抗体的轻链可变结构域，VHBCMA是抗BCMA抗体的重链可变结构域，并且Fc是抗体Fc区。
9.根据权利要求8所述的结合蛋白或FIT-Fab片段，其中，结构域VLCD3-CL与抗CD3亲本抗体轻链相同，结构域VHCD3-CH1与抗CD3亲本抗体的重链可变结构域和重链第一恒定结构域相同，结构域VLBCMA-CL结构域与抗BCMA亲本抗体轻链相同，并且结构域VHBCMA-CH1与抗BCMA亲本抗体的重链可变结构域和重链第一恒定结构域相同。
10.根据权利要求6所述的结合蛋白或FIT-Fab片段，其中所述第一多肽链包含SEQ IDNO:50的氨基酸序列，所述第二多肽链包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列，并且所述第三多肽链包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列；
所述第一多肽链包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列，所述第二多肽链包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列，并且所述第三多肽链包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列；
或所述结合蛋白的Fab片段。
所述第一多肽链包含SEQ ID NO:80的氨基酸序列，所述第二多肽链包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列，并且所述第三多肽链包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列；
所述第一多肽链包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列，所述第二多肽链包含SEQ ID NO:84的氨基酸序列，并且所述第三多肽链包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列；或
所述第一多肽链包含SEQ ID NO:86的氨基酸序列，所述第二多肽链包含SEQ ID NO:87的氨基酸序列，并且所述第三多肽链包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列，
或所述结合蛋白的Fab片段。
11.包含根据权利要求6-10中任一项的至少一种结合蛋白或FIT-Fab片段和可药用的载体的药物组合物。
12.根据权利要求6-10中任一项的至少一种结合蛋白或FIT-Fab片段在制备药物中的用途，所述药物用于治疗疾病或病症，其中CD3介导的活性和/或BCMA介导的活性有害。
13.根据权利要求12的用途，其中所述疾病是癌症并且任选地选自：多发性骨髓瘤、黑素瘤(例如，转移性恶性黑素瘤)、肾癌(例如，透明细胞癌)、前列腺癌(例如，激素难治性前列腺腺癌)、胰腺腺癌、乳腺癌、结肠癌、肺癌(例如，非小细胞肺癌)，食道癌、头颈部鳞状细胞癌、肝癌、卵巢癌、子宫颈癌、甲状腺癌、成胶质细胞瘤、胶质瘤、白血病、淋巴瘤或原发性骨癌(例如，骨肉瘤、尤文氏肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤或软骨肉瘤)。
14.治疗其中CD3介导和/或BCMA介导的活性有害的病症的方法，包括向有需求的受试者施用有效量的根据权利要求6-10中任一项的至少一种结合蛋白或FIT-Fab片段或其组合。
15.根据权利要求14的方法，其中所述疾病是癌症并且任选地选自：多发性骨髓瘤、黑素瘤(例如，转移性恶性黑素瘤)、肾癌(例如，透明细胞癌)、前列腺癌(例如，激素难治性前列腺腺癌)、胰腺腺癌、乳腺癌、结肠癌、肺癌(例如，非小细胞肺癌)，食道癌、头颈部鳞状细胞癌、肝癌、卵巢癌、子宫颈癌、甲状腺癌、成胶质细胞瘤、胶质瘤、白血病、淋巴瘤或原发性骨癌(例如，骨肉瘤、尤文氏肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤或软骨肉瘤)。
16.根据权利要求14或15的方法，其中所述受试者是人。
17.一种抗-BCMA抗体或其抗原结合部分，其包含选自如下CDR集合的下列六个CDR的组：CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3：
Figure FDA0003661442650000041
Figure FDA0003661442650000051
18.根据权利要求17的抗BCMA抗体或其抗原结合部分，其包含VH和VL结构域，其具有选自以下VH/VL对的氨基酸序列：
VH/VL对 VH/VL对 SEQ ID NO:29/SEQ ID NO:30 SEQ ID NO:36/SEQ ID NO:40 SEQ ID NO:31/SEQ ID NO:32 SEQ ID NO:36/SEQ ID NO:41 SEQ ID NO:34/SEQ ID NO:38 SEQ ID NO:36/SEQ ID NO:42 SEQ ID NO:35/SEQ ID NO:38 SEQ ID NO:36/SEQ ID NO:43 SEQ ID NO:36/SEQ ID NO:38 SEQ ID NO:36/SEQ ID NO:44 SEQ ID NO:37/SEQ ID NO:38 SEQ ID NO:34/SEQ ID NO:45 SEQ ID NO:34/SEQ ID NO:39 SEQ ID NO:34/SEQ ID NO:46 SEQ ID NO:35/SEQ ID NO:39 SEQ ID NO:34/SEQ ID NO:47 SEQ ID NO:36/SEQ ID NO:39 SEQ ID NO:34/SEQ ID NO:48 SEQ ID NO:37/SEQ ID NO:39 SEQ ID NO:34/SEQ ID NO:49
19.包含根据权利要求17或18的至少一种抗-BCMA抗体或其抗原结合片段和可药用的载体的药物组合物。
20.根据权利要求17或18的抗-CD3抗体或其抗原结合片段在制备药物中的用途，所述药物用于治疗疾病或病症，其中CD3介导的活性和/或BCMA介导的活性有害。
21.根据权利要求20的用途，其中所述疾病是癌症并且任选地选自：多发性骨髓瘤、黑素瘤(例如，转移性恶性黑素瘤)、肾癌(例如，透明细胞癌)、前列腺癌(例如，激素难治性前列腺腺癌)、胰腺腺癌、乳腺癌、结肠癌、肺癌(例如，非小细胞肺癌)，食道癌、头颈部鳞状细胞癌、肝癌、卵巢癌、子宫颈癌、甲状腺癌、成胶质细胞瘤、胶质瘤、白血病、淋巴瘤或原发性骨癌(例如，骨肉瘤、尤文氏肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤或软骨肉瘤)。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024074145A1 (zh) * 2022-10-08 2024-04-11 盛禾(中国)生物制药有限公司 一种结合baffr和cd3的双特异性抗体及其应用

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6706578B2 (ja) * 2013-12-30 2020-06-10 エピムアブ バイオセラピューティクス インコーポレイテッド タンデム型Ｆａｂ免疫グロブリン及びその使用
BR112023002895A2 (pt) * 2020-08-24 2023-03-21 Epimab Biotherapeutics Hk Ltd Anticorpos anti-ror1 e proteínas de ligação biespecíficas relacionadas
CA3234068A1 (en) * 2021-10-07 2023-04-13 National Research Council Of Canada Anti-cd3 monoclonal antibodies and therapeutic constructs
CN117003871A (zh) * 2022-04-28 2023-11-07 北京天广实生物技术股份有限公司 结合bcma和cd3的抗体及其用途
WO2024012513A1 (en) * 2022-07-13 2024-01-18 Hansoh Bio Llc Antibody, antigen-binding fragment thereof, and pharmaceutical use thereof
CN117024596B (zh) * 2023-08-18 2024-02-27 镜像绮点(上海)细胞技术有限公司 肿瘤原代细胞特异性标记与活体成像

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK3415531T3 (da) * 2011-05-27 2023-09-18 Glaxo Group Ltd Bcma (cd269/tnfrsf17)-bindende proteiner
EP2953972B1 (en) * 2013-02-05 2020-07-08 EngMab Sàrl Method for the selection of antibodies against bcma
JP6706578B2 (ja) * 2013-12-30 2020-06-10 エピムアブ バイオセラピューティクス インコーポレイテッド タンデム型Ｆａｂ免疫グロブリン及びその使用
EP2982692A1 (en) * 2014-08-04 2016-02-10 EngMab AG Bispecific antibodies against CD3epsilon and BCMA
WO2016204966A1 (en) * 2015-06-16 2016-12-22 Genentech, Inc. Anti-cd3 antibodies and methods of use
CN109195993B (zh) * 2016-02-06 2022-05-10 岸迈生物科技有限公司 串联fab免疫球蛋白及其用途
WO2018035084A1 (en) * 2016-08-16 2018-02-22 Epimab Biotherapeutics, Inc. Monovalent asymmetric tandem fab bispecific antibodies
WO2018224441A1 (en) * 2017-06-05 2018-12-13 Numab Innovation Ag Novel anti-cd3 antibodies
BR112020005675A2 (pt) * 2017-09-22 2020-10-20 WuXi Biologics Ireland Limited novos complexos de polipeptideo cd3/cd19 biespecíficos
MX2020011588A (es) * 2018-05-03 2020-12-07 Shanghai Epimab Biotherapeutics Co Ltd Anticuerpos de alta afinidad a pd-1 y lag-3 y proteinas de union bispecificas preparadas a partir de las mismas.
JOP20200292A1 (ar) * 2018-05-16 2020-11-15 Stichting Vumc Bcma / cd3 و gprdc5d / cd3 مضادات غير محددة للاستخدام في علاج السرطان

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024074145A1 (zh) * 2022-10-08 2024-04-11 盛禾(中国)生物制药有限公司 一种结合baffr和cd3的双特异性抗体及其应用

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