WO2016143904A1 - エクソソームの破壊方法、エクソソームの破壊キットおよび正常細胞由来のエクソソームの分離方法 - Google Patents

エクソソームの破壊方法、エクソソームの破壊キットおよび正常細胞由来のエクソソームの分離方法 Download PDF

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exosomes
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derived
less
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亮太 藤井
美和 池田
松本　和也
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三井化学株式会社
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Definitions

  • the present invention relates to an exosome destruction method, an exosome destruction kit, and a normal cell-derived exosome separation method.
  • Exosomes are a type of extracellular granule secreted from cells. Specifically, exosomes are vesicles having a diameter of about 30 nm to 100 nm released from cells having a vesicle structure composed of a lipid bilayer membrane. This exosome is known to transmit information between the secretory cell and the other cells by being taken up by another cell different from the cell that secreted the exosome (hereinafter also referred to as secretory cell). (Non-Patent Documents 1 and 2).
  • Exosome stability It is known that the exosome membrane structure is generally more stable than the cell membrane structure.
  • Non-Patent Document 3 even when exosomes are freeze-thawed four times without adding a stabilizer such as saccharide under a temperature condition of ⁇ 20 ° C., the inclusions in the exosomes are stably present. Experimental results indicating that it was maintained are described.
  • cells called animal cells generally cannot withstand freeze-thaw treatment unless the stabilizer described above is used. This suggests that exosomes have a stable membrane structure compared to animal cells.
  • the formation process of the membrane structure is different between exosomes and cells.
  • the exosome membrane structure and the cell membrane structure are compared, they differ in the surface area of the membrane and the types of surface proteins present on the membrane surface. Even under these circumstances, the exosome membrane structure is considered to be a stable structure compared to the cell membrane structure. Since exosomes are not living cells, they are excluded from the cell death program by apoptosis that can be applied to general cells.
  • exosomes present in the blood of cancer patients include substances that serve as biomarkers for cancer (proteins such as PSA, HER2, and EGFR, microRs such as miR-21 and miR-200a). It is reported that RNA, messenger RNA such as Apbb1ip, ASPN, DNA such as KRAS, and various metabolites are included.
  • microRNA encapsulated in exosomes as a substance that can be a biomarker for cancer is promising as an indicator for cancer testing.
  • Biological microRNAs are already databased in miRBBase (URL: http://www.mirbase.org/). Among them, 2588 human microRNAs are known as of 2015. Moreover, it is known that the expression profile of human microRNA described above varies depending on the type of organ, and also differs between normal cells and cancer cells. In view of these circumstances, in recent years, intensive studies have been conducted to develop a technique for diagnosing the site and progression of cancer by a blood test that analyzes microRNA encapsulated in exosomes in blood (non-patented). Reference 7).
  • Exosome separation / collection (collection) / removal method examples include the following.
  • a method for recovering exosomes from human body fluids (blood, saliva, urine, etc.) and cell culture fluid the ultracentrifugation method described in Non-Patent Document 8 and the like is most commonly used as of 2015. The method used. For example, when recovering exosomes from cell culture supernatants or body fluids, after removing large contaminants such as cell debris with a filter or the like, ultracentrifugation is performed at 4 ° C. and 100,000 G for 70 minutes. Exosomes can be recovered.
  • Non-Patent Document 8 also describes a method of collecting exosomes by precipitation in cell culture supernatant or body fluid using a coprecipitation agent such as PEG (Non-Patent Document 8).
  • Patent Document 1 discloses a technique for adsorbing and removing the exosome using an antibody that specifically binds to the exosome. Specifically, in Patent Document 1, the exosome is adsorbed and removed by using an antibody that specifically binds to a four-pass membrane-penetrating protein such as CD9, CD63, and CD81 existing on the surface of exosome vesicles. How to do is described.
  • a four-pass membrane-penetrating protein such as CD9, CD63, and CD81 existing on the surface of exosome vesicles. How to do is described.
  • Patent Document 2 describes a method of using an antibody that specifically adsorbs a cancer cell-derived exosome in order to adsorb and remove the cancer cell-derived exosome secreted by the cancer cell.
  • Non-Patent Documents 9 and 10 disclose methods of destroying and removing the exosome itself by chemically treating the cell membrane of the exosome. Specifically, Non-Patent Document 9 describes a method using a surfactant, and Non-Patent Document 10 describes a method using phenol, guanidine, and a surfactant.
  • Non-Patent Documents 9 and 10 for chemically treating the cell membrane of exosome are techniques for destroying both exosomes derived from cancer cells and normal cells.
  • the organic compound used for the treatment of the cell membrane is not in vivo. There is a high probability that it will act specifically.
  • phenol since a substance called phenol has a strong protein denaturing action compared to other compounds, phenol is not suitable for the application of the method described in Non-Patent Document 10 to the treatment of diseases such as cancer metastasis.
  • Non-Patent Documents 9 and 10 it is considered necessary to eliminate the influence on components different from exosomes present in the living body. From this, it is considered that it is practically impossible to apply the methods described in Non-Patent Documents 9 and 10 to the treatment of diseases such as cancer metastasis in the future. In view of these circumstances, in recent years, there is a tendency to establish a method for destroying and removing exosomes using a biologically safe substance that hardly exhibits a non-specific action in a living body.
  • Non-Patent Document 11 describes a technique in which exosomes are collected by antibody immunization and then biomarkers such as microRNAs are extracted from the exosomes.
  • the above-described method has room for improvement in that it selectively extracts cancer cell-derived biomarkers.
  • the antibody used for collecting exosomes may be used when an antibody recognizing a characteristic protein present in a cancer cell-derived exosome is used as an antigen.
  • Non-Patent Document 12 it is difficult to collect exosomes because characteristic proteins present in cancer cell-derived exosomes are degraded by proteases in vivo and lost from the exosome surface. It has been reported that this may occur.
  • Patent Documents 1 and 2 are also techniques for adsorbing and removing exosomes using antibodies that are highly safe for living bodies, but only for the amount of exosomes that can be adsorbed to the antibodies. Therefore, there is a disadvantage that exosomes exceeding a specific amount cannot be adsorbed and removed. It has been confirmed that this inconvenience tends to become more apparent particularly when exosomes are adsorbed and removed using a column packed with an antibody at a high density. The reason is that the exosome particle is 10 times larger than the antibody. When the exosome is adsorbed and removed using a column packed with an antibody at a high density, the binding points between the antibody and the exosome are densely present in the space.
  • exosome particle size is 10 times or more larger than that of the antibody as described above, the space is occupied by the exosome particle. Therefore, when adsorbing and removing exosomes using a column packed with antibodies at a high density, antibody binding points that are not involved in exosome particle binding (adsorption) are generated in the space, resulting in exosome particles.
  • Exosomes have a smaller surface area compared to column particles, and there is a relatively small amount of antigen on the surface. Conceivable). It is also known that depending on the type of exosome, the state of antigen on its surface varies, and the result depends greatly on the titer and specificity of the antibody. Furthermore, the method of collecting exosomes using an antibody has room for improvement in terms of recovering highly purified exosomes because it is difficult to sufficiently wash the exosomes.
  • the present invention ensures safety for living bodies, and easily and efficiently destroys exosomes derived from cancer cells, and efficiently and selectively extracts biomarkers contained in the exosomes. It is possible to provide exosome destruction and removal technology.
  • the present inventors diligently studied to solve the problems in the prior art described in the section of problems to be solved by the above invention. As a result, by using a specific polypeptide, the present inventors have ensured safety against living bodies, easily and efficiently destroy cancer cell-derived exosomes, and are encapsulated in the exosomes.
  • the present invention has been completed by finding that a technique capable of efficiently and selectively extracting existing biomarkers can be constructed.
  • kits for destroying exosomes derived from cancer cells which contains an antibacterial peptide and the antibacterial peptide is a peptide that satisfies the following condition (1) or (2).
  • the chain length is 10 or more and less than 50, Net Charge is greater than 0 and less than 15, and the proportion of hydrophobic residues is 25% or more and less than 65% (provided that 3 or more S—S bonds are included) And excluding those containing any one of lysine residues and valine residues in all amino acids constituting the antimicrobial peptide).
  • the chain length is 2 or more and less than 10, the net charge is 0 or less, the hydrophobic residue ratio is less than 25%, and the following conditions (2-1) or (2-2) are satisfied: To meet.
  • All amino acids constituting the antibacterial peptide contain 3 or more histidine residues and do not contain tryptophan residues and valine residues.
  • All amino acids constituting the antibacterial peptide contain one or more arginine residues and do not contain phenylalanine residues, tryptophan residues and valine residues.
  • the method includes a step of allowing an exosome to coexist with an antibacterial peptide that satisfies the following condition (1) or (2):
  • a method for separating normal cell-derived exosomes wherein the exosome is a mixture of cancer cell-derived exosomes and normal cell-derived exosomes.
  • the chain length is 10 or more and less than 50, Net Charge is greater than 0 and less than 15, and the proportion of hydrophobic residues is 25% or more and less than 65% (provided that 3 or more S—S bonds are included) And excluding those containing any one of lysine residues and valine residues in all amino acids constituting the antimicrobial peptide).
  • the chain length is 2 or more and less than 10, the net charge is 0 or less, the hydrophobic residue ratio is less than 25%, and the following conditions (2-1) or (2-2) are satisfied: To meet.
  • All amino acids constituting the antibacterial peptide contain 3 or more histidine residues and do not contain tryptophan residues and valine residues.
  • All amino acids constituting the antibacterial peptide contain one or more arginine residues and do not contain phenylalanine residues, tryptophan residues and valine residues.
  • the present invention safety to a living body is ensured, cancer cell-derived exosomes are easily and efficiently destroyed, and biomarkers contained in the exosomes are extracted efficiently and selectively. It is possible to provide a technique for destroying and removing exosomes. In particular, according to the method for destroying exosomes according to the present invention, it is safer and more selective than a known method of performing chemical treatment, more easily, more efficiently and selectively than a known method using an antibody. It is possible to destroy cancer cell-derived exosomes. According to the present invention, it is also possible to selectively destroy cancer cell-derived exosomes from a body fluid sample in which normal cell-derived exosomes and cancer cell-derived exosomes are mixed. The technology according to the present invention will be applied in the future in the field of cancer treatment, selection of new biomarkers related to cancer diseases, testing and diagnosis by efficient detection of existing cancer markers, and dialysis technology. It is considered useful to do.
  • antibacterial peptide generally means a polypeptide that exhibits bacteriostatic or bactericidal action against Gram-negative bacteria, Gram-positive bacteria, fungi, some viruses, and the like.
  • the antibacterial peptide in the exosome destruction method (hereinafter also referred to as this destruction method) according to the present embodiment refers to one having exosome destruction activity.
  • an antimicrobial peptide which can be used for this destruction method what can selectively destroy the exosome derived from a cancer cell is preferable.
  • antibacterial peptides having a special function have been reported so far. However, it has not been reported so far that known antibacterial peptides have the action of destroying and removing exosomes. In addition, among the known antibacterial peptides, there is also a so-called “anticancer peptide” that exhibits an action of destroying cancer cells (Non-patent Document 13). Among such anti-cancer peptides, there are those that have little effect on normal cells and low hemolysis. However, it has not yet been elucidated whether the anticancer peptide has an action of selectively destroying cancer cell-derived exosomes.
  • the antibacterial peptide has a positive charge.
  • a positively charged substance generally binds to a negatively charged compound such as a nucleic acid to form an insoluble substance and precipitate (Non-patent Document 14).
  • nucleic acid components such as microRNA from exosomes using antibacterial peptides.
  • a technique for extracting nucleic acid components such as microRNA from exosomes using antibacterial peptides has been completed.
  • antibacterial peptide examples include magainin such as magainin 2, defensin such as Defensin HNP-1, cecropin such as lactoferricin, nisin, and Cecropin B, andropine, Morrin, seratotoxin, melittin, dermaseptin, bombinin, brevinin, esculetin, buforin such as Buforin IIb, caelin such as MG2B, Caerin 1.1, LL37, mCRAMP, PR-39, CAP-11, CAP-18 , RL-37, CRAMP-1 / 2, rCRAMP, Prophenin, PMAP-23, PMAP-36, PMAP-37, BMAP-27, BMAP-28, BM Cateridines such as AP-34, Bac5, Bac7 and catthelicidin-AL, abaesin, apidaesin, indolicidin, brevinin, protegrin, tachy
  • the antibacterial peptide according to the present embodiment may be extracted from an organism containing the antibacterial peptide, or may be artificially synthesized in a microbial cell by a genetic recombination technique. It may be one that has been artificially synthesized using an organic synthesis technique such as a method.
  • a part of the amino acid residue constituting the antibacterial peptide may be substituted with another amino acid residue, or one of the amino acid residues constituting the antibacterial peptide may be substituted. The part may be deleted, and another amino acid residue may be inserted into the amino acid residue constituting the antibacterial peptide.
  • the antimicrobial peptide according to the present embodiment may be one in which two or more peptides are linked via a spacer.
  • the antibacterial peptide according to the present embodiment has been subjected to post-translational modifications such as C-terminal modification (such as amination), N-terminal modification (such as acetylation), side chain modification, cyclization, and sugar chain modification. May be. Therefore, the amino acids constituting the antibacterial peptide according to the present embodiment are not limited to the 20 essential amino acids constituting the living body, and may be special amino acids described later.
  • N-terminal modification methods include: Acetylation, 5-FAM, BSA, Hexanoic acid, PEN, 5-FAM-Ahx, CBZ, HYNIC, Stearic acid, Abz, Dansyl , KLH, Succinylation, dansyl-Ahx, Lauric acid, TMR, Acrylic Decanoic acid, Lipoic acid, Alloc, DTPA, Maleimide, Benzoyl, Various Fatty Acid, MCAIT, BioF acid, BOC, Fmoc, OVA, Br-Ac-, Formulation, Palmitoyl, Dab Syl, DHA, Nicotine, ATTO 488/550/633 / 647N / 655, Rhodamine Green, rhodamine B, TAMRA, Texas Red, fluorescein and the like.
  • Modification methods for the C-terminal (side chain carboxyl group) include Amidation, AFC, AMC, MAPS Asymmetric 2 branch, MAPS Asymmetric 4 branch, MAPS Asymmetric 8 branch, BSA, KLH, BZl, NHEm, NHzp, ST , Ester (OEt), Ester (OMe), Ester (OtBu), Ester (OTBzl), OVA, p-Nitroanilide, tBu, etc.
  • Examples of the above-mentioned special amino acids include 6-Aminocapric acid, Aminobutyric acid, Citruline, Cysteine (Acm protected), various D-Aminoacid, Dimethy-Lythine, Hydroxy-Proline, Methyline-Lineline Lysine, ⁇ -Aline, ⁇ -Acetyl-Lycine, 3-Nitro-Tyrosine, Phosphorylated Tyrosine, Gamma-GLU, Cysteine (tBu), Penicillamine, Penicillamine, N-methyl ted Leucine, Homocystein, N-methylated Valine, Homoserine, Isoleucine, Biotin Lysine, Cysteine (Acm), N-methylated ALA, N-methylLiquelyL ) 1-NAL, N-methylated Phenylalanine, N-methylated Threonine, N-methylated Serine, N-methylated Tyrosine, Alpha Amino-Butyric Acid, FA
  • the linkage between the peptides is the S—S bond between cysteines, the C-terminus (or the carboxyl group of the side chain) and the N-terminus (or the side chain).
  • NH 2 group, side chain SH group can be performed by cyclization or the like.
  • the antimicrobial peptide which concerns on this embodiment may be connected through the spacer as mentioned above.
  • the antibacterial peptide according to the present embodiment has a total amino acid chain length (hereinafter also referred to as chain length), Net charge, and a proportion of hydrophobic residues in the amino acid sequence (hereinafter referred to as a hydrophobic residue proportion) constituting the peptide. Etc.) are preferably controlled.
  • the chain length represents the number of monomers such as amino acids constituting the antimicrobial peptide.
  • Net charge represents the net charge of the peptide.
  • the Net charge basically indicates the value of the Net charge at neutrality (pH 7.4).
  • Net charge of the antibacterial peptide described later in Examples is a value described in a database (URL: http://aps.unmc.edu/AP/main.php) or a value calculated in the same database. Is adopted.
  • the lower limit of the chain length of the antimicrobial peptide according to this embodiment is preferably 10 or more, and more preferably 20 or more.
  • the upper limit of the chain length is preferably less than 50, and more preferably less than 40.
  • the lower limit value of Net charge of the antibacterial peptide according to this embodiment is preferably a value greater than 0, and more preferably a value less than 10.
  • the upper limit value of Net charge is preferably a value less than 15, and more preferably a value less than 10.
  • the lower limit of the proportion of hydrophobic residues in the amino acid sequence constituting the antibacterial peptide according to the present embodiment is preferably 0% or more, and more preferably 25% or more.
  • the upper limit of the hydrophobic residue ratio is preferably 80% or less, and more preferably less than 65%.
  • the antibacterial peptide according to the present embodiment includes a predetermined number or more of specific amino acid residues, assuming that the chain length, the net charge, the ratio of hydrophobic residues in the amino acid sequence, etc. are within the above numerical ranges, respectively.
  • the ability to destroy exosomes derived from cancer cells may be reduced. For example, when 6 or more cysteine residues are contained and either a lysine residue or a valine residue is contained, the ability to destroy cancer cell-derived exosomes decreases.
  • the number of SS bonds present in the antibacterial peptide according to this embodiment is preferably less than 3.
  • the antibacterial peptide according to the present embodiment is preferably a peptide that satisfies the following condition (1) or (2).
  • the chain length is 10 or more and less than 50, Net Charge is greater than 0 and less than 15, and the proportion of hydrophobic residues is 25% or more and less than 65% (provided that 3 or more S—S bonds are included) And all amino acids constituting the antibacterial peptide except those containing either lysine residues or valine residues).
  • the chain length is 2 or more and less than 10, the net charge is 0 or less, the hydrophobic residue ratio is less than 25%, and the following conditions (2-1) or (2-2) are satisfied: To meet.
  • All amino acids constituting the antibacterial peptide contain 3 or more histidine residues and do not contain tryptophan residues and valine residues.
  • All amino acids constituting the antibacterial peptide contain one or more arginine residues, and do not contain phenylalanine residues, tryptophan residues and valine residues.
  • the antibacterial peptide according to the present embodiment is more preferably a peptide that satisfies the following conditions. (Conditions) Chain length is 20 or more and less than 40, Net Charge is 1 or more and less than 10, and hydrophobic residue ratio is 25% or more and less than 65% (provided that 3 or more S—S bonds are included, In addition, all amino acids constituting the antibacterial peptide exclude those containing any one of lysine residues and valine residues).
  • the antibacterial peptides according to the present embodiment are classified on the basis of their three-dimensional structure, specific examples of the classification include magainin 2, BMAP-27, BMAP-28, cecropin, LL37, CAP-11, CAP. -18, ⁇ -helix antibacterial peptides such as aurein, gaegrin, citropin and melittin, ⁇ -sheet antibacterial peptides such as defensin, lactoferricin and tachypressin, ⁇ -helix antibacterial peptides, and connecting peptides of the above ⁇ -sheet antibacterial peptides And a complex antibacterial peptide such as a peptide having a large number of specific amino acid residues (Histatin-5). Among them, it was confirmed that peptides classified as ⁇ -helix antibacterial peptides tend to have a high ability to destroy cancer cell-derived exosomes, as described later in Examples.
  • antimicrobial peptide which concerns on this embodiment may be used individually by 1 type, and may use 2 or more types together.
  • the exosome according to this embodiment is a kind of extracellular granule released by living cells, and refers to a small lipid vesicle having a diameter of about 30 nm to about 100 nm derived from a late endosomal compartment.
  • biomaterials containing exosomes include blood (including separated components), bone marrow fluid, lymph fluid, urine, feces, saliva and other body fluids, and cell lysates.
  • any exosome extracted by pretreatment according to a conventional method can be used depending on the biomaterial.
  • the exosome according to this embodiment may be an exosome derived from any animal species. Specific examples of exosomes include exosomes derived from warm-blooded animals such as humans, mice, rats, monkeys, dogs, cats, cows, horses, and birds.
  • the exosome according to the present embodiment may be an exosome derived from any cell tumor.
  • cell tumors derived from exosomes include tumor cells, dendritic cells, reticulocytes, T cells, B cells, platelets, epithelial cells and the like.
  • the exosome according to the present embodiment preferably includes an exosome derived from a tumor cell involved in cancer cell metastasis, that is, a cancer cell-derived exosome secreted from the cancer cell.
  • the exosome according to the present embodiment may include only a exosome derived from a cancer cell secreted from a cancer cell, or the exosome derived from a cancer cell and a exosome derived from a normal cell.
  • exosomes derived from cancer cells preferably contains exosomes derived from cancer cells.
  • the exosome according to the present embodiment is a mixture of the above-described exosome derived from cancer cells and exosomes derived from normal cells, the exosome derived from cancer cells is selectively destroyed as described later in Examples. it can.
  • Specific examples of cancer cells that secrete exosomes derived from cancer cells according to the present embodiment include breast cancer cells, esophageal cancer cells, stomach cancer cells, appendix cancer cells, colon cancer cells, endometrial cancers.
  • the desired exosome fraction can be extracted by the following method of treatment using gel filtration.
  • various processing conditions such as centrifugation are not limited to the conditions described later.
  • the supernatant of the target cell culture medium secreting exosomes is centrifuged at room temperature for 15 minutes under the condition that the exosome fraction of 2,000 G is not precipitated, thereby separating the insoluble matter.
  • the supernatant fraction is obtained by performing centrifugation for 35 minutes at a speed higher than that of the first centrifugation at 12,000 G at room temperature and under conditions where the exosome fraction does not precipitate. Separate impurities.
  • the obtained supernatant fraction is applied to a gel filtration column, the absorbance at 260 nm is measured for the eluate obtained, and the fraction having a high absorbance is recovered as a desired exosome fraction.
  • the gel filtration column may be a column prepared by purchasing a carrier, or a commercially available product such as Sephacryl S-400 HR (manufactured by GE Healthcare Bioscience).
  • Antibody immunization is known as an alternative technique to the ultracentrifugation method.
  • the antibody that can be used is not particularly limited as long as it can recognize, as an antigen, a substance that exists only in the surface layer of exosomes in blood.
  • Specific examples of the antigen include proteins belonging to the four-transmembrane protein family called tetraspanins such as CD9, CD63, and CD81, and epithelial cell adhesion molecule (EpCAM), human epidermal growth factor type 2 (H2). Specific proteins for exosomes derived from cancer cells.
  • These antibodies are generally used in a state of being supported on a carrier.
  • the exosome destruction method includes a step of preparing an antibacterial peptide and a step of destroying the exosome by causing the antibacterial peptide and the exosome to coexist.
  • exosomes in a sample can be efficiently removed as compared with the conventional method.
  • this method is a technique that can be performed ex vivo and can destroy exosomes under conditions that are mild to components other than exosomes in a sample.
  • it is preferable that the antibacterial peptide and exosome are allowed to coexist and then incubated at a predetermined temperature and time.
  • the work procedure can be simplified about the exosome destruction process.
  • the content of the exosome amount and the antibacterial peptide amount in the incubation solution prepared by mixing and coexisting antibacterial peptide and exosome is 1 ⁇ 10 8 particles / mL exosome.
  • the concentration can be adjusted using a buffer such as physiological saline or PBS.
  • the incubation temperature between the antibacterial peptide and the exosome in the exosome disruption method according to the present embodiment varies depending on the type of the antibacterial peptide, and the optimum value at which the disruption activity is maximized. More preferably, it is 20 ° C. or higher. On the other hand, the upper limit of the incubation temperature is preferably 70 ° C. or lower, and more preferably 40 ° C. or lower.
  • the lower limit of the incubation time between the antibacterial peptide and the exosome in the exosome destruction method according to this embodiment is preferably 1 second or more, and more preferably 10 minutes or more.
  • the upper limit of the incubation time is preferably 72 hours or less, and more preferably 48 hours or less.
  • the incubation solution prepared by mixing and coexisting antimicrobial peptide and exosome contains additive components other than buffers such as physiological saline and PBS. Also good.
  • additives include reagents such as RNase Inhibitor that stabilize biomarkers, and reagents such as protease inhibitor and BSA that stabilize peptides.
  • RNase Inhibitor when extracting the ribonucleic acid biomarker contained in exosome, it is preferable to contain RNase Inhibitor as an additive.
  • RNase Inhibitor mammal-derived (human placenta-derived, mouse-derived, porcine-derived, etc.) RNase inhibitor is mainly used (Non-patent Document 15).
  • the RNase Inhibitor is a protein of about 50 kDa and is inactivated by noncovalent binding to ribonucleases A, B, and C.
  • the RNase Inhibitor is known not to act on RNase T1, T2, H, U1, U2, and CL3.
  • a stabilizer based on a complex of oxovanadium (IV) and ribonucleoside may be used (Non-patent Document 16).
  • the amount of the additive added to the incubation solution prepared by mixing and coexisting antibacterial peptide and exosome is the exosome destruction activity, the target biomarker or the biological safety.
  • the amount generally used in the art can be arbitrarily selected as long as it does not adversely affect the sex.
  • RNase Inhibitor it is 0.01 U to 20 U / ⁇ L, preferably 0.1 U to 1 U / mL.
  • the antibacterial peptide according to the present embodiment may be immobilized on a carrier. It is known that a specific peptide having an antibacterial action called an antibacterial peptide can retain its function even if the peptide is used after being fixed to a carrier or the like (Patent Document 3, etc.) .
  • the carrier that can be used in the exosome destruction method according to the present embodiment may be a known carrier as long as it can chemically or physically bind the antimicrobial peptide or the antibody described above.
  • Specific examples of the carrier include polyamide, polyethylene glycol, sepharose, polyvinyl alcohol, cellulose, silica, silicon, titanium, and iron. Of these, Sepharose and cellulose are preferable, and Sepharose is more preferable from the viewpoint of safety during use.
  • a dialysis membrane for hemodialysis can also be used as a carrier for immobilizing an antimicrobial peptide.
  • dialysis membranes for hemodialysis include cellulose, cellulose acetate, polysulfone, polyethersulfone, polymethyl methacrylate, ethylene vinyl alcohol copolymer, polyacrylonitrile, polyester polymer alloy, polyallyl ether sulfone, and the like.
  • it may be a complex immobilized on an antibody having an amino acid sequence different from that of the antibacterial peptide, or may be a complex in which the complex is immobilized on a carrier.
  • the antibody used here is preferably an antibody that specifically binds to exosomes.
  • the exosome can be destroyed by the antibacterial peptide in a state where the exosome interacts with the antibody and the exosome is adsorbed to the antibody.
  • the carrier having the antibacterial peptide can be packed in a column and used. By passing a sample containing exosomes through a column packed with a carrier having an antibacterial peptide, exosomes can be efficiently destroyed.
  • the antimicrobial peptide and the carrier can be used as long as the object of the present invention is not impaired.
  • a spacer substance having a predetermined length may be interposed between the antibody and the carrier or between the antibacterial peptide and the antibody. Specific examples include polyethylene glycol, unsaturated hydrocarbon, peptide and the like.
  • the spacer substance is a general term for components capable of binding and connecting two objects via a functional group. Specific examples of the functional group include an amino group, a hydroxyl group, a carboxyl group, and a thiol group.
  • the binding mode between the spacer and the antibody, carrier and antimicrobial peptide is not particularly limited.
  • the combination of the carrier and the spacer substance include commercially available products such as HiTrap NHS-activated HP Columns (manufactured by GE Healthcare).
  • the above-mentioned additives may be added to the solution used for column extraction.
  • the effect of the exosome destruction method using the antimicrobial peptide according to the present embodiment will be described.
  • the method for destroying exosomes using the antibacterial peptide according to the present embodiment safety for a living body is ensured, and cancer cell-derived exosomes can be easily and efficiently destroyed.
  • the exosome derived from a cancer cell can be selectively destroyed by a simple operation as compared with the conventional method.
  • the exosome destruction method using the antibacterial peptide according to the present embodiment can be suitably used for extracting a biomarker included in the exosome.
  • the destruction method according to the present embodiment described above it is possible to selectively destroy cancer cell-derived exosomes while suppressing the destruction of normal cell-derived exosomes. Therefore, in the field of cancer treatment, the destruction method according to this embodiment will be used in the future to select new biomarkers related to cancer diseases, examination / diagnosis by efficient detection of existing cancer markers, and dialysis. It is considered useful to apply to technology.
  • the solution after destruction by the antibacterial peptide can be extracted by a known method.
  • a known method for example, in the case of microRNA, it can be extracted using a commercially available RNA extraction kit.
  • a generally known method can be employed, for example, after obtaining cDNA from the extracted microRNA using reverse transcriptase and then measuring using a PCR device, particularly a real-time PCR device. .
  • the method for destroying exosomes according to the present embodiment it is possible to destroy and remove exosomes in a sample with a substance having safety against a living body.
  • exosomes in the sample can be efficiently removed as compared with the conventional method.
  • the exosomes in the sample can be effectively destroyed and removed under the condition that other components different from the exosomes in the sample are prevented from being destroyed. Is also possible.
  • the exosome destruction method according to the present embodiment is a technique that can be applied to a cancer cell metastasis suppression system in the future.
  • the carrier having the antibacterial peptide can be used as one configuration of a blood circulation device for destroying exosome.
  • the cancer cell-derived exosome destruction kit utilizes the above-described destruction method and includes an antibacterial peptide.
  • the antimicrobial peptide contained in this destruction kit can selectively destroy the exosome derived from a cancer cell, and is a peptide which satisfy
  • the chain length is 10 or more and less than 50, Net Charge is greater than 0 and less than 15, and the proportion of hydrophobic residues is 25% or more and less than 65% (provided that 3 or more S—S bonds are included) And all amino acids constituting the antibacterial peptide except those containing either lysine residues or valine residues).
  • the chain length is 2 or more and less than 10, the net charge is 0 or less, the hydrophobic residue ratio is less than 25%, and the following conditions (2-1) or (2-2) are satisfied: Fulfill.
  • All amino acids constituting the antibacterial peptide contain 3 or more histidine residues and do not contain tryptophan residues and valine residues.
  • All amino acids constituting the antibacterial peptide contain one or more arginine residues and do not contain phenylalanine residues, tryptophan residues and valine residues.
  • the cancer cell-derived exosome destruction kit according to this embodiment preferably further includes the above-described RNase Inhibitor from the viewpoint of efficiently destroying the cancer cell-derived exosome.
  • the destruction method described above is a technique that can selectively destroy cancer cell-derived exosomes, and can therefore be used to separate normal cell-derived exosomes.
  • the method for separating exosomes derived from normal cells according to this embodiment includes a step of allowing an antimicrobial peptide and exosomes to coexist.
  • the exosome used in such a method needs to be a mixture of a cancer cell-derived exosome and a normal cell-derived exosome.
  • the antimicrobial peptide used in the method for separating normal cell-derived exosomes according to the present embodiment needs to be capable of selectively destroying cancer cell-derived exosomes, the above-described (1) or (2 It is a peptide that satisfies the conditions of
  • the method for separating exosomes derived from normal cells further includes a step of adsorbing and removing exosome destruction residues derived from cancer cells. By doing so, exosomes derived from normal cells with high purity can be extracted.
  • this invention includes the following aspects. 1. Preparing an antimicrobial peptide; Destroying the exosome by coexisting the antimicrobial peptide and the exosome; A method for destroying exosomes. 2. 1. further comprising preparing a sample containing the exosome prior to the disrupting step; The method for destroying exosomes according to 1. 3. The destroying step is performed ex vivo. Or 2. The method for destroying exosomes according to 1. 4). The exosome is an exosome derived from a cancer cell. To 3.
  • the antibacterial peptide is a polypeptide consisting of 10 or more and 50 or less amino acid residues.
  • the antimicrobial peptide comprises one or more peptides selected from the group consisting of magainin 2, LL-37, protamine and nisin; To 5.
  • the step of preparing the antibacterial peptide includes the step of preparing the antibacterial peptide immobilized on a carrier.
  • the step of preparing the antibacterial peptide includes the step of preparing the antibacterial peptide immobilized on an antibody.
  • the antibody is an antibody that specifically binds to the exosome, The method for destroying exosomes according to 1. 10.
  • the method for destroying exosomes according to 1. 11.
  • An exosome destruction kit containing an antibacterial peptide. 12 10.
  • the antibacterial peptide is a polypeptide consisting of 10 or more and 50 or less amino acid residues.
  • the antimicrobial peptide comprises one or more peptides selected from the group consisting of magainin 2, LL-37, protamine and nisin; Or 12.
  • An exosome destruction kit according to 1. 14 10. the antibacterial peptide is immobilized on a carrier; Thru 13. The exosome destruction kit according to any one of the above. 15. 10. the antibacterial peptide is immobilized on an antibody; Thru 13. The exosome destruction kit according to any one of the above. 16. 15.
  • the antibody is an antibody that specifically binds to the exosome, An exosome destruction kit according to 1. 17.
  • a method for using an antibacterial peptide comprising a step of destroying the exosome by allowing the antibacterial peptide and the exosome to coexist. 18. The method of using an antimicrobial peptide according to claim 17, wherein in the step of destroying, the exosome is destroyed.
  • Example 1 (Exosome fraction A derived from human breast cancer cells)
  • a human breast cancer cell-derived cell line MM231-luc-D3H2LN (test from National Cancer Center) was inoculated into Advanced RPMI 1640 medium (manufactured by Life Technologies). Then, under the conditions set such that CO 2 concentration using the CO 2 incubator comprising 5% by volume, incubated for 48 hours at 37 ° C., to obtain a culture solution containing exosomes. The culture solution was centrifuged at 2,000 G to remove precipitates, and then centrifuged at 110,000 G to precipitate exosomes, and exosome fraction A was collected. The recovered exosome fraction A was suspended in phosphate buffered saline (PBS) and stored at 4 ° C.
  • PBS phosphate buffered saline
  • the stored sample was lightly used before use and suspended after being vortexed (shaking mixer).
  • the number of exosomes in the solution was analyzed using a nanoparticle analyzer (NanoSight LM10; manufactured by NanoSight) according to the protocol attached to the apparatus.
  • the culture solution was centrifuged at 2,000 G for 10 minutes to remove the precipitate, and then centrifuged at 110,000 G for 70 minutes to precipitate the exosome fraction B.
  • the recovered exosome fraction B was suspended in phosphate buffered saline (PBS) and stored at 4 ° C.
  • the stored sample was lightly suspended by a vortex mixer (shaking mixer) before use.
  • the number of exosomes in the solution was analyzed using a nanoparticle analyzer (NanoSight LM10; manufactured by NanoSight) according to the protocol attached to the apparatus.
  • the recovered exosome fraction was suspended in phosphate buffered saline (PBS) and stored at 4 ° C.
  • the stored sample was lightly suspended by a vortex mixer (shaking mixer) before use.
  • the number of exosomes in the solution was analyzed using a nanoparticle analyzer (NanoSight LM10; manufactured by NanoSight) according to the protocol attached to the apparatus.
  • the culture solution was centrifuged at 2,000 G for 10 minutes to remove the precipitate, and then centrifuged at 110,000 G for 70 minutes to precipitate the exosome fraction.
  • the recovered exosome fraction was suspended in phosphate buffered saline (PBS) and stored at 4 ° C.
  • the stored sample was lightly suspended by a vortex mixer (shaking mixer) before use.
  • the number of exosomes in the solution was analyzed using a nanoparticle analyzer (NanoSight LM10; manufactured by NanoSight) according to the protocol attached to the apparatus.
  • microRNA (miR-21 or miR-16) in the reaction solution was reverse transcription primer (Thermo Fisher Scientific, Taqman microRNA Assays, RT primer, hsa-mir-21 or hsa-mir-16) and reverse. Reverse transcription PCR was performed using a coenzyme (Therman Fisher Scientific, Taqman microRNA RT kit).
  • the reverse transcription PCR solution obtained by the above-mentioned method was used as a Taqman Assay primer (manufactured by Thermo Fisher Scientific, Taqman microRNA Assays, Taqman Assay Primer, hsa-mir-21 or hsa-mir-16) and a master for real-time PCR.
  • a mix Thermo Fisher Scientific, TaqMan Universal PCR Master Mix II, w / UNG
  • a calibration curve for microRNA was prepared using synthetic miR-21 (manufactured by Sigma Aldrich) or synthetic miR-16 (manufactured by Sigma Aldrich).
  • a phosphate buffered saline (PBS) solution of exosome fraction A prepared from a human breast cancer cell-derived cell line MM231-luc-D3H2LN equivalent to 1.36 ⁇ 10 11 particles / mL, and 200 ⁇ M magainin 2 A PBS solution was prepared.
  • 10 ⁇ L of human breast cancer cell-derived exosome solution, 50 ⁇ L of magainin 2 solution, and 40 ⁇ L of PBS are mixed to contain 1.36 ⁇ 10 10 particles / mL of human breast cancer cell-derived exosomes and 100 ⁇ M of magainin 2.
  • PBS 100 ⁇ L was prepared and incubated at 25 ° C. for 24 hours. Samples were stored at 4 ° C.
  • a phosphate buffered saline (PBS) solution of exosome fraction A prepared from a human breast cancer cell-derived cell line MM231-luc-D3H2LN equivalent to 1.36 ⁇ 10 11 particles / mL was prepared.
  • 10 ⁇ L of an exosome solution derived from human breast cancer cells and 90 ⁇ L of PBS were mixed to prepare 100 ⁇ L of PBS containing 1.36 ⁇ 10 10 particles / mL exosomes derived from human breast cancer cells at 25 ° C. for 24 hours. Incubated by standing. Samples were stored at 4 ° C.
  • the number of exosomes contained in the said solution is measured using a nanoparticle analyzer (Nanosight LM10, manufactured by Nanosite). did.
  • the number of exosomes in the solution was reduced to 1.89 ⁇ 10 9 particles / mL due to the coexistence of the antibacterial peptide (magainin 2) and exosomes.
  • Magnainin 2 the antibacterial peptide
  • the comparative example it was 1.36 ⁇ 10 10 particles / mL.
  • Example 2 An exosome fraction prepared from a human breast cancer cell-derived cell line MM231-luc-D3H2LN against a peripheral blood sample (hereinafter also referred to as a human peripheral blood sample) collected from a healthy human who does not have cancer. A is added so that it may become the exosome density
  • the human peripheral blood sample is obtained by performing informed consent on the patient according to the Declaration of Helsinki, for example, in the same manner as the method described in JP2013-198483A. Blood is collected using a blood collection tube containing an anticoagulant.
  • human breast cancer cell-derived exosomes and magainin 2 pelleted by ultracentrifugation at 110,000 G were suspended in a human peripheral blood sample, and the contents of the human breast cancer cell-derived exosomes and magainin 2 were 1 respectively.
  • Human breast cancer cell-derived exosomes pelleted by ultracentrifugation at 110,000 G and phenol are suspended in a human peripheral blood sample, and the contents of the human breast cancer cell-derived exosomes and phenol are 1.4 ⁇ 10 4 respectively.
  • 100 ⁇ L of human peripheral blood sample is prepared so as to be 10 parts / mL human breast cancer cell-derived exosomes and 8% phenol, and incubated by allowing to stand at 25 ° C. for 24 hours.
  • Example 2 About a part of the solution after the incubation, after exosome is purified with Exo-Flow32 CD9 IP Kit (manufactured by SBI), it is contained in the solution using a nanoparticle analyzer (Nanosite, NanoSight LM10). Measure the number of exosomes. In Example 2 and Comparative Example 2, the amount of exosome decreases compared to Comparative Example 3. Moreover, protein electrophoresis of serum components is performed on a part of the solution after the incubation. In Example 2 and Comparative Example 3, there is no decrease in albumin component (molecular weight 60,000 to 70,000) and globulin component (molecular weight of about 160,000) as compared with Comparative Example 2.
  • Example 3 a phosphate buffered saline (PBS) solution of exosome fraction A derived from human breast cancer cells equivalent to 1.36 ⁇ 10 11 particles / mL and a PBS solution of 100 ⁇ M nisin A were prepared. Then, 10 ⁇ L of human breast cancer cell-derived exosome solution, 50 ⁇ L of nisin A solution, and 40 ⁇ L of PBS were mixed to obtain 1.36 ⁇ 10 10 particles / mL of human breast cancer cell-derived exosome and 50 ⁇ M of nisin A.
  • PBS phosphate buffered saline
  • exosome fraction 100 ⁇ L was prepared so as to contain PBS, and incubated by standing at 25 ° C. for 48 hours. Samples were stored at 4 ° C. About the solution after the said incubation, after suspending lightly using the mixer, the number of exosomes contained in the said solution was measured using the nanoparticle analyzer (the Nanosite LM10, Nanosight LM10).
  • Example 4 First, a phosphate buffered saline (PBS) solution of exosome fraction A derived from human breast cancer cells corresponding to 1.36 ⁇ 10 11 particles / mL and a PBS solution of 100 ⁇ M lactoferricin were prepared. Then, 10 ⁇ L human breast cancer cell-derived exosome solution, 50 ⁇ L lactoferricin solution, and 40 ⁇ L PBS were mixed to obtain 1.36 ⁇ 10 10 particles / mL human breast cancer cell-derived exosome, and 50 ⁇ M lactoferri An exosome fraction (100 ⁇ L) was prepared so as to be a PBS containing syn, and incubated at 25 ° C. for 48 hours. Samples were stored at 4 ° C. About the solution after the said incubation, after suspending lightly using the mixer, the number of exosomes contained in the said solution was measured using the nanoparticle analyzer (the Nanosite LM10, Nanosight LM10).
  • the nanoparticle analyzer the Nanosite
  • a phosphate buffered saline (PBS) solution of exosome fraction A derived from human breast cancer cells equivalent to 1.36 ⁇ 10 11 particles / mL and a PBS solution of 100 ⁇ M LL-37 were prepared.
  • 10 ⁇ L of human breast cancer cell-derived exosome solution, 50 ⁇ L of LL-37 solution, and 40 ⁇ L of PBS were mixed to obtain 1.36 ⁇ 10 10 particles / mL of human breast cancer cell-derived exosome, and 50 ⁇ M of LL-37.
  • PBS containing 100 ⁇ L was prepared and incubated by allowing to stand at 25 ° C. for 48 hours. Samples were stored at 4 ° C. About the solution after the said incubation, after suspending using a shaking mixer, the number of exosomes contained in the said solution was measured using the nanoparticle analyzer (the Nanosite LM10, Nanosight LM10).
  • a phosphate buffered saline (PBS) solution of exosome fraction A derived from human breast cancer cells corresponding to 1.36 ⁇ 10 11 particles / mL was prepared.
  • 10 ⁇ L of an exosome solution derived from human breast cancer cells and 90 ⁇ L of PBS were mixed to prepare 100 ⁇ L of PBS containing 1.36 ⁇ 10 10 particles / mL exosomes derived from human breast cancer cells at 25 ° C. for 48 hours. Incubated by standing. Samples were stored at 4 ° C. About the solution after the said incubation, after suspending using a shaking mixer, the number of exosomes contained in the said solution was measured using the nanoparticle analyzer (the Nanosite LM10, Nanosight LM10).
  • Example 3 allowed the number of exosomes in the solution to be 4.51 ⁇ 10 9 particles by allowing the antibacterial peptide and exosome to coexist. / ML.
  • Example 4 the number of exosomes in the solution was reduced to 7.47 ⁇ 10 9 particles / mL.
  • the number of exosomes in the solution was reduced to 1.09 ⁇ 10 9 particles / mL.
  • Example 6 A PBS solution containing magainin 2 at a concentration of 500 ⁇ g / mL is prepared. Next, 100 mg of the above magainin 2 solution is brought into contact with 100 mg of Epoxy-activated Sepharose 6B carrier (manufactured by GE Healthcare) and allowed to react at room temperature for 24 hours. After washing the carrier with PBS three times, 100 ⁇ L of 1M ethanolamine (pH 8.0) is added and reacted at 40 ° C. for 4 hours. Thereafter, the carrier is washed 3 times with PBS to obtain Magainin 2-carrying Epoxy-activated Sepharose 6B.
  • Epoxy-activated Sepharose 6B carrier manufactured by GE Healthcare
  • a phosphate buffered saline (PBS) solution of exosome fraction A derived from human breast cancer cells corresponding to 9.92 ⁇ 10 10 particles / mL is prepared.
  • 10 ⁇ L of human breast cancer cell-derived exosome and 90 ⁇ L of PBS are mixed to prepare 100 ⁇ L of PBS containing 9.92 ⁇ 10 9 particles / mL human breast cancer cell-derived exosome.
  • this exosome fraction is incubated by contacting with the above-mentioned Magainin-2-supported Epoxy-activated Sepharose 6B carrier, and then allowing to stand at 25 ° C. for 24 hours. In the resulting eluate, the number of exosomes is reduced to 5.68 ⁇ 10 9 particles / mL.
  • Example 7 a phosphate buffered saline (PBS) solution of exosome fraction A derived from 1 ⁇ 10 11 particles / mL human breast cancer cells is prepared. Then, 10 ⁇ L of human breast cancer cell-derived exosome and 90 ⁇ L of PBS are mixed to prepare 100 ⁇ L of PBS containing 1 ⁇ 10 10 particles / mL human breast cancer cell-derived exosome. Next, 100 ⁇ L of the exosome fraction is contacted with Epoxy-activated Sepharose 6B carrier carrying magainin 2 and anti-human CD9 antibody (Funakoshi, PRO-485), and then incubated at 25 ° C. for 24 hours. The number of exosomes decreases in the resulting eluate.
  • PBS phosphate buffered saline
  • Example 8 A human blood sample containing exosome fraction A derived from 1 ⁇ 10 10 particles / mL human breast cancer cells is prepared. Next, 100 ⁇ L of human blood sample was brought into contact with Epoxy-activated Sepharose 6B carrier (GE Healthcare) carrying magainin 2 and anti-human CD9 antibody (Funakoshi, PRO-485), and then 24 hours at 25 ° C. Incubate for hours. In the resulting eluate, the number of exosomes decreases.
  • Epoxy-activated Sepharose 6B carrier GE Healthcare
  • Example 9 First, a phosphate buffered saline (PBS) solution of exosome fraction A derived from 1 ⁇ 10 11 particles / mL human breast cancer cells is prepared. Then, 10 ⁇ L of human breast cancer cell-derived exosome and 90 ⁇ L of PBS are mixed to prepare 100 ⁇ L of PBS containing 1 ⁇ 10 10 particles / mL human breast cancer cell-derived exosome. Next, 100 ⁇ L of human blood sample was brought into contact with Epoxy-activated Sepharose 6B carrier (manufactured by GE Healthcare) carrying Magainin-2-supported Epoxy-activated Sepharose 6B carrier and anti-human CD9 antibody (manufactured by Funakoshi, PRO-485). And then incubate at 25 ° C. for 24 hours. In the resulting eluate, the number of exosomes decreases.
  • Epoxy-activated Sepharose 6B carrier manufactured by GE Healthcare
  • Example 10 ⁇ Micro RNA extraction from exosomes derived from human breast cancer cells> (Example 10) PBS containing 1 ⁇ 10 11 particles / mL exosome fraction B derived from human breast cancer cells, various antibacterial peptides shown in Table 2 below adjusted to 100 ⁇ M, and 0.4 U / ⁇ L RNase inhibitor (manufactured by Toyobo) Thus, 10 ⁇ L of the exosome fraction was prepared and incubated by allowing to stand at 37 ° C. for 24 hours.
  • microRNA eluted in the solution was purified and collected by the following method. First, 160 ⁇ L of PBS was added to the reaction solution, and then added to a centrifugal filter (Millipore, Amicon Ultra 0.5 mL, 100K filter) and centrifuged at 14,000 G for 2 minutes. Next, 100 ⁇ L was collected from the filtrate after centrifugation and introduced into a 1.5 mL tube. Next, 350 ⁇ L of RLT buffer (Qiagen, RNeasy mini kit) and 675 ⁇ L of ethanol were added and mixed in a 1.5 mL tube.
  • a centrifugal filter Micropore, Amicon Ultra 0.5 mL, 100K filter
  • the resulting mixed solution was divided into two portions and added onto a spin column (Qiagen, RNeasy mini kit attached), centrifuged at 8,000 G for 15 seconds, and the entire amount of the mixed solution was passed through the spin column. . Thereafter, 500 ⁇ L of RPE buffer (Qiagen, RNeasy mini kit attached) was added to the spin column, and centrifuged at 8,000 G for 15 seconds. Furthermore, once again, 500 ⁇ L of RPE buffer was added to the spin column and centrifuged at 8,000 G for 15 seconds. Thereafter, the remaining RPE buffer was removed by centrifuging the spin column at 14,000 G for 1 minute. Next, 30 ⁇ L of RNase free water (Qiagen, RNeasy mini kit attached) was added to the spin column, allowed to stand for 1 minute, and centrifuged at 14,000 G for 1 minute to collect the eluate.
  • RPE buffer Qiagen, RNeasy mini kit attached
  • microRNA (miR-21) contained in the eluate collected by the above-described method was quantified by the above-mentioned real-time PCR method.
  • microRNA extraction was confirmed for some peptides by treating exosomes with antimicrobial peptides.
  • the destruction activity of the used antimicrobial peptide was evaluated according to the following criteria. The results are shown in Table 2 below.
  • the concentration of microRNA contained in was 8 ⁇ 10 ⁇ 14 M.
  • Example 11 1 ⁇ 10 11 particles / mL exosome derived from human prostate cancer cells (PC3ML), various antibacterial peptides shown in Table 3 below adjusted to 100 ⁇ M, and 0.4 U / ⁇ L RNase inhibitor (manufactured by Toyobo) 10 ⁇ L of the exosome fraction was prepared so as to contain PBS, and incubated by allowing to stand at 37 ° C. for 24 hours.
  • the eluted microRNA was purified and recovered from the solution after incubation in Example 11 and Comparative Example 7 by the same method as that extracted from the solution after incubation in Example 10 and Comparative Example 6 described above. .
  • microRNA (miR-21) contained in the recovered eluate was quantified by the real-time PCR method described above.
  • microRNA extraction was confirmed for some peptides by treating exosomes with antimicrobial peptides.
  • the destruction activity of the used antimicrobial peptide was evaluated according to the following criteria. The results are shown in Table 3 below.
  • the concentration of microRNA contained in was 3 ⁇ 10 ⁇ 14 M.
  • Example 12 PBS containing 1 ⁇ 10 11 particles / mL exosome fraction B derived from human breast cancer cells, various antibacterial peptides shown in Table 4 below adjusted to 100 ⁇ M, and 0.4 U / ⁇ L RNase inhibitor (manufactured by Toyobo) Thus, 10 ⁇ L of the exosome fraction was prepared and incubated by allowing to stand at 37 ° C. for 24 hours.
  • microRNA eluted microRNA (miR-16) was purified and recovered from the solution after incubation by the same method as that extracted from the solution after incubation in Examples 10 and 11 and Comparative Examples 6 and 7 described above. did.
  • an exosome fraction derived from 1 ⁇ 10 11 particles / mL human mammary gland cells (MCF-10A, normal cells), various antibacterial peptides shown in Table 4 below adjusted to 100 ⁇ M, and 0.4 U / ⁇ L RNase inhibitor 10 ⁇ L of the exosome fraction was prepared so as to be PBS containing (manufactured by Toyobo) and incubated by allowing to stand at 37 ° C. for 24 hours.
  • microRNA eluted microRNA (miR-16) was purified and recovered from the solution after incubation by the same method as that extracted from the solution after incubation in Examples 10 and 11 and Comparative Examples 6 and 7 described above. did.
  • microRNA eluted microRNA (miR-16) was purified and recovered from the solution after incubation by the same method as that extracted from the solution after incubation in Examples 10 and 11 and Comparative Examples 6 and 7 described above. did.
  • microRNA eluted microRNA (miR-16) was purified and recovered from the solution after incubation by the same method as that extracted from the solution after incubation in Examples 10 and 11 and Comparative Examples 6 and 7 described above. did.
  • the amount of microRNA (miR-16) contained in each collected eluate was quantified by the real-time PCR method described above.
  • the miR-16 ratio for each antimicrobial peptide used was calculated by the following formula 1.
  • the selectivity of the antibacterial peptide used in Example 12 was evaluated as ⁇ when the calculated miR-16 value was higher than the miR-16 ratio of Comparative Example 8. The results are shown in Table 4 below.
  • miR-16 ratio ⁇ (quantitative value of microRNA (miR-16) contained in the eluate collected from each incubation solution of Example 12 containing exosomes derived from human breast cancer cells)-(human breast cancer cells Quantitative value of microRNA (miR-16) contained in the eluate recovered from the incubation solution of Comparative Example 8 containing exosomes derived from ⁇ ⁇ (from each incubation solution of Example 12 containing exosomes derived from normal cells) Quantitative value of microRNA (miR-16) contained in recovered eluate)-(microRNA (miR-16) contained in eluate recovered from the incubation solution of Comparative Example 8 containing exosomes derived from normal cells) Quantitative value) ⁇
  • each antimicrobial peptide used in Example 12 was capable of selectively destroying human breast cancer cell-derived exosomes.
  • the eluted microRNA (miR-16) is purified and recovered from the incubated solution by the same method as that extracted from the incubated solutions of Examples 10 to 12 and Comparative Examples 6 to 8 described above. did.
  • the eluted microRNA (miR-16) is purified and recovered from the incubated solution by the same method as that extracted from the incubated solutions of Examples 10 to 12 and Comparative Examples 6 to 8 described above. did.
  • RPE buffer (Qiagen, attached with RNeasy mini kit) was added to the spin column, and centrifuged at 8,000 G for 15 seconds. Furthermore, once again, 500 ⁇ L of RPE buffer was added to the spin column and centrifuged at 8,000 G for 15 seconds. The spin column was centrifuged at 14,000 G for 1 minute to remove the remaining RPE buffer. 30 ⁇ L of RNase free water (Qiagen, RNeasy mini kit attached) was added to the above spin column, allowed to stand for 1 minute, centrifuged at 14,000 G for 1 minute, and an eluate containing microRNA (miR-16) was recovered.
  • RNase free water Qiagen, RNeasy mini kit attached
  • the eluted microRNA (miR-16) is purified and recovered from the incubated solution by the same method as that extracted from the incubated solutions of Examples 10 to 12 and Comparative Examples 6 to 8 described above. did.
  • Comparative Example 10 A solution containing microRNA (miR-16) was purified and collected from 10 ⁇ L of exosome fraction B derived from 1 ⁇ 10 11 particles / mL human breast cancer cells in the same manner as in Comparative Example 9. In addition, a solution containing microRNA (miR-16) was purified and collected from 10 ⁇ L of exosome fraction derived from 1 ⁇ 10 11 particles / mL normal human serum in the same manner as in Comparative Example 9.
  • the eluted microRNA (miR-16) is purified and recovered from the incubated solution by the same method as that extracted from the incubated solutions of Examples 10 to 12 and Comparative Examples 6 to 8 described above. did.
  • an exosome fraction was prepared so as to be a PBS containing an exosome fraction derived from 1 ⁇ 10 11 particles / mL normal human serum and 0.4 U / ⁇ L RNase inhibitor (manufactured by Toyobo), Incubation was carried out by standing at 37 ° C. for 24 hours.
  • the eluted microRNA (miR-16) is purified and recovered from the incubated solution by the same method as that extracted from the incubated solutions of Examples 10 to 12 and Comparative Examples 6 to 8 described above. did.
  • miR-16 ratio ⁇ (quantitative value of microRNA (miR-16) contained in the eluate recovered from each incubation solution of Example 13, Comparative Example 9 or 10 containing exosomes derived from human breast cancer cells) )-(Quantitative value of microRNA (miR-16) contained in the eluate collected from the incubation solution of Comparative Example 11 containing exosomes derived from human breast cancer cells) ⁇ ⁇ ⁇ (Examples containing exosomes derived from normal cells) 13.
  • Example 13 the method using the antimicrobial peptide of Example 13 was capable of selectively destroying human breast cancer cell-derived exosomes compared to the method using no antimicrobial peptide of the comparative example.

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Abstract

　本発明に係るエクソソームの破壊方法は、抗菌ペプチドを準備する工程と、前記抗菌ペプチドと、エクソソームとを共存させることにより、前記エクソソームを破壊する工程と、を有するものである。

Description

エクソソームの破壊方法、エクソソームの破壊キットおよび正常細胞由来のエクソソームの分離方法
　本発明は、エクソソームの破壊方法、エクソソームの破壊キットおよび正常細胞由来エクソソームの分離方法に関する。
＜エクソソームの概要＞
　エクソソームは、細胞から分泌される細胞外顆粒の一種である。具体的には、エクソソームは、脂質二重膜からなるベシクル構造を有した細胞から放出される直径３０ｎｍ～１００ｎｍ程度の小胞である。このエクソソームは、当該エクソソームを分泌した細胞（以下、分泌細胞ともいう。）とは異なる他の細胞に取り込まれることにより、分泌細胞と上記他の細胞との間で情報伝達を行うことが知られている（非特許文献１および２）。
＜エクソソームの安定性＞
　エクソソームの膜構造は、一般に、細胞の膜構造と比べて安定であることが知られている。例えば、非特許文献３には、－２０℃の温度条件下、糖類等の安定化剤を添加することなくエクソソームを４回凍結融解処理した場合においても、該エクソソーム中の内包物が安定的に維持されたことを示す実験結果が記載されている。一方、動物細胞と称される細胞は、一般に、上述した安定化剤を用いない限り、凍結融解処理に耐えきれないことが知られている。このことから、エクソソームは、動物細胞と比べて、安定な膜構造を有しているものと推察される。
　また、エクソソームと、細胞とでは、膜構造の形成工程が相違している。くわえて、エクソソームの膜構造と、細胞の膜構造とを対比した場合、両者は、膜の表面積や、膜の表面に存在する表面タンパク質の種類が相違している。こうした事情を踏まえても、エクソソームの膜構造は、細胞の膜構造と比べて安定な構造であると考えられる。なお、エクソソームは生細胞ではないため、一般的な細胞に対して適用することが可能なアポトーシスによる細胞死プログラムの対象外である。
＜エクソソームと疾患の関係＞
　近年、エクソソームと各種疾患との間に相関関係があることについて、種々の報告がなされている。特に、がん細胞が放出するエクソソームに着目し、がんという特定の疾患に対して上記エクソソームが及ぼす影響について、様々な研究結果が報告されている。たとえば、がん細胞が放出するエクソソーム中に含まれている血管新生を誘導する因子が健常な血管内皮細胞に取り込まれた場合、上記血管新生を誘導する因子によりがん組織周辺の血管新生が誘導され、がん転移や湿潤を進行させる可能性について報告されている（非特許文献４～６）。
　また、近年においては、エクソソームと各種疾患との相関について、エクソソーム内には疾患に関連する情報が含まれていることも明らかになりつつある。例えば、非特許文献３においては、がん患者の血液中に存在するエクソソームには、がんのバイオマーカーとなる物質（ＰＳＡ，ＨＥＲ２，ＥＧＦＲ等のタンパク質、ｍｉＲ－２１，ｍｉＲ－２００ａ等のマイクロＲＮＡ、Ａｐｂｂ１ｉｐ，ＡＳＰＮ等のメッセンジャーＲＮＡ、ＫＲＡＳ等のＤＮＡ、また各種代謝産物、等）、が内包されていることが報告されている。
　特に、がんのバイオマーカーとなる物質としてエクソソームに内包されているマイクロＲＮＡは、がんの検査指標として有望視されている。生物のマイクロＲＮＡは、既に、ｍｉＲＢａｓｅ（ＵＲＬ：http://www.mirbase.org/）にデータベース化されている。中でも、ヒトのマイクロＲＮＡは、２０１５年時点で２５８８種が公知となっている。また、上述したヒトのマイクロＲＮＡの発現プロファイルは、臓器の種類によって異なることや、正常細胞とがん細胞との間でも異なることが知られている。こうした事情に鑑みて、近年においては、血液中のエクソソームに内包されたマイクロＲＮＡを解析する血液検査によって、がんの部位や進行度を診断する技術を開発すべく鋭意検討されている（非特許文献７）。
＜エクソソームの分離回収（捕集）・除去方法＞
　エクソソームの分離回収（捕集）・除去方法に着目した技術として、たとえば、以下のものがある。
　ヒトの体液（血液、唾液、尿、等）や細胞培養液からエクソソームを回収するための方法としては、非特許文献８等に記載されている超遠心法が、２０１５年時点で最も一般的に使用される手法である。たとえば、細胞培養上清や体液からエクソソームの回収を行う場合、フィルターなどで細胞片などの大きな夾雑物を除去した後、４℃、１００，０００Ｇの条件で７０分間超遠心を行うことにより所望のエクソソームを回収することができる。また、非特許文献８には、ＰＥＧなどの共沈剤を利用して、細胞培養上清や体液中にエクソソームを沈殿させることにより回収する方法も記載されている（非特許文献８）。
　また、特許文献１には、エクソソームと特異的に結合する抗体を利用して当該エクソソームを吸着除去する技術が開示されている。具体的に、特許文献１には、エクソソームの小胞表面に存在するＣＤ９、ＣＤ６３及びＣＤ８１等の膜４回貫通型タンパク質に対して特異的に結合する抗体を利用して、当該エクソソームを吸着除去する方法が記載されている。
　特許文献２には、がん細胞が分泌したがん細胞由来のエクソソームを吸着除去するため、当該がん細胞由来のエクソソームを特異的に吸着する抗体を使用する方法が記載されている。
　非特許文献９および１０には、エクソソームの細胞膜を化学的に処理することにより、当該エクソソーム自体を破壊除去する方法が開示されている。具体的には、非特許文献９には、界面活性剤を使用する方法が記載されており、非特許文献１０には、フェノール、グアニジン、および界面活性剤を使用する方法が記載されている。
国際公開第２０１３／０９９９２５号パンフレット 国際公開第２００７／１０３５７２号パンフレット 特表２００９－５２６８６２号公報
Salido-Guadarrama I,et al., Onco Targets Ther. 2014 Jul 21;7:1327-38. Valadi H et al., Nat Cell Biol 2007, 9: 654-659 Int. J. Biol. Sci. 2013, 9; 10:1021-31 細胞工学、３２巻１号、ｐｐ１６－２２ 実験医学２９巻１号、ｐ４１０－４１４ Ueda, et. al., Proc. Natl, Acad. Sci. USA, 106, 10746-10751, 2009 Genomics Proteomics Bioinformatics 13 (2015) 17-24 エクソソーム解析マスターレッスン（羊土社） Anal Biochem., 2012 Dec 15;431(2):96-8. Mol. Immunol., 2012 Apr;50(4):278-86. Journal of Extracellular Vesicles 2015, 4: 27522 Gynecologic Oncology 2011, 122: 437-446 Biochimica et Biophysica Acta, 1778 (2008), 357-375 Nucleic Acids Symposium Series, 2000, 44 49-50 Prog Nucleic Acid Res Mol Biol. 2005;80:349-74 Biochemistry, 1979, 18 (23), pp 5143-5149
　エクソソームに関する研究現場においては、２０１５年現在、該エクソソームに内包されているがんのバイオマーカーを効率的に捕捉するとともに、上記バイオマーカーを高感度に再現性高く定量的に検出することが可能なシステムの開発が求められている。また、かかるシステムを実現するためには、がん細胞由来のエクソソームを簡便な操作で効率的に破壊する技術や、正常細胞由来のエクソソームを破壊することなく、がん細胞由来のエクソソームを選択的に破壊する技術や、エクソソームに内包されているバイオマーカーを定量的に抽出（分離）する技術などを確立する必要があるとされている。また、上述したシステムを実現することができれば、将来的に、かかるシステムをがんの早期発見及び治療にも応用することが可能と考えられている。
　しかしながら、上記背景技術の項で述べた各種従来技術は、いずれも、上述したシステムを実現するために必要な要求水準を満たすものではなかった。具体的には、本発明者らは、上記背景技術の項で述べた各種従来技術について、以下のような課題があることを見出した。
　まず、エクソソームの細胞膜を化学的に処理する非特許文献９および１０に記載された方法は、がん細胞由来のエクソソームと正常細胞由来のエクソソームの双方を破壊する手法である。
　また、非特許文献９および１０に記載された方法は、将来的に当該方法をがん転移等の疾患治療に応用することを想定した場合、細胞膜の処理に利用する有機化合物が生体内において非特異的に作用してしまう蓋然性が高い。特に、フェノールという物質は、他の化合物と比べて強力なタンパク質変性作用を有しているため、非特許文献１０に記載の方法をがん転移等の疾患治療に応用する場合には、フェノールが生体内に存在するエクソソームとは異なる成分に対して及ぼす影響を排除する必要があると考えられる。このことから、非特許文献９および１０に記載された方法を将来的にがん転移等の疾患治療に応用することは、実質的に不可能であるものと考えられる。こうした事情に鑑みて、近年においては、生体内において非特異的な作用を発現しにくい生体安全性を有した物質を用いるエクソソームの破壊除去方法の構築が求められている傾向にある。
　また、エクソソームに内包されているバイオマーカーを抽出する方法としては、抗体免疫法により捕集したがん細胞由来のエクソソームからマイクロＲＮＡ等のバイオマーカーを抽出する手法が公知となっている。たとえば、非特許文献１１には、エクソソームを抗体免疫法により捕集した後、該エクソソームからマイクロＲＮＡ等のバイオマーカーを抽出する手法が記載されている。しかし、上述した手法は、がん細胞由来のバイオマーカーを選択的に抽出するという点で改善の余地があるとされている。具体的には、上述したバイオマーカーを抽出する手法において、エクソソームを捕集する際に用いる抗体として、がん細胞由来のエクソソームに存在する特徴的なタンパク質を抗原として認識するものを用いる場合においても、かかる特徴的なタンパク質が正常細胞由来のエクソソームにもある程度共通して存在することから、がん細胞由来のエクソソームを正常細胞由来のエクソソームと判別して捕集するという点で、十分な選択性が得られないとされている。また、非特許文献１２には、がん細胞由来のエクソソームに存在する特徴的なタンパク質が、生体内のプロテアーゼにより分解されてエクソソーム表面から失われることにより、該エクソソームを捕集することが困難になる場合もあることが報告されている。
　また、特許文献１および２に記載された方法も同様に、生体に対して安全性の高い抗体を用いてエクソソームを吸着除去する手法ではあるものの、当該抗体に吸着させることのできるエクソソーム量に限りがあるため、特定量以上のエクソソームを吸着除去することはできないという不都合がある。この不都合は、特に、抗体を高密度に充填したカラム等を使用してエクソソームを吸着除去する場合においてより顕在化する傾向にあることが確認されている。その理由としては、エクソソーム粒子が抗体と比べて１０倍以上大きいことが挙げられる。抗体を高密度に充填したカラム等を使用してエクソソームを吸着除去する場合、抗体とエクソソームとの結合点は、空間内に密集して存在することになる。その場合、上述したとおりエクソソーム粒子サイズは抗体と比べて１０倍以上大きいため、上記空間内は、エクソソーム粒子によって占有されることになる。そのため、抗体を高密度に充填したカラム等を使用してエクソソームを吸着除去する場合には、その空間内にエクソソーム粒子の結合（吸着）に関与しない抗体の結合点が発生し、結果としてエクソソーム粒子の吸着量が低下するという不都合が生じる可能性を有している（エクソソームはカラム粒子に比して表面積が小さく、その分相対的に表面に存在する抗原が少ないことが影響していることも考えられる）。
　また、エクソソームの種類によっては、その表面に抗原が存在する状態もまちまちであり、抗体の力価や特異性に結果が大きく左右されることも知られている。さらに、抗体を用いてエクソソームを捕集する手法は、その十分に洗浄することが困難であるため、精製度の高いエクソソームを回収するという点においても、改善の余地を有していた。
　以上に述べたように、上述したシステムを実現する観点から、生体に対する安全性が担保されていることを前提とした、がん細胞由来のエクソソームを簡便な操作で効率的に破壊する技術や、がん細胞由来のエクソソームを選択的に破壊する技術や、エクソソームに内包されているバイオマーカーを定量的に抽出（分離）する技術は、未だ確立されていないのが実情であった。
　そこで、本発明は、生体に対する安全性が担保されており、かつがん細胞由来のエクソソームを簡便かつ効率的に破壊し、該エクソソームに内包されているバイオマーカーを効率的かつ選択的に抽出することが可能な、エクソソームの破壊除去技術を提供する。
　本発明者らは、上記発明が解決しようとする課題の項で述べた従来技術における課題を解決すべく鋭意検討した。その結果、本発明者らは、特定のポリペプチドを用いることにより、生体に対する安全性が担保されており、かつがん細胞由来のエクソソームを簡便かつ効率的に破壊し、該エクソソームに内包されているバイオマーカーを効率的かつ選択的に抽出することが可能な手法を構築できることを見出し、本発明を完成させた。
　本発明によれば、抗菌ペプチドを準備する工程と、
　前記抗菌ペプチドと、エクソソームとを共存させることにより、前記エクソソームを破壊する工程と、
　を有するエクソソームの破壊方法が提供される。
　さらに、本発明によれば、抗菌ペプチドを含んでおり、かつ前記抗菌ペプチドが下記（１）または（２）の条件を満たすペプチドである、がん細胞由来のエクソソームの破壊キットが提供される。
（１）鎖長が１０以上５０未満であり、Ｎｅｔ　Ｃｈａｒｇｅが０より大きく１５未満であり、かつ疎水性残基割合が２５％以上６５％未満である（ただし、Ｓ－Ｓ結合を３以上含み、かつ、前記抗菌ペプチドを構成する全アミノ酸中にリジン残基およびバリン残基のいずれか一方を含むものを除く）。
（２）鎖長が２以上１０未満であり、Ｎｅｔ　Ｃｈａｒｇｅが０以下であり、かつ疎水性残基割合が２５％未満であるとともに、下記（２－１）または（２－２）の条件を満たすものである。
（２－１）前記抗菌ペプチドを構成する全アミノ酸中にヒスチジン残基を３以上含み、かつ、トリプトファン残基及びバリン残基を含まない。
（２－２）前記抗菌ペプチドを構成する全アミノ酸中にアルギニン残基を１以上含み、フェニルアラニン残基、トリプトファン残基およびバリン残基を含まない。
　さらに、本発明によれば、下記（１）または（２）の条件を満たす抗菌ペプチドと、エクソソームとを共存させる工程を含み、
　前記エクソソームが、がん細胞由来のエクソソームと正常細胞由来のエクソソームとの混合物である、正常細胞由来のエクソソームの分離方法が提供される。
（１）鎖長が１０以上５０未満であり、Ｎｅｔ　Ｃｈａｒｇｅが０より大きく１５未満であり、かつ疎水性残基割合が２５％以上６５％未満である（ただし、Ｓ－Ｓ結合を３以上含み、かつ、前記抗菌ペプチドを構成する全アミノ酸中にリジン残基およびバリン残基のいずれか一方を含むものを除く）。
（２）鎖長が２以上１０未満であり、Ｎｅｔ　Ｃｈａｒｇｅが０以下であり、かつ疎水性残基割合が２５％未満であるとともに、下記（２－１）または（２－２）の条件を満たすものである。
（２－１）前記抗菌ペプチドを構成する全アミノ酸中にヒスチジン残基を３以上含み、かつ、トリプトファン残基及びバリン残基を含まない。
（２－２）前記抗菌ペプチドを構成する全アミノ酸中にアルギニン残基を１以上含み、フェニルアラニン残基、トリプトファン残基およびバリン残基を含まない。
　本発明によれば、生体に対する安全性が担保されており、かつがん細胞由来のエクソソームを簡便かつ効率的に破壊し、該エクソソームに内包されているバイオマーカーを効率的かつ選択的に抽出することが可能な、エクソソームの破壊除去技術を提供することができる。特に、本発明に係るエクソソームの破壊方法によれば、化学的な処理を行う公知の手法よりも安全かつ選択的に、抗体を用いる公知の手法よりも、簡便、効率的、かつ、選択的にがん細胞由来エクソソームを破壊することが可能である。
　また、本発明によれば、正常細胞由来のエクソソームと、がん細胞由来のエクソソームとが混在する体液試料から、がん細胞由来のエクソソームを選択的に破壊することも可能である。本発明に係る技術は、がん治療の分野において、将来的に、がん疾患に関わる新規バイオマーカーの選別、既存がんマーカーの効率的検出による検査・診断、さらには、透析技術にも応用することが有用であるものと考えられる。
（抗菌ペプチド）
　まず、「抗菌ペプチド」とは、一般に、グラム陰性菌、グラム陽性菌、真菌、一部のウイルス等に対して、静菌作用もしくは殺菌作用を示すポリペプチドを意味する。一方、本実施形態に係るエクソソームの破壊方法（以下、本破壊方法ともいう。）における抗菌ペプチドは、エクソソームの破壊活性を有するものを指す。中でも、本破壊方法に使用可能な抗菌ペプチドとしては、がん細胞由来のエクソソームを選択的に破壊できるものが好ましい。
　抗菌ペプチドという特殊な機能を有するペプチドは、これまでに数多くの種類が報告されている。しかし、公知となっている抗菌ペプチドが、エクソソームを破壊して除去できる作用を有することについては、これまでに報告されていなかった。また、公知となっている抗菌ペプチドの中には、がん細胞を破壊する作用を示す「抗がんペプチド」と称されるものもある（非特許文献１３）。このような抗がんペプチドの中には、正常細胞への影響が少なく、溶血性が低いものも存在する。しかし、上記抗がんペプチドが、がん細胞由来のエクソソームを選択的に破壊する作用を有するか否かという点については、未だ解明されていない。
　また、本発明者らによる事前検討結果においては、上述した抗がんペプチドの中には、そもそも、がん細胞由来のエクソソームの破壊能が無い又は低いものが多数散見されることが確認されている。具体的には、本発明者らは、以下の知見を得た、
　第１に、ペプチドのＮｅｔ　ｃｈａｒｇｅが０未満であり、かつがん細胞の破壊能を有することが公知となっている抗がんペプチドであったとしても、がん細胞由来のエクソソームの破壊能が無い又は低い場合がある。
　第２に、抗がん作用を示すことが公知となっているＰＲ－３９などの抗がんペプチドであったとしても、がん細胞由来のエクソソームの破壊能が無い又は低い場合がある。
　第３に、がん細胞の細胞膜分解性を有することが公知となっているＨｅｐｃｉｄｉｎ　ＴＨ２－３やＡ６Ｋ等の抗がんペプチドであったとしても、がん細胞由来のエクソソームの破壊能が無い又は低い場合がある。
　このような事情を踏まえ、本発明者らは、抗菌ペプチドのがん細胞に対する作用機序と、がん細胞由来のエクソソームに対する作用機序との間には、相関性や類似性はなく、両者の作用機序は互いに相違しているものと推察した。
　また、抗菌ペプチドは、正電荷を有する。しかし、正電荷を有する物質は、一般に、核酸等の負電荷を有する化合物と結合して、不溶性物質を形成し沈殿することが知られている（非特許文献１４）。
　このことから、抗菌ペプチドを用いて、エクソソームからマイクロＲＮＡ等の核酸成分を抽出することは容易ではないと予想される。しかし、発明者らが鋭意検討した結果、抗菌ペプチドを利用してエクソソームからマイクロＲＮＡ等の核酸成分を抽出する手法が完成した。
　まず、本実施形態に係る抗菌ペプチドの具体例としては、マガイニン２（Ｍａｇａｉｎｉｎ２）等のマガイニン、Ｄｅｆｅｎｓｉｎ　ＨＮＰ－１等のディフェンシン、ラクトフェリシン、ナイシン、Ｃｅｃｒｏｐｉｎ　Ｂ等のセクロピン（Ｃｅｃｒｏｐｉｎ）、アンドロピン、モリシン、セラトトキシン、メリチン（Ｍｅｌｉｔｔｉｎ）、デルマセプチン、ボンビニン、ブレビニン、エスクレチン、Ｂｕｆｏｒｉｎ　ＩＩｂ等のブフォリン（Ｂｕｆｏｒｉｎ）、ＭＧ２Ｂ、Ｃａｅｒｉｎ１．１等のカエリン、ＬＬ３７、ｍＣＲＡＭＰ、ＰＲ－３９、ＣＡＰ－１１、ＣＡＰ－１８、ＲＬ－３７、ＣＲＡＭＰ－１／２、ｒＣＲＡＭＰ、Ｐｒｏｐｈｅｎｉｎ、 ＰＭＡＰ－２３、ＰＭＡＰ－３６、ＰＭＡＰ－３７、ＢＭＡＰ－２７、ＢＭＡＰ－２８、ＢＭＡＰ－３４、Ｂａｃ５、Ｂａｃ７およびｃａｔｈｅｌｉｃｉｄｉｎ－ＡＬ等のカテリジン、アバエシン、アピダエシン、インドリシジン、ブレビニン、プロテグリン、タキプレシン、ドロソマイシン、マクシミン（Ｍａｘｉｍｉｎ）、Ｄｅｒｍａｓｅｐｔｉｎ、Ｍａｃｕｌａｔｉｎ、ＴｓＡＰ－２、ＮＲＣ－０３、Ａｓｃａｐｈｉｎ－８、Ｐｏｌｙｂｉａ－ＭＰＩ、ＮＫ－２、Ｅｐｉｎｅｃｉｄｉｎ－１、Ｐａｒｄａｘｉｎ４、ＮＲＣ－０７、Ｋ６Ｌ９、Ｐｅｐ２７、９Ｒ、ＭＧ２Ａ、Ｈｉｓｔａｔｉｎ－５、Ｍａｃｒｏｐｉｎ、Ｔｕｆｔｓｉｎ、各種ＨＨＰＨＧ、Ａ３Ｋ、Ａ６Ｋ、Ａ９Ｋ、Ｈｅｐｃｉｄｉｎ　ＴＨ２－３、Ａｌｌｏｆｅｒｏｎ１、Ｓｅｓｑｕｉｎ、Ｇａｇｅｏｓｔａｔｉｎ　Ｃ、ＰＮＣ－２８、ＥＰ３，ＢＥＰＴ　ＩＩ－１、ＰＴＰ７、（Ｇｌｎ５３）－Ｃｏｎｎｅｘｉｎ　３７、Ｃ－Ｒｅａｃｔｉｖｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＣＲＰ）、Ｄｅｒｍｃｉｄｉｎ－１Ｌ等のダームシジン、Ｈｅｐｃｉｄｉｎ－２０、オーレイン、ガエグリン、シトロピン、プロタミン等が挙げられる。中でも、マガイニン２、ＬＬ－３７、プロタミンおよびナイシン、ＭＧ２Ｂ、ｍＣＲＡＭＰ、Ｃａｅｒｉｎ　１．１、Ｍａｘｉｍｉｎ　１、Ｍａｘｉｍｉｎ　４、Ｄｅｒｍａｓｅｐｔｉｎ、Ｍａｃｕｌａｔｉｎ　３．１、ＴｓＡＰ－２、ＮＲＣ－０３、Ａｓｃａｐｈｉｎ－８、Ｐｏｌｙｂｉａ－ＭＰＩ、ＮＫ－２、Ｅｐｉｎｅｃｉｄｉｎ－１、Ｓｈｏｒｔ　α－ｈｅｌｉｃａｌ　ｐｅｐｔｉｄｅｓ　（２）　（ＧＩＩＫＫＩＩＫＫＩＩＫＫＩＩＫＫＩ）　、Ｐａｒｄａｘｉｎ　４、ＮＲＣ－０７、Ｋ６Ｌ９、Ｍａｇａｉｎｉｎ　Ｉ、Ｂｕｆｏｒｉｎ　ＩＩｂ、Ｐｅｐ２７、９Ｒ、ＭＧ２Ａ、Ｓｈｏｒｔ　α－ｈｅｌｉｃａｌ　ｐｅｐｔｉｄｅｓ　（１）（ＧＩＩＫＫＩＩＫＫＩ）　、Ｄｅｆｅｎｓｉｎ　ＨＮＰ－１、Ｃｅｃｒｏｐｉｎ　Ｂ、Ｈｉｓｔａｔｉｎ－５、Ｍａｃｒｏｐｉｎ　１、Ｔｕｆｔｓｉｎ、ＨＨＰＨＧ、（ＨＨＰＨＧ）２、（ＨＨＰＨＧ）３、（ＨＨＰＨＧ）４からなる群より選択される１以上のペプチドを含むことが好ましく、カエル由来のマガイニン２、Ｍｅｌｉｔｔｉｎ、ＭＧ２Ｂ、ｍＣＲＡＭＰ、Ｃａｅｒｉｎ　１．１および／またはヒト由来のＬＬ－３７が好ましい。
　また、抗菌ペプチドの配列は、以下に示す各種データベース上に記載されている。
ＵＲＬ：http://aps.unmc.edu/AP/main.php
ＵＲＬ：http://defensins.bii.a-star.edu.sg/
ＵＲＬ：http://crdd.osdd.net/raghava/cancerppd/
ＵＲＬ：http://peptaibol.cryst.bbk.ac.uk/home.shtml
ＵＲＬ：http://www.cybase.org.au/
ＵＲＬ：http://bactibase.pfba-lab-tun.org/main.php
ＵＲＬ：http://phytamp.pfba-lab-tun.org/main.php
ＵＲＬ：http://www.camp.bicnirrh.res.in/
ＵＲＬ：http://yadamp.unisa.it/
ＵＲＬ：http://split4.pmfst.hr/dadp/
ＵＲＬ：http://db-mml.sjtu.edu.cn/THIOBASE/
ＵＲＬ：http://biotechlab.fudan.edu.cn/database/EnzyBase/home.php
ＵＲＬ：http://biotechlab.fudan.edu.cn/database/lamp/
ＵＲＬ：http://milkampdb.org/home.php
ＵＲＬ：http://dbaasp.org/home.xhtml
ＵＲＬ：http://www.baamps.it/
　また、本実施形態に係る抗菌ペプチドは、該抗菌ペプチドを含む生物から抽出したものであってもよいし、遺伝子組み換え技術により人工的に菌体内で合成したものであってもよく、固相合成法等の有機合成技術を用いて人工的に全合成したものであってもよい。また、エクソソームの破壊活性を損なわない範囲であれば、抗菌ペプチドを構成するアミノ酸残基の一部が他のアミノ酸残基に置換されていてもよいし、抗菌ペプチドを構成するアミノ酸残基の一部が欠失していてもよく、抗菌ペプチドを構成するアミノ酸残基に他のアミノ酸残基が挿入されたものであってよい。また、本実施形態に係る抗菌ペプチドは、２以上のペプチドがスペーサーを介して連結されたものであってもよい。また、本実施形態に係る抗菌ペプチドは、Ｃ末端修飾（アミノ化等）、Ｎ末端修飾（アセチル化等）、側鎖修飾、環状化、糖鎖修飾等の翻訳後修飾を受けたものであってもよい。それ故、本実施形態に係る抗菌ペプチドを構成するアミノ酸は、生体を構成する２０種の必須アミノ酸に限らず、後述する特殊アミノ酸であってもよい。
　Ｎ末端修飾方法（側鎖ＮＨ２基修飾、側鎖ＳＨ基修飾）としては、Ａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ、５－ＦＡＭ、ＢＳＡ、Ｈｅｘａｎｏｉｃ　ａｃｉｄ、ＰＥＮ　、５－ＦＡＭ－Ａｈｘ、ＣＢＺ、ＨＹＮＩＣ、Ｓｔｅａｒｉｃ　ａｃｉｄ、Ａｂｚ、Ｄａｎｓｙｌ、ＫＬＨ、Ｓｕｃｃｉｎｙｌａｔｉｏｎ、Ｄａｎｓｙｌ－Ａｈｘ、Ｌａｕｒｉｃ　ａｃｉｄ、ＴＭＲ、Ａｃｒｙｌ　Ｄｅｃａｎｏｉｃ　ａｃｉｄ、Ｌｉｐｏｉｃ　ａｃｉｄ、Ａｌｌｏｃ、ＤＴＰＡ、Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ、Ｂｅｎｚｏｙｌ、各種Ｆａｔｔｙ　Ａｃｉｄ、ＭＣＡ、Ｂｉｏｔｉｎ、ＦＩＴＣ、Ｍｙｒｉｓｔｏｙｌ、Ｂｉｏｔｉｎ－Ａｈｘ、ＦＩＴＣ－Ａｈｘ、Ｏｃｔａｎｏｉｃ　ａｃｉｄ、ＢＯＣ、Ｆｍｏｃ、ＯＶＡ、Ｂｒ－Ａｃ－、Ｆｏｒｍｙｌａｔｉｏｎ、Ｐａｌｍｉｔｏｙｌ、Ｄａｂｓｙｌ，、ＤＨＡ、Ｎｉｃｏｔｉｎｅ、ＡＴＴＯ４８８／５５０／６３３／６４７Ｎ／６５５、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ　Ｇｒｅｅｎ、ｒｈｏｄａｍｉｎｅ　Ｂ、ＴＡＭＲＡ、Ｔｅｘａｓ　Ｒｅｄ、フルオレセイン等が挙げられる。
　Ｃ末端（側鎖カルボキシル基）の修飾方法としては、Ａｍｉｄａｔｉｏｎ、ＡＦＣ、ＡＭＣ、ＭＡＰＳ　Ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ　２　ｂｒａｎｃｈｅｓ、ＭＡＰＳ　Ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ　４　ｂｒａｎｃｈｅｓ、ＭＡＰＳ　Ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ　８　ｂｒａｎｃｈｅｓ、ＢＳＡ、ＫＬＨ、Ｂｚｌ、ＮＨＥｔ、Ｃｙｓｔｅａｍｉｄｅ、ＮＨｉｓｏｐｅｎ、ＮＨＭｅ、ＯＳＵ、Ｅｓｔｅｒ　（ＯＥｔ）、Ｅｓｔｅｒ　（ＯＭｅ）、Ｅｓｔｅｒ　（ＯｔＢｕ）、Ｅｓｔｅｒ　（ＯＴＢｚｌ）、　ＯＶＡ、ｐ－Ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｄｅ、ｔＢｕ等が挙げられる、
　上述した特殊アミノ酸としては、６－Ａｍｉｎｏｃａｐｒｏｉｃ　ａｃｉｄ、Ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃ　ａｃｉｄ、Ｃｉｔｒｕｌｌｉｎｅ、Ｃｙｓｔｅｉｎｅ（Ａｃｍ　ｐｒｏｔｅｃｔｅｄ）、各種Ｄ－Ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ、Ｄｉｍｅｔｈｙ－Ｌｙｓｉｎｅ、Ｈｙｄｒｏｘｙ－Ｐｒｏｌｉｎｅ、Ｍｅｔｈｙｌ－Ｌｙｓｉｎｅ、Ｎｏｒｌｅｕｃｉｎｅ、Ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ、Ｐｙｒｏｇｌｕｔａｍｉｃ　ａｃｉｄ、Ｔｒｉｍｅｔｈｙｌ－Ｌｙｓｉｎｅ、β－Ａｌａｎｉｎｅ、ε－Ａｃｅｔｙｌ－Ｌｙｓｉｎｅ、３－Ｎｉｔｒｏ－Ｔｙｒｏｓｉｎｅ、Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ　Ｔｙｒｏｓｉｎｅ、Ｇａｍｍａ－ＧＬＵ、Ｃｙｓｔｅｉｎｅ　（ｔＢｕ）、Ｐｅｎｉｃｉｌｌａｍｉｎｅ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌａｍｉｎｅ、Ｎ－ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ　Ｌｅｕｃｉｎｅ、Ｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅ、Ｎ－ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ　Ｖａｌｉｎｅ、Ｈｏｍｏｓｅｒｉｎｅ、Ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ、Ｂｉｏｔｉｎ　Ｌｙｓｉｎｅ、Ｃｙｓｔｅｉｎｅ　（Ａｃｍ）、Ｎ－ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ　ＡＬＡ、Ｎ－ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ　Ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ、（Ｌ）　２－ＰＡＬ、　（Ｌ）　４－ＣＬ－ＰＨＥ、 （Ｌ）　１－ＮＡＬ、Ｎ－ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ　Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ、Ｎ－ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ　Ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ、Ｎ－ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ　Ｓｅｒｉｎｅ、Ｎ－ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ　Ｔｙｒｏｓｉｎｅ、Ａｌｐｈａ　Ａｍｉｎｏ－Ｂｕｔｙｒｉｃ　Ａｃｉｄ、Ｂｅｔａ－ＡＳＰ、（Ｌ）－４－Ｐａｌ、Ｌｙｓ（５－ＦＡＭ）、　Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ　ｓｕｌｆｏｎｅ、ＮＭｅ－Ａｓｐ、Ａｉｂ、Ａｂｕ、Ｍｐａ、Ｈｙｄｒｏｘｙ　Ｐｒｏｌｉｎｅ、Ａｃｅｔｙｌａｔｅｄ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ、Ｍｉｎｉ－ＰＥＧ１、Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ　ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ、ＮＨ２－（ＰＥＧ）１１－ＣＨ２ＣＯＯＨ、Ｃｙｃｌｏｐｅｎｔｙｌｇｌｙｃｉｎｅ、Ｓｅｌｅｎｏｃｙｓｔｅｉｎｅ、Ａｚｉｄｏ－Ｌｙｓｉｎｅ、ＮＨ２－（ＰＥＧ）２－ＣＨ２ＣＯＯＨ、ＮＨ２－（ＰＥＧ）６－ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ、ＮＨ２－（ＰＥＧ）１２－ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ、Ｐｒｏｐａｒｇｙｌｇｌｙｃｉｎｅ、１，２，３，４－Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｉｓｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅ－３－ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ　ａｃｉｄ、Ｌｙｓ（ＴＭＲ）、Ｌｙｓ（ｉｖｄｄｅ）、ＮＭｅ－Ｎｌｅ、ＮＭｅ－Ｇｌｕ、ＮＭｅ－Ｎｖａ、Ｐｈｇ、Ｓｅｒ（ｏｃｔａｎｏｉｃ－ａｃｉｄ）、Ｄａｂ（Ｄｎｐ）、Ｓｅｌｅｎｏｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ、Ｃａｒｂｏｘｙａｍｉｄｏｍｅｔｈｙ、Ｂｅｔａ－ＨｏｍｏＬｅｕｃｉｎｅｌａｔｅｄ、Ｃｙｓｔｅｉｎｅ、Ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ　Ａｒｇｉｎｉｎｅ、Ａｒｇ（Ｍｅ）２　ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃａｌ、Ａｒｇ（Ｍｅ）２　ｓｙｍｍｅｔｒｉｃａｌ、Ｌｙｓ（Ｄｄｅ）等が挙げられる。
　また、本実施形態に係る抗菌ペプチドが環状化されたものである場合、ペプチド間の連結は、システイン同士のＳ－Ｓ結合、Ｃ末端（もしくは側鎖のカルボキシル基）とＮ末端（もしくは側鎖ＮＨ２基、側鎖ＳＨ基）の連結による環状化などにより行うことができる。また、本実施形態に係る抗菌ペプチドは、上述したようにスペーサーを介して連結されていてもよい。
　本実施形態に係る抗菌ペプチドは、該ペプチドを構成する全アミノ酸鎖長（以下、鎖長とも示す）、Ｎｅｔ　ｃｈａｒｇｅや、アミノ酸配列中の疎水性残基の割合（以下、疎水性残基割合とも示す）等が制御されたものであることが好ましい。ここで、鎖長とは、抗菌ペプチドを構成するアミノ酸等のモノマー数を表す。Ｎｅｔ　ｃｈａｒｇｅとは、ペプチドが有する正味の電荷を表す。なお、Ｎｅｔ　ｃｈａｒｇｅの算出手法としては、種々の方法が知られているが、本実施形態におけるＮｅｔ　ｃｈａｒｇｅは、基本的に、中性（ｐＨ７．４）におけるＮｅｔ　ｃｈａｒｇｅの値を示す。また、実施例にて後述する抗菌ペプチドのＮｅｔ　ｃｈａｒｇｅは、データベース（ＵＲＬ：http://aps.unmc.edu/AP/main.php）に記載されている値、または同データベース中で算出した値を採用したものである。
　本実施形態に係る抗菌ペプチドの鎖長の下限値は、好ましくは、１０以上であり、さらに好ましくは、２０以上である。一方、鎖長の上限値は、好ましくは、５０未満であり、より好ましくは、４０未満である。
　本実施形態に係る抗菌ペプチドのＮｅｔ　ｃｈａｒｇｅの下限値は、好ましくは、０より大きい値であり、さらに好ましくは、１０未満の値である。一方、Ｎｅｔ　ｃｈａｒｇｅの上限値は、好ましくは、１５未満の値であり、さらに好ましくは、１０未満の値である。
　本実施形態に係る抗菌ペプチドを構成するアミノ酸配列中の疎水性残基割合の下限値は、好ましくは、０％以上であり、さらに好ましくは、２５％以上である。一方、疎水性残基割合の上限値は、好ましくは、８０％以下であり、さらに好ましくは、６５％未満である。
　ここで、本実施形態に係る抗菌ペプチドについて、その鎖長、Ｎｅｔ　ｃｈａｒｇｅやアミノ酸配列中の疎水性残基割合等がそれぞれ上記数値範囲内であったとして、特定のアミノ酸残基を所定数以上含む場合、がん細胞由来エクソソームの破壊能が低下することもある。たとえば、システイン残基を６以上含有し、かつ、リジン残基又はバリン残基のいずれかが含まれる場合、がん細胞由来エクソソームの破壊能が低下する。その他にも、アラニン残基を６以上含みロイシン残基を含まないもの、フェニルアラニン残基及びトリプトファン残基を含まずアルギニン残基を１以上含むものであって、バリン残基、ロイシン残基のいずれかを含むもの等についても、がん細胞由来エクソソームの破壊能が低下する可能性がある。それ故、本実施形態に係る抗菌ペプチド中に存在するＳ－Ｓ結合の数は、３未満であることが好ましい。
　したがって、本実施形態に係る抗菌ペプチドは、下記（１）または（２）の条件を満たすペプチドであることが好ましい。
（１）鎖長が１０以上５０未満であり、Ｎｅｔ　Ｃｈａｒｇｅが０より大きく１５未満であり、かつ疎水性残基割合が２５％以上６５％未満である（ただし、Ｓ－Ｓ結合を３以上含み、かつ、抗菌ペプチドを構成する全アミノ酸中にリジン残基およびバリン残基のいずれか一方を含むものを除く）。
（２）鎖長が２以上１０未満であり、Ｎｅｔ　Ｃｈａｒｇｅが０以下であり、かつ疎水性残基割合が２５％未満であるとともに、下記（２－１）または（２－２）の条件を満たすものである。
（２－１）抗菌ペプチドを構成する全アミノ酸中にヒスチジン残基を３以上含み、かつ、トリプトファン残基及びバリン残基を含まない。
（２－２記抗菌ペプチドを構成する全アミノ酸中にアルギニン残基を１以上含み、フェニルアラニン残基、トリプトファン残基およびバリン残基を含まない。
　また、本実施形態に係る抗菌ペプチドは、下記条件を満たすペプチドであるとさらに好ましい。
（条件）鎖長が２０以上４０未満であり、Ｎｅｔ　Ｃｈａｒｇｅが１以上１０未満であり、かつ疎水性残基割合が２５％以上６５％未満である（ただし、Ｓ－Ｓ結合を３以上含み、かつ、前記抗菌ペプチドを構成する全アミノ酸中にリジン残基およびバリン残基のいずれか一方を含むものを除く）。
　また、本実施形態に係る抗菌ペプチドをその立体構造という観点に基づいて分類する場合、その分類の具体例としては、マガイニン２、ＢＭＡＰ－２７、ＢＭＡＰ－２８、セクロピン、ＬＬ３７、ＣＡＰ－１１、ＣＡＰ－１８、オーレイン、ガエグリン、シトロピンおよびメリチン等のαへリックス型抗菌ペプチド、ディフェンシン、ラクトフェリシンおよびタキプレシン等のβシート型抗菌ペプチド、αへリックス型抗菌ペプチド、上記βシート型抗菌ペプチドの連結ペプチド等の複合型抗菌ペプチド、特定のアミノ酸残基が多いペプチド（Ｈｉｓｔａｔｉｎ－５）等が挙げられる。中でも、αへリックス型抗菌ペプチドに分類されるペプチドは、実施例にて後述するように、がん細胞由来エクソソームの破壊能が高い傾向にあることが確認された。
　また、本実施形態に係る抗菌ペプチドは、１種を単独で用いてもよいし、２種以上を併用してもよい。
（エクソソーム）
　本実施形態に係るエクソソームは、生物の細胞が放出する細胞外顆粒の一種であり、後期エンドソーム区画由来の直径３０ｎｍ以上１００ｎｍ以下程度の小型脂質小胞を指す。
　また、エクソソームを含む生体材料としては、血液（成分分離したものを含む）、骨髄液、リンパ液、尿、便、唾液等の体液、細胞破砕物などが挙げられる。本実施形態においては、生体材料に応じて、常法に従って前処理を行い抽出したエクソソームであれば使用可能である。
　本実施形態に係るエクソソームは、いかなる動物種由来のエクソソームであってもよい。エクソソームの具体例として、ヒト、マウス、ラット、サル、イヌ、ネコ、ウシ、ウマおよびトリ等の温血動物由来のエクソソームが挙げられる。
　また、本実施形態に係るエクソソームは、如何なる細胞腫由来のエクソソームであってもよい。エクソソームの由来する細胞腫の具体例としては、腫瘍細胞、樹状細胞、網状赤血球、Ｔ細胞、Ｂ細胞、血小板、上皮細胞等が挙げられる。
　中でも、本実施形態に係るエクソソームはがん細胞の転移に関与する腫瘍細胞に由来するエクソソーム、すなわち、がん細胞から分泌されたがん細胞由来のエクソソームを含むことが好ましい。言い換えれば、本実施形態に係るエクソソームは、がん細胞から分泌されたがん細胞由来のエクソソームのみを含むものであってもよいし、上記がん細胞由来のエクソソームと正常細胞由来のエクソソームとの混合物であってもよいが、がん細胞由来のエクソソームを含むものであることが好ましい。また、本実施形態に係るエクソソームが、上記がん細胞由来のエクソソームと正常細胞由来のエクソソームとの混合物である場合、実施例にて後述するように、がん細胞由来のエクソソームを選択的に破壊できる。
　そして、本実施形態に係るがん細胞由来のエクソソームを分泌するがん細胞の具体例としては、乳がん細胞、食道がん細胞、胃がん細胞、虫垂がん細胞、大腸がん細胞、子宮体がん細胞、子宮頚がん細胞、卵巣がん細胞、脳腫瘍細胞、肝がん細胞、胆嚢がん細胞、胆管がん細胞、膵臓がん細胞、副腎がん細胞、消化管間質腫瘍、中皮腫、喉頭がん細胞、口腔がん細胞（口腔底がん、歯肉がん、舌がん、頬粘膜がん、唾液腺がん）、副鼻腔がん細胞（上顎洞がん、前頭洞がん、篩骨洞がん、蝶型骨洞がん）、甲状腺がん細胞、腎臓がん細胞、肺がん細胞、骨肉腫、前立腺がん細胞、精巣腫瘍、腎細胞がん細胞、膀胱がん細胞、横紋筋肉腫、皮膚がん細胞、肛門がん細胞、白血病、リンパ腫 、ホジキン病、多発性骨髄腫等が挙げられる。
＜エクソソーム抽出方法＞
　次に、エクソソームの各種抽出方法について説明する。
（超遠心法）
　まず、超遠心分離機を用いてエクソソーム画分を抽出する方法について説明する。
　細胞から直接エクソソーム画分を抽出する場合、たとえば、細胞培養液の上清を後述する方法で超遠心処理する以下の方法を用いれば、所望のエクソソーム画分を抽出することができる。ただし、遠心分離等の各種処理条件は、後述する条件に限定されるものではない。
　まず、エクソソームを分泌する対象細胞培養液の上清を、室温、２，０００Ｇというエクソソーム画分が沈殿しない条件で１５分間の遠心分離を行った後、不溶性分を分離する。次に、得られた上清画分を、１１０，０００Ｇで７０分間遠心することによりエクソソームを沈殿させる。その後、上清画分を除去することで、所望のエクソソーム画分を回収することができる。
（ゲルろ過法）
　次に、ゲルろ過することによりエクソソーム画分を抽出する方法について説明する。
　細胞培養液の上清からエクソソーム画分を抽出する場合、たとえば、ゲルろ過法を用いて処理する以下の方法で所望のエクソソーム画分を抽出することができる。ただし、遠心分離等の各種処理条件は、後述する条件に限定されるものではない。
　まず、エクソソームを分泌する対象細胞培養液の上清を、室温、２，０００Ｇというエクソソーム画分が沈殿しない条件で１５分間の遠心分離を行うことにより、不溶性分を分離する。この不溶性分を除去した後、室温、１２，０００Ｇという１回目の遠心分離よりも速い速度であり、かつ、エクソソーム画分が沈殿しない条件で３５分間の遠心分離を行うことにより上清画分と不純物分とを分離する。次いで、得られた上清画分を、ゲルろ過カラムに供して得られた溶出液について、２６０ｎｍの吸光度を測定し、吸光度の高いフラクションを所望のエクソソーム画分として回収する。なお、ゲルろ過カラムは、担体を購入し自ら作製したものであってもよいし、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ－４００ ＨＲ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）等の市販品であってもよい。
（検体からの抽出）
　次に、血液などの検体試料からエクソソーム画分を抽出する方法について説明する。
　血液などの検体試料からエクソソーム画分を得る場合には、公知の方法に従い血漿成分又は血清を分離し、以降は細胞培養液上清からエクソソーム画分を抽出する場合に準じた方法にて抽出することができる。検体試料が尿、唾液、汗、髄液からエクソソーム画分を抽出する場合には、公知の方法に従い夾雑物を取り除いた後、以降は細胞培養液上清の場合に準じた方法にて抽出することができる。
（抗体免疫法）
　次に、抗体を用いてエクソソーム画分を抽出する方法について説明する。
　上記超遠心法の代替技術として、抗体免疫法が知られている。使用できる抗体は、血液中においてエクソソームの表層にのみ存在する物質を抗原として認識できるものであれば、特に制限はない。上記抗原の具体例としては、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１等のテトラスパニンと呼ばれる膜４回貫通型タンパク質ファミリーに属するタンパク質や、Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ（ＥｐＣＡＭ）、ｈｕｍａｎ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｐｅ２（ＨＥＲ２）等のがん細胞由来のエクソソームに対して特異的なタンパクが挙げられる。その他、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ４１、ＣＤ５１、ＣＤ６１、ＣＤ６２ｅ、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ１０５、ＣＤ１４４、ＣＤ２３５ａ、Ａｎｎｅｘｉｎ　Ｖ、Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ　Ａ、Ｖａｌｐｈａ２４／Ｖｂｅｔａ１１、などが挙げられる。これら抗体は、担体に担持された状態で使用されることが一般的である。
＜エクソソームの破壊方法＞
　本実施形態に係るエクソソームの破壊方法は、抗菌ペプチドを準備する工程と、抗菌ペプチドと、エクソソームとを共存させることにより、エクソソームを破壊する工程と、を有する。かかる方法によれば、従来の方法と比べて、試料中におけるエクソソームを効率よく除去することが可能である。また、本方法は、生体外で実施されるものであり、かつ試料中におけるエクソソーム以外の成分に対して温和な条件にて、エクソソームの破壊を実施することができる技術である。かかる方法においては、抗菌ペプチドと、エクソソームとを共存させた後、所定の温度・時間でインキュベートすることが好ましい。また、本方法によれば、エクソソームの破壊処理について、その作業手順を簡便化することができる。
　本実施形態に係るエクソソームの破壊方法において、抗菌ペプチドとエクソソームとを混合して共存させて調製するインキュベート溶液におけるエクソソーム量と抗菌ペプチド量との含有量は、１×１０８ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍＬのエクソソームに対して、１００μＭ以下の抗菌ペプチドを含むことが好ましく、１０μＭ以下の抗菌ペプチドを含むものであるとより好ましく、１μＭ以下の抗菌ペプチドを含むものであるとさらに好ましい。その場合、生理食塩水又はＰＢＳ等のバッファーを用いて濃度調整することができる。
　本実施形態に係るエクソソームの破壊方法における抗菌ペプチドとエクソソームとのインキュベート温度は、抗菌ペプチドの種類により破壊活性が最大となる最適値が異なるが、インキュベート温度の下限値は、好ましくは、０℃以上であり、さらに好ましくは、２０℃以上である。一方、インキュベート温度の上限値は、好ましくは、７０℃以下であり、さらに好ましくは、４０℃以下である。
　本実施形態に係るエクソソームの破壊方法における抗菌ペプチドとエクソソームとのインキュベート時間の下限値は、好ましくは、１秒以上であり、さらに好ましくは、１０分以上である。一方、インキュベート時間の上限値は、好ましくは、７２時間以下であり、さらに好ましくは、４８時間以下である。
　また、本実施形態に係るエクソソームの破壊方法において、抗菌ペプチドとエクソソームとを混合して共存させて調製するインキュベート溶液中には、生理食塩水やＰＢＳ等のバッファー以外の添加剤成分を含有させてもよい。このような添加剤の具体例としては、バイオマーカーを安定化させるＲＮａｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ等の試薬や、ペプチドを安定化させるｐｒｏｔｅａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒおよびＢＳＡ等の試薬が挙げられる。中でも、エクソソームに含まれるリボ核酸系バイオマーカーを抽出する場合には、ＲＮａｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒを添加剤として含有させることが好ましい。
　上述したＲＮａｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒとしては、哺乳類由来（ヒト胎盤由来、マウス由来、ブタ由来、等）のＲＮａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒが主に利用される（非特許文献１５）。上記ＲＮａｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒは、約５０ｋＤａのタンパク質であり、リボヌクレアーゼＡ、Ｂ、およびＣに非共有結合することで不活性化する。また、上記ＲＮａｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒは、ＲＮａｓｅ　Ｔ１、Ｔ２、Ｈ、Ｕ１、Ｕ２、ＣＬ３へは作用しないことが知られている。
　また、オキソバナジウム(ＩＶ)とリボヌクレオシドの錯体による安定化剤が利用されることもある（非特許文献１６）。
　上述した各種添加剤は、１種を単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
　本実施形態に係るエクソソームの破壊方法において、抗菌ペプチドとエクソソームとを混合して共存させて調製するインキュベート溶液中に添加する添加剤の量は、エクソソームの破壊活性、目的とするバイオマーカー又は生体安全性に対して悪影響を及ぼさない範囲で、当該技術分野における一般的な量を任意に選択できる。たとえば、ＲＮａｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒであれば、０．０１Ｕ～２０Ｕ／μL、好ましくは０．１Ｕ～１Ｕ／mLである。
（担体接触法）
　本実施形態に係る抗菌ペプチドは、担体に固定化されたものであってもよい。抗菌ペプチドという殺菌作用を有する特定のペプチドは、当該ペプチドを担体などに固定して使用したとしても、その機能を保持することができるものであることが公知となっている（特許文献３など）。
　本実施形態に係るエクソソームの破壊方法に使用できる担体は、抗菌ペプチドまたは上述した抗体を化学的もしくは物理的に結合できるものであれば、公知のものであってもよい。上記担体の具体例としては、ポリアミド、ポリエチレングリコール、セファロース、ポリビニルアルコール、セルロース、シリカ、シリコン、チタンおよび鉄等が挙げられる。中でも、セファロースおよびセルロースであることが好ましく、使用時の安全性という観点から、セファロースであるとさらに好ましい。
　また、エクソソームを含む試料がエクソソームを含む血液である場合には、血液透析用の透析膜を抗菌ペプチドを固定化するための担体として使用することもできる。血液透析用の透析膜の具体例としては、セルロース、セルロースアセテート、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリメチルメタクリレート、エチレンビニルアルコール共重合体、ポリアクリロニトリル、ポリエステル系ポリマーアロイ、ポリアリルエーテルスルホン等が挙げられる。
　また、抗菌ペプチドとは異なるアミノ酸配列からなる抗体に固定化された複合体としてもよく、担体に対して上記複合体を固定化したものであってもよい。ここで使用される抗体は、エクソソームに対して特異的に結合する抗体であることが好ましい。こうすることで、エクソソームと抗体と相互作用させて、上記エクソソームを抗体に対して吸着した状態で、当該エクソソームを抗菌ペプチドにより破壊することができる。
　担体に固定化された抗菌ペプチド、または担体に固定化された上記複合体を使用する場合には、当該抗菌ペプチドを有する担体をカラムに充填して使用することも可能である。エクソソームを含む試料は、抗菌ペプチドを有する担体を充填したカラムに通すことにより、効率的にエクソソームを破壊することが可能となる。
　本実施形態に係るエクソソームの破壊方法において、抗体または担体に固定化させた抗菌ペプチドを用いる場合には、本発明の目的を損なわない範囲であれば、上記抗菌ペプチドと上記担体との間、上記抗体と上記担体との間、または上記抗菌ペプチドと上記抗体との間に、所定の長さのスペーサー物質を介在させてもよい。具体例としては、ポリエチレングリコール、不飽和炭化水素、ペプチド等が挙げられる。
　スペーサー物質は、一般的に、官能基を介して、２の物体を結合させて連結することが可能な成分の総称である。上記官能基の具体例としては、アミノ基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、チオール基等が挙げられる。また、スペーサーと、抗体、担体および抗菌ペプチドとの間の結合様式は、特に限定されない。なお、上記担体とスペーサー物質との組み合わせの例として、ＨｉＴｒａｐ　ＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ＨＰ　Ｃｏｌｕｍｎｓ（ＧＥヘルスケア社製）等の市販製品が挙げられる。
　担体接触法の場合であっても、カラム抽出に供する溶液に、上述した添加剤を添加してもよい。
　以下、本実施形態に係る抗菌ペプチドを使用したエクソソームの破壊方法による効果を説明する。
　本実施形態に係る抗菌ペプチドを使用したエクソソームの破壊方法によれば、生体に対する安全性が担保されており、かつがん細胞由来のエクソソームを簡便かつ効率的に破壊することが可能となる。また、本破壊方法によれば、従来の手法と比べて、簡便な操作でがん細胞由来のエクソソームを選択的に破壊することができる。
　また、本実施形態に係る抗菌ペプチドを使用したエクソソームの破壊方法は、エクソソームに内包されているバイオマーカーを抽出するために好適に利用することができる。上述した本実施形態に係る破壊方法を利用すれば、正常細胞由来のエクソソームを破壊することを抑制しつつ、がん細胞由来のエクソソームを選択的に破壊することが可能になる。そのため、本実施形態に係る破壊方法は、がん治療の分野において、将来的に、がん疾患に関わる新規バイオマーカーの選別、既存がんマーカーの効率的検出による検査・診断、さらには、透析技術にも応用することが有用であるものと考えられる。
　ここで、エクソソームに内包されているバイオマーカーの抽出方法は、抗菌ペプチドによる破壊後の溶液を、公知の方法で抽出することができる。例えば、マイクロＲＮＡの場合は、市販のＲＮＡ抽出キットを用いて抽出することができる。マイクロＲＮＡの検出は、例えば、抽出したマイクロＲＮＡから逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを得たのちＰＣＲ装置、特にリアルタイムＰＣＲ装置を用いて測定するなど、一般的な公知の方法を採用することができる。
　また、本実施形態に係るエクソソームの破壊方法によれば、試料中におけるエクソソームを、生体に対する安全性を有した物質により破壊除去することが可能となる。この方法を用いた場合には、従来の方法と比べて、試料中におけるエクソソームを効率よく除去することが可能となる。また、本実施形態に係るエクソソームの破壊方法によれば、たとえば、試料中におけるエクソソームとは異なる他の成分が破壊されることを抑制する条件で、試料中におけるエクソソームを効果的に破壊除去することも可能となる。そのため、エクソソームを含む試料として、たとえば、がん患者の生体から採取した血液試料を使用する場合には、当該血液試料中におけるエクソソームとは異なる他の成分が破壊されることを抑制しつつ、がん細胞由来のエクソソームを破壊することができる。こうした事情に鑑みて、本実施形態に係るエクソソームの破壊方法は、今後、がん細胞の転移抑制システムに適用可能な技術であるといえる。
　これにより、たとえば、エクソソームを含む試料がエクソソームを含む血液である場合には、上記抗菌ペプチドを有する担体を、エクソソームを破壊するための血液循環装置の一構成として使用することが可能となる。
＜がん細胞由来のエクソソームの破壊キット＞
　本実施形態に係るがん細胞由来のエクソソームの破壊キットは、上述した破壊方法を利用するものであり、抗菌ペプチドを含むものである。そして、かかる破壊キットに含まれる抗菌ペプチドは、がん細胞由来のエクソソームを選択的に破壊できるものであり、下記（１）または（２）の条件を満たすペプチドである。
（１）鎖長が１０以上５０未満であり、Ｎｅｔ　Ｃｈａｒｇｅが０より大きく１５未満であり、かつ疎水性残基割合が２５％以上６５％未満である（ただし、Ｓ－Ｓ結合を３以上含み、かつ、抗菌ペプチドを構成する全アミノ酸中にリジン残基およびバリン残基のいずれか一方を含むものを除く）。
（２）鎖長が２以上１０未満であり、Ｎｅｔ　Ｃｈａｒｇｅが０以下であり、かつ疎水性残基割合が２５％未満であるとともに、下記（２－１）または（２－２）の条件を満たす。
（２－１）抗菌ペプチドを構成する全アミノ酸中にヒスチジン残基を３以上含み、かつ、トリプトファン残基及びバリン残基を含まない。
（２－２）抗菌ペプチドを構成する全アミノ酸中にアルギニン残基を１以上含み、フェニルアラニン残基、トリプトファン残基およびバリン残基を含まない。
　また、本実施形態に係るがん細胞由来のエクソソームの破壊キットは、がん細胞由来のエクソソームを効率的に破壊する観点から、上述したＲＮａｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒをさらに含むものであることが好ましい。
＜正常細胞由来のエクソソームの分離方法＞
　上述した破壊方法は、がん細胞由来のエクソソームを選択的に破壊できる手法であるが故、正常細胞由来のエクソソームを分離するためにも利用することが可能である。具体的には、本実施形態に係る正常細胞由来のエクソソームの分離方法は、抗菌ペプチドと、エクソソームとを共存させる工程を含むものである。ただし、かかる方法において使用するエクソソームは、がん細胞由来のエクソソームと正常細胞由来のエクソソームとの混合物である必要がある。くわえて、本実施形態に係る正常細胞由来のエクソソームの分離方法に用いる抗菌ペプチドは、がん細胞由来のエクソソームを選択的に破壊できるものである必要が有るため、上述した（１）または（２）の条件を満たすペプチドである。
　また、本実施形態に係る正常細胞由来のエクソソームの分離方法は、がん細胞由来のエクソソームの破壊残渣を吸着除去する工程をさらに含むことが好ましい。こうすることで、純度の高い正常細胞由来のエクソソームを抽出することができる。
　本発明の実施形態について述べたが、これらは本発明の例示であり、これらに限定されるものではなく、上記以外の様々な構成を採用することを妨げるものではない。
　なお、本発明は、以下の態様を含むものである。
１．抗菌ペプチドを準備する工程と、
　前記抗菌ペプチドと、エクソソームとを共存させることにより、前記エクソソームを破壊する工程と、
　を有するエクソソームの破壊方法。
２．前記破壊する工程の前に、前記エクソソームを含む試料を準備する工程をさらに含む、１．に記載のエクソソームの破壊方法。
３．前記破壊する工程は、生体外で実施される、１．または２．に記載のエクソソームの破壊方法。
４．前記エクソソームが、癌細胞由来のエクソソームである、１．乃至３．のいずれか一つに記載のエクソソームの破壊方法。
５．前記抗菌ペプチドが、１０以上５０以下のアミノ酸残基からなるポリペプチドである、１．乃至４．のいずれか一つに記載のエクソソームの破壊方法。
６．前記抗菌ペプチドが、マガイニン２、ＬＬ－３７、プロタミンおよびナイシンからなる群より選択される１以上のペプチドを含む、１．乃至５．のいずれか一つに記載のエクソソームの破壊方法。
７．前記抗菌ペプチドを準備する工程が、担体に固定化されている前記抗菌ペプチドを準備する工程を含む、１．乃至６．のいずれか一つに記載のエクソソームの破壊方法。
８．前記抗菌ペプチドを準備する工程が、抗体に固定化されている前記抗菌ペプチドを準備する工程を含む、１．乃至６．のいずれか一つに記載のエクソソームの破壊方法。
９．前記抗体が、前記エクソソームに対して特異的に結合する抗体である、８．に記載のエクソソームの破壊方法。
１０．前記破壊する工程が、
　前記抗体と前記エクソソームとを相互作用させて、前記抗体に相互作用させた前記エクソソームを前記抗菌ペプチドで破壊する工程と、
　を含む８．または９．に記載のエクソソームの破壊方法。
１１．抗菌ペプチドを含有する、エクソソームの破壊キット。
１２．前記抗菌ペプチドが、１０以上５０以下のアミノ酸残基からなるポリペプチドである、１１．に記載のエクソソームの破壊キット。
１３．前記抗菌ペプチドが、マガイニン２、ＬＬ－３７、プロタミンおよびナイシンからなる群より選択される１以上のペプチドを含む、１１．または１２．に記載のエクソソームの破壊キット。
１４．前記抗菌ペプチドが担体に固定化されている、１１．乃至１３．のいずれか一つに記載のエクソソームの破壊キット。
１５．前記抗菌ペプチドが抗体に固定化されている、１１．乃至１３．のいずれか一つに記載のエクソソームの破壊キット。
１６．前記抗体が、前記エクソソームに対して特異的に結合する抗体である、１５．に記載のエクソソームの破壊キット。
１７．抗菌ペプチドと、エクソソームとを共存させることにより、前記エクソソームを破壊する工程を含む、抗菌ペプチドの使用方法。
１８．前記破壊する工程において、前記エクソソームを破壊する、請求項１７に記載の抗菌ペプチドの使用方法。
　以下、本発明を実施例および比較例により説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
＜抗菌ペプチドの準備＞
　各実施例で用いた抗菌ペプチドの特徴を下記表１に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
＜エクソソーム試料の準備＞
（ヒト乳がん細胞由来のエクソソーム画分Ａ）
　ヒト乳がん細胞由来の細胞株ＭＭ２３１－ｌｕｃ－Ｄ３Ｈ２ＬＮ（国立がん研究センターからの供試）を、Ａｄｖａｎｃｅｄ　ＲＰＭＩ１６４０培地（ライフテクノロジーズ社製）に植菌した。次いで、ＣＯ２インキュベーターを用いてＣＯ２濃度が５体積％となるように設定した条件下、３７℃で４８時間培養し、エクソソームを含む培養液を得た。この培養液を、２，０００Ｇで遠心することにより沈殿を除去した後、１１０，０００Ｇで遠心することによりエクソソームを沈殿させ、エクソソーム画分Ａを回収した。回収したエクソソーム画分Ａは、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に懸濁後、４℃で保管した。なお、保管サンプルは、使用前に軽く、ボルテックスミキサー（振とうミキサー）により懸濁してから使用した。
　また、溶液中のエクソソームの個数は、ナノ粒子解析装置（ＮａｎｏＳｉｇｈｔ　ＬＭ１０；ＮａｎｏＳｉｇｈｔ社製）を用いて、装置添付のプロトコルに従い解析した。
（ヒト乳がん細胞由来のエクソソーム画分Ｂ）
　ヒト乳がん由来の細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１－ｌｕｃ－Ｄ３Ｈ２ＬＮ（＝ＭＭ２３１－ｌｕｃ－Ｄ３Ｈ２ＬＮ、国立がん研究センターからの供試）の細胞懸濁液を、１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ　１６４０培地（サーモフィッシャーサイエンテイフィック社製）を入れたディッシュに播種した。次いで、ＣＯ２インキュベーターを用いてＣＯ２濃度が５体積％となるように設定した条件下、３７℃で上記細胞株を増殖させた後、Ａｄｖａｎｃｅｄ　ＲＰＭＩ１６４０培地（サーモフィッシャーサイエンテイフィック社製）に交換した。次いで、４８時間培養し、エクソソームを含む培養液を得た。この培養液を２，０００Ｇで１０分間遠心することにより沈殿を除去した後、１１０，０００Ｇで７０分間遠心することにより沈殿させ、エクソソーム画分Ｂを回収した。回収したエクソソーム画分Ｂはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に懸濁後、４℃で保管した。なお、保管サンプルは、使用前に軽くボルテックスミキサー（振とうミキサー）により懸濁してから使用した。
　溶液中のエクソソームの個数は、ナノ粒子解析装置（ＮａｎｏＳｉｇｈｔ　ＬＭ１０；ＮａｎｏＳｉｇｈｔ社製）を用いて、装置添付のプロトコルに従い解析した。
（ヒト乳腺上皮細胞由来のエクソソーム画分）
　ヒト乳腺上皮由来の細胞株ＭＣＦ　１０Ａ（国立がん研究センターからの供試）の細胞懸濁液を、Ｍａｍｍａｒｙ　Ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ　Ｃｅｌｌ　Ｂａｓａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ（ロンザ社製）を入れたディッシュに播種した。次いで、ＣＯ２インキュベーターを用いてＣＯ２濃度が５体積％となるように設定した条件下、３７℃で上記細胞株を増殖させた後、新鮮な培地に交換した。次いで、４８時間培養し、エクソソームを含む培養液を得た。この培養液を２，０００Ｇで１０分間遠心することにより沈殿を除去した後、１１０，０００Ｇで７０分間遠心することにより沈殿させ、エクソソーム画分を回収した。回収したエクソソーム画分はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に懸濁後、４℃で保管した。なお、保管サンプルは、使用前に軽くボルテックスミキサー（振とうミキサー）により懸濁してから使用した。
　溶液中のエクソソームの個数は、ナノ粒子解析装置（ＮａｎｏＳｉｇｈｔ　ＬＭ１０；ＮａｎｏＳｉｇｈｔ社製）を用いて、装置添付のプロトコルに従い解析した。
（ヒト前立腺がん細胞由来のエクソソーム画分）
　ヒト前立腺がん由来の細胞株ＰＣ３ＭＬ（国立がん研究センターより供試）の細胞懸濁液を、１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ　１６４０培地（サーモフィッシャーサイエンテイフィック社製）を入れたディッシュに播種した。次いで、ＣＯ２インキュベーターを用いてＣＯ２濃度が５体積％となるように設定した条件下、３７℃で上記細胞株を増殖させた後、Ａｄｖａｎｃｅｄ　ＲＰＭＩ１６４０培地（サーモフィッシャーサイエンテイフィック社製）に交換した。その後、４８時間培養し、エクソソームを含む培養液を得た。この培養液を２，０００Ｇで１０分間遠心することにより沈殿を除去した後、１１０，０００Ｇ７０分間で遠心することにより沈殿させ、エクソソーム画分を回収した。回収したエクソソーム画分はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に懸濁後、４℃で保管した。なお、保管サンプルは、使用前に軽くボルテックスミキサー（振とうミキサー）により懸濁してから使用した。
　溶液中のエクソソームの個数は、ナノ粒子解析装置（ＮａｎｏＳｉｇｈｔ　ＬＭ１０；ＮａｎｏＳｉｇｈｔ社製）を用いて、装置添付のプロトコルに従い解析した。
（正常ヒト血清由来のエクソソーム画分）
　Ｐｏｏｌｅｄ　Ｈｕｍａｎ　Ｓｅｒｕｍ（コスモバイオ社製）を２，０００Ｇで１０分間遠心した後、油層と沈殿とを除去した。その後、１１０，０００Ｇで７０分間遠心することにより沈殿させ、エクソソーム画分を回収した。回収したエクソソーム画分はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に懸濁後、４℃で保管した。なお、保管サンプルは、使用前に軽くボルテックスミキサー（振とうミキサーにより懸濁してから使用した。
　溶液中のエクソソームの個数は、ナノ粒子解析装置（ＮａｎｏＳｉｇｈｔ　ＬＭ１０；ＮａｎｏＳｉｇｈｔ社製）を用いて、装置添付のプロトコルに従い解析した。
＜マイクロＲＮＡの定量方法（リアルタイムＰＣＲ法）＞
　反応液中のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ－２１もしくはｍｉＲ－１６）は、逆転写プライマー（サーモフィッシャーサイエンテイフィック社製、Ｔａｑｍａｎ　ｍｉｃｒｏＲＮＡ　Ａｓｓａｙｓ，ＲＴプライマー，ｈｓａ－ｍｉｒ－２１もしくはｈｓａ－ｍｉｒ－１６）および逆転写酵素（サーモフィッシャーサイエンテイフィック社製、Ｔａｑｍａｎ　ｍｉｃｒｏＲＮＡ　ＲＴ　ｋｉｔ）を用いて、逆転写ＰＣＲを行った。
　上述した方法で得られた逆転写ＰＣＲ溶液を、Ｔａｑｍａｎ　Ａｓｓａｙ　プライマー（サーモフィッシャーサイエンテイフィック社製、Ｔａｑｍａｎ　ｍｉｃｒｏＲＮＡ　Ａｓｓａｙｓ，Ｔａｑｍａｎ　Ａｓｓａｙ　プライマー，ｈｓａ－ｍｉｒ－２１もしくはｈｓａ－ｍｉｒ－１６）およびリアルタイムＰＣＲ用マスターミックス（サーモフィッシャーサイエンテイフィック社製、ＴａｑＭａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ　ＩＩ, ｗ／ＵＮＧ）を用いて、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ リアルタイムＰＣＲシステムにより、マイクロＲＮＡの検量線上のサイクル数の比較により、ｍｉＲ－２１もしくはｍｉＲ－１６を定量した。マイクロＲＮＡの検量線は、合成ｍｉＲ－２１（シグマアルドリッチ社製）もしくは合成ｍｉＲ－１６（シグマアルドリッチ社製）を利用して作成した。
＜マガイニン２を用いたエクソソームの破壊＞
（実施例１）
　まず、１．３６×１０１１ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍＬ相当のヒト乳がん細胞由来の細胞株ＭＭ２３１－ｌｕｃ－Ｄ３Ｈ２ＬＮ株から調製したエクソソーム画分Ａのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液、および２００μＭマガイニン２のＰＢＳ溶液を準備した。次いで、１０μＬのヒト乳がん細胞由来のエクソソーム溶液、５０μＬのマガイニン２溶液、および４０μＬのＰＢＳを混合して、１．３６×１０１０ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍＬのヒト乳がん細胞由来のエクソソームおよび１００μＭのマガイニン２を含むＰＢＳを１００μＬ調製し、２５℃で２４時間静置することによりインキュベートした。サンプルは４℃で保管した。
（比較例１）
　まず、１．３６×１０１１ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍＬ相当のヒト乳がん細胞由来の細胞株ＭＭ２３１－ｌｕｃ－Ｄ３Ｈ２ＬＮ株から調製したエクソソーム画分Ａのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液を準備した。それから、１０μＬのヒト乳がん細胞由来のエクソソーム溶液、および９０μＬのＰＢＳを混合して、１．３６×１０１０ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍＬのヒト乳がん細胞由来のエクソソームを含むＰＢＳを１００μＬ調製し、２５℃で２４時間静置することによりインキュベートした。サンプルは４℃で保管した。
　上記インキュベート後の溶液について、軽くボルテックスミキサー（振とうミキサー）を用いて懸濁した後、ナノ粒子解析装置（ナノサイト社製、ＮａｎｏＳｉｇｈｔ　ＬＭ１０）を用いて当該溶液中に含まれるエクソソームの個数を測定した。実施例１の溶液は、抗菌ペプチド（マガイニン２）とエクソソームとを共存させたことにより、当該溶液中のエクソソームの個数が、１．８９×１０９ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍＬまで減少していた。一方、比較例においては１．３６×１０１０ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍＬだった。
＜マガイニン２のヒト乳がん細胞由来のエクソソームに対する選択性＞
（実施例２）
　がんにはかかっていない健常なヒトから採取した末梢血試料（以下、ヒト末梢血試料ともいう。）に対して、ヒト乳がん細胞由来の細胞株ＭＭ２３１－ｌｕｃ－Ｄ３Ｈ２ＬＮ株から調製したエクソソーム画分Ａを、実際のがん患者のエクソソーム濃度となるよう添加し、模擬的にがん患者のヒト末梢血試料を作製する。なお、上記ヒト末梢血試料は、例えば、特開２０１３―１９８４８３号公報に記載されている方法と同様、ヘルシンキ宣言に従って、患者にインフォームドコンセントを実施して入手する。抗凝固剤入りの採血管を利用して採血する。
　次いで、１１０，０００Ｇで超遠心することによりペレット化したヒト乳癌細胞由来のエクソソームおよびマガイニン２をヒト末梢血試料に懸濁し、上記ヒト乳癌細胞由来のエクソソームおよびマガイニン２の含有量が、それぞれ、１．４×１０１０ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍＬのヒト乳癌細胞由来のエクソソームおよび１００μＭのマガイニン２となるようヒト末梢血試料を１００μＬ調製し、２５℃で２４時間静置することによりインキュベートする。
（比較例２）
　１１０，０００Ｇで超遠心することによりペレット化したヒト乳がん細胞由来のエクソソーム、およびフェノールをヒト末梢血試料に懸濁し、上記ヒト乳がん細胞由来のエクソソームおよびフェノールの含有量が、それぞれ１．４×１０１０ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍＬのヒト乳がん細胞由来のエクソソームおよび８％のフェノールとなるようにヒト末梢血試料を１００μＬ調製し、２５℃で２４時間静置することによりインキュベートする。
（比較例３）
　１１０，０００Ｇで超遠心することによりペレット化したヒト乳がん細胞由来のエクソソームをヒト末梢血試料に懸濁し、上記ヒト乳がん細胞由来のエクソソームの含有量が、１．４×１０１０ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍＬとなるようにヒト末梢血試料を１００μＬ調製し、２５℃で２４時間静置することによりインキュベートする。
　上記インキュベート後の溶液の一部について、Ｅｘｏ－Ｆｌｏｗ３２　ＣＤ９　ＩＰ　Ｋｉｔ（ＳＢＩ社製）でエクソソームを精製した後、ナノ粒子解析装置（ナノサイト社製、ＮａｎｏＳｉｇｈｔ　ＬＭ１０）を用いて当該溶液中に含まれるエクソソームの個数を測定する。実施例２および比較例２は、比較例３と比べてエクソソーム量が減少する。また、上記インキュベート後の溶液の一部について、血清成分のタンパク電気泳動を実施する。実施例２および比較例３においては、比較例２と比べてアルブミン成分（分子量６万～７万）とグロブリン成分（分子量約１６万）の減少は無い。
＜ナイシンＡ、ラクトフェリシンおよびＬＬ－３７を用いたエクソソームの破壊＞
（実施例３）
　まず、１．３６×１０１１ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍＬ相当のヒト乳がん細胞由来のエクソソーム画分Ａのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液、および１００μＭナイシンＡのＰＢＳ溶液、を準備した。それから、１０μＬのヒト乳がん細胞由来のエクソソーム溶液、５０μＬのナイシンＡ溶液、および４０μＬのＰＢＳを混合して、１．３６×１０１０ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍＬのヒト乳がん細胞由来のエクソソーム、および５０μＭのナイシンＡを含むＰＢＳとなるように、エクソソーム画分１００μＬを調製し、２５℃で４８時間静置することによりインキュベートした。サンプルは４℃で保管した。上記インキュベート後の溶液について、軽く振とうミキサーを用いて懸濁した後、ナノ粒子解析装置（ナノサイト社製、ＮａｎｏＳｉｇｈｔ　ＬＭ１０）を用いて当該溶液中に含まれるエクソソームの個数を測定した。
（実施例４）
　まず、１．３６×１０１１ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍＬ相当のヒト乳がん細胞由来のエクソソーム画分Ａのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液、および１００μＭラクトフェリシンのＰＢＳ溶液、を準備した。それから、１０μＬのヒト乳がん細胞由来のエクソソーム溶液、５０μＬのラクトフェリシン溶液、および４０μＬのＰＢＳを混合して、１．３６×１０１０ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍＬのヒト乳がん細胞由来のエクソソーム、および５０μＭのラクトフェリシンを含むＰＢＳとなるように、エクソソーム画分１００μＬを調製し、２５℃で４８時間静置することによりインキュベートした。サンプルは４℃で保管した。上記インキュベート後の溶液について、軽く振とうミキサーを用いて懸濁した後、ナノ粒子解析装置（ナノサイト社製、ＮａｎｏＳｉｇｈｔ　ＬＭ１０）を用いて当該溶液中に含まれるエクソソームの個数を測定した。
（実施例５）
　まず、１．３６×１０１１ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍＬ相当のヒト乳がん細胞由来のエクソソーム画分Ａのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液、および１００μＭのＬＬ－３７のＰＢＳ溶液を準備した。それから、１０μＬのヒト乳がん細胞由来のエクソソーム溶液、５０μＬのＬＬ－３７溶液、および４０μＬのＰＢＳを混合して、１．３６×１０１０ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍＬのヒト乳がん細胞由来のエクソソーム、および５０μＭのＬＬ－３７を含むＰＢＳを１００μＬ調製し、２５℃で４８時間静置することによりインキュベートした。サンプルは４℃で保管した。上記インキュベート後の溶液について、振とうミキサーを用いて懸濁した後、ナノ粒子解析装置（ナノサイト社製、ＮａｎｏＳｉｇｈｔ　ＬＭ１０）を用いて当該溶液中に含まれるエクソソームの個数を測定した。
（比較例４）
　まず、１．３６×１０１１ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍＬ相当のヒト乳がん細胞由来のエクソソーム画分Ａのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液を準備した。それから、１０μＬのヒト乳がん細胞由来のエクソソーム溶液、および９０μＬのＰＢＳを混合して、１．３６×１０１０ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍＬのヒト乳がん細胞由来のエクソソームを含むＰＢＳを１００μＬ調製し、２５℃で４８時間静置することによりインキュベートした。サンプルは４℃で保管した。上記インキュベート後の溶液について、振とうミキサーを用いて懸濁した後、ナノ粒子解析装置（ナノサイト社製、ＮａｎｏＳｉｇｈｔ　ＬＭ１０）を用いて当該溶液中に含まれるエクソソームの個数を測定した。
　実施例３の溶液を、比較例４の溶液と対比した結果、実施例３は、抗菌ペプチドとエクソソームとを共存させたことにより、当該溶液中のエクソソームの個数が、４．５１×１０９ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍＬにまで減少していた。同様に、実施例４の溶液は、比較例４の溶液と対比した結果、当該溶液中のエクソソームの個数が、７．４７×１０９ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍＬまで減少していた。実施例５の溶液は、比較例４の溶液と対比した結果、当該溶液中のエクソソームの個数が、１．０９×１０９ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍＬまで減少していた。
＜担体への担持によるエクソソームの破壊＞
（実施例６）
　マガイニン２を５００μｇ／ｍＬの濃度で含有するＰＢＳ溶液を準備する。次いで、１００ｍｇのＥｐｏｘｙ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　６Ｂ担体（ＧＥヘルスケア社製）に、１００μＬの上記マガイニン２溶液を接触させ、室温で２４時間反応させる。担体をＰＢＳで３回洗浄後、１００μＬの１Ｍエタノールアミン（ｐＨ８．０）を添加し、４０℃で４時間反応させる。その後、担体をＰＢＳで３回洗浄し、マガイニン２担持Ｅｐｏｘｙ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　６Ｂとする。　次に、９．９２×１０１０ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍＬ相当のヒト乳がん細胞由来のエクソソーム画分Ａのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液を準備する。１０μＬのヒト乳がん細胞由来のエクソソームおよび９０μＬのＰＢＳを混合して、９．９２×１０９ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍＬヒト乳がん細胞由来のエクソソームを含むＰＢＳを１００μＬ調製する。次いで、このエクソソーム画分を、上記マガイニン２担持Ｅｐｏｘｙ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　６Ｂ担体に接触させ、その後、２５℃で２４時間静置することによりインキュベートする。得られる溶出液においてエクソソームの個数が５．６８×１０９　ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍＬへと減少する。
（実施例７）
　まず、１×１０１１ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍＬヒト乳がん細胞由来エクソソーム画分Ａのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液を準備する。それから、１０μＬのヒト乳がん細胞由来のエクソソームおよび９０μＬのＰＢＳを混合して、１×１０１０　ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍＬヒト乳がん細胞由来のエクソソームを含むＰＢＳを１００μＬ調製する。次いで、エクソソーム画分１００μＬを、マガイニン２および抗ヒトＣＤ９抗体（フナコシ社製、ＰＲＯ－４８５）を担持したＥｐｏｘｙ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　６Ｂ担体に接触させ、その後、２５℃で２４時間インキュベートする。得られる溶出液においてエクソソームの個数が減少する。
（実施例８）
　１×１０１０ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍＬヒト乳がん細胞由来のエクソソーム画分Ａを含むヒト血液試料を準備する。次いで、ヒト血液試料１００μＬを、マガイニン２および抗ヒトＣＤ９抗体（フナコシ社製、ＰＲＯ－４８５）を担持したＥｐｏｘｙ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　６Ｂ担体（ＧＥヘルスケア社製）に接触させ、その後、２５℃で２４時間インキュベートする。得られる溶出液においてエクソソームの個数が、減少する。
（実施例９）
　まず、１×１０１１ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍＬヒト乳がん細胞由来エクソソーム画分Ａのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液を準備する。それから、１０μＬのヒト乳がん細胞由来のエクソソームおよび９０μＬのＰＢＳを混合して、１×１０１０ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍＬヒト乳がん細胞由来のエクソソームを含むＰＢＳを１００μＬ調製する。次いで、ヒト血液試料１００μＬを、マガイニン２担持Ｅｐｏｘｙ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　６Ｂ担体と、抗ヒトＣＤ９抗体（フナコシ社製、ＰＲＯ－４８５）を担持したＥｐｏｘｙ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　６Ｂ担体（ＧＥヘルスケア社製）に接触させ、その後、２５℃で２４時間インキュベートする。得られる溶出液においてエクソソームの個数が、減少する。
（参考例）
＜ＲＮａｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒの添加有無がマイクロＲＮＡの安定性に及ぼす影響＞
　１×１０１０ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍＬのヒト乳がん細胞由来のエクソソーム画分Ｂ、１×１０－１３ＭのｍｉＲ－２１（シグマアルドリッチ社製）、および０．４Ｕ／μＬのＲＮａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｔｏｙｏｂｏ社製）を含むＰＢＳとなるように、エクソソーム画分１０μＬを調製し、３７℃で２４時間静置することによりインキュベートした。
（比較例５）
　１×１０１０ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍＬのヒト乳がん細胞由来のエクソソーム画分Ｂ、および１×１０－１３ＭのｍｉＲ－２１（シグマアルドリッチ社製）を含むＰＢＳとなるように、エクソソーム画分１０μＬを調製し、３７℃で２４時間静置することによりインキュベートした。
　上記参考例および比較例５のマイクロＲＮＡ量を前述のリアルタイムＰＣＲ法で定量したところ、ＲＮａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒを含む参考例においては、マイクロＲＮＡの濃度に減少は見られなかったが、比較例５ではマイクロＲＮＡの濃度が６×１０－１５Ｍに減少した。
＜ヒト乳がん細胞由来のエクソソームからのマイクロＲＮＡ抽出＞
（実施例１０）
　１×１０１１ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍＬのヒト乳がん細胞由来のエクソソーム画分Ｂと、１００μＭに調整した下記表２に示す各種抗菌ペプチドと、０．４Ｕ／μＬのＲＮａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｔｏｙｏｂｏ社製）とを含むＰＢＳとなるように、エクソソーム画分１０μＬを調製し、３７℃で２４時間静置することによりインキュベートした。
　（比較例６）
　１×１０１１ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍＬのヒト乳がん細胞由来のエクソソーム画分Ｂと、０．４Ｕ／μＬのＲＮａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｔｏｙｏｂｏ社製）とを含むＰＢＳとなるように、エクソソーム画分１０μＬを調製し、３７℃で２４時間静置することによりインキュベートした。
　上記実施例１０および上記比較例６のインキュベート後の溶液から、以下の方法で該溶液中に溶出したマイクロＲＮＡを精製、回収した。
　まず、１６０μＬのＰＢＳを反応液に添加した後、遠心式フィルター（ミリポア社製、アミコンウルトラ０．５ｍＬ、１００Ｋ フィルター）上に添加して１４，０００Ｇで２分間遠心した。次に、遠心後のろ液から１００μＬを回収し、１．５ｍＬチューブ内に導入した。次いで、１．５ｍＬチューブ内に３５０μＬのＲＬＴ　ｂｕｆｆｅｒ（キアゲン社製、ＲＮｅａｓｙ　ｍｉｎｉ　ｋｉｔ添付）と６７５μＬのエタノールとを添加し混合した。得られた混合液を、２回に分けて、スピンカラム（キアゲン社製、ＲＮｅａｓｙ　ｍｉｎｉ　ｋｉｔ添付）上に添加し、８，０００Ｇで１５秒遠心して、かかる混合液の全量をスピンカラムに通した。その後、スピンカラムに、５００μＬのＲＰＥ　ｂｕｆｆｅｒ（キアゲン社製、ＲＮｅａｓｙ　ｍｉｎｉ　ｋｉｔ添付）を添加し、８，０００Ｇで１５秒遠心した。さらに、もう一度、上記スピンカラムに、５００μＬのＲＰＥ　ｂｕｆｆｅｒを添加して、８，０００Ｇで１５秒遠心した。その後、スピンカラムを、１４，０００Ｇで１分間遠心することで残存するＲＰＥ　ｂｕｆｆｅｒを除去した。次に、スピンカラムに３０μＬのＲＮａｓｅ　ｆｒｅｅ　ｗａｔｅｒ（キアゲン社製、ＲＮｅａｓｙ　ｍｉｎｉ　ｋｉｔ添付）を添加して、１分間放置後、１４，０００Ｇで１分間遠心して得られた溶出液を回収した。
　上述した方法で回収した溶出液中に含まれるマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ－２１）の量を、上述したリアルタイムＰＣＲ法で定量した。その結果、エクソソームを抗菌ペプチドで処理することにより、いくつかのペプチドでマイクロＲＮＡの抽出が確認された。また、リアルタイムＰＣＲ法によるマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ－２１）濃度の定量結果に基づき、使用した抗菌ペプチドの破壊活性を、以下の基準で評価した。その結果を下記表２に示す。なお、抗菌ペプチドを用いることなくインキュベートした比較例６の溶液を上述した方法で処理し、得られた溶出液中に含まれるマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ－２１）の量を定量した所、該溶出液中に含まれるマイクロＲＮＡ濃度は、８×１０－１４Ｍであった。
◎：マイクロＲＮＡ濃度が５０×１０－１４Ｍ以上である。
○：マイクロＲＮＡ濃度が１０×１０－１４Ｍ～５０×１０－１４Ｍである。
×：マイクロＲＮＡ濃度が１０×１０－１４Ｍ未満である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
＜前立腺がん細胞由来エクソソームからのマイクロＲＮＡ抽出＞
（実施例１１）
　１×１０１１ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍＬのヒト前立腺がん細胞（ＰＣ３ＭＬ）由来のエクソソームと、１００μＭに調整した下記表３に示す各種抗菌ペプチドと、０．４Ｕ／μＬのＲＮａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｔｏｙｏｂｏ社製）とを含むＰＢＳとなるように、エクソソーム画分１０μＬを調製し、３７℃で２４時間静置することによりインキュベートした。
（比較例７）
　１×１０１１ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍＬのヒト前立腺がん細胞（ＰＣ３ＭＬ）由来のエクソソームと、０．４Ｕ／μＬのＲＮａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｔｏｙｏｂｏ社製）とを含むＰＢＳとなるように、エクソソーム画分１０μＬを調製し、３７℃で２４時間静置することによりインキュベートした。
　上記実施例１１および上記比較例７のインキュベート後の溶液から、上述した実施例１０および上記比較例６のインキュベート後の溶液から抽出した方法と同様の方法により、溶出したマイクロＲＮＡを精製、回収した。
　次に、回収した溶出液中に含まれるマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ－２１）の量を、上述したリアルタイムＰＣＲ法で定量した。その結果、エクソソームを抗菌ペプチドで処理することにより、いくつかのペプチドでマイクロＲＮＡの抽出が確認された。また、リアルタイムＰＣＲ法によるマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ－２１）濃度の定量結果に基づき、使用した抗菌ペプチドの破壊活性を、以下の基準で評価した。その結果を下記表３に示す。なお、抗菌ペプチドを用いることなくインキュベートした比較例７の溶液を上述した方法で処理し、得られた溶出液中に含まれるマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ－２１）の量を定量した所、該溶出液中に含まれるマイクロＲＮＡ濃度は、３×１０－１４Ｍであった。
◎：マイクロＲＮＡ濃度が１０×１０－１４Ｍ以上である。
○：マイクロＲＮＡ濃度が５×１０－１４Ｍ～１０×１０－１４Ｍである。
×：マイクロＲＮＡ濃度が５×１０－１４Ｍ未満である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
＜各種抗菌ペプチドのヒト乳がん細胞由来エクソソームに対する選択性＞
（実施例１２）
　１×１０１１ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍＬのヒト乳がん細胞由来のエクソソーム画分Ｂと、１００μＭに調整した下記表４に示す各種抗菌ペプチドと、０．４Ｕ／μＬのＲＮａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｔｏｙｏｂｏ社製）とを含むＰＢＳとなるように、エクソソーム画分１０μＬを調製し、３７℃で２４時間静置することによりインキュベートした。
　その後、インキュベート後の溶液から、上述した実施例１０、１１および上記比較例６、７のインキュベート後の溶液から抽出した方法と同様の方法により、溶出したマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ－１６）を精製、回収した。
　また、１×１０１１ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍＬのヒト乳腺細胞（ＭＣＦ－１０Ａ、正常細胞）由来のエクソソーム画分と、１００μＭに調整した下記表４に示す各種抗菌ペプチドと、０．４Ｕ／μＬのＲＮａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｔｏｙｏｂｏ社製）とを含むＰＢＳとなるように、エクソソーム画分１０μＬを調製し、３７℃で２４時間静置することによりインキュベートした。
　その後、インキュベート後の溶液から、上述した実施例１０、１１および上記比較例６、７のインキュベート後の溶液から抽出した方法と同様の方法により、溶出したマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ－１６）を精製、回収した。
（比較例８）
　１×１０１１ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍＬのヒト乳がん細胞由来のエクソソーム画分Ｂと、０．４Ｕ／μＬのＲＮａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｔｏｙｏｂｏ社製）とを含むＰＢＳとなるように、エクソソーム画分１０μＬを調製し、３７℃で２４時間静置することによりインキュベートした。
　その後、インキュベート後の溶液から、上述した実施例１０、１１および上記比較例６、７のインキュベート後の溶液から抽出した方法と同様の方法により、溶出したマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ－１６）を精製、回収した。
　また、１×１０１１ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍＬのヒト乳腺細胞（ＭＣＦ－１０Ａ、正常細胞）由来のエクソソーム画分と、０．４Ｕ／μＬのＲＮａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｔｏｙｏｂｏ社製）とを含むＰＢＳとなるように、エクソソーム画分１０μＬを調製し、３７℃で２４時間静置することによりインキュベートした。
　その後、インキュベート後の溶液から、上述した実施例１０、１１および上記比較例６、７のインキュベート後の溶液から抽出した方法と同様の方法により、溶出したマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ－１６）を精製、回収した。
　次に、回収した各溶出液中に含まれるマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ－１６）の量を、上述したリアルタイムＰＣＲ法で定量した。次に、得られた定量結果から、下記式１にて、使用した抗菌ペプチドごとのｍｉＲ－１６比を算出した。また、実施例１２で使用した抗菌ペプチドの選択性は、算出したｍｉＲ－１６の値が、比較例８のｍｉＲ－１６比よりも高い場合を○と評価した。その結果を、下記表４に示す。
式１：ｍｉＲ－１６比＝｛（ヒト乳がん細胞由来のエクソソームを含む実施例１２の各インキュベート溶液から回収した溶出液中に含まれるマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ－１６）の定量値）－（ヒト乳がん細胞由来のエクソソームを含む比較例８のインキュベート溶液から回収した溶出液中に含まれるマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ－１６）の定量値）｝÷｛（正常細胞由来のエクソソームを含む実施例１２の各インキュベート溶液から回収した溶出液中に含まれるマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ－１６）の定量値）－（正常細胞由来のエクソソームを含む比較例８のインキュベート溶液から回収した溶出液中に含まれるマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ－１６）の定量値）｝
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　上記表４からも分かるとおり、実施例１２にて使用した各抗菌ペプチドは、いずれも、ヒト乳がん細胞由来エクソソームを選択的に破壊できるものであった。
＜各種抗菌ペプチドのがん細胞に特異的な抗体に対する選択性の比較＞
（抗体の準備）
　ＥｐＣＡＭ－ｅｘｏｓｏｍｅ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ｒｅａｇｅｎｔ（サーモフィッシャーサイエンテイフィック社製）懸濁液４０μＬを１．５ｍLのチューブに分注し、かかる懸濁液をＭａｇｎｅｔｉｃ　Ｂｅａｄｓ　Ｓｅｐａｒａｔｏｒ　（サーモフィッシャーサイエンテイフィック社製）で分離した後、上清を除去することでペレットを回収した。このペレットに対して、０．５ｍＬのＰＢＳを添加して懸濁させ、得られた懸濁液をＭａｇｎｅｔｉｃ　Ｂｅａｄｓ　Ｓｅｐａｒａｔｏｒで分離した後、上清を除去することでペレットを回収した。次に、得られたペレットと、１０μＬの１．８×１０１１ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍＬの乳がん細胞由来エクソソーム（ＭＭ２３１－ｌｕｃ－Ｄ３Ｈ２ＬＮ）もしくは１．８×１０１１ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍＬのヒト正常血清由来エクソソームとを混合し、４℃で１８時間放置した。次いで、Ｍａｇｎｅｔｉｃ　Ｂｅａｄｓ　Ｓｅｐａｒａｔｏｒで混合液を分離した後、上清を除去することでペレットを回収した。その後、上記ペレットに対して１ｍＬのＰＢＡを添加して懸濁させたものをＭａｇｎｅｔｉｃ　Ｂｅａｄｓ　Ｓｅｐａｒａｔｏｒで分離し、上清を除去することでペレットを回収した。この１ｍＬのＰＢＳを添加して分離させる操作を、もう一度繰り返した。その後、得られたペレットに１０μＬのＰＢＳを添加して懸濁させることでエクソソームを吸着させた抗体サンプルを得た。
（実施例１３）
　１×１０１１ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍＬのヒト乳がん細胞由来のエクソソーム画分Ｂと、１００μＭに調整したマガイニン２と、０．４Ｕ／μＬのＲＮａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｔｏｙｏｂｏ社製）とを含むＰＢＳとなるように、エクソソーム画分１０μＬを調製し、３７℃で２４時間静置することによりインキュベートした。
　その後、インキュベート後の溶液から、上述した実施例１０～１２および上記比較例６～８のインキュベート後の溶液から抽出した方法と同様の方法により、溶出したマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ－１６）を精製、回収した。
　また、１×１０１１ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍＬの正常ヒト血清（正常細胞）由来のエクソソーム画分と、１００μＭに調整したマガイニン２と、０．４Ｕ／μＬのＲＮａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｔｏｙｏｂｏ社製）とを含むＰＢＳとなるように、エクソソーム画分１０μＬを調製し、３７℃で２４時間静置することによりインキュベートした。
　その後、インキュベート後の溶液から、上述した実施例１０～１２および上記比較例６～８のインキュベート後の溶液から抽出した方法と同様の方法により、溶出したマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ－１６）を精製、回収した。
（比較例９）
　上記ＥｐＣＡＭ－ｅｘｏｓｏｍｅ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ｒｅａｇｅｎｔにヒト乳がん細胞由来のエクソソーム画分Ｂを吸着させた抗体のエクソソーム画分１０μＬを調製し、ＲＮｅａｓｙ　ｋｉｔを用いて抽出処理を行い、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ－１６）を精製、回収した。
　具体的には１．５ｍＬチューブ内で、エクソソーム破壊用の界面活性剤組成物として３５０μＬのＲＬＴ　ｂｕｆｆｅｒ（キアゲン社製、ＲＮｅａｓｙ　ｍｉｎｉ　ｋｉｔ添付）および６７５μＬのエタノールと混合した。上記混合液を、２回に分けて、スピンカラム（キアゲン社製、ＲＮｅａｓｙ　ｍｉｎｉ　ｋｉｔ添付）上に添加し、８，０００Ｇで１５秒遠心して、上記混合液の全量をスピンカラムに通した。上記スピンカラムに、５００μＬのＲＰＥ　ｂｕｆｆｅｒ（キアゲン社製、ＲＮｅａｓｙ　ｍｉｎｉ　ｋｉｔ添付）を添加して、８，０００Ｇで１５秒遠心した。さらに、もう一度、上記スピンカラムに、５００μＬのＲＰＥ　ｂｕｆｆｅｒを添加して、８，０００Ｇで１５秒遠心した。上記スピンカラムを、１４，０００Ｇで１分間遠心して、残存するＲＰＥ　ｂｕｆｆｅｒを除去した。上記スピンカラムに、３０μＬのＲＮａｓｅ　ｆｒｅｅ　ｗａｔｅｒ（キアゲン社製、ＲＮｅａｓｙ　ｍｉｎｉ　ｋｉｔ添付）を添加して、１分間放置後、１４，０００Ｇで１分間遠心して、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ－１６）を含む溶出液を回収した。
　また、上記ＥｐＣＡＭ－ｅｘｏｓｏｍｅ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ｒｅａｇｅｎｔに正常ヒト血清（正常細胞）由来のエクソソームを吸着させた抗体のエクソソーム画分１０μＬを調製し、上述した方法と同様の方法で、ＲＮｅａｓｙ　ｋｉｔを用いて抽出処理を行い、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ－１６）を精製、回収した。
　その後、インキュベート後の溶液から、上述した実施例１０～１２および上記比較例６～８のインキュベート後の溶液から抽出した方法と同様の方法により、溶出したマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ－１６）を精製、回収した。
（比較例１０）
　１×１０１１ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍＬのヒト乳がん細胞由来のエクソソーム画分Ｂ１０μＬから、比較例９と同様の方法で、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ－１６）を含む溶液を精製、回収した。また、１×１０１１ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍＬの正常ヒト血清由来のエクソソーム画分１０μＬから、比較例９と同様の方法で、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ－１６）を含む溶液を精製、回収した。
（比較例１１）
　１×１０１１ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍＬのヒト乳がん細胞由来のエクソソーム画分Ｂと、０．４Ｕ／μＬのＲＮａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｔｏｙｏｂｏ社製）とを含むＰＢＳとなるように、エクソソーム画分１０μＬを調製し、３７℃で２４時間静置することによりインキュベートした。
　その後、インキュベート後の溶液から、上述した実施例１０～１２および上記比較例６～８のインキュベート後の溶液から抽出した方法と同様の方法により、溶出したマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ－１６）を精製、回収した。
　また、１×１０１１ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍＬの正常ヒト血清由来のエクソソーム画分と、０．４Ｕ／μＬのＲＮａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｔｏｙｏｂｏ社製）とを含むＰＢＳとなるように、エクソソーム画分１０μＬを調製し、３７℃で２４時間静置することによりインキュベートした。
　その後、インキュベート後の溶液から、上述した実施例１０～１２および上記比較例６～８のインキュベート後の溶液から抽出した方法と同様の方法により、溶出したマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ－１６）を精製、回収した。
　次に、回収した各溶出液中に含まれるマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ－１６）の量を、上述したリアルタイムＰＣＲ法で定量した。次に、得られた定量結果から、下記式にて、使用した抗菌ペプチドごとのｍｉＲ－１６比を算出した。その結果を、下記表５に示す。
式２：ｍｉＲ－１６比＝｛（ヒト乳がん細胞由来のエクソソームを含む実施例１３、比較例９または１０の各インキュベート溶液から回収した溶出液中に含まれるマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ－１６）の定量値）－（ヒト乳がん細胞由来のエクソソームを含む比較例１１のインキュベート溶液から回収した溶出液中に含まれるマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ－１６）の定量値）｝÷｛（正常細胞由来のエクソソームを含む実施例１３、比較例９または１０の各インキュベート溶液から回収した溶出液中に含まれるマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ－１６）の定量値）－（正常細胞由来のエクソソームを含む比較例１１のインキュベート溶液から回収した溶出液中に含まれるマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ－１６）の定量値）｝
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　上記表５からも分かるように、実施例１３の抗菌ペプチドを用いる方法は、比較例の抗菌ペプチドを用いない方法と比べて、ヒト乳がん細胞由来エクソソームを選択的に破壊できるものであった。
　この出願は、２０１５年３月１２日に出願された日本出願特願２０１５－０４９１３６号を基礎とする優先権を主張し、その開示の全てをここに取り込む。

Claims (9)

  1. 　抗菌ペプチドを準備する工程と、
    　前記抗菌ペプチドと、エクソソームとを共存させることにより、前記エクソソームを破壊する工程と、
    　を有するエクソソームの破壊方法。
  2. 　前記エクソソームが、がん細胞由来のエクソソームである請求項１に記載のエクソソームの破壊方法。
  3. 　前記エクソソームが、がん細胞由来のエクソソームと正常細胞由来のエクソソームとの混合物であり、
    　前記エクソソームを破壊する工程において、前記がん細胞由来のエクソソームを選択的に破壊する、請求項１に記載のエクソソームの破壊方法。
  4. 　前記抗菌ペプチドが、下記（１）または（２）の条件を満たすペプチドである、請求項１乃至３のいずれか一項に記載のエクソソームの破壊方法。
    （１）鎖長が１０以上５０未満であり、Ｎｅｔ　Ｃｈａｒｇｅが０より大きく１５未満であり、かつ疎水性残基割合が２５％以上６５％未満である（ただし、Ｓ－Ｓ結合を３以上含み、かつ、前記抗菌ペプチドを構成する全アミノ酸中にリジン残基およびバリン残基のいずれか一方を含むものを除く）。
    （２）鎖長が２以上１０未満であり、Ｎｅｔ　Ｃｈａｒｇｅが０以下であり、かつ疎水性残基割合が２５％未満であるとともに、下記（２－１）または（２－２）の条件を満たす。
    （２－１）前記抗菌ペプチドを構成する全アミノ酸中にヒスチジン残基を３以上含み、かつ、トリプトファン残基及びバリン残基を含まない。
    （２－２）前記抗菌ペプチドを構成する全アミノ酸中にアルギニン残基を１以上含み、フェニルアラニン残基、トリプトファン残基およびバリン残基を含まない。
  5. 　前記抗菌ペプチドが、下記条件を満たすペプチドである、請求項４に記載のエクソソームの破壊方法。
    （条件）鎖長が２０以上４０未満であり、Ｎｅｔ　Ｃｈａｒｇｅが１以上１０未満であり、かつ疎水性残基割合が２５％以上６５％未満である（ただし、Ｓ－Ｓ結合を３以上含み、かつ、前記抗菌ペプチドを構成する全アミノ酸中にリジン残基およびバリン残基のいずれか一方を含むものを除く）。
  6. 　抗菌ペプチドを含んでおり、かつ前記抗菌ペプチドが下記（１）または（２）の条件を満たすペプチドである、がん細胞由来のエクソソームの破壊キット。
    （１）鎖長が１０以上５０未満であり、Ｎｅｔ　Ｃｈａｒｇｅが０より大きく１５未満であり、かつ疎水性残基割合が２５％以上６５％未満である（ただし、Ｓ－Ｓ結合を３以上含み、かつ、前記抗菌ペプチドを構成する全アミノ酸中にリジン残基およびバリン残基のいずれか一方を含むものを除く）。
    （２）鎖長が２以上１０未満であり、Ｎｅｔ　Ｃｈａｒｇｅが０以下であり、かつ疎水性残基割合が２５％未満であるとともに、下記（２－１）または（２－２）の条件を満たす。
    （２－１）前記抗菌ペプチドを構成する全アミノ酸中にヒスチジン残基を３以上含み、かつ、トリプトファン残基及びバリン残基を含まない。
    （２－２）前記抗菌ペプチドを構成する全アミノ酸中にアルギニン残基を１以上含み、フェニルアラニン残基、トリプトファン残基およびバリン残基を含まない。
  7. 　ＲＮａｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒをさらに含む、請求項６に記載のがん細胞由来のエクソソームの破壊キット。
  8. 　下記（１）または（２）の条件を満たす抗菌ペプチドと、エクソソームとを共存させる工程を含み、
    　前記エクソソームが、がん細胞由来のエクソソームと正常細胞由来のエクソソームとの混合物である、正常細胞由来のエクソソームの分離方法。
    （１）鎖長が１０以上５０未満であり、Ｎｅｔ　Ｃｈａｒｇｅが０より大きく１５未満であり、かつ疎水性残基割合が２５％以上６５％未満である（ただし、Ｓ－Ｓ結合を３以上含み、かつ、前記抗菌ペプチドを構成する全アミノ酸中にリジン残基およびバリン残基のいずれか一方を含むものを除く）。
    （２）鎖長が２以上１０未満であり、Ｎｅｔ　Ｃｈａｒｇｅが０以下であり、かつ疎水性残基割合が２５％未満であるとともに、下記（２－１）または（２－２）の条件を満たす。
    （２－１）前記抗菌ペプチドを構成する全アミノ酸中にヒスチジン残基を３以上含み、かつ、トリプトファン残基及びバリン残基を含まない。
    （２－２）前記抗菌ペプチドを構成する全アミノ酸中にアルギニン残基を１以上含み、フェニルアラニン残基、トリプトファン残基およびバリン残基を含まない。
  9. 　前記共存させる工程が、前記がん細胞由来のエクソソームを破壊する工程を含み、
    　前記共存させる工程の後、前記がん細胞由来のエクソソームの破壊残渣を吸着除去する工程をさらに含む、請求項８に記載の正常細胞由来のエクソソームの分離方法。
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