CN101189266A - 显示cd63表面表达的细胞毒性介导 - Google Patents

Abstract

本发明涉及癌症的诊断和治疗，特别涉及肿瘤细胞的细胞毒性的介导；最特别涉及任选与一种或多种化疗剂联合使用的癌症调节抗体(CDMAB)的用途，作为启动细胞毒性反应的方法。本发明进一步涉及使用本发明CDMAB的结合测定。

Description

显示CD63表面表达的细胞毒性介导

技术领域

本发明涉及癌症的诊断和治疗，特别涉及肿瘤细胞的细胞毒性的介导；最特别涉及癌症调节抗体(CDMAB)(任选与一种或多种化疗剂联合使用)的用途，作为启动细胞毒性反应的方法。本发明进一步涉及使用本发明CDMAB的结合测定。

背景技术

癌症中的CD63：CD63是四次跨膜蛋白超家族(tetraspanin)的III型膜蛋白，所述四次跨膜蛋白超家族的20个现有成员的特点是具有四个跨膜片段。几个工作组使用针对活化的血小板、粒细胞和黑素瘤细胞的全细胞制品产生的抗体，各自独立鉴定了CD63。其同族糖蛋白抗原的各自cDNA的克隆，发现所述不同抗原为同一种分子。随后，第六届国际白细胞分型研讨会(The Sixth InternationalWorkshop on Leukocyte Typing，1996)将这些抗体分类为CD63抗体。在1996年的研讨会之前，已知CD63有多个名称(黑素瘤1抗原、眼黑素瘤相关抗原、黑素瘤相关抗原ME491、溶酶体相关膜糖蛋白3、granulophysin、黑色素相关抗原MLA1)，这些命名往往与导致其部分表征和鉴定的抗体有关。因此，CD63也被命名为ME491抗原(MAb ME491)、神经腺(neuroglandular)抗原(MAb LS59、LS62、LS76、LS113、LS140和LS152)、PItgp40(MAb H5C6、H4F8和H5D2)、人类髓质基质细胞抗原(MAb 12F12)、骨祖细胞特异性标志物(MAbHOP-26)和整联蛋白相关蛋白(MAb 6H1)。发现与人体CD63交叉反应的其他抗体有8-1H、8-2A(与ME491交叉反应)、NKI/C-3和NKI/black-13(Vannegoor和Rumke，1986；Demetrick等，1992；Wang等，1992)。

首先使用MAb ME491(针对人体黑素瘤细胞产生的许多抗体的一种)从黑素瘤cDNA文库克隆了CD63。人体黑素瘤活组织检查研究中表明：MAb ME491的反应性表现出与黑素瘤进程反相相关。ME491抗体的反应性在正常黑色素细胞中是低的，在黑素瘤进程早期(包括发育不良痣和辐射状生长期(RGP)肿瘤)较高，并在更晚期的黑素瘤肿瘤(例如在垂直生长期(VGP)和转移性肿瘤中的那些)中降低或甚至没有。

使用MAb2.28(针对活化血小板产生)在人血小板中发现并部分表征了CD63，MAb2.28检测到了活化依赖性的血小板膜53kDa糖蛋白。该分子还与未活化血小板内部颗粒的膜相关联。同一研究中，MAb2.28还标记了巨核细胞和内皮细胞的内部颗粒，在所述细胞中，MAb2.28与抗体共定位至蛋白酶D(已知的溶酶体区室标志物)。使用抗体群集和克隆表达继续研究，鉴定了被该抗体识别为CD63的抗原，并进一步证实了其在溶酶体区室中的存在，在那里其与区室特异性标志物LAMP1和LAMP2被共定位。该分子的克隆将其鉴定为CD63，并使其包括于四次跨膜蛋白超家族。

在许多不同组织和细胞类型中检测到了CD63的表达。在细胞水平上，发现其与质膜相关联，并且还与细胞内晚期内体的囊状结构有关。某些情况下，细胞活化导致经由细胞内储备CD63的动员而增加的表面表达。还发现CD63与MHC-II类分子共定位(且生理上相关联)于B淋巴细胞中，特别是内体中、参与外运MHC-II类复合体至表面的外体中和分泌的小泡中。发现CD63在许多细胞类型(包括B和T淋巴细胞、中性粒细胞、乳腺癌和黑素瘤细胞)中与四次跨膜蛋白超家族的其他成员相互作用，所述其他成员例如CD9、CD81、CD11(整联蛋白链α_M，L，X)、CD18(整联蛋白链β₂)、CD49c(VLA-3或整联蛋白链α₃)、CD49d(整联蛋白链α₄)、CD49f(VLA-6或整联蛋白链α₆)和CD29(整联蛋白链β₁)。

还不清楚CD63在肿瘤性疾病中的作用。尽管几个相互独立的工作组最初发现CD63参与各种事件，例如血小板和中性粒细胞活化、MHC-II类抗原呈递、整联蛋白依赖性细胞粘附和游动性以及某些类型癌症中的肿瘤进程，但其功能还有待完全阐明。虽然目前证据支持CD63在多种细胞生理事件中的作用，但还不清楚这些功能是否相互独立，或者是否存在涉及CD63的潜在的共同细胞学机制。

几个工作组已经考察了CD63和某些类型肿瘤(特别是黑素瘤)进程之间的关联。除Mab ME491之外，还研发了许多其他的抗CD63单克隆抗体(以下简称单克隆抗体)，用于来自不同进程阶段肿瘤患者的肿瘤样品的免疫组织化学(IHC)染色。发现：被作者解释为最可能反映减少的CD63表达的减少的染色与晚期进程和肿瘤的转移特征相关联。更近期的研究也描述了几个四次跨膜蛋白超家族成员(包括CD63)明显下降的表达水平(mRNA定量之后)与几种乳腺癌衍生细胞系体外侵袭之间的显著关联。另一研究通过差异展示在经受了雌激素消除的培养乳腺癌细胞中鉴定了CD63。这表明：CD63表达可以受激素水平的调节，而且改变的CD63丰度和/或功能也可能与乳腺肿瘤进程有关。

相反，使用抗CD63单克隆抗体MAb FC-5.01的研究揭示：其反应性表位变异表达于不同的正常组织。尽管发现该抗体识别了CD63，但其没有区分早期和包括转移性黑素瘤的更晚期黑色素(不同于MAb ME491)，这表明CD63抗原存在于这些更晚期的肿瘤，但其表位有一些可能在不同时期的肿瘤细胞中已经被掩蔽了。可能归因于CD63核心多肽的改变的翻译后修饰，或者归因于CD63与其他分子的相互作用，其可能已经影响了用于抗体识别和结合的特异性表位的可用性。这些研究结果支持了Si和Hersey(1993)所报道的发现，即使用抗CD63单克隆抗体NKI-C3的染色没有区分来自不同进程时期(例如初期、辐射状生长期、垂直生长期和转移性黑素瘤)的黑素瘤的组织切片。在其他研究中(Adachi等，1998；Huang等，1998)，尽管通过PCR定量对来自乳腺和非小细胞性肺癌的mRNA的分析揭示了两个四次跨膜分子超家族成员(CD9和CD82)的表达水平和肿瘤进程和患者预后之间存在显著关联，但没有发现CD63的这种关联，因为其在所有样品中的表达是相似的。这些明显矛盾的结果表明，缺乏有力和一致的数据能够明确证明CD63与癌症之间的关联。

到目前为止，近乎没有体内研究尝试建立CD63与该分子最终的肿瘤抑制剂功能之间的联系。其中一项研究中，当与亲本非CD63过表达细胞相比较，经皮下和腹腔注射入无胸腺小鼠的人CD63过表达的H-ras转化的NIH-3T3细胞显示了降低的恶性/肿瘤原性表型，如减小的肿瘤大小和转移潜力以及增加的存活时间所表明的。这表明人CD63在转化细胞中的存在可能抑制其恶性行为。更近期地，使用表达人CD63并被开发以诱导针对CD63耐受性的转基因小鼠模型的研究表明：在用融合至痘苗病毒的人CD63免疫后，可以抑制注射的人CD63-MHC-I类分子(H-2K^b)共转染的小鼠黑素瘤细胞系的肿瘤生长，并可以增加存活。作者表明这种治疗作用是T淋巴细胞依赖性的，并且内源性抗CD63抗体似乎并未参与这种保护作用，因为肿瘤生长的抑制作用仅在动物用CD63-MHC-I类分子共转染的细胞(而不是CD63单独转染的细胞)注射时发生。这一解释得到下述事实的支持：在预先使用纯化人CD63免疫并显示已经产生抗CD63抗体的野生型动物中，没有针对肿瘤细胞生长的保护性作用。Radford等(1995年)描述的使用经人CD63转染的KM3细胞系(最初认为是人类来源，后来鉴定为鼠谱系)的研究表明：尽管各种转染和未转染细胞系的体外生长率并无显著差异，但是当皮内注射肿瘤细胞至无胸腺小鼠时，与未转染的KM3亲代细胞相比较，该蛋白的表达减少了肿瘤细胞生长和转移潜力。这些发现表明了CD63比其他已知肿瘤抑制基因突出的影响体内和体外肿瘤细胞生长率的潜在作用。此外，在体外测定中发现通过减少细胞随机游动性而对相同细胞具有功能性作用的抗CD63单克隆抗体ME491(Radford等，1997)的添加没有影响其体外生长速度。

该研究还描述了如下发现：CD63可以促进相应于细胞外基质(ECM)衍生的化学引诱物(例如层粘连蛋白、纤维连接蛋白、胶原和玻璃粘连蛋白)的迁移，尽管针对整联蛋白的抗体不能阻滞这些作用，但该作用可以由β₁型整联蛋白的功能性参与来调节。然而，玻璃粘连蛋白介导的信号传导(已知为整联蛋白α_vβ₅的配体)的作用与CD63转染细胞上其他ECM组分(例如层粘连蛋白、纤维连接蛋白合胶原)所介导的信号传导的作用之间存在拮抗效应。这表明在特定条件下，存在ECM时，CD63的表达可以导致降低的迁移，并且其可能依赖于粘附与游动性之间的精细平衡。另一研究中，抗CD63单克隆抗体(MAb 710F)提高了经PMA处理的HL-60细胞的粘附和散布，而另一抗CD63单克隆抗体(Mab 2.28)促进了类似的作用，但是仅作用于小很多比例的细胞，而且仅当以大的多量添加时。这些结果显示：尽管已经研发了多种抗CD63抗体，但是它们的功能作用可以是非常不同的。

四次跨膜蛋白超家族还可以参与细胞增殖。Oren等(1990年)描述了识别CD81(TAPA-1)的小鼠MAb 5A6对淋巴细胞系的抗增殖作用。另一研究中，人类T淋巴细胞的CD37与抗体的连接阻滞了CD37诱导的增殖。更近期地，使用CD37表达缺陷(CD37敲除)的动物模型的研究揭示：在相应于刀豆蛋白A活化和CD3/T细胞受体接合中，来自该动物的T淋巴细胞与来自野生型动物的T淋巴细胞相比较是高度增殖的。因此提出：在细胞生长和增殖中的功能作用可能是四次跨膜蛋白超家族的共同特性。使用肝胚细胞癌和肝细胞癌细胞的近期研究显示，这些细胞与抗CD81单克隆抗体的接合导致Erk/MAP激酶途径的活化。已经显示该信号转导途径参与细胞生长和增殖事件。在平行研究中，经转染的过表达人CD81的细胞系相对于模拟转染对照组细胞显示出增加的增殖。因此，可获得的证据已经指出了四次跨膜蛋白超家族(一般而言)和CD63(具体而言)在与细胞生长增殖、粘附/游动性相关的事件中的作用。目前，这两类细胞事件是重点研究的目标，因其在肿瘤进程和转移中起重要作用。

目前为止，还没有特异性靶向CD63表达细胞的抗CD63抗体或者其它试剂被报道并显示同时影响肿瘤细胞的体外和体内生长特性和肿瘤细胞生长动物模型的存活时间。

氨基酸序列测定和分析没有揭示四次跨膜蛋白超家族与其它蛋白质家族之间的同源性，或具有任何以前经鉴定的功能模块，也没有显示任何之前已知的酶活性。因此，很难考察该蛋白质家族在调节信号转导途径中的作用。然而，使用导致细胞生理改变的四次跨膜蛋白超家族特异性试剂(其紧密依赖于信号转导途径的调节)所生成的证据表明：四次跨膜蛋白超家族具有信号转导性质。CD63在生理和/或功能上均显示出与许多分子的关联，所述分子本身是参与产生次级信使信号的酶或者与这类酶在生理和/或功能上有关联。

设计以剖析中性粒细胞和内皮细胞之间相互作用(其为炎症反应的起始步骤之一)的控制机制的实验揭示：使用几种抗CD63单克隆抗体(AHN-16、AHN-16.1、AHN-16.2、AHN-16.3和AHN-16.5)对中性粒细胞的预处理促进了其对培养内皮细胞层的粘附。而且，该作用强烈依赖于钙离子(Ca²⁺)的存在，钙离子是公知的多种细胞内信号传导途径的调节剂并且限于细胞暴露于刺激性抗体过程的特定时期。经过较长暴露于抗体之后，中性粒细胞对内皮细胞的粘附对后来添加的钙离子变得不敏感，从而表明了动态和临时调节的(短暂的)事件。另外，发现CD63与CD11/CD18复合体物理相互作用，并且特异性靶向该复合体的试剂介导了调节信号。在该研究中还发现，CD63与包括了酪氨酸激酶Lck和Hck的复合体有物理关联或者是其部分。所述酶是一类蛋白质的成员，其在特异性细胞表面受体活化后的介导细胞内调节信号中起重要作用，并且是导致细胞特异性生理变化的信号传导途径级联的部分。另一项研究也表明，四次跨膜蛋白超家族(包括CD63)与单克隆抗体的共连接可以增强黏着斑激酶(FAK)的磷酸化或活性，所述黏着斑激酶是由MDA-MB-231乳腺癌细胞对胶原底物的粘附所诱导的。这指出CD63(和其它四次跨膜蛋白超家族成员)直接参与调节整联蛋白介导的酪氨酸激酶信号转导途径。可与表面CD63的出现和经由抗CD63单克隆抗体MAb710F的连接功能上交叉的信号传导途径是那些依赖于蛋白激酶C(PKC)磷酸化的调节的途径，所述蛋白激酶C是另一公知的细胞内信号传导途径的调节剂。在该上下文中，经由MAb 710F的髓质样细胞系的粘附和形态改变的增强依赖于豆蔻酸-佛波醇-乙酸酯(PMA)对所述细胞的预处理，但PKC的短暂参与并没有能够得到最终证实。然而，独立工作组的后期研究证明了PMA诱导的HL-60分化是PKC活性依赖性的，因为Ro31-8220分子(该酶的特异性抑制剂)阻滞了PMA的作用。

支持CD63以及其它四次跨膜蛋白超家族成员与信号传导途径关联的进一步证据产生于下述研究：该研究描述了CD63(和CD53)分子与酪氨酸磷酸化激酶活性之间的物理关联，或直接关联或作为超分子复合体的部分。在该研究中，利用抗CD63抗体分离的免疫沉淀复合体显示与酪氨酸磷酸酶活性有关，但CD53不同，其显示与与酪氨酸磷酸酶CD45有关，不可能鉴定CD63相关的磷酸酶。更近期还发现几个四次跨膜蛋白超家族的成员与磷脂酰肌醇4-激酶(II型PI4-K)有关联(Berditchevski等，1997)。这种相互作用表现的非常特异性，因为仅仅在CD9、CD63、CD81、CD151和A15/TALLA中得到了证实，在CD37、CD52、CD82或NAG-2中并没有发现。另外，由于每个含有PI-4激酶的复合体限于单个四次跨膜蛋白超家族成员，所以四次跨膜蛋白超家族成员和PI4-K之间的作用相互间是唯一的。特别的，不同于其它四次跨膜蛋白超家族成员，发现CD63-PI-4激酶复合体几乎完全位于脂膜筏样(lipid raft-like)结构域的细胞内区室中。这一发现表明，与PI-4的相互作用的CD63部分可能已经参与了有关于或依赖于磷酸肌醇的生物合成途径的特异性细胞内事件(Claas，C，等，2001)，磷酸肌醇生物合成途径除了作为次级信号传导分子外的功能外，还公知参与调节细胞膜转运(内吞和胞吐)以及细胞骨架的重组(Martin，T.，1998)。

到目前为止发现的和CD63直接相关的所有酶在调节信号传导途径中的直接和重要的参与提供了进一步的证据，支持了CD63作为调节剂或作为这些酶活性下游的效应分子与调节信号传导途径的关联。

阐明导致肿瘤进程的机制是非常困难和复杂的工作，经常被很多明显的相互矛盾的发现所掩盖，因此很少能够把那些发现成功转化成有效的疗法。从有关CD63与肿瘤进程以及转移和与信号转导机制之间关联的目前已知的来看，在肿瘤细胞内改变CD63的功能是可能的。

对肿瘤细胞具有细胞毒作用的抗原特异性试剂的开发作为潜在的治疗或诊断工具将是极其有益的，所述试剂结合表达识别抗原的细胞，并且通过自身或与其它分子结合而具有细胞或体内的生理学活性，以便这些试剂抑制细胞生长、进程和转移，且对正常人体细胞群无显著的损伤作用。

作为癌症治疗的单克隆抗体：每一患有癌症的个体都是独特的，跟其身份一样，每个人所患的癌症都不同于其它癌症。尽管如此，现有疗法都是在同样的时期、以同样的方式来治疗患有同种癌症的患者。至少30％的患者的一线治疗是失败的，从而增加了额外的疗程以及治疗失败、病毒转移和最终死亡的可能性。治疗的优选方法将是针对特定个体的个性化治疗。目前唯一的个性化治疗方法是手术。化学治疗和放射治疗无法针对患者具体情况，而在大多数情况下单靠手术不足以治愈癌症。

随着单克隆抗体的出现，开发个性化治疗方法的可能性变得更加现实，因为每个抗体能够针对单一的抗原表位。而且，也可以生产针对多个相关抗原表位的组合抗体，所述多个相关抗原表位唯一确定了某一特定个体的肿瘤。

已经认识到癌细胞和正常细胞之间的显著差别是癌细胞含有对变异细胞来说具有特异性的抗原，科技界长期认为：通过与癌抗原特异性结合，单克隆抗体能够被设计来特异靶向变异细胞；因此产生了这样的观点：单克隆抗体能够作为“神奇子弹(Magic Bullets)”来消灭癌细胞。然而，现在普遍认为：没有一个单克隆抗体能够用于所有的癌症，单克隆抗体可以作为一类被开发为目标癌症的疗法。依照本发明方法分离的单克隆抗体已经显示出通过对患者有益的方式(如通过降低肿瘤负荷)来调节癌症过程，在本文将被称为癌症调节抗体(CDMAB)或“抗癌”抗体。

目前，癌症的治疗手段很少。已有的癌症治疗方法已经对全球的癌症存活率有所改善。然而，对于特定个体而言，这些改善的统计数据与他们的个人状况不是必然相关的。

因此，如果有一种方法学能够使医师单独处理同类肿瘤患者的每个肿瘤，将使每个患者可以用适合自己的独特方法进行治疗。理论上，这种治疗过程将提高治愈率，产生更好的结果，从而满足人们长期感受到的需要。

过去，多克隆抗体已经被应用于人类癌症的治疗，但只取得了有限的成功。已经用人血浆来治疗淋巴瘤和白血病，但是很少获得持久的改善或应答。而且，缺乏重现性，也没有比化疗多出额外的优点。实体瘤(如乳癌、黑素瘤和肾细胞癌)也已经采用人血液、猩猩血清、人血清和马血清来治疗，但是相应的结果是不确定的和无效的。

有很多用单克隆抗体治疗实体瘤的临床实验。在20世纪80年代，对人乳腺癌进行了至少4次利用抗体针对特异抗原或基于组织选择性的临床实验，在至少47例患者中只产生了1例应答者。直至1998年，才有1次成功的临床实验，该实验联合使用了人源化的抗Her2/neu抗体(HERCEPTIN)和顺铂(顺铂)。在这次实验中，评价了37例患者的反应，其中约1/4患者具有部分缓解率(partialresponse rate)，还有1/4患者疾病进展轻微或稳定。应答者中的中位肿瘤进程时间(median time to progression)为8.4个月，中位缓解期(median response duration)为5.3个月。

Herceptin于1998年被批准一线用药，与Taxol结合使用。临床研究结果显示了中位肿瘤进程时间的增加，接受抗体治疗+Taxol的患者(6.9个月)与只接受了Taxol治疗的患者(3.0个月)相比较。中位存活时间也有所增加，HERCEPTIN+Taxol治疗方式为22个月，Taxol单独治疗为18个月。另外，抗体+Taxol联合治疗组与Taxol单独治疗组相比，完全应答者(8％∶2％)和部分应答者(34％∶15％)的数目都有所增加。但是，采用抗体+Taxol治疗相比于Taxol单独治疗，导致了较高的心脏毒发病率(13％∶1％)。在临床实验中，Her2/neu的表达水平(通过免疫组织化学方法测定)预示了对Herceptin治疗的响应。在转移性乳腺癌患者中，只有那些过量表达Her2/neu的患者(在病理评分级指示为2-3+)从抗体治疗中获益。大约25％的转移性乳腺癌患者过量表达Her2/neu而能够用Herceptin治疗；那些没有过量表达的患者将不会获益，不能用抗体治疗。对Herceptin治疗的选择代表了一种选择患者的方法，所选患者适合于以疾病分子标志识别为基础的治疗，该方法作为诊断测验已经被美国FDA批准。但是，还远未满足乳腺癌患者的需求。甚至是那些能够从Herceptin治疗获益的患者，依然需要化疗并因此依然不得不面对(至少在某种程度上)这种疗法的副反应。

研究结肠直肠癌的临床实验涉及同时抗糖蛋白和糖脂类靶的抗体。对腺癌有一定特异性的抗体，如17-1A，已经进行了超过60例患者的2期临床实验，其中仅有1例患者有部分反应。在其他应用17-1A的实验中，使用了附加的环磷酰胺，52例受试患者中仅有1例完全反应和2例轻微反应。其它涉及17-1A的实验得到了类似的结果。目前为止，17-1A的3期临床实验没有证明其作为辅助疗法对III期结肠癌的改善效能。使用首次批准用于影像的人源化鼠单克隆抗体也没有产生肿瘤消退。

只有近期，在应用单克隆抗体的结肠癌临床研究中得到了一些正面的结果。2004年，ERBITUX被批准用于表达EGFR的转移性结肠癌患者的二线治疗，这些患者对基于依立替康(irinotecan)的化疗是耐受的。双臂II期临床研究和单臂研究的结果表明，ERBITUX与依立替康结合使用的缓解率分别为23％和15％，中位肿瘤进程时间分别为4.1个月和6.5个月。同样的双臂II期临床研究和另外一个单臂研究表明，ERBITUX单独治疗的缓解率分别为11％和9％，中位总瘤进程时间分别为1.5个月和4.2个月。

因此，ERBITUX与依立替康结合治疗在瑞士和美国，以及ERBITUX单独治疗。在美国，ERBITUX单独治疗已经被批准作为那些在依立替康一线治疗中失败的结肠癌患者的二线治疗。因此，与Herceptin一样ERBITUX治疗在瑞士只被批准作为单克隆抗体和化疗的联合使用。另外，在瑞士和美国，ERBITUX治疗都是被批准用于患者的二线疗法。在2004年，AVASTIN(阿瓦斯汀)也被批准与静注5-氟尿嘧啶为基础的化疗结合使用，作为转移性结肠癌的一线治疗。III期临床研究结果表明了患者中位存活时间的延长，AVASTIN+5-氟尿嘧啶治疗与5-氟尿嘧啶单独治疗相比较(分别为20个月和16个月)。然而，还是与Herceptin和ERBITUX一样，AVASTIN治疗只被批准作为单克隆抗体和化疗的结合使用。

对于肺癌、脑癌、卵巢癌、胰腺癌前列腺癌、胃癌和肝细胞癌的较差结果依然继续着。在II期临床实验中，得到了近期对于非小细胞癌最有希望的结果，其中治疗涉及了与细胞杀伤药物阿霉素交联的单克隆抗体(SGN-15；doxBR96，抗Sialyl-LeX)，与化学疗剂Taxotere结合使用。Taxotere是唯一经FDA批准用于肺癌二线治疗的化学疗剂。最初数据表明比单独使用Taxotere具有提高的总存活。该研究的62例受试患者中，三分之二接受了SGN-15和Taxotere结合应用，而留下三分之一接受单独的Taxotere。接受SGN-15和Taxotere结合应用的患者的中位总存活时间为7.3个月，而接受单独Taxotere的患者为5.9个月。对于接受SGN-15+Taxotere的患者在1年和18个月时的总存活分别为29％和18％，相比较的接受单独Taxotere的患者分别为24％和8％。为该药计划了进行了进一步的临床试验。

在潜伏期，使用单克隆抗体治疗黑色瘤的效果有限。到目前为止，这些抗体中很少有达到临床试验的阶段，没有一个单克隆抗体被批准，也没有证据表明单克隆抗体在III期临床试验中有令人满意的效果。

在与疾病发病明确有关的30000个已知基因的产物中，缺少相关变点的识别而阻碍了治疗疾病新药的发现。在肿瘤学研究中，潜在的药物靶点经常被容易的选出，因为它们在肿瘤细胞中过量表达。然后，将上述被识别的靶点与大量化合物进行相互作用筛选。对于可能的抗体治疗，这些候选化合物一般通过单克隆抗体生成的传统方法而获得，根据Kohler和Milstein制定的基本原理(1975，Nature，256，495-497，Kohler和Milstein)。脾细胞从抗原免疫小鼠中被收集(如全细胞、细胞组分、纯化的抗原)并与永生化杂交瘤配偶体融合。所得到的杂交瘤经过筛选，获得能分泌与靶点最有效结合的抗体的杂交瘤。许多导向抗癌细胞的治疗性和诊断性抗体(包括HERCEPTIN和RITUXIMAB)已经通过这些方法而被生成并基于它们与靶点的亲和力和特异性而被选择。这种方法的缺点有两方面。第一，对具体癌症过程的组织缺乏了解和方法的过分简单，选择适合用于治疗或诊断抗体结合的靶点受到限制，如高表达确认的靶点的选择。第二，和受体有最大亲和力结合的药物模型的假设非常可能激发或排除所述情况的信号。

尽管治疗肠癌和乳腺癌取得了一些进展，但是有效的抗体治疗的确认和进展，无论是单试剂或组合试剂，对于各种类型的癌症是不够的。

现有技术：

US05296348教导了用于选择特异性针对肿瘤细胞表面内化抗原的单克隆抗体的方法，和用于鉴定对细胞代谢具有抗转录和/或抗复制作用的单克隆抗体的方法。作为离子，显示ME491抗体在W9、WM35和WM983黑素瘤细胞以及SW948结直肠癌细胞中内化。此外，显示ME491降低了SW948细胞中的转录和细胞增殖。专利中请US20030211498A1(及其相关申请WO0175177A3、WO0175177A2、AU0153140A5)公开了一种使用与卵巢肿瘤标志多肽结合的抗体来抑制卵巢肿瘤生长和转移的方法，所述多肽由选自包括CD63抗原的一个组的卵巢肿瘤标志物基因所编码。利用卵巢癌进行了基因表达系列分析，来鉴定导致将CD63识别为候选物的卵巢肿瘤标志物基因。专利申请WO02055551A1(及其相关申请CN1364803A)公开了新的多肽，即人CD63抗原56.87。专利CN1326962A公开了新的多肽，即人CD63抗原14.63。专利申请CN1326951A公开了新的多肽，即人CD63抗原15.07。专利CN1351054A公开了新的多肽，即人CD63抗原11.11。这些专利和专利申请均鉴定了CD63抗原和抗体，但未公开本发明的分离的单克隆抗体，或者本发明的分离的单克隆抗体的应用。

编码ME491多肽抗原的基因被克隆并于1988年2月18日受到用于公开的序列(Can Res 48：2955，1988年6月1日)；编码CD63的基因被克隆并于1991年2月公开了序列(JBC 266(5)：3239-3245，1991)，并且所述公开清楚表明了ME491与CD63的同一性。

WO2004041170.89(序列ID No.：89，优选权申请日：2004年6月29日)、WO2003068268-A2(序列ID No.：1，优先权申请日：2003年2月13日(2003WO-EP001461)；其他优选权日：2002年2月14日(2002GB-00003480))、WO2003057160-A29(序列ID No.：40，优先权申请日：2002年12月30日(2002WO-US041798)；其他优先权日：2002年1月2日(2002US-0345444P))都公开了与CD63具有100％序列同源性的多肽。

WO2003016475-A2(序列ID No.：9787&12101，优先权申请日：2002年8月14日(2002WO-US025765)；其他优先权日：2001年8月14日(2001US-0312147P)公开了与包括CD63的238个氨基酸的237个氨基酸具有100％序列同源性的多肽。

WO2003070902-A2(序列ID No.：27，优先权申请日：2003年2月18日(2003WO-US004902)；其他优先权日：2002年2月20日(2002US-0358279P))公开了与包括CD63的238个氨基酸的224个氨基酸具有94％的序列同源性的多肽。

EP1033401-A2(序列ID No.：4168&4913，优先权申请日：2000年2月21日(2000EP-00200610)；其他优先权日：1999年2月26日(99US-0122487P))分别公开了与包括CD63的238个氨基酸的205个氨基酸和94个氨基酸具有100％的序列同源性的多肽。

WO200257303-A2(Human prey protein for Shigella ospG#26，优先权申请日：2002年1月11日(2002WO-EP000777)；其他优先权日：2001年1月12日(2001US-0261130P))公开了与包括CD63的238个氨基酸的130个氨基酸具有100％序列同源性的多肽。

WO200055180-A2(序列ID No.：756，优先权申请日：2000年3月8日(2000WO-US005918)；其他优先权日：1999年3月12日(99US-0124270P))公开了与包括CD63的238个氨基酸的127个氨基酸具有99％序列同源性的多肽。

W0200200677-A1(序列ID No.：3203，优先权申请日：2001年7月7日(2001WO-US018569)；其他优先权日：07-JUN-2000(2000US-0209467P))公开了与包括CD63的238个氨基酸的132个氨基酸具有97％序列同源性的多肽。

WO9966027-A1(来自人类CD63蛋白的大细胞外环序列(Largeextracellular loop sequence from human CD63 protein)，优先权申请日：1999年6月15日(99WO-US013480)；其他优先权日：1998年6月15日(98US-0089226P))公开了与包括CD63的238个氨基酸的99个氨基酸具有100％序列同源性的多肽。

WO200270539-A2(序列ID No.：1207，优先权申请日：2002年3月5日(2002WO-US005095)；其他优先权日：2001年3月5日(2001US-00799451))公开了与包括CD63的238个氨基酸的102个氨基酸具有86％序列同源性的多肽。

EP1033401-A2(序列ID No.：4169，2000年12月2日(2000EP-00200610)；其他优先权日：1999年2月26日(99US-0122487P))公开了与包括CD63的238个氨基酸的74个氨基酸具有100％序列同源性的多肽。

这些专利申请鉴定了与CD63抗原具有不同的序列同源性的多肽。在大多数情况下，这些申请还公开了相应多肽及其同系物的抗体和抗体衍生物，但没有公开本发明的分离的单克隆抗体，或者本发明的分离的单克隆抗体的应用。重要的是，所有上述申请都在编码CD63的多核苷酸公开之后提交的。

发明内容

概述

本发明人之前已经被授予题为“个体化患者特异性抗癌抗体(Individualized Patient Specific Anti-Cancer Antibodies)”的美国专利6,180,357，涉及用于选择用于治疗癌症的个体化的抗癌抗体的方法。为本文目的，术语“抗体”和“单克隆抗体”(mAb)可互换使用，并指由杂交瘤(例如小鼠或人类)生成的完整的免疫球蛋白、免疫交联物以及从所述免疫球蛋白衍生的适当的免疫球蛋白片段和重组蛋白，例如嵌合的和人源化的免疫球蛋白、F(ab’)和F(ab’)2片段、单链抗体、重组免疫球蛋白可变区(Fv)、融合蛋白等。现有技术公认在多肽中的一些氨基酸序列可以变化，而没有对所述蛋白质的结构或功能没有显著影响。在抗体的分子重排中，骨架区的核酸或氨基酸序列的修饰一般可以是耐受的。这些包括但不限于置换(优选为保守置换)、删除或添加。进一步地，在本发明范围内的是将标准的化学治疗模式(例如放射性同位素)与本发明的CDMAB相结合，从而集中所述化学疗法的用途。CDMAB还可以与毒素、细胞毒部分、酶(例如生物素结合酶)或造血细胞结合，从而形成抗体结合物。

本申请使用如’357专利中教导的用于生成患者特异性抗癌抗体的方法用于分离编码癌症调节单克隆抗体的杂交瘤细胞系。可以针对一种肿瘤而特别制备这些抗体，从而使癌症治疗个体化成为可能。在本发明公开的内容中，具有杀灭细胞(细胞毒素的)或抑制细胞生长(细胞生长抑制的)性能的抗癌抗体将在下文中被称为细胞毒。这些抗体能够用于帮助癌症分期和诊断，也可用于治疗肿瘤转移。不同于根据传统药物开发方式生成的抗体，通过该方法生成的抗体可以靶向之前未显示与恶性组织的生长和/或存活整合的分子和途径。进一步地，这些抗体的结合亲和力适合于可能对较强亲和力相互作用不顺从的细胞毒事件的启动要求。

个性化抗癌治疗的前景将给患者的治疗方式带来变化。可能的临床情境是在一种肿瘤出现时就取样并入库。通过该样品，能够通过已有的癌症调节抗体库对该肿瘤进行分类。患者将被常规分期，但可用的抗体可以对患者进一步分期。可以用已有的抗体立即对患者进行治疗，和/或肿瘤特异性抗体库可以使用本发明公开的方法或者使用噬菌体展示库并结合本发明公开的筛选方法来生成。生成的所有抗体将被添加入抗癌抗体库，因为其它的肿瘤细胞可能具有与被治疗的肿瘤相同的抗原表位。根据该方法生成的抗体可以用于治疗任何数量的、患有与这些抗体结合的癌症的患者。

大致使用美国专利6,180,357的方法，以及如美国专利6,657,048中和S.N.10/348,231、S.N.10/603,006和S.N.10/810,751中所描述的(其各自内容通过引用结合入本文)，通过使用来自患者肺(H460-22-1)或乳腺(7BD-33-11A和1A245.6)肿瘤活组织检查的细胞免疫小鼠后而获得小鼠单克隆抗体，H460-22-1、1A245.6和7BD-33-11A。在不同组织来源的广泛人类细胞系的细胞表面表达了H460-22-1、1A245.6和7BD-33-11A抗原。乳腺癌细胞系MDA-MB-231(MB-231)和黑素瘤细胞系A2058在体外对H460-22-1的细胞毒作用是敏感的。乳腺癌细胞系MCF-7和and前列腺癌细胞系PC-3在体外对1A245.6和7BD-33-11A的细胞毒作用是敏感的。

H460-22-1在体内针对该癌适应症的抗肿瘤活性进一步扩充了H460-22-1针对培养物中乳腺癌细胞的细胞毒性结果。在乳腺癌体内模型中，由于免疫缺陷小鼠因缺乏某些免疫细胞而不能排斥人类肿瘤细胞，所以在免疫缺陷小鼠颈背皮下植入人类MB-231细胞。临床前的移植肿瘤模型被认为是治疗效果的有效预测器。小鼠中的异种移植物长成实体瘤，发展了基质、中心性坏死和新生血管。乳腺肿瘤细胞MB-231已经被评价为免疫缺陷小鼠的体内异种移植模型。MB-231肿瘤的良好植入或“成活率”以及所述肿瘤对标准化学疗剂的敏感性已经使其成为合适的模型。亲本细胞系及细胞系的变种已经用于异种移植模型中，来评价广泛的治疗剂。

在人类乳腺癌的预防性体内模型中，H460-22-1在肿瘤细胞植入前一天给入小鼠，随后每周注射一次持续7周。治疗期间，H460-22-1治疗在抑制肿瘤生长方面比同种型对照明显有效(p＜0.001)，所述同种型对照在结构和大小上与H460-22-1相同，但不能结合MB-231细胞。在治疗期末，给入H460-22-1的小鼠的肿瘤生长只有对照组的17.7％。在治疗后的随访期间，H460-22-1的治疗效果依然持续，治疗组的平均肿瘤体积继续明显小于对照组，直到检测期结束。使用存活率作为抗体效力的量度，对照组在治疗后第74至81天之间达到50％的死亡率。相反，H460-22-1治疗组在研究结束时的死亡率还没有达到50％。H460-22-1与同种型对照治疗组之间的这种差异是显著的(p＜0.0015)。这些数据表明，与对照治疗组相比，H460-22-1治疗组带来了存活益处。H460-22-1治疗显示出是安全的，因为其没有诱导任何毒性体征，包括体重降低或临床不良应激。因此，H460-22-1治疗是有效的，因为与对照治疗组相比，其在完备的人类乳腺癌模型中延缓了肿瘤生长并提高了存活率。这些结果还是可重现的，因为在另一该类研究中发现了类似的结果，表明其对癌症患者治疗的关联和益处。

除了预防性的乳腺癌体内肿瘤模型外，H460-22-1在体内肿瘤模型中表现出抗MB-231细胞的抗肿瘤活性。在该异种移植肿瘤模型中，MB-231乳腺癌细胞经皮下植入免疫缺陷鼠，以便所述肿瘤在抗体治疗前达到临界大小。将H460-22-1治疗与标准化疗药物顺铂相比较，显示顺铂和H460-22-1治疗组的平均肿瘤体积显著(p＜0.001)小于同种型对照抗体治疗组。 H460-22-1治疗介导的肿瘤抑制约为顺铂化学疗法介导的肿瘤抑制的三分之二，但没有使用顺铂时观察到的显著的体重降低(p＜0.003)和临床应激。H460-22-1的抗肿瘤活性及其最小化的毒性使其成为一种引人注目的抗癌治疗剂。

在治疗后期，与同种型对照抗体组相比较，H460-22-1通过延缓肿瘤生长而保持肿瘤抑制。在治疗后31天，与同种型对照组比较，H460-22-1通过减少42％的肿瘤生长而限制了肿瘤大小，相当于对照组在治疗结束时观察到的48％的减少。在完备的乳腺癌肿瘤模型中，这些结果表明了H460-22-1保持肿瘤抑制至超过治疗期的潜力，并证明了所述抗体在哺乳动物中减少肿瘤负荷并提高存活率的能力。

在体内针对乳腺和前列腺癌适应症的抗肿瘤活性进一步扩充了1A245.6和7BD-33-11A针对培养物中乳腺和前列腺癌细胞的细胞毒性结果(如在S.N.10/348,231、S.N.10/891,866、S.N.10/603,006和S.N.10/810,751中所公开的，其各自内容通过引用结合入本文)。临床前的移植肿瘤模型被认为是治疗效果的有效预测器。

参考S.N.10/348,231、S.N.10/891,866、S.N.10/603,006和S.N.10/810,751(其各自内容通过引用结合入本文)，7BD-33-11A和1A245.6在预防性的人乳腺癌体内模型中防止了肿瘤生长和肿瘤负荷。监测持续治疗后300天。7BD-33-11A从未产生肿瘤，并且在移植后的9个月内7BD-33-11A治疗组的87.5％依然存活。相反，同种型对照组在第72天(治疗后23天)100％死亡。1A245.6治疗鼠在治疗后151天达到100％死亡，所述天数比同种型对照治疗组长超过6倍。因此，1A245.6以及更大程度上的7BD-33-11A在乳腺癌模型中提高了存活率并防止了肿瘤生长(从而延缓了疾病进程)。

同时，如S.N.10/348,231、S.N.10/603,006、S.N.10/810,751和S.N.10/891,866(其各自内容通过引用结合入本文)中描述的，7BD-33-11A和1A245.6在完备的人乳腺癌体内模型中抑制了肿瘤生长并降低了肿瘤负荷。到第80天(治疗后23天)，7BD-33-11A治疗鼠的平均肿瘤体积比同种型对照组低83％(p＝0.001)。在该天，1A245.6治疗减少了35％的平均肿瘤体积，但是，所述减少在该实验中没有达到显著性(p＝0.135)。使用存活率作为抗体效力的量度，估计在治疗后约60天，7BD-33-11A治疗组中的死亡风险为同种型对照组的约16％(p＝0.0006)。对照组在治疗后50天100％死亡。相反，1A245.6治疗鼠存活至治疗后100天，7BD-33-11A治疗组的60％在治疗后130天依然存活。这些数据表明，与对照治疗组相比，1A245.6和7BD-33-11A治疗都带来了存活益处并减少了肿瘤负荷。1A245.6和7BD-33-11A治疗显示出是安全的，因为其没有诱导任何毒性体征，包括体重降低或临床不良应激。因此，1A245.6和7BD-33-11A治疗是有效的，因为与对照治疗组相比，其都在完备的人类乳腺癌模型中延缓了肿瘤生长并提高了存活率。

在S.N.10/810,751中描述的研究中(其内容通过引用结合入本文)，在两个不同的完备的乳腺癌异种移植模型中确定了与化学治疗药物(顺铂)治疗单独或联合比较的7BD-33-11A的作用。在MB-231模型中第83天(治疗后20天)，与缓冲液对照治疗的动物相比较，7BD-33-11A治疗导致了83％的肿瘤生长减少(p＝0.002)。与对照比较，单独顺铂治疗导致77％的肿瘤体积减少，而顺铂与7BD-33-11A联合治疗相比对照导致了88％的肿瘤体积减少(p＝0.006)。在MDA-MB-468(MB-468)模型中第62天(治疗后12天)，与7BD-33-11A联合的顺铂治疗观察到最大肿瘤生长减少(97％，p＝0.001)。与缓冲液对照相比较，单独顺铂治疗产生了95％的肿瘤生长减少，而单独7BD-33-11A治疗显示了37％的减少(p＝0.046)。在MB-231和MB-468模型中，以体重为量度，与顺铂治疗相比较，7BD-33-11A治疗导致了较大的动物健康。这些结果表明，与单独顺铂治疗相比较，7BD-33-11A治疗在MB-231模型中具有较大的效力，并在两个乳腺癌模型中比顺铂更好的耐受，具有较少副反应(例如体重减轻)。

为确定7BD-33-11A治疗在各种剂量下的作用，在预防性乳腺癌异种移植模型中进行了剂量反应实验(如S.N.10/810,751中描述的，其内容通过引用结合入本文)。在第55天(治疗后5天)，相对于同种型对照治疗组，0.2mg/kg的治疗组防止了85％的肿瘤生长。还是在第55天，2mg/kg和20mg/kg治疗组都没有发生肿瘤。在第125天(治疗后75天)获得了类似的结果，其中20mg/kg治疗组依然没有发生肿瘤，而2mg/kg治疗组具有了一些初期肿瘤生长。7BD-33-11A治疗还表现了存活益处。同种型对照组的所有小鼠在第104天(治疗后54天)死亡，而0.2mg/kg 7BD-33-11A治疗组存活至第197天(治疗后147天)。使用2mg/kg和20mg/kg 7BD-33-11A治疗组观察到了甚至更大的存活益处；2.0mg/kg治疗组只有50％在第290天死亡(治疗后240天)，而20mg/kg治疗组在第290天还没有死亡。因此，全部三种剂量的7BD-33-11A治疗显示了显著的肿瘤生长减少和增加的益处，且最高剂量表现出了最大程度的效力。

除了在完备的体内乳腺癌肿瘤模型中的有益效果，7BD-33-11A和1A245.6治疗在预防性体内前列腺癌模型中也具有针对PC-3细胞的抗肿瘤活性(描述于S.N.10/603,006和S.N.10/810,751中，其全部内容通过引用结合入本文)。7BD-33-11A和1A245.6治疗比同种型对照抗体在治疗期后不久更有效抑制肿瘤生长(p分别为0.001和0.017)。在治疗期末，给入7BD-33-11A或1A245.6的小鼠的肿瘤生长分别为同种型对照的仅31％和50％。

对于PC-3 SCID异种移植模型，体重可以用作疾病进展的替代指示剂。在第52天，与同种型对照相比，7BD-33-11A和1A245.6治疗分别显著(p分别为0.002和0.004)防止了54％和25％的体重减轻。监测小鼠治疗后的存活率。在治疗后11天，同种型和缓冲液对照鼠达到了100％的死亡率。相反，7BD-33-11A和1A245.6在治疗后38天达到100％死亡率，时间比对照组长3倍。因此，7BD-33-11A和1A245.6是有效的，因为与同种型对照治疗组相比较，7BD-33-11A和1A245.6治疗在完备的人前列腺癌模型中都延缓了肿瘤生长、防止了体重减轻并延长了存活。

除了预防性体内前列腺癌肿瘤模型以外，7BD-33-11A在完备的体内肿瘤模型中表现了针对PC-3细胞的抗肿瘤活性(描述于S.N.10/603,006和S.N.10/810,751中，其内容通过引用结合入本文)。7BD-33-11A治疗再次与同种型对照相比较。显示在进行治疗后，7BD-33-11A治疗组的平均肿瘤体积显著(p＜0.024)小于同种型对照治疗组。与同种型对照组相比较，7BD-33-11A治疗介导的肿瘤抑制为36％。

除了在乳腺癌和前列腺癌的体内肿瘤模型中的有益效果，7BD-33-11A治疗在预防性体内胰腺癌模型中还具有针对BxPC-3细胞的抗肿瘤活性。在治疗期后不久，7BD-33-11A治疗比缓冲液对照抗体更有效抑制肿瘤生长(71％，p＝0.0009)。另外，与缓冲液对照治疗组相比，7BD-33-11A治疗带来了存活益处。在7BD-33-11A治疗组中，40％的小鼠在缓冲液对照组小鼠全部死亡后2周内依然存活。

除了在乳腺癌、前列腺癌和胰腺癌的体内肿瘤模型中的有益效果，7BD-33-11A治疗在两个独立的预防性体内黑素瘤模型中还具有针对A2058和A375细胞的抗肿瘤活性。在A2058和A375模型中，7BD-33-11A治疗都比缓冲液对照更有效抑制了肿瘤生长(分别为72％，p＝0.011和63％，p＝0.0006)。7BD-33-11A在黑素瘤中以及在乳腺癌、前列腺癌和胰腺癌模型中的抗肿瘤活性使其成为引人注目的抗肿瘤治疗剂。

为确定7BD-33-11A在体内表现的效力是否全部或部分归因于ADCC活性，在NOD SCID和SCID鼠中完备的肿瘤模型中都检测了7BD-33-11A针对MB-231细胞的抗肿瘤活性。NOD SCID在天然杀伤(NK)细胞中有功能性缺陷并缺乏循环补体和功能上未成熟的巨噬细胞群，而SCID鼠同时具有补体和强有力的NK细胞活性。7BD-33-11A是小鼠IgG2a单克隆抗体，并因此在体内有ADCC活性。同时比较了7BD-33-11A的抗肿瘤活性与缓冲液对照和H460-22-1(基于其同种型，不应该通过ADCC表现其活性的鼠IgG1单克隆抗体)。在第54天(最终治疗后4天)，在SCID治疗组中，7BD-33-11A和H460-22-1治疗鼠发生的肿瘤的平均肿瘤体积分别仅为缓冲液对照鼠的1.9％和3.6％。相反，在NOD SCID治疗组中，还是在第54天(最终治疗后4天)，7BD-33-11A治疗鼠的肿瘤生长的平均肿瘤体积为缓冲液对照鼠的67％。H460-22-1治疗鼠表现出与SCID鼠中类似的效果；肿瘤生长的平均肿瘤体积为缓冲液对照治疗鼠的1.4％。因此，7BD-33-11A的体内活性似乎部分归因于ADCC活性，而H460-22-1的抗肿瘤作用似乎不依赖于ADCC。

为验证H460-22-1、1A245.6和7BD-33-11A表位作为药物靶，测定了其靶抗原在正常人类组织中的表达。如在S.N.10/603,006和S.N.10/810,751(其通过引用结合入本文)中部分讨论和描述的，确定了7BD-33-11A、H460-22-1和1A245.6对正常人组织的结合。通过IHC染色，多数组织未能表达7BD-33-11A抗原，包括重要的组织，例如肾、心脏和肺。7BD-33-11A染色了唾液腺、肝、胰腺、胃、十二指肠，并强染色了扁桃体。组织染色的结果表明7BD-33-11A显示了对各种细胞类型的受限制的结合，但具有对侵润性巨噬细胞、淋巴细胞和成纤维细胞的结合。对于H460-22-1和1A245.6，更广泛的组织被阳性染色。对于大多数情况，染色被限制于上皮或侵润性巨噬细胞、淋巴细胞和成纤维细胞。然而，在心肌和肝细胞上都观察到了阳性染色。7BD-33-11A、H460-22-1和1A245.6都同时展示了细胞膜和细胞质染色模式。

如S.N.10/810,751中所讨论和描述的(其内容通过引用结合入本文)，7BD-33-11A与可商业获得的抗CD63抗体(RFAC4和H5C6)进行了比较。来自正常人组织染色的结果表明，7BD-33-11A再次显示了对各种细胞类型的受限制的结合，但具有对侵润性巨噬细胞、淋巴细胞和成纤维细胞的结合。相互比较，RFAC4和H5C6抗体显示了类似的染色模式。然而，RFAC4和H5C6的染色模式都非常不同于使用7BD-33-11A所观察到的模式。特别地，与更广泛正常组织结合的RFAC4和H5C6抗体通常在其中7BD-33-11A也是阳性的组织中具有较高的染色强度，并且不仅结合至侵润性巨噬细胞、淋巴细胞和成纤维细胞，还结合至多数组织的上皮细胞。

H460-22-1、1A245.6和7BD-33-11A抗原的定位以及其在人群(例如在乳腺癌患者中)中流行的确定在评价这些抗体的治疗用途和设计临床实验中是重要的。为描述H460-22-1、1A245.6和7BD-33-11A抗原在癌症患者的乳腺肿瘤中的表达，筛选了来自98名个体乳腺癌患者的肿瘤组织样品的7BD-33-11A抗原的表达(来自50名患者的结果之前已经在S.N.10/603,006和S.N.10/810,751中描述，其各自内容通过引用结合入本文)，并且筛选了来自50名患者的肿瘤组织样品的1A245.6和H460-22-1抗原(讨论于S.N.10/603,006，其内容通过引用结合入本文)。

这些研究的结果显示，37％的组织样品对7BD-33-11A抗原的染色呈阳性。患者样品中的7BD-33-11A的表达显示了对癌细胞的特异性，因为染色被限制于恶性细胞。另外，7BD-33-11A染色了来自乳腺癌患者的20个正常组织样品中的0个。另一方面，H460-22-1和1A245.6分别染色了92％和98％的乳腺癌组织样品。H460-22-1和1A245.6还染色了来自乳腺癌患者的10个正常组织样品中的9个。然而，该染色一般比使用乳腺癌组织样品观察到的染色弱的多，并一般限制于侵润性成纤维细胞。7BD-33-11A、H460-22-1和1A245.6抗原的乳腺肿瘤表达表现出定位于恶性细胞的细胞膜和细胞质，使CD63成为治疗上引人注目的靶。

如S.N.10/810,751中所讨论和描述的(其内容通过引用结合入本文)，7BD-33-11A与RFAC4和H5C6以及与抗Her2抗体(c-erbB-2)进行了比较。目前研究的结果类似于之前的结果，并显示36％的肿瘤组织样品对7BD-33-11A抗原染色呈阳性，而94％和85％的乳腺肿瘤组织分别对H5C6和RFAC4表位呈阳性。患者样品中7BD-33-11A的表达表现出对癌细胞的特异性，因为染色限制于恶性细胞。另外，7BD-33-11A染色了来自乳腺癌患者的10个正常组织样品中的0个，而H460-22-1和1A245.6都染色了8个正常乳腺癌组织样品中的7个。与c-erbB-2比较，7BD-33-11A显示了完全不同的染色特征，其中半数对7BD-33-11A抗原呈阳性的乳腺肿瘤组织样品对Her2表达呈阴性，表明7BD-33-11A靶向不能用现有抗体疗法治疗的患者群。在对7BD-33-11A和Her2都呈阳性的乳腺肿瘤组织切片之间存在染色强度的差别。c-erbB-2抗体还阳性染色了一个正常乳腺组织切片。

如S.N.10/603,006和S.N.10/810,751(其各自内容通过引用结合入本文)中部分讨论的，基于雌激素和黄体酮受体的乳腺肿瘤表达，进一步评价了7BD-33-11A、H460-22-1和1A245.6的表达，雌激素和黄体酮在乳腺肿瘤的发展、治疗和预后中起重要作用。1A245.6抗原的表达与雌激素或黄体酮受体的表达之间没有明显相关。在缺乏雌激素受体并存在黄体酮受体和7BD33-11A抗原表达之间以及同时存在雌激素和黄体酮受体与H460-22-1抗原表达之间存在轻微相关。当基于癌症进展期或程度来分析肿瘤时，结果表明：对于7BD-33-11A和H460-22-1而言，都是较高肿瘤期具有较大阳性表达的趋势。使用RFAC4获得了类似的结果。H5C6还显示了使用雌激素或黄体酮受体表达的轻度相关，但与肿瘤期没有明显相关，然而，结论受小体积样品的限制。

7BD-33-11A抗原的定位及其在前列腺癌患者中的流行在评价7BD-33-11A免疫治疗对前列腺癌患者的益处和设计有效临床实验中是重要的。为描述7BD-33-11A抗原在来自癌症患者的前列腺肿瘤中的表达，筛选了来自51名个体前列腺癌患者的肿瘤组织样品的7BD-33-11A抗原的表达(如S.N.10/810,751中描述和讨论的，其内容通过引用结合入本文)。该研究结果显示，88％的组织样品对7BD-33-11A抗原染色呈阳性。尽管7BD-33-11A也高强度染色了正常组织切片，但与正常样品比较，在肿瘤组织样品中存在更高程度的膜染色。有一个胚横纹肌肉瘤组织样品没有染色7BD-33-11A抗原。在受试的小体积样品中，肿瘤期和7BD-33-11A抗原存在之间没有显示直接相关。

7BD-33-11A抗原的定位及其在在黑素瘤癌症患者中的流行在评价7BD-33-11A免疫治疗对黑素瘤患者的益处和设计有效临床实验中是重要的。为描述7BD-33-11A抗原在来自癌症患者的黑素瘤中的表达，筛选了来自39名个黑素瘤患者的肿瘤组织样品的7BD-33-11A抗原的表达。该研究结果显示，90％的组织样品对7BD-33-11A抗原染色呈阳性。在该小样品中，肿瘤期和7BD-33-11A抗原的存在之间没有显示直接相关。

为进一步扩充7BD-33-11A、H460-22-1和1A245.6的潜在治疗益处，还测定了各种人类癌组织中的抗原的定位(如在S.N.10/603,006中对1A245.6和7BD33-11A描述和在S.N.10/810,751中引用的，其各自内容通过引用结合入本文)。除了乳腺癌和前列腺癌，集中癌症类型表达了7BD-33-11A抗原。阳性人类癌症类型包括皮肤(1/2)、肺(3/4)、肝(2/3)、胃(4/5)、甲状腺(2/2)、子宫(4/4)和肾(3/3)。一些癌症没有表达所述抗原；这些包括卵巢(0/3)、睾丸(0/1、脑(0/2)和淋巴结(0/2)。关于H460-22-1和1A245.6，与正常人类组织阵列一样，来自各种人类组织类型的多种癌被阳性染色。在皮肤、肺、肝、子宫、肾、胃和膀胱的恶性细胞上观察到了较大的染色。与人类乳腺、前列腺和黑素瘤癌组织一样，7BD-33-11A、H460-22-1和1A245.6的定位同时发生于这些肿瘤细胞的细胞膜上和细胞质内。因此，除了H460-22-1、1A245.6和7BD-33-11A抗体在体外结合至癌细胞系外，有证据表明抗原在人类中表达，并表达于多种类型的癌上。

如S.N.10/810,751中对7BD-33-11A的描述(其内容通过引用结合入本文)和本文对1A245.6和H460-22-1的描述，生物化学数据也表明由H460-22-1、1A245.6和7BD-33-11A识别的抗原是CD63。这也得到了研究支持，所述研究表明反应性针对CD63的单克隆抗体RFAC4识别了通过免疫沉淀结合至7BD-33-11A、H460-22-1或1A245.6的蛋白质。另外，细菌表达研究阐明，H460-22-1、1A245.6和7BD-33-11A结合至CD63的细胞外环2。还通过构型依赖性区分了7BD-33-11A、H460-22-1和1A245.6表位。这些IHC和生物化学结果证明，H460-22-1、1A245.6和7BD-33-11A结合至CD63抗原。因此，优势证据表明，H460-22-1、1A245.6和7BD-33-11A通过存在于CD63上的独特构型表位的连接而介导抗癌作用。为本发明目的，所述表位定义为“CD63抗原性部分”，其特征为与由杂交瘤细胞系7BD-33-11A、1A245.6、H460-22-1编码的单克隆抗体、其抗原结合片段或其抗体结合物相结合的能力。

总体上，该数据说明H460-22-1、1A245.6和7BD-33-11A抗原是癌症相关抗原并在人类中表达，并且是病理相关的癌靶。进一步地，该数据也证明了H460-22-1、1A245.6和7BD-33-11A抗体与人类癌组织的结合，并能够适当用于可以是诊断、治疗预测或预后性的测定。另外，该抗原的细胞膜定位因该抗原在多数非恶性细胞中表达的相对频率而指示了细胞的癌症状态，该发现允许该抗原、其基因或衍生物、其蛋白质或其变体用于可以是诊断、治疗预测或预后性的测定。

本发明描述了H460-22-1、7BD-33-11A和1A245.6的开发和用途，通过美国专利6,180,357中描述的方法而被开发，并通过其在细胞毒性测定、动物模型中非完备和完备的肿瘤生长以及在癌症患者中延长存活时间的作用而被鉴定。本发明代表了癌症治疗领域的进步，因为其首次描述了特异性结合至存在于靶分子CD63上的一种或多种表位并在体外也具有抗恶性肿瘤细胞但非正常细胞的细胞毒性质的试剂，并且其还在人类癌症体内模型中直接介导了肿瘤生长的抑制和存活的延长。这相对于其他之前描述的抗CD63抗体是进步的，因为还没有抗CD63抗体显示出具有类似的性质。其还提供了领域内的进步，因为其首次清楚证明了CD63直接参与某些类型的肿瘤的生长和发展相关事件。其也代表了癌症治疗中的进步，因为其具有在人类患者中表现类似抗癌性质的潜力。另一进步是抗癌症抗体文库中加入这些抗体将提高靶向肿瘤(表达不同的抗原标志物)的可能性，通过确定不同抗癌抗体的适当组合，以寻求最有效的靶向和抑制肿瘤生长和发展。

总之，本发明教导了使用7BD-33-11A抗原作为治疗剂的靶，其在施用时可减少哺乳动物中表达所述抗原的癌的肿瘤负荷，并且还能导致受治哺乳动物延长的存活。本发明还教导了使用CDMAb(H460-22-1、7BD-33-11A和1A245.6)及其衍生物及其抗原结合片段来靶向其抗原，以减少哺乳动物中表达所述抗原的肿瘤负荷，并延长患有表达该抗原的肿瘤的哺乳动物的存活。进一步地，本发明还教导了在癌细胞中检测H460-22-1、7BD-33-11A和1A245.6抗原的用途，其可用于患有表达该抗原的肿瘤的哺乳动物的诊断、治疗预测和预后。

如果患者的初期治疗没有效果或发生了转移，则可以重复肿瘤特异抗体生成过程来进行治疗。而且，抗癌抗体可以和患者的红细胞结合并再次注入来治疗病灶转移。目前对转移癌症的有效治疗很少，转移通常预示着糟糕的出院率而导致死亡。不过，转移的肿瘤通常有较好的血管生成，通过红细胞进行的抗癌抗体的输送具有将抗体聚集在肿瘤位置的作用。甚至在转移前，大多数癌细胞依靠宿主血液供应来存活，而与红细胞结合的抗癌抗体同样能有效抵抗原位肿瘤。或者，抗体可以和其它造血细胞结合，如淋巴细胞、巨噬细胞、单核细胞、自然杀伤细胞，等等。

有五类抗体，每类抗体具有一种其重链所赋予的功能。通常认为通过裸抗体的癌细胞杀伤作用由抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)或补体依赖性细胞毒作用(CDC)来介导。例如，鼠IgM和IgG2a抗体能够通过与补体系统中的C-1组分结合来激活人类补体，从而激活补体激活的经典途径，这能导致肿瘤细胞溶解。对于人类抗体，最有效的补体激活抗体通常是IgM和IgG1。鼠同种型抗体IgG2a和IgG3在俘获具有Fc受体的细胞毒性细胞过程中起作用，导致由单核细胞、巨噬细胞、粒细胞和某些淋巴细胞的细胞杀伤作用。人类同种型抗体IgG1和IgG3都介导ADCC。

抗体介导的癌细胞杀伤作用的另一种可能的机制是可以通过利用抗体催化功能，来水解细胞膜与其结合的糖蛋白或糖脂之间的化学键，即所谓的催化抗体。

还有两种被普遍接受的抗体调节癌细胞杀伤的机理。第一种是利用抗体作为疫苗来诱导机体对肿瘤细胞表面的特定癌抗原产生免疫反应。第二种是利用抗体来靶向生长受体并干扰其功能或下调该受体以使其功能丧失。

肿瘤药物的临床应用基于该药物在可接受的危险评估之下的受益。在癌症的治疗中，存活率通常是最重要的受益目标，但是除了延长寿命外，还有一些其它公认的受益。这些对存活没有负面影响的其它受益包括症状的减轻、防止负面影响、延长复发周期或无瘤存活时间和延长疾病进程。这些标准被普遍接受，美国食品药品监督管理局(FDA)等管理机构批准产生这些受益的药物(Hirschfeld等.Critical Reviews in Oncology/Hematology 42：137-1432002)。除了这些标准外，人们充分认识到还有其他特征可以预示这些受益类型。部分的，美国FDA的快速审批程序确认了有替代特征可能预测患者的受益。到2003年末，有16个药物被批准进入这个程序，其中四个已经进入全面审批，即，随访研究证明了替代特征所预示的直接的患者受益。确定实体瘤药物疗效的一个重要指标是通过测试治疗效果来评价肿瘤负荷(Therasse等.Journal of theNational Cancer Institute 92(3)：205-216 2000)。这种评价的临床标准(RECIST标准)已经由实体瘤疗效评价标准工作组颁布，该工作组由国际癌症专家组成。和参照RECIST标准的客观疗效所显示的一样，与适当的对照组相比，对实体瘤有确切疗效的药物易于最终产生直接的患者受益。在临床前条件下，肿瘤负荷通常更容易被评估和记录。因为临床前研究可以被转化为临床条件，所以在临床前模型中产生存活延长的药物具有最大的、所期望的临床效用。与产生对临床治疗有益反应相类似，在临床前条件下降低肿瘤负荷的药物也可能对疾病具有显著的直接影响。尽管延长生命是癌症药物治疗最重要的目标，但是还有其他受益具有临床效用，显然，肿瘤负荷的降低也能够导致直接的受益并具有临床效果(Eckhardt等.Developmental Therapeutics：靶向化合物的临床实验设计的成功与失败(Successes and Failures of Clinical Trial Designs ofTargeted Compounds)；ASCO Educational Book，第39^th届年会，2003，第209-219页)。

因此，本发明的目的是利用从特定个体衍生的细胞生成癌症调节抗体的方法，该抗体对癌细胞有细胞毒性而同时对非癌细胞相对无毒，为了分离杂交瘤细胞系和该杂交瘤细胞系编码的相应的分离的单克隆抗体及其抗原结合片段。

本发明的另一个目的是提供癌症调节抗体(CDMAB)及其抗原结合片段。

本发明另一个目的是生成CDMAB，其细胞毒通过ADCC介导。

本发明另一个目的是生成CDMAB，其细胞毒通过CDC介导。

本发明另一个目的是生成CDMAB，其细胞毒是其催化细胞化学键水解的能力的功能。

本发明另一个目的是生成CDMAB，该CDMAB在癌症的诊断、预后和监测的结合试验中是有用的。

本发明其它的目的和优点将从通过描述和实施例方式的下述描述而变得显而易见，其中提出了本发明的某些实施方案。

附图说明

专利或申请文件含有至少一幅彩色附图。具有彩色附图的专利或专利申请公布的副本将在要求和付给必要费用后由当局提供。

图1.7BD-33-11A(板A)或同种型对照(板B)探针的MDA-MB-231全细胞溶解产物(泳道1)或细胞膜(泳道2和3)的Western印迹。分子量标记显示于左边。

图2.使用7BD-33-11A探针的MDA-MB-231膜的Western印迹。泳道1：膜在还原条件下的跑板。泳道2：膜在非还原条件下的跑板。分子量标记显示于左边。

图3.针对7BD-33-11A至MDA-MB-231膜的结合的去糖基化作用。MDA-MB-231膜经受下述物质处理：糖肽酶F(PNGase F；泳道1)，O-聚糖酶(泳道2)，唾液酸酶(泳道3)，PNGase F、O-聚糖酶和唾液酸酶的组合(泳道4)，PNGase F、O-聚糖酶、唾液酸酶、半乳糖苷酶和葡萄糖胺酶的组合(泳道5)或缓冲液对照(泳道6)。分子量标记显示于左边。

图4.与7BD-33-11A免疫沉淀的MDA-MB-231膜蛋白的SDS-PAGE(板A)和Western印迹(板B)。泳道A：同种型对照免疫沉淀蛋白质，泳道B：7BD-33-11A免疫沉淀蛋白质和泳道TM：总MDA-MB-231膜蛋白。矩形盒描绘了SDS-PAGE中泳道B和Western印迹中泳道TM的相同条带。分子量显示于左边。

图5.Profound检索概要表。

图6.MASCOT检索概要表。

图7a：使用探针7BD-33-11A(板A)、抗CD63(克隆RFAC4，板B)、IgG2a同种型对照(板C)和IgG1同种型对照(板D)的蛋白质Western印迹(板A)。泳道A：总MDA-MB-231膜蛋白；泳道B：7BD-33-11A免疫沉淀的蛋白质；泳道C：抗CD63(RFAC4)免疫沉淀的蛋白质；泳道D：IgG2a同种型对照免疫沉淀的蛋白质；和泳道E：IgG1同种型对照免疫沉淀的蛋白质。分子量标记显示于左边。

图7b：使用探针7BD-33-11A(板A)、抗CD63(克隆H5C6，板B)、IgG2a同种型对照(板C)和IgG1同种型对照(板D)的蛋白质Western印迹。泳道A：总MDA-MB-231膜蛋白；泳道B：7BD-33-11A免疫沉淀的蛋白质；泳道 C：抗CD63(H5C6)免疫沉淀的蛋白质；泳道D：IgG2a同种型对照免疫沉淀的蛋白质；和泳道E：IgG1同种型对照免疫沉淀的蛋白质。分子量标记显示于左边。

图8.使用探针7BD-33-11A(板A)、抗CD63(克隆RFAC4，板B)、抗CD63(克隆H5C6，板C)、IgG2a同种型对照(板D)和IgG1同种型对照(板E)的蛋白质Western印迹。泳道1-5含有7BD-33-11A免疫沉淀的蛋白质，且泳道6-10含有IgG2a同种型对照免疫沉淀的蛋白质。泳道1和6：没有NaCl，泳道2和7：150mM NaCl，泳道3和8：500mM NaCl，泳道4和9：2000mM NaCl，以及泳道5和10：RIPA缓冲液。

图9.使用探针7BD-33-11A(板A)、抗CD63(克隆RFAC4，板B)、抗CD63(克隆H5C6，板C)、IgG2a同种型对照(板D)和CoomassieColloidal Blue蛋白质染色(板E)的蛋白质Western印迹。泳道1：单独的非诱导的载体，泳道2：非诱导的GST-EC1，泳道3：非诱导的GST-EC2，泳道4：单独的诱导载体，泳道5：诱导的GST-EC1和泳道6：诱导的GST-EC2。分子量标记显示于左边。

图10.使用探针IgG1和IgG2a同种型对照、抗CD44(克隆H460-16-2)、抗CD63(RFAC4)、1A245.6和H460-22-1的蛋白质Western印迹。泳道1：全细胞膜组分(泳道1)，泳道2：与H460-16-2免疫沉淀的物质，泳道3：与7BD-33-11A免疫沉淀的物质，泳道4：与H460-22-1免疫沉淀的物质泳道5：与1A245.6免疫沉淀的物质泳道6：与IgG2a同种型对照免疫沉淀的物质，和泳道7：与IgG1同种型对照免疫沉淀的物质。分子量标记显示于左边。

图11.使用探针IgG1和IgG2a同种型对照、抗CD44(克隆H460-16-2)、抗CD63(RFAC4)、1A245.6和H460-22-1的蛋白质Western印迹。泳道1：单独的非诱导的GST载体，泳道2：非诱导的GST-EC1，泳道3：非诱导的GST-EC2，泳道4：单独的诱导的GST载体，泳道5：诱导的GST-EC1，泳道6：诱导的GST-EC2。分子量标记显示于左边。

图12.导向几种癌细胞系和非癌细胞的7BD-33-11A、同种型对照和抗EGFR的代表性FACS直方图。

图13.导向几种癌细胞系和非癌细胞的1A245.6、同种型对照和抗EGFR的代表性FACS直方图。

图14.导向几种癌细胞系和非癌细胞的H460-22-1、同种型对照和抗EGFR的代表性FACS直方图。

图15.正常人心脏。A.7BD-33-11A。正常人脑。B.1A245.6。C.H460-22-1。正常人心脏。D.阳性对照。正常人脑。E.阳性对照。放大200倍。

图16.正常人胃腔。A.7BD-33-11A。B.H460-22-1。C.1A245.6。D.阴性同种型对照。放大200倍。

图17.结合至人乳腺癌肿瘤(侵润性导管癌)的A.7BD-33-11A，B.1A245.6和C.H460-22-1的代表性显微照片。D.阴性同种型对照。放大200倍。

图18.结合至人正常乳腺组织的7BD-33-11A，B.阳性对照的代表性显微照片。放大200倍。

图19.显示了使用7BD-33-11A(A)、同种型阴性对照(B)、抗CD63(RFAC4)抗体或抗CD63(H5C6)抗体(D)在来自人乳腺癌组织阵列的侵润性导管癌组织切片上获得的结合模式的代表性显微照片。与RFAC4或H5C6抗体相比较，7BD-33-11A显示了对肿瘤细胞较弱的阳性染色。放大200倍。

图20.显示了使用7BD-33-11A(A)或抗Her2(c-erbB-2)抗体(B)在来自人乳腺癌组织阵列的侵润性导管癌组织切片上获得的结合模式的代表性显微照片。与显示了阴性染色的抗Her2抗体相比较，7BD-33-11A显示了对肿瘤细胞强的阳性染色。放大200倍。

图21.显示了使用7BD-33-11A在来自人前列腺癌组织阵列的前列腺腺癌(A)或正常前列腺(B)的组织切片上获得的结合模式的代表性显微照片。7BD-33-11A显示了对腺癌组织切片中肿瘤细胞的强阳性膜染色。7BD-33-11A同时显示了正常前列腺组织切片中腺状上皮的膜和细胞质染色。放大200倍。

图22.原发性恶性黑素瘤。A.7BD-33-11A(黑色箭头指示肿瘤细胞的阳性染色，且绿色箭头指示间质的染色缺乏)。B.阴性同种型对照。放大400倍。

图23.肾细胞癌。A.7BD-33-11A。B.1A245.6。C.H460-22-1。D.阴性同种型对照。放大200倍。

图24.H460-22-1、同种型对照或缓冲液对照在预防性MDA-MB-231乳腺癌模型中对体重的影响。

图25.H460-22-1、同种型对照或缓冲液对照在预防性MDA-MB-231乳腺癌模型中对肿瘤生长的影响。阴影线指示抗体施用的时期。数据点表示平均+/-SEM。

图26.H460-22-1、同种型对照或缓冲液对照在预防性MDA-MB-231乳腺癌模型中对存活的影响。阴影线指示抗体施用的时期。

图27.H460-22-1、同种型对照或顺铂在预防性MDA-MB-231乳腺癌模型中对肿瘤生长的影响。阴影线指示抗体施用的时期。数据点表示平均+/-SEM。

图28.H460-22-1、同种型对照或顺铂在完备的MDA-MB-231乳腺癌模型中对肿瘤生长抑制(％T/C)的影响。阴影线指示抗体施用的时期。

图29.H460-22-1、同种型对照或顺铂在完备的MDA-MB-231乳腺癌模型中对体重的影响。

图30.7BD-33-11A或缓冲液对照在预防性A2058黑素瘤癌症模型中对肿瘤生长的影响。阴影线指示抗体施用的时期。数据点表示平均+/-SEM。

图31.7BD-33-11A或缓冲液对照在预防性A2058黑素瘤癌症模型中对体重的影响。

图32.7BD-33-11A或缓冲液对照在完备的A2058黑素瘤癌症模型中对肿瘤生长的影响。数据点表示平均+/-SEM。

图33.7BD-33-11A或缓冲液对照在完备的A2058黑素瘤癌症模型中对体重的影响。

图34.7BD-33-11A或缓冲液对照在预防性A375黑素瘤癌症模型中对肿瘤生长的影响。阴影线指示抗体施用的时期。数据点表示平均+/-SEM。

图35.7BD-33-11A或缓冲液对照在预防性A375黑素瘤癌症模型中对体重的影响。

图36.AR7BD-33-11A和达卡巴嗪(单独和结合)在完备的A375黑素瘤癌症模型中的作用。AR7BD-3311A和磷酸缓冲盐(对照)以20mg/kg腹腔注射，每周3次，持续3周。达卡巴嗪以90mg/kg(该模型中的1/2最大耐受剂量)腹腔注射，每天1次，持续连续5天。显示了组的中等肿瘤生长和存活(Kaplan-Meier曲线)曲线。

图37.7BD-33-11A或缓冲液对照在预防性BxPC-3胰腺癌模型中对肿瘤生长的影响。阴影线指示抗体施用的时期。数据点表示平均+/-SEM。

图38.7BD-33-11A或缓冲液对照在预防性BxPC-3胰腺癌模型中对体重的影响。

图39.7BD-33-11A、H460-22-1或缓冲液对照在MDA-MB-231乳腺SCID或NOD/SCID癌症模型中对肿瘤生长的影响。

具体实施方式

实施例1

通过Western免疫印迹鉴定7BD-33-11A结合蛋白

如S.N.10/810,751(其内容通过引用结合入本文)中描述和讨论的，为鉴定由抗体7BD-33-11A识别的抗原，细胞膜制品经受十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，并转膜。后者使用抗体7BD-33-11A探针检测，以使由该抗体检测的蛋白质显影。

1.0.全细胞溶解产物和全细胞膜组分制品

1.1.全细胞溶解产物的制备

之前通过FACS的工作证明了抗体7BD-33-11A对乳腺癌细胞系MDA-MB-231(MB-231)的结合。结果，从该细胞系获得的全细胞膜制品和全细胞溶解产物用于抗原鉴定和表征。来自MB-231细胞的总细胞溶解产物制备如下：MB-231细胞片状沉淀(1.5g)重悬于2mL裂解缓冲液，所述缓冲液含有20mM Tris(pH7.4)、150mM NaCl、1％(v/v)Triton X-100、0.02％(w/v)叠氮化钠、2mM原钒酸钠、50mM氟化钠和蛋白酶抑制剂鸡尾酒(Roche Diagnostics；Manheim，Germany)。所述片状沉淀经玻璃匀化器均质化并搅拌下于4℃保温1小时。然后将样品于4℃离心(20,000g)15分钟，以除去不溶于洗涤剂的物质。收集上清夜，分成小份，-80℃冷冻。通过BCA(二金鸡宁酸)测定法(Pierce；Rockford，IL.)测定细胞溶解产物中的蛋白质浓度。

1.2.全细胞膜组分的制备

MB-231乳腺癌细胞的铺满培养物制备全细胞膜。从细胞堆除去培养基，使用磷酸缓冲盐水(PBS)洗涤细胞。使用离解缓冲液细胞离解缓冲液(Gibco-BRL；Grand Island，NY)在台式振荡器上于37℃离解细胞20分钟。收集细胞4℃下900g离心10分钟。离心后，重悬于PBS并再次于4℃下900g离心10分钟来洗涤细胞片状沉淀。然后将片状沉淀保存于-80℃待用。为制备细胞膜，细胞片状沉淀经融化并以每克细胞3mL缓冲液的比例重悬于均匀化缓冲液(每50mL含有1片完全蛋白酶抑制剂鸡尾酒(Roche；Laval QC))。使用polytron匀化器在冰上对细胞悬浮液进行均匀化，以裂解细胞。细胞匀浆在4℃下15,000g离心10分钟，以除去核颗粒。收集上清液，分入离心管中，然后在4℃下75,600g离心90分钟。小心去除上清夜，各细胞膜片状沉淀重悬于约5mL的均匀化缓冲液。合并来自所有离心管的细胞膜片状沉淀，再次分开，并在4℃下75,600g离心90分钟。小心去除上清夜，称重片状沉淀。含有1％Triton X-100的均匀化缓冲液以每克细胞膜片状沉淀3mL缓冲液的比例添加至所述片状沉淀。通过在台式振荡器上以300rpm振荡溶解细胞膜，冰上持续1小时。细胞膜悬浮液在75,600g离心至片状不溶性物质。小心从所述离心管移出含有溶解的细胞膜蛋白质的上清液，检测蛋白质浓度，并保存于-80℃。

2.0一维SDS-PAGE和Western免疫印记

通过一维SDS-PAGEMB-231(1D SDS-PAGE)从细胞的全细胞膜组分和全细胞溶解产物分离了蛋白质，积层胶和分离胶分别为5％和10％。通过电印记至PVDF膜(Millipore；Billerica，MA)上，蛋白质4℃下转移过夜。通过评价预先染色的分子量标记转移至所述膜上来测定完全转移。转移后，使用于TBST中的5％(w/v)脱脂乳室温下(RT)封闭所述膜1小时，然后如下探针检测两个复制的印记：一个印记使用抗体7BD-33-11A(5g/mL，于5％脱脂乳的TBST中)探针检测，复制印记使用IgG2a同种型对照(5g/mL，于5％脱脂乳的TBST中)探针检测。在TBST中洗涤印记3次持续10分种，然后使用辣根HRP-结合的山羊抗鼠IgG(Fc)(Bio-Rad Laboratories；Hercules，CA)室温培养1小时。各自使用TBST洗涤3次10分种后，按照生产商的说明使用TMB过氧化物酶底物试剂盒(VectorLaboratories；Burlingame，CA)显影所述印记。水洗所述印记并使用凝胶记录系统获得影像(图1和2)(Bio-Rad；Hercules，CA)。印记在相同的照相机焦距、孔径和图像采集时间条件下成像。图1中，7BD-33-11A明显结合至20-80 kDa范围内的蛋白质，在含有全细胞溶解产物和全细胞膜组分的泳道中检测了其活性。同种型对照没有结合至MB-231溶解产物或细胞膜组分中的任何蛋白质，表明对于7BD-33-11A的结合是特异性的。图2说明了样品减少对7BD-33-11A结合、Western印迹的影响。只有当样品在非还原条件下(泳道2)制备时才检测该抗体的反应性。还原剂(例如DTT或β-巯基乙醇)完全消除了结合(泳道1)，表明7BD-33-11A的识别和对其天然蛋白质上表位的结合依赖于二硫键的存在。

为确定抗原的分散性质(如Western免疫印记所检测的)是否归因于异种糖基化，使用几种糖苷酶(糖肽酶F、o-聚糖酶、唾液酸酶、半乳糖苷酶和葡萄糖胺酶)处理了全细胞膜组分，所述糖苷酶除去了特异性糖类基团。在处理后，所述样品进行1D SDS-PAGE和Western印记。预期，如果一些所述酶除去了贡献了显著量的由抗体7BD-33-11A识别的抗原质量的一部分糖类，则可能通过SDS-PAGE检测该差异。图3显示，来自MB-231细胞的全细胞膜组分的糖苷酶处理减少了被识别抗原的质量。这表明7BD-33-11A抗体所识别的抗原由至少一种糖蛋白组成。抗原游动性的显著改变仅发生在几种酶一起使用时的事实表明，至少一些糖类部分由复合N联糖类组成。尽管使用糖苷酶对膜的处理导致分子量改变，但其没有降低结合的强度。这表明抗体主要结合至糖蛋白的多肽部分。

实施例2

由7BD-33-11A结合的抗原的鉴定

本实施例具体的数据之前已经在S.N.10/810,751中描述，其内容通过引用结合入本文。

1.0来自MB-231全细胞膜组分的抗原的免疫沉淀

使用适当体积的1×裂解缓冲液(50mM Tris pH7.4，150mMNaCl，1％Triton X-100，0.02％NaN₃，2mM原钒酸钠，50mM氟化钠，和蛋白酶抑制剂鸡尾酒(Roche Diagnostics，Manheim，Germany))并使用适当体积的2×RIPA缓冲液(50mM Tris pH7.4，150mM NaCl，1.0％牛胆酸钠，0.2％SDS，1％Triton X-100和0.02％NaN₃)稀释全细胞膜提取物(5mg全蛋白)至1mg/mL最终蛋白质浓度，以获得最终1×RIPA缓冲液的浓度。所述提取物预先经蛋白质G-Sepharose珠(Amersham Biosciences，Uppsala，Sweden)于4℃下清洁2小时。移出全细胞膜提取物并添加BSA原液(10mg/mL)至0.5mg/mL的最终BSA浓度。在提取物被预先清洁的同时，使用1mL的0.5mg/mL的BSA通过在4℃下保温来封闭抗体结合的蛋白质G-Sepharose珠(60g抗体化学交联至30μl蛋白质G Sepharose)，也持续2小时。封闭后，抗体结合的珠经1x RIPA缓冲液洗涤两次，持续5分钟。然后将抗体结合的蛋白质G-Sepharose珠添加至含有全细胞膜提取物的BSA，在end-over-end振荡器上于4℃下保温3小时。经4℃下20,000g离心10秒钟后，移出并弃掉未结合的组分，所述珠洗涤3次，持续5分钟，每洗涤步骤使用1mL的RIPA缓冲液。然后所述珠用1.5mL的PBS冲洗一次。使用7BD-33-11A结合的蛋白质G Sepharose进行如上所述免疫沉淀(IP)，其与其中蛋白质G-Sepharose珠与IgG2a同种型对照(BD Biosciences，San Diego，CA)化学交联的类似IP平行进行。该步骤的进行实现了对蛋白质至免疫复合体的非特异性结合的评价。经完全排出PBS后，所述珠于40μl非还原样品缓冲液中煮沸，样品通过1D SDS-PAGE分析，随后一部分胶进行Western免疫印迹，使用Coomassie Colloidal Blue染色剩余部分的胶。40μl，部分(8μl)上样至SDS-PAGE用于Western印迹，剩余部分(32μl)上样至同样胶的分离泳道，用于CoomassieColloidal Blue的蛋白质染色。指定用于蛋白质染色的凝胶部分使用Coomassie Colloidal Blue染料浸泡过夜。指定用于Western印迹的凝胶部分在320mA下转膜2小时至PVDF膜，使用去离子水冲洗，使用5％乳的TBST室温下封闭1小时，然后使用7BD-33-11A(于5％乳的TBST溶液中)4℃保温过夜。印迹在TBST中洗涤3次，持续10分钟，并使用HRP-结合的Fc-特异性山羊抗鼠IgG(1∶5000)在5％乳的TBST中室温保温1小时。然后印迹经洗涤3次持续10分钟，并使用TMB过氧化物酶底物试剂盒根据包装说明书显影。如图4中所显示的，Western免疫印迹和Coomassie Colloidal Blue染色的凝胶凝胶成一排，使用分子量标记作为参考。使用CoomassieColloidal Blue染色的主条带和与Western印迹上7BD-33-11A反应的主条带成一排。这部分在图4中突出显示(矩形插入物)。

2.0肽作图，和通过质谱的抗原鉴定

通过上述实验，然后将与Western印迹上最强烈反应性成一排的Coomassie Colloidal Blue染色凝胶上的条带切出，并使用可商业获得的试剂盒(Pierce，Rockford，IL)进行凝胶内胰蛋白酶消化。消化液的小份在SELDI-TOF Ciphergen PBSIIc读数器(CiphergenBiosystems Inc.，Freemont，CA)上进行质谱分析。简言之，小份消化液被人工点斑于H4 芯片(Ciphergen Biosystems Inc.，Freemont，CA)上。干燥后，小份CHCA基质(α-氰基4-羟基cinnaminic acid；Ciphergen Biosystems Inc.，Freemont，CA)添加至所述芯片的同一斑点上，并使之干燥。然后在PBSIIc读数器上分析样品。来自同种型对照泳道和空白凝胶区上平行区域的类似大小的条带使用来自7BD-33-11A IP的凝胶填料并排处理，以实现通过消化7BD-33-11A免疫沉淀的抗原而生成的独特肽片段的测定。使用PROFOUND(可公开访问的在线工具，用于使用来自质谱的信息来检索蛋白质序列数据库)检索独特肽片段的质量。然后在QSTAR(Applied Biosystems，Foster City，CA)上对来自7BD-33-11A IP消化液的样品中的独特肽进行MS/MS分析，所述QSTAR配备了能够实现之前在PBSIIc读数器上分析的相同样品的分析的界面。然后使用MASCOT(可公开访问的在线工具，用于使用来自MS/MS谱的信息来检索蛋白质数据库)分析MS/MS数据。图5是从ProFound检索得到的表的概要。表明为推定候选的蛋白(具有显著程度的置信度)的唯一蛋白是CD63。图6是MASCOT检索得到的表的概要。经鉴定具有高度概率的唯一蛋白质是CD63，支持了之前通过肽图指纹的推测鉴定。

3.0 7BD-33-11A抗原ID确认

通过测定已知的抗人类CD63单克隆抗体RFAC4(CymbusBiotechnology LTD，Hants，UK)and H5C6(BD Biosciences，SanDiego，CA)是否会与7BD-33-11A免疫沉淀的蛋白质反应来进行7BD-33-11A的推定抗原的ID确认，反之亦然。通过来自诱导和非诱导细菌的总溶解产物的免疫印迹进行进一步确认，所述细菌经人类CD63的细胞外结构域的谷光甘肽S-转移酶(GST)-融合构建物转化。通过1D SDS-PAGE及随后的Western免疫印迹分析了使用单克隆抗体7BD-33-11A、RFAC4、H5C6以及使用IgG2a和IgG1(BD Biosciences，San Diego，CA)同种型对照从MB-231全细胞膜制备的免疫沉淀物。在复制凝胶上分析来自各免疫复合体样品的相等部分体积。在电印迹至PVDF膜上后，来自复制凝胶的印迹使用单克隆抗体7BD-33-11A、RFAC4、H5C6和IgG2a和IgG1同种型对照进行平行探针检测。图7a描述了交叉IP实验的结果，其中通过Western免疫印迹分析了由各自测试单克隆抗体7BD-33-11A和RFAC4所免疫沉淀的物质。图7b显示了交叉IP实验的结果，其中通过Western免疫印迹分析了由各自测试单克隆抗体7BD-33-11A和H5C6所免疫沉淀的物质。单克隆抗体7BD-33-11A、RFAC4和H5C5各自与7BD-33-11A免疫沉淀的类似抗原交叉反应。另外，在Western印迹上，7BD-33-11A与20-80kDa范围内的RFAC4和H5C6免疫沉淀的类似抗原交叉反应，但不与使用同种型对照抗体制备的免疫复合体交叉反应。使用同种型对照抗体探针检测的斑点是完全阴性的。该数据表明7BD-33-11A抗体所识别的表位包含在CD63抗原内。

为确定交叉反应性是否可归因于被所有抗体识别的相同分子，或者其是否归因于具有类似质量的相互作用分子的存在，在增加的缓冲液严紧性条件下(50mM Tris pH7.4，1％Triton X-100，和变化的NaCl浓度：0、150、500和2000mM；以及使用上述但含有500mMNaGl的RIPA缓冲液)进行了与抗体7BD-33-11A的免疫沉淀。然后通过Western免疫印迹使用单克隆抗体7BD-33-11A、H5C6和RFAC4以及使用同种型对照IgG2a和IgG1探针检测所生成的免疫复合体。图8显示了变化的IP条件的严紧性对免疫复合体的生成没有任何可测的影响，这表明被抗体7BD-33-11A识别的分子也被抗体CD63抗体识别，并且反之亦然。

为进一步确认7BD-33-11A直接结合至人CD63抗原，通过Western免疫印迹评价了其对大肠杆菌(E.coli)溶解产物的反应性，所述大肠杆菌表达了含有人类CD63细胞外结构域(环EC1和EC2)的重组融合多肽。为此研究，通过将适当的cDNA片段亚克隆入细菌表达载体PGEX-4T-2(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)中而产生了CD63的细胞外环(分别为环1和环2-EC1和EC2)的GST融合构建物。使用全长人类cDNA作为模板通过聚合酶链式反应扩增(PCR)获得了编码所述环的cDNA片段(克隆MGC-8339，美国典型菌种保藏中心(American Type Culture Collection)Manassas，VA)。使用下述PCR引物获得了编码EC1环的cDNA：

5’引物(EC1_5’)，5’GCCGTGGGATCCGGGGCACAGCTTGTCCTG3’和

3’引物(EC1_3’)，5’GATGACGAATTCTCACAGAGAGCCAGGGGTAGC3’。

使用下述PCR引物获得了编码EC2环的cDNA：

5’引物(EC2_5’)，5’GGCTATGGATCCAGAGATAAGGTGATG3’和

3’引物(EC2_3’)，5’TACCAGAATTCAATTTTTCCTCAGCCAGCC3’。

PCR反应条件如下：2μL的5’引物(25pmol/μL)，2μL的3’引物(25pmol/μL)，0.2μL的模板DNA(pOTB-CD63，0.76mg/mL)，和45.8μL的PCR SuperMix High Fidelity(Invitrogen，Burlington，ON)。PCR反应如下进行：94℃、5分钟，随后30个循环：每个循环94℃解链30秒、55℃退火30秒和72℃延伸1分钟。

亚克隆后，将构建物(包括单独PGEX-4T-2载体的阴性对照(没有cDNA片段亚克隆入所述载体))转化入大肠杆菌(株BL-21)。培养来自各转化的单个的氨苄西林抗性菌落，并测序各自的插入cDNA。确认所述cDNA序列正确之后，在液体培养基中培养各克隆，并通过添加1mM IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)  (Gibco-BRL；Rockville，MD)诱导了GST融合构建物的表达。2小时的培养后，细菌培养物在室温下2000g离心5分钟。弃掉上清液，并在非还原性SDS-PAGE样品缓冲液中煮沸细菌的片状沉淀。然后如之前所述，通过SDS-PAGE(聚丙烯酰胺层积胶和分离胶分别为5％和12％)和Western免疫印迹分析所述样品。使用7BD-33-11A、H5C6、RFAC4或使用IgG2a同种型对照探针检测印迹膜。图9描述的结果表明，7BD-33-11A特异性识别人类CD63的环2(氨基酸108-202)(7BD-33-11A探针检测的印迹的泳道6)，并不识别环1(氨基酸34-52)。两个良好表征的抗人类CD63抗体(RFAC4和H5C6)也仅在表达EC2融合多肽的诱导的大肠杆菌的溶解产物上识别了类似大小的条带，该发现进一步确认了针对细菌溶解产物的抗体特异性。所有上述结果表明，7BD-33-11A识别并直接结合至人类CD63，并特异性结合至包含氨基酸108-202的细胞外区域。

实施例3

1A245.6和H460-22-1结合的抗原的鉴定

1.0来自MB-231全细胞膜组分的抗原的免疫沉淀

使用适当体积的1×裂解缓冲液(50mM Tris pH7.4，150mMNaCl，1％Triton X-100，0.02％NaN₃，2mM原钒酸钠，50mM氟化钠，和蛋白酶抑制剂鸡尾酒(Roche Diagnostics，Manheim，Germany))并使用适当体积的2×RIPA缓冲液(50mM Tris pH7.4，150mM NaCl，1.0％牛胆酸钠，0.2％SDS，1％Triton X-100和0.02％NaN₃)稀释全细胞膜提取物(1mg全蛋白)，以获得最终1×RIPA缓冲液的浓度。所述提取物预先经蛋白质G-Sepharose珠(AmershamBiosciences，Uppsala，Sweden)于4℃下清洁2小时。移出全细胞膜提取物并添加BSA原液(10mg/mL)至0.5mg/mL的最终BSA浓度。在提取物被预先清洁的同时，使用1mL的0.5mg/mL的BSA通过在4℃下保温来封闭抗体结合的蛋白质G-Sepharose珠(60g抗体化学交联至30μl蛋白质G Sepharose)，也持续2小时。封闭后，抗体结合的珠经1x RIPA缓冲液洗涤两次，持续5分钟。然后将抗体结合的蛋白质G-Sepharose珠添加至含有全细胞膜提取物的BSA，在end-over-end振荡器上于4℃下保温3小时。经4℃下20,000g离心10秒钟后，移出并弃掉未结合的组分，所述珠洗涤3次，持续5分钟，每洗涤步骤使用1mL的RIPA缓冲液。然后所述珠用1.5mL的PBS冲洗一次。使用蛋白质G Sepharose结合的单克隆抗体7BD-33-11A、1A245.6、H460-22-1、IgG1同种型对照、IgG2a同种型对照和H460-16-2(后者是已知特异性识别CD44的良好表征的抗体)平行进行免疫沉淀(IP)。经完全排出PBS后，所述珠于40μl非还原样品缓冲液中煮沸，样品通过1D SDS-PAGE以及随后的Western免疫印迹分析。复制胶在320mA下转膜2小时至PVDF膜。然后所述膜用去离子水冲洗，使用5％乳的TBST室温下封闭1小时。然后复制膜使用单克隆抗体RFAC4(抗CD63)、1A245.6、H460-22-1、H460-16-2以及使用同种型对照IgG1和IgG2a于5％乳的TBST中4℃保温过夜。印迹在TBST中洗涤3次，持续10分钟，并使用HRP-结合的Fc-特异性山羊抗鼠IgG(1∶5000稀释)在5％乳的TBST中室温保温1小时。然后印迹经洗涤3次持续10分钟，并根据有关HRP的TMB底物标准程序显影。如图10中显示的，使用抗体RFAC4(抗CD63)、1A245.6和H460-22-1探针检测的印迹显示了同样的反应性模式。所有三个抗体与抗体7BD-33-11A、H460-22-1和1A245.6(分别为泳道3、4和5)免疫沉淀的物质交叉反应，所述物质反应性特征为表观分子量范围从20至80kDa。在使用未分级的全细胞膜清洁剂提取物上样的泳道(泳道1)上也观察到了类似的反应性。另外，这些抗体没有一个与被抗CD44抗体H460-16-2(泳道2)免疫沉淀的物质交叉反应，后者没有识别被不同于H460-16-2的抗体(泳道3、4和5)免疫沉淀的物质。在使用同种型对照抗体探针检测的复制印迹上没有检测到非特异性的交叉反应性。因此，这些结果强烈表明抗体1A245.6和H460-22-1识别了与抗体RFAC4和7BD-33-11A一样的抗原分子CD63。

2.0 1A245.6和H460-22-1抗原ID确认

为确认1A245.6和H460-22-1直接结合至人CD63抗原，通过Western免疫印迹评价了其对大肠杆菌溶解产物的反应性，所述大肠杆菌表达了含有人类CD63细胞外结构域(环EC1和EC2)的重组融合多肽。为此研究，通过将适当的cDNA片段亚克隆入细菌表达载体PGEX-4T-2(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)中而产生了CD63的细胞外环(分别为环1和环2-EC1和EC2)的GST融合构建物。使用全长人类cDNA作为模板通过聚合酶链式反应扩增(PCR)获得了编码所述环的cDNA片段(克隆MGC-8339，美国典型菌种保藏中心(American Type Culture Collection)Manassas，VA)。使用下述PCR引物获得了编码EC1环的cDNA：

5’引物(EC1_5’)，5’GCCGTGGGATCCGGGGCACAGCTTGTCCTG3’和

3’引物(EC1_3’)，5’GATGACGAATTCTCACAGAGAGCCAGGGGTAGC3’。

使用下述PCR引物获得了编码EC2环的cDNA：

5’引物(EC2_5’)，5’GGCTATGGATCCAGAGATAAGGTGATG3’和

3’引物(EC2_3’)，5’TACCAGAATTCAATTTTTCCTCAGCCAGCC3’。

PCR反应条件如下：2μL的5’引物(25pmol/μL)，2μL的3’引物(25pmol/μL)，0.2μL的模板DNA(pOTB-CD63，0.76mg/mL)，和45.8μL的PCR SuperMix High Fidelity(Invitrogen)。PCR反应如下进行：94℃、5分钟，随后30个循环：每个循环94℃解链30秒、55℃退火30秒和72℃延伸1分钟。

亚克隆后，将构建物(包括单独PGEX-4T-2载体的阴性对照(没有cDNA片段亚克隆入所述载体))转化入大肠杆菌(株BL-21)。培养来自各转化的单个的氨苄西林抗性菌落，并测序各自的插入cDNA。确认所述cDNA序列正确之后，在液体培养基中培养各克隆，并通过添加1mM IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)(Gibco-BRL；Rockville，MD)诱导了GST融合构建物的表达。2小时的培养后，细菌培养物在室温下2000g离心5分钟。弃掉上清液，并在非还原性SDS-PAGE样品缓冲液中煮沸细菌的片状沉淀。然后如之前所述，通过SDS-PAGE(聚丙烯酰胺层积胶和分离胶分别为5％和12％)和Western免疫印迹分析所述样品。使用1A245.6、H460-22-1、RFAC4、H460-16-2以及IgG1和IgG2a同种型对照探针检测印迹膜。所有抗体使用浓度为5μg/mL。图11描述的结果表明，1A245.6和H460-22-1特异识别人类CD63的环2(氨基酸108-202)(1A245.6和H460-22-1探针检测的印迹的泳道6)，并不识别环1(氨基酸34-52)，单独的GST载体也不识别。良好表征的抗人类CD63抗体(RFAC4)也仅在表达GST-EC2融合多肽的大肠杆菌的溶解产物上识别了类似大小的条带，该发现进一步确认了针对细菌溶解产物的抗体特异性。另外，识别人类CD44(H460-16-2)的抗体没有识别该实验中表达的任何重组蛋白质。所有上述结果表明，1A245.6和H460-22-1识别并直接结合至人类CD63，并特异性结合至包含氨基酸108-202的细胞外区域。

实施例4

如S.N.10/348,231、S.N.10/603,006、S.N.10/810,751和S.N.10/891,866(其各自内容通过引用结合入本文)中有关杂交瘤细胞系7BD-33-11A和1A245.6以及本文有关杂交瘤细胞系H460-22-1所描述的，所述三个杂交瘤克隆都根据布达佩斯条约保藏在美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，10801University Blvd.，Manassas，VA 20110-2209)，H460-22-1保藏日为2003年9月4日，保藏号为PTA-4622；1A245.6和7BD-33-11A保藏日为2003年1月8日，保藏号分别为PTA-4889和PTA-4890。根据37 CFR 1.808，保藏人保证所有对公众获取所述保藏物质的限制将在专利授权时永久取消。

抗体生成：

通过在CL-1000摇瓶(BD Biosciences，Oakville，ON)培养杂交瘤(每周两次收集并再接种)而生成了H460-22-1、1A245.6和7BD-33-11A单克隆抗体。使用Protein G Sepharose 4 Fast Flow(Amersham Biosciences，Baie d’Urfé，QC)根据标准抗体纯化程序纯化了抗体。

如之前S.N.10/348,231、S.N.10/603,006、S.N.10/810,751和S.N.10/891,866(其各自内容通过引用结合入本文)中有关杂交瘤细胞系7BD-33-11A和1A245.6所描述的以及本文有关杂交瘤细胞系H460-22-1所描述的，所述三个抗体再细胞毒性测定中与许多阳性(抗Fas(EOS9.1，IgM，κ，20微克/mL，eBioscience，San Diego，CA)、抗Her2/neu(IgG1，κ，10微克/mL，Inter Medico，Markham，ON)、抗EGFR(C225，IgG1，κ，5微克/mL，Cedarlane，Hornby，ON)、放线菌酮(100微摩尔，Sigma，Oakville，ON)、NaN₃(0.1％，Sigma，Oakville，ON))和阴性(107.3(抗TNP，IgG1，κ，20微克/mL，BDBiosciences，Oakville，ON)、G155-178(抗TNP，IgG2a，κ，20微克/mL，BD Biosciences，Oakville，ON)、MPC-11(抗原特异性未知，IgG2b，κ，20微克/mL)，J606(抗果聚糖，IgG3，κ，20微克/mL)，IgG缓冲液(2％))对照相比较(表1和2)。测试了乳腺癌(MB-231，MB-468，MCF-7)、结肠癌(HT-29，SW1116，SW620)、肺癌(NCIH460)、卵巢癌(OVCAR)、前列腺癌(PC-3)、黑素瘤(A2058，A357和A549)和非癌(Hs578.Bst，CCD 27sk，Hs888 Lu)细胞系(全部来自ATCC，Manassas，VA)。从Molecular Probes(Eugene，OR)获得存活/死亡细胞毒性测定法。所述测定根据生产商说明书进行，且具有下述改变。细胞在检测前以预定的适当密度铺板。2天后，纯化的抗体或对照稀释入培养基，然后将100μL转移至细胞板并于5％CO₂培养箱培养5天。然后倒空所述板并吸干。含有MgCl₂和CaCl₂的室温DPBS经由多孔道挤压瓶分散入各板孔，轻打三次，倒空并然后吸干。稀释于含有MgCl₂和CaCl₂的DPBS的50μL钙荧光素染料被添加至各板孔并在37℃下于5％CO₂培养箱中培养30分钟。在Perkin-ElmerHTS7000荧光读板器中读板，并在Microsoft Excel中分析数据，结果制成表1和2。数据表示了四次实验(重复三次测试)的平均，并以下述方式定性表示：4/4实验大于阈值细胞毒性(+++)，3/4实验大于阈值细胞毒性(++)，2/4实验大于阈值细胞毒性(+)。表1中未标记的细胞表示不一致的或作用小于阈值细胞毒性。7BD-33-11A抗体选择性地在乳腺和前列腺肿瘤细胞系中表现了细胞毒性，而对非转化的正常细胞没有毒性。7BD-33-11A和1A245.6对前列腺癌细胞系表现出比对照抗Fas或抗EGFR抗体更大的杀伤。H460-22-1对MB-231细胞系表现出比抗Fas或抗EGFR更大的杀伤。化学毒性剂诱导了其预期细胞毒性，而被包括用于比较的许多其他抗体也如预期的进行了给定的生物细胞测定限制。总之，显示了7BD-33-11A、1A245.6和H460-22-1抗体对许多癌细胞类型具有细胞毒活性。这些抗体的活性是选择性的，因为并非所有的癌细胞类型是敏感的。进一步地，所述抗体表现出功能特异性，因为其没有对非癌细胞类型产生细胞毒性，这在治疗环境中是重要的因素。

表1

		乳腺			结肠			肺	卵巢	前列腺	正常
													MB-231	MB-468	MCF-7	HT-29	SW1116	SW620	NCIH460	OVCAR	PC-3	CCD 27sk	Hs888Lu
			7BD-33-11A			+						++
	1A245.6														+						++
		阳性对照	抗体Fas			+++					+++	+													+
抗体Her2	+													+					+
			抗体EGFR		+++	+		+++			+												+
CHX(100LM)	+++												+++	+++	+++	+++	+++	+++	+++	+++	+++	+++
			NaN3(0.1％)	+++	+++	+++	+++			+++	+++	+++
阴性对照	IgG1																		+++		+
		IgG2a			+++		+
	IgG2b														+++
		IgG3
	IgG缓冲液												+

表2

		黑素瘤			结肠	乳腺		肺	卵巢	前列腺	正常
															克隆	A2058	A375	A549	HT-29	MB-231	MB-468	NCIH460	OVCAR	PC-3	Hs578Bst	CCD27sk	Hs888Lu
	H460-22-1	++	+			+++	+
														阴性对照	IgG1同种型					+	+
IgG缓冲液						+	+		+
													阳性对照		aFas	++	+++						+++
aHer2								++
														CHX	+++	+++	+++	+++	+++	+++	+++	+++	+++	+++	+++	+++

通过流式细胞术(FACS，参考S.N.10/348,231、S.N.10/603,006和S.N.10/810,751，其各自内容通过引用结合入本文)评价了7BD-33-11A对上述名单的癌细胞系和正常细胞系以及对下述其他癌细胞系的结合：结肠(LOVO)、胰脏(BxPC-3)、卵巢(ES-2，OCC-1)和前列腺(DU-145)，以及下述其他正常细胞系(CCD-112)。还通过FACS评价了1A245.6(参考S.N.10/348,231、S.N.10/603,006、S.N.10/810,751和S.N.10/891,866，其各自内容通过引用结合入本文)和H460-22-1对上述名单的癌细胞系和正常细胞系的结合。通过开始使用DPBS(不含Ca⁺⁺和Mg⁺⁺)洗涤细胞单层，使细胞准备好用于FACS。然后使用细胞离解缓冲液(INVITROGEN，Burlington，ON)使细胞从其37℃细胞培养板上移出。经离心和收集后，细胞重悬于4℃的Dulbecco’s磷酸缓冲盐水(含有MgCl₂、CaCl₂和2％或25％的胎牛血清(FBS))(洗涤介质)并计数，稀释至适当细胞密度，离心以沉淀所述细胞并重悬于含有20μg/mL的7BD-33-11A或对照抗体(同种型对照或抗EGFR)的染色介质(含有MgCl₂和CaCl₂+/-2％FBS的DPBS)，冰上30分钟。在添加Alexa Fluor 488结合的二次抗体之前，使用洗涤介质洗涤细胞一次。然后将Alexa Fluor488结合的二次抗体添加至染色介质，持续20至30分钟。然后最后洗涤一次细胞，并重悬于含有1μg/mL碘化丙啶或1.5％多聚甲醛的染色介质中。通过使用CellQuest软件(BD Biosciences)在FACScan上扫描样品评价了细胞的流式细胞采集。通过调节FSC和SSC检测器上电压和幅度获得而设置了前散射(FSC)和侧散射(SSC)。通过使用纯化的同种型对照抗体并随后Alexa Fluor 488结合的二次抗体染色细胞来调节三种荧光通路的检测器(FL1、FL2和FL3)，以便细胞具有一致的峰，且中位荧光强度约1-5单位。通过门控FSC和碘化丙啶排除(当使用时)获得了活细胞。对于每个样品，获得了约10,000个活细胞用于分析，结果表示于表3、4和5。表3、4和5分别列出了7BD-33-11A、1A245.6和H460-22-1高于同种型对照的平均荧光强度倍增，并定性表示为：5(-)；5至50(+)；50至100(++)；高于100(+++)并且在括号内，染色细胞的百分比。

7BD-33-11A、1A245.6和H460-22-1抗体的代表性直方图分别汇编为图12、13和14。7BD-33-11A表现了对乳腺(MB-231和MCF-7)、结肠(HT-29、SW1116和SW520)、肺、卵巢、胰脏和前列腺(PC-3)来源的癌细胞系的相似结合，以及对乳腺(MB-468)、结肠(LOVO)和前列腺(DU-145)癌细胞系之一的不同结合。1A245.6表现了对乳腺(MB-231、MB-468和MCF-7)、结肠(SW1116和SW520)、肺、卵巢和前列腺来源的癌细胞系的相似结合，以及对结肠(HT-29)癌细胞系之一的不同结合。H460-22-1表现了对受试癌细胞系的相似结合。还存在7BD-33-11A、1A245.6和H460-22-1对非癌细胞的结合，然而，所述结合没有产生细胞毒性。这进一步证明了结合不必然预示其同族抗原的抗体连接的结果，并且是非显而易见的发现。这表明不同细胞中的抗体连接环境决定了细胞毒性，而非仅仅抗体结合。

表3

		7BD-33-11AIgG2a，κ	抗EGFRIgG1，κ
				乳腺	MB-231	+	++
MB-468	-	++
			MCF-7		+	-
结肠	HT-29	+					+
			LOVO	-	-
	SW1116	+				+
			SW620	+	-
	肺	NCI H460				+	+
卵巢			ES-2	+	+
	OOC-1	+				+
			OVCAR	+	+
	胰脏	BxPC-3				+	+
前列腺			DU-145	-	+
	PC-3	+				+
			正常	CCD27sk	+		+
CCD-112	+	+
				Hs888Lu	+	+

表4

		乳腺			结肠			肺	卵巢	前列腺	正常
													抗体	同种型	MB-231	MB-468	MCF-7	HT-29	SW1116	SW620	NCIH460	OVCAR	PC-3	CCD27sk	Hs888Lu
1A245.6	IgG1，k	+	+	+	++	+	+	+	+	+	+	+
													抗EGFR	IgG1，k	++	++	-	+	+	-	+	+	+	+	+

表5

		肺		结肠	前列腺	卵巢	黑素瘤		乳腺		正常
														抗体	同种型	NCIH460	A549	HT-29	PC-3	OVCAR	A375	A2058	MB-2321	MB-468	Hs578Hst	CCD27sk	Hs888Lu
H460-22-1	IgG1，k	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+
														抗EGFR	IgG1，k	+	+	++	+	++	+	-	+++	+++	+	+	++

实施例5

正常人组织染色

进行了IHC研究来表征7BD-33-11A、H460-22-1和1A245.6抗原在人体内的分布。之前已经讨论了关于7BD-33-11A(S.N.10/603,006、S.N.10/810,751，其各自内二薛通过引用结合入本文)和1A245.6(S.N.10/603,006，其内容通过引用结合入本文)的这些数据。之前进行了IHC优化研究，以确定进一步实验的条件。如上所述生成并纯化了7BD-33-11A、H460-22-1和1A245.6单克隆抗体。

组织切片通过在烘箱中58℃干燥1小时而被去石蜡化，并各自在染色缸(Coplin jars)中通过浸入二甲苯5次(持续4分钟)而脱蜡。通过一系列分级乙醇洗涤液(100％-75％)处理后，所述切片在水中重新水合。载玻片浸入10mM柠檬酸盐缓冲液(pH6)(Dako，Toronto，Ontario)，然后各自在高、中和低功率设置下微波5分钟，最后浸入冷的PBS。然后将载玻片浸入3％的过氧化氢溶液6分钟，PBS洗涤三次，每次5分钟，干燥，用Universal封闭溶液(Dako，Toronto，Ontario)室温处理5分钟。7BD-33-11A、1A245.6、H460-22-1、单克隆鼠抗波形蛋白(Dako，Toronto，Ontario)或同种型对照抗体(导向黑曲霉(Aspergillus niger)葡萄糖氧化酶，一种在哺乳动物组织中既不存在也不可诱导的酶；Dako，Toronto，Ontario)稀释于抗体稀释缓冲液(Dako，Toronto，Ontario)至其工作浓度(各抗体为5μg/mL)并在室温下培养1小时。所述载玻片经PBS洗涤3次，每次5分钟。使用所提供的HRP结合的二次抗体(DakoEnvision System，Toronto，Ontario)室温检测/显像原发性抗体的免疫反应性30分钟。该步骤后，使用PBS洗涤载玻片3次，每次5分钟，并通过添加用于免疫过氧化物酶染色的DAB(3，3’-二氨基联苯四氢氯化物，Dako，Toronto，Ontario)色原体底物溶液室温下进行颜色反应10分钟。自来水洗涤载玻片终止了显色反应。使用Meyer’s Hematoxylin(Sigma Diagnostics，Oakville，ON)复染之后，所述载玻片使用分级乙醇(75-100％)脱水，并使用二甲苯清洁。使用封固剂(Dako Faramount，Toronto，Ontario)封盖了载玻片。使用Axiovert200(Zeiss Canada，Toronto，ON)显微镜检查载玻片，并且使用Northern Eclipse Imaging software(Mississauga，ON)获得并储存了数字图像。组织病理学家对结果进行审阅、评分和解释。

使用人正常器官组织阵列(Imgenex，San Diego，CA)进行了抗体对59种正常人组织的结合。表6总结了正常人组织阵列的7BD-33-11A、H460-22-1和1A245.6的染色结果。根据表，有3类组织染色。一组组织是完全阴性的。对于7BD-33-11A，这些组织包括正常的皮肤、脑、卵巢、胸腺、小肠、食管、心脏(图15A)、胆囊和淋巴结。对于H460-22-1，完全阴性的组织包括皮下脂肪和脑(图15C)。对于1A245.6，完全阴性的组织包括皮肤、皮下脂肪、食管和脑(图15B)。第二组包括了表现出阳性染色的组织。对于7BD-33-11A，这些包括肝和胰腺。使用该抗体，扁桃体具有最强的染色。对于H460-22-1，阳性染色发生于肝、心脏、睾丸、甲状腺、肾上腺和子宫肌层。类似于H460-22-1，1A245.6阳性染色发生于肝、心脏、睾丸、甲状腺、肾上腺和子宫肌层。与7BD-33-11A一样，H460-22-1和1A245.6对扁桃体的染色最强。第三组组织包括其中在组织切片中为阳性的组织，但不限于侵润性巨噬细胞、淋巴细胞、成纤维细胞或上皮细胞，例如胃，对于7BD-33-11A、1A245.6和H460-22-1(分别为图16A和B和C)。应该注意，7BD-33-11A抗原不存在于几种重要器官的细胞上，包括肾、心(图15A)和肺。总之，与H460-22-1和1A245.6相比较，7BD-33-11A结合至正常人组织的较小亚型，且在阳性组织中的结合为弱至中先等。H460-22-1和1A245.6染色虽然更广泛，但通常在强度上为弱至中等。这些结果表明，7BD-33-11A的抗原不广泛表达于正常组织上，且所述抗体将特异性结合至有限数目的人类组织。另外，H460-22-1和1A245.6的抗原除了存在于心脏和肝中以外，限于上皮细胞和侵润性淋巴细胞、巨噬细胞和成纤维细胞。

表6：H460-22-1、1A245.6和7BD-33-11A在正常人组织阵列上的IHC概要

序号	器官	H460-22-1	1A245.6	7BD-33-11A	波形蛋白	同种型对照
							1.	皮肤*	+/-成纤维细胞	-	-	+++成纤维细胞	-
2.	皮肤*	CS	-	-	+++成纤维细胞	-
							3.	皮下脂肪	-	-	-	++脂肪细胞	-
4.	乳腺	+/-成纤维细胞	+/-成纤维细胞	-	++内皮细胞&血管平滑肌	-
							5.	乳腺	+++小叶上皮细	+++小叶上皮细	+/-成纤维细	++血管&基质	-

		胞	胞	胞
							6.	脾	++淋巴细胞	++淋巴细胞	+/-淋巴细胞	+++窦状腺内皮细胞&淋巴细胞	-
7.	脾	+++淋巴细胞	+++淋巴细胞	+/-淋巴细胞	+++窦状腺内皮细胞&淋巴细胞	-
							8.	淋巴结	++血管内皮细胞&淋巴细胞	++血管内皮细胞&淋巴细胞	-	+++淋巴细胞	-
9.	淋巴结	+血管内皮细胞	+血管内皮细胞	-	++血管&淋巴细胞	-
							10.	骨骼肌	+/-血管内皮细胞	+/-血管内皮细胞	-	+/血管	-
11.	鼻粘膜	-NR	-NR	-NR	-NR	CS
							12.	肺	+/-肠细胞(巨噬细胞&成纤维细胞)	+/-肠细胞(巨噬细胞)	-	++Alevolar上皮细胞&巨噬细胞	-
13.	肺	++细支气管上皮细胞，+++巨噬细胞	+细支气管上皮细胞，++巨噬细胞	+巨噬细胞	++Alevolar上皮细胞，巨噬细胞&淋巴细胞	-
							14.	支气管	-NR	-NR	-NR	NR，++chrondrocytes	-NR
15.	心脏	++心肌	++心肌	-**	+++血管	-**
							16.	唾液腺	++腺泡上皮细胞	++腺泡上皮细胞	+腺泡上皮细胞	+++血管&外周神经	-
17.	肝	+++肝细胞	+++肝细胞	++肝细胞	+++血管	-
							18.	肝	+++肝细胞	+++肝细胞	+肝细胞	+++血管&巨噬细胞	-
19.	肝	++肝细胞	+肝细胞	+/-肝细胞	+/-血管	-
							20.	胆囊	++粘膜上皮细胞，成纤维四包&平滑肌纤维	++粘膜上皮细胞，成纤维四包&平滑肌纤维	-	+++淋巴细胞	-
21.	胰腺	+++腺泡上皮细胞&胰岛	+++腺泡上皮细胞&胰岛	+腺泡上皮细胞	+++腺泡上皮细胞&血管	-
							22.	胰腺	+++腺泡上皮细胞&胰岛	+++腺泡上皮细胞&胰岛	++腺泡上皮细胞	+++腺泡上皮细胞& 血管	-
23.	扁桃体	+++角蛋白，++淋巴细胞	+++角蛋白，+淋巴细胞	+++角蛋白，+/-淋巴细胞	+++淋巴细胞	-
							24.	食管	-	-	-	++血管	-
25.	食管	+/-成纤维细胞	-	-	+++血管	-
							26.	胃体***	++胃腺上皮细胞&鼓膜纤维层中的淋巴细胞	+/-胃腺上皮细胞，++鼓膜纤维层中的淋巴细胞	++胃腺上皮细胞	+++血管&成纤维细胞	-
27.	胃体***	+++胃腺上皮细胞，++鼓膜纤维层中的淋巴细胞	+++胃腺上皮细胞，+鼓膜纤维层中的淋巴细胞	++胃腺上皮细胞	+++淋巴细胞，血管&成纤维细胞	-
							28.	胃腔	++胃腺上皮细胞&鼓膜纤维层中的淋巴细胞	+/胃腺上皮细胞，+淋巴细胞	++胃腺上皮细胞	+++淋巴细胞	-
29.	胃平滑肌	-	-	-	+++淋巴细胞&血管	-
							30.	十二指肠	++粘膜&腺上皮细胞，+++淋巴细胞	+++淋巴细胞	+肠腺上皮细胞	++成纤维细胞&血管	-

31.	小肠	+/-鼓膜纤维层中的淋巴细胞	+/-鼓膜纤维层中的淋巴细胞	-	+淋巴细胞&血管	-
							32.	小肠	+/-粘膜上皮细胞，++鼓膜纤维层中的淋巴细胞	+/-鼓膜纤维层中的淋巴细胞	-	+++鼓膜纤维层中的淋巴细胞	-
33.	阑尾	++粘膜上皮细胞，+++淋巴细胞	+++粘膜上皮细胞&淋巴细胞	++淋巴细胞	+++淋巴细胞&血管	-
							34.	结肠	+粘膜上皮细胞，++淋巴细胞	+/-淋巴细胞	+/-鼓膜纤维层中的巨噬细胞	++淋巴细胞	-
35.	结肠	++鼓膜纤维层中的淋巴细胞	+淋巴细胞	-	++淋巴细胞&血管	-
							36.	直肠	+粘膜上皮细胞&鼓膜纤维层中的淋巴细胞	+/-淋巴细胞&血管	-	++淋巴细胞&血管	-
37.	肾皮质	++管状上皮细胞	++管状上皮细胞	-	+++肾小球毛细血管&血管	-
							38.	肾皮质	+++管状上皮细胞	+++管状上皮细胞	+管状上皮细胞	+++管状上皮细胞，肾小球毛细血管&血管	-
39.	肾髓质	+管状上皮细胞&肾盂移行上皮细胞	++管状上皮细胞	-	+++肾管状上皮细胞脂肪细胞&成纤维细胞	-
							40.	膀胱	+++移行上皮细胞	++移行上皮细胞	+/-移行上皮细胞	++血管	-
41.	前列腺	+++腺上皮细胞	+++腺上皮细胞	++腺上皮细胞	+++腺上皮细胞&血管	-
							42.	前列腺	+++腺上皮细胞	+++腺上皮细胞	++腺上皮细胞	+++腺上皮细胞&血管	-
43.	精囊	+粘膜上皮细胞	+粘膜上皮细胞	+/粘膜上皮细胞	+/-	-
							44.	睾丸	++生殖上皮细胞，间质细胞	++生殖上皮细胞，间质细胞	+/-间质细胞	+++腺上皮细胞	-
45.	增殖的子宫内膜	++腺上皮细胞	++腺上皮细胞，+基质	-	++子宫内膜腺&基质	-
							46.	子宫内膜分泌腺	++腺上皮细胞&基质	++腺上皮细胞&基质&基质	-	++腺上皮细，+++血管	-
47.	子宫肌层	+平滑肌纤维	+平滑肌纤维	+/-成纤维细胞	++平滑肌纤维&血管	-
							48.	子宫颈	+/-成纤维细胞	+/-成纤维细胞	-	+++成纤维细胞	-
49.	输卵管	+血管上皮细胞，平滑肌纤维&成纤维细胞	+粘膜上皮细胞&血管	-	+/-粘膜上皮细胞，+++血管	-
							50.	卵巢***	++基质细胞	+基质细胞	-	+++基质细胞	-
51.	胎盘，绒毛	+滋养母细胞	+滋养母细胞	-	++血管	-
							52.	胎盘，绒毛	++滋养母细胞	++滋养母细胞	-	++血管	-
53.	脐带	-	-	-	++成纤维细胞	-
							54.	肾上腺	++内分泌细胞	++内分泌细胞	+/-**	+/-**	+/-**
55.	甲状腺	+/-滤泡细胞	+/-滤泡细胞	-	++滤泡细胞&血管	-

56.	胸腺	+淋巴细胞	+淋巴细胞	-	+++淋巴细胞	-
							57.	脑白质	-	-	-	++星形胶质细胞	-
58.	脑灰质	-	-	-	++血管	-
							59.	小脑	-	-	-	++脑皮质	-

缩写：NR：切片不是代表性的，CS：切片是完全脱去的，*：切片最初在基底层看色，**：切片具有外源细胞质背景染色，***：胃腔(非胃体)，****：仅卵巢间质。

如10/810,751中描述和讨论的(其内容通过引用结合入本文)，因为7BD-33-11A抗原如前通过生物化学方法确定为CD63，所以研究比较了7BD-33-11A与两种导向CD63(RFAC4和H5C6)的抗体。使用人类正常器官组织阵列(Clinomics，Watervliet，NY)进行了抗体对24种正常人组织的结合。所有原发性抗体(7BD-33-11A；RFAC4(Cymbus Biotechnology Ltd.，Hants，UK)和H5C6抗CD63(BDPharMingen，Oakville，ON)；和鼠IgG1阴性对照(Dako，Toronto，ON))稀释于抗体稀释缓冲液(Dako，Toronto，ON)至浓度为5μg/mL(在之前的优化步骤发现是最佳浓度)。通过生产商已知阴性对照抗体对于所有哺乳动物组织都是阴性的。有关THC的程序如上所述。

组织切片通过在烘箱中58℃干燥1小时而被去石蜡化，并各自在染色缸中通过浸入二甲苯5次(持续4分钟)而脱蜡。通过一系列分级乙醇洗涤液(100％-75％)处理后，所述切片在水中重新水合。载玻片浸入10mM柠檬酸盐缓冲液(pH6)(Dako，Toronto，Ontario)，然后各自在高、中和低功率设置下微波5分钟，最后浸入冷的PBS。然后将载玻片浸入3％的过氧化氢溶液6分钟，PBS洗涤三次，每次5分钟，干燥，用Universal封闭溶液(Dako，Toronto，Ontario)室温处理5分钟。7BD-33-11A、1A245.6、H460-22-1、单克隆鼠抗波形蛋白(Dako，Toronto，Ontario)或同种型对照抗体(导向黑曲霉葡萄糖氧化酶，一种在哺乳动物组织中既不存在也不可诱导的酶；Dako，Toronto，Ontario)稀释于抗体稀释缓冲液(Dako，Toronto，Ontario)至其工作浓度(各抗体为5μg/mL)并在室温下培养1小时。所述载玻片经PBS洗涤3次，每次5分钟。使用所提供的HRP结合的二次抗体(Dako Envision System，Toronto，Ontario)室温检测/显像原发性抗体的免疫反应性30分钟。该步骤后，使用PBS洗涤载玻片3次，每次5分钟，并通过添加用于免疫过氧化物酶染色的DAB(3，3’-二氨基联苯四氢氯化物，Dako，Toronto，Ontario)色原体底物溶液室温下进行颜色反应10分钟。自来水洗涤载玻片终止了显色反应。使用Meyer’s Hematoxylin(Sigma Diagnostics，Oakville，ON)复染之后，所述载玻片使用分级乙醇(75-100％)脱水，并使用二甲苯清洁。使用封固剂(Dako Faramount，Toronto，Ontario)封盖了载玻片。使用Axiovert 200(Zeiss Canada，Toronto，ON)显微镜检查载玻片，并且使用Northern Eclipse成像软件(Mississauga，ON)获得并储存了数字图像。组织病理学家对结果进行审阅、评分和解释。

表7显示了正常人组织测试阵列的7BD-33-11A和RFAC4和H5C6抗CD63染色结果的概要。使用7BD-33-11A的组织染色类似于之前描述(S.N.10/603,006，其内容通过引用结合入本文)。应该再次注意，7BD-33-11A显示了对各种细胞类型的限制结合，但结合至侵润性巨噬细胞、淋巴细胞和成纤维细胞。相互比较，RFAC4和H5C6抗体显示了类似的染色模式。然而，RFAC4和H5C6的染色模式非常不同于7BD-33-11A所观察到的染色模式。特别地，RFAC4和H5C6抗体都结合至广泛的正常组织，通常在其中7BD-33-11A也是阳性的组织中具有更高的染色强度，并不仅结合至侵润性巨噬细胞、淋巴细胞和成纤维细胞，还结合至多数组织中的上皮细胞。

对7BD-33-11A呈阳性的组织对RFAC4或H5C6抗CD63抗体也呈阳性。对7BD-33-11A呈阴性的组织一般对RFAC4或H5C6不呈阴性。这些结果表明7BD-33-11A结合至由RFAC4或H5C6抗CD63抗体识别的组织的较小亚型，并且在组织中的染色强度也常常是较小。这些结果显示7BD-33-11A的表位不是广泛表达于正常组织上，并且所述抗体特异性结合至有限数目的人类组织。这也支持了7BD-33-11A导向CD63表位的生化证据，尽管不同于用于这些IHC研究的RFAC4或H5C6抗体所识别的表位。

表7：人类正常组织上RFAC4和H5C6抗CD63与7BD-33-11A的IHC的比较

切片	组织	7BD-33-11A	RFAC4	H5C6
					Aa3	乳腺	-	+(小管上皮细胞和基质成纤维细胞)	+++(小管上皮细胞和基质成纤维细胞)
Aa4	乳腺	+/-(2/3基质成纤维细胞)*小管上皮细胞没有染色	+/-(小管上皮细胞和基质成纤维细胞)	+++(基质成纤维细胞)+/-(小管上皮细胞)
					Ab3	肺	+++(肺泡隔中的巨噬细胞和成纤维细胞)	+++(肺泡隔中的巨噬细胞和成纤维细胞)	+++(alevolar上皮细胞和巨噬细胞)
Ab4	肺	+/-(肺泡隔中的巨噬细胞和成纤维细胞)	+++(肺泡隔中的巨噬细胞和成纤维细胞)	+++(肺泡隔中的巨噬细胞和成纤维细胞)
					Ab5	肺	+++(肺泡隔中的巨噬细胞和成纤维细胞)	+++(肺泡隔中的巨噬细胞利成纤维细胞)	+++(肺泡隔中的巨噬细胞和成纤维细胞)
Ac1	结肠	+++(鼓膜纤维层中的淋巴细胞和巨噬细胞)*粘膜上皮细胞没有染色	+++(鼓膜纤维层中的粘膜上皮细胞、淋巴细胞和巨噬细胞)	+++(鼓膜纤维层中的粘膜上皮细胞、淋巴细胞和巨噬细胞)
					Ac3	结肠	-	-	+/-(鼓膜纤维层中的淋巴细胞)
Ac4	结肠	+++(鼓膜纤维层中的巨噬细胞和成纤维细胞)+(粘膜上皮细胞)	+++(鼓膜纤维层中的巨噬细胞和成纤维细胞)+(粘膜上皮细胞)	+++(鼓膜纤维层中的粘膜上皮细胞、淋巴细胞和巨噬细胞)
					Ac5	结肠	+/-(鼓膜纤维层中的巨噬细胞和成纤维细胞)	+++(鼓膜纤维层中的巨噬细胞和成纤维细胞)+(粘膜上皮细胞)	+++(鼓膜纤维层中的淋巴细胞和巨噬细胞)
Ad1	前列腺	+++(腺上皮细胞)	+++(腺上皮细胞)	+++(腺上皮细胞)
					Ad2	前列腺	+++(腺上皮细胞)	+++(腺上皮细胞)	+++(腺上皮细胞)
Ad4	前列腺	++(腺上皮细胞)	-	+++(腺上皮细胞)
					Ad5	前列腺	+++(腺上皮细胞)	+++(腺上皮细胞)	+++(腺上皮细胞)
Ae1	肾	-	+(管状上皮细胞)	++(管状上皮细胞)
					Ae2	肾	+/-(2/3肠细胞)*小管上皮细胞没有染色	++(管状上皮细胞)	++(管状上皮细胞)
Ae3	肾	+/-(2/3肠细胞)	++(管状上皮细胞)	++(管状上皮细胞)
					Ae4	肝	++(肝细胞和窦状腺染色)	+++(肝细胞&窦状腺染色和胆管上皮细胞)	+++(肝细胞、窦状腺染色利胆管)
Af1	肝	-	++(窦状腺和胆管上皮细胞)	++(窦状腺和胆管上皮细胞)
					Af2	肝	-	+/-(肝细胞和窦状腺染色)	+/-(肝细胞和窦状腺染色)

Af3	淋巴结	-	++(网状细胞)	++(网状细胞)
					Ag1	甲状腺	-	+/-(滤泡细胞)	+/-(滤泡细胞)
Ag2	甲状腺	+++(滤泡细胞)	+++(滤泡细胞)	+++(滤泡细胞)
					Ah1	胎盘	-	+++(合胞体滋养层&绒毛膜绒毛的基底膜)	+++(合胞体滋养层&绒毛膜绒毛的基底膜)
Ah2	胎盘	-	+++(合胞体滋养层&绒毛膜绒毛的基底膜)	+++(合胞体滋养层&绒毛膜绒毛的基底膜)

实施例6

人类乳腺肿瘤组织染色

如S.N.10/603,006、S.N.10/810,751(其各自内容通过引用结合入本文)中部分描述和讨论的，进行了IHC研究以确定7BD-33-11A、H460-22-1和1A245.6抗原与人类乳腺癌之间的癌关联，以及抗体是否可能识别人类癌。比较了波形蛋白(阳性对照)或抗黑曲霉葡萄糖氧化酶抗体(一种在哺乳动物组织中既不存在也不可诱导的酶)(阴性对照)。使用全部3种抗体染色了来自50名乳腺癌患者的乳腺癌组织阵列和来自乳腺癌患者的非瘤乳腺组织的10个样品(Imgenex Corporation，San Diego，CA)。提供了每名患者的年龄、性别和诊断。遵循了实施例5的IHC程序。所有抗体的在5μg/mL的工作浓度下使用。表8a提供了该阵列的7BD-33-11A、H460-22-1和1A245.6抗体染色的概要。

使用7BD-33-11A检测了另外48个乳腺癌(Imgenex Corporation)和9个正常乳腺组织样品(显示于表8b)。7BD-33-11A染色的全部98个切片的汇总结果参考表11。总体上，98名受试患者的37％对7BD-33-11A抗原呈阳性(图17A)，而50名受试患者分别有92％和98％对H460-22-1和1A245.6呈阳性(分别为图17C和B)。对于7BD-33-11A，来自乳腺癌患者的19个正常乳腺组织样品中有0个呈阳性(图18A)。相反，对于H460-22-1和1A245.6，10个正常乳腺组织样品中有9个呈阳性。然而，多数情况下，染色是归因于侵润性成纤维细胞(分别为图18C和B)。如表11中所示，存在7BD-33-11A对雌激素受体阴性乳腺癌、黄体酮阳性乳腺癌和晚期乳腺癌的较高结合趋势(T3&T4)。

关于1A245.6，雌激素和黄体酮受体状态之间明显没有关联，但组织染色的强度确实表现出与较高的肿瘤期相关(表9)。稍高数目的H460-22-1阳性组织也是雌激素和黄体酮受体阳性的，并且趋势是较高的肿瘤期具有较高的阳性表达(表10)。7BD-33-11A、H460-22-1和1A2425.6染色对于癌细胞是特异性的，染色同时发生在细胞膜上和细胞质内。7BD-33-11A、H460-22-1和1A245.6的染色模式显示：在患者样品中，抗体对于恶性细胞是高度特异性的，并且各自的抗原存在于细胞膜上，从而使其成为引人注目的药物靶。

表8a：H460-22-1、1A245.6和7BD-33-11A在50个人乳腺肿瘤和10个正常组织切片上的IHC概要

序号	性别	年龄	器官	H460-22-1	1A245.6	7BD-33-11A	波形蛋白
								1.	F	28	侵润性导管癌	++MC	+++MC	++MC	-肿瘤，+++基质
2.	F	71	实质性乳头癌	+++MC	+++MC	+/-	+/-肿瘤，+++基质
								3.	F	26	侵润性导管癌	+MC	++MC	-	+/-肿瘤，+++基质
4.	F	43	侵润性导管癌	++MC	++MC	+/-	-肿瘤，+++基质
								5.	F	39	侵润性导管癌	+/肿瘤，+++基质	+MC肿瘤，+++基质	+/-	++MC肿瘤，+++基质
6.	F	46	原位导管癌	++MC	++MC	+/-	+/-肿瘤，+血管
								7.	F	47	侵润性导管癌	+++MC	+++MC肿瘤，++基质	++MC	+/-肿瘤，+++基质
8.	M	67	侵润性导管癌	++MC	+++MC	++MC	-肿瘤，+++基质
								9.	F	33	侵润性导管	+MC	++MC	-	+/-肿瘤，+++基质
10.	F	47	侵润性导管癌	++MC	++MC	-	+/-肿瘤，+++基质
								11.	F	49	侵入性小叶癌	-	-肿瘤，+/-成纤维细胞	-	-肿瘤，+++血管&淋巴细胞
12.	F	46	侵润性导管癌	++MC	++MC	-	+/-肿瘤；+++血管&淋巴细胞
								13.	F	39	润性导管癌	++MC	++MC	-	+++M肿瘤，+++基质
14.	F	43	侵润性导管癌	+++MC	+++MC	+/-	-肿瘤，+++基质
								15.	F	54	侵润性导管癌	++MC	++MC	+/-	-肿瘤，+++血管
16.	F	58	侵润性导管癌	++MC肿瘤&基质，+++坏死区	++MC肿瘤&基质，+++坏死区	+/-	++MC肿瘤，+++基质

17.	F	37	侵润性导管癌	++MC	++MC	-	-肿瘤，+++基质
								18.	F	43	侵润性导管癌	+++MC肿瘤&淋巴细胞	+++MC肿瘤&淋巴细胞	+++MC	+++MC肿瘤&基质
19.	F	51	侵润性导管癌	++MC	+++MC	+MC	+++MC肿瘤&基质
								20.	F	80	髓样癌	++MC	++MC	-	+++MC肿瘤，+++基质
21.	F	36	侵润性导管癌	++MC肿瘤&淋巴细胞	++MC肿瘤&基质	-	+++MC肿瘤&基质
								22.	F	59	侵润性导管癌	+MC	+MC	+/-血管	++MC肿瘤
23.	F	34	原位管癌	++MC肿瘤&基质，+++坏死区	++MC肿瘤&基质，+++坏死区	+MC肿瘤，++坏死区	+/-肿瘤，+++血管
								24.	F	54	侵润性导管癌	+MC	++MC	+/-	-肿瘤，+++基质
25.	F	47	侵润性导管癌	+++MC	+++MC	++MC	+++MC
								26.	F	53	侵润性导管癌	+++MC肿瘤&基质	++MC	-	-肿瘤，+++基质
27.	F	59	侵润性导管癌	+MC肿瘤，+++坏死区	+MC肿瘤，+++坏死区	+/-坏死区	-肿瘤，+++基质
								28.	F	60	印戒细胞癌	++MC	++MC	-	-肿瘤，+++基质
29.	F	37	侵润性导管癌	+++MC	+++MC	++MC	++MC肿瘤，+++基质
								30.	F	46	侵润性导管癌	++MC	++MC	+/-	++MC肿瘤&基质
31.	F	35	侵润性导管癌	+/-	+/-	-	+肿瘤，+++基质
								32.	F	47	侵润性导管癌	-肿瘤，++坏死区	-肿瘤，++坏死区	-	+++MC
33.	F	54	侵润性导管癌	+MC	+MC	-	-瘤，+++基质
								34.	F	47	侵润性导管癌	+MC肿瘤&基质	+MC肿瘤&基质	-	-肿瘤，+++基质
35.	F	41	侵润性导管癌	++MC	++MC	-	+/-肿瘤，+++基质
								36.	F	38	侵润性导管癌	+++MC	+++MC	-	-肿瘤，+++基质
37.	F	55	侵润性导管癌	+MC肿瘤&基质	+MC肿瘤&基质	-	-肿瘤，+++基质
								38.	F	65	侵润性导管癌	+/-	++MC肿瘤&基质	-	-肿瘤，+++基质
39.	M	66	侵润性导管癌	+MC肿瘤&基质	+MC肿瘤&基质	-	-肿瘤，+++基质
								40.	F	44	侵润性导管癌	++MC	++MC	-	+++MC
41.	F	52	淋巴结中的转移癌	++MC	++MC	-	+++MC
								42.	F	32	淋巴结中的转移癌	+MC	++MC	-	-肿瘤，+++基质

43.	F	58	淋巴结中的转移癌	++MC	+++MC	+/-	-肿瘤，+++基质
								44.	F	52	淋巴结中的转移癌	++MC	++MC	-	+++MC
45.	F	58	淋巴结中的转移癌	-肿瘤，++基质	+MC	-	+++MC
								46.	F	38	淋巴结中的转移癌	++MC	+++MC	-	+++MC
47.	F	45	淋巴结中的转移癌	-	+/-	-	+++MC
								48.	F	45	淋巴结中的转移癌	++MC	++MC	-	-肿瘤，+++基质
49.	F	29	淋巴结中的转移癌	+MC	++MC	-	-肿瘤，+++基质
								50.	F	61	淋巴结中的转移癌	+MC肿瘤&基质	++MC	-	-肿瘤，+++基质
51*	F	46	乳头	++皮脂腺	++皮脂腺	-	+++成纤维细胞、淋巴细胞&巨噬细胞
								52*	F	47	乳头	++MC	++MC	-	+++成纤维细胞、淋巴细胞&巨噬细胞
53*	F	40	正常乳腺	-	-	-	+++血管、肌上皮细胞、成纤维细胞&淋巴细胞
								54*	F	43	正常乳腺	+/-成纤维细胞	+/-成纤维细胞	-	+++血管、肌上皮细胞、成纤维细胞&淋巴细胞
55*	F	40	正常乳腺	++小叶上皮细胞，成纤维细胞&内皮细胞	++小叶上皮细胞，成纤维细胞&内皮细胞	-	+++管状上皮细胞、肌上皮细胞&成纤维细胞
								56*	F	40	正常乳腺	+/-成纤维细胞	+/-成纤维细胞	-	+++血管、肌上皮细胞、成纤维细胞&淋巴细胞
57*	F	45	正常乳腺	+/-成纤维细胞	+/-成纤维细胞	-	+++血管、成纤维细胞&淋巴细胞
								58*	F	44	正常乳腺	+/-成纤维细胞	+/-成纤维细胞	-	+/-管状上皮细胞、+++肌上皮细胞、血管&成纤维细胞
59*	F	37	正常乳腺	+/-成纤维细胞	++小叶上皮细胞&成纤维细胞	-	+++血管、肌上皮细胞、成纤维细胞&淋巴细胞
								60	F	51	正常乳腺	+/-成纤维细胞	+/-成纤维细胞	-	+/-管状上皮细胞、+++血管

缩写：M：线粒体染色，C：细胞质染色

表8b：有关7BD-33-11A的48个人类乳腺癌肿瘤和9个正常组织切片的IHC概要

序号	性别/年龄	诊断	T时期	ER	PR	AR7BD-33-11A
							1	F/65	侵润性导管癌	T2	+	+	-
2	F/34	侵润性导管癌	T1	+	-	-
							3	F/39	侵润性导管癌	T2	-	+	+/-肿瘤细胞
4	F/38	侵润性导管癌	T2	+	+	+/-肿瘤细胞

5	F/67	侵润性小叶癌	T3	+	-	-
							6	F/45	侵润性导管癌	T2	-	-	-
7	F/50	侵润性导管癌	T2	+	-	-
							8	F/54	侵润性导管癌	T2	-	-	-
9	F/37	侵润性导管癌	T2	-	-	-
							10	F/52	侵润性导管癌	T2	+	-	-
11	F/84	侵润性导管癌	T3	-	-	+肿瘤细胞+++坏死区
							侵润性导管癌
		12						F/40	侵润性导管癌	T2	-	-	-肿瘤细胞++侵润性炎性细胞
13	F/64		侵润性导管癌	T2	-	-	+肿瘤细胞
		14						F/61	侵润性导管癌	T4	+	-	-
15	F/35		侵润性导管癌	T1	-	-	+肿瘤细胞
		16						F/66	侵润性导管癌	T2	-	-	-肿瘤细胞+/-基质
17	F/58		侵润性导管癌	T3	-	-	-
		18						F/49	侵润性导管癌	T3	-	-	+/-肿瘤细胞+++基质
19	F/75		侵润性导管癌	T1	+	+	-
		20						F/44	侵润性小叶癌	T2	+	+	++肿瘤细胞
21	F/40		侵润性导管癌	T2	-	-	-
		22						F/49	髓样癌	T2	-	-	-
23	F/50		侵润性导管癌	T2	-	+	-
		24						F/71	侵润性导管癌	T3	-	-	-
25	F/50		侵润性导管癌	T3	-	-	+肿瘤细胞
		26						F/42	侵润性导管癌	T3	-	-	+/-肿瘤细胞
27	F/64		侵润性导管癌	T1	+	+	-
		28						F/32	侵润性导管癌	T3	-	-	+肿瘤细胞
29	F/60		侵润性导管癌	T2	-	-	+/-肿瘤细胞
		30						F/53	侵润性导管癌	T2	+	-	-肿瘤细胞++基质
31	F/73		侵润性导管癌	T2	-	-	-肿瘤细胞+/-侵润性淋巴细胞
		32						F/50	侵润性导管癌	T3	-	-	-
33	F/46		侵润性导管癌	T3	-	-	-肿瘤细胞+/-坏死区
		34						F/51	侵润性导管癌	T2	-	-	-
35	F/59		侵润性导管癌	T1	+	-	+肿瘤细胞
		36						F/36	侵润性导管癌	T2	+	-	-
37	F/53		侵润性导管癌	T3	-	-	+肿瘤细胞
		38						F/69	侵润性导管癌	T2	-	-	+++肿瘤细胞
39	F/34		侵润性导管癌	T2	-	-	+++肿瘤细胞
		40						F/36	侵润性导管癌	T3	+	+	+/-肿瘤细胞&基质
41	F/60		侵润性导管癌	T3	-	-	+/-肿瘤细胞&基质
		42						F/49	侵润性导管癌	T3	+	+	+/-肿瘤细胞&基质
43	F/48		侵润性导管癌	T3	+	-	-肿瘤细胞+/-基质
		44						F/36	侵润性导管癌	T2	-	-	-肿瘤细胞++基质&侵润性淋巴细胞

45	F/34	侵润性导管癌	T1	+	-	-肿瘤细胞+++基质&侵润性炎性细胞
							46	F/54	侵润性导管癌	T3	+	+	-肿瘤细胞++基质&侵润性炎性细胞
47	F/41	侵润性导管癌	T1	+	+	-肿瘤细胞+/-基质
							48	F/67	侵润性导管癌	T2	+	-	-
49	F/42	非新生乳腺				-
							50	F/31	非新生乳腺				-
51	F/47	非新生乳腺				-
							52	F/43	非新生乳腺				-
53	F/42	非新生乳腺				-
							54	F/40	非新生乳腺				-
55	F/35	非新生乳腺				-
							56	F/50	非新生乳腺				-
57	F/41	非新生乳腺				-

表9

有关1A245.6的人类乳腺肿瘤IHC概要

			结合评分
										总计#	-	+/-	+	++	+++	阳性总计	阳性％
		患者样品	肿瘤	50	1	2	8	23	16									49	98％
正常	10									1	5成纤维细胞	0	4	0	9	90％
			RP状态	ER+	28	0	1	2	14								11	28	100％
ER-	22	1								1	6	9	5	21	96％
				未知	0	0	0	0	0							0	0	0％
PR状态	PR+	19								0	0	1	8	10	19				100％
			PR-	30	1	2	7	14	6							29	97％
	未知	1								0	0	0	0	0	1			100％
			AJCC肿瘤期	T1	4	0	1	1	1							1	4		100％
T2	21	1								0	6	9	5	20	95％
				T3	20	0	1	1	10							8	20	100％
T4	5	0								0	0	3	2	5	100％

表10

有关H460-22-1的人乳腺肿瘤IHC概要

			结合评分
												#	-	+/-	+	++	+++	阳性总计	阳性％
患者样品	肿瘤	50	4	3	12	23	8	46	92％
										正常	10	1	6	0	3	0	9	90％
	EP状态	ER+	28	0	2	7	17	2	28										100％
ER-										22	4	1	5	6	6	18	82％
		未知	0	0	0	0	0	0	0									0％
PR状态										PR+	19	0	0	5	11	3	19		100％
	PR-	30	4	3	7	11	5	26	87％
										未知	1	0	0	0	1	0	1	100％
	AJCC肿瘤期	T1	4	1	0	2	1	0	3										75％
T2										21	4	0	6	7	4	17	81％
		T3	20	0	2	3	12	3	20									100％
T4										5	0	0	1	3	2	5	100％

表11

有关7BD-33-11A的人乳腺肿瘤IHC概要

如S.N.10/810,751(其内容通过引用结合入本文)中描述和讨论的，使用7BD-33-11A和RFAC4和H5C6抗CD63和c-erbB-2抗Her2(A0485，DakoCytomation，Mississagua，ON)抗体进行了比较。使用了来自50名乳腺癌患者的组织阵列和来自乳腺癌患者的非瘤乳腺组织的10个样品(Imgenex Corporation，San Diego，CA)。提供了每名患者的下述信息：年龄、性别、美国癌症联合会(AJCC)肿瘤期、淋巴结、雌激素受体(ER)和孕酮受体(PR)状态。遵循实施例5的IHC程序。除了抗Her2抗体使用1.5μg/mL浓度以外，所有抗体的在5μg/mL的工作浓度下使用。

表11、12、13和14分别提供了乳腺癌组织阵列的7BD-33-11A、RFAC4和H5C6抗CD63抗体的染色。总体上，50名受试患者的36％对7BD-33-11A抗原呈阳性，而分别有85和94％对RFAC4和H5C6抗CD63抗体呈阳性。在7BD-33-11A和RFAC4 or H5C6抗CD63抗体染色相同组织时，97％的样品使用RFAC4和H5C6抗CD63具有比7BD-33-11A更高强度的染色(图19)。对于7BD-33-11A，来自乳腺癌患者的10个正常乳腺组织样品中有0个呈阳性(图18A)。对于RFAC4和H5C6抗CD63抗原，来自乳腺癌患者的8个正常乳腺组织样品中有7个呈阳性(两个样品不是代表性的)。如上所述，雌激素或黄体酮受体表达与7BD-33-11A抗原表达之间具有轻微的关联；具有任一受体表达的组织具有稍高的7BD-33-11A抗原表达。当肿瘤根据其时期或所述癌症进展程度而被分析时，结果表明对于7BD-33-11A的趋势是较高肿瘤期具有更大的阳性反应。使用RFAC4获得了类似的结果。H5C6也显示出与雌激素或黄体酮受体表达之间非常轻微的关联，但与肿瘤期没有明显关联。然而，对于全部三种抗体，结果受限于小尺寸样品。

表12

有关RFAC4的人类乳腺肿瘤IHC概要

			结合评分
												总计#	-	+/-	+	++	+++	阳性总计	阳性％
患者样品	肿瘤	47	7	3	7	16	14	40	85％
										正常	8	1	1	0	2	4	7	87.50％
	ER状态	ER+	27	1	2	3	15	6	26										96％
ER-										20	6	1	3	4	6	14	70％
		未知	0	0	0	0	0	0	0									0％
PR状态										PR+	18	0	1	2	9	6	18		100％
	PR-	28	7	2	4	9	6	21	75％
										未知	1	0	0	0	1	0	1	100％
	AJCC肿瘤期	T1	4	2	0	1	1	0	2										50％
T2										20	4	2	3	6	5	16	80％
		T3	18	1	1	2	7	7	17									94％
T4										5	0	0	1	2	2	5	100％

表13

有关H5C6的人类乳腺肿瘤IHC概要

			结合评分
												总计#	-	+/-	+	++	+++	阳性总计	阳性％
患者样品	肿瘤	47	3	4	8	15	17	44	94％
										正常	8	1	1	0	2	4	7	87.50％
	ER状态	ER+	27	1	1	6	8	11	26										96％
ER-										20	2	3	2	8	5	18	90％
		未知	0	0	0	0	0	0	0									0％
PR状态										PR+	18	0	0	4	4	10	18		100％
	PR-	28	3	4	4	11	6	25	89％
										未知	1	0	0	0	1	0	1	100％
	AJCC肿瘤期	T1	4	0	0	1	2	1	4										100％
T2										20	2	4	3	7	4	18	90％
		T3	18	1	0	3	4	10	17									94％
T4										5	0	0	1	2	2	5	100％

7BD-33-11A染色特异性针对癌细胞(与正常细胞相比较)，其中基质细胞明显为阴性，而成片恶性细胞呈阳性。使用7BD-33-11A抗原观察到的细胞定位模式限于细胞膜和细胞质。使用抗CD63抗体、RFAC4和H5C6在乳腺肿瘤组织样品上获得了类似的细胞膜和细胞质染色结果。另外，这些抗体都在正常乳腺组织样品上显示了该染色定位模式，而7BD-33-11为阴性。

与c-erbB-2抗Her2相比较，7BD-33-11A显示了完全不同的染色特征，其中18个乳腺肿瘤组织样品中有9个对7BD-33-11A抗原呈阳性、对Her2表达呈阴性，表明未满足对于乳腺癌患者的靶向治疗需求(表15，图20)。对7BD-33-11A和Her2都呈阳性的乳腺肿瘤组织切片之间染色强度也存在差别；一些对7BD-33-11A抗原呈高阳性的乳腺肿瘤组织切片对Her2仅呈轻度阳性，且反之依然，表明7BD-33-11A将治疗性靶向不同类的乳腺癌患者。c-erbB-2抗体也阳性染色了一个正常乳腺组织切片。

这些结果表明7BD-33-11A抗原可以被约三分之二的乳腺癌患者所表达，其中半数对Her2抗原呈完全阴性。该染色模式显示，在患者样品中，抗体对恶性细胞是高度特异性的，且7BD-33-11A抗原存在于细胞膜上，从而使其成为引人注目的药物靶。7BD-33-11A的染色与RFAC4或H5C6抗CD63抗体相比尽管类似，但更多的限制再次说明7BD-33-11A表位是CD63上更加限制性的表位。

表14

RFAC4和H5C6与CD63抗与7BD-33-11A在人类肿瘤和正常乳腺组织上的IHC比较缩写：NR：样品不是代表性的；F：切片是折叠的。

数据表				RFAC4	H5C6	7BD-33-11A
							序号	性别	年龄	诊断	切片评分	切片评分	切片评分
1	F	28	侵润性导管癌	+++	+++	++
							2	F	71	实质性乳头癌	+++	+++	+/-
3	F	26	侵润性导管癌	++	+	-
							4	F	43	侵润性导管癌	++	++	+/-
5	F	39	侵润性导管癌	NR	NR	+/-
							6	F	46	原位管癌	+	+	+/-
7	F	47	侵润性导管癌	+++	+++	+
							8	M	67	侵润性导管癌	+++	+++	+
9	F	33	侵润性导管癌	+++	+++	-
							10	F	47	侵润性导管癌	++	++	-
11	F	49	侵入性小叶癌	-	-	-
							12	F	46	侵润性导管癌	++	++	-
13	F	39	侵润性导管癌	++	++	-
							14	F	43	侵润性小叶癌	+++	+++	+/-
15	F	54	侵润性小叶癌	++	++	+/-
							16	F	58	侵润性导管癌	+	++	+/-
17	F	37	侵润性导管癌	+++	++	-
							18	F	43	侵润性导管癌	+++	+++	+++
19	F	51	侵润性导管癌	+++	+++	+
							20	F	80	髓样癌	++	++	-
21	F	36	侵润性导管癌	NR	NR	-
							22	F	59	侵润性导管癌	+	+	-
23	F	34	原位管癌	+++	+++	+
							24	F	54	侵润性导管癌	++	+++	+/-
25	F	47	侵润性导管癌	+++	+++	++
							26	F	53	侵润性导管癌	++	++	-
27	F	59	侵润性导管癌	+	+	-
							28	F	60	印戒细胞癌	F	F	-
29	F	37	侵润性导管癌	+++	+++	++
							30	P	46	侵润性导管癌	++	++	+/-
31	F	35	侵润性导管癌	-	-	-
							32	F	47	侵润性导管癌	++	++	-
33	F	54	侵润性导管癌	+	+	-
							34	F	47	侵润性导管癌	-	+/-	-
35	F	41	侵润性导管癌	+++	+++	-
							36	F	38	侵润性导管癌	+++	+++	-
37	F	55	侵润性导管癌	-	+/-	-
							38	F	65	侵润性导管癌	+/-	+/-	-
39	M	66	侵润性导管癌	-	+	-
							40	F	44	侵润性导管癌	++	+++	-
41	F	52	淋巴结中的转移癌	++	++	-
							42	F	32	淋巴结中的转移癌	+/-	+	-
43	F	58	淋巴结中的转移癌	++	+++	+/-
							44	F	52	淋巴结中的转移癌	+	+	-
45	F	58	淋巴结中的转移癌	-	-	-
							46	F	38	淋巴结中的转移癌	++	+++	-
47	F	45	淋巴结中的转移癌	-	++	-
							48	F	45	淋巴结中的转移癌	++	++	-
49	F	29	淋巴结中的转移癌	+/-	+/-	-
							50	F	61	淋巴结中的转移癌	+	++	-
51	F	46	乳头	++	++	-
							52	F	47	乳头	NR	NR	-
53	F	40	正常乳腺	+/-	+/-	-
							54	F	43	正常乳腺	+++	+++	-
55	F	40	正常乳腺	++	+++	-
							56	F	40	正常乳腺	+++	++	-
57	F	45	正常乳腺	NR	NR	-
							58	F	44	正常乳腺	-	-	-
59	F	37	正常乳腺	+++	+++	-
							60	F	51	正常乳腺	+++	+++	-

缩写：NR：样品不是代表性的，F：切片是折叠的。

表15

c-erbB抗Her2与7BD-33-11A在人类肿瘤和正常乳腺组织上的IHC比较

数据表				c-erbB-2	78D-33-11A
						序号	性别	年龄	诊断	切片评分	切片评分
1	F	28	侵润性导管癌	+	++
						2	F	71	实质性乳头癌	-	+/-
3	F	26	侵润性导管癌	+/-	-
						4	F	43	侵润性导管癌	+/-	+/-
5	F	39	侵润性导管癌	NR	+/-
						6	F	46	原位管癌	-	+/-
7	F	47	侵润性导管癌	+++	+
						8	M	67	侵润性导管癌	-	+
9	F	33	侵润性导管癌	+++	-
						10	F	47	侵润性导管癌	++	-
11	F	49	侵入性小叶癌	PD	-
						12	F	46	侵润性导管癌	-	-
13	F	39	侵润性导管癌	+++	-
						14	F	43	侵润性小叶癌	-	+/-
15	F	54	侵润性小叶癌	-	+/-
						16	F	58	侵润性导管癌	-	+/-
17	F	37	侵润性导管癌	+++	-
						18	F	43	侵润性导管癌	-	+++
19	F	51	侵润性导管癌	+	+
						20	F	80	髓样癌	-	-
21	F	36	侵润性导管癌	NR	-
						22	F	59	侵润性导管癌	-	-
23	F	34	原位管癌	+++	+
						24	F	54	侵润性导管癌	+	+/-
25	F	47	侵润性导管癌	-	++
						26	F	53	侵润性导管癌	+++	-
27	F	59	侵润性导管癌	+	-
						28	F	60	印戒细胞癌	-	-
29	F	37	侵润性导管癌	+++	++
						30	F	46	侵润性导管癌	-	+/-
31	F	35	侵润性导管癌	-	-
						32	F	47	侵润性导管癌	+++	-
33	F	54	侵润性导管癌	-	-
						34	F	47	侵润性导管癌	+++	-
35	F	41	侵润性导管癌	-	-
						36	F	38	侵润性导管癌	++	-
37	F	55	侵润性导管癌	+/-	-
						38	F	65	侵润性导管癌	-	-
39	M	66	侵润性导管癌	-	-
						40	F	44	侵润性导管癌	-	-
41	F	52	淋巴结中的转移癌	-	-
						42	F	32	淋巴结中的转移癌	-	-
43	F	58	淋巴结中的转移癌	++	+/-
						44	F	52	淋巴结中的转移癌	+++	-
45	F	58	淋巴结中的转移癌	-	-
						46	F	38	淋巴结中的转移癌	++	-
47	F	45	淋巴结中的转移癌	-	-
						48	F	45	淋巴结中的转移癌	-	-
49	F	29	淋巴结中的转移癌	-	-
						50	F	61	淋巴结中的转移癌	-	-
51	F	46	乳头	-	-
						52	F	47	乳头	+++	-
53	F	40	正常乳腺	-	-
						54	F	43	正常乳腺	-	-
55	F	40	正常乳腺	+/-	-
						56	F	40	正常乳腺	-	-
57	F	45	正常乳腺	-	-
						58	F	44	正常乳腺	-	-
59	F	37	正常乳腺	-	-
						60	F	51	正常乳腺	-	-

实施例7

人类前列腺组织染色

为确定7BD-33-11A抗原是否在除了乳腺癌以外的其他人类癌组织上表达，使用7BD-33-11A探针检测了人类前列腺肿瘤组织阵列(S.N.10/810,751，其内容通过引用结合入本文；ImgenexCorporation，San Diego，CA)。使用了与实施例5所描述的相同的染色程序。波形蛋白用作阳性对照抗体，且使用了与有关人类乳腺肿瘤组织阵列所描述的同样的阴性对照抗体。所有抗体在5μg/mL的工作浓度下使用。

如表16中所描述的，7BD-33-11A染色了88％的人类前列腺癌。尽管7BD-33-11A同样以高强度染色了正常组织切片，但与正常组织相比较，肿瘤组织样品存在更高程度的细胞膜染色。有一个胚横纹肌肉瘤组织样品没有染色7BD-33-11A抗原。还显示肿瘤期与7BD-33-11A抗原的存在之间没有直接关联。然而，结果受限于小尺寸样品。再次，使用7BD-33-11A，在前列腺肿瘤组织样品上同时观察到了细胞膜和细胞质染色。然而，相对于乳腺肿瘤组织样品，细胞膜染色程度有所提高(图21)。对于正常前列腺组织样品，没有观察到细胞膜染色程度的这种提高。

表16

有关7BD-33-11A的人类前列腺肿瘤IHC概要

			结合评分
												总计#	-	+/-	+	++	+++	阳性总计	阳性％
患者样品	肿瘤	51	6	6	6	7	26	45	88％
										正常	3	0	0	0	1	2	3	100％
	肿瘤亚型	腺癌	50	5	6	6	7	26	44										88％
环胎性横纹肌肉瘤										1	1	0	0	0	0	0	0％
		肿瘤期	I	1	0	0	0	0	1									1	100％
II	11									0	0	1	3	7	11	100％
			III	2	1	0	0	0	1								1	50％
IV	32									6	5	5	3	13	26	81％

因此，7BD-33-11A抗原似乎没有单独发现于乳腺癌细胞膜上，而是也发现于前列腺癌细胞膜上。这些结果表明，7BD-33-11A具有作为包括乳腺的肿瘤类型的治疗药物的潜力。

实施例8

人类黑素瘤组织染色

为确定7BD-33-11A抗原是否在除了乳腺和前列腺癌以外的其他人类癌组织上表达，使用7BD-33-11A探针检测了人类黑素瘤组织阵列(Tri star Technology Group，LLC，Bethesda，MD)。除了AEC取代DAB作为色原体使用，使用了与实施例5所描述的相同的染色程序。RFAC4和NKI/C3用作阳性对照抗体，且使用了与有关人类乳腺肿瘤组织阵列所描述的同样的阴性对照抗体。除了使用0.4μg/mL的NKI/C3，所有抗体在5μg/mL的工作浓度下使用。

如表17中所描述的7BD-33-11A染色了90％的人类黑素瘤癌(图22)。在有限数目的受试样品中，还显示肿瘤期与7BD-33-11A抗原的存在之间没有直接关联。再次，使用7BD-33-11A，在黑素瘤组织样品上同时观察到了细胞膜和细胞质染色。

表17

有关7BD-33-11A的人类黑素瘤肿瘤IHC概要

7BD-33-11A
									肿瘤	总计	评分					阳性总计	阳性肿瘤％
39	-	+/-	+	++	+++	35	89.7％
								4		2	6	10	17
AJCC期										总计	-	+/-	+	++	+++	阳性总计	阳性肿瘤％
	I期	0	0	0	0	0	0	0	0
II期										5	0	0	1	1	3	5	100％
	III期	4	0	0	0	1	3	4	100％
IV期										13	1	2	1	3	6	12	92％

实施例9

人类肿瘤组织染色

如S.N.10/603,006(其内容通过引用结合入本文)中部分描述和讨论的，为确定7BD-33-11A、H460-22-1或1A245.6抗原是否表达于除乳腺癌以外的其他人类癌组织上，在多种人类肿瘤组织阵列(Imgenex，San Diego，CA)上单独检测了所述抗体。提供了每名患者的下列信息：年龄、性别、器官和诊断。使用了与实施例5所描述的相同的染色程序。波形蛋白用作阳性对照抗体，且使用了与有关人类乳腺肿瘤组织阵列所描述的同样的阴性对照抗体。所有抗体在5μg/mL的工作浓度下使用。

如表18中描述的，7BD-33-11A染色了许多不同的人类癌(包括乳腺)。下述肿瘤类型对7BD-33-11A呈阳性：皮肤(1/2)、肺(3/4)、肝(2/3)、胃(4/5)、甲状腺(2/2)、前列腺(1/1)、子宫(4/4)和肾(3/3)(图23A)。几种其他肿瘤类型也偶尔染色为阳性。其他肿瘤组织对7BD-33-11A表达呈阴性：卵巢(0/3)、睾丸(0/1)、脑(0/2)和淋巴结(0/2)。相反，H460-22-1和1A245.6染色了受试的每种组织类型。然而染色强度不同，在皮肤、肺、肝、子宫、肾肾(分别为图23B和C)、胃和膀胱的恶性细胞上看到一些最强的染色。如使用乳腺和前列腺(仅7BD-33-11A)癌所看到的，7BD-33-11A、H460-22-1和1A245.6染色定位于癌细胞的细胞膜上和细胞质内。

因此，显示7BD-33-11A、H460-22-1和1A245.6抗原不仅发现于乳腺、前列腺和黑素瘤癌的细胞膜上，而且发现于非常多的肿瘤类型的细胞膜上。这些结果表明7BD-33-11A、H460-22-1和1A245.6具有作为除了乳腺和前列腺癌以外的广泛多种肿瘤类型的治疗药物的潜力。

表18：有关H460-22-1、1A245.6和7BD-33-11A在人类多肿瘤组织阵列上的IHC概要

序号	年龄	性别	器官	诊断	H460-22-1	1A245.6	7BD-33-11A	波形蛋白	同种型对照
										1.	59	M	皮肤	恶性黑素瘤	+++M/C	++M/C	++M/C	+++M/C	-
2.	25	F	皮肤	SSC	++M/C	++M/C	-	+++M/C	-
										3.		F	乳腺	侵润性导管癌	+M/C肿瘤&基质	++M/C肿瘤&基质	++M/C	++仅基质	-
4.	50	F	乳腺	侵入性乳头癌	+/-PS	+M/C	-	++基质成纤维细胞&血管	-
										5.	57	F	乳腺	侵润性小叶癌	CS	+M/C	F	CS	-
6.	35	M	淋巴结	恶性淋巴癌，immunoplastic	+M/C	+M/C	-	+++M/C	-
										7.	40	M	淋巴结	来自胃的转移腺癌	++M/C	+M/C	-	+++肿瘤&脂肪细胞	-
8.	58	F	骨	骨肉瘤	++C	++M/C	-+M/C	+++M/C	-
										9.	26	M	骨	巨细胞肿瘤	++M/C	++M/C	-	++M/C	-
10.	40	M	骨	软骨肉瘤	CS	CS	CS	CS	CS
										11.	51	F	软组织	脂肉瘤	+/-	+/-	-	+++M/C	-
12.	47	F	软组织	多发性肿经纤维瘤	+/-PS	+/-	-	+++M/C	-
										13.	74	M	骨腔	内翻型乳头瘤，	+M/C	+M/C	+/-	+角质素	-
14.	57	M	喉	SCC	++肿瘤，+++淋巴细胞&基质	+肿瘤，++淋巴细胞&基质	+/-肿瘤&基质	+++主要基质细胞	-
										15.	60	M	肺	腺癌	+++M/C	+++M/C	++M/C	++M/C	-
16.	51	F	肺	SCC	+-M/C肿瘤&基质	++M/C肿瘤&基质	+M/C	+++M/C	-
										17.	68	F	肺	腺癌	++M/C	+M/C	-	+++M/C	-

18.	60	M	肺	小细胞癌	+++M/C	++M/C	+M/C	+++M/C	-
										19.	88	F	舌	SCC	++M/C肿瘤&基质	+M/C肿瘤&基质	+/-	+++主要基质细胞	-
20.	34	F	腮腺	混合瘤	+/-粘蛋白	+/-粘蛋白	-	++M/C	-
										21.	50	F	腮腺	疣瘤	+++M/C	+++M/C	+++M/C	+++肿瘤&淋巴细胞	-
22.	40	F	腮腺	混合瘤	+/-	+M/C	+/-	+++M/C	-
										23.	56	M	颌下腺	睡液管癌	+M/C肿瘤&基质	+M/C肿瘤&基质	-	+++M/C	-
24.	69	F	肝	胆管癌	+++M/C	+++M/C	++M/C	+/+肿瘤+++血管	-
										25.	51	M	肝	转移胃癌	++M/C	++M/C	-	++基质	-
26.	64	M	肝	HCC	+++M/C	+++M/C肿瘤&基质	++M/C	+/-	-
										27.	62	F	胆囊	腺癌	++M/C	++M/C	+M/C	+基质	-
28.	64	F	胰腺	腺瘤	P	++M/C	++M/C	++基质	-
										29.	68	M	食管	SCC	+/-	+M/C	+/-	++基质	-
30.	73	M	胃	弱分化的腺癌	++M/C肿瘤&基质	+-M/C肿瘤&基质	+M/C	++主要基质细胞&血管	-
										31.	63	M	胃	中度分化的腺癌	++M/C	++M/C	+/-	++M/C	-
32.	59	F	胃	环戒细胞癌	++M/C	++M/C	+/-	++M/C	-
										33.	62	M	胃	恶性淋巴癌	++M/C	+M/C	+血管	+++M/C	-
34.	51	M	胃	边缘胃肿瘤	++M/C	+++M/C	+M/C	++M/C	-
										35.	42	M	小肠	恶性胃肿瘤	++M/C	++M/C	-	+++M/C	-
36.	52	F	阑尾	Pseuomyxomaperionia	-PS	-PS	-	+肿瘤+++脂肪细胞	-
										37.	53	M	结肠	腺癌	++M/C	+M/C	+/-	++主要淋巴细胞	-
38.	67	M	直肠	腺癌	F	++M/C	-	++脂肪细胞&血管	-

39.	75	F	肾	移行细胞癌	+++M/C	+++M/C	++M/C	++基质	-
										40.	54	F	肾	肾细胞癌	++M/C	++M/C	+/-	++M	-
41.	75	F	肾	肾细胞癌	+++M/C	+++M/C	++M/C	+肿瘤+++基质	-
										42.	65	M	膀胱	弱分化癌	+M/C	+M/C	-	++主要基质	-
43.	67	M	膀胱	移行细胞癌，高级	+++M/C	+++M/C	+++M/C	+++基质&血管	-
										44.	62	M	前列腺	腺癌	++M/C	+M/C	+/-	+++肿瘤基质&血管	-
45.	30	M	睾丸	精原细胞癌	+M/C	+M/C	-	+++血管	-
										46.	68	F	子宫	子宫内膜腺癌	+++M/C	+++M/C	++M/C	+肿瘤+++基质	-
47.	57	F	子宫	Leimyosacoma	+C	+C	+/-	+M/C	-
										48.	45	F	子宫	平滑肌瘤	+C	++C	+/-	+++M/C	-
49.	63	F	子宫颈	SCC	-肿瘤细胞，++基质&淋巴细胞	+肿瘤细胞，++基质&淋巴细胞	+/-	+/-肿瘤，++基质	-
										50.	12	F	卵巢	内胚层窦瘤	+	+	-	++	-
					M/C	M/C		(肿瘤&基质)
										51.	70	F	卵巢	粘蛋白腺癌	+M/C	+M/C	-	++基质	-
52.	70	F	卵巢	Flbrothecoma	+M/C	+M/C	-	+++M/C	-
										53.	67	F	肾上腺	皮质癌	++M/C	++M/C	+M/C	+++M/C	-
54.	61	F	肾上腺	Pheohromcytoina	+++M/C	+++M/C	-	+++	-
										55.	54	M	甲状腺	乳头癌	+++M/C	+++M/C	++M/C	+/-肿瘤，++基质	-
56.	58	F	甲状腺	最小侵入性的滤泡	++M/C	++M/C	+M/C	+++M/C	-

				癌
										57.	74	M	胸腺	胸腺癌	+C	+C	+/-	++M/C	-

缩写：NR：切片不是代表性的，CS：切片完全脱落，M：线粒体染色，C：细胞质染色。

实施例10

AR7BD-33-11A、ARH460-22-1和AR1A245.6对短尾猴和猕猴正常组织的结合

为评价非人灵长类物种中的抗原表达，通过在2种灵长类物种的正常组织上的IHC测试了AR7BD-33-11A、ARH460-22-1、1A245.6和H5C6(可商业获得的抗CD63)抗体结合。从BioChain，Hayward，CA获得了短尾猴和猕猴的正常组织阵列，并根据实施例5中描述的程序染色。还测试了阳性(抗肌动蛋白抗体)和阴性对照。阵列由下述9种代表性器官的切片组成：心脏、脑、肾、肝、肺、脾、小肠、骨骼肌和胰腺。

AR7BD-33-11A抗体结合是有限的，并与人类组织观察到的一致。如表19和20中所示，抗体没有结合至心脏、脑或骨骼肌，并在其他受试组织中显示了弱到中度结合，而在肺巨噬细胞和胰脏组织中观察到强结合。两种非人灵长类物种间的结合是类似的，且具有两个限制(caveats)。在猕猴小肠切片中，存在较少成纤维细胞的模糊结合，然而，相应的短尾猴切片不是代表性的，并因此不能被评价。使用猕猴样品的AR7BD-33-11A至肝和肾切片的结合比短尾猴样品强。

表19：短尾猴组织切片的AR7BD-33-11A的IHC染色结果

生物链数据表				IHC数据
									组织名称	性别	年龄(年)	病理诊断	切片评分	组织特异性	细胞定位	％染色细胞	染色强度
心	F	3.2	正常	-	-	-	-	阴性
									脑	F	3.2	正常	-	-	-	-	阴性
肾	F	3.2	正常	+	管状上皮细胞	CMD	＜50％	弱
									肝	F	3.2	正常	++	胆管上皮细胞和侵润性中性粒细胞	CMD	＞50％	中
肝细胞	CMG	＜50％	弱
				肺	F	3.2	正常	+++						肺巨噬细胞和间隙细胞	CMD	＞50％	中-强

脾	F	3.2	正常	++	中性粒细胞	CMG	＞50％	中
									淋巴细胞	SF	10％	模糊
					小肠*	F	3.2	正常					-	-	-	-	阴性
骨骼肌	F	3.2	正常	-					-	-	-	阴性
					胰腺	F	3.2	正常					+++	朗格汉司小岛	CMD	＞50％	强
腺泡上皮细胞	CMD	＞50％	弱-中

最终切片评分取决于细胞的最强染色强度，如下：

阴性染色(-)，模糊染色(+/-)，弱染色(+)，中度染色(++)，强染色(+++)。细胞定位：细胞膜(M)，细胞质(C)，分散(D)，颗粒状(G)，散在的局部(SF)。约％染色的细胞：＜10％(1-9％)，10％，＜50％(11-49％)，50％，＞50％(51-100％)。

*仅脂肪组织

表20：猕猴组织切片的AR7BD-33-11A的IHC的染色结果

生物链数据表				IHC数据
									组织名称	性别	年龄(年)	病理诊断	切片评分	组织特异性	细胞定位	％染色细胞	染色强度
心	M	2.5	正常	-	-	-	-	阴性
									脑	M	2.5	正常	-	-	-	-	阴性
肾	M	2.5	正常	++	管状上皮细胞	CMD	＜50％	弱-中
									肝	M	2.5	正常	+++	胆管上皮细胞和侵润性中性粒细胞	CMD	＞50％	强
肝细胞	CMG	＜50％	弱
				肺	M	2.5	正常	+++						肺巨噬细胞和间隙细胞	CMD	＞50％	中-强
脾	M	2.5	正常						++	中性粒细胞	CMG	＞50％	中
				淋巴细胞	CMD	10％	模糊
								小肠		M	2.5	正常	+/-	成纤维细胞	SF	＜10％	模糊
骨骼肌	M	2.5	正常	-	-	-	-		阴性
								胰腺		M	2.5	正常	+++	朗格汉司小岛&腺泡上皮细胞	CMD	＞50％	中-强

最终切片评分取决于细胞的最强染色强度，如下：阴性染色(-)，模糊染色(+/-)，弱染色(+)，中度染色(++)，强染色(+++)。细胞定位：细胞膜(M)，细胞质(C)，分散(D)，颗粒状(G)，散在的局部(SF)。约％染色的细胞：＜10％(1-9％)，10％，＜50％(11-49％)，50％，＞50％(51-100％)。

*仅脂肪组织

ARH460-22-1至灵长类物种的结合也与人类组织观察到的一致。如表21和22中所看到的，除了在短尾猴脑样品中看到模糊的结合而在相应的猕猴切片中为阴性以外，这两种非人灵长类物种的ARH460-22-1结合是类似的。

表21.短尾猴组织切片的ARH460-22-1的IHC的染色结果

组织名称	性别	年龄(年)	病理诊断	切片评分	组织特异性	细胞定位	％染色细胞	染色强度
									心	F	3.2	正常	+	心肌纤维&心内膜	CMG	＞50％	弱
脑	F	3.2	正常	+/-	血管内皮细胞	SF	＜10％	模糊
									肾	F	3.2	正常	+++	管状上皮细胞	CMD	＞50％	中-强
肾小球	SF	＜10％	模糊
				肝	F	3.2	正常	+++						窦状腺细胞、胆管上皮细胞、侵润性中性粒细胞和血管内皮细胞	CMD	＞50％	中-强
肝细胞	CMG	＞50％	中
									肺	F	3.2	正常	+++	肺上皮细胞、间隙细胞和巨噬细胞	CMG	＞50％	中-强
脾	F	3.2	正常	+++	红髓中的淋巴细胞和白髓的生发中心，中性粒细胞和内皮细胞	CMG	＞50％	中-强
									小肠*	F	3.2	正常	+/-	血管	SF	＜50％	弱
骨骼肌	F	3.2	正常	-	-	-	-	阴性
									胰腺	F	3.2	正常		朗格汉司小岛	CMG	＞50％	强

最终切片评分取决于细胞的最强染色强度，如下：

阴性染色(-)，模糊染色(+/-)，弱染色(+)，中度染色(++)，强染色(+++)。细胞定位：细胞膜(M)，细胞质(C)，分散(D)，颗粒状(G)，散在的局部(SF)。约％染色的细胞：＜10％(1-9％)，10％，＜50％(11-49％)，50％，＞50％(51-100％)。

*仅脂肪组织

表22：猕猴组织切片的ARH460-22-1的IHC的染色结果

组织名称	性别	年龄(年)	病理诊断	切片评分	组织特异性	细胞定位	％染色细胞	染色强度
									心	M	2.5	正常	+	心肌纤维&心内膜	CMG	＞50％	弱
脑	M	2.5	正常	-	-	-	-	阴性
									肾	M	2.5	正常	+++	管状上皮细胞	CMD	＞50％	中-强
肾小球	SF	＜10％	模糊
				肝	M	2.5	正常	+++						窦状腺细胞、胆管上皮细胞、侵润性中性粒细胞和血管内皮细胞	CMD	＞50％	中-强
肝细胞	CMG	＞50％	中
									肺	M	2.5	正常	+++	肺上皮细胞、间隙细胞和巨噬细胞	CMG	＞50％	中-强
脾	M	2.5	正常	+++	红髓中的淋巴细胞和白髓的生发中心，中性粒细胞和内皮细胞	CMG	＞50％	中-强
									小肠	M	2.5	正常	++	粘膜&腺上皮细胞	CMG	＞50％	弱-中
骨骼肌	M	2.5	正常	-	-	-	-	阴性
									胰腺	M	2.5	正常	+++	朗格汉司小岛、腺泡上皮细胞和血管内皮细胞	CMG	＞50％	强

最终切片评分取决于细胞的最强染色强度，如下：

阴性染色(-)，模糊染色(+/-)，弱染色(+)，中度染色(++)，强染色(+++)。细胞定位：细胞膜(M)，细胞质(C)，分散(D)，颗粒状(G)，散在的局部(SF)。约％染色的细胞：＜10％(1-9％)，10％，＜50％(11-49％)，50％，＞50％(51-100％)。

*仅脂肪组织

AR1A245.6至灵长类物种的结合也与人类组织观察到的一致。如表23和24中所看到的，这两种物种的AR1A245.6组织结合是类似的，除了：骨骼肌(猕猴中为阴性，短尾猴中为模糊的)，心肌(在猕猴中比在短尾猴中强)和脑(在短尾猴中比在猕猴中强)。

表23.短尾猴组织切片的AR1A245.6的IHC的染色结果

组织名称	性别	年龄(年)	病理诊断	切片评分	组织特异性	细胞定位	％染色细胞	染色强度
									心	F	3.2	正常	+	心肌纤维&心内膜	CMG	＞50％	弱
脑	F	3.2	正常	++	血管内皮细胞	CMG	＜50％	中
									神经元和神经胶质	SF	＜10％	模糊
					肾	F	3.2	正常					+++	肾小球和肾小管	CMG	＞50％	强
肝	F	3.2	正常	+++					干细胞、窦状腺细胞、胆管上皮细胞、侵润性中性粒细胞和血管内皮细胞	CMG	＞50％	中-强
					肺	F	3.2	正常					+++	肺上皮细胞、间隙细胞和巨噬细胞	CMG	＞50％	中-强
脾	F	3.2	正常	+++					红髓中的淋巴细胞和白髓的生发中心，中性粒细胞和内皮细胞	CMG	＞50％	中-强
					小肠*	F	3.2	正常					+	脂肪细胞和血管	CMG	10％	弱
骨骼肌	F	3.2	正常	+/-					血管内皮细胞	SF	＜50％	模糊
					胰腺	F	3.2	正常					+++	腺泡上皮细胞和朗格汉司小岛	CMG	＞50％	强

最终切片评分取决于细胞的最强染色强度，如下：

阴性染色(-)，模糊染色(+/-)，弱染色(+)，中度染色(++)，强染色(+++)。细胞定位：细胞膜(M)，细胞质(C)，分散(D)，颗粒状(G)，散在的局部(SF)。约％染色的细胞：＜10％(1-9％)，10％，＜50％(11-49％)，50％，＞50％(51-100％)。

*仅脂肪组织

表24：猕猴组织切片的AR1A245.6的IHC的染色结果

组织名称	性别	年龄(年)	病理诊断	切片评分	组织特异性	细胞定位	％染色细胞	染色强度
									心	M	2.5	正常	++	心肌纤维	CMG	＞50％	弱-强
脑	M	2.5	正常	+/-	神经元、神经胶质、血管内皮细胞	SF	＜50％	模糊

肾	M	2.5	正常	+++	肾小管	CMG	＞50％	中-强
									肾小球	SF	＜50％	模糊
					肝	M	2.5	正常					+++	肝细胞、窦状腺细胞、胆管上皮细胞、侵润性中性粒细胞和血管内皮细胞	CMG	＞50％	中-强
肺	M	2.5	正常	+++					肺上皮细胞、间隙细胞和巨噬细胞	CMG	＞50％	中-强
					脾	M	2.5	正常					+++	红髓中的淋巴细胞和白髓的生发中心，中性粒细胞和	CMG	＞50％	中-强
小肠	M	2.5	正常	+++					粘膜&腺上皮细胞	CMG	＞50％	中-强
					骨骼肌	M	2.5	正常					-	-	-	-	阴性
胰腺	M	2.5	正常	+++					腺泡上皮细胞、导管上皮细胞和朗格汉司小岛	CMG	＞50％	强

最终切片评分取决于细胞的最强染色强度，如下：

阴性染色(-)，模糊染色(+/-)，弱染色(+)，中度染色(++)，强染色(+++)。细胞定位：细胞膜(M)，细胞质(C)，分散(D)，颗粒状(G)，散在的局部(SF)。约％染色的细胞：＜10％(1-9％)，10％，＜50％(11-49％)，50％，＞50％(51-100％)。

*仅脂肪组织

如使用人类组织观察到的，H5C6结合(表25和26中所描述的)表现出与H460-22-1和AR1A245.6的结合相类似的结合模式，比AR7BD-33-11A结合了更广泛的组织。对于全部四种抗CD63抗体，细胞定位主要是细胞质，且具有颗粒状染色模式。

表25.短尾猴组织切片的H5C6的IHC的染色结果

组织名称	性别	年龄(年)	病理诊断	切片评分	组织特异性	细胞定位	％染色细胞	染色强度
									心	F	3.2	正常	+	心肌纤维	CMG	＞50％	弱
脑	F	3.2	正常	+/-	血管内皮细胞	SF	＜10％	模糊
									肾	F	3.2	正常	+++	管状上皮细胞	CMD	＞50％	强

					肾小球	SF	＜10％	模糊
									肝	F	3.2	正常	+++	窦状腺细胞、胆管上皮细胞、侵润性中性粒细胞和血管内皮细胞	CMG	＞50％	强
肝细胞	CMG	＞50％	弱-中
				肺	F	3.2	正常	+++						肺上皮细胞、间隙细胞和巨噬细胞	CMG	＞50％	中-强
脾	F	3.2	正常						+++	红髓中的淋巴细胞和白髓的生发中心，中性粒细胞和内皮细胞	CMG	＞50％	中-强
				小肠*	F	3.2	正常	+/-						血管	SF	＜50％	弱
骨骼肌	F	3.2	正常						-	-	-	-	阴性
				胰腺	F	3.2	正常	+++						朗格汉司小岛	CMG	＞50％	强
腺泡上皮细胞和血管内皮细胞	CMG	＞50％	弱-中

最终切片评分取决于细胞的最强染色强度，如下：

阴性染色(-)，模糊染色(+/-)，弱染色(+)，中度染色(++)，强染色(+++)。细胞定位：细胞膜(M)，细胞质(C)，分散(D)，颗粒状(G)，散在的局部(SF)。约％染色的细胞：＜10％(1-9％)，10％，＜50％(11-49％)，50％，＞50％(51-100％)。

*仅脂肪组织

表26：猕猴组织切片的H5C6的IHC的染色结果

组织名称	性别	年龄(年)	病理诊断	切片评分	组织特异性	细胞定位	％染色细胞	染色强度
									心	M	2.5	正常	+	心肌纤维	CMG	＞50％	弱
脑	M	2.5	正常	+/-	血管内皮细胞	SF	＜10％	模糊
									肾	M	2.5	正常	+++	管状上皮细胞	CMD	＞50％	强
肾小球	SF	＜10％	模糊

肝	M	2.5	正常	+++	窦状腺细胞、胆管上皮细胞、侵润性中性粒细胞和血管内皮细胞	CMG	＞50％	强
									肝细胞	CMG	＞50％	弱-中
					肺	M	2.5	正常					+++	肺上皮细胞、间隙细胞和巨噬细胞	CMG	＞50％	中-强
脾	M	2.5	正常	+++					红髓中的淋巴细胞和白髓的生发中心，中性粒细胞和内皮细胞	CMG	＞50％	中-强
					小肠*	M	2.5	正常					++	粘膜&腺上皮细胞	CMG	＞50％	弱-中
骨骼肌	M	2.5	正常	-					-	-	-	阴性
					胰腺	M	2.5	正常					+++	朗格汉司小岛	CMG	＞50％	强
腺泡上皮细胞和血管内皮细胞	CMG	＞50％	弱-中

最终切片评分取决于细胞的最强染色强度，如下：

阴性染色(-)，模糊染色(+/-)，弱染色(+)，中度染色(++)，强染色(+++)。细胞定位：细胞膜(M)，细胞质(C)，分散(D)，颗粒状(G)，散在的局部(SF)。约％染色的细胞：＜10％(1-9％)，10％，＜50％(11-49％)，50％，＞50％(51-100％)。

*仅脂肪组织

这些数据证明：H460-22-1、AR1A245.6、AR7BD-33-11A和H5C6的抗原在人和短尾猴和猕猴中类似地表达，且这些非人灵长类物中表现了体内模型的潜力，以研究H460-22-1、1A245.6或AR7BD-33-11A给药的安全性和药物动力学。

实施例11

体内MDA-MB-231预防性肿瘤实验

参考图24和25中显示的数据，4至8周大的雌性SCID鼠经颈背皮下注射而被植入5百万MB-231人乳腺癌细胞(于100μL盐水中)。将所述鼠随机分为3个治疗组，每组10只。在植入前一天，腹腔内注入稀释后体积为300μL的20mg/kg的H460-22-1测试抗体、抗体缓冲液或同种型对照抗体(已知不结合MB-231细胞)，所述稀释使用含有2.7mM KCl、1mM KH₂PO4、137mM NaCl和20mM Na₂HPO₄的稀释剂从原液浓度稀释。然后以同样方式每周注射一次所述抗体，持续7周。

使用测径器大约每7天测量一次肿瘤生长，持续至10周或直至个体动物达到加拿大动物护理委员会(CCAC)的极限或第120天。在研究的持续过程中记录动物的体重。在研究结束时，所有的动物都根据CCAC指南进行安乐死。

该研究中显示的数据是纵向数据组的通常实例。通常，在该数据组中，时间点间具有高度关联，并且较近的时间点间观察到较高关联。因此，重复测量的方差分析(Rep.ANOVA)用以确定治疗间差异，并且当存在差异时使用共方差分析方法来确定时间点。当各时间点的组间差异可能不仅归因于组而可能归因于之前时间点时，后者是适当的方法。

在整个研究中，没有临床毒性症状。每周测量的体重是健康状况和未能成长的表征。图24表示了研究期间3组鼠的平均体重。各组的体重随时间增加。Rep.ANOVA表明组间没有显著差异，且同种型对照、抗体缓冲液或H460-22-1治疗组的平均曲线没有随时间点改变。

使用Rep.ANOVA用于整个实验，下述结果是显著的。Rep.ANOVA方法表明，不仅各组的平均是差异的(p＜0.001)，而且平均曲线的形状也彼此不同。如图25中可看见的，治疗组H460-22-1似乎具有比其他组更好的效果。另外，同种型对照治疗组和抗体缓冲液治疗组之间的差异不是在统计学上显著的。根据共方差分析，在第18天首次出现显著差异，其中同种型和缓冲液治疗组不同于H460-22-1治疗组。在第53天(在停止治疗后首次测量肿瘤体积)，H460-22-1治疗组的肿瘤体积是抗体对照治疗组的17.7％(p＜0.0001)，从而表明了预防肿瘤负荷的效力。H460-22-1治疗还具有相应的存活益处(图26)。提高的存活率是有价值的效力指标。所有3组治疗后都随访70天。这些数据表明，与对照治疗组相比较，测试抗体的治疗带来了存活益处。对照组在植入后第74-81天间达到50％死亡率。相反，H460-22-1治疗组在研究结束时(植入后120天)还未达到50％的死亡率。同种型对照治疗组在植入后第102天达到100％死亡率。相反，H460-22-1治疗的动物在研究结束时显示了60％的存活率。

总之，在公认的人类癌症模型中，H460-22-1抗体治疗与对照抗体相比，预防了肿瘤负荷并提高了存活率。这些结果表明了该抗体(H460-22-1)作为疗法在其他哺乳动物(包括人)中潜在的药理学和药学益处。

实施例12

体内MDA-MB-231建立的肿瘤实验

5至6周大的雌性SCID鼠经颈背皮下注射而被植入5百万MB-231人乳腺癌细胞(于100μL盐水中)。使用测径器每周测量一次肿瘤生长。当大部分队列在植入后34天达到100mm³(范围70-130mm³)的肿瘤体积时，12只小鼠被随机分成三个治疗组。静脉注入稀释后体积为150μL的15mg/kg/剂量的H460-22-1或同种型对照抗体(已知不结合MB-231细胞)，所述稀释使用含有2.7mM KCl、1mMKH₂PO4、137mM NaCl和20mM Na₂HPO₄的稀释剂从原液浓度稀释；腹腔内注入300μL的9mg/kg/剂量(稀释于盐水中)顺铂。然后以同样方式每周注射3次所述抗体，总共10剂量，直至植入后第48天。每四天注入1次顺铂，至3剂量。使用测径器约每7天测量一次肿瘤生长，持续研究期间或直至个体动物达到CCAC的极限。在在研究的持续过程中记录动物的体重。在研究结束时，所有的动物都根据CCAC指南进行安乐死。

在随机时间点，各组中的平均肿瘤体积和标准偏差是相似的：同种型对照(97.60+/-18.33)；H460-22-1(94.06+/-17.77)；顺铂(98.00+/-18.93)。如图27中所示，在3周治疗期结束时，抗体H460-22-1能够显著抑制肿瘤生长。3组间的平均肿瘤体积的比较显示了组间差异是非常显著的(表27)。

表27：治疗结束时的平均肿瘤体积比较

组(1)	组(2)	平均差异(1-2)	标准差	显著性
					同种型	H460-22-1	188.81	41.09	0
	顺铂	300.69	43.1	0
					H460-22-1	同型	188.81	41.09	0
	顺铂	111.88	43.1	0.013
					顺铂	同型	300.69	43.1	0
	H460-22-1	111.88	43.1	0.013

*在0.05水平下的平均差异是显著的。

通过计算T/C比值(治疗的中位肿瘤体积[T]为同种型对照的中位肿瘤体积[C]的百分比)评价了效力的进一步估计，所述T/C比值反应生长抑制。H460-22-1抗体获得了等于对照的48％的中位肿瘤体积(图28)。图27进一步显示，再与同种型对照相比较时，H460-22-1治疗导致了显著的肿瘤生长抑制，且所述抑制是以最大耐受剂量(MTD)给入的顺铂的肿瘤生长抑制的2/3，但没有顺铂的伴随毒性或死亡。

实验过程中每周记录的体重被作为评价安全性和毒性的指标。如表28中所描述和图29中所显示的，使用同种型对照或H460-22-1治疗的组在体重上差异最小。相反，在治疗期间，顺铂组中观察到了显著的(p＜0.003)恶病质。该组中，体重减轻达最初体重的19.2％，发生了其他临床不良应激(例如归因于脱水和昏睡的毛皮皱折)。与顺铂治疗组中观察到的2例死亡相比，H460-22-1治疗组中没有死亡。

表28：治疗结束时的体重改变和肿瘤生长抑制(％T/C)

*静脉注入的剂量，每周3次，持续3周

治疗剂	号/组	剂量	％体重改变	％肿瘤生长抑制
					同种型对照	12	15mg/kg/剂量*	无平均改变
H460-22-1	12	15mg/kg/剂量*	+1.6％	48
					顺铂	12(-2)	9mg/kg/剂量**	-19.20％	25

**腹腔注入的剂量，每周1次，持续3剂量

总之，在SCID鼠中建立的乳腺癌肿瘤异种移植模型中，H460-22-1比同种型对照抗体显著更有效抑制了肿瘤生长。在3周的治疗期间，H460-22-1获得了比对照少50％的中位T/C肿瘤。另外，H460-22-1导致的抑制为在MTD下给入的顺铂的三分之二，但没有使用化学治疗药物观察到的毒性体征或死亡。

因此，在公认的人类疾病模型中，与对照抗体相比较，使用H460-22-1的治疗显著降低了已建立肿瘤的肿瘤负荷，表明了该抗体在其他哺乳动物(包括人)中用于治疗的药理和药学益处。

实施例13

体内A2058预防性肿瘤实验

参考图30和31中显示的数据，4至8周大的雌性SCID鼠经颈背皮下注射而被植入75万A2058人黑素瘤癌细胞(于100μL盐水中)。将所述鼠随机分为2个治疗组，每组5只。在植入后一天，腹腔内注入稀释后体积为300μL的20mg/kg的7BD-33-11A测试抗体或缓冲液对照，所述稀释使用含有2.7mM KCl、1mM KH₂P04、137mMNaCl和20mM Na₂HPO₄的稀释剂从原液浓度稀释。然后以同样方式每周注射一次所述抗体或缓冲液对照，持续7周。

使用测径器大约每7天测量一次肿瘤生长，持续至10周或直至个体动物达到加拿大动物护理委员会(CCAC)的极限。在研究的持续过程中记录动物的体重。在研究结束时，所有的动物都根据CCAC指南进行安乐死。

与缓冲液对照治疗相比，7BD-33-11A治疗导致了减少的肿瘤生长(图31)。在第55天(治疗结束后5天)，7BD-33-11A治疗组的平均肿瘤体积是缓冲液对照的28％(p＝0.0112，未配对的t-检验)。如体重测定的没有临床毒性体征(图30)。还是在第55天，7BD-33-11A治疗组与缓冲液对照治疗组的平均体重之间没有显著差异(p＝0.3351，未配对的t-检验)。因此，7BD-33-11A治疗显得安全，并在人类癌症体内模型中表现出治疗乳腺、前列腺和现在的黑素瘤中的效力。

实施例14

体内A2058建立的肿瘤实验

参考图32和33中所示的数据，4至8周大的雌性SCID鼠经颈背皮下注射而被植入5×10⁵百万A2058人黑素瘤癌细胞(于100μL盐水中)。当肿瘤达到约75mm³时，将所述鼠随机分为2个治疗组，每组7只。各测试组小鼠使用在载体对照缓冲液(不含CaCl₂和MgCl₂的磷酸缓冲盐水)中稀释至300μL的15mg/kg AR7BD-33-11A治疗，每周3次，共10剂量。对照组小鼠根据相同的计划接受单独的载体对照缓冲液。

使用测径器大约每7天测量一次肿瘤生长，持续研究期间或直至个体动物达到CCAC的极限。在在研究的持续过程中记录动物的体重。在研究结束时，所有的动物都根据CCAC指南进行安乐死。存活不是研究终点。

肿瘤生长在AR7BD-33-11A治疗组中得到了显著抑制。该组中的平均肿瘤体积为对照组测量的30.87％(p＜0443)(图32)。2组记录的平均体重没有发现显著差异(图33)。因此，7BD-33-11A治疗显得安全，并在已建立的人类癌症体内模型中表现出治疗乳腺和现在的黑素瘤的效力。

实施例15

体内A375预防性肿瘤实验

参考图34和35中显示的数据，4至8周大的雌性SCID鼠经颈背皮下注射而被植入1百万A375人黑素瘤癌细胞(于100μL盐水中)。将所述鼠随机分为2个治疗组，每组5只。在植入后一天，腹腔内注入稀释后体积为300μL的20mg/kg的7BD-33-11A测试抗体或缓冲液对照，所述稀释使用含有2.7mM KCl、1mM KH₂PO4、137mMNaCl和20mM Na₂HPO₄的稀释剂从原液浓度稀释。然后以同样方式每周注射一次所述抗体或缓冲液对照，持续7周。

使用测径器大约每7天测量一次肿瘤生长，持续至10周或直至个体动物达到加拿大动物护理委员会(CCAC)的极限。在研究的持续过程中记录动物的体重。在研究结束时，所有的动物都根据CCAC指南进行安乐死。

与缓冲液对照治疗相比，7BD-33-11A治疗导致了减少的肿瘤生长(图34)。在第41天(治疗结束后9天)，7BD-33-11A治疗组的平均肿瘤体积是缓冲液对照的37％(p＝0.0006，未配对的t-检验)。如体重测定的，没有临床毒性体征(图35)。还是在第41天，7BD-33-11A治疗组与缓冲液对照治疗组的平均体重之间没有显著差异(p＝0.5656，未配对的t-检验)。另外，与缓冲液对照鼠相比较，7BD-33-11A治疗延长了存活。所有缓冲液对照鼠由于在第41天(治疗结束前9天)达到CCAC极限而被安乐死，而所有7BD-33-11A治疗鼠在第55天(治疗结束后5天)依然存活。因此，7BD-33-11A治疗再次显示安全，并在人类癌症体内模型中表现出治疗乳腺、前列腺和现在的黑素瘤中的效力。

实施例16

体内A375建立的肿瘤实验

在已建立的黑素瘤体内模型中，已经单独和结合达卡巴嗪测试了AR7BD-33-11A。参考图36中显示的数据，保留在无胸腺裸鼠中的A375黑素瘤系衍生的1mm³肿瘤片段被皮下植入测试小鼠(来自Charles River的无胸腺裸鼠，研究第1天为14-15周大)的拱侧翼。每周监测2次肿瘤，然后当肿瘤达到80-120mm³时每周监测1次。动物被分类成肿瘤体积为62.5-144.0mm³的治疗组和平均肿瘤体积为101.0-102.2mm³的组。每周3次腹腔内注射20mg/kg的AR7BD-3311A，持续3周；并且每周一次腹腔内注射90mg/kg(该模型中的1/2最大耐受剂量)达卡巴嗪，持续连续5天。对照组接受0.2mL/20g体重的磷酸缓冲盐水、AR7BD-33-11A载体，每周3次，持续3周。治疗在具有已建立的(~102mm³)黑素瘤的10只裸鼠的组中开始于第1天。每周测量2次肿瘤大小，直至肿瘤达到2,000-mm³的极限体积。一旦小鼠达到该极限，则被安乐死。该研究在第87天结束。Logrank检测确定了药物治疗组和载体治疗组的至极限的时间(TTE)值之间是否存在显著差异(P＜0.05)。研究期间记录了动物的体重，并经常检查小鼠任何不良的药物相关负作用的明显体征。

载体治疗产生了约15.8的中位TTE。一对照鼠在研究期结束时没有可测肿瘤，表明了每组一个不令人满意的肿瘤植入背景，一对照鼠死于非治疗相关原因。在对照组中观察到可忽略的最大平均体重减轻(＜5％)。

达卡巴嗪单一疗法产生了35.1天的中位TTE，与对照鼠相比，相当于122％的肿瘤生长延缓。然而，该降低是不显著的，该组中没有小鼠存活至第87天。三只小鼠死于非治疗相关的原因；两只排出的小鼠经历了完全的肿瘤反应。该组中在第7天观察到的最大平均体重减轻为5.2％。

使用AR7BD-33-11单一疗法观察到不显著的肿瘤生长延缓和可忽略的最大平均体重减轻(＜5％)。

在AR7BD-33-11A/达卡巴嗪联合治疗组中，观察到中位TTE为39.1天，相当于显著的147％的肿瘤生长延缓(P＜0.01)。所述联合治疗产生3例部分反应和2例完全反应，且87天存活者的三分之二在研究结束时保持没有肿瘤。一只小鼠死于非治疗相关原因。该组中在第7天观察到的最大平均体重减轻为3.1％。在研究的任何组中没有观察到毒性死亡。

总之，尽管AR7BD-33-11A单独治疗没有影响该模型中的A375黑素瘤生长，但其提高了达卡巴嗪半数最大耐受剂量的效力，产生了显著活性、存活率增加和增加数目的退行反应。重要的是，AR7BD-33-11A的加入没有调节达卡巴嗪毒性。这些结果表明，AR7BD-33-11A可用以提高其他潜在更毒性的抗癌剂的效力，使需要的药物剂量减少，而同时保持肿瘤反应和毒性水平。

实施例17

体内BxPC-3预防性肿瘤实验

参考图37和38中显示的数据，4至8周大的雌性SCID鼠经颈背皮下注射而被植入5百万BxPC-3人黑素瘤癌细胞(于100μL盐水中)。将所述鼠随机分为2个治疗组，每组5只。在植入后一天，腹腔内注入稀释后体积为300μL的20mg/kg的7BD-33-11A测试抗体或缓冲液对照，所述稀释使用含有2.7mM KCl、1mM KH₂PO4、137mM NaCl和20mM Na₂HPO₄的稀释剂从原液浓度稀释。然后以同样方式每周注射一次所述抗体或缓冲液对照，持续7周。

使用测径器大约每7天测量一次肿瘤生长，持续至10周或直至个体动物达到加拿大动物护理委员会(CCAC)的极限。在研究的持续过程中记录动物的体重。在研究结束时，所有的动物都根据CCAC指南进行安乐死。

与缓冲液对照治疗相比，7BD-33-11A治疗导致了减少的肿瘤生长(图37)。在第55天(治疗结束后5天)，7BD-33-11A治疗组的平均肿瘤体积是缓冲液对照的29％(p＝0.0009，未配对的t-检验)。如体重测定的，没有临床毒性体征(图38)。还是在第55天，7BD-33-11A治疗组与缓冲液对照治疗组的平均体重之间没有显著差异(p＝0.5358，未配对的t-检验)。另外，与缓冲液对照鼠相比较，7BD-33-11A治疗延长了存活。所有缓冲液对照鼠由于在第55天(治疗结束前5天)达到CCAC极限而被安乐死，而80％的7BD-33-11A治疗鼠在第70天(治疗结束后20天)依然存活。因此，7BD-33-11A治疗再次显示安全，并在人类癌症体内模型中表现出治疗乳腺、前列腺和现在的黑素瘤中的效力。

实施例18

NOD SCID与SCID的体内预防性肿瘤实验

参考图39中显示的数据，4至6周大的雌性NOD SCID和SCID鼠经颈背皮下注射而被植入5百万MB-231人乳腺癌细胞(于100μL盐水中)。将所述鼠随机分为3个治疗组，每组10只。在植入后一天，腹腔内注入稀释后体积为300μL的20mg/kg的H460-22-1测试抗体、0.2mg/kg的7BD-33-11A测试或抗体缓冲液，所述稀释使用含有2.7mM KCl、1mM KH₂PO4、137mM NaCl和20mM Na₂HPO₄的稀释剂从原液浓度稀释。然后以同样方式每周注射一次所述抗体，持续7周。

使用测径器大约每7天测量一次肿瘤生长，持续至10周或直至个体动物达到加拿大动物护理委员会(CCAC)的极限或第120天。在研究的持续过程中记录动物的体重。在研究结束时，所有的动物都根据CCAC指南进行安乐死。

在整个研究中，没有临床毒性症状。每周测量的体重是健康状况和未能成长的表征。各组的体重随时间增加。

如图19中所描述的，在第54天(最终治疗后4天)，在SCID治疗组中，7BD-33-11A和H460-22-1治疗鼠生成的肿瘤分别仅为缓冲液对照治疗鼠平均肿瘤体积的1.9％和3.6％。相反，在NOD SCID治疗组中，还是在第54天(最终治疗后4天)，7BD-33-11A治疗鼠的肿瘤生长为缓冲液对照治疗鼠平均肿瘤体积的67％。尽管与缓冲液对照相比，NOD SCID鼠中平均体重依然是降低的(p＝0.0710，未配对的t-检验)，但是与SCID鼠中观察到的相比，效力还是降低的。H460-22-1治疗鼠表现出与SCID鼠中类似的效果；肿瘤生长为缓冲液对照治疗鼠平均肿瘤体积的1.4％。因此，7BD-33-11A的体内活性似乎部分归因于ADCC活性，而H460-22-1的抗肿瘤作用似乎不依赖于ADCC。

另外，与缓冲液对照鼠相比较，7BD-33-11A治疗延长了存活。所有缓冲液对照鼠由于在第55天(治疗结束前5天)达到CCAC极限而被安乐死，而80％的7BD-33-11A治疗鼠在第70天(治疗结束后20天)依然存活。因此，7BD-33-11A治疗再次显示安全，并在人类癌症体内模型中表现出治疗乳腺、前列腺和现在的黑素瘤中的效力。

优势证据表明，7BD-33-11A通过存在于CD63细胞外环2上的表位的连接而介导抗癌作用。在实施例2中已经显示，7BD-33-11A抗体可用以免疫沉淀来自表达细胞(例如MDA-MB-231细胞)的同族抗原。进一步地，可以显示，7BD-33-11A抗体可使用(但不限于)FACS、细胞ELISA或IHC描述的技术而用于检测表达CD63抗原性部分(与其特异性结合)的细胞和/或组织。

因此，使用FACS、细胞ELISA或IHC可以显示，免疫沉淀的7BD-33-11A抗原可以抑制7BD-33-11A结合至这类细胞或组织。进一步地，与7BD-33-11A抗体一样使用相同类型的测定法其他抗CD63抗体可用以免疫沉淀和分离其他形式的CD63抗原，并且所述抗原可用以抑制这些抗体至表达所述抗原的细胞或组织的结合。

实施例19

通过BIAcore分析测定7BD33-11A、ARH460-22-1和AR1A245.6的抗原结合亲和力

通过BIAcore分析测定了7BD33-11A、ARH460-22-1和AR1A245.6的抗原结合亲和力。全部实验使用Hanks缓冲盐水作为电泳缓冲液(20mM Hepes pH7.4，150mM NaCl，3.4mM EDTA，0.005％吐温20)在流速5μl/分钟下进行。首先使用标准的胺偶联程序固定抗谷光甘肽S-转移酶(GST)抗体。简要地，通过注射35μl含有0.05M N-羟基琥珀酰亚胺和0.2M 1-乙基-3-(3-二甲胺基丙胺)carbodimide的水混合物、随后浓度为30μg/ml的抗GST抗体(于10mM醋酸钠中，pH5.0)来活化CM5传感器芯片，直至捕获50,000RU至100,000RU。最后，注射30μl的1.0M乙醇胺-HCl(pH8.5)来封闭传感器芯片表面上的任何活化位点。然后注射25μl的5μg/ml的GST-EC2(GST的重组融合多肽，且具有CD63的完整C末端结构域)，随后注射25-50μl的测试抗体。通过10μl的20mM甘氨酸(pH2.2)的两次脉冲完成了传感器芯片表面再生，用于随后的注射。以范围从12.5至200nM的浓度连续注射测试抗体。作为对照，各抗体浓度注射在表面上，其中GST替代GST-EC2被捕获。

根据测量的稳定状态结合水平计算不同抗体对EC2结构域的亲和力。对于各感应谱，报告点取在抗体注射前20秒(在平衡或Req的共振单位)。对于各抗体浓度，抗体注射在GST-EC2上所获得的Req减去抗体注射在GST表面时所获得的Req。根据Req/Conc.与Reqplot斜线计算的结合常数(KA)显示于表29。也显示于表29中的离解常数(KD)被计算为KA的倒数。

表29：通过BIAcore分析的7BD33-11A、ARH460-22-1和AR1A245.6抗原结合亲和力

抗体	7BD-33-11A	H460-22-1	1A245.6
				*KD(nM)	135.0	41.7	9.8
SEM	30.4	8.3	2.9

*数据是平均的且是至少三次独立实验的SEM。

本说明书提到的所有专利和公布都是本发明所述领域技术人员的预示水平。所有专利和公布通过引用结合入本文，至如同各单个公布通过引用特别和单独结合入的程度。

应该理解，虽然描述了本发明的某种形式，但不限于本文描述和显示的部分特定形式或安排。对本领域技术人员显而易见的是，可以做出各种变化且不脱离本发明的范围，不认为本发明限于本说明书所显示和描述的。本领域技术人员将容易理解，本发明适以实施所述目的并获得所述结果和优点，以及本文那些固有优点。本文描述的任何寡核苷酸、肽、多肽、生物相关化合物、方法、程序和技术是目前代表性的优选实施方案，并意欲示例并不意欲对范围的限制。本领域技术人员将想到其改变或其他用途，其包括在本发明的精神之内并由所附权利要求书所限定。尽管通过特别优选的实施方案已经描述了本发明，但应该理解，所要求保护的发明不应该不当地限于这样的特定实施方案。实际上，对于本领域技术人员显而易见的用于实施本发明的期望模式的各种调整将在下述权利要求的范围内。

Claims (8)

1.一种能够特异性结合至人类CD63的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体与可获自杂交瘤细胞系H460-22-1的单克隆抗体相同的人类CD63表位反应，所述杂交瘤细胞系H460-22-1的ATCC保藏号为PTA-4622。

2.一种能够特异性结合至人类CD63的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体与可获自杂交瘤细胞系1A245.6的单克隆抗体相同的人类CD63表位反应，所述杂交瘤细胞系1A245.6的ATCC保藏号为PTA-4889。

3.一种能够特异性结合至人类CD63的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体与可获自杂交瘤细胞系7BD-33-11A的单克隆抗体相同的人类CD63表位反应，所述杂交瘤细胞系7BD-33-11A的ATCC保藏号为PTA-4890。

4.一种单克隆抗体，其识别的表位与选自下述组的杂交瘤所生成的单克隆抗体所识别的表位相同：保藏号为PTA-4622的杂交瘤细胞系H460-22-1、保藏号为PTA-4889的杂交瘤细胞系1A245.6和保藏号为PTA-4890的杂交瘤细胞系7BD-33-11A。

5.单克隆抗体用于减少表达CD63抗原的人类癌症中肿瘤负荷的用途，包括：

提供至少一种单克隆抗体，所述单克隆抗体识别的表位与选自下述组的杂交瘤所生成的单克隆抗体所识别的表位相同：保藏号为PTA-4622的杂交瘤细胞系H460-22-1、保藏号为PTA-4889的杂交瘤细胞系1A245.6和保藏号为PTA-4890的杂交瘤细胞系7BD-33-11A；

其中所述表位的结合有效减少肿瘤负荷。

6.单克隆抗体用于治疗表达人类CD63抗原的人类癌性肿瘤的用途，包括：

提供至少一种单克隆抗体，所述单克隆抗体识别的表位与选自下述组的杂交瘤所生成的单克隆抗体所识别的表位相同：保藏号为PTA-4622的杂交瘤细胞系H460-22-1、保藏号为PTA-4889的杂交瘤细胞系1A245.6和保藏号为PTA-4890的杂交瘤细胞系7BD-33-11A；结合至少一种化学疗剂；

从而减少肿瘤负荷。

7.一种测定表达CD63表位的细胞在灵长类组织样品中存在的结合测定法，包括：

提供来自所述灵长类的组织样品；

提供至少一种单克隆抗体或抗原结合片段，所述单克隆抗体或抗原结合片段识别的表位与选自下述组的杂交瘤所生成的单克隆抗体所识别的表位相同：保藏号为PTA-4622的杂交瘤细胞系H460-22-1、保藏号为PTA-4889的杂交瘤细胞系1A245.6和保藏号为PTA-4890的杂交瘤细胞系7BD-33-11A，所述克隆以保藏号PTA-4890保藏于ATCC；

将所述至少一种单克隆抗体或其抗原结合片段与所述灵长类组织样品相接触；和

测定所述至少一种单克隆抗体或其抗原结合片段与所述灵长类组织样品的结合；

从而指示所述细胞在所述组织样品中的存在。

8.一种测定表达CD63表位的癌细胞在选自人类肿瘤的组织样品中存在的结合测定法，包括：

提供来自所述人类的组织样品；

提供至少一种单克隆抗体或抗原结合片段，所述单克隆抗体或抗原结合片段识别的表位与选自下述组的杂交瘤所生成的单克隆抗体所识别的表位相同：保藏号为PTA-4622的杂交瘤细胞系H460-22-1、保藏号为PTA-4889的杂交瘤细胞系1A245.6和保藏号为PTA-4890的杂交瘤细胞系7BD-33-11A，所述克隆以保藏号PTA-4890保藏于ATCC；

将所述至少一种单克隆抗体或其抗原结合片段与所述组织样品相接触；和

测定所述至少一种单克隆抗体或其抗原结合片段与所述组织样品的结合；

从而指示所述癌细胞在所述组织样品中的存在。

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