CN110740756A - 针对b细胞成熟抗原(bcma)的纳米颗粒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含针对B细胞成熟抗原的纳米颗粒和使用该纳米颗粒的方法。

Description

针对B细胞成熟抗原(BCMA)的纳米颗粒
相关申请
基于35U.S.C.§119(e)，本申请主张2017年6月14日提交的美国临时申请第62/519,643号和2017年6月26日提交的美国临时申请第62/524,952号的优先权的权益，该临时申请各自通过引用而以其整体并入本文。
技术领域
本发明大致涉及以B细胞成熟抗原(BCMA)为靶向的组合物。
背景技术
对微小残留病(MRD)的有效诊断在癌症控制和治疗应答监测中扮演关键角色。多发性骨髓瘤(MM)患者的MRD水平直接与对治疗的应答程度和长期结果两者相关。在本文所述的发明之前，亟需研发可改善对MM的检测和治疗尤其是对MM患者体内MRD的存在的检测和治疗的改善的成像剂。
发明内容
本发明涉及以B细胞成熟抗原(BCMA)为靶向的组合物，包括那些包含BCMA靶向纳米颗粒的那些，该纳米颗粒具备比现有纳米颗粒增强的成像效果，以及研究、诊断和治疗可使用BCMA靶向组合物的特征、疾病和病症(例如，多发性骨髓瘤)的方法。
本发明至少部分地基于对特异性地以桨细胞的细胞表面受体为靶向的非侵入性成像组合物和技术的认定。此类组合物和技术尤其可用于检测MRD(经由生物标记物检测)，且能进行对治疗进展和/或结果的快速无痛评估，同时还能令使用者解释疾病的典型空间异质性，而此类空间异质性是通过例如骨髓采样、流式细胞术和/或分子研究的评估方法所难以获得的。本文所述是对细胞表面靶向组合物的鉴别，该组合物包括基于氧化硅的钆纳米颗粒(NP)，且该纳米颗粒结合至单克隆抗B细胞成熟抗原(BCMA)。该NP用于对BCMA细胞表面受体的体内磁共振成像，作为可用于监测细胞、组织或受试者体内对于MM治疗的治疗性应答的生物标记物；并且用于评估细胞、组织和/或MM受试者体内的微小残留病MRD的存在。
具体地，本文所述为靶向纳米颗粒结合物，其包含纳米颗粒、链接子、抗BCMA抗体如抗BCMA单克隆抗体。在某些实施方案中，该靶向纳米颗粒结合物的纳米颗粒的尺寸为小于10nm、小于9nm、小于8nm、小于7nm、小于6nm、小于5nm、小于4nm、小于3nm、小于2nm、或小于1nm。例示性的纳米颗粒包含钆纳米颗粒。举例而言，纳米颗粒包含基于氧化硅的钆纳米颗粒(SiGdNP)。在一些情况下，该纳米颗粒的尺寸可在最大30nm或更大的范围内(例如，50nm或更小、40nm或更小、35nm或更小、34nm或更小、33nm或更小、32nm或更小、31nm或更小、30nm或更小、10至50nm、15至5nm、20至40nm、25至35nm、20至30nm等)，举例而言，在其中该结合物包括聚合物刷纳米颗粒或包括成簇的规则间隔短回文重复序列(CRISPR)结构(即，sgRNA引导序列和/或Cas9 mRNA)剂的纳米颗粒的实施方案中。据信较大的纳米颗粒降解，从而最小化毒性。
一方面，纳米颗粒包含聚合物纳米颗粒。任选地，靶向纳米颗粒结合物还包含药物。或者，纳米颗粒包含无机纳米颗粒。在一些情况下，该靶向纳米颗粒结合物的尺寸为大约6至15nm，任选地约8至12nm，任选地其中该靶向纳米颗粒结合物的尺寸随时间而保持稳定，任选地其中该靶向纳米颗粒结合物的尺寸在15min(分钟)或更久、30min或更久、1小时或更久、2小时或更久、4小时或更久、8小时或更久、1天或更久、2天或更久、3天或更久、或1周或更久的时间段内保持稳定在其它实施方案中，该靶向纳米颗粒结合物的尺寸为大约15至60nm，任选地约20至50nm，任选地约30至50nm、任选地约35至45纳米、任选地约40nm或更大，任选地其中该靶向纳米颗粒结合物的尺寸随时间而保持稳定，任选地其中该靶向纳米颗粒结合物的尺寸在15min或更久、30min或更久、1小时或更久、2小时或更久、4小时或更久、8小时或更久、1天或更久、2天或更久、3天或更久、或1周或更久的时间段内保持稳定
例示性的链接子包括同双官能胺-胺链接子(N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)至NHS)链接子、异双官能胺至巯基(NHS至卤代酰基、NHS-马来酰亚胺、NHS-吡啶基二硫醇)链接子。不受缚于理论，在一些实施方案中，NHS链接子与聚合物和/或本公开的NP结合，随后该NHS链接子也结合至本公开的抗体，且后一种粘附经由例如NHS、硫醇、马来酰亚胺或卤代酰基而出现。合适的抗BCMA抗体包括单克隆抗体或其片段。举例而言，合适的抗BCMA抗体包含人类单克隆抗体或其片段。例示性的抗BCMA抗体片段包括Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2、双特异性抗体、线性抗体、单链抗体分子(例如，scFv)和由抗体片段形成的多特异性抗体。
在一些情况下，抗BCMA抗体是被标记的。举例而言，抗BCMA抗体用多甲藻素叶绿素蛋白复合物(PerCP)/Cy5.5标记。
一方面，靶向纳米颗粒结合物包含装饰有游离NHS基团的纳米颗粒芯。任选地，NHS基团经由双磺基琥珀酰亚胺辛二酸盐交联剂结合之抗BCMA的表面上。
在一些情况下，纳米颗粒结合物还包含药物部分。举例而言，该药物部分为抗CS1抗体或药物(例如，埃罗妥珠单抗(Elotuzamab))或抗CD38抗体或药物(例如，达雷木单抗(Daratumumab))。
还提供包含本文所述的靶向纳米颗粒结合物的制剂。优选的，该靶向纳米颗粒结合物以0.11mg/g的SiGdNP，例如，约0.2mg/g、0.3mg/g、0.4mg/g、0.5mg/g、0.6mg/g、0.7mg/g、0.8mg/g、或0.9mg/g的SiGdNP的剂量当量存在。举例而言，该靶向纳米颗粒结合物以约0.25mg/g的SiGdNP的剂量当量存在。
还提供一种药物组合物，其包含本文所述的靶向纳米颗粒结合物和药学可接受的载剂。
检测多发性骨髓瘤(MM)和/或微小残留病在受试者体内的存在和/或位置的方法通过下述完成：将本文所述的靶向纳米颗粒结合物给药至该受试者，并检测该靶向纳米颗粒结合物在所述受试者体内的存在和/或位置，从而检测MM和/或MRD在所述受试者体内的存在和/或位置。在某些实施方案中，给药步骤通过注射执行，任选地通过静脉注射或腹膜注射执行。
举例而言，检测步骤包括使用磁共振成像(MRI)扫描。一方面，靶向纳米颗粒结合物作为成像生物标记物用于检测受试者体内的MM细胞和/或MRD。在一些情况下，该靶向纳米颗粒结合物，例如，BCMA靶向的NP，提供比适宜的非靶向NP对照物如不以BCMA为靶向的NP改善至少5倍、任选至少10倍、任选约12倍或更高的对比度。举例而言，该靶向纳米颗粒结合物提供比适宜的非靶向NP对照物改善至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少11倍、至少12倍、至少13倍、至少14倍、至少15倍、至少16倍、至少17倍、至少18倍、至少19倍、或至少20倍的对比度。在一些情况下，根据等式(1)和(2)计算信噪比(SNR)和归一化SNR：(1)SNR＝强度/噪声；(2)归一化SNR(i)＝SNR(i)/SNR基线。不受缚于理论，据信本公开的靶向NP的增强的成像属性对于本文所述的抗BCMA抗体的稳健细胞靶向效能有所贡献。尽管无靶向的和/或被动靶向的NP大多通过血管生成被引导至肿瘤细胞，但此类无靶向的和/或被动靶向的NP不以桨细胞为靶向，从而在受试者的健康组织内产生“噪声”(例如，更为弥散的成像信号)。
在某些实施方案中，靶向纳米颗粒结合物所具备的对于MRD的MRI检测阈值为每位受试者100,000个或更少桨细胞、任选地每位受试者50,000个或更少桨细胞、任选地每位受试者30,000个或更少桨细胞、任选地每位受试者20,000个或更少桨细胞、任选地每位受试者10,000个或更少桨细胞、任选地每位受试者8,000个或更少桨细胞、任选地每位受试者6,000个或更少桨细胞、任选地每位受试者5,000个或更少桨细胞、任选地每位受试者4,000个或更少桨细胞、任选地每位受试者3,000个或更少桨细胞、任选地每位受试者约2,200个桨细胞，例如，任选地每位受试者2,200±450个桨细胞(任选地，其中所述受试者是鼠)。
在一些情况下，检测步骤在给药所述靶向纳米颗粒结合物的步骤后大约1小时内执行，任选在给药所述靶向纳米颗粒结合物的步骤后大约30分钟内执行。在其它情况下，在给药该靶向纳米颗粒结合物的步骤之后5分钟内、10分钟内、15分钟内、20分钟内、25分钟内、30分钟内、35分钟内、40分钟内、45分钟内、50分钟内、55分钟内、60分钟内、65分钟内、70分钟内、75分钟内、80分钟内、85分钟内、或90分钟内执行检测步骤。
在某些其它实施方案中，在给药该靶向纳米颗粒结合物的步骤之后大约12至48小时内执行检测步骤，任选地给药该靶向纳米颗粒结合物的步骤之后大约36小时内执行检测步骤，任选地给药该靶向纳米颗粒结合物的步骤之后约34小时内、约33小时内、约32小时内、约31小时内、约30小时内、约29小时内、约28小时内、约27小时内、约26小时内、约25小时内、约24小时内、约23小时内、约22小时内、约21小时内、约20小时内、约19小时内、约18小时内、约17小时内、约16小时内、约15小时内、约14小时内、约13小时内、约12小时内、约11小时内、约10小时内、约9小时内、约8小时内、约7小时内、约6小时内、约5小时内、约4小时内、约3小时内、或约2小时内执行检测步骤。
一方面，靶向纳米颗粒结合物在给药所述靶向纳米颗粒结合物的步骤后30分钟时结合大约70％的MM细胞。在其它方面，该靶向纳米颗粒结合物结合至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、或约100％的MM细胞。
任选地，靶向纳米颗粒结合物在脊柱、股骨、其它骨骼和/或脾脏中被检出。
优选的，相对于适宜的非靶向对照纳米颗粒，肿瘤对本文所述的靶向纳米颗粒结合物的吸收增强。
一方面，检测MM和/或MRD在所述受试者体内的存在和/或位置被用于评估MM疗法。举例而言，疗法包含给药抗CS1抗体或药物(例如，埃罗妥珠单抗(Elotuzamab))或抗CD38抗体或药物(例如，达雷木单抗(Daratumumab))。在另一实例中，将该靶向纳米颗粒结合物与MM疗法联合给药。
优选的，受试者是人类。或者，受试者是鼠科动物。举例而言，受试者是MRD模型鼠。任选地，该MRD模型鼠是通过给药硼替佐米(Bortezomib)和美法仑(Melphalan)而诱导的。一方面，在严重联合免疫缺陷(SCID)/褐色小鼠体内检测到源自异种移植物的MM。
在一些情况下，检测受试者体内MM和/或MRD的存在和/或位置包括检测从意义未明的单克隆丙种球蛋白病(MGUS)到阴燃多发性骨髓瘤(SMM)的疾病进展和/或检测早期肿瘤和/或髓外MM疾病。
一方面，检测步骤包括检测钆。举例而言，检测步骤包括检测Gd155浓度。
还提供包含靶向纳米颗粒结合物，其包含具有多个结合位点的纳米颗粒和抗BCMA看他。
定义
除非明确指出或从语境中明显可见，否则本文中使用的术语“约”理解为处于该领域正常公差范围内，例如，处于均值的2标准偏差内。“约”可理解为处于所指出值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％或0.01％内。除非从语境中明确排除，否则本文中提供的所有数值均以术语“约”修饰。
“剂”意为任何小化合物、抗体、核酸分子、或肽、或其片段。
如本文中所用，术语“抗体”(Ab)包括单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出所希望的生物学活性即可。本文中，术语“免疫球蛋白”(Ig)与“抗体”互换地使用。如本文中所用，术语“抗体”可以指多种免疫特异性蛋白质。尽管不在术语“抗体分子”范畴内，但本发明也包括“抗体类似物”，即基于蛋白质模板的的其它非抗体分子，例如使用CDR来提供特异性抗原结合的工程化结合蛋白、融合蛋白和/或免疫结合物。术语“抗体”也包括合成性变体和基因工程化变体。
“单离的抗体”是已经与其天然环境的成分分离及/或自该天然环境的成分回收的抗体。抗体天然环境的污染物组分是将会干扰该抗体的诊断性或治疗性用途的材料，且可包括酶、激素和其它蛋白性或非蛋白性溶质。优选实施方式中，该抗体被纯化：(1)至超过90重量％的抗体，如通过Lowry方法所测，且最优选超过99重量％；(2)至足以通过使用旋杯式测序仪获得至少15个N端或内部氨基酸的残基的程度；或(3)至通过SDS-PAGE在还原或非还原性条件下使用考马斯蓝或优选银染色的同质性。单离的抗体包括重组细胞内的原位抗体，这是由于该抗体的天然环境的至少一种成分将不存在。但通常情况下，单离的抗体将通过至少一个纯化步骤制备。
抗体四链基本单元是由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链组成的异四聚体糖蛋白。IgM抗体由5个该异四聚体基本单元与被称为J链的额外的肽一起组成，并因此含有10个抗原结合位点，而所分泌的IgA抗体可聚合以形成包含2至5个四链基本单元以及J链的多价组合体。在IgG的情形中，该四链单元通常为约150,000道尔顿。每一L链通过一价二硫键链接至H链，同时，两个H链依据该H链同种型而通过一个或多个二硫键彼此链接。每一H链和L链也具有规则间隔的链间二硫桥。每一H链在N端具有可变域(VH)，对于α链和γ链，该VH域后接着三个恒定域(CH)，对于μ同种型和ε同种型，该VH域后接着四个CH域。每一L链在N端具有可变域(VH)，接着是位于该VH域另一端的恒定域(CL)。VL与VH对准，且CL与重链的第一个恒定域(CH1)对准。据信，特定的氨基酸残基在轻链可变域与重链可变域之间形成界面。将VH和VL配对在一起形成单个抗原结合部位。对于不同类别抗体的结构和特性，见，例如，《基础和临床免疫学(第八版)》(Basic and Clinical Immunology,8th edition,DanielP.Stites,Abba I.Terr and Tristram G.Parslow(eds.),Appleton&Lange,Norwalk,Conn.,1994)第71页第6章。
基于其恒定域(CL)的氨基酸序列，来自任何脊椎物种的L链均可分配至被称为kappa(κ)和lambda(λ)的两种截然不同的类型中的一种。依据其重链的恒定域(CH)的氨基酸序列，免疫球蛋白可分为不同的类别或同种型。存在五种类型的免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，分别具有指代为alpha(α)、delta(δ)、epsilon(ε)、gamma(γ)和mu(μ)的重链。基于CH序列和功能的相对较小的差异，该γ类和α类进一步分为多个子类，如，人类表达下述子类：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。
术语“可变”指的是下述事实：不同抗体的V域的某些片段的序列大为不同。该V域介导抗原结合，并界定特定抗体对于其特定抗原的特异性。但是，可变性在该可变域的110个氨基酸跨度上并非均匀分布。反而该V区域由多个以被称为“高变区”的较短的极度可变区域分开的被称为构架区(FR)的相对不变的伸展段组成，该构架区为15至30个氨基酸，而每个高变区的长度为9至12个氨基酸。天然重链和轻链的可变域各自包含4个FR，主要采用β-折叠构型，由三个高变区连接，它们形成环圈连接，并在一些情形中形成该β-折叠结构的一部分。每一链中的高变区通过该FR而极为靠近地保持在一起,并与来自另一链的高变区保持在一起，促成抗体的抗原结合部位的形成(见，《具有免疫学意义的蛋白质序列(第五版)》(Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5thEd.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)))。恒定域不直接牵涉入抗体至抗原的结合中，但展现多种效应子功能，如抗体依赖性细胞毒性(ADCC)中抗体的参与。
当在本文中使用时，术语“高变区”指的是作为抗原结合的原因的抗体的氨基酸残基。高变区通常包含来自“互补决定区”或“CDR”(如，当根据Kabat计数系统计数时，VL中大约在残基24至34(L1)、残基50至56(L2)和残基89至97(L3)左右，VH中大约在残基31至35(H1)、残基50至65(H2)和残基95至102(H3)；《具有免疫学意义的蛋白质序列(第五版)》(Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.PublicHealth Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)))的氨基酸残基；及/或那些来自“高变环”(如，当根据Chothia计数系统计数时，VL中的残基24至34(L1)、残基50至56(L2)和残基89至97(L3)，以及VH中的残基26至32(H1)、残基52至56(H2)和残基95至101(H3)；Chothia and Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987))的残基；及/或那些来自“高变环”/CDR(如，当根据IMGT计数系统计数时，VL中的残基27至38(L1)、残基56至65(L2)和残基105至120(L3)，以及VH中的残基27至38(H1)、残基56至65(H2)和残基105至120(H3)；Lefranc,M.P.et al.Nucl.Acids Res.27:209-212(1999)；Ruiz,M.e al.Nucl.AcidsRes.28:219-221(2000))的残基。视情况，该抗体在下述一个或多个点具有对称插入：当根据AHo；Honneger,A.and Plunkthun,A.J.Mol.Biol.309:657-670(2001)计数时，VL中的28、36(L1)、63、74至75(L2)和123(L3)，以及VH中的28、36(H1)、63、74至75(H2)和123(H3)。
如本文中所用，术语“单克隆抗体”指的是从基本同质的抗体群落获得的抗体，即，除了可能以微量存在的可能天然出现的突变以外，包含该群落的个体抗体是相同的.单克隆抗体是高度特异性的，被引导至单个抗原位点。此外，与包括被引导至不同决定位(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂不同，每一个单克隆抗体被引导至该抗原上的单一决定位。该单克隆抗体的优点除了它们的特异性之外，还在于它们可通过其它抗体无杂质地合成。修饰语“单克隆”被视为需要通过任何特定方法生产该抗体。例如，可用于本发明的单克隆抗体可通过Kohler et al.,Nature,256:495(1975)中首次描述的杂种细胞方法制备，或可使用在细菌、真核动物或植物细胞中的重组DNA方法(见，例如，美国专利4,816,567)制造。“单克隆抗体”也可使用例如Clackson et al.,Nature,352:624-628(1991)和Marks etal.,J.Mol.Biol.,222:581-597(1991)中描述的技术从噬菌体抗体库中单离。
单克隆抗体包括“嵌合”抗体，其中该重链及/或轻链的一部分与源自特定物种的抗体或属于特定抗体类别或子类的相应序列相同或同源，同时，该链的剩余部分于源自另一物种或属于另一抗体类别或子类的相应序列相同或同源，一级此类抗体的片段，只要它们展现所希望的生物学活性即可(见，美国专利第4,816,567号；以及Morrison et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984))。还提供源自人类抗体的可变域抗原结合序列。据此，本文中最感兴趣的嵌合抗体包括具有一个或多个人类抗原结合序列(如，CDR)且含有一个或多个源自非人类抗体的序列如FR或C区序列的抗体。此外，本文中最感兴趣的嵌合抗体是那些包含一个抗体类别或子类的人类可变域抗原结合序列以及源自另一抗体类别或子类的另一序列如FR或C区序列。本文中感兴趣的嵌合抗体也包括那些含有与本文中描述的那些相关或源自不同物种如非人灵长动物(如，旧大陆猴、猿等)的可变域抗原结合序列的嵌合抗体。嵌合抗体也包括灵长动物源化(primatized)抗体和人类源化抗体。而且，嵌合抗体可包含未见于接受者抗体中或供体抗体中的残基。做出这些修饰以进一步细化抗体效能。进一步的细节见Jones et al.,Nature 321:522-525(1986)；Riechmann etal.,Nature332:323-329(1988)；以及Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。
“人源化抗体”通常认为是具有一个或多个被引入该抗体中的来自非人类来源的氨基酸残基的人类抗体。这些非人类氨基酸残基一般称为“输入”残基，它们典型取自“输入”可变域。传统上，遵循Winter及合作者的方法(Jones et al.,Nature,321:522-525(1986)；Reichmann et al.,Nature,332:323-327(1988)；Verhoeyen et al.,Science,239:1534-1536(1988))，通过以输入高变区序列替换人类抗体的相应序列来实施人源化。据此，此类“人源化的”抗体是嵌合抗体(美国专利4,816,567)，其中，实质上少于完整的人类可变域已经被替换为来自非人类物种的相应序列。
“人类抗体”是仅含有存在于由人类天然产生的抗体中的序列的抗体。但是，如本文中所用，人类抗体可包含未见于天人出现的人类抗体内的残基或修饰，包括本文所述的那些修饰和变体序列。典型地，做出这些修饰以增强抗体效能。
短语抗体的“功能性片段或类似物”是具有与全长度抗体一样的定性生物学活性的化合物。例如，抗IgE抗体的功能性片段或类似物是可以一定方式结合至IgE免疫球蛋白的化合物，从而防止或实质上降低该分子具有结合至高亲和性受体FcεRI的能力的可能性。
术语“抗体片段”表示不同于完整抗体的分子，其包含完整抗体的一部分，该部分结合该完整抗体所结合的抗原(例如，BCMA)。抗体片段的实例包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2、双特异性抗体、线性抗体、单链抗体分子(例如，scFv)和由抗体片段形成的多特异性抗体。
本方法中使用的抗体可经由检测抗体附接部分(例如，荧光和/或染料标记，例如，Cy5)而检测或免疫学检测。换言之，通过被标记的抗-抗体如抗IgG抗体可在间接ELISA例如辣根过氧化物酶(HRP)和碱性磷酸酶(AP)中发现，可检测样品中抗体的存在。也可使用其它酶。这些包括β-半乳糖苷酶、乙酰胆碱酯酶和催化酶。大量底物可用于执行使用HRP或AP结合物进行的ELISA。底物的选择取决于所需的检验灵敏度和可用于信号检测的仪器设备(分光光度计、荧光计或光度计)。
在某些实施方案中，除非另外指明或语境中明确排除(除了其中此类数字将超过可能值的100％之外)，术语“大约”或“约”是指落入指定参考值任一方向(大于或小于)的25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更小范围内的值的范围。
术语“给药”是指将一物质引入受试者体内。通常，可使用任何给药途径，包括例如，肠道外(例如，静脉)给药、口服、外用、皮下给药、腹膜给药、动脉给药、吸入、阴道给药、直肠给药、鼻腔给药、引入脑脊液中、或滴注入体腔中。在一些实施方案中，给药是口服给药。此外或另选地，在一些实施方案中，给药是肠道外给药。在一些实施方案中，给药是静脉给药。
“对照”或“参考”意为比较的标准。一方面，如本文中所用，“与对照样本或受试者相比的改变”理解为具有与来自正常的、未处理的或对照样本相比的显着性差异的水平。对照样本包括，例如，培养物中、一种或多种实验室测试动物体内、或一位或多位人类受试者体内的细胞。选择和测试杜仲样本的方法处于该领域技术人员的能力之内。分析物可以是由该细胞或有机体特别地表达或产生的天然出现的物质(如，抗体、蛋白)或由受体构造产生的物质(如，β-半乳糖苷酶或荧光素酶)。依据用于检测的方法的不同，该改变的量和测量值可变。统计学显着性的确定处于该领域技术人员的能力之内，例如，构成阳性结果的与均值的标准偏差数字。
“检测”是指鉴别待检测的试剂(如，核酸分子，例如脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA))的存在、不存在或量。
“检测步骤”可使用多种已知方法中的任一种来检测核酸(如，甲基化的DNA)或多肽的存在。可使用探针的检测方法的类型包括西方墨点法、南方墨点法、点杂交或槽印迹、以及北方墨点法。
如本文中所用，“诊断”指的是将病理或症状归类，确定丙烯的严重性(如，阶段或分期)，监控病理学进展，预测病理结局，和/或确定修复的前景。
“片段”意为一个部分，例如，多肽或核酸分子的一部分。这一部分优选地含有参考核酸分子或多肽总长度的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。例如，该片段包含10、20、30、40、50、60、70、80、90、或100、200、300、400、500、600、700、800、900、或1000核苷酸或氨基酸。但是，本发明也包含多肽片段和核酸片段，只要它们分别展现全长度多肽和核酸的所希望的生物学活性即可。采用几乎任何长度的核酸片段。例如，本发明的多种实作中包括例示性的总长度为约10,000、约5000、约3000、约2,000、约1,000、约500、约200、约100、或约50个碱基对长度(包括所有中间长度)的多核苷酸链段。同样，采用几乎任何长度的多肽片段。例如，本发明的多种实作中包括例示性的总长度为约10,000、约5,000、约3,000、约2,000、约1,000、约5,000、约1,000、约500、约200、约100、约50个氨基酸长度(包括所有中间长度)的多肽链段。
如本文所用，术语“体外”是指在人工环境例如试管或反应容器中、细胞培养物中而非多细胞有机体内出现的事件。
如本文所用，“体内”是指在多细胞有机体例如人类和非人类动物体内出现的事件。在基于细胞的系统的情况下，该术语可用来指代在活体细胞中出现的事件(与例如体外系统相反)。
如本文所用，术语“成像剂”是指促进检测其所接合的剂(例如，多糖纳米颗粒)的任何元素、分子、官能团、化合物、其片段或部分。成像剂的实例包括但不限于：钆例如Gd155、多种配体、放射性核素(例如，3H、14C、18F、19F、32P、35S、1351、125I、123I、64Cu、187Re、mIn、90Y、99mTc、177Lu、89Zr等)、荧光染料、化学发光剂(例如，吖啶酯、稳定化的二氧杂环丁烷等)、生物发光剂、光谱可拆分的无机荧光半导体纳米晶体(即，量子点)、金属纳米颗粒(例如，金、银、铜、铂等)纳米簇、顺磁金属离子、酶(酶的具体实例见下文)、比色标签(例如，染料、胶体金等)、生物素、地高辛(dioxigenin)、半抗原、以及对抗血清或单克隆抗体有效的蛋白质。
术语“单离的”、“纯化的”或“生物学纯的”指的是材料没有不同程度的在其天然状态下发现的正常伴生组分。“单离”表示与原始来源或周围物质分隔的程度。“纯化”表示高于“单离”的分隔程度。
“标记物”意为任意蛋白质或多核苷酸，其在表达水平或活性上有与疾病或病变相关的改变。
如本文所用，术语“纳米颗粒”是指直径小于1000纳米(nm)的颗粒。在一些实施方案中，纳米颗粒的直径小于300nm，如美国国家科学基金会所界定。在一些实施方案中，纳米颗粒的直径小于100nm，如美国国立卫生院研究院所界定。任选地，纳米颗粒的直径小于50nm，任选地小于25nm，任选地小于20nm，任选地小于15nm，任选地小于10nm，以及任选地大约5nm或更小。在一些实施方案中，纳米颗粒是包含密闭隔室的胶束，通过胶束膜与本体溶液分隔开来，典型地由环绕并密闭一个空间或隔室(例如，界定内腔)的两亲性实体组成。在一些实施方案中，胶束膜由至少一种聚合物例如生物相容的和/或生物可降解的聚合物组成。
如本文所用，术语“受试者”包括人类和母乳动物(例如，小鼠、大鼠、猪、猫、狗和马)。在多个实施方案中，受试者是哺乳动物，尤其是灵长动物，尤其是人类。在一些实施方案中，受试者是家畜如牛、绵羊、山羊、奶牛、猪等；家禽如鸡、鸭、鹅、火鸡等；以及驯养动物尤其是宠物如狗和猫。在一些实施方案中(例如，尤其在研究语境中)，受试者哺乳动物将是，举例而言，啮齿动物(例如，小鼠、大鼠、仓鼠)、兔、灵长动物或猪例如近交系猪等。
除非明确指出或从语境中明显可见，否则如本文中所用，术语“或”理解为包含的。除非明确指出或从语境中明显可见，否则如本文中所用，术语“一(a)”、“一(an)”和“该”理解为单数或复数。
短语“药学可接受的载剂”是该领域中公认的，且包括适用于将本发明的化合物给药至哺乳动物的药学可接受的材料、组合物或媒介物。载剂包括牵涉入将所测试的剂从一个器官或身体的一部分携带或运输至另一器官或身体的一部分的液体或固体填料、稀释剂、赋形剂、溶剂或胶囊化材料。就与配方中其它成分可相容且不对患者造成伤害而言，每种载剂必须是“可接受的”。可用作药学可接受的载剂的材料的一些实例包括：糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉类，如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；黄芪粉；麦芽；明胶；滑石；赋形剂，如可可脂和栓蜡；油类，如花生油、棉籽油、葵花籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；二醇类，如丙二醇；多元醇类，如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；酯类，如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，如氢氧化镁和氢氧化铝；藻酸；无热原水；等渗盐水；林格溶液；乙醇；磷酸盐缓冲溶液；以及其它用于药物配方中的非毒性可相容物质。
本文中，范围可表达为从“约”一个特定值和/或到“约”另一个特定值。当此范围被表达时，另一方面包括从该一个特定值和/或到该另一个特定值。同样，当数值通过前缀“约”表达为大约数时，应理解为该特定数值形成另一方面。还应理解，每一范围的端点均明显与另一端点相关，且独立于该另一端点。也应理解，本文中揭示了大量值，而每一值除了其自身值外，在本文中也揭示为“约”该特定值。也应理解，贯穿本申请，数据提供为不同的格式，且这一数据代表端点和起始点以及该数据点的任意组合的范围。例如，如果揭示了特定数据点“10”和特定数据点“15”，则理解为大于、大于或等于、小于、小于或等于、以及等于10和15的值以及10与15之间的值也视为被揭示。也应理解，还揭示两个特定单位之间的每一单位。例如，如果10和15被揭示，则11、12、13和14页被揭示。
本文中提供的范围理解为该范围内所有值的略写。例如，1至50的范围理解为包括来自由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50所组成的群组的任意数字、数字组合或子范围以及前述整数之间的所有中间的十分位小数如，举例而言，1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8和1.9。关于“子范围”，尤其预期从该范围的任一端延伸的“嵌套子范围”。例如，例示性范围1至50的嵌套子范围可包括在一个方向上的1至10、1至20、1至30和1至40，以及在另一方向上的50至40、50至30、50至20和50至10。
如本文所用，术语“治疗”是指以任何方式给药物质，该物质部分地或完全地减轻、缓解、再生、抑制特定疾病、病变和/或病症的一种或多种症状、特征和/或肇因以及延迟其发作、降低其严重性和/或降低其发生率。此类治疗可用于并未展现相关疾病、病变和/或病症迹象的受试者，和/或用于仅展现该疾病、病变和/或病症早期迹象的受试者。或者或此外，此类治疗可用于展现相关疾病、病变和/或病症的一种或多种建立迹象的受试者。在一些实施方案中，治疗可用于已经被诊断为罹患相关疾病、病变和/或病症的受试者。在一些实施方案中，治疗可用于已知具有一种或多种在统计学上与发展出相关疾病、病变和/或病症的风险增加相关的敏感性因子的受试者。
连词“包含”与“包括”、“含有”或“特征在于”同义，是包含或开放性的，且并不排除额外的未引用的元件或方法步骤。相比之下，连词“由...组成”排除未在该主张中具体指出的任何元件、步骤或成分。连词“主要由...组成”将所主张的范畴限制为具体的材料或步骤，以及“那些不在材料上影响本发明主张的基本特征和新颖特征的材料或步骤”。
从下述对本发明优选实施方案的说明和权利要求书可明了本发明的其它特征和优点。除非另做定义，否则本文中使用的所有科技术语均具有与本发明所属领域技术人员所一般理解的相同的意义。尽管与本文所述类似或等效的方法和材料可用于实践或测试本发明，但适当的方法和材料描述如下。本文中引用的所有已公开的外国专利和专利申请通过引用而并入本文。以本文中引用的登录号指明的Genbank和NCBI文件通过引用而并入本文。本文中引用的所有其它已出版的参考文献、文档、手稿和科学文献通过引用而并入本文。在矛盾的情况下，包括定义在内，以本说明书为准。此外，材料、方法和实施例仅做例示性说明之用，而非试图限制。
附图说明
图1A至图1J示出了所采用的方法和所得的结果，其引导对于可用于MM的靶向成像造影剂(生物标记物)的合理选择和设计。图1A显示比较来自所分析的Achilles数据库的患者的BCMA表达水平随疾病分期(分别为MGUS、SMM、MM和复发)变化的信号传导淋巴细胞激活分子F7(SLAMF7)的火山图。图1B显示经由同双官能链接子(以绿色表示)使用基于钆的氧化硅纳米颗粒(Gd-NP)的NHS化学性结合至单克隆抗体靶向恶性浆细胞(例如，表达作为细胞表面生物标记物的BCMA的细胞)的示意图。图1C显示所观察到的纳米颗粒(NP)的水合粒径，分别为非结合形式和作为Gd-NP(NP)与抗SLAMF7(NP-SLAMF7)和抗BCMA抗体(NP-BCMA)的纳米颗粒-抗体复合物(从左至右)。图1D显示每种含NP组合的相对应的观察弛豫率(r1)值，如使用7T MRI机器所评估。图1E显示使用结合有Cy5.5的抗BCMA抗体以及或Gd-NP(NP)或NP-BCMA对MM1.S细胞的竞争性标记，如通过流式细胞术所评估，表明将抗BCMA抗体作为NP结合物包合在内促使SiGdNP结合到MM1.S细胞。图1F显示荧光共聚焦成像，其证实抗BCMA抗体(AF488信号)和Gd-NP(Cy5结合信号)在给药该NP-抗BCMA结合物的DAPI染色浆细胞上的共定位，因此证实这一结合物组合物(其包括与纳米颗粒结合的抗BCMA)对于浆细胞核的有效靶向性。比例尺为5μm。图1G显示通过MRI在移植后第19天和给药多种造影剂后第19天对小鼠(n＝5只小鼠/组)体内的GFP+/Luc+MM1.S细胞(箭头)成像，图像具体的为最初静脉注射MM1.SGFP+/Luc+细胞并令其播散19天的小鼠。之后，分别使用马根维显(Magnevist)、NP、或结合至单克隆抗体(抗SLAMF7或抗BCMA)的NP对n＝5/组成像。箭头标示出，在此类小鼠体内，NP-单克隆抗体结合物对脊柱的靶向性。图1H显示苏木精和伊红(H&E)染色，其用来证实骨髓中浆细胞的存在；以及普鲁士蓝(Prussian)染色，其显示钆的存在(Gd，以箭头强调)。比例尺为50nm。图1I显示所观察到的经治疗小鼠的脊柱随时间的归一化信噪比(SNR)，归一化至基线捕获水平。图1J显示NP-BCMA在非荷瘤小鼠体内的分布研究结果，通过ICP-MS对钆随时间的浓度(n＝5/时间点)定量(在多个器官中，每克中所注射Gd剂量所占的百分比(％ID/g))而评估。图1J的子图像表示在每个健康动物的脊柱和股骨中观察到的钆(Gd)的量(来自游离NP)。*P<0.05，**P<0.005，***P<0.001。
图2A至图2L显示对用于MRD检测的抗BCMA靶向成像生物标记物(NP-抗BCMA单克隆抗体结合物)的校验，NP-BCMA结合物的MRI表明其作为此新颖标记物的应用性。在图2A至图2C中，对动物静脉注射MM1.SGFP+/LUC+，并每周一次通过生物发光成像法成像(图2A)、在注射NP-BCMA后30分钟进行MRI(图2B)或CT扫描(图2C)，以将肿瘤边界可视化(箭头)。21天后(肿瘤细胞移植后第21天)，通过基于硼替佐米(3x 0.5mg/kg)和美法仑(5.5mg/kg)治疗而诱导微小残留病(MRD)的模型，并在第25天建立MRD模型。之后，每周一次继续对小鼠成像，以追踪它们的疾病负担(MRD状态)。图2D显示所观察到的BLI信号强度的变化。图2E显示所观察到的MRI信噪比的变化。图2F显示CT定量的结果和肿瘤存在性评估，将CT SNR的变化特异性地定量以评估对肿瘤细胞的检测。图2G显示当通过免疫检验定量λ轻链水平时获得的结果。阴影标定出90％置信区间(n＝每组5)。图2H显示在第5周观察到的受试者工作特征(ROC)曲线，与4种模式的灵敏度和特异性比较以检测MRD的存在。虚线表示无区别能力的诊断模式(AUC＝0.50)。图2I显示在治疗进程观察到的曲线下面积(AUC)的比较，具体比较4种检测模式的灵敏度和特异性。图2J显示流式细胞术直方图，其说明在每个时间点的总浆细胞(GFP信号)和NP-BCMA结合浆细胞(Cy5.5信号)的百分比。图2K显示浆细胞的总百分比，在所标注的时间点枚举并比较(n＝每组3只小鼠)。图2L显示NP-BCMA结合浆细胞在骨髓中的百分比，在所标注的时间点枚举并比较(n＝每组3只小鼠)。
图3A至图3D显示基于钆的纳米颗粒结合至单克隆抗体。图3A显示HPLC测量，其证实与基于钆的纳米颗粒结合之前(左图，游离NP)和之后(Gd-NP，右图，NP-BCMA)在经纯化的悬浮液中的存在。图3B显示PACE实验，其证实抗BCMA抗体结合至Gd-NP。图3C和图3D显示DLS测量，其表明结合后的纳米颗粒尺寸在酸性pH条件下随时间保持稳定，特别地，证实了在与抗BCMA抗体(图3C)或抗SLAMF7(图3D)结合之前(Gd-NP)和之后的多种纳米颗粒悬浮液在酸性pH条件下随时间保持稳定。
图4A和图4B显示多种NP-抗体复合物(包括NP-抗BCMA结合物和NP-抗SLAMF7结合物)与恶性浆细胞的体外结合有效性。图4A显示FACS数据，其显示MM1.S细胞上的作为NP-抗BCMA结合物靶向的BCMA抗原，具体地，测定了通过荧光标记的纳米颗粒本身(NP)在它们进一步结合至抗BCMA抗体之后(NP-BCMA)的流式细胞术测定的荧光标记的MM1.S细胞的百分比。图4B显示在孵化30分钟后通过ICP-MS进行的钆摄取研究，具体地，评估了多种MM细胞系的钆(Gd)摄取，通过在使用未改性的纳米颗粒(NP)、抗SLAMF7抗体结合纳米颗粒(NP-SLAMF7)、或抗BCMA抗体结合纳米颗粒(NP-BCMA)孵化30分钟后对细胞裂解液执行ICP-MS而测定。
图5A和图5B显示细胞存活率分析，其表明本公开的纳米颗粒无毒性。通过评估不同MM细胞系的细胞活力，检测纳米颗粒-抗体复合物的相对体外毒性，通过CellTiter 96单水溶液细胞增殖分析检查，该相对体外毒性随着使用递增浓度的单独的单克隆抗体(抗SLAMF7,抗BCMA)、单独的基于钆的纳米颗粒(Gd-NP)、或纳米颗粒-抗体复合物(NP-SLAMF7或NP-BCMA)孵化而变化，图5A具体地显示对两种单独的单克隆抗体和单独的钆纳米颗粒的毒性评估。图5B显示对纳米颗粒-抗体复合物(NP-BCMA和NP-SLAMF7纳米颗粒结合物)的毒性评估。实验全部在以纳米颗粒孵化72小时后执行。
图6表明通过生物发光成像(BLI)确定的MM1.S肿瘤播散，具体地显示多发性骨髓瘤的原位细胞系异种移植模型中浆细胞瘤的生长。通过IV播散将人类GFP+/LUC+MM1.S细胞引入4只小鼠体内，在此后多个以天计数的时间点执行BLI。对于MRI研究，类似地建立模型，在肿瘤细胞移植后第19天对小鼠进行研究，此时是它们的股骨和脊柱的肿瘤负担将会轻易被识别的时间点。
图7显示在肿瘤细胞移植后第19天，荷MM1.S小鼠的股骨位点中的纳米颗粒摄取。左图中，在IV给药NP-SLAMF7(上)或NP-BCMA(下)之后对5只小鼠成像。右图中，在注射纳米颗粒-抗体复合物后的多个时间点测定它们的股骨中的对比噪声比(CNR)。*P值<0.05，***P值<0.001，双尾t测试。
图8A和图8B显示通过H&E染色(左)和通过普鲁士蓝染色(右)测定的纳米颗粒-抗体复合物在注射NP-抗BCMA结合物的小鼠的脊柱(图8A)和股骨(图8B)中的定位(纳米颗粒摄取)进行的对肿瘤负担的组织学评估。
图9A至图9F显示不同纳米颗粒(基于钆的纳米颗粒和它们的抗体复合物)的生物分布、药代动力学和毒性评价。图9A显示NP(未结合的(NP)、抗SLAMF7抗体结合的(NP-SLAMF7)和抗BCMA抗体结合的基于Gd的纳米颗粒(NP-BCMA))在非荷瘤(健康)小鼠体内的生物分布(组织分布)；通过ICM-MS测量随时间变化的多种器官中每克组织的所注射Gd剂量的百分比(％ID/g)定量(n＝5/时间点)。图9B显示对从相同动物抽取的一系列血液样品执行的药代动力学研究，通过ICM-MS测量(n＝5/时间点)，其显示来自给药NP、NP-SLAMF7或NP-BCMA的健康小鼠血液的Gd浓度变化。图9C显示所观察到的随时间变化的纳米颗粒对于体重的影响(n＝5只小鼠/时间点)，在给药单剂量的多种基于Gd的造影剂之后，观察到健康小鼠的体重随时间变化。图9D显示基本代谢情况(n＝每组2只小鼠)，而图9E显示全血计数且图9F显示来自对照组(n＝3只小鼠)和在注射NP-抗BCMA结合物之后96小时的实验组(n＝3只小鼠)健康小鼠之间的化学小组比较(白细胞分类计数)。
图10显示对来自在给药单剂量的NP-BCMA后的多个时间点牺牲的健康小鼠的器官的H&E染色，其用来评估NP-抗BCMA结合物的随时间积存的毒性。从H&E载玻片没有观察到毒性，这证实了NP-抗BCMA结合物的安全性。
具体实施方式
本公开至少部分地针对以细胞表面受体为靶向的纳米颗粒-抗体结合物，因为它们的靶向特性，所述结合物具备增强的作为用于检测和定位多发性骨髓瘤和/或细胞系和/或受试者体内MRD的存在的成像剂的能力。在某些实施方案中，本公开的抗体-纳米颗粒结合物的纳米颗粒部分是基于钆的，且任选尺寸如此之小(例如，小于5nm的NP)，以至于此类结合物组合物甚至在经由链接子(例如，NHS链接子部分)结合至靶向部分(例如，抗BCMA单克隆抗体)时，经由肾排泄被相对快速地从受试者循环系统中清除而无毒性作用。因此，本文所述的纳米颗粒-抗体结合物提供改善的成像对比度，并允许增强对MRD的监测和/或对MM的治疗性预测。
目前，多种新的MM治疗模式处于临床试验阶段，并且最近此类组合物的快速发展已经伴随着对于用来监测MRD的特异性成像生物标记物的需求的增长，且伴随着改善此类治疗的评价和效能的目标。由于M峰/自由轻链(FLC)比率水平的快速改变和/或终末器官损伤，大多数MM患者被诊断为MRD阳性，如由例如高钙率、肾衰竭、贫血和/或骨骼病变所指示的(CRAB criteria；Kumar et al.Lancet Oncol 17:e328-346)。若M峰/FLC水平比率增加，则对患者进行全身X射线成像以检测骨骼病变。但是，这一成像技术缺乏灵敏性。因为新的MM疗法已经变得可用，对MM的早期确认可显着改善患者结果。
在多发性骨髓瘤患者体内，微小残留病(MRD)直接与更短的治疗应答持续时间以及较差的长期生存结果相关联(MM；Kumar et al.Lancet Oncol 17:e328-346；Nishihoriet al.Curr Hematol Malig Rep 11:118-126；Anderson et al.Clin Cancer Res,doi:10.1158/1078-0432.CCR-16-2895)。目前使用血清学研究和/或骨髓检查的诊断方法并不考虑肿瘤微环境的空间异质性；它们需要连续侵入性采样以诊断残留的浆细胞。可获得的诊断成像模式对于恶性浆细胞的检测来说既不灵敏也不具特异性(Lapa etal.Theranostics 6:254-261)，并且往往依赖于妨碍频繁测试的电离辐射(Fazel et al.NEngl J Med 361:849-857)。
据预测，用于检测MRD的成像方法的建立对于护理MM患者将具有变革性的影响，使得非侵入性和重复性测试成为可能，以发现在早期时间点和当以妨碍检测的均匀焦点分布格局存在时的残留浆细胞。
与计算机断层造影术(CT)扫描和正电子发射断层造影术(PET)比较，已知磁共振成像(MRI)提供更合理的用于评估疾病负担、预后、以及监测对疗法应答的方法(SpinnatoP.et al,Eur J Radiol.201281(12):4013-8)。当与计算机断层造影术(CT)、单光子发射计算机断层造影术(SPECT)或正电子发射断层造影术(PET；Spinnato et al.Eur J Radiol81:4013-4018)比较时，使用FDA核准的传统试剂进行磁共振成像(MRI)的技术正处于发展中，且已经显示在评估疾病负担(Pawlyn et al.Leukemia 30:1446-1448)、令准确的疾病预测成为可能(Dimopoulos et al.J Clin Oncol 33:657-664)、以及追踪MM患者对疗法的应答方面更为可靠。除了检测早期骨髓浸润以外，MRI具有区分良恶性溶骨区的优点(Shortt et al.AJR Am J Roentgenol 192:980-986)；但是，目前用来执行MRI的策略，即脂肪-水成像、弥散加权成像、对比增强，是耗时、昂贵的，且依赖于非靶向造影剂在肿瘤微环境中的被动蓄积(Matsumura and Maeda.Cancer Res 46:6387-6392)，这已经固有地限制了它们的检测特异性和灵敏度。CT扫描可仅检测骨质破坏而不检测骨髓瘤活动，而PET成像则依靠展现活跃代谢的所成像细胞，但PET成像不具备足以令显示低增殖活性的MM细胞可视化的灵敏度(Freedenberg MI et al.Phys Med 2014 30(1):104-10)。尽管SPECT和基于氟脱氧葡萄糖的(18F-FDG-)PET能准确地鉴别浆细胞群体(Cavo et al.Lancet Oncol18:e206-e217)，但它们使用有碍于短时间间隔重复测试的电离辐射。18F-FDG-PET也显示，对于更慢增殖的MRD状态的恶性浆细胞的检测灵敏度差。
在本文所述的本发明之前，迫切需要用于基于MRI撷取的MM成像生物标记物，该生物标记物将会呈现超过现有成像技术的清晰性优点。在MM诊断，更具体的说，在MRD诊断中，目前使用的MRI造影剂(钆螯合物)依赖于被动靶向途径(Zhou et al.Wiley InterdiscipRev Nanomed Nanobiotechnol.2013 5(1):1-18)(EPR效应)，这不能产生足以被检出的特异性的对比信号。在纳米医疗技术中，已经建议使用抗体实现对于细胞表面受体的靶向性。但是，最近对此类靶向剂执行的概念验证研究已经表明了次佳结果。事实上，观察到此类研究中的NP循环半衰期时间急剧下降，导致由于这些复合物的大尺寸造成的低体内结合亲和性，并且成像进一步被NP不能为了以作为该抗体靶点的细胞表面受体为靶向而避开脉管系统所阻止。结果，在主动靶向形式的NP和被动靶向形式的NP之间没有观察到差异，这限制了它们作为有效且特异性的成像剂的应用。如下文所详述，为了研发改善的成像生物标记物并且注意到待结解决的首要课题是复合物“纳米颗粒-全抗体”的最终尺寸，选择了具有高MRI特性的小于5nm的超细NP，以及相对小的单克隆抗体。本公开聚焦于生成新颖的MM靶向造影剂，其能使用短MRI序列鉴定具有高度空间定位的微小肿瘤细胞群体。本公开的首要目标是生成基于钆(Gd)的纳米颗粒(Gd-NP)，其将会特异性地以浆细胞为靶向，以增强对MRD的早期检测。抗体用于通过结合在它们的细胞表面上过度表达的受体而令纳米颗粒以肿瘤为靶向的用途由来已久(Ulbrich et al.Chem Rev 116:5338-5431；Mulvey et al.NatNanotechnol 8:763-771)。由于这些典型纳米颗粒-抗体复合物的尺寸(直径为50至200nm；Arruebo et al.J Nanomater,doi:10.1155/2009/439389(2009))比完整的单克隆抗体或它们的分子结合物尺寸(长度为10至15nm且直径为3至5nm；Reth,M.Nat Immunol 14:765-767)大得多，它们的药理学很大程度上由该纳米颗粒而非由抗体表述。此外，使用此类剂实施的大多数临床前研究已经在皮下异种移植物模型中执行(Smith et al.NatNanotechnol,doi:10.1038/nnano.2017.57(2017)；Qian et al.Nat Biotechnol 26:83-90)，该模型中并不概括在天然肿瘤微环境中发现的血管模式(Mack and Marshall.NatBiotechnol 28:214-229)。因此，报导的这些构造物很多已经展现，在实现肿瘤定位方面与它们的非靶向副本没有差别(Kunjachan et al.Nano Lett 14:972-981)，这已经阻挠了它们的进一步转化研发。
最初，比较了单克隆抗体针对两种特异性抗原的靶向有效性，该抗原为B细胞成熟抗原(BCMA)和信号传导淋巴细胞活化分子-F7(SLAMF7)受体。两种靶点是几乎专有地存在于非特性B细胞表面上的良好构建的抗原(Lonial et al.N Engl J Med 373:621-631；Novak et al.Blood 103:689-694)。BCMA，区别于SLAMF7，是高度特异性的将细胞抗原，其在B细胞成熟及分化为浆细胞中扮演重要角色(Carpenter RO et al.Clin Cancer Res2013 19(18):2048-60)。BCMA的广泛存在和高表达水平随着MM级数的发展而增加(图1A)，使得BCMA成为用于监测MM的实际细胞表面受体。本文所述是低于5nm NP的发展(如Detappeet al.Nano Lett 17:1733-1740；Detappe et al.J Control Release 238:103-113中所述)，这是基于氧化硅的钆NP，特异性地以浆细胞的细胞表面受体为靶向，并因此允许对MM疾病级数和/或MM疗法(包括新研发的MM疗法)结果进行更有效和特异性的预测(提升的特异性和灵敏度)。
本文中，对基于钆的结合单克隆抗体的超小纳米颗粒的磁共振成像(MRI)已经令对骨髓微环境中的克隆浆细胞进行快速检测成为可能。据信，本公开首次描绘了使用非侵入性的安全成像剂来改善在给予治疗后对MRD进行早期检测的实例。
本公开的某些靶向纳米颗粒结合物能提升检测受试者(例如，哺乳动物受试者)体内MM细胞的灵敏度。本公开的靶向纳米颗粒可例如将灵敏度相对于非靶向NP改善至少1.5倍。任选地，灵敏度相对于非靶向NP改善了至少两倍。任选地，灵敏度相对于非靶向NP改善了至少三倍。任选地，灵敏度相对于非靶向NP改善了至少五倍。任选地，灵敏度相对于非靶向NP改善了至少十倍。
本公开的某些靶向纳米颗粒结合物可额外地和/或另选地提升检测受试者(例如，哺乳动物受试者)体内MM细胞的特异性。本公开的靶向纳米颗粒可例如将特异性相对于非靶向NP改善至少1.5倍。任选地，特异性相对于非靶向NP改善了至少两倍。任选地，特异性相对于非靶向NP改善了至少三倍。任选地，特异性相对于非靶向NP改善了至少五倍。任选地，特异性相对于非靶向NP改善了至少十倍。
在某些实施方案中，对于MRD，本公开的靶向纳米颗粒结合物可具备比非靶向纳米颗粒更低的MRI检测阈值。举例而言，某些本公开的靶向纳米颗粒对于受试者体内的MRDF的MRI检测阈值可以是每位受试者100,000个或更少浆细胞、任选地每位受试者50,000个或更少浆细胞、任选地每位受试者30,000个或更少浆细胞、任选地每位受试者20,000个或更少浆细胞、任选地10,000个或更少浆细胞每位受试者、任选地每位受试者8,000个或更少浆细胞、任选地每位受试者6,000个或更少浆细胞、任选地每位受试者5,000个或更少浆细胞、任选地每位受试者4,000个或更少浆细胞、任选地每位受试者3,000个或更少浆细胞、任选地约每位受试者2,200非浆细胞，例如，任选地每位受试者2,200±450个浆细胞(任选地，其中受试者是小鼠)。
抗BCMA单克隆抗体
B细胞成熟抗原(BCMA)是肿瘤坏死因子受体超家族(TNFRSF)的成员17。其天然配体是B细胞活化因子(BAFF；也称BLγS或TALL-1、TNFSF13B)和增殖诱导配体(APRIL、TNFSF13、CD256)(Mackay et al.(2003)Annu Rev Immunol 21:231-264)，它们最终(通过与其它配体相互作用)牵涉入调节体液免疫、B细胞发育和体内平衡的多个方面中。BAFF的亲和性在低摩尔范围内有所体现，而ARPIL的结合紧密度比BCMA高接近100倍(Bossen etal.(2006)Semin Immunol 18:263-275)。BCMA的表达仅限于B细胞谱系，其中它主要被表达在浆母细胞和浆细胞上但在原生B细胞、生发中心B细胞和记忆性B细胞上缺失(Darce etal.(2007)J Immunol 179:7276-7286；Benson et al.(2008)J Immunol 180:3655-3659；Good et al.(2009)J Immunol 182:890-901)。
对于骨髓中的长寿、无柄浆细胞的存活来说，BCMA表达是重要的(O'Connor etal.(2004)J Exp Med 199:91-98)。因此，BCMA缺陷小鼠显示骨髓中浆细胞数目降低，而脾脏中的浆细胞水平不受影响(Peperzak et al.(2013)Nat Immunol[Epub 2013Feb 03,10.1038/ni.2527])。在BCMA敲除小鼠体内，成熟的B细胞分化为浆细胞是正常的(Schiemann et al.(2001)Science 293:21 1 1-21 14；Xu et al.(2001)Mol Cell Biol21:4067-4074)。BAFF或APRIL结合到BCMA，触发了NF-κΒ活化(Hatzoglou et al.(2000)JImmunol165:1322-1330)，这诱导抗细胞凋亡Bcl-2成员例如Bcl-xL或Bcl-2和Mcl-1的上调(Peperzak et al.(2013)Nat Immunol[Epub 2013Feb 03,10.1038/ni.2527])。
BCMA也在恶性浆细胞上高度表达，例如在作为骨髓的B细胞非霍奇金(Hodgkin)氏淋巴瘤的多发性骨髓瘤(MM)中，以及浆细胞白血病(PCL)中，PCL比MM更具侵略性且构成了所有浆细胞病变中的大约4％。除了MM和PCL之外，也已经在患有霍奇金氏淋巴瘤的患者的霍奇金细胞和Reed-Sternberg细胞上检测到了BCMA(Chiu et al.(2007)Blood 109:729-739)。与其在浆细胞上的功能类似，结合到BCMA的配体已经显示调节表达BCMA的多发性骨髓瘤细胞的生长和存活(Novak et al.(2004)Blood 103:689-694)。经由BCMA进行的BAFF和APRIL信号传导被认为是恶性浆细胞的促生存因子；因此，BCMA阳性肿瘤细胞的耗竭和/或配体-受体相互作用的中断应改善对多发性骨髓瘤和自身抗体依赖性自身免疫疾病的治疗结果。目前存在大量可获得的用于治疗多发性骨髓瘤的途径(Raab et al.(2009)Lancet374:324-339)。化疗在大多数受试者体内仅导致对多发性骨髓瘤的部分控制；仅极少数进行化疗的患者实现了完全缓解。因此一般采用联合途径，该途径通常牵涉额外给药皮质类固醇，诸如地塞米松或强的松。但是，皮质类固醇具有副作用的困扰，诸如骨密度减轻。也提出了使用自己的干细胞(自体的)或使用来自密切相关的或匹配的不相干供体的细胞(同种异体的)进行干细胞移植。在多发性骨髓瘤中，实施的大多数移植物是自体类的。尽管此类移植物不是治愈性的，但它们已经显示延长了所选择患者的寿命(Suzuki(2013)Jpn JClin Oncol 43:1 16-124)。或者，近来萨利多胺(thalidomide)及其衍生物已经被用于治疗，但也与次优成功率和高成本联系在一起。最近，蛋白酶体抑制剂硼替佐米(PS-341)已经被批准用于治疗复发性和难治性MM，单独或与构建药物联合用于大量临床试验中并且导致令人振奋的临床结果(Richardson et al.(2003)New Engl J Med 348:2609-2617；Kapooret al.(2012)Semin Hematol 49:228-242)。治疗途径一般是联合疗法。此类联合治疗的成本相应地高，而成功率仍存在显着的改善空间。由于同步使用多种药物时副作用的叠加，治疗方案的联合也是不实际的。
对于自身免疫疾病的治疗，特异性地以浆细胞为靶向的能力也极为有益。对于其中自身反应性抗体对于病理学至关重要的自身免疫疾病例如全身性红斑狼疮(SLE)和风湿性关节炎(RA)，传统疗法取决于症状的严重性和患者的具体情况(Scott et al.(2010)Lancet 376:1094-1 108,D'Cruz et al.(2007)Lancet 369,587-596)。通常，中度疾病首先使用非甾体抗炎药(NSAID)或疾病缓解性抗风湿药(DMARD)治疗。更严重的SLE，由于活跃疾病而牵涉器官功能障碍，往往使用甾体类药物与强效免疫抑制剂如环磷酰胺(一种以循环细胞为靶向的细胞毒性剂)协同治疗。贝利单抗(Belimumab)，一种以提高的水平在自身免疫疾病患者血清中发现的细胞因子BAFF靶向抗体，被美国食品和药物管理局(Food andDrug Administration(FDA))批准用于SLE，仅仅是最近的事。但是，仅新形成的B细胞依赖BAFF在人体内存活，而记忆性B细胞和浆细胞对于选择性BAFF抑制的易感度较低(Jacobiet al.(2010)Arthritis Rheum 62:201-210)。对于类风湿性关节炎，TNF抑制剂是最早被许可的生物制剂，之后是阿巴西普(abatacept)、利妥昔单抗(rituximab)和托珠单抗(tocilizumab)等，它们阻抑牵涉入关节炎症和破坏中的关键炎性途径，但由于相关免疫抑制，这是以增加感染风险为代价的(Chan et al.(2010)Nat Rev Immunol 10:301-316；Keyser(2011)Curr Rheumatol Rev 7:77-87)。即使这些生物制剂被批准，但患有RA和SLE的患者往往显示自身免疫标记物的持续性，这最大可能是与骨髓中长寿的固着浆细胞的存在有关，这种浆细胞抗拒由利妥昔单抗和高剂量的糖皮质固醇和环磷酰胺疗法造成的CD20介导的消融。目前，SLE中的策略包括通过免疫消融和自体干细胞移植而“重置”免疫系统，但移植相关死亡率的风险仍然是严重隐患(Farge et al.(2010)Haematologica 95:284-292)。使用蛋白酶体抑制剂例如硼替佐米可能是用于浆细胞耗竭的备选策略：由于高速率的蛋白质合成和有限的蛋白质水解能力，浆细胞对于蛋白酶体抑制剂是高度敏感的。近来硼替佐米已经被批准用于治疗复发性多发性骨髓瘤，且近期在具有狼疮样疾病的小鼠体内进行的研究显示，硼替佐米耗尽浆细胞并保护具有狼疮样疾病的小鼠免于罹患肾炎(Neubert et al.(2008)Nat Med 14:748-755)。但是，蛋白酶体抑制剂并不特异性地作用于浆细胞，且副作用例如周围神经病变的发生率高(Arastu-Kapur et al.(2011)ClinCancer Res 17:2734-2743)。
治疗性抗体可通过若干基于结合至其靶点的机制发挥作用。结合其自身可触发信号转导，这可导致程序性细胞死亡(Chavez-Galan et al.(2009)Cell Mol Immunol 6:15-25)。它也能够通过结合物至受体或配体而阻断受体与其配体的相互作用。如果对于存活来说重要的细胞被影响，则这些干扰可造成细胞凋亡(Chiu et al.(2007)Blood 109:729-739)。关于细胞耗竭，存在两种已知的主要效应子机制。第一种是朝向靶点细胞的补体依赖性细胞毒性反应(CDC)。存在三种已知的不同途径。但是，在抗体的情况下，CDC的重要途径是通过C1 q结合至IgG或IgM的恒定区启动的经典途径(Wang and Weiner(2008)ExpertOpin Biol Ther 8:759-768)。
第二种机制称为抗体依赖性细胞的细胞毒性反应(ADCC)。这一效应子功能的特征是表达用于该抗体的各同种型的Fc-受体的免疫细胞的募集。ADCC很大程度上由活化Fc-γ受体(FcγR)而介导，该Fc-γ受体能单独或作为免疫复合物结合物IgG分子。小鼠展现三种激活Fc-γ受体(FcγRI、FcγRIII和FcγRIV)，而人类有五种(FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIC、FcγRIIIA和FcγRIIIB)。这些受体被表达在固有免疫细胞如粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞和天然杀手细胞上，并因此将固有的免疫系统与适应性免疫系统关联。
依据细胞类型，在识别抗体标记的靶点细胞时，荷FcgR细胞具有若干种作用模式。粒细胞通常释放血管活性但细胞毒性的物质或化学引诱物，但也能进行吞噬作用。单核细胞和巨噬细胞应答吞噬作用、氧化爆发、细胞毒性或促炎细胞因子的释放；而天然杀手细胞释放颗粒酶和穿孔素，也能通过与靶点细胞上的FAS和它们的Fas配体相互作用而触发细胞死亡(Nimmerjahn and Ravetch(2008)Nat Rev Immunol 8:34-47；Wang and Weiner(2008)Expert Opin Biol Ther 8:759-768；Chavez-Galan et al.(2009)Cell MolImmunol 6:15-25)。
结合CD269(BCMA)的抗体和它们在治疗各种B细胞相关医学疾病中的用途在该领域中有所描述。Ryan等人(Molecular Cancer Therapeutics,2007 6(11),3009)描述了使用BCMA蛋白质的氨基酸5至54构成的肽在大鼠体内接种疫苗而获得的抗BCMA抗体。本文所述的抗体结合BCMA，阻断APRIL依赖性NF-KB活化，并诱导ADCC。未提供关于抗体的特异性表位的细节。WO 2012/163805描述了BCMA结合蛋白例如嵌合抗体和人源化抗体、它们阻断BAFF和/或与BCMA的APRIL相互作用的用途、以及它们在治疗浆细胞恶性肿瘤如多发性骨髓瘤中的潜在用途。其中公开的抗体是使用BCMA蛋白质的氨基酸4至53的重组肽在小鼠体内接种疫苗而获得的。WO 2010/104949也描述了多种优选结合BCMA胞外域的抗体以及它们在治疗B细胞介导的医学病症和疾病中的应用。未提供关于抗体的特异性表位的细节。
WO 2002/066516描述了结合BCMA和TACI两者的二价抗体以及它们在治疗自身免疫疾病和B细胞癌症中的潜在用途。BCMA的一个未界定的胞外域被用来生成其中所述抗体的抗BCMA部分。WO 2012/066058公开了结合BCMA和CD3两者的二价抗体以及它们在治疗B细胞相关医学疾病中的潜在用途。两个出版物中均未提供关于抗体的结合特性和特异性表位的细节。
WO 2012/143498描述了对牵涉抗BCMA抗体的使用的多发性骨髓瘤进行分层的方法。优选的抗体是被称为“Vicky-1”(from来自GeneTex的lgG1亚型)和“Mab 193”(来自R&D系统的lgG2a亚型)的那些。未提供关于抗体的结合特性和特异性表位的细节。
WO 2014/068079描述了被评估为适用于治疗浆细胞疾病如多发性骨髓瘤(MM)和自身免疫疾病的抗BCMA抗体。WO 2014/068079提供了结合CD269(BCMA)，尤其是CD269(BCMA)的胞外域表位的单离抗体或抗体片段。因此提供了结合CD269(BCMA)的单离抗体或抗体片段，其中该抗体结合包含CD269(BCMA)的残基13至32中的一个或多个氨基酸的表位。
为了培育抗BCMA抗体，在接种疫苗中使用包含CD269胞外域的抗原来生成抗BCMA抗体的结合特异性。在抗体生产过程中使用完整的CD269或其包含膜结合域或胞内域的片段作为抗原，将会产生结合CD269的隐藏域或胞内域的抗体，从而使得此类试剂不适用于治疗性应用或在治疗性应用中存在缺点。WO 2014/068079中描述的抗体因此通过它们结合至CD269胞外域而界定。胞外域中的特异性表位也呈递优选新颖的和WO 2014/068079公布未预期的特征。
将从WO 2014/068079的一个实施方案制备的Fab片段以与纯化的BCMA胞外域的复合物形式结晶，并解析复合物结构。结构分析显示了WO 2014/068079公布的抗BCMA抗体的表位的详细信息和它的生物相关性。胞外域的包含CD269(BCMA)的残基13至32的一个或多个氨基酸的表位与WO 2014/068079公布的抗体结合被鉴定为优势特性，因为这一区域显示与CD269的两种天然配体——BAFF和APRIL——的结合位点的显着重叠。先前技术所述的抗CD269抗体无一显示这种与BAFF和APRIL结合位点的广泛重叠。
本文所述的某些抗BCMA抗体或抗体片段可结合包含CD269(BCMA)的氨基酸13、15、16、17、18、19、20、22、23、26、27或32中的一个或多个的表位。任选地，单离的抗BCMA抗体或抗体片段可结合由CD269(BCMA)的氨基酸13、15、16、17、18、19、20、22、23、26、27或32所组成的表位。这些残基表示直接与抗BCMA抗体相互作用的氨基酸，如通过WO 2014/068079中所示晶体结构数据所鉴别的。这些残基的编号是相对于CD269的N端序列进行的。
在某些实施方案中，抗BCMA抗体结合CD269(BCMA)并中断BAFF-CD269相互作用和/或APRIL-CD269相互作用。BAFF/APRIL-CD269相互作用被认为分别在细胞内触发抗细胞凋亡信号和生长信号(Mackay,Schneider et al.(2003)Annu Rev Immunol 21:231-264；Bossen and Schneider(2006)Semin Immunol 18:263-275)。
抗BCMA抗体J22.9-xi:J22.9-xi的示例性人源化是基于序列对齐和从晶体结构获得的数据而人源化的。使用IgBLAST(NCBI)将可变区的序列与它们对应的人类同源对齐。通过在改变之前对结构进行目测而评估每种提出的突变。突变体与BCMA的结合可使用流式细胞术测试。使用表面等离子体共振(ProteOnTMXPR36；Bio-Rad)测量亲和性。对人源化序列的结合特性的初步评估显示了关于它们对于与所述用于J22.9-xi结合的表位的特异性和亲和性的满意结果。
可使用标准杂交瘤技术和获得BCMA结合抗体。例如，为了生产最初的抗BCMA抗体，用不完全的弗氏佐剂(Freund's adjuvant)和30μg的C端融合至谷胱甘肽S-转移酶(GST)的人类BCMA胞外域将四(4)只BL/6野生型小鼠免疫化6次。细胞融合以及之后的筛选阶段后，J22.9杂交瘤显示分泌抗BCMA抗体。
链接子
任何数量的该领域中广为人知的链接子部分可用来接合抗BCMA抗体与具备增强的成像特征的纳米颗粒，从而形成本文所述结合物范畴内的抗BCMA抗体-纳米颗粒组合物。在示例性实施方案中，组合物表面上的反应性胺基团经由与胺基团的N-羟基琥珀酰亚胺酯(例如，NHS)反应而呈递异双官能链接子分子(例如，“锚定点”)。在一些实施方案中，异双官能锚定链接子(例如，双官能PEG大分子单体)可包括位于一端的胺反应性NHS酯、短的(例如，大约2千道尔顿(kDa))PEG链、以及位于另一端的丙烯酸酯基团。在某些实施方案中，异双官能锚定链接子(例如，双官能PEG大分子单体)可包括位于一端的胺反应性NHS酯、短的PEG链、以及位于另一端的硫醇基团。短的PEG链接子也想位于末端的丙烯酸酯基团或硫醇基团提供额外程度的自由，使得它更容易链接至第二反应中的凝胶涂层。在本公开的具体实施方案中，双磺基琥珀酰亚胺基辛二酸盐(BS3)链接子被用于NP与抗BCMA抗体的结合。也明确考虑另选的链接子，例如，具备比本文所述的某些NHS-NHS同双官能链接子更直接的官能性的那些。
预计NP与抗体的结合可以多种方法实施，包括使用外部链接子结合至NP以创建与抗体的链接(其中可选择两个不同的官能性并在相同链接子中混合在一起，例如，NHS链接子(可与胺反应)或马来酰亚胺(可与硫醇反应))。也可使用多种其它链接子，包括炔-叠氮化物链接子(经由铜催化的点击化学反应)、环辛炔-叠氮化物(无铜点击化学)、TCO-四嗪等。由于本公开的NP具备胺，链接子的一端将倾向于是NHS，但该链接子的另一端的组成可依据抗体操控而变化。硫醇装饰的/官能化的抗体创建了以下情境：其中可采用NHS-马来酰亚胺链接子和/或NHS-马来酰亚胺基己酰基链接子且效果良好。此外和/或另选地，可在聚合物本身上创建外接臂，从而创建具有硫醇基团的游离胺，其可直接将NP结合至抗体而无需使用链接子来桥接两个部分(NP和抗体)。
纳米颗粒
已经证实，尺寸和形状均匀(例如，3至5nm直径)的纳米颗粒是用于生物成像的有效工具。纳米颗粒具有高的面积体积比；它们是高反应性的良好催化剂并粘附至生物分子。一种纳米颗粒材料是硅，因为它是惰性的、无毒的、充裕的和经济的。可将硅表面官能化。硅纳米颗粒显示在电磁光谱的可见部分的有效光学发光，并且是生物惰性的和化学稳定的。一种具有类似生物相容性的材料是多孔硅。小于100nm的颗粒显示在肿瘤内的增强的渗透性和保留效应(EPR效应)，这是一种重要的非特异性靶向效应。硅纳米颗粒，也称为硅量子点，可用于成像技术中，还可用于LED、光伏、锂离子电池、晶体管、聚合物或双光子吸收。
多种纳米颗粒可用于本公开的结合物组合物中，包括本文所述的例示性的基于氧化硅的钆NP，以及例如聚合物NP如US 9,381,253中公开的那些(用于有机MRI造影的聚合物刷纳米颗粒)和例示性的用于体内CRISPR改性的聚合物纳米颗粒(如WO 2017/004509中所述)。
磁共振成像(MRI)
MRI是最常用的医学诊断技术之一，其具备非侵入性、快速和无需危害患者的组合优点。MRI基于对水的质子驰豫的观察，这直接取决于磁场(重要的磁场B0和射频场)、脉冲序列、水在有机体中的环境等。随后，对MRI图像的诠释给出对大多数组织的鉴别。可通过两种类型的试剂增加对比度：阳性造影剂T1和阴性造影剂T2。阳性造影剂即T1，允许在水与造影剂接触时照亮图像，使得其可能降低总行弛豫时间：T1。Gd(III)DTPA或Gd(III)DOTA是临床实践中使用的和本公开中预期/采用的T1造影剂的实例。
该领域中已知的和本文采用的某些纳米颗粒尤其可作为造影剂用于成像(例如，MRI)和/或其它诊断技术中和/或作为治疗剂，其给出比相同类型的已知纳米颗粒更好的表现，并且其组合了小尺寸(例如，小于20nm)和高金属负载(例如，稀土金属)，尤其是从而在成像(例如，MRI)中具有高强度和在高频下的正确响应(驰豫增加)。
根据本公开的具备介于1与20nm之间的直径的例示性纳米颗粒，可各自包含：包括任选地与掺杂阳离子关联的钆阳离子的聚有机硅氧烷(POS)基质；螯合移植物C1 DTPABA(二乙三胺五乙酸二酐)，其通过—Si—C—共价键结合至POS基质，并以足够能复合所有钆阳离子的数量存在；以及任选地另一种功能化移植物Gf*，其通过—Si—C—共价键结合至POS基质(其中Gf*可源自亲水性化合物(PEG)；源自具有活性成分PA1的化合物；源自靶向化合物；和/或源自发光化合物(荧光素))。
给药
本公开的纳米颗粒-抗BCMA抗体结合物可经由多种给药途径给药，包括但不限于：皮下给药、静脉给药、鞘内给药、肌肉给药、鼻腔给药、口服给药、经表皮给药、肠道外给药、吸入给药或脑室内给药。
如本文所用，术语“注射”或“可注射的”是指推注(给药离散量的试剂，以增加其在体液中的浓度)、在几分钟内的慢推注、或延长的输液、或以间隔分开的若干次连续注射/输液。
在本公开的一些实施方案中，如本文中界定的制剂被通过推注给药至受试者。
纳米颗粒结合物以足以在所希望的成像(和/或治疗，例如，药物或其它试剂被给药之处)位点实现熟练医师认为有效的浓度的量给药，例如，以足以实现约1×10-8至约1×10-1摩尔/升左右的浓度的量给药。在本发明的一些实施方案中，该纳米颗粒结合物给药为每年至少一次。在本发明的其它实施方案中，该纳米颗粒结合物给药为每天至少一次。在本发明的其它实施方案中，该纳米颗粒结合物给药为每周至少一次。在本发明的一些实施方案中，该纳米颗粒结合物给药为每月至少一次。
将本公开的纳米颗粒结合物给药至收十字的例示性剂量包括但不限于下列：1至20mg/kg/天、2至15mg/kg/天、5至12mg/kg/天、10mg/kg/天、1至500mg/kg/天、2至250mg/kg/天、5至150mg/kg/天、20至125mg/kg/天、50至120mg/kg/天、100mg/kg/天、至少10ug/kg/天、至少100ug/kg/天、至少250ug/kg/天、至少500ug/kg/天、至少1mg/kg/天、至少2mg/kg/天、至少5mg/kg/天、至少10mg/kg/天、至少20mg/kg/天、至少50mg/kg/天、至少75mg/kg/天、至少100mg/kg/天、至少200mg/kg/天、至少500mg/kg/天、至少1g/kg/天，以及低于500mg/kg/天、低于200mg/kg/天、低于100mg/kg/天、低于50mg/kg/天、低于20mg/kg/天、低于10mg/kg/天、低于5mg/kg/天、低于2mg/kg/天、低于1mg/kg/天、低于500ug/kg/天、以及低于500ug/kg/天的成像和/或治疗有效剂量。
在本发明的一些实施方案中，在给药成像和/或治疗有效量的本公开的纳米颗粒结合物之前、与其联合、同时、或之后，给药与纳米颗粒结合物截然不同的治疗剂。在一些实施方案中，第二治疗剂选自化疗剂、抗氧化剂、抗炎剂、抗微生物剂、类固醇等组成的组。
除非另外指定，否则本发明的实践采用传统的化学、分子生物学、微生物学、重组DNA、遗传学、免疫学、细胞生物学、细胞培养和转基因生物学技术，它们处于该领域技术人员能力之内。例如，见《分子克隆》(Maniatis et al.,1982,Molecular Cloning(ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.))；《分子克隆(第二版)》(Sambrook et al.,1989,Molecular Cloning,2nd Ed.(Cold Spring Harbor LaboratoryPress,Cold Spring Harbor,N.Y.))；《分子克隆(第三版)》(Sambrook and Russell,2001,Molecular Cloning,3rd Ed.(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,N.Y.))；《分子生物学现代方法》(Ausubel et al.,1992,Current Protocols inMolecular Biology(John Wiley&Sons,including periodic updates))；《DNA克隆》(Glover,1985,DNA Cloning(IRL Press,Oxford))；Anand,1992；Guthrie and Fink,1991；《抗体》(Harlow and Lane,1988,Antibodies,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.))；《核酸杂交》(Jakoby and Pastan,1979；Nucleic AcidHybridization(B.D.Hames&S.J.Higgins eds.1984))；《转录和转译》(Transcription AndTranslation(B.D.Hames&S.J.Higgins eds.1984))；《动物细胞培养》(Culture Of AnimalCells(R.I.Freshney,Alan R.Liss,Inc.,1987))；《免疫化细胞和酶》(Immobilized CellsAnd Enzymes(IRL Press,1986))；《分子克隆实践指南》(B.Perbal,A Practical Guide ToMolecular Cloning(1984))；著述《酶学方法》(Methods In Enzymology(Academic Press,Inc.,N.Y.))；《用于哺乳动物细胞的基因转移载体》(Gene Transfer Vectors ForMammalian Cells(J.H.Miller and M.P.Calos eds.,1987,Cold Spring HarborLaboratory))；《酶学方法》(Methods In Enzymology,Vols.154and155(Wu et al.eds.))；《细胞和分子生物学中的免疫化学方法》(Immunochemical Methods In Cell AndMolecular Biology(Mayer and Walker,eds.,Academic Press,London,1987))；《实验免疫学手册》(Handbook Of Experimental Immunology,Volumes I-IV(D.M.Weir andC.C.Blackwell,eds.,1986))；《基础免疫学(第六版)》(Riott,Essential Immunology,6thEdition,Blackwell Scientific Publications,Oxford,1988)；《小鼠胚胎操控》(Hoganet al.,Manipulating the Mouse Embryo,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1986))；《斑马鱼实验室使用指南(第四版)》(Westerfield,M.,The zebrafish book.A guide for the laboratory use of zebrafish(Danio rerio),(4th Ed.,Univ.of Oregon Press,Eugene,2000))。
除非另做定义，否则本文中使用的所有科技术语均具有与本发明所属领域技术人员所一般理解的相同的意义。尽管与本文所述类似或等效的方法和材料可用于实践或测试本发明，但适当的方法和材料描述如下。本文中提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献通过引用而以其整体并入本文。在矛盾的情况下，包括定义在内，以本说明书为准。此外，材料、方法和实施例仅做例示性说明之用，而非试图限制。
[实施例]
参考下述实施例描述本发明，这些实施例仅以示例方式提供而非意图以任何方式限制本发明。使用该领域中周知的标准技术或下文具体描述的技术。
实施例1：材料和方法
细胞系
人类MM细胞系MM.1S购自ATCC(Manassas,VA,USA)。通过逆转录病毒转导，使用pGC-GFP/Luc载体，生成MM.1S GFP+Luc+细胞。通过短串联重复序列DNA分型验证细胞。将MM.1S细胞、OPM2细胞和KMS11细胞在RPMI培养基例如，RPMI-1640培养基；Sigma,USA)中培养，以10％胎牛血清(Sigma,USA)、1％青霉素-链霉素(Invitrogen,USA)和1％谷氨酰胺(Invitrogen,USA)补充培养基。在湿润培养器内维持37℃和5％CO2的最优条件。
基于氧化硅的钆纳米颗粒的合成，包括抗体结合的基于钆的纳米颗粒(Gd-NP)的合成
超小的包含氧化硅的Gd-NP由NH Theraguix,Inc.(Villeurbanne,France)提供，并在先前所报导的过程之后合成(Detappe et al.J Control Release 238:103-113；Detappe et al.Sci Rep 6:34040)。此类纳米颗粒在例如US 2013/0195766中也有所描述。
使用先前报导的同双官能链接子化学(Schmidt and Robinson.Nat Protoc 9:2224-2236)，将NP构造物与鼠抗人类SLAMF7和BCMA单克隆抗体(Biolegend Inc.,SanDiego,CA)结合。简单地说，将Gd-NP在超纯水中稀释为50nM的最终浓度。将1:10摩尔比的双磺基琥珀酰亚胺基辛二酸盐(BS3)链接子与Gd-NP在室温混合30分钟，以促进链接子接合的纳米颗粒的生成。随后，将这些表面改性的Gd-NP与单克隆抗体以1:100的摩尔比组合，并将悬浮液在室温搅拌1小时。使用配备50kDa分子量截留膜(Milipore)并以5,000rpm旋转的过滤装置通过离心过滤纯化纳米颗粒-抗体复合物；离心浓缩之后，将纳米颗粒-抗体复合物再次悬浮在1M PBS中。将这一过程重复执行三次，以确保全部过量的游离抗体被移除到滤液中和浓缩纯NP-SLAMF7和NP-BCMA的悬浮液。使用Agilent 7900(Agilent Technologies,Inc.,Santa Clara,CA)，通过ICP-MS测定纳米颗粒-抗体复合物的最终浓度。
测定纳米颗粒-抗体复合物结合MM细胞的特异性的体外分析
对使用多种纳米颗粒-抗体复合物处理的MM细胞系实施流式细胞术分析。首先，将细胞与Gd-NP、NP-SLAMF7或NP-BCMA的悬浮液(0.5mM)混合30分钟，用新鲜培养基洗涤，再次悬浮在溶液中(1x106细胞/mL)。随后，将经处理的细胞使用PerCP/Cy5.5标记的抗人类BCMA抗体在37℃温育一小时，其用作NP-BCMA的竞争性标记(它的结合减少了使用这一试剂的荧光标记)。之后通过流式细胞术检测Cy5.5标记的细胞群体。为了交叉验证该结果，使用ICP-MS对Gd结合每细胞的量进行定量。为了实施这些后期实验，在使用ICP-MS精确枚举每个样品中Gd的量之前，使用0.3％Triton-X 100溶液将经处理的MM细胞系裂解。作为第三种验证纳米颗粒-抗体复合物结合至MM细胞的方法，实施共聚焦显微照相将荧光标记的抗体和纳米颗粒-抗体复合物在MM细胞表面上的共定位可视化，其中纳米颗粒-抗体复合物已经使用独立的荧光团标记。对于这些实验，首先，使用EDC/NHS化学，以1:1000的荧光团与纳米颗粒的摩尔比将Gd-NP与Cy5-NHS结合。同样，在进行先期所述的纳米颗粒结合之前，用AF488-NHS标记单克隆抗体(1:1000的荧光团与抗体的摩尔比)(参见前文)。将MM细胞系用双荧光团结合的纳米颗粒复合物温育30分钟，在冰冷的甲醇中固定，加载到涂覆封片剂(DapiFluoromount-G(SouthernBiotech))的盖玻片上。随后，进行共聚焦显微照相(OlympusFV12000,Olympus)，以核实两种荧光团在细胞表面上的斑点状分布的共定位。
动物模型
经由IV散播将GFP+/Luc+MM1.S细胞给药至SCID/褐色小鼠(5×106细胞/鼠；n＝5只小鼠每组)，建立MM的原位鼠异种移植物模型。使用IVIS光谱——生物发光和荧光成像系统(Perkins Elmer)，通过生物发光成像(BLI)每周监测肿瘤生长。通过用硼替佐米(0.5mg/kgx3剂量每天)以及之后的美法仑(5.5mg/kg x1剂量)治疗这些小鼠，进一步尽力MRD的鼠模型。
成像研究
使用临床前7-Tesla BioSpec 70/20MRI扫描仪(Bruker BioSpin,Billerica,MA)执行MR图像采集。在成像之前，通过IV注射，将与0.25mg/g的Gd-NP结合至80μg/mL的抗BCMA抗体等效的剂量给药至每只小鼠。使用重复时间为87ms、回波时间为3.9ms且翻转角为60°的T1 GRE序列进行成像。采集矩阵大小和重构矩阵为256x 256像素；切片厚度为5mm。当比较使用不同的基于Gd的造影剂所获得的成像参数时，在给药造影剂后的多个时间间隔实施MRI；以及，将结果与基线图像比较。对于早期诊断和MRD定量研究，在IV注射后30分钟实施MRI。在配备50kVp源的临床前CT扫描仪(Siemens)上执行CT采集；图像分辨率为10.2像素/mm；以及，采用0.1mm的切片厚度。为了比较经由每种成像模式检测的不同疾病负担的SNR变化，在多个时间间隔和注射每种MR造影剂之前实施CT成像(参照前文)。
成像模式的定量比较
通过对每张采集图像执行信噪比(SNR)计算，实施对在不同时间点和/或经由不同成像模式获得的对浆细胞的相对检测灵敏度的评估。在对每一动物的脊柱和股骨首先实施3D细分之后，使用Fiji免费软件(https://fiji.sc/)获得这些SNR值。将每张图像归一化至相同的强度水平，并且将包括全检器官(即，脊柱或骨干)在内的感兴趣区域(ROI)细分；记录ROI内的信号强度并与每次扫描时测量的背景水平比较。根据等式(1)和(2)计算SNR和归一化SNR：(1)SNR＝强度/噪声；(2)归一化SNR(i)＝SNR(i)/SNR基线。使用ICP-MS(Agilent7900)并遵循先前所述策略，测定对多种基于Gd的造影剂的摄取的绝对定量。简单地说，在造影注射后30分钟牺牲动物；将切除的动物器官溶解在70％HCl溶液中；测定每个器官的Gd含量。
λ轻链定量
每周令小鼠流血一次，并立即对血液成像。将血清从血液样品中分离并在-80℃冷冻，直到研究结束。将血清样品以PBS稀释(1:10v:v)，并使用临床脊免疫检验(在布里翰妇女医院(Brigham and Women’s Hospital(Boston,MA))病理学中心常规实施)对每个样品中存在的λ轻链的数量定量。
受试者工作特征比较
使用ROC曲线表示SNR辨别肿瘤细胞存在与否的能力。列举了多种成像模式中每一个的在肿瘤细胞抑制后5周的SNR，并将其用作借以比较各模式检测灵敏度的度量。使用以下方法既定每一时间点的类别：在肿瘤细胞抑制之前的基线测量值用作对照(Ct0＝0)，并与假设肿瘤细胞此后一直存在的后续时间点(Ct＝1)比较。采用双边威尔科克森秩和检验以确保预测不是随机的。低于0.05的p值表明，对于给定类别的SNR值与另一类的SNR值显着不同。
统计学分析
所有体外统计学分析均使用GraphPad Prism软件(V.7.1)实施。使用R版本3.3.3实施使用不同医学成像技术中的每一种区分MRD存在的能力。
实施例2：结合有抗体的基于钆的超小纳米颗粒的研发：NP-抗BCMA结合物检测细胞系和小鼠体内MM的存在和级数
如图1A所示，BCMA水平随着MM级数的前进而增加，使得BCMA成为引人类关注的可用于监测MM级数、响应治疗剂和/或MRD状态的细胞表面受体生物标记物。设计上述小于5nm的基于氧化硅的钆NP和抗BCMA单克隆抗体的结合物(或者小于5nm的基于氧化硅的钆NP和抗SLAMF7单克隆抗体的结合物)，使得装饰有游离的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)基团的NP芯被经由双磺基琥珀酰亚胺基辛二酸盐交联剂结合至抗体表面上的NHS基团(图1B)。SLAMF7和BCMA两种抗原均被高度表达且几乎唯一地呈递在B细胞表面上(Lonial et al.N Engl JMed373:621-631；Novak et al.Blood 103:689-694)。BCMA进一步在浆细胞转化和MM进展中扮演重要角色(Nutt et al.Nat Rev Immunol 15:160-171；图1A)，使得它成为用于MRD检测的由吸引力的和特异性的生物标记物。如上所述，为了生成本公开的MM靶向造影剂，将所采用的Gd-NP表面用游离的NHS基团修饰，并经由双磺基琥珀酰亚胺基辛二酸盐交联剂结合至抗SLAMF7抗体和抗BCMA抗体的NHS修饰的胺基(图1B)。接着，在实施比较性研究以测定此类纳米颗粒-抗体复合物相对于其它诊断模式的MRD检测能力之前，评估了它们的体内外靶向效率。使用EDC/NHS化学实施鼠抗人类SLAMF7和BCMA抗体与Gd-NP的化学偶联，分别生成NP-SLAMF7构造物和NP-BCMA构造物。通过高效液相色谱(HPLC)和通过使用碳水化合物凝胶电泳进行的多糖分析，验证了每种NP-抗体构造物中抗体与NP的结合(图3A和图3B)。如预期的，抗体NP的结合将对应的抗体-NP复合物的尺寸从4.4±1.4nm增加到10.01±2.03nm(NP-BCMA)或12.9±2.3nm(NP-SLAMF7)(图1C)。前述尺寸结果反映了平均水动力学直径的动态光散射(DLS)测量值，这事实上证实了NP-SLAMF7和NP-BCMA均略大于未改性饰的Gd-NP。这些纳米颗粒-抗体复合物和它们的直径随时间保持稳定，甚至在酸性悬浮液条件下仍稳定(图3C和图3D)。观察到NP的造影特性的轻微下降(如通过观察它们的驰豫系数与未改性的Gd-NP相比的最小下降而评价的)，不欲受缚于理论，据信这是由于抗体定位在钆原子的表面上，因此，Gd原子的表面被所结合的抗体屏蔽，这导致与MagnevistTM类似的r1值(例如，对于NP、NP-BCMA、NP-SLAMF7和MagnevistTM，r1分别为5.90、5.49、5.33和4.73；图1D)。
接着，采用人类MM细胞系(MM1.S)，证实了NP-BCMA的体外靶向效率有所提升。如图4A所示，在孵化30分钟后，NP-BCMA结合了74.1±2.9％的MM1.S细胞表面(如通过检测以NP-BCMA复合物标记的细胞的流式细胞术分析所证实)，而在相同条件下，仅20±4.9％的细胞被游离NP(Gd-NP)结合(p<0.001；图1E、图4A)。通过电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)测得的钆原子在细胞表面上的浓度(在最终的细胞悬浮液中)，证实了使用NP-BCMA的三种不同MM细胞系(MM1.S、OPM2和KMS11)的标记比使用未改性的Gd-NP增加了接近两倍，从而整死了细胞表面策略的效率(图4B)；并且对已经使用NP-BCMA复合物温育的细胞进行荧光显微照相，其中荧光团标记的抗BCMA抗体被结合至已经独立结合至单独的荧光标记的Gd-NP，结果证实了抗体物质和纳米颗粒在MM细胞表面上的共定位(图1F)。所培养的MM细胞系(MM1.S、OPM2和KMS11)的体外细胞生存能力分析也证实，在蛋白质浓度(10,000μg/mL)和Gd-NP浓度(1μg/mL)分别比预想的静脉(IV)给药后血流中浓度高125倍和4倍的情况下，未改性的Gd-NP、游离的抗体(抗SLAMF7或抗BCMA)、纳米颗粒-抗体复合物中无一赋予任何体外毒性(图5A-B)。
实施例3：使用纳米颗粒-抗体复合物的浆细胞体内靶向性
随后，在MM的鼠科动物模型中评估不同的NP组合物(NP-SLAMF7和NP-BCMA，以及它们检测浆细胞的能力)的靶向效率，该模型是通过IV散播MM1.S细胞，之后将它们的骨髓异种移植到免疫功能不全的SCID-褐色小鼠体内而构建的。肿瘤负荷(肿瘤散播)之后，从细胞(MM1.S)异种移植(注射；图6)后第19天开始，以两周的间隔进行生物发光成像。进行MRI研究来比较各种纳米颗粒构造物(Gd-NP、NP-SLAMF7和NP-BCMA)的效率，以鉴别相同的浆细胞负荷，并与FDA批准的造影剂马根维显(MagnevistTM(美国食品和药品管理局(FDA)批准的用于MM的造影剂))比较。使用7T Bruker Biospin MRI扫描并采用T1-梯度回波(GRE)序列将动物脊柱和股骨中的钆(Gd)摄取可视化(图1G和图7)。
每种所给药的造影剂以MM细胞为靶点的特异性(证实钆原子在肿瘤区域内的存在)通过在MRI后立即牺牲动物得以证实。收获每只动物的股骨和脊椎组织，通过H&E和普鲁士蓝染色后进行组织学评价，显示了Gd标记的骨髓浸润浆细胞的多个片。1H、图8A和图8B)。
对于MRI灵敏度的定量比较，在给药不同的基于Gd的造影剂后的多个时间点获取的每张图像中，枚举了检测浆细胞群体的信噪比(SNR)；在对动物的脊柱和股骨进行3D细分后，定量信号强度(图1I；图9A至图9F)。具体地，在对脊柱和股骨进行3D细分后，定量信号强度。SNR定量表明，就检测浆细胞群体而言，NP-BCMA和NP-SLAMF7结合物的灵敏度比被动靶向剂Gd-NP和MagnevistTM有所增强。一旦到达静脉注射纳米颗粒-抗体复合物后30分钟，已经给药NP-SLAMF7的动物就表明其对脊柱中浆细胞的SNR增加约3.8倍，而接受NP-BCMA的动物展现了约12倍的提升。值得注意的是，NP-BCMA结合物表明了比NP-SLAMF7更好的肿瘤摄取(p＝0.0045，单边成对t测试)，不欲受缚于理论，这归因于更大数目的表面BCMA抗原每MM细胞。在给药任何基于纳米颗粒的造影剂后48小时，肝、肾、肺或其它器官中观察到没有钆的残留痕迹(Gd-NP、NP-SLAMF7或NP-BCMA；他9A)。
NP-SLAMF7和NP-BCMA的药代动力学类型相似(图9B)，它们的循环半衰期比未改性的Gd-NP更长(Gd-NP、NP-SLAMF7和NP-BCMA的t1/2分别为16.1分钟、25.2分钟和30.3分钟)。不欲受缚于理论，这一脉管持续性的提升归因于它们略大的尺寸和所选择的抗体的固有特性。发现NP-SLAMF7和NP-BCMA展现快速的肾清除(大概是因为本公开的NP-抗体结合物甚至具备小于15nm的尺寸)，这限制了它们长期暴露于健康器官(从而限制了钆与健康器官的长期接触)。BALB/c小鼠对该构造物的耐受良好，如通过在单剂IV给药后两周的时间段内观察到的稳定的动物体重所证明的(图9C，其中没有观察到体重的下降)。在这一观察阶段结束时，末梢血研究证实了正常的基础代谢功能试验组合(BMP；图9D)、全血计数(CBC；图9E，其中没有观察到差异)、以及白细胞分类计数(图9F，其中化学试验组合没有改变)。切片组织的H&E染色也表明，没有微结构变形的证据(图10，其中没有观察到差异)。同样地，纳米颗粒-抗体复合物被认为展现无急性毒性。取自在多个时间点牺牲的荷MM1.S肿瘤的SCID-褐色小鼠的切片器官的ICP-MS证实，在注射后30分钟，4.2±0.4％的所注射的剂量每克(ID/g)定位在脊柱中的浆细胞内，而2.01±0.1％ID/g见于骨干中的浆细胞内(图1I和图1J)。
实施例4：BCMA靶向纳米颗粒-抗体复合物与用于检测微小残留病的传统方法的灵敏度和特异性比较表明，NP-抗BCMA结合物检出了哺乳动物受试者的MRD
检查NP-抗BCMA结合物在注射后30分钟时是否具备接近实际的对于实体肿瘤的靶向效率(即，如上所述，在脊柱中为4.2±0.4％ID/g，在股骨中为2.01±0.1％ID/g)(如通过ICP-MS所定量的)，以确定当与MRI扫描合用时，这一试剂是否能够被用作检测MRD的成像生物标记物。比较NP-BCMA与目前可获得的用于临床MRD诊断的方法的灵敏度和特异性。近来在MM治疗中已经实现了显着进展，至少部分地归因于近来在深入理解MM病发病机制方面的成长。特别地，用于治疗MM的治疗选择已经有所拓展，例如，在2015年已经批准了埃罗妥珠单抗(Elotuzumab)和达雷木单抗(Daratumumab)。但是，尽管MM患者的生存期已经翻倍，仍然证明了对MM患者的早期治疗可甚至更大地增加生存期。相比之下，也证明了在MM治疗结束时，如果实现了MRD阴性状态，则患者不复发的机会比MRD阳性患者更大。因此，评估了NP-BCMA结合物可否提供MM的早期预测剂和MRD生物标记物。
将MRD建立为最相关的用于MM的生物标记物之一，事实上，大多数MM患者的复发已经由于MRD阳性信号的存在而得以鉴定。已经证明，MRD可用来评估MM治疗剂的直接疗效，同时也用来评估未来的治疗决策。但是，对MRD的检测并非是径直的。目前用来评估MRD阳性状态的存在的技术，例如多参数流式细胞术和等位基因特异性寡核苷酸PCR，是基于侵袭过程的，是定性的，依赖于骨髓样品，对于样品是摧毁性的，和/或给药和评估过程高度耗时。MM的治疗和成像中常见的失败是传统疗法没有到达致肿瘤B细胞的骨归巢并与之战斗的能力。因此需要将有效的细胞外试剂靶向递送至靶点细胞，但靶向递送也存在困难障碍。尽管已经证明了使用基于不具备对于恶性浆细胞的特异亲和性的双磷酸盐的纳米颗粒可能以骨微环境为靶点，但本公开已经鉴别了新的特异性地以MM细胞为靶点的途径。
至少出于上述原因，作为MRD的成像生物标记物而评估了NP-BCMA。为了做到这一点，通过静脉散播GFP和表达荧光素酶的MM1.S细胞(GFP+/Luc+MM1.S)建立了MRD的鼠模型，之后，在21天后使用三剂量的硼替佐米(0.5mg/kg)和一剂量的美法仑(5.5mg/kg)进行治疗性减瘤。每周通过生物发光成像(BLI)监测肿瘤生长，其中在细胞散播(MM1.SGFP+/Luc+)之后每周一次通过BLI监测是肿瘤细胞散播临床前监控的黄金标准(图2A)，并且通过全身MRI(图2B)和全身CT扫描(图2C)监测肿瘤生长。通过在治疗第25天获得阴性BLI信号而验证MRD模型，该信号对应于所给药的治疗剂的耗尽(图2D)。接着，评估脊柱的SNR随时间的变化并用来通过MRI追踪疾病再扩增，这在每个成像时间点给药NP-BCMA后30min进行(图2E)，将结果与通过CT扫描获得的结果(图2F)比较。此外，λ轻链水平随时间增加(作为患者诊断的标准方法)是由于MM1.s细胞是λ轻链表达者的事实(MM1.S细胞仅表达λ轻链；它们既不表达κ轻链也不表达M-蛋白(Walker et al.Blood Cancer J 4:e191))，具体地说，在相同时间点测量血清λ轻链的水平(图1G)。
比较在进行治疗性减瘤1周后(即，最初的肿瘤细胞移植后5周)通过BLI、MRI、CT和血清λ轻链分析获得的结果。生成受试者工作特征(ROC)曲线以评估4种检测MRD存在的诊断模式中每一种的灵敏度和特异性，并证实了使用NP-BCMA的MRI的优越性(图2H)。对通过每种模式并在整个实验过程中(即，从最初的肿瘤细胞移植到治疗性减瘤到最终动物死于肿瘤再生长)检测的SNR的曲线下面积(AUC)的比较，进一步支持这些发现(图2I)。为了测定使用NP-BCMA的MRI的分析灵敏度，在肿瘤移植后第25天(在肿瘤减瘤后立刻)、第28天和第30天牺牲额外的小鼠，这对应于第一时间点，此后浆细胞通过MRI可见。对骨髓穿刺液执行流式细胞术实验(图2J)；所枚举的结果证实，使用NP-BCMA的MRI对于MRD的检测阈值为2200±450个浆细胞每小鼠。正如预期，浆细胞在骨髓中总群体中的百分比(图2K)以及NP-BCMA接合的浆细胞的百分比(图2L)，随着时间流逝而增加并且起因于肿瘤再生长。
归因于T1信号增强的特异性和易用性，已经使得在对患者实施更深入的诊断例如实施下一代测序之前快速优先检测MM病(包括MRD)成为可能，且可在临床上用作预测剂。事实上，从第5周(即，治疗后第1周)获得的结果(图2H)和相关联的在整个实验进程中获得的曲线下面积计算值(图2I)已经提供了对以下概念的首次验证：有效的纳米颗粒驱动的单克隆抗体可作为MM的成像生物标记物而发挥作用，且更具体地，以比其它可获得的成像模式和甚至轻链定量更为灵敏和特异的方式预计治疗结果。因此，如本文所公开，对于MM疗法，选择抗原BCMA作为用于MM和MRD的细胞表面受体由BCMA的高发和在MM疾病从MGUS进展为SMM的过程中升高的表达水平所决定。此外，这一标记物也表达在浆细胞样树突细胞上，这些细胞是MM细胞生长、存活和耐药性的启动子，BCMA在天然B细胞、记忆型B细胞和健康组织细胞上不被表达，使得这一靶点为独特的有受体。据此，NP-BCMA使得检测早期肿瘤和髓外MM病成为可能，从而使得经由对可抵达的MRD进行非侵入性定量而监测新的MM疗法成为可能。
总之，本文所证明的据信是第一个概念验证实例，其中通过基于Gd的超小纳米颗粒-抗体复合物的串行MRI获得SNR变化，而该复合物已经用作成像生物标记物检测MRD。重要的是，本文所述的新公开的试剂能规避使用第一代抗体靶向纳米颗粒实现对处于其天然微环境中的恶性浆细胞的精准定位的挑战。尽管由于所有基于Gd的造影剂的得到确认的风险，它们可能不适用于晚期肾衰竭患者(Barrett and Parfrey.N Engl J Med 354:379-386)，但本文公开的构造物可能在促进尽早结束无效疗法和/或在长期MM缓解后再次启动治疗中找到应用性。随着MM疗法中的细胞表面靶向剂(例如，埃罗妥珠单抗(elotuzumab)(Lonial et al.N Engl J Med 373:621-631)、BCMA靶向嵌合抗原受体T细胞(Ali etal.Blood 128:1688-1700；CAR-T)、和达雷木单抗(daratumumab)(Lokhorst et al.N EnglJ Med 373:1207-1219))的使用日益增加，NP-SLAMF7、NP-BCMA和未来构象的Gd-NP-抗CD38抗体复合物制剂可以令MRI能能够引导患者特异性的疗法选择。它们的成功应用可进一步提供对于制造可能有助于转化纳米药物的完整潜力以改善癌症患者的护理和存活率的其它靶向构造物的洞察。
说明书中提及的所有专利和出版物均以本发明所属领域技术人员的水平表示。本公开引用的所有参考文献通过以每一参考文献已经通过引用而以其整体独立并入的相同程度引用而并入。
该领域技术人员将会轻易获知，本公开特别适于实施该目标并获得所提及的结果和优点，以及它们所固有的那些。优选实施方案目前所表示的本文所述的方法和组合物是例示性的，且不试图作为对本公开范畴的限制。对其做出的改变和其它用途对于该领域技术人员是显而易见的，它们为本公开精神所涵盖，且由权利要求书的范畴界定。
此外，若本公开的特征或方面描述为马库什组或其它替代分组，则该领域技术人员应认识到，本发明也因此描述为该马库什组或其它组的任何独立成员或成员的亚组。
在描述本公开的语境中(尤其在所附权利要求书的语境中)使用的术语“一(a)”和“一(an)”和“该”以及类似术语解释为覆盖单个或多个，除非本文中明确排除或明显与上下文矛盾。除非明确排除，否则术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”解释为开放性术语(即，意为“包括但不限于”)。除非本文中明确排除，否则本文中对数值范围的引用仅旨在作为独立指代落入该范围内的每个单独的值的简写，且每个单独的值如同被本文单独引用一样并入本说明书。
除非本文中明确指定或明显与上下文矛盾，否则本文所述的全部方法可以任何适当的次序实施。除非明确主张，本文所提供的任何和全部实施例或例示性语言(例如，“例如”)的使用仅旨在更好地例示性说明本公开而非意图限制本公开的范畴。本说明书中的语言无一应解释为指定任何非主张的要素作为本公开实践的必需条件。
这一公开的实施方案在本文中有所描述，包括发明人所知的用于实施所公开的发明的最佳模式。阅读前述说明书后，那些实施方案的变动对于该领域技术人员是显而易见的。
本文中适当地例示性描述的公开可在本文中未具体公开的任何一种或多种要素、一种或多种限制的缺席下实践。因此，例如，在本文所述的每种情况下，术语“包含”、“基本由...组成”和“由...组成”中的任一个可替换为任一个或两个其它术语。已经采用的术语和表达用作说明性而非限制性的术语，且没有使用此类术语和表达排除所显示和描述的特征或其部分的任何等效物的意图，但应认识到，在所主张的发明范畴内，进行多种修饰是可能的。因此应理解，尽管本公开提供优选的实施方案、最优特征，但本文所公开概念的修饰和变动可被该领域技术人员采取，且此类修饰和变更被视为处于本公开的由说明书和所附权利要求书所界定的公开范畴内。
该领域技术人员将轻易了解，不同的置换和修饰可使得本文所公开的发明不悖离本发明的范畴和精神。因此，此类实施方案处于本公开及所附权利要求的范畴内。本公开教导该领域技术人员朝着生成具备改善对比度、诊断和/或成像活性的结合物方向测试本文所述化学修饰的各种组合和/或置换。因此，本文所述的具体实施方案是非限制性的，且该领域技术人员可轻易了解，可测试本文所述的修饰的具体组合而无需进行鉴别具备改善对比度、诊断和/或成像活性的结合物的过度实验。
本发明预期技术人员根据需要采用此类变动，且发明人希望本公开被以不同于本文具体所述的形式实践。据此，本公开包括为适用法律所允许的对本文所附权利要求书中引用的主题的全部修饰和等效物。此外，除非本文中明确排除或明显与上限为矛盾，否则上述要素以所有可能变动形式的任何组合为本公开所涵盖。该领域技术人员应认识到，或能使用不超过常规的实验获知，本文所述公开的具体实施方案的多种等效物。此类等效物为所附权利要求书所涵盖。

Claims (36)

1.一种靶向纳米颗粒结合物，包含：
纳米颗粒；
链接子；以及
抗B细胞成熟(BCMA)抗体。
2.根据权利要求1所述的靶向纳米颗粒结合物，其中所述靶向纳米颗粒结合物的纳米颗粒的尺寸小于10nm。
3.根据权利要求1所述的靶向纳米颗粒结合物，其中所述纳米颗粒是钆纳米颗粒，任选地基于氧化硅的钆纳米颗粒(SiGdNP)。
4.根据权利要求1所述的靶向纳米颗粒结合物，其中所述靶向纳米颗粒结合物的纳米颗粒的尺寸为30nm或更大。
5.根据权利要求1所述的靶向纳米颗粒结合物，其中所述纳米颗粒是聚合物刷纳米颗粒或包含成簇的规则间隔短回文重复序列(CRISPR)机构(即，sgRNA引导序列和/或Cas9mRNA)剂的纳米颗粒。
6.根据权利要求1所述的靶向纳米颗粒结合物，其中所述纳米颗粒是聚合物纳米颗粒，任选地其中所述靶向纳米颗粒结合物还包含药物。
7.根据权利要求1所述的靶向纳米颗粒结合物，其中所述纳米颗粒是无机纳米颗粒。
8.根据权利要求1所述的靶向纳米颗粒结合物，其中所述靶向纳米颗粒结合物的尺寸为大约6至15nm，任选地约8至12nm，任选地其中所述靶向纳米颗粒结合物随时间保持稳定，任选地其中所述靶向纳米颗粒结合物在15分钟或更久的时间段内保持稳定，任选地其中所述靶向纳米颗粒结合物的尺寸在30分钟或更久的时间段内保持稳定。
9.根据权利要求1所述的靶向纳米颗粒结合物，其中所述靶向纳米颗粒结合物的尺寸为大约15至60nm，任选地约30至50nm，任选地其中所述靶向纳米颗粒结合物随时间保持稳定，任选地其中所述靶向纳米颗粒结合物在15分钟或更久的时间段内保持稳定，任选地其中所述靶向纳米颗粒结合物的尺寸在30分钟或更久的时间段内保持稳定。
10.根据权利要求1所述的靶向纳米颗粒结合物，其中所述链接子选自下列所组成的群组：N-羟基琥珀酰胺(NHS)与NHS的链接子、NHS与卤乙酰基的链接子、NHS-马来酰胺、和NHS-吡啶基二硫醇链接子。
11.根据权利要求1所述的靶向纳米颗粒结合物，其中所述抗BCMA抗体是单克隆抗体或其片段，任选地为人类人类单克隆抗体或其片段。
12.根据权利要求1所述的靶向纳米颗粒结合物，其中所述抗BCMA抗体是抗BCMA抗体片段，任选地选自下列所组成的群组：Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2、双特异性抗体、线性抗体、单链抗体分子(例如，scFv)和由抗体片段形成的多特异性抗体。
13.根据权利要求1所述的靶向纳米颗粒结合物，其中所述抗BCMA抗体是被标记的，任选地其中所述抗BCMA抗体是用多甲藻素叶绿素蛋白复合物(PerCP)/Cy5.5标记的。
14.根据权利要求1所述的靶向纳米颗粒结合物，其中所述靶向纳米颗粒结合物包含装饰有游离NHS基团的纳米颗粒芯，任选地其中所述NHS基团经由双磺基琥珀酰胺基辛二酸盐交联剂结合到抗BCMA抗体的表面上。
15.根据权利要求1所述的靶向纳米颗粒结合物，还包含药物部分，任选地其中所述药物部分是抗CS1剂或抗BCMA剂。
16.一种制剂，其包含根据权利要求1所述的靶向纳米颗粒结合物。
17.根据权利要求14所述的制剂，其中所述靶向纳米颗粒结合物以0.1-1mg/g的SiGdNP的剂量当量存在，任选地以约0.25mg/g的SiGdNP的剂量当量存在。
18.一种药物组合物，其包含如权利要求1所述的靶向纳米颗粒结合物和药学可接受的载剂。
19.一种检测受试者体内多发性骨髓瘤(MM)和/或微小残留病(MRD)的存在和/或位置的方法，所述方法包括：
将根据权利要求1所述的靶向纳米颗粒结合物给药至所述受试者；以及
检测所述靶向纳米颗粒结合物在所述受试者体内的存在和/或位置，
从而检测MM和/或MRD在所述受试者体内的存在和/或位置。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述给药步骤通过注射执行，任选地通过静脉注射和/或腹膜注射执行。
21.根据权利要求19所述的方法，其中所述检测步骤包括使用磁共振成像(MRI)扫描。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述靶向纳米颗粒结合物作为成像生物标记物用于检测受试者体内的MM细胞和/或MRD。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述靶向纳米颗粒结合物提供比适宜的非靶向NP对照物改善至少5倍、任选至少10倍、任选约12倍或更高的对比度，任选地其中根据等式(1)和(2)计算信噪比(SNR)和归一化SNR：(1)SNR＝强度/噪声；(2)归一化SNR(i)＝SNR(i)/SNR基线。
24.根据权利要求22所述的方法，其中所述靶向纳米颗粒结合物所具备的对于MRD的MRI检测阈值为每位受试者100,000个或更少桨细胞、任选地每位受试者50,000个或更少桨细胞、任选地每受试者30,000个或更少桨细胞、任选地每位受试者20,000个或更少桨细胞、任选地每位受试者10,000个或更少桨细胞、任选地每位受试者8,000个或更少桨细胞、任选地每位受试者6,000个或更少桨细胞、任选地每位受试者5,000个或更少桨细胞、任选地每位受试者4,000个或更少桨细胞、任选地每位受试者3,000个或更少桨细胞、任选地每位受试者约2,200个桨细胞。
25.根据权利要求19所述的方法，其中所述检测步骤在给药所述靶向纳米颗粒结合物的步骤后大约1小时内执行，任选在给药所述靶向纳米颗粒结合物的步骤后大约30分钟内执行。
26.根据权利要求19所述的方法，其中所述靶向纳米颗粒结合物在给药所述靶向纳米颗粒结合物的步骤后30分钟时结合大约70％的MM细胞。
27.根据权利要求19所述的方法，其中所述靶向纳米颗粒结合物在脊柱、股骨、其它骨骼和/或脾脏中被检出。
28.根据权利要求19所述的方法，其中相对于适宜的非靶向对照纳米颗粒，肿瘤对所述靶向纳米颗粒结合物的吸收增强。
29.根据权利要求19所述的方法，其中检测受试者体内MM和/或MRD的存在和/或位置被用来评估MM疗法，任选包括给药抗CS1剂或抗BCMA剂的疗法，任选地其中所述靶向纳米颗粒结合物与所述MM疗法联合给药。
30.如权利要求19所述的方法，其中所述受试者是人类。
31.如权利要求19所述的方法，其中所述受试者是鼠科动物。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述受试者是MRD模型鼠，任选地其中通过给药硼替佐米和美法仑而诱导所述MRD模型鼠。
33.根据权利要求31所述的方法，其中在SCID/浅褐色鼠体内检出了源自异种移植物的MM。
34.根据权利要求19所述的方法，其中检测受试者体内MM和/或MRD的存在和/或位置包括检测从MGUS到SMM的疾病进展和/或检测早期肿瘤和/或髓外MM疾病。
35.根据权利要求19所述的方法，其中所述检测步骤包括检测钆浓度，任选地检测Gd155浓度。
36.一种靶向纳米颗粒结合物，包含：
包含多个结合位点的纳米颗粒；以及
抗BCMA抗体。
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