KR20220104783A - Cd3 및 bcma에 대한 항체, 및 이로부터 제조된 이중특이적 결합 단백질 - Google Patents
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Abstract
CD3 및 B 세포 성숙 인자 단백질(BCMA)을 인식하는 고친화성 항체가 개시되어 있다. 인간화 항-CD3 및 항-BCMA 항체로부터의 결합 부위는 결합 친화성을 현저히 소실하지 않고서, 탠덤 Fab 면역글로불린 포맷으로 도입되고, 수득된 이중특이적, 다가 결합 단백질은 CD3 및 BCMA 둘 다에 동시에 결합할 수 있다. 이러한 항체, 이의 항원 결합 부분, 및 이중특이적 FIT-Ig 결합 단백질은 암 치료에 유용하다.
Description
본 발명은 CD3을 인식하는 신규한 항체, B 세포 성숙 항원(BCMA)을 인식하는 신규한 항체, 및 이러한 항체를 사용하여 제조된 FIT-Ig 결합 단백질 및 MAT-Fab 결합 단백질 등의 이중특이적 BCMA/CD3 결합 단백질에 관한 것이다. 항체 및 이중특이적 결합 단백질은 면역 질환 및 혈액 암의 치료에 유용하다.
분화 클러스터 3(CD3)
T 세포 수용체(TCR)는 주요 조직적합성 복합체(MHC)에 의해 표시되는 항원(Ags)에 결합하고, T 세포 기능에서 중요한 역할을 한다. 그러나, TCR은 그 자체로 세포내 신호전달을 갖지 않는다. 대신에, TCR은 분화 클러스터 3(Cluster of Differentiation 3; CD3) 복합체와 비공유적으로 회합하고, CD3의 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프(immunoreceptor tyrosine-based activation motifs; ITAM)를 통해 세포내 신호전달을 촉발한다. CD3 T 세포 보조-수용체는 세포독성 T 세포(CD8+ 나이브 T 세포)와 T 헬퍼 세포(CD4+ 나이브 T 세포) 모두를 활성화하는 데 도움이 된다. 이는 단백질 복합체로 구성되고, 4개의 상이한 쇄로 구성되어 있다. 포유동물에서, 복합체는 CD3γ 쇄, CD3δ 쇄 및 2개의 CD3ε 쇄를 포함한다. 이들 쇄는 T 세포 수용체(TCR) 및 CD3ζ 쇄(제타 쇄)와 결합하여, T 림프구에서 활성화 신호를 생성한다. TCR, ζ-쇄 및 CD3γ, δ 및 ε 쇄가 함께 TCR 복합체를 구성한다. 이어서, CD3 4-쇄 복합체는 1:1:1 화학량론에서 CD3εγ, CD3εδ 및 ζζ 이량체를 형성한다.
CD3는 최초, 흉선에서 T 세포가 발생하는 줄기 세포인 전-흉선세포의 세포질에서 발현된다. 전-흉선세포는 일반적 흉선세포로 분화하고, 이어서 수질 흉선세포로 분화하고, 이 후기에서 CD3 항원이 세포막으로 이동하기 시작한다. 항원은 모든 성숙 T 세포의 막에 결합되어 있고, 푸르킨예(Purkinje) 세포에는 소량 존재하는 것으로 보이지만, 다른 세포 유형에서는 거의 존재하지 않는다.
이 높은 특이성은, T 세포 발달의 모든 단계에서 CD3의 존재와 조합하여, 조직 절편에서 T 세포에 대한 유용한 면역조직화학적 마커로 된다. 항원은 거의 모든 T 세포 림프종 및 백혈병에 존재하고, 따라서 표면적으로 유사한 B 세포 및 골수성 신생물과 구별하기 위해 사용될 수 있다. CD3ε 쇄에 대한 일부 항체는 아마도 T 세포 상에서 CD3 복합체를 클러스터링함으로써 TCR-CD3 복합체를 활성화하는 것으로 나타났다. 또한, CD3 및 종양 특이적 항원 둘 다를 표적으로 하는 이중특이적 항체는 T 세포에 의한 재지시된 종양 근절을 위해 연구되어 왔다. CD3는 T 세포 활성화에 필요하기 때문에, CD3를 표적으로 하는 약물(종종 모노클로날 항체)은 제1형 당뇨병 및 기타 자가면역 질환에 대한 면역억제 요법(예: 오텔릭시주맙)으로서 연구되어 있다.
B 세포 성숙 항원(
BCMA
)
B 세포 성숙 항원(BCMA, TNFRSF17, CD269)은 TNF 수용체 슈퍼패밀리의 구성원이다. BCMA의 발현은 주로 형질 세포와 형질모세포에서 발현되는 B 세포 계열로 한정되고, 나이브 B 세포에는 부재한다. BCMA는 A 증식-유도 리간드(APRIL, TNFSF13, TALL-2, CD256)와 B 세포 활성화 인자(BAFF, BLYS, TNFSF13B, TALL-1, CD257)의 2개 리간드에 결합한다. BCMA는 BAFF보다 APRIL에 대하여 높은 결합 친화성을 갖는다. 다발성 골수종(MM) 세포는 높은 수준의 BCMA를 발현한다. 리간드 차단 활성을 갖는 BCMA를 표적으로 하는 항체는 네이키드 IgG 및 약물-접합체로서 MM 세포의 세포독성을 촉진할 수 있다. 후기 성숙 B 세포에서 BCMA의 제한된 발현은 또한 키메라 항원 수용체 T 세포(CAR-T 세포)의 이상적 공-표적으로 되게 하고, 이는 변형된 T 세포를 특정 세포 단백질로 표적화하기 위한 키메라 항원 수용체를 나타내도록 유전적으로 조작된 T 세포이다. CAR-T 세포는 B 세포 암에 대한 유망한 면역요법을 제공하지만, 그 메커니즘은 공지되어 있지 않고, CAR-T 세포 요법의 부작용은 종종 심각하고, 사이토카인 방출 증후군(사이토카인 폭풍) 및 신경학적 독성을 포함한다.
CD3 및 BCMA의 역할에 대한 이해는 또한 이중특이적 T 세포 재지시 항체로서 공지된 관련 면역요법도 유도했다. CD3 및 BCMA를 모두 표적으로 하는 이중특이적 항체는 재지시된 T 세포 세포독성(RTCC)을 통한 다발성 골수종의 치료에 유용할 것이다.
본 발명은 CD3에 높은 친화성으로 결합하는 신규 항체 및 BCMA에 높은 친화성으로 결합하는 신규 항체를 제공한다. 본 발명은 또한 CD3 및 BCMA 둘 다와 반응하는 BCMA/CD3 이중특이적 Fabs-in-Tandem 면역글로불린(FIT-Ig)을 제공한다. 본 발명은 또한 CD3 및 BCMA 둘 다와 반응하는 BCMA/CD3 이중특이적 1가 비대칭 탠덤 Fab 항체(MAT-Fab)를 제공한다. 본 발명의 항체 및 이중특이적 결합 단백질은 TCR-CD3 복합체를 활성화할 수 있다. 본 명세서에 기재된 이중특이적 다가 결합 단백질은, 재지시된 T 세포 세포독성을 통해 다발성 골수종(MM) 세포의 치료를 위한 상승적 조합 효과를 제공하는 BCMA/CD3 이중특이적 억제제로서 유용할 것이다.
본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 항-CD3 및 항-BCMA 항체 및 BCMA/CD3 이중특이적 결합 단백질의 제조 및 사용 방법, 게다가 샘플에서 CD3 및/또는 BCMA를 검출하는 방법, 또는 CD3 및/또는 BCMA 활성과 관련된 개인의 장애를 치료 또는 예방하는 방법에서 사용될 수 있는 다양한 조성물을 제공한다.
추가 실시형태에서, 본 발명은 제1, 제2 및 제3 폴리펩티드 쇄를 포함하는 이중특이적 탠덤 Fab(Fabs-in-Tandem) 면역글로불린(FIT-Ig) 결합 단백질을 제공하고,
여기서, 상기 제1 폴리펩티드 쇄는, 아미노 말단으로부터 카복실 말단까지, (i) VLA-CL-VHB-CH1-Fc(여기서, CL은 VHB에 직접 융합됨), 또는 (ii) VHB-CH1-VLA-CL-Fc(여기서, CH1은 VLA에 직접 융합됨)을 포함하고;
상기 제2 폴리펩티드 쇄는, 아미노 말단으로부터 카복실 말단까지, VHA-CH1을 포함하고;
상기 제3 폴리펩티드 쇄는, 아미노 말단으로부터 카복실 말단까지, VLB-CL을 포함하고;
VL은 경쇄 가변 도메인(domain)이고, CL은 경쇄 불변 도메인이고, VH는 중쇄 가변 도메인이고, CH1은 중쇄 불변 도메인이고, Fc는 면역글로불린 Fc 영역이고, A는 CD3 또는 BCMA의 에피토프(epitope)이고, B는 CD3 또는 BCMA의 에피토프이고, 단, A 및 B는 상이하다. 본 발명에 따르면, 이러한 FIT-Ig 결합 단백질은 CD3 및 BCMA 모두에 결합한다.
추가의 일 실시형태에서, 이러한 FIT-Ig 결합 단백질의 Fab 단편은 항원 표적 CD3 또는 BCMA 중 하나에 결합하는 모 항체(parental antibody)로부터의 VLA 및 VHA 도메인을 도입하고, 항원 표적 CD3 및 BCMA의 다른 하나에 결합하는 상이한 모 항체로부터의 VLB 및 VHB 도메인을 도입한다. 따라서, 제1, 제2 및 제3 폴리펩티드 쇄의 VHA-CH1/VLA-CL 및 VHB-CH1/VLB-CL 쌍은 CD3 및 BCMA를 인식하는 탠덤 Fab 부분을 생성한다.
본 발명에 따르면, BCMA/CD3 FIT-Ig 결합 단백질은 유리하게는 제1, 제2 및 제3 폴리펩티드 쇄를 포함하고, 여기서 상기 제1 폴리펩티드 쇄는, 아미노 말단으로부터 카복실 말단까지, VLCD3-CL-VHBCMA-CH1-Fc(여기서, CL은 VHBCMA에 직접 융합됨)을 포함하고, 상기 제2 폴리펩티드 쇄는, 아미노 말단으로부터 카복실 말단까지, VHCD3-CH1을 포함하고; 상기 제3 폴리펩티드 쇄는, 아미노 말단으로부터 카복실 말단까지, VLBCMA-CL을 포함하고; VLCD3은 항-CD3 항체의 경쇄 가변 도메인이고, CL은 경쇄 불변 도메인이고, VHCD3은 항-CD3 항체의 중쇄 가변 도메인이고, CH1은 중쇄 불변 도메인이고, VLBCMA는 항-BCMA 항체의 경쇄 가변 도메인이고, VHBCMA는 항-BCMA 항체의 중쇄 가변 도메인이고, Fc는 면역글로불린 Fc 영역이다. 유리하게는, 제1 폴리펩티드 쇄에서, 도메인 VLCD3-CL은 항-CD3 모 항체의 경쇄와 동일하고, 도메인 VHCD3-CH1은 항-CD3 모 항체의 중쇄 가변 및 중쇄 불변 도메인과 동일하고, 도메인 VLBCMA-CL은 항-BCMA 모 항체의 경쇄와 동일하고, 도메인 VHBCMA-CH1은 항-BCMA 모 항체의 중쇄 가변 및 중쇄 불변 도메인과 동일하다.
대안적 실시형태에서, BCMA/CD3 FIT-Ig 결합 단백질은 유리하게는 제1, 제2 및 제3 폴리펩티드 쇄를 포함할 수 있고, 여기서 상기 제1 폴리펩티드 쇄는, 아미노 말단으로부터 카복실 말단까지, VLBCMA-CL-VHCD3-CH1-Fc(여기서, CL은 VHCD3에 직접 융합됨)를 포함하고, 상기 제2 폴리펩티드 쇄는, 아미노 말단으로부터 카복실 말단까지, VHBCMA-CH1을 포함하고; 상기 제3 폴리펩티드 쇄는, 아미노 말단으로부터 카복실 말단까지, VLCD3-CL을 포함하고; 여기서 VLCD3은 항-CD3 항체의 경쇄 가변 도메인이고, CL은 경쇄 불변 도메인이고, VHCD3은 항-CD3 항체의 중쇄 가변 도메인이고, CH1은 중쇄 불변 도메인이고, VLBCMA는 항-BCMA 항체의 경쇄 가변 도메인이고, VHBCMA는 항-BCMA 항체의 중쇄 가변 도메인이고, Fc는 면역글로불린 Fc 영역이다. 유리하게는, 제1 폴리펩티드 쇄에서, 도메인 VLBCMA-CL은 항-BCMA 모 항체의 경쇄와 동일하고, 도메인 VHBCMA-CH1은 항-BCMA 모 항체의 중쇄 가변 및 중쇄 불변 도메인과 동일하고, 도메인 VLCD3-CL은 항-CD3 모 항체의 경쇄와 동일하고, 도메인 VHCD3-CH1은 항-CD3 모 항체의 중쇄 가변 및 중쇄 불변 도메인과 동일하다.
대안적 실시형태에서, BCMA/CD3 FIT-Ig 결합 단백질은 유리하게는 제1, 제2 및 제3 폴리펩티드 쇄를 포함할 수 있고, 여기서 상기 제1 폴리펩티드 쇄는, 아미노 말단으로부터 카복실 말단까지, VHBCMA-CH1-VLCD3-CL-Fc(여기서, CH1은 VLCD3에 직접 융합됨)를 포함하고, 상기 제2 폴리펩티드 쇄는, 아미노 말단으로부터 카복실 말단까지, VLBCMA-CL을 포함하고; 상기 제3 폴리펩티드 쇄는, 아미노 말단으로부터 카복실 말단까지, VHCD3-CH1을 포함하고; VLCD3은 항-CD3 항체의 경쇄 가변 도메인이고, CL은 경쇄 불변 도메인이고, VHCD3은 항-CD3 항체의 중쇄 가변 도메인이고, CH1은 중쇄 불변 도메인이고, VLBCMA는 항-BCMA 항체의 경쇄 가변 도메인이고, VHBCMA는 항-BCMA 항체의 중쇄 가변 도메인이고, Fc는 면역글로불린 Fc 영역이다. 유리하게는, 제1 폴리펩티드 쇄에서, 도메인 VLBCMA-CL은 항-BCMA 모 항체의 경쇄와 동일하고, 도메인 VHBCMA-CH1은 항-BCMA 모 항체의 중쇄 가변 및 중쇄 불변 도메인과 동일하고, 도메인 VLCD3-CL은 항-CD3 모 항체의 경쇄와 동일하고, 도메인 VHCD3-CH1은 항-CD3 모 항체의 중쇄 가변 및 중쇄 불변 도메인과 동일하다.
대안적 실시형태에서, BCMA/CD3 FIT-Ig 결합 단백질은 유리하게는 제1, 제2 및 제3 폴리펩티드 쇄를 포함할 수 있고, 여기서 상기 제1 폴리펩티드 쇄는, 아미노 말단으로부터 카복실 말단까지, VHCD3-CH1-VLBCMA-CL-Fc(여기서, CH1은 VLBCMA에 직접 융합됨)를 포함하고, 상기 제2 폴리펩티드 쇄는, 아미노 말단으로부터 카복실 말단까지, VLCD3-CL을 포함하고; 상기 제3 폴리펩티드 쇄는, 아미노 말단으로부터 카복실 말단까지, VHBCMA-CH1을 포함하고; VLCD3은 항-CD3 항체의 경쇄 가변 도메인이고, CL은 경쇄 불변 도메인이고, VHCD3은 항-CD3 항체의 중쇄 가변 도메인이고, CH1은 중쇄 불변 도메인이고, VLBCMA는 항-BCMA 항체의 경쇄 가변 도메인이고, VHBCMA는 항-BCMA 항체의 중쇄 가변 도메인이고, Fc는 면역글로불린 Fc 영역이다. 유리하게는, 제1 폴리펩티드 쇄에서, 도메인 VLBCMA-CL은 항-BCMA 모 항체의 경쇄와 동일하고, 도메인 VHBCMA-CH1은 항-BCMA 모 항체의 중쇄 가변 및 중쇄 불변 도메인과 동일하고, 도메인 VLCD3-CL은 항-CD3 모 항체의 경쇄와 동일하고, 도메인 VHCD3-CH1은 항-CD3 모 항체의 중쇄 가변 및 중쇄 불변 도메인과 동일하다.
FIT-Ig 결합 단백질의 제1 폴리펩티드 쇄에 대한 상기 식에서, Fc 영역은 천연 또는 변이체 Fc 영역일 수 있다. 특정 실시형태에서, Fc 영역은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgM, IgE, 또는 IgD로부터의 인간 Fc 영역이다. 특정 실시형태에서, Fc는 하기에 제시된 바와 같은 IgG1 유래의 인간 Fc이다:
DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호 1).
본 발명의 일 실시형태에서, 본 발명의 FIT-Ig 결합 단백질은, 이의 Fab 단편의 서열이 이용되고 FIT-Ig 구조 내로 도입되는 모 항체의 하나 이상의 특성을 보유한다. 추가의 일 실시형태에서, FIT-Ig는 모 항체의 결합 친화성에 필적하는 표적 항원(즉, CD3 및 BCMA)에 대한 결합 친화성을 유지할 것이고, 이는 CD3 및 BCMA 항원 표적에 대한 FIT-Ig 결합 단백질의 결합 친화성이, 표면 플라즈몬 공명 또는 생물층 간섭계로 측정할 때, 각각의 표적 항원에 대한 모 항체의 결합 친화성과 비교하여 10배 초과로 변화하지 않는 것을 의미한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 BCMA/CD3 FIT-Ig 결합 단백질은 CD3 및 BCMA에 결합하고, 서열번호 50의 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 이들로 이루어지거나, 이들로 이루어진 제1 폴리펩티드 쇄; 서열번호 51의 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 이들로 이루어지거나, 이들로 이루어지는 제2 폴리펩티드 쇄; 및 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 이들로 이루어지거나, 이들로 이루어지는 제3 폴리펩티드 쇄로 구성된다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명의 BCMA/CD3 FIT-Ig 결합 단백질은 CD3 및 BCMA에 결합하고, 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 이들로 이루어지거나, 이들로 이루어진 제1 폴리펩티드 쇄; 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 이들로 이루어지거나, 이들로 이루어지는 제2 폴리펩티드 쇄; 및 서열번호 55의 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 이들로 이루어지거나, 이들로 이루어지는 제3 폴리펩티드 쇄로 구성된다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명의 BCMA/CD3 FIT-Ig 결합 단백질은 CD3 및 BCMA에 결합하고, 서열번호 80의 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 이들로 이루어지거나, 이들로 이루어진 제1 폴리펩티드 쇄; 서열번호 81의 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 이들로 이루어지거나, 이들로 이루어진 제2 폴리펩티드 쇄; 및 서열번호 82의 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 이들로 이루어지거나, 이들로 이루어진 제3 폴리펩티드 쇄로 구성된다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명의 BCMA/CD3 FIT-Ig 결합 단백질은 CD3 및 BCMA에 결합하고, 서열번호 83의 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 이들로 이루어지거나, 이들로 이루어진 제1 폴리펩티드 쇄; 서열번호 84의 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 이들로 이루어지거나, 이들로 이루어진 제2 폴리펩티드 쇄; 및 서열번호 85의 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 이들로 이루어지거나, 이들로 이루어진 제3 폴리펩티드 쇄로 구성된다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명의 BCMA/CD3 FIT-Ig 결합 단백질은 CD3 및 BCMA에 결합하고, 서열번호 86의 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 이들로 이루어지거나, 이들로 이루어진 제1 폴리펩티드 쇄; 서열번호 87의 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 이들로 이루어지거나, 이들로 이루어진 제2 폴리펩티드 쇄; 및 서열번호 88의 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 이들로 이루어지거나, 이들로 이루어진 제3 폴리펩티드 쇄로 구성된다.
본 발명은 또한 인간 CD3에 결합할 수 있는 신규 항체를 제공하고, 여기서 항체의 항원 결합 도메인은 6개의 CDR 세트, 즉, 하기 정의된 CDR 세트의 그룹으로부터 선택된 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 포함한다:
본 발명은 또한 인간 BCMA에 결합할 수 있는 신규 항체를 제공하고, 여기서 항체의 항원 결합 도메인은 6개의 CDR의 세트, 즉, 하기 정의된 CDR 세트의 그룹으로부터 선택된 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 포함한다:
일 실시형태에서, 본 발명에 따른 결합 단백질은 2개 이상의 항원 결합 부위를 포함하는 이중특이적, 다가 면역글로불린 결합 단백질이고, 여기서 적어도 하나의 항원 결합 부위는 상기 CDR 세트 1 및 2로부터 선택된 CDR 세트를 포함하고, 적어도 하나의 항원 결합 부위는 상기 CDR 세트 3 및 4로부터 선택된 CDR 세트를 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명에 따른 항-CD3 항체는 VH 및 VL 도메인을 포함하고, 여기서 2개의 가변 도메인은 하기 VH/VL 쌍으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다:
추가 실시형태에서, 본 발명에 따른 항-BCMA 항체는 VH 및 VL 도메인을 포함하고, 여기서 2개의 가변 도메인은 하기 VH/VL 쌍으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다:
또 다른 실시형태에서, 항-CD3 항체 또는 항-BCMA 항체를 사용하여, 당해 분야에 충분히 확립된 기술에 의해, 동일한 표적 항원을 인식하는 유도체 결합 단백질을 제조할 수 있다. 이러한 유도체는, 예를 들면, 일본쇄 항체(scFv), Fab 단편(Fab), Fab' 단편, F(ab')2, Fv, 및 디설파이드 연결된 Fv일 수 있다.
면역글로불린의 Fab 단편은, 공유 결합하여 항체 결합 부위를 형성하는 2개의 성분으로 구성된다. 2개 성분은 각각 가변 도메인-불변 도메인 쇄(VH-CH1 또는 VL-CL)이고, 따라서 Fab의 각 V-C 쇄는 Fab 결합 단위의 "절반"으로 기재될 수 있다.
본 발명의 또 다른 태양에서, 본 명세서에 기재된 항체 또는 이중특이적 결합 단백질은 CD3, BCMA, 또는 이들 둘 모두의 생물학적 기능을 조절할 수 있다. 또 다른 태양에서, 본 명세서에 기재된 항-CD3 항체는 CD3 신호전달을 억제할 수 있다. 또 다른 태양에서, 본 명세서에 기재된 항-BCMA 항체는 이의 리간드 APRIL 및/또는 BAFF와의 BCMA 상호작용을 억제할 수 있고, 임의로 본 발명에 따른 항-BCMA 항체는 BCMA-매개 세포 신호전달 경로를 억제할 수 있다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 항-CD3 항체 또는 이의 항원-결합 단편은, 표면 플라즈몬 공명 또는 생물층 간섭계에 의해 측정될 때, 적어도 1 × 105 M-1s-1, 예를 들면, 적어도 3.3 × 105 M-1s-1 이상의 인간 CD3에 대한 온 속도 상수(kon)를 갖는다.
또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 항-CD3 항체 또는 이의 항원-결합 단편은, 표면 플라즈몬 공명 또는 생물층 간섭계에 의해 측정될 때, 5 × 10-3 미만의 인간 CD3에 대한 오프 속도 상수 (koff)를 갖는다.
또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 항-CD3 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 2 × 10-8 M 미만, 예를 들면, 1.5 × 10-8 M 미만의 인간 CD3에 대한 해리 상수(KD)를 갖는다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 항-BCMA 항체 또는 이의 항원-결합 단편은, 표면 플라즈몬 공명 또는 생물층 간섭계에 의해 측정될 때, 적어도 4 × 104 M-1s-1, 예를 들면, 적어도 1 × 105 M-1s-1, 적어도 2 × 105 M-1s-1 이상의 인간 BCMA에 대한 온 속도 상수(kon)를 갖는다.
또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 항-BCMA 항체 또는 이의 항원-결합 단편은, 표면 플라즈몬 공명 또는 생물층 간섭계에 의해 측정될 때, 5 × 10-3s-1 미만, 1 × 10-3s-1 미만, 5 × 10-4s-1 미만, 2 × 10-5s-1 미만 또는 1 × 10-5s-1 미만의 인간 BCMA에 대한 오프 속도 상수(koff)를 갖는다.
또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 항-BCMA 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 2 × 10-8 M 미만, 1 × 10-9 M 미만, 또는 5 × 10-10 M 미만의 BCMA에 대한 해리 상수(KD)를 갖는다.
일 실시형태에서, 본 발명에 따른 CD3 및 BCMA에 결합할 수 있는 이중특이적 BCMA/CD3 FIT-Ig 결합 단백질은 인간 CD3에 대한 온 속도 상수(kon)가 적어도 1 × 105 M-1s-1, 예를 들면, 적어도 2 × 105 M-1s-1, 또는 적어도 3 × 105 M-1s-1, 또는 그 이상이고, 동일한 결합 단백질은, 표면 플라즈몬 공명 또는 생물층 간섭계에 의해 측정될 때, 적어도 5 × 104 M-1s-1, 예를 들면, 적어도 6 × 104 M-1s-1, 또는 적어도 8 × 104 M-1s-1 이상의 인간 BCMA에 대한 온 속도 상수(kon)을 갖는다. 추가 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 CD3 및 BCMA에 결합할 수 있는 이중특이적 BCMA/CD3 FIT-Ig 결합 단백질은, 모 항-CD 항체의 CD3에 대한 kon으로부터 10배 이하 감소이고, FIT-Ig 결합 단백질의 항-CD 및 항-BCMA 특이성이 각각 유래하는 모 항-BCMA 항체의 BCMA에 대한 kon으로부터 10배 이하 감소인 인간 CD3에 대한 온 속도 상수(kon)를 가질 것이다. 다시 말해서, FIT-Ig 결합 단백질은 각각의 항원(CD3 또는 BCMA)에 대한 온 속도 상수를 보유하고, 이는 각각의 CD3 또는 BCMA 항원과 반응하는 모 항체에 의해 나타나는 온 속도 상수(kon)보다 높거나, 동일하거나, 1차수 이하이다. 본원에 개시된 바와 같이, 항원에 대한 BCMA/CD3 FIT-Ig 결합 단백질은 모 항체에 의해 나타나는 각각의 항원에 대한 kon과 비교하여 하나 또는 둘 모두의 항원에 대한 kon의 개선을 나타낼 수 있거나, 또는 하나 또는 둘 모두의 항원에 대한 kon은, 각각 모 항체에 의해 나타나는 것과 본질적으로 동일하거나, 모 항체와 비교하여 FIT-Ig 결합 단백질에 의해 나타난 항원 중 하나 또는 둘 모두에 대한 kon이 감소하는 경우, 그 감소는 10배 이하의 감소이다. 예를 들면, 모 항체의 그 항원에 대한 kon과 비교하여 FIT-Ig의 특정 항원에 대한 kon의 감소는 50% 미만, 25% 미만의 감소이다. 모 항체의 kon과 비교하여 이중특이적 FIT-Ig에서 이러한 높은 보유된 kon 값은 이 분야에서 놀라운 성과이다.
일 실시형태에서, 본 발명에 따른 CD3 및 BCMA에 결합할 수 있는 이중특이적 FIT-Ig 결합 단백질은 1 × 10-2s-1 미만, 8 × 10-3s-1 미만, 7 × 10-3s-1 미만, 예를 들면, 6 × 10-3s-1 미만의 인간 CD3에 대한 오프 속도 상수(koff)를 갖고, 동일한 결합 단백질은, 표면 플라즈몬 공명 또는 생물층 간섭계에 의해 측정될 때, 5 × 10-5s-1 미만, 4 × 10-5s-1 미만, 3 × 10-5s-1 미만, 또는 5 × 10-6s-1 미만의 인간 BCMA에 대한 오프 속도 상수(koff)를 갖는다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명에 따른 CD3 및 BCMA에 결합할 수 있는 이중특이적 BCMA/CD3 FIT-Ig 결합 단백질은 5 × 10-8 M 미만, 3 × 10-8 M 미만, 2 × 10-8 M 미만, 또는 1.75 × 10-8 M 미만의 CD3에 대한 해리 상수(KD)를 갖고, 동일한 결합 단백질은 1 × 10-9 M 미만, 6 × 10-10 M 미만, 3 × 10-10 M 미만, 1 × 10-10 M 미만, 8 × 10-11 M 미만, 또는 6 × 10-11 M 미만의 인간 BCMA에 대한 해리 상수(KD)를 갖는다. 추가 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 CD3 및 BCMA에 결합할 수 있는 이중특이적 FIT-Ig 결합 단백질은, 모 항-CD3 항체의 CD3에 대한 KD와 10배 이하 상이하고, FIT-Ig 결합 단백질의 항-CD3 및 항-BCMA 특이성이 각각 유도되는 모 항-BCMA 항체의 BCMA에 대한 KD와 10배 이하 상이한 인간 CD3에 대한 해리 상수(KD)를 가질 것이다. 다시 말해서, FIT-Ig 결합 단백질은 해리 상수(KD)에 의해 지시된 바와 같이 각 항원(CD3 또는 BCMA)에 대한 모 항체의 결합 친화성을 보유할 것이고, 이는 각각 CD3 또는 BCMA 항원과 반응하는 모 항체에 의해 나타나는 KD의 1차수의 크기 이내이다.
본 명세서에 개시된 바와 같이, BCMA/CD3 FIT-Ig 결합 단백질은 모 항체에 의해 나타난 각각의 항원에 대한 KD와 비교하여 하나 또는 둘 모두의 항원에 대한 KD의 개선을 나타낼 수 있거나(즉, 더 낮은 KD 값을 가짐, 더 긴밀하게 결합함), 또는 하나 또는 둘 다의 항원에 대한 KD는 각각 모 항체에 의해 나타나는 것과 본질적으로 동일할 수 있거나, 또는 FIT-Ig 결합 단백질에 의해 나타나는 하나 또는 둘 모두의 항원에 대한 KD는 모 항체의 KD와 비교하여 감소를 나타낼 수 있지만(즉, 더 큰 KD를 가짐, 덜 긴밀하게 결합함), FIT-Ig 결합 단백질과 모 항체 사이에 KD의 차이가 있는 경우, 그 차이는 10배 이하의 차이이다. 예를 들면, BCMA/CD3 FIT-Ig 결합 단백질은 하나 또는 둘 모두의 모 항체에 의해 나타나는 각각의 항원에 대한 KD와 비교하여 하나 또는 둘 모두의 항원에 대해 더 낮은 KD(더 긴밀하게 결합함)를 나타낸다. 모 항-CD3 및 항-BCMA 항체의 결합 친화성의 유지 ± KD에서의 10배 변화는 이 분야에서 놀라운 성과이다.
본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 바와 같은 적어도 하나의 항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 적어도 하나의 항-BCMA 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 바와 같은 항-CD3 및 항-BCMA 항체, 또는 이의 항원-결합 단편(들)의 조합, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 CD3 및 BCMA 둘 다와 반응하는 이중특이적, 다가 면역글로불린 결합 단백질을 제공하고, 이 결합 단백질은 본 명세서에 기재된 항-CD3 및 항-BCMA 항체로부터의 VH/VL 결합 부위를 도입한다. 특히, 본 발명은 CD3 및 BCMA에 결합할 수 있는 적어도 하나의 FIT-Ig 결합 단백질 또는 적어도 하나의 MAT-Fab 결합 단백질 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 약제학적 조성물은 적어도 하나의 추가 활성 성분을 추가로 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 이러한 추가 성분에는 치료제, 영상화제, 세포독성제, 혈관신생 억제제, 키나제 억제제, 공-자극 분자 차단제, 접착 분자 차단제, 상이한 특이성의 항체 또는 이의 기능적 단편, 검출가능한 표지 또는 리포터; 특정 사이토카인(들)에 대한 작용제 또는 길항제, 마약, 비-스테로이드성 항염증제(NSAID), 진통제, 마취제, 진정제, 국소 마취제, 신경근 차단제, 항균제, 코르티코스테로이드, 동화 스테로이드, 에리트로포이에틴, 면역원, 면역억제제, 성장 호르몬, 호르몬 대체 약물, 방사성 의약품, 항우울제, 항정신병제, 각성제(예: 암페타민, 카페인 등), 베타 작용제, 흡입 스테로이드, 에피네프린 또는 유사체, 사이토카인이 포함되지만, 이들로 한정되지 않는다.
또 다른 실시형태에서, 약제학적 조성물은 CD3-매개 및/또는 BCMA-매개 신호전달 활성이 유해한 장애를 치료하기 위한 적어도 하나의 추가 치료제를 추가로 포함한다.
추가 실시형태에서, 본 발명은 본 발명의 항-CD3 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 하나 이상의 아미노산 서열을 코딩하는 단리된 핵산; 본 발명의 항-BCMA 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 하나 이상의 아미노산 서열을 코딩하는 단리된 핵산; 및 CD3 및 BCMA 둘 다에 결합할 수 있는 이중특이적 탠덤 Fab 면역글로불린(FIT-Ig) 결합 단백질의 하나 이상의 아미노산 서열을 코딩하는 단리된 핵산을 제공한다. 이러한 핵산은 다양한 유전자 분석을 수행하기 위해, 또는 본 명세서에 기재된 항체 또는 결합 단백질의 하나 이상의 특성을 발현, 특성화 또는 개선하기 위해 벡터에 삽입될 수 있다. 벡터는 본 명세서에 기재된 항체 또는 결합 단백질의 하나 이상의 아미노산 서열을 코딩하는 하나 이상의 핵산 분자를 포함할 수 있고, 여기서 하나 이상의 핵산 분자는 벡터를 운반하는 특정 숙주 세포에서 항체 또는 결합 단백질의 발현을 가능하게 하는 적절한 전사 및/또는 번역 서열에 작동가능하게 연결된다. 본 명세서에 기재된 결합 단백질의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 클로닝 또는 발현하기 위한 벡터의 예에는 pcDNA, pTT, pTT3, pEFBOS, pBV, pJV 및 pBJ, 및 이들의 유도체가 포함되지만, 이들로 한정되지 않는다.
본 발명은 또한, 본 명세서에 기재된 항체 또는 결합 단백질의 하나 이상의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 본 발명에 유용한 숙주 세포는 원핵생물 또는 진핵생물일 수 있다. 예시적 원핵 숙주 세포는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)이다. 본 발명에서 숙주 세포로서 유용한 진핵 세포에는 원생생물 세포, 동물 세포, 식물 세포 및 진균 세포가 포함된다. 예시적 진균 세포는 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)를 포함하는 효모 세포이다. 본 발명에 따른 숙주 세포로서 유용한 예시적 동물 세포에는 포유동물 세포, 조류 세포 및 곤충 세포가 포함되지만, 이들로 한정되지 않는다. 예시적 포유동물 세포에는 CHO 세포, HEK 세포, 및 COS 세포가 포함되지만, 이들로 한정되지 않는다. 본 발명에 따른 숙주 세포로서 유용한 곤충 세포는 곤충 Sf9 세포이다.
또 다른 태양에서, 본 발명은, 항체 또는 기능적 단편을 코딩하는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를, CD3에 결합할 수 있는 항체 또는 단편의 숙주 세포에 의한 발현을 유발하기에 충분한 조건하에 배양 배지에서 배양하는 것을 포함하는, 항-CD3 항체 또는 이의 기능적 단편을 생산하는 방법을 제공한다. 또 다른 태양에서, 본 발명은, 항-BCMA 항체 또는 이의 기능적 단편을 코딩하는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를, BCMA에 결합할 수 있는 항체 또는 단편의 숙주 세포에 의한 발현을 유발하기에 충분한 조건하에 배양 배지에서 배양하는 것을 포함하는 항-BCMA 항체 또는 이의 기능적 단편을 생산하는 방법을 제공한다. 또 다른 태양에서, 본 발명은, FIT-Ig 결합 단백질을 코딩하는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를, CD3 및 BCMA에 결합할 수 있는 결합 단백질의 숙주 세포에 의한 발현을 유발하기에 충분한 조건하에 배양 배지에서 배양하는 것을 포함하는, CD3 및 BCMA에 결합할 수 있는 이중특이적, 다가 결합 단백질, 구체적으로 FIT-Ig 결합 단백질을 생산하는 방법을 제공한다. 이렇게 생산된 단백질은 단리되고, 본 명세서에 기재된 다양한 조성물 및 방법에서 사용될 수 있다.
일 실시형태에서, 본 발명은 이를 필요로 하는 대상체(subject)에서 암을 치료하는 방법을 제공하고, 이 방법은 본 명세서에 기재된 항-CD3 항체 또는 이의 CD3-결합 단편을 대상체에게 투여하는 것을 포함하고, 상기 항체 또는 결합 단편은 CD3에 결합하고 CD3을 발현하는 세포에서 CD3-매개 신호전달을 억제할 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명은 이를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공하고, 이 방법은 본 명세서에 기재된 항-BCMA 항체 또는 이의 BCMA 결합 단편을 대상체에게 투여하는 것을 포함하고, 상기 항체 또는 결합 단편은 BCMA에 결합하고, BCMA를 발현하는 세포에서 BCMA-매개 신호전달을 억제할 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명은 이를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공하고, 이 방법은 본 명세서에 기재된 CD3 및 BCMA 둘 모두에 결합할 수 있는 이중특이적 FIT-Ig 결합 단백질을 대상체에게 투여하는 것을 포함하고, 상기 결합 단백질은 CD3 및 BCMA에 결합하고, CD3을 발현하는 세포에서 CD3-매개 신호전달을 억제하고 BCMA를 발현하는 세포에서 BCMA-매개 신호전달을 억제할 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 이를 필요로 하는 대상체에서 자가면역 질환 또는 암을 치료하는 방법을 제공하고, 여기서 결합 단백질은 CD3 및 BCMA에 결합할 수 있고, 자가면역 질환 또는 암은 전형적으로 면역요법에 반응하는 자가면역 질환 또는 암이다. 또 다른 실시형태에서, 암은 면역요법과 연관되지 않은 암이다. 또 다른 실시형태에서, 암은 난치성 또는 재발성 악성종양인 암이다. 또 다른 실시형태에서, 결합 단백질은 종양 세포의 성장 또는 생존을 억제한다. 또 다른 실시형태에서, 암은 흑색종(melanoma)(예: 전이성 악성 흑색종(metastatic malignant melanoma)), 신장암(renal cancer)(예: 투명 세포 암종(clear cell carcinoma)), 전립선암(prostate cancer)(예: 호르몬 난치성 전립선 선암종(hormone refractory prostate adenocarcinoma)), 췌장 선암종(pancreatic adenocarcinoma), 유방암(breast cancer), 결장암(colon cancer), 폐암(lung cancer)(예: 비-소세포 폐암(non-small cell lung cancer)), 식도암(esophageal cancer), 두경부 편평 세포 암종(squamous cell carcinoma of the head and neck), 간암(liver cancer), 난소암(ovarian cancer), 자궁경부암(cervical cancer), 갑상선암(thyroid cancer), 교모세포종(glioblastoma), 신경교종(glioma), 백혈병(leukemia), 림프종(lymphoma) 및 기타 신생물성 악성종양(neoplastic malignancies)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
본 명세서에 기재된 치료 방법은, 이를 필요로 하는 대상체에게, 전체 또는 부분적 포스포디에스테르 또는 포스포로티오에이트 골격을 포함하는 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드(CpG ODN) 등의 면역자극 애주번트를 투여하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 치료 방법에서, 면역자극 애주번트는 본 발명의 항체 또는 FIT-Ig 결합 단백질을 포함하는 조성물에 도입될 수 있고, 조성물은 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여된다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 치료 방법은, 치료를 필요로 하는 대상체에게 본 명세서에 기재된 항체 또는 FIT-Ig 결합 단백질을 투여하는 단계, 및 본 발명의 항체 또는 FIT-Ig 결합 단백질을 대상체에게 투여하는 단계의 전, 동시, 또는 후에 면역자극 애주번트를 대상체에게 투여하는 별개의 단계를 포함할 수 있다.
도 1은 마이크로플레이트 상에 고정된 인간 CD3ε/γ 헤테로이량체-Fc 융합 단백질 표적에 대한 시험 항체의 결합을 나타내는 플롯의 컬렉션이다. 새롭게 단리된 mAbCD3-001 및 mAbCD3-002의 결합 활성을, 음성 대조군으로서 참조 항-CD3 모노클로날 항체("대조군 α-CD3 mAb") 및 관계 없는 뮤린 항체("mIgG")와 비교한다.
도 2는 마이크로플레이트 상에 고정된 사이노몰구스 원숭이 CD3ε/γ 헤테로이량체-Fc 융합 단백질 표적에 대한 시험 항체의 결합을 나타내는 플롯의 컬렉션이다. 새롭게 단리된 mAbCD3-001 및 mAbCD3-002의 결합 활성을, 음성 대조군으로서 참조 항-CD3 모노클로날 항체("대조군 α-CD3 mAb") 및 관계 없는 뮤린 항체("mIgG")와 비교한다.
도 3은 시험관내 배양된 인간 T 세포가 항-CD3 항체 mAbCD3-001(본 발명) 및 OKT3(양성 대조군)에 의한 증식으로 자극되었음을 나타내는 막대 그래프이다.
도 4는 시험관내 배양된 인간 T 세포가 항-CD3 항체 mAbCD3-001(본 발명) 및 OKT3(양성 대조군)에 의해 인터페론 감마(IFN-g)를 분비하도록 자극되었음을 나타내는 막대 그래프이다.
도 5A-5H는 mAbCD3-001의 상이한 인간화 VH 변이체 및 2개의 VK 변이체(EM0006-01VK.1 또는 EM0006-01VK.1A, 표 2 참조) 중 하나를 사용하는 인간화 항-CD3 항체 작제물의 결합 활성을 비교하는 형광 플롯이다. 플롯은 VH 변이체가 CD3 결합 활성의 핵심이고, VL의 변화가 주르카트(Jurkat) 세포에 대한 결합에 거의 영향을 미치지 않는다는 것을 나타낸다. 그래프 패널 5A-5H에서 몇몇 플롯을 그룹화하면, 중간 및 낮은 친화성의 결합제와 대조적으로, HuEM0006-01-8 및 HuEM0006-01-17 등의 매우 높은 친화성의 인간화 항체를 식별할 수 있다.
도 6은 BCMA-발현 종양 세포주 NCI-H929에서 BCMA 리간드 BAFF-유도 NF-κB 인산화를 억제하는 다양한 항-BCMA 항체의 능력을 나타내는 그래프이다. 항-BAFF mAb 및 관계 없는 항-RAC1 뮤린 IgG를 각각 양성 및 음성 대조군으로 사용했다. 본 명세서에 기재된 신규 항-BCMA 항체 mAbBCMA-002 및 mAbBCMA-003은 특허 문헌에 기재된 참조 항체(도 6에서 TAB1 및 TAB2로 표지됨)와 양호하게 비교되었다. 상세한 내용은 하기 실시예 3.3을 참조한다.
도 7은 HEK293 형질감염된 BCMA-발현 세포주, HEK293F-BCMA-NF-kB-luc에서 BCMA 리간드 BAFF-유도 NF-κB 포스포릴화를 억제하는 다양한 항-BCMA 항체의 능력을 나타내는 그래프이다. 항-BCMA 참조 항체 TAB1 및 TAB2를 비교용 양성 대조군으로 사용했다. 관계 없는 항-Ro1 뮤린 IgG를 대조군으로 사용했다.
도 8은 BCMA-형질감염된 HEK293 세포에서 BCMA 리간드 APRIL(TNFSF13) 유도 NF-kB-루시퍼라제 신호를 억제하는 항-BCMA 항체의 능력을 나타내는 그래프이다.
도 9는 BCMA-발현 NCI-H929 세포에 대한 BCMA/CD3 이중특이적 FIT-Ig Fab 단편의 결합을 나타내는 그래프이다. 시험된 3개의 FIT-Fab은 동일한 BCMA 결합 도메인을 갖고 있다. 실시예 4.1, 4.2 및 4.3을 참조한다.
도 10은 인간 T 세포 수용체 복합체를 발현하도록 형질감염된 CHO 세포(CHOK1/CD3/TCR)에 대한 BCMA/CD3 FIT-Ig 결합 단백질의 결합을 나타내는 그래프이다(실시예 1.1 참조). 시험된 3개의 FIT-Ig 결합 단백질은 3개의 상이한 인간화 모 항-CD3 항체로부터 상이한 CD3 결합 부위를 갖는다. 실시예 4.3을 참조한다.
도 11은 BCMA/CD3 이중특이적 FIT-Ig 및 BCMA/CD3 FIT-Fab이 NCI-H929 세포와 공-배양된 주르카트-NFAT 세포의 활성화를 재지시하는 능력을 나타내는 그래프이다. 단일특이적 항-CD3 IgG(HuEM1006-01-24)와 이의 Fab 단편(HuEM1006-01-24-Fab)을 비교용으로 시험하고, 관련 없는 인간 IgG를 음성 대조군으로 사용했다.
도 12는 NCI-H929와 공-배양된 주르카트-NFAT 세포의 활성화를 재지시하는 BCMA/CD3 이중특이적 FIT-Fab 결합 단백질의 능력을 나타내는 그래프이다. 항-BCMA 및 항-CD3 모노클로날 항체 및 관계 없는 Fab(FIT1002-5a-Fab)의 조합을 대조군으로 사용했다.
도 13은 T 세포 세포독성을 NCI-H929 세포로 재지시하는 다양한 BCMA/CD3 이중특이적 FIT-Fab의 능력을 나타내는 그래프이다. 관계 없는 FIT-Fab(FIT1002-5a-Fab), 항-CD3 Fab와 항-BCMA mAb의 조합(콤보), 참조 항-BCMA mAb(TAB1) 단독, 항-CD3 Fab 단독(HuEM1006-01-24-Fab) 및 관계 없는 인간 IgG를 대조군으로 사용했다.
도 14는, 검정이 BCMA-발현 NCI-H929 표적 세포 부재하에 수행되는 경우, 인간화 BCMA/CD3 FIT-Ig 및 BCMA/CD3 FIT-Fab이 주르카트-NFAT 세포의 한정된 비-표적 재지시된 활성화를 입증한다는 것을 나타내는 그래프이다. 항-CD3 IgG(HuEM1006-01-24), 이의 Fab 단편(HuEM1006-01-24-Fab), 관계 없는 FIT-Ig(FIT1002-5a) 및 관계 없는 인간 IgG(hIgG)를 대조군으로 사용했다.
도 15는 본 발명에 따른 인간화 BCMA/CD3 FIT-Ig가 T 세포 세포독성을 NCI-H929 종양 세포로 재지시할 수 있음을 나타내는 그래프이다. 마우스-인간 키메라 FIT-Ig(FIT1006-4b) 및 관계 없는 FIT-Ig(FIT1002-5a)를 대조군으로 사용했다.
도 16은 BCMA-발현 NCI-H929 세포에 대한 전술한 2개의 BCMA/CD3 인간화 이중특이적 FIT-Ig 결합 단백질의 결합 활성을 나타내는 그래프이다. 관계 없는 인간 IgG 항체(hIgG)를 대조군으로 사용했다.
도 17은 CD3-발현 주르카트 세포에 대한 상기 기재된 2개의 BCMA/CD3 인간화 이중특이적 FIT-Ig 결합 단백질의 결합 활성을 나타내는 그래프이다. 관계 없는 인간 IgG 항체(hIgG)를 대조군으로 사용했다.
도 18 및 19는 BCMA-발현(도 18) 및 CD3-발현(도 19) 표적 세포에 대한 결합 활성을 입증하고, 둘 다 2개의 대안적 구성의 이중특이적 작제물을 표적으로 하는 것을 확인한다.
도 20은 BCMA × CD3 FIT-Ig에 의한 치료에 의해 달성된 인간 PBMC 이식된 NPSG 마우스에서 종양 성장의 억제를 입증한다.
도 21은 BCMA × CD3 FIT-Ig에 의한 치료에 의해 유도된 B 세포 고갈을 입증한다.
도 22는 FIT-Ig 처리된 사이노몰구스 원숭이에서 순환 T 세포의 일시적 소실을 입증한다.
도 2는 마이크로플레이트 상에 고정된 사이노몰구스 원숭이 CD3ε/γ 헤테로이량체-Fc 융합 단백질 표적에 대한 시험 항체의 결합을 나타내는 플롯의 컬렉션이다. 새롭게 단리된 mAbCD3-001 및 mAbCD3-002의 결합 활성을, 음성 대조군으로서 참조 항-CD3 모노클로날 항체("대조군 α-CD3 mAb") 및 관계 없는 뮤린 항체("mIgG")와 비교한다.
도 3은 시험관내 배양된 인간 T 세포가 항-CD3 항체 mAbCD3-001(본 발명) 및 OKT3(양성 대조군)에 의한 증식으로 자극되었음을 나타내는 막대 그래프이다.
도 4는 시험관내 배양된 인간 T 세포가 항-CD3 항체 mAbCD3-001(본 발명) 및 OKT3(양성 대조군)에 의해 인터페론 감마(IFN-g)를 분비하도록 자극되었음을 나타내는 막대 그래프이다.
도 5A-5H는 mAbCD3-001의 상이한 인간화 VH 변이체 및 2개의 VK 변이체(EM0006-01VK.1 또는 EM0006-01VK.1A, 표 2 참조) 중 하나를 사용하는 인간화 항-CD3 항체 작제물의 결합 활성을 비교하는 형광 플롯이다. 플롯은 VH 변이체가 CD3 결합 활성의 핵심이고, VL의 변화가 주르카트(Jurkat) 세포에 대한 결합에 거의 영향을 미치지 않는다는 것을 나타낸다. 그래프 패널 5A-5H에서 몇몇 플롯을 그룹화하면, 중간 및 낮은 친화성의 결합제와 대조적으로, HuEM0006-01-8 및 HuEM0006-01-17 등의 매우 높은 친화성의 인간화 항체를 식별할 수 있다.
도 6은 BCMA-발현 종양 세포주 NCI-H929에서 BCMA 리간드 BAFF-유도 NF-κB 인산화를 억제하는 다양한 항-BCMA 항체의 능력을 나타내는 그래프이다. 항-BAFF mAb 및 관계 없는 항-RAC1 뮤린 IgG를 각각 양성 및 음성 대조군으로 사용했다. 본 명세서에 기재된 신규 항-BCMA 항체 mAbBCMA-002 및 mAbBCMA-003은 특허 문헌에 기재된 참조 항체(도 6에서 TAB1 및 TAB2로 표지됨)와 양호하게 비교되었다. 상세한 내용은 하기 실시예 3.3을 참조한다.
도 7은 HEK293 형질감염된 BCMA-발현 세포주, HEK293F-BCMA-NF-kB-luc에서 BCMA 리간드 BAFF-유도 NF-κB 포스포릴화를 억제하는 다양한 항-BCMA 항체의 능력을 나타내는 그래프이다. 항-BCMA 참조 항체 TAB1 및 TAB2를 비교용 양성 대조군으로 사용했다. 관계 없는 항-Ro1 뮤린 IgG를 대조군으로 사용했다.
도 8은 BCMA-형질감염된 HEK293 세포에서 BCMA 리간드 APRIL(TNFSF13) 유도 NF-kB-루시퍼라제 신호를 억제하는 항-BCMA 항체의 능력을 나타내는 그래프이다.
도 9는 BCMA-발현 NCI-H929 세포에 대한 BCMA/CD3 이중특이적 FIT-Ig Fab 단편의 결합을 나타내는 그래프이다. 시험된 3개의 FIT-Fab은 동일한 BCMA 결합 도메인을 갖고 있다. 실시예 4.1, 4.2 및 4.3을 참조한다.
도 10은 인간 T 세포 수용체 복합체를 발현하도록 형질감염된 CHO 세포(CHOK1/CD3/TCR)에 대한 BCMA/CD3 FIT-Ig 결합 단백질의 결합을 나타내는 그래프이다(실시예 1.1 참조). 시험된 3개의 FIT-Ig 결합 단백질은 3개의 상이한 인간화 모 항-CD3 항체로부터 상이한 CD3 결합 부위를 갖는다. 실시예 4.3을 참조한다.
도 11은 BCMA/CD3 이중특이적 FIT-Ig 및 BCMA/CD3 FIT-Fab이 NCI-H929 세포와 공-배양된 주르카트-NFAT 세포의 활성화를 재지시하는 능력을 나타내는 그래프이다. 단일특이적 항-CD3 IgG(HuEM1006-01-24)와 이의 Fab 단편(HuEM1006-01-24-Fab)을 비교용으로 시험하고, 관련 없는 인간 IgG를 음성 대조군으로 사용했다.
도 12는 NCI-H929와 공-배양된 주르카트-NFAT 세포의 활성화를 재지시하는 BCMA/CD3 이중특이적 FIT-Fab 결합 단백질의 능력을 나타내는 그래프이다. 항-BCMA 및 항-CD3 모노클로날 항체 및 관계 없는 Fab(FIT1002-5a-Fab)의 조합을 대조군으로 사용했다.
도 13은 T 세포 세포독성을 NCI-H929 세포로 재지시하는 다양한 BCMA/CD3 이중특이적 FIT-Fab의 능력을 나타내는 그래프이다. 관계 없는 FIT-Fab(FIT1002-5a-Fab), 항-CD3 Fab와 항-BCMA mAb의 조합(콤보), 참조 항-BCMA mAb(TAB1) 단독, 항-CD3 Fab 단독(HuEM1006-01-24-Fab) 및 관계 없는 인간 IgG를 대조군으로 사용했다.
도 14는, 검정이 BCMA-발현 NCI-H929 표적 세포 부재하에 수행되는 경우, 인간화 BCMA/CD3 FIT-Ig 및 BCMA/CD3 FIT-Fab이 주르카트-NFAT 세포의 한정된 비-표적 재지시된 활성화를 입증한다는 것을 나타내는 그래프이다. 항-CD3 IgG(HuEM1006-01-24), 이의 Fab 단편(HuEM1006-01-24-Fab), 관계 없는 FIT-Ig(FIT1002-5a) 및 관계 없는 인간 IgG(hIgG)를 대조군으로 사용했다.
도 15는 본 발명에 따른 인간화 BCMA/CD3 FIT-Ig가 T 세포 세포독성을 NCI-H929 종양 세포로 재지시할 수 있음을 나타내는 그래프이다. 마우스-인간 키메라 FIT-Ig(FIT1006-4b) 및 관계 없는 FIT-Ig(FIT1002-5a)를 대조군으로 사용했다.
도 16은 BCMA-발현 NCI-H929 세포에 대한 전술한 2개의 BCMA/CD3 인간화 이중특이적 FIT-Ig 결합 단백질의 결합 활성을 나타내는 그래프이다. 관계 없는 인간 IgG 항체(hIgG)를 대조군으로 사용했다.
도 17은 CD3-발현 주르카트 세포에 대한 상기 기재된 2개의 BCMA/CD3 인간화 이중특이적 FIT-Ig 결합 단백질의 결합 활성을 나타내는 그래프이다. 관계 없는 인간 IgG 항체(hIgG)를 대조군으로 사용했다.
도 18 및 19는 BCMA-발현(도 18) 및 CD3-발현(도 19) 표적 세포에 대한 결합 활성을 입증하고, 둘 다 2개의 대안적 구성의 이중특이적 작제물을 표적으로 하는 것을 확인한다.
도 20은 BCMA × CD3 FIT-Ig에 의한 치료에 의해 달성된 인간 PBMC 이식된 NPSG 마우스에서 종양 성장의 억제를 입증한다.
도 21은 BCMA × CD3 FIT-Ig에 의한 치료에 의해 유도된 B 세포 고갈을 입증한다.
도 22는 FIT-Ig 처리된 사이노몰구스 원숭이에서 순환 T 세포의 일시적 소실을 입증한다.
본 발명은 신규한 항-CD3 항체, 신규한 항-BCMA 항체, 이들의 항원-결합 부분(antigen-binding portion), 및 다가, 이중특이적 결합 단백질, 예컨대, 탠덤 Fab 면역글로불린(FIT-Igs) 및 "1가 비대칭 탠덤 Fab 이중특이적 항체" 또는 "MAT-Fab 이중특이적 항체" 또는 간단히 "MAT-Fab 항체"에 관한 것이다. 본 발명의 다양한 태양은 항-CD3 및 항-BCMA 항체 및 항체 단편, FIT-Ig 결합 단백질, 및 인간 CD3 및 인간 BCMA에 결합하는 MAT-Fab 결합 단백질, 및 이의 약제학적 조성물, 뿐만 아니라 이러한 항체, 기능성 항체 단편 및 결합 단백질을 제조하기 위한 핵산, 재조합 발현 벡터 및 숙주 세포에 관한 것이다. 본 발명의 항체, 기능성 항체 단편 및 이중특이적 결합 단백질을 사용하여, 인간 CD3, 인간 BCMA 또는 이들 둘 다를 검출하고; 시험관내 또는 생체내에서 인간 CD3 및/또는 인간 BCMA 활성을 억제하고; 이들의 리간드, 즉 T 세포 수용체 및 A 증식-유도 리간드(APRIL)에 각각 결합하는 CD3 및/또는 BCMA에 의해 매개되는 질환, 특히 암을 치료하는 방법이 또한 본 발명에 포함된다.
본 명세서에서 달리 정의되지 않는 한, 본 발명과 관련하여 사용되는 과학 및 기술 용어는 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 갖는 것이다. 용어의 의미와 범위는 명확해야 하지만, 잠재적으로 모호한 경우, 본 명세서에 제공된 정의가 사전 또는 외부 정의보다 우선한다. 또한, 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 단수형에는 복수형이 포함되고, 복수형에는 단수형이 포함되어야 한다. 본 출원에서, "또는"의 사용은, 달리 명시되지 않는 한, "및/또는"을 의미한다. 추가로, 용어 "포함하는" 및 "포함하다" 및 "포함된" 등의 기타 형태의 사용은 한정적인 것은 아니다. 또한, "요소" 또는 "구성요소" 등의 용어는, 달리 구체적으로 언급되지 않는 한, 하나의 유닛을 포함하는 요소 및 구성요소, 및 하나 이상의 서브유닛을 포함하는 요소 및 구성요소 모두를 포함한다.
일반적으로, 본 명세서에 기재된 세포 및 조직 배양, 분자 생물학, 면역학, 미생물학, 유전학 및 단백질 및 핵산 화학 및 하이브리드화와 관련하여 사용되는 명명법 및 이들 기술은 당해 기술분야에 널리 공지되고 일반적으로 사용되는 것들이다. 본 발명의 방법 및 기술은 일반적으로 당해 기술분야에 공지된 종래의 방법에 따라, 특히 달리 지시되지 않는 한, 본 명세서 전체에 걸쳐 인용 및 논의되는 다양한 일반적 및 보다 구체적인 참고문헌에 기재된 바와 같이 수행된다. 효소 반응 및 정제 기술은 당해 기술분야에서 일반적으로 달성되거나, 본 명세서에 기재된 바와 같이 제조업자의 사양에 따라 수행된다. 본 명세서에 기재된 분석 화학, 합성 유기 화학, 의약 및 약학 화학과 관련하여 사용되는 명명법, 실험 절차 및 기술은 당해 기술분야에 공지되어 있고 일반적으로 사용되는 것들이다. 표준 기술은 화학 합성, 화학 분석, 의약품 제조, 제형화, 전달 및 환자의 치료에 사용된다.
본 발명을 보다 용이하게 이해할 수 있도록 선택된 용어를 하기에 정의한다.
용어 "폴리펩티드"는 아미노산의 임의의 중합체 쇄를 지칭한다. 용어 "펩티드" 및 "단백질"은 용어 폴리펩티드와 호환적으로 사용되고, 또한 아미노산의 중합체 쇄를 지칭한다. 용어 "폴리펩티드"는 천연 또는 인공의 단백질, 단백질 단편, 및 단백질 아미노산 서열의 폴리펩티드 유사체를 포함한다. 용어 "폴리펩티드"는, 문맥상 달리 모순되지 않는 한, 이의 단편 및 변이체(변이체의 단편 포함)를 포함한다. 항원성 폴리펩티드의 경우, 폴리펩티드의 단편은 임의로 폴리펩티드의 적어도 하나의 연속 또는 비선형 에피토프를 함유한다. 적어도 하나의 에피토프 단편의 정확한 경계는 당업자의 통상의 기술을 사용하여 확인할 수 있다. 단편은 적어도 약 10개의 연속 아미노산, 적어도 약 15개의 연속 아미노산, 또는 적어도 약 20개의 연속 아미노산을 포함한다. 폴리펩티드의 변이체는 본 명세서에 기재된 바와 같다.
용어 "단리된 단백질" 또는 "단리된 폴리펩티드"는, 이의 기원 또는 유래의 공급원으로 인해, 천연 상태에서 이를 수반하는 자연적으로 연관된 성분과 연관되지 않고, 동일한 종으로부터의 다른 단백질을 실질적으로 포함하지 않거나, 상이한 종의 세포에 의해 발현되거나, 자연계에서 발생하지 않는 단백질 또는 폴리펩티드이다. 따라서, 화학적으로 합성되거나 그것이 자연적으로 유래하는 세포와 상이한 세포 시스템에서 합성된 폴리펩티드는 이의 자연적으로 연관된 성분으로부터 "단리"될 것이다. 단백질은 또한 당해 기술분야에 공지된 단백질 정제 기술을 사용하여 단리에 의해 천연적으로 연관된 성분을 실질적으로 포함하지 않도록 할 수 있다.
용어 "회수"는, 예를 들면, 당해 기술분야에 공지된 단백질 정제 기술을 사용하여, 단리에 의해 폴리펩티드 등의 화학종을 자연적으로 연관된 성분을 실질적으로 포함하지 않도록 하는 프로세스를 지칭한다.
용어 "생물학적 활성"은 본 명세서에 기재된 항-CD3 또는 항-BCMA 항체의 모든 고유한 생물학적 특성을 지칭한다. CD3 항체의 생물학적 특성에는 CD3 단백질에 대한 결합이 포함되지만, 이들로 한정되지 않고; 항-BCMA 항체의 생물학적 특성에는, 예를 들면, A 증식-유도 리간드(APRIL) 및/또는 B 세포 활성화 인자(BAFF) 단백질에 대한 결합이 포함되지만, 이들로 한정되지 않는다.
항체, 결합 단백질, 또는 펩티드와 제2 화학종의 상호작용과 관련하여 용어 "특이적 결합" 또는 "특이적으로 결합하는"은 상호작용이 특정 구조(예를 들면, 제2 화학 종에 대한 항원 결정기 또는 에피토프)의 존재에 의존하는 것을 의미한다. 예를 들면, 항체는 일반적으로 단백질이 아닌 특정 단백질 구조를 인식하여 결합한다. 항체가 에피토프 "A"에 특이적인 경우, 표지된 "A"와 항체를 포함하는 반응에서 에피토프 A(또는 유리의 비표지 A)를 포함하는 분자의 존재는 항체에 결합하는 표지된 A의 양을 감소시킬 것이다.
용어 "항체"는 4개의 폴리펩티드 쇄, 2개의 중쇄(H) 및 2개의 경쇄(L)로 구성된 임의의 면역글로불린(Ig) 분자, 또는 이들의 임의의 기능적 단편, 돌연변이체, 변이체 또는 유도체를 지칭하고, 이는 Ig 분자의 필수 에피토프 결합 특징을 보유한다. 이러한 돌연변이체, 변이체 또는 유도체 항체 포맷은 당해 기술분야에 공지되어 있다. 이의 비제한적 실시형태를 하기에서 논의한다.
전장 항체에서, 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(본 명세서에서 VH로 약칭됨) 및 중쇄 불변 영역으로 구성된다. 중쇄 불변 영역은 CH1, CH2 및 CH3의 3개의 도메인으로 구성된다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(본 명세서에서 VL로 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역으로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인 CL로 구성된다. VH 및 VL 영역은 상보성 결정 영역(CDR)이라고 명명된 초가변성 영역으로 추가로 세분될 수 있고, 이는 프레임워크 영역(FR)이라고 명명된 보다 보존된 영역이 산재되어 있다. 각각의 VH 및 VL은 3개의 CDR과 4개의 FR로 구성되고, 아미노 말단으로부터 카복시 말단까지, FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4의 순서로 배치되어 있다. VH 도메인의 제1, 제2 및 제3 CDR은 통상 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3으로 열거되고; 마찬가지로, VL 도메인의 제1, 제2 및 제3 CDR은 통상 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3으로 열거된다. 면역글로불린 분자는 임의의 유형(예: IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 클래스(예: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 서브클래스일 수 있다.
용어 "Fc 영역"은 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하기 위해 사용되고, 이는 무손상 항체의 파파인 소화에 의해 생성될 수 있다. Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역 또는 변이체 Fc 영역일 수 있다. 면역글로불린의 Fc 영역은 일반적으로 2개의 불변 도메인, 즉, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하고, 예를 들면, IgM 및 IgE 항체의 Fc 영역의 경우에서와 같이 임의로 CH4 도메인을 포함한다. IgG, IgA 및 IgD 항체의 Fc 영역은 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함한다. 대조적으로, IgM 및 IgE 항체의 Fc 영역은 힌지 영역을 결여하고 있지만, CH2 도메인, CH3 도메인 및 CH4 도메인을 포함한다. 항체 이펙터 기능을 변경하기 위해 Fc 부분에서 아미노산 잔기의 치환을 갖는 변이체 Fc 영역은 당해 기술분야에 공지되어 있다[참조: 예를 들면, Winter et al., 미국 특허 제5,648,260호 및 제5,624,821호]. 항체의 Fc 부분은 몇몇 중요한 이펙터 기능, 예를 들면, 사이토카인 유도, ADCC, 식균작용, 보체 의존성 세포독성(CDC), 항체 및 항원-항체 복합체의 반감기/클리어런스율을 매개한다. 일부 경우에, 이러한 이펙터 기능은 치료용 항체에 바람직하지만, 다른 경우에는 치료 목적에 따라 불필요하거나 심지어 유해할 수도 있다. 특정 인간 IgG 아이소타입, 특히 IgG1 및 IgG3은 각각 FcγR 및 보체 C1q에 대한 결합을 통해 ADCC 및 CDC를 매개한다. 또 다른 실시형태에서, 항체의 이펙터 기능이 변화되도록, 항체의 불변 영역, 예를 들면, 항체의 Fc 영역에서 적어도 하나의 아미노산 잔기가 치환된다. 면역글로불린의 2개의 동일한 중쇄의 이량체화는 CH3 도메인의 이량체화에 의해 매개되고, CH1 불변 도메인을 Fc 불변 도메인(예: CH2 및 CH3)에 연결하는 힌지 영역 내의 디설파이드 결합에 의해 안정화된다. IgG의 항염증 활성은 IgG Fc 단편의 N-연결 글리칸의 시알릴화에 완전히 의존한다. 적절한 IgG1 Fc 단편을 생성할 수 있도록, 항염증 활성에 대한 정확한 글리칸 요건이 결정되었고, 이에 의해 효능이 대폭 증강된 완전히 재조합된 시알릴화 IgG1 Fc를 생성할 수 있다[참조: Anthony et al., Science, 320:373-376(2008)].
항체의 용어 "항원 결합 부분" 및 "항원 결합 단편" 또는 "기능적 단편"은 호환적으로 사용되고, 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편, 즉, 부분 또는 단편이 유래하는 전장 항체와 동일한 항원(예: CD3, BCMA)을 지칭한다. 항체의 항원 결합 기능은 전장 항체의 단편에 의해 수행될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 이러한 항체의 실시형태는 또한 이중특이적, 이중 특이적 또는 다중-특이성 포맷일 수 있고; 2개 이상의 상이한 항원(예: CD3 및 BCMA 등의 상이한 항원)에 특이적으로 결합한다. 항체의 용어 "항원 결합 부분"에 포함되는 결합 단편의 예에는 (i) Fab 단편, VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 1가 단편; (ii) F(ab')2 단편, 힌지 영역에서 디설파이드 브릿지에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 아암(arm)의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편, (v) 단일 가변 도메인을 포함하는 dAb 단편[참조: Ward et al., Nature, 341:544-546 (1989); PCT 공개공보 제WO 90/05144호]; 및 (vi) 단리된 상보성 결정 영역(CDR)이 포함된다. 추가로, Fv 단편의 2개 도메인, VL 및 VH는 별도의 유전자에 의해 코딩되지만, 재조합 방법을 사용하여, VL 및 VH 영역이 쌍을 이루어 1가 분자를 형성하는 단일 단백질 쇄로서 이들을 제조하는 것을 가능하게 하는 합성 링커에 의해 결합될 수 있다(일본쇄 Fv(scFv)로 공지됨; 예를 들면, 문헌[참조: Bird et al., Science, 242: 423-426(1988); and Huston et al., Proc. Natl. Acad Sci.USA, 85: 5879-5883 (1988)]). 이러한 일본쇄 항체는 또한 항체의 용어 "항원-결합 부분" 및 상기 기재된 동등한 용어 내에 포함되는 것으로 의도된다. 디아바디 등의 기타 형태의 일본쇄 항체도 포함된다. 디아바디는, VH 및 VL 도메인이 단일 폴리펩티드 쇄에서 발현되는 2가의 이중특이적 항체이지만, 동일한 쇄 상의 2개의 도메인 사이에 페어링하기에는 너무 짧은 링커를 사용하고, 이에 의해 도메인은 또 다른 쇄의 상보적 도메인과 페어링되고 2개의 항원 결합 부위를 생성한다[참조: 예를 들면, Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993)]. 이러한 항체 결합 부분은 당해 기술분야에 공지되어 있다[참조: Kontermann and Dubel eds., Antibody Engineering (Springer-Verlag, New York, 2001), p.790 (ISBN 3-540-41354-5)]. 추가로, 일본쇄 항체에는, 상보적 경쇄 폴리펩티드와 함께 한 쌍의 항원 결합 영역을 형성하는 탠덤 Fv 세그먼트(VH-CH1-VH-CH1)를 포함하는 "선형 항체"가 포함된다[참조: Zapata et al., Protein Eng., 8(10): 1057-1062(1995) 및 미국 특허 제5,641,870호].
면역글로불린 불변(C) 도메인은 중쇄(CH) 또는 경쇄(CL)의 불변 도메인을 지칭한다. 뮤린 및 인간 IgG 중쇄 및 경쇄 불변 도메인 아미노산 서열은 당해 기술분야에 공지되어 있다.
용어 "모노클로날 항체" 또는 "mAb"는 실질적으로 균질한 항체 모집단으로부터 수득된 항체를 지칭하고, 즉 모집단을 포함하는 개별 항체는, 소량으로 존재할 수 있는 가능한 천연 존재 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 모노클로날 항체는 매우 특이적이고, 단일 항원 결정기(에피토프)에 대해 지시되어 있다. 추가로, 상이한 결정기(에피토프)에 대해 지시된 상이한 항체를 통상 포함하는 폴리클로날 항체 조제물과 대조적으로, 각각의 mAb는 항원 상의 단일 결정기에 대해 지시되어 있다. 수식어 "모노클로날"은 임의의 특정 방법에 의한 항체의 생산을 필요로 하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
용어 "인간 항체"는 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유래하는 가변 및 불변 영역을 갖는 항체를 포함한다. 본 발명의 인간 항체는, 예를 들면, CDR 및 특히 CDR3에서 인간 생식계열 면역글로불린 서열에 의해 코딩되지 않은 아미노산 잔기(예를 들면, 시험관내 랜덤 또는 부위-특이적 돌연변이유발에 의해 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다. 그러나, 용어 "인간 항체"는, 마우스 등의 다른 포유동물 종의 생식세포 계열로부터 유래하는 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열에 이식되어 있는 항체를 포함하지 않는다.
용어 "재조합 인간 항체"는, 숙주 세포로 형질감염된 재조합 발현 벡터를 사용하여 발현된 항체, 재조합, 조합 인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체[참조: Hoogenboom, H.R., Trends Biotechnol., 15: 62-70(1997), Azzazy and Highsmith, Clin. Biochem., 35: 425-445(2002), Gavilondo and Larrick, BioTechniques, 29: 128-145 (2000); Hoogenboom and Chames, Immunol. Today, 21: 371-378 (2000)], 인간 면역글로불린 유전자에 대해 형질전환된 동물(예: 마우스)로부터 단리된 항체[참조: 예를 들면, Taylor et al., Nucl. Acids Res., 20: 6287-6295 (1992), Kellermann and Green, Curr. Opin. Biotechnol., 13: 593-597 (2002); Little et al., Immunol. Today, 21: 364-370 (2000)]; 또는 인간 면역글로불린 유전자 서열을 다른 DNA 서열에 스플라이싱하는 것을 포함하는 임의의 다른 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 항체 등의 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 모든 인간 항체를 포함한다. 이러한 재조합 인간 항체는 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유래하는 가변 및 불변 영역을 갖는다. 그러나, 특정 실시형태에서, 이러한 재조합 인간 항체는 시험관내 돌연변이유발(또는 인간 Ig 서열에 대한 유전자도입 동물이 사용되는 경우, 생체내 체세포 돌연변이유발)에 제공되고, 따라서 재조합체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열은, 인간 생식계열 VH 및 VL 서열로부터 유래하고 관련되지만, 생체내 인간 항체 생식계열 레퍼토리 내에 자연적으로 존재하지 않을 수 있는 서열이다.
용어 "키메라 항체"는 한 종으로부터의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열 및 다른 종으로부터의 불변 영역 서열을 포함하는 항체, 예를 들면, 인간 불변 영역에 연결된 뮤린 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 갖는 항체를 지칭한다.
용어 "CDR-이식된 항체"는 한 종으로부터의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하지만, 여기서 VH 및/또는 VL의 CDR 영역 중 하나 이상의 서열은 다른 종으로부터의 CDR 서열로 치환된 항체, 예를 들면, 인간 CDR 중 하나 이상이 뮤린 CDR 서열로 치환된 인간 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 갖는 항체를 지칭한다.
용어 "인간화 항체"는 비인간 종(예: 마우스)으로부터의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하지만 VH 및/또는 VL 서열의 적어도 일부가 더 "인간-유사한", 즉 인간 생식계열 가변 서열과 더 유사하도록 변경되어 있는 항체를 지칭한다. 인간화 항체의 한 유형은 CDR 이식 항체이고, 여기서 비인간 종(예를 들면, 마우스)로부터의 CDR 서열은 인간 VH 및 VL 프레임워크 서열 내로 도입된다. 인간화 항체는, 목적 항원에 면역특이적으로 결합하고 실질적으로 인간 항체의 아미노산 서열을 갖는 프레임워크 영역 및 불변 영역, 그러나 실질적으로 비-인간 항체의 아미노산 서열을 갖는 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 이의 변이체, 유도체, 유사체 또는 단편이다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, CDR의 문맥에서 용어 "실질적으로"는 비-인간 항체 CDR의 아미노산 서열에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 CDR을 지칭하다. 인간화 항체는 적어도 하나, 및 통상 2개의 가변 도메인(Fab, Fab', F(ab')2, Fv)의 전부를 실질적으로 포함하고, 여기서 CDR 영역의 전부 또는 실질적으로 전부가 비-인간의 것에 대응하고, 프레임워크 영역의 전부 또는 실질적으로 전부가 인간 면역글로불린 컨센서스 서열의 것이다. 일 실시형태에서, 인간화 항체는 또한 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부, 전형적으로 인간 면역글로불린의 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 인간화 항체에는 경쇄 및 적어도 중쇄의 가변 도메인 둘 다가 함유된다. 항체는 또한 중쇄의 CH1, 힌지, CH2, CH3, 및 CH4 영역을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 인간화 항체에는 인간화 경쇄만이 함유된다. 일부 실시형태에서, 인간화 항체는 인간화 중쇄만을 함유한다. 특정 실시형태에서, 인간화 항체는 경쇄 및/또는 인간화 중쇄의 인간화 가변 도메인만을 함유한다.
인간화 항체는 IgM, IgG, IgD, IgA 및 IgE를 포함하는 임의 클래스의 면역글로불린, 및 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함하지만 이들로 한정되지 않는 임의의 아이소타입으로부터 선택될 수 있다. 인간화 항체는 하나 이상의 클래스 또는 이소타입으로부터의 서열을 포함할 수 있고, 특정 불변 도메인은 당해 기술분야에 널리 공지된 기술을 사용하여 목적하는 이펙터 기능을 최적화하도록 선택될 수 있다.
인간화 항체의 프레임워크 및 CDR 영역은 모 서열과 정확히 대응할 필요는 없고, 예를 들면, 공여자 항체 CDR 또는 수용체 프레임워크는 CDR이 적어도 하나의 아미노산 잔기의 치환, 삽입 및/또는 결실에 의해 돌연변이될 수 있고, 따라서 해당 부위의 프레임워크 잔기는 공여자 항체 또는 컨센서스 프레임워크에 대응하지 않는다. 그러나, 예시적 실시형태에서, 이러한 돌연변이는 광범위하지 않을 것이다. 통상, 인간화 항체 잔기의 적어도 80%, 예를 들면, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%는 모 FR 및 CDR 서열의 잔기에 대응할 것이다. 공여자 항체의 해당 위치에 나타나는 동일한 아미노산을 회복하기 위한 특정 프레임워크 위치에서의 역돌연변이는 종종 특정 루프 구조를 보존하거나, 표적 항원과의 접촉을 위한 CDR 서열의 정확한 배향을 위해 이용된다.
용어 "CDR"은 항체 가변 도메인 서열 내의 상보성 결정 영역을 지칭한다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 각각에는 3개의 CDR이 있고, 이는 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3으로 지정된다. 본 명세서에 사용된 용어 "CDR 세트"는 항원에 결합할 수 있는 단일 가변 영역에서 발생하는 3개의 CDR의 그룹을 지칭한다. 이러한 CDR의 정확한 경계는 상이한 시스템에 따라 정의가 상이하다. 카바트[참조: Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Maryland (1987) and (1991)]에 의해 기술된 시스템은 항체의 임의의 가변 영역에 적용할 수 있는 명확한 잔기 넘버링 시스템을 제공할 뿐만 아니라, 또한 3개의 CDR을 정의하는 정확한 잔기 경계를 제공한다.
당해 기술분야에서 인식되고 있는 용어 "카바트 넘버링"은, 항체 또는 이의 항원-결합 부분의 중쇄 및 경쇄 가변 영역에서 다른 아미노산 잔기보다 더 가변성(즉, 초가변성)인 아미노산 잔기의 넘버링 시스템을 지칭한다[참조: 예를 들면, Kabat et al., Ann. NY Acad. Sci., 190: 382-391 (1971); and Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242 (1991)].
과거 20년 동안 가변 중쇄 및 경쇄 영역의 아미노산 서열에 대한 광범위한 공개 데이터베이스의 성장 및 분석은, 가변 영역 서열 내의 프레임워크 영역(FR)과 CDR 서열 사이의 전형적 경계에 대한 이해를 유도했고, 숙련된 기술자가 카바트 넘버링, 초티아 넘버링, 또는 기타 시스템에 따라 CDR을 정확하게 결정하는 것을 가능하게 했다[참조: 예를 들면, Martin, "Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains," In Kontermann and Dubel, eds., Antibody Engineering (Springer-Verlag, Berlin, 2001), chapter 31, pages 432-433].
용어 "다가 결합 단백질"은 2개 이상의 항원 결합 부위를 포함하는 결합 단백질을 의미한다. 다가 결합 단백질은 바람직하게는 3개 이상의 항원 결합 부위를 갖도록 조작되고, 일반적으로 자연에 존재하는 항체가 아니다. 용어 "이중특이적 결합 단백질"은 상이한 특이성을 갖는 2개의 표적에 결합할 수 있는 결합 단백질을 지칭한다. 본 발명의 "탠덤 Fab(Fab-in-Tandem) 면역글로불린"(FIT-Ig) 결합 단백질은 2개 이상의 항원 결합 부위를 포함하고, 전형적으로 4가 결합 단백질이다. FIT-Ig는 단일특이적(즉, 하나의 항원에 결합할 수 있음) 또는 다중특이적(즉, 2개 이상의 항원에 결합할 수 있음)일 수 있다. 본 발명에 따른 예시적 FIT-Ig는 CD3 및 BCMA 모두에 결합하고, 따라서 이중특이적이다. 2개의 긴(중) V-C-V-C-Fc 쇄 폴리펩티드와 4개의 짧은(경) V-C 쇄 폴리펩티드를 포함하는 FIT-Ig 결합 단백질은 4개의 Fab 항원 결합 부위(VL-CL과 쌍을 이루는 VH-CH1, 때때로 VH-CH1::VL-CL로 표기됨)를 나타내는 6량체를 형성한다. FIT-Ig의 각 절반은 중쇄 폴리펩티드 및 2개의 경쇄 폴리펩티드를 포함하고, 3개 쇄의 VH-CH1 및 VL-CL 요소의 상보적 면역글로불린 쌍은 탠덤으로 배치된 2개의 Fab-구조의 항원 결합 부위를 생성한다. 본 발명에서, Fab 요소를 포함하는 면역글로불린 도메인은 도메인간 링커를 사용하지 않고서 중쇄 폴리펩티드에 직접 융합되는 것이 바람직하다. 즉, 긴(중) 폴리펩티드 쇄의 N-말단 V-C 요소는 이의 C-말단에서 다른 V-C 요소의 N-말단에 직접 융합되고, 이는 또한 C-말단 Fc 영역에 연결된다. 이중특이적 FIT-Ig 결합 단백질에서, 탠덤 Fab 요소는 상이한 항원과 반응성일 것이다. 각각의 Fab 항원 결합 부위는, 항원 결합 부위당 합계 6개의 CDR을 갖는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 다가 결합 단백질은 FIT-Ig Fab 단편(즉, FIT-Fab)이고, 이는 실질적으로 C-말단 Fc 영역을 갖지 않는 FIT-Ig이다. 이러한 FIT-Fab은 기존의 FIT-Ig로부터 C-말단 Fc 영역을 제거함으로써 수득할 수 있거나, 또는 당해 기술분야에 공지된 임의의 다수의 기술에 의해, 예를 들면, 대응하는 펩티드 쇄를 코딩하는 발현 벡터(들)를 포함하는 숙주 세포로부터의 발현에 의해 생성될 수 있다.
FIT-Ig 분자의 설계, 발현 및 특성화에 대한 설명은 PCT 공보 WO 제2015/103072호에 제공되어 있다. 이러한 FIT-Ig 분자의 예는 중쇄 및 2개의 상이한 경쇄를 포함한다. 중쇄는 구조식 VLA-CL-VHB-CH1-Fc(여기서, CL은 VHB에 직접 융합됨) 또는 VHB-CH1-VLA-CL-Fc(여기서, CH1은 VLA에 직접 융합되고, VLA는 항원 A에 결합하는 모 항체로부터의 가변 경쇄 도메인이고, VHB는 항원 B에 결합하는 모 항체의 가변 중쇄 도메인이고, CL은 경쇄 불변 도메인이고, CH1은 중쇄 불변 도메인이고, Fc는 면역글로불린 Fc 영역(예: IgG1 항체의 중쇄의 C-말단 힌지-CH2-CH3 부분)이다)을 포함한다. FIT-Ig의 2개의 경쇄 폴리펩티드는 각각 VHA-CH1 및 VLB-CL의 화학식을 갖는다. 이중특이적 FIT-Ig 실시형태에서, 항원 A 및 항원 B는 상이한 항원, 또는 동일한 항원의 상이한 에피토프이다. 본 발명에서, A와 B 중 하나는 CD3이고 다른 하나는 BCMA이다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "직접 융합된" 또는 "직접 융합된"은, 폴리펩티드 구조에서 2개 도메인의 선형 연결을 지칭하는 경우, 인공 폴리펩티드 링커 또는 커넥터(connector)를 사용하지 않고서, 도메인이 펩티드 결합에 의해 직접 연결되는 것을 의미한다.
용어 "활성"은 표적 항원에 특이적으로 결합하는 능력, 항원에 대한 항체의 친화성, 표적 항원의 생물학적 활성을 중화시키는 능력, 표적 항원과 이의 천연 수용체(들)과의 상호작용을 억제하는 능력 등의 특성을 포함한다. 본 발명의 예시적 항체 및 결합 단백질은, 본 명세서에 기재된 이중특이적 결합 단백질의 경우, 이의 리간드에 대한 CD3 결합을 억제하는 능력, 이의 리간드에 대한 BCMA 결합을 억제하는 능력, 또는 이들 둘 모두를 갖는다.
본 명세서에 사용된 용어 "kon"(또한 "Kon", "kon")은 결합 단백질(예를 들면, 항체)를 항원에 결합시켜 회합 복합체, 예를 들면, 당해 기술분야에 공지된 바와 같은 항체/항원 복합체를 형성하기 위한 온 속도 상수를 지칭한다. "kon"은 또한 본 명세서에서 호환적으로 사용되는 용어 "회합 속도 상수" 또는 "ka"로 공지되어 있다. 이 값은, 하기 방정식에 의해 제시된 바와 같이, 항체가 표적 항원에 결합하는 속도 또는 항체와 항원 사이의 복합체 형성 속도를 나타낸다:
항체("Ab") + 항원("Ag")→Ab-Ag.
본 명세서에 사용된 용어 "koff"(또한 "Koff", "koff")는, 당해 기술분야에 공지된 바와 같은 회합 복합체(예를 들면, 항체/항원 복합체)로부터 결합 단백질(예를 들면, 항체)의 해리에 대한 오프 속도 상수 또는 "해리 속도 상수"를 지칭하는 것을 의도한다. 이 값은, 하기 방정식에 의해 제시된 바와 같이, 표적 항원으로부터 항체의 해리 속도 또는 시간 경과에 따른 유리 항체 및 항원에 대한 Ab-Ag 복합체의 분리를 나타낸다.
Ab + Ag←Ab-Ag.
본 명세서에 사용된 용어 "KD"(또한 "Kd")는 "평형 해리 상수"를 지칭하는 것을 의도하고, 평형에서의 적정 측정에서 또는 해리 속도 상수(koff)를 회합 속도 상수(kon)에 의해 나눔으로써 수득된 값을 지칭한다. 회합 속도 상수(kon), 해리 속도 상수(koff) 및 평형 해리 상수(KD)는 항원에 대한 항체의 결합 친화성을 나타내기 위해 사용된다. 회합 및 해리 속도 상수를 결정하는 방법은 당해 기술분야에 공지되어 있다. 형광 기반 기술을 사용하면, 높은 감도와 평형 상태에서 생리학적 완충액의 샘플을 검사할 수 있다. BIAcore®(생체분자 상호작용 분석) 검정 등의 기타 실험 접근법 및 기기가 사용될 수 있다(예를 들면, 스웨덴 웁살라 소재의 GE Healthcare 컴파니, BIAcore International AB로부터 입수가능한 기기). 예를 들면, Octet® RED96 시스템(Pall ForteBio LLC)을 사용하는 생물층 간섭계(BLI)는 또 다른 친화성 검정 기술이다. 추가적으로, 사피딘 인스트루먼츠(Sapidyne Instruments)(Boise, Idaho)로부터 입수가능한 KinExA®(Kinetic Exclusion Assay) 검정이 또한 사용될 수 있다.
용어 "단리된 핵산"은, 인간 개입에 의해, 그것이 자연적으로 발견되는 폴리뉴클레오티드의 전부 또는 일부와 연관되지 않는 폴리뉴클레오티드(예: 게놈, cDNA 또는 합성 기원, 또는 이들의 일부 조합)를 의미하고; 자연적으로 연결되지 않은 폴리뉴클레오티드에 작동적으로 연결되거나; 또는 더 큰 서열의 일부로서 자연계에서 발생하지 않는다.
본 명세서에 사용된 용어 "벡터"는, 그것이 연결된 또 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 지칭하는 것을 의도한다. 벡터의 한 유형은 "플라스미드"이고, 이는 추가 DNA 세그먼트가 결찰될 수 있는 환상 이중쇄 DNA 루프를 지칭한다. 또 다른 유형의 벡터는 바이러스 벡터이고, 여기서 추가 DNA 세그먼트는 바이러스 게놈에 결찰될 수 있다. 특정 벡터는 이들이 도입된 숙주 세포에서 자율 복제할 수 있다(예를 들면, 세균의 복제 기점을 갖는 세균 벡터 및 에피솜 포유동물 벡터). 다른 벡터(예를 들면, 비-에피솜 포유동물 벡터)는 숙주 세포 내로의 도입시에 숙주 세포의 게놈 내로 통합될 수 있고, 이에 의해 숙주 게놈과 함께 복제된다. 더욱이, 특정 벡터는 이들이 작동적으로 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 본 명세서에서 "재조합 발현 벡터"(또는 간단히 "발현 벡터")로 지칭된다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에서 유용한 발현 벡터는 종종 플라스미드의 형태이다. 본 명세서에서, "플라스미드" 및 "벡터"는 플라스미드가 가장 일반적으로 사용되는 벡터 형태이기 때문에 호환적으로 사용될 수 있다. 그러나, 본 발명은, 동등한 기능을 하는 바이러스 벡터(예를 들면, 복제 결함 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-연관 바이러스) 등의 기타 형태의 발현 벡터를 포함하는 것을 의도한다.
용어 "작동적으로 연결된"은 기재된 성분이 이들의 의도된 방식으로 기능하는 것을 가능하게 하는 관계에 있는 병치를 지칭한다. 코딩 서열에 "작동적으로 연결된" 조절 서열은 코딩 서열의 발현이 조절 서열과 양립할 수 있는 조건하에 달성되는 방식으로 결찰된다. "작동적으로 연결된" 서열은 목적 유전자와 인접하는 발현 조절 서열 및 목적 유전자를 조절하기 위해 트랜스 또는 거리를 두고 작용하는 발현 조절 서열 모두를 포함한다. 본 명세서에 사용된 용어 "발현 조절 서열"은 이들이 결찰된 코딩 서열의 발현 및 프로세싱을 달성하기 위해 필요한 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 발현 조절 서열에는 적절한 전사 개시, 종결, 프로모터 및 인핸서 서열; 스플라이싱 및 폴리아데닐화 신호 등의 효율적 RNA 프로세싱 신호; 세포질 mRNA를 안정화시키는 서열; 번역 효율성을 증강시키는 서열(즉, Kozak 컨센서스 서열); 단백질 안정성을 증강시키는 서열; 및 필요에 따라, 단백질 분비를 증강시키는 서열이 포함된다. 이러한 조절 서열의 성질은 숙주 생물에 따라 상이하고, 원핵생물에서 이러한 조절 서열에는 일반적으로 프로모터, 리보솜 결합 부위 및 전사 종결 서열이 포함되고; 진핵생물에서 일반적으로 이러한 조절 서열에는 프로모터 및 전사 종결 서열이 포함된다. 용어 "조절 서열"은 이의 존재가 발현 및 프로세싱에 필수적인 성분을 포함하는 것을 의도하고, 또한 이의 존재가 유리한 추가 성분, 예를 들면, 리더 또는 신호 서열 및 융합 파트너 서열을 포함할 수 있다.
본 명세서에 정의된 "형질전환"은 외인성 DNA가 숙주 세포에 진입하는 임의의 프로세스를 지칭한다. 형질전환은 당해 기술분야에 공지되어 있는 다양한 방법을 사용하여 자연적 또는 인공적 조건하에서 발생할 수 있다. 형질전환은 원핵 또는 진핵 숙주 세포에 외래 핵산 서열을 삽입하기 위한 임의의 공지된 방법에 의존할 수 있다. 이 방법은 형질전환되는 숙주 세포를 기반으로 선택되고, 형질감염, 바이러스 감염, 전기천공, 리포펙션 및 입자 충격을 포함할 수 있지만, 이들로 한정되지 않는다. 이러한 "형질전환된" 세포에는 삽입된 DNA가 자가 복제 플라스미드로서 또는 숙주 염색체의 일부로서 복제할 수 있는 안정적으로 형질전환된 세포가 포함된다. 또한, 삽입된 DNA 또는 RNA를 제한된 시간 동안 일시적으로 발현하는 세포를 포함한다.
용어 "재조합 숙주 세포"(또는 간단히 "숙주 세포")는 외인성 DNA가 도입된 세포를 지칭하는 것을 의도한다. 일 실시형태에서, 숙주 세포는, 예를 들면, 미국 특허 제7,262,028호에 기재된 숙주 세포 등의 항체를 코딩하는 2개 이상(예를 들면, 다중) 핵산을 포함한다. 이러한 용어는 특정 대상체 세포뿐만 아니라, 이러한 세포의 자손도 지칭하는 것을 의도한다. 돌연변이 또는 환경적 영향으로 인해, 특정 변형이 후속 세대에서 발생할 수 있기 때문에, 이러한 자손은 실제로는 모 세포와 동일하지 않을 수 있지만, 본 명세서에서 사용되는 용어 "숙주 세포"의 범위에는 여전히 포함된다. 일 실시형태에서, 숙주 세포에는 임의의 생명의 왕국으로부터 선택된 원핵 및 진핵 세포가 포함된다. 또 다른 실시형태에서, 진핵 세포에는 원생생물, 진균, 식물 및 동물 세포가 포함된다. 또 다른 실시형태에서, 숙주 세포에는 원핵 세포주 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli); 포유동물 세포주 CHO, HEK 293, COS, NS0, SP2 및 PER.C6; 곤충 세포주 Sf9; 및 진균 세포 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae)가 포함되지만, 이들로 한정되지 않는다.
표준 기술은 재조합 DNA, 올리고뉴클레오티드 합성, 조직 배양 및 형질전환(예: 전기천공, 리포펙션)에 사용될 수 있다. 효소 반응 및 정제 기술은 제조업자의 사양에 따라, 또는 당해 기술분야에서 일반적으로 달성되는 바와 같이, 또는 본 명세서에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다. 전술한 기술 및 절차는 일반적으로 당해 기술분야에 공지된 종래의 방법에 따라 및 본 명세서 전체에 걸쳐 인용 및 논의되는 다양한 일반적 및 보다 구체적 참고문헌에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다[참조: 예를 들면, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989)].
본 명세서에 사용된 용어 "작용제"는, 목적 분자와 접촉할 때에, 분자의 특정 활성 또는 기능의 크기를 작용제의 부재하에 관찰된 활성 또는 기능의 크기와 비교하여 증가시키는 조절제를 지칭한다. 본 명세서에 사용된 용어 "길항제" 및 "억제제"는, 목적 분자와 접촉될 때에, 길항제의 부재하에 관찰된 활성 또는 기능의 크기와 비교하여 분자의 특정 활성 또는 기능의 크기의 감소를 유발하는 조절제를 지칭한다. 목적의 특정 길항제는 인간 CD3 및 인간 BCMA의 생물학적 또는 면역학적 활성을 차단 또는 감소시키는 길항제를 포함한다.
본 명세서에 사용된 용어 "유효량"은, 장애 또는 이의 하나 이상의 증상의 중증도 및/또는 기간을 감소 또는 개선하거나; 장애의 진행을 방지하거나; 장애의 퇴행을 유발하거나; 장애와 관련된 하나 이상의 증상의 재발, 발증 또는 진행을 예방하거나; 장애를 검출하거나; 또는 다른 요법(예를 들면, 예방제 또는 치료제)의 예방 또는 치료 효과(들)를 증강 또는 개선하기에 충분한 치료제의 양을 지칭한다.
항-CD3 및 항-
BCMA
항체의 생산
본 발명의 항-CD3 및 항-BCMA 항체는 당해 기술분야에 공지된 임의의 다수의 기술에 의해 생성될 수 있다. 예를 들면, 숙주 세포로부터의 발현, 여기서 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 발현 벡터(들)는 표준 기술에 의해 숙주 세포 내로 형질감염된다. 용어 "형질감염"의 다양한 형태는 원핵생물 또는 진핵생물의 숙주 세포에 대한 외인성 DNA의 도입에 일반적으로 사용되는 광범위한 기술, 예를 들면, 전기천공법, 인산칼슘 침전, DEAE-덱스트란 형질감염 등을 포함하는 것을 의도한다. 본 발명의 항체를 원핵 또는 진핵 숙주 세포에서 발현하는 것이 가능하지만, 진핵 세포(및 특히 포유동물 세포)는 원핵 세포보다 적절하게 폴딩된 및 면역학적 활성 항체를 조립하고 분비할 가능성이 있기 때문에, 진핵 세포, 예를 들면, 포유동물 숙주 세포에서 항체의 발현이 바람직하다.
본 발명의 재조합 항체를 발현하기 위한 예시적 포유동물 숙주 세포에는 차이니즈 햄스터 난소(CHO 세포)(예를 들면, 문헌[참조: Kaufman and Sharp, J. Mol. Biol., 159: 601-621 (1982)]에 기재된 바와 같이 DHFR 선택가능한 마커와 함께 사용되는, 문헌[참조: Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4216-4220 (1980)]에 기재된 dhfr-CHO 세포 포함), NS0 골수종 세포, COS 세포, 및 SP2 세포가 포함된다. 항체 유전자를 코딩하는 재조합 발현 벡터가 포유동물 숙주 세포에 도입되는 경우, 항체는 숙주 세포에서 항체의 발현 또는 숙주 세포가 성장하는 배양 배지 내로 항체의 분비를 가능하게 하기에 충분한 기간 동안 숙주 세포를 배양함으로써 생산된다. 항체는 표준 단백질 정제 방법을 사용하여 배양 배지로부터 회수할 수 있다.
숙주 세포는 또한 Fab 단편 또는 scFv 분자 등의 기능적 항체 단편을 생산하기 위해 사용될 수 있다. 상기 절차에 대한 변형은 본 발명의 범위 내에 있음이 이해될 것이다. 예를 들면, 본 발명의 항체의 경쇄 및/또는 중쇄의 기능적 단편을 코딩하는 DNA로 숙주 세포를 형질감염시키는 것이 바람직할 수 있다. 재조합 DNA 기술을 또한 사용하여, 목적 항원에 대한 결합에 필요하지 않은 경쇄 및 중쇄 중 하나 또는 둘 다를 코딩하는 DNA의 일부 또는 전부를 제거할 수 있다. 이러한 절단된 DNA 분자로부터 발현되는 분자는 또한 본 발명의 항체에 포함된다. 또한, 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄가 본 발명의 항체이고, 다른 중쇄 및 경쇄가 표준적 화학 가교결합 방법에 의해 본 발명의 항체를 제2 항체에 가교결합시킴으로써 목적하는 항원 이외의 항원에 특이적인, 이기능성 항체가 생산될 수 있다.
본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 부분의 재조합 발현을 위한 예시적 시스템에서, 항체 중쇄 및 항체 경쇄 둘 다를 코딩하는 재조합 발현 벡터는 인산칼슘 매개 형질감염에 의해 dhfr- CHO 세포 내로 도입된다. 재조합 발현 벡터 내에서, 항체 중쇄 및 경쇄 유전자는 각각 CMV 인핸서/AdMLP 프로모터 조절 요소에 작동적으로 연결되어 유전자의 높은 수준의 전사를 유도한다. 재조합 발현 벡터는 또한 DHFR 유전자를 운반하고, 이는 메토트렉세이트 선택/증폭을 사용하여 벡터로 형질감염된 CHO 세포의 선택을 가능하게 한다. 선택된 형질감염된 숙주 세포는 항체 중쇄 및 경쇄의 발현을 가능하게 하도록 배양되고, 무손상 항체가 배양 배지로부터 회수된다. 표준 분자 생물학 기술을 사용하여, 재조합 발현 벡터를 제조하고, 숙주 세포를 형질감염시키고, 형질감염체를 선택하고, 숙주 세포를 배양하고, 배양 배지로부터 항체를 회수한다. 추가로, 본 발명은, 본 발명의 재조합 항체가 생산될 때까지 본 발명의 형질감염된 숙주 세포를 적합한 배양 배지에서 배양함으로써 본 발명의 재조합 항-CD3 또는 항-BCMA 항체를 제조하는 방법을 제공한다. 이 방법은 배양 배지로부터 재조합 항체를 단리하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
CD3 및
BCMA에
결합하는
이중특이적
FIT-Ig의 생산
본 발명은 CD3 및 BCMA 둘 다에 결합하는 탠덤 Fab 면역글로불린 결합 단백질(FIT-Ig)을 제공한다. 이러한 FIT-Ig 분자의 예시적 실시형태는 (1) 구조식 (i) VLA-CL-VHB-CH1-Fc(여기서, CL은 VHB에 직접 융합됨) 또는 구조식 (ii) VHB-CH1-VLA-CL-Fc(여기서, CH1은 VLA에 직접 융합됨)을 포함하는 중쇄 폴리펩티드; (2) 화학식 VHA-CH1의 경쇄 폴리펩티드; 및 (3) 화학식 VLB-CL의 또 다른 경쇄 폴리펩티드를 포함하고,
여기서, VL은 경쇄 가변 도메인이고, CL은 경쇄 불변 도메인이고, VH는 중쇄 가변 도메인이고, CH1은 중쇄 불변 도메인이고, Fc는 면역글로불린 Fc 영역이고, A는 CD3 또는 BCMA의 에피토프이고, B는 CD3 또는 BCMA의 에피토프이고, 단 A와 B는 상이하다. 본 발명에 따르면, 이러한 FIT-Ig 결합 단백질은 CD3 및 BCMA 모두에 결합한다.
적합한 숙주 세포에서 재조합적으로 발현되는 경우, FIT-Ig의 3개 쇄는 통상 천연 면역글로불린과 동일한 방식으로 6-쇄, 다가, 단량체 단백질로 회합하고, 여기서 이러한 중쇄 중 2개(1), 이러한 경쇄 중 2개(2) 및 이러한 경쇄 중 2개(3)는 회합하여, 4개의 기능적 Fab 항원 결합 부위를 나타내는 6쇄 결합 단백질 단량체를 형성한다. 이러한 FIT-Ig 결합 단백질은 2개의 동일한 서브유닛을 포함하고, 여기서 각각의 서브유닛은 하나의 중쇄(1), 하나의 경쇄(2) 및 하나의 경쇄(3)를 포함하고, 이들은 함께 탠덤으로 배열된 한 쌍의 Fab 결합 부위를 형성한다. 2개의 이러한 중쇄 서브유닛의 Fc 영역의 쌍 형성은, 합계 4개의 기능적 Fab 결합 유닛을 갖는 본 발명의 6쇄 이중특이적 FIT-Ig 결합 단백질을 제공한다.
중쇄 상의 펩티드 링커를 사용하여 탠덤으로 연결된 Fab 모이어티를 분리하는 것이 가능하지만, 본 발명에 따른 이중특이적 FIT-Ig의 경우에는 이러한 링커 서열의 생략이 바람직하다. 탠덤 결합 부위를 갖는 다가 조작된 면역글로불린 포맷에서, 가요성 링커를 사용하여 결합 부위를 공간적으로 분리하지 않는 한, 인접한 결합 부위가 서로 간섭할 것이라는 것이 당해 기술분야에서 일반적으로 이해되었다. 그러나, 본 발명의 BCMA/CD3 FIT-Ig의 경우에, 상기 제공된 쇄 화학식에 따른 면역글로불린 도메인의 배열은 형질감염된 포유동물 세포에서 충분히 발현되고, 적절하게 조립되고, 표적 항원 CD3 및 BCMA에 결합하는 이중특이적 다가 면역글로불린-유사 결합 단백질로서 분비되는 폴리펩티드 쇄를 생성한다는 것이 발견되었다. Fab 결합 부위 사이에 링커 서열이 없음에도 불구하고, 본 발명의 BCMA/CD3 FIT-Ig는 표적 항원에 대한 결합 친화성을 보유하여, 모 mAb에 필적하는 결합 친화성을 나타낸다. 더욱이, 결합 단백질로부터 합성 링커 서열의 생략은 포유동물 면역계에 의해 인식될 수 있는 항원 부위의 생성을 회피할 수 있고, 이러한 방식으로 링커의 제거는 FIT-Ig의 가능한 면역원성을 감소시키고, 천연 항체와 같이 순환 중의 반감기를 유도하고, 즉, FIT-Ig는 면역 옵소닌작용 및 간에서 포획을 통해 급속하게 제거되지 않는다.
FIT-Ig의 각 가변 도메인(VH 또는 VL)은 표적 항원 중 하나, 즉 CD3 또는 BCMA에 결합하는 하나 이상의 "모" 모노클로날 항체로부터 수득될 수 있다. FIT-Ig 결합 단백질은 유리하게는 본 명세서에 개시된 항-CD3 및 항-BCMA 모노클로날 항체의 가변 도메인 서열을 사용하여 생산된다. 예를 들면, 모 항체는 인간화 항체이다. 가변 도메인은 또한 친화성 성숙 기술을 사용하여 제조 또는 개선될 수 있다.
본 발명의 태양은 FIT-Ig 분자에서 목적하는 적어도 하나 이상의 특성을 갖는 모 항체를 선택하는 것에 관한 것이다. 일 실시형태에서, 항체 특성은 항원 특이성, 항원에 대한 친화성, 효능, 생물학적 기능, 에피토프 인식, 안정성, 용해도, 생산 효율, 면역원성의 결여, 약동학, 생체이용률, 조직 교차 반응성, 및 이종 항원 결합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. CD3 및 BCMA는 둘 다 세포 표면 단백질이고, 각각의 리간드와의 상호작용은 세포내 신호 전달 경로에 영향을 미치고; 따라서, 본 발명의 최적 이중특이적 BCMA/CD3 FIT-Ig 및 FIT-Fab는 CD3-매개 및/또는 BCMA-매개 신호전달을 억제 또는 차단할 수 있을 것이다.
본 발명에 따른 항체, 이의 기능적 단편, 및 결합 단백질은 항체 및 결합 단백질을 정제하기 위해 당해 기술분야에서 이용가능한 다양한 방법 및 재료 중 하나 이상을 사용함으로써 (의도된 용도를 위해) 정제될 수 있다. 이러한 방법 및 재료에는, 의도된 용도에 허용되는 순도를 수득하기 위해, 친화성 크로마토그래피(예: 단백질 A, 단백질 G, 단백질 L, 또는 항체의 특정 리간드, 이의 기능적 단편, 또는 결합 단백질에 접합된 수지, 입자 또는 막을 사용), 이온 교환 크로마토그래피(예를 들면, 이온 교환 입자 또는 막을 사용), 소수성 상호작용 크로마토그래피("HIC"; 예를 들면, 소수성 입자 또는 막을 사용), 한외여과, 나노여과, 정용여과, 크기 배제 크로마토그래피("SEC"), 낮은 pH 처리(오염 바이러스를 불활성화하기 위해) 및 이들의 조합이 포함되지만, 이들로 한정되지 않는다. 오염 바이러스를 불활성화시키기 위한 낮은 pH 처리의 비제한적 예는 본 발명의 항체, 이의 기능적 단편 또는 결합 단백질을 포함하는 용액 또는 현탁액의 pH를 18℃ 내지 25℃에서 60 내지 70분 동안 0.5M 인산을 사용하여 pH 3.5로 감소시키는 것을 포함한다.
본 발명의 항체 및 결합 단백질의 용도
인간 CD3 및/또는 BCMA에 결합하는 능력을 감안할 때, 본 명세서에 기재된 항체, 이의 기능적 단편, 및 본 명세서에 기재된 이중특이적 다가 결합 단백질을 사용하여, 예를 들면, 이들 표적 항원 중 하나 또는 둘 모두를 발현하는 세포를 함유하는 생물학적 샘플에서 CD3 또는 BCMA, 또는 이들 둘 다를 검출할 수 있다. 본 발명의 항체, 기능적 단편, 및 결합 단백질은 효소 결합 면역흡착 검정(ELISA), 방사선면역검정(RIA), 또는 조직 면역조직화학 등의 종래의 면역검정에 사용될 수 있다. 본 발명은, 생물학적 샘플을 본 발명의 항체, 이의 항원 결합 부분 또는 결합 단백질과 접촉시키고, 표적 항원에 대한 결합이 발생하는지의 여부를 검출하고, 이에 의해 생물학적 샘플 중의 표적의 존재 또는 부재를 검출하는 것을 포함하는, 생물학적 샘플에서 CD3 또는 BCMA를 검출하는 방법을 제공한다. 항체, 기능적 단편, 또는 결합 단백질은 결합 또는 비결합 항체/단편/결합 단백질의 검출을 용이하게 하기 위해 검출가능한 물질로 직접 또는 간접적으로 표지될 수 있다. 적절한 검출 가능한 물질에는 다양한 효소, 보결 그룹, 형광 물질, 발광 물질 및 방사성 물질이 포함된다. 적합한 효소의 예에는 서양고추냉이 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다제 또는 아세틸콜린에스테라제가 포함된다. 적합한 보결 그룹 복합체의 예에는 스트렙트아비딘/비오틴 및 아비딘/비오틴이 포함되고; 적합한 형광 물질의 예에는 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 단실 클로라이드 또는 피코에리트린이 포함되고; 발광 물질의 예에는 루미놀이 포함되고; 적합한 방사성 물질의 예에는 3H, 14C, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I, 177Lu, 166Ho, 또는 153Sm이 포함된다.
본 발명의 항체, 이의 기능적 단편, 및 결합 단백질은 바람직하게는 시험관내 및 생체내 둘 모두에서 인간 CD3 및/또는 인간 BCMA 활성을 중화할 수 있다. 따라서, 본 발명의 항체, 이의 기능적 단편, 및 결합 단백질은 인간 CD3 및/또는 인간 BCMA 활성을 억제하기 위해 사용될 수 있고, 예를 들면, CD3 발현 및/또는 BCMA 발현 세포를 포함하는 세포 배양물, 인간 대상체, 또는 본 발명의 항체, 이의 기능적 단편 또는 결합 단백질이 교차-반응하는 CD3 또는 BCMA를 갖는 기타 포유동물 대상체에서 CD3/T 세포 상호작용 및/또는 BCMA/B 세포 상호작용에 의해 매개되는 세포 신호전달을 억제하기 위해 사용될 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 CD3 및/또는 BCMA 활성이 유해한 질환 또는 장애를 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법을 제공하고, 이러한 방법은, 대상체에서 CD3 결합 및/또는 BCMA 결합에 의해 매개되는 활성이 감소되도록, 본 발명의 항체 또는 결합 단백질을 유효량으로 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "CD3 및/또는 BCMA 활성이 유해한 장애"는 장애를 앓고 있는 대상체에서 CD3과 CD3 리간드의 상호작용 또는 BCMA와 BCMA 리간드의 상호작용이 질환의 병인에 관여하거나 질환의 악화에 관여하는 인자인 질환 및 기타 장애를 포함하는 것을 의도한다. 따라서, CD3 및/또는 BCMA 활성이 유해한 장애는 CD3 및/또는 BCMA 활성의 억제가 증상 및/또는 장애의 진행을 완화시킬 것으로 예상되는 장애이다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은, CD3, BCMA, 또는 CD3 및 BCMA 둘 다에 결합할 수 있는 본 명세서에 기재된 항체, 이의 기능적 단편, 또는 결합 단백질을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 자가면역 질환 또는 암을 치료하는 방법을 제공하고, 여기서 자가면역 질환 또는 암은 면역요법에 반응성인 질환이다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 방법은 면역요법과 연관되지 않은 자가면역 질환 또는 암을 치료하기 위해 사용된다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 방법은 난치성 또는 재발성 악성종양인 암을 치료하기 위해 사용된다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 CD3 또는 BCMA 항체, 이의 기능적 단편, 또는 BCMA/CD3 이중특이적 결합 단백질은 종양 세포의 성장 또는 생존을 억제하는 방법에 사용된다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은, 본 명세서에 기재된 CD3 또는 BCMA에 대한 항체, 이의 기능적 단편, 또는 본 명세서에 기재된 BCMA/CD3 이중특이적 결합 단백질, 예를 들면, 탠덤 Fab 면역글로불린(FIT-Ig) 결합 단백질, 또는 MAT-Fab 결합 단백질을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공하고, 여기서 암은 흑색종(melanoma)(예: 전이성 악성 흑색종(metastatic malignant melanoma)), 신장암(renal cancer)(예: 투명 세포 암종(clear cell carcinoma)), 전립선암(prostate cancer)(예: 호르몬 난치성 전립선 선암종(hormone refractory prostate adenocarcinoma)), 췌장 선암종(pancreatic adenocarcinoma), 유방암(breast cancer), 결장암(colon cancer), 폐암(lung cancer)(예: 비소세포 폐암(non-small cell lung cancer)), 식도암(esophageal cancer), 두경부의 편평 세포 암종(squamous cell carcinoma of the head and neck), 간암(liver cancer), 난소암(ovarian cancer), 자궁경부암(cervical cancer), 갑상선암(thyroid cancer), 교모세포종(glioblastoma), 신경교종(glioma), 백혈병(leukemia), 림프종(lymphoma), 원발성 골암(primary bone cancer)(예: 골육종(osteosarcoma), 유잉 육종(Ewing sarcoma), 악성 섬유 조직구종(malignant fibrous histiocytoma), 및 연골육종(chondrosarcoma)), 전이성 암(metastatic cancer), 및 기타 신생물 악성 종양(neoplastic malignancies)으로 이루어진 임의의 그룹으로부터 선택된다.
본 발명은 또한 본 발명의 항체, 또는 이의 항원-결합 부분, 또는 이중특이적 다가 결합 단백질(즉, 1차 활성 성분), 또는 본 발명의 이중특이적 1가 결합 단백질 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 단백질을 포함하는 약제학적 조성물은 장애의 진단, 검출 또는 모니터링; 장애 또는 이의 하나 이상의 증상의 치료, 관리 또는 개선; 및/또는 연구에 사용하기 위한 것이지만, 이들로 한정되지 않는다. 특정 실시형태에서, 조성물은 본 발명의 하나 이상의 항체 또는 결합 단백질을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 약제학적 조성물은, CD3 및/또는 BCMA 활성이 유해한 장애를 치료하기 위한 본 발명의 하나 이상의 항체 또는 결합 단백질 및 본 발명의 항체 또는 결합 단백질 이외의 하나 이상의 예방제 또는 치료제를 포함한다. 일 실시형태에서, 예방제 또는 치료제는 장애 또는 이의 하나 이상의 증상의 예방, 치료, 관리 또는 개선에 유용한 것으로 공지되어 있거나, 또는 사용되어 왔거나, 또는 현재 사용되고 있다. 이들 실시형태에 따르면, 조성물은 담체, 희석제 또는 부형제를 추가로 포함할 수 있다. 부형제는 일반적으로 1차 활성 성분(즉, 본 발명의 항체, 이의 기능적 부분, 또는 결합 단백질 제외) 이외의 조성물에 목적하는 특징을 제공하는 임의의 화합물 또는 화합물의 조합이다.
본 발명의 항체(이의 기능적 단편 포함) 및 결합 단백질은 대상체에 대한 투여에 적합한 약제학적 조성물에 도입될 수 있다. 전형적으로, 약제학적 조성물은 본 발명의 항체 또는 결합 단백질 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "약제학적으로 허용되는 담체"는 생리학적으로 양립가능한 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항균제 및 항진균제, 등장제 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 약제학적으로 허용되는 담체의 예에는 물, 생리식염수, 인산염 완충 생리식염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등의 하나 이상, 뿐만 아니라 이들의 조합을 포함한다. 다수의 경우에, 등장화제, 예를 들면, 당, 다가알콜(예: 만니톨 또는 소르비톨), 또는 염화나트륨을 조성물에 포함하는 것이 바람직할 것이다. 약제학적으로 허용되는 담체는, 조성물에 존재하는 항체 또는 결합 단백질의 저장 수명 또는 유효성을 향상시키는, 습윤제 또는 유화제, 보존제 또는 완충제 등의 소량의 보조 물질을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 이의 의도된 투여 경로와 양립하도록 제형화된다. 투여 경로의 예에는 비경구(예를 들면, 정맥내, 피내, 피하, 근육내), 경구, 비강내(예를 들면, 흡입), 경피(예를 들면, 국소), 종양내, 경점막 및 직장 투여가 포함되지만, 이들로 한정되지 않는다. 특정 실시형태에서, 조성물은 인간에 대한 정맥내, 피하, 근육내, 경구, 비강내 또는 국소 투여에 적합한 약제학적 조성물로서 통상의 절차에 따라 제형화된다. 전형적으로, 정맥내 투여용의 조성물은 멸균 등장성 수성 완충액 중의 용액이다. 필요한 경우, 조성물은 또한, 주사 부위의 통증을 완화하기 위해, 가용화제 및 리도카인(자일로카인, 리그노카인) 등의 국소 마취제를 포함할 수 있다.
본 발명의 방법은 주사(예를 들면, 볼루스 주사 또는 연속 주입)에 의한 비경구 투여용으로 제형화된 조성물의 투여를 포함할 수 있다. 주사용 제형은 방부제를 첨가한 단위 투여 형태(예: 앰플 또는 다중 투여 용기)로 제공될 수 있다. 조성물은 유성 또는 수성 비히클 중의 현탁액, 용액 또는 에멀젼 등의 형태를 취할 수 있고, 현탁제, 안정화제 및/또는 분산제 등의 제형화제를 함유할 수 있다. 또는, 1차 활성 성분은 사용 전에 적합한 비히클(예를 들면, 멸균 파이로겐-비함유 물)로 구성하기 위한 분말 형태일 수 있다.
본 발명의 방법은 데포 조제물로서 제형화된 조성물의 투여를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 장기간 작용 제형은 이식(예를 들면, 피하 또는 근육내) 또는 근육내 주사에 의해 투여될 수 있다. 따라서, 예를 들면, 조성물은 적합한 중합체 또는 소수성 재료(예를 들면, 허용되는 오일 중의 에멀젼으로서) 또는 이온 교환 수지로서, 또는 난용성 유도체로서(예를 들면, 난용성 염으로서) 제형화될 수 있다.
본 발명의 항체, 이의 기능적 단편, 또는 결합 단백질은 또한 다양한 질환의 치료에 유용한 하나 이상의 추가 치료제와 함께 투여될 수 있다. 본 명세서에 기재된 항체, 이의 기능적 단편, 및 결합 단백질은 단독으로, 또는 추가 약제, 예를 들면, 치료제와 조합하여 사용될 수 있고, 상기 추가 약제는 이의 의도된 목적을 위해 당업자에 의해 선택된다. 예를 들면, 추가 약제는 본 발명의 항체 또는 결합 단백질에 의해 치료되는 질환 또는 병태를 치료하기 위해 유용한 것으로 당해 기술분야에서 인식되어 있는 치료제일 수 있다. 추가 약제는 또한 치료 조성물에 유익한 속성을 부여하는 약제, 예를 들면, 조성물의 점도에 영향을 미치는 약제일 수 있다.
본 발명을 상세하게 설명하였지만, 하기 실시예를 참조함으로써 동일한 것이 더욱 명확하게 이해될 것이고, 이들 실시예는 예시만을 목적으로 하여 포함되고, 본 발명을 한정하는 것을 의도하는 것은 아니다.
실시예
실시예 1: 항-인간 CD3 모노클로날 항체의 생성
항-인간 CD3 모노클로날 항체는 다음과 같이 생성되었다:
실시예 1.1: 인간 CD3 항원을 사용한 면역화
항-CD3 항체는 10마리의 Balb/c 및 SJL/J 마우스(Shanghai Laboratory Animal Center)의 그룹을 별도의 면역화 전략으로 면역화함으로써 수득되었다. 4개의 상이한 CD3 면역원이 사용되었고, 이는 2개의 펩티드(CD3ε 단편: LSLKEFSELEQSGYYVC(서열번호 2) 및 QDGNEEMGGITQTPYK(서열번호 3), 재조합 huCD3εγ/Fc 융합 단백질(융합 단백질 헤테로이량체: 제1 쇄,
QDGNEEMGGITQTPYKVSISGTTVILTCPQYPGSEILWQHNDKNIGGDEDDKNIGSDEDHLSLKEFSELEQSGYYVCYPRGSKPEDANFYLYLRARVCENCMEMDGSSGSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(서열번호 4) 및 제2 쇄,
QSIKGNHLVKVYDYQEDGSVLLTCDAEAKNITWFKDGKMIGFLTEDKKKWNLGSNAKDPRGMYQCKGSQNKSKPLQVYYRMCQNCIELNAATISGSSGSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(서열번호 5)), 및 인간 T 세포 수용체 복합체를 발현시키기 위해, 전장 인간 CD3γ 쇄, CD3ε 쇄, CD3δ 쇄, CD3ζ 쇄(제타-쇄), TCRα 쇄 및 TCRβ 쇄로 형질감염된 CHO 세포주(CHOK1/CD3/TCR)를 포함했다.
실시예 1.2: 하이브리도마의 생성
마우스를 2주 간격으로 면역원 중 하나로 면역화하고(일부 그룹은 초기 면역화에 사용된 것과는 상이한 면역원으로 부스팅함), 제2 주사 후 1주일에 1회 혈청 역가를 모니터링했다. 4 내지 6회 면역화 후, 비장세포를 수확하고, 마우스 골수종 세포와 융합시켜 하이브리도마 세포주를 형성했다. 이어서, 하이브리도마 세포의 상청액을 huCD3/Fc 이량체 표적에 대해 스크리닝하고, 관계 없는 단백질/Fc 이량체로 역선택하여, CD3-특이적 마우스 항체를 생성하는 세포주를 동정했다. 양성 하이브리도마는, 주르카트 세포 및 TCR 복합체-형질감염된 CHO 세포 표적에 대한 세포 결합 검정으로 시험하여, 항체의 세포 표면 결합을 확인했다. 마지막으로, 확인된 세포 결합제를, cynoCD3εγ/Fc 융합 단백질을 표적으로 하여 ELISA에 의해 사이노몰구스 교차 반응성에 대해 시험하고, 주르카트-NFAT-루시퍼라제 리포터 세포주를 사용하여 항-CD3 작용 활성을 특성화했다. 이러한 방식으로 시험된 하이브리도마 중 2개만이 모든 검정에서 양성으로 시험된 모노클로날 항체를 생성했다. 이들은 mAbCD3-001 및 mAbCD3-002로 지정되었다.
실시예 1.3: 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열
중쇄 및 경쇄 가변 영역을 증폭하기 위해, TRIzol™ RNA 추출 시약(Invitrogen, Cat. #15596018)을 사용하여, 5×106개 이상의 세포로부터 각 하이브리도마 클론의 합계 RNA를 단리했다. cDNA는 인비트로겐(Invitrogen™) 수퍼스크립트(SuperScript™) III 제1-본쇄 합성 수퍼믹스(First-Strand Synthesis SuperMix) 키트(ThermoFisher Scientific Cat. #18080)를 사용하여 제조업체의 지시에 따라 합성하고, 경쇄 및 중쇄 마우스 면역글로불린 쇄의 가변 영역을 코딩하는 cDNA는 밀리포어시그마(MilliporeSigma™) 노바겐(Novagen™) 마우스 Ig-프라이머 세트(Fisher Scientific Cat. #698313)을 사용하여 증폭했다. PCR 산물은 SYBR™ 세이프(Safe) DNA 겔 염색(ThermoFisher Cat. #S33102)을 사용하여 1.2% 아가로스 겔에서 전기영동으로 분석했다. 정확한 크기의 DNA 단편은 뉴클레오스핀(NucleoSpin®) Gel 및 PCR 클린-업(Clean-up) 키트(Macherey-Nagel Cat. #740609)를 사용하여 정제하고, pMD18-T 벡터에 개별적으로 서브클로닝했다. 각 형질전환으로부터 15개의 콜로니를 선택하고, 삽입 단편의 서열을 DNA 서열분석에 의해 분석했다. 적어도 8개의 콜로니 단편이 VH 및 VL에 대한 컨센서스 서열과 정합하는 경우, 서열이 확인되었다. 뮤린 모노클로날 항체 가변 영역의 단백질 서열을 서열 상동성 정렬에 의해 분석하고, 표 1에 수록했다. 상보성 결정 영역(CDR)은 카바트 넘버링에 기초하여 밑줄되어 있다.
[표 1]
2개의 뮤린 항-CD3 항체의 가변 영역 서열
실시예 1.4: 항-CD3 항체는 인간 및 사이노몰구스 CD3 둘 모두에 결합한다
단리된 뮤린 항-CD3 항체의 결합 특성은 다음과 같이 ELISA로 측정되었다: 헤테로이량체 CD3εγ/Fc 융합 단백질을 4℃에서 밤새 96-웰 플레이트에 1㎍/mL로 코팅했다. 플레이트를 세척 완충액(0.05% 트윈 20을 함유하는 PBS)으로 1회 세척하고, ELISA 차단 완충액(0.05% 트윈 20을 함유하는 PBS 중의 1% BSA)으로 실온에서 2시간 동안 차단했다. 이어서, 항-CD3 항체를 첨가하고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이팅했다. 플레이트를 세척 완충액으로 3회 세척했다. HRP 표지된 항-마우스 IgG 2차 항체(Sigma, Cat. #A0168)를 첨가하고, 플레이트를 37℃에서 30분 동안 인큐베이팅하고, 이어서 세척 완충액에서 5회 세척했다. 100㎕의 테트라메틸벤지딘(TMB) 발색 용액을 각 웰에 첨가했다. 발색 후, 1N HCl로 반응을 중지하고, 바리오스칸(Varioskan™) LUX 마이크로플레이트 판독기(ThermoFisher Scientific)에서 450nm에서의 흡광도를 측정했다. 그라프패드 프리즘(GraphPad Prism) 5.0 소프트웨어를 사용하여 항체 농도에 대해 결합 신호를 플롯팅하고, 이에 따라 EC50을 계산했다. 도 1 및 도 2에 도시된 바와 같이, mAbCD3-002는 최고의 결합 활성을 나타낸 반면, mAbCD3-001은 미국 특허 제8,236,308호에 보고된 가변 도메인 서열을 사용하여 발현된 참조 항-CD3ε 항체와 유사한 결합 EC50을 나타냈다.
실시예 1.5: 항-CD3 항체는 시험관내에서 인간 T 세포를 활성화시킨다
말초 혈액 단핵 세포(PBMC)는 림포프렙(Lymphoprep™) 단핵 세포 분리 배지(STEMCELL Technologies, Cat. #07851)를 사용하여 건강한 공여자로부터 수득하고, T 세포는 CD3-음성 T 세포 선택 키트(EasySep™ STEMCELL Technologies, Cat. #17951))를 사용하여 PBMC으로부터 단리했다. 증식(CTG) 및 사이토카인(IFN-γ) 생산 데이터는 하기 프로토콜을 사용하여 취득했다: 100μl의 시험 항체(mAbCD3-001, OKT3 또는 음성 대조군 IgG)를 고결합 96웰 플레이트(Nunc™, Cat. #3361)에서 4℃에서 밤새 코딩하고, 이어서 DPBS 세척을 수행했다. 시판되는 OKT3 항체를 양성 항-CD3 대조군으로 사용하고, 관계 없는 마우스 IgG를 음성 대조군으로 사용했다. 각 웰에 대해, 200μl 배양 배지(RPMI1640 + 10% FBS + 1% 페니실린-스트렙토마이신 용액 + 1% GlutaMAX™ 보충제) 중의 1×105 T 세포를 파종하고, 37℃에서 96시간 동안 인큐베이팅했다. 증식은 ATP 촉매 정량 키트(CellTiter-Glo™, Promega)를 사용하여 측정했다. IFN-γ는 LANCE®(Lanthanide Chelate Excite) TR-FRET 검정 키트(PerkinElmer, Cat. #TRF1217M)에 의해 측정되었다. 데이터는 그라프패드 프리즘(GraphPad Prism) 5.0 소프트웨어로 분석했다. 결과를 도 3 및 4에 도시한다. 세포 증식 및 IFN-γ 생산 데이터는 mAbCD3-001이 시험관내에서 인간 T 세포를 활성화하는 것을 나타냈다.
실시예 2: 항-CD3 항체의 인간화
실시예 2.1: mAbCD3-001의 인간화
항-CD3 mAbCD3-001 가변 영역 유전자를 사용하여 인간화 mAb를 생성했다. 이 프로세스의 제1 단계에서, mAbCD3-001의 VH 및 VK의 아미노산 서열(상기 표 1 참조)을 인간 Ig V-유전자 서열의 이용 가능한 데이터베이스와 비교하여 전반적으로 가장 잘 정합하는 인간 생식세포 Ig V-유전자 서열을 찾았다. 추가로, VH 또는 VL의 프레임워크 4를 J-영역 데이터베이스와 비교하여, 각각 뮤린 VH 및 VL 영역에 대해 가장 높은 상동성을 갖는 인간 프레임워크를 찾았다. 경쇄의 경우, 가장 가까운 인간 V-유전자 정합은 B3 유전자(V-염기 데이터베이스)였고, 중쇄의 경우 가장 가까운 인간 정합은 VH1-2 유전자였다. 이어서, 인간화 가변 도메인 서열을 설계하고, 여기서 mAbCD3-001 경쇄의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을, CDR-L3 이후에 JK4 프레임워크 4 서열과 함께, B3 유전자의 프레임워크 서열에 이식하고; mAbCD3-001 VH의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3 서열을, CDR-H3 이후에 JH6 프레임워크 4 서열과 함께, VH1-2의 프레임워크 서열에 이식했다. 이어서, mAbCD3-001의 3D Fv 모델을 생성하여 분석하고, CDR 잔기에 대한 거리가 4Å 미만이고 루프 구조 또는 VH/VL 계면을 서포트하는 데 가장 중요한 프레임워크 잔기가 있는지의 여부를 확인했다. 인간화 서열의 이러한 잔기는 친화성/활성을 유지하기 위해 동일한 위치에서 마우스 잔기로 역돌연변이되어야 한다. 해당되는 경우, N-말단 피로글루타메이트 형성을 제거하기 위해 Q1E 돌연변이가 항상 포함되었다. 중쇄의 경우, Y27F, T28S, V37M, M48I, V67A, M69L 및 R71A(카바트 넘버링)의 잠재적 돌연변이가 동정되었다. 경쇄의 경우, T5S와 N22T가 역돌연변이로 동정되었다. CDR과의 상호작용에 의해 결정된 바와 같이, 각 역돌연변이의 중요도 계층을 통해, 가장 중요한 역돌연변이가 우선 정도에 따라 인간화 VH 서열에 도입되었고, 이어서 기타 역돌연변이가 연속 설계로 도입되었다. 또한, VK CDR-L1 서열은 잠재적 탈아미드화 부위인 NS 패턴을 가졌다. 이 아스파라긴 탈아미드화 가능성을 제거하기 위해, NS는 인간화된 카파 쇄에서 QS, NT 또는 NA로 돌연변이되었다. 인간화 VH 및 VL 작제물은 표 2(하기)에 제시되어 있다. (역돌연변이된 프레임워크 아미노산 잔기는 이중 밑줄로 표시되고, 원래 모 항체의 마우스 CDR에는 밑줄되어 있다.)
[표 2]
항-CD3 항체 mAbCD3-001의 인간화 VH/VL 설계
주: EM0006-01VH.1 또는 EM0006-01VK.1은 역돌연변이가 없는 CDR 이식 VH/VL을 의미한다.
대응하는 아미노산 서열 설계로부터 역-번역된 인간화 VH 및 VK 유전자를 새롭게 합성하고, 이어서 인간 IgG1 및 인간 카파 불변 도메인(각각 서열번호 26 및 서열번호 27)을 함유하는 벡터로 클로닝했다.
[표 3]
항체 인간화에 사용된 인간 불변 영역 서열
인간 VH와 인간 VK의 페어링은 HuEM0006-01-1 내지 HuEM0006-01-27로 명명된 27개의 인간화 항체를 생성했다(표 3). 모 마우스 VH/VL 및 인간 불변 서열을 갖는 키메라 항체(HuEM0006-01c)도 생성되고, 인간화 항체 랭킹에 대한 양성 대조군으로 사용되었다. 모든 재조합 인간화 mAb는 HEK293 세포에서 일시적으로 발현되었고, 단백질 A 크로마토그래피에 의해 정제되었다.
[표 4]
mAbCD3-001로부터 유래하는 인간화 항-CD3 항체의 생산 목록
* EM0006-01VH에는 mAbCD3-001의 뮤린 가변 중쇄 영역이 포함되고; EM0006-01VK에는 mAbCD3-001의 뮤린 가변 경쇄 영역이 포함된다.
실시예 2.2: 인간화 항-CD3 항체는 상이한 CD3 결합 활성을 나타냈다
상이한 인간화 VH 및 VK 조합은 상이한 CD3 결합 친화성을 갖는 인간화 항-CD3 변이체를 유도했다. mAbCD3-001의 인간화 변이체의 결합 활성은 인간 CD3-발현 주르카트 T 세포주를 사용하여 유세포 분석을 통해 시험했다. FACS 완충액 중의 5 × 105 주르카트 세포를 96웰 플레이트의 각 웰에 파종했다. 세포를 400g에서 5분 동안 원심분리하고, 상청액을 폐기했다. 이어서, 각 웰에 대해, 연속 희석된 항체 100㎕를 첨가하여 세포와 혼합했다. 4℃에서 40분간 인큐베이팅 후, 플레이트를 수회 세척하여 과량의 항체를 제거했다. 이어서, 2차 형광색소-접합 항체(Alexa Fluor® 647 염소 항-인간 IgG1 H&L; Jackson ImmunoResearch, Cat. #109-606-170)를 첨가하고, 실온에서 20분 동안 세포와 함께 인큐베이팅했다. 또 다른 라운드의 원심분리 및 세척 단계 후, 세포를 FACS 완충액에 재현탁하여 CytoFLEX 유세포 분석기(Beckman Coulter)에서 판독했다. 형광 강도의 중앙치(MFI; Median Fluorescence Intensity) 판독값을 항체 농도에 대해 플롯팅하고, 그라프패드 프리즘(GraphPad Prism) 5.0 소프트웨어로 분석했다.
도 5A-5H에 도시된 바와 같이, 인간화 항-CD3 항체는 주르카트 세포 상의 세포 표면 CD3 표적에 대해 광범위한 친화성을 나타냈다. 카파 쇄(즉, EM0006-01VK.1과 EM0006-01VK.1A 사이)의 변화가 결합에 유의한 영향을 미치지 않는 것으로 나타났기 때문에, VH 변이체는 명백하게는 이 CD3 결합 조절의 핵심 요소였다. 일부 인간화 항체, 특히 VH 변이체 EM006-01VH.1H를 갖는 HuEM0006-01-08 및 HuEM0006-01-17(표 4 및 서열번호 18 참조)은, 모 마우스 VH 영역 EM0006-01VH를 갖는 키메라 대조군 항체 HuEM0006-01c보다 훨씬 더 높은 CD3 결합을 나타냈다(표 4 참조).
실시예 3: 항-BCMA 모노클로날 항체의 생성
항-BCMA 항체는, Balb/c 또는 SJL 마우스를, 인간 Fc 영역에 융합된 인간 BCMA(ECD)의 호모이량체화에 의해 형성된 재조합 BCMA 세포외 도메인/Fc 이량체로 면역화하여 수득했다:
MLQMAGQCSQNEYFDSLLHACIPCQLRCSSNTPPLTCQRYCNASVNSVKGTNAIEGRMDPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(서열번호 28). 마우스를 2주 간격으로 면역화하고, 제2 주사 후 1주일에 1회 혈청 역가를 모니터링했다.
실시예 3.1: 하이브리도마의 생성
4 내지 6회의 면역화 후, 비장세포를 수확하고, 마우스 골수종 세포와 융합시켜 하이브리도마 세포주를 형성했다. 융합 생성물을 96-웰 플레이트의 하이포크산틴-아미노프테린-티미딘(HAT)을 함유하는 선별 배지에 웰당 1 × 105 비장 세포의 밀도로 플레이팅했다. 융합 후 7-10일에, 육안으로 볼 수 있는 하이브리도마 콜로니가 관찰되었다. 이어서, 하이브리도마 세포의 상청액을 스크리닝 및 선택하여, BCMA 특이적 마우스 항체를 생산하는 세포주를 동정했다. 5개의 항-BCMA 항체가 선택되고, 서열분석되었다.
실시예 3.2: 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열
중쇄 및 경쇄 가변 영역을 증폭하기 위해, TRIzol™ RNA 추출 시약(Invitrogen, Cat. #15596018)을 사용하여, 5×106개 이상의 세포로부터 각 하이브리도마 클론의 합계 RNA를 단리했다. cDNA는 인비트로겐(Invitrogen™) 수퍼스크립트(SuperScript™) III 제1-본쇄 합성 수퍼믹스(First-Strand Synthesis SuperMix) 키트(ThermoFisher Scientific Cat. #18080)를 사용하여 제조업체의 지시에 따라 합성하고, 경쇄 및 중쇄 마우스 면역글로불린 쇄의 가변 영역을 코딩하는 cDNA는 밀리포어시그마(MilliporeSigma™) 노바겐(Novagen™) 마우스 Ig-프라이머 세트(Fisher Scientific Cat. #698313)을 사용하여 증폭했다. PCR 산물은 SYBR™ 세이프(Safe) DNA 겔 염색(ThermoFisher Cat. #S33102)을 사용하여 1.2% 아가로스 겔에서 전기영동에 의해 분석했다. 뉴클레오스핀(NucleoSpin®) 겔 및 PCR 클린-업 키트(Macherey-Nagel, Cat. #740609)를 제조업체의 지시에 따라 사용하여, 정확한 크기의 DNA 단편을 정제하고, 개별적으로 pMD18-T 벡터에 서브클로닝했다. 각 형질전환으로부터 15개의 콜로니를 선택하고, 삽입 단편의 서열을 DNA 서열분석에 의해 분석했다. 적어도 8개의 콜로니 단편이 VH 및 VL에 대한 컨센서스 서열과 정합하는 경우, 서열이 확인되었다. 뮤린 mAb 가변 영역의 단백질 서열을 서열 상동성 정렬에 의해 분석했다.
실시예 3.3: 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의한 항-BCMA 항체의 결합 동역학
항-BCMA 항체의 결합 친화성 및 동역학 상수는, 표준 절차를 사용하여 비아코어(Biacore) T200 기기(GE Healthcare)를 사용하여, 25℃에서 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정했다. 간단히 말해서, 염소 항-마우스 IgG Fc 항체는, 바이오센서 칩 전체에 직접 고정되고, 항체 샘플을 5㎕/분의 유속으로 반응 매트릭스에 주입했다. 마우스 항-BCMA IgG 시험 항체를 고정화 표면 위에 주입하고, 고정화 항-Fc 항체에 의해 포획했다. 이어서, 인간 및 사이노몰구스 BCMA(ECD)/Fc 표적 폴리펩티드를 포획된 마우스 항-BCMA IgG 표면 위에 주사했다. 회합 및 해리 속도 상수, 각각 kon(M-1s-1) 및 koff(s-1)는 30μl/min의 연속 유속으로 결정되었다. 속도 상수는 표적 BCMA(ECD) 폴리펩티드의 5개 상이한 농도에서 동적 결합 측정을 수행함으로써 유도되었다. 이어서, 항체와 관련 표적 단백질 사이의 반응의 평형 해리 상수 KD(M)를 식 KD = koff/kon을 사용하여 운동 속도 상수로부터 계산했다. 속도 상수는, 비아코어 분석 소프트웨어를 사용하여 데이터를 처리하고 1:1 결합 모델에 적합시킴으로써 결정했다. 결과를 표 7에 제시한다.
[표 7]
항-BCMA 모노클로날 항체에 대한 친화성 측정
N/A = 측정 가능한 결합 신호는 검출되지 않음
TAb1은, 국제 공개공보 WO 제2012/163805호의 클론 CA8인 참조 항-BCMA 항체이다.
TAb2는, 국제 공개공보 WO 제2014/122143호의 클론 83A10인 참조 항-BCMA 항체이다.
인간 및 사이노몰구스 BCMA 표적 모두에 대해 높은 친화성을 나타내는 2개의 항-BCMA 항체를 추가로 개발하고, 분석했다. 이들 선택된 항-BCMA 모노클로날 항체, mAbBCMA-002 및 mAbBCMA-003에 대한 가변 도메인 서열은 하기 표 8에 제시되어 있다. 상보성 결정 영역(CDR)은 카바트 넘버링을 기반으로 밑줄되어 있다.
[표 8]
항-BCMA 항체의 가변 영역 서열
실시예 3.4: 항-BCMA 항체는 상이한 BCMA 차단 활성을 나타냈다
인간 골수종 세포주 NCI-H929에서 BCMA 리간드 BAFF에 의해 자극된 NFκB 포스포릴화를 차단하는 모노클로날 항-BMCA 항체의 능력은 포스포-NFκB(Ser536) 세포 검정 키트(Cisbio; Cat. #64 NFBPEG)를 사용하여 평가했다. NCI-H929 인간 골수종 세포를 검정 배지(RPMI1640, 0.1% BSA)에서 37℃에서 밤새 기아 상태로 했다. 세포를 세척하고, 재현탁하고, 384-웰 마이크로플레이트(PerkinElmer, Cat. #6008280)에 웰당 2×105개 세포로 파종했다. 이어서, 항체를 웰에 첨가하고, 세포와 함께 37℃에서 약 10분 동안 인큐베이팅했다. 항-BAFF 항체(R&D Systems, Cat. #BAF124)를 양성 대조군으로 사용하고, 관계 없는 항-RAC1 모노클로날 항체를 음성 대조군으로 사용했다. 참조 항-BCMA 항체 TAb1 및 TAb2(각각 국제 공개공보 제WO 2012/163805호로부터의 클론 CA8 및 국제 공개공보 제WO 2014/122143호로부터의 클론 83A10)를 비교를 위해 시험했다.
이어서, 재조합 BAFF를 5㎍/ml의 농도로 각 웰에 첨가하고, 30분 동안 인큐베이팅했다. 키트 용해 완충액을 첨가하여 세포를 용해시키고, 진탕하면서 실온에서 적어도 30분 동안 인큐베이팅했다. 이어서, 세포 용해물을 384-웰 소량 마이크로플레이트(PerkinElmer, Cat. #6008280)로 옮겼다. 검정 키트 시약을 제조하고, 제조업체의 지시에 따라 웰에 첨가했다. 실온에서 4시간 동안 최종 인큐베이팅한 후, 665nm 및 620nm의 파장에서 형광 발광에 대해 플레이트를 판독했다. 그라프패드 프리즘(GraphPad Prism) 5.0 소프트웨어를 사용하여, 억제 백분율을 계산하고, 항체 농도에 대해 플롯팅했다. 도 6에 도시된 바와 같이, 전술한 바와 같이 단리된 선택된 항-BCMA 항체, mAbBCMA-002 및 mAbBCMA-003은 음성 대조군(항-RAC)보다 BAFF-유도성 NF-κB 포스포릴화에 대해 우수한 억제 활성을 나타냈다.
또 다른 리포터 유전자 기반 발광 검정 시스템을 사용하여, BCMA에 대한 리간드 결합 활성의 항체 차단을 특성화했다. BCMA를 발현하도록 형질감염된, NF-κB 포스포릴화가 유도되면 루시퍼라제 신호를 방출하는 안정한 HEK293F 세포주(HEK293F-BCMA-NF-kB-luc 클론 1H2)를 사내에서 확립하고, 이 발광 검정에 사용했다. 세포를 수확하고, 세척하고, 검정 배지(10% FBS를 포함하는 RPMI1640)에 재현탁시켰다. 이어서, 세포를 96-웰 마이크로플레이트(Costar, Cat. #3903)에 웰당 5×104개 세포로 파종하고, 시험 항체: mAbBCMA-002, mAbBCMA-003, TAb1(항-BCMA), TAb2(항-BCMA), 또는 관계 없는 뮤린 IgG와 함께 인큐베이팅했다. BAFF 또는 APRIL(TNFSF13, CD286)의 BCMA 리간드를 첨가하고, 항체 용액과 10분 동안 공-인큐베이팅했다. 원-글로(One-Glo™) 루시퍼라제 검정 시스템(Promega, Cat. #E6130) 시약을 제조하고, 제조업자의 지시에 따라 웰에 첨가했다. 바리오스칸(Varioskan™) LUX 마이크로플레이트 판독기(Thermo Scientific)를 사용하여, 발광 신호에 대해 플레이트를 판독했다. 그라프패드 프리즘(GraphPad Prism) 5.0 소프트웨어를 사용하여, 억제 백분율을 계산하고, 항체 농도에 대해 플롯팅했다. 도 7(BAFF 차단) 및 도 8(APRIL 차단)에 도시된 바와 같이, mAbBCMA-002는 활성이 없거나 약한 차단 활성을 나타낸 반면, mAbBCMA-003은 양성 참조 항체 TAb1 및 TAb2와 유사한 강력한 NF-κB 신호 경로 차단 활성을 나타냈다.
이어서, mAbBCMA-002 및 mAbBCMA-003의 결합 도메인을 사용하여, 이중특이적 BCMA/CD3 FIT-Ig 결합 단백질을 생성했다.
실시예 4: BCMA/CD3 Fabs-in-tandem 면역글로불린(FIT-Igs)의 생산
실시예 4.1: BCMA/CD3 FIT-Ig 결합 단백질(FIT-Ig)의 생성
인간 CD3 및 인간 BCMA 둘 다를 인식하는 이중특이적 Fabs-in-Tandem 면역글로불린(FIT-Ig) 결합 단백질을 작제했다. FIT-Ig 작제물은 국제 공개공보 제WO 2015/103072호에 기재된 일반 절차에 따라 면역글로불린 도메인 사이의 합성 링커 서열의 사용을 생략하도록 조작되었다.
CD3 및 BCMA에 결합할 수 있는 FIT-Ig 항체를 생성하기 위해 사용된 DNA 작제물은 모 항-CD3 및 항-BCMA 모노클로날 항체(mAb)의 가변 도메인을 코딩했다. 각각의 FIT-Ig 결합 단백질은 하기 구조를 갖는 3개의 폴리펩티드 쇄로 구성되었다:
쇄 1(장쇄): VLCD3-CL-VHBCMA-CH1-힌지-CH2-CH3;
쇄 2(제1 단쇄): VHCD3-CH1;
쇄 3(제2 단쇄): VLBCMA-CL;
여기서, VLBCMA는 BCMA를 인식하는 모노클로날 항체의 경쇄 가변 도메인이고, VHCD3은 CD3을 인식하는 모노클로날 항체의 중쇄 가변 도메인이고, VLCD3은 CD3을 인식하는 모노클로날 항체의 경쇄 가변 도메인이고, VHBCMA는 BCMA를 인식하는 모노클로날 항체의 중쇄 가변 도메인이고, 각 CL은 경쇄 불변 도메인이고, 각 CH1은 제1 중쇄 불변 도메인이고, 힌지-CH2-CH3은 항체 C-말단 Fc 영역이다.
장쇄 벡터를 작제하기 위해, VLCD3-CL-VHBCMA 세그먼트를 코딩하는 cDNA를 새롭게 합성하고, 인간 CH1-힌지-CH2-CH3에 대한 코딩 서열을 포함하는 벡터의 다중 클로닝 부위(MCS)에 삽입했다. 수득된 벡터에서, 모든 도메인 단편이 정확한 판독 프레임에 있는 것을 보장하기 위해 상동 재조합 동안 MCS 서열이 제거되었다. 유사하게, 제1 및 제2 단쇄를 작제하기 위해, VHCD3 및 VLBCMA 구조 유전자를 드 노보 합성하고, 각각 인간 CH1 및 CL 도메인에 대한 코딩 세그먼트를 포함하는 적절한 벡터의 MCS에 삽입했다.
3개의 플라스미드를 1:2:1.5의 비율로 혼합하고, 이어서 HEK293 세포에 공-형질감염시켰다. 발현 7일 후, 세포 배양 상청액을 수집하고, 단백질 A 크로마토그래피로 정제했다. 정제된 FIT-Ig 단백질의 농도를 A280으로 측정하고, 균질성을 크기 배제 크로마토그래피(SEC)로 분석했다.
신규한 뮤린 항-BCMA 항체, mAbBCMA-002 및 mAbBCMA-003의 결합 특성을 이중특이적 FIT-Ig 포맷으로 시험하기 위해, 쇄 1 및 쇄 3 폴리펩티드(상기)에 사용된 VHBCMA 및 VLBCMA 도메인은 표 8에 기재된 VH 및 VL 도메인(즉, VH의 경우 서열번호 29 또는 서열번호 31, VL의 경우 서열번호 30 또는 서열번호 32)이었다. 쇄 1 및 쇄 2의 VHCD3 및 VLCD3 도메인의 경우(상기 참조), 모 항-CD3 항체는 3개의 선택된 인간화 항-CD3 항체 중 하나였다: HuEM0006-01-24 항체(VH = 서열번호 18; VL = 서열번호 25), HuEM0006-01-25 항체(VH = 서열번호 15, VL = 서열번호 25), 또는 HuEM0006-01-26 항체(VH = 서열번호 12, VL = 서열번호 25). FIT-Ig 구조의 불변 도메인 CH1-힌지-CH2-CH3 및 CL의 경우, 인간 서열, 즉, 서열번호 26 및 서열번호 27을 사용했다. 전술한 폴리펩티드 도메인을 코딩하는 cDNA를 이용하여, FIT-Ig 발현 벡터를 작제하고, HEK293 세포를 형질감염시키기 위해 사용했다. 각각의 비-링커 FIT-Ig 작제물의 배양물을 성장시키고, FIT-Ig를 상기 기재된 바와 같이 정제했다. 6개의 FIT-Ig 결합 단백질은 하기 표 9에 제시된 명칭을 갖는다:
[표 9]
huCD3/키메라 BCMA FIT-Ig 결합 단백질에 대한 생산 목록
실시예 4.2: BCMA/CD3 FIT-Ig Fab 단편 결합 단백질(FIT-Fab)의 생성
전장 FIT-Ig 단백질을 소화하고, 피어스(Pierce™) Fab 제조 키트(ThermoFisher Scientific, Cat. #44985)로 정제했다. 이 프로세스에서, FIT-Ig 단백질의 Fc 도메인은 아가로스 비드에 고정된 파파인을 사용하여 효소적 절단에 의해 제거되었다. 이어서, FIT-Ig Fab 단편(FIT-Fab)을 단백질 A 크로마토그래피로부터의 통과액으로부터 정제했다. 정제된 FIT-Fab 단백질의 농도를 A280으로 측정하고, 균질성을 크기 배제 크로마토그래피(SEC)로 분석했다.
실시예 4.3: FIT-Ig 이중특이적 항체는 CD3 및 BCMA 표적 둘 모두에 대한 결합을 나타냈다
키메라 이중특이적 BCMA/CD3 FIT-Ig 항체의 결합 활성은 인간 CD3/TCR 복합체 형질감염된 CHO 세포주(CHOK1/CD3/TCR 세포) 및 BCMA-발현 NCI-H929 세포를 사용하여 유세포 분석을 통해 시험되었다. 간단히 말해서, FACS 완충액 중의 5 × 105 세포를 96웰 플레이트에 파종했다. 세포를 400×g에서 5분 동안 원심분리하고, 상청액을 폐기했다. 각 웰에 대해, 연속 희석된 FIT-Ig 또는 FIT-Fab 항체 100㎕를 첨가하고, 세포와 혼합했다. 4℃에서 40분 동안 인큐베이팅한 후, 플레이트를 수회 세척하여 과량의 항체를 제거했다. 이어서, 2차 항체(염소 항-huIgG 카파 쇄 특이적)를 첨가하고, 실온에서 20분 동안 세포와 함께 인큐베이팅했다. 또 다른 라운드의 원심분리 및 세척 후, CytoFLEX 유세포 분석기에서 판독하기 위해 세포를 FACS 완충액으로 재현탁했다. 결과는 그라프패드 프리즘(GraphPad Prism) 5.0 소프트웨어로 분석 및 플롯팅되었다. 결과는 도 9 및 10에 도시되어 있다.
도 9에 도시된 바와 같이, 이중특이적 키메라 BCMA/CD3 FIT-Fab 항체의 Fab 단편에 의한 BCMA에 대한 결합 활성은 이들이 동일한 BCMA 결합 도메인으로 구성되어 있는 경우에 정확히 동일한 결합 곡선을 나타냈다. 도 10에 도시된 바와 같이, 키메라 BCMA/CD3 FIT-Ig 결합 단백질은 모 모노클로날 인간화 CD3 항체에 대해 유사한 결합 활성 곡선을 유지했다(도 5B, 5C 참조).
실시예 4.4: 키메라 FIT-Fab 및 FIT-Ig는 재지시된 CD3 활성화를 나타냈다
BCMA/CD3 이중특이적 FIT-Ig 및 FIT-Fab 항체에 의한 재지시된 CD3 활성화를 측정하기 위해, 공-배양된 리포터 유전자 검정을 사용했다. 주르카트-NFAT-luc 세포는, 세포 표면 CD3가 활성화되면, 하류 루시퍼라제 신호를 유발한다. NCI-H929 세포를 BCMA-발현 표적 세포로 사용하고, 이는 BCMA 결합시에 이중특이적 BCMA/CD3 항체를 통해 T 세포 상의 CD3/TCR 복합체를 가교할 수 있다. 주르카트-NFAT-luc 및 NCI-H929 세포를 세척하고, 검정 배지(10% FBS를 포함하는 RPMI1640)에 별도로 재현탁시켰다. 두 세포 유형 모두를 96웰 플레이트(Costar #3903)에 웰당 1×105개 세포로 1:1의 비율로 파종했다. FIT-Ig 또는 FIT-Fab 항체를 첨가하여 세포와 혼합하고, 37℃에서 4시간 동안 인큐베이팅했다. 인큐베이션의 종료 후, ONE-Glo™ 발광 검정 키트(Promega, Cat. #E6130) 시약을 제조하고, 제조업자의 지시에 따라 웰에 첨가한다. 바리오스칸(Varioskan™) LUX 마이크로플레이트 판독기(ThermoFisher Scientific)를 사용하여, 발광 신호에 대해 플레이트를 판독했다. 결과를 도 11 및 12에 도시한다.
도 11을 참조하면, T 세포 활성화를 유발하는 FIT-Ig 농도는, 가장 높은 친화성의 항-BCMA 및 항-CD3 항체의 2개, 즉 mAbBCMA-003 및 HuEM0006-01-24를 사용하여, 실시예 4.1에 기재된 바와 같이 제조된 FIT-Ig 결합 단백질에 대해 플롯팅한다. 도면에서, FIT1006-4a는 외부 CD3-결합 Fab 결합 부위 및 내부 BCMA-결합 Fab 결합 부위를 갖는 FIT-Ig이고(상기 표 9 참조); FIT1006-4b는 동일한 아미노산 서열을 사용하여 작제된 FIT-Ig이지만, 결합 도메인의 위치가 역전된, 즉 외부 BCMA 결합 Fab 결합 부위 및 내부 CD3 결합 Fab 결합 부위를 갖고; FIT1006-4a-Fab는 파파인 소화에 의해 FIT1006-4a로부터 제조된다(실시예 4.2 참조). 이들 결합 단백질의 성능은 2개의 음성 대조군: (i) 2개의 관계 없는 항원 표적과 반응하는 결합 부위를 갖는 FIT-Ig("FIT1002-5a"), 및 (ii) 관계 없는 항원("hIgG")과 반응하는 인간화 IgG 모노클로날 항체에 대해 비교된다. 또한, 2개의 항-CD3 결합 단백질, 즉 인간화 항-CD3 모노클로날 항체(HuEM0006-01-24) 및 이로부터 제조된 Fab 단편(HuEM0006-01-24-Fab)도 시험했다. BCMA 결합 활성을 갖지 않는 단일특이적 항-CD3 결합 단백질과 비교하여, BCMA-발현 표적 세포의 존재하에, 모든 이중특이적 BCMA/CD3 결합 단백질은 T 세포 활성화의 증가를 유도하는 것을 알 수 있다.
도 12를 참조하면, 상기 표 9에 기재된 FIT-Ig 결합 단백질로부터 제조된 FIT-Fab에 대해, BCMA-발현 표적 세포의 존재하에 T 세포 활성화를 유발하는 다양한 이중특이적 BCMA/CD3 FIT-Fab 결합 단백질의 농도를 플롯팅한다(FIT1006-3a-Fab, FIT1006-4a-Fab, FIT1006-5a-Fab, FIT1006-6a-Fab, FIT1006-7a-Fab, FIT1006-8a-Fab으로 지정). 이러한 FIT-Fab의 성능을, 참조 항-CD3 Fab 및 mAbBCMA-002, WO 2016/020332에 개시된 항-CD3 및 항-BCMA 결합 영역을 이용하는 FIT1006-1a-Fab로 지정된 참조 FIT-Fab 항체, 및 2개의 관계 없는 항원 표적에서 지시된 모 항체 결합 부위를 사용하여 제조된 FIT1002-5a-Fab로 지정된 음성 대조군 FIT-Fab에 대해 비교했다.
이러한 결과는 BCMA/CD3 이중특이적 항체가 종양 세포 표면에서 BCMA에 결합하면 가교결합에 의해 CD3을 활성화할 수 있는 것을 입증했다. FIT-Ig 결합 단백질(도 11)뿐만 아니라, FIT-Fab 결합 단백질(도 12)도, 이 검정에서 재지시된 활성화를 나타냈다. 추가로, FIT1006-4a-Fab은 낮은 농도에서 놀라울 정도로 급격한 활성화 곡선을 나타냈다.
실시예 4.5: 키메라 BCMA/CD3 FIT-Fab은 재지시된 T 세포 세포독성을 나타냈다
BCMA/CD3 이중특이적 결합 단백질의 종양 세포 사멸 효능은 표적 세포로서 인간 골수종 세포주 NCI-H929 및 이펙터 세포로서 인간 T 세포를 사용하여, 재지시된 T 세포 세포독성 검정에서 측정되었다. 간단히 말해서, 세포를 수확하고, 세척하고, 검정 배지(10% FBS를 포함하는 RPMI1640)로 재현탁했다. NCI-H929 세포를 평저 96웰 플레이트(Corning, Cat. #3599)에 웰당 5×104개 세포로 파종했다. T 세포는 상업용 PBMC 단리 키트(EasySep™, Stemcell Technologies, Cat. #17951)를 사용하여 인간 PBMC로부터 정제하고, 웰당 2×105개 세포로 웰에 첨가했다. 시험 항체를 첨가하고, 세포 혼합물과 함께 37℃에서 48시간 동안 인큐베이팅했다. 락테이트 데하이드로게나제(LDH) 방출은 사이토톡스(CytoTox) 96® 세포독성 검정 키트(Promega, Cat. #G1780)로 측정했다. OD490 판독값은 제조업자의 지시에 따라 수득했다. 표적 세포 NCI-H929의 최대 용해(100%)로부터 최소 용해(0%)를 뺀 값을 정규화 분모로 제시했다. LDH 방출의 백분율을 이중특이적 항체의 농도에 대해 플롯팅했다. 도 13에 도시된 바와 같이, 항-BCMA 및 항-CD3 특이성을 갖는 이중특이적 FIT-Fab은 NCI-H929 종양 세포에 대한 재지시된 T 세포 세포독성을 입증한 반면, 단일특이적 인간화 항-CD3 Fab, 및 항-CD3 Fab(HuEM0006-01-24의 Fab 단편) 및 항-BCMA mAb(TAB1)의 조합은 세포독성 활성을 나타내지 않았다.
실시예 4.5: 키메라 FIT-Ig는 시험관내에서 한정된 비-표적 재지시된 CD3 활성화를 나타냈다
비표적 재지시된 CD3 활성화는, 주르카트-NFAT-luc 기반 리포터 유전자 분석을 사용하여 표적 세포의 부재하에 시험했다. 주르카트-NFAT-luc 세포를 수확하고, 세척하고, 검정 배지(10% FBS를 포함하는 RPMI1640)에 재현탁하고, 웰당 1×105개 세포로 96웰 플레이트(Costar #3903)에 파종했다. 시험 항체를 첨가하고, 세포와 혼합하고, 37℃에서 4시간 동안 인큐베이팅했다. 인큐베이션 후, ONE-Glo™ 발광 검정 키트(Promega, Cat. #E6130) 시약을 제조하고, 제조업자의 지시에 따라 웰에 첨가했다. 바리오스칸(Varioskan™) Lux 플레이트 판독기를 사용하여, 발광 신호에 대해 플레이트를 판독했다. 결과를 도 14에 도시한다.
이 검정은 이중특이적 결합 단백질, 이 경우 BCMA에 대한 공-표적을 발현하는 세포의 부재를 제외하고, 상기 실시예 4.4에서 수행된 시험과 유사했다. 결과는 이중특이적 BCMA/CD3 FIT-Ig 항체(FIT1006-4a 및 FIT1006-4b) 및 FIT1006-4a-Fab로 지정된 BCMA/CD3 FIT-Fab(이들 모두는 인간화 항-CD3 모노클로날 항체 HuEM0006-01-24와 동일한 CD3 결합 도메인을 갖는다)가 BCMA-발현 표적 세포의 부재하에 항-CD3 항체 단독보다 훨씬 적은 비-표적 재지시된 활성화를 나타냈음을 보여준다(도 11 참조).
실시예 5: 인간화 이중특이적 BCMA/CD3 FIT-Ig 결합 단백질의 생산
항-BCMA 모노클로날 mAbBCMA-003은, BCMA/CD3 FIT-Ig 및 FIT-Fab 포맷에서 사용된 경우, 더 높은 BCMA 결합 친화성 및 더 양호하게 재지시된 세포 사멸을 나타냈다. 따라서, mAbBCMA-003은 인간화 및 후속 인간화된 이중특이적 결합 단백질의 작제에서 사용을 위해 선택되었다.
실시예 5.1: 항-BCMA 항체 mAbBCMA-003의 인간화
mAbBCMA-003 가변 영역 유전자를 사용하여 인간화 mAb를 생성했다. 이 프로세스의 제1 단계에서, mAbBCMA-003의 VH 및 VK의 아미노산 서열(상기의 표 8 참조)을 인간 Ig V-유전자 서열의 이용 가능한 데이터베이스와 비교하여, 전체적으로 가장 정합하는 인간 생식계열 Ig V-유전자 서열을 찾았다. 추가로, VH 또는 VL의 프레임워크 4를 J-영역 데이터베이스와 비교하여, 각각 뮤린 VH 및 VL 영역에 대해 가장 높은 상동성을 갖는 인간 프레임워크를 찾았다. 경쇄의 경우, 가장 가까운 인간 V-유전자 정합은 VK1-39(02) 유전자이고, 중쇄의 경우, 가장 가까운 인간 정합은 VH1-03 유전자였다. 이어서, mAbBCMA-003 경쇄의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3이, CDR-L L3 후의 JK2 프레임워크 4 서열과 함께, VK1-39(02) 유전자의 프레임워크 서열에 이식되고, mAbBCMA-003 VH의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3 서열이, CDR-H3 후의 JH6 프레임워크 4 서열과 함께, VH1-03 유전자의 프레임워크 서열에 이식된, 인간화 가변 도메인 서열을 설계했다. 이어서, mAbBCMA-003의 3D Fv 모델을 생성하고, CDR 잔기까지의 거리가 4Å 미만이고 루프 구조 또는 VH/VL 계면을 서포트하는 데 가장 중요한 임의의 프레임워크 잔기가 있는지의 여부를 결정하기 위해 분석했다. 인간화 서열의 이러한 잔기는 친화성/활성을 유지하기 위해 동일한 위치에서 마우스 잔기로 역돌연변이되어야 한다. 해당되는 경우, N-말단 피로글루타메이트 형성을 제거하기 위해 Q1E 돌연변이가 항상 포함되었다. 중쇄의 경우, P30T, I48M, K66R, A67V, L69I 및 A71R(카바트 넘버링)의 잠재적 돌연변이가 바람직한 역돌연변이로 동정되었다. 경쇄의 경우, V58I와 R69T는 바람직한 역돌연변이로 동정되었다. CDR과의 상호작용에 의해 결정된 바와 같이, 각 역돌연변이의 중요도 계층을 통해, 가장 중요한 역돌연변이가 우선도의 순서로 인간화 VH 서열에 도입되고, 이어서 기타 역돌연변이가 연속적 설계로 도입되었다. 또한, CDR-L2의 C-말단에 존재하는 DG 디펩티드는 잠재적 아스파르트산 이성화 부위를 제시했고, 이는 경쇄 변이체에서 D56A, D56E, D56S, D56T 또는 G57A의 대체 치환에 의해 제거되었다. 인간화 VH 및 VL 설계 작제물은 표 10(하기)에 제시되어 있다. (역돌연변이된 프레임워크 아미노산 잔기는 이중 밑줄로 표시되고, 원래 모 항체로부터의 뮤린 CDR에는 밑줄되어 있다.)
[표 10]
항-BCMA mAbBCMA-003의 인간화 VH/VL 설계
인간화 항-BCMA VH 및 VL 유전자는 합성적으로 생성되고, 이어서 실시예 4.1에 기재된 바와 같이, 항-CD3 모노클로날 HuEM0006-01-24로부터의 VH 및 VL 유전자를 또한 함유하는, FIT-Ig 벡터로 각각 클로닝되었다. 인간화 VH 및 인간화 VL의 페어링은 하기 표 11에 수록된 인간화 BCMA/CD3 FIT-Ig 결합 단백질을 생성했다. mAbBCMA-003의 모 마우스 VH/VL 및 인간 불변 서열을 갖는 키메라 항체는 또한 인간화 결합 단백질 랭킹에 대한 양성 대조군으로서 생산되었다. 모든 재조합 FIT-Ig는 실시예 4.1에 기재된 바와 같이 발현 및 정제했다.
[표 11]
인간화 BCMA/CD3 FIT-Ig의 생산 목록
BCMA 및 CD3 항원 모두에 결합하는 능력을 갖는 이중특이적 FIT-Ig 및 FIT-Fab 결합 단백질을, 상기 실시예 4.1 및 4.2와 동일한 방식으로, 상기 표 11에 수록된 인간화 가변 도메인 및 표 3에 제시된 인간 불변 영역 서열(서열번호 26 및 서열번호 27)을 코딩하는 cDNA를 사용하여 작제했다. 면역글로불린 도메인 사이에 링커가 사용되지 않았기 때문에, FIT-Ig 결합 단백질에 대한 완전한 서열은 표 11 및 3의 서열 정보로부터 유도될 수 있다. 예를 들면, 표 11에 개시된 3개의 예시적FIT-Ig 결합 단백질의 3개 폴리펩티드 쇄에 대한 아미노산 서열은 FIT-Ig FIT1006-29b(D-A), FIT1006-31b(D-T), 및 FIT1006-35b(D-T)에 대해 하기 표 12, 13 및 14에 제시되어 있다. 이들 FIT-Ig는 조립된 쇄의 N-말단 위치에 BCMA 결합 부위를 갖고, CD3 결합 부위는 Fc 영역에 인접(N-말단)하지만 BCMA 결합 부위의 C-말단에 인접하는 FIT-Ig 구조의 내부에 위치한다. 달리 말하면, 성분 폴리펩티드 쇄의 도메인 구성은 다음과 같다:
쇄 1(장쇄): VLBCMA-CL-VHCD3-CH1-힌지-CH2-CH3;
쇄 2(제1 단쇄): VHBCMA-CH1;
쇄 3(제2 단쇄): VLCD3-CL;
여기서, VLBCMA는 BCMA를 인식하는 인간화 모노클로날 항체의 경쇄 가변 도메인이고, VHCD3은 CD3을 인식하는 인간화 모노클로날 항체의 중쇄 가변 도메인이고, VLCD3은 CD3을 인식하는 인간화 모노클로날 항체의 경쇄 가변 도메인이고, VHBCMA는 BCMA를 인식하는 인간화 모노클로날 항체의 중쇄 가변 도메인이고, 각 CL은 경쇄 불변 도메인(서열번호 27)이고, 각 CH1은 제1 중쇄 불변 도메인이고, CH1-힌지-CH2-CH3은 Fc 영역의 말단을 통한 CH1로부터의 C-말단 중쇄 불변 영역(서열번호 26 참조)이다.
[표 12]
FIT-Ig FIT1006-29b(D-A) 성분 쇄의 아미노산 서열
[표 13]
FIT-Ig FIT1006-31b(D-T) 성분 쇄의 아미노산 서열
[표 14]
FIT-Ig FIT1006-35b(D-T) 성분 쇄의 아미노산 서열
실시예 5.3: 인간화 BCMA/CD3 FIT-Ig의 결합 동역학
BCMA/CD3 이중특이적 FIT-Ig 항체의 결합 친화성 및 동역학 상수는 표준 절차를 사용하여 비아코어(Biacore™) T200 기기(GE Healthcare)를 사용하여 25℃에서 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의해 측정되었다. 결과를 표 15에 제시한다.
간단히 말해서, 전형적 아민 커플링 방법에 따라 헤테로이량체 CD3/Fc 항원 또는 BCMA/Fc 항원을 바이오센서 칩 전체에 직접 고정하고, 이어서 시험 항체를 5㎕/분의 유속으로 반응 매트릭스에 주입하고, 결합 반응을 기록했다. 회합 및 해리 속도 상수, 각각 kon(M-1s-1) 및 koff(s-1)는 30μl/분의 연속 유속으로 결정되었다. 속도 상수는 인간 CD3/Fc 단백질 또는 인간 BCMA/Fc 단백질의 5개 상이한 농도에서 동역학적 결합 측정을 수행함으로써 유도되었다. 이어서, 항체 및 관련 표적 단백질 사이의 반응의 평형 해리 상수 KD(M)를 식 KD = koff/kon을 사용하여 운동 속도 상수로부터 계산했다. 하기 표 15에 기재된 바와 같이, 인간화 항-CD3/인간화 항-BCMA FIT-Ig 항체에 대한 친화성을 측정했다.
[표 15]
인간화 BCMA/CD3 FIT-Ig 결합 단백질에 대한 결합 친화성
실시예 5.4: 인간화 이중특이적 FIT-Ig는 재지시된 CD3 활성화 및 세포독성을 나타냈다
BCMA/CD3 인간화 이중특이적 FIT-Ig 항체의 종양 세포 사멸 효능은 표적 세포로서 인간 골수종 세포주 NCI-H929 및 이펙터 세포로서 인간 T 세포를 사용하여 재지시된 T 세포 세포독성 검정에서 측정되었다. 간략하게 설명하면, 세포를 수확하고, 세척하고, 검정 배지(10% FBS를 포함하는 RPMI1640)로 재현탁시켰다. NCI-H929 세포를 평저 96 웰 플레이트(Corning #3599)에 웰당 5 × 104 세포로 파종했다. T 세포를 상업용 키트(Stemcell #17951)를 사용하여 인간 PBMC로부터 정제하고, 웰당 2 × 105개 세포로 동일한 플레이트에 첨가했다. 이어서, FIT-Ig 결합 단백질을 첨가하고, 세포 혼합물과 함께 인큐베이팅했다. 37℃에서 48시간 인큐베이팅 후, LDH 방출을 검정 키트(Promega #G1780)로 측정했다. 제조업자의 지시에 따라 OD490 판독값을 수득했다. 표적 세포 NCI-H929 최대 용해(100%)로부터 최소 용해(0%)를 뺀 값이 정규화 분모로서 표시되었다. LDH 방출의 백분율을 이중특이적 Ab의 농도에 대해 플롯팅했다. 이 예에서, 인간화 FIT-Ig는 모 키메라 FIT-Ig와 유사한 재지시된 T 세포 세포독성을 나타냈다. 결과를 도 15에 도시했다. 결과는, 본 발명에 따른 인간화 BCMA/CD3 FIT-Ig가 공-배양에서 T 세포 세포독성을 NCI-H929 종양 세포로 재지시할 수 있음을 나타낸다. 도 16 및 17을 참조하면, BCMA-발현 및 CD3-발현 표적 세포에 대한 본 발명에 따른 2개 BCMA/CD3 이중특이적 FIT-Ig 결합 단백질의 결합이 확인된다.
외부 결합 부위가 CD3 Fab 결합 부위이고 내부 결합 부위가 탠덤으로 배열된 Fab 영역의 BCMA Fab 결합 부위인, 2개의 예시적 BCMA/CD3 FIT-Ig 결합 단백질의 대안적 구성이 제조되었고, FIT1006-31a(D-T) 및 FIT1006-35a(D-T)로 명명되었다. 이들 2개의 FIT-Ig에 대한 폴리펩티드 쇄 식은 다음과 같다:
쇄 1(장쇄): VLCD3-CL-VHBCMA-CH1-힌지-CH2-CH3;
쇄 2(제1 단쇄): VHCD3-CH1;
쇄 3(제2 단쇄): VLBCMA-CL;
FIT1006-31a(D-T) 및 FIT1006-35a(D-T)에 대한 폴리펩티드 쇄의 아미노산 서열은 다음과 같다:
[표 16]
FIT-Ig FIT1006-31a(D-T) 성분 쇄의 아미노산 서열
[표 17]
FIT-Ig FIT1006-35a(D-T) 성분 쇄의 아미노산 서열
2개의 대안적 구성의 BCMA-발현 및 CD3-발현 표적 세포에 대한 결합 활성은 각각 도 18 및 도 19에 도시되어 있다. 각각의 표적에 대한 2개의 구성을 비교하면, Fc에 대해 원위에 배치된 대응하는 결합 도메인은 Fc에 근위에 배치된 동일한 결합 도메인보다 비교적 높은 결합 활성을 나타내고, 이는 결합 활성에 대한 구성의 특정 영향을 나타낸다. 그럼에도 불구하고, 결과는 양 구성이 BCMA 및 CD3 모두에 대해 목적하는 표적 결합 활성을 보유하는 것을 확인한다.
실시예 6 BCMA × CD3 FIT-Ig에 의한 치료는 인간 PBMC 이식된 NPSG 마우스에서 NCI-H929 종양 용적을 감소시킨다
항종양 효능은, T 세포, B 세포 및 자연 살해 세포를 결여하는 면역결핍 균주인 NPSG 마우스에서 평가했다. NCI-H929 세포(5×106)를 우측 등쪽 복부 NPSG 마우스에 피하 주사했다. 동일한 일자에, 마우스는 5×106 인간 PBMC의 단일 정맥내 용량을 제공받았다. 11일차에 종양 크기(70~140mm3)에 기초하여 동물을 랜덤화하고, 동일한 일자에 치료를 개시했다. 종양 성장은 캘리퍼스 측정에 의해 모니터링되었다. 연구는 25일차에 종료되었고, 종양 크기가 3000mm3를 초과할 때에 마우스를 안락사시켰다. 마우스를 1주에 1회 3주간(QW × 3), 6mg/kg의 FIT1006-31b(D-T) 또는 FIT1006-35b(D-T) 또는 비히클을 복강내(i.p.) 주사에 의해 치료했다. 도 20에 도시된 바와 같이, FIT-Ig 치료 그룹의 마우스는 비히클 그룹과 비교하여 유의한 종양 성장 억제를 나타냈다. 특히 FIT1006-35b(D-T) 치료 그룹의 경우, 종양은 완전히 근절됐다.
실시예 7 BCMA × CD3 FIT-Ig는 사이노몰구스 원숭이에서 B 세포 모집단을 고갈시키고, 제한된 사이토카인 방출 프로파일을 나타낸다
사이노몰구스 원숭이 B 세포는 인간보다 높은 BCMA 발현을 갖는 것으로 보고되었다[참조: Seckinger, A. et al., (2017). Target Expression, Generation, Preclinical Activity, and Pharmacokinetics of the BCMA-T Cell Bispecific Antibody EM801 for Multiple Myeloma Treatment. Cancer Cell, 31(3), 396-410]. 사이노몰구스 원숭이에서 파일롯 비-GLP 독성학 및 약리학적 연구를 실시하여, 이들 동물의 B 세포 모집단을 고갈시키는 BCMA × CD3 FIT-Ig의 능력을 평가했다. 이들 연구에는 3개 그룹이 있고, 각각은 1마리의 수컷 및 1마리의 암컷 원숭이로 구성되어 있고, 이들 그룹 전체에서 체중은 동등하고, 그룹 1은 비히클을 제공받고, 그룹 2는 0.5mg/kg FIT1006-31b(D-T)의 단일 주사를 제공받고, 그룹 3은 0.5mg/kg FIT1006-35b(D-T)의 단일 주사를 제공받고, 모두는 1일차의 정맥내 주사에 의해 투여했다. 혈액 샘플은, 투여 2일전(-1일차, 기준선), 1일차 투여의 2, 4, 6, 24시간 후, 및 8일차 및 15일차에 전지 또는 후지의 피하 정맥으로부터 수집했다. 혈액 샘플을 FACS에 의해 B 및 T 세포 마커와 T 세포 마커에 대해 분석하고, 각 모집단의 상대적 변화율을 -1일차의 기준선 수준과 비교하여 결정했다. 혈청 샘플은, 시판의 사이토메트릭 비드 어레이(Cytometric Bead Array; CBA) 키트를 사용하여 사이토카인 수준(INFγ, IL-2, IL-6 및 TNFα)에 대해 또한 분석했다.
도 21은, 최초 투여 후의 시점(투여후 2시간)으로부터 최후 시점(15일차)까지의 BCMA × CD3 FIT-Ig의 투여에 기인하는 순환 B 세포의 50% 이상의 고갈을 입증한다. 일시적 B 세포 고갈은 제2 및 제3 시점(1일차의 2시간 및 4시간)까지 비히클 그룹에서 발견되었고, 이는 혈액 샘플링 스케쥴과 관련될 수 있다. 그러나, 비히클 그룹의 B 세포 모집단은 투여후 6시간까지 플래튜에 도달하는 신속한 회복을 나타냈다.
도 22에 도시된 바와 같이, FIT-Ig 치료 그룹의 순환 T 세포 수준은 일시적 상실을 나타내고, 이는 8일차에 비히클 그룹의 수준까지 회복하고, 실험이 종료할 때까지 유지되었다. 일시적 T 세포 상실은 T 세포의 활성화와 치료시의 재분포에 의한 것으로 생각되었다.
본 발명은 상기 기재한 본 발명의 본질적 특징을 벗어나지 않고서 기타 특정 형태로 구체화될 수 있다. 따라서, 전술한 실시형태는 본 명세서에 기재된 본 발명을 한정하는 것이 아니라 예시로서 간주되어야 한다. 본 발명의 범위는 첨부된 청구범위에 의해 제시된다.
SEQUENCE LISTING
<110> Shanghai EpimAb Biotherapeutics Co., Ltd.
<120> Antibodies to CD3，and BCMA and Bispecific Binding Proteins Made Therefrom
<130> PF 200768PCT
<160> 88
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 227
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1
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Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
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50 55 60
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Pro Gly Lys
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<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<213> Artificial
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<220>
<223> Synthetic
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Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr Cys Pro Gln Tyr Pro
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65 70 75 80
Gly Ser Lys Pro Glu Asp Ala Asn Phe Tyr Leu Tyr Leu Arg Ala Arg
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Gly Lys
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<223> Synthetic
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50 55 60
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65 70 75 80
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165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
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Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser
275 280 285
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
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Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
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Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
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<213> Artificial
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<223> Synthetic
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Tyr Val His Trp Met Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
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<223> Synthetic
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Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
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<213> Artificial
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<223> Synthetic
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1 5 10 15
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Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln
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Ser Tyr Ile Leu Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
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Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Gln Ser
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Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
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Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
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65 70 75 80
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Phe
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Gly Ala Phe Tyr Pro Gly Asn Asp Asp Thr Tyr Tyr Asn Gln Lys Phe
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Ser Gly Ser Gly Arg Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
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450 455 460
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
465 470 475 480
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
485 490 495
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
500 505 510
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
515 520 525
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
530 535 540
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
545 550 555 560
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys
565 570 575
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
580 585 590
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
595 600 605
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
610 615 620
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
625 630 635 640
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
645 650 655
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
660
<210> 81
<211> 224
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 81
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Phe
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ala Phe Tyr Pro Gly Asn Asp Asp Thr Tyr Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Ser Ser Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
<210> 82
<211> 219
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 82
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ala
20 25 30
Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln
85 90 95
Ser Tyr Ile Leu Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 83
<211> 670
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 83
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ala
20 25 30
Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln
85 90 95
Ser Tyr Ile Leu Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Glu Val Gln Leu Val
210 215 220
Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser
225 230 235 240
Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Phe Trp Met His Trp Val
245 250 255
Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met Gly Ala Phe Tyr Pro
260 265 270
Gly Asn Asp Asp Thr Tyr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr
275 280 285
Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser
290 295 300
Leu Arg Ser Glu Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Tyr
305 310 315 320
Tyr Gly Ser Ser Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val
325 330 335
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
340 345 350
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
355 360 365
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
370 375 380
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
385 390 395 400
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
405 410 415
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
420 425 430
Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
435 440 445
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe
450 455 460
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
465 470 475 480
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
485 490 495
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
500 505 510
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
515 520 525
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
530 535 540
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
545 550 555 560
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
565 570 575
Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
580 585 590
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
595 600 605
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
610 615 620
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
625 630 635 640
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
645 650 655
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
660 665 670
<210> 84
<211> 222
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 84
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Ser Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Tyr Val His Trp Met Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Ser Pro Gly Ser Asp Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Asp Tyr Gly Asn Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
<210> 85
<211> 214
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 85
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gly Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Gly Ala
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Thr Asn Leu Ala Thr Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Arg Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser Val Leu Thr Thr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 86
<211> 670
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 86
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ala
20 25 30
Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln
85 90 95
Ser Tyr Ile Leu Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Glu Val Gln Leu Val
210 215 220
Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser
225 230 235 240
Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Phe Trp Met His Trp Val
245 250 255
Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met Gly Ala Phe Tyr Pro
260 265 270
Gly Asn Asp Asp Thr Tyr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr
275 280 285
Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser
290 295 300
Leu Arg Ser Glu Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Tyr
305 310 315 320
Tyr Gly Ser Ser Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val
325 330 335
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
340 345 350
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
355 360 365
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
370 375 380
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
385 390 395 400
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
405 410 415
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
420 425 430
Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
435 440 445
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe
450 455 460
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
465 470 475 480
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
485 490 495
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
500 505 510
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
515 520 525
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
530 535 540
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
545 550 555 560
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
565 570 575
Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
580 585 590
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
595 600 605
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
610 615 620
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
625 630 635 640
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
645 650 655
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
660 665 670
<210> 87
<211> 222
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 87
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Ser Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Tyr Val His Trp Met Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Ser Pro Gly Ser Asp Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Asp Tyr Gly Asn Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
<210> 88
<211> 214
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 88
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gly Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Gly Ala
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Thr Asn Leu Ala Thr Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Arg Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser Val Leu Thr Thr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
Claims (21)
- 항-CD3 항체 또는 이의 항원-결합 부분(antigen-binding portion)으로서,
하기 CDR 세트의 그룹으로부터 선택된, CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3의 6개 CDR의 세트를 포함하는, 항-CD3 항체 또는 이의 항원-결합 부분:
- 제1항에 있어서, 하기 VH/VL 쌍으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 VH 및 VL 도메인(domain)을 포함하는, 항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 부분:
- 제1항 또는 제2항에 따른 적어도 하나의 항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 약제학적 조성물.
- CD3-매개 활성 및/또는 BCMA-매개 활성이 유해한 질환 또는 장애를 치료하기 위한 약제의 제조를 위한, 제1항 또는 제2항에 따른 항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 부분의 용도.
- 제4항에 있어서, 상기 질환이 암이고, 임의로 다발성 골수종(multiple myeloma), 흑색종(melanoma)(예: 전이성 악성 흑색종(metastatic malignant melanoma)), 신장암(renal cancer)(예: 투명 세포 암종(clear cell carcinoma)), 전립선암(prostate cancer)(예: 호르몬 난치성 전립선 선암종(hormone refractory prostate adenocarcinoma)), 췌장 선암종(pancreatic adenocarcinoma), 유방암(breast cancer), 결장암(colon cancer), 폐암(lung cancer)(예: 비소세포 폐암(non-small cell lung cancer)), 식도암(esophageal cancer), 두경부의 편평 세포 암종(squamous cell carcinoma of the head and neck), 간암(liver cancer), 난소암(ovarian cancer), 자궁경부암(cervical cancer), 갑상선암(thyroid cancer), 교모세포종(glioblastoma), 신경교종(glioma), 백혈병(leukemia), 림프종(lymphoma), 및 원발성 골암(primary bone cancer)(예: 골육종(osteosarcoma), 유잉 육종(Ewing sarcoma), 악성 섬유성 조직구종(malignant fibrous histiocytoma) 또는 연골육종(chondrosarcoma))으로부터 선택되는, 용도.
- 제1, 제2 및 제3 폴리펩티드 쇄를 포함하는 결합 단백질 또는 이의 FIT-Fab 단편으로서,
상기 제1 폴리펩티드 쇄는, 아미노 말단으로부터 카복실 말단까지, (i) VLA-CL-VHB-CH1-Fc(여기서, CL은 VHB에 직접 융합됨), 또는 (ii) VHB-CH1-VLA-CL-Fc(여기서, CH1은 VLA에 직접 융합됨)를 포함하고;
상기 제2 폴리펩티드 쇄는, 아미노 말단으로부터 카복실 말단까지, VHA-CH1을 포함하고;
상기 제3 폴리펩티드 쇄는, 아미노 말단으로부터 카복실 말단까지, VLB-CL을 포함하고;
여기서, VL은 경쇄 가변 도메인이고, CL은 경쇄 불변 도메인이고, VH는 중쇄 가변 도메인이고, CH1은 중쇄 불변 도메인이고, Fc는 면역글로불린 Fc 영역이고, A는 CD3 또는 BCMA의 에피토프(epitope)이고, B는 CD3 또는 BCMA의 에피토프이고, 단 A 및 B는 상이하고, 상기 결합 단백질은 CD3 및 BCMA 둘 다에 결합할 수 있는, 결합 단백질, 또는 이의 FIT-Fab 단편. - 제6항에 있어서, 상기 VLA 및 VHA가 항원 표적 CD3 또는 BCMA 중 하나에 결합하는 모 항체(parental antibody)로부터의 가변 도메인이고, 상기 VLB 및 VHB가 항원 표적 CD3 또는 BCMA의 다른 하나에 결합하는 상이한 모 항체로부터의 가변 도메인인, 결합 단백질 또는 FIT-Fab 단편.
- 제7항에 있어서,
상기 제1 폴리펩티드 쇄가, 아미노 말단으로부터 카복실 말단까지, VLCD3-CL-VHBCMA-CH1-Fc를 포함하고, 여기서 CL은 VHBCMA에 직접 융합되고, 상기 제2 폴리펩티드 쇄가, 아미노 말단으로부터 카복실 말단까지, VHCD3-CH1을 포함하고, 상기 제3 폴리펩티드 쇄가, 아미노 말단으로부터 카복실 말단까지, VLBCMA-CL을 포함하거나;
상기 제1 폴리펩티드 쇄가, 아미노 말단으로부터 카복실 말단까지, VLBCMA-CL-VHCD3-CH1-Fc를 포함하고, 여기서 CL은 VHCD3에 직접 융합되고, 상기 제2 폴리펩티드 쇄가, 아미노 말단으로부터 카복실 말단까지, VHBCMA-CH1을 포함하고, 상기 제3 폴리펩티드 쇄가, 아미노 말단으로부터 카복실 말단까지, VLCD3-CL을 포함하거나;
상기 제1 폴리펩티드 쇄가, 아미노 말단으로부터 카복실 말단까지, VHBCMA-CH1-VLCD3-CL-Fc를 포함하고, 여기서 CH1은 VLCD3에 직접 융합되고, 상기 제2 폴리펩티드 쇄가, 아미노 말단으로부터 카복실 말단까지, VLBCMA-CL을 포함하고, 상기 제3 폴리펩티드 쇄가, 아미노 말단으로부터 카복실 말단까지, VHCD3-CH1을 포함하거나; 또는
상기 제1 폴리펩티드 쇄는 아미노 말단으로부터 카복실 말단까지, VHCD3-CH1-VLBCMA-CL-Fc를 포함하고, 여기서 CH1은 VLBCMA에 직접 융합되고, 상기 제2 폴리펩티드 쇄가, 아미노 말단으로부터 카복실 말단까지, VLCD3-CL을 포함하고, 상기 제3 폴리펩티드 쇄가, 아미노 말단으로부터 카복실 말단까지, VHBCMA-CH1을 포함하고;
여기서, VLCD3은 항-CD3 항체의 경쇄 가변 도메인이고, CL은 항체 경쇄 불변 도메인이고, VHCD3은 항-CD3 항체의 중쇄 가변 도메인이고, CH1은 항체 제1 중쇄 불변 도메인이고, VLBCMA는 항-BCMA 항체의 경쇄 가변 도메인이고, VHBCMA는 항-BCMA 항체의 중쇄 가변 도메인이고, Fc는 항체 Fc 영역인, 결합 단백질 또는 FIT-Fab 단편. - 제8항에 있어서, 상기 도메인 VLCD3-CL이 항-CD3 모 항체의 경쇄와 동일하고, 도메인 VHCD3-CH1이 항-CD3 모 항체의 중쇄 가변 및 중쇄 제1 불변 도메인과 동일하고, 도메인 VLBCMA-CL이 항-BCMA 모 항체의 경쇄와 동일하고, 도메인 VHBCMA-CH1이 항-BCMA 모 항체의 중쇄 가변 및 중쇄 제1 불변 도메인과 동일한, 결합 단백질 또는 FIT-Fab 단편.
- 제6항에 있어서,
상기 제1 폴리펩티드 쇄가 서열번호 50의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 폴리펩티드 쇄가 서열번호 51의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제3 폴리펩티드 쇄가 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하거나;
상기 제1 폴리펩티드 쇄가 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 폴리펩티드 쇄가 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제3 폴리펩티드 쇄가 서열번호 55의 아미노산 서열을 포함하거나;
상기 제1 폴리펩티드 쇄가 서열번호 80의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 폴리펩티드 쇄가 서열번호 81의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제3 폴리펩티드 쇄가 서열번호 82의 아미노산 서열을 포함하거나;
상기 제1 폴리펩티드 쇄가 서열번호 83의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 폴리펩티드 쇄가 서열번호 84의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제3 폴리펩티드 쇄가 서열번호 85의 아미노산 서열을 포함하거나; 또는
상기 제1 폴리펩티드 쇄가 서열번호 86의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 폴리펩티드 쇄가 서열번호 87의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제3 폴리펩티드 쇄가 서열번호 88의 아미노산 서열을 포함하는, 결합 단백질 또는 FIT-Fab 단편. - 제6항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 결합 단백질 또는 FIT-Fab 단편, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
- CD3-매개 활성 및/또는 BCMA-매개 활성이 유해한 질환 또는 장애를 치료하기 위한 약제의 제조를 위한, 제6항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 결합 단백질 또는 FIT-Fab 단편의 용도.
- 제12항에 있어서, 상기 질환이 암이고, 임의로 다발성 골수종(multiple myeloma), 흑색종(melanoma)(예: 전이성 악성 흑색종(metastatic malignant melanoma)), 신장암(renal cancer)(예: 투명 세포 암종(clear cell carcinoma)), 전립선암(prostate cancer)(예: 호르몬 난치성 전립선 선암종(hormone refractory prostate adenocarcinoma)), 췌장 선암종(pancreatic adenocarcinoma), 유방암(breast cancer), 결장암(colon cancer), 폐암(lung cancer)(예: 비소세포 폐암(non-small cell lung cancer)), 식도암(esophageal cancer), 두경부의 편평 세포 암종(squamous cell carcinoma of the head and neck), 간암(liver cancer), 난소암(ovarian cancer), 자궁경부암(cervical cancer), 갑상선암(thyroid cancer), 교모세포종(glioblastoma), 신경교종(glioma), 백혈병(leukemia), 림프종(lymphoma), 및 원발성 골암(primary bone cancer)(예: 골육종(osteosarcoma), 유잉 육종(Ewing sarcoma), 악성 섬유성 조직구종(malignant fibrous histiocytoma) 또는 연골육종(chondrosarcoma))으로부터 선택되는, 용도.
- CD3-매개 및/또는 BCMA-매개 활성이 유해한 장애를 치료하는 방법으로서,
제6항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 유효량의 결합 단백질 또는 FIT-Fab 단편, 또는 이의 조합을 이를 필요로 하는 대상체(subject)에게 투여하는 것을 포함하는, 방법. - 제14항에 있어서, 상기 질환이 암이고, 임의로 다발성 골수종(multiple myeloma), 흑색종(melanoma)(예: 전이성 악성 흑색종(metastatic malignant melanoma)), 신장암(renal cancer)(예: 투명 세포 암종(clear cell carcinoma)), 전립선암(prostate cancer)(예: 호르몬 난치성 전립선 선암종(hormone refractory prostate adenocarcinoma)), 췌장 선암종(pancreatic adenocarcinoma), 유방암(breast cancer), 결장암(colon cancer), 폐암(lung cancer)(예: 비소세포 폐암(non-small cell lung cancer)), 식도암(esophageal cancer), 두경부의 편평 세포 암종(squamous cell carcinoma of the head and neck), 간암(liver cancer), 난소암(ovarian cancer), 자궁경부암(cervical cancer), 갑상선암(thyroid cancer), 교모세포종(glioblastoma), 신경교종(glioma), 백혈병(leukemia), 림프종(lymphoma), 및 원발성 골암(primary bone cancer)(예: 골육종(osteosarcoma), 유잉 육종(Ewing sarcoma), 악성 섬유성 조직구종(malignant fibrous histiocytoma) 또는 연골육종(chondrosarcoma))으로부터 선택되는, 용도.
- 제14항 또는 제15항에 있어서, 상기 대상체가 인간인, 방법.
- 항-BCMA 항체 또는 이의 항원-결합 부분으로서,
하기 CDR 세트의 그룹으로부터 선택된, CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3의 6개 CDR의 세트를 포함하는, 항-BCMA 항체 또는 이의 항원-결합 부분:
- 제17항에 있어서, 하기 VH/VL 쌍으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 VH 및 VL 도메인을 포함하는, 항-BCMA 항체 또는 이의 항원 결합 부분:
- 제17항 또는 제18항에 따른 적어도 하나의 항-BCMA 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
- CD3-매개 활성 및/또는 BCMA-매개 활성이 유해한 질환 또는 장애를 치료하기 위한 약제의 제조를 위한, 제17항 또는 제18항에 따른 항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 부분의 용도.
- 제20항에 있어서, 상기 질환이 암이고, 임의로 다발성 골수종(multiple myeloma), 흑색종(melanoma)(예: 전이성 악성 흑색종(metastatic malignant melanoma)), 신장암(renal cancer)(예: 투명 세포 암종(clear cell carcinoma)), 전립선암(prostate cancer)(예: 호르몬 난치성 전립선 선암종(hormone refractory prostate adenocarcinoma)), 췌장 선암종(pancreatic adenocarcinoma), 유방암(breast cancer), 결장암(colon cancer), 폐암(lung cancer)(예: 비소세포 폐암(non-small cell lung cancer)), 식도암(esophageal cancer), 두경부의 편평 세포 암종(squamous cell carcinoma of the head and neck), 간암(liver cancer), 난소암(ovarian cancer), 자궁경부암(cervical cancer), 갑상선암(thyroid cancer), 교모세포종(glioblastoma), 신경교종(glioma), 백혈병(leukemia), 림프종(lymphoma), 및 원발성 골암(primary bone cancer)(예: 골육종(osteosarcoma), 유잉 육종(Ewing sarcoma), 악성 섬유성 조직구종(malignant fibrous histiocytoma) 또는 연골육종(chondrosarcoma))으로부터 선택되는, 용도.
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