CN108136008A - 针对具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖的抗体及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本公开涉及对具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N‑聚糖具有特异性的抗体，以及用于检测受试者的肿瘤的方法。本公开还涉及对具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N‑聚糖具有特异性的治疗性抗体。

Description

针对具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖的抗体及 其使用方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2015年7月15日提交的美国临时申请号62/192,750的权益，所述申请的公开内容特此以引用的方式整体并入。

发明领域

本公开涉及对一组具有GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖具有特异性的抗体，以及用于检测受试者的肿瘤的方法。本公开还涉及对所述组具有GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖具有特异性的治疗性抗体。

发明背景

在2014年，在美国将存在预计1,665,540例诊断的新癌症病例和585,720例癌症死亡。为了对抗这种破坏性疾病，最重要的关键之一是在临床上开发用于早期癌症检测和诊断、监测疾病进展和评估治疗反应的灵敏、准确、非侵入性、经济且容易进行的测定。

具体地说，前10位最致命的癌症(肺癌、结肠直肠癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、白血病、非霍奇金淋巴瘤、肝癌和肝内胆管癌、卵巢癌和食管癌)是西方世界癌症死亡的首要原因。在美国，每年前10位癌症的超过一百万新病例被诊断且约420,000名患者死亡。高死亡率部分地反映了对于早期肿瘤检测和诊断缺乏通用(泛)肿瘤特异性标志物。此外，数百万人处于前10位癌症的高风险。具有癌症高风险的那些需要可靠且非侵入性的测试来在早期阶段检测他们的肿瘤。目前，许多肿瘤标志物如CA19-9、CEA、CA50、CA125、PSA和CA242已被研究用于早期肿瘤检测，但它们中没有一个是足够的。此外，包括肿瘤M2-丙酮酸激酶、弹性蛋白酶-1和半乳糖基转移酶同工酶II的酶蛋白已被用于癌症诊断。结果表明，那些标志物似乎在癌症诊断中具有有限价值。还已经研究了非编码RNA、巨噬细胞抑制性细胞因子1(MIC-1)和CEACAM1(CEA抗原家族的成员)。不幸的是，大多数仍处于临床前评估或在早期癌症检测中具有有限应用。总之，目前没有生物标志物或生物标志物测定可用于癌症早期检测和诊断。因此，迫切需要肿瘤特异性生物标志物及其结合配体用于开发用于早期癌症检测和诊断的生物标志物测定。

因此，本领域中需要用于早期癌症检测和诊断、监测疾病进展以及评估治疗反应的肿瘤特异性、敏感性、非侵入性、经济且容易进行的测定。

发明概述

一方面，本公开提供一种分离的抗体，所述抗体特异性地结合具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖。在某些实施方案中，所述抗体包含SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8中列出的氨基酸序列。在其他实施方案中，所述抗体特异性地结合具有GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖，并且包含轻链CDR1，所述轻链CDR1包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列；轻链CDR2，所述轻链CDR2包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列；轻链CDR3，所述轻链CDR3包含SEQ IDNO:3的氨基酸序列；重链CDR1，所述重链CDR1包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列；重链CDR2，所述重链CDR2包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列；以及重链CDR3，所述重链CDR3包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。在前述实施方案中的任一项中，所述抗体是选自由以下各项组成的组：单链抗体、抗体片段、嵌合抗体、人源化抗体、双特异性T细胞衔接器(BiTE)抗体或嵌合抗原受体(CAR)。

另一方面，本公开提供一种测量生物样品中具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖的量的方法。所述方法包括使用至少一种特异性地结合具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖的分离的抗体来测量从受试者获得的生物样品中具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖的量，其中所述抗体包含具有0至2个氨基酸取代的选自由SEQ IDNO:1-6组成的组的氨基酸序列。

在又一方面，本公开提供一种检测受试者的肿瘤的方法。所述方法包括：使用至少一种特异性地结合具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖的分离的抗体来测量从受试者获得的生物样品中具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖的量，其中所述抗体包含具有0至2个氨基酸取代的选自由SEQ ID NO:1-6组成的组的氨基酸序列；以及将所述样品中具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖的所述量与参考值进行比较，其中与所述参考值相比，所述样品中更大量的具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖指示所述受试者中肿瘤的存在。

在又另一方面，本公开提供一种监测受试者对肿瘤治疗的反应的方法。所述方法包括：(a)使用至少一种特异性地结合具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖的分离的抗体来测量从受试者获得的生物样品中具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖的量，其中所述抗体包含具有0至2个氨基酸取代的选自由SEQ ID NO:1-6组成的组的氨基酸序列；(b)在开始治疗之后使用至少一种特异性地结合具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖的分离的抗体来测量从所述受试者获得的第二生物样品中具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖的所述量，其中所述抗体包含具有0至2个氨基酸取代的选自由SEQID NO:1-6组成的组的氨基酸序列；以及(c)将所述第一样品中的具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖的所述量与所述第二样品中的具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖的所述量进行比较，其中所述样品中具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖的所述量的变化指示对治疗的反应。

附图简述

本申请文件含有至少一张以彩色制作的附图。在提出请求并支付必要费用后，本事务所将提供具有彩色绘图的本专利申请公布的副本。

图1A、图1B、图1C和图1D描绘免疫荧光染色的代表性图像。培养的人癌细胞中mAbM9A12的免疫荧光染色：(图1A)2780卵巢癌；(图1B)NSY结肠癌；(图1C)Panc-1胰腺癌和(图1D)A427肺癌。mAb M9A12染色培养的癌细胞的质膜，因为活细胞的完整膜阻止IgG(150KD)被动地进入细胞。

图2描绘示出mAb M9A12与CFG(功能性糖组学协会)聚糖阵列(版本5)上的选定碳水化合物的结合的图。每个聚糖的草图表示在条形上方示出。误差条对应于阵列载玻片上的重复点之间的标准偏差。x轴列出CFG阵列上的聚糖ID编号。y轴是相对荧光单位(RFU)。

图3描绘人癌症组织及其正常对应物中mAb M9A12的免疫组织化学染色。它示出在肺、胰腺、胃、结肠和卵巢癌组织中mAb M9A12的强烈染色(上图)。相比之下，mAb M9A12不染色它们的正常对应物(下图)，除了在结肠和胃粘膜的少数上皮细胞中非常微弱的染色。

图4描绘人正常组织(组织阵列，BN 243，Biomax.US)中mAbM9A12的免疫组织化学染色。在人正常细胞和组织中未检测到与肿瘤相关的复合N-聚糖的mAb M9A12结合。

图5描绘人胰腺癌组织中mAb M9A12的免疫组织化学染色。此图展示mAb M9A12与癌症组织的特异性结合，并且示出癌性腺结构(箭头)的管腔中、肿瘤细胞膜上(箭头头部)和细胞质中的高尔基氏复合体的区域中(空心箭头)的复合N-聚糖的位置。

图6描绘胰腺癌和成纤维细胞培养物的上清液中具有末端GlcNAcβ残基的外泌体结合的复合N-聚糖的测量中mAb M9A12的ExoELISA测定。胰腺癌细胞系是SW-1990、Mia-PaCa-2、293TV、HPAC、HS766T、PANC-1、CFPAC-1、MPAC-1和Capan-1。成纤维细胞的培养物上清液是来自人动量组织原代培养物。成纤维细胞与癌症之间的平均任意单位显著不同(P＝0.007)。

图7描绘来自健康个体和患有胰腺癌的患者的血清中具有末端GlcNAcβ残基的外泌体结合的复合N-聚糖的测量中mAb M9A12的ExoELISA测定。中值任意单位在健康个体和患有胰腺癌的患者中分别是21和53(红色条)。正常对照与癌症组之间的差异是统计上显著的(P<0.05)。

图8A、图8B、图8C、图8D、图8E和图8F描绘肺正常组织、良性组织和恶性组织中mAbM9A12的免疫组织化学染色。(图8A)示出癌性管腔中的肿瘤细胞和组分的阳性染色(棕色)的腺癌(空心箭头)；(图8B)鳞状细胞癌；(图8C)小细胞癌；(图8D)示出小支气管中的正常组织和材料两者中的阴性染色的正常肺组织(实线箭头头部)；(图8E)展示小支气管中的正常组织和组分的阴性染色的慢性支气管炎(空心箭头头部)；以及(图8F)在高尔基氏复合体的区域中表现出阳性染色的具有上皮细胞增生的慢性支气管炎(实线箭头)。

图9描绘来自健康个体和患有肺良性和恶性疾病的患者的血清中具有末端GlcNAcβ残基的外泌体结合的复合N-聚糖的测量中mAb M9A12的ExoELISA测定。中值任意单位是在健康个体以及患有肺良性疾病和癌症的患者中分别是27、29和65.4(红色条)。正常/良性对照组与癌症组之间的差异是统计上显著的(P<0.005)。

图10A、图10B、图10C、图10D、图10E、图10F描绘用mAb M9A12进行的卵巢正常组织、交界性肿瘤组织和癌症组织的免疫组织化学染色的代表性图像。将癌症组织和交界性肿瘤组织用抗体染色(棕色)。(图10A、图10B)浆液性癌；(图10C、图10D)粘液性癌；(图10E)交界性肿瘤；(图10F)正常卵巢组织。将细胞核用苏木精染成蓝色。

图11描绘来自健康个体和患有卵巢癌的患者的血清中具有末端GlcNAcβ残基的外泌体结合的复合N-聚糖的测量中mAb M9A12的ExoELISA测定。中值任意单位在健康个体和患有卵巢癌的患者中分别是17.1和50.6(红色条)。正常对照与癌症组之间的差异是统计上显著的(P<0.005)。如果设定35个任意单位的截止值，则81％的卵巢癌患者(13/16例)是阳性的。相比之下，100％的正常对照(5/5例)低于截止值(阴性)。

图12描绘来自健康个体和患有舌/咽/喉癌的患者的血清中具有末端GlcNAcβ残基的外泌体结合的复合N-聚糖的测量中mAb M9A12的ExoELISA测定。中值任意单位在健康个体和患有舌/咽/喉癌的患者中分别是25.3和52(红色条)。正常对照与癌症组之间的差异是统计上显著的(P<0.005)。然而，约40％的患有舌/咽/喉癌的患者显示假阴性结果。

图13A描绘mAb M9A12的双特异性T细胞衔接器(BiTE)构建体的示意图，并且图13B描绘示出BiTE经由CD3(T细胞膜抗原)结合T细胞且经由具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖结合肿瘤细胞的示意图。

图14描绘具有mAb M9A12单链可变片段(scFV)的嵌合抗原受体(CAR)的结构。CD28和4-1BB是刺激性配体以增强T细胞增殖。CD3ζ是T细胞受体。

图15描绘使用CAR-工程化T细胞的过继细胞转移疗法的示意图。所述过程以含有CAR的病毒颗粒的结合开始。改编自：en.wikipedia.org/wiki/Chimeric_antigen_receptor。

发明详述

申请人已经开发了用于检测受试者的癌症的抗体及其使用方法。所述方法包括使用本公开的抗体检测和测量从受试者获得的生物样品中具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖的量。本公开涵盖以下发现：具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖是在癌细胞上大量表达的肿瘤特异性抗原，并且它在从生物样品分离的外泌体中是可检测的。据发现mAb M9A12识别具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖。因此，本公开提供以下证据：生物样品中检测到具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖的量增加可能与肿瘤负荷直接相关。在一方面，生物样品中具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖的量增加指示存在肿瘤。在另一方面，生物样品中具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖的量增加指示肿瘤负荷。在另一方面，生物样品中具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖的量增加指示肿瘤进展。在又一方面，相对于生物流体中具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖的先前评估量，生物样品中具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖的量增加指示肿瘤进展或治疗无效。在又一方面，适用于检测生物样品中具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖的量增加的抗体包括结合肿瘤相关复合N-聚糖内的末端GlcNAcβ的那些抗体。更具体地说，适用于检测生物样品中具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖的量增加的抗体包括结合NGA3B内的表位的那些抗体。在其他方面，结合具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖的抗体可用于治疗癌症。

I.抗肿瘤相关复合N-聚糖抗体

适用于本文的针对具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖的抗体包括所有特异性地结合具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖的抗体。另外，适用于本文的抗体包括所有特异性地结合肿瘤相关复合N-聚糖内的末端GlcNAcβ的抗体。另外，适用于本文的抗体包括所有特异性地结合NGA3B聚糖内的表位的抗体。具体地说，适用于本文的抗NGA3B抗体包括所有特异性地结合NGA3B聚糖内的末端GlcNAcβ的抗体。一般来说，由本公开的抗体识别的表位可在癌细胞上检测到。由本公开的抗体识别的表位在不存在癌细胞的情况下可能是或可能不是可检测的。例如，癌细胞可增加聚糖的表达，以使得先前不可检测的表位变得可检测。或者，由本公开的抗体识别的表位可在癌细胞不存在和癌细胞存在两者的情况下可检测到，但是在癌细胞存在下可检测信号更大。适用于本文的抗体还包括结合至肿瘤相关复合N-聚糖的特定区域的抗体。复合N-聚糖的特定区域包括但不限于GlcNAc残基、甘露糖残基、β1-2键联、α1-6键联、β1-4键联、α1-3键联以及β1-6键联。在一个具体的实施方案中，适用于本文的抗体包括结合至具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖的抗体。其他形式的肿瘤相关复合N-聚糖包括但不限于截短的形式、修饰的形式、可溶性形式、不溶性形式、细胞内形式、细胞外形式，以及具有其他蛋白质或分子的复合N-聚糖上的肿瘤相关GlcNAcβ残基。本公开的抗体与复合N-聚糖的末端GlcNAcβ残基的结合可取决于呈递的分子(蛋白质和/或脂质)上的蛋白质核心、间隔、N-聚糖的取向和/或末端GlcNAcβ的3-D结构。

适用于本文的抗体包括分离的、表征的、纯化的、功能性的并且已经从其制备方法中回收(获得)且因此可供用于在本文中以有用形式以足以用于检测和测量生物样品中具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖的量的测定的量使用的抗体。

术语“抗体”包括术语“单克隆抗体”。“单克隆抗体”是指源自单个拷贝或克隆的抗体，包括例如任何真核、原核或噬菌体克隆。“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术产生的抗体。单克隆抗体可使用例如本领域中熟知的杂交瘤技术，以及重组技术、噬菌体展示技术、合成技术或此类技术的组合以及本领域中容易已知的其他技术来产生。此外，单克隆抗体可根据本领域中已知的方法用固定在固相上和/或与异源化合物(例如酶或毒素)缀合的可检测标记进行标记。

此外，“抗体”是指功能性单克隆抗体或其免疫学有效片段；如其Fab、Fab'或F(ab')2片段。在本文的一些上下文中，将特别提及片段以强调；然而，应该理解的是，无论是否指定片段，术语“抗体”包括此类片段以及单链形式。只要蛋白质保留特异性地结合其预期靶标的能力，其就包括在术语“抗体”内。定义“抗体”内还包括例如具有这种特异性的抗体的单链形式，通常称为Fv区域。

双特异性单克隆抗体(即包含两种不同单克隆抗体的片段并因此结合两种不同抗原的蛋白质)也包括在“抗体”的定义内。双特异性单克隆抗体的具体实例可以是由不同抗体的两个单链可变片段(scFv)组成的融合蛋白的双特异性T细胞衔接器(BiTE)。在某些实施方案中，BiTE在T细胞与肿瘤细胞之间形成连接。因此，一个scFv是本公开的抗体并且一个scFv结合T细胞。更具体地说，结合T细胞的scFv可结合CD3受体。例如，结合T细胞的scFv可以是抗CD3抗体。包含为本公开抗体的一个scFv和为抗CD3抗体的一个scFv的双特异性抗体在T细胞与肿瘤细胞之间形成连接。这种相互作用独立于MHCI或共刺激分子的存在引起T细胞通过产生蛋白质如穿孔蛋白和颗粒酶而在肿瘤细胞上发挥细胞毒性活性。这些蛋白质进入肿瘤细胞并起始细胞凋亡。氨基酸残基可用作第一与第二scFv之间的接头。用于连接的典型氨基酸残基是甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸、亮氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、谷氨酸和天冬氨酸等。例如，接头可以是(AAS)_n、(AAAL)_n、(G_nS)_n或(G₂S)_n，其中A是丙氨酸，S是丝氨酸，L是亮氨酸，并且G是甘氨酸，并且其中n是1-20、或1-10、或3-10的整数。因此，n可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。在一个具体实施方案中，接头可以是(G₄S)₄。

另外，本公开的抗体可以是嵌合抗原受体(CAR)，也称为人工T细胞受体、嵌合T细胞受体或嵌合免疫受体。CAR是工程化受体，其将任意特异性移植到免疫效应细胞上。通常，这些受体用于将单克隆抗体的特异性移植到T细胞上。CAR经由过继细胞转移被用作癌症的治疗。从受试者中取出T细胞并进行修饰，以使得它们表达对癌症具有特异性的受体(即本公开的抗体)。将然后可识别并杀死癌细胞的T细胞重新引入受试者。具体地说，CAR可以是本公开的scFv抗体与来自CD3-ζ(CD3ζ)的细胞内结构域的融合体。CAR还可包含来自各种共刺激蛋白质受体的一个或多个细胞内信号传导结构域。共刺激蛋白质受体的非限制性实例包括CD28、41BB、OX40和ICOS。在一个具体实施方案中，CAR包含与CD28、41BB和CD3ζ融合的本公开的scFv抗体。所述构建体还可包含如上所述的接头。

优选但非必须地，适用于所述发现的抗体是重组产生的，因为需要以适当的特异性操作通常鼠类或其他非人抗体以将其转化为人源化形式。虽然糖基化抗体是优选的，但抗体可以是或可以不是糖基化的。众所周知，抗体经由二硫键正确地交联。

适用于本文的抗体的基本抗体结构单元包含四聚体。每个四聚体由两对相同的多肽链组成，每一对具有一个“轻”(约25kDa)链和一个“重”链(约50-70kDa)。每条链的氨基末端部分包括主要负责抗原识别的具有约100至110个或更多个氨基酸序列的可变区。每条链的羧基末端部分限定主要负责效应子功能的恒定区。

轻链被分类为γ、μ、α和λ。重链被分类为γ、μ、α、δ或ε，并分别将抗体的同种型定义为IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。在轻链和重链内，可变区与恒定区是通过具有约12个或更多个氨基酸序列的“J”区连接，其中重链也包括具有约10个氨基酸序列的“D”区。

各轻链/重链对的可变区形成抗体结合位点。因此，完整抗体具有两个结合位点。所述链展现出由三个高变区连接的相对保守的框架区(FR)的相同通用结构，所述高变区又称为互补决定区(在下文称为“CDR”)。来自两个链的CDR通过框架区对准，从而使得能够结合至特定表位。自N末端至C末端，轻链和重链两者均包含结构域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。根据已知的惯例(参见，Kabat"Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest"National Institutes ofHealth,Bethesda,Md.,1987和1991；Chothia等人,J.Mol.Bio.(1987)196:901-917；Chothia等人,Nature(1989)342:878-883)的定义将氨基酸序列指定给各结构域。

一方面，通过哺乳动物免疫的标准技术，从所述哺乳动物的抗体产生细胞形成杂交瘤或以其他方式永生化所述细胞以及培养所述杂交瘤或永生化的细胞以评估它们的适当特异性来产生具有适当特异性的单克隆抗体。在目前的情况下，此类抗体可通过例如用具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖对人、兔、大鼠或小鼠进行免疫来产生。用于重组操作的材料可通过从杂交瘤或产生它的其他细胞中检索编码所需抗体的核苷酸序列来获得。然后可操作和分离这些核苷酸序列，进行表征、纯化和回收以提供它们的人源化形式，以根据需要用于本文。

如本文所用，“人源化抗体”包括本公开的抗体，其通过改变具有非人互补决定区(“CDR”)的抗体的序列而部分或完全由源自人抗体种系的氨基酸序列组成。最简单的这种改变可简单地包括用人抗体的恒定区取代鼠恒定区，从而产生可具有足够低的免疫原性以为药物使用所接受的人/鼠嵌合体。然而，优选地，所述抗体的可变区且甚至CDR也通过本领域中现在熟知的技术人源化。可变区的框架区被相应的人框架区取代，从而留下非人CDR基本上完整，或甚至用来源于人基因组的序列取代CDR。CDR也可随机突变，以使得在完全人种系框架区或基本上为人的框架区的情况下，对具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖的结合活性和亲和力得以维持或增强。基本上人框架与已知的人框架序列具有至少90％、95％或99％序列同一性。在免疫系统已被改变以对应于人免疫系统的遗传修饰的小鼠中产生完全有用的人抗体。如上所述，其足以在本发现的方法中使用以采用所述抗体的免疫学特异性片段(包括代表单链形式的片段)。

此外，如本文所用，术语“人源化抗体”是指本公开的抗体，其包含人框架、至少一个来自非人抗体的CDR，并且其中存在的任何恒定区与人免疫球蛋白恒定区基本上相同，即至少约85％-90％、优选至少95％相同。因此，除可能的CDR外，人源化抗体的所有部分都与一个或多个天然人免疫球蛋白序列的对应对基本上相同。

如果需要，人源化免疫球蛋白的设计可如下进行。当氨基酸序列属于以下类别时，待使用的人免疫球蛋白的框架氨基酸序列(受体免疫球蛋白)被来自提供CDR的非人免疫球蛋白(供体免疫球蛋白)的框架氨基酸序列置换：(a)所述受体免疫球蛋白的人框架区中的氨基酸序列对于在所述位置处的人免疫球蛋白是不寻常的，而所述供体免疫球蛋白中的相应氨基酸序列对于在所述位置处的人免疫球蛋白是典型的；(b)所述氨基酸序列的位置与所述CDR中的一个直接相邻；或(c)框架氨基酸序列的任何侧链原子在三维免疫球蛋白模型中的CDR氨基酸序列的任何原子的约5-6埃(中心到中心)内(Queen等人,op.cit.,和Co,等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1991)88:2869)。当所述受体免疫球蛋白的人框架区中的氨基酸序列中的每个和所述供体免疫球蛋白中的相应氨基酸序列对于在所述位置处的人免疫球蛋白为不寻常时，这种氨基酸序列被对于在所述位置处的人免疫球蛋白典型的氨基酸序列置换。

在所有情况下，本公开的抗体特异性地结合具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖。具体地说，本公开的抗体结合复合N-聚糖内的表位。更具体地说，本公开的抗体结合复合N-聚糖内的末端GlcNAcβ残基。此外，本公开的抗体结合NGA3B聚糖内的表位。本文的短语“特异性地结合”是指抗体以在至少0.1mM至1pM范围内或在至少0.1pM至10nM范围内的亲和力常数或相互作用亲和力(K_D)结合至蛋白质，其中优选的范围是0.1pM至1nM。具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖可在多种物种中找到，并且确定抗体是否结合至具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖的方法是本领域中已知的。例如，参见实施例。因此，本公开的抗体还可结合来自其他物种的具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖。

本公开的抗体还可用作已知为单链可变片段(scFv)的融合蛋白。这些scFv由通过接头连接的重链可变区和轻链可变区组成。在大多数情况下，但并非全部，接头可以是肽。接头肽的长度优选是约10至25个氨基酸。优选地，接头肽富含甘氨酸以及丝氨酸或苏氨酸。ScFv可用于促进噬菌体展示或可用于流式细胞术、免疫组织化学或用作靶向结构域。制造和使用scFv的方法是本领域中已知的。

在一个优选的实施方案中，本公开的scFv缀合至人恒定结构域。在一些实施方案中，重链恒定结构域来源于IgG结构域，如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在其他实施方案中，重链恒定结构域可来源于IgA、IgM或IgE。

包含scFV的本公开的抗体还可缀合至有效负载，如治疗剂、可检测标记和/或含有药物或可检测标记的递送装置(包括但不限于脂质体或纳米颗粒)。将抗体缀合至治疗剂、可检测标记、脂质体、纳米颗粒或其他递送装置的方法是本领域中已知的。一般来说，缀合不应干扰抗体识别其靶标，并且不应干扰靶标的活性位点。在一些情况下，可在抗体与有效负载之间具有可裂解键联的情况下产生抗体。这种接头可允许在特定细胞位置处释放有效负载。合适的接头包括但不限于用反应性基团官能化以用于缀合至本公开的抗体和可检测标记和/或治疗剂的氨基酸链和烷基链。下文进一步详细描述治疗剂、可检测标记和递送装置。

优选的抗体是源自指定为M9A12的杂交瘤的小鼠抗体。如本文所用，术语“源自”是指“源性”抗体包含来自由M9A12产生的抗体的至少一个CDR区。换句话说，“源性抗体”包含至少一个CDR区，所述CDR区包含选自由SEQ ID NO:1、2、3、4、5和6组成的组的氨基酸序列。

在一个实施方案中，本公开的抗体可源自杂交瘤M9A12，并且可由包含与SEQ IDNO:9的轻链可变区的90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列编码，或可由包含与SEQ ID NO:10的重链可变区的90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列编码。在另一个实施方案中，本公开的抗体可源自杂交瘤M9A12，并且可由包含与SEQ ID NO:7的轻链可变区的90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列编码，或可由包含与SEQ ID NO:8的重链可变区的90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列编码。在以上实施方案中的每个中，所述抗体可以是人源化的。

在示例性实施方案中，本公开的抗体包含SEQ ID NO:7的轻链氨基酸序列和SEQID NO:8的重链氨基酸序列[即在本文中称为mAbM9A12的单克隆抗体]。在另一个示例性实施方案中，本公开的抗体包含SEQ ID NO:9的轻链核酸序列和SEQ ID NO:10的重链氨基酸序列[即在本文中称为mAb M9A12的单克隆抗体]。在以上实施方案中的每个中，所述抗体可以是人源化的。

在一个实施方案中，本公开的抗体可包含轻链CDR1，如表A的抗体1。在另一个实施方案中，本公开的抗体可包含轻链CDR2，如表A的抗体4。在另一个实施方案中，本公开的抗体可包含轻链CDR3，如表A的抗体6。在一个替代实施方案中，本公开的抗体可包含两个或三个轻链CDR的组合，如表A的抗体2、3和5。在以上实施方案中的每个中，所述抗体可以是人源化的。

类似地，在一个实施方案中，本公开的抗体可包含重链CDR1，如表A的抗体7。在另一个实施方案中，本公开的抗体可包含重链CDR2，如表A的抗体10。在另一个实施方案中，本公开的抗体可包含重链CDR3，如表A的抗体12。在一个替代实施方案中，本公开的抗体可包含两个或三个重链CDR的组合，如表A的抗体8、9和11。在以上实施方案中的每个中，所述抗体可以是人源化的。

或者，本公开的抗体可包含一个或多个轻链CDR和一个或多个重链CDR，如表A的抗体13-48。在以上实施方案中的每个中，所述抗体可以是人源化的。

表A

在一个实施方案中，本公开的抗体可包含轻链可变区，所述轻链可变区包含具有0至2个氨基酸取代的氨基酸序列SEQ ID NO:1的CDR1，具有0至2个氨基酸取代的氨基酸序列SEQ ID NO:2的CDR2，以及具有0至2个氨基酸取代的氨基酸序列SEQ ID NO:3的CDR3；或可包含重链可变区，所述重链可变区包含具有0至2个氨基酸取代的氨基酸序列SEQ ID NO:4的CDR1，具有0至2个氨基酸取代的氨基酸序列SEQ ID NO:5的CDR2，以及具有0至2个氨基酸取代的氨基酸序列SEQ ID NO:6的CDR3。在一个优选的实施方案中，本公开的抗体可包含轻链可变区，所述轻链可变区包含具有0至2个氨基酸取代的氨基酸序列SEQ ID NO:1的CDR1，具有0至2个氨基酸取代的氨基酸序列SEQ ID NO:2的CDR2，氨基酸序列SEQ ID NO:3的CDR3；重链可变区，所述重链可变区包含具有0至2个氨基酸取代的氨基酸序列SEQ ID NO:4的CDR1，具有0至2个氨基酸取代的氨基酸序列SEQ ID NO:5的CDR2，以及具有0至2个氨基酸取代的氨基酸序列SEQ ID NO:6的CDR3。在一个示例性实施方案中，本公开的抗体可包含轻链可变区，所述轻链可变区包含氨基酸序列SEQ ID NO:1的CDR1，氨基酸序列SEQ ID NO:2的CDR2，氨基酸序列SEQ ID NO:3的CDR3；重链可变区，所述重链可变区包含氨基酸序列SEQID NO:4的CDR1，氨基酸序列SEQ ID NO:5的CDR2和氨基酸序列SEQ ID NO:6的CDR3。本公开还涵盖SEQ ID NO:1、2、3、4、5和6的相应核酸序列，所述核酸序列可容易地由本领域的技术人员确定并且可并入载体或其他大DNA分子如染色体中以表达本公开的抗体。在以上实施方案中的每个中，所述抗体可以是人源化的。

(a)可检测标记

在一方面，本公开的抗体可缀合至可检测标记。可检测标记可直接缀合至本公开的抗体，或者可间接缀合至本公开的抗体。在一个实施方案中，可检测标记可与缀合至本公开的抗体的螯合剂复合。在另一个实施方案中，可检测标记可与缀合至接头的螯合剂复合，所述接头缀合至本公开的抗体。在另一个实施方案中，可检测标记可缀合至接头，所述接头缀合至本公开的抗体。在另一个实施方案中，可检测标记可通过所述标记被第二分子特异性地结合的能力间接地连接至本公开的抗体。这种类型的间接连接的标记的一个实例是可被第二分子、链霉亲和素或其他生物素结合蛋白特异性地结合的生物素标记。单一、双重或多重标记可以是有利的。本公开的分离的抗体可缀合至1、2、3、4或5种类型的可检测标记。

如本文所用，“可检测标记”是当连接至本公开的抗体时使抗体可检测的任何类型的标记。可检测标记也可对细胞有毒性或是细胞毒性的。因此，可检测标记也可以是治疗剂或细胞毒性剂。通常，可检测标记可包括发光分子、化学发光分子、荧光染料、荧光团、荧光淬灭剂、有色分子、放射性同位素、放射性核素、闪烁体、大型标记如金属原子(用于经由质量变化检测)、生物素、抗生物素蛋白、链霉亲和素、蛋白A、蛋白G、抗体或其片段、Grb2、聚组氨酸、Ni²⁺、Flag标签、myc标签、重金属、酶、碱性磷酸酶、过氧化物酶、荧光素酶、电子供体/受体、吖啶酯以及比色底物。本领域的技术人员将容易地认识到可在本公开的操作中使用的以上未提及的其他有用的标记。

可检测标记发出可通过信号转导机器检测的信号。在一些情况下，可检测标记可自发地发出信号，如当可检测标记是放射性核素时。在其他情况下，可检测标记由于受外场的刺激、如当可检测标记是弛豫金属时发出信号。信号的实例包括但不限于γ射线、X射线、可见光、红外/近红外能量和无线电波。信号转导机器的实例包括但不限于γ照相机，包括SPECT/CT装置、PET扫描仪、荧光计和磁共振成像(MRI)机器。如此，可检测标记包括可使用磁共振成像、闪烁照相成像、超声或荧光来检测的标记。在具体实施方案中，可检测标记包括可使用正电子发射断层摄影术、单光子发射计算机断层摄影术、γ照相机成像或直线扫描来检测的标记。

合适的荧光团包括但不限于异硫氰酸荧光素(FITC)、荧光素氨基硫脲、若丹明、德克萨斯红、Cy染料(例如Cy3、Cy5、Cy5.5)、Alexa Fluors(例如Alexa488、Alexa555、Alexa594、Alexa647)、近红外(NIR)(700-900nm)荧光染料以及羰花青和氨基苯乙烯基染料。可使用本领域中熟知的技术通过用荧光团标记试剂来标记B₁₂或其类似物以用于荧光检测(参见例如，Lohse等人,Bioconj Chem 8:503-509(1997))。例如，许多已知的染料能够与NH₂末端基团偶联。或者，荧光染料如荧光素可结合至肽接头的赖氨酸残基。在一个具体实施方案中，可使用例如Sharpless点击化学将炔烃改性的染料(如Alexa Fluor染料)点击到叠氮基改性的B₁₂上(Kolb等人,Angew Chem Int Ed 2001；40:2004-2021，其以引用的方式整体并入)。

放射性核素可以是γ发射放射性核素、俄歇发射放射性核素、β发射放射性核素、α发射放射性核素或正电子发射放射性核素。放射性核素可以是可检测标记和/或治疗剂。合适的放射性核素的非限制性实例可包括碳-11，氮-13，氧-15，氟-18，氟脱氧葡萄糖-18，磷-32，钪-47，铜-64、65和67，镓-67和68，溴-75、77和80m，铷-82，锶-89，锆-89，钇-86和90，钌-95、97、103和105，铼-99m、101、105、186和188，锝-99m，铑-105，汞-107，钯-109，铟-111，银-111，铟-113m，镧系元素-114m，锡-117m，碲-121m、122m和125m，碘-122、123、124、125、126、131和133，镨142、钷-149，钐-153，钆-159，铥-165、167和168，镝-165，钬-166，镥-177，铼-186和188，铱-192，铂-193和195m，金-199，铊-201，钛-201，砹-211，铋-212和213，铅-212，镭-223，锕-225，以及自其衍生的氮化物或氧化物形式。在一个具体实施方案中，放射性核素是选自由以下各项组成的组：铜-64、锆-89、钇-86、钇-90、锝-99m、碘-125、碘-131、镥-177、铼-186以及铼-188。

各种金属原子可用作可检测标记。金属原子通常可选自由原子序数为20或更大的金属组成的金属原子组成的组。例如，金属原子可以是钙原子、钪原子、钛原子、钒原子、铬原子、锰原子、铁原子、钴原子、镍原子、铜原子、锌原子、镓原子、锗原子、砷原子、硒原子、溴原子、氪原子、铷原子、锶原子、钇原子、锆原子、铌原子、钼原子、锝原子、钌原子、铑原子、钯原子、银原子、镉原子、铟原子、锡原子、锑原子、碲原子、碘原子、氙原子、铯原子、钡原子、镧原子、铪原子、钽原子、钨原子、铼原子、锇原子、铱原子、铂原子、金原子、汞原子、铊原子、铅原子、铋原子、钫原子、镭原子、锕原子、铈原子、镨原子、钕原子、钷原子、钐原子、铕原子、钆原子、铽原子、镝原子、钬原子、铒原子、铥原子、镱原子、镥原子、钍原子、镤原子、铀原子、镎原子、钚原子、镅原子、锔原子、锫原子、锎原子、锿原子、镄原子、钔原子、锘原子或铹原子。在一些实施方案中，金属原子可选自包括原子序数大于20的碱金属的组。在其他实施方案中，金属原子可选自包括原子序数大于20的碱土金属的组。在一个实施方案中，金属原子可选自包含镧系元素的金属的组。在另一个实施方案中，金属原子可选自包含锕系元素的金属的组。在又一个实施方案中，金属原子可选自包含过渡金属的金属的组。在又一个实施方案中，金属原子可选自包含贫金属的金属的组。在其他实施方案中，金属原子可选自包括金原子、铋原子、钽原子和钆原子的组。在优选的实施方案中，金属原子可选自包括原子序数为53(即碘)至83(即铋)的金属的组。在替代实施方案中，金属原子可以是适合于磁共振成像的原子。在另一个替代实施方案中，金属原子可选自由在CT的x射线能带中具有K边缘的金属组成的组。优选的金属原子包括但不限于锰、铁、钆、金和碘。

金属原子可以是+1、+2或+3氧化态形式的金属离子。例如，非限制性实例包括Ba²⁺、Bi³⁺、Cs⁺、Ca²⁺、Cr²⁺、Cr³⁺、Cr⁶⁺、Co²⁺、Co³⁺、Cu⁺、Cu²⁺、Cu³⁺、Ga³⁺、Gd³⁺、Au⁺、Au³⁺、Fe²⁺、Fe³⁺、F³⁺、Pb²⁺、Mn²⁺、Mn³⁺、Mn⁴⁺、Mn⁷⁺、Hg²⁺、Ni²⁺、Ni³⁺、Ag⁺、Sr²⁺、Sn²⁺、Sn⁴⁺以及Zn²⁺。金属原子可包括金属氧化物。例如，金属氧化物的非限制性实例可包括氧化铁、氧化锰或氧化钆。另外的实例可包括磁铁矿、磁赤铁矿或其组合。

在本公开的抗体缀合至非放射性同位素的实施方案中，所述抗体可用于中子俘获疗法(NCT)中。中子俘获疗法(NCT)是用于治疗局部侵袭性恶性肿瘤的无创性治疗方法。NCT是一种两步骤程序：首先，将受试者注射含有非放射性同位素的肿瘤定位药物，所述非放射性同位素具有俘获慢中子的高倾向或截面(σ)。俘获剂的截面比组织中存在的其他元素如氢、氧和氮的截面大很多倍。在第二步骤中，将受试者用超热中子辐射，所述超热中子当它们穿透组织在损失能量后被俘获剂吸收，所述俘获剂随后发射高能带电粒子，从而导致生物破坏性的核反应。在某些实施方案中，非放射性同位素可以是硼-10或钆。

(b)治疗剂

在一方面，本公开的抗体可缀合至治疗剂，以使得所述治疗剂可选择性地靶向表达具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖的细胞。所述治疗剂可直接缀合至本公开的抗体，或者可间接缀合至本公开的抗体。在一个实施方案中，所述治疗剂可以与缀合至本公开的抗体的螯合剂复合。在另一个实施方案中，所述治疗剂可与缀合至接头的螯合剂复合，所述接头缀合至本公开的抗体。在另一个实施方案中，所述治疗剂可缀合至接头，所述接头缀合至本公开的抗体。在又一个实施方案中，所述治疗剂可缀合至接头，所述接头缀合至螯合剂，所述螯合剂与可检测标记复合并缀合至本公开的抗体。

“治疗剂”是用于检测、诊断或治疗病状或疾病的本领域中已知的任何化合物。此类化合物可以是天然存在的、修饰的或合成的。治疗剂的非限制性实例可包括药物、治疗性化合物、毒素、遗传物质、金属(如放射性同位素)、蛋白质、肽、碳水化合物、脂质、类固醇、基于核酸的物质，或其呈其天然形式或用疏水性或带电部分衍生化以增强并入或吸附到细胞中的衍生物、类似物或组合。此类治疗剂可以是水溶性的或可以是疏水性的。治疗剂的非限制性实例可包括免疫相关药剂、甲状腺剂、呼吸产品、抗肿瘤剂、抗蠕动剂、抗疟疾剂、有丝分裂抑制剂、激素、毒素、抗原生动物剂、抗结核剂、心血管产品、血液产品、生物反应调节剂、抗真菌剂、维生素、肽、抗过敏剂、抗凝血剂、循环系统药物、代谢增强剂、抗病毒剂、抗心绞痛剂、抗生素、抗炎剂、抗风湿剂、麻醉剂、强心苷、神经肌肉阻断剂、镇静剂、局部麻醉剂、全身麻醉剂或放射性原子或离子。下文描述治疗剂的非限制性实例。在具体实施方案中，治疗剂可以是用于癌症的检测诊断或治疗的化合物。治疗剂优选降低或干扰肿瘤生长或以其他方式降低肿瘤在机体或生物体内的影响。减少由肿瘤产生的症状或减少肿瘤生长的治疗剂适用于本公开。此外，减少与肿瘤细胞生长相关的症状的任何治疗剂将用于本公开的目的。

本公开的抗体可与1、2、3、4或5种治疗剂缀合。接头可以或可以不用于将治疗剂缀合至本公开的抗体。一般来说，缀合不应该干扰抗体结合。在一些情况下，可在抗体与治疗剂之间具有可裂解键联的情况下产生本公开的抗体。这种接头可允许在特定细胞位置处释放治疗剂。在其他情况下，本公开的抗体可在具有连接至其以产生前药的酶的情况下产生。例如，胞苷脱氨酶可与本公开的抗体连接。胞苷脱氨酶然后裂解前药以产生细胞毒性药物。

本公开的治疗剂可以是毒素。“毒素”是指植物、动物、微生物(包括但不限于细菌、病毒、真菌、立克次体或原生动物)的有毒物质或产物；或传染性物质；或重组或合成的分子，无论它们的起源和产生方法如何。毒素可以是能够在接触与生物大分子如酶或细胞受体相互作用的身体组织或被所述身体组织吸收时引起疾病的小分子、肽或蛋白质。毒素可以是“生物毒素”，其被用于从生物来源明确鉴定毒素。生物毒素可进一步分为真菌生物毒素或短霉菌毒素、微生物生物毒素、植物生物毒素、短植物毒素和动物生物毒素。生物毒素的非限制性实例包括：由细菌产生的内毒素，如假单胞菌内毒素；由蓝细菌产生的蓝藻毒素，如微囊藻毒素、节球藻毒素、类毒素-a、柱孢藻毒素、鞘丝藻毒素-a、蛤蚌毒素、脂多糖、海兔毒素、BMAA；由沟鞭藻类产生的沟鞭藻毒素(dinotoxin)，如蛤蚌毒素和膝沟藻毒素；由例如褐隐蛛或“提琴背”蜘蛛、大多数响尾蛇和毒蛇、鼓蝮巨蝰、酿脓链球菌产生坏死毒素；由例如黑寡妇蜘蛛、大多数蝎子、箱形水母、眼镜蛇、锥螺、蓝环章鱼、有毒鱼、青蛙、黄纽扣珊瑚、各种不同类型的藻类、蓝细菌和沟鞭藻类等产生的神经毒素，如肉毒杆菌毒素(例如肉毒杆菌毒素(Botox))、破伤风毒素、河豚毒素、氯毒素、芋螺毒素、类毒素-a、金环蛇毒素、杨桃毒素(caramboxin)、箭毒；在例如蛇和蜥蜴毒液中发现的肌肉毒素；以及细胞毒素，如来自蓖麻子的蓖麻毒素、来自蜜蜂的蜂毒以及来自某些有毒蘑菇的T-2霉菌毒素。在某些实施方案中，毒素是细胞毒素。在一个实施方案中，细胞毒素是来自假单胞菌的内毒素。

本公开的治疗剂可以是小分子治疗剂、治疗性抗体、治疗性核酸或化学治疗剂。治疗性抗体的非限制性实例可包括莫罗单抗、阿昔单抗、利妥昔单抗、达利珠单抗、巴利昔单抗、帕利珠单抗、英夫利昔单抗、曲妥珠单抗、依那西普、吉妥单抗、阿仑单抗、伊布莫单抗、阿达木单抗、阿法赛特、奥马珠单抗、托西莫单抗、依法利珠单抗、西妥昔单抗、贝伐单抗、那他珠单抗、兰尼单抗、帕尼单抗、依库珠单抗以及塞妥珠单抗。代表性治疗性核酸可编码具有在体内诱导免疫应答和/或抗血管生成应答的能力的多肽。具有免疫刺激作用的代表性治疗性蛋白质包括但不限于细胞因子(例如，白细胞介素(IL)，如IL2、IL4、IL7、IL12，干扰素，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，肿瘤坏死因子α(TNF-α))，免疫调节细胞表面蛋白质(例如，人白细胞抗原(HLA蛋白)，共刺激分子以及肿瘤相关抗原。参见Kirk&Mule,2000；Mackensen等人,1997；Walther&Stein,1999；以及其中引用的参考文献。可根据目前公开的主题使用的具有抗血管生成活性的代表性蛋白质包括：血小板反应蛋白I(Kosfeld&Frazier,1993；Tolsma等人,1993；Dameron等人,1994)、金属底板反应蛋白(Carpizo&Iruela-Arispe,2000)、I类干扰素(Albini等人,2000)、IL12(Voest等人,1995)、鱼精蛋白(Ingber等人,1990)、血管抑素(O'Reilly等人,1994)、层粘连蛋白(Sakamoto等人,1991)、内皮抑素(O'Reilly等人,1997)以及催乳素片段(Clapp的,1993)。另外，已经从这些蛋白质中分离了几种抗血管生成肽(Maione等人,1990；Eijan等人,1991；Woltering等人,1991)。具有免疫刺激活性和抗血管生成活性的代表性蛋白质可包括IL12、干扰素-γ或趋化因子。可适用于癌症治疗的其他治疗性核酸包括但不限于编码肿瘤抑制基因产物/抗原、抗代谢物、自杀基因产物及其组合的核酸序列。

化学治疗剂是指适用于治疗癌症的化学化合物。所述化合物可以是通常影响快速分裂细胞的细胞毒性剂，或者可以是影响癌细胞的失调蛋白质的靶向治疗剂。细胞毒素剂是对肿瘤细胞毒性的任何天然存在的、修饰的或合成的化合物。此类药剂适用于治疗肿瘤，且适用于治疗以细胞增殖或极度活跃细胞群体为特征的其他症状或疾病。化学治疗剂可以是烷化剂、抗代谢物、抗肿瘤抗生素、抗细胞骨架剂、拓扑异构酶抑制剂、抗激素剂、靶向治疗剂、光动力学治疗剂或其组合。

合适的烷化剂的非限制性实例可包括六甲蜜胺、苯佐替派、白消安、卡铂、卡波醌、卡莫司汀(BCNU)、苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯磷酰胺、氯脲霉素、顺铂、环磷酰胺、达卡巴嗪(DTIC)、雌莫司汀、福莫司汀、异环磷酰胺、英丙舒凡、脂质体顺铂(lipoplatin)、洛莫司汀(CCNU)、马磷酰胺、甘露舒凡、氮芥、盐酸甲氧氮芥、美法仑、美妥替哌、氮芥(mustine)(氮芥(mechlorethamine))、二溴甘露醇、尼莫司汀、奥沙利铂、苯芥胆甾醇、哌泊舒凡、泼尼氮芥、雷莫司汀、赛特铂、司莫司汀、替莫唑胺、噻替派、曲奥舒凡、三亚胺醌、三亚乙基密胺、三亚乙基磷酰胺(TEPA)、三亚乙基硫代磷酰胺(噻替派)、三羟甲基蜜胺、曲洛磷胺、尿嘧啶氮芥以及乌瑞替派。

合适的抗代谢物可包括但不限于氨喋呤、安西他滨、阿扎胞苷、8-氮杂鸟嘌呤、6-氮尿苷、卡培他滨、卡莫氟(1-己基氨甲酰基-5-氟尿嘧啶)、克拉屈滨、氯法拉滨、阿糖胞苷(阿糖胞苷(Ara-C))、地西他滨、二甲叶酸、双脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷、氟达拉滨、5-氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲(羟基尿素)、甲酰四氢叶酸(亚叶酸)、6-巯基嘌呤、甲氨蝶呤、萘福昔定、奈拉滨、奥利默森、培美曲塞、蝶罗呤、雷替曲塞、泰戈福、噻唑呋林、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤(硫鸟嘌呤)以及三甲曲沙。

合适的抗肿瘤抗生素的非限制性实例可包括阿克拉霉素、阿柔比星、放线菌素、阿霉素、奥瑞他汀(例如单甲基奥瑞斯他汀E)、安曲霉素(authramycin)、重氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C(cactinomycin)、加利车霉素、卡拉比星、洋红霉素、嗜癌菌素、色霉素、放线菌素D、道诺霉素、地托比星、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、阿霉素、表柔比星、环氧酶素(epoxomicin)、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素、光神霉素、霉酚酸、诺加霉素、普卡霉素、橄榄霉素、培洛霉素、泊非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、稀疏霉素、链黑菌素、链脲菌素、杀结核菌素、戊柔比星、乌苯美司、净司他汀以及佐柔比星。

合适的抗细胞骨架剂的非限制性实例可包括卡巴他赛、秋水仙碱、地美可辛、多西他赛、埃博霉素、伊沙匹隆、大分子霉素(macromycin)、高三尖杉酯碱、奥他赛、紫杉醇(例如DHA-紫杉醇)、紫杉烷、替司他赛、长春花碱、长春新碱、长春地辛以及长春瑞滨。

合适的拓扑异构酶抑制剂可包括但不限于安吖啶、依托泊苷(VP-16)、伊立替康、米托蒽醌、RFS 2000、替尼泊苷以及拓扑替康。

合适的抗激素剂的非限制性实例可包括氨鲁米特、抗雌激素、抑制芳香酶的4(5)-咪唑、比卡鲁胺、非那雄胺、氟他胺、氟维司群、戈舍瑞林、4-羟基他莫昔芬、可莫昔芬(keoxifene)、亮丙瑞林、LY117018、米托坦、尼鲁米特、奥那司酮、雷洛昔芬、他莫昔芬、托瑞米芬以及曲洛司坦。

靶向治疗剂的实例可包括但不限于单克隆抗体，如阿仑单抗、卡妥索单抗、依达洛单抗、依帕珠单抗、吉妥单抗、吉妥单抗奥佐米星、格兰巴单抗(glembatumumab vedotin)、替伊莫单抗(ibritumomab tiuxetan)、reditux、利妥昔单抗、托西莫单抗和曲妥珠单抗；蛋白激酶抑制剂，如贝伐单抗、西妥昔单抗、克唑替尼、达沙替尼、厄洛替尼、吉非替尼、伊马替尼、拉帕替尼、莫立替尼、尼洛替尼、帕尼单抗、帕唑帕尼、索拉非尼、舒尼替尼、托西尼布以及凡德他尼。

血管生成抑制剂的非限制性实例可包括血管抑素、贝伐单抗、地尼白介素-毒素连接物、内皮抑素、依维莫司、木黄酮、干扰素α、白细胞介素-2、白细胞介素-12、帕唑帕尼、哌加他尼、兰尼单抗、雷帕霉素(西罗莫司)、坦罗莫司以及沙利度胺。

生长抑制性多肽的非限制性实例可包括硼替佐米、促红细胞生成素、白细胞介素(例如，IL-1、IL-2、IL-3、IL-6)、白血病抑制因子、干扰素、罗米地辛、血小板生成素、TNF-α、CD30配体、4-1BB配体以及Apo-1配体。

光动力治疗剂的非限制性实例可包括氨基乙酰丙酸、氨基乙酰丙酸甲酯、类维生素A(阿瑞特汀、他米巴罗汀、维甲酸)以及替莫泊芬。

其他抗肿瘤剂可包括阿那格雷、三氧化二砷、天冬酰胺酶、贝沙罗汀、溴匹立明、塞来考昔、化学连接的Fab、乙丙昔罗、依托格鲁、弥罗松酚、氯尼达明、马索罗酚、米替福新、米托胍腙、他仑帕奈(talapanel)、曲贝替定以及伏立诺他。

还包括以上列出的药剂中的任一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。化学治疗剂的剂量可以并且将根据药剂以及肿瘤或赘生物的类型而变化。熟练的从业者将能够确定化学治疗剂的适当剂量。

其他治疗剂可包含病毒或病毒基因组，如溶瘤病毒。溶瘤病毒包含天然存在的病毒，所述病毒在进入这种细胞时能够杀死靶组织中的细胞(例如通过溶解)。

(c)递送媒介物

本公开的抗体可缀合至媒介物以用于细胞递送。在这些实施方案中，通常可将本公开的抗体(其可以或可以不与可检测标记和/或治疗剂缀合)封装在合适的载体中以帮助将化合物递送至靶细胞、增加抗体的稳定性或使抗体的潜在毒性最小化。如本领域的技术人员将理解，多种媒介物适合用于递送本公开的抗体。合适的结构化流体递送系统的非限制性实例可包括纳米颗粒、脂质体、微乳液、胶束、树枝状聚合物和其他含有磷脂的系统。将抗体并入递送媒介物中的方法是本领域中已知的。尽管以下呈现了各种实施方案，但应理解，涵盖本领域中已知的将本公开的抗体并入递送媒介物中的其他方法。

在一个替代实施方案中，可使用脂质体递送媒介物。取决于实施方案，包含从mAbM9A12杂交瘤细胞释放的外泌体的脂质体鉴于其结构和化学性质而适合用于递送本公开的抗体。一般来说，脂质体是具有磷脂双层膜的球形囊泡。脂质体的脂质双层可与其他双层(例如细胞膜)融合，从而将脂质体的内容物递送至细胞。以这种方式，本公开的抗体可通过包封在与靶细胞膜融合的脂质体中而选择性地递送至细胞。

脂质体可由具有不同烃链长度的多种不同类型的磷脂组成。磷脂通常包含两个通过甘油磷酸酯连接至各种极性基团中的一个的脂肪酸。合适的磷脂包括磷脂酸(PA)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰甘油(PG)、二磷脂酰甘油(DPG)、磷脂酰胆碱(PC)和磷脂酰乙醇胺(PE)。包含磷脂的脂肪酸链的长度可在约6至约26个碳原子的范围内，并且脂质链可以是饱和的或不饱和的。合适的脂肪酸链包括(通用名称在括号中呈现)正十二烷酸酯(月桂酸酯)、正十四烷酸酯(肉豆蔻酸酯)、正十六烷酸酯(棕榈酸酯)、正十八烷酸酯(硬脂酸酯)、正二十烷酸酯(花生酸酯)、正二十二烷酸(山嵛酸酯)、正二十四烷酸酯(木蜡酸酯)、顺式-9-十六碳烯酸酯(棕榈油酸酯)、顺式-9-十八烷酸酯(油酸酯)、顺式-9,12-十八碳二烯酸酯(亚油酸酯)、全顺式-9,12,15-十八碳三烯酸酯(亚麻酸酯)以及全顺式-5,8,11,14-二十碳四烯酸酯(花生四烯酸酯)。磷脂的两个脂肪酸链可相同或不同。可接受的磷脂包括二油酰PS、二油酰PC、二硬脂酰PS、二硬脂酰PC、二肉豆蔻酰PS、二肉豆蔻酰PC、二棕榈酰PG、硬脂酰、油酰PS、棕榈酰、亚麻酰PS等。

磷脂可来自任何天然来源，并且因此可包含磷脂的混合物。例如，蛋黄富含PC、PG和PE，大豆含有PC、PE、PI和PA，并且动物脑或脊髓富含PS。磷脂也可来自合成来源。可使用具有不同比例的单独磷脂的磷脂混合物。不同磷脂的混合物可导致脂质体组合物具有有利的活性或活性性质的稳定性。上述磷脂可与阳离子脂质以最佳比例混合，所述阳离子脂质如N-(1-(2,3-二油酰基氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵、1,1'-双十八烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚羰花青高氯酸盐、3,3'-脱庚基氧杂羰花青碘化物、1,1'-十二烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚羰花青高氯酸盐、1,1'-二油基-3,3,3',3'-四甲基吲哚羰花青甲磺酸盐、N-4-(二亚油烯基氨基苯乙烯基)-N-甲基吡啶鎓碘化物或1,1-二亚油烯基-3,3,3',3'-四甲基吲哚羰花青高氯酸盐。

脂质体可任选地包含鞘脂类，其中鞘氨醇是甘油的结构对应物以及磷酸甘油酯或胆固醇(动物细胞膜的主要组分)的一种脂肪酸之一。脂质体可任选地含有聚乙二醇化的脂质，其是与聚乙二醇(PEG)的聚合物共价连接的脂质。PEG的大小可在约500至约10,000道尔顿的范围内。

脂质体还可包含合适的溶剂。溶剂可以是有机溶剂或无机溶剂。合适的溶剂包括但不限于二甲亚砜(DMSO)、甲基吡咯烷酮、N-甲基吡咯烷酮、乙腈、醇、二甲基甲酰胺、四氢呋喃或其组合。

携带本公开的抗体(即，具有至少一种甲硫氨酸化合物)的脂质体可通过任何已知的制备用于药物递送的脂质体的方法来制备，例如像美国专利号4,241,046、4,394,448、4,529,561、4,755,388、4,828,837、4,925,661、4,954,345、4,957,735、5,043,164、5,064,655、5,077,211以及5,264,618中所详述，所述专利的公开内容特此以引用的方式整体并入。例如，可通过在水溶液中超声处理脂质、溶剂注射、脂质水合、反向蒸发或通过反复冷冻和解冻而冷冻干燥来制备脂质体。在一个优选的实施方案中，通过超声处理形成脂质体。脂质体可以是多层的，其具有许多像洋葱一样的层，或单层。脂质体可以是大的或小的。持续的高剪切超声处理倾向于形成较小的单层脂质体。

对于普通技术人员来说显而易见的是，可改变控制脂质体形成的所有参数。这些参数包括但不限于温度、pH、甲硫氨酸化合物的浓度、脂质的浓度和组成、多价阳离子的浓度、混合速率、溶剂的存在和浓度。

在另一个实施方案中，可将本公开的抗体作为微乳液递送至细胞。微乳液通常是澄清的、热力学稳定的溶液，其包含水溶液、表面活性剂和“油”。在这种情况下，“油”是超临界流体相。表面活性剂位于油-水界面处。各种表面活性剂中的任一种适用于包括本文所述的或本领域中已知的那些的微乳液制剂。适用于本公开的水性微结构域通常将具有约5nm至约100nm的特征结构尺寸。这种大小的聚集体是可见光的不良散射体，且因此这些溶液是光学透明的。如本领域的技术人员将理解，微乳液可以并且将具有许多不同的微观结构，包括球形、棒形或圆盘形聚集体。在一个实施方案中，所述结构可以是胶束，其是最简单的微乳液结构，所述微乳液结构通常是球形或圆柱形物体。胶束就像水包油的液滴，并且反胶束就像油包水的液滴。在一个替代实施方案中，微乳液结构是薄层。它包括由表面活性剂的层分隔的连续的水层和油层。微乳液的“油”优选包含磷脂。以上针对脂质体详述的任何磷脂适用于涉及微乳液的实施方案。本公开的抗体可通过本领域中通常已知的任何方法包封在微乳液中。

在又一个实施方案中，本公开的抗体可在树枝状大分子或树枝状聚合物中递送。一般来说，树枝状聚合物是一种分支的树状分子，其中每个分支是分子的相互连接的链，所述链在一定长度之后分成两个新的分支(分子)。这种分支继续进行，直到分支(分子)变得如此密集以至于树冠形成一个球体。通常，树枝状聚合物的性质由其表面处的官能团决定。例如，亲水性端基(如羧基)通常会形成水溶性树枝状聚合物。或者，可将磷脂并入树枝状聚合物的表面中以促进穿过皮肤的吸收。详述用于脂质体实施方案中的任何磷脂适用于树枝状聚合物实施方案。本领域中通常已知的任何方法可用于制备树枝状聚合物并包封本文公开的抗体。例如，树枝状聚合物可通过迭代顺序的反应步骤产生，其中每个额外的迭代导致更高阶的树枝状聚合物。因此，它们具有规则的、高度分支的3D结构，具有几乎一致的大小和形状。此外，树枝状聚合物的最终大小通常由合成期间使用的迭代步骤的数量来控制。各种树枝状聚合物大小适合用于本公开。通常，树枝状聚合物的大小可在约1nm至约100nm的范围内。

II.使用本公开抗体的方法

一方面，本公开提供用于检测从受试者获得的生物样品中具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖的抗体。在另一方面，本公开提供用于测量从受试者获得的生物样品中具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖的量的抗体。从受试者获得的生物样品中具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖的量可用于将受试者分类为具有高或低量的具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖，并且可进一步用于鉴定受试者内肿瘤的存在。在某些实施方案中，可在检测或测量生物样品中具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖的量之前从生物样品中分离外泌体。

(a)用于检测和测量生物样品中具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖的量的方法

一方面，本公开提供用于检测从受试者获得的生物样品中具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖的方式。在另一方面，本公开提供用于测量从受试者获得的生物样品中具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖的量的方式。所述方法通常包括使用本公开的抗体检测和/或测量从受试者获得的生物样品中具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖的量。在某些实施方案中，所述方法包括(i)从获自受试者的生物样品中分离外泌体，和(ii)使用本公开的抗体检测和/或测量外泌体样品中具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖的量。上文章节I中描述了合适的抗体。

如本文所用，术语“生物样品”是指从受试者获得的样品。含有具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖的任何生物样品都是合适的。本领域中已知许多类型的生物样品。合适的生物样品可包括但不限于组织样品或体液。在一些实施方案中，生物样品是组织样品，如组织活检。组织活检可以是已知或疑似肿瘤的活组织检查。活检的组织可被固定、包埋在石蜡或塑料中并切片，或者活检的组织可被冷冻并冷冻切片。或者，可将活检组织加工成单个细胞或外植体，或加工成匀浆、细胞提取物、膜状级分或蛋白质提取物。样品也可以是来自受试者的组织的原代和/或转化的细胞培养物。在其他实施方案中，样品可以是体液。合适的体液的非限制性实例包括血液、血浆、血清、尿液、唾液、痰、腹水、眼泪、来自胃肠道的粘液以及胸腔积液。流体可以“按原样”使用，细胞组分可从流体中分离出来，或者可使用标准技术从流体中分离出蛋白质级分。在一个具体的实施方案中，可从生物样品中富集和分离外泌体。这可经由本领域的标准方法来进行，例如参见Thery等人,Curr ProtocCell Biol 2006；第3章；第3.22单元或实施例。

合适的受试者包括但不限于人、家畜动物、伴侣动物、实验动物和动物园动物。受试者可能或可能不知道患有癌症。在一个实施方案中，受试者可以是啮齿类动物，例如小鼠、大鼠、豚鼠等。在另一个实施方案中，受试者可以是家畜动物。合适的家畜动物的非限制性实例可包括猪、牛、马、山羊、绵羊、美洲驼和羊驼。在又一个实施方案中，受试者可以是伴侣动物。伴侣动物的非限制性实例可包括宠物，例如狗、猫、兔和鸟类。在又一个实施方案中，受试者可以是动物园动物。如本文所用，“动物园动物”是指可在动物园中找到的动物。此类动物可包括非人灵长类，大型猫科动物、狼和熊。在优选的实施方案中，动物是实验室动物。实验室动物的非限制性实例可包括啮齿类动物、犬科动物、猫科动物和非人灵长类。在某些实施方案中，动物是啮齿动物。在一个优选的实施方案中，所述受试者是人。

如本领域的技术人员将理解的，收集生物样品的方法可以并且将根据生物样品的性质和待进行的分析的类型而变化。本领域中通常已知的各种方法中的任一种都可用于收集生物样品。一般来说，所述方法优选保持样品的完整性，以使得可准确检测具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖和根据本公开测量的量。

一旦获得样品，就在体外对它进行加工以使用本公开的抗体检测和测量具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤缔合复合N-聚糖的量。本公开的范围内涵盖了使用本领域技术人员已知的抗体检测和测量蛋白质的量的所有合适的方法。使用抗体检测和测量蛋白质的量的方法(即“基于抗体的方法”)是本领域中熟知的。非限制性实例包括ELISA、ExoELISA、夹心免疫测定、放射免疫测定、免疫印迹或蛋白质印迹、流式细胞术、免疫组织化学、阵列和基于微流体芯片的测定。

一般来说，检测和测量具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖的量的基于抗体的方法包括使包含具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖的一些样品或所有样品与本公开的抗体在有效允许所述抗体与具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖之间形成复合物的条件下接触。通常，不需要整个样品，从而使得本领域的技术人员能够重复检测和测量样品中具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖的量。所述方法可在溶液中发生，或者可将所述抗体或包含样品的具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖固定在固体表面上。合适表面的非限制性实例可包括微量滴定板、试管、载玻片、珠粒、磁珠、树脂和其他聚合物。如本领域技术人员将理解，可以各种各样的方式发生附接至底物。例如，底物和抗体可用化学官能团衍生化，以便随后连接两者。例如，底物可用化学官能团进行衍生化，所述化学官能团包括但不限于氨基、羧基、氧代基或硫醇基。使用这些官能团，可使用官能团直接地连接或使用接头间接地连接抗体。本公开的抗体还可非共价地连接至底物。例如，可制备生物素化的抗体，所述抗体可结合至用链霉亲和素共价涂覆的表面，从而导致附着。或者，可使用诸如光聚合和光刻的技术在表面上合成抗体。

使所述样品与抗体在有效条件下接触足以允许形成复合物的一段时间通常涉及将本公开的抗体组合物添加至所述样品中，并将所述混合物孵育足够长的时间段以使抗体结合至存在的任何抗原。在这段时间之后，复合物将被洗涤并且复合物可以被检测，并且通过本领域中熟知的任何方法来测量所述量。检测和测量抗体-多肽复合物的量的方法通常基于检测标记或标志物。如本文所用，术语“标记”是指附着至抗体或其他底物材料的任何物质，其中所述物质可通过检测方法检测。合适标记的非限制性实例包括发光分子、化学发光分子、荧光染料、荧光淬灭剂、有色分子、放射性同位素、闪烁体、生物素、抗生物素蛋白、链霉亲和素、蛋白A、蛋白G、抗体或其片段、聚组氨酸、Ni²⁺Flag标签、myc标签、重金属和酶(包括碱性磷酸酶、过氧化物酶、葡萄糖氧化酶和荧光素酶)。基于检测标记或标志物来检测和测量抗体-多肽复合物的量的方法是本领域中熟知的。

在一些实施方案中，基于抗体的方法是免疫测定。免疫测定可以多种不同的形式运行。一般来说，免疫测定可分为两个类别：竞争性免疫测定和非竞争性免疫测定。在竞争性免疫测定中，样品中未标记的分析物与标记的分析物竞争结合抗体。未结合的分析物被洗掉，并测量结合的分析物。在非竞争性免疫测定中，将抗体而不是分析物进行标记。非竞争性免疫测定可使用一种抗体(例如标记俘获抗体)或多于一种抗体(例如至少一种未标记的俘获抗体和至少一种标记的“封端”或检测抗体)。合适的标记在上文进行了描述。

在其他实施方案中，基于抗体的方法是免疫印迹或蛋白质印迹。在其他实施方案中，基于抗体的方法是流式细胞术。在不同的实施方案中，基于抗体的方法是免疫组织化学(IHC)。IHC使用抗体来检测和定量完整组织样品中的抗原。组织样品可以是被制备用于通过IHC进行研究的新鲜冷冻的和/或福尔马林固定的、石蜡包埋的(或塑料包埋的)组织块。制备供IHC研究的组织块的方法以及进行IHC的方法是本领域中熟知的。

在替代实施方案中，基于抗体的方法是阵列。阵列包括至少一个地址，其中阵列的至少一个地址上布置有本公开的抗体。阵列可包括约1至约数十万个地址。本领域中已知适合用于构建阵列的若干底物，并且本领域的技术人员将理解，随着本领域进展，其他底物可能变得可用。上文也描述了合适的底物。在一些实施方案中，阵列包括至少一种本公开的抗体。附着于底物的抗体位于阵列的一个或多个空间限定的地址处。例如，阵列可包括至少一种、至少两种、至少三种、至少四种或至少五种抗体，每种抗体识别具有末端GlcNAcβ残基的相同或不同的肿瘤相关复合N-聚糖，并且每种抗体可处于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个空间限定的地址处。

对于前述实施方案中的每一个，具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖可在检测前首先分离或富集。例如，具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖可使用液相色谱法、通过沉淀、电泳、亲和纯化或通过外泌体分离来富集或分离。在一些实施方案中，可使用液相色谱法来富集或纯化具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖。在其他实施方案中，可使用电泳来富集或纯化具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖。在具体实施方案中，可使用外泌体分离来富集或分离具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖。外泌体分离可包括外泌体结合的具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖。

在某些实施方案中，可在检测前通过亲和纯化来富集或纯化具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖。具体地说，可使用本公开的抗体通过亲和纯化来富集或纯化具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖。使用亲和纯化来富集样品的聚糖或纯化聚糖的方法是本领域中已知的。简言之，亲和纯化包括将样品与便于后续步骤的固体支持物(如珠粒、培养板或膜)一起孵育。固体支持物可用本公开的抗体涂覆，从而引起具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖附着于固体支持物。或者，可将样品与本公开的抗体一起孵育，并且可通过与涂覆有对本公开的抗体具有特异性的第二抗体的固体支持物一起孵育来分离所述抗体复合物，从而引起聚糖-抗体复合物附着至所述固体支持物。然后可通过洗涤样品中未结合至固体支持物的其他物质来纯化或富集具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖，或者如果固体支持物是超顺磁珠，则具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖可通过吸引至强磁场而与样品分离。在富集或纯化后，然后可使用上述方法中的任一种在富集或纯化的样品中检测肿瘤相关复合N-聚糖。

(b)用于检测受试者的肿瘤的方法

在一方面，本公开提供用于基于从受试者获得的生物样品中测量到的具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖的量来分类受试者的方式。所述方法通常包括(i)使用本公开的抗体来测量从受试者获得的生物样品中具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖的量，(ii)将所述样品中的具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖的量与参考值进行比较，以及(iii)基于在所述样品中测量到的具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖的量，将所述受试者分类为具有高或低量的具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖。从受试者获得生物样品并使用本公开的抗体测量所述样品中具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖的量的方法在上文进行了详述并在实施例中进一步描述。在一个优选的实施方案中，生物样品是选自由以下各项组成的组的生物流体：血液、血浆、血清、唾液、痰、腹水、胸腔积液以及尿液。在一个具体实施方案中，在测量样品中具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖的量之前，可以或可以不从生物样品中分离外泌体。

可使用本领域中已知的任何合适的参考值。例如，合适的参考值可以是从不具有可检测癌症的相同物种的受试者或一组受试者获得的生物流体样品中具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖的量。在另一个实例中，合适的参考值可以是从具有可检测癌症的相同物种的受试者或一组受试者获得的生物流体样品中具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖的量，如经由标准方法如成像所测量。在另一个实例中，合适的参考值可以是从同一受试者获得的参考样品中具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖的量的测量值。参考样品包括与测试样品相同类型的生物流体，并且当不怀疑癌症时可以或可以不从所述受试者获得。本领域的技术人员将理解，当受试者为健康时，从受试者获得参考样本并不总是可能的或者期望的。例如，在急性情况下，参考样品可以是在呈现时从受试者获得的第一样品。在另一个实例中，当监测疗法的有效性时，参考样品可以是在治疗开始之前从受试者获得的样品。

根据本公开，可基于样品中测量的具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖的量来对受试者进行分类。基于从受试者获得的生物流体的样品中测量的具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖的量对受试者进行分类可用于鉴定患有肿瘤的受试者。一般来说，与参考值相比，受试者可被分类为具有高或低量的具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖，其中具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖的高量是高于参考值的量，并且低量是等于或低于参考值的量。在优选的实施方案中，为了将受试者分类为具有高量的具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖，与参考值相比样品中具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖的量可以是至少5％更大。例如，样品中具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖的量可比参考值大至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少100％。在其他实施方案中，与参考值相比，从受试者获得的生物流体的样品中具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖的量可增加至少2倍。例如，与参考值相比，样品中具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖的量可增加至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少30倍、至少35倍、至少40倍、至少45倍或至少50倍。

另一方面，本公开提供用于检测受试者的肿瘤的方式。如此，本公开的方法可用于检测源自赘生物或癌症的肿瘤。赘生物可以是恶性或良性的，癌症可以是原发性或转移性的；赘生物或癌症可以是早期阶段或晚期阶段。可治疗的赘生物或癌症的非限制性实例包括急性成淋巴细胞性白血病、急性骨髓性白血病、肾上腺皮质癌、AIDS相关癌症、AIDS相关淋巴瘤、肛门癌、阑尾癌、星形细胞瘤(儿童小脑或大脑)、基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脑干胶质瘤、脑肿瘤(小脑星形细胞瘤、大脑星形细胞瘤/恶性胶质瘤、室管膜瘤、成神经管细胞瘤、幕上原始神经外胚层肿瘤、视通路和下丘脑神经胶质瘤、乳腺癌、支气管腺瘤/类癌、伯基特淋巴瘤、类癌肿瘤(儿童期、胃肠道)、原发灶不明癌、中枢神经系统淋巴瘤(原发性)、小脑星形细胞瘤、大脑星形细胞瘤/恶性胶质瘤、宫颈癌、儿童期癌症、慢性淋巴细胞性白血病、慢性骨髓增生性病症、结肠癌、皮肤T细胞淋巴瘤、促纤维增生性小圆细胞肿瘤、子宫内膜癌、室管膜瘤、食管癌、尤文氏肿瘤家族的尤文氏肉瘤、颅外生殖细胞肿瘤(儿童期)、性腺外生殖细胞肿瘤、肝外胆管癌、眼癌(眼内黑色素瘤、成视网膜细胞瘤)、胆囊癌、胃(gastric/stomach)癌、胃肠类癌肿瘤、胃肠道间质瘤、生殖细胞肿瘤(儿童期颅外、性腺外、卵巢)、妊娠滋养细胞肿瘤、神经胶质瘤(成人、儿童期脑干、儿童期大脑星形细胞瘤、儿童期视通路和下丘脑)、胃类癌、毛细胞白血病、头颈癌、肝细胞(肝)癌、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、下丘脑和视通路神经胶质瘤(儿童期)、眼内黑色素瘤、胰岛细胞癌、卡波西肉瘤、肾癌(肾细胞癌)、喉癌、白血病(急性成淋巴细胞性、急性骨髓性、慢性淋巴细胞性、慢性髓细胞性、毛细胞)、唇癌和口腔癌、肝癌(原发性)、肺癌(非小细胞、小细胞)、淋巴瘤(AIDS相关、伯基特、皮肤T细胞、霍奇金、非霍奇金、原发性中枢神经系统)、巨球蛋白血症(瓦尔登斯特伦)、骨恶性纤维组织细胞瘤/骨肉瘤、成神经管细胞瘤(儿童期)、黑色素瘤，眼内黑色素瘤、默克尔细胞癌、间皮瘤(成年恶性、儿童期)、原发灶隐匿性转移性鳞状颈癌、口腔癌、多发性内分泌瘤形成综合征(儿童期)、多发性骨髓瘤/浆细胞瘤、蕈样霉菌病、骨髓增生异常综合征、骨髓增生异常/骨髓增生性疾病、髓细胞性白血病(慢性)、骨髓性白血病(成人急性、儿童急性)、多发性骨髓瘤、骨髓增生性疾病(慢性)、鼻腔和鼻旁窦癌、鼻咽癌、成神经细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、非小细胞肺癌、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤/骨恶性纤维组织细胞瘤、卵巢癌、卵巢上皮癌(表面上皮-间质肿瘤)、卵巢生殖细胞肿瘤、卵巢低度恶性潜能肿瘤、胰腺癌、胰腺癌(胰岛细胞)、鼻旁窦和鼻腔癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、咽癌、嗜铬细胞瘤、松果体星形细胞瘤、松果体生殖细胞瘤、松果体母细胞瘤和幕上原始神经外胚层肿瘤(儿童期)、垂体腺瘤、浆细胞瘤、胸膜肺母细胞瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌(肾癌)、肾盂和输尿管移行细胞癌、成视网膜细胞瘤、横纹肌肉瘤(儿童期)、唾液腺癌、肉瘤(尤文氏肿瘤家族、卡波西、软组织、子宫)、塞扎莱综合征、皮肤癌(非黑色素瘤、黑色素瘤)、皮肤癌(默克尔细胞)、小细胞肺癌、小肠癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、原发灶隐匿性鳞状颈癌(转移性)、胃癌、幕上原发性神经外胚层肿瘤(儿童期)、T细胞淋巴瘤(皮肤)、睾丸癌、喉癌、胸腺瘤(儿童期)、胸腺瘤和胸腺癌、甲状腺癌、甲状腺癌(儿童期)、肾盂和输尿管移行细胞癌、滋养细胞肿瘤(妊娠)、不明原发灶(成人、儿童期)、输尿管和肾盂移行细胞癌、尿道癌、子宫癌(子宫内膜)、子宫肉瘤、阴道癌、视通路和下丘脑神经胶质瘤(儿童期)、外阴癌、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症以及维尔姆斯瘤(儿童期)。在一个实施方案中，赘生物或癌症是选自由以下各项组成的组：胰腺癌、卵巢癌、肺癌、胃癌、结肠癌和食管癌以及舌/咽/喉癌。在具体实施方案中，赘生物或癌症是胰腺癌。在其他具体实施方案中，赘生物或癌症是卵巢癌。在其他具体实施方案中，赘生物或癌症是肺癌。在不同实施方案中，赘生物或癌症是食管癌或舌/咽/喉癌。

在检测到肿瘤时，可经由本领域中用于治疗癌症的标准方法来治疗受试者。此类治疗方法可取决于癌症的类型和严重程度以及患者的一般状况。癌症的治疗主要包括放射疗法、手术、化学疗法和/或靶向疗法。每种癌症的标准治疗算法可经由国家综合癌症网络(NCCN)指南(www.nccn.org/professionals/physician_gls/f_guidelines.asp)找到。

此外，本公开的方法可用于检测、表征和/或确定从早期到晚期疾病范围内的肿瘤的定位。此外，本公开的方法可用于分期癌症，即确定癌症的严重程度、监测癌症的进展(恶化)和/或监测消退(改善)。本公开的方法也可用于癌症的预后或监测对治疗的反应。

在一个实施方案中，用于监测受试者的癌症的方法可用于确定疾病进展。在这种实施方案中，可使用检测具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖的方法来评估在一个时间点受试者的风险，然后在稍后的时间可使用检测具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖的方法来确定受试者随时间推移的风险变化。例如，所述检测具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖的方法可在初始确定具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖的量之后数天、数周、数月或数年对同一受试者使用。因此，所述检测具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖的方法可用于追踪受试者以确定何时进展至更严重疾病的风险高、从而需要治疗。此外，所述检测具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖的方法可用于测量疾病进展的速率。例如，抑制量的具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖可指示疾病进展减弱。或者，增加量的具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖可指示疾病进展。

在另一个实施方案中，用于监测受试者的癌症的方法也可以用于确定对治疗的反应。如本文所用，对治疗有反应的患者据称已从治疗中受益。在临床实践中测量的对治疗的典型反应包括但不限于总体存活、无事件存活、进展时间、死亡时间、部分反应(PR)、非常好的部分反应(VGPR)和完全反应(CR)。这些术语在本领域中是熟知的，并且意图指在临床试验和本领域技术人员的临床实践期间测量的具体参数。例如，可在开始治疗之前在受试者的生物样品上进行检测具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖的方法，然后在稍后的时间可使用检测具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖的方法来确定随时间推移对治疗的反应。例如，检测具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖的方法可在治疗开始后数天、数周、数月或数年在同一受试者的生物样品上进行。因此，检测具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖的方法可用于追踪接受治疗的受试者以确定受试者是否对治疗有反应。如果具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖的量保持相同或减少，则受试者可能对治疗有反应。如果具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖的量增加，则受试者可能对治疗无反应。可重复这些步骤以确定随时间推移对疗法的反应。

对于每个方面，所述方法通常包括(i)使用本公开的抗体测量从受试者获得的生物样品中具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖的量，以及(ii)将所述样品中具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖的量与参考值进行比较。与参考值相比，所述样品中具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖的更大量指示存在肿瘤。具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖的量可以是定性的、半定量的或定量的测量。以上描述了合适的抗体，以及用于测量生物样品中具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖的量的方法。在一个优选的实施方案中，生物样品是选自由血液、血浆和血清组成的组的生物流体。在具体实施方案中，在测量具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖的量之前，从生物样品中分离外泌体。

在某些实施方案中，本公开的方法可与检测其他已知的癌症生物标志物组合。例如，CA19-9、癌胚抗原(CEA)、CA-125、CA50、CA242、肿瘤M2-丙酮酸激酶、弹性蛋白酶-1、半乳糖基转移酶同工酶II、甲胎蛋白、巨噬细胞抑制细胞因子1(MIC-1)、CEACAM1以及非编码RNA。这些生物标志物中的许多对于癌症的检测不是特异性或敏感的，或者可能仅存在于一部分癌症中，或者只能稍后在癌症中检测到。然而，当与具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖组合使用时，此类生物标志物可增强癌症检测和诊断中具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖的效用。

(c)肿瘤特异性递送

在另一方面，本公开提供一种将治疗剂递送至表达具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖的细胞的方法。因此，如章节I中所述，与有效负载、双特异性抗体或CAR缀合的本公开的抗体可用于治疗、稳定和预防受试者的癌症和相关疾病。“治疗、稳定或预防癌症”是指引起肿瘤大小或癌细胞数量的减少、减缓或预防肿瘤大小或癌细胞增殖的增加、增加在肿瘤或其他癌症消失与其再现之间的无疾病存活时间、预防肿瘤或其他癌症的初始或随后发生或减轻与肿瘤或其他癌症相关的不利症状。在期望的实施方案中，如使用任何标准测定(例如，半胱天冬酶测定、TUNEL和DNA片段化测定、细胞渗透性测定和膜联蛋白V测定)所测量，在治疗后存活的肿瘤或癌细胞的百分比比肿瘤或癌细胞的初始数目低至少20％、40％、60％、80％或100％。期望地，通过施用本公开的抗体诱导的肿瘤或癌细胞数量的减少比非肿瘤或非癌性细胞数量的减少大至少2、5、10、20或50倍。期望地，如使用标准方法所测定，本公开的方法导致肿瘤大小或癌细胞数量减少20％、40％、60％、80％或100％。期望地，至少20％、40％、60％、80％、90％或95％的所治疗受试者具有完全缓解，其中肿瘤或癌症的所有迹象都消失。期望地，肿瘤或癌症在至少5、10、15或20年后不再出现或再现。

在又一方面，本公开提供一种检测受试者的肿瘤的方法。所述方法包括向所述受试者施用与可检测标记缀合的本公开的抗体，并且检测所述可检测标记以检测具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖的存在，其中具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖的存在指示受试者中存在肿瘤。在优选的实施方案中，所述方法可用于诊断或成像受试者的癌症。在一些实施方案中，一种检测肿瘤的方法可包括(a)对可疑肿瘤进行活检；(b)使本公开的抗体与所述可疑肿瘤体外接触；以及(c)检测所述可检测标记，由此诊断肿瘤。

可使用显微镜(荧光显微镜、共焦显微镜或电子显微镜)、磁共振成像(包括MTI、MRS、DWI和fMRI)、闪烁照相成像(SPECT(单光子发射计算机断层摄影术)、PET(正电子发射断层摄影术)、γ相机成像和直线扫描)、射线照相术或超声来检测结合。可检测标记可原位、体内、离体和体外检测。

抗体组合物、受试者、癌症和治疗剂是如上所述。下文描述组合物的施用。

在某些方面，可将药理学有效量的本公开抗体(包括免疫学反应性片段)施用至受试者。使用标准的有效技术进行施用，包括外周(即不通过施用至中枢神经系统中)或局部施用至中枢神经系统。外周施用包括但不限于静脉内、腹膜内、皮下、肺部、透皮、肌内、鼻内、口腔、舌下或栓剂施用。包括直接进入中枢神经系统(CNS)的局部施用包括但不限于经由腰椎、心室内或实质内导管或使用手术植入的控释制剂。

用于有效施用的药物组合物被有意地设计为适合于所选择的施用模式，并且根据需要使用药学上可接受的赋形剂如相容性分散剂、缓冲剂、表面活性剂、防腐剂、增溶剂、等渗剂、稳定剂等。以引用的方式整体并入本文的Remington's Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.,Easton Pa.,16Ed ISBN:0-912734-04-3，最新版本提供了从业者通常已知的配制技术的概要。可能特别有用的是改变适用于这一发现的抗体的溶解度特征，从而使它们更亲脂，例如通过将它们包封在脂质体中或通过封闭极性基团。

通过静脉内或腹膜内或皮下注射的有效外周全身递送是对活患者施用的优选方法。对于这种注射适合的媒介物是直接的。然而，此外，也可通过鼻用气雾剂或栓剂通过粘膜进行施用。用于这种施用模式的合适制剂是熟知的，并且通常包括促进跨膜转移的表面活性剂。此类表面活性剂通常来源于类固醇或是阳离子脂质，如N-[1-(2,3-二油酰基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)或各种化合物，如半琥珀酸胆固醇酯、磷脂酰胆碱甘油等。

待施用的制剂中抗体的浓度是有效量，并且在低至约0.1重量％至多达约15重量％或约20重量％的范围内，并且将根据按照需要选择的特定施用模式主要基于流体体积、粘度等进行选择。用于注射至活患者的典型组合物可被配制成含有1mL磷酸盐缓冲盐水的无菌缓冲水和约1-1000mg的本发现的人源化抗体中的任一种或组合。在具体实施方案中，所述抗体组合物每次施用可具有50-300mg的抗体。所述制剂可在制成制剂后进行无菌过滤，或者以另外的方式制成微生物学上可接受的。用于静脉输注的典型组合物可具有介于1-250mL之间体积的流体(如无菌林格氏溶液)和1-100mg/ml或更高的抗体浓度。本发现的治疗剂可被冷冻或冻干以用于储存，并且在使用前在合适的无菌载体中复原。冻干和复原可导致不同程度的抗体活性损失(例如，在常规免疫免疫球蛋白的情况下，IgM抗体倾向于具有比IgG抗体更大的活性损失)。所施用的剂量是有效的剂量并且可能需要调整以补偿。所述制剂(通常为药物级质量)的pH将被选择成平衡抗体稳定性(化学和物理)并且在施用时对患者舒适。一般来说，介于4与8之间的pH是可耐受的。基于接受成功施用的个体的大小、体重和其他生理生物学特征，剂量将因个体而异。

对于治疗性应用，将治疗有效量的本公开组合物施用至受试者。“治疗有效量”是足以产生可测量的生物肿瘤应答(例如细胞毒性应答或肿瘤消退)的治疗组合物的量。本公开的治疗性组合物中活性成分的实际剂量水平可变化，以便施用有效实现特定受试者的所需治疗反应的量的活性化合物。所选择的剂量水平将取决于多种因素，包括治疗性组合物的活性、制剂、施用途径、与其他药物或治疗的组合、肿瘤大小和寿命以及受试者的身体状况和先前病史。在一些实施方案中，施用最小剂量，并且在不存在剂量限制性毒性的情况下增加剂量。治疗有效剂量的确定和调整以及何时以及如何进行这种调整的评估对于医学领域的普通技术人员是已知的。在一方面，典型剂量含有约0.01mg/kg至约100mg/kg的本文所述的抗体。剂量可在约0.05mg/kg至约50mg/kg、更优选约0.1mg/kg至约25mg/kg的范围内。

对于诊断应用，将可检测量的本公开组合物施用至受试者。如本文中用于指诊断组合物的“可检测量”是指这种组合物使得可在体内或体外测定组合物的存在的剂量。可检测量将根据各种因素而变化，所述因素包括但不限于所标记药物的化学特征、可检测标记、标记方法、成像方法和与其有关的参数、标记药物在受试者中的代谢、标记的稳定性(例如放射性核素标记的半衰期)、在成像之前在施用药物和/或标记抗体之后所经历的时间、药物施用途径、受试者的身体状况和先前病史以及肿瘤或疑似肿瘤的大小和寿命。因此，可检测量可变化并且可针对特定应用进行定制。在研究本公开内容且特别是实施例之后，确定这种可检测量在本领域技术人员的能力范围内。

根据需要，给药频率可以是每天一次或每周或每月一次、两次、三次或更多次以有效地治疗症状。相对于疾病本身的治疗施用时间和治疗持续时间将由围绕病例的情况决定。治疗可立即开始，如在由紧急医务人员施用的受伤部位处。治疗可在医院或诊所本身开始，或在医院出院后或在门诊就诊后的稍后时间开始。治疗的持续时间可在一次施用的单次剂量至终身治疗性治疗疗程的范围内。

虽然前述方法对于施用蛋白质如抗体似乎是最方便和最合适且有效的，但是通过合适的改编，可采用其他有效的施用技术，如心室内施用、透皮施用和口服施用，只要在本文使用适当的制剂。

另外，可能需要采用使用生物可降解膜和基质或渗透微泵的控释制剂，或基于葡聚糖珠、藻酸盐或胶原的递送系统。

典型的剂量水平可使用标准临床技术来确定和优化，并且将取决于施用方式。

表B.序列表

实施例

包括以下实施例以证实本公开的各种实施方案。本领域的普通技术人员应理解的是，在以下实施例中公开的技术代表由本发明人发现的在本发明的实践中起良好作用的技术，并且因此可被认为构成本发明实践的优选模式。然而，根据本公开，本领域的技术人员应理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下可在已公开并仍获得类似或相似结果的特定实施方案中做出许多改变。

实施例1.新颖肿瘤特异性生物标志物的鉴定和单克隆抗体M9A12的产生。

在血清诊断测定的开发中，鉴定肿瘤特异性生物标志物和产生配体如可结合至生物标志物的抗体是至关重要的。聚糖在细胞表面和分泌蛋白中起着多种结构和功能作用。糖基化变化是恶性转化和肿瘤进展的普遍特征。本发明人鉴定了一组肿瘤特异性生物标志物，即具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖。新发现的肿瘤抗原，即具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖在不同类型的癌细胞的表面上特异性地表达(图1)。在培养的活卵巢癌细胞、结肠癌细胞、胰腺癌细胞和肺癌细胞上检测到所述组肿瘤相关复合N-聚糖。

使用杂交瘤技术，本发明人成功地产生了针对具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖的mAb M9A12。这种抗体被分类为对所述抗原具有显著结合亲和力(Kd>2X 10⁹)的IgG1免疫球蛋白亚类。使用功能性糖组学协会(CFG)聚糖阵列(版本5)(www.functionalglycomics.org/static/consortium/resources/resourcecoreh16.shtml)，对mAb M9A12的结合位点进行了分析。确定mAb M9A12结合至具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖。图2和表1描绘由mAb M9A12特异性地结合的聚糖。图2和表1中的结果表明，其他呈递特征如N-聚糖的蛋白质核心、间隔和取向也可能影响结合，并且进一步证实mAb M9A12及其结合抗原是独特且新颖的。

使用免疫组织化学(IHC)染色，证实与正常对应物相比，mAb M9A12对癌细胞的特异性。在肺癌、胰腺癌、胃癌、结肠癌和卵巢癌组织中观察到相对于其正常对应物的强染色(图3)。使用mAb M9A12的人正常细胞和组织的另外IHC揭示在正常脑、乳腺、肝、肺、卵巢、胰腺、心脏、皮肤或前列腺组织中未检测到肿瘤相关复合N-聚糖B(图4)。在胰腺癌中，mAbM9A12的阳性染色率是约98％(105/107)。在人胰腺癌组织中使用mAb M9A12进行的IHC染色证明了mAb M9A12与癌症组织的特异性结合，并且显示了在癌性腺体结构的管腔中、在肿瘤细胞膜上以及在细胞质中的高尔基氏复合体区域中肿瘤相关复合N-聚糖的位置(图5)，从而表明具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖是分泌的抗原，其有利于开发用于癌症检测和诊断的基于生物流体的测定。在肺癌中，mAb M9A12的阳性染色率是约85.5％，具有显著特异性(图8)。肺的腺癌、鳞癌和小细胞癌都显示阳性染色。正常肺组织和慢性支气管炎组织展示阴性染色。伴有上皮增生的慢性支气管炎在高尔基氏复合体区域中呈现阳性染色。

接下来，开发了用于有效测量生物流体中具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖的基于外泌体结合的肿瘤相关复合N-聚糖的ELISA测定。测量外泌体结合的肿瘤相关复合N-聚糖以用于癌症检测和诊断存在至少三个主要优点。首先，肿瘤相关复合N-聚糖可与外泌体共分离。与在从肿瘤细胞分泌到大血池中后更加稀释的可溶性肿瘤相关抗原不同，外泌体结合的肿瘤相关复合N-聚糖可容易地从生物流体中富集和分离。这种富集可提高癌症检测和诊断的灵敏度。其次，肿瘤细胞比正常细胞释放更大量的外泌体。大约每个肿瘤细胞可在24小时周期内释放>5,000个外泌体。因此，测量外泌体结合的肿瘤相关复合N-聚糖或肿瘤相关复合N-聚糖阳性外泌体比搜寻循环中的肿瘤细胞以用于癌症检测和诊断更灵敏。第三，测量生物流体外泌体结合的抗原以用于癌症检测和诊断是非侵入性的、经济的且在临床上容易进行。目前，测量了来自健康个体和患有良性和恶性疾病的患者的血清中外泌体结合的肿瘤相关复合N-聚糖。结果清楚地表明，通过测量具有末端GlcNAcβ残基的血清外泌体结合的肿瘤相关复合N-聚糖，可将癌症患者与健康个体和患有良性疾病的患者区分开来。在健康个体和卵巢癌患者中，使用基于外泌体的ELISA测定(ExoELISA测定)的平均任意单位分别是17.1和50.6。使用35个任意单位的截断值，81％的卵巢癌患者是阳性，100％的健康个体是阴性(图11)。ExoELISA测定还用于测量来自健康个体和患有肺良性和恶性疾病的患者的血清中外泌体结合的肿瘤相关复合N-聚糖。中值任意单位分别是37、29和65.4(图9)。在健康个体和患有舌/咽/喉癌的患者中，平均任意单位分别是25.3和52(图12)。

实施例2.具有末端GlcNAcβ残基的新颖肿瘤特异性复合N-聚糖的发现为开发用于胰腺癌检测和诊断的测定提供了理想的生物标志物。

胰腺癌是一种预后不良的疾病。不良预后可归因于以下因素：1)疾病的沉默性质和延误诊断(在诊断时仅约20％的病例呈现为可切除性疾病)；2)高转移潜力和对常规化学疗法和放射疗法的抗性；3)缺乏准确测量患者对治疗性治疗的反应的方法。目前，手术切除是用于胰腺癌患者的唯一根治性治疗。然而，由于肿瘤血管累及或转移扩散的存在，在诊断时近80％的患者不是手术候选者。即使在根治性切除的患者中，中值存活期也不到两年。研究表明，无淋巴管浸润的早期胰腺病变(<3cm)的患者在手术切除后具有显著更好的预后，5年存活率达25％-30％，从而说明早期检测和诊断的重要性。因此，为了降低死亡率并改善预后，开发用于早期胰腺癌检测、治疗反应的评估和肿瘤复发的监测的非侵入性和经济性测定是至关重要的。遗憾的是，目前没有基于血清的测定可用于早期胰腺癌检测和诊断。

如实施例1中所描述，鉴定了肿瘤特异性生物标志物，即具有末端GlcNAcβ残基的复合N-聚糖，并且成功产生了针对肿瘤相关复合N-聚糖的mAb M9A12。这种抗体被分类为对所述抗原具有显著结合亲和力(Kd>2X 10⁹)的IgG1免疫球蛋白亚类。培养的胰腺癌细胞的抗体染色的质膜在图1C中示出。先前尚未报道所述组具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖作为肿瘤相关抗原。如图1C中所示，培养的人胰腺癌细胞(Panc-1)在细胞膜中用mAb M9A12强烈染色。mAb M9A12展示显著肿瘤特异性(图5和图4)。mAb M9A12在胰腺癌中的阳性染色率是约98％(105/107)[阴性(-)1.9％(2/107)；弱阳性(±)18.7％(20/107)；阳性(+)39.3％(42/107)；强阳性(++)31.8％(34/107)；和非常强的阳性(+++)8.4％(9/107)](图5)。因此，具有优异肿瘤特异性和灵敏度的具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖是用于开发用于胰腺癌检测和诊断的测定的理想候选生物标志物。

实施例3.用于胰腺癌检测和诊断的ExoELISA测定。

癌症血清诊断中的主要问题之一是由于血清中肿瘤相关抗原的低丰度所致的血液测试的灵敏度不足。例如，血清中的前列腺特异性抗原与白蛋白的比例是1至750万个分子。检测肿瘤特异性分子就像是在干草堆里寻找针。外泌体近来已成为鉴定用于诊断目的的生物标志物的重点。外泌体是30-nm至100-nm，脂质双层膜结合囊泡由大多数类型的细胞、包括肿瘤细胞释放。外泌体表达通常与肿瘤质膜连接的分子标志物，并且它们携带基因组和蛋白质组学材料，如蛋白质、miRNA、脂质、聚糖以及它们所源自的细胞的DNA。研究表明，一些外泌体miRNA可用作诊断和预后标志物。最近，已经探索了外泌体膜结合的肿瘤标志物。目前，血清外泌体膜蛋白和碳水化合物抗原尚未在癌症、特别是胰腺癌中进行深入评估。从胰腺癌患者的水平升高的血清中回收外泌体结合的肿瘤相关复合N-聚糖(图7)。与在从肿瘤细胞分泌到大血池中后更加稀释的可溶性肿瘤相关抗原不同，外泌体结合的肿瘤相关复合N-聚糖可容易地从体液中富集和分离。另外，肿瘤细胞比正常细胞释放更多的外泌体。大约每个肿瘤细胞可在24小时周期内释放超过5,000个外泌体。测量具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤循环外泌体结合的肿瘤相关复合N-聚糖或肿瘤相关复合N-聚糖阳性外泌体可能比寻找循环中的肿瘤细胞以用于癌症检测和诊断更灵敏。已经建立了测量外泌体结合的肿瘤相关复合N-聚糖的ExoELISA测定。ExoELISA测定在小型试验中证明了用于胰腺癌检测和诊断的有希望的结果。ExoELISA测定可能能够区分胰腺癌患者与正常个体和患有良性胰腺疾病的患者，并且可充当用于早期胰腺癌检测的非侵入性且经济的工具。此外，ExoELISA测定可用于开发用于早期胰腺癌检测和诊断以及用于准确监测疾病进展和治疗反应的试剂盒。

用于测量正常个体以及患有恶性和良性疾病的患者中的血清外泌体结合的肿瘤 相关复合N-聚糖的mAb M9A12的制备：将按照实验室中常规使用的程序，通过收集杂交瘤培养基并将其使用蛋白A/G琼脂糖珠进行纯化来产生mAb M9A12。简言之，将收集来自M9A12杂交瘤培养物的上清液并将其在4℃、14,000X g下离心20分钟，通过0.22μm过滤器过滤以除去细颗粒，并且使用平衡缓冲液(1mol/L Tris，pH 9.0)将pH调节至7.0。将使过滤的上清液通过蛋白A/G柱，并且用结合缓冲液(50mmol/LNa2PO4，500mmol/LNaCl，pH 6)洗涤所述柱，然后用甘氨酸缓冲液(0.1mol/L，pH 2.7)从所述柱洗脱所述抗体。将含有抗体的洗脱液收集在装有100μL的Tris缓冲液(1mol/L，pH 9.0)的试管中以用于中和，将其用Nanodrop在280nm波长下定量，并将其储存在-20℃冰箱中备用。

实验分组和患者纳入标准：将设置三个组：正常对照组、胰腺癌组和良性胰腺病状组，每组中60例病例。基于文献和计算，此设计将提供足够的能力来估计mAb M9A12在胰腺癌诊断中的AUC[ROC(接受者操作特征)曲线下面积]。对于正常对照组，将随机招募60名健康志愿者。对于胰腺癌组，只有尚未接受任何治疗的胰腺癌患者才有资格入组。良性胰腺疾病组将包括患有慢性胰腺炎、胰腺囊肿、导管内乳头状粘液性肿瘤(IPMN)以及血清CA19-9较高且在测量CA19-9抗原以用于胰腺癌检测时产生假阳性结果的良性胆道梗阻患者。所有血清样品收集将在机构审查委员会(IRB)批准下进行。

从血清中富集和分离外泌体：使用血清外泌体分离试剂盒(Life technology,Cat34478360)，按照制造商的说明从患者血清中富集外泌体。简言之，所述方案包括：1)在2,000RPM下离心0.6ml血清样品30分钟以除去细胞和碎片；2)将澄清的血清转移至新管中，不要搅动沉淀，并且将其置于冰上直至准备好进行分离；3)将100μl外泌体分离试剂添加至0.5ml血清中并且通过涡旋将其充分混合；4)将样品在2℃至8℃下孵育30分钟；5)在孵育后将所述样品在室温、10,000xg下离心10分钟；6)吸出并丢弃上清液-外泌体包含在管底部的沉淀中；7)加入150μl 1x磷酸盐缓冲盐水(PBS)，悬浮沉淀，且最终将外泌体储存在-80℃选以备将来使用或立即在ExoELISA测定中使用它。

用于定量测量血清外泌体结合的肿瘤相关复合N-聚糖的ExoELISA测定将使用用外泌体特异性兔多克隆抗体(由HansaBiomed生产并由Galen Laboratory Supplies,Middletown,CT分销)预涂覆的泛外泌体俘获免疫板。通过连续稀释来自正常个体和胰腺癌患者的血清的分离的外泌体，针对免疫平板最大俘获对分离的外泌体的浓度进行优化。结果表明，使用从分离自0.5ml血清的外泌体制备并溶解在150μl PBS中的50μl的外泌体悬液，免疫板被饱和以最大限度俘获外泌体。为了测量外泌体结合的肿瘤相关复合N-聚糖，将根据制造商的说明书进行ExoELISA测定。简言之，1).将50μl浓缩或分离的血清外泌体样品添加至每个孔中并且对于每个样品一式三份；2).用石蜡膜密封板并在4℃下孵育过夜或在室温下孵育2小时；3).通过添加200μl洗涤缓冲液(PBS+0.05％的tween20和0.5％的BSA)洗涤平板三次，并且通过倒出丢弃板内容物。4).添加浓度为10μg/ml的100μl M9A12抗体-这是组织病理学载玻片上用于免疫组织化学染色的抗体浓度。5).将板在室温下孵育1小时；6).在洗涤后添加100μl的与Fluor488荧光染料(500X稀释)缀合的山羊抗小鼠IgG第二抗体，并且将板在室温下孵育1小时。7).最后在用洗涤缓冲液洗涤板三次后，使用具有面积扫描程序以及485nm和528nm的激发/发射波长的SynergyH1混合多模式微板读取器来读取板。为了量化血清外泌体结合的肿瘤相关复合N-聚糖，将通过平行运行碳水化合物结合板产生定量标准曲线，所述结合板预涂有能够共价结合碳水化合物基团(Carbo-BINDTM,Costar2507)的酰肼基团，其中ExoELISA测定使用不同浓度的具有末端GlcNAcβ残基的纯复合N-聚糖(V-LABS,INC.Covington,LA)。将具有末端GlcNAcβ残基的纯复合N-聚糖(不同类型的聚糖的重量比是1:1)从1ng/ml连续稀释至100μg/ml，然而，肿瘤相关复合N-聚糖浓度将根据来自胰腺癌患者的血清中外泌体结合的肿瘤相关复合N-聚糖的量进行调节。所有实验将重复三次。将分析血清外泌体结合的肿瘤相关复合N-聚糖的平均量(纳克或微克)。平行CA19-9ELISA测定也将使用相同组的血清样品用肿瘤相关复合N-聚糖ExoELISA测定运行。将通过以下步骤来在胰腺癌的诊断中验证血清外泌体结合的肿瘤相关复合N-聚糖：(1)使用ANOVA和双样品学生t检验将胰腺癌组的肿瘤相关复合N-聚糖量和/或荧光强度(任意单位)的平均值与正常对照组和良性胰腺病状组的那些进行统计性比较；以及(2)将胰腺癌诊断中血清外泌体结合的肿瘤相关复合N-聚糖对CA19-9的灵敏度和特异性与接受者操作特征(ROC)曲线的分析进行比较。最后，以通过比较源自单独肿瘤相关复合N-聚糖、单独CA19-9、肿瘤相关复合N-聚糖与CA19-9的组合的AUC以及使用Delong方法的空AUC为0.5来确定外泌体结合的肿瘤相关复合N-聚糖和CA19-9的组合是否可改善胰腺癌诊断的性能。也将评估作为额外生物标志物的CEA。

实施例4.血清外泌体结合的肿瘤相关复合N-聚糖的量与末端GlcNAcβ残基和肿瘤负荷(质量)之间的相关性。

将在切除肿瘤之前和之后在胰腺癌患者中测量血清外泌体结合的肿瘤相关复合N-聚糖，以建立血清外泌体结合的肿瘤相关复合N-聚糖的量与肿瘤负荷之间的相关性。还将在同一组样品中测量CA19-9，并且比较血清外泌体结合的肿瘤相关复合N-聚糖与CA19-9之间的肿瘤标志物关联。实施例3中描述的ExoELISA测定可导致对胰腺癌早期检测和诊断的大规模筛选。然而，为了监测疾病进展和治疗反应，将使用与实施例3中描述的相同方法，在30名患有晚期(III期和IV期)胰腺癌的患者中，在部分或全部肿瘤切除之前和之后测量血清外泌体结合的肿瘤相关复合N-聚糖。这种30名患者的样本量在双侧0.05显著性水平的配对t检验中给出>0.8的幂。注意，血清标本将被收集，并且外泌体结合的肿瘤相关复合N-聚糖将在手术切除肿瘤后的两至三周内进行测量，因为外泌体在循环中具有较短半衰期。

将报告使用分类数据的平均值、中值和标准偏差的描述性数据。将示出曲线、表和直方图。将使用ANOVA和双样品学生t检验来比较所有组和任何两组之间的血清外泌体结合的肿瘤相关复合N-聚糖的平均量(纳克或微克)。P<0.05的差异将被认为是统计上显著的。诊断灵敏度(真阳性率)和特异性(真阴性率)将通过接受者操作特征(ROC)曲线的分析来评估和确定。将通过经由多种方法定义CA19-9与外泌体结合的肿瘤相关复合N-聚糖检测的最佳组合来产生新的标志物：(1)来自包括多个标志物的多变量逻辑回归模型的线性预测因子；(2)通过分类树确定的分类规则；(3)优化ROC曲线的的标志物中的两种或三种的线性组合。最佳截断点将在单独的考虑中获得以便(1)使最大总体分类准确度的约登指数(灵敏度和特异性的总和)最大化；(2)对应于ROC曲线中的完美分类坐标，即(0,1)坐标；(3)满足成本效益分析；(4)在最大化灵敏度的同时满足限定的特异性。对应于每个最佳截断点，将导出包括灵敏度和特异性、阳性和阴性预测值(PPV和NPV)的诊断测试统计测量。为了在两种标志物之间进行比较，将包括Delong的方法，从而比较相应的AUC或部分AUC估计值来比较所述两种标志物。在文献中，据报导单独CA19-9在胰腺导管腺癌(PDAC)与正常对照之间具有约0.74的灵敏度和0.84的AUC(方差＝0.022)。通过计算，每组60个的样本量(正常，PDAC和癌症)将提供80％幂来比较0.84的估计的AUC与无效随机标志物的0.5的AUC。估计的AUC将能够以95％的置信区间(0.797，0.883)进行预测。注意，统计分析对于开发癌症诊断测定非常重要。

实施例5.ExoELISA测定的另外用途。

另外的研究包括以下各项：(1).用ExoELISA测定筛查胰腺癌高风险群体以用于早期胰腺癌的检测和诊断；高风险群体包括患有胰腺良性肿瘤(上皮内瘤变、导管内乳头状粘液性肿瘤和粘液性囊性肿瘤)的个体以及患有使他们易患胰腺癌的遗传病状的个体。(2)比较患有可手术和不可手术的疾病的患者之间的外泌体结合的肿瘤相关复合N-聚糖的水平，以评估测量外泌体结合的肿瘤相关复合N-聚糖在估计胰腺癌临床分期中的价值。可手术组将不包括患有边界可切除疾病的个体，所述个体的肿瘤在化学疗法和/或放射疗法后变得可切除。不可手术组将包括患有局部晚期和转移性疾病的患者。来自这项研究的有利结果将有助于医生在诊所制定治疗计划。(3).在治疗性治疗之前和期间测量血清外泌体结合的肿瘤相关复合N-聚糖，以观察肿瘤对化学疗法和/或放射疗法的反应(即，将外泌体结合的肿瘤相关复合N-聚糖的水平与肿瘤治疗反应相关联)。(4).通过在疾病过程期间的不同时间点或定期测量血清抗原来评估血清外泌体结合的肿瘤相关复合N-聚糖在监测疾病进展和复发中的价值。(5).测量其他体液(尿液和唾液)中的外泌体结合的肿瘤相关复合N-聚糖以用于胰腺癌早期检测和诊断。(6).计数循环肿瘤相关复合N-聚糖阳性外泌体的数量以用于早期检测和诊断胰腺癌，监测肿瘤复发和肿瘤对治疗剂的反应并做出治疗决定(如估计临床分期和预测预后)；这将使用Exo-Flow方法完成(首先将外泌体俘获在较大的磁珠上，用针对肿瘤相关复合N-聚糖的抗体和与荧光染料缀合的第二抗体染色，且然后使用流式细胞术方法进行定量)。(7).研究胰腺癌检测和诊断中肿瘤相关复合N-聚糖阳性外泌体中所含的miRNA及其他组分。(8).将胰腺癌研究扩展到其他类型的肿瘤-直肠癌、肺癌、胃癌和卵巢癌。(9).鉴定肿瘤相关复合N-聚糖呈递蛋白或脂质，以加深对肿瘤相关复合N-聚糖在肿瘤起始和发展以及进展中的生物学功能的理解；初步研究显示在用mAb M9A12染色后在蛋白质印迹上分子量高于60的多个键，从而表明多种蛋白质或脂质可呈递肿瘤相关复合N-聚糖。(10)用相似的ExoELISA测定检测并测量胰腺癌患者的血清中外泌体结合的CA 19-9，以观察其是否能够提高肿瘤诊断灵敏度和特异性。

实施例6.用于卵巢癌检测和诊断的ExoELISA测定。

目前，CA-125是用于卵巢癌检测和诊断的最佳可用标志物。然而，达20％的卵巢癌(主要是粘液癌)缺乏CA125抗原的表达。此外，临床中常用的CA-125ELISA测定错过50％的早期(1期)卵巢癌，并且在患有良性疾病如憩室炎、子宫内膜异位症、肝硬化、妊娠和子宫肌瘤的患者中具有显著假阳性率。因此，迫切需要用于卵巢癌的更灵敏和特异性的生物标志物和基于血清的测定。

在此研究中，评估了血清外泌体结合的肿瘤相关复合N-聚糖对卵巢癌的诊断价值。将卵巢癌组中的血清外泌体结合的肿瘤相关复合物N-聚糖量与健康对照组和卵巢良性疾病组进行比较。接下来，评估用于早期(1期)卵巢癌检测和诊断的测量血清外泌体结合的肿瘤相关复合N-聚糖的可行性。在卵巢癌诊断中，CA-125测试错过50％的早期疾病患者。此外，探索了测量来自粘液性卵巢肿瘤患者的血清中的外泌体结合的肿瘤相关复合N-聚糖的可能性。CA-125测试不适用于粘液型卵巢癌患者，因为它们缺乏CA-125抗原表达。

如图1A和图3中所示，在卵巢癌细胞的表面上检测到新颖肿瘤抗原，即具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖，并且mAb M9A12强烈染色超过80％的卵巢癌组织。用mAb M9A12进行正常卵巢组织、交界性癌组织和癌组织的免疫组织化学染色以鉴定mAbM9A12在卵巢癌中的特异性(图10)。浆液性癌(图10A、图10B)和粘液性癌(图10C、图10D)用mAb M9A12强烈染色。交界组织样品用mAb M9A12微弱地染色(图10E)。正常卵巢组织未明显地用mAb M9A12染色。最令人感兴趣的是，已经检测到并定量地测量了外泌体结合的肿瘤相关复合N-聚糖，其中来自卵巢癌患者的血清中的水平升高(图11)。

实施例7.mAb M9A12构建体。

mAb M9A12可用于产生双特异性T细胞衔接(BiTE)抗体。mAb M9A12的可变区可经由接头缀合至CD3抗体的可变区(图13)。接头可以是(G₄S)₄接头。这种抗体经由CD3抗体结合至T细胞，并且经由M9A12抗体结合至肿瘤细胞。这种双重结合使T细胞接近以选择性地攻击肿瘤细胞。

也可产生具有mAb M9A12的嵌合抗原受体(CAR)。这种构建体包含mAb M9A12单链可变片段(scFv)、增强T细胞增殖的刺激性配体以及T细胞受体(图14)。增强T细胞增殖的刺激性配体可以是CD28和4-1BB。T细胞受体可以是CD3ζ。图15中描绘了这种构建体的使用，其示出使用CAR工程化T细胞的过继细胞转移疗法。

序列表

<110> WASHINGTON UNIVERSITY

XU, Mai

<120> 针对具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖的抗体及其使用方法

<130> 047563-548559

<150> 62/192,750

<151> 2015-07-15

<160> 14

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 1

Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His

1 5 10

<210> 2

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 2

Glu Ile Ser Lys Leu Ala Ser

1 5

<210> 3

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 3

Gln Gln Trp Asn Tyr Pro Leu Tyr Thr

1 5

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<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 4

Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Gly Met Ala

1 5 10

<210> 5

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 5

Phe Ile Ser Tyr Leu Ala Tyr Thr Val Phe Tyr Ala Asp Thr Val Thr

1 5 10 15

Gly

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 6

Glu Ala Tyr Gly Gly Gly Phe Thr Tyr

1 5

<210> 7

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 7

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Thr Ala Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr

35 40 45

Glu Ile Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Ile Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Asn Tyr Pro Leu Tyr Thr

85 90 95

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100 105

<210> 8

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 8

Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Arg Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr

20 25 30

Gly Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val

35 40 45

Ala Phe Ile Ser Tyr Leu Ala Tyr Thr Val Phe Tyr Ala Asp Thr Val

50 55 60

Thr Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Glu Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ser Arg Glu Ala Tyr Gly Gly Gly Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val

115

<210> 9

<211> 318

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 9

gaaattgtgc tcactcagtc tccagccatc acagctgcat ctctggggca aaaggtcacc 60

atcacctgca gtgccagctc aagtgtaagt tacatgcact ggtaccagca gaagtcaggc 120

acctccccca aaccatggat ttatgaaata tccaaactgg cttctggagt cccagctcgc 180

ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttac tctctcacaa tcagcagcat ggaggctgaa 240

gatgctgcca tttattactg ccagcagtgg aattatcctc tgtacacgtt cggagggggg 300

accaagctgg aaataaaa 318

<210> 10

<211> 348

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 10

gaggtgaagt tggtggagtc tgggggaggc ttagtgcagc ctggagggtc ccggaaactc 60

tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt gactacggaa tggcgtgggt tcgacaggct 120

ccagggaagg ggcctgagtg ggttgcattc attagttatt tggcatatac tgtcttctat 180

gcagacactg tgacgggccg attcaccatc tctagagaga atgccaaaaa caccctgtac 240

ctggaaatga gcagtctgag gtctgaggac acagccatgt actactgttc aagggaggcg 300

tacgggggag ggtttactta ctggggccaa gggactctgg tcactgtc 348

<210> 11

<211> 1386

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 11

atggacttca ggctcagctt acttattttt gtccttattt taaaaggtgt ccagtgtgag 60

gtgaagttgg tggagtctgg gggaggctta gtgcagcctg gagggtcccg gaaactctcc 120

tgtgcagcct ctggattcac tttcagtgac tacggaatgg cgtgggttcg acaggctcca 180

gggaaggggc ctgagtgggt tgcattcatt agttatttgg catatactgt cttctatgca 240

gacactgtga cgggccgatt caccatctct agagagaatg ccaaaaacac cctgtacctg 300

gaaatgagca gtctgaggtc tgaggacaca gccatgtact actgttcaag ggaggcgtac 360

gggggagggt ttacttactg gggccaaggg actctggtca ctgtctctgc agccaaaacg 420

acacccccat ctgtctatcc actggcccct ggatctgctg cccaaactaa ctccatggtg 480

accctgggat gcctggtcaa gggctatttc cctgagccag tgacagtgac ctggaactct 540

ggatccctgt ccagcggtgt gcacaccttc ccagctgtcc tgcagtctga cctctacact 600

ctgagcagct cagtgactgt cccctccagc acctggccca gcgagaccgt cacctgcaac 660

gttgcccacc cggccagcag caccaaggtg gacaagaaaa ttgtgcccag ggattgtggt 720

tgtaagcctt gcatatgtac agtcccagaa gtatcatctg tcttcatctt ccccccaaag 780

cccaaggatg tgctcaccat tactctgact cctaaggtca cgtgtgttgt ggtagacatc 840

agcaaggatg atcccgaggt ccagttcagc tggtttgtag atgatgtgga ggtgcacaca 900

gctcagacgc aaccccggga ggagcagttc aacagcactt tccgctcagt cagtgaactt 960

cccatcatgc accaggactg gctcaatggc aaggagttca aatgcagggt caacagtgca 1020

gctttccctg cccccatcga gaaaaccatc tccaaaacca aaggcagacc gaaggctcca 1080

caggtgtaca ccattccacc tcccaaggag cagatggcca aggataaagt cagtctgacc 1140

tgcatgataa cagacttctt ccctgaagac attactgtgg agtggcagtg gaatgggcag 1200

ccagcggaga actacaagaa cactcagccc atcatggaca cagatggctc ttacttcgtc 1260

tacagcaagc tcaatgtgca gaagagcaac tgggaggcag gaaatacttt cacctgctct 1320

gtgttacatg agggcctgca caaccaccat actgagaaga gcctctccca ctctcctggt 1380

aaatga 1386

<210> 12

<211> 461

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 12

Met Asp Phe Arg Leu Ser Leu Leu Ile Phe Val Leu Ile Leu Lys Gly

1 5 10 15

Val Gln Cys Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln

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Pro Gly Gly Ser Arg Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe

35 40 45

Ser Asp Tyr Gly Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro

50 55 60

Glu Trp Val Ala Phe Ile Ser Tyr Leu Ala Tyr Thr Val Phe Tyr Ala

65 70 75 80

Asp Thr Val Thr Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn

85 90 95

Thr Leu Tyr Leu Glu Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ser Arg Glu Ala Tyr Gly Gly Gly Phe Thr Tyr Trp Gly

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130 135 140

Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val

145 150 155 160

Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

165 170 175

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180 185 190

Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro

195 200 205

Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro

210 215 220

Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly

225 230 235 240

Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile

245 250 255

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260 265 270

Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln

275 280 285

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290 295 300

Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu

305 310 315 320

Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg

325 330 335

Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys

340 345 350

Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro

355 360 365

Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr

370 375 380

Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln

385 390 395 400

Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly

405 410 415

Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu

420 425 430

Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn

435 440 445

His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys

450 455 460

<210> 13

<211> 702

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 13

atggactttc gggtgcagat tttcagcttc ctgctaatca gtgtcacagt gtccagagga 60

gaaattgtgc tcactcagtc tccagccatc acagctgcat ctctggggca aaaggtcacc 120

atcacctgca gtgccagctc aagtgtaagt tacatgcact ggtaccagca gaagtcaggc 180

acctccccca aaccatggat ttatgaaata tccaaactgg cttctggagt cccagctcgc 240

ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttac tctctcacaa tcagcagcat ggaggctgaa 300

gatgctgcca tttattactg ccagcagtgg aattatcctc tgtacacgtt cggagggggg 360

accaagctgg aaataaaacg ggctgatgct gcaccaactg tatccatctt cccaccatcc 420

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aaagacatca atgtcaagtg gaagattgat ggcagtgaac gacaaaatgg cgtcctgaac 540

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accaaggacg agtatgaacg acataacagc tatacctgtg aggccactca caagacatca 660

acttcaccca ttgtcaagag cttcaacagg aatgagtgtt ag 702

<210> 14

<211> 233

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 14

Met Asp Phe Arg Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Val Thr

1 5 10 15

Val Ser Arg Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Thr Ala

20 25 30

Ala Ser Leu Gly Gln Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser

35 40 45

Val Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys

50 55 60

Pro Trp Ile Tyr Glu Ile Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg

65 70 75 80

Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser

85 90 95

Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Ile Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Asn Tyr

100 105 110

Pro Leu Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala

115 120 125

Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu

130 135 140

Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro

145 150 155 160

Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn

165 170 175

Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr

180 185 190

Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His

195 200 205

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210 215 220

Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys

225 230

Claims (27)

1.一种分离的抗体，其中所述抗体特异性地结合具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖并且识别所述肿瘤相关复合N-聚糖内的表位。

2.如权利要求1所述的分离的抗体，其中所述抗体包含SEQ ID NO：8中列出的氨基酸序列。

3.如权利要求1所述的分离的抗体，其中所述抗体包含SEQ ID NO：7中列出的氨基酸序列。

4.如权利要求1所述的分离的抗体，其中所述抗体由包含选自由SEQ ID NO：9和SEQ IDNO：10组成的组的核酸序列的核酸序列编码。

5.一种分离的抗体，其中所述抗体特异性地结合具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖，并且包含重链CDR3，所述重链CDR3包含具有0至2个氨基酸取代的SEQ ID NO：6的氨基酸序列。

6.一种分离的抗体，其中所述抗体特异性地结合具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖，并且包含轻链CDR3，所述轻链CDR3包含具有0至2个氨基酸取代的SEQ ID NO：3的氨基酸序列。

7.一种分离的抗体，其中所述抗体特异性地结合具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖，并且包含轻链CDR1，所述轻链CDR1包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列；轻链CDR2，所述轻链CDR2包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列；轻链CDR3，所述轻链CDR3包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列；重链CDR1，所述重链CDR1包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列；重链CDR2，所述重链CDR2包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列；以及重链CDR3，所述重链CDR3包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列。

8.如前述权利要求中任一项所述的分离的抗体，其中所述抗体是选自由以下各项组成的组：单链抗体、抗体片段、嵌合抗体、人源化抗体、双特异性T细胞衔接器(BiTE)抗体或嵌合抗原受体(CAR)。

9.如权利要求8所述的分离的抗体，其中所述抗体是BiTE并且还包含抗CD3 scFv。

10.如权利要求8所述的分离的抗体，其中所述抗体是CAR并且还包含来自CD3-ζ(CD3ζ)的细胞内结构域。

11.如权利要求10所述的分离的抗体，其中所述CAR还包含CD28和41BB。

12.如权利要求8所述的分离的抗体，其中所述抗体缀合至选自由以下各项组成的组的有效负载：治疗剂、可检测标记以及递送装置。

13.一种免疫测定，其包括至少一种如前述权利要求中任一项所述的分离的抗体。

14.一种测量生物样品中具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖的量的方法，所述方法包括使用至少一种特异性地结合具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖的分离的抗体来测量从受试者获得的生物样品中具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖的所述量，其中所述抗体包含具有0至2个氨基酸取代的选自由SEQ ID NO：1-6组成的组的氨基酸序列。

15.如权利要求14所述的方法，其中所述生物样品是选自由以下各项组成的组：血液、血浆、血清、唾液、痰、腹水、眼泪、胃肠道粘液、胸腔积液以及尿液。

16.如权利要求14所述的方法，其还包括在测量所述样品中的具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖的量之前，从所述生物样品分离外泌体。

17.一种检测受试者的肿瘤的方法，所述方法包括：

a)使用至少一种特异性地结合具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖的分离的抗体来测量从受试者获得的生物样品中具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖的量，其中所述抗体包含具有0至2个氨基酸取代的选自由SEQ ID NO：1-6组成的组的氨基酸序列；以及

b)将所述样品中具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖的量与参考值进行比较，其中与所述参考值相比，所述样品中更大量的具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖指示所述受试者中肿瘤的存在。

18.如权利要求17所述的方法，其中所述生物样品是选自由以下各项组成的组：血液、血浆、血清、唾液、痰、腹水、眼泪、胃肠道粘液、胸腔积液以及尿液。

19.如权利要求17所述的方法，其还包括在测量所述样品中的具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖的量之前，从所述生物样品分离外泌体。

20.如权利要求19所述的方法，其中用珠粒或磁珠从所述生物样品分离所述外泌体，所述珠粒或磁珠涂覆有针对诸如CD9、CD61、CD63、CD81、Alix以及TSG101等外泌体生物标志物的抗体。

21.如权利要求17所述的方法，其中所述肿瘤是选自由以下各项组成的组：胰腺肿瘤、卵巢肿瘤、肺肿瘤、胃肿瘤、结肠肿瘤、乳腺肿瘤、前列腺肿瘤和食管肿瘤以及舌/咽/喉肿瘤。

22.一种监测受试者对肿瘤治疗的反应的方法，所述方法包括：

a)使用至少一种特异性地结合具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖的分离的抗体来测量从受试者获得的生物样品中具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖的量，其中所述抗体包含具有0至2个氨基酸取代的选自由SEQ ID NO：1-6组成的组的氨基酸序列；

b)在开始治疗之后使用至少一种特异性地结合具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖的分离的抗体来测量从所述受试者获得的第二生物样品中具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖的量，其中所述抗体包含具有0至2个氨基酸取代的选自由SEQ ID NO：1-6组成的组的氨基酸序列；以及

c)将所述第一样品中的所述具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖的量与所述第二样品中的具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖的量进行比较，其中与所述第一样品中的具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖的量相比，所述第二样品中的具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖的量的变化指示对治疗的反应。

23.如权利要求21所述的方法，其中具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖的量的减少指示肿瘤大小的减小并且因此指示肿瘤消退。

24.如权利要求21所述的方法，其中具有末端GlcNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖的量的增加指示肿瘤大小的增加并且因此指示肿瘤进展。

25.如权利要求21所述的方法，其中所述生物样品是选自由以下各项组成的组：血液、血浆、血清、唾液、痰、腹水、胸腔积液以及尿液。

26.如权利要求21所述的方法，其还包括在测量所述样品中的具有末端G1cNAcβ残基的肿瘤相关复合N-聚糖的量之前，从所述生物样品分离外泌体。

27.如权利要求21所述的方法，其中所述肿瘤是选自由以下各项组成的组：胰腺肿瘤、卵巢肿瘤、肺肿瘤、胃肿瘤、结肠肿瘤和食管肿瘤以及舌/咽/喉肿瘤。