CN106279418A - Bcma（cd269/tnfrsf17）结合蛋白 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及抗原结合蛋白及其片段，所述抗原结合蛋白及其片段特异性结合B细胞成熟抗原(BCMA)、特别是人BCMA(hBCMA)并且抑制BAFF和APRIL对BCMA受体的结合。进一步公开了药物组合物，筛选和医学治疗方法。

Description

BCMA(CD269/TNFRSF17)结合蛋白
本申请是以下申请的分案申请：申请日：2012年5月24日；申请号：201280025793.1(PCT/EP2012/059762)；发明名称：同上。
技术领域
本发明涉及特异性结合B细胞成熟抗原(BCMA)和特别是人BCMA(hBCMA)的抗原结合蛋白及其片段。
本发明还涉及用所述抗原结合片段治疗疾病或失调的方法、包含所述抗原结合片段的药物组合物和制造方法。本发明的其它实施方案通过下面的描述将是显而易见的。
发明背景
BCMA(CD269或TNFRSF17)是TNF受体超家族的成员。其是对配体BAFF和APRIL的非糖基化的内在膜受体。BCMA的配体还可以结合额外的受体：TACI(跨膜激活物和钙调节物和亲环素配体相互作用物)，其结合APRIL和BAFF，以及BAFF-R(BAFF受体或BR3)，其显示对BAFF受限的但高亲和力。总之，这些受体和它们的相应配体调节体液免疫、B细胞发育和稳态的不同方面。
BCMA的表达通常限于B细胞谱系，并且有报告在终末B细胞分化中增加。BCMA由人浆母细胞、来自扁桃体，脾和骨髓的浆细胞，还由扁桃体记忆B细胞和由生发中心B细胞表达，其具有TACI-BAFFR低表型(Darce等，2007)。BCMA实际上不存在于幼稚和记忆B细胞上(Novak等，2004a和b)。BCMA抗原表达在细胞表面所以可以接触抗体，但也表达在高尔基体中。如其表达概况所表明，BCMA信号传递(通常与B细胞存活和增殖有关)在B细胞分化的晚期，以及长寿命骨髓浆细胞(O’Connor等，2004)和浆母细胞(Avery等，2003)的存活中是重要的。并且，由于BCMA以高亲和力结合APRIL，表明BCMA-APRIL信号传递轴在B细胞分化的更晚期是主要的，可能是生理上最相关的相互作用。
多发性骨髓瘤(MM)是克隆性B细胞恶性肿瘤，其在蔓延到循环之前发生于骨髓内的多个位点，或者从头，或者作为意义未明的单克隆丙种球蛋白病(MGUS)的进展。其通常表征为异常蛋白和破骨细胞的活性，以及高血钙症、血细胞减少症、肾功能不全、高粘和外周神经病变的增加。正常抗体水平和中性粒细胞数的减少也很普遍，导致危及生命的对感染的易感性。BCMA已经与骨髓瘤细胞系的体外生长和存活有牵连(Novak等，2004年a和b；Moreaux等，2004)。
BCMA表达(转录物和蛋白两者)据报告与MM中疾病进展有关。使用Affymetrix微阵列，证明TACI和BCMA基因与它们的正常对应物(Moreaux等，2004)相比，在多发性骨髓瘤细胞(MMC)中过度表达。基因表达分析已用于比较人骨髓瘤细胞与来自MGUS患者和来自正常骨髓的纯化的浆细胞，以及与来自B细胞谱系白血病的原发肿瘤细胞(Bellucci等，2005)。所述BCMA基因在所有骨髓瘤样品中高表达。虽然来自MGUS患者的纯化的浆细胞具有BCMA的较低表达，但是当与在正常浆细胞或骨髓瘤细胞中发现的表达相比时没有显著的差异。相反，在B细胞慢性淋巴细胞白血病(CLL)，前-B急性淋巴细胞白血病(ALL)和T细胞ALL(T-ALL)中BCMA表达显著更低。
转基因过度表达BAFF或APRIL的小鼠模型具有B细胞淋巴瘤的显著增加(Batten等，2004–BAFF；；Planelles等，2004–APRIL)。在人类中，在具有一些B细胞恶性肿瘤，以及其他B细胞失调的患者的血清和微环境中已检测到过量的BAFF和APRIL。
本说明书内公开的所有专利和文献参考通过引用清楚和完整地并入本文。
附图简述
图1：FMAT结合测定——图显示对CA8抗体结合到表达人和食蟹猴BCMA的HEK293细胞的FMAT测定的结果。人嵌合CA8良好地结合到表达人和食蟹猴BCMA的细胞。
图2：ELISA结合测定——图显示对CA8抗体结合到人和食蟹猴BCMA重组蛋白的ELISA结果。这清楚地显示人嵌合CA8抗体等同地结合人和食蟹猴BCMA蛋白。
图3：BiaCore结合测定——图显示在Biacore实验中CA8对BCMA-Fc、TACI-Fc和BAFF-R-Fc蛋白的结合。CA8嵌合抗体不结合TACI或BAFF-R蛋白。
图4：细胞结合测定——图显示如通过FACS确定的鼠S307118G03、S3222110D07、S332121F02和S332126E04对H929多发性骨髓瘤细胞，以及S3322110D07、S332121F02和S332126E04对BCMA转染的ARH77细胞的结合。
多发性骨髓瘤细胞系H929或ARH77-hBCMA 10B5表达BCMA的转染细胞用鼠抗BCMA抗体(实心柱状图)或鼠IgG2a同种型对照(空心柱状图)染色。细胞通过FACS分析以检测结合到细胞的抗体。
图5：细胞结合测定——图显示如通过FACS确定的嵌合CA8对一组多发性骨髓瘤细胞系的结合。通过流式细胞术测试对H929、OPM-2、JJN-3和U266的结合，并且测量平均荧光强度(MFI)值以确定结合。帕利珠单抗用作不相关同种型对照。
图6：细胞结合测定——图显示如FACS确定的人源化CA8变体对BCMA转染的ARH77细胞(A)和多发性骨髓瘤H929细胞(B)的结合曲线。人源化变体J6M0、J6M1、J6M2、J9M0、J9M1和J9M2通过流式细胞术测试并且测量平均荧光强度(MFI)值以确定相比CA8嵌合体的结合。
图7：配体中和测定——
(A和B)图显示CA8和J6M0中和重组BAFF或APRIL对包被在ELISA板上的重组BCMA的结合的能力。OD值用于计算通过相关配体单独结合重组BCMA获得的最大信号的抗体介导的抑制。数据报告为最大信号的百分比抑制。所测试的抗体是以野生型和去岩藻糖基化(Potelligent)的形式的嵌合CA8和人源化的CA8版本J6M0。
(A)BAFF配体结合的中和；(B)APRIL配体结合的中和。
(C)图显示J6M0 BCMA抗体在H929细胞中抑制BAFF或APRIL诱导的NFκB磷酸化的能力。H929细胞清洗3次以去除任何可溶的BCMA(sBCMA)并重悬在无血清培养基中。将J6M0potelligent抗体添加到96孔板以获得100μg/mL的最终孔浓度，连同BAFF或APRIL配体以分别获得0.6或0.2μg/mL的最终孔浓度。H929细胞然后在无血清培养基中以7.5x104细胞/孔铺板。30分钟后，裂解细胞并使用MSD pNFκB测定来测量磷酸化的NFκB水平。MSD读板器读数502819。这是来自一个独立的实验的数据。每个数据点是两次重复的平均值/sd。
图8：ADCC测定-——图显示嵌合CA8和去岩藻糖化(Fc增强的)CA8对表达BCMA的靶细胞的ADCC活性。
人NK细胞与铕标记的ARH77 10B5 BCMA转染的靶细胞在存在各种浓度的抗体的情况下孵育。测量从靶细胞释放的铕并计算特异性裂解。(A)嵌合CA8相比同种型对照的ADCC剂量应答曲线。(B)嵌合CA8和去岩藻糖化的嵌合CA8(Fc增强的)针对表达BCMA的细胞系ARH7710B5的ADCC剂量应答曲线。
图9：ADCC测定——图显示使用ARH77表达BCMA的靶细胞对CA8人源化抗体的ADCC测定。
人PBMC与铕标记的ARH77 BCMA转染的靶细胞在存在一系列浓度的人源化CA8抗体的J5、J6、J7、J8或J9系列的情况下孵育。测量从靶细胞释放的铕并计算特异性裂解。EC50值以μg/mL显示。
图10：ADCC测定——图显示嵌合的S332121F02(A)、S3322110D07(B)S307118G03(C)和人源化的S307118G03 H3L0(D)针对ARH77 10B5靶细胞并以纯化的NK细胞作为效应细胞的ADCC活性。人NK靶细胞与铕标记的ARH77 10B5 BCMA转染的靶细胞在存在各种浓度的抗体的情况下孵育。测量从靶细胞释放的铕并计算特异性裂解。
图11：活力测定剂量应答曲线——图显示细胞活力测定中对于嵌合CA8抗体、嵌合CA8-vcMMAE和嵌合CA8-mcMMAF抗体-药物缀合物在人多发性骨髓瘤细胞系(A)NCI-H929(B)U266-B1(C)JJN3和(D)OPM2z中的剂量应答曲线。将抗体添加到细胞并在96小时后使用CelltiterGlo测量有活力的细胞数。数据点表示三次重复的CellTiterGlo测量的平均。误差条表示标准误差。
图12：CA8嵌合抗体对细胞周期的影响
(A)对所指示的时间点的用50ng/mL的未缀合的嵌合CA8、嵌合CA8-vcMMAE ADC或嵌合CA8-mcMMAF ADC处理的NCI-H929细胞的细胞周期柱状图。紫杉醇(100nM)(Pactitaxel)用作G2/M细胞周期阻滞和细胞死亡的阳性对照。对照人IgG1用作阴性对照。在图上所示时间进行细胞周期分析。对每个所指示的处理的(B)指示G2/M阻滞的4N DNA细胞群体定量，和(C)指示细胞死亡的亚-2N DNA细胞群体定量。细胞种植在12孔板中(2x105细胞/孔，在1mLRPMI+10％FBS中)。抗体或ADC在细胞种植6小时后添加。
图13：嵌合CA8对磷酸化组蛋白H3的影响
嵌合CA8ADC处理造成NCI-H929细胞的磷酸化组蛋白H3染色增加。
(A，B)用对照IgG(A)或嵌合CA8-mcMMAF(B)处理后，用碘化丙啶染色以测量DNA含量(FL3-H)x轴和抗磷酸化组蛋白H3(Thr11)抗体(FL1-H)y轴的细胞的点图。(C)用所指示浓度的嵌合CA8ADC处理48小时后，磷酸化组蛋白H3阳性NCI-H929细胞的定量。紫杉醇(100nM)用作有丝分裂阻滞的阳性对照，并且对照嵌合IgG1用作阴性对照。细胞种植在12孔板中(2x105细胞/孔，在1mLRPMI+10％FBS中)。抗体或ADC在细胞种植6小时后添加。
图14：嵌合CA8对膜联蛋白V的影响。
嵌合CA8ADC处理导致NCI-H929细胞的膜联蛋白V染色增加。
(A，B)用浓度逐渐增加的嵌合CA8ADC处理后膜联蛋白-V-FITC(FL1-H；顶部小图)和活细胞碘化丙啶染色(FL3-H；底部小图)的柱状图。(B)用所指示浓度的嵌合CA8ADC处理96小时后，膜联蛋白V阳性NCI-H929细胞的定量。紫杉醇(100nM)用作细胞凋亡的阳性对照，并且对照嵌合IgG1用作阴性对照。细胞种植在12孔板中(2x105细胞/孔，在1mLRPMI+10％FBS中)。抗体或ADC在细胞种植6小时后添加。
图15：活力测定剂量应答曲线——图显示嵌合CA8或人源化J6M0抗体的未缀合的(裸的)和vcMMAE和mcMMAF抗体-药物缀合物的剂量应答曲线。抗体药物缀合物针对人多发性骨髓瘤细胞系NCI-H929和OPM2进行测试。
图16：活力测定剂量应答曲线——图显示在人多发性骨髓瘤细胞系NCI-H929和U266-B1中鼠抗BCMA抗体S332121F02、S322110D07、S332126E04和S307118G03的未缀合的抗体和vcMMAE和mcMMAF抗体-药物缀合物的剂量应答曲线。
图17 ADC J6M0分子的ADCC活性——图显示使用ARH77表达BCMA的靶细胞对J6M0抗体的ADCC测定。人PBMC与铕标记的ARH77 BCMA转染的靶细胞在存在一系列浓度的缀合到MMAE、MMAF或为未缀合的J6M0 WT和potelligent BCMA抗体的情况下孵育。在Victor 21420多标记读板器上监测铕释放。
图18 CA8 J6M0 Potelligent针对一组5个多发性骨髓瘤细胞系的ADCC剂量应答曲线——人PBMC与多发性骨髓瘤靶细胞在存在不同浓度的CA8 J6M0 potelligent抗体的情况下以50：1的E：T比例孵育18小时。然后通过FACS使用荧光标记的抗CD138抗体测量保留在效应物加靶混合物中的靶细胞的百分比，以检测靶细胞并且计算百分比毒性。A)CA8J6M0 potelligent针对所测试的5种多发性骨髓瘤细胞系的实例剂量应答曲线。每个数据点来自单次重复(singlicate)值。
图19在CB.17 SCID小鼠中，J6M0和缀合药物的J6M0对NCI-H929细胞的生长和建立的剂量增加效果——经过每周两次腹膜内给药50或100μg未缀合的，或缀合到MMAE或MMAF的J6M0抗BCMA或IgG1同种型对照两周后，在CB17 SCID小鼠中NCI-H929肿瘤的计算的肿瘤体积。数据点表示每组n＝5的平均肿瘤体积。
图20——来自健康志愿者和骨髓瘤患者的血清中可溶性BCMA水平的确定。从MM患者样品收集的血清样品来自多个阶段(进展性疾病、减轻、复发、新近诊断的和其它)。图中显示的样品是那些来自血清的样品，在测定前1/500稀释。
使用来自R&D Systems的人BCMA/TNFRSF17夹心ELISA试剂盒(其测量可溶性人BCMA水平)按照试剂盒提供的标准方案检测BCMA。
发明概述
本发明提供了结合膜结合靶的抗原结合蛋白，并且所述抗原结合蛋白能够内化。在进一步的实施方案中，提供了包括本发明抗原结合蛋白和毒性剂的免疫缀合物。在进一步的实施方案中，所述抗原结合蛋白具有ADCC效应物功能，例如所述抗原结合蛋白具有增强的ADCC效应物功能。
本发明提供了特异性地结合BCMA的抗原结合蛋白，例如特异性地结合BCMA和抑制BAFF和/或APRIL对BCMA受体结合的抗体。本发明还提供特异性结合BCMA和抑制BAFF和/或APRIL对BCMA结合的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白能够结合FcγRIIIA或能够发挥FcγRIIIA介导的效应物功能。
本发明抗原结合蛋白特异性地结合BCMA和抑制BAFF和/或APRIL对BCMA结合，其中所述抗原结合蛋白具有增强的对FcγRIIIA的结合或具有增强的FcγRIIIA介导的效应物功能。在一个实施方案中，所述抗原结合蛋白能够内化。
在本发明的一个方面，提供了如本文所述的根据本发明的抗原结合蛋白，其结合非膜结合的BCMA，例如血清BCMA。
在本发明的一个实施方案中，提供了包括本发明抗原结合蛋白和毒性剂的免疫缀合物。
在进一步的实施方案中，所述抗原结合蛋白缀合到毒素例如奥瑞斯汀(auristatin)。在又一个实施方案中，所述药物缀合物是vcMMAE或mcMMAF。在一个实施方案中，所述免疫缀合物还是ADCC增强的。
所述本发明的抗原结合蛋白可涉及，或衍生自鼠单克隆抗体CA8。所述CA8鼠重链可变区氨基酸序列提供为SEQ ID NO.7，并且所述CA8鼠轻链可变区氨基酸序列提供为SEQID NO.9。
所述抗原结合蛋白可涉及，或衍生自鼠单克隆抗体S336105A07。所述S336105A07鼠重链可变区氨基酸序列提供为SEQ ID NO.140，并且所述S336105A07鼠轻链可变区氨基酸序列提供为SEQ ID NO.144。
本发明的抗原结合蛋白还可以衍生自的其它鼠单克隆抗体包括在表C中。
所述抗原结合蛋白的重链可变区(VH)可以包括下列CDR或这些CDR的变体(如Kabat所定义(Kabat等:Sequences ofproteins ofImmunological InterestNIH,1987))：
CDRH1提供为SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.182
CDRH2提供为SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.183
CDRH3提供为SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.184
所述抗原结合蛋白的轻链可变区(VL)可以包括下列CDR或这些CDR的变体(如Kabat所定义(Kabat等:Sequences of proteins of Immunological InterestNIH,1987))：
CDRL1提供为SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.185
CDRL2提供为SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.186
CDRL3提供为SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.187
本发明还提供编码本文所述任何抗原结合蛋白的重链可变区的多核苷酸序列，和编码本文所述任何抗原结合蛋白的轻链可变区的多核苷酸序列。
本发明还提供编码本文所述任何抗原结合蛋白的重链的多核苷酸序列，和编码本文所述任何抗原结合蛋白的轻链的多核苷酸序列。
这些多核苷酸表示对应等价多肽序列的编码序列，但是将明白这些多核苷酸序列可以与起始密码子、适当的信号序列和终止密码子一起克隆进表达载体。
本发明还提供重组转化的或转染的宿主细胞，所述宿主细胞包括一种或多种编码本文所述任何抗原结合蛋白的重链和/或轻链的多核苷酸。
本发明进一步提供用于生产本文所述任何抗原结合蛋白的方法，所述方法包括在适当的培养基，例如无血清培养基中培养宿主细胞的步骤，所述宿主细胞包括第一和第二载体，所述第一载体包括编码本文所述任何抗原结合蛋白的重链的多核苷酸并且所述第二载体包括编码本文所述任何抗原结合蛋白的轻链的多核苷酸。
本发明进一步提供包括如本文所述的抗原结合蛋白的药物组合物和药学可接受的载体。
在进一步的方面，本发明提供治疗或预防对抑制或阻断BCMA，例如调节BCMA和其配体BAFF或APRIL的相互作用有应答的疾病或失调的方法，所述方法包括向所述患者施用治疗有效量的如本文所述的其抗原结合蛋白的步骤。
因此本发明的一个目标是提供对治疗B细胞相关的失调或疾病例如抗体介导的或浆细胞介导的疾病或浆细胞恶性肿瘤例如如多发性骨髓瘤(MM)的治疗方法。具体而言，本发明的目标是提供抗原结合蛋白，尤其是特异性结合BCMA(例如，hBCMA)并调节(即抑制或阻断)BCMA和其配体例如BAFF和/或APRIL之间相互作用的抗体，在对该相互作用的调节有应答的疾病或失调的治疗中。
在本发明的另一方面，提供了治疗患有B细胞相关失调或疾病例如抗体介导的或浆细胞介导的疾病或浆细胞恶性肿瘤例如如多发性骨髓瘤(MM)的人患者的方法，所述方法包括向所述患者施用治疗有效量的如本文所述的抗原结合蛋白的步骤。
在本发明的另一方面，提供了治疗患有类风湿关节炎、牛皮癣、1型糖尿病或多发性硬化症的人患者的方法，所述方法包括向所述患者施用治疗有效量的如本文所述的抗原结合蛋白的步骤。
发明详述
本发明提供了结合膜结合靶的抗原结合蛋白，并且其中所述抗原结合蛋白能够内化。在进一步的实施方案中，提供了包括本发明抗原结合蛋白和毒性剂的免疫缀合物。在进一步的实施方案中，所述抗原结合蛋白具有ADCC效应物功能，例如所述抗原结合蛋白具有增强的ADCC效应物功能。
在一个该实施方案中，提供了特异性地结合BCMA的抗原结合蛋白或其片段，例如特异性地结合人BCMA(hBCMA)和抑制BAFF和/或APRIL与BCMA受体结合的抗体。
在进一步的实施方案中，本发明的抗原结合蛋白或片段特异性结合BCMA并抑制BAFF和/或APRIL与BCMA的结合，其中所述抗原结合蛋白或其片段具有结合FcγRIIIA并介导FcgRIIIA介导的效应物功能的能力，或具有增强的FcγRIIIA介导的效应物功能。在如本文提供的本发明的一个实施方案中，抗原结合蛋白能够内化。
在本发明的一个方面，提供了如本文所述的根据本发明的抗原结合蛋白，其结合非膜结合的BCMA，例如血清BCMA。
在本发明的一个方面，提供如本文所述的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白包括SEQ ID NO.3的CDRH3或SEQ ID NO.3的变体。
在本发明的一个进一步的方面，提供如本文所述的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白进一步包括一个或多个：SEQ ID NO:1的CDR H1，CDRH2:SEQ ID NO:2:CDRL1:SEQID NO:4,CDRL2:SEQ ID NO:5和/或CDRL3:SEQ ID NO:6和或其变体
在本发明的一个方面，提供如本文所述的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白包括SEQ ID NO.184的CDRH3或SEQ ID NO.184的变体。
在本发明的一个进一步的方面，提供如本文所述的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白进一步包括一个或多个：SEQ ID NO:182的CDR H1，CDRH2:SEQ ID NO:183:CDRL1:SEQ ID NO:185,CDRL2:SEQ ID NO:186和/或CDRL3:SEQ ID NO:187和或其变体
在又进一步的方面，所述抗原结合蛋白包括SEQ ID NO:3的CDR H3:CDRH2:SEQ ID NO:2:SEQ ID NO:1的CDR H1:CDRL1:SEQ ID NO:4:CDRL2:SEQ ID NO:5和CDRL3:SEQ ID NO:6。
在又进一步的方面，所述抗原结合蛋白包括SEQ ID NO:184的CDR H3:CDRH2:SEQID NO:183:SEQ ID NO:182的CDR H1:CDRL1:SEQ ID NO:185:CDRL2:SEQ ID NO:186和CDRL3:SEQ ID NO:187。
在本发明的一个方面，所述抗原结合蛋白具有增强的效应物功能。在另一方面，所述抗原结合蛋白缀合到细胞毒性剂。在又进一步的实施方案中，所述抗原结合蛋白具有增强的效应物功能并且缀合到细胞毒性剂。
本发明的抗原结合蛋白可以包括本发明的重链可变区和轻链可变区，其可以编排入天然抗体或功能片段或等价物的结构中。当与适当的轻链配对时，本发明的抗原结合片段从而可以包括编排入全长抗体、(Fab’)2片段、Fab片段或其等价物(例如scFV，双、三链或四链抗体，Tandabs等)的本发明的VH区。抗体可以是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4；或IgM；；IgA、IgE或IgD或其修饰的变体。抗体重链的恒定结构域可以相应的选择。轻链恒定区可以是κ或λ恒定区。进一步，所述抗原结合蛋白可以包括所有类型的修饰，例如IgG二体、不结合Fc受体或介导C1q结合的Fc突变体。所述抗原结合蛋白还可以是WO86/01533中描述的类型的嵌合抗体，其包括抗原结合区和非免疫球蛋白区。
所述恒定区根据任何所需的功能性选择，例如，IgG1可以通过结合补体展示裂解能力和/或将介导ADCC(抗体依赖的细胞毒性)。
本发明的抗原结合蛋白衍生自具有如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:9中描述的可变区的鼠抗体或其非鼠等价物，例如大鼠、人、其嵌合或人源化的变体，例如它们衍生自具有如SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:29中描述的可变重链序列和/或如SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33和/或SEQ ID NO:35中描述的可变轻链序列的抗体。
在另一个实施方案中，所述本发明的抗原结合蛋白衍生自具有如SEQ ID NO:116或SEQ ID NO:118描述的可变重链序列和/或如SEQ ID NO:120或SEQ ID NO:122描述的可变轻链序列的抗体。
在另一个实施方案中，所述本发明的抗原结合蛋白衍生自具有如SEQ ID NO:140描述的可变重链序列和/或如SEQ ID NO:144描述的可变轻链序列的抗体。
在本发明的一个方面，提供包括选自下列任一个的分离的重链可变结构域的抗原结合蛋白：SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:116或SEQ ID NO:118。
在本发明的另一个方面，提供包括选自下列任一个的分离的轻链可变结构域的抗原结合蛋白：SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33or SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:120或SEQ ID NO:122。
在本发明的一个进一步的方面，提供一种抗原结合蛋白，其包括选自下列任一个的分离的重链可变结构域：SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:29，和选自下列任一个的分离的轻链可变结构域：SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33和/或SEQID NO:35。
在一个方面，本发明的抗原结合蛋白包括由SEQ ID NO:23编码的重链可变区和由SEQ ID NO:31编码的轻链可变区。
在一个方面，本发明的抗原结合蛋白包括由SEQ ID NO:27编码的重链可变区和由SEQ ID NO:31编码的轻链可变区。
在一个方面，本发明的抗原结合蛋白包括由SEQ ID NO:29编码的重链可变区和由SEQ ID NO:31编码的轻链可变区。
在一个方面，本发明的抗原结合蛋白包括由SEQ ID NO:116编码的重链可变区和由SEQ ID NO:120编码的轻链可变区。
在一个方面，本发明的抗原结合蛋白包括由SEQ ID NO:118编码的重链可变区和由SEQ ID NO:122编码的轻链可变区。
在一个方面，提供了编码分离的可变重链的多核苷酸，所述多核苷酸包括SEQ IDNO.12，或SEQ ID NO.14，或SEQ ID NO.16，或SEQ ID NO.18，或SEQ ID NO.20，或SEQ IDNO.22，或SEQ ID NO.24，或SEQ ID NO.26，或SEQ ID NO.28，或SEQ ID NO.30或SEQ IDNO.117或SEQ ID NO.119或SEQ ID NO.141。
在一方面，提供了编码分离的轻链可变区的多核苷酸，所述多核苷酸包括SEQ IDNO.32，或SEQ ID NO.34，或SEQ ID NO.36或SEQ ID NO.121或SEQ ID NO.123或SEQ IDNO.145。
在进一步的方面，提供了编码分离的重链可变区的多核苷酸，所述多核苷酸包括SEQ ID NO.24，或SEQ ID NO.28，或SEQ ID NO.30和编码分离的轻链可变区的多核苷酸，所述多核苷酸包括SEQ ID NO.32，或SEQ ID NO.34。
在又进一步的方面，提供了编码分离的重链可变区的多核苷酸，所述多核苷酸包括SEQ ID NO.24和编码分离的轻链可变区的多核苷酸，所述多核苷酸包括SEQ ID NO.32。
在又进一步的方面，提供了编码分离的重链可变区的多核苷酸，所述多核苷酸包括SEQ ID NO.117和编码分离的轻链可变区的多核苷酸，所述多核苷酸包括SEQ IDNO.121。
在又进一步的方面，提供了编码分离的重链可变区的多核苷酸，所述多核苷酸包括SEQ ID NO.119和编码分离的轻链可变区的多核苷酸，所述多核苷酸包括SEQ IDNO.123。
在又进一步的方面，提供了编码分离的重链可变区的多核苷酸，所述多核苷酸包括SEQ ID NO.141和编码分离的轻链可变区的多核苷酸，所述多核苷酸包括SEQ IDNO.145。
在进一步的方面，所述抗原结合蛋白可以包括与如本文所述的任一轻链组合的如本文所述的任一可变重链。
在一方面，所述抗原结合蛋白是抗体或其抗原结合片段，其包括一种或多种根据本文所述的本发明的CDR，或根据本文所述的本发明的重或轻链可变结构域之一或两者。在一个实施方案中，所述抗原结合蛋白结合灵长类动物BCMA。在一个该实施方案中，所述抗原结合蛋白额外结合非人灵长类动物BCMA，例如食蟹猴猴BCMA。
在另一方面，所述抗原结合片段选自dAb、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、双抗体(diabody)、三链抗体(triabody)、四链抗体(tetrabody)、微型抗体(miniantbody)和微小抗体(minibody)。
在本发明的一个方面，所述抗原结合蛋白是人源化或嵌合抗体，在进一步的方面所述抗体是人源化的。
在一方面，所述抗体是单克隆抗体。
在本发明的一个方面，提供具有如SEQ ID NO:55或SEQ ID NO:59或SEQ ID NO:61所述重链序列的抗体。
在本发明的一个方面，提供具有如SEQ ID NO:63或SEQ ID NO:65所述轻链序列的抗体。
在本发明的进一步的方面，提供具有SEQ ID NO:55的重链序列和如SEQ ID NO:63所述的轻链序列的抗体。
在一个实施方案中，提供抗原结合蛋白，其与如本文所述的本发明的抗原结合蛋白竞争。在一个该实施方案中，因此提供抗原结合蛋白，其与包括SEQ ID NO:23的重链可变序列和SEQ ID NO:31的轻链可变区的抗原结合蛋白竞争。
在进一步的实施方案中，因此提供抗原结合蛋白，其与包括选自SEQ ID NO 27、SEQ ID NO 29、SEQ ID NO 116、SEQ ID NO 118和SEQ ID NO 140的重链可变序列和选自SEQ ID NO 31、SEQ ID NO 120、SEQ ID NO 122和SEQ ID NO 144的轻链可变区的抗原结合蛋白竞争。
在另一方面，所述抗原结合蛋白以高亲和力结合人BCMA，例如当通过Biacore测量时，所述抗原结合蛋白以20nM或更低的亲和力或15nM或更低的亲和力或5nM或更低的亲和力或1000pM或更低的亲和力或500pM或更低的亲和力或400pM或更低，或300pM或更低例如约120pM的亲和力结合人BCMA。在进一步的实施方案中，所述抗原结合蛋白结合人BCMA，当通过Biacore测量时，在约100pM和约500pM之间，或在约100pM和约400pM之间，或在约100pM和约300pM之间。在本发明的一个实施方案中，所述抗原结合蛋白以少于150pm的亲和力结合BCMA。
在一个该实施方案中，这通过Biacore测量，例如，如实施例4中所述。
在另一方面，所述抗原结合蛋白结合人BCMA并在细胞中和测定中中和配体BAFF和/或APRIL对BCMA受体的结合，其中所述抗原结合蛋白具有在约1nM和约500nM之间，或在约1nM和约100nM之间，或在约1nM和约50nM之间，或在约1nM和约25nM之间，或在约5nM和约15nM之间的IC50。在本发明进一步的实施方案中，所述抗原结合蛋白结合BCMA并在细胞中和测定中中和BCMA，其中所述抗原结合蛋白具有约10nM的IC50。
在一个该实施方案中，这通过细胞中和测定测量，例如，如实施例4.6中所述。
所述抗原结合蛋白，例如本发明的抗体，可以通过用包括编码本发明抗原结合蛋白序列的表达载体转染宿主细胞产生。表达载体或重组质粒通过将这些抗原结合蛋白的编码序列置于与常规调节控制序列可操作的关联来产生，所述调节控制序列能够控制在宿主细胞中复制和表达和/或从其分泌。调节序列包括启动子序列，例如CMV启动子和可以衍生自其它已知抗体的信号序列。类似地，可以产生具有编码互补的抗原结合蛋白轻或重链的DNA序列的第二表达载体。在某些实施方案中，此第二表达载体与第一表达载体相同，除非涉及所述编码序列和可选择的标志物，以便尽可能保证每个多肽链功能性地表达。可替代地，所述抗原结合蛋白的重和轻链编码序列可以位于单个载体上。
所选择的宿主细胞是通过常规技术用第一和第二载体共转染的(或仅仅通过单个载体转染的)以产生包括重组或合成的轻和重链的本发明的转染的宿主细胞。所述转染的细胞然后通过常规技术培养以产生本发明的改造的抗原结合蛋白。包括重组重链和/或轻链两者的关联的抗原结合蛋白通过适当的测定，例如ELISA或RIA从培养基中筛选。可以采用类似的常规技术以构建其它抗原结合蛋白。
在本发明的方法和组合物的构建中用于克隆和亚克隆步骤的合适的载体可以被本领域技术人员选择。例如，可以使用常规pUC系列克隆载体。一种载体，pUC19可以从供货商(supply house)例如Amersham(Buckinghamshire,United Kingdom)或Pharmacia(Uppsala,Sweden)商购获得。另外，能够容易复制，具有丰富的克隆位点和可选择的基因(例如，抗生素抗性)，并且容易操作的任何载体都可以用于克隆。因此，克隆载体的选择不是本发明的限制因素。
所述表达载体还可以通过合适用于异源DNA序列，例如，哺乳动物二氢叶酸还原酶基因(DHFR)的扩增表达的基因来表征。其它载体序列包括聚A信号序列，例如来自牛生长激素(BGH)和β-球蛋白启动子序列(betaglopro)。可用于本文的所述表达载体可以通过本领域技术人员熟知的技术合成。
这些载体的组分，例如复制子、选择基因、增强子、启动子、信号序列等可以从市售或天然来源获得，或通过已知程序合成，以用于在所选择的宿主中引导重组DNA产物的表达和/或分泌。为此目的也可以选择其它适当的表达载体，其很多类型是本领域已知的，用于哺乳动物、细菌、昆虫、酵母和真菌表达。
本发明还涵盖用包含本发明的抗原结合蛋白编码序列的重组质粒转染的细胞系。可用于这些克隆载体的克隆和其它操作的宿主细胞也是常规的。但是，可以使用来自大肠杆菌的各种菌株的细胞用于克隆载体的复制和本发明抗原结合蛋白的构建中其它步骤。
用于本发明的抗原结合蛋白的表达的合适的宿主细胞或细胞系包括哺乳动物细胞例如NSO、Sp2/O、CHO(例如，DG44)、COS、HEK、成纤维细胞(例如，3T3)，和骨髓瘤细胞，例如其可以在CHO或骨髓瘤细胞中表达。可以使用人细胞，从而使分子能够用人糖基化模式修饰。可替代地，可以采用其它真核细胞系。合适的哺乳动物宿主细胞和用于转化、培养、扩增、筛选和产品生产和纯化的方法的选择是本领域已知的。参见，例如Sambrook等，上文引用。
细菌细胞可以证明可用作宿主细胞，适合用于重组Fab或本发明其它实施方案的表达(参见，例如Plückthun,A.,Immunol.Rev.,130:151-188(1992))。但是，由于在细菌细胞中表达的蛋白以解折叠的或不正确折叠形式或以非糖基化形式的倾向，将不得不筛选在细菌细胞中产生的任何重组Fab是否保留抗原结合能力。如果细菌细胞表达的分子以正确折叠形式产生，则该细菌细胞将是所希望的宿主，或在可替代的实施方案中，所述分子可以在所述细菌宿主中表达并然后被后来重折叠。例如，用于表达的各种大肠杆菌菌株作为宿主细胞在生物技术领域是熟知的。在本方法中也可以采用枯草芽孢杆菌、链霉菌和其它杆菌等的各种菌株。
希望时，本领域技术人员已知的酵母细胞的菌株作为宿主细胞也是可获得的，以及昆虫细胞，例如果蝇和鳞翅类和病毒表达系统。参见，例如Miller等,GeneticEngineering,8:277-298,Plenum Press(1986)和其中引用的参考文献。
通过其可以构建载体的一般方法、产生本发明的宿主细胞所需的转染方法和从这些宿主细胞产生本发明抗原结合蛋白所必需的培养方法均可以是常规技术。典型地，本发明的培养方法是无血清培养方法，通常通过在悬液中无血清培养细胞。类似地，一旦产生，本发明的抗原结合蛋白可以从细胞培养内容物中根据所属领域标准程序纯化，包括硫酸铵沉淀、亲和柱、柱层析、凝胶电泳等。这些技术在本领域技术范围内并且不限制本发明。例如改变的抗体的制备在WO 99/58679和WO 96/16990中描述。
而所述抗原结合蛋白的另一个表达方法可以利用在转基因动物中表达，例如美国专利号4,873,316中所述。这涉及使用动物酪蛋白启动子的表达系统，当其被转基因掺入哺乳动物时，允许雌性动物在其乳中产生所希望的重组蛋白。
在本发明进一步的实施方案中，提供了产生本发明抗体的方法，所述方法包括培养用编码本发明抗体轻和/或重链的载体转化或转染的宿主细胞的步骤和回收由此产生的抗体。
根据本发明，提供了产生本发明的抗BCMA抗体的方法，所述抗体结合人BCMA并中和人BCMA的活性，所述方法包括下列步骤：
提供编码所述抗体重链的第一载体；
提供编码所述抗体轻链的第二载体；
用所述第一和第二载体转化哺乳动物宿主细胞(例如CHO)。
在有益于所述抗体从所述宿主细胞分泌到所述培养基中的条件下培养步骤(c)的宿主细胞；
回收步骤(d)的分泌的抗体。
一旦通过所希望的方法表达，则随后通过使用适当的测定来检查所述抗体的体外活性。采用目前常规的ELISA测定形式以评价所述抗体对BCMA的定性和定量结合。另外，在后续人临床研究之前也可以使用其它体外测定验证中和效力，进行所述人临床研究以评价所述抗体在机体中的持续，不论通常的清除机制如何。
治疗的剂量和持续时间涉及本发明的分子在人循环中的相对持续时间，并且可以通过本领域技术人员根据治疗条件和患者的一般健康状况调整。为了实现最大治疗效力，预想可能需要在延长的时期内(例如四到六个月)重复给药(例如，一周一次或每两周一次或每3周一次)。
在本发明的一个实施方案中，提供了重组转化的、转染的或转导的宿主细胞，包括至少一个表达盒，例如其中所述表达盒包括编码根据本文所述的本发明的抗原结合蛋白的重链的多核苷酸，并进一步包括编码根据本文所述的本发明的抗原结合蛋白的轻链的多核苷酸，或其中有两个表达盒，并且第一个编码轻链和第二个编码重链。例如，在一个实施方案中，第一表达盒包括编码包括恒定区的抗原结合蛋白或其抗原结合片段(其与根据本文所述的本发明的恒定区连接)的重链的多核苷酸，并进一步包括第二盒，其包括编码包括恒定区的抗原结合蛋白或其抗原结合片段(其与根据本文所述的本发明的恒定区连接)的轻链的多核苷酸，例如所述第一表达盒包括编码选自SEQ ID NO:56或SEQ ID NO:60或SEQ IDNO:62的重链的多核苷酸，和第二表达盒包括编码选自SEQ ID NO:64或SEQ ID NO:66的轻链的多核苷酸。
在本发明的另一个实施方案中，提供稳定转染的宿主细胞，所述宿主细胞包括载体，所述载体包括一种或多种编码包括恒定区的抗体或其抗原结合片段(其与如本文所述的恒定区连接)的重链和/或轻链的表达盒。例如这些宿主细胞可以包括编码轻链的第一载体和编码重链的第二载体，例如所述第一载体编码选自SEQ ID NO:55或SEQ ID NO:59或SEQ ID NO:61的重链并且第二载体编码轻链例如SEQ ID NO:63或SEQ ID NO:65的轻链。在一个该实例中，所述第一载体编码选自SEQ ID NO:55的重链，并且所述第二载体编码轻链例如SEQ ID NO:63的轻链。
在本发明的另一个实施方案中，提供根据本文所述本发明的宿主细胞，其中所述细胞是真核的，例如其中所述细胞是哺乳动物细胞。这些细胞系的实例包括CHO或NSO。
在本发明的另一个实施方案中，提供用于产生包括恒定区的抗体或其抗原结合片段(其与根据本文所述本发明的恒定区连接)的方法，所述方法包括在培养基例如无血清培养基中培养宿主细胞的步骤。
在本发明的另一个实施方案中，提供根据本文所述本发明的方法，其中所述抗体关于包含所述抗体的无血清培养基进一步纯化到至少95％或更高(例如98％或更高)。
在又一个实施方案中，提供包括抗原结合蛋白和药学可接受的载体的药物组合物。
在本发明的另一个实施方案中，提供包括根据本文所述本发明的组合物连同使用说明书的部件试剂盒(kit of parts)。
本发明的治疗剂的施用模式可以是任何合适的途径，其将试剂递送至宿主。所述抗原结合蛋白和本发明的药物组合物特别可用于胃肠外施用，即，皮下(s.c.)、鞘内、腹膜内、肌内(i.m.)或静脉内(i.v.)。在一个该实施方案中，本发明的抗原结合蛋白静脉内或皮下施用。
本发明的治疗剂可以制备成包含作为活性成分在药学可接受的载体中的有效量的本发明的抗原结合蛋白的药物组合物。在一个实施方案中，本发明的预防剂是包含以即用于注射形式的抗原结合蛋白的水悬液或溶液。在一个实施方案中，所述悬液或溶液是缓冲在生理pH。在一个实施方案中，用于胃肠外施用的组合物将包括溶于药学可接受载体的本发明的抗原结合蛋白或其混合物的溶液。在一个实施方案中，所述载体是水载体。可以采用各种水载体，例如0.9％盐水、0.3％甘氨酸等。这些溶液可以制成无菌的并且通常无微粒物质。这些溶液可以通过常规、熟知的灭菌技术(例如，过滤)灭菌。所述组合物可以包含以近似生理条件所需的药学可接受的辅助物质，例如pH调节剂和缓冲剂等。根据所选择的特定施用模式，在该药物制剂中的本发明抗原结合蛋白的浓度可以变化很大，即，从少于约0.5％，通常在或至少约1％到多如约15或20wt％，并将主要基于流体体积、粘度等进行选择。
因此，本发明的用于静脉内输注的药物组合物可以制备以包含约250mL无菌林格氏液，并且每mL林格氏液约1到约30或5mg到约25mg本发明的抗原结合蛋白。制备胃肠外施用的组合物的实际方法是本领域技术人员熟知的或将对于本领域技术人员是显而易见的，并在例如Remington’s Pharmaceutical Science,15th ed.,Mack Publishing Company,Easton,Pennsylvania中更详细的描述。对于本发明的静脉内施用的抗原结合蛋白制剂的制备参见Lasmar U和Parkins D“The formulation of Biopharmaceutical products”,Pharma.Sci.Tech.today,page 129-137,Vol.3(3rd April 2000)；Wang,W“Instability,stabilisation and formulation of liquid protein pharmaceuticals”,Int.J.Pharm185(1999)129-188；Stability of Protein Pharmaceuticals Part A and B ed AhernT.J.,Manning M.C.,New York,NY:Plenum Press(1992)；Akers,M.J.“Excipient-Druginteractions in Parenteral Formulations”,J.Pharm Sci 91(2002)2283-2300；Imamura,K et al“Effects of types of sugar on stabilization of Protein in thedried state”,J Pharm Sci 92(2003)266-274；Izutsu,Kkojima,S.“Excipientcrystalinity and its protein-structure-stabilizing effect during freeze-drying”,J Pharm.Pharmacol,54(2002)1033-1039；Johnson,R,“Mannitol-sucrosemixtures-versatile formulations for protein peroxidise g n”,J.Pharm.Sci,91(2002)914-922；and Ha,E Wang W,Wang Y.j.“Peroxide formation in polysorbate 80andprotein stability”,J.Pharm Sci,91,2252-2264,(2002)，其整体内容通过引用并入本文，并且读者具体参见其。
在一个实施方案中，当在药物制剂中时，本发明的治疗剂以单位剂量形式存在。适当的治疗有效的剂量将由本领域技术人员容易地确定。对患者合适的剂量可以根据他们的重量计算，例如合适的剂量可以范围在约0.1到约20mg/kg，例如约1到约20mg/kg，例如约10到约20mg/kg或例如约1到约15mg/kg，例如约10到约15mg/kg，或例如1-5mg/kg。在一个实施方案中，所述抗体每三周给予1-5mg/kg。为了有效地治疗状况，例如多发性骨髓瘤、SLE或IPT，在人中，合适的剂量可以在下列范围内：约0.1到约1000mg，例如约0.1到约500mg，例如约500mg，例如约0.1到约100mg或约0.1到约80mg，或约0.1到约60mg，或约0.1到约40mg，或例如约1到约100mg，或约1到约50mg的本发明的抗原结合蛋白，其可以胃肠外施用，例如皮下、静脉内或肌内。如果需要，该剂量可以以适当的时间间隔(通过医师选择为适当的)重复。
本文所述抗原结合蛋白可以冻干储存并在使用前重构在合适的载体中。已证明此技术对于常规免疫球蛋白是有效的，并且可以采用本领域已知的peroxidise和重构技术。
在本发明的另一方面，提供了如本文所述的抗原结合蛋白以用于药物。
在本发明的一个方面，提供了根据本文所述的本发明的抗原结合蛋白，以用于类风湿关节炎、1型糖尿病、多发性硬化症或牛皮癣的治疗，其中所述方法包括向所述患者施用治疗有效量的本文所述的抗原结合蛋白的步骤。
在本发明的一个实施方案中，提供了用于治疗人中癌症的方法，包括向所述人施用特异性结合BCMA的抗原结合蛋白。在一些例子中，所述抗原结合蛋白是免疫缀合物的一部分。
在本发明的另一个方面，提供了一种根据如本文所述的本发明的抗原结合蛋白，用于治疗B细胞介导的或浆细胞介导的疾病或抗体介导的疾病或失调，所述疾病或失调选自多发性骨髓瘤(MM)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、非分泌多发性骨髓瘤、隐匿型多发性骨髓瘤、意义不明的单克隆丙种球蛋白病(MGUS)、弧立性浆细胞瘤(骨，髓外)、淋巴浆细胞淋巴瘤(LPL)、华氏巨球蛋白血症、浆细胞白血病、原发性淀粉样变性(AL)、重链病、全身性红斑狼疮(SLE)、POEMS综合征/骨硬化性骨髓瘤、I和II型冷沉球蛋白血症、轻链沉积病、肺出血性肾炎综合征、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、急性肾小球肾炎、天疱疮和类天疱疮疾病，和获得性大疱性表皮松解症；或任何表达BCMA的非霍奇金氏淋巴瘤B细胞白血病或霍奇金氏淋巴瘤(HL)或任何其中患者发展针对重组蛋白替代治疗的中和抗体的疾病，其中所述方法包括向所述患者施用如本文所述的治疗有效量的抗原结合蛋白的步骤。
B细胞失调可以分成下列缺陷：B细胞发育/免疫球蛋白产生(免疫缺乏)和过度/失控的增殖(淋巴瘤，白血病)。如本文所用，B细胞失调指两类疾病，并且提供了方法用于用抗原结合蛋白治疗B细胞失调。
在特定的方面，所述疾病或失调选自多发性骨髓瘤(MM)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、弧立性浆细胞瘤(骨，髓外)、华氏巨球蛋白血症。
在本发明的一个方面，所述疾病是多发性骨髓瘤、隐匿型多发性骨髓瘤(SMM)或弧立性浆细胞瘤(骨，髓外)。
在本发明的一个方面，所述疾病是多发性骨髓瘤。
在本发明的一个方面，所述疾病是全身性红斑狼疮(SLE)。
在本发明的一个方面，所述疾病是特发性血小板减少性紫癜(ITP)。
还提供了本文所述的抗原结合蛋白在制造用于治疗如本文所述的疾病和失调的药物中的用途。
例如在本发明的一个方面，提供了如本文所述抗原结合蛋白用于治疗或预防对BCMA和配体BAFF和APRIL之间相互作用的调节(例如抑制或阻断)有应答的疾病和失调的用途。
在本发明的另一方面，提供如本文所述抗原结合蛋白用于治疗或预防抗体介导的或浆细胞介导的疾病或失调的用途，所述疾病或失调选自类风湿关节炎、1型糖尿病、多发性硬化症或牛皮癣。
在本发明的另一个方面，提供了一种如本文所述的抗原结合蛋白用于治疗或预防抗体介导的或浆细胞介导的疾病或失调的用途，所述疾病或失调选自多发性骨髓瘤(MM)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、意义不明的单克隆丙种球蛋白病(MGUS)、隐匿型多发性骨髓瘤(SMM)、弧立性浆细胞瘤(骨，髓外)、华氏巨球蛋白血症、原发性淀粉样变性(AL)、重链病、全身性红斑狼疮(SLE)、POEMS综合征/骨硬化性骨髓瘤、I和II型冷沉球蛋白血症、轻链沉积病、肺出血性肾炎综合征、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、急性肾小球肾炎、天疱疮和类天疱疮疾病，和获得性大疱性表皮松解症，任何表达BCMA的非霍奇金氏淋巴瘤和白血病或任何其中患者发展针对重组蛋白替代治疗的中和抗体的疾病，其中所述方法包括向所述患者施用如本文所述的治疗有效量的抗原结合蛋白的步骤。
在一个方面，本发明提供了包括本发明的抗原结合蛋白或其功能片段和药学可接受的载体的药物组合物，用于治疗或预防类风湿关节炎、1型糖尿病、多发性硬化症或牛皮癣或抗体介导的或浆细胞介导的疾病或失调，所述疾病或失调选自多发性骨髓瘤(MM)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、意义不明的单克隆丙种球蛋白病(MGUS)、隐匿型多发性骨髓瘤(SMM)、弧立性浆细胞瘤(骨，髓外)、华氏巨球蛋白血症、原发性淀粉样变性(AL)、重链病、全身性红斑狼疮(SLE)、POEMS综合征/骨硬化性骨髓瘤、I和II型冷沉球蛋白血症、轻链沉积病、肺出血性肾炎综合征、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、急性肾小球肾炎、天疱疮和类天疱疮疾病和获得性大疱性表皮松解症，任何表达BCMA的非霍奇金氏淋巴瘤和白血病或任何其中患者发展针对重组蛋白替代治疗的中和抗体的疾病，其中所述方法包括向所述患者施用如本文所述的治疗有效量的抗原结合蛋白的步骤。
在本发明的另一个方面，提供了治疗患有类风湿关节炎、1型糖尿病、多发性硬化症或牛皮癣或抗体介导的或浆细胞介导的疾病或失调的患者的方法，所述方法包括施用治疗有效量的根据如本文所述本发明的抗原结合蛋白的步骤，例如提供了治疗患有患有抗体介导的或浆细胞介导的疾病或失调的患者的方法，所述疾病或失调选自在本发明的另一个方面，提供了一种根据如本文所述的本发明的抗原结合蛋白，用于治疗抗体介导的或浆细胞介导的疾病或失调，所述疾病或失调选自多发性骨髓瘤(MM)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、意义不明的单克隆丙种球蛋白病(MGUS)、隐匿型多发性骨髓瘤(SMM)、弧立性浆细胞瘤(骨，髓外)、华氏巨球蛋白血症、原发性淀粉样变性(AL)、重链病、全身性红斑狼疮(SLE)、POEMS综合征/骨硬化性骨髓瘤、I和II型冷沉球蛋白血症、轻链沉积病、肺出血性肾炎综合征、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、急性肾小球肾炎、天疱疮和类天疱疮疾病和获得性大疱性表皮松解症，任何表达BCMA的非霍奇金氏淋巴瘤和白血病或任何其中患者发展针对重组蛋白替代治疗的中和抗体的疾病，其中所述方法包括施用包括根据本文本发明的抗原结合蛋白与药学可接受的载体的组合的药物组合物的步骤。
在进一步的实施方案中，提供治疗患有多发性骨髓瘤(MM)的患者的方法。
定义
如本文所用，术语“癌症”、“瘤”和“肿瘤”互换使用并且，以单数或复数形式，指已经经历恶性转化使它们对宿主有机体有病理性的细胞。原发性癌细胞可以容易与非癌性细胞区分，通过广泛建立的技术，特别是组织学检查。癌细胞的定义，如本文所用，不仅包括原发性癌细胞还包括任何衍生自癌细胞祖先的细胞。这包括转移的癌细胞，和衍生自癌细胞的体外培养物和细胞系。当提及一类通常显示为实体瘤的癌症时，“临床可检测的”肿瘤是一种基于肿瘤块可检测的肿瘤，例如通过程序如计算机断层扫描(CT)、磁共振成像(MRI)、X射线、超声波或触诊体检，和/或一种因为在可从患者获得的样品中一个或更多的癌症特异性抗原的表达而可检测的肿瘤。肿瘤可以是造血(血液的或血液学的或血液有关的)癌症，例如，衍生自血细胞或免疫细胞的癌症，其可能被称为“液体瘤”。基于血液肿瘤的临床状况的具体实例包括白血病，如慢性粒细胞白血病、急性髓细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病和急性淋巴细胞白血病；浆细胞恶性肿瘤例如多发性骨髓瘤、MGUS和华氏巨球蛋白血症；淋巴瘤，例如非霍奇金氏淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤等。
所述癌症可以是任何癌症，其中存在母细胞数目异常或不需要的细胞增殖，或者被诊断为血液学的癌症，包括淋巴样和髓系恶性肿瘤两者。髓系恶性肿瘤包括但不限于，急性髓细胞性(或中幼粒细胞或髓细胞或原粒细胞)白血病(未分化或分化)，急性前髓细胞(或者早幼粒细胞或前髓细胞或前原粒细胞)性白血病，急性骨髓单核细胞(或单核原粒细胞)白血病，急性单核细胞(或单核母细胞)白血病，红白血病和巨核细胞(或巨核母细胞)白血病。这些白血病可以统称为急性髓细胞(或中幼粒细胞或髓细胞)白血病(AML)。髓系恶性肿瘤还包括骨髓增生性疾病(MPD)，其包括但不限于，慢性髓细胞(或骨髓)白血病(CML)、慢性骨髓单核细胞白血病(CMML)、原发性血小板增多症(或血小板增多症)和真性红细胞增多症(PCV)。髓系恶性肿瘤还包括骨髓增生异常(或骨髓增生异常综合征或MDS)，其可以被称为难治性贫血(RA)、伴有原始细胞过多的难治性贫血(RAEB)，和转化中的伴原始细胞过多难治性贫血(RAEBT)，以及伴有或不伴有特发性骨髓外化生的骨髓纤维化(MFS)。
造血系统的癌症还包括淋巴组织的恶性肿瘤，其可以影响淋巴结、脾脏、骨髓、外周血，和/或结外部位。淋巴癌症包括B细胞恶性肿瘤，其中包括，但不限于，B细胞非霍奇金氏淋巴瘤(B-NHL)。B-NHL可能是惰性(或低度)，中度(或侵袭性的)或高度(非常侵袭性的)。惰性B细胞淋巴瘤包括滤泡性淋巴瘤(FL)、小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)、边缘带淋巴瘤(MZL)，包括结MZL，结外MZL，脾MZL和具有绒毛淋巴细胞的脾MZL、淋巴浆细胞淋巴瘤(LPL)和黏膜相关的淋巴组织淋巴瘤(MALT或结外边缘区)。中度B-NHL包括具有或不具有白血病参与的套细胞淋巴瘤(MCL)、弥漫性大细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性大细胞(或3级或级3B)淋巴瘤，和原发性纵隔淋巴瘤(PML)。高度B-NHL包括伯基特淋巴瘤(BL)、伯基特样淋巴瘤、小无裂细胞淋巴瘤(SNCCL)和淋巴母细胞淋巴瘤。其它B-NHL包括免疫母细胞淋巴瘤(或免疫细胞瘤)、原发性渗出性淋巴瘤、HIV相关(或AIDS相关)淋巴瘤，和移植后淋巴增生症(PTLD)或淋巴瘤。B细胞恶性肿瘤还包括，但不限于，慢性淋巴细胞白血病(CLL)、幼淋巴细胞白血病(PLL)、华氏巨球蛋白血症(WM)、多毛细胞白血病(HCL)、大颗粒淋巴细胞(LGL)白血病、急性淋巴(或淋巴细胞或淋巴母细胞)白血病，和巨大淋巴结增生症。NHL还包括T细胞非霍奇金氏淋巴瘤(T-NHL)，其包括，但不限于非特指型(NOS)T细胞非霍奇金氏淋巴瘤、外周T细胞淋巴瘤(PTCL)、间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)、血管免疫母细胞性淋巴结病(AILD)，鼻自然杀伤(NK)细胞/T细胞淋巴瘤、γ/δ淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、蕈样肉芽肿，和塞扎里综合征。
造血系统的癌症还有霍奇金氏淋巴瘤(或疾病)，包括经典型霍奇金氏淋巴瘤、结节硬化性霍奇金氏淋巴瘤、混合细胞型霍奇金氏淋巴瘤、淋巴细胞优势型(LP)霍奇金氏淋巴瘤、结节性LP霍奇金氏淋巴瘤和淋巴细胞耗尽型霍奇金氏淋巴瘤。造血系统的癌症还包括浆细胞疾病或癌症，如多发性骨髓瘤(MM)包括隐匿型MM，意义不明的(未知的或不清楚的)单克隆丙种球蛋白病(MGUS)、浆细胞瘤(骨，髓外)、淋巴浆细胞淋巴瘤(LPL)、华氏巨球蛋白血症、浆细胞白血病，和原发性淀粉样变性(AL)。造血系统的癌症还可以包括另外的造血细胞，包括多形核白细胞(或中性粒细胞)、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、树突状细胞、血小板、红细胞和天然杀伤细胞的其它癌症。包括造血细胞的组织在本文中称为“造血细胞组织”包括骨髓、外周血、胸腺和外周淋巴组织，例如如脾脏、淋巴结、粘膜相关淋巴组织(如肠道相关淋巴组织)、扁桃体、派伊尔斑和阑尾，以及与其它粘膜相关的淋巴组织，例如，支气管衬里。
如本文所用的术语“抗原结合蛋白”指抗体、抗体片段和其它蛋白构建物，其能够结合和中和人BCMA。
以它们的标准含义使用术语Fv、Fc、Fd、Fab或F(ab)2(参见例如Harlow等,AntibodiesALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,(1988))。
本文中使用的术语“抗体”以其最广泛的意义并具体涵盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)。
如本文所用的术语“单克隆抗体”指获自一群基本上同源的抗体的抗体，即包括该群体的个别抗体除了可能自然发生的突变(其可以少量存在)之外是相同的。单克隆抗体是高度特异性的，针对单个抗原性结合位点。并且，与多克隆抗体制剂相反，其典型地包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体，每种单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。
“嵌合抗体”指一类改造的抗体，其中一部分重和/或轻链与衍生自特定供体抗体类型或亚型的抗体中相应序列相同或同源，而一条或多条链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类型或亚型的抗体，以及这些抗体的片段中相应序列相同或同源，使得它们展示所希望的生物活性(美国专利号4,816,567和Morrison等Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:6851-6855)(1984))。
“人源化的抗体”指一类改造的抗体，具有其CDR衍生自非人供体免疫球蛋白，分子剩余的免疫球蛋白衍生的部分衍生自一种(或多种)人免疫球蛋白。另外，框架支持残基可以被改变以保留结合亲和力(参见例如Queen等,Proc.Natl Acad Sci USA,86:10029-10032(1989),Hodgson等,Bio/Technology,9:421(1991))。合适的人受体抗体可以是通过与供体抗体的核苷酸和氨基酸序列的同源性选自常规数据库例如数据库、LosAlamos数据库和瑞士蛋白数据库的一种抗体。通过与供体抗体的框架区的同源性(在氨基酸基础上)表征的人抗体可以适合提供重链恒定区和/或重链可变框架区用于插入供体CDR。能够贡献轻链恒定或可变框架区的合适的受体抗体可以以类似方式选择。应当注意，受体抗体重和轻链不需要源自相同的受体抗体。现有技术描述了产生这些人源化抗体的多种方法——参见例如EP-A-0239400和EP-A-054951。
对于核酸，术语“基本上同一性”指示两个核酸或其指定的序列，当最佳地比对和比较时，在至少约80％的核苷酸，至少约90％到约95％，或至少约98％到约99.5％的核苷酸中是相同的，具有适当的核苷酸插入或缺失。或者，当所述区段将在选择性的杂交条件下杂交到所述链的互补物时，存在基本上同一性。
“同一性”指，对于多核苷酸和多肽，视情况而定，使用下文(1)和(2)提供的算法计算的比较：
(1)对于多核苷酸的同一性的计算通过将给定序列中核苷酸的总数与定义百分比同一性的整数相乘除以100，并然后将乘积从所述序列中所述核苷酸的总数中减去，或：
nn≤xn–(xn·y),
其中nn是核苷酸改变的数目，xn是给定序列中核苷酸的总数，y是0.95(对于95％)、0.97(对于97％)或1.00(对于100％)，并且·是乘法运算的符号，并且其中xn和y的任何非整数乘积在将其从xn减去之前向下调整到最近的整数。编码多肽的多核苷酸序列的改变可以在此编码序列中产生无义、错义或移码突变，并由此改变由经过这些改变的多核苷酸编码的多肽。
(2)对于多肽的同一性的计算通过将给定序列中氨基酸的总数与定义百分比同一性的整数相乘除以100，并然后将乘积从所述氨基酸的总数中减去，或：
na≤xa–(xa·y),
其中na是氨基酸改变的数目，xa是给定序列中氨基酸的总数，y是0.95(对于95％)、0.97(对于97％)或1.00(对于100％)，并且·是乘法运算的符号，并且其中xa和y的任何非整数乘积在将其从xa减去之前向下调整到最近的整数。对于核苷酸和氨基酸序列，术语“相同”指示当与适当插入或缺失进行最佳比对和比较时，两条核酸或氨基酸序列之间同一性的程度。
“分离的”指“通过人手”从其天然状态改变的，已从其初始环境改变或离开，或两者。例如天然存在于活的生物中的多核苷酸或多肽是非“分离的”，但是与其天然状态的共存物质分离的同样的多核苷酸或多肽是“分离的”，包括但不限于，当该多核苷酸或多肽重新导回细胞内，即使所述细胞是与所述多核苷酸或多肽从中分离的细胞相同物种或类型。
在整个本说明书和所附权利要求中，术语“包括”和“包含”包括“由......组成”和““由......构成””。也就是说，在允许的情况下，这些词语意图传达没有具体记载的其它元素或整数的可能内含。
在整个本说明书中使用的术语“特异性结合”涉及本发明的抗原结合蛋白，指所述抗原结合蛋白结合人BCMA(hBCMA)而与其它人蛋白无或不显著结合。但是该术语不排除本发明的抗原结合蛋白也可以与其它形式的BCMA，例如灵长类动物BCMA交叉反应的事实。例如，在一个实施方案中，所述抗原结合蛋白不结合TACI或BAFF-R。
在整个本说明书中使用的术语“抑制”涉及本发明的抗原结合蛋白，指BCMA的生物活性在存在本发明抗原结合蛋白的情况下与不存在该抗原结合蛋白的情况下BCMA的活性相比降低。抑制可以由于但不限于阻断配体结合、防止配体活化受体，和/或下调BCMA的一种或多种。抑制还可以指抗原结合蛋白结合BCMA并导致细胞凋亡或ADCC。本发明的抗体可以中和BCMA配体BAFF和/或APRIL结合BCMA的活性。中和的水平可以以多种方法测量，例如，通过使用下文实施例中所述的测定，例如在4.4中的H929细胞中NFkB信号传递测定。BCMA配体BAFF和APRIL在结合BCMA后能够诱导NFkB信号传递和下游事件。通过评价抗BCMA单克隆抗体抑制BAFF或APRIL驱动的NFkB诱导来测量在此测定中BCMA的中和。
如果抗体或其抗原结合片段能中和，则这指示人BAFF或APRIL和BCMA之间相互作用的抑制。认为针对人BCMA具有中和活性的抗体在如实施例4.4所述的H929刺激测定中将具有少于30微克/mL，或少于20微克/mL，或少于10微克/mL，或少于5微克/mL或少于1微克/mL或少于0.1微克/mL的IC50。
“CDR”定义为抗体的互补决定区氨基酸序列，其是免疫球蛋白重和轻链的高度可变的结构域。在免疫球蛋白的可变部分中有三个重链和三个轻链CDR(或CDR区)。因此，如本文所用的“CDR”可以指所有三种重链CDR，或所有三种轻链CDR(或所有重和所有轻链CDR两者，在适当情况下)。
CDR提供大部分接触残基用于抗体对抗原或表位的结合。本发明中的目的CDR衍生自供体抗体可变重和轻链序列，并且包括天然发生的CDR的类似物，其类似物还共享或保留与它们衍生自的供体抗体相同的抗原结合特异性和/或中和能力。
所述抗体的CDR序列可以通过Kabat编号系统确定(Kabat等；(Sequences ofproteins of Immunological Interest NIH,1987)，可替代地，它们可以使用Chothia编号系统(Al-Lazikani等,(1997)JMB 273,927-948)，接触定义方法(MacCallum R.M.,和Martin A.C.R.和Thornton J.M,(1996),Journal of Molecular Biology,262(5),732-745)或本领域技术人员已知的用于给抗体中的残基编号和确定CDR的任何其它已建立的方法来确定。
本领域技术人员可获得的用于CDR序列的其它编号惯例包括“AbM”(Universityof Bath)和“接触”(University College London)法。使用Kabat、Chothia、AbM和接触法的至少两种可以确定最小重叠区以提供“最小结合单位”。最小结合单位可以是CDR的子部分。
下文表A表示对每个CDR或结合单位使用每种编号惯例的一种定义。在表X中使用Kabat编号方案以对可变结构域氨基酸序列编号。应当注意，一些CDR定义可以根据所使用的个别公开而变化。
表A
在整个此说明书中，抗体序列中的氨基酸序列根据Kabat方案编号。类似地，术语“CDR”、“CDRL1”、“CDRL2”、“CDRL3”、“CDRH1”、“CDRH2”、“CDRH3”按照Kabat编号系统，如Kabat等；Sequences of proteins of Immunological Interest NIH,1987所述的。
术语“变体”指序列中至少一个、两个或三个氨基酸变化。这些氨基酸变化可以是缺失、取代或添加，但优选取代。在一个该实施方案中，所述取代是保守取代。
在可替代的实施方案中，所述变体序列包含至少一种取代，同时保留所述抗原结合蛋白的规范。
所述互补决定区(CDR)L1、L2、L3、H1和H2倾向于在结构上表现出有限数目的主链构象之一。CDR的特定规范结构类型通过CDR的长度和通过环包装定义，通过位于CDR和框架区中关键位置的残基(结构确定残基或SDR)确定。Martin和Thornton(1996；J Mol Biol263:800-815)已经生成了定义“关键残基”规范模板的自动方法。簇分析用于定义CDR组的规范类型(canonical class)，并且规范模板然后通过分析包埋的疏水性、氢键键合残基，并且例如保守甘氨酸来鉴定。抗体序列的CDR可以通过将序列与关键残基模板比较并使用同一性或类似度矩阵对每个模板评分来分配到规范类型。
本文所用的术语“VH”和“VL”分别指抗体的重链可变结构域和轻链可变结构域。
如本文所用术语“结构域”指折叠的蛋白结构，其具有独立于蛋白其余部分的三级结构。通常，结构域负责蛋白的离散的功能性质，并且在很多情况下可以添加、移除或转移到其它蛋白，而不丧失蛋白剩余部分和/或所述结构域的功能。“抗体单可变结构域”是折叠的多肽结构域，包括表征为抗体可变结构域的序列。因此，其包括完整的抗体可变结构域和修饰的可变结构域，例如，其中一个或多个环已被非表征为抗体可变结构域的序列替换，或已被截短或包括N-或C-末端延伸的抗体可变结构域，以及至少保留全长结构域的结合活性和特异性的可变结构域的折叠的片段。
短语“免疫球蛋白单个可变结构域”指不依赖于不同V区或结构域而特异性结合抗原或表位的抗体可变结构域(VH、VHH、VL)。免疫球蛋白单可变结构域可以以具有其它不同的可变区或可变结构域的形式(例如，同源或异源多聚体)存在，其中其它区或结构域对于免疫球蛋白单可变结构域的抗原结合是不需要的(即，其中免疫球蛋白单可变结构域不依赖于额外的可变结构域而结合抗原)。如该术语在本文中所用，“结构域抗体”或“dAb”与“免疫球蛋白单可变结构域”相同，其能够结合抗体。免疫球蛋白单可变结构域可以是人抗体可变结构域，但也包括来自其它物种的单个抗体可变结构域，例如啮齿动物(例如，如WO 00/29004中所公开的)，铰口鲨和骆驼科动物VHH dAb。骆驼科动物VHH是免疫球蛋白单可变结构域多肽，其衍生自包括骆驼、美洲驼、羊驼、单峰骆驼和原驼的物种，其产生天然缺少轻链的重链抗体。这些VHH结构域可以根据本领域现有的标准技术人源化，并且根据本发明，这些结构域仍然被认为是“结构域抗体”。如本文所用“VH”包括骆驼科动物VHH结构域。NARV是另一类免疫球蛋白单可变结构域，其在软骨鱼类，包括铰口鲨中鉴定出来。这些结构域还称为新抗原受体可变区(通常缩写为V(NAR)或NARV)。进一步的细节参见Mol.Immunol.44,656-665(2006)和US20050043519A。
术语“表位结合结构域”指不依赖于不同的V区或结构域而特异性结合抗原或表位的结构域，这可以是结构域抗体(dAb)，例如人、骆驼科动物或鲨鱼免疫球蛋白单个可变结构域或其可以是选自下列的支架的衍生物的结构域：CTLA-4(Evibody)、脂质运载蛋白、蛋白A衍生的分子例如蛋白A的Z结构域(亲和体(Affibody),SpA)、A结构域(Avimer/Maxibody)、热休克蛋白例如GroEI和GroES、29eroxidise29g(穿膜抗体(trans-body))、锚蛋白重复蛋白(DARPin)、肽适配体、C-型凝集素结构域(四连接素(Tetranectin))、γ-晶体蛋白和人泛素(affilins)、PDZ结构域、人类蛋白酶抑制剂的蝎毒素kunitz型结构域，和纤连蛋白(adnectin)，其已经进行蛋白改造，以获得天然配体以外的配体的结合。
CTLA-4(毒性T淋巴细胞相关抗原4)是CD28家族受体，主要表达在CD4+T细胞上。其细胞外结构域具有可变结构域样Ig折叠。抗体的CDR相应的环可以用异源序列取代以赋予不同的结合性质。改造以具有不同结合特异性的CTLA-4分子也称为Evibody。对于进一步的细节，参见Journal of Immunological Methods 248(1-2),31-45(2001)。
脂质运载蛋白是转运小的疏水性分子，如类固醇、后胆色素类、维甲酸和脂质的胞外蛋白家族。它们具有刚性的β-折叠二级结构，在锥形结构的开放端具有一些环，其可以被改造以结合不同靶抗原。Anticalins大小在160-180个氨基酸之间，并衍生自脂质运载蛋白。进一步的细节参见Biochim Biophys Acta 1482:337-350(2000)、US7250297B1和US20070224633。
亲和体(Affibody)是衍生自金黄色葡萄球菌蛋白A的支架，其可以被改造以结合抗原。该结构域由约58个氨基酸的三螺旋束构成。已通过表面残基的随机化生成文库。进一步的细节参见Protein Eng.Des.Sel.17,455-462(2004)和EP1641818A1。
Avimer是衍生自A结构域支架家族的多结构域蛋白。约35个氨基酸的天然结构域选择了定义的二硫键键合结构。通过改组(shuffling)A结构域家族展示的天然变异而生成多样性。对于进一步的细节，参见Nature Biotechnology 23(12),1556–1561(2005)和Expert Opinion on Investigational Drugs 16(6),909-917(June 2007)。
转铁蛋白是单体血清转运糖蛋白。转铁蛋白可以通过在允许的表面环中插入肽序列被改造以结合不同靶抗原。改造的转铁蛋白支架的实例包括穿膜抗体(Trans-body)。对于进一步的细节，参见J.Biol.Chem 274,24066-24073(1999)。
设计的锚蛋白重复蛋白(DARPins)衍生自锚蛋白，其是介导膜内在蛋白对细胞骨架附着的蛋白家族。单个的锚蛋白重复是33个残基的基序，由两个α-螺旋和β-转角构成。它们可以通过在每个重复的第一α-螺旋和β-转角中随机化残基被改造以结合不同靶抗原。它们的结合界面可以通过增加模块的数目(亲和力成熟的方法)而增加。对于进一步的细节，参见J.Mol.Biol.332,489-503(2003),PNAS 100(4),1700-1705(2003)和J.Mol.Biol.369,1015-1028(2007)和US20040132028A1。
纤连蛋白是可以被改造以结合抗原的支架。Adnectin由人III型纤连蛋白(FN3)的15个重复单位的第10个结构域的天然氨基酸序列的骨架构成。在β-夹心的一个末端的三个环可以被改造以使Adnectin能特异性识别目的治疗靶。进一步的细节参见ProteinEng.Des.Sel.18,435-444(2005)、US20080139791、WO2005056764和US6818418B1。
肽适配体是组合的识别分子，其由恒定支架蛋白组成，所述恒定支架蛋白通常为含有在活性位点插入的限定的可变肽环的硫氧还蛋白(TrxA)。进一步的细节参见ExpertOpin.Biol.Ther.5,783-797(2005)。
微抗体(microbody)衍生自长度25-50个氨基酸的天然发生的微蛋白，其包含3-4个半胱氨酸桥，微蛋白的实例包括KalataB1和芋螺毒素和打结素(knottin)。微蛋白具有环，其可以被改造以包括至多25个氨基酸而不影响微蛋白的总体折叠。对于改造的打结素的进一步的细节，参见WO2008098796。
其他表位结合结构域包括已经用作改造不同靶抗原结合性质的支架的蛋白，所述蛋白包括人γ-晶体蛋白和人泛素(affilins)、人蛋白酶抑制剂的kunitz型结构域、Ras-结合蛋白AF-6的PDZ-结构域、蝎毒素(卡律蝎毒素)、C-型凝集素结构域(四连接素)，它们在Handbook of Therapeutic Antibodies(2007,由Stefan Dubel编辑)的第7章“非抗体支架”和Protein Science 15:14-27(2006)中综述。本发明的表位结合结构域可以衍生自任何这些可替代蛋白结构域。
本文中所用的术语“抗原结合位点”是指在蛋白上能够特异性与抗原结合的位点，其可以是单结构域，例如表位-结合结构域，或其可以是如在标准抗体中发现的配对的VH/VL结构域。在本发明的一些实施方案中，单链Fv(ScFv)结构域可以提供抗原结合位点。
术语“mAb/dAb”和dAb/mAb”在本文中用于指本发明的抗原结合蛋白。这2个术语可以互换使用，且意在具有与本文中所用的相同含义。
本文中所用的术语“抗原结合蛋白”是指抗体、抗体片段例如结构域抗体(dAb)、ScFv、FAb、FAb2和其他蛋白构建体。抗原结合分子可以包含至少一个Ig可变结构域，例如抗体、结构域抗体(dAbs)、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、ScFv、双抗体、mAbdAb、亲和体、异源缀合物抗体或双特异性抗体。在一个实施方案中，所述抗原结合蛋白是抗体。在另一个实施方案中，所述抗原结合分子是dAb，即免疫球蛋白单可变结构域，诸如VH、VHH或VL，其独立于不同的V区或结构域特异性地结合抗原或表位。抗原结合分子能够结合2种靶，即它们可以是双靶向蛋白。抗原结合分子可以是抗体和抗原结合片段的组合，例如，如与单克隆抗体相连的一个或多个结构域抗体和/或一个或多个ScFv。抗原结合分子也可以包含非Ig结构域，例如作为选自下述的支架的衍生物的结构域：CTLA-4(Evibody)；脂质运载蛋白；源自蛋白A的分子诸如蛋白A的Z-结构域(亲和体、SpA)、A-结构域(Avimer/Maxibody)；热休克蛋白诸如GroEl和GroES；31eroxidise31g(trans-body)；锚蛋白重复蛋白(DARPin)；肽适配体；C-型凝集素结构域(四连接素)；人γ-晶体蛋白和人泛素(affilins)；PDZ结构域；人蛋白酶抑制剂的蝎毒素kunitz类型结构域；和纤连蛋白(adnectin)；它们已经经过蛋白改造，以实现与OSM的结合。如本文所用“抗原结合蛋白”将能够拮抗和/或中和人OSM。另外，抗原结合蛋白可以如下抑制和或阻断OSM活性：通过结合OSM并阻止天然配体结合和/或激活gp130受体。
本文中所用的术语“效应物功能”意指抗体依赖性细胞介导的细胞毒性活性(ADCC)、补体依赖性细胞毒性活性(CDC)介导的应答、Fc介导的吞噬作用和经由FcRn受体的抗体再循环中的一种或多种。对于IgG抗体，效应物功能性包括ADCC和ADCP通过重链恒定区与免疫细胞表面上存在的Fcγ受体家族的相互作用介导。在人中，这些包括FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)。在与抗原结合的抗原结合蛋白和Fc/Fcγ复合物形成之间的相互作用诱导一系列效应，包括细胞毒性、免疫细胞活化、吞噬作用和炎性细胞因子的释放。
在抗原结合蛋白的恒定区和多种Fc受体(FcR)之间的相互作用被认为介导抗原结合蛋白的效应物功能。显著的生物学效应可以是效应物功能性的结果，特别是抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)、补体固定(补体依赖性细胞毒性或CDC)、和抗原结合蛋白的半衰期/清除。通常，介导效应物功能的能力要求抗原结合蛋白与抗原的结合，并且并非所有抗原结合蛋白都介导每种效应物功能。
效应物功能可以以许多方法进行测量，包括例如经由FcγRIII与天然杀伤细胞的结合或经由FcγRI与单核细胞/巨噬细胞的结合，以测量ADCC效应物功能。例如，本发明的抗原结合蛋白可以在天然杀伤细胞测定中就ADCC效应物功能进行评价。此类测定的实例可以在Shields等，2001The Journal of Biological Chemistry，第276卷，第6591-6604页；Chappel等，1993The Journal of Biological Chemistry，第268卷，第25124-25131页；Lazar等，2006PNAS,103；4005-4010中发现。
确定CDC功能的测定的实例包括在1995 J Imm Meth 184:29-38中所述的那些。
人恒定区的一些同种型特别是IgG4和IgG2同种型基本上缺乏下述功能：a)通过经典途径的补体活化；和b)抗体依赖性细胞的细胞毒性。取决于所需效应性质，可以进行对于抗原结合蛋白的重链恒定区的多种修饰。已分开描述了含有特定突变的IgG1恒定区，所述突变减少与Fc受体的结合，并且因此减少ADCC和CDC(Duncan等，Nature 1988,332；563-564；Lund等，J.Immunol.1991,147；2657-2662；Chappel等PNAS 1991,88；9036-9040；Burton和Woof,Adv.Immunol.1992,51；1-84；Morgan等，Immunology 1995,86；319-324；Hezareh等，J.Virol.2001,75(24)；12161-12168)。
在本发明的一个实施方案中，提供了包含恒定区的抗原结合蛋白，使得所述抗原结合蛋白具有减少的ADCC和/或补体活化或效应物功能性。在一个这样的实施方案中，所述重链恒定区可以包含IgG2或IgG4同种型的天然有缺陷的恒定区或突变的IgG1恒定区。合适的修饰的实例描述在EP0307434中。一个实例包含在235和237位的丙氨酸残基的取代(EU索引编号)。
也已经描述了含有特定突变或在残基Asn297上具有改变的糖基化的人IgG1恒定区以增强与Fc受体的结合。也已经显示，在一些情况下，这些突变增强ADCC和CDC(Lazar等人PNAS 2006,103；4005-4010；Shields等人J Biol Chem 2001,276；6591-6604；Nechansky等人Mol Immunol,2007,44；1815-1817)。
在本发明的一个实施方案中，这种突变在选自239、332和330(IgG1)的一个或多个位置处或其他IgG同种型中的等效位置处。合适突变的实例是S239D和I332E和A330L。在一个实施方案中，本文所述的本发明的抗原结合蛋白在239和332位处突变，例如S239D和I332E，或在进一步实施方案中，其在选自239和332和330的三个或更多个位置处突变，例如S239D和I332E和A330L。(EU索引编号)。
在本发明的可替代实施方案中，提供了抗原结合蛋白，其包含具有改变的糖基化概况的重链恒定区，使得该抗原结合蛋白具有增强的效应物功能。例如，其中抗原结合蛋白具有增强的ADCC或增强的CDC或其中其具有增强的ADCC和CDC效应物功能。产生具有改变的糖基化概况的抗原结合蛋白的合适的方法的实例描述于WO2003011878、WO2006014679和EP1229125，所有这些都可以被应用到本发明的抗原结合蛋白。
本发明还提供了用于产生根据本发明的抗原结合蛋白的方法，其包含以下步骤：
a)培养包含表达载体的重组宿主细胞，所述表达载体包含如本文所述的分离核酸，其中在所述重组宿主细胞中编码α-1,6-岩藻糖基转移酶的FUT8基因已经失活；和
b)回收抗原结合蛋白。
这种产生抗原结合蛋白的方法可以例如使用可以从BioWa,Inc.(Princeton,NJ)获得的POTELLIGENTTM技术系统进行，其中缺乏FUT8基因的功能性拷贝的CHOK1SV细胞产生具有增强的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)活性的单克隆抗体，该活性相对于具有功能性FUT8基因的细胞中产生的相同单克隆抗体增加。POTELLIGENTTM技术系统的方面描述于US7214775、US6946292、WO0061739和WO0231240中，其都通过引用并入本文。本领域普通技术人员也将认识到其他合适系统。
在本发明的一个实施方案中，提供了包含嵌合重链恒定区的抗原结合蛋白，例如包含具有至少一个来自IgG3的CH2结构域的嵌合重链恒定区以使得抗原结合蛋白具有增强的效应物功能的抗原结合蛋白，例如其中其具有增强的ADCC或增强的CDC，或增强的ADCC和CDC功能。在一个这种实施方案中，抗原结合蛋白可以包含一个来自IgG3的CH2结构域或两个CH2结构域都可以来自IgG3。
还提供了产生本发明的抗原结合蛋白的方法，其包括以下步骤：
a)培养包含表达载体的重组宿主细胞，所述表达载体包含如本文所述的分离核酸，其中所述表达载体包含编码具有IgG1和IgG3Fc结构域氨基酸残基的Fc结构域的核酸序列；
b)回收抗原结合蛋白。
这种产生抗原结合蛋白的方法可以例如使用可以从BioWa,Inc.(Princeton,NJ)和Kyowa Hakko Kogyo(now,Kyowa Hakko Kirin Co.,Ltd.)Co.,Ltd.获得的COMPLEGENTTM技术系统进行，其中重组宿主细胞包含表达载体，其中表达编码具有IgG1和IgG3Fc结构域氨基酸残基的嵌合Fc结构域的核酸序列以产生具有增强的补体依赖性细胞毒性(CDC)活性的抗原结合蛋白，该活性相对于缺乏这种嵌合Fc结构域但其他方面都相同的抗原结合蛋白增加。COMPLEGENTTM技术系统的方面描述于WO2007011041和US20070148165中，其都通过引用并入本文。在可替代的实施方案中，可以通过在IgG链的Fc区中引入序列特异性突变来增加CDC活性。本领域普通技术人员也将认识到其他合适系统。
本领域技术人员将显而易见的是，这种修饰不仅可以单独使用，而且可以彼此组合使用以进一步增强效应物功能。
在本发明的一个这种实施方案中，提供了包含重链恒定区的抗原结合蛋白，所述重链恒定区包含突变和嵌合的重链恒定区，例如其中抗原结合蛋白包含至少一个来自IgG3的CH2结构域和一个来自IgG1的CH2结构域，其中IgG1CH2结构域在选自239和332和330的位置处具有一个或多个突变(例如突变可以选自S239D和I332E和A330L)以使得抗原结合蛋白具有增强的效应物功能，例如其中其具有一种或多种下列功能：增强的ADCC或增强的CDC，例如其中其具有增强的ADCC和增强的CDC。在一个实施方案中，IgG1CH2结构域具有突变S239D和I332E。
在本发明的可替代实施方案中，提供了包含嵌合重链恒定区且具有改变的糖基化概况的抗原结合蛋白。在一个这种实施方案中，重链恒定区包含至少一个来自IgG3的CH2结构域和一个来自IgG1的CH2结构域且具有改变的糖基化概况以使得岩藻糖与甘露糖的比率为0.8：3或更低，例如其中抗原结合蛋白经去岩藻糖基化以使得所述抗原结合蛋白与具有缺乏所述突变和改变的糖基化概况的免疫球蛋白重链恒定区的等效抗原结合蛋白相比具有增强的效应物功能，例如其中其具有一种或多种下列功能：增强的ADCC或增强的CDC，例如其中其具有增强的ADCC和增强的CDC。
在可替代的实施方案中，抗原结合蛋白具有至少一个IgG3CH2结构域和至少一个来自IgG1的重链恒定结构域，其中两个IgG CH2结构域都根据本文所述的限制进行突变。
在本发明的一个方面，提供了产生本文所述的本发明的抗原结合蛋白的方法，其包括以下步骤：
a)培养含有表达载体的重组宿主细胞，所述表达载体含有如本文所述的分离核酸，所述表达载体进一步包含编码具有IgG1和IgG3Fc结构域氨基酸残基的嵌合Fc结构域的Fc核酸序列，且其中在该重组宿主细胞中编码α-1,6-岩藻糖基转移酶的FUT8基因已经失活；和
b)回收抗原结合蛋白。
这种产生抗原结合蛋白的方法可以例如使用可以从BioWa,Inc.(Princeton,NJ)获得的ACCRETAMABTM技术系统进行，所述系统组合POTELLIGENTTM和COMPLEGENTTM技术系统以产生具有增强的ADCC和CDC活性的抗原结合蛋白，所述活性相对于缺乏嵌合Fc结构域且在寡糖上具有岩藻糖但其他方面相同的单克隆抗体增加。
在本发明的又另一个实施方案中，提供了包含突变和嵌合的重链恒定区的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白具有改变的糖基化概况以使得抗原结合蛋白具有增强的效应物功能，例如其中其具有一种或多种下列功能：增强的ADCC或增强的CDC。在一个实施方案中，突变选自239和332和330位，例如突变选自S239D和I332E和A330L。在进一步实施方案中，重链恒定区包含至少一个来自IgG3的CH2结构域和一个来自IgG1的CH2结构域。在一个实施方案中，重链恒定区具有改变的糖基化概况使得岩藻糖和甘露糖的比率为0.8:3或更低，例如抗原结合蛋白是去岩藻糖基化的，使得所述抗原结合蛋白与等效非嵌合抗原结合蛋白或缺乏所述突变和具有改变的糖基化概况的免疫球蛋白重链恒定区相比具有增强的效应物功能。
免疫缀合物
还提供了免疫缀合物(可互换地称为“抗体-药物缀合物”或“ADC”)，包括根据如本文所述的本发明的抗原结合蛋白，包括但不限于缀合一种或多种细胞毒性剂的抗体，例如化学治疗剂、药物、生长抑制剂、毒素(例如，蛋白毒素，细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素，或其片段)，或放射性同位素(即，放射性缀合物(radioconjugate))。
免疫缀合物在癌症治疗中已用于细胞毒性剂(即，杀死细胞或抑制细胞生长或增殖的药物)的局部递送(Lambert,J.(2005)Curr.Opinion in Pharmacology 5:543-549；Wu等(2005)Nature Biotechnology 23(9):1137-1146；Payne,G.(2003)i 3:207-212；Syrigos and Epenetos(1999)Anticancer Research 19:605-614；Niculescu-Duvaz和Springer(1997)Adv.Drug Deliv.Rev.26:151-172；U.S.Pat.No.4,975,278)。免疫缀合物允许药物部分向肿瘤的靶向递送和其中细胞内积累，而未缀合的药物的全身施用可以导致对正常细胞和寻求消除的肿瘤细胞不能接受的毒性水平(Baldwin等,Lancet(Mar.15,1986)pp.603-05；Thorpe(1985)"Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In CancerTherapy:A Review,"in Monoclonal Antibodies'84:Biological And ClinicalApplications(A.Pinchera等,eds)pp.475-506)。多克隆抗体和单克隆抗体均被报道可用于这些策略(Rowland等,(1986)Cancer Immunol.Immunother.21:183-87)。这些方法中使用的药物包括道诺霉素、阿霉素、氨甲喋呤和长春地辛(Rowland等,(1986)supra)。在抗体-毒素缀合物中使用的毒素包括细菌毒素，例如白喉毒素、植物毒素例如蓖麻毒素，小分子毒素例如格尔德霉素(geldanamycin)(Mandler等(2000)J.Nat.Cancer Inst.92(19):1573-1581；Mandler等(2000)Bioorganic&Med.Chem.Letters 10:1025-1028；Mandler等(2002)Bioconjugate Chem.13:786-791)，美登木素生物碱(maytansinoid)(EP 1391213；Liu等,(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:8618-8623)和刺孢霉素(calicheamicin)(Lode等(1998)Cancer Res.58:2928；Hinman等(1993)Cancer Res.53:3336-3342)。
在一个实施方案中，本发明包括具有下列一般结构的免疫缀合物：
ABP-((Linker)n-Ctx)m
其中ABP是抗原结合蛋白。
接头是不存在或是本文所述任何可切割或不可切割的接头。
Ctx是本文所述的任何细胞毒性剂。
n是0、1、2或3并且
m是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
通过MC接头与奥瑞斯汀，例如MMAE和MMAF连接的抗体的实例描述于下列结构中：
在某些实施方案中，免疫缀合物包括抗原结合蛋白，包括但不限于抗体和化学治疗剂或其它毒素。可用于免疫缀合物的生成的化学治疗剂如本文所述。可以使用的酶活性毒素及其片段包括白喉毒素A链，白喉毒素的非结合活性片段，外毒素A链(来自绿脓杆菌)，蓖麻毒素A链，相思子毒素A链，蒴莲素A链，α-帚曲毒蛋白，油桐蛋白，石竹素蛋白，美洲商陆蛋白(PAPI，PAPII，及PAP-S)，苦瓜抑制剂，麻疯树毒蛋白，巴豆毒素，肥皂草(sapaonariaofficinalis)抑制剂，白树毒素，米托菌素(mitogellin)，局限曲霉素(restrictocin)，酚霉素，伊诺霉素和单端孢霉烯。参见例如1993年10月28日公布的WO 93/21232。可获得用于产生放射性缀合抗体的各种放射性核素。实例包括211At、212Bi、131I、131In、90Y和186Re。
本发明的抗原结合蛋白还可以缀合一种或多种毒素，包括但不限于刺孢霉素、美登木素生物碱、海兔毒素(dolastatin)、奥若斯汀(aurostatins)、单端孢霉烯和CC1065，以及这些毒素的具有毒素活性的衍生物。合适的细胞毒性剂包括但不限于，奥瑞斯汀(包括do缬氨酸-缬氨酸-dola异亮氨酸-dola脯氨酸-苯丙氨酸(MMAF)和单甲基奥瑞斯汀E(MMAE)，以及MMAE的酯形式)、DNA小沟结合剂、DNA小沟烷化剂、烯二炔类、5－噻唑甲酰胺(lexitropsin)、多卡霉素(duocarmycin)、紫杉烷(包括紫杉醇和多西他赛)、嘌呤霉素、海兔毒素、美登木素生物碱和长春花生物碱。具体的细胞毒性剂包括拓扑替康(topotecan)、吗啉代阿霉素、根霉素、氰基吗啉代-阿霉素、海兔毒素-10、棘霉素、康普立停(combretatstatin)、卡里奇霉素(chalicheamicin)、美登素、DM-1、DM-4、纺锤菌素。其它合适的细胞毒性剂包括抗微管蛋白剂，例如奥瑞斯汀、长春花生物碱、足叶草毒素、紫衫烷、浆果赤霉素衍生物、念珠藻素(cryptophysin)、美登木素生物碱、康普瑞汀(combretastatin)或海兔毒素。抗微管蛋白剂包括二甲基缬氨酸-缬氨酸-dola异亮氨酸-dola脯氨酸-苯丙氨酸对苯撑-亚胺(AFP)、MMAF、MMAE、奥瑞斯汀E、长春新碱、长春花碱、长春地辛、长春瑞滨、VP-16、喜树碱、紫杉醇、多西紫杉醇、埃博霉素A、埃博霉素B、噻氨酯哒唑、秋水仙素、秋水仙胺、雌氮芥、西马多丁(cemadotin)、圆皮海绵内酯、美登素、DM-1、DM-4或软珊瑚醇(eleutherobin)。
通过将小分子抗微管蛋白剂单甲基奥瑞斯汀E(MMAE)或单甲基奥瑞斯汀F(MMAF)缀合到抗体上产生抗体药物缀合物。在MMAE的情况中，接头由巯基反应性马来酰亚胺、己酰基间隔物、缬氨酸-瓜氨酸二肽和对-氨基苄氧羰基(一种自切除分割(self-immolativefragmenting)基团)组成。在MMAF的情况中，使用蛋白酶抗性的马来酰亚胺己酰基接头。缀合处理导致药物-抗体附着的异质性，每个抗体分子结合的药物的数量(摩尔比[MR])和附着部位均不同。最普遍的种类是具有MR＝4的材料，较不普遍的是具有0、2、6和8的MR的材料。总体平均药物对抗体MR约为4。
免疫缀合物的产生
附着的点是通过温和还原抗体的链间二硫键产生的半胱氨酸，其在抗体固定化在蛋白G亲和树脂上时进行(从而使用大大过量的试剂而无需中间纯化)。固定化时，大大过量的TCEP将充分还原链间二硫键但对抗体对树脂的结合没有影响。
通过此程序生成的每个抗体巯基的数目取决于抗体的来源和同种型。例如人(和小鼠-人嵌合)IgG1具有4个可还原的二硫键，并且从而充分还原后生成8个巯基，而鼠IgG1具有5个可还原的二硫键并产生10个巯基。如果希望ADC具有最大药物负荷(例如对于鼠IgG1每个抗体10个药物)，则可以仅仅将充分过量的马来酰亚胺-药物-接头添加到固定化的抗体以保证完全缀合。但是具有每个抗体较少药物的ADC还可以从充分还原的抗体制备，通过引入生物学惰性封端剂例如N-乙基马来酰亚胺(NEM)，其占据抗体上的一些可用的巯基。当马来酰亚胺-药物-接头和所述封端剂同时添加到充分还原的抗体并大大过量时(至少3倍)，两种马来酰亚胺亲电子试剂竞争有限数目的可用的巯基。以此形式，通过药物-接头与封端剂的相对巯基反应率确定所述药物负荷，并且从而可以认为是在动力学控制下。马来酰亚胺-药物-接头的相对反应率的确变化很大，并且从而药物-接头与反应混合物中存在的NEM的摩尔比必须经验性地确定以达成一组具有所希望药物负荷水平的ADC。对普通人和鼠IgG同种型获得每个抗体约4个药物的ADC的NEM混合物中的药物接头SGD-1006(vcMMAE)和SGD-1269(mcMMAF)的摩尔分数总结在表2中。
奥瑞斯汀和海兔毒素
在一些实施方案中，所述免疫缀合物包括缀合到海兔毒素或海兔毒素肽类似物和衍生物，和奥瑞斯汀的抗原结合蛋白或抗体(美国专利号5,635,483；5,780,588)。已经证明海兔毒素和奥瑞斯汀干扰微管动力学、GTP水解和核与细胞分裂(Woyke等(2001)Antimicrob.Agents and Chemother.45(12):3580-3584)并具有抗癌(美国专利号5,663,149)和抗真菌活性(Pettit等(1998)Antimicrob.Agents Chemother.42:2961-2965)。海兔毒素或奥瑞斯汀(其是海兔毒素的5肽衍生物)药物部分可以通过肽药物部分的N(氨基)末端或C(羧基)末端附着到抗体(WO 02/088172)。
示例性的奥瑞斯汀实施方案包括N-末端连接的单甲基奥瑞斯汀药物部分DE和DF，公开于"Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands,"美国专利号7,498,298，其公开通过引用以其整体清楚地并入。如本文所用，缩写“MMAE”指单甲基奥瑞斯汀E。如本文所用，缩写“MMAF”指do缬氨酸-缬氨酸-dola异亮氨酸-dola脯氨酸-苯丙氨酸。
典型地，基于肽的药物部分可以通过在两个或更多氨基酸和/或肽片段之间形成肽键制备。这些肽键可以例如根据液相合成方法制备(参见E.Schroder和K.Lubke,"ThePeptides,"volume 1,pp 76-136,1965,Academic Press)，其在肽化学领域是众所周知的。奥瑞斯汀/海兔毒素药物部分可以根据下列的方法制备：美国专利号5,635,483；美国专利号5,780,588；Pettit等(1989)J.Am.Chem.Soc.111:5463-5465；Pettit等(1998)Anti-Cancer Drug Design 13:243-277；Pettit,G.R.,等Synthesis,1996,719-725；和Pettit等(1996)J.Chem.Soc.Perkin Trans.15:859-863。还参见Doronina(2003)Nat Biotechnol21(7):778-784；"Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation toLigands,"，2004年11月5日提交的美国专利号7,498,298，通过引用以其整体并入本文(公开了，例如接头和缀合接头的单甲基缬氨酸化合物例如MMAE和MMAF的制备方法)。美国专利号6,884,869；7,498,298；7,098,308；7,256,257；和7,423,116中公开了充当细胞毒性剂的生物活性有机化合物，具体是五肽。。连接MMAE和MMAF的单克隆抗体以及奥瑞斯汀的各种衍生物和制备它们的方法在美国专利号7,964,566中描述。
奥瑞斯汀的实例包括MMAE和MMAF，其结构显示如下：
美登素和美登木素生物碱
美登木素生物碱是有丝分裂抑制剂，其通过抑制微管蛋白聚合发挥作用。美登素首先分离自东亚灌木齿叶美登木(美国专利号3,896,111)。随后，发现某些微生物也产生美登木素生物碱，例如美登醇和C-3美登醇酯(美国专利号4,151,042)。可以从微生物例如束丝放线菌属发酵产生的安丝菌素前体制备高细胞毒性美登木素生物碱药物。分离安丝菌素的方法描述于美国专利号6,573,074。合成的美登醇及其衍生物和类似物公开于，例如美国专利号4,137,230；4,248,870；4,256,746；4,260,608；4,265,814；4,294,757；4,307,016；4,308,268；4,308,269；4,309,428；4,313,946；4,315,929；4,317,821；4,322,348；4,331,598；4,361,650；4,364,866；4,424,219；4,450,254；4,362,663；和4,371,533。
通过化学连接抗体到美登木素生物碱分子而不显著减少抗体或美登木素生物碱分子的生物学活性来制备抗体-美登木素生物碱缀合物。参见，例如，美国专利号5,208,020。每个抗体分子缀合平均3-4个美登木素生物碱分子已经显示在增强靶细胞的细胞毒性中的效力，而不负面影响抗体的功能或溶解性，尽管即使一个毒素/抗体分子也将预期会增强裸抗体的使用中的细胞毒性。美登木素生物碱是本领域熟知的并且可以通过已知技术合成或从天然来源分离。合适的美登木素生物碱公开于，例如上文提及的美国专利号5,208,020和其它专利和非专利出版物中。美登木素生物碱是美登醇和在芳香环修饰的美登醇类似物或在美登醇分子的其它位置修饰的美登醇类似物，例如各种美登醇酯。制备与抗体连接的美登木素生物碱的方法描述于美国专利号6,570,024和6,884,874。
刺孢霉素
刺孢霉素家族的抗生素能够产生亚皮摩尔浓度的双链DNA断裂。对于刺孢霉素家族的缀合物的制备，参见美国专利号5,712,374,5,714,586,5,739,116,5,767,285,5,770,701,5,770,710,5,773,001,5,877,296(所有都属于美国Cyanamid公司).可以使用的刺孢霉素的结构类似物包括但不限于γ1I、α2I、α3I、N-乙酰-γ1I、PSAG和θI1(Hinman等,CancerResearch 53:3336-3342(1993),Lode等,Cancer Research 58:2925-2928(1998)和上述属于美国Cyanamid公司的美国专利)。抗体可以缀合的另一种抗肿瘤药物是QFA，其是抗叶酸剂。刺孢霉素和QFA均具有细胞内作用位点并且不容易穿过质膜。因此，通过抗体介导的内化的这些试剂的细胞摄入大大增强了它们的细胞毒性效果。
其它细胞毒性剂
能够缀合到抗体的其它抗肿瘤剂包括BCNU、streptozoicin、长春新碱和5-氟尿嘧啶，美国专利号：5053394，5770710中描述的统称LL-E33288复合物的试剂家族，以及埃斯波霉素(esperamicin)(美国专利号5877296)。
可以使用的酶活性毒素及其片段包括白喉毒素A链，白喉毒素的非结合活性片段，外毒素A链(来自绿脓杆菌)，蓖麻毒素A链，相思子毒素A链，蒴莲素A链，α-帚曲毒蛋白，油桐蛋白，石竹素蛋白，美洲商陆蛋白(PAPI，PAPII，及PAP-S)，苦瓜抑制剂，麻疯树毒蛋白，巴豆毒素，肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制剂，白树毒素，米托菌素，局限曲霉素，酚霉素，伊诺霉素和单端孢霉烯。参见例如1993年10月28日公布的WO 93/21232。
本发明进一步考虑在抗体和具有核溶解活性的化合物(例如，核糖核酸酶或DNA内切核酸酶诸如脱氧核糖核酸酶，DNA酶)之间形成的免疫缀合物。
对于肿瘤的选择性破坏，抗体可以包括高度放射性的原子。可获得用于产生放射性缀合抗体的各种放射性同位素。实例包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素。当缀合物用于检测时，其可以包括用于核医学研究的放射性原子，例如tc99m或I123，或用于核磁共振(NMR)成像(也称为磁共振成像，mri)的自旋标记物，例如还是碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。
放射性-或其它标记物可以以已知的方式掺入缀合物。例如，肽可以是生物合成的或可以通过化学氨基酸合成使用合适的氨基酸前体合成，包括，例如氟-19替换氢。标记物例如tc99m或I123、Re186、Re188和In111可以经由肽中的半胱氨酸残基附着。钇-90可以经由赖氨酸残基附着。IODOGEN法(Fraker等(1978)Biochem.Biophys.Res.Commun.80:49-57)可用于掺入碘-123。"Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy"(Chatal,CRCPress 1989)详细描述了其它方法。
ADC的制备：
在抗体药物缀合物中，所述抗体可以直接或经由接头缀合到细胞毒性剂。合适的接头包括例如可切割的和不可切割的接头。可切割的接头典型地在细胞内条件下易于被切割。合适的可切割的接头包括例如可通过细胞内蛋白酶切割的肽接头，例如溶酶体蛋白酶或内体蛋白酶。在示例性的实施方案中，所述接头可以是二肽接头，例如缬氨酸-瓜氨酸(val-cit)或苯丙氨酸-赖氨酸(phe-lys)接头。其它合适的接头包括在低于5.5的pH可水解的接头，例如腙接头。另外的合适的可切割的接头包括二硫化物接头。
Bristol-Myers Squibb已经描述了特定的溶酶体酶-可切割的抗肿瘤药物缀合物。参见，例如，美国专利号6,214,345。Seattle Genetics已经公开了申请美国专利申请号2003/0096743和美国专利申请号2003/0130189，其描述了药物递送剂中的对氨基苄基醚。这些申请中描述的接头限于氨基苄基醚组合物。
抗原结合蛋白与细胞毒性剂的缀合物可以使用各种双功能蛋白偶联剂制备，例如N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二巯基)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚氨基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)、亚氨基硫杂环戊烷(iminothiolane,IT)、亚氨酸酯的双功能衍生物(如二亚胺代己二酸二甲酯盐酸盐)、活性酯类(如二琥珀酰亚胺基辛二酸酯)、醛类(如戊二醛)、双-叠氮化合物(如双(对-叠氮基苯甲酰基)己二胺)、双-重氮衍生物(如双-(对-重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(如甲苯2，6-二异氰酸酯)，和双-活性氟化合物(如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)。
另外的接头可以由一种或多种接头组分构成。示例性的接头组分包括6-马来酰亚胺基己酰(“MC”)、马来酰亚胺基丙酰(“MP”)、缬氨酸-瓜氨酸(“val-cit”)、丙氨酸-苯丙氨酸(“ala-phe”)、对氨基苄氧基羰基(“PAB”)、N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯(“SPP”)、琥珀酰亚氨基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(“SMCC”)，和N-琥珀酰亚胺基(4-碘代乙酰基)氨基苯甲酸酯(“SIAB”)。额外的接头组分是本领域已知的并且一些在本文中描述。还参见"Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation toLigands,"2004年11月5日提交的美国专利号US7,498,298，其内容通过引用整体并入本文。
接头还可以包括氨基酸和/或氨基酸类似物。氨基酸接头组分包括二肽、三肽、四肽或五肽。示例性的二肽包括：缬氨酸-瓜氨酸(vc或val-cit)、丙氨酸-苯丙氨酸(af或ala-phe)。示例性的三肽包括：甘氨酸-缬氨酸-瓜氨酸(gly-val-cit)和甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸(gly-gly-gly)。包括氨基酸接头组分的氨基酸残基包括那些天然发生的，以及次要氨基酸和非天然发生的氨基酸类似物，例如瓜氨酸。氨基酸接头组分可以设计并优化它们对通过特定酶进行的酶切割的选择性，例如肿瘤相关的蛋白酶、组织蛋白酶B、C和D，或纤溶酶蛋白酶。
抗原结合蛋白和抗体可以制成对与接头试剂的缀合是有反应性的。抗体上的亲核基团包括但不限于：(i)N-末端氨基，(ii)侧链氨基，例如赖氨酸，(iii)侧链巯基，例如半胱氨酸，和(iv)当抗体是糖基化时的糖羟基或氨基。氨基、巯基和羟基是亲核的，并且能够反应以与接头部分和接头试剂上的亲电基团形成共价键，所述亲电基团包括：(i)活性酯，例如NHS酯、HOBt酯、卤代甲酸酯，和酰卤；(ii)烷基和苄基卤代物(如卤代乙酰胺)；(iii)醛、酮、羧基，和马来酰亚胺基团。某些抗体具有可还原的链间二硫键、即半胱氨酸桥。抗体可以制成对与接头试剂的缀合是反应性的，通过用还原剂例如DTT(二硫苏糖醇)处理。理论上，每个半胱氨酸桥将从而形成两个反应性巯基亲核剂。额外的亲核基团可以导入抗体，通过赖氨酸与2-亚氨基四氢噻吩(Traut试剂)的反应导致氨基向巯基的转化。反应性巯基可以引入抗体(或其片段)，通过引入一、二、三、四或更多个半胱氨酸残基(例如，制备包括一个或多个非天然半胱氨酸氨基酸残基的突变体抗体)。
抗原结合蛋白和抗体还可以修饰以引入亲电部分，其可以与接头试剂或药物上的亲核取代物反应。糖基化的抗体的糖可以被氧化，例如用高碘酸盐氧化剂，以形成醛或酮基团，其可以与接头试剂或药物部分的氨基反应。所获得的亚胺希夫碱基团可以形成稳定的连接，或可以被还原，例如通过硼氢化物试剂，以形成稳定的氨基连接。在一个实施方案中，糖基化抗体的碳水化合物部分与半乳糖氧化酶或高碘酸钠(sodium meta-periodate)的反应可以在蛋白中获得羰基(醛和酮)基团，其可以与药物(Hermanson,BioconjugateTechniques)上适当的基团反应。在另一个实施方案中，包含N-末端丝氨酸或苏氨酸残基的蛋白可以与高碘酸钠反应，导致替代第一个氨基酸的醛的产生(Geoghegan&Stroh,(1992)Bioconjugate Chem.3:138-146；U.S.Pat.No.5,362,852)。该醛可以与药物部分或接头亲核剂反应。
药物部分上的亲核基团包括，但不限于：氨基、巯基、羟基、酰肼、肟、肼、缩氨基硫脲、肼羧酸酯和芳酰肼基团，其能够与接头部分和接头试剂上的亲电基团反应形成共价键，所述亲电基团包括：(i)活性酯，例如NHS酯、HOBt酯、卤代甲酸酯，和酰卤；(ii)烷基和苄基卤代物(如卤代乙酰胺)；(iii)醛、酮、羧基，和马来酰亚胺基团。
在一些实施方案中，所述接头是可以通过切割剂切割的，其存在于细胞内环境(例如在溶酶体或内体或胞膜窖)。接头可以是，例如肽基接头，其通过细胞内的肽酶蛋白酶酶类，包括但不限于溶酶体或内体蛋白酶切割。典型地，所述肽基接头是至少两个氨基酸长或至少三个氨基酸长。切割剂可以包括组织蛋白酶B和D和纤溶酶，其均已知水解二肽药物衍生物，导致在靶细胞内活性药物的释放(参见例如Dubowchik和Walker,1999,Pharm.Therapeutics 83:67-123)。肽基接头可以是通过细胞存在的酶可切割的。例如，可以使用在癌组织高表达的可通过巯基依赖性的蛋白酶组织蛋白酶B切割的肽基接头(例如，Phe-Leu或Gly-Phe-Leu-Gly(SEQ ID NO:50)接头)。在例如美国专利号6,214,345中描述了其它这些接头。在具体实施方案中，所述可通过细胞内蛋白酶切割的肽基接头是Val-Cit接头或Phe-Lys接头(参见，例如美国专利号6,214,345，其描述了用val-cit接头的阿霉素的合成)。使用细胞内蛋白水解释放治疗剂的一个优点是当缀合的时候，所述试剂是典型地减毒的(attenuated)，并且缀合物的血清稳定性典型地是高的。
在其它实施方案中，所述可切割的接头是pH敏感的，即在某些pH值下对水解敏感。典型地，所述pH敏感的接头在酸性条件下是可水解的。例如，可以使用在溶酶体中可水解的酸不稳定接头(例如腙、缩氨基脲、缩氨基硫脲、顺式乌头酰胺、原酸酯、乙缩醛、缩酮等)。(参见例如，美国专利号5,122,368；5,824,805；5,622,929；Dubowchik和Walker,1999,Pharm.Therapeutics 83:67-123；Neville等,1989,Biol.Chem.264:14653-14661。)这些接头在中性pH条件下例如在血液中相对稳定，但是在低于pH5.5或5.0，溶酶体的大致pH下不稳定。在某些实施方案中，所述可水解的接头是硫醚接头(例如，如经由酰腙键附着到治疗剂的硫醚(参见例如美国专利号5,622,929))。
在其它实施方案中，所述接头在还原条件下是可切割的(例如，二硫化物接头)。各种二硫化物接头在本领域中是已知的，包括，例如，那些可以使用SATA(N-琥珀酰亚胺基-5-乙酰硫代乙酸酯)、SPDP(N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯)、SPDB(N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯)和SMPT(N-琥珀酰亚胺基-氧基羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基二硫代)甲苯)-、SPDB和SMPT形成的接头(参见，例如，Thorpe等,1987,Cancer Res.47:5924-5931；Wawrzynczak等,In Immunoconjugates:Antibody Conjugates inRadioimagery and Therapy ofCancer(C.W.Vogel ed.,Oxford U.Press,1987。还参见美国专利号4,880,935。)。
在其它具体实施方案中，所述接头是丙二酸接头(Johnson等,1995,AnticancerRes.15:1387-93)、马来酰亚胺苯甲酰接头(Lau等,1995,Bioorg-Med-Chem.3(10):1299-1304)，或3'-N-酰胺类似物(Lau等,1995,Bioorg-Med-Chem.3(10):1305-12)。
典型地，所述接头对细胞外环境基本上不敏感。如本文所用“对细胞外环境基本上不敏感”在涉及接头的语境中指在ADC或ADC衍生物样品中，不多于约20％，典型地不多于约15％，更典型地不多于约10％，并且甚至更典型地不多于约5％，不多于约3％或不多于约1％的接头在当ADC或ADC衍生物存在于细胞外环境中(例如血浆)时被切割。例如，通过与血浆独立地孵育(a)ADC或ADC衍生物(“ADC样品”)和(b)等摩尔量的非缀合的抗体或治疗剂(“对照样品”)事先确定的时间周期(例如，2、4、8、16或24小时)并然后将如例如通过高效液相色谱所测量的ADC样品中存在的非缀合的抗体或治疗剂的量与对照样品中存在的量比较，可以确定是否接头对细胞外环境基本上不敏感。
在其它的、非互相排斥的实施方案中，所述接头促进细胞内化。在某些实施方案中，所述接头当缀合到治疗剂时(即，在如本文所述的ADC或ADC衍生物的接头-治疗剂部分的环境下)促进细胞内化。在其它实施方案中，所述接头当缀合到治疗剂和抗原结合蛋白或抗体或其衍生物时(在如本文所述的ADC或ADC衍生物的环境下)促进细胞内化。
可以与本组合物和方法使用的各种接头描述于2003年7月31日提交的题为“DrugConjugates and Their Use for Treating Cancer,An Autoimmune Disease or anInfectious Disease”的WO 2004010957，和2002年7月31日提交的题为“Drug Conjugatesand their use for treating cancer,an autoimmune disease or an infectiousdisease”的美国专利临时申请号60/400,403(其公开内容通过引用并入本文)。
或者，可以制造包括抗原结合蛋白和细胞毒性剂的融合蛋白，例如通过重组技术或肽合成。DNA的长度可以包括编码缀合物的两部分的分别的区域，或者彼此相邻或者通过编码接头肽(其不破坏所希望的缀合物的性质)的区域分隔。
在又一个实施方案中，所述抗体可以缀合到“受体”(例如链霉亲和素)用于在肿瘤预靶向中利用，其中所述抗体-受体缀合物施用于患者，随后使用清除剂从循环中去除未结合的缀合物，并然后施用“配体”(例如抗生物素蛋白)，其缀合到细胞毒性剂(例如，放射性核苷酸)。
如本文所用的术语“非人抗体或其抗体片段”意思是指源自任何除了人以外的物种的抗体或其片段，其中人包括嵌合抗体。
术语“供体抗体”指对第一免疫球蛋白配偶体贡献其可变结构域、CDR或其其它功能片段或类似物的的氨基酸序列抗体(单克隆的和/或重组的)，以便提供改变的免疫球蛋白编码区并获得表达的改变的具有供体抗体的抗原特异性和中和活性特征的抗体。
术语“受体抗体”指与供体抗体异源的抗体(单克隆的和/或重组的)，其对第一免疫球蛋白配偶体贡献编码其重和/或轻链框架区和/或其重和/或轻链恒定区的氨基酸序列的全部(或任何部分，但优选全部)。人抗体是受体抗体。
如本文所用的术语“人受体序列”意思是指抗体或其抗体片段的框架，包括衍生自人抗体或其抗体片段的VH或VL框架或其中可以掺入来自非人物种CDR的人共有序列框架的氨基酸序列。
如本文所用的术语CDR或高变区的“掺入”涵盖任何方式，通过其将非人CDR置于人受体框架。将理解这可以各种方法实现，例如可以通过突变编码非人可变结构域序列的核酸，使得其框架残基变为人受体框架残基，或通过突变编码人可变结构域序列的核酸，使得CDR变为非人残基，或通过合成编码所希望序列的核酸来生成编码所希望的氨基酸序列的核酸。在一个实施方案中，最终序列是电子生成。
本发明现在仅通过实施例的方式描述。所附的权利要求可以包括下列实施例的一个或更多的概括。
实施例
实施例1单克隆抗体的生成和选择
1.1免疫接种策略
所述抗人BCMA mAb鼠亲本CA8从衍生自用全长人BCMA免疫接种的小鼠的杂交瘤中鉴定。BALB/c小鼠用组合CFA的25μg重组(rBCMA)蛋白腹膜内免疫接种。小鼠以一个月的间隔用25μg全长rBCMA蛋白+10μg单磷酰脂质A-稳定乳液(MPL-SE)(Corixa Corporation,Seattle,WA)加强免疫三次，并在融合前3天静脉内给予30μgrBCMA蛋白的融合前加强免疫。杂交瘤可以使用ClonaCell-HY杂交瘤克隆试剂盒(StemCell Technologies,Vancouver,BC)或使用常规方法生成和克隆。在常规方法中，来自免疫接种的动物的脾脏的B细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞在存在PEG(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)的情况下融合。过夜恢复后，融合细胞以有限稀释铺板到96孔板内并进行次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸苷选择。通过ELISA和流式细胞术检查杂交瘤培养物上清中抗BCMA抗体的存在。
抗人BCMAmAb鼠亲本S3071G03从衍生自用重组人BCMA/TNFRSF17-Fc嵌合体(R&D193-Fc)使用RIMMS法(快速免疫接种多位点)免疫接种的SJL小鼠杂交瘤中鉴定。在第0天，每只小鼠5μg蛋白乳化在AS02a佐剂中，在背部的两个位点(腰臀部上和肩膀上)以及在前面的4个位点主要淋巴结下方。在第6天和第11天，每只小鼠2.5μg在RIBI佐剂中的蛋白注射在前面4个位点的主要淋巴结下方。在第14天，处死动物。切取淋巴结和脾脏，破碎并使用3：1的比例与小鼠骨髓瘤细胞X63 AG8 653.GFP.Bcl-2.11(BioCat 112754；R17209/58)进行PEG1500诱导的体细胞融合。融合体铺板到10x96孔板，并直接从这些中筛选。
所述抗人BCMA mAb鼠亲本S336105A07从衍生自同样免疫接种的杂交瘤中鉴定。在第14天切取淋巴结和脾脏，破碎并使用1：1的比例与小鼠骨髓瘤细胞X63AG8653.GFP.Bcl-2.11(BioCat 112754；R17209/58)进行Cytopulse电融合。融合体在选择入10x96孔板中之前铺板到包含半固体培养基的多用途放行培养盘(omnitray)中，并在5天后直接从这些96孔板筛选。
抗人BCMA鼠亲本S33212F02和S332126E04从衍生自用人BCMA(4-53)BCMA的胞外结构域的重组Fc融合体使用RIMMS法(快速免疫接种)免疫接种的SJL小鼠杂交瘤中鉴定。在第0天，每只小鼠5μg蛋白乳化在AS02a佐剂中，在背部的两个位点(腰臀部上和肩膀上)以及在前面的4个位点主要淋巴结下方。在第6天，每只小鼠5μg在RIBI佐剂中的重组食蟹猴(cyno)BCMA-Fc蛋白注射在前面4个位点的主要淋巴结下方。在第11天，每只小鼠2.5μg在RIBI佐剂中的重组人BCMA-Fc和重组食蟹猴BCMA-Fc注射在前面4个位点的主要淋巴结下方。在第14天，处死动物，并如对S307118G03那样处理细胞。
抗人BCMA鼠亲本S322110D07从衍生自用以1：1摩尔比预混合的人BCMA(4-53)的胞外结构域的重组Fc融合体和重组人APRIL(R&D 5860-AP/CF)的复合物免疫接种的SJL小鼠杂交瘤中鉴定。小鼠用5μgPBS中的APRIL/食蟹猴BCMA-Fc复合物腹膜内免疫接种，悬浮在RIBI佐剂中，每只小鼠100μl剂量，并以3-4周的间隔，用2.5μgPBS中的APRIL/食蟹猴BCMA-Fc复合物加强免疫3次，悬浮在RIBI佐剂中，每只小鼠100μl剂量经由腹膜内途径注射，并用相同的抗原在融合前1天给予融合前加强免疫，如对S307118G03那样。
抗人BCMA mAb鼠亲本S335115G01和S335122F05从衍生自用人BCMA(4-53)的胞外结构域的重组Fc融合体和食蟹猴BCMA(4-52)的胞外结构域的重组Fc融合体的混合物，使用RIMMS法(快速免疫接种多位点)免疫接种的SJL小鼠杂交瘤中鉴定。在第0、2天，每只小鼠5μg每种蛋白乳化在AS02a佐剂中，并注射在背部的两个位点(腰臀部上和肩膀上)以及在前面的4个位点的主要淋巴结下方。在第6天和第11天，每只小鼠2.5μg在RIBI佐剂中的每种蛋白注射在前面4个位点的主要淋巴结下方。在第14天，处死动物。切取淋巴结和脾脏，破碎并使用1：1的比例与小鼠骨髓瘤细胞X63AG8653.GFP.Bcl-2.11(BioCat 112754；R17209/58)进行Cytopulse电融合。融合体在选择入32x96孔板中之前铺板到包含半固体培养基的多用途放行培养盘(omnitray)中，并在5天后直接从这些96孔板筛选。
实施例2
2.1CA8杂交瘤可变区的克隆
从CA8杂交瘤细胞提取总RNA，然后通过反转录和聚合酶链式反应(RT-PCR)生成轻链可变结构域cDNA序列。用于RT-PCR的正向引物是对鼠免疫球蛋白基因前导序列特异性的简并引物的混合物，并且反向引物对抗体恒定区是特异性的。在此例中使用对IgG1、IgG2a和IgG2b特异性的反向引物，因为同种型是未知的。为了设计引物，生成了小鼠VH和Vk基因前导序列的DNA多序列比对。
2.2嵌合CA8的克隆
通过构建包括用于克隆入哺乳动物表达载体的限制性位点以及人信号序列的重叠寡核苷酸，从头制备编码嵌合抗体的DNA表达构建体。将HindIII和SpeI限制性位点引入以形成包含用于克隆入哺乳动物表达载体的信号序列的VH结构域框架，所述哺乳动物表达载体包含人γ1恒定区。将HindIII和BsiWI限制性位点引入以形成包含用于克隆入哺乳动物表达载体的信号序列的VL结构域框架，所述哺乳动物表达载体包含人κ恒定区。
2.3人源化的CA8变体的克隆
通过构建包括用于克隆入哺乳动物表达载体的限制性位点以及人信号序列的重叠寡核苷酸，从头制备编码人源化的抗体变体的DNA表达构建体。将HindIII和SpeI限制性位点引入以形成包含用于克隆入哺乳动物表达载体的信号序列的VH结构域框架，所述哺乳动物表达载体包含人γ1恒定区。将HindIII和BsiWI限制性位点引入以形成包含用于克隆入哺乳动物表达载体的信号序列的VL结构域框架，所述哺乳动物表达载体包含人κ恒定区。
2.4重组CA8抗体的表达(包括抗体定量)
分别编码重和轻链的表达质粒瞬时共转染到HEK2936E细胞并小规模表达以产生抗体。抗体通过ELISA定量。ELISA板用1mg/mL的抗人IgG(SigmaI3382)包被并用封闭液(在Tris缓冲盐水中4％BSA)封闭。添加组织培养物上清的各种稀释液并且板在室温下孵育1小时。也向板添加已知标准抗体的稀释液。板在TBST中清洗并且通过添加在封闭液中1/1000稀释的peroxidise标记的抗人κ轻链抗体(Sigma A7164)检测结合。在TBST中清洗前，板在室温下孵育1小时。板通过添加OPD底物(Sigma P9187)显色，并且通过添加2M H2SO4终止显色。在490nm测量吸收并且使用对已知标准稀释液的数据绘制标准曲线。标准曲线用于估计组织培养物上清中抗体的浓度。使用蛋白A纯化大规模抗体制剂，并且使用Nanodrop(ThermoScientific)测量浓度。
表1CA8可变重和轻链人源化变体的设计
2.5去岩藻糖基化的抗体产生
为了生成去岩藻糖基化的抗体，重和轻链分别共转染到CHO DG44 MS705 BioWa细胞中并规模表达以产生抗体。简而言之，30μg DNA用Not1线性化过夜，DNA用乙醇沉淀并重溶在TE缓冲液中。从培养物中，获得了2.4X107BioWa DG44细胞并在14mL温暖的PBS-蔗糖中清洗。旋转离心细胞并且沉淀重悬在1.6mL PBS-蔗糖中。上述细胞的一半(0.8mL)悬浮在PBS-蔗糖中，与30μg线性化的DNA(在50μL TE缓冲液中)一起添加到BioRad小池中。BioRadGenePulser设程序为380v，具有25μF电容，小池进入用于电穿孔。所获得的850μL电穿孔的细胞和DNA添加到(80mL)温暖的SFM512培养基(包括酚红、2XHT(核苷)、glutamax和Gibco补充物4)中。最终，所获得的80mL细胞悬浮物转移到4x96孔板之一的每个孔(150μL/孔)中。48小时后，通过去除大约130μL条件培养基并用150μL新鲜选择培养基SFM512培养基(包括酚红和glutamax)替换，培养基变为无核苷的。每3-4天，去除约130-150μL条件培养基并用新鲜的选择培养基替换。如先前讨论的，监测孔的颜色变化并测定IgG浓度。
2.6额外的抗体-杂交瘤可变区的克隆
从S307118G03、S332121F02、S332126E04、S322110D07、S336105A07、S335115G01和S335122F05杂交瘤细胞中提取总RNA。然后通过反转录和聚合酶链式反应(RT-PCR)生成重和轻链可变结构域cDNA序列。用于RT-PCR的正向引物是对鼠免疫球蛋白基因前导序列特异性的简并引物的混合物，并且反向引物对抗体恒定区是特异性的，在本例中是同种型IgG2a。基于Jones和Bendig所述策略设计引物(Bio/Technology 9:88,1991)。对两个V区序列进行RT-PCR以能够进行后续的正确的V区序列的确认。对于通过RT-PCR生成的V区产物获得DNA序列数据。
2.7额外的抗体-嵌合体的克隆
通过将V基因PCR产物的有利的PCR克隆(Clonetech)注入哺乳动物表达载体从头制备编码嵌合抗体的DNA表达构建体。此克隆方法能够使鼠可变区与人IgG1H链和κL链恒定区融合。
2.8S307118G03-人源化变体的克隆
如用于2.3节的方法进行克隆。
2.9S307118G03-重组抗体的表达
编码相关重和轻链(下表8中所列)的表达质粒瞬时共转染到HEK2936E细胞并小规模表达以产生抗体。抗体用蛋白A从上清纯化并用Nanodrop光谱仪定量。
瞬时共转染到HEK2936E细胞并小规模表达以产生抗体。抗体用蛋白A从上清纯化并用Nanodrop光谱仪定量。
实施例3抗体与vcMMAE和mcMMAF的缀合以形成抗体药物缀合物(ADC)
表B药物-接头的化学结构
Gammabind Plus蛋白G琼脂糖(GE Healthcare)树脂浆(75μL)添加到深孔(2mL容量)滤器板的每个孔中。待缀合的抗体通过物种和同种型分组并且至多达0.5mg的每种抗体转移到板的每个孔中。每种抗体转移到两个分开的孔中以帮助两种缀合物(与药物-接头SGD-1006和SGD-1269)的制备。然后将滤器板在5℃以1200RPM摇动2小时以将抗体结合到树脂。然后将滤器板以500xg离心3分钟以保证完全拉下所有流体和树脂到每个孔的底部。
然后通过添加500μL 10mM TCEP(在pH7的100mM KPO4、150mM NaCl、1mM EDTA中)并在22℃摇动30分钟以还原结合的抗体。还原后，板再次离心以去除TCEP溶液并随后用PBS+1mM EDTA清洗，每孔1mL。通过离心去除清洗液，并且过程重复3次以达到共4次清洗。所结合的和还原的抗体然后使用NEM和根据表2中指示的摩尔分数制备的药物接头的混合物缀合。
表2
*也用于鼠/人IgG1嵌合体。
从而对于每个抗体物种/同种型制备NEM和药物接头的单独的混合物，使用SGD-1006、SGD-1269(参见表B)和NEM的10mM DMSO原液。当以适当的比例混合时，总马来酰亚胺浓度从而仍然是10mM，并且此值用于计算所要添加到每孔的马来酰亚胺溶液的体积。例如，对于具有5个可还原的二硫键(当还原后有10个可利用的巯基)鼠IgG1，0.5mg 150kD的抗体是3.33nmol，对应33.3nmol的巯基。因此3倍过量是100nmol总马来酰亚胺或10μL 10mM药物接头/NEM混合物。对于SGD-1269缀合物，将然后用5.86μL的SGD-1269和4.14μL的NEM制备此混合物。在添加固定化的还原的抗体之前，马来酰亚胺混合物将然后稀释到500μL的PBS中。实际上，由于每个同种型的多个抗体同时缀合，对于每个同种型制备单个SGD-1269/NEM混合的溶液，通过用每孔10μL乘以包含该同种型的孔数然后稀释到等于500μL乘以孔数的体积的PBS中。以类似形式，制备总共八种药物-接头/NEM混合物——四种用SGD-1006并且四种用SGD-1269——并稀释到PBS中。这些混合物然后添加到还原的抗体中(每孔500μL)并且板在22℃摇动30分钟。然后将板如上述离心以去除过量的反应溶液，并随后用PBS如前述清洗4次。
然后通过每孔添加200μL pH2.5的50mM甘氨酸并以1200RPM摇动板3分钟以洗脱所结合的ADC。摇动时，向1mL的收集板每孔添加20μL中和缓冲液(1M磷酸钾，pH7.4，500mMNaCl，0.2％吐温-20)。然后通过在1500xg旋转6分钟将ADC洗脱到收集板中。然后短暂摇动收集板以保证完全混合中和缓冲液。
然后通过将溶液转移到UV测定板(Costar model 3635,Corning)并测量在280nm的光密度，用吸收读板器确定每种ADC的浓度。使用1.45mL mg-1cm-1的平均IgG消光系数以提供对整个组的ADC浓度的充分估计。为了证实成功缀合，使用反相蛋白HPLC法(下文描述)来估计同种型对照的药物负载。对于包含CA8的人源化变体的板，使用此方法直接估计所有ADC的负载。
用于确定药物负载的反相蛋白色谱法采用PLRP-S聚合物固定相(AgilentTechnologies)。由于抗体在缀合过程中充分还原，所有的抗体亚单位作为单个多肽链从柱上洗脱，允许具有不同药物负载水平的轻和重链物种的亚群单独被评价。因此，这些数据的分析允许计算平均轻链药物负载和平均重链药物负载，作为独立的因素，然后其可以组合以确定平均抗体药物负载，根据每个抗体由两条轻和两条重链组成的基本知识。色谱条件如下：PRLP-S柱，50x2.1mm，8μm颗粒大小(Agilent Technologies)，用水+0.05％TFA作为流动相A和乙腈+0.01％TFA作为流动相B；洗脱用在12.5分钟内27％B到42％B的线性梯度。
抗BCMA抗体与SGD-1006和SGD-1269在历经七个月时期的三个单独批次中缀合。在第一批次中，缀合了总共29个抗体(获得58个ADC)。每种同种型对照的药物负载通过PLRP色谱确定，并且数据总结在表3中。
表3
对于第二批次，额外缀合了25个抗体(获得50个ADC)。每种同种型对照的药物负载再次通过PLRP色谱确定，并且数据总结在表4中。
表4
在第三批次中，缀合了30个抗体(获得60个ADC)，包括13个CA8的人源化变体。在此最后的批次中，所有ADC的药物负载被确定并总结在下面两个板图中。(表5&6)。
表5
表6
对于每个同种型系列在底部指示平均药物负载和％CV。对于用mIgG2b抗体制备的SGD-1269ADC，观察到药物负载中非同寻常的大的变异性，对此原因不清楚。并且，Fc增强的CA8抗体比其它CA8人变体获得稍微更低的药物负载水平，为了解释此，额外的Fc增强的CA8在溶液相反应中缀合以与其它抗体获得的药物负载更好地匹配。
实施例4——结合数据
4.1显示嵌合CA8与表达人或食蟹猴BCMA的细胞结合的FMAT结合测定
冻存的转染的人、食蟹猴BCMA和假转染的HEK293细胞从LN2储存中复苏。用人嵌合CA8抗体以不同浓度范围，分别混合人BCMA HEK293、食蟹猴BCMA HEK293和假转染的细胞制备测定孔。添加抗人IgG FMAT蓝色第二缀合物以检测人嵌合CA8。在ABI8200(FMAT)读板器上读取结果之前，测定板放置至少90分钟。
这显示嵌合形式的CA8抗体与在HEK293细胞上表达的人和食蟹猴BCMA蛋白均结合良好。
结果显示在图1中。
4.2ELISA实验显示嵌合CA8与重组BCMA蛋白的结合
测试嵌合CA8抗体与作为Fc融合体表达的人BCMA和食蟹猴BCMA的结合。人BCMA-Fc和食蟹猴BCMA-Fc包被在ELISA板上，并且板用BSA封闭以减少非特异性结合。以5μg/mL到0.1μg/mL的浓度范围将CA8嵌合抗体添加到人和食蟹猴BCMA包被的ELISA板。视情况使用抗人IgGHRP缀合的第二抗体检测任何结合的人嵌合CA8抗体。添加HRP底物(TMB)以使ELISA显色。这表明在ELISA测定中CA8抗体结合重组人和食蟹猴BCMA。
结果显示在图2中。
4.3显示CA8抗体与BCMA和TACI蛋白结合以确定与TACI蛋白的交叉反应性的Biacore实验。
CA8嵌合抗体被注射并被捕获在蛋白A上。(使用蛋白A衍生化的传感器芯片)。残留的蛋白A结合用注射高浓度的人IgG溶液封闭。然后测试BCMA-Fc、TACI-Fc或BAFF-R-Fc溶液对抗体的结合。所述3种蛋白按顺序注射并测量结合事件。在每种蛋白的注射之间使表面再生。
Biaevaluation程序中分析传感图。完成双参考消减(Double referencesubtraction)以从传感曲线上去除设备噪声和任何非特异性结合。
这显示CA8对结合BCMA是特异性的，但对TACI和BAFFR不是。
CA8抗体对BCMA-Fc、TACI-Fc和BAFF-R-Fc的结合绘图如图3所示。
4.4细胞结合和中和数据
4.4.1鼠抗BCMA抗体对多发性骨髓瘤细胞和表达BCMA的细胞的结合
多发性骨髓瘤细胞系H929和ARH77-hBCMA 10B5表达BCMA的转染细胞用5μg/mL的鼠S332211D07、S3332121F02或S332126E04，或鼠同种型对照染色。多发性骨髓瘤细胞系H929用鼠S307118G03染色。细胞在室温(RT)下孵育20分钟并然后用FACS缓冲液(PBS+0.5％BSA+0.1％叠氮钠)清洗以去除未结合的抗体。细胞与第二PE标记的抗小鼠IgG抗体在RT孵育15分钟并然后用FACS缓冲液清洗以去除未结合的抗体。细胞通过FACS分析以检测结合到细胞的抗体。
结果(图4)显示所有4种鼠抗体结合H929多发性骨髓瘤细胞系和在ARH77BCMA转染细胞上测试的三种抗体结合这些细胞。
4.4.2如通过FACS确定的嵌合CA8与多发性骨髓瘤细胞的结合曲线
使用一组多发性骨髓瘤细胞系以确定嵌合CA8的结合。细胞系H929、OPM-2、JJN-3和U266用嵌合CA8或不相关的抗体(Synagis)以不同浓度在RT染色20分钟。然后细胞用FACS缓冲液(PBS+0.5％BSA+0.1％叠氮钠)清洗以去除未结合的抗体。细胞与第二PE标记的抗人IgG抗体在RT孵育15分钟并然后用FACS缓冲液清洗以去除未结合的抗体。通过FACS分析细胞并且测量平均荧光强度(MFI)值以确定结合。
结果表明嵌合CA8以剂量依赖性方式(图5)结合多发性骨髓瘤细胞系H929、OPM-2、JJN-3&U226。
4.4.3如通过FACS确定的人源化CA8与BCMA转染细胞的结合曲线
ARH77-hBCMA 10B5表达BCMA的转染细胞或H929细胞用嵌合CA8或CA8的人源化变体，特指为J6M0、J6M1、J6M2、J9M0、J9M1、J9M2以不同浓度在RT染色20分钟。然后细胞用FACS缓冲液(PBS+0.5％BSA+0.1％叠氮钠)清洗以去除未结合的抗体。细胞与第二PE标记的抗人IgG抗体在RT孵育15分钟并然后用FACS缓冲液清洗以去除未结合的抗体。通过FACS分析细胞并且测量平均荧光强度(MFI)值以确定结合。
结果表明嵌合CA8和除了J9M2之外的所有测试的抗体以剂量依赖性方式(图6)结合ARH77-hBCMA 10B5表达BCMA的转染细胞和H929细胞。
4.5CA8和人源化版本J6M0中和BAFF或APRIL与重组BCMA结合的能力的证明此测定的目的是评价野生型和去岩藻糖基化(Potelligent)形式的抗体CA8和人源化版本J6M0在各种浓度下中和BCMA配体、BAFF或APRIL的结合能力的能力。
96孔平底板用PBS中的重组人BCMA Fc 4-53的1μg/mL溶液包被过夜。用0.05％吐温20清洗步骤后，板用PBS中的2％牛血清白蛋白溶液在室温下封闭1小时。如前述清洗板，并添加40μL每种抗体(鼠IgG、鼠CA8和嵌合CA8)(从10μg/mL开始，以1或2倍滴定(1in 2)，一式两份)到相关孔中，并在室温下孵育1小时。将40μL 2％的BSA添加到相关对照孔中。10μL重组人BAFF(2149-BF/CF，R&D Systems)或重组人APRIL(5860-AP/CF,R&D Systems)分别以30ng/mL和750ng/mL添加，在每孔中分别得到6ng/mL和150ng/mL的终浓度。将等体积2％的BSA添加到相关对照孔中。允许板在室温下孵育2小时，之后它们如前述清洗。以50ng/mL将生物素化的抗人配体(BAFF BAF124或APRIL BAF884,R&D Systems)添加到相关孔中并孵育1小时。清洗步骤后，将50μL1:4000稀释的链霉亲和素-HRP(Amersham RPN4401)添加到每孔并在室温下孵育30分钟。再次重复清洗过程，然后将100μL四甲基联苯胺底物溶液(T8665,Sigma)添加到每孔中。板包裹在箔片中室温下孵育20-25分钟。采用添加100μL 1M H2SO4终止反应。使用Spectromax读板器在450nm确定光密度。参见图7A和B。
对于BAFF或APRIL与BCMA的结合的中和，基于板的测定中，对于嵌合CA8所计算的EC50值分别是0.695μg/mL和0.773μg/mL。人源化J6M0的值是0.776ng/mL和0.630ng/mL。对于J6M0potelligent版本的值分别是0.748和0.616ng/mL。。
·4.6嵌合CA8和人源化J6M0 BCMA抗体对BAFF或APRIL在H929细胞中诱导的NFkB的磷酸化的效果。
·在一组实验中，在无血清培养基中的H929细胞以75,000细胞/板铺板在96孔板中。24小时后添加嵌合CA8抗体以获得至多达200μg/mL的最终孔浓度。10分钟后，将BAFF或APRIL添加到细胞中以分别获得0.6或0.3μg/mL的最终孔浓度。30分钟后，裂解细胞并使用MSD pNFκB测定来测量磷酸化的NFκB水平。
·嵌合BCMA抗体CA8中和BAFF和APRIL两者在H929细胞中诱导的NFκB细胞信号传递。在此细胞类型中，相比对于APRIL诱导的NFκB细胞信号传递的257nM的IC50，在中和BAFF诱导的NFκB细胞信号传递时其特别有效，具有10nM的平均IC50。
·对于两个实验的平均数据
·对于BAFF诱导的NFκB中和IC50是10nM，对于APRIL诱导的NFκB中和是257nM(两次独立实验的平均)，显示于表7中。
·表7
又进行一组实验，目标是理解在基于细胞系统中中和APRIL和BAFF的效价之间为什么存在如此的差异。在发现BCMA的可溶形式后，实验设计变为包括如下步骤：其中H929细胞在测定之前清洗以减少来自结合可溶的BCMA的抗体的干扰。H929细胞清洗3次以去除任何sBCMA并重悬在无血清培养基中。将J6M0potelligent抗体加入96孔板以获得100μg/mL的最终孔浓度，连同BAFF或APRIL配体以分别获得0.6或0.2μg/mL的最终孔浓度。H929细胞然后在无血清培养基中以7.5x104细胞/孔铺板。30分钟后，裂解细胞并使用MSD pNFκB测定来测量磷酸化的NFκB水平。这是来自一个实验的数据。每个数据点是两次重复的平均值/sd。来自此实验的数据显示在图7c中。对于BAFF和APRIL信号传递的抑制的IC50分别确定为0.91μg/mL和2.43μg/mL。
4.7抗BCMA CA8嵌合和人源化构建体的ProteOn分析
在ProteOn XPR36(Biorad)上进行CA8嵌合和人源化变体的初始筛选。方法如下：蛋白A通过伯胺偶联固定化在GLC芯片(Biorad,Cat No:176-5011)上，然后CA8变体捕获在此表面，并且重组人BCMA(自身的或商购的US Biological,B0410)材料(仅运行2次)以256、64、16、4、1nM经过，并且0nM注射(即，单独缓冲液)用于双参考结合曲线，所使用的缓冲液是HBS-EP缓冲液。50mM NaOH用于再生捕获表面。使用ProteOn XPR36固有的分析软件将数据拟合到1：1模型。运行1对应人源化CA8变体(J0-J5系列)的第一次筛选，并且运行2对应人源化CA8变体(J5-J9系列)的第二次筛选。两次运行在25℃进行。
从运行1获得的数据在表8中描述，并且来自运行2的数据在表9中描述。运行2(表9)中几个分子无法给出通过ProteOn可测量的亲和力值，这由于此测定中的解离率超出了机器的灵敏度，但这的确指示所有这些分子紧密结合重组人BCMA。来自运行1的数据指示一些构建体没有显示对重组食蟹猴BCMA的任何结合。
表8运行1——抗BCMA分子针对重组人BCMA的动力学分析
表9运行2——抗BCMA分子针对重组人BCMA的动力学分析
对于抗体J8M0、J9M0、J8M1、J9M2、J7M2、J5M0、J7M1、J7M0、J8M2、J9M1、J5M2、J5M1，解离率超出了测定的灵敏度，因此没有显示数据。
4.8抗BCMA CA8嵌合和人源化的构建体(J7-J9系列)的BIAcore分析
蛋白A通过伯胺偶联固定化到CM5芯片上(GE Healthcare,Cat No:BR-1005-30)，并且此表面然后用于捕获抗体分子。重组人BCMA(US Biological,B0410)以256nM、64nM、16nM、4nM和1nM用作分析物。捕获表面的再生使用50mM NaOH进行。所有的结合曲线使用缓冲液注射(即0nM)双参考并且数据使用T100评价软件固有的1：1模型拟合。运行在37℃进行，使用HBS-EP作为运行缓冲液。
结果显示所测试的分子(除了J9M2)以与嵌合分子类似的亲和力结合重组人BCMA。从此实验生成的数据显示在表10中。
表10抗BCMA人源化分子对重组人BCMA的动力学分析
4.9抗BCMA CA8嵌合和人源化的构建体J6M0和J9M0的BIAcore分析
蛋白A通过伯胺偶联固定化到CM5芯片上(GE Healthcare,Cat No:BR-1005-30)，并且此表面然后用于捕获抗体分子。重组人BCMA(US Biological,B0410)以256nM、64nM、16nM、4nM和1nM用作分析物。捕获表面的再生使用50mM NaOH进行。所有的结合曲线使用缓冲液注射(即0nM)双参考，数据使用T100评价软件固有的1：1模型拟合。对于实验1，运行在25℃和37℃进行，对于实验2仅37℃，使用HBS-EP作为运行缓冲液。
两次运行均鉴定J9M0在对人BCMA的总体亲和力方面为最佳分子。从此实验生成的数据显示在表11中。
表11抗BCMA人源化分子对人BCMA的动力学分析
4.10.新抗BCMA嵌合构建体的ProteOn分析
来自第二批次的杂交瘤的新嵌合变体的初始筛选在ProteOn XPR36(Biorad)上进行。方法如下：蛋白A通过伯胺偶联固定化在GLM芯片(Biorad,Cat No:176-5012)上，然后抗BCMA变体捕获在此表面，并且重组人BCMA(自身的材料)以256、64、16、4、1nM经过，并且0nM注射(即，单独缓冲液)用于双参考结合曲线，所使用的缓冲液是HBS-EP缓冲液。捕获表面的再生使用50mM NaOH进行。使用ProteOn XPR36固有的分析软件将数据拟合到1：1模型。运行在25℃进行。
从此实验生成的数据显示在表12中。
表12抗BCMA人源化分子对人BCMA的动力学分析
实施例5细胞杀死测定
5.1嵌合CA8和去岩藻糖基化的嵌合CA8版本在表达BCMA的ARH77细胞中的ADCC效价
人天然杀伤(NK)细胞与铕标记的ARH77BCMA转染靶细胞(10B5)在存在各种浓度的抗体的情况下以5：1的E：T比例孵育2小时。测量从靶细胞释放的铕并计算特异性裂解。
结果：嵌合CA8和去岩藻糖基化的嵌合CA8经由ADCC杀死表达BCMA的靶细胞。相比亲本嵌合抗体，去岩藻糖基化的嵌合抗体显示更有效的ADCC活性，如所测量的，对所有测试的靶细胞获得的更高百分比裂解和对高表达BCMA靶细胞系10B5的EC50低十倍。参见图8A和8B。
5.2使用ARH77表达BCMA的靶细胞和PBMC作为效应细胞的CA8人源化抗体的ADCC活性
人PBMC与铕标记的ARH77 BCMA转染靶细胞(10B5)在存在各种浓度(5μg/mL到0.005μg/mL)的人源化版本的CA8抗体的情况下以5：1的E：T比例孵育2小时。测量从靶细胞释放的铕并计算特异性裂解。
结果：
结果：CA8的人源化变体的所有J5、J6、J7、J8&J9系列显示针对ARH77高表达BCMA的细胞系10B5的剂量依赖性方式的ADCC活性。ADCC的水平与如使用嵌合CA8分子的实验中发现的水平类似。参见图9。
5.3针对表达BCMA的ARH77 10B5细胞并以纯化的NK细胞作为效应细胞的嵌合S322110F02、S322110D07和S307118G03和人源化的S307118G03 H3L0的ADCC效价人天然杀伤(NK)靶细胞与铕标记的ARH77BCMA转染靶细胞(10B5)在存在各种浓度的抗体的情况下以5：1的E：T比例孵育2小时。测量从靶细胞释放的铕并计算特异性裂解。
结果：所有测试的4种抗体均显示对ARH77 10B5细胞的ADCC活性。参见图10。
5.4嵌合CA8ADC的抗体-药物缀合物(ADC)活性
测量嵌合CA8抗体、嵌合CA8-mcMMAF抗体药物缀合物和嵌合CA8-vcMMAE抗体药物缀合物针对人多发性骨髓瘤细胞系的ADC活性。
多发性骨髓瘤细胞系用嵌合CA8抗体-药物缀合物处理以确定用于生长抑制和死亡所需的ADC浓度。
以从1μg/mL到5ng/mL的浓度范围将所测试的抗体药物缀合物添加到包含多发性骨髓瘤细胞的孔中。板在37℃孵育96小时，在该时间点使用Cell titre Glo进行活细胞定量。未缀合的嵌合CA8抗体在所测试的抗体浓度下显示没有显著的生长抑制活性。在所测试的所有4个多发性骨髓瘤细胞系中，嵌合的CA8-mcMMAF抗体-药物缀合物显示比嵌合CA8-vcMMAE抗体-药物缀合物更高的生长抑制活性。参见图11和表13。
表13在4个不同的多发性骨髓瘤细胞系中，对于嵌合CA8-vcMMAE和嵌合CA8-mcMMAF抗体-药物缀合物的IC50值以ng/mL表示
5.5测量嵌合CA8抗体、嵌合CA8-mcMMAF抗体药物缀合物和嵌合CA8-vcMMAE抗体药物缀合物针对人多发性骨髓瘤细胞系H929的细胞周期阻滞。
为了确定嵌合CA8抗体药物缀合物(ADC)导致多发性骨髓瘤细胞生长抑制的机制，在嵌合CA8抗体和嵌合CA8 ADC处理后多个时间点进行固定细胞碘化丙啶染色，通过测量细胞DNA含量监测NCI-H929细胞的细胞周期。
在所测试的嵌合CA8 ADC浓度(50ng/mL)，嵌合CA8-mcMMAF ADC导致显著的G2/M细胞周期阻滞(4N DNA含量)，其峰值在48小时。在更晚的时间点48、72和96小时，用嵌合CA8-mcMMAF ADC处理导致具有亚-2N DNA含量的细胞群体积累，其表示细胞死亡。在所测试的50ng/mL浓度，嵌合CA8-vcMMAE ADC对G2/M细胞周期阻滞或亚-G1积累没有显著效果。参见图12。
5.6磷酸-组蛋白-H3(Thr11)染色作为标志物，用于嵌合CA8-mcMMAF抗体药物缀合物和嵌合CA8-vcMMAE抗体药物缀合物诱导的有丝分裂阻滞。
为了确定具有4N DNA含量的细胞的积累是否是通过嵌合CA8 ADC诱导的有丝分裂阻滞的特异性结果，NCI-H929细胞用抗磷酸
组蛋白H3抗体染色，然后用浓度逐渐增加的未缀合的嵌合CA8、嵌合CA8-cMMAE或嵌合CA8-mcMMAF处理48小时。
用嵌合CA8 ADC处理导致NCI-H929细胞的剂量依赖性的积累，所述细胞对于有丝分裂细胞的特异性标志物磷酸-组蛋白-H3(Thr11)染色阳性。嵌合CA8-mcMMAF ADC在低于嵌合CA8-vcMMAEADC的浓度导致磷酸-组蛋白-H3阳性细胞的积累。参见图13。
5.7通过膜联蛋白V染色测量NCI-H929细胞中对嵌合CA8 ADC应答的凋亡
为了确定具有亚2N DNA含量的细胞的积累是否是通过嵌合CA8 ADC诱导的凋亡的特异性结果，NCI-H929细胞用抗膜联蛋白V抗体染色，然后用浓度逐渐增加的未缀合的嵌合CA8、嵌合CA8-cMMAE或嵌合CA8-mcMMAF处理48小时。用嵌合CA8 ADC处理导致NCI-H929细胞的剂量依赖性的积累，所述细胞对于凋亡细胞的特异性标志物膜联蛋白V染色阳性。嵌合CA8-mcMMAF ADC在低于嵌合CA8-vcMMAE ADC的浓度导致膜联蛋白V阳性细胞的积累。参见图14。
5.8CA8抗BCMA抗体-药物缀合物的人源化变体的抗体-药物缀合物(ADC)活性。
细胞种植在96孔板中(4,000细胞/孔，在100μLRPMI+10％FBS中)。种植细胞6小时后添加裸抗体或ADC，并且板孵育144小时。在存在抗体或ADC的情况下的生长抑制在144小时使用Cell Titre glo测量。数据点表示三次重复的CellTiterGlo测量的平均值。误差条表示标准误差。
多发性骨髓瘤细胞系NCI-H929和OPM2用人源化CA8抗BCMA抗体-药物缀合物处理以确定用于生长抑制和死亡所需的ADC浓度。这些抗体的mcMMAF和vcMMAE抗体-药物缀合物形式相比用CA8嵌合体所发现的结果显示显著的生长抑制活性。在H929细胞和OPM2细胞中，变体J6M0比嵌合体显示更高的效价，并且数据显示在图15中。对于所有抗体在两种所测试的细胞中，mcMMAF抗体-药物缀合物相比vcMMAE抗体-药物缀合物显示更高的生长抑制活性。对于所有人源化变体的结果显示在表14中。
表14对于抗BCMA抗体-药物缀合物在NCI-H929和U266-B1细胞中IC50值以ng/mL表示。
5.9其它鼠抗BCMA抗体-药物缀合物的抗体-药物缀合物(ADC)活性。
细胞种植在96孔板中(4,000细胞/孔，在100μLRPMI+10％FBS中)。种植细胞6小时后添加抗体或ADC，并且板孵育144小时。在存在ADC的情况下的生长抑制在144小时使用Cell Titre glo测量。显示了三次重复的CellTiterGlo测量的平均。表15a和15b来自在不同时间对不同抗体序列进行的实验。多发性骨髓瘤细胞系NCI-H929和U266-B1用于表15a中的抗体。
鼠抗体S322110D07、S332121F02、S332136E04的mcMMAF和vcMMAE抗体-药物缀合物形式显示显著的生长抑制活性。在所有测试的其中看到活性的鼠抗BCMA抗体中，mcMMAF抗体-药物缀合物相比vcMMAE抗体-药物缀合物显示更高的生长抑制活性。IC50数字显示在表15a中。对于这三种抗体的剂量应答曲线参见图16，S107118G03的也参见图16。误差条表示标准误差。对于表15b中的抗体，NCI-H929、U266-B1、JJN3和OPM2细胞用不同系列的鼠抗BCMA抗体-药物缀合物处理以确定对生长抑制和死亡所需的ADC浓度。IC50数字显示在表15b中。表中显示的所有5种抗体均具有显著的ADC活性。
表15a对于抗BCMA抗体-药物缀合物在NCI-H929和U266-B1细胞中IC50值以ng/mL表示。
表15b对于抗BCMA抗体-药物缀合物在NCI-H929、U266-B1、JJN3和OPM2细胞中IC50值以ng/mL表示。
5.10缀合的去岩藻糖基化的J6M0(Potelligent)的ADCC效价
缀合MMAE或MMAF的去岩藻糖基化的J6M0在ADCC测定中使用BCMA转染子测试，以保证其ADCC活性不被缀合妥协。在添加PBMC(PBMC：靶细胞比例50：1)之前，铕标记的ARH77-10B5细胞与各种J6M0 WT和Potelligent BCMA抗体在至多达10000ng/mL的浓度孵育30分钟。两小时后，细胞培养基的等份试样取样并与增强溶液混合。在板摇床上30分钟后，在Victor 21420多标记读板器上监测铕释放。数据点表示三次重复值的平均。此数据表示2个实验。
J6M0 Potelligent的未缀合的和ADC形式之间在ADCC效价中没有显著的差异。在同样的实验中，包括J6M0的野生型版本，以显示效价相比去岩藻糖基化版本如何。如所预期的，去岩藻糖基化导致更低的EC50和更高的最大裂解。对J6M0的Fc失能形式没有观察到裂解。(图17)
5.11去岩藻糖基化的J6M0对MM细胞系的ADCC效价
人PBMC与多发性骨髓瘤靶细胞以50：1的E：T比例在存在不同浓度的去岩藻糖基化(Potelligent)J6M0的情况下孵育。通过FACS使用荧光标记的抗CD138抗体测量保留在效应细胞+靶混合物中18小时后的靶细胞的百分比，以检测靶细胞并且计算百分比裂解。这表示几个实验。
J6M0 Potelligent抗体显示针对所有5种测试的多发性骨髓瘤靶细胞的ADCC活性。这对测试是重要的，因为更早的研究是使用转染的细胞进行的。结果显示在图18中。具有多个供体的全部的数据组显示在表16中。效价均在与用转染子发现的那些类似的范围内。ADCC活性不直接涉及在这些细胞系上的BCMA表面表达。
表16使用11个供体(特指为A-K)在包括五种多发性骨髓瘤细胞系的13个独立测定中产生的EC50值。
实施例6异种移植数据
6.1测试了人MM细胞系的鼠异种移植以保证体外检测的抗体效价还可以在体内展示。选择用于异种移植研究的细胞系是NCI-H929，其对ADC和ADCC体外杀伤敏感。在无免疫应答的CB.17SCID小鼠中进行研究，所述小鼠缺乏T和B细胞但保留NK细胞以允许ADCC活性。但是应当注意虽然人IgG1可以使用鼠Fc受体，但Potelligent增强不会如其对人Fc受体那样改善亲和力。
6.2未缀合的和MMAE或MMAF缀合的J6M0对NCI-H929肿瘤生长的影响。
为了独立分析J6M0的ADCC和ADC活性，我们在存在和不存在MMAF或MMAE缀合的情况下测试了J6M0抗体。通过测试未缀合的J6M0，任何抗肿瘤效果可以归于ADCC和功能抑制活性的一些组合。
具有平均体积达到200mm3的NCI-H929肿瘤的小鼠用人IgG1对照或J6M0抗体(未缀合的，MMAE或MMAF)处理，以50μg或100μg剂量每周两次，进行2周。来自此研究的结果显示100μg剂量的J6M0-MMAF缀合物导致在那些已完成给药的小鼠中肿瘤的消除。在最后一次剂量后，J6M0-MMAF小鼠保留40天，没有发生肿瘤复发。来自此实验的这些结果证明MMAF缀合增加了未缀合的J6M0抗体和J6M0-MMAE缀合物两者的抗肿瘤活性。参见图19。
实施例7来自MM患者血清的可溶性BCMA水平的评价
7.1目前未知BCMA是否在细胞外存在并且可以在血液中检测到。在此工作中，我们确定了来自MM患者的人BCMA的血清水平。来自54个MM和浆细胞恶液质患者的血清样品和20个正常对照样品通过ELISA进行分析。从西部伦理委员会获得人受试者批准(Human SubjectApproval)。
7.2血清人BCMA水平的评价
来自临床患者和正常对照的血液收集在血清收集管中。MM患者样品来自多个阶段(进展性疾病、减轻、复发、新近诊断的和其它)。血液样品在10000RPM旋转10分钟并且血清转移到无菌微量离心塑料管中。
使用来自R& D Systems的人BCMA/TNFRSF17ELISA试剂盒(目录#DY193E)(其测量可溶性人BCMA水平)按照试剂盒提供的标准方案检测BCMA。
简而言之，96孔板用每孔100μL的捕获抗体包被并在4℃孵育过夜。板用清洗缓冲液(PBS中0.05％吐温20，pH7.2)清洗三次并用300μL PBS中的1％BSA在室温下封闭2小时。板用清洗缓冲液清洗三次。将100μL血清样品或标准品添加到每孔，并在室温下孵育2小时。板用清洗缓冲液清洗三次，并然后将100μL检测抗体添加到每孔，并在室温下孵育2小时。清洗板三次后将100μL链霉亲和素-HRP添加到每孔，并在暗室中孵育20分钟。板清洗三次并添加50μL终止液并然后通过具有570nm波长的微量板读板器确定。
进行一系列测定以确定对于存在的BCMA的水平适当的血清稀释因子。发现1：500的稀释因子对大部分样品是合适的，并且是图20中所示数据使用的稀释因子。完整的数据集显示在表17中。
确定了稀释并一式三份运行的患者和正常对照血清样品具有的BCMA水平。在此研究中，BCMA的血清水平在来自MM患者的血清中相比正常对照显著升高。当进一步分开疾病子集时，在来自进展的MM患者的血清中BCMA的血清水平相比那些在减轻的患者中的血清水平有朝向升高的趋势。这是第一次报告在任何人疾病中鉴定血清BCMA，并且表明这些水平可以是对于监测MM患者的疾病状态和治疗应答以及对于具有浆细胞介导的疾病的其它患者的新的生物标志物。
表17图表示从以1/50、1/500和1/5000稀释的样品计算的以ng/mL的可溶性BCMA的血清浓度。使用单尾T检验计算P值，并且95％显著性值显示在表中。
P-值(单尾T检验，95％显著性)
～1-500单次
正常比进展：p＝0.0010*
进展比减轻：p＝0.0146*
～1-500三次重复
正常比进展：p＝0.0004*
进展比减轻：p＝0.0091*
～1-50实验1
正常比进展：p＝0.0171*
进展比减轻：p＝0.0777
～1-50实验2
正常比进展：p＝0.0184*
进展比减轻：p＝0.0876
*显示显著性。
序列总结(表C)

Claims (31)

1.抗原结合蛋白，其特异性结合BCMA和抑制BAFF和/或APRIL对BCMA的结合，其中所述抗原结合蛋白能够结合FcγRIIIA或能够发挥FcγRIIIA介导的效应物功能，并且其中所述抗原结合蛋白能够内化。
2.根据权利要求1的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白具有增强的对FcγRIIIA的结合或具有增强的FcγRIIIA介导的效应物功能。
3.根据权利要求2的抗原结合蛋白，其中抗原结合片段具有增强的ADCC效应物功能。
4.根据前述权利要求任一项的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白是去岩藻糖基化的。
5.根据前述权利要求任一项的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白不结合Taci。
6.根据前述权利要求任一项的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白包括SEQ IDNO.3的CDRH3或SEQ ID NO.3的变体。
7.根据权利要求6的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白进一步包括SEQ ID NO.1的CDR H1、SEQ ID NO.2的CDRH2、SEQ ID NO.4的CDRL1、SEQ ID NO.5的CDRL2，和/或SEQ IDNO.6的CDRL3。
8.根据权利要求7的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白包括
i) 如SEQ ID NO. 3所述CDRH3
ii) 如SEQ ID NO. 1所述CDRH1；和
iii) 如SEQ ID NO. 2所述CDRH2。
9.根据权利要求8的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白包括
i) 如SEQ ID NO. 3所述CDRH3
ii) 如SEQ ID NO. 1所述CDRH1
iii) 如SEQ ID NO. 2所述CDRH2
iv) 如SEQ ID NO. 4所述CDRL1
v) 如SEQ ID NO. 5所述CDRL2；和
vi) 如SEQ ID NO. 6所述CDRL3。
10.根据前述权利要求任一项的抗原结合蛋白，其包括由SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:29任一编码的重链可变区。
11.根据前述权利要求任一项的抗原结合蛋白，其包括由SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:33任一编码的轻链可变区。
12.根据权利要求1-11任一项的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白包括由SEQ IDNO:23编码的重链可变区和由SEQ ID NO:31编码的轻链可变区。
13.根据权利要求1-11任一项的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白包括由SEQ IDNO:27编码的重链和由SEQ ID NO:31编码的轻链。
14.根据前述权利要求任一项的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白是人源化的单克隆抗体。
15.根据权利要求14的抗原结合蛋白，其中抗体是IgG1同种型。
16.包括权利要求6-9任一项中所述的CDR的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白是片段，其为Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、双抗体、三链抗体、四链抗体、微型抗体、微小抗体、分离的VH或分离的VL。
17.根据前述权利要求任一项的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白额外地结合非人灵长类BCMA。
18.根据前述权利要求任一项的抗原结合蛋白，并且其中所述抗原结合蛋白以强于150pM的亲和力结合BCMA。
19.免疫缀合物，其包括权利要求1-18任一项的抗原结合蛋白和细胞毒性剂。
20.根据权利要求19的免疫缀合物，其中所述抗原结合蛋白经由接头连接到细胞毒性剂。
21.根据权利要求19或20的免疫缀合物，其中所述细胞毒性剂是奥瑞斯汀或海兔毒素。
22.根据权利要求19-21任一项的免疫缀合物，其中所述细胞毒性剂选自MMAE和MMAF。
23.根据权利要求19-22任一项的免疫缀合物，其中所述细胞毒性剂共价结合到所述抗原结合蛋白。
24.根据权利要求20-23任一项的抗体，其中所述接头是可切割的接头。
25.根据权利要求20-23任一项的抗体，其中所述接头是不可切割的接头。
26.根据权利要求20-25任一项的免疫缀合物，其中所述接头选自6-马来酰亚胺基己酰（MC）、马来酰亚胺基丙酰（MP）、缬氨酸-瓜氨酸（val-cit）、丙氨酸-苯丙氨酸（ala-phe）、对氨基苄氧基羰基（PAB）、N-琥珀酰亚胺基4-（2-吡啶基硫代）戊酸酯（SPP）、琥珀酰亚氨基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯（SMCC），和N-琥珀酰亚胺基（4-碘代乙酰基）氨基苯甲酸酯（SIAB）。
27.根据权利要求19-26任一项的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物当与肿瘤细胞接触时被肿瘤细胞吞入。
28.药物组合物，其包括根据前述权利要求任一项的抗原结合蛋白或免疫缀合物和药学可接受的载体。
29.治疗患有炎性失调或疾病的人患者的方法，所述方法包括施用权利要求28的组合物的步骤。
30.权利要求27的组合物在治疗患有B细胞淋巴瘤例如多发性骨髓瘤（MM）或慢性淋巴细胞白血病（CLL）的人患者中的用途。
31.根据权利要求1-27任一项的抗原结合蛋白或免疫缀合物，其用于治疗患有B细胞淋巴瘤例如多发性骨髓瘤（MM）或慢性淋巴细胞白血病（CLL）的人患者。
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