JPWO2016143904A1 - エクソソームの破壊方法、エクソソームの破壊キットおよび正常細胞由来のエクソソームの分離方法 - Google Patents
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Abstract
Description
エクソソームは、細胞から分泌される細胞外顆粒の一種である。具体的には、エクソソームは、脂質二重膜からなるベシクル構造を有した細胞から放出される直径30nm〜100nm程度の小胞である。このエクソソームは、当該エクソソームを分泌した細胞(以下、分泌細胞ともいう。)とは異なる他の細胞に取り込まれることにより、分泌細胞と上記他の細胞との間で情報伝達を行うことが知られている(非特許文献1および2)。
エクソソームの膜構造は、一般に、細胞の膜構造と比べて安定であることが知られている。例えば、非特許文献3には、−20℃の温度条件下、糖類等の安定化剤を添加することなくエクソソームを4回凍結融解処理した場合においても、該エクソソーム中の内包物が安定的に維持されたことを示す実験結果が記載されている。一方、動物細胞と称される細胞は、一般に、上述した安定化剤を用いない限り、凍結融解処理に耐えきれないことが知られている。このことから、エクソソームは、動物細胞と比べて、安定な膜構造を有しているものと推察される。
近年、エクソソームと各種疾患との間に相関関係があることについて、種々の報告がなされている。特に、がん細胞が放出するエクソソームに着目し、がんという特定の疾患に対して上記エクソソームが及ぼす影響について、様々な研究結果が報告されている。たとえば、がん細胞が放出するエクソソーム中に含まれている血管新生を誘導する因子が健常な血管内皮細胞に取り込まれた場合、上記血管新生を誘導する因子によりがん組織周辺の血管新生が誘導され、がん転移や湿潤を進行させる可能性について報告されている(非特許文献4〜6)。
エクソソームの分離回収(捕集)・除去方法に着目した技術として、たとえば、以下のものがある。
ヒトの体液(血液、唾液、尿、等)や細胞培養液からエクソソームを回収するための方法としては、非特許文献8等に記載されている超遠心法が、2015年時点で最も一般的に使用される手法である。たとえば、細胞培養上清や体液からエクソソームの回収を行う場合、フィルターなどで細胞片などの大きな夾雑物を除去した後、4℃、100,000Gの条件で70分間超遠心を行うことにより所望のエクソソームを回収することができる。また、非特許文献8には、PEGなどの共沈剤を利用して、細胞培養上清や体液中にエクソソームを沈殿させることにより回収する方法も記載されている(非特許文献8)。
しかしながら、上記背景技術の項で述べた各種従来技術は、いずれも、上述したシステムを実現するために必要な要求水準を満たすものではなかった。具体的には、本発明者らは、上記背景技術の項で述べた各種従来技術について、以下のような課題があることを見出した。
また、非特許文献9および10に記載された方法は、将来的に当該方法をがん転移等の疾患治療に応用することを想定した場合、細胞膜の処理に利用する有機化合物が生体内において非特異的に作用してしまう蓋然性が高い。特に、フェノールという物質は、他の化合物と比べて強力なタンパク質変性作用を有しているため、非特許文献10に記載の方法をがん転移等の疾患治療に応用する場合には、フェノールが生体内に存在するエクソソームとは異なる成分に対して及ぼす影響を排除する必要があると考えられる。このことから、非特許文献9および10に記載された方法を将来的にがん転移等の疾患治療に応用することは、実質的に不可能であるものと考えられる。こうした事情に鑑みて、近年においては、生体内において非特異的な作用を発現しにくい生体安全性を有した物質を用いるエクソソームの破壊除去方法の構築が求められている傾向にある。
また、エクソソームの種類によっては、その表面に抗原が存在する状態もまちまちであり、抗体の力価や特異性に結果が大きく左右されることも知られている。さらに、抗体を用いてエクソソームを捕集する手法は、その十分に洗浄することが困難であるため、精製度の高いエクソソームを回収するという点においても、改善の余地を有していた。
前記抗菌ペプチドと、エクソソームとを共存させることにより、前記エクソソームを破壊する工程と、
を有するエクソソームの破壊方法が提供される。
(1)鎖長が10以上50未満であり、Net Chargeが0より大きく15未満であり、かつ疎水性残基割合が25%以上65%未満である(ただし、S−S結合を3以上含み、かつ、前記抗菌ペプチドを構成する全アミノ酸中にリジン残基およびバリン残基のいずれか一方を含むものを除く)。
(2)鎖長が2以上10未満であり、Net Chargeが0以下であり、かつ疎水性残基割合が25%未満であるとともに、下記(2−1)または(2−2)の条件を満たすものである。
(2−1)前記抗菌ペプチドを構成する全アミノ酸中にヒスチジン残基を3以上含み、かつ、トリプトファン残基及びバリン残基を含まない。
(2−2)前記抗菌ペプチドを構成する全アミノ酸中にアルギニン残基を1以上含み、フェニルアラニン残基、トリプトファン残基およびバリン残基を含まない。
前記エクソソームが、がん細胞由来のエクソソームと正常細胞由来のエクソソームとの混合物である、正常細胞由来のエクソソームの分離方法が提供される。
(1)鎖長が10以上50未満であり、Net Chargeが0より大きく15未満であり、かつ疎水性残基割合が25%以上65%未満である(ただし、S−S結合を3以上含み、かつ、前記抗菌ペプチドを構成する全アミノ酸中にリジン残基およびバリン残基のいずれか一方を含むものを除く)。
(2)鎖長が2以上10未満であり、Net Chargeが0以下であり、かつ疎水性残基割合が25%未満であるとともに、下記(2−1)または(2−2)の条件を満たすものである。
(2−1)前記抗菌ペプチドを構成する全アミノ酸中にヒスチジン残基を3以上含み、かつ、トリプトファン残基及びバリン残基を含まない。
(2−2)前記抗菌ペプチドを構成する全アミノ酸中にアルギニン残基を1以上含み、フェニルアラニン残基、トリプトファン残基およびバリン残基を含まない。
また、本発明によれば、正常細胞由来のエクソソームと、がん細胞由来のエクソソームとが混在する体液試料から、がん細胞由来のエクソソームを選択的に破壊することも可能である。本発明に係る技術は、がん治療の分野において、将来的に、がん疾患に関わる新規バイオマーカーの選別、既存がんマーカーの効率的検出による検査・診断、さらには、透析技術にも応用することが有用であるものと考えられる。
まず、「抗菌ペプチド」とは、一般に、グラム陰性菌、グラム陽性菌、真菌、一部のウイルス等に対して、静菌作用もしくは殺菌作用を示すポリペプチドを意味する。一方、本実施形態に係るエクソソームの破壊方法(以下、本破壊方法ともいう。)における抗菌ペプチドは、エクソソームの破壊活性を有するものを指す。中でも、本破壊方法に使用可能な抗菌ペプチドとしては、がん細胞由来のエクソソームを選択的に破壊できるものが好ましい。
第1に、ペプチドのNet chargeが0未満であり、かつがん細胞の破壊能を有することが公知となっている抗がんペプチドであったとしても、がん細胞由来のエクソソームの破壊能が無い又は低い場合がある。
第2に、抗がん作用を示すことが公知となっているPR−39などの抗がんペプチドであったとしても、がん細胞由来のエクソソームの破壊能が無い又は低い場合がある。
第3に、がん細胞の細胞膜分解性を有することが公知となっているHepcidin TH2−3やA6K等の抗がんペプチドであったとしても、がん細胞由来のエクソソームの破壊能が無い又は低い場合がある。
このような事情を踏まえ、本発明者らは、抗菌ペプチドのがん細胞に対する作用機序と、がん細胞由来のエクソソームに対する作用機序との間には、相関性や類似性はなく、両者の作用機序は互いに相違しているものと推察した。
URL:http://aps.unmc.edu/AP/main.php
URL:http://defensins.bii.a-star.edu.sg/
URL:http://crdd.osdd.net/raghava/cancerppd/
URL:http://peptaibol.cryst.bbk.ac.uk/home.shtml
URL:http://www.cybase.org.au/
URL:http://bactibase.pfba-lab-tun.org/main.php
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URL:http://yadamp.unisa.it/
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URL:http://db-mml.sjtu.edu.cn/THIOBASE/
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URL:http://biotechlab.fudan.edu.cn/database/lamp/
URL:http://milkampdb.org/home.php
URL:http://dbaasp.org/home.xhtml
URL:http://www.baamps.it/
(1)鎖長が10以上50未満であり、Net Chargeが0より大きく15未満であり、かつ疎水性残基割合が25%以上65%未満である(ただし、S−S結合を3以上含み、かつ、抗菌ペプチドを構成する全アミノ酸中にリジン残基およびバリン残基のいずれか一方を含むものを除く)。
(2)鎖長が2以上10未満であり、Net Chargeが0以下であり、かつ疎水性残基割合が25%未満であるとともに、下記(2−1)または(2−2)の条件を満たすものである。
(2−1)抗菌ペプチドを構成する全アミノ酸中にヒスチジン残基を3以上含み、かつ、トリプトファン残基及びバリン残基を含まない。
(2−2記抗菌ペプチドを構成する全アミノ酸中にアルギニン残基を1以上含み、フェニルアラニン残基、トリプトファン残基およびバリン残基を含まない。
(条件)鎖長が20以上40未満であり、Net Chargeが1以上10未満であり、かつ疎水性残基割合が25%以上65%未満である(ただし、S−S結合を3以上含み、かつ、前記抗菌ペプチドを構成する全アミノ酸中にリジン残基およびバリン残基のいずれか一方を含むものを除く)。
本実施形態に係るエクソソームは、生物の細胞が放出する細胞外顆粒の一種であり、後期エンドソーム区画由来の直径30nm以上100nm以下程度の小型脂質小胞を指す。
また、エクソソームを含む生体材料としては、血液(成分分離したものを含む)、骨髄液、リンパ液、尿、便、唾液等の体液、細胞破砕物などが挙げられる。本実施形態においては、生体材料に応じて、常法に従って前処理を行い抽出したエクソソームであれば使用可能である。
本実施形態に係るエクソソームは、いかなる動物種由来のエクソソームであってもよい。エクソソームの具体例として、ヒト、マウス、ラット、サル、イヌ、ネコ、ウシ、ウマおよびトリ等の温血動物由来のエクソソームが挙げられる。
中でも、本実施形態に係るエクソソームはがん細胞の転移に関与する腫瘍細胞に由来するエクソソーム、すなわち、がん細胞から分泌されたがん細胞由来のエクソソームを含むことが好ましい。言い換えれば、本実施形態に係るエクソソームは、がん細胞から分泌されたがん細胞由来のエクソソームのみを含むものであってもよいし、上記がん細胞由来のエクソソームと正常細胞由来のエクソソームとの混合物であってもよいが、がん細胞由来のエクソソームを含むものであることが好ましい。また、本実施形態に係るエクソソームが、上記がん細胞由来のエクソソームと正常細胞由来のエクソソームとの混合物である場合、実施例にて後述するように、がん細胞由来のエクソソームを選択的に破壊できる。
そして、本実施形態に係るがん細胞由来のエクソソームを分泌するがん細胞の具体例としては、乳がん細胞、食道がん細胞、胃がん細胞、虫垂がん細胞、大腸がん細胞、子宮体がん細胞、子宮頚がん細胞、卵巣がん細胞、脳腫瘍細胞、肝がん細胞、胆嚢がん細胞、胆管がん細胞、膵臓がん細胞、副腎がん細胞、消化管間質腫瘍、中皮腫、喉頭がん細胞、口腔がん細胞(口腔底がん、歯肉がん、舌がん、頬粘膜がん、唾液腺がん)、副鼻腔がん細胞(上顎洞がん、前頭洞がん、篩骨洞がん、蝶型骨洞がん)、甲状腺がん細胞、腎臓がん細胞、肺がん細胞、骨肉腫、前立腺がん細胞、精巣腫瘍、腎細胞がん細胞、膀胱がん細胞、横紋筋肉腫、皮膚がん細胞、肛門がん細胞、白血病、リンパ腫 、ホジキン病、多発性骨髄腫等が挙げられる。
次に、エクソソームの各種抽出方法について説明する。
まず、超遠心分離機を用いてエクソソーム画分を抽出する方法について説明する。
細胞から直接エクソソーム画分を抽出する場合、たとえば、細胞培養液の上清を後述する方法で超遠心処理する以下の方法を用いれば、所望のエクソソーム画分を抽出することができる。ただし、遠心分離等の各種処理条件は、後述する条件に限定されるものではない。
まず、エクソソームを分泌する対象細胞培養液の上清を、室温、2,000Gというエクソソーム画分が沈殿しない条件で15分間の遠心分離を行った後、不溶性分を分離する。次に、得られた上清画分を、110,000Gで70分間遠心することによりエクソソームを沈殿させる。その後、上清画分を除去することで、所望のエクソソーム画分を回収することができる。
次に、ゲルろ過することによりエクソソーム画分を抽出する方法について説明する。
細胞培養液の上清からエクソソーム画分を抽出する場合、たとえば、ゲルろ過法を用いて処理する以下の方法で所望のエクソソーム画分を抽出することができる。ただし、遠心分離等の各種処理条件は、後述する条件に限定されるものではない。
まず、エクソソームを分泌する対象細胞培養液の上清を、室温、2,000Gというエクソソーム画分が沈殿しない条件で15分間の遠心分離を行うことにより、不溶性分を分離する。この不溶性分を除去した後、室温、12,000Gという1回目の遠心分離よりも速い速度であり、かつ、エクソソーム画分が沈殿しない条件で35分間の遠心分離を行うことにより上清画分と不純物分とを分離する。次いで、得られた上清画分を、ゲルろ過カラムに供して得られた溶出液について、260nmの吸光度を測定し、吸光度の高いフラクションを所望のエクソソーム画分として回収する。なお、ゲルろ過カラムは、担体を購入し自ら作製したものであってもよいし、Sephacryl S−400 HR(GEヘルスケアバイオサイエンス社製)等の市販品であってもよい。
次に、血液などの検体試料からエクソソーム画分を抽出する方法について説明する。
血液などの検体試料からエクソソーム画分を得る場合には、公知の方法に従い血漿成分又は血清を分離し、以降は細胞培養液上清からエクソソーム画分を抽出する場合に準じた方法にて抽出することができる。検体試料が尿、唾液、汗、髄液からエクソソーム画分を抽出する場合には、公知の方法に従い夾雑物を取り除いた後、以降は細胞培養液上清の場合に準じた方法にて抽出することができる。
次に、抗体を用いてエクソソーム画分を抽出する方法について説明する。
上記超遠心法の代替技術として、抗体免疫法が知られている。使用できる抗体は、血液中においてエクソソームの表層にのみ存在する物質を抗原として認識できるものであれば、特に制限はない。上記抗原の具体例としては、CD9、CD63、CD81等のテトラスパニンと呼ばれる膜4回貫通型タンパク質ファミリーに属するタンパク質や、Epithelial cell adhesion molecule(EpCAM)、human epidermal growth factor receptor type2(HER2)等のがん細胞由来のエクソソームに対して特異的なタンパクが挙げられる。その他、CD3、CD4、CD8、CD14、CD15、CD19、CD20、CD41、CD51、CD61、CD62e、CD66b、CD105、CD144、CD235a、Annexin V、Glycoprotein A、Valpha24/Vbeta11、などが挙げられる。これら抗体は、担体に担持された状態で使用されることが一般的である。
本実施形態に係るエクソソームの破壊方法は、抗菌ペプチドを準備する工程と、抗菌ペプチドと、エクソソームとを共存させることにより、エクソソームを破壊する工程と、を有する。かかる方法によれば、従来の方法と比べて、試料中におけるエクソソームを効率よく除去することが可能である。また、本方法は、生体外で実施されるものであり、かつ試料中におけるエクソソーム以外の成分に対して温和な条件にて、エクソソームの破壊を実施することができる技術である。かかる方法においては、抗菌ペプチドと、エクソソームとを共存させた後、所定の温度・時間でインキュベートすることが好ましい。また、本方法によれば、エクソソームの破壊処理について、その作業手順を簡便化することができる。
また、オキソバナジウム(IV)とリボヌクレオシドの錯体による安定化剤が利用されることもある(非特許文献16)。
本実施形態に係る抗菌ペプチドは、担体に固定化されたものであってもよい。抗菌ペプチドという殺菌作用を有する特定のペプチドは、当該ペプチドを担体などに固定して使用したとしても、その機能を保持することができるものであることが公知となっている(特許文献3など)。
また、エクソソームを含む試料がエクソソームを含む血液である場合には、血液透析用の透析膜を抗菌ペプチドを固定化するための担体として使用することもできる。血液透析用の透析膜の具体例としては、セルロース、セルロースアセテート、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリメチルメタクリレート、エチレンビニルアルコール共重合体、ポリアクリロニトリル、ポリエステル系ポリマーアロイ、ポリアリルエーテルスルホン等が挙げられる。
また、抗菌ペプチドとは異なるアミノ酸配列からなる抗体に固定化された複合体としてもよく、担体に対して上記複合体を固定化したものであってもよい。ここで使用される抗体は、エクソソームに対して特異的に結合する抗体であることが好ましい。こうすることで、エクソソームと抗体と相互作用させて、上記エクソソームを抗体に対して吸着した状態で、当該エクソソームを抗菌ペプチドにより破壊することができる。
担体に固定化された抗菌ペプチド、または担体に固定化された上記複合体を使用する場合には、当該抗菌ペプチドを有する担体をカラムに充填して使用することも可能である。エクソソームを含む試料は、抗菌ペプチドを有する担体を充填したカラムに通すことにより、効率的にエクソソームを破壊することが可能となる。
スペーサー物質は、一般的に、官能基を介して、2の物体を結合させて連結することが可能な成分の総称である。上記官能基の具体例としては、アミノ基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、チオール基等が挙げられる。また、スペーサーと、抗体、担体および抗菌ペプチドとの間の結合様式は、特に限定されない。なお、上記担体とスペーサー物質との組み合わせの例として、HiTrap NHS−activated HP Columns(GEヘルスケア社製)等の市販製品が挙げられる。
本実施形態に係る抗菌ペプチドを使用したエクソソームの破壊方法によれば、生体に対する安全性が担保されており、かつがん細胞由来のエクソソームを簡便かつ効率的に破壊することが可能となる。また、本破壊方法によれば、従来の手法と比べて、簡便な操作でがん細胞由来のエクソソームを選択的に破壊することができる。
また、本実施形態に係る抗菌ペプチドを使用したエクソソームの破壊方法は、エクソソームに内包されているバイオマーカーを抽出するために好適に利用することができる。上述した本実施形態に係る破壊方法を利用すれば、正常細胞由来のエクソソームを破壊することを抑制しつつ、がん細胞由来のエクソソームを選択的に破壊することが可能になる。そのため、本実施形態に係る破壊方法は、がん治療の分野において、将来的に、がん疾患に関わる新規バイオマーカーの選別、既存がんマーカーの効率的検出による検査・診断、さらには、透析技術にも応用することが有用であるものと考えられる。
これにより、たとえば、エクソソームを含む試料がエクソソームを含む血液である場合には、上記抗菌ペプチドを有する担体を、エクソソームを破壊するための血液循環装置の一構成として使用することが可能となる。
本実施形態に係るがん細胞由来のエクソソームの破壊キットは、上述した破壊方法を利用するものであり、抗菌ペプチドを含むものである。そして、かかる破壊キットに含まれる抗菌ペプチドは、がん細胞由来のエクソソームを選択的に破壊できるものであり、下記(1)または(2)の条件を満たすペプチドである。
(1)鎖長が10以上50未満であり、Net Chargeが0より大きく15未満であり、かつ疎水性残基割合が25%以上65%未満である(ただし、S−S結合を3以上含み、かつ、抗菌ペプチドを構成する全アミノ酸中にリジン残基およびバリン残基のいずれか一方を含むものを除く)。
(2)鎖長が2以上10未満であり、Net Chargeが0以下であり、かつ疎水性残基割合が25%未満であるとともに、下記(2−1)または(2−2)の条件を満たす。
(2−1)抗菌ペプチドを構成する全アミノ酸中にヒスチジン残基を3以上含み、かつ、トリプトファン残基及びバリン残基を含まない。
(2−2)抗菌ペプチドを構成する全アミノ酸中にアルギニン残基を1以上含み、フェニルアラニン残基、トリプトファン残基およびバリン残基を含まない。
上述した破壊方法は、がん細胞由来のエクソソームを選択的に破壊できる手法であるが故、正常細胞由来のエクソソームを分離するためにも利用することが可能である。具体的には、本実施形態に係る正常細胞由来のエクソソームの分離方法は、抗菌ペプチドと、エクソソームとを共存させる工程を含むものである。ただし、かかる方法において使用するエクソソームは、がん細胞由来のエクソソームと正常細胞由来のエクソソームとの混合物である必要がある。くわえて、本実施形態に係る正常細胞由来のエクソソームの分離方法に用いる抗菌ペプチドは、がん細胞由来のエクソソームを選択的に破壊できるものである必要が有るため、上述した(1)または(2)の条件を満たすペプチドである。
なお、本発明は、以下の態様を含むものである。
1.抗菌ペプチドを準備する工程と、
前記抗菌ペプチドと、エクソソームとを共存させることにより、前記エクソソームを破壊する工程と、
を有するエクソソームの破壊方法。
2.前記破壊する工程の前に、前記エクソソームを含む試料を準備する工程をさらに含む、1.に記載のエクソソームの破壊方法。
3.前記破壊する工程は、生体外で実施される、1.または2.に記載のエクソソームの破壊方法。
4.前記エクソソームが、癌細胞由来のエクソソームである、1.乃至3.のいずれか一つに記載のエクソソームの破壊方法。
5.前記抗菌ペプチドが、10以上50以下のアミノ酸残基からなるポリペプチドである、1.乃至4.のいずれか一つに記載のエクソソームの破壊方法。
6.前記抗菌ペプチドが、マガイニン2、LL−37、プロタミンおよびナイシンからなる群より選択される1以上のペプチドを含む、1.乃至5.のいずれか一つに記載のエクソソームの破壊方法。
7.前記抗菌ペプチドを準備する工程が、担体に固定化されている前記抗菌ペプチドを準備する工程を含む、1.乃至6.のいずれか一つに記載のエクソソームの破壊方法。
8.前記抗菌ペプチドを準備する工程が、抗体に固定化されている前記抗菌ペプチドを準備する工程を含む、1.乃至6.のいずれか一つに記載のエクソソームの破壊方法。
9.前記抗体が、前記エクソソームに対して特異的に結合する抗体である、8.に記載のエクソソームの破壊方法。
10.前記破壊する工程が、
前記抗体と前記エクソソームとを相互作用させて、前記抗体に相互作用させた前記エクソソームを前記抗菌ペプチドで破壊する工程と、
を含む8.または9.に記載のエクソソームの破壊方法。
11.抗菌ペプチドを含有する、エクソソームの破壊キット。
12.前記抗菌ペプチドが、10以上50以下のアミノ酸残基からなるポリペプチドである、11.に記載のエクソソームの破壊キット。
13.前記抗菌ペプチドが、マガイニン2、LL−37、プロタミンおよびナイシンからなる群より選択される1以上のペプチドを含む、11.または12.に記載のエクソソームの破壊キット。
14.前記抗菌ペプチドが担体に固定化されている、11.乃至13.のいずれか一つに記載のエクソソームの破壊キット。
15.前記抗菌ペプチドが抗体に固定化されている、11.乃至13.のいずれか一つに記載のエクソソームの破壊キット。
16.前記抗体が、前記エクソソームに対して特異的に結合する抗体である、15.に記載のエクソソームの破壊キット。
17.抗菌ペプチドと、エクソソームとを共存させることにより、前記エクソソームを破壊する工程を含む、抗菌ペプチドの使用方法。
18.前記破壊する工程において、前記エクソソームを破壊する、請求項17に記載の抗菌ペプチドの使用方法。
各実施例で用いた抗菌ペプチドの特徴を下記表1に示した。
ヒト乳がん細胞由来の細胞株MM231−luc−D3H2LN(国立がん研究センターからの供試)を、Advanced RPMI1640培地(ライフテクノロジーズ社製)に植菌した。次いで、CO2インキュベーターを用いてCO2濃度が5体積%となるように設定した条件下、37℃で48時間培養し、エクソソームを含む培養液を得た。この培養液を、2,000Gで遠心することにより沈殿を除去した後、110,000Gで遠心することによりエクソソームを沈殿させ、エクソソーム画分Aを回収した。回収したエクソソーム画分Aは、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)に懸濁後、4℃で保管した。なお、保管サンプルは、使用前に軽く、ボルテックスミキサー(振とうミキサー)により懸濁してから使用した。
また、溶液中のエクソソームの個数は、ナノ粒子解析装置(NanoSight LM10;NanoSight社製)を用いて、装置添付のプロトコルに従い解析した。
ヒト乳がん由来の細胞株MDA−MB−231−luc−D3H2LN(=MM231−luc−D3H2LN、国立がん研究センターからの供試)の細胞懸濁液を、10%ウシ胎児血清を含むRPMI 1640培地(サーモフィッシャーサイエンテイフィック社製)を入れたディッシュに播種した。次いで、CO2インキュベーターを用いてCO2濃度が5体積%となるように設定した条件下、37℃で上記細胞株を増殖させた後、Advanced RPMI1640培地(サーモフィッシャーサイエンテイフィック社製)に交換した。次いで、48時間培養し、エクソソームを含む培養液を得た。この培養液を2,000Gで10分間遠心することにより沈殿を除去した後、110,000Gで70分間遠心することにより沈殿させ、エクソソーム画分Bを回収した。回収したエクソソーム画分Bはリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に懸濁後、4℃で保管した。なお、保管サンプルは、使用前に軽くボルテックスミキサー(振とうミキサー)により懸濁してから使用した。
溶液中のエクソソームの個数は、ナノ粒子解析装置(NanoSight LM10;NanoSight社製)を用いて、装置添付のプロトコルに従い解析した。
ヒト乳腺上皮由来の細胞株MCF 10A(国立がん研究センターからの供試)の細胞懸濁液を、Mammary Epithelium Cell Basal Medium(ロンザ社製)を入れたディッシュに播種した。次いで、CO2インキュベーターを用いてCO2濃度が5体積%となるように設定した条件下、37℃で上記細胞株を増殖させた後、新鮮な培地に交換した。次いで、48時間培養し、エクソソームを含む培養液を得た。この培養液を2,000Gで10分間遠心することにより沈殿を除去した後、110,000Gで70分間遠心することにより沈殿させ、エクソソーム画分を回収した。回収したエクソソーム画分はリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に懸濁後、4℃で保管した。なお、保管サンプルは、使用前に軽くボルテックスミキサー(振とうミキサー)により懸濁してから使用した。
溶液中のエクソソームの個数は、ナノ粒子解析装置(NanoSight LM10;NanoSight社製)を用いて、装置添付のプロトコルに従い解析した。
ヒト前立腺がん由来の細胞株PC3ML(国立がん研究センターより供試)の細胞懸濁液を、10%ウシ胎児血清を含むRPMI 1640培地(サーモフィッシャーサイエンテイフィック社製)を入れたディッシュに播種した。次いで、CO2インキュベーターを用いてCO2濃度が5体積%となるように設定した条件下、37℃で上記細胞株を増殖させた後、Advanced RPMI1640培地(サーモフィッシャーサイエンテイフィック社製)に交換した。その後、48時間培養し、エクソソームを含む培養液を得た。この培養液を2,000Gで10分間遠心することにより沈殿を除去した後、110,000G70分間で遠心することにより沈殿させ、エクソソーム画分を回収した。回収したエクソソーム画分はリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に懸濁後、4℃で保管した。なお、保管サンプルは、使用前に軽くボルテックスミキサー(振とうミキサー)により懸濁してから使用した。
溶液中のエクソソームの個数は、ナノ粒子解析装置(NanoSight LM10;NanoSight社製)を用いて、装置添付のプロトコルに従い解析した。
Pooled Human Serum(コスモバイオ社製)を2,000Gで10分間遠心した後、油層と沈殿とを除去した。その後、110,000Gで70分間遠心することにより沈殿させ、エクソソーム画分を回収した。回収したエクソソーム画分はリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に懸濁後、4℃で保管した。なお、保管サンプルは、使用前に軽くボルテックスミキサー(振とうミキサーにより懸濁してから使用した。
溶液中のエクソソームの個数は、ナノ粒子解析装置(NanoSight LM10;NanoSight社製)を用いて、装置添付のプロトコルに従い解析した。
反応液中のマイクロRNA(miR−21もしくはmiR−16)は、逆転写プライマー(サーモフィッシャーサイエンテイフィック社製、Taqman microRNA Assays,RTプライマー,hsa−mir−21もしくはhsa−mir−16)および逆転写酵素(サーモフィッシャーサイエンテイフィック社製、Taqman microRNA RT kit)を用いて、逆転写PCRを行った。
(実施例1)
まず、1.36×1011particles/mL相当のヒト乳がん細胞由来の細胞株MM231−luc−D3H2LN株から調製したエクソソーム画分Aのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)溶液、および200μMマガイニン2のPBS溶液を準備した。次いで、10μLのヒト乳がん細胞由来のエクソソーム溶液、50μLのマガイニン2溶液、および40μLのPBSを混合して、1.36×1010particles/mLのヒト乳がん細胞由来のエクソソームおよび100μMのマガイニン2を含むPBSを100μL調製し、25℃で24時間静置することによりインキュベートした。サンプルは4℃で保管した。
まず、1.36×1011particles/mL相当のヒト乳がん細胞由来の細胞株MM231−luc−D3H2LN株から調製したエクソソーム画分Aのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)溶液を準備した。それから、10μLのヒト乳がん細胞由来のエクソソーム溶液、および90μLのPBSを混合して、1.36×1010particles/mLのヒト乳がん細胞由来のエクソソームを含むPBSを100μL調製し、25℃で24時間静置することによりインキュベートした。サンプルは4℃で保管した。
(実施例2)
がんにはかかっていない健常なヒトから採取した末梢血試料(以下、ヒト末梢血試料ともいう。)に対して、ヒト乳がん細胞由来の細胞株MM231−luc−D3H2LN株から調製したエクソソーム画分Aを、実際のがん患者のエクソソーム濃度となるよう添加し、模擬的にがん患者のヒト末梢血試料を作製する。なお、上記ヒト末梢血試料は、例えば、特開2013―198483号公報に記載されている方法と同様、ヘルシンキ宣言に従って、患者にインフォームドコンセントを実施して入手する。抗凝固剤入りの採血管を利用して採血する。
次いで、110,000Gで超遠心することによりペレット化したヒト乳癌細胞由来のエクソソームおよびマガイニン2をヒト末梢血試料に懸濁し、上記ヒト乳癌細胞由来のエクソソームおよびマガイニン2の含有量が、それぞれ、1.4×1010particles/mLのヒト乳癌細胞由来のエクソソームおよび100μMのマガイニン2となるようヒト末梢血試料を100μL調製し、25℃で24時間静置することによりインキュベートする。
110,000Gで超遠心することによりペレット化したヒト乳がん細胞由来のエクソソーム、およびフェノールをヒト末梢血試料に懸濁し、上記ヒト乳がん細胞由来のエクソソームおよびフェノールの含有量が、それぞれ1.4×1010particles/mLのヒト乳がん細胞由来のエクソソームおよび8%のフェノールとなるようにヒト末梢血試料を100μL調製し、25℃で24時間静置することによりインキュベートする。
110,000Gで超遠心することによりペレット化したヒト乳がん細胞由来のエクソソームをヒト末梢血試料に懸濁し、上記ヒト乳がん細胞由来のエクソソームの含有量が、1.4×1010particles/mLとなるようにヒト末梢血試料を100μL調製し、25℃で24時間静置することによりインキュベートする。
(実施例3)
まず、1.36×1011particles/mL相当のヒト乳がん細胞由来のエクソソーム画分Aのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)溶液、および100μMナイシンAのPBS溶液、を準備した。それから、10μLのヒト乳がん細胞由来のエクソソーム溶液、50μLのナイシンA溶液、および40μLのPBSを混合して、1.36×1010particles/mLのヒト乳がん細胞由来のエクソソーム、および50μMのナイシンAを含むPBSとなるように、エクソソーム画分100μLを調製し、25℃で48時間静置することによりインキュベートした。サンプルは4℃で保管した。上記インキュベート後の溶液について、軽く振とうミキサーを用いて懸濁した後、ナノ粒子解析装置(ナノサイト社製、NanoSight LM10)を用いて当該溶液中に含まれるエクソソームの個数を測定した。
まず、1.36×1011particles/mL相当のヒト乳がん細胞由来のエクソソーム画分Aのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)溶液、および100μMラクトフェリシンのPBS溶液、を準備した。それから、10μLのヒト乳がん細胞由来のエクソソーム溶液、50μLのラクトフェリシン溶液、および40μLのPBSを混合して、1.36×1010particles/mLのヒト乳がん細胞由来のエクソソーム、および50μMのラクトフェリシンを含むPBSとなるように、エクソソーム画分100μLを調製し、25℃で48時間静置することによりインキュベートした。サンプルは4℃で保管した。上記インキュベート後の溶液について、軽く振とうミキサーを用いて懸濁した後、ナノ粒子解析装置(ナノサイト社製、NanoSight LM10)を用いて当該溶液中に含まれるエクソソームの個数を測定した。
まず、1.36×1011particles/mL相当のヒト乳がん細胞由来のエクソソーム画分Aのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)溶液、および100μMのLL−37のPBS溶液を準備した。それから、10μLのヒト乳がん細胞由来のエクソソーム溶液、50μLのLL−37溶液、および40μLのPBSを混合して、1.36×1010particles/mLのヒト乳がん細胞由来のエクソソーム、および50μMのLL−37を含むPBSを100μL調製し、25℃で48時間静置することによりインキュベートした。サンプルは4℃で保管した。上記インキュベート後の溶液について、振とうミキサーを用いて懸濁した後、ナノ粒子解析装置(ナノサイト社製、NanoSight LM10)を用いて当該溶液中に含まれるエクソソームの個数を測定した。
まず、1.36×1011particles/mL相当のヒト乳がん細胞由来のエクソソーム画分Aのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)溶液を準備した。それから、10μLのヒト乳がん細胞由来のエクソソーム溶液、および90μLのPBSを混合して、1.36×1010particles/mLのヒト乳がん細胞由来のエクソソームを含むPBSを100μL調製し、25℃で48時間静置することによりインキュベートした。サンプルは4℃で保管した。上記インキュベート後の溶液について、振とうミキサーを用いて懸濁した後、ナノ粒子解析装置(ナノサイト社製、NanoSight LM10)を用いて当該溶液中に含まれるエクソソームの個数を測定した。
(実施例6)
マガイニン2を500μg/mLの濃度で含有するPBS溶液を準備する。次いで、100mgのEpoxy−activated Sepharose 6B担体(GEヘルスケア社製)に、100μLの上記マガイニン2溶液を接触させ、室温で24時間反応させる。担体をPBSで3回洗浄後、100μLの1Mエタノールアミン(pH8.0)を添加し、40℃で4時間反応させる。その後、担体をPBSで3回洗浄し、マガイニン2担持Epoxy−activated Sepharose 6Bとする。 次に、9.92×1010particles/mL相当のヒト乳がん細胞由来のエクソソーム画分Aのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)溶液を準備する。10μLのヒト乳がん細胞由来のエクソソームおよび90μLのPBSを混合して、9.92×109particles/mLヒト乳がん細胞由来のエクソソームを含むPBSを100μL調製する。次いで、このエクソソーム画分を、上記マガイニン2担持Epoxy−activated Sepharose 6B担体に接触させ、その後、25℃で24時間静置することによりインキュベートする。得られる溶出液においてエクソソームの個数が5.68×109 particles/mLへと減少する。
まず、1×1011particles/mLヒト乳がん細胞由来エクソソーム画分Aのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)溶液を準備する。それから、10μLのヒト乳がん細胞由来のエクソソームおよび90μLのPBSを混合して、1×1010 particles/mLヒト乳がん細胞由来のエクソソームを含むPBSを100μL調製する。次いで、エクソソーム画分100μLを、マガイニン2および抗ヒトCD9抗体(フナコシ社製、PRO−485)を担持したEpoxy−activated Sepharose 6B担体に接触させ、その後、25℃で24時間インキュベートする。得られる溶出液においてエクソソームの個数が減少する。
1×1010particles/mLヒト乳がん細胞由来のエクソソーム画分Aを含むヒト血液試料を準備する。次いで、ヒト血液試料100μLを、マガイニン2および抗ヒトCD9抗体(フナコシ社製、PRO−485)を担持したEpoxy−activated Sepharose 6B担体(GEヘルスケア社製)に接触させ、その後、25℃で24時間インキュベートする。得られる溶出液においてエクソソームの個数が、減少する。
まず、1×1011particles/mLヒト乳がん細胞由来エクソソーム画分Aのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)溶液を準備する。それから、10μLのヒト乳がん細胞由来のエクソソームおよび90μLのPBSを混合して、1×1010particles/mLヒト乳がん細胞由来のエクソソームを含むPBSを100μL調製する。次いで、ヒト血液試料100μLを、マガイニン2担持Epoxy−activated Sepharose 6B担体と、抗ヒトCD9抗体(フナコシ社製、PRO−485)を担持したEpoxy−activated Sepharose 6B担体(GEヘルスケア社製)に接触させ、その後、25℃で24時間インキュベートする。得られる溶出液においてエクソソームの個数が、減少する。
<RNase Inhibitorの添加有無がマイクロRNAの安定性に及ぼす影響>
1×1010particles/mLのヒト乳がん細胞由来のエクソソーム画分B、1×10−13MのmiR−21(シグマアルドリッチ社製)、および0.4U/μLのRNase inhibitor(Toyobo社製)を含むPBSとなるように、エクソソーム画分10μLを調製し、37℃で24時間静置することによりインキュベートした。
1×1010particles/mLのヒト乳がん細胞由来のエクソソーム画分B、および1×10−13MのmiR−21(シグマアルドリッチ社製)を含むPBSとなるように、エクソソーム画分10μLを調製し、37℃で24時間静置することによりインキュベートした。
(実施例10)
1×1011particles/mLのヒト乳がん細胞由来のエクソソーム画分Bと、100μMに調整した下記表2に示す各種抗菌ペプチドと、0.4U/μLのRNase inhibitor(Toyobo社製)とを含むPBSとなるように、エクソソーム画分10μLを調製し、37℃で24時間静置することによりインキュベートした。
1×1011particles/mLのヒト乳がん細胞由来のエクソソーム画分Bと、0.4U/μLのRNase inhibitor(Toyobo社製)とを含むPBSとなるように、エクソソーム画分10μLを調製し、37℃で24時間静置することによりインキュベートした。
まず、160μLのPBSを反応液に添加した後、遠心式フィルター(ミリポア社製、アミコンウルトラ0.5mL、100K フィルター)上に添加して14,000Gで2分間遠心した。次に、遠心後のろ液から100μLを回収し、1.5mLチューブ内に導入した。次いで、1.5mLチューブ内に350μLのRLT buffer(キアゲン社製、RNeasy mini kit添付)と675μLのエタノールとを添加し混合した。得られた混合液を、2回に分けて、スピンカラム(キアゲン社製、RNeasy mini kit添付)上に添加し、8,000Gで15秒遠心して、かかる混合液の全量をスピンカラムに通した。その後、スピンカラムに、500μLのRPE buffer(キアゲン社製、RNeasy mini kit添付)を添加し、8,000Gで15秒遠心した。さらに、もう一度、上記スピンカラムに、500μLのRPE bufferを添加して、8,000Gで15秒遠心した。その後、スピンカラムを、14,000Gで1分間遠心することで残存するRPE bufferを除去した。次に、スピンカラムに30μLのRNase free water(キアゲン社製、RNeasy mini kit添付)を添加して、1分間放置後、14,000Gで1分間遠心して得られた溶出液を回収した。
◎:マイクロRNA濃度が50×10−14M以上である。
○:マイクロRNA濃度が10×10−14M〜50×10−14Mである。
×:マイクロRNA濃度が10×10−14M未満である。
(実施例11)
1×1011particles/mLのヒト前立腺がん細胞(PC3ML)由来のエクソソームと、100μMに調整した下記表3に示す各種抗菌ペプチドと、0.4U/μLのRNase inhibitor(Toyobo社製)とを含むPBSとなるように、エクソソーム画分10μLを調製し、37℃で24時間静置することによりインキュベートした。
1×1011particles/mLのヒト前立腺がん細胞(PC3ML)由来のエクソソームと、0.4U/μLのRNase inhibitor(Toyobo社製)とを含むPBSとなるように、エクソソーム画分10μLを調製し、37℃で24時間静置することによりインキュベートした。
◎:マイクロRNA濃度が10×10−14M以上である。
○:マイクロRNA濃度が5×10−14M〜10×10−14Mである。
×:マイクロRNA濃度が5×10−14M未満である。
(実施例12)
1×1011particles/mLのヒト乳がん細胞由来のエクソソーム画分Bと、100μMに調整した下記表4に示す各種抗菌ペプチドと、0.4U/μLのRNase inhibitor(Toyobo社製)とを含むPBSとなるように、エクソソーム画分10μLを調製し、37℃で24時間静置することによりインキュベートした。
1×1011particles/mLのヒト乳がん細胞由来のエクソソーム画分Bと、0.4U/μLのRNase inhibitor(Toyobo社製)とを含むPBSとなるように、エクソソーム画分10μLを調製し、37℃で24時間静置することによりインキュベートした。
式1:miR−16比={(ヒト乳がん細胞由来のエクソソームを含む実施例12の各インキュベート溶液から回収した溶出液中に含まれるマイクロRNA(miR−16)の定量値)−(ヒト乳がん細胞由来のエクソソームを含む比較例8のインキュベート溶液から回収した溶出液中に含まれるマイクロRNA(miR−16)の定量値)}÷{(正常細胞由来のエクソソームを含む実施例12の各インキュベート溶液から回収した溶出液中に含まれるマイクロRNA(miR−16)の定量値)−(正常細胞由来のエクソソームを含む比較例8のインキュベート溶液から回収した溶出液中に含まれるマイクロRNA(miR−16)の定量値)}
(抗体の準備)
EpCAM−exosome Isolation reagent(サーモフィッシャーサイエンテイフィック社製)懸濁液40μLを1.5mLのチューブに分注し、かかる懸濁液をMagnetic Beads Separator (サーモフィッシャーサイエンテイフィック社製)で分離した後、上清を除去することでペレットを回収した。このペレットに対して、0.5mLのPBSを添加して懸濁させ、得られた懸濁液をMagnetic Beads Separatorで分離した後、上清を除去することでペレットを回収した。次に、得られたペレットと、10μLの1.8×1011particles/mLの乳がん細胞由来エクソソーム(MM231−luc−D3H2LN)もしくは1.8×1011particles/mLのヒト正常血清由来エクソソームとを混合し、4℃で18時間放置した。次いで、Magnetic Beads Separatorで混合液を分離した後、上清を除去することでペレットを回収した。その後、上記ペレットに対して1mLのPBAを添加して懸濁させたものをMagnetic Beads Separatorで分離し、上清を除去することでペレットを回収した。この1mLのPBSを添加して分離させる操作を、もう一度繰り返した。その後、得られたペレットに10μLのPBSを添加して懸濁させることでエクソソームを吸着させた抗体サンプルを得た。
1×1011particles/mLのヒト乳がん細胞由来のエクソソーム画分Bと、100μMに調整したマガイニン2と、0.4U/μLのRNase inhibitor(Toyobo社製)とを含むPBSとなるように、エクソソーム画分10μLを調製し、37℃で24時間静置することによりインキュベートした。
上記EpCAM−exosome Isolation reagentにヒト乳がん細胞由来のエクソソーム画分Bを吸着させた抗体のエクソソーム画分10μLを調製し、RNeasy kitを用いて抽出処理を行い、マイクロRNA(miR−16)を精製、回収した。
具体的には1.5mLチューブ内で、エクソソーム破壊用の界面活性剤組成物として350μLのRLT buffer(キアゲン社製、RNeasy mini kit添付)および675μLのエタノールと混合した。上記混合液を、2回に分けて、スピンカラム(キアゲン社製、RNeasy mini kit添付)上に添加し、8,000Gで15秒遠心して、上記混合液の全量をスピンカラムに通した。上記スピンカラムに、500μLのRPE buffer(キアゲン社製、RNeasy mini kit添付)を添加して、8,000Gで15秒遠心した。さらに、もう一度、上記スピンカラムに、500μLのRPE bufferを添加して、8,000Gで15秒遠心した。上記スピンカラムを、14,000Gで1分間遠心して、残存するRPE bufferを除去した。上記スピンカラムに、30μLのRNase free water(キアゲン社製、RNeasy mini kit添付)を添加して、1分間放置後、14,000Gで1分間遠心して、マイクロRNA(miR−16)を含む溶出液を回収した。
1×1011particles/mLのヒト乳がん細胞由来のエクソソーム画分B10μLから、比較例9と同様の方法で、マイクロRNA(miR−16)を含む溶液を精製、回収した。また、1×1011particles/mLの正常ヒト血清由来のエクソソーム画分10μLから、比較例9と同様の方法で、マイクロRNA(miR−16)を含む溶液を精製、回収した。
1×1011particles/mLのヒト乳がん細胞由来のエクソソーム画分Bと、0.4U/μLのRNase inhibitor(Toyobo社製)とを含むPBSとなるように、エクソソーム画分10μLを調製し、37℃で24時間静置することによりインキュベートした。
式2:miR−16比={(ヒト乳がん細胞由来のエクソソームを含む実施例13、比較例9または10の各インキュベート溶液から回収した溶出液中に含まれるマイクロRNA(miR−16)の定量値)−(ヒト乳がん細胞由来のエクソソームを含む比較例11のインキュベート溶液から回収した溶出液中に含まれるマイクロRNA(miR−16)の定量値)}÷{(正常細胞由来のエクソソームを含む実施例13、比較例9または10の各インキュベート溶液から回収した溶出液中に含まれるマイクロRNA(miR−16)の定量値)−(正常細胞由来のエクソソームを含む比較例11のインキュベート溶液から回収した溶出液中に含まれるマイクロRNA(miR−16)の定量値)}
Claims (9)
- 抗菌ペプチドを準備する工程と、
前記抗菌ペプチドと、エクソソームとを共存させることにより、前記エクソソームを破壊する工程と、
を有するエクソソームの破壊方法。 - 前記エクソソームが、がん細胞由来のエクソソームである請求項1に記載のエクソソームの破壊方法。
- 前記エクソソームが、がん細胞由来のエクソソームと正常細胞由来のエクソソームとの混合物であり、
前記エクソソームを破壊する工程において、前記がん細胞由来のエクソソームを選択的に破壊する、請求項1に記載のエクソソームの破壊方法。 - 前記抗菌ペプチドが、下記(1)または(2)の条件を満たすペプチドである、請求項1乃至3のいずれか一項に記載のエクソソームの破壊方法。
(1)鎖長が10以上50未満であり、Net Chargeが0より大きく15未満であり、かつ疎水性残基割合が25%以上65%未満である(ただし、S−S結合を3以上含み、かつ、前記抗菌ペプチドを構成する全アミノ酸中にリジン残基およびバリン残基のいずれか一方を含むものを除く)。
(2)鎖長が2以上10未満であり、Net Chargeが0以下であり、かつ疎水性残基割合が25%未満であるとともに、下記(2−1)または(2−2)の条件を満たす。
(2−1)前記抗菌ペプチドを構成する全アミノ酸中にヒスチジン残基を3以上含み、かつ、トリプトファン残基及びバリン残基を含まない。
(2−2)前記抗菌ペプチドを構成する全アミノ酸中にアルギニン残基を1以上含み、フェニルアラニン残基、トリプトファン残基およびバリン残基を含まない。 - 前記抗菌ペプチドが、下記条件を満たすペプチドである、請求項4に記載のエクソソームの破壊方法。
(条件)鎖長が20以上40未満であり、Net Chargeが1以上10未満であり、かつ疎水性残基割合が25%以上65%未満である(ただし、S−S結合を3以上含み、かつ、前記抗菌ペプチドを構成する全アミノ酸中にリジン残基およびバリン残基のいずれか一方を含むものを除く)。 - 抗菌ペプチドを含んでおり、かつ前記抗菌ペプチドが下記(1)または(2)の条件を満たすペプチドである、がん細胞由来のエクソソームの破壊キット。
(1)鎖長が10以上50未満であり、Net Chargeが0より大きく15未満であり、かつ疎水性残基割合が25%以上65%未満である(ただし、S−S結合を3以上含み、かつ、前記抗菌ペプチドを構成する全アミノ酸中にリジン残基およびバリン残基のいずれか一方を含むものを除く)。
(2)鎖長が2以上10未満であり、Net Chargeが0以下であり、かつ疎水性残基割合が25%未満であるとともに、下記(2−1)または(2−2)の条件を満たす。
(2−1)前記抗菌ペプチドを構成する全アミノ酸中にヒスチジン残基を3以上含み、かつ、トリプトファン残基及びバリン残基を含まない。
(2−2)前記抗菌ペプチドを構成する全アミノ酸中にアルギニン残基を1以上含み、フェニルアラニン残基、トリプトファン残基およびバリン残基を含まない。 - RNase Inhibitorをさらに含む、請求項6に記載のがん細胞由来のエクソソームの破壊キット。
- 下記(1)または(2)の条件を満たす抗菌ペプチドと、エクソソームとを共存させる工程を含み、
前記エクソソームが、がん細胞由来のエクソソームと正常細胞由来のエクソソームとの混合物である、正常細胞由来のエクソソームの分離方法。
(1)鎖長が10以上50未満であり、Net Chargeが0より大きく15未満であり、かつ疎水性残基割合が25%以上65%未満である(ただし、S−S結合を3以上含み、かつ、前記抗菌ペプチドを構成する全アミノ酸中にリジン残基およびバリン残基のいずれか一方を含むものを除く)。
(2)鎖長が2以上10未満であり、Net Chargeが0以下であり、かつ疎水性残基割合が25%未満であるとともに、下記(2−1)または(2−2)の条件を満たす。
(2−1)前記抗菌ペプチドを構成する全アミノ酸中にヒスチジン残基を3以上含み、かつ、トリプトファン残基及びバリン残基を含まない。
(2−2)前記抗菌ペプチドを構成する全アミノ酸中にアルギニン残基を1以上含み、フェニルアラニン残基、トリプトファン残基およびバリン残基を含まない。 - 前記共存させる工程が、前記がん細胞由来のエクソソームを破壊する工程を含み、
前記共存させる工程の後、前記がん細胞由来のエクソソームの破壊残渣を吸着除去する工程をさらに含む、請求項8に記載の正常細胞由来のエクソソームの分離方法。
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