CN104302667A - 外来体检测用单克隆抗体 - Google Patents

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Abstract

外来体检测或捕捉用单克隆抗体，其选自：能够检测或捕捉外来体的、识别SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的氨基酸编号113～195的单克隆抗体或其抗体片段、识别SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的氨基酸编号104～202的单克隆抗体或其抗体片段、识别SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列的氨基酸编号36～54的单克隆抗体或其抗体片段、和识别SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列的氨基酸编号113～201的单克隆抗体或其抗体片段。本发明的外来体检测用单克隆抗体可以以良好的灵敏度和特异性检测机体内外来体上的CD9、CD63或CD81。

Description

外来体检测用单克隆抗体
技术领域
本发明涉及检测外来体的抗体的套件。更详细而言，涉及针对外来体表面的特定抗原（CD9、CD63、CD81）的单克隆抗体或其抗体片段、含有该单克隆抗体或其抗体片段的套件、使用该单克隆抗体或其抗体片段来检测来源于外来体的miRNA的方法、测定该套件与来源于受试者的机体试样的复合体的方法、使用该套件的癌或免疫系疾病的诊断方法和用于实施该方法的试剂盒、以及使用该套件的抗癌剂或抗免疫系疾病药的药效评价方法和用于实施该方法的试剂盒。
背景技术
外来体是存在于机体内的体液中的囊泡颗粒。已知与通常的细胞表面相同地，在外来体表面存在各种膜蛋白。另一方面，还已知在外来体内部，除了细胞因子等各种蛋白质以外，还含有microRNA（miRNA）。此外，据报道外来体分泌自各种细胞、例如免疫系的细胞或各种癌细胞，作为机体内的细胞间通信的媒介发挥功能而与生理现象关联、或者与癌等疾病的关联性受到关注。
例如，在非专利文献1中，报道了使用作为肿瘤标志物的EpCAM的抗体来分离卵巢癌患者的循环血液中的外来体，并在来源于该外来体的miRNA表达量与卵巢癌患者之间发现了关联性。因此，只要可简便地捕捉与癌等疾病关联的外来体的量的变化，则可期待在外来体的诊断药中的应用。
此外，CD9、CD63和CD81是属于四跨膜蛋白家族的4次穿膜型膜蛋白，在许多外来体上表达。例如，非专利文献2中报道了用CD63的抗体、或肿瘤关联标志物的Caveolin-1的抗体对黑素瘤患者血浆中的外来体进行检测、定量化，与正常人相比有所上升。专利文献1中通过组合CD63抗体或针对各种膜蛋白的抗体等来与离心后的血浆样品反应，并对来源于癌患者中的外来体的信号进行定量、分析。
现有技术文献
专利文献
专利文献1 : WO2010/065968号小册子
非专利文献
非专利文献1 : D.D.Taylor，et　al.、Gynecol.Oncol.、2008、110、p13-21
非专利文献2 : M.Logozzi，et　al.、PLoS　ONE、2009、4、p1-10。
发明内容
发明要解决的技术问题
作为抗CD9抗体、抗CD63抗体和抗CD81抗体，销售有各种抗体。这些市售抗体是通过直接免疫表达CD9、CD63或CD81的细胞而得的抗体之一，而并不是利用设计的特定抗原进行免疫得到的抗体。因此，在灵敏度、特异性方面尚不充分，为了迅速且简便、而且准确且精度良好地检测外来体，需要进一步的技术开发。
本发明的课题在于提供：能够以良好的灵敏度和特异性检测或捕捉机体内外来体的单克隆抗体或其抗体片段、含有该单克隆抗体或其抗体片段的套件、测定该套件与来源于受试者的机体试样的复合体的方法、使用该套件的癌或免疫系疾病的诊断方法、以及使用该套件的抗癌剂或抗免疫系疾病药的药效评价方法。
用于解决技术问题的方法
本发明人为了解决上述课题而反复深入研究，结果发现，通过制备并使用针对外来体上的CD9、CD63和CD81的特定序列的单克隆抗体，能够以良好的灵敏度和特异性检测和捕捉机体内外来体，从而完成了本发明。
即、本发明涉及：
＜1＞　外来体检测或捕捉用单克隆抗体，其选自：能够检测或捕捉外来体的、识别SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的氨基酸编号113～195的单克隆抗体或其抗体片段、识别SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的氨基酸编号104～202的单克隆抗体或其抗体片段、识别SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列的氨基酸编号36～54的单克隆抗体或其抗体片段、和识别SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列的氨基酸编号113～201的单克隆抗体或其抗体片段。　
更详细而言，涉及以下的＜2＞～＜13＞。
＜2＞　外来体检测或捕捉用单克隆抗体，其选自：作为识别SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的氨基酸编号113～195的单克隆抗体片段的由以保藏编号FERM　ABP-11519保藏的杂交瘤产生的单克隆抗体（CD9-12A12抗体）或其片段；
作为识别SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的氨基酸编号104～202的单克隆抗体片段的由以保藏编号FERM　ABP-11520保藏的杂交瘤产生的单克隆抗体（CD63-8A12抗体）或其片段；
作为识别SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的氨基酸编号104～202的单克隆抗体片段的由以保藏编号FERM　ABP-11521保藏的杂交瘤产生的单克隆抗体（CD63-13C8抗体）或其片段；
作为识别SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列的氨基酸编号113～201的单克隆抗体片段的由以保藏编号NITE　ABP-1480保藏的杂交瘤产生的单克隆抗体（CD81-4G6抗体）或其片段；
作为识别SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列的氨基酸编号113～201的单克隆抗体片段的由以保藏编号NITE　ABP-1481保藏的杂交瘤产生的单克隆抗体（CD81-6D12抗体）或其片段；和
作为识别SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列的氨基酸编号36～54的单克隆抗体片段的由以保藏编号NITE　ABP-1482保藏的杂交瘤产生的单克隆抗体（CD81-12C4抗体）或其片段。
＜3＞　单克隆抗体或其抗体片段的套件，其包含选自下述的同一或二种抗体或其抗体片段的组合：CD9-12A12抗体或其抗体片段、CD63-8A12抗体或其抗体片段、和CD63-13C8抗体或其抗体片段。
＜4＞　前述＜3＞所述的套件，其选自：固相抗体为CD9-12A12抗体或其抗体片段、标记抗体为CD9-12A12抗体或其抗体片段的套件；
固相抗体为CD9-12A12抗体或其抗体片段、标记抗体为CD63-13C8抗体或其抗体片段的套件；
固相抗体为CD63-8A12抗体或其抗体片段、标记抗体为CD9-12A12抗体或其抗体片段的套件；和
固相抗体为CD63-8A12抗体或其抗体片段、标记抗体为CD63-13C8抗体或其抗体片段的套件。
＜5＞　前述＜3＞或＜4＞所述的套件，其用于检测外来体。
＜6＞　疾病特异性的外来体检测用单克隆抗体的套件，其包含选自CD9-12A12抗体或其抗体片段、CD63-8A12抗体或其抗体片段、和CD63-13C8抗体或其抗体片段中的抗体或其抗体片段、与疾病特异性膜蛋白抗体或其抗体片段的组合。
＜7＞　癌或免疫系疾病的诊断试剂盒，其含有前述＜3＞～＜5＞中任一项所述的套件的单克隆抗体或其抗体片段。
＜8＞　癌或免疫系疾病的诊断试剂盒，其含有前述＜6＞所述的套件的单克隆抗体或其抗体片段。
＜9＞　癌或免疫系疾病的诊断试剂盒，其含有前述＜6＞所述的套件。
＜10＞　检测外来体的miRNA的方法，该方法包括：使来源于受试者的机体试样与前述＜1＞或＜2＞所述的单克隆抗体接触而捕捉该外来体。
＜11＞　测定来源于外来体复合体的信号强度的方法，该方法包括：使来源于受试者的机体试样与前述＜3＞～＜5＞中任一项所述的套件的单克隆抗体接触而形成该外来体复合体。
＜12＞　癌或免疫系疾病的判定方法，其是用于判定受试者是否具有癌或免疫系疾病的发病的方法，该方法包括：
步骤（I)：使来源于受试者的机体试样与前述＜3＞～＜5＞中任一项所述的套件的单克隆抗体接触而形成外来体复合体，并测定来源于该复合体的信号强度的步骤；和
步骤（II）：将前述步骤（I）中测定得到的信号强度与对照者的信号强度进行对比，在确认前述受试者的信号强度较对照者的信号强度强时，判定前述受试者具有癌或免疫系疾病的发病的步骤。
＜13＞　抗癌剂或抗免疫系疾病药的药效评价方法，该方法包括：
步骤（A）：使来源于抗癌剂或抗免疫系疾病药的给药前和给药后的受试者的机体试样与前述＜3＞～＜5＞中任一项所述的套件的单克隆抗体接触而形成外来体复合体，并测定来源于该复合体的信号强度的步骤；和
步骤（B）：在确认前述来源于抗癌剂或抗免疫系疾病药的给药后的受试者的机体试样的来源于该复合体的信号强度较前述来源于抗癌剂或抗免疫系疾病药的给药前的受试者的机体试样的来源于该复合体的信号强度弱时，判定抗癌剂或抗免疫系疾病药显示药效的可能性高的步骤。
发明效果
本发明的外来体检测用单克隆抗体能够以良好的灵敏度和特异性检测和捕捉机体内外来体上的CD9、CD63或CD81。藉此实现了下述优异效果：可以捕捉血液样本内的外来体的微小变化（除了外来体的量的变化之外，还包括外来体上的膜蛋白的CD9、CD63或CD81的量的变化），可以检测来源于癌等疾病的外来体的变化，可应用于诊断作为造成变化的原因的疾病。
附图说明
[图1] 图1是示出利用外来体的诊断方法的概念的图。
[图2] 图2是示出四跨膜蛋白家族（CD9、CD63和CD81）的结构的图（图A）、和示出抗体制作中使用的小环肽缀合物（图B）和大环Fc融合蛋白（图C）的图。
[图3] 图3是用于抗原的CD9和CD63的序列信息。
[图4] 图4是示出使用单克隆抗体的VLPs（Virus-Like-Particles，病毒样颗粒）的评价方法（VLP　ELISA）。
[图5] 图5是进行抗CD9单克隆抗体的2次评价的图。
[图6] 图6是进行抗CD63单克隆抗体的2次评价的图。
[图7] 图7是示出CD9的外来体　ELISA的标准曲线的图。
[图8] 图8是示出CD63的外来体　ELISA的标准曲线的图。
[图9] 图9是通过使用市售和本发明（自制）的抗CD9抗体或抗CD63抗体的外来体　ELISA对来自正常人、乳癌患者、和大肠癌患者的血清中的外来体的信号强度进行比较的图。
[图10] 图10是通过组合本发明的抗CD9抗体和抗CD63抗体的外来体　ELISA对来自正常人、乳癌患者、和大肠癌患者的血清中的外来体的信号强度进行测定的图。
[图11] 图11是通过组合本发明的抗CD9抗体或抗CD63抗体与抗EpCAM抗体的外来体　ELISA对来自正常人、乳癌患者、和大肠癌患者的血清中的外来体的信号强度进行测定的图。
[图12] 图12是用于抗原的CD81的序列信息。
[图13] 图13是将本发明的抗CD9抗体与市售的抗CD9抗体进行免疫沉降性能比较的图。
[图14] 图14是将本发明的抗CD63抗体与市售的抗CD63抗体进行免疫沉降性能比较的图。
[图15] 图15是将本发明的抗CD81抗体与市售的抗CD81抗体进行免疫沉降性能比较的图。
具体实施方式
本发明的外来体检测用单克隆抗体具有下述特征：能够以良好的灵敏度和特异性检测或捕捉机体内外来体上的CD9、CD63或CD81。所以，有时也将本发明的单克隆抗体记载为外来体检测或捕捉用单克隆抗体。
外来体上的CD9、CD63、CD81分别是由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列组成的多肽、由SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列组成的多肽、由SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列组成的多肽。此外，CD9、CD63和CD81均是属于具有图2A所示4次穿膜型的结构的四跨膜蛋白家族的膜蛋白。这些膜蛋白将小环（记为EC1）和大环（记为EC2）这2种环结构提呈至细胞外，本发明的单克隆抗体的特征在于，对这些环表现出特异性的识别。
以下，对本发明的外来体检测或捕捉用单克隆抗体的制备方法、含有该抗体的套件、利用该抗体或套件的评价方法、和使用该抗体的外来体的捕捉进行详述。
＜单克隆抗体的制备方法＞
(抗原的制备)
本发明的单克隆抗体是如下所述设计抗原而制备的，因而对抗原的灵敏度和特异性优异。
依照公知的方法合成外来体的CD9、CD63或CD81的小环肽，即，在CD9多肽的Arg36-Asn50、CD63多肽的Val38-Pro54、CD81多肽的Arg36-Ala54的氨基末端添加了半胱氨酸残基的肽。对于所得的各肽，使用进行了马来酰亚胺化的KLH〔Keyhole　Limpet　Hemocyanin、Imject（注册商标）Maleimide　Activated　mcKLH、ピアス社制〕，经由肽的SH基制备半抗原。图2B示出前述免疫原的模式图，图3A和图12A示出其肽序列。
此外，家兔IgG的Fc区与CD9、CD63或CD81的大环肽的融合蛋白（Fc融合蛋白）也可用作抗原。具体可如下制备：将导入了与在CD9多肽的His113-Ile195、CD63多肽的Gly104-Asn202、CD81多肽的Phe113-Lys201的羧基末端添加有Fc的多肽对应的多核苷酸序列的质粒载体导入例如Freestyle　293-F　细胞（Invitrogen公司(インビトロジェン社)制）并瞬时表达，然后使用蛋白A柱（MAPS　II试剂盒、Bio-Rad　Laboratories　Inc.）进行纯化，由此制备。图2C示出前述免疫原的模式图，图3B和图12B示出其肽序列。
(单克隆抗体的制备)
本发明的外来体检测用单克隆抗体(以下也简称为本发明的单克隆抗体)并无特别限定，可依照公知的方法、例如、K.Watanabe　et　al.，Vasohibin　as　an　endothelium-derived　negative　feedback　regulator　of　angiogenesis，J.Clin.Invest.114（2004），898-907中记载的方法制备。
具体地，首先使用上述所得的抗原对哺乳动物进行免疫。作为哺乳动物，没有特别限制，通常可使用小鼠、大鼠、牛、兔、山羊、绵羊、豚鼠等。其中，优选小鼠和大鼠、更优选小鼠、作为所述小鼠，例示有A/J系、BALB/C系、DBA/2系、C57BL/6系小鼠。此外，该哺乳动物的年龄根据使用的动物种类而不同，没有特别限定，在小鼠或大鼠的情形，通常为约4～12周龄、优选为约5～10周龄。应予说明，为了制造本发明的单克隆抗体，可以考虑与进行细胞融合的转化细胞的适合性来选择这些哺乳动物。
为了增强免疫应答，抗原与佐剂混合而作为免疫原使用。作为佐剂，可以没有特别限定地使用公知的佐剂。此外，该佐剂与抗原的混合，对于使用的佐剂，可以依照本领域公知的方法。
哺乳动物的免疫依照本领域公知的方法进行。例如，通过将免疫原向哺乳动物的皮下、皮内、静脈、和/或腹腔内注射给药来进行。此外，免疫原的给药可以在最初的免疫后重复数次进行，其给药间隔可适宜调整。应予说明，免疫应答根据被免疫的哺乳动物的种类和系统而不同，因而免疫计划和免疫原的给药量可对应于所用动物适宜设定。
如此，可在经免疫的哺乳动物体内制备所期望的抗体产生细胞。作为所述抗体产生细胞，优选为在免疫原的最终给药的3～5天后采集的脾细胞。应予说明，为了使经免疫的哺乳动物的脾脏肥大化，可以进行加强（免疫原的追加注射）。在加强中所给药的免疫原的量理想的是最初给药的免疫原的量的约4～5倍，可以以此为标准进行适宜增减。
接着，将所得抗体产生细胞与来源于骨髓瘤的细胞(骨髓瘤细胞)进行细胞融合，制备杂交瘤。
杂交瘤的增殖能力依赖于细胞融合中所用骨髓瘤细胞的种类，因而作为骨髓瘤细胞，优选为增殖能力优异的细胞。此外，骨髓瘤细胞优选与产生待融合抗体产生细胞的哺乳动物具有相容性。作为该实例，例示有小鼠骨髓瘤P3U1、X63-Ag8.653等骨髓瘤细胞。
细胞融合的方法可以使用本领域公知的方法，例如，例示有使用聚乙二醇（PEG）的方法、使用仙台病毒的方法、使用电融合装置的方法等。
所得的杂交瘤可以依照公知方法通过用选择培养基培养来分离。应予说明，为了确认所选择的杂交瘤是否产生所期望的抗体，可以采集培养上清，基于公知的方法、例如、后述ELISA法进行抗体效价测定。
这样，可以得到产生所期望的单克隆抗体的杂交瘤。该杂交瘤可以用通常的培养基传代培养，还可以在液氮中半永久地保存。
所期望的单克隆抗体可以通过体内和体外的培养法来大量制备。体外培养法可通过在适当的血清培养基或无血清培养基中培养杂交瘤来实施，所期望的单克隆抗体产生在培养基中。根据该培养法，可以以培养上清的形式得到比较高纯度的所期望的抗体。此外，体内培养法可以通过将杂交瘤注射接种于与杂交瘤具有相容性的哺乳类动物、例如小鼠等的腹腔内并进行增殖来实施，所期望的抗体可以以小鼠腹水的形式大量回收。
所得培养上清和小鼠等的腹水可以直接作为粗制抗体液使用。此外，它们可以依照常法，例如，通过适宜组合DEAE阴离子交换色谱法、亲和色谱法、硫酸铵分级沉淀法、PEG分级沉淀法、乙醇分级沉淀法等来纯化，制为纯化抗体。
这样得到的本发明的单克隆抗体示于表1。本说明书中，各单克隆抗体可通过抗原蛋白和克隆编号来表示，例如，可表示为CD9-12A12抗体。
[表1]
应予说明，本发明中，作为产生上述单克隆抗体的杂交瘤，还可以使用以下述保藏编号保藏于独立行政法人　制品评价技术基础机构(製品評価技術基盤機構)　专利微生物保藏中心(茨城県つくば市東1-1-1　つくば中心中央第6、或千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8)的细胞。　
FERM　ABP-11519(产生的单克隆抗体为CD9-12A12抗体、表示为CD9：12A12、保藏日2011年11月8日）
FERM　ABP-11520（产生的单克隆抗体为CD63-8A12抗体、表示为CD63：8A12、保藏日2011年11月8日）
FERM　ABP-11521（产生的单克隆抗体为CD63-13C8抗体、表示为CD63：13C8、保藏日2011年11月8日）
NITE　ABP-1480(产生的单克隆抗体为CD81-4G6抗体、表示为CD81-4G6、保藏日2012年12月12日）
NITE　ABP-1481（产生的单克隆抗体为CD81-6D12抗体、表示为CD81-6D12、保藏日2012年12月12日）
NITE　ABP-1482（产生的单克隆抗体为CD81-12C4抗体、表示为CD81-12C4、保藏日2012年12月12日）。
本发明中，“单克隆抗体片段”意指前述本发明的单克隆抗体的一部分，是与该单克隆抗体相同地对CD9、CD63或CD81具有特异性的结合性的片段。对CD9、CD63或CD81具有特异性结合性的片段具体可举出：Fab、F（ab’）2、Fab’、单链抗体（scFv）、二硫键稳定化抗体（dsFv）、二聚化V区片段（双抗体）、含CDR的肽等（エキスパート・オピニオン・オン・テラピューティック・パテンツ、第6卷、第5号、第441～456页、1996年）。
本发明的单克隆抗体或其抗体片段对外来体表面的CD9、CD63或CD81显示特异性的识别，因而可适宜地用于以表达CD9、CD63或CD81的物质为对象的后述评价方法。
＜单克隆抗体的套件＞
此外，本发明还提供含有至少1种前述本发明的单克隆抗体或其抗体片段的单克隆抗体的套件。通过使用所述套件，可以灵敏度良好地进行试样中的外来体的捕捉，因而例如利用夹心ELISA法的定量精度提高。
作为套件，根据与本发明的单克隆抗体组合的抗体的种类，可举出以下2种方式。　
方式1：含有2种以上本发明的单克隆抗体或其抗体片段的套件
方式2：含有本发明的单克隆抗体或其抗体片段与疾病特异性膜蛋白抗体或其抗体片段的套件。
方式1的套件只要含有2种以上本发明的单克隆抗体或其抗体片段则没有特别限定，也包括含有多个同种的抗体或其抗体片段的方式。具体地，可举出组合了选自CD9-12A12抗体或其抗体片段、CD63-8A12抗体或其抗体片段、和CD63-13C8抗体或其抗体片段中的抗体、与选自CD9-12A12抗体或其抗体片段、CD63-8A12抗体或其抗体片段、和CD63-13C8抗体或其抗体片段中的抗体的套件，此时，可将一方作为固相抗体、另一方作为标记抗体使用。
固相抗体和标记抗体的制备，即，表1所示的单克隆抗体或其抗体片段的固相化和标记化没有特别限定，可依照公知的方法进行。
对于固相抗体和标记抗体的组合，可以依照公知的ELISA法，调查例如外来体的特异性结合性或定量性来进行评价。
对于特异性结合性，在通过后述实施例4中记载的夹心EILSA法来测定添加有已知量外来体的试样中的外来体时，可以通过所得的信号强度来进行评价。将能够得到充分的信号强度的组合判断为良好的组合。进而，还可以对血液样本进行外来体的添加回收试验，添加回收率的好坏均可以用于判断组合的选择。例如，添加回收率若为85～115%左右，则判断为良好的组合。
对于定量性，在与后述实施例4中记载的夹心EILSA法相同的方法中，在至少直至100ng/mL、优选50～25000ng/mL的浓度范围，以外来体浓度依赖性的方式确认到信号强度的上升、并可得到线性良好的标准曲线的组合可判断为良好的组合。
如上所述，将判断为良好组合的组合示于以下表2。
[表2]
方式1的套件的具体使用方法在后述测定方法中说明。
方式2的套件含有本发明的单克隆抗体或其抗体片段与疾病特异性膜蛋白抗体或其抗体片段。具体可举出：组合了选自CD9-12A12抗体或其抗体片段、CD63-8A12抗体或其抗体片段、和CD63-13C8抗体或其抗体片段中的抗体与疾病特异性膜蛋白抗体或其抗体片段的套件。此时，可以将任一方用于外来体固相用（也称为外来体固定用），将另一方用于外来体标记用，从固定外来体、判断对疾病是否具有特异性的观点出发，优选将本发明的单克隆抗体用于外来体固相用，将疾病特异性膜蛋白抗体用于外来体标记用。应予说明，本说明书中，疾病特异性膜蛋白抗体意指针对存在于外来体表面的疾病特异性的膜蛋白的抗体。例如，可举出Ep-CAM、EGFR、CD276、CD55、CD71、EphA2、PSMA、Integrin、HER2、HER3。
方式2的套件的具体使用方法在后述测定方法中说明。
＜利用本发明的单克隆抗体或套件的评价方法＞
(抗体的2次评价法)
可以使任意的试验抗体与强制表达CD9或CD63的VLPs（Virus-Like　Particles，病毒样颗粒）作用，来评价试验抗体对CD9或CD63的结合性。
具体地，将强制表达CD9或CD63与I型膜蛋白（例如、TEM7）的VLPs添加于抗小鼠IgG抗体固相板，进而添加各抗CD试验抗体与标记化I型膜蛋白抗体（例如、HRP标记抗TEM7抗体Fab’），进行反应。反应后，对板进行清洗，通过检测抗体的标记来定量残留VLPs（在前述实例中，则是检测标记于抗体的HRP活性）。残留VLPs越多，则可评价试验抗体的结合性越优异。
(外来体的捕捉法)
在捕捉外来体时，可适宜地使用本发明的单克隆抗体。例如，将本发明的单克隆抗体生物素化并与外来体反应后，可通过使用链霉亲和素固相磁性珠进行分离。
更详细而言，首先依照公知的方法将本发明的单克隆抗体或其抗体片段生物素化。接着，将外来体与生物素化抗体混合，在4℃过夜反应。然后，添加链霉亲和素固相磁性珠，在4℃进一步反应2小时后，使用磁铁进行分离，可以回收结合于生物素化抗体的外来体。
(来源于外来体的miRNA的检测法)
外来体分泌自各种细胞、例如免疫系的细胞或各种癌细胞，因而只要可以检测来源于外来体的miRNA，则可通过对其进行分析来判定生理现象或各种疾病。
具体地，使来源于受试者的机体试样与本发明的单克隆抗体或其抗体片段接触，依照前述外来体的捕捉分离法分离外来体，依照公知的方法，由回收的外来体检测miRNA。
对于检测出的miRNA，可以依照公知的方法进行分析，藉此，可以分析生理现象或判定罹患有特定的疾病。
应予说明，在本说明书中，机体试样只要是选自血液、血清、和血浆的机体试样，则没有特别限定。
(免疫测定法)
使用本发明的单克隆抗体的套件进行免疫测定。作为免疫测定法，可举出：酶免疫测定法（EIA）、酶免疫测定法（ELISA）、荧光免疫测定法（FIA）、放射线免疫测定法（RIA）、发光免疫测定法、免疫印迹法、蛋白质印迹法等，从能够简便且灵敏度良好地检测抗体的角度出发，优选ELISA法。
ELISA法中可举出：通常的竞争法、夹心法等，由于可将本发明的单克隆抗体或其抗体片段用于夹心法中的固相抗体、或固相抗体和标记抗体两者，因而优选夹心法。
接着，示出夹心ELISA法的一个方式。首先，使本发明的单克隆抗体或其抗体片段固相化，然后与含有外来体的被测试样接触，形成复合体。之后，对其添加将本发明的套件中的另一本发明的单克隆抗体或其抗体片段（方式1的情形）、疾病特异性膜蛋白抗体或其抗体片段（方式2的情形）分别进行了修饰的标记抗体，形成进一步的复合体，并检测标记，由此可分别测定来自试样中所含的外来体的信号量（方式1）、试样中所含的疾病特异性外来体量（方式2的情形）。因此，本发明还提供测定复合体的存在量的方法，该方法包括使来源于受试者的机体试样与本发明的单克隆抗体的套件中所含的单克隆抗体接触而形成该复合体。
应予说明，在将本发明的单克隆抗体或其抗体片段固相化时，可以直接进行固相化，也可以经由公知的介质，例如，链霉亲和素来进行固相化。
(癌或免疫系疾病的发病预测)
此外，本发明还提供癌或免疫系疾病的诊断方法（发病预测方法）。本发明的方式1的套件能够以良好的灵敏度和特异性检测分布于机体内的外来体。方式2的套件能够以良好的灵敏度检测疾病特异性的外来体。外来体分泌自各种细胞、例如免疫系的细胞或各种癌细胞，因而认为在具有癌或免疫系疾病的发病时，机体内的外来体量会变多。此外，与正常细胞相比，癌细胞等有可能在细胞表面引起变化，促进CD9或CD63等膜蛋白的表达量。因此，通过以来自前述外来体的信号量作为指标，可以进行癌或免疫系疾病的诊断（发病预测），进而，还可以进行癌或免疫系疾病的特定（方式2的情形），前述方法还可作为诊断方法（发病关联因子的测定方法或判定方法）使用。
作为可进行发病诊断的癌或免疫系疾病，例示有：大肠癌、乳癌、子宫体癌、子宫颈癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、食道癌、肝癌、肺癌、肾癌、皮肤癌等癌疾病、和风湿病、变形性关节病、肾病（糖尿病性肾病、肾小球肾炎）、胰腺炎、肝炎、过敏等炎症系疾病。此外，若应用于细胞障害性T细胞（CTL）的免疫活性的指标，则还可应用于判定癌疫苗对癌疾病的效果。
具体地，上述预测方法包括癌或免疫系疾病的判定方法，所述方法包括：
步骤（I)：使来源于受试者的机体试样与前述本发明的套件的单克隆抗体接触而形成外来体复合体，并测定来源于该复合体的信号强度的步骤；和
步骤（II）：将前述步骤（I）中测定得到的信号强度与对照者的信号强度进行对比，在确认前述受试者的信号强度较对照者的信号强度强时，判定前述受试者具有癌或免疫系疾病的发病的步骤。
上述预测方法的步骤（I）中的来源于复合体的信号强度的测定只要是使用本发明的单克隆抗体的套件的方法，则可使用本领域技术人员周知的方法，优选为夹心ELISA法。
在步骤（II）中，对于上述所得的信号强度，基于对照者的信号进行统计学分析来进行比较。分析方法并不特别限定，可使用公知的方法。此外，之后的判定中，例如，在来源于受试者的机体试样的信号比对照者的信号多时，则判断具有癌或免疫系疾病的发病的可能性高。应予说明，在本发明中，对照者是指不具有癌或免疫系疾病的发病的与受试者相同年纪・相同性别的人员的平均，对照者的信号强度可以与受试者的信号强度一起测定，也可以使用由另外预先测定的值得到的统计值。
(癌或免疫系疾病的发病预测用试剂盒)
本发明的另外的方式中，提供用于进行癌或免疫系疾病的诊断的试剂盒。
本发明的试剂盒中，可举出含有本发明的单克隆抗体的套件的试剂盒，只要是在检测样品中的外来体时使用本发明的单克隆抗体的套件的检测方法，则可以使用前述试剂盒。本发明的单克隆抗体的套件能够以良好的灵敏度和特异性检测机体内外来体，因而该试剂盒的使用可对癌或免疫系疾病的诊断带来巨大贡献。
(抗癌剂的药效评价)
此外，本发明的另外的方式中，提供抗癌剂或抗免疫系疾病药的药效评价方法。
外来体分泌自各种细胞、例如免疫系的细胞或各种癌细胞，因而认为通过测定抗癌剂或抗免疫系疾病药的给药前后的血中外来体的变化（除了存在量的增减之外，还包含膜蛋白的量的变动），可以评价患者中的药效。此外，例如，认为若将针对癌细胞特异性的膜蛋白的抗体或其抗体片段与本发明的单克隆抗体或其抗体片段组合，则可期待癌诊断的特异性的提高和癌种类的特定等，可以开发对癌疾病更为特异性的诊断药。
具体地，上述药效评价方法包括：
步骤（A）：使来源于抗癌剂或抗免疫系疾病药的给药前和给药后的受试者的机体试样与本发明的单克隆抗体的套件中所含的单克隆抗体接触而形成外来体复合体，并测定来源于该复合体的信号强度的步骤
步骤（B）：在确认前述来源于抗癌剂或抗免疫系疾病药的给药后的受试者的机体试样的来源于该复合体的信号强度较前述来源于抗癌剂或抗免疫系疾病药的给药前的受试者的机体试样的来源于该复合体的信号强度弱时，判定抗癌剂或抗免疫系疾病药显示药效的可能性高的步骤。
上述药效评价方法的步骤（A）中的来源于复合体的信号强度的测定只要是使用本发明的单克隆抗体的套件的方法，则可以使用本领域技术人员周知的方法，优选为夹心ELISA法。
在步骤（B）中，对于上述所得的信号强度，基于抗癌剂或抗免疫系疾病药的给药前的机体试样的信号进行统计学分析来进行比较。分析方法并不特别限定，可使用公知的方法。此外，之后的判定中，例如，在抗癌剂或抗免疫系疾病药的给药后的机体试样的信号量比给药前的机体试样的信号量少时，判断该抗癌剂或抗免疫系疾病药具有抑制癌或免疫系疾病的效果的可能性高。
(抗癌剂或抗免疫系疾病药的药效评价用试剂盒)
本发明的另外的方式中，提供用于进行抗癌剂或抗免疫系疾病药的药效评价的试剂盒。
本发明的试剂盒中，可举出含有本发明的单克隆抗体的套件的试剂盒，只要是在检测样品中的外来体时使用本发明的单克隆抗体的套件的检测方法，则可以使用前述试剂盒。本发明的单克隆抗体的套件能够以良好的灵敏度和特异性检测机体内外来体，因而该试剂盒的使用可对抗癌剂或抗免疫系疾病药的药效评价带来巨大贡献。
实施例
以下，基于实施例对本发明进行说明，但本发明不受这些实施例等的任何限定。
实施例1〔抗CD9和CD63单克隆抗体的制备〕
（抗原的制备）
通过Sigma-Aldrich公司（シグマアルドリッチ社）合成CD9和CD63蛋白的部分肽，即，在CD9多肽的Arg36-Asn50、CD63多肽的Val38-Pro54的各氨基末端添加了半胱氨酸残基的2种肽。使用将它们进行了马来酰亚胺化的KLH〔Keyhole　Limpet　Hemocyanin、Imject（注册商标）Maleimide　Activated　mcKLH、サーモサイエンティフィック社制〕，经由肽的SH基制备半抗原。图2A模式地示出四跨膜蛋白家族（CD9、CD63）的结构，图2B模式地示出抗原。此外，图3A示出肽的序列。
此外，家兔IgG的Fc区与CD9和CD63的各大环部分的融合蛋白也被制备作为抗原（Fc融合蛋白）。图2C和图3B示出抗原的信息。即，Fc融合蛋白如下制备：将导入了在各CD抗原的大环的羧基末端添加有Fc的多核苷酸序列的质粒载体导入Freestyle　293-F　细胞（Invitrogen公司制）并瞬时表达，然后使用蛋白A柱（MAPS　II试剂盒、Bio-Rad　Laboratories　Inc.）进行纯化。
（单克隆抗体的制备）
通过将CD9和CD63的半抗原、Fc融合蛋白在初次免疫中与完全佐剂等量混和，在第2次以后与不完全佐剂等量混和，由此制备作为免疫原的乳剂。
单克隆抗体用K.Watanabe　et　al.，Vasohibin　as　an　endothelium-derived　negative　feedback　regulator　of　angiogenesis，J.Clin.Invest.114（2004），898-907中记载的方法制作。即，对于5周龄的雌性A/J系小鼠，1次给药中，每只将50μg的半抗原或10μg的Fc融合蛋白分为等量给药至皮下和腹腔内。然后，在第4次或第5次免疫后，从进行了最终的加强（细胞融合的4天前）的小鼠摘出脾脏，制备脾细胞。脾细胞和骨髓瘤细胞（P3U1）的细胞融合依照K.Watanabe　et　al.，Vasohibin　as　an　endothelium-derived　negative　feedback　regulator　of　angiogenesis，J.Clin.Invest.114（2004），898-907中记载的方法进行。
（单克隆抗体的评价）
抗血清和杂交瘤上清的抗体效价的评价（1次评价）通过下述记载的ELISA法来进行。即，在固定有山羊抗小鼠IgG抗体的96孔微板中添加抗血清或杂交瘤上清，进一步混合生物素化CD9、CD63蛋白质和HRP标记链霉亲和素并搅拌后，在室温反应2小时或在4℃过夜反应。反应后，用洗涤液（含有0.01%　Tween20和0.1%　ProClin　150的生理盐水）进行3次洗涤，加入100μL　TMB试药，搅拌后静置15～20分钟，添加1N　硫酸溶液50μL终止反应。通过ARVO　MX（Perkin　Elmer社制）测定450nm下的吸光度，将显示超过未添加抗血清、杂交瘤时所得信号的3倍的信号强度的情形判断为阳性。
所得各单克隆抗体是通过将抗体产生杂交瘤的无血清培养基或杂交瘤对小鼠给药，并使用蛋白A柱（MAPS　II试剂盒、Bio-Rad　Laboratories　Inc.）由所得腹水纯化。如上所述，制备后述所有的单克隆抗体。
实施例2〔通过半抗原或Fc融合蛋白免疫得到的单克隆抗体对膜表面蛋白质的反应性的确认：2次评价（外来体　ELISA）〕
使用Invitrogen公司的MembranePro功能性蛋白表达试剂盒，制备共表达CD9或CD63与I型膜蛋白TEM7的VLPs（virus-like　particles，病毒样颗粒）。具体地，将CD9或CD63与TEM7基因插入pEF　V5-His　TA　Vector　Kit，将所得质粒载体用Lipofectamine　2000转染293FT细胞（Invitrogen公司制）。在转染后的培养上清中添加Precipitation　Mix试药，使VLPs沉淀。VLPs中的TEM7和各CD抗原的表达通过蛋白质印迹法（WB）确认（结果未显示）。
接着，使用如此制备的VLPs，如图4所示进行夹心ELISA。具体地，将前述VLPs添加于抗小鼠IgG抗体固相板，进一步添加各抗CD抗体和HRP标记抗TEM7抗体Fab’，在4℃过夜反应。作为比较对照，也制作添加了市售抗CD抗体的孔。过夜反应后，用洗涤液洗涤，然后添加TMB溶液100μL，搅拌后静置15～20分钟，添加1N　硫酸溶液50μL终止反应。通过ARVO　MX（Perkin　Elmer社制）测定450nm下的吸光度。应予说明，市售抗体通过VLP　ELISA分别选择识别立体结构的抗体，抗CD9抗体使用了Abnova社制的抗体（克隆IVA50），抗CD63抗体使用了BD社制的抗体（克隆H5C6）。吸光度的结果分别示于图5、6。
结果得知，CD9-12A12抗体、CD63-8A12抗体、CD63-13C8抗体能够以与市售抗体、即识别可用于FACS的立体结构的市售抗体相同程度、或其以上的反应性立体地捕捉外来体。
实施例3〔抗CD9、抗CD63单克隆抗体的组合〕
为了探索可以测定血中外来体的夹心ELISA法中的抗体的组合，对于前述实施例1中所得的所有单克隆抗体制备固相抗体和标记抗体，进行血中外来体测定用的夹心ELISA。
首先，制备固定有前述所有单克隆抗体的96孔微板。即，将用磷酸缓冲生理盐水（PBS）制备为10μg/mL的各抗体溶液以100μL/孔分别添加于96孔微板，过夜反应。然后，除去反应液，用洗涤液（含有0.01%　Tween20和0.1%　ProClin　150的生理盐水）洗涤3次后，以200μL/孔分别添加2%Block Ace（大日本住友制药社制），在4℃过夜放置，由此进行封闭。另一方面，作为标记抗体，将表3～4所示的所有抗体与20倍摩尔量的Sulfo-NHS-LC-Biotin（サーモサイエンティフィック社制）反应，以PD-10柱（GEヘルスケア社制）进行凝胶过滤，由此制备标记抗体。
接着，在固定有各抗体的板中添加外来体溶液（0～25μg/mL）25μL，然后添加含有1μg/mL的上述制备的标记抗体和0.4μg/mL　HRP（Horseradish　Peroxidase）标记链霉亲和素的溶液50μL，搅拌后在4℃过夜反应。然后，除去反应液，用上述洗涤液洗涤3次后，添加TMB溶液（Colorburst　Blue、ALerCHEK社制）100μL，在室温反应15分钟。向其中添加1N　硫酸50μL终止反应，测定各孔的450nm下的吸光度。根据吸光度的数值，将最良好的组合（灵敏度为100ng/mL以上、且各组中灵敏度最良好的组合）记为“◎”、可以测定的组合（灵敏度为100ng/mL以上）记为“○”、确认到弱反应性的组合（灵敏度为小于100ng/mL）记为“△”、未确认到反应的组合记为“×”、未进行研究的组合则记为“-”，进行评价。结果示于表3和4。应予说明，市售抗体使用与实施例2相同的市售抗体。
[表3]
[表4]
结果，在使用抗CD9、抗CD63的单克隆抗体的任意外来体　ELISA中，作为最良好的组合，发现了以下本申请发明中制备的抗体彼此的组合。　
固相抗体：CD9-12A12抗体、标记抗体：CD9-12A12抗体
固相抗体：CD63-8A12抗体、标记抗体：CD63-13C8抗体。
此外，已知在与特定标记抗体的组合中适合用作固相抗体的抗体通常在与其它标记抗体的组合中也适合用作固相抗体。同样地，已知在与特定固相抗体的组合适合用作标记抗体的抗体通常在与其它固相抗体的组合中也适合用作标记抗体。
因此，基于上述实验结果，预测以下组合也同样是良好的组合。　
固相抗体：CD9-12A12抗体、标记抗体：CD63-13C8抗体、
固相抗体：CD63-8A12抗体、标记抗体：CD9-12A12抗体。
以上，将本发明和市售的抗体汇总于表5和6。应予说明，对于抗体适合性，根据前述结果，将非常强的抗体（非常适合的抗体）评价为“◎”、可以使用的抗体评价为“○”、虽然弱但有反应性的抗体评价为“△”、不能使用的抗体评价为“×”。
[表5]
[表6]
实施例4〔使用抗CD9、抗CD63的外来体的ELISA法的构建〕
对于实施例3中选择的最良好抗体的组合，为了进一步提高灵敏度，使用通过对抗体进行直接标记而制备的标记抗体来构建ELISA法。
首先，进行适于检测的抗体的碱性磷酸酶（ALP）标记。关于无法通过胃蛋白酶处理进行Fab’化的亚类IgG2b的CD9-12A12抗体，使用Alkaline　Phosphatase　Labeling　Kit-SH（ALP标记试药、同仁社制），经由还原IgG而产生的SH基对EpCAM抗体进行ALP标记。
此外，关于作为亚类IgG2a的CD63-13C8抗体，制备Fab’后使用铰链法进行酶标记。即，将抗体1mg与胃蛋白酶50μg反应，进行消化，制备F（ab’）2后，通过使用HPLC的TSKgel　G2000SWXL柱（東ソー社制）的凝胶过滤进行纯化。接着，通过利用10mM的2-巯基乙胺的还原和上述柱来制备Fab’。另一方面，ALP通过Sulfo-HMCS进行马来酰亚胺化，通过PD-10柱（GEヘルスケア社制）进行纯化。混合等摩尔的Fab’和进行了马来酰亚胺化的ALP，在4℃过夜反应后，通过上述HPLC的TSKgel　G2000SWXL柱进行纯化，制备标记抗体。
具体地，关于CD9，在CD9-12A12抗体固相板中预先添加测定缓冲液（含有1mM氯化镁、0.1mM氯化钙、0.5%BSA、1%BSA的50mM　Tris盐酸缓冲生理盐水　pH7.4）75μL，添加外来体标准液（0～25μg/mL）25μL，一边振摇一边在室温反应2小时。用洗涤液（含有0.01%　Tween　20和0.05%　ProClin150的生理盐水（0.9%　NaCl））洗涤3次后，添加2.5ng/mL　ALP标记CD9-12A12抗体100μL后，搅拌后在室温静置反应3小时。然后，除去反应液，用上述洗涤液洗涤4次，然后添加化学发光底物溶液（Lumigen　APS-5）100μL，搅拌后测定各孔的化学发光量。其结果示于图7。
关于CD63，预先与生物素化CD63-8A12抗体以1μg/mL浓度在4℃过夜反应。用与CD9相同的洗涤液洗涤3次后，添加上述测定缓冲液75μL，添加外来体标准液（0～25μg/mL）25μL，一边振摇一边在室温反应2小时。用上述洗涤液洗涤3次后，添加12.5ng/mL　ALP标记CD63-13C8抗体100μL后，搅拌后在室温静置反应3小时。然后，除去反应液，用上述洗涤液洗涤4次，然后添加上述化学发光底物溶液100μL，搅拌后测定各孔的化学发光量。其结果示于图8。
其结果是，使用抗CD9、抗CD63的单克隆抗体的任意外来体　ELISA中，均能检测到2.5ng/assay（100ng/mL）的外来体。关于利用外来体　ELISA法的检测，M.Logozzi　et　al.，High　Levels　of　Exosomes　Expressing　CD63　and　Caveolin-1　in　Plasma　of　Melanoma　Patients，PLoS　One.4（2009），1-10中报道了能够检测到3μg的外来体。另一方面，本次构建的抗CD9、抗CD63的外来体　ELISA中，均可进行2.5ng的外来体检测，与报道的外来体　ELISA相比，是高3个数量级的灵敏度。此外，在任意外来体　ELISA中，与使用市售抗体彼此的外来体　ELISA相比，均为高灵敏度。
进而，关于使用前述本发明的抗CD9抗体的组合、抗CD63抗体的组合的外来体　ELISA，进行添加回收试验，评价结合的特异性。具体地，调查血清样本中的来源于C32黑素瘤细胞的外来体的添加回收，结果回收率在使用抗CD9抗体时为87.9～113.4%，在使用抗CD63抗体时为96.2～99.3%，得到良好的添加回收率。另一方面，使用抗CD9市售抗体的外来体　ELISA中，回收率为32.1～41.8%，未得到充分的添加回收率。应予说明，市售抗体使用与实施例2相同的市售抗体。
实施例5〔利用抗CD9、抗CD63抗体的癌患者血液样本中的外来体的检测〕
使用固相抗体：CD9-12A12抗体、标记抗体：CD9-12A12抗体的组合、固相抗体：CD63-8A12抗体、标记抗体：CD63-13C8抗体的组合，以与实施例4相同的方式通过外来体　ELISA测定正常人、乳癌患者和大肠癌患者各10名的血清中外来体量。结果示于图9。应予说明，组间比较通过t检验进行。
结果，使用抗CD9抗体的外来体　ELISA中，乳癌患者和大肠癌患者两者与正常人相比，均显著性地显示出高值。此外，使用抗CD63抗体的外来体　ELISA中也为相同的结果。所以，暗示使用本发明的抗CD9抗体的组合、抗CD63抗体的组合的外来体　ELISA可适用于乳癌和大肠癌的诊断。另一方面，使用市售抗体（抗CD9抗体或抗CD63抗体）的外来体　ELISA中，未确认到显著性差异。应予说明，对于市售抗体，抗CD9抗体使用Abnova社制抗体（克隆IVA50），抗CD63抗体使用SantaCruz社制抗体（sc-5275）。
进而，构件组合了抗CD9抗体和抗CD63抗体的外来体　ELISA，同样地测定正常人、乳癌患者和大肠癌患者的血清中外来体。具体地，使用固相抗体：CD9-12A12抗体、标记抗体：CD63-8A12抗体的组合、固相抗体：CD63-13C8抗体、标记抗体：CD9-12A12抗体的组合来进行。结果示于图10。应予说明，标记抗体均使用ALP直接标记抗体。
如图10的左（固相抗体：抗CD9抗体、ALP标记抗体：抗CD63抗体）和右（固相抗体：抗CD63抗体、ALP标记抗体：抗CD9抗体）所示，癌患者和正常人的差异均变大，乳癌患者和大肠癌患者中均显著性地显示出高值。
实施例6〔组合了针对疾病特异性膜蛋白的抗体的外来体　ELISA的诊断应用〕
组合上述抗CD9、抗CD63抗体和针对疾病特异性膜蛋白的抗体，调查与癌相关的外来体的定量的可能性。具体地，选择EpCAM抗体作为与癌相关的膜蛋白抗体，并使用AbCAM社制的抗体（克隆AUA1）。
应予说明，进行外来体　ELISA之前，预先确认到EpCAM在乳癌细胞株（ZR75-1、T47D、MCF7、BT474、MDA-MB-468）和大肠癌细胞株（HT29、SW48、SW480、HCT116）等中在细胞裂解物或培养上清中的外来体中强表达。另一方面，还确认到在正常乳腺细胞184A1中没有观察到表达（两结果未示出）。
为了构建使用抗EpCAM抗体的外来体　ELISA，使用Alkaline　Phosphatase　Labeling　Kit-SH（ALP标记试药、同仁社制）对EpCAM抗体进行ALP标记。以来源于大肠癌细胞株HCT116的外来体为对象，使用ALP标记EpCAM抗体和抗CD9、抗CD63抗体作为固相抗体，进行外来体　ELISA，进行血液样本的定量。结果示于图11。应予说明，组间比较通过t检验进行。
结果得知，与正常人相比，乳癌患者、大肠癌患者的任一者或两者中均有显著性地显示高值的外来体　ELISA。其结果是表明通过组合了与癌等疾病相关的膜蛋白抗体和抗CD9、抗CD63抗体的外来体　ELISA，可将迄今为止诊断应用困难的膜蛋白应用作为诊断标志物的可能性的数据。
实施例7〔抗CD81单克隆抗体的制备〕
（抗原的制备）
为了进一步制作抗CD81抗体，通过Sigma-Aldrich公司合成CD81的小环肽，即，在CD81多肽的Arg36-Ala54的氨基末端添加有半胱氨酸残基的肽。使用将其进行了马来酰亚胺化的KLH〔Keyhole　Limpet　Hemocyanin、Imject（注册商标）Maleimide　Activated　mcKLH、サーモサイエンティフィック社制〕，经由肽的SH基制备半抗原。图2A模式地示出四跨膜蛋白家族（CD9、CD63和CD81）的结构，图2B模式地示出抗原。此外，图12A示出肽的序列。
此外，家兔IgG的Fc区和CD81的大环部分的融合蛋白也制备作为抗原（Fc融合蛋白）。图2C和图12B示出抗原的信息。即，Fc融合蛋白如下制备：将导入了在CD抗原的大环的羧基末端添加有Fc的多核苷酸序列的质粒载体导入Freestyle　293-F　细胞（Invitrogen公司制）并瞬时表达，然后使用蛋白A柱（MAPS　II试剂盒、Bio-Rad　Laboratories　Inc.）进行纯化。
（单克隆抗体的制备）
通过将CD81的半抗原、Fc融合蛋白在初次免疫中与完全佐剂等量混合，在第2次以后与不完全佐剂等量混和，由此制备作为免疫原的乳剂。
单克隆抗体用K.Watanabe　et　al.，Vasohibin　as　an　endothelium-derived　negative　feedback　regulator　of　angiogenesis，J.Clin.Invest.114（2004），898-907中记载的方法制作。即，对于5周龄的雌性A/J系小鼠，1次给药中，每只将50μg的半抗原或10μg的Fc融合蛋白分为等量给药至皮下和腹腔内。然后，在第4次或第5次免疫后，从进行了最终的加强（细胞融合的4天前）的小鼠摘出脾脏，制备脾细胞。脾细胞和骨髓瘤细胞（P3U1）的细胞融合依照K.Watanabe　et　al.，Vasohibin　as　an　endothelium-derived　negative　feedback　regulator　of　angiogenesis，J.Clin.Invest.114（2004），898-907中记载的方法进行。
（单克隆抗体的评价）
抗血清和杂交瘤上清的抗体效价的评价（1次评价）通过下述记载的ELISA法来进行。即，在固定有山羊抗小鼠IgG抗体的96孔微板中添加抗血清或杂交瘤上清，进一步混合生物素化CD9、CD63蛋白质和HRP标记链霉亲和素并搅拌后，在室温反应2小时或在4℃过夜反应。反应后，用洗涤液（含有0.01%　Tween20和0.1%　ProClin　150的生理盐水）进行3次洗涤，加入100μL　TMB试药，搅拌后静置15～20分钟，添加1N　硫酸溶液50μL终止反应。通过ARVO　MX（Perkin　Elmer社制）测定450nm下的吸光度，将显示超过未添加抗血清、杂交瘤时所得信号的3倍的信号强度的情形判断为阳性。
所得各单克隆抗体是通过将抗体产生杂交瘤的无血清培养基或杂交瘤对小鼠给药，并使用蛋白A柱（MAPS　II试剂盒、Bio-Rad　Laboratories　Inc.）由所得腹水纯化。如上所述，制备后述所有的抗CD81的单克隆抗体。
实施例8〔利用抗CD9、抗CD63和抗CD81抗体通过免疫沉降捕捉外来体〕
调查使用实施例1和7中所得的抗CD9、抗CD63和抗CD81单克隆抗体通过免疫沉降纯化外来体的可能性。应予说明，作为比较中使用的市售抗体，分别由任意的3种市售抗体中预先选择并使用免疫沉降能力良好的抗体。具体地，抗CD9抗体使用Abnova社的抗体（IVA50），抗CD63抗体使用ExoBio社的抗体（MEM-259）和BD社的抗体（H5C6），抗CD81抗体使用GENETEX社的抗体（1D6）。
免疫沉降中使用的试样使用以下试样。对于抗CD63抗体和抗CD81抗体，使用由导入了在编码CD63或CD81多肽的多核苷酸的C末端添加有FLAG标签的质粒的COS7细胞的培养上清制备的外来体。对于CD9抗体，使用正常人的血清。
免疫沉降如下所述进行。
抗CD63或抗CD81抗体的情形中，在溶解于含有1%BSA的PBS溶液的1μg的外来体溶液中加入抗体1μg，4℃过夜反应。添加20μL的ProteinG琼脂（50%　slurry）后，在4℃一边搅拌一边反应2小时。反应后，用含有1%BSA的PBS进行2次离心洗涤后，通过使用HRP标记抗FLAG抗体的蛋白质印迹法（WB）对捕捉于珠的外来体上的CD63或CD81量进行评价。关于抗CD9抗体，在血清100μL中添加含有1%BSA的PBS 100μL，以抗体达到1μg分量的量添加固定有抗CD9抗体的M280磁性珠，在4℃过夜反应。反应后，通过含有1%BSA的PBS，使用磁铁进行洗涤，通过使用抗CD9抗体和HRP标记抗小鼠IgG抗体的WB对捕捉于上清的外来体上的CD9量进行评价。将比较各抗CD抗体的外来体的免疫沉降的性能的图示于图13、14、15。
结果，CD9-12A12抗体、CD63-8A12抗体、CD81-6D12抗体、CD81-4G6抗体CD81-12C4抗体与市售抗体相比显示出强的外来体的免疫沉降能力。
实施例9〔通过检测来源于捕捉的外来体的miRNA来诊断疾病〕
由参照实施例8的方法捕捉的外来体，依照公知的方法检测miRNA或蛋白质。对于检测出的miRNA或蛋白质，可以依照公知的方法进行分析，藉此，可以分析生理现象或判定罹患有特定的疾病。
对于外来体内的miRNA，可以参照例如K.Ohshima、et　al、PLoS One、2010、5、p1-10，通过微阵列分析或定量PCR来进行分析。
产业实用性
本发明的外来体检测用单克隆抗体可以以良好的灵敏度和特异性检测机体内外来体上的CD9、CD63或CD81。所以，通过与例如针对疾病特异性膜蛋白的抗体组合进行外来体的定量，可以进行特定疾病的诊断，因而期待应用于诊断药。进而，表明本发明的单克隆抗体可通过免疫沉降来纯化外来体，应用了外来体内的miRNA或蛋白质的变动的诊断药的开发也受到期待。
序列表的SEQ ID NO：1为外来体膜蛋白CD9多肽。
序列表的SEQ ID NO：2为外来体膜蛋白CD63多肽。
序列表的SEQ ID NO：3为外来体膜蛋白CD81多肽。
序列表
<110> SHIONOGI&Co.,Ltd.
<120> 外来体检测用单克隆抗体
<130> 12-019-PCTJP
<150> JP 2011-283928
<151> 2011-12-26
<160> 3
<170> PatentIn 版本 3.5
<210> 1
<211> 228
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
Met Pro Val Lys Gly Gly Thr Lys Cys Ile Lys Tyr Leu Leu Phe Gly
1 5 10 15
Phe Asn Phe Ile Phe Trp Leu Ala Gly Ile Ala Val Leu Ala Ile Gly
20 25 30
Leu Trp Leu Arg Phe Asp Ser Gln Thr Lys Ser Ile Phe Glu Gln Glu
35 40 45
Thr Asn Asn Asn Asn Ser Ser Phe Tyr Thr Gly Val Tyr Ile Leu Ile
50 55 60
Gly Ala Gly Ala Leu Met Met Leu Val Gly Phe Leu Gly Cys Cys Gly
65 70 75 80
Ala Val Gln Glu Ser Gln Cys Met Leu Gly Leu Phe Phe Gly Phe Leu
85 90 95
Leu Val Ile Phe Ala Ile Glu Ile Ala Ala Ala Ile Trp Gly Tyr Ser
100 105 110
His Lys Asp Glu Val Ile Lys Glu Val Gln Glu Phe Tyr Lys Asp Thr
115 120 125
Tyr Asn Lys Leu Lys Thr Lys Asp Glu Pro Gln Arg Glu Thr Leu Lys
130 135 140
Ala Ile His Tyr Ala Leu Asn Cys Cys Gly Leu Ala Gly Gly Val Glu
145 150 155 160
Gln Phe Ile Ser Asp Ile Cys Pro Lys Lys Asp Val Leu Glu Thr Phe
165 170 175
Thr Val Lys Ser Cys Pro Asp Ala Ile Lys Glu Val Phe Asp Asn Lys
180 185 190
Phe His Ile Ile Gly Ala Val Gly Ile Gly Ile Ala Val Val Met Ile
195 200 205
Phe Gly Met Ile Phe Ser Met Ile Leu Cys Cys Ala Ile Arg Arg Asn
210 215 220
Arg Glu Met Val
225
<210> 2
<211> 238
<212> PRT
<213> 智人
<400> 2
Met Ala Val Glu Gly Gly Met Lys Cys Val Lys Phe Leu Leu Tyr Val
1 5 10 15
Leu Leu Leu Ala Phe Cys Ala Cys Ala Val Gly Leu Ile Ala Val Gly
20 25 30
Val Gly Ala Gln Leu Val Leu Ser Gln Thr Ile Ile Gln Gly Ala Thr
35 40 45
Pro Gly Ser Leu Leu Pro Val Val Ile Ile Ala Val Gly Val Phe Leu
50 55 60
Phe Leu Val Ala Phe Val Gly Cys Cys Gly Ala Cys Lys Glu Asn Tyr
65 70 75 80
Cys Leu Met Ile Thr Phe Ala Ile Phe Leu Ser Leu Ile Met Leu Val
85 90 95
Glu Val Ala Ala Ala Ile Ala Gly Tyr Val Phe Arg Asp Lys Val Met
100 105 110
Ser Glu Phe Asn Asn Asn Phe Arg Gln Gln Met Glu Asn Tyr Pro Lys
115 120 125
Asn Asn His Thr Ala Ser Ile Leu Asp Arg Met Gln Ala Asp Phe Lys
130 135 140
Cys Cys Gly Ala Ala Asn Tyr Thr Asp Trp Glu Lys Ile Pro Ser Met
145 150 155 160
Ser Lys Asn Arg Val Pro Asp Ser Cys Cys Ile Asn Val Thr Val Gly
165 170 175
Cys Gly Ile Asn Phe Asn Glu Lys Ala Ile His Lys Glu Gly Cys Val
180 185 190
Glu Lys Ile Gly Gly Trp Leu Arg Lys Asn Val Leu Val Val Ala Ala
195 200 205
Ala Ala Leu Gly Ile Ala Phe Val Glu Val Leu Gly Ile Val Phe Ala
210 215 220
Cys Cys Leu Val Lys Ser Ile Arg Ser Gly Tyr Glu Val Met
225 230 235
<210> 3
<211> 236
<212> PRT
<213> 智人
<400> 3
Met Gly Val Glu Gly Cys Thr Lys Cys Ile Lys Tyr Leu Leu Phe Val
1 5 10 15
Phe Asn Phe Val Phe Trp Leu Ala Gly Gly Val Ile Leu Gly Val Ala
20 25 30
Leu Trp Leu Arg His Asp Pro Gln Thr Thr Asn Leu Leu Tyr Leu Glu
35 40 45
Leu Gly Asp Lys Pro Ala Pro Asn Thr Phe Tyr Val Gly Ile Tyr Ile
50 55 60
Leu Ile Ala Val Gly Ala Val Met Met Phe Val Gly Phe Leu Gly Cys
65 70 75 80
Tyr Gly Ala Ile Gln Glu Ser Gln Cys Leu Leu Gly Thr Phe Phe Thr
85 90 95
Cys Leu Val Ile Leu Phe Ala Cys Glu Val Ala Ala Gly Ile Trp Gly
100 105 110
Phe Val Asn Lys Asp Gln Ile Ala Lys Asp Val Lys Gln Phe Tyr Asp
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Gln Ala Leu Gln Gln Ala Val Val Asp Asp Asp Ala Asn Asn Ala Lys
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Thr Leu Thr Ala Leu Thr Thr Ser Val Leu Lys Asn Asn Leu Cys Pro
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Ser Gly Ser Asn Ile Ile Ser Asn Leu Phe Lys Glu Asp Cys His Gln
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Lys Ile Asp Asp Leu Phe Ser Gly Lys Leu Tyr Leu Ile Gly Ile Ala
195 200 205
Ala Ile Val Val Ala Val Ile Met Ile Phe Glu Met Ile Leu Ser Met
210 215 220
Val Leu Cys Cys Gly Ile Arg Asn Ser Ser Val Tyr
225 230 235

Claims (13)

1. 外来体检测或捕捉用单克隆抗体，其选自：能够检测或捕捉外来体的、识别SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的氨基酸编号113～195的单克隆抗体或其抗体片段、识别SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的氨基酸编号104～202的单克隆抗体或其抗体片段、识别SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列的氨基酸编号36～54的单克隆抗体或其抗体片段、和识别SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列的氨基酸编号113～201的单克隆抗体或其抗体片段。
2. 外来体检测或捕捉用单克隆抗体，其选自：作为识别SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的氨基酸编号113～195的单克隆抗体片段的由以保藏编号FERM　ABP-11519保藏的杂交瘤产生的单克隆抗体（CD9-12A12抗体）或其片段；
作为识别SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的氨基酸编号104～202的单克隆抗体片段的由以保藏编号FERM　ABP-11520保藏的杂交瘤产生的单克隆抗体（CD63-8A12抗体）或其片段；
作为识别SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的氨基酸编号104～202的单克隆抗体片段的由以保藏编号FERM　ABP-11521保藏的杂交瘤产生的单克隆抗体（CD63-13C8抗体）或其片段；
作为识别SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列的氨基酸编号113～201的单克隆抗体片段的由以保藏编号NITE　ABP-1480保藏的杂交瘤产生的单克隆抗体（CD81-4G6抗体）或其片段；
作为识别SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列的氨基酸编号113～201的单克隆抗体片段的由以保藏编号NITE　ABP-1481保藏的杂交瘤产生的单克隆抗体（CD81-6D12抗体）或其片段；和
作为识别SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列的氨基酸编号36～54的单克隆抗体片段的由以保藏编号NITE　ABP-1482保藏的杂交瘤产生的单克隆抗体（CD81-12C4抗体）或其片段。
3. 单克隆抗体或其抗体片段的套件，其包含选自下述的同一或二种抗体或其抗体片段的组合：CD9-12A12抗体或其抗体片段、CD63-8A12抗体或其抗体片段、和CD63-13C8抗体或其抗体片段。
4. 权利要求3所述的套件，其选自：固相抗体为CD9-12A12抗体或其抗体片段、标记抗体为CD9-12A12抗体或其抗体片段的套件；
固相抗体为CD9-12A12抗体或其抗体片段、标记抗体为CD63-13C8抗体或其抗体片段的套件；
固相抗体为CD63-8A12抗体或其抗体片段、标记抗体为CD9-12A12抗体或其抗体片段的套件；和
固相抗体为CD63-8A12抗体或其抗体片段、标记抗体为CD63-13C8抗体或其抗体片段的套件。
5. 权利要求3或4所述的套件，其用于检测外来体。
6. 疾病特异性的外来体检测用单克隆抗体的套件，其包含选自CD9-12A12抗体或其抗体片段、CD63-8A12抗体或其抗体片段、和CD63-13C8抗体或其抗体片段中的抗体或其抗体片段、与疾病特异性膜蛋白抗体或其抗体片段的组合。
7. 癌或免疫系疾病的诊断试剂盒，其含有权利要求3～5中任一项所述的套件的单克隆抗体或其抗体片段。
8. 癌或免疫系疾病的诊断试剂盒，其含有权利要求6所述的套件的单克隆抗体或其抗体片段。
9. 癌或免疫系疾病的诊断试剂盒，其含有权利要求6所述的套件。
10. 检测外来体的miRNA的方法，该方法包括：使来源于受试者的机体试样与权利要求1或2所述的单克隆抗体接触而捕捉该外来体。
11. 测定来源于外来体复合体的信号强度的方法，该方法包括：使来源于受试者的机体试样与权利要求3～5中任一项所述的套件的单克隆抗体接触而形成所述外来体复合体。
12. 癌或免疫系疾病的判定方法，其是用于判定受试者是否具有癌或免疫系疾病的发病的方法，该方法包括：
步骤（I)：使来源于受试者的机体试样与权利要求3～5中任一项所述的套件的单克隆抗体接触而形成外来体复合体，并测定来源于该复合体的信号强度的步骤；和
步骤（II）：将前述步骤（I）中测定得到的信号强度与对照者的信号强度进行对比，在确认前述受试者的信号强度较对照者的信号强度强时，判定前述受试者具有癌或免疫系疾病的发病的步骤。
13. 抗癌剂或抗免疫系疾病药的药效评价方法，该方法包括：
步骤（A）：使来源于抗癌剂或抗免疫系疾病药的给药前和给药后的受试者的机体试样与权利要求3～5中任一项所述的套件的单克隆抗体接触而形成外来体复合体，并测定来源于该复合体的信号强度的步骤；和
步骤（B）：在确认前述来源于抗癌剂或抗免疫系疾病药的给药后的受试者的机体试样的来源于该复合体的信号强度较前述来源于抗癌剂或抗免疫系疾病药的给药前的受试者的机体试样的来源于该复合体的信号强度弱时，判定抗癌剂或抗免疫系疾病药显示药效的可能性高的步骤。
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