JP2004530404A - 選択的相互作用リガンドのバイオパニング迅速分析法（ｂｒａｓｉｌ） - Google Patents

選択的相互作用リガンドのバイオパニング迅速分析法（ｂｒａｓｉｌ） Download PDF

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Abstract

本発明は、標的に選択的に結合するペプチド配列を同定する新規方法に関する。もう一つの態様において、標的は、細胞もしくは細胞塊、化学物質、化合物、分子、もしくは集合体に結合した粒子、または寄生体を含んでもよい。好ましい態様において、標的細胞は、ファージライブラリに曝露する前にソーティングされる。一般的な方法である選択的相互作用リガンドのバイオパニング迅速分析法（ＢＲＡＳＩＬ）は、未結合のファージを保存しながら標的に結合するファージの、迅速かつ効率的な分離を提供する。ＢＲＡＳＩＬは、第一の標的に非特異的に結合するファージを差し引いてから、差し引いたライブラリを第二の標的に曝露する前選択法において用いてもよい。特定の態様は、ＢＲＡＳＩＬによって同定されたターゲティングペプチド、および治療物質もしくは造影剤の標的化輸送、または疾患の診断もしくは治療のために、そのようなペプチドを用いる方法に関する。第一の相、第二の相、標的およびファージライブラリを含む新規組成物も同様に開示する。

Description

【０００１】
発明の背景
本出願は、２０００年９月８日に提出された米国特許仮出願第６０／２３１，２６６号および２００１年１月１７日に提出された米国特許出願第０９／７６５，１０１号の恩典を主張する。本発明は、米国陸軍の助成金ＤＡＭＤ １７−９８−１−８０４１および１７−９８−１−８５８１ならびに米国国立衛生研究所の助成金１Ｒ０１ＣＡ７８５１２−０１Ａ１、１Ｒ０１ＣＡ９０８１０−０１、および１Ｒ０１ＣＡ８２９７６−０１により政府の支援を受けて行われた。米国政府は本発明に一定の権利を保有する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、分子薬品および治療物質の標的化送達の分野に関する。より詳しく述べると、本発明は、臓器または細胞を選択的に標的にするペプチドを同定し使用するための、組成物および方法に関する。特に、この方法および組成物は
選択的相互作用リガンドのバイオパニング迅速分析法（ＢＲＡＳＩＬ）に関する。
【０００３】
関連技術の説明
多くのヒトの疾患状態の治療的治療は、用いる治療物質の全身毒性のために制限される。癌治療物質は、特に非常に低い治療指数を示し、皮膚および骨髄のような急速に増殖する正常組織は、腫瘍細胞を殺すために用いる濃度ほど高くない物質の濃度で影響を受ける。癌および他の臓器、または組織限定疾患の治療は、所望の臓器または組織への治療物質の標的化送達のための組成物および方法を開発することによって大きく促進されるであろう。診断上の造影法も、所望の臓器、組織、または疾患細胞への造影剤の送達によって促進されるであろう。
【０００４】
最近、マウスモデル系において臓器または組織ターゲティングペプチドを同定するためのファージディスプレイライブラリを用いるインビボ選択系が開発された。バクテリオファージの表面上にトランスジェニックペプチドを発現するファージディスプレイライブラリは、当初、免疫グロブリンのエピトープ結合部位をマッピングするために開発された（ＳｍｉｔｈおよびＳｃｏｔｔ、１９８６、１９９３）。そのようなライブラリは、ファージの表面タンパク質をコードするｃＤＮＡにランダムオリゴヌクレオチドを挿入すること、独自のペプチドを１０９個もの順列で示すファージ粒子のコレクションを作製することによって作製することができる（ＰａｓｑｕａｌｉｎｉおよびＲｕｏｓｌａｈｔｉ、１９９６；Ａｒａｐら、１９９８ａ；Ａｒａｐら、１９９８ｂ）。
【０００５】
ファージディスプレイライブラリをマウスに静脈内投与した後に、個々の臓器からのファージの回収を行った（ＰａｓｑｕａｌｉｎｉおよびＲｕｏｓｌａｈｔｉ、１９９６）。ファージの外部表面上に発現された特異的ターゲティングペプチド配列に基づいて、異なるマウス臓器または組織の血管床に選択的に回帰することができるファージを回収した（ＰａｓｑｕａｌｉｎｉおよびＲｕｏｓｌａｈｔｉ、１９９６）。多様な臓器および腫瘍回帰ペプチドがこの方法によって同定されている（Ｒａｊｏｔｔｅら、１９９８、１９９９；Ｋｏｉｖｕｎｅｎら、１９９９；Ｂｕｒｇら、１９９９；Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ、１９９９）。それらのターゲティングペプチドはそれぞれ、マウス標的組織の血管上に選択的に発現される異なる受容体に結合した（Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ、１９９９；Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉら、２０００；Ｆｏｌｋｍａｎ、１９９５；Ｆｏｌｋｍａｎ、１９９７）。腫瘍回帰ペプチドはマウスの腫瘍新生血管において上方制御されている受容体に結合した（Ｂｒｏｏｋｓら、１９９４ｂ；Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ、２０００）。臓器または組織に対して選択的な個々のターゲティングペプチドを同定する他に、（ＰａｓｑｕａｌｉｎｉおよびＲｕｏｓｌａｈｔｉ、１９９６；Ａｒａｐら、１９９８ａ；Ｋｏｉｖｕｎｅｎら、１９９９）、このシステムは、インビボでマウスに発現される内皮細胞表面マーカーを同定するために用いられている（ＲａｊｏｔｔｅおよびＲｕｏｓｌａｈｔｉ、１９９９）。
【０００６】
ターゲティングペプチドに治療物質を結合させると、マウスモデル系において所望の臓器または組織への物質の選択的輸送が得られた。腫瘍の新生血管に存在する受容体に化学療法剤および前アポトーシスペプチドを標的化輸送すると、担癌マウスモデルにおいて治療有効性の顕著な増加および全身毒性の減少が得られた（アラプ（Ａｒａｐ）ら、１９９８ａ、１９９８ｂ；エラビー（Ｅｌｌｅｒｂｙ）ら、１９９９）。
【０００７】
この相対的成功にもかかわらず、ファージライブラリの細胞表面選択は、技術的問題を伴った。ファージライブラリを細胞懸濁液または単層と共にインキュベートすると、多数の非結合および非特異的結合クローンが回収される。このバックグラウンドファージ結合を繰り返し洗浄によって除去することは、労力を要し、しかも非効率的である。細胞および可能性があるリガンドは、必要な多くの洗浄段階のさいにしばしば失われる。このように、非特異的バックグラウンドを減少させながら、インビボ法の選択性および特異性を保持するインビトロバイオパニングの迅速かつ有効な方法が必要である。
【０００８】
ファージディスプレイライブラリによるこれまでの研究は、ヒトターゲティングペプチドが相同であると仮定して、ターゲティングペプチドおよびその受容体を同定するためにマウスモデル系を信頼していた。しかし、細胞表面受容体のヒトにおける分布および機能は、マウスとは大きく異なっている可能性がある。さらに、マウスモデル系は、ほんの一握りの特異的臓器のためのターゲティングペプチドを特徴を調べるために利用されているに過ぎない。当技術分野において、治療物質を標的化輸送するために臨床的に有用となりうるヒト臓器、組織、または細胞型に対して選択的なターゲティングペプチドを同定するための方法および組成物が必要である。
【０００９】
発明の概要
本発明は、臓器、組織、または細胞型に対して選択的なターゲティングペプチドを同定するための組成物およびインビトロ方法を提供することによって、当技術分野における長いあいだの必要性を解決する。好ましい態様において、そのようなターゲティングペプチドは、一つまたは複数の臓器、組織、または細胞型の試料を採取すること、試料を単離細胞または小さな細胞塊に分離すること、細胞または塊を第一の相に懸濁させること、細胞または細胞塊をファージディスプレイライブラリに曝露すること、第一の相を第二の相の上に載せること、および細胞が遠心管の底に沈降するように二つの相を遠心分離することによって同定される。より好ましい態様において、第一の相は水相であり、第二の相は有機相である。さらにより好ましい態様において、細胞はヒト細胞である。特定の態様において、ファージは細菌に曝露することによって沈殿物から回収して、ファージクローンを播種、単離、およびバルク培養において増殖させてもよい。もう一つの態様において、ファージインサートは、ＰＣＲ（商標）または他の増幅技術によって沈殿物から回収して、インサートを配列決定してターゲティングペプチドを同定してもよい。特定の態様において、有機相はジブチルフタレートまたはジブチルフタレートとシクロヘキサンとの混合物を含む。本明細書に開示の方法は、本明細書において一般的に、選択的相互作用リガンドのバイオパニング迅速分析法（ＢＲＡＳＩＬ）と呼ぶ。
【００１０】
もう一つの態様において、ＢＲＡＳＩＬ法を用いて、実質的に如何なる化学、分子、または分子複合体に対するターゲティングペプチドを同定してもよい。結合ファージと未結合ファージとの分離は、好ましくは、結合ファージを水相から有機相に分配することによって行われる。これには、ファージが結合する標的が、ファージより密度が大きい、ファージより大きい、または好ましくはその双方である必要がある。好ましい態様において、標的は水相に不溶性である。この要件を満足するために、化学、化合物、または分子を、大きい不溶性の粒子、例えば、ガラス、プラスチック、セラミックまたは磁気ビーズに結合させてもよい。当業者は、本発明が、ビーズに限定されず、如何なる大きいおよび／または密度の大きい粒子を用いてもよいことを認識するであろう。標的を結合した粒子を、水相においてファージライブラリを曝露して、標的に結合したファージを有機相に分配してもよい。本明細書に示した例は、結合したファージを有機相に分配するために遠心分離を用いることを説明するが、当業者は、他のタイプの分配を用いてもよく、それらも本発明の範囲内であることを認識するであろう。例えば、磁気ビーズに結合した標的の場合、ビーズに結合したファージを有機相に引き寄せるために磁場を課すことができるであろう。
【００１１】
細胞が標的である態様において、細胞は哺乳類細胞、ヒト細胞、マウス細胞、または動物細胞であってもよい。または、細胞には、細菌または多細胞微生物のような如何なるタイプの原核細胞または真核細胞が含まれてもよい。好ましい態様において、ＢＲＡＳＩＬに用いるために特定の細胞集団を調製してもよい。例えば、白血病患者からの細胞をＦＡＣＳ（蛍光活性化セルソーター、ベクトン−ディッキンソン社）を用いて非癌細胞から癌細胞をソーティングしてもよい。ファージライブラリを、同じ患者の正常細胞に対して予め選択するサブトラクションを行って、または行わずに癌様細胞のみに対してスクリーニングしてもよい。当業者は、細胞のソーティングが白血病試料に限定されず、如何なる不均一な細胞集団によって実践してもよいことを認識するであろう。
【００１２】
特定の態様において、ＢＲＡＳＩＬによって同定されたターゲティングペプチドは、遺伝子治療ベクターおよび融合タンパク質を含むがこれらに限定されない治療物質を被験者における特定の臓器、組織、または細胞型に選択的に輸送するために有用である。当業者は、用いられる請求の方法の範囲には、所望の臓器、組織、または細胞型への治療物質の標的化輸送によって治療することができる如何なる疾患状態も含まれることを認識するであろう。
【００１３】
当業者は、本明細書に開示のターゲティングペプチドがヒト被験者において用いるために特に適しているが、それらは、マウス、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、豚、または他の如何なる哺乳類のような他の被験者においても有用となる可能性があることが考慮されることを理解するであろう。
【００１４】
本発明の特定の態様は、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：１１、配列番号：１３〜配列番号：１２４のいずれか、または配列番号：１２８〜配列番号：２８９のいずれかから選択されるターゲティングペプチド配列の少なくとも３つの連続するアミノ酸を含む、大きさがアミノ酸１００個またはそれ未満の単離ペプチドに関する。
【００１５】
好ましい態様において、単離ペプチドは、アミノ酸５０個もしくはそれ未満、より好ましくはアミノ酸３０個もしくはそれ未満、より好ましくはアミノ酸２０個もしくはそれ未満、より好ましくはアミノ酸１０個もしくはそれ未満、またはさらにより好ましくは大きさがアミノ酸５個もしくはそれ未満である。他の好ましい態様において、請求項１記載の単離ペプチドは、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：１１、配列番号：１３〜配列番号：１２４のいずれか、または配列番号：１２８〜配列番号：２８９のいずれかから選択されるターゲティングペプチド配列の少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５個の連続するアミノ酸を含む。
【００１６】
特定の態様において、単離ペプチドは分子に結合する。好ましい態様において、結合は共有結合である。さらなる態様において、分子は、薬物、化学療法剤、放射性同位元素、アポトーシス促進物質、抗血管新生剤、ホルモン、サイトカイン、増殖因子、細胞障害物質、ペプチド、タンパク質、抗生物質、抗体、抗体のＦａｂ断片、造影剤、生存因子、抗アポトーシス物質、ホルモンアンタゴニスト、核酸または抗原である。それらの分子は、例示目的により挙げたに過ぎない。本発明の範囲に含まれる分子には、ターゲティングペプチドに結合して、被験者に投与してもよい実質的に任意の分子が含まれる。好ましい態様において、アポトーシス促進物質は、グラミシジン、マガイニン、メリチン、デフェンシン、セクロピン、
Figure 2004530404
である。他の好ましい態様において、抗血管新生物質は、トロンボスポンジン、アンジオスタチン、エンドスタチン、または色素上皮由来因子である。さらに好ましい態様において、サイトカインは、インターロイキン１（ＩＬ−１）、ＩＬ−２、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、インターフェロン−γ（ＩＦ−γ）、ＩＦ−α、ＩＦ−β、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、またはＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子）である。そのような例は、代表として示したに過ぎず、当技術分野で既知の他のアポトーシス促進物質、抗血管新生物質、またはサイトカインを除外すると解釈されない。
【００１７】
他の態様において、単離ペプチドは高分子複合体に結合する。好ましい態様において、結合は共有結合である。他の好ましい態様において、高分子複合体はウイルス、バクテリオファージ、細菌、リポソーム、微粒子、磁気ビーズ、細胞、または微小装置である。これらは例示目的で示したに過ぎない。本発明の範囲に含まれる高分子複合体には、ターゲティングペプチドに結合して、被験者に投与してもよい実質的に任意の高分子複合体が含まれる。他の好ましい態様において、単離ペプチドは、真核細胞発現ベクター、より好ましくは遺伝子治療ベクターに結合する。
【００１８】
もう一つの態様において、単離ペプチドは、固体支持体、好ましくは磁気ビーズ、セファロースビーズ、アガロースビーズ、ニトロセルロースメンブレン、ナイロンメンブレン、カラムクロマトグラフィーマトリクス、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）マトリクス、またはファストパフォーマンス液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）に結合する。このような結合ペプチドは、例えば抗体、タンパク質、ペプチド、またはターゲティングペプチドに結合する他のリガンドを精製または単離するのに役立つ。特定の態様において、この結合はターゲティングペプチドにより模倣される、内因性受容体、リガンド、または受容体：リガンド対を同定するのに使用できる。
【００１９】
本発明のさらなる態様は、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：１１、配列番号：１３〜配列番号：１２４のいずれか、または配列番号：１２８〜配列番号：２８９のいずれかから選択される配列の連続アミノ酸少なくとも３個を含む、融合タンパク質に関する。
【００２０】
その他の特定の態様は、薬学的に許容される担体において主張される単離ペプチドまたは融合タンパク質を含む組成物に関する。さらなる態様は、一つまたは複数の容器において主張される単離ペプチドまたは融合タンパク質を含むキットに関する。
【００２１】
さらなる態様は、ＢＲＡＳＩＬを実施するための組成物および装置を含む、キットに関する。キットの構成要素は、溶液、緩衝液、培地、有機層、細菌、ファージライブラリ、遠心チューブなどの、ＢＲＡＳＩＬの実施に役立ちうる任意の組成物または装置を含むが、これらに限定されない。
【００２２】
その他の態様は、所望の臓器または組織に対するターゲティングペプチドを選択する段階、上記のターゲティングペプチドを分子、高分子複合体、または遺伝子治療ベクターに結合させる段階、および上記の分子、複合体、またはベクターに結合した上記のペプチドを被験者に提供する段階を含む、標的化送達方法に関する。好ましくは、ターゲティングペプチドは、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：１１、配列番号：１３〜配列番号：１２４のいずれか、または配列番号：１２８〜配列番号：２８９のいずれか由来の、連続アミノ酸少なくとも３個を含むように選択される。他の好ましい態様において、ターゲティングペプチドに結合した分子は、化学療法剤、抗原、または造影剤である。当業者は、本明細書の範囲において、任意の臓器、組織、または細胞型が、任意の分子、高分子複合体、または遺伝子治療ベクターに結合したターゲティングペプチドを用いた送達のための標的となりうることを認識するであろう。
【００２３】
本発明の特定の態様は、臓器または組織にターゲティングされるペプチドを選択する段階、造影剤をペプチドに結合させる段階、ペプチドを被験者に投与する段階、および像を得る段階を含む、臓器、組織、または細胞型を造影する方法に関する。好ましい態様において、標的細胞は、疾患または他の病態に関連している。他の好ましい態様において、ターゲティングペプチドは、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：１１、配列番号：１３〜配列番号：１２４の如何なるもの、または配列番号：１２８〜配列番号：２８９の如何なるものから選択される少なくとも３つの連続アミノ酸を含む。
【００２４】
他の態様において、本発明は、そのような疾患状態に関連した細胞にターゲティングされるペプチドを選択する段階、上記のペプチドに造影剤を結合させる段階、疾患を有することが疑われる被験者に上記のペプチドと造影剤とを投与する段階、および上記の被験者における上記のペプチドと造影剤との分布に基づいて疾患の有無を診断する段階を含む、疾患状態を診断する方法に関する。好ましくは、ターゲティングペプチドは、、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：１１、配列番号：１３〜配列番号：１２４の如何なるもの、または配列番号：１２８〜配列番号：２８９の如何なるものから選択される少なくとも３つの連続アミノ酸を含む。好ましい態様において、疾患状態は、真性糖尿病、炎症疾患、リウマチ性関節炎、アテローム性動脈硬化症、癌、自己免疫疾患、細菌感染症、またはウイルス感染症である。より好ましい態様において、疾患状態は転移性癌である。
【００２５】
さらなる態様は、上記の受容体を含む臓器、組織、または細胞にペプチドを接触させる段階、上記のペプチドを上記の受容体に結合させる段階、および上記のペプチドとのその結合によって上記の受容体を同定する段階を含む、ターゲティングペプチドに対する受容体を同定する方法に関する。好ましい態様において、ターゲティングペプチドは、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：１１、配列番号：１３〜配列番号：１２４の如何なるもの、または配列番号：１２８〜配列番号：２８９の如何なるものから選択される少なくとも３つの連続アミノ酸を含む。当業者は、接触段階が、臓器、組織、もしくは細胞の試料を利用できること、または臓器、組織、もしくは細胞のホモジネートもしくは洗浄剤抽出物を利用してもよいことを認識するであろう。特定の態様において、接触すべき細胞は、ターゲティングペプチドの疑われる受容体を発現するように遺伝子操作してもよい。好ましい態様において、ターゲティングペプチドは、上記の受容体にそれを共有結合させる反応性部分によって改変される。より好ましい態様において、反応性部分は、光によって活性化されると受容体に共有結合するようになる光反応基である。もう一つの好ましい態様において、ペプチドは固相支持体に結合して、受容体は、アフィニティクロマトグラフィーによって精製する。他の好ましい態様において、固相支持体は磁気ビーズ、セファロースビーズ、アガロースビーズ、ニトロセルロースメンブレン、ナイロンメンブレン、カラムクロマトグラフィーマトリクス、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）マトリクス、またはファストパフォーマンス液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）マトリクスを含む。特定の態様において、ターゲティングペプチドは、受容体に結合すると受容体の活性を阻害する。当業者は受容体活性が、触媒活性および結合活性を含むがこれらに限定されない当技術分野で既知の多様な方法によってアッセイすることができることを認識するであろう。もう一つの好ましい態様において、受容体は、エンドスタチン受容体、メタロプロテアーゼ、またはアミノペプチダーゼである。
【００２６】
本発明のその他の態様は、ターゲティングペプチドをコードする、大きさが３００ヌクレオチドまたはそれ未満の単離核酸に関する。好ましい態様において、単離核酸は、大きさが２５０、２２５、２００、１７５、１５０、１２５、１００、７５、５０、４０、３０、２０または１０ヌクレオチドまたはそれ未満である。他の好ましい態様において、単離核酸は、真核または原核細胞発現ベクターに組み入れられる。さらにより好ましい態様において、ベクターは、プラスミド、コスミド、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、ウイルスまたはバクテリオファージである。他の好ましい態様において、単離核酸は、発現されたペプチドを宿主細胞の細胞外表面に局在させるリーダー配列に機能的に結合している。
【００２７】
本発明のさらなる態様は、疾患状態に関連する細胞を標的とするターゲティングペプチドを選択する段階、疾患状態を治療するために有効な一つまたは複数の分子をペプチドに結合させる段階、および疾患状態を有する被験者にペプチドを投与する段階を含む、疾患状態を治療する方法に関する。好ましくは、ターゲティングペプチドには、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：１１、配列番号：１３〜配列番号：１２４のいずれか、または配列番号：１２８〜配列番号：２８９のいずれかから選択される連続アミノ酸少なくとも３個が含まれる。好ましい態様において、疾患状態は、真性糖尿病、炎症疾患、リウマチ様関節炎、アテローム硬化症、癌、自己免疫疾患、細菌感染症、およびウイルス感染症である。
【００２８】
本発明のもう一つの態様は、標的化遺伝子治療の分子アダプタに関する。好ましい態様において、分子アダプタは、所望の臓器または組織に対して選択的なターゲティングを提供するターゲティングペプチド配列に共有結合した、遺伝子治療ベクターに特異的な抗体のＦａｂ断片を含む。当業者は、本発明には、当技術分野で既知の如何なる遺伝子治療ベクターも含まれてもよいことを認識するであろう。分子アダプタのベクター結合部分は、抗体のＦａｂ断片に限定されないが、遺伝子治療ベクターにターゲティングペプチドを結合させるために用いることができる如何なる他の分子も含まれてもよい。唯一の要件は、遺伝子治療ベクターが分子アダプタの存在下で所望の臓器、または組織に選択的にターゲティングされなければならないことである。
【００２９】
本発明のもう一つの態様は、癌に対する腫瘍ターゲティングペプチドを用いる組成物および方法に関する。本出願に開示の方法によって同定された腫瘍ターゲティングペプチドは、分子または高分子群を含むがこれらに限定されない治療用物質に結合させて、癌罹患被験者に投与してもよく、治療用物質の有効性の増加および全身毒性の減少を提供する。本発明の範囲に含まれる治療用物質には、化学療法剤、放射性同位元素、アポトーシス促進物質、細胞障害物質、細胞抑制物質、および遺伝子治療ベクターが含まれるがこれらに限定されない。そのような治療用物質の腫瘍への標的化送達は、腫瘍に対する物質の送達を増加させながら、被験者の正常な臓器および組織に対する物質の不適切な送達を減少させることに関して、先行技術に対する有意な改善を提供する。好ましい態様において、腫瘍ターゲティングペプチドは、ファージの送達を腫瘍血管の血管新生内皮細胞にターゲティングするためにファージ遺伝子治療ベクターのカプセルに組み入れられる。
【００３０】
本発明のさらなる態様は、レポーター遺伝子を組み入れるファージディスプレイライブラリを用いて、新規腫瘍ターゲティングペプチドを同定する方法に関する。レポーター遺伝子ファージライブラリを腫瘍を有する被験者に投与した後、腫瘍からファージを回収して、ターゲティングペプチドをコードする核酸配列を含むファージゲノムの選択した一部を配列決定することによって腫瘍ターゲティングペプチドの同定を行う。本発明のこれらの態様は腫瘍に関するが、当業者は、特定の臓器または組織に存在する他の疾患状態も同様に、本明細書に開示の方法および組成物を用いて治療すると、治療効率が増強して、全身毒性が減少する可能性があり、それらも本発明の範囲に含まれることを認識するであろう。
【００３１】
本発明のさらにもう一つの態様は、個体から血清試料を得る段階、試料から抗体を得る段階、抗体にファージディスプレイライブラリを加える段階、および抗体に結合したファージを回収する段階を含む、疾患状態の被験者から抗体に対するターゲティングペプチドを同定する方法に関する。好ましい態様において、抗体は、固体支持体に結合させる、より好ましくはビーズに結合したＧタンパク質に結合させる。もう一つの好ましい態様において、疾患状態を有さない被験者からの抗体に対して、ファージディスプレイライブラリをまずスクリーニングするサブトラクション段階を加える。これらの対照抗体に結合しないファージのみを用いて、疾患を有する個体の抗体に結合するファージを得る。
【００３２】
他の態様において、標的臓器または組織、例えば胎盤に結合するファージは、その臓器または組織を欠く被験者に対して、プレスクリーニングまたはポストスクリーニングすることができる。その臓器または組織を欠く被験者に結合するファージは、ライブラリから除去する。
【００３３】
他の態様は、抗原に対する抗体を得る方法に関する。好ましい態様において、抗原は、一つまたは複数のターゲティングペプチドを含む。ターゲティングペプチドを調製して、固体支持体に固定して、抗体を含む血清を加えて、ターゲティングペプチドに結合する抗体を回収する。
【００３４】
他の好ましい態様において、被験者由来の抗体の抗原結合部分を示すファージディスプレイライブラリを調製して、ライブラリを一つまたは複数の抗原に対してスクリーニングして、抗原に結合するファージを回収する。より好ましい態様において、抗原はターゲティングペプチドである。
【００３５】
例示的態様の説明
本明細書において用いられるように、「一つ（ａ）」、または「一つ（ａｎ）」とは、一つまたは複数を意味してもよい。本明細書の特許請求の範囲において用いられるように、「含む」という用語と組み合わせて用いる場合、「一つ（ａ）」または「一つ（ａｎ）」とは、一つまたは複数を意味してもよい。本明細書において用いられるように、「もう一つ」とは、項目の少なくとも二番目またはそれ以上を意味してもよい。
【００３６】
「ターゲティングペプチド」とは、連続するアミノ酸配列を含むペプチドであり、好ましくはヒト由来の標的の臓器、組織、または細胞型への選択的局在を特徴とする。選択的局在は例えば、推定のターゲティングペプチド配列が、ファージの外表面上に表示されるタンパク質に組み入れられる、下記に開示する方法によって決定してもよい。特定の態様において、ＢＲＡＳＩＬによって同定されたターゲティングファージは被験者に投与され、続いて一つまたは複数の臓器、組織、または細胞型が被験者から回収され、標的の臓器、組織、または細胞型において見出されたファージが同定される。ターゲティングペプチド配列を発現するファージは、そのファージが対照組織、臓器、または細胞型と比較して、標的においてより大きな結合を示す場合、選択的に局在すると見なされる。選択的局在を決定するもう一つの方法は、推定の標的ペプチドを発現するファージが好ましくは、非特異的ペプチドを発現する、または任意の推定の標的ペプチドを発現するように遺伝子操作されていない対照ファージと比較して、標的において少なくとも２倍、より好ましくは少なくとも３倍の濃縮を示すことである。選択的局在を決定するもう一つの方法は、標的ペプチドを発現するファージの標的への局在が、標的ペプチド配列を含む合成ペプチドの同時投与によって、少なくとも部分的に阻害されることである。「ターゲティングペプチド」および「回帰ペプチド」とは、本明細書において同義に用いられる。
【００３７】
「ファージディスプレイライブラリ」とは、その外表面上に推定のターゲティングペプチドの組を発現するように遺伝子操作されているファージのコレクションを意味する。好ましい態様において、推定のターゲティングペプチドをコードするＤＮＡ配列は、ファージ被膜タンパク質をコードする遺伝子にフレームが合うように挿入される。他の好ましい態様において、推定のターゲティングペプチド配列は、一部が２０個全てのアミノ酸のランダム混合物であり、一部が非ランダム混合物である。特定の好ましい態様において、ファージディスプレイライブラリの推定のターゲティングペプチドは、ターゲティングペプチド配列内の固定位置で一つまたは複数のシステイン残基を示す。
【００３８】
「高分子複合体」とは、その配列がランダム、規則正しい、または部分的に規則正しくてもよい分子のコレクションを意味する。この用語は、バクテリオファージ、ウイルス、細菌、単細胞病原性生物、多細胞病原性生物、および原核または真核細胞のような生物を含む。この用語はまた、リポソーム、微小カプセル、微粒子および微小装置のような非生存分子群を含む。唯一の要件は、複合体が一つ以上の分子を含むことである。分子は同一であっても、または互いに異なっていてもよい。
【００３９】
ターゲティングペプチドのための「受容体」には、ターゲティングペプチドに結合する任意の分子または分子の複合体が含まれるがこれらに限定されない。受容体の非制限的な例には、ペプチド、タンパク質、糖タンパク質、リポタンパク質、エピトープ、脂質、糖質、多分子構造、一つまたは複数の分子の特異的コンフォメーションおよび形態解剖学的実体が含まれる。好ましい態様において、「受容体」とは、標的臓器、組織、または細胞型内の血管を形成する細胞の管腔表面上に存在する天然に存在する分子または分子の複合体である。
【００４０】
「被験者」とは、一般的に哺乳類を意味する。特定の好ましい態様において、被験者は、マウスまたはウサギである。さらにより好ましい態様において、被験者はヒトである。
【００４１】
ファージディスプレイ
ターゲティングペプチドを同定するための本明細書に記載の方法は、ファージディスプレイライブラリのインビトロ投与を含む。ファージディスプレイの様々な方法およびペプチドの多様な集団を作製する方法は当技術分野で周知である。例えば、そのそれぞれが参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第５，２２３，４０９号、第５，６２２，６９９号、および第６，０６８，８２９号は、ファージライブラリを調製する方法を開示する。ファージディスプレイ技術は、小さなペプチドがその表面上に発現されうるようにバクテリオファージを遺伝子操作することを含む（ＳｍｉｔｈおよびＳｃｏｔｔ、１９８５、１９９３）。この技術を適用できる可能性がある範囲はかなり広く、過去１０年の間に、ファージによって表示されたペプチドライブラリの構築、およびライブラリを用いてペプチドリガンドを単離するスクリーニング方法の開発にはかなりの進歩が認められている。例えば、ペプチドライブラリを用いることによって、相互作用部位、および炎症反応に関与する抗体または細胞接着を媒介するインテグリンのような多くのタンパク質における受容体−リガンド結合モチーフの特徴を調べることが可能となった。この方法は同様に、ペプチド模倣薬または造影剤を開発するためのリードとして役立つ新規ペプチドリガンドを同定するためにも用いられている（Ａｒａｐら、１９９８ａ）。ペプチドの他に、一本鎖抗体のようなより大きいタンパク質ドメインもまた、ファージ粒子の表面上に表示されうる（Ａｒａｐら、１９９８ａ）。
【００４２】
これまで、所定の臓器または組織をターゲティングするためのアミノ酸配列は、インビボ「バイオパニング」によって単離されていた（パスカリーニおよびルオスラーティ（ＰａｓｑｕａｌｉｎｉおよびＲｕｏｓｌａｈｔｉ）、１９９６；パスカリーニ（Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ）、１９９９）。簡単に説明すると、推定のターゲティングペプチドを含むファージのライブラリを動物またはヒト被験者に投与して、ファージを含む臓器または組織の試料を採取する。線維様ファージを利用する例において、ファージは、線毛陽性細菌におけるバイオパニングラウンドのあいだにインビトロで増殖させてもよい。細菌はファージによって溶解されないが、特定のインサートを表示するファージの多数のコピーを分泌する。標的分子に結合するファージを標的臓器または組織から溶出させて、次に、宿主細菌においてそれらを増殖させることによって増幅することができる。増幅したファージを第二の被験者に投与して、臓器または組織の試料を再度採取してもよい。選択的結合体の集団が得られるまで、多数のバイオパニングラウンドを行ってもよい。ペプチドのアミノ酸配列は、ファージゲノムにおけるターゲティングペプチドインサートに対応するＤＮＡを配列決定することによって決定する。同定されたターゲティングペプチドは、標準的なタンパク質化学技術によって合成ペプチドとして産生することができる（アラプ（Ａｒａｐ）ら、１９９８ａ；スミス（Ｓｍｉｔｈ）ら、１９８５）。このアプローチによって、その標的の特性に関する先入観なく、循環中のターゲティングペプチドを偏りのない機能的アッセイにおいて検出することができる。候補標的がターゲティングペプチドの受容体として同定されれば、標準的な生化学方法によってそれを単離、精製、そしてクローニングすることができる（パスカリーニ（Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ）、１９９９；ラジョッテおよびルオスラーティ（ＲａｊｏｔｔｅおよびＲｕｏｓｌａｈｔｉ）、１９９９）。
【００４３】
本明細書に開示のインビトロ方法も同様に、ファージディスプレイライブラリを利用する。しかし、ライブラリを生きた宿主に注入するのではなく、標的臓器、組織、または細胞型の試料をインビトロでファージディスプレイライブラリに曝露する。
【００４４】
ファージディスプレイ系の選択
マウスにおいて行われたインビボ選択研究は、ｆＵＳＥ５ベクターにおけるＩＩＩ遺伝子被膜タンパク質との融合タンパク質として発現されたランダムペプチドのライブラリを好んで用いた（ＰａｓｑｕａｌｉｎｉおよびＲｕｏｓｌａｈｔｉ、１９９６）。所定のライブラリに存在する個々のクローンの数および多様性は、インビボ選択の成否にとって重要な要因である。欠損ファージクローンの過剰発現を有する可能性が低い、第一のライブラリが好ましい（Ｋｏｉｖｕｎｅｎら、１９９９）。ライブラリの調製は、１０８〜１０９形質導入単位（Ｔ．Ｕ．）／ｍｌのあいだで最適化しうる。特定の態様において、各選択ラウンドの間にバルク増幅戦略を適用する。
【００４５】
直鎖、環状、または二環ペプチドを示すファージライブラリを用いてもよい。しかし、単環ペプチドは直鎖ペプチドより標的臓器に対して高い親和性を有する傾向があることから、環状挿入物（ＣＸ３−１０Ｃ）において３〜１０個のランダム残基を表示するファージライブラリが好ましい。二環ペプチドを示すライブラリ（ＣＸ３Ｃ Ｘ３ＣＸ３Ｃなど；Ｒａｊｏｔｔｅら、１９９８）も首尾よく用いられている。しかし、同源の合成ペプチドの産生は、可能ではあるが、異なるジスルフィド架橋配列を有する多数の配座異性体のために複雑となりうる。
【００４６】
マウスにおけるインビボファージディスプレイによる回帰ペプチドおよび受容体の同定
マウスに投与されたファージディスプレイペプチドライブラリ由来のペプチドのインビボ選択を用いて、正常なマウス脳、腎臓、肺、皮膚、膵臓、網膜、腸、小腸、子宮、前立腺、および副腎に関して選択的なターゲティングペプチドを同定した（ＰａｓｑｕａｌｉｎｉおよびＲｕｏｓｌａｈｔｉ、１９９６；Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ、１９９９；Ｒａｊｏｔｔｅら、１９９８）。これらの結果は、正常な臓器の血管内皮が、ペプチドプローブによる異なるターゲティングを可能にするために十分に不均一であることを示している（ＰａｓｑｕａｌｉｎｉおよびＲｕｏｓｌａｈｔｉ、１９９６；Ｒａｊｏｔｔｅら、１９９８）。ヌードマウスにおける腫瘍異種移植片の血管を標的とするペプチドモチーフのパネルが構築されている（Ａｒａｐら、１９９８ａ；Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ、１９９９により概説）。これらのモチーフには、配列ＲＧＤ−４Ｃ、ＮＧＲ、およびＧＳＬペプチドが含まれる。ＲＧＤ−４Ｃペプチドはこれまで、選択的に結合するαｖインテグリンとして同定されており、ヌードマウスにおける腫瘍異種移植片の血管に回帰することが示されている（Ａｒａｐら、１９９８ａ、１９９８ｂ；Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ、１９９７）。
【００４７】
腫瘍回帰ＲＧＤ４Ｃターゲティングペプチドの受容体は、αｖインテグリンとして同定されている（Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉら、１９９７）。αｖインテグリンは、血管新生において重要な役割を果たす。αｖβ３およびαｖβ５インテグリンは、正常な内皮細胞には存在しないか、または発現されても低レベルであるが、腫瘍の新生血管では誘導される（Ｂｒｏｏｋｓら、１９９４；Ｈａｍｍｅｓら、１９９６）。アミノペプチダーゼＮ／ＣＤ１３は最近、ＮＧＲモチーフの血管新生受容体であると同定されている（Ｂｕｒｇら、１９９９）。アミノペプチダーゼＮ／ＣＤ１３は、ＴＲＡＭＰマウス中の前立腺癌の新生血管だけでなく、正常上皮前立腺組織中においても強く発現されている。
【００４８】
腫瘍回帰ファージは、腫瘍の新生血管においてその受容体と同時局在するが、正常組織の非新生血管には存在しない（Ａｒａｐら、１９９８ｂ）。免疫組織化学的証拠から、血管ターゲティングファージが、組織切片においてヒト腫瘍血管に結合するが（Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉら、２０００）、正常血管には結合しないことが示されている。挿入物を有さない陰性対照ファージ（ｆｄファージ）は、正常または腫瘍組織切片に結合しなかった。血管新生受容体の発現を、細胞株、非増殖血管、および腫瘍の活性化血管、ならびに黄体のような他の血管新生組織において評価した。フローサイトメトリーおよび免疫組織化学から、これらの受容体が多くの腫瘍細胞および活性化ＨＵＶＥＣｓにおいて発現されていることが示された（データは示さない）。血管新生受容体は、マウスまたはヒト組織の正常臓器の血管において検出されなかった。
【００４９】
これらの受容体の分布を、腫瘍細胞、腫瘍血管、および正常血管において免疫組織化学によって分析した。αｖインテグリン、ＣＤ１３、アミノペプチダーゼＡ、ＮＧ２、および腫瘍血管における既知の受容体であるＭＭＰ−２／ＭＭＰ−９は、ヒトおよびマウス起源の双方の新生血管の内皮細胞および周皮細胞において特異的に発現される。新生血管は、非増殖性の内皮細胞では非常に低レベルで発現されるか、または全く発現されないマーカーを発現する（示していない）。
【００５０】
新生血管内皮のマーカーには、ＶＥＧＦおよび塩基性ＦＧＦ受容体の特異的サブタイプ、ならびに中でもαｖインテグリンのような血管増殖因子の受容体が含まれる（ＭｕｓｔｏｎｅｎおよびＡｌｉｔａｌｏ、１９９５）。これまで、新生血管の特徴である新規分子の同定および単離は、主に内皮細胞を培養で増殖させると表現型が劇的に変化するために遅れている（Ｗａｔｓｏｎら、１９９５）。
【００５１】
これらの腫瘍血管マーカーの多くはプロテアーゼであり、マーカーのいくつかは、ウイルス受容体として作用する。αｖインテグリンは、アデノウイルスの受容体であり（Ｗｉｃｋｈａｍら、１９９７ｃ）、ＣＤ１３はコロナウイルスの受容体である（Ｌｏｏｋら、１９８９）。ＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９は、エコーウイルスの受容体である（Ｋｏｉｖｕｎｅｎら、１９９９）。アミノペプチダーゼＡも同様にウイルス受容体であるように思われる。バクテリオファージは真核細胞ウイルスと同じ細胞受容体を利用する可能性がある。これらの知見は、ファージディスプレイによって単離された受容体が、同定されたペプチドモチーフを標的遺伝子治療担体として利用するための重要な特徴である、細胞内部移行（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）能を有することを示唆している。
【００５２】
標的化送達
腫瘍血管に回帰するペプチドを細胞障害薬またはアポトーシス促進ペプチドにカップリングさせると、腫瘍異種移植片を有する実験的マウスモデルにおいて親化合物より有効でより毒性の低い化合物が得られている（Ａｒａｐら、１９９８ａ；Ｅｌｌｅｒｂｙら、１９９９）。ＲＧＤ−４Ｃペプチドをアデノウイルスの表面タンパク質に挿入すると、腫瘍標的化遺伝子治療のために用いてもよいアデノウイルスベクターが得られる（Ａｒａｐら、１９９８ｂ）。
【００５３】
ＢＲＡＳＩＬ
特定の態様において、標的臓器または組織の細胞に結合したファージを未結合のファージから分離することは、ＢＲＡＳＩＬ技術を用いて行う。ＢＲＡＳＩＬ（選択的相互作用リガンドのバイオパニング迅速分析法）において、臓器または組織を、第一の相に懸濁させた細胞または小さな細胞塊に穏やかに分離する。第一の相を、適当な密度の第二の相の上に重ねて、遠心分離する。結合ファージに結合した細胞は遠心管の底に沈殿するが、未結合のファージは第一の相に残っている。これによって、ファージと細胞のあいだの結合相互作用を維持しながら、未結合のファージから結合ファージをより効率よく分離することができる。ＢＲＡＳＩＬは、ファージライブラリを水相において曝露してから遠心分離するインビトロプロトコールによって行ってもよい。好ましい態様において、第一の相は水相であり、第二の相は有機相である。本発明の範囲内で用いてもよい有機相の特異的な非制限的を下記に開示する。
【００５４】
下記の実施例に示した細胞は、主にヒト細胞であるが、本発明は、用いてもよい細胞のタイプに限定されない。ヒト、マウス、哺乳類、動物、または植物細胞、細菌、およびアメーバ、胞子、酵母、カビ、藻類、ジアルジア（Ｇｉａｒｄｉａ）、または渦鞭毛藻類のような単細胞生物を含むがこれらに限定されない、実質的に如何なるタイプの原核または真核細胞もＢＲＡＳＩＬに用いてもよい。特定の態様において、ＢＲＡＳＩＬによってスクリーニングされる細胞は、不均一な細胞集団を均一な細胞集団に分離するために、例えばＦＡＣＳ装置（ベクトン・ディッキンソン社）を用いてまずソーティングしてもよい。
【００５５】
もう一つの態様において、ファージライブラリをスクリーニングするために用いる標的には、化学物質、化合物、分子、または分子集合体のような非細胞標的が含まれてもよい。ＢＲＡＳＩＬにおいて用いられる可能性がある標的分子には、タンパク質、プロテオグリカン、糖質、脂質、糖脂質、スフィンゴリピッド、およびリポタンパク質が含まれるがこれらに限定されない。好ましい態様において、そのような非細胞標的は、ガラス、プラスチック、セラミック、または磁気ビーズのようなより大きい粒子に、共有結合によってまたは非共有結合によって結合してもよい。ファージターゲティングペプチドに対する標的の近づき易さを増加するために結合のためのリンカーを用いてもよい。そのような態様において、当業者は、遠心分離以外に、結合したファージを有機相に分離する他の方法を用いてもよいことを認識するであろう。例えば、磁気粒子を用いる場合、磁場をかけることによって粒子を有機相に分配してもよい。粒子が十分に大きい、または密度が大きい場合には、重力の影響下での粒子の沈殿を用いて結合ファージを有機相に分配してもよい。本発明は、結合ファージを有機相に分配する方法に限定されず、粒子または細胞に結合したファージを有機相または他の第二の相に分離するために当技術分野で既知の如何なる方法も用いてもよく、それらも本発明の範囲内である。
【００５６】
本発明は、沈殿させる細胞が第二の相の密度より高い密度を有し、第二の相が第一の相より高い密度を有する限り、第一および第二の相の正確な組成に関して制限的ではない。
【００５７】
好ましい態様において、第二の相の密度は、約１．０２〜１．０４であり、第一の相の密度は約１．００である。ＢＲＡＳＩＬのために用いられる細胞または細胞塊の密度は、好ましくは１．０４ ｇｍ／ｍｌ以上である。当業者は、特定の細胞型は、密度が異なってもよいこと、そして相の密度の調節によるＢＲＡＳＩＬの最適化は適当であってもよいことを認識するであろう。好ましい態様において、混合および希釈を防止するために、第一および第二の相は不混和性である。しかし、混和性の相を用いる勾配遠心分離段階が当技術分野において既知であり、これを例えば、適当な密度の塩化セシウム、ショ糖、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）、フィコール、またはパーコール溶液を用いて、本発明の実践において用いてもよい。
【００５８】
既知の密度の多様な有機溶媒を用いることができる。報告された密度１．０２〜１．０４のあいだの有機溶媒の非制限的な例には、ジイソアミルフタレート（１．０２１）、フェニルブチレート（１．０３８）、トリブチリン（１．０３５）、９−エチルアントラセン（１．０４１）、メチル−ジフェニルアミン（１．０４８）、１−２−ジメトキシ−４−（２−プロピル）−ベンゼン（１．０３９）、α−フェニル−ベンゼンエタノール（１．０３６）、３−メチル−ベンゼンチオール（１．０４１）、アセトアルデヒドセミカルバゾン（１．０３０）、フェニルアセトアルデヒド（１．０２７）、およびジベンジルアミン（１．０２６）が含まれる。他の有機化合物およびその密度は、例えば、「化学物理ハンドブック（Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｃｓ）」、第５０版、Ｃ−７５〜Ｃ５４１頁、ケミカルラバー社、クリーブランド、オハイオ州１９６９年に認められる。当然のこととして、有機相は単一の有機溶媒で構成される必要はなく、適当な密度の有機相は、下記の実施例に開示のように異なる密度の有機溶媒を混合することによって得てもよく、それらも本発明の範囲内であると考慮される。さらなる混合物を、当技術分野で既知の一般的な技術を用いて設計してもよい。当業者は、密度がしばしば温度依存性であり、細胞を沈殿させるために用いられる遠心分離温度で適当な密度が得られることを認識するであろう。様々な態様において、その温度は室温から約４℃であってもよい。遠心分離の目的のために、用いられる如何なる有機相も、用いる温度で液体でなければならない。
【００５９】
当業者はさらに、第二の相の密度の最適化が異なる細胞型にとって必要であるかも知れないことをさらに認識するであろう。例えば、ラット肝細胞（１．０７〜１．１０）、クッパー細胞（１．０５〜１．０６）、ヒト血小板（１．０４〜１．０６）、リンパ球（１．０６〜１．０８）、顆粒球（１．０８〜１．０９）、赤血球（１．０９〜１．１０）および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（１．１３）について異なる密度が認められる。これらの細胞型は全て、密度約１．０３の第二の有機相の中を沈殿すると予想されるであろう。第一（水性）の相の浸透圧は、細胞、特に堅固な細胞壁によって囲まれていない細胞の密度に影響を及ぼす可能性があるとさらに認識される。好ましい態様において、培地の浸透圧はインサイチューでの細胞の浸透圧にほぼ等しい（約１５０ ｍＭ塩濃度）。リン酸またはトリス緩衝生理食塩液（ＰＢＳまたはＴＢＳ）のような生理的浸透圧の多様な培地が当技術分野で既知である。
【００６０】
当業者はまた、高い毒性の有機相を避けるべきであることを認識するであろう。例えば、タンパク質の変性が起こるフェノールまたはホルムアルデヒドのような有機溶媒は、第二の相として用いるには望ましくない。有機溶媒の毒性特性は当技術分野で周知である。
【００６１】
特定の態様において、バックグラウンドのファージ結合をさらに減少させるために、ＢＲＡＳＩＬと共にサブトラクションプロトコールを用いてもよい。サブトラクションの目的は、関心対象の細胞以外の細胞に結合する、または非活性化細胞に結合するファージをライブラリから除去することである。もう一つの態様において、ファージライブラリは、標的細胞、組織、または臓器ではない対照細胞株、組織、または臓器に対してスクリーニングしてもよい。サブトラクションの後、ライブラリを関心対象の細胞、組織、または臓器に対してスクリーニングしてもよい。もう一つの代わりの態様において、刺激していない休止期の細胞株、組織、または臓器を、ライブラリに対してスクリーニングして、結合したファージを除去してもよい。細胞株、組織、または臓器は、例えば、ホルモン、増殖因子、サイトカイン、またはケモカインを投与することによって活性化して、活性化細胞株を差し引いたファージディスプレイに対してスクリーニングする。
【００６２】
その他のサブトラクションプロトコール法が既知であり、例えば、参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第５，８４０，８４１号、第５，７０５，６１０号、第５，６７０，３１２号、および第５，４９２，８０７号に開示されるように本発明の実践において用いてもよい。
【００６３】
タンパク質とペプチド
特定の態様において、本発明は、少なくとも一つのタンパク質またはペプチドを含む新規組成物に関する。本明細書において用いられるように、タンパク質またはペプチドは一般的に、アミノ酸２００個以上で遺伝子から翻訳された完全長の配列までのタンパク質；アミノ酸１００個以上のポリペプチド；および／またはアミノ酸約３〜約１００個のペプチドを意味するがこれらに限定されない。便宜上、「タンパク質」、「ポリペプチド、および「ペプチド」という用語は、本明細書において互換的に用いられる。
【００６４】
特定の態様において、少なくとも一つのタンパク質またはペプチドの大きさは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、約１１０、約１２０、約１３０、約１４０、約１５０、約１６０、約１７０、約１８０、約１９０、約２００、約２１０、約２２０、約２３０、約２４０、約２５０、約２７５、約３００、約３２５、約３５０、約３７５、約４００、約４２５、約４５０、約４７５、約５００、約５２５、約５５０、約５７５、約６００、約６２５、約６５０、約６７５、約７００、約７２５、約７５０、約７７５、約８００、約８２５、約８５０、約８７５、約９００、約９２５、約９５０、約９７５、約１０００、約１１００、約１２００、約１３００、約１４００、約１５００、約１７５０、約２０００、約２２５０、約２５００個のアミノ酸残基またはそれ以上を含んでもよいがこれらに限定されない。
【００６５】
本明細書において用いられるように、「アミノ酸残基」とは、当技術分野で既知の任意の天然のアミノ酸、任意のアミノ酸誘導体、または任意のアミノ酸模倣体を意味する。特定の態様において、タンパク質またはペプチドの残基は連続的であって、アミノ酸残基の配列を中断する任意の非アミノ酸は存在しない。他の態様において、配列は一つまたは複数の非アミノ酸部分を含んでもよい。特定の態様において、タンパク質またはペプチドの残基の配列は、一つまたは複数のアミノ酸部分によって中断されてもよい。特定の態様において、タンパク質またはペプチドの残基配列は、一つまたは複数のアミノ酸部分によって中断されてもよい。
【００６６】
したがって、「タンパク質またはペプチド」という用語は、天然に存在するタンパク質において認められる一般的なアミノ酸２０個の少なくとも一つ、または下記の表１に示すアミノ酸を含むがこれらに限定しない少なくとも一つの改変もしくはまれな（ｕｎｕｓｕａｌ）アミノ酸を含むアミノ酸配列を含む。
【００６７】
【表１】改変アミノ酸およびまれなアミノ酸
Figure 2004530404
【００６８】
タンパク質またはペプチドは、標準的な分子生物学的技術を用いたタンパク質、ポリペプチドもしくはペプチドの発現、タンパク質もしくはペプチドの天然資源からの単離、またはタンパク質もしくはペプチドの化学合成を含む、当業者に既知の任意の技術によって作製してもよい。様々な遺伝子に対応するヌクレオチドならびにタンパク質、ポリペプチド、およびペプチド配列がこれまでに開示されており、当業者に既知のコンピューターデータベースにおいて認められるであろう。そのような一つのデータベースは、国立バイオテクノロジー情報センターのＧｅｎＢａｎｋおよびＧｅｎＰｅｐｔデータベースである（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）。既知の遺伝子のコード領域は、本明細書に開示の技術を用いて、または当業者に既知であるように増幅および／または発現してもよい。または、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドの様々な市販の調製物が、当業者に既知である。
【００６９】
ペプチド模倣体
本発明に従ってポリペプチドを調製するためのもう一つの態様は、ペプチド模倣体を用いることである。模倣体は、タンパク質の二次構造の要素を模倣するペプチド含有分子である。例えば、参照として本明細書に組み入れられる、「バイオテクノロジーと薬学（ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙおよびＰｈａｒｍａｃｙ）」、ペズット（Ｐｅｚｚｕｔｏ）ら編、Ｃｈａｐｍａｎ ａｎｄ Ｈａｌｌ、ニューヨーク（１９９３）内、ジョンソン（Ｊｏｈｎｓｏｎ）ら、「ペプチド折り返し模倣体（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｔｕｒｎ Ｍｉｍｅｔｉｃｓ）」を参照のこと。ペプチド模倣体を用いる背景の基礎となる根本的理由は、タンパク質のペプチド骨格が、抗体と抗原の相互作用のような分子間相互作用を促進するようにアミノ酸側鎖を主に向けるように存在する点である。ペプチド模倣体は、天然の分子と類似の分子間相互作用を可能にすると予想される。これらの原理を用いて、本明細書に開示のターゲティングペプチドの天然の特性の多くを有するが、改変および改善すらされた特徴を有する第二世代の分子を操作してもよい。
【００７０】
融合タンパク質
本発明の他の態様は、融合タンパク質に関する。これらの分子は一般的に、ターゲティングペプチドの全てまたは実質的な部分が、Ｎ末端またはＣ末端で第二のポリペプチドまたはタンパク質の全てまたは実質的な部分に結合している。例えば、融合体は、異種宿主においてタンパク質の組み換え型を発現させるように他の種からのリーダー配列を用いてもよい。もう一つの有用な融合には、融合タンパク質の精製を促進するために、抗体のエピトープのような免疫学的に活性なドメインを付加することが含まれる。融合部またはその近傍に切断部位を含めると、精製後のさらなるポリペプチドの除去が促進されるであろう。他の有用な融合には、酵素からの活性部位、グリコシル化ドメイン、細胞ターゲティングシグナル、または膜貫通領域のような機能的ドメインの連結が含まれる。好ましい態様において、本発明の融合タンパク質は、治療タンパク質またはペプチドに結合したターゲティングペプチドを含む。融合タンパク質に組み入れてもよいタンパク質またはペプチドの例には、細胞抑制タンパク質、殺細胞タンパク質、アポトーシス促進物質、抗血管新生物質、ホルモン、サイトカイン、増殖因子、ペプチド薬、抗体、Ｆａｂ断片抗体、抗原、受容体タンパク質、酵素、レクチン、ＭＨＣタンパク質、細胞接着タンパク質、および結合タンパク質が含まれる。これらの例は、制限することを意味しておらず、実質的に本発明の範囲内において、タンパク質またはペプチドはターゲティングペプチドを含む融合タンパク質に組み入れることができることを意図している。融合タンパク質を作製する方法は、当業者に周知である。そのようなタンパク質は、例えば二官能架橋剤を用いる化学的結合によって、完全な融合タンパク質の新規合成によって、またはターゲティングペプチドをコードするＤＮＡ配列を第二のペプチドまたはタンパク質をコードするＤＮＡ配列に結合させた後、無傷の融合タンパク質を発現させることによって、産生することができる。
【００７１】
タンパク質の精製
特定の態様において、タンパク質またはペプチドは単離または精製してもよい。タンパク質精製技術は当業者に周知である。これらの技術は、一つのレベルで細胞、組織、または臓器のポリペプチドおよび非ポリペプチド画分へのホモジナイゼーションならびに粗分画化を含む。関心対象のタンパク質またはポリペプチドは、部分的または完全な精製を得るために（または均一になるまで精製）、クロマトグラフィーおよび電気泳動技術を用いてさらに精製してもよい。純粋なペプチドの調製に特に適した分析法は、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル排除クロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、アフィニティクロマトグラフィー、免疫アフィニティクロマトグラフィー、および等電点電気泳動である。アフィニティクロマトグラフィーによる受容体タンパク質精製の例は、その全文が参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第５，２０６，３４７号に開示されている。ペプチドを精製する特に効率のよい方法は、速いタンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）またはＨＰＬＣである。
【００７２】
精製タンパク質またはペプチドは、タンパク質またはペプチドが、その天然に得られる状態と比較して任意の程度にも精製されている、他の成分から単離可能な組成物を意味すると解釈される。したがって、単離または精製タンパク質またはペプチドも同様に、天然に存在する可能性がある環境を含まないタンパク質またはペプチドを意味する。一般的に、「精製された」とは、様々な他の成分を除去するために分画化が行われている、および組成物がその発現された生物活性を実質的に保持しているタンパク質またはペプチド組成物を意味するであろう。「実質的に精製された」という用語を用いる場合、この用語は、タンパク質またはペプチドが、組成物におけるタンパク質の約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、またはそれ以上を構成するような、組成物の主成分を形成する組成物を意味する。
【００７３】
タンパク質またはペプチドの精製の程度を定量する様々な方法が、本開示に照らして当業者に既知である。これらには、例えば、活性な画分の比活性を決定する、またはＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析によって画分内でのポリペプチドの量を評価することが含まれる。画分の純度を評価する好ましい方法は、画分の比活性を計算すること、それを最初の抽出物の比活性と比較すること、およびこのように、「〜精製倍率」によって評価して、その純度を計算することである。活性の量を示すために用いられる実際の単位は、当然、精製を行うために選択される特定のアッセイ技術、および発現されたタンパク質またはペプチドが検出可能な活性を示すか否かに依存するであろう。
【００７４】
タンパク質精製に用いるために適した様々な技術は、当業者に周知である。これらには、例えば、硫酸アンモニウム、ＰＥＧ、抗体等による沈殿、または熱変性の後に遠心分離；イオン交換、ゲル濾過、逆相、ヒドロキシアパタイト、およびアフィニティクロマトグラフィーのようなクロマトグラフィー段階；等電点電気泳動；ゲル電気泳動；ならびにこれらおよび他の技術の組み合わせが含まれる。当技術分野で一般的に既知であるように、様々な精製段階を行う順序は、変更してもよく、または特定の段階を省略してもよいと考えられ、なおも実質的に精製されたタンパク質またはペプチドを調製するための適した方法が得られる。
【００７５】
タンパク質またはペプチドは常にその最も精製された状態で提供すべきであるという一般要件はない。実際に、実質的にあまり精製されていない産物は、特定の態様において有用であると考えられる。部分精製は、より少ない精製段階を組み合わせて用いて、または同じ一般的精製スキームの異なる型を用いて行ってもよい。例えば、ＨＰＬＣ装置を用いて行われる陽イオン交換カラムクロマトグラフィーは、一般的に低圧クロマトグラフィーシステムを用いる同じ技術より大きい精製「倍率」が得られるであろうと認識される。相対的なより低い程度の精製を示す方法は、タンパク質産物の全体的な回収、または発現されたタンパク質の活性を維持するために長所を有する可能性がある。
【００７６】
アフィニティクロマトグラフィーは、単離される物質と、それが特異的に結合する分子との特異的親和性に依存するクロマトグラフィー技法である。これは、受容体−リガンドタイプの相互作用である。カラム材料は、結合パートナーの一つを不溶性のマトリクスに共有カップリングさせることによって合成される。次に、カラム材料は溶液から物質を特異的に吸収することができる。条件を結合が起こらない条件に変更すると（例えば、ｐＨ、イオン強度、温度等の変化）、溶出が起こる。マトリクスは、如何なる有意な程度にもそれ自身が分子を吸収せず、しかも広い範囲の化学、物理、および熱安定性を有する物質でなければならない。リガンドはその結合特性に影響を及ぼさないようにカップリングしなければならない。リガンドは、比較的堅固な結合を提供しなければならない。そして、試料またはリガンドを破壊することなく、物質を溶出することができなければならない。様々な態様においてアフィニティクロマトグラフィーは、ターゲティングペプチドに対する抗体、抗体に結合する抗原、ターゲティングペプチドの内在性受容体、またはターゲティングペプチドのリガンドを精製するために実施できる。
【００７７】
合成ペプチド
本発明のターゲティングペプチドは、その大きさが比較的小さいために、従来の技術に従って溶液または固体支持体上で合成することができる。様々な自動シンセサイザーが市販されており、既知のプロトコールに従って用いることができる。例えば、そのそれぞれが参照として本明細書に組み入れられる、スチュワート（Ｓｔｅｗａｒｔ）およびヤング（Ｙｏｕｎｇ）、１９８４；タム（Ｔａｍ）ら、１９８３；メリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ）、１９８６；およびバラニー（Ｂａｒａｎｙ）およびメリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ）、１９７９を参照のこと。通常、アミノ酸約６個から約３５〜５０個までの短いペプチド配列は、そのような方法によって容易に合成することができる。または、本発明のペプチドをコードするヌクレオチド配列が発現ベクターに挿入され、適当な宿主細胞に形質転換またはトランスフェクトされ、発現に適した条件で培養される組み換え型ＤＮＡ技術を用いてもよい。
【００７８】
抗体
特定の態様において、同定されたターゲティングペプチドまたはその受容体に対する抗体を作製することが望ましいかも知れない。適当なターゲティングペプチドまたは受容体、またはその一部をリンカー、ポリリンカー、または誘導体化アミノ酸によって一つまたは複数の物質にカップリング、結合（ｂｏｎｄｅｄ）、結合（ｂｏｕｎｄ）、共役、または化学的に結合させてもよい。これは、双特異的、または多価組成物またはワクチンが産生されるように行ってもよい。これらの組成物の調製において用いられる方法は、当業者に周知であり、ヒト被験者に投与するために適していなければならない、すなわち薬学的に許容されなければならないとさらに想像される。好ましい物質は、担体であり、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）である。
【００７９】
「抗体」という用語は、抗原決定領域を有する任意の抗体様分子を意味するために用いられ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖ドメイン抗体（ＤＡＢｓ）、Ｆｖ、ｓｃＦｖ（一本鎖Ｆｖ）等のような抗体断片が含まれる。様々な抗体に基づく構築物および断片を調製および用いる技術は、当技術分野で周知である。抗体を調製および特徴付けする手段も同様に、当技術分野で周知である（例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、「抗体：実験マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８８を参照のこと；参照として本明細書に組み入れられる）。
【００８０】
サイトカインとケモカイン
特定の態様において、臓器または組織に標的化送達するために、特異的生物活性物質を一つまたは複数のターゲティングペプチドにカップリングさせることが望ましいかも知れない。そのような物質には、サイトカイン、ケモカイン、アポトーシス促進因子、および抗血管新生因子が含まれるがこれらに限定されない。「サイトカイン」という用語は、細胞間メディエータとしてもう一つの細胞に作用する、一つの細胞集団によって放出されたタンパク質の総称である。そのようなサイトカインの例は、リンフォカイン、モノカイン、増殖因子、および従来のポリペプチドホルモンである。サイトカインには、ヒト成長ホルモン、Ｎ−メチオニルヒト成長ホルモン、およびウシ成長ホルモンのような成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；リラキシン；プロリラキシン；卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、および黄体形成ホルモン（ＬＨ）のような糖タンパク質ホルモン；肝増殖因子；プロスタグランジン、線維芽細胞増殖因子、プロラクチン；胎盤ラクトゲン、ＯＢタンパク質；腫瘍壊死因子−αおよび腫瘍壊死因子−β；ムレリアン阻害物質；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子；インテグリン；トロンボポエチン（ＴＰＯ）；ＮＧＦ−βのような神経生長因子；血小板増殖因子；ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−βのようなトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）；インスリン様増殖因子−Ｉおよびインスリン様増殖因子−ＩＩ；エリスロポエチン（ＥＰＯ）；骨誘導因子；インターフェロン−α、−β、および−γのようなインターフェロン；マクロファージ−ＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球−マクロファージ−ＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）、および顆粒球−ＣＳＦ（Ｇ−ＣＳＦ）のようなコロニー刺激因子（ＣＳＦ）；ＩＬ−１、ＩＬ−１α、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８のようなインターロイキン（ＩＬ）、ＬＩＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＥＰＯ、キット−リガンドまたはＦＬＴ−３、アンジオスタチン、トロンボスポンジン、エンドスタチン、腫瘍壊死因子ならびにＬＴが含まれる。本明細書において用いられるように、サイトカインという用語には、天然起源からのタンパク質または組み換え型細胞培養からのタンパク質、および本来の配列サイトカインの生物活性同等物が含まれる。
【００８１】
ケモカインは、一般的に、ケモカイン発現部位に免疫エフェクター細胞を動員するための化学誘引物質として作用する。例えば、他の免疫系成分の治療部位への動員を増強するために、サイトカイン遺伝子と併用して特定のケモカイン遺伝子を発現することが有利であろう。ケモカインには、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＡＦ、ＭＩＰ１−α、ＭＩＰ１−β、およびＩＰ−１０が含まれるが、これらに限定されない。当業者は、特定のサイトカインも同様に化学誘引作用を有することが知られており、それらも同様にケモカインという用語の下に分類されうることを認識するであろう。
【００８２】
造影剤と放射性同位元素
特定の態様において、本発明で主張されるペプチドまたはタンパク質は、様々な疾患を有する臓器または組織を造影および診断するために用いられる造影剤に結合してもよい。多くの適当な造影剤が、それらをタンパク質またはペプチドに結合させる方法と共に当技術分野で既知である（例えば、いずれも参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第５，０２１，２３６号および第４，４７２，５０９号を参照のこと）。タンパク質またはペプチドはまた、グルタルアルデヒドまたは過ヨウ素酸塩のようなカップリング剤の存在下で酵素と反応させてもよい。蛍光マーカーとの結合物は、これらのカップリング剤の存在下で、またはイソチオシアネートとの反応によって調製する。
【００８３】
造影剤として用いられる可能性がある常磁性イオンの非制限的な例には、クロム（ＩＩＩ）、マンガン（ＩＩ）、鉄（ＩＩＩ）、鉄（ＩＩ）、コバルト（ＩＩ）、ニッケル（ＩＩ）、銅（ＩＩ）、ネオジム（ＩＩＩ）、サマリウム（ＩＩＩ）、イッテルビウム（ＩＩＩ）、ガドリニウム（ＩＩＩ）、バナジウム（ＩＩ）、テルビウム（ＩＩＩ）、ジスプロシウム（ＩＩＩ）、ホルミウム（ＩＩＩ）、およびエルビウム（ＩＩＩ）が含まれ、ガドリニウムが特に好ましい。Ｘ線造影のような他の状況において有用なイオンには、ランタン（ＩＩＩ）、金（ＩＩＩ）、鉛（ＩＩ）および特にビスマス（ＩＩ）が含まれるがこれらに限定されない。
【００８４】
造影剤または治療用物質として用いられる可能性がある放射性同位元素には、アスタチン２１１、１４炭素、５１クロム、３６塩素、５７コバルト、５８コバルト、銅６７、１５２ユーロピウム、ガリウム６７、３水素、ヨウ素１２３、ヨウ素１２５、ヨウ素１３１、インジウム１１１、５９鉄、３２リン、レニウム１８６、レニウム１８８、７５セレニウム、３５硫黄、テクネチウム９９ｍ、およびイットリウム９０が含まれる。１２５Ｉは、特定の態様における使用に好ましいことが多く、テクネチウム９９ｍおよびインジウム１１１も同様に、低エネルギーであって、長い範囲の検出に適しているため、好ましいことが多い。
【００８５】
本発明の放射活性標識タンパク質またはペプチドは、当技術分野で周知の方法に従って産生してもよい。例えば、それらは、ヨウ化ナトリウムまたはヨウ化カリウム、および次亜塩素酸ナトリウムのような化学酸化剤またはラクトペルオキシダーゼのような酵素的酸化剤と接触させることによってヨウ化することができる。本発明に従うタンパク質またはペプチドは、リガンド交換プロセスによって、例えば、ペルテクネートをスズ溶液によって還元して、還元したテクネチウムをセファデックスカラム上でキレート化して、ペプチドをこのカラムに適用することによって、または直接標識技術によって、例えばペルテクネート、ＳＮＣｌ２のような還元物質、フタル酸ナトリウムカリウム溶液のような緩衝液、およびペプチドをインキュベートすることによって、テクネチウム９９ｍによって標識してもよい。金属イオンとして存在する放射性同位元素に結合するために用いられることが多い中間官能基は、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＰＴＡ）およびエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）である。ローダミン、フルオレセインイソチオシアネート、およびレノグラフィンを含む蛍光標識も同様に用いることが考慮される。
【００８６】
特定の態様において、主張されるタンパク質またはペプチドは、色素産生基質に接触させると着色産物を生じる二次結合リガンドまたは酵素（酵素タグ）に結合してもよい。適した酵素の例には、ウレアーゼ、アルカリホスファターゼ、（ホースラディッシュ）水素ペルオキシダーゼ、およびグルコースオキシダーゼが含まれる。好ましい二次結合リガンドはビオチンおよびアビジンまたはストレプトアビジン化合物である。そのような標識の利用は当業者に周知であり、例えば、それぞれが参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第３，８１７，８３７号、第３，８５０，７５２号、第３，９３９，３５０号、第３，９９６，３４５号；第４，２７７，４３７号；第４，２７５，１４９号；および第４，３６６，２４１号に記載されている。
【００８７】
架橋剤（ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｒ）
二官能架橋試薬は、アフィニティマトリクスの調製、多様な構造の改変および安定化、リガンドおよび受容体結合部位の同定、ならびに構造研究を含む多様な目的のために広く用いられている。二つの同一の官能基を有するホモ二官能試薬は、同一および異なる高分子または高分子サブユニット間の架橋を誘導するために、ならびにペプチドリガンドをその特異的結合部位に結合させるために非常に効率がよいことが判明した。ヘテロ二官能試薬は、異なる二つの官能基を含む。異なる二つの官能基の異なる反応性を利用することによって、架橋は、選択的および連続的に制御することができる。二官能架橋試薬はその官能基の特異性に従って、例えばアミノ、スルフヒドリル、グアニジノ、インドール、カルボキシル特異的置換基に分類することができる。これらの中で、遊離のアミノ基に対する試薬は、それらが市販されているため、合成が容易であるため、およびそれらを適用できる緩和な反応条件のために特に一般的となった。ヘテロ二官能架橋試薬の大部分は、一級アミン反応基とチオール反応基とを含む。
【００８８】
リガンドをリポソームに架橋させる例示的方法は、それぞれが特に参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第５，６０３，８７２号、および米国特許第５，４０１，５１１号に記載されている。様々なリガンドをアミン残基の架橋によってリポソーム表面に共有結合させることができる。リポソーム、特に、それぞれがホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）を含む微小乳化リポソーム（ＭＥＬ）および大きい単層リポソーム（ＬＵＶＥＴ）のような多層小胞（ＭＬＶ）または単層小胞は、確立された技法によって調製されている。リポソームにＰＥを含めこと、架橋目的のためにリポソーム表面上に活性な官能残基、１級アミンを提供する。上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）のようなリガンドは、ＰＥ−リポソームに首尾よく結合されている。リガンドは、リポソーム表面上の明確な部位に共有結合している。これらの部位の数および表面密度は、リポソーム製剤およびリポソームタイプによって決まる。リポソーム表面はまた、非共有結合部位を有してもよい。リガンドとリポソームとの共有結合体を形成するために、架橋試薬を有効性および生体適合性に関して調べられている。架橋試薬には、グルタルアルデヒド（ＧＡＤ）、二官能オキシラン（ＯＸＲ）、エチレングリコールジグリシジルエーテル（ＥＧＤＥ）、および水溶性カルボジイミド、好ましくは１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）が含まれる。架橋の複合体化学によって、認識物質のアミン残基とリポソームとの結合が確立される。
【００８９】
もう一つの例において、ヘテロ二官能架橋試薬および架橋試薬を用いる方法を記載する（特にその全文が参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第５，８８９，１５５号）。架橋試薬は、求核性のヒドラジド残基を求電子性のマレイミド残基と組み合わせて、それによって一つの例においてアルデヒドを遊離のチオールにカップリングさせることができる。架橋試薬は、様々な官能基を架橋するように改変することができる。
【００９０】
架橋剤も同様に、ＢＲＡＳＩＬスクリーニングにおいて用いるためにより大きい粒子に化学物質、化合物、分子、または分子集合体を結合するために有用となる可能性がある。
【００９１】
磁気ビーズ
本発明において用いられる粒子は、多様な大きさになる可能性があると想像される。大きい磁気粒子（溶液中での平均直径は１０ μｍを超える）は、弱い磁場および磁場勾配に反応することができるが、それらは急速に沈殿する傾向があり、均一な条件を必要とする反応ではその有用性は限られている。大きい粒子はまた、小さな粒子より表面積が限られており、そのためより少ない材料をそれらにカップリングさせることができる。好ましい態様において、磁気ビーズは直径１０ μｍ未満である。
【００９２】
磁気ビーズに適用可能な様々なシランカップリングが、参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第３，６５２，７６１号において考察されている。当技術分野で既知のシラン化技法は一般的に、シランの重合化および反応性表面上でのその沈着のために選択される培地によって互いに異なる。トルエン（ウィータル（Ｗｅｅｔａｌｌ）、１９７６）、メタノール（米国特許第３，９３３，９９７号）、およびクロロホルム（米国特許第３，６５２，７６１号）のような有機溶媒が用いられている。水性アルコールおよび水性溶液からの酸によるシラン沈着も同様に用いられている。
【００９３】
強磁性材料は一般的に、磁場に反応して永久磁石科する。「超常磁性」と呼ばれる材料は、磁場勾配における力を受けるがが、永久磁石化しない。磁性酸化鉄の結晶は、結晶の大きさに応じて、強磁性または超常磁性のいずれかとなる可能性がある。超常磁性鉄酸化物は、一般的に結晶の直径が約３００オングストローム（Å）未満である場合に生じ、より大きい結晶は一般的に強磁性特徴を有する。
【００９４】
分散可能な磁気酸化鉄粒子は、直径が３００ Åであると報告されており、表面アミン基は、米国特許第４，２６７，２３４号に従ってポリエチレンイミンの存在下で塩化第一鉄および塩化第二鉄（Ｆｅ２＋／Ｆｅ３＋＝１）の塩基沈殿によって調製される。これらの粒子は、調製の際に磁場に３回曝露して、再分散可能であると記述される。磁性粒子を、グルタルアルデヒド懸濁液重合化システムと混合して、磁性ポリグルタルアルデヒドミクロスフェアを形成し、これは直径が０．１ μｍであると報告されている。ポリグルタルアルデヒドミクロスフェアは、タンパク質のようなアミノ含有分子と結合を形成することができる結合アルデヒド基をその表面に有する。
【００９５】
多様な粒子の大きさは、好ましい態様において開示の方法において適用可能であると予想されるが、粒子は直径が約０．１〜約１．５ μｍのあいだである。この範囲内の平均直径を有し、約１００〜１５０ ｍ２／ｇｍもの高い表面積を有する粒子が産生され、これは高いバイオアフィニティ吸着カップリング能を提供する。この大きさの磁性粒子は、より大きい粒子が急速に沈殿する問題を克服するが、より小さな粒子を分離するために必要な磁場および磁場勾配の作製に大きい磁石を必要としない。本発明の磁性粒子を分離するために用いられる磁石は、約１００〜約１０００エルステッドのあいだの磁場を産生する必要があるに過ぎない。そのような磁場は、好ましくは磁性粒子の分散を保持する容器より小さく、このように、ベンチ上で用いるために適している可能性がある永久磁石によって得ることができる。強磁性粒子は、本発明の特定の応用において有用となる可能性があるが、超常磁性粒子は強磁性粒子に関連した磁石の集合を示さず、再分散および再利用できることから、超常磁性挙動が通常好ましい。
【００９６】
磁気粒子を調製する方法は、塩基中で金属塩を沈殿させて、細かい磁性金属酸化物の結晶を形成させること、結晶を水および電解質中で再分散させて洗浄することを含んでもよい。結晶が超常磁性である場合には、磁性分離を用いて、洗浄間に結晶を採取してもよい。次に結晶を、金属酸化物と吸着または共有結合することができ、および様々な標的分子とカップリングするための官能基を有する材料によってコーティングしてもよい。
【００９７】
非磁性ビーズ、フローサイトメトリー、およびＦＡＣＳ
もう一つの態様において、関係する標的は、ガラス、ポリアクリルアミド、ポリスチレンまたはラテックスのような非磁性ビーズに、非共有結合または共有結合してもよい。標的は、磁気ビーズに関して先の記述と同じ技術によってそのようなビーズに結合してもよい。ビーズをファージライブラリに曝露後、ビーズに結合したそれらのファージを、例えば遠心分離によって未結合のファージから分離してもよい。
【００９８】
特定の態様において、ＢＲＡＳＩＬによってスクリーニングされる細胞は、何らかの形のフローサイトメトリーを用いて予めソーティングしてもよい。フローサイトメトリー法の非制限的な例は、それぞれが参照として本明細書にその全文が組み入れられる、ベッツら（Ｂｅｔｚ、１９８４）、ウィルソンら（Ｗｉｌｓｏｎ、１９８８）、シリアンら（Ｓｃｉｌｌｉａｎ、１９８９）、フレンゲンら（Ｆｒｅｎｇｅｎ、１９９４）、グリフィスら（Ｇｒｉｆｆｉｔｈ、１９９６）、スチュアートら（Ｓｔｕａｒｔ、１９９８）、ならびに米国特許第５，８５３，９８４号および第５，９４８，６２７号に開示されている。参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第４，７２７，０２０号、第４，７０４，８９１号、および第４，５９９，３０７号は、フローサイトメーターを含む成分の配置およびその利用の一般的原理について記述している。
【００９９】
フローサイトメーターでは、ビーズ、細胞、または他の粒子を、それぞれの粒子がエネルギー源に曝露される、検出器の中を実質的に一度に通過させる。エネルギー源は一般的に、単一の波長の励起性の光を提供する。検出器は、光電子増倍管または電荷カップリング装置のような光収集単位を含み、これをコンピューターのようなデータ分析装置に接続してもよい。ビーズ、細胞、または粒子は、例えば、励起光に反応して放出された蛍光の量を検出および／または定量することによって、励起光に対するその反応を特徴としうる。特定の特徴を示すビーズまたは細胞は、ベクトンディッキンソンイムノサイトメトリーシステムズ社（サンノゼ、カリフォルニア州）が販売しているＦＡＣＳバンテッジ（商標）セルソータのような付属のセルソータを用いてソーティングすることができる。
【０１００】
核酸
本発明に従う核酸は、ターゲティングペプチド、受容体タンパク質、または融合タンパク質をコードしてもよい。核酸は、ゲノムＤＮＡ、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、または合成ＤＮＡに由来してもよい。発現ベクターに組み入れることが望ましい場合、核酸はまた、天然のイントロンまたはもう一つの遺伝子に由来するイントロンを含んでもよい。そのような操作された分子は時に、「ミニ遺伝子」と呼ばれる。
【０１０１】
本明細書において用いられる「核酸」には、一本鎖および二本鎖分子と共に、ＤＮＡ、ＲＮＡ、化学改変核酸および核酸類似体が含まれる。本発明の範囲内の核酸は、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、約１１０、約１２０、約１３０、約１４０、約１５０、約１６０、約１７０、約１８０、約１９０、約２００、約２１０、約２２０、約２３０、約２４０、約２５０、約２７５、約３００、約３２５、約３５０、約３７５、約４００、約４２５、約４５０、約４７５、約５００、約５２５、約５５０、約５７５、約６００、約６２５、約６５０、約６７５、約７００、約７２５、約７５０、約７７５、約８００、約８２５、約８５０、約８７５、約９００、約９２５、約９５０、約９７５、約１０００、約１１００、約１２００、約１３００、約１４００、約１５００、約１７５０、約２０００、約２２５０、約２５００個のヌクレオチド残基またはそれ以上の長さであってもよいと考えられる。
【０１０２】
ターゲティングペプチド、融合タンパク質、および受容体は、適当なアミノ酸配列をコードする任意の核酸配列によってコードされうると考えられる。所望のアミノ酸配列をコードする核酸の設計および産生は、標準化コドン表を用いて当業者に周知である（下記の表２を参照のこと）。好ましい態様において、それぞれのアミノ酸をコードするために選択されたコドンは、関心対象の宿主細胞において核酸の発現を最適にするように改変してもよい。宿主細胞の様々な種のコドン選択性は当技術分野で周知である。
【０１０３】
【表２】
Figure 2004530404
Figure 2004530404
【０１０４】
所望のターゲティングペプチド、融合タンパク質または受容体アミノ酸配列をコードする核酸の他に、本発明は、そのようなコードする核酸配列と高ストリンジェンシー条件でハイブリダイズする相補的核酸を含む。核酸ハイブリダイゼーションのための高ストリンジェンシー条件は当技術分野で周知である。例えば、条件は、温度約５０℃〜約７０℃で約０．０２ Ｍ〜約０．１５ Ｍ ＮａＣｌによって提供される条件のように、低い塩および／または高い温度条件を含んでもよい。所望のストリンジェンシーの温度およびイオン強度は特定の核酸、標的配列の長さおよびヌクレオチド含有量、核酸の荷電組成物、およびハイブリダイゼーション混合物中のホルムアミド、塩化テトラメチルアンモニウム、または他の溶媒の存在または濃度によって部分的に決定される。
【０１０５】
クローニング、遺伝子移入、および発現のためのベクター
特定の態様において、発現ベクターを用いてターゲティングペプチドまたは融合タンパク質を発現して、次にこれを精製および用いることができる。他の態様において、発現ベクターは、遺伝子治療において用いられる。発現は、適当なシグナルがベクターにおいて提供される必要があり、宿主細胞において関心対象の遺伝子の発現を促進するウイルスおよび哺乳類起源の双方からのエンハンサー／プロモーターのような様々な調節要素が含まれる。宿主細胞においてメッセンジャーＲＮＡ安定性および翻訳可能性を最適にするように設計した要素も同様に既知である。
【０１０６】
調節要素
「発現構築物」または「発現ベクター」という用語は、核酸コード配列の一部または全てが転写されることが可能である遺伝子産物をコードする核酸を含む任意の種類の遺伝子構築物が含まれることを意味する。好ましい態様において、遺伝子産物をコードする核酸は、プロモーターの転写制御下である。「プロモーター」は、細胞の合成機構または導入された合成機構によって認識され、遺伝子の特異的転写を開始するために必要なＤＮＡ配列を意味する。「転写制御下」という用語は、プロモーターが、ＲＮＡポリメラーゼの開始および遺伝子の発現を制御するために、核酸に対して正しい位置および方向に存在することを意味する。
【０１０７】
関心対象の核酸配列の発現を制御するために用いられる特定のプロモーターは、標的細胞において核酸の発現を指示することができる限り、重要ではないと考えられている。このように、ヒト細胞が標的となる場合、ヒト細胞において発現されることができるプロモーターに隣接してその制御下にあるように核酸コード領域を配置することが好ましい。一般的に、そのようなプロモーターには、ヒトまたはウイルスプロモーターのいずれかが含まれてもよい。
【０１０８】
様々な態様において、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期遺伝子プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ラウス肉腫ウイルス長末端反復、ラットインスリンプロモーター、およびグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼプロモーターを用いて、関心対象のコード配列の高レベル発現を得ることができる。関心対象のコード配列の発現を得るために、当技術分野で周知である他のウイルスもしくは哺乳類の細胞プロモーターまたは細菌ファージプロモーターを用いることも同様に、発現レベルが所定の目的にとって十分である限り考慮される。
【０１０９】
ｃＤＮＡ挿入物を用いる場合、典型的にこれは遺伝子転写物の適切なポリアデニル化を行うためにポリアデニル化シグナルを含むであろう。ポリアデニル化シグナルの特性は、本発明の実践の成功にとって重要ではないと考えられ、ヒト成長ホルモン、およびＳＶ４０ポリアデニル化シグナルのようなそのような任意の配列を用いてもよい。同様に、ターミネータも発現構築物の要素として同様に考慮される。これらの要素は、メッセージレベルを増強して構築物からの他の配列への読み過ごしを最小限にするように作用しうる。
【０１１０】
選択マーカー
本発明の特定の態様において、本発明の核酸構築物を含む細胞は、発現構築物にマーカーを含めることによってインビトロまたはインビボで同定してもよい。そのようなマーカーは、細胞に対して同定可能な変化を付与して、発現構築物を含む細胞を容易に同定できるようにするであろう。通常、薬物選択マーカーを含めると、形質転換体のクローニングおよび選択に役立つ。例えば、ネオマイシン、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、ＤＨＦＲ、ＧＰＴ、ゼオシン、およびヒスチジノールに対して抵抗性を付与する遺伝子は、有用な選択マーカーである。または、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ｔｋ）のような酵素、またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）のような酵素を用いてもよい。免疫学的マーカーも同様に用いることができる。用いられる選択マーカーは、それが遺伝子産物をコードする核酸と同時に発現されることができる限り、重要ではないと考えられる。選択マーカーのさらなる例は当業者に周知である。
【０１１１】
発現ベクターの送達
発現ベクターを細胞に導入する多くの方法がある。本発明の特定の態様において、発現構築物は、ウイルス、またはウイルスゲノムに由来する操作された構築物を含む。特定のウイルスは受容体媒介エンドサイトーシスによって細胞内に入ることができること、宿主細胞ゲノムに組み入れられうること、およびウイルス遺伝子を安定かつ効率よく発現できることによって、それらは、哺乳類細胞に外来遺伝子を移入するための魅力的な候補物質となる（Ｒｉｄｇｅｗａｙ、１９８８；ＮｉｃｏｌａｓおよびＲｕｂｅｎｓｔｅｉｎ、１９８８；ＢａｉｃｈｗａｌおよびＳｕｇｄｅｎ、１９８６；Ｔｅｍｉｎ、１９８６）。一般的に、好ましい遺伝子治療ベクターはウイルスベクターである。
【０１１２】
外来の遺伝子材料を許容することができるいくつかのウイルスは、それらが順応することができるヌクレオチドの数およびそれらが感染する細胞の範囲が制限されるが、これらのウイルスは遺伝子発現を首尾よく行うことができることが証明されている。しかし、アデノウイルスは、宿主ゲノムにその遺伝子材料を組み入れず、したがって、遺伝子発現のために宿主複製を必要とせず、そのためそれらは迅速で、効率のよい、異種遺伝子発現にとって理想的に適している。複製欠損ウイルスを調製する技術は当技術分野で周知である。
【０１１３】
ウイルス送達系を用いる場合はもちろん、それがベクター構築物を受け入れる細胞、動物または個体において望ましくない反応を引き起こさないように、欠損干渉ウイルス粒子またはエンドトキシンおよび他の発熱物質のような望ましくない混入物を本質的に含まないようにするために十分にビリオンを精製することが望ましいであろう。ベクターを精製する非制限的な手段は、塩化セシウム勾配遠心のような懸濁密度勾配を用いることを含む。
【０１１４】
遺伝子ベクターとして用いられるＤＮＡウイルスは、パポバウイルス（例えば、シミアンウイルス４０、ウシ乳頭腫ウイルス、およびポリオーマ）（Ｒｉｄｇｅｗａｙ、１９８８；ＢａｉｃｈｗａｌおよびＳｕｇｄｅｎ、１９８６）およびアデノウイルス（Ｒｉｄｇｅｗａｙ、１９８８；ＢａｉｃｈｗａｌおよびＳｕｇｄｅｎ、１９８６）が含まれる。
【０１１５】
インビボ送達のための好ましい方法の一つは、アデノウイルス発現ベクターを用いることを含む。アデノウイルスベクターは、ゲノムＤＮＡに対する組み込み能が低いことが知られているが、この特徴は、これらのベクターによって得られる遺伝子移入効率が高いことによって相殺される。「アデノウイルス発現ベクター」は、（ａ）構築物のパッケージングを支持するため、および（ｂ）その中にクローニングされているアンチセンスポリヌクレオチドを発現するために十分なアデノウイルス配列を含む構築物を含むことを意味する。
【０１１６】
発現ベクターは、アデノウイルスの遺伝子操作型を含む。アデノウイルスの遺伝子構築が、３６ ｋｂの直線状の二本鎖ＤＮＡウイルスであることを理解すれば、アデノウイルスＤＮＡの大きい断片を７ｋｂまでの外来配列に置換することが可能である（ＧｒｕｎｈａｕｓおよびＨｏｒｗｉｔｚ、１９９２）。レトロウイルス感染症とは対照的に、宿主細胞のアデノウイルス感染症は、アデノウイルスＤＮＡがエピソームにおいて複製できることから、染色体組み込みが起こらず、可能性がある遺伝子毒性を示さない。同様に、アデノウイルスは構造的に安定であり、十分に増幅させた後もゲノム再編成は検出されていない。アデノウイルスは、その細胞周期段階によらず、実質的に全ての上皮細胞に感染することができる。これまで、アデノウイルス感染症は、ヒトにおける急性呼吸器疾患のようにごく軽度の疾患に関係しているように思われる。
【０１１７】
アデノウイルスは、そのゲノムの大きさが中等度であること、操作が容易であること、高力価、広い細胞範囲、および高い感染性のために、遺伝子移入ベクターとして用いるために特に適している。ウイルスゲノムの両端は１００塩基対〜２００塩基対の逆方向反復配列（ＩＴＲ）を含み、これはウイルスＤＮＡ複製およびパッケージングにとって必要なシス要素である。ゲノムの初期（Ｅ）および後期（Ｌ）領域は、ウイルスＤＮＡ複製の開始によって分割される異なる転写単位を含む。Ｅ１領域（Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ）は、ウイルスゲノムおよびいくつかの細胞遺伝子の転写の調節に関与するタンパク質をコードする。Ｅ２領域（Ｅ２ＡおよびＥ２Ｂ）の発現によって、ウイルスＤＮＡ複製のためのタンパク質の合成が起こる。これらのタンパク質は、ＤＮＡ複製、後期遺伝子発現、および宿主細胞の遮断（Ｒｅｎａｎ、１９９０）に関係している。ウイルスカプシドタンパク質の大多数を含む後期遺伝子の産物は、主要な後期プロモーター（ＭＬＰ）によって生じた単一の主転写物の有意なプロセシングの後に限って発現される。ＭＬＰ（１６．８ ｍ．ｕ．に存在）は、感染の後期段階において特に効率的であり、このプロモーターに由来する全てのｍＲＮＡは、５’−３連（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ）リーダー（ＴＰＬ）配列を有し、それによってそれらは翻訳にとって好ましいｍＲＮＡとなる。
【０１１８】
現在用いられている系において、組み換え型アデノウイルスは、シャトルベクターとプロウイルスベクターとの相同的組み換えによって生じる。二つのプロウイルスベクターのあいだの可能性がある組み換えにより、野生型アデノウイルスがこのプロセスから生じる可能性がある。したがって、個々のプラークからウイルスの単一のクローンを単離して、そのゲノム構造を調べることが重要である。
【０１１９】
複製欠損であるアデノウイルスベクターの作製および増殖は、Ａｄ５ ＤＮＡ断片によってヒト胎児腎細胞から形質転換され、Ｅ１タンパク質を構成的に発現する２９３と呼ばれる独自のヘルパー細胞株に依存する（Ｇｒａｈａｍら、１９７７）。Ｅ３領域は、アデノウイルスゲノムにとって重要ではないため（ＪｏｎｅｓおよびＳｈｅｎｋ、１９７８）、現在のアデノウイルスベクターは、２９３細胞の助けを借りて、Ｅ１、Ｅ３、または双方の領域のいずれかに外来ＤＮＡを有する（ＧｒａｈａｍおよびＰｒｅｖｅｃら、１９９１）。本質的に、アデノウイルスは、野生型ゲノムの約１０５％をパッケージングすることができ（Ｇｈｏｓｈ−Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙら、１９８７）、約２ｋｂの余分のＤＮＡの容量を提供する。Ｅ１領域およびＥ３領域において置換可能な約５．５ ｋｂのＤＮＡと組み合わせると、現在のアデノウイルスベクターの最大容量は７．５ ｋｂ以下、またはベクターの全長の約１５％である。アデノウイルスウイルスゲノムの８０％以上がベクター骨格に残っており、ベクター媒介細胞障害性の原因となる。同様に、Ｅ１欠失ウイルスの複製欠損も不完全である。例えば、ウイルス遺伝子発現の漏出は、現在利用可能なベクターについて高い感染多重度（ＭＯＩ）で認められる（Ｍｕｌｌｉｇａｎ、１９９３）。
【０１２０】
ヘルパー細胞株は、ヒト胎児腎細胞、筋細胞、造血細胞、または他のヒト胎児間葉細胞または上皮細胞のようなヒト細胞に由来してもよい。または、ヘルパー細胞は、ヒトアデノウイルスにとって許容される他の哺乳類種の細胞に由来してもよい。そのような細胞には、例えば、Ｖｅｒｏ細胞、または他のサル胎児間葉もしくは上皮細胞が含まれる。考察したように、好ましいヘルパー細胞株は２９３である。
【０１２１】
レイチャー（Ｒａｃｈｅｒ）ら（１９９５）は、２９３細胞を培養して、アデノウイルスを増殖させる改善された方法を開示した。一つの形式において、個々の細胞を培地１００ ｍｌ〜２００ ｍｌを含む１Ｌのシリコン処理スピナーフラスコ（Ｔｅｃｈｎｅ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）に接種して天然の細胞凝集体を増殖させる。４０ ｒｐｍで攪拌した後、細胞生存率をトリパンブルーによって推定する。もう一つの形式において、フィブラ−セル微小担体（５ ｇ／ｌ）（Ｂｉｂｂｙ Ｓｔａｒｌｉｎ、Ｓｔｏｎｅ、ＵＫ）を以下のように用いる。培地５ｍｌに再懸濁させた細胞接種物を２５０ ｍｌアーレンマイヤーフラスコ中の担体（５０ ｍｌ）に加えて、時折攪拌しながら１時間〜４時間静置した。次に、培地を新鮮な培地５０ ｍｌに交換して振とうを開始する。ウイルスを産生するために、細胞を約８０％コンフルエンスまで増殖させて、その後培地を交換して（最終容積の２５％）、アデノウイルスをＭＯＩ ０．０５で加える。培養物を一晩静置して、その後容積を１００％まで増加させて、振とうをさらに７２時間行う。
【０１２２】
アデノウイルスベクターが複製欠損である、または少なくとも条件的に欠損であるという要件以外に、アデノウイルスベクターの特性は、本発明の実施の成功にとって重要ではないと考えられる。アデノウイルスは、既知の異なる血清型４２個またはサブグループＡ〜Ｆのいずれかであってもよい。サブグループＣのアデノウイルス５型は、本発明において用いられる条件的複製欠損アデノウイルスベクターを得るために好ましい開始材料である。これは、５型アデノウイルスが、それに関する膨大な生化学および遺伝子情報が既知であるヒトアデノウイルスであるためであり、このためこのアデノウイルスは、歴史的にアデノウイルスをベクターとして用いるほとんどの構築物について用いられている。
【０１２３】
本発明を実践するために適用可能な典型的なベクターは、複製欠損であり、アデノウイルスＥ１領域を有さないであろう。このように、Ｅ１コード配列が除去されている位置で遺伝子をコードするポリヌクレオチドを導入することが最も簡便である。しかし、アデノウイルス配列内の構築物の挿入位置は重要ではない。関心対象の遺伝子をコードするポリヌクレオチドも同様に、カールソン（Ｋａｒｌｓｓｏｎ）ら、１９８６によって記載されるようにＥ３置換ベクターにおいて欠失されたＥ３領域の代わりに、またはヘルパー細胞株もしくはヘルパーウイルスがＥ４欠損を補う場合にはＥ４領域の代わりに挿入してもよい。
【０１２４】
アデノウイルスは、増殖および操作が容易で、インビトロおよびインビボで広い宿主範囲を示す。このグループのウイルスは、高い力価、例えば、１０９〜１０１１プラーク形成単位／ｍｌで得ることができ、それらは非常に感染性である。アデノウイルスの生活環は宿主細胞ゲノムに組み入れられる必要はない。アデノウイルスベクターによって送達される外来遺伝子は、エピソームであり、したがって、宿主細胞に対する遺伝子毒性は低い。野生型アデノウイルスをワクチン接種した研究では副作用は報告されておらず（Ｃｏｕｃｈ、１９６３；Ｔｏｐら、１９７１）、インビボ遺伝子移入ベクターとしてのその安全性および治療能を証明する。
【０１２５】
アデノウイルスベクターは、真核細胞遺伝子発現（Ｌｅｖｒｅｒｏら、１９９１；Ｇｏｍｅｚ−Ｆｏｉｘら、１９９２）およびワクチン開発（ＧｒｕｎｈａｕｓおよびＨｏｒｗｉｔｚ、１９９２；ＧｒａｈａｍおよびＰｒｅｖｅｃ、１９９１）に用いられている。最近、動物試験から、組み換え型アデノウイルスが遺伝子治療に用いられ得ることが示唆された（Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−ＰｅｒｒｉｃａｕｄｅｔおよびＰｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ、１９９１；Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔら、１９９０；Ｒｉｃｈら、１９９３）。異なる組織に組み換え型アデノウイルスを投与する研究には、気管注入（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、１９９１；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、１９９２）、筋肉注射（Ｒａｇｏｔら、１９９３）、末梢静脈注射（ＨｅｒｚおよびＧｅｒａｒｄ、１９９３）、および脳への定位注射（Ｌｅ Ｇａｌ Ｌａ Ｓａｌｌｅら、１９９３）が含まれる。
【０１２６】
他の遺伝子移入ベクターは、レトロウイルスから構築してもよい。レトロウイルスは、逆転写のプロセスによって感染細胞においてそのＲＮＡを二本鎖ＤＮＡに変換できることを特徴とする一本鎖ＲＮＡウイルスの群である（Ｃｏｆｆｉｎ、１９９０）。次に、得られたＤＮＡは、プロウイルスとして細胞の染色体に安定に組み入れられ、ウイルスタンパク質の合成を指示する。組み込みによって、レシピエント細胞およびその子孫においてウイルス遺伝子配列が保持される。レトロウイルスゲノムは、カプシドタンパク質、ポリメラーゼ酵素、およびエンベロープ成分をそれぞれコードする３つの遺伝子、ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖを含む。ｇａｇ遺伝子から上流に認められる配列は、ゲノムをビリオンにパッケージングするためのシグナルを含む。二つの長末端反復（ＬＴＲ）配列は、ウイルスゲノムの５’および３’末端に存在する。これらは、強いプロモーターおよびエンハンサー配列を含み、同様に、宿主細胞ゲノムへの組み込みにとって必要である（Ｃｏｆｆｉｎ、１９９０）。
【０１２７】
レトロウイルスベクターを構築するために、関心対象のタンパク質をコードする核酸を、特定のウイルス配列の代わりにウイルスゲノムに挿入して、複製欠損であるウイルスを作製する。ビリオンを産生するために、ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ遺伝子を含むが、ＬＴＲおよびパッケージング成分を含まないパッケージング細胞株を構築する（Ｍａｎｎら、１９８３）。レトロウイルスＬＴＲおよびパッケージング配列と共にｃＤＮＡを含む組み換え型プラスミドをこの細胞株に導入する場合（例えば、リン酸カルシウムによって）、パッケージング配列によって、組み換え型プラスミドのＲＮＡ転写物をウイルス粒子にパッケージングすることが可能となり、次に、これを培養培地に分泌する（ＮｉｃｏｌａｓおよびＲｕｂｅｎｓｔｅｉｎ、１９８８；Ｔｅｍｉｎ、１９８６；Ｍａｎｎら、１９８３）。次に、組み換え型レトロウイルスを含む培地を回収して、選択的に濃縮し、遺伝子移入のために用いる。レトロウイルスベクターは広く多様な細胞型に感染することができる。しかし、組み込みおよび安定な発現には宿主細胞の分割を必要とする（Ｐａｓｋｉｎｄら、１９７５）。
【０１２８】
レトロウイルスベクターを用いることには特定の制限がある。例えば、レトロウイルスベクターは、通常、細胞ゲノムにおけるランダムな部位に組み入れられる。このため、宿主遺伝子の中断によって、または隣接遺伝子の機能を妨害することができるウイルス調節配列の挿入によって挿入変異誘発が起こりうる（Ｖａｒｍｕｓら、１９８１）。欠損レトロウイルスベクターを用いる場合のもう一つの懸念は、パッケージング細胞において野生型複製コンピテントウイルスが出現する可能性である。これは、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ配列から上流の組み換え型ウイルス挿入物からの無傷の配列が宿主細胞ゲノムに組み入れられる組み換え事象が原因である可能性がある。しかし、今では新しいパッケージング細胞株を利用することができ、それらは組み換えの可能性を大きく減少させるはずである（Ｍａｒｋｏｗｉｔｚら、１９８８；Ｈｅｒｓｄｏｒｆｆｅｒら、１９９０）。
【０１２９】
他のウイルスベクターを発現構築物として用いてもよい。ワクシニアウイルス（Ｒｉｄｇｅｗａｙ、１９８８；ＢａｉｃｈｗａｌおよびＳｕｇｄｅｎ、１９８６；Ｃｏｕｐａｒら、１９８８）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）（Ｒｉｄｇｅｗａｙ、１９８８；ＢａｉｃｈｗａｌおよびＳｕｇｄｅｎ、１９８６；ＨｅｒｍｏｎａｔおよびＭｕｚｙｃｓｋａ、１９８４）、およびヘルペスウイルスのようなウイルスに由来するベクターを用いてもよい。それらは様々な哺乳類細胞にとっていくつかの魅力的な特徴を提供する（Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ、１９８９；Ｒｉｄｇｅｗａｙ、１９８８；ＢａｉｃｈｗａｌおよびＳｕｇｄｅｎ、１９８６；Ｃｏｕｐａｒら、１９８８；Ｈｏｒｗｉｃｈら、１９９０）。
【０１３０】
発現構築物を培養哺乳類細胞に移入するためのいくつかの非ウイルス法もまた、本発明によって考慮される。これらには、リン酸カルシウム沈殿（ＧｒａｈａｍおよびＶａｎ Ｄｅｒ Ｅｂ、１９７３；ＣｈｅｎおよびＯｋａｙａｍａ、１９８７；Ｒｉｐｐｅら、１９９０）、ＤＥＡＥデキストラン（Ｇｏｐａｌ、１９８５）、エレクトロポレーション（Ｔｕｒ−Ｋａｓｐａら、１９８６；Ｐｏｔｔｅｒら、１９８４）、直接マイクロインジェクション、ＤＮＡ負荷リポソーム、およびリポフェクタミン−ＤＮＡ複合体、細胞の超音波処理、高速微小弾丸を用いた遺伝子衝突、および受容体媒介トランスフェクション（ＷｕおよびＷｕ、１９８７；ＷｕおよびＷｕ、１９８８）が含まれる。これらの技術のいくつかは、インビボまたはエキソビボでの使用に首尾よく適合させてもよい。
【０１３１】
本発明のさらなる態様において、発現構築物はリポソームに封入してもよい。リポソームはリン脂質二重膜と内側の水性媒体とを特徴とする小胞構造である。多層リポソームは水性媒体で分かれた多数の脂質層を有する。それらは、リン脂質が過剰量の水溶液に懸濁されると自然に形成する。脂質成分は閉鎖構造を形成する前に自己再配列を受けて、脂質二重層の間に水と溶存溶質とを捕獲する。同様に、リポフェクタミン−ＤＮＡ複合体も考慮される。
【０１３２】
リポソーム媒介核酸送達および外来ＤＮＡのインビトロでの発現は非常に成功している。ウォン（Ｗｏｎｇ）ら、（１９８０）は、培養ニワトリ胚、ＨｅＬａ、および肝腫細胞において外来ＤＮＡのリポソーム媒介送達および発現の実現可能性を証明した。ニコラウ（Ｎｉｃｏｌａｕ）ら、（１９８７）は、静脈内注射後のラットにおいてリポソーム媒介遺伝子移入に成功した。
【０１３３】
ｔｋ細胞、ｈｇｐｒｔ細胞、またはａｐａｒｔ細胞においてそれぞれ、ＨＳＶチミジンキナーゼ、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子を含むがこれらに限定されない多くの選択系を用いてもよい。同様に、抗代謝物抵抗性を、メソトレキセートに対する抵抗性を付与するｄｈｆｒ、ミコフェノール酸に対する抵抗性を付与するｇｐｔ、アミノグリコシドＧ４１８に対する抵抗性を付与するｎｅｏ、およびハイグロマイシンに対する抵抗性を付与するｈｙｇｒｏを選択するための基礎として用いることができる。
【０１３４】
薬学的組成物
臨床応用を考慮する場合、薬学的組成物発現ベクター、ウイルス保存液、タンパク質、抗体、および薬剤を意図する適用にとって適当な形で調製する必要があるかも知れない。一般的に、これは、ヒトまたは動物に対して有害となりうる不純物を本質的に含まない組成物を調製することを含むであろう。
【０１３５】
一般的に、送達ベクターを安定にして、標的細胞によって取り込まれることができるように、適当な塩および緩衝液を用いることが望まれるであろう。組み換え型細胞を患者に導入する場合には緩衝液も同様に用いる。本発明の水性組成物は、薬学的に許容される担体または水性培地に溶解または分散させたタンパク質またはペプチドの有効量を含む。そのような組成物も同様に、接種物と呼ばれる。「薬学的または薬理学的に許容される」という用語は、動物またはヒトに投与した場合に有害、アレルギー、またはその他の望ましくない反応を引き起こさない分子実体および組成物を意味する。本明細書において用いられるように、「薬学的に許容される担体」には、任意のおよび全ての溶媒、分散培地、コーティング、抗菌および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤等が含まれる。そのような培地および物質を薬学的活性物質のために用いることは当技術分野で周知である。従来の培地または物質が本発明のタンパク質またはペプチドと不適合である場合を除き、治療的組成物において用いることが考慮される。補助活性成分も同様に組成物に組み入れることができる。
【０１３６】
本発明の活性組成物には、古典的な薬学的調製物が含まれてもよい。本発明に従うこれらの組成物の投与は、標的組織がその経路によって利用可能である限り、任意の一般的な経路によってなしうる。これには、経口、鼻腔内、口腔内、直腸内、膣内、または局所投与が含まれる。または、投与は、正所性、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、動脈内、または静脈内注射であってもよい。そのような組成物は通常、上記の薬学的に許容される組成物として投与されるであろう。
【０１３７】
注射によって用いるために適した薬学的剤形は、滅菌水溶液または分散液、および注射可能滅菌溶液または分散液の即時調合製剤のための滅菌粉末が含まれる。全ての場合において、製剤は滅菌でなければならず、容易なシリンジ操作性が存在する程度に流動性でなければならない。これは、製造および保存条件で安定でなければならず、細菌および真菌のような微生物の混入作用に対して保存されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール等）、その適した混合物、および植物油を含む溶媒または分散培地となりうる。適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングを用いることによって、分散剤の場合には必要な粒子径を維持することによって、および界面活性剤を用いることによって維持することができる。微生物の作用の予防は、様々な抗菌および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等によって得ることができる。多くの場合、等張剤、例えば糖または塩化ナトリウムを含めることが好ましい。注射可能な組成物の持続的な吸収は、吸収を遅らせる物質、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物において用いることによって得ることができる。
【０１３８】
注射可能滅菌溶液は、必要な量の活性化合物を、先に列挙した様々な他の成分と共に適当な溶媒において組み入れて、必要であれば濾過滅菌することによって調製される。一般的に、分散剤は、様々な滅菌活性成分を滅菌媒体に組み入れることによって調製される。注射可能滅菌溶液を調製するための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、活性成分および先に濾過滅菌したその溶液からの任意のさらなる所望の成分の粉末を生じる真空乾燥および凍結乾燥技術である。
【０１３９】
治療用物質
特定の態様において、化学療法剤を、腫瘍に選択的に送達するためのターゲティングペプチドまたは融合タンパク質に結合してもよい。用いるために適した物質または因子には、細胞に適用した場合にＤＮＡ損傷を誘導する任意の化学化合物が含まれてもよい。化学療法剤には、５−フルオロウラシル、ブレオマイシン、ブスルファン、カンプトテシン、カルボプラチン、クロラムブシル、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、シクロホスファミド、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エストロゲン受容体結合物質、エトポシド（ＶＰ１６）、ファルネシル−タンパク質トランスフェラーゼ阻害剤、ゲムシタビン、イフォスファミド、メクロレタミン、メルファラン、マイトマイシン、ナベルビン、ニトロソウレア、プリコマイシン、プロカルバジン、ラロキシフェン、タモキシフェン、タキソール、テマゾロミド（ＤＴＩＣの水溶性型）、トランスプラチナ、ビンブラスチンおよびメソトレキセート、ビンクリスチン、または上記の任意の類似体もしくは誘導体変種が含まれるがこれらに限定されない。ほとんどの化学療法剤は以下の分類に入る：アルキル化剤、抗代謝剤、抗腫瘍抗生物質、コルチコステロイドホルモン、分裂阻害剤、およびニトロソウレア、ホルモン物質、雑多な物質、およびその任意の類似体または誘導体変種。
【０１４０】
化学療法剤および投与方法、用量等は、当業者に周知であり（例えば、関連部分が参照として本明細書に組み入れられる、「医師用添付文書集」、ＧｏｏｄｍａｎおよびＧｉｌｍａｎの「治療の薬理学的基礎（Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）」、および「レミントンの薬化学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」、を参照のこと）、本明細書に開示に照らして本発明と組み合わせてもよい。用量の何らかの変更は、治療すべき被験者の状態に応じて必要に応じて起こるであろう。投与の責任者は、いずれにせよ、個々の被験者に関して適当な用量を決定するであろう。特定の化学療法剤および用量レジメの例も同様に本明細書に記載する。当然、これらの用量および物質および投与レジメは全て、制限するためではなく一例であって、特定の患者または適用に関して当業者は他の用量または物質を用いてもよい。これらの点のあいだの任意の用量、またはそこから誘導されうる範囲も同様に、本発明において用いられると予想される。
【０１４１】
アルキル化剤
アルキル化剤は、ゲノムＤＮＡと直接相互作用して癌細胞の増殖を防止する薬剤である。この範疇の化学療法剤は、細胞周期の全ての相に影響を及ぼす、すなわちそれらは相特異的ではない物質を表す。アルキル化剤には、ニトロジェンマスタード、エチレニメン、メチルメラミン、アルキルスルホネート、ニトロソウレア、またはトリアジンが含まれてもよいがこれらに限定されない。それらには、ブスルファン、クロラムブシル、シスプラチン、シクロホスファミド（シトキサン）、ダカルバジン、イフォスファミド、メクロレタミン（マスタージェン）、およびメルファランが含まれるがこれらに限定されない。
【０１４２】
抗代謝剤
抗代謝剤はＤＮＡおよびＲＮＡ合成を破壊する。アルキル化剤とは異なり、それらは細胞周期のＳ期に特異的に影響を及ぼす。抗代謝剤は、葉酸類似体、ピリミジン類似体およびプリン類似体ならびに関連阻害化合物のような様々な範疇に分類することができる。抗代謝剤には、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、シタラビン（Ａｒａ−Ｃ）、フルダラビン、ゲミシタビンおよびメソトレキセートが含まれるがこれらに限定されない。
【０１４３】
天然物
天然物は一般的に、最初に天然資源から単離された化合物を意味する。そのような化合物、その類似体および誘導体は天然起源から単離してもよく、当業者に既知の任意の技術によって化学合成または組み換えによって産生してもよい。天然物には、分裂阻害剤、抗腫瘍抗生物質、酵素および生物反応修飾剤のような分類が含まれる。
【０１４４】
分裂阻害剤には、細胞分裂または分裂に必要ないずれかのタンパク質合成を阻害することができる植物アルカロイドおよび他の天然物が含まれる。それらは、細胞周期の特定の期において作用する。分裂阻害剤には、例えば、ドセタキセル、エトポシド（ＶＰ１６）、テニポシド、パクリタキセル、タキソール、ビンブラスチン、ビンクリスチン、およびビノレルビンが含まれる。
【０１４５】
タキソイドは、トネリコ（ａｓｈ）の木であるタクサス・ブレビフォリア（Ｔａｘｕｓ ｂｒｅｖｉｆｏｌｉａ）の樹皮から単離された関連化合物の一種である。タキソイドにはドセタキセルおよびパクリタキセルのような化合物が含まれるがこれらに限定されない。パクリタキセルはチューブリンに結合して（ビンカアルカロイドによって用いられるものとは異なる部位で）、微小管の集合を促進する。
【０１４６】
ビンカアルカロイドは、薬学的活性を有すると同定された植物アルカロイドのタイプである。それらには、ビンブラスチン（ＶＬＢ）およびビンクリスチンのような化合物が含まれる。
【０１４７】
抗腫瘍抗生物質
抗腫瘍抗生物質は、抗菌および細胞障害活性の双方を有する。これらの薬剤はまた、酵素および分裂を化学的に阻害することによって、または細胞膜を変化させることによって、ＤＮＡを妨害する。これらの物質は、それらが細胞周期の全ての期において作用するため細胞周期特異的ではない。抗腫瘍抗生物質の例には、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、プリカマイシン（ミスラマイシン）、およびイダルビシンが含まれるがこれらに限定されない。
【０１４８】
ホルモン
コルチコステロイドホルモンは、それらが癌細胞を殺すまたは増殖を遅らせる場合に、化学療法剤と見なされる。コルチコステロイドホルモンは、他の化学療法剤の有効性を増加させるため、併用治療において用いられることが多い。プレドニゾンおよびデキサメタゾンは、コルチコステロイドホルモンの例である。
【０１４９】
カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、酢酸メドロキシプロゲステロン、および酢酸メゲストロールのようなプロゲスチンは、子宮内膜および乳房の癌において用いられてきた。ジエチルスチルベストロールおよびエチニルエストラジオールのようなエストロゲンは、乳房および前立腺のような癌に用いられている。タモキシフェンのような抗エストロゲン剤は、乳癌のような癌に用いられてきた。プロピオン酸テストステロンおよびフルオキシメステロンのようなアンドロゲンも同様に、乳癌の治療に用いられてきた。フルタミドのような抗アンドロゲンは、前立腺癌の治療に用いられている。リュープロリドのようなゴナドトロピン放出ホルモン類似体は、前立腺癌の治療に用いられている。
【０１５０】
雑多な物質
いくつかの化学療法剤は、その活性に基づくこれまでの範疇に入らない。それらには、白金配位複合体、アントラセンジオン、置換ウレア、メチルヒドラジン誘導体、副腎皮質抑制剤、アムサクリン、Ｌ−アスパラギナーゼ、およびトレチノインが含まれるがこれらに限定されない。それらは、本発明の組成物および方法において用いてもよいと考慮される。
【０１５１】
白金配位複合体には、カルボプラチンおよびシスプラチン（シス−ＤＤＰ）のような化合物が含まれる。
【０１５２】
ミトキサントロンのようなアントラセンジオンは、急性顆粒球白血病および乳癌の治療に用いられている。ヒドロキシウレアのような置換ウレアは、慢性顆粒球白血病、真性赤血球増加症、本態性血小板増加症、および悪性黒色腫を治療するために用いられている。プロカルバジン（Ｎ−メチルヒドラジン、ＭＩＨ）のようなメチルヒドラジン誘導体は、ホジキン病の治療に用いられている。ミトタンのような副腎皮質抑制剤は、副腎皮質癌を治療するために用いられており、アミノグルテチミドは、ホジキン病を治療するために用いられている。
【０１５３】
プログラムされた細胞死の調節物質
アポトーシスまたはプログラムされた細胞死は、正常な胚発達の際に、成人組織において恒常性を維持し、および発癌を抑制するための本質的なプロセスである（Ｋｅｒｒら、１９７２）。Ｂｃｌ−２タンパク質ファミリーおよびＩＣＥ−様プロテアーゼが、他の系においてアポトーシスの重要な調節物質およびエフェクターであることが証明されている。濾胞性リンパ腫に関連して発見されたＢｃｌ−２タンパク質は、アポトーシスの制御および多様なアポトーシス刺激に反応した細胞の生存を増強するために顕著な役割を果たしている（ＣｌｅａｒｙおよびＳｋｌａｒ、１９８５；Ｃｌｅａｒｙら、１９８６；Ｔｓｕｊｉｍｏｔｏら、１９８５；ＴｓｕｊｉｍｏｔｏおよびＣｒｏｃｅ、１９８６）。進化的に保存されたＢｃｌ−２タンパク質は今では、関連タンパク質ファミリーのメンバーであると認識され、これらは死のアゴニストまたは死のアンタゴニストとして分類することができる。
【０１５４】
その発見後、Ｂｃｌ−２は、様々な刺激によって誘発された細胞死を抑制するように作用することが示された。同様に、共通の構造および配列相同性を有するＢｃｌ−２細胞死調節タンパク質のファミリーが存在することが今では明らかである。これらの異なるファミリーメンバーは、Ｂｃｌ−２と類似の機能（ＢｃｌＸＬ、Ｂｃｌｗ、Ｂｃｌｓ、Ｍｃｌ−１、Ａ１、Ｂｆｌ−１）を有するか、またはＢｃｌ−２機能を相殺して細胞死を促進するか（例えば、Ｂａｘ、Ｂａｋ、Ｂｉｋ、Ｂｉｍ、Ｂｉｄ、Ｂａｄ、Ｈａｒａｋｉｒｉ）のいずれかであることが示されている。
【０１５５】
本発明の範囲内で考慮されるアポトーシス促進物質の非制限的な例には、グラミシジン、マガイニン、メリチン、デフェンシン、セクロピン、
Figure 2004530404
が含まれる。
【０１５６】
血管新生阻害剤
特定の態様において、本発明は、アンジオテンシン、ラミニンペプチド、フィブロネクチンペプチド、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤、組織メタロプロテイナーゼ阻害剤、インターフェロン、インターロイキン１２、血小板因子４、ＩＰ−１０、Ｇｒｏ−β、トロンボスポンジン、２−メトキシエストラジオール、プロリフェリン関連タンパク質、カルボキサミドトリアゾール、ＣＭ１０１、マリマスタット、ペントサンポリスルフェート、アンジオポエチン２（レジェネロン）、インターフェロン−α、ハービマイシンＡ、ＰＮＵ１４５１５６Ｅ、１６Ｋプロラクチン断片、リノマイド、サリドマイド、ペントキシフィリン、ゲニステイン、ＴＮＰ−４７０、エンドスタチン、パクリタキセル、アキュチン、アンジオスタチン、シドフォビル、ビンクリスチン、ブレオマイシン、ＡＧＭ−１４７０、血小板因子４、またはミノサイクリンのような抗血管新生物質に結合したターゲティングペプチドを投与することに関してもよい。
【０１５７】
用量
当業者は、「レミントンの薬科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」、第１５版、第３３章、特に６２４頁〜６５２頁に従う。治療すべき被験者の状態に応じて用量の何らかの変更が必然的に起こるであろう。投与の責任者は、いずれにせよ、個々の被験者にとって適当な用量を決定するであろう。その上、ヒトでの投与に関して、調製物は、ＦＤＡの生物医薬品標準局によって必要とされる滅菌性、発熱性、および全身的安全性および純度標準を満たさなければならない。
【０１５８】
実施例
以下の実施例は、本発明の好ましい態様を示すために含められる。以下の実施例に開示した技術は、本発明の実践において十分に機能するように本発明者らによって発見された技術を表し、このように、その実践のために好ましい様式を構成すると見なされうると、当業者によって認識されなければならない。しかし、当業者は、開示の特定の態様に多くの変更を行うことができ、それらも本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく同様または類似の結果をなおも得ることができることを、本開示に照らして認識すべきである。
【０１５９】
実施例１．ＢＲＡＳＩＬ
細胞表面レベルでの分子の多様性を探索することは、ターゲティングペプチドを同定するため、そして標的化治療を開発するために重要である。精製受容体とは反対に、膜結合タンパク質は、その機能的配座を保存する可能性が高い。多くの細胞表面受容体はホモまたはヘテロ二量体相互作用を必要とするが、これは細胞膜環境に限って起こる。組み合わせアプローチによって、細胞受容体の特性に関して如何なる先入観も抱かずに、偏りのない機能的アッセイにおいて細胞膜リガンドを選択することができる。このように、未知受容体を標的とすることができる。これらの長所にもかかわらず、所定の細胞集団において同時に発現される標的の複雑度が高いために、特異的リガンドを単離することはしばしば難しい。
【０１６０】
これらの問題に対処するために、単一の細胞または小さな細胞塊のレベルでファージの選択を改善するために、新しいインビトロアプローチが開発されている。この方法、すなわち選択的相互作用リガンドのバイオパニング迅速分析法（ＢＲＡＳＩＬ）は、１回の分別遠心段階で、細胞−ファージ複合体を残っている未結合のファージから分離することができる技法に基づいている（図１）。本明細書に記載するように、ＢＲＡＳＩＬは、様々な細胞系においてファージを単離するために用いて成功している。
【０１６１】
ＢＲＡＳＩＬは、下記のように、第二の（好ましくは有機）相の上に重ねた第一の（好ましくは水）相を含む遠心管に細胞を加えることを含む。遠心分離すると、細胞と如何なる未結合のファージも第二の相の底に沈殿するが、結合していないファージは上部の第一の相に残っている。この緩やかな分離技術は、受容体に強く結合していないターゲティングペプチドのファージ−受容体相互作用を保存するために役立つ。
【０１６２】
好ましい態様において、第一の相は水相であり、第二の相は有機相である。有機相は一般的に水相と不混和性であり、これによって相の成分の混合および希釈、そしてその後の密度の変化が防止される。ファージを細胞に結合させるために水相を用いることは、それがタンパク質相互作用が通常起こるインビボ環境を模倣することから好ましい。第二の有機相も同様に、それがイオン性相互作用または水素結合の強度を増加させることによって特異的に結合したファージを保持しながら、非特異的疎水性相互作用を妨害することによってバックグラウンドを減少させる可能性があることから、好ましい。
【０１６３】
ＢＲＡＳＩＬは、選択した如何なる臓器、組織、または細胞型からの異なる細胞亜集団の特異的マーカーに結合するペプチド配列を表示するファージを単離するために用いてもよい。細胞の亜集団は、ＢＲＡＳＩＬ法を行う前にフィコール勾配によってエキソビボで精製してもよく、および／または蛍光活性化細胞分析（ＦＡＣＳ）によって同定してもよい。この改善されたインビボ選別法は、特定の細胞亜集団に限って認められるマーカーに結合するファージを採取するために用いてもよい。臓器の細針吸引（ＦＮＡ）は、ＢＲＡＳＩＬによるバイオパニングを行うための優れた細胞供給源である。当業者は、ＢＲＡＳＩＬ技術が、幅広い範囲の臓器、細胞、および細胞型に対して向けられるターゲティングペプチドを同定するために適用可能であることを認識するであろう。
【０１６４】
材料および方法
試薬と細胞
構造ＣＸ６Ｃ（Ｃ、システイン；Ｘ、任意のアミノ酸残基）ランダムな環状ペプチドを表示するファージライブラリをスクリーニングのために用いた。ファージライブラリおよびクローンは、既知の方法（スミス（Ｓｍｉｔｈ）、１９８５；スミスおよびスコット（ＳｍｉｔｈおよびＳｃｏｔｔ）、１９９３）を用いて、コイブネン（Ｋｏｉｖｕｎｅｎ、１９９９）に従って作製した。カポジ肉腫細胞（ＫＳ１７６７細胞株）は、１０％仔ウシ胎児血清（ギブコ−ＢＲＬ、ロックビル、メリーランド）を添加した最小基本培地（ＭＥＭ）において維持した。ジブチルフタレートおよびシクロヘキサン（シグマ−アルドリッチ社、セントルイス、ミズーリ州）は購入した。用いたペプチドは、９５％を超える純度で合成、環状化して、ＨＰＬＣおよび質量分析（アナスペック社、サンノゼ、カリフォルニア州）によって分析した。
【０１６５】
エキソビボ技法
例としてのインビトロ技法において、前立腺細胞を採取して、洗浄し、１％ＢＳＡを含む培地（１００〜３００ μｌ）に再懸濁させた。ファージライブラリ（ファージ１０９個）を加えて、氷中で４時間放置した。ジブチルフタレート（シグマ社）２００ μｌを含む４００ μｌエッペンドルフチューブに移した後、混合物を１０，０００ ｇで１０分間遠心分離した。上部の水相の未結合ファージとの交叉汚染を防止するために、チューブの底（細胞−ファージ複合体を含む）を液体窒素中で瞬間凍結した。凍結したチューブを鋭利なかみそりの刃で注意深く切断して、新鮮なファルコンチューブに移した。ＰＢＳ（１００〜２００ μｌ）を加えて、繰り返しピペッティングによって沈殿物をホモジナイズした。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ９１ ｋａｎ細菌１ｍｌを加えて、１時間インキュベートした後、テトラサイクリンを含むＬＢを加えて、混合物を３７℃のシェーカーにおいて一晩増殖させた。沈殿した細胞に結合したファージを細菌プラークとして回収した。バイオパニングの結果を歪めうる如何なる凝集物も入らないように注意深く行った。ＢＳＡ含有培地を０．２２ミクロンの滅菌メッシュを通して濾過して、細胞に加える直前にファージを１６，０００ ｇで５分間溶液中で遠心分離した。本研究は、結合したファージがＢＲＡＳＩＬ法を用いて前立腺細胞から採取できることを示した（示していない）。
【０１６６】
ＢＲＡＳＩＬ法の最適化
細胞をリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）および５ｍＭ ＥＤＴＡによって採取して、ＭＥＭによって洗浄し、１％ＢＳＡを含むＭＥＭに１０６個／ｍｌで再懸濁させて、１．５ ｍｌエッペンドルフチューブにおいてファージと共にインキュベートした。４時間後、細胞−ファージ懸濁液１００ μｌを不混和性の下部有機相（４００μｌのエッペンドルフチューブに２００ μｌ）の上部に静かに移して、１０，０００ ｇで１０分間遠心分離した。好ましい有機相の組み合わせは、ジブチルフタレート：シクロヘキサン（９：１［ｖ／ｖ］；ρ＝１．０３ ｇ／ｍｌ）からなった。ＢＲＡＳＩＬは、適当な密度で他のフタレート混合物（例えば、ジブチルフタレート：ジイソオクチルフタレート；４：６［ｖ／ｖ］）について試みたが類似の結果を得た。チューブを液体窒素中で瞬間凍結して、チューブの底を切断し、細胞−ファージ沈殿物を新しいチューブに移した。結合したファージを対数増殖期の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ９１ ｋａｎ宿主細菌２００ μｌによる感染によって救出した。結合の特異性を評価するために、ファージと細胞とを同源または対照合成ペプチドと共に競合アッセイのためにインキュベートした。
【０１６７】
ファージクローンによる結合アッセイ
ＫＳ１７６７細胞を冷ＥＤＴＡによって剥離させ、１％ＢＳＡを含むＭＥＭにおいて再懸濁させた。ＲＧＤ−４Ｃファージ（パスカリーニ（Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ）ら、１９９７）を、特異的αｖインテグリン結合モチーフを示す既定のリガンドとして用いた。細胞懸濁液をＲＧＤ−４Ｃファージまたはペプチドインサートを含まない対照（ｆｄ−ｔｅｔファージ）と共にインキュベートした。いずれかのファージの増加量を細胞懸濁液に加えて、細胞−ファージ混合物を氷中で４時間インキュベートした。標的細胞によるリガンド−受容体内部移行のような結合後事象を最小限にするために、ＢＲＡＳＩＬを氷中で実施した。細胞を上記のように有機相を通しての遠心分離によって分離した。結合ファージを回収して、ファージＴＵを計数した。ＢＲＡＳＩＬを、さらなる洗浄段階を必要とする従来の細胞選別法と比較するため、細胞懸濁液２００ μｌをファージと共に氷中で４時間インキュベートした。１００ μｌアリコートからの未結合ファージを有機相上で遠心分離するか、または０．３％ＢＳＡを含むＰＢＳ１ｍｌによって細胞を３回洗浄することによって除去した。それぞれの条件を少なくとも３回繰り返した。競合的阻害は、標的配列
Figure 2004530404
を含む合成ＲＧＤ−４Ｃペプチドについて行い、これを、同じモル比で用いた対照ペプチド
Figure 2004530404
と比較した。
【０１６８】
結果
ＢＲＡＳＩＬ技術は、α−ｖインテグリン（パスカリーニ（Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ）ら、１９９７）およびα−ｖインテグリンの高レベルを発現するＫＳ１７６７細胞株に結合するＲＧＤ４Ｃファージを用いて調べた。油混合物が感染率を妨害するか否かをまず決定した。油の増加量を細菌培養物に加えて、ファージをそれらに加えた。１時間感染後、細胞を播種して、テトラサイクリン抵抗性コロニー（ファージによる感染）数を計数した。対照（油を加えない）と油混合物との有意差を検出できず（データは示していない）、このことは、油混合物が感染率およびファージの回収を妨害しないことを示唆している。
【０１６９】
細胞が存在しない場合、ファージがチューブの底に沈殿するか否かを決定した。Ｆｄ（インサートを有しない）ファージ１０９ ＴＵを培地に加えて、遠心分離した。Ｆｄファージはチューブまたは油相の底には検出できなかった。次に、ファージが細胞によって油相に特異的に運ばれるか否かを調べた後、細菌による感染によって回収した。このため、ＲＧＤ４ＣファージまたはＦｄファージの増加量をＫＳ１７６７細胞懸濁液に加えて、氷中で４時間インキュベートした後油相の上で遠心分離した。図２Ａに示すように、細胞から回収したファージの数は、加えたファージの数と共に増加した。回収された（濃縮）Ｆｄファージに対するＲＧＤ４Ｃの数の比は、一貫して１００〜５００倍のあいだであった。ＫＳ１７６７細胞に対するＲＧＤ４Ｃファージの結合は特異的であって、対応する可溶性のペプチドによる競合実験がＫＳ１７６７細胞に対するＲＧＤ４Ｃファージの結合を完全に阻害して、結合したファージの数はＦｄファージの数（バックグラウンド）に近くなったことから、ｐＩＩＩタンパク質において発現されるペプチドによって媒介された（図２Ｂ）。陰性対照ペプチド
Figure 2004530404
は、ＫＳ１７６７細胞に対するＲＧＤ４Ｃファージの結合に影響を及ぼさなかった（示していない）。瞬間凍結段階を行った、または行わない場合のファージの回収を比較した。回収された試験ファージの量に実質的な減少を認めなかった（データは示していない）。
【０１７０】
ＢＲＡＳＩＬによるファージの回収を、洗浄段階を必要とする標準的なバイオパニング法と比較した。ＢＲＡＳＩＬによって回収されたＲＧＤ−４Ｃファージの数は、洗浄を含む従来のファージ−細胞結合戦略を用いた場合に回収された同じファージの数より有意に高かった（ｔ検定、Ｐ＜０．０１）（示していない）。逆に、陰性対照ファージによる有意に低いバックグラウンド（ｔ検定、Ｐ＜０．０１）を認めた（示していない）。特異的ファージの回収における有意な増加とバックグラウンドにおける実質的な減少を仮定すると、ＢＲＡＳＩＬを用いた場合、全体的な精度は従来の細胞選別法と比較して１次数以上一貫して改善した。
【０１７１】
実施例２．ＢＲＡＳＩＬによって同定されたＶＥＧＦターゲティングペプチド
糖尿病性網膜症は、高血糖症によって引き起こされた網膜および隔膜における新しい血管の形成（血管新生）である。網膜の血管新生プロセスは完全には理解されていないが、増殖因子、特に血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）がこのプロセスにおいて重要な役割を有する。
【０１７２】
眼内血管新生は、多くの眼科疾患の病理的合併症であり、世界における失明原因の第一位である。高血糖症そのものは、糖尿病性網膜症の主因であるように思われるが（エンガーマンおよびカーン（ＥｎｇｅｒｍａｎおよびＫｅｒｎ）、１９８６）、血管新生プロセスを開始するのは増殖因子の誘導である。いくつかの可能性がある候補体の中で、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）は、いくつかの抗ＶＥＧＦ治療が動物モデルにおいて眼の血管新生を防止することから、虚血誘導血管新生の最も重要なメディエータであるように思われる。ＶＥＧＦは、いくつかの網膜細胞型（神経節細胞、ＲＰＥ、周細胞、内皮細胞、星状細胞、およびミュラー細胞）によって産生される。その発現は低酸素症によってアップレギュレートされて、これは眼を通して自由に拡散する。
【０１７３】
血管新生は複雑なプロセスであり、これは活性化剤と阻害剤の存在によってバランスを保っているように思われる（ハナハンおよびフォークマン（ＨａｎａｈａｎおよびＦｏｌｋｍａｎ）、１９９６）。ＶＥＧＦは、生理的および病理的血管新生の主要な活性化因子および調節因子である（フェララおよびデービス−スミス（ＦｅｒｒａｒａおよびＤａｖｉｓ−Ｓｍｙｔｈ）による総説、１９９７）。これは、血管内皮細胞にとって比較的特異的な分裂促進因子であり、多様なインビボモデルにおいて十分な血管新生反応を誘発する。ＶＥＧＦは、これまで記述された５つのメンバーと共に多遺伝子ファミリーに属する：ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＰＩＧＦおよびオルフウイルスＶＥＧＦ（ＶＥＧＦ−Ｅとも呼ばれる）。遺伝子のもう一つのエキソンスプライシングによって、生物作用が異なる多数の種のｍＲＮＡが得られる（ティッシャー（Ｔｉｓｃｈｅｒ）ら、１９９１；ベイッコラおよびアリタロ（ＶｅｉｋｋｏｌａおよびＡｌｉｔａｌｏ）、１９９９）。ＶＥＧＦｓはまた、ホモおよびヘテロダイマーとして産生されるが、ＶＥＧＦヘテロダイマーの機能に関してはほとんどわかっていない。
【０１７４】
材料および方法
細胞と試薬
組み換え型ヒトＶＥＧＦ１６５（ファーミンゲン社、サンジエゴ、カリフォルニア州）、組み換え型ヒトＶＥＧＦ−１（オンコジーンリサーチプロダクツ、ボストン、マサチューセッツ州）、組み換え型ラットＮＲＰ−１／Ｆｃ、ラットＮＲＰ−２／Ｆｃ、ヒトＶＥＨＧ−２／Ｆｃ（３つ全ての受容体／ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域を有するキメラ）、ＰＤＧＦ−ＢＢ、抗ＶＥＧＦＲ−１（ポリクローナル抗Ｆｌｔ１）、および抗ヒトＶＥＧＦポリクローナル抗体（Ｒ＆Ｄシステムズ、ミネアポリス、ミネソタ州）は、全て購入した。ＨＵＶＥＣ（ヒト臍帯静脈内皮細胞）は、クロネティクス社から購入して、製造元の説明書に従って培養した。抗マウスＣＤ１３抗体Ｒ３−６３および２Ｍ−７は、記述のように産生して特徴を調べた（ハンセン（Ｈａｎｓｅｎ）ら、１９９３）。抗Ｍ１３ポリクローナル抗体（アマシャム−ファルマシア社）は購入した。抗ＣＤ３１抗体はファーミンゲン社（カリフォルニア州）から購入して、Ｃｙ３またはＦＩＴＣに結合した抗平滑筋アクチンは、シグマ社から購入した。抗デスミンポリクローナル血清は、ダイコ社から購入した。アミノペプチダーゼ−Ｎ（ロイシンアミノペプチダーゼ）はシグマ社から購入した。ＨＵＶＥＣを培養して、製造元のプロトコール（クロネティクス社、サンジエゴ、カリフォルニア州）に従って継代回数２〜８回のあいだで用いた。受容体媒介内部移行を最小限にするために、細胞と培地は特に明記していない限り氷中で維持した。
【０１７５】
ＢＲＡＳＩＬ
細胞をＰＢＳ、５ｍＭ ＥＤＴＡ（５分間）によって回収して、ＰＢＳによって洗浄し、１％ＢＳＡを含むＭＥＭ（ＭＥＭ１％ＢＳＡ）に１０６個／ｍｌで再懸濁させた。ファージを細胞懸濁液に加えて氷中でインキュベートした。４時間後、細胞懸濁液１００ μｌをジブチルフタレート：シクロヘキサン混合物（９：１）２００ μｌを含む４００ μｌエッペンドルフチューブに移して、１０，０００ ｇで１０分間遠心分離した。結合したファージを有する細胞は油相の中をチューブの底へと移動して、未結合のファージは油の上部の水相に残った。チューブを液体窒素中で瞬間凍結して、沈殿物を切断し、新しいエッペンドルフに移して、対数増殖期の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ９１ｋａｎ細胞２００ μｌによる感染によってファージを救出した後、希釈してテトラサイクリンを添加したＬＢプレート上に播種した。
【０１７６】
ＢＲＡＳＩＬファージディスプレイによるＨＵＶＥＣバイオパニング
二段階バイオパニング戦略を設計して、血管新生内皮細胞に結合するファージを単離した。非特異的結合を減少させるために、ファージライブラリを、飢えさせたＨＵＶＥＣ細胞上で予め浄化してから、ＶＥＧＦ１６５によって刺激した同じ細胞株上で選別した。有機相を通して遠心分離した後、ＶＥＧＦ１６５刺激ＨＵＶＥＣ沈殿物に結合したファージを細菌感染によって回収して、増幅し、さらに二回の選択ラウンドを行った。
【０１７７】
ファージペプチドライブラリは、記述のように得て、増殖させ、操作した（パスカリーニ（Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ）ら、１９９９）。添加剤を加えない内皮基礎培地（ＥＢＭ−２；クロネティクス社）において８０％コンフルエンスまで２４時間培養したＨＵＶＥＣ細胞を「飢えさせたＨＵＶＥＣ」と定義した。次に、培地を２０ ｎｇ／ｍｌ ＶＥＧＦ１６５を添加したＥＢＭ−２に交換して、これらの条件でさらに１８時間培養した細胞を「ＶＥＧＦ１６５−刺激ＨＵＶＥＣ」と定義した。飢えさせたおよびＶＥＧＦ１６５−刺激ＨＵＶＥＣをいずれも、氷冷ＰＢＳおよび５ｍＭ ＥＤＴＡによって回収して、１％ＢＳＡを含むＥＢＭ−２によって１回洗浄し、同じ培地に１０７ 個／ｍｌで再懸濁させた。予め浄化する段階において、飢えさせたＨＵＶＥＣ（細胞１０６個）を非選択ＣＸ６Ｃファージライブラリ１０９ ＴＵと共に氷中で２時間インキュベートした；次に、混合物を有機相を通して遠心分離した。スクリーニング段階において、上部水相（上清）の上に残っていた未結合のファージを新しいチューブに移して、ＶＥＧＦ１６５刺激ＨＵＶＥＣ（細胞１０６個）と共にインキュベートした。氷中で４時間後、細胞−ファージ複合体を下部有機相を通して遠心によって分離した。細胞沈殿物におけるファージ集団を対数増殖期の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ９１ｋａｎ宿主細菌２００ μｌの感染によって回収した。この技法は、前回のラウンドから得たファージを用いて３回繰り返した。３回目のバイオパニングラウンドの後、ファージ３２個を無作為に選択して分析のために配列決定した。
【０１７８】
精製受容体上での結合アッセイ
ヒトＶＥＧＦ−１、ヒトＶＥＧＦ−２、ラットＮＲＰ−１、およびラットＮＲＰ−２（ＰＢＳ ５０ μｌ中に１μｇ）を、マイクロタイタープレートに４℃で一晩固定した。ウェルをＰＢＳによって２回洗浄して、３％ＢＳＡを含むＰＢＳによって室温で２時間ブロッキングした後、ＣＰＱＰＲＰＬＣ（配列番号：６）ファージ、ＣＮＩＲＲＱＧＣ（配列番号：１１）ファージ、またはｆｄ−ｔｅｔファージのいずれかの１０９ ＴＵと共にＰＢＳ／１．５％ＢＳＡ ５０ μｌ中でインキュベートした。室温で１時間後、ウェルをＰＢＳによって９回洗浄して、ファージを細菌感染によって回収した。連続希釈液を、テトラサイクリンを添加したルリアベルタニ（ＬＢ）培地上に播種した。ＶＥＧＦ１６５、ＰＤＧＦ−ＢＢ、または合成ペプチドを表示の濃度で用いて、固定したタンパク質と共にプレインキュベートしてファージ結合の競合的阻害を評価した。ポリクローナル抗ＶＥＧＦＲ−１血清または抗ヒトＩｇＧ（ＶＥＧＦＲ−２、ＮＲＰ−１、およびＮＲＰ−２）のいずれかによるＥＬＩＳＡによって、マイクロタイタープレート上の固定受容体の有無および濃縮を確認した。ＶＥＧＦ受容体が機能的に活性であることを示すために、ＶＥＧＦ１６５（５０ ｎｇ／ｍｌ）を固定受容体と共に室温で２時間インキュベートした。３回洗浄後、ＶＥＧＦ１６５結合を抗ＶＥＧＦ特異的抗体を用いてＥＬＩＳＡによって評価した（データは示していない）。
【０１７９】
結果
ＶＥＧＦ刺激ＨＵＶＥＣ上でのバイオパニング
ＢＲＡＳＩＬの長所は、上部水相に残っている未結合のファージを、わずかな減損で新しい選別ラウンドのために用いることができる点である。このアプローチを用いて、飢えさせたＨＵＶＥＣによるファージディスプレイライブラリをまず予め浄化してから、ＶＥＧＦ１６５−活性化ＨＵＶＥＣによるバイオパニングを行った（図３）。次に、ＶＥＧＦ１６５活性化細胞をＢＲＡＳＩＬによって回収して、それらに結合したファージを増幅してもう一つの選択ラウンドに供した。
【０１８０】
選択法を調べるために、無作為に選択したファージクローン２１個を飢えさせたＨＵＶＥＣおよびＶＥＧＦ−刺激ＨＵＶＥＣに対する結合に関して調べた。クローン２１個中１４個（６７％）は、対照のインサートを有しないファージに対して標準化すると、ＶＥＧＦ刺激に基づく細胞結合の比が１５０％より多く（範囲、１．５〜８．７倍；中央値、２．２倍）増強した（データは示していない）。ＶＥＧＦ１６５活性化細胞上での３回のＢＲＡＳＩＬ選択ラウンド後、ファージ３４個を配列決定のために無作為に選択した。インサート配列３４個のアラインメント分析によって、ＢＲＡＳＩＬによって回収したファージの２４クローン（７０％）がＶＥＧＦファミリーメンバーに存在する配列にマッピングされうるペプチドモチーフを示すことが判明した（示していない）。ＶＥＧＦファミリーに対して相同なペプチドを下記の表３に示す。
【０１８１】
ペプチド配列ＣＰＱＰＲＰＬＣ（配列番号：６、以降「クローン１９」と呼ぶ）を示すファージクローンは、ＶＥＧＦ−Ｂイソ型１６７タンパク質の一部と配列が非常に類似であった。異なるペプチド３個はモチーフＩＲＲＥ／Ｑを含んだ。モチーフＩＲＲＥ／Ｑは、既知のタンパク質配列と実質的な相同性を示さず、さらなる実験はＣＰＱＰＲＰＬＣ（配列番号：６）に重点を置いた。
【０１８２】
【表３】ＶＥＧＦファミリーメンバーとの相同性を示すターゲティングペプチド
Figure 2004530404
Figure 2004530404
【０１８３】
ＶＥＧＦと相同ではない他のＨＵＶＥＣ結合ペプチドには、
Figure 2004530404
が含まれた。
【０１８４】
クローン１９ペプチドが一つまたは複数のＶＥＧＦ受容体に結合するか否かを決定するために、異なる組み換え型ＶＥＧＦ受容体についてインビトロファージディスプレイを用いた。図４に示すように、クローン１９はラットニューロピリン−１（ＮＲＰ−１）のみならずヒトＶＥＧＦ−Ｒ１に結合したが、ヒトＶＥＧＦ−Ｒ２には結合しなかった。この結果は、ＶＥＧＦ−Ｂの結合プロフィールと一致する（オロフソン（Ｏｌｏｆｓｓｏｎ）ら、１９９９）。ＶＥＧＦ−Ｒ２には結合しなかったが、３つ全ての固定受容体が類似のＶＥＧＦ１６５結合活性を示したために、結合しなかったのは活性がないためではなかった（データは示していない）。クローン１９ファージは、ｆｄ−ｔｅｔファージと比較してＶＥＧＦ−Ｒ１に対して１０００倍を超える強い結合を示した（示していない）。クローン１９ファージは、ニューロピリン−２（ＮＲＰ−２）受容体には結合しなかった（示していない）。
【０１８５】
ＶＥＧＦ１６５およびＶＥＧＦ−Ｂイソ型は、ＶＥＧＦ−Ｒ１（オロフソン（Ｏｌｏｆｓｓｏｎ）ら、１９９９）に対する結合に関して競合することが知られている。クローン−１９とＶＥＧＦ−Ｒ１およびＮＲＰ−１との相互作用は、ＶＥＧＦ１６５との競合によって遮断されるが（図４Ａ）、ＰＤＧＦ−ＢＢでは２００ ｎｇ／ｍｌまでの濃度での遮断されなかった。ＶＥＧＦ１６５との競合は、濃度依存的であり、１００％阻害は、ＶＥＧＦ１６５の１０ ｎｇ／ｍｌもの低い濃度で得られた（図４Ｂ）。クローン１９ファージの結合は同源のペプチドＣＰＱＰＲＰＬＣ（配列番号：６）によっても遮断されるが、その作用は異なる（示していない）。ＣＰＱＰＲＰＬＣ（配列番号：６）ペプチドは、ＮＲＰ−１に対する場合よりＶＥＧＦ−Ｒ１に対するファージ結合の遮断において約１００倍有効であった（示していない）。
【０１８６】
これらの結果は、ＣＰＱＰＲＰＬＣ（配列番号：６）が、ＶＥＧＦＲ−１およびＮＲＰ−１と特異的に相互作用するキメラＶＥＧＦ−Ｂファミリー模倣体であることを示している。ＶＥＧＦ−Ｂ１６７はおそらくＨＵＶＥＣ細胞の分裂促進因子である（オロフソン（Ｏｌｏｆｓｓｏｎ）ら、１９９６）。図５に示すように、ファージクローン１９の１０１０ Ｔ．Ｕ．は、非刺激細胞と比較して、またはＨＵＶＥＣ細胞にも結合するＲＧＤ４Ｃファージと比較してＨＵＶＥＣの増殖を有意に誘導した。
【０１８７】
ＶＥＧＦ−Ｂは二つのｍＲＮＡスプライス変種を有し、これらは、そのカルボキシ末端において配列が開散するエキソン６（イソ型１６７および１８６）の異なるが重なり合う読みとり枠を用いることによって作製された（オロフソン（Ｏｌｏｆｓｓｏｎ）ら、１９９９）。ペンタペプチド配列ＰＲＰＬＣは、エキソン５と６Ｂのあいだの境界後の二番目の残基で始まるエキソン６ＢによってコードされるＶＥＧＦ−Ｂ１６７カルボキシ末端領域に認められる。ＰＲＰＬＣはニューロピリン−１（ＮＲＰ−１）結合ドメイン（マキネン（Ｍａｋｉｎｅｎ）ら、１９９９）である。一方、ＰＲＰＬＣと重なり合い、クローン１９ペプチドとも重なり合うテトラペプチド配列ＰＱＰＲは、ＶＥＧＦ−Ｂ１８６のカルボキシ末端に認められ、これはエキソン６Ａによってコードされる。ＰＱＰＲは、１２残基の既知のＮＲＰ−１結合部位内に埋もれている（マキネン（Ｍａｋｉｎｅｎ）ら、１９９９）。
【０１８８】
ＨＵＶＥＣ細胞も同様に、ＣＸ７Ｃファージライブラリに対して選別した。同定されたターゲティングファージペプチド配列を下記の表４に示す。
【０１８９】
【表４】ＨＵＶＥＣ細胞に対するＣＸ７Ｃペプチド結合
Figure 2004530404
Figure 2004530404
【０１９０】
考察
モチーフＰＲＰＬＣ（ＶＥＧＦ−Ｂ１６７に認められるＮＲＰ−１結合部位）およびモチーフＰＱＰＲ（ＶＥＧＦ−Ｂ１８６の１２残基ＮＲＰ−１結合エピトープ内に埋もれている）に類似する配列ＣＰＱＰＲＰＬＣ（配列番号：６）によってＶＥＧＦ受容体リガンドを同定した（マキネン（Ｍａｋｉｎｅｎ）ら、１９９９）。このように、ＶＥＧＦ−Ｂ模倣体ＣＰＱＰＲＰＬＣ（配列番号：６）は、異なるＶＥＧＦ−Ｂイソ型における結合部位間のキメラであるように思われる。これらの結果は、双方のＶＥＧＦ−Ｂイソ型のカルボキシ末端領域がＶＥＧＦ−Ｒ１およびＮＲＰ−１に結合してこれを活性化する可能性があることを示唆している。それらはまた、ペプチドＣＰＱＰＲＰＬＣ（配列番号：６）が、ＶＥＧＦ−Ｒ１およびＮＲＰ−１受容体とのその相互作用において双方のＶＥＧＦ−Ｂイソ型の作用を模倣する可能性があることも示唆している。合成ペプチドＣＰＱＰＲＰＬＣ（配列番号：６）を用いた場合に、ファージ結合との競合においてＶＥＧＦ−Ｒ１およびＮＲＰ−１に関して異なる作用が認められたことは、ペプチドキメラモチーフがＶＥＧＦ受容体と異なるように相互作用することを示唆している。これは、それぞれの受容体における結合部位の数またはキメラペプチドに対する結合部位の親和性による可能性がある。
【０１９１】
これらの結果は、ＢＲＡＳＩＬが患者の試料に由来する細胞集団を標的とするために有用となることを示している。方法は、例えば、固形腫瘍の細針吸引または白血病患者からの白血球の蛍光活性化細胞ソーティングに関連して容易に用いることができる。上部水相に存在する未結合のファージはわずかな減損で回収される可能性があるため、予め浄化する戦略はＢＲＡＳＩＬによって容易となる。これによって、例えば、疾患を有する細胞に結合するファージを単離する前に、正常被験者からの細胞に結合するファージを差し引くことによって、ファージディスプレイによってターゲティングペプチドを同定するための改善されたプロトコールが可能となる。ＢＲＡＳＩＬ法によってまた、ファージ結合の非特異的バックグラウンドも減少させることができる。
【０１９２】
多数の試料および予め浄化および選択するいくつかのラウンドは、数時間で行うことができ、方法を自動化して、高処理能のスクリーニングを促進することができる。データ（下記に示す）は、現在利用可能なインビボファージディスプレイ技術によって実現可能でない脾臓、肝臓、および骨髄のような有意な網内内皮成分を有する臓器のターゲティングが、ＢＲＡＳＩＬによって可能となるかも知れないことを示唆している（パスカリーニ（Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ）ら、２０００）。方法はまた、酵素または抗体のようなより大きいポリペプチドまたは折り畳まれたタンパク質を示すファージについて用いてもよく（示していない）、天然に存在する酵素、受容体、または他のタンパク質の新規阻害剤または活性化剤の高処理能スクリーニングを行うためのファージディスプレイに基づくアプローチを提供する。データは、ＢＲＡＳＩＬが、ターゲティングリガンド−受容体対を同定するための従来のプロトコールより、そして細胞表面の分子多様性の探索より優れていることを示している。
【０１９３】
実施例３．白血病細胞株によるＢＲＡＳＩＬ
上記の方法を用いて、Ｍｏｌｔ−４白血病細胞株およびＣＸ５ＣライブラリについてもＢＲＡＳＩＬプロトコールを行った。ライブラリを正常なＭｏｌｔ−４細胞株に対して予め差し引いた後、ＣＤ−１３タンパク質をコードする遺伝子によって形質転換したＭｏｌｔ−４細胞株に対してスクリーニングした。Ｍｏｌｔ−４白血病ターゲティングペプチドを下記の表５に記載する。
【０１９４】
【表５】Ｍｏｌｔ−４白血病細胞株に対するターゲティングペプチド
Figure 2004530404
【０１９５】
白血病細胞株ターゲティングペプチドに関して同定されたコンセンサス配列はＣＸＶＷＸＧＣ（配列番号：２０１）であった。
【０１９６】
実施例４．ＢＲＡＳＩＬによる尿路上皮組織のターゲティングペプチドの同定
尿路上皮組織のターゲティングペプチドは、これまでファージディスプレイによって同定されていなかった。本実施例は、新規ターゲティングペプチドを同定する場合のＢＲＡＳＩＬ法の有用性をさらに証明して、方法および組成物のさらなる態様を説明する。
【０１９７】
材料および方法
材料
ヒト細胞株Ｔ２４、ＲＴ４、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ、およびＭＯＬＴ−４は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（マナッサス、バージニア州）から得た。組織培養培地は全て、ライフテクノロジーズ社（ニューヨーク州）から得た。細胞は、１０％ウシ胎児血清、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１００ ＩＵ／ｍｌペニシリン、および１００ ｍｇ／ｍｌストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭにおいて、３７℃で５％ＣＯ２の標準的な条件で増殖させた。ヒト尿路上皮細胞は新鮮な尿管標本から単離して、添加ケラチノサイトＳＦＭ培地を用いて培養した。ブタ膀胱は、ライト博士（Ｋ． Ｗｒｉｇｈｔ、Ｍ．Ｄ．アンダーソン癌センター獣医学部、ハウストン、テキサス州）から得た。ファージディスプレイライブラリを調製して、上記のようにＫ９１ｋａｎ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株によって増幅した。合成ペプチドはアナスペック社（サンノゼ、カリフォルニア州）から得た。
【０１９８】
ファージのパニング
尿路上皮細胞は、腎細胞癌のために腎切除を受けた患者の新鮮な尿路標本から単離した。滅菌条件で、尿管から結合組織および脂肪組織を除去して、切開し、粘膜をＰＢＳ中に丁寧に剥離した。次に、細胞を沈殿させて、ＲＰＭＩ／１０％ＢＳＡに再懸濁させた。次に、細胞約１×１０７個をＲＰＭＩ／１０％ＢＳＡ ２００ μｌにおいて、環状ＣＸ７Ｃファージライブラリ、直鎖状のＸ６−ライブラリ、または先のバイオパニングラウンドから得られた増幅ファージの１×１０７ ｃｆｕと共に氷中で４時間インキュベートした。二つの異なる実験において、ライブラリまたは先のラウンドから得た増幅ファージを１×１０７ ＭＯＬＴ−４細胞上で氷中で３０分間予め浄化してから、正常な尿路上皮細胞に加えた。インキュベーション後、上記のＢＲＡＳＩＬ法を用いて選別を継続した。簡単に説明すると、４００ μｌエッペンドルフチューブにおいて９０％ジブチルフタレートおよび１０％シクロヘキサン（シグマ社、セントルイス、ミズーリ州）からなる油のクッションに細胞を載せて、エッペンドルフ遠心分離機において１０，０００ ｒｐｍで１０分間沈殿させた。チューブを液体窒素において凍結して、細胞沈殿物を含むチューブの下部を切断した。過剰量の油を除去した後、沈殿物に対数増殖期Ｋ９１細菌１ｍｌを１時間再感染させて、一晩増幅した。少量を播種して単一のコロニーを採取して配列決定した。３回のラウンドまでを行った。
【０１９９】
配列決定およびアラインメント
各ラウンド後、無作為に選択したファージクローン９４個のペプチドインサートを、プライマー
Figure 2004530404
およびビッグダイターミネーターサイクルシークエンシングキット（パーキンエルマー社、ノーウォーク、コネチカット州）を用いてＤＮＡ配列決定によって配列決定した。ペプチド配列はＣｌｕｓｔａｌＷアラインメントプログラム（ヨーロッパ生物情報学研究所のホームページ、（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ２．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｃｌｕｓｔａｌｗ／））を用いて並置した。国立バイオテクノロジー情報センターのＢＬＡＳＴプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）を用いて、濃縮したペプチド配列をタンパク質データベースと並置した。類似性はプログラムによって並置された領域における陽性マッチの百分率として定義した。
【０２００】
ファージの結合と競合実験
選択したファージの結合は、ヒト接着性初代尿路上皮細胞、乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−４３５、および移行性癌細胞株ＲＴ４およびＴ２４について調べた。細胞は全て、４８ウェルプレートにおいてサブコンフルエンシーまで増殖させ、遊離の結合部位を３０％ＦＣＳ／ＤＭＥＭ（ブロッキング培地）８００ μｌによって３７℃で１時間ブロッキングした。次に、ブロッキング溶液を、各ファージ１×１０８ ｃｆｕ／ウェルを含む１０％ＦＣＳ／ＤＭＥＭ（洗浄培地）２００ μｌに交換した。非特異的エンドサイトーシスを防止するために４℃で２時間インキュベートした後、未結合のファージを洗浄培地５００ μｌによって７回洗浄することによって除去した。競合実験の場合、対応するペプチドまたは対照ペプチド（ＣＡＲＡＣ、配列番号：５）の漸増濃度をインキュベーションのあいだに加えた。結合したファージを、対数増殖期のＫ９１培養物５００ μｌによる感染、および連続希釈液の播種によって決定した。値は１試料あたり３個ずつのウェルの連続希釈液の平均値を表し、インサートを有しないｆｄ−ｔｅｔファージの結合と比較して示す。
【０２０１】
無傷の粘膜に対する結合を決定するために、新規ドットブロットチャンバーアッセイを開発して、ドットブロットチャンバー（バイオラド、ハーキュルズ、カリフォルニア州）に膀胱または尿路上皮標本を置いて、粘膜面を上にして、このように、等しく大きい粘膜片９６個までを作製した。ドットブロットチャンバーにおけるブロッキングおよび洗浄は上記のように行ったが、対応する培地は４００ μｌで行い、感染は、対数増殖期のＫ９１ｋａｎ培養物４００ μｌ／ウェルによって行った。
ウェル３個を一つのウェルとしてプールした。
【０２０２】
無傷の粘膜試料上でのグルコサミノグリカン（ＧＡＧ）層の除去を、ドットブロットチャンバーアッセイとして行った。ウェルの半数を０．１ Ｍ ＨＣｌ ２００ μｌと共に２分間インキュベートして、ブロッキング溶液によって十分にすすぎ、双方の部分を先に記載したようにブロックした。結果は、１に設定した無処置の粘膜に対するｆｄ−ｔｅｔファージと比較して示す。
【０２０３】
結果
ヒト膀胱壁と相互作用するペプチドモチーフを同定するために、外科尿路上皮標本から新しく単離した尿路上皮細胞上での連続アフィニティ選別ラウンドによって、ファージディスプレイペプチドライブラリからクローンを選択した。四つの実験において、異なる二つのライブラリ、環状７量体および直鎖状の６量体ライブラリを、ＢＲＡＳＩＬ法を用いてＭＯＬＴ−４白血病細胞に対して予め差し引いて、または差し引かずにヒト尿路上皮細胞上で選別した。４回までの選択ラウンドを行い、毎回のラウンド後クローン９４個を配列決定した。ＣｌｕｓｔａｌＷプログラムによって得られた全ての配列を並置することによって、ペプチドモチーフ５個を同定した（表６）。
【０２０４】
【表６】ヒト尿路上皮細胞に結合したペプチドの選択
Figure 2004530404
Figure 2004530404
ＭＯＬＴ−４細胞に対して差し引いてから選択したファージを＃で示す。結合アッセイのために選択したファージは＊で示す。
【０２０５】
ペプチドモチーフ５個を含むファージを増幅して、注意深く滴定して、培養ヒト尿路上皮細胞に対するその結合をサブコンフルエント層において調べた。インサートを有しないｆｄ−ｔｅｔファージを陰性対照として用いた。コンセンサスモチーフを含むファージは、インサートを有しないｆｄ−ｔｅｔファージと比較して培養尿路上皮細胞に最大１２．７倍の結合を示した（図６）。転移性の乳管癌に由来するヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓには結合しないことによって決定されるように、結合は尿路上皮細胞に対して特異的であった（図７）。
【０２０６】
分化が進んでいない再発性の移行性細胞癌に由来する尿路上皮腫瘍細胞株Ｔ２４および移行性細胞乳頭腫に由来するＲＴ４に対する結合も同様に調べた。ＲＴ４にはＣＷＧＧＬＳＧＬＣ（配列番号：２０）を除く全てのファージが結合したが、Ｔ２４腫瘍細胞に結合したのはＣＧＱＥＩＳＧＬＣ（配列番号：１３）ファージのみであった（図７）。ＶＨＡＬＥＳ（配列番号：２５）ファージは明らかにＲＴ４腫瘍細胞のみに結合した。ＶＨＡＬＥＳ（配列番号：２５）の結合特異性は、競合的ファージ結合阻害によって確認した（図８）。結合はｆｄ−ｔｅｔファージより５．４倍高く、結合は可溶性のＶＨＡＬＥＳ（配列番号：２５）ペプチドによって用量依存的に減少したが、残りは、等量の対照ペプチドＣＡＲＡＣ（配列番号：５）によって不変であった（図８）。
【０２０７】
無傷の膀胱粘膜に対するモチーフの結合を、膀胱または尿路粘膜の９６個までの等しい部分においてファージ結合を同時に調べることができる新規ドットブロットチャンバー結合アッセイを用いて調べた。無傷のブタ膀胱およびヒト尿路粘膜に対する結合をこのアッセイによって決定した。コンセンサスモチーフを示す選択したファージは、ｆｄ−ｔｅｔファージよりブタ膀胱粘膜に対して３．８〜１１．７倍高い結合を示した（図９）。
【０２０８】
同じアッセイ法を用いて、無傷の粘膜に対するいくつかのファージの結合に及ぼすグルコサミノグリカン（ＧＡＧ）層の影響を調べた。ＧＡＧ層を上記のように除去した。ヒト尿路およびブタ膀胱標本の粘膜の半分を、ドットブロットチャンバーにおいて０．１Ｍ ＨＣｌによって２分間処理して、十分に洗浄し、結合アッセイ法を先の記述のように行った。
【０２０９】
ＧＡＧ除去後のファージの結合を、１に設定した無処置粘膜の結合と比較した。対照ファージｆｄ−ｔｅｔおよびＣＲＩＲＭＳＡＧＣ（配列番号：２７）ファージの結合は、処置を行っても不変のままであったが、ＣＷＧＧＬＳＧＬＣ（配列番号：２０）ファージ結合は４．２倍増加した。ＶＨＡＬＥＳ（配列番号：２５）ファージ結合は５０％減少した（図１０）。ヒト尿路試料に関して調べたところ、ＧＡＧ除去によってＣＷＧＧＬＳＧＬＣファージ結合は３．４倍増加した（データは示していない）。このことは、ＣＷＧＧＬＳＧＬＣ（配列番号：２０）ファージの結合にＧＡＧ層が負の影響を及ぼすこと示唆している。
【０２１０】
これらの結果は、尿路上皮組織を標的とする多くの新規ターゲティングペプチド配列および保存モチーフを示している。ＢＲＡＳＩＬプロトコールのさらなる改変を、それらの新規同定方法の有用性およびターゲティングペプチド配列の特徴と共に本明細書において示す。当業者は、開示の方法および組成物が尿路上皮細胞または組織に限定されず、ヒトにおいて認められる多様な臓器、組織、および細胞型に対して広い適用を有することを認識するであろう。
【０２１１】
実施例５．ＢＲＡＳＩＬおよび幹細胞スクリーニング
ＢＲＡＳＩＬによってターゲティングペプチド配列に関してスクリーニングしてもよい細胞型のもう一つの非制限的な実施例には、幹細胞が含まれる。下記に考察するように、幹細胞は骨髄から得る。しかし、当業者は開示の方法が幹細胞全般に適用可能であることを認識するであろう。
【０２１２】
細胞供給源と培養
間葉細胞は、ヒト骨髄吸引液をプラスチックフラスコに播種することによって得られる骨髄由来の一次幹細胞である。フラスコに結合した細胞は間葉細胞である。間葉細胞は、２０％仔ウシ胎児血清を添加したＲＰＭＩ１６４０培地において３７℃（５％ＣＯ２）で培養して、４〜５日毎に継代培養した。ＫＳ１７６７細胞は、１０％仔ウシ胎児血清を添加したＭＥＭ培地において増殖させ、３〜５日毎に継代培養した。
【０２１３】
間葉細胞上でのバイオパニング
ファージライブラリをＫＳ１７６７細胞に対して最初に予めスクリーニングするサブトラクション戦略を行って、ＫＳ１７６７非幹細胞株に対するファージ結合を除去した。予めスクリーニングしたライブラリをＢＲＡＳＩＬ法を用いて間葉細胞に対してスクリーニングした。
【０２１４】
技法は全て４℃で行った。バイオパニングのために用いた全ての培地および溶液は、０．２２ μｍミリポアフィルターを通して濾過した。間葉細胞およびＫＳ１７６７細胞をＰＢＳによって洗浄して、プラスチックからの細胞の剥離を促進するためにＰＢＳプラス５ｍＭ ＥＤＴＡと共に氷中で１０分間インキュベートした。培地を吸引して細胞を回収し、ＲＰＭＩ１６４０培地と共に遠心分離して洗浄し、０．５％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を添加したＲＰＭＩ１６４０培地において細胞１０６個／ｍｌで再懸濁させた。ＣＸ７Ｃファージディスプレイライブラリ（または前回のバイオパニングラウンドから得たファージ）をＫＳ細胞（細胞１０５個あたりファージ１０９ Ｔ．Ｕ．）に加えて、氷中で１〜２時間インキュベートした。ＫＳ１７６７細胞をファージに曝露して、ジブチルフタレート：シクロヘキサン（６：１）上で４℃で遠心分離した後、未結合のファージをＢＲＡＳＩＬによって選択した。これらの条件において、結合したファージを有する細胞はチューブの底に沈殿する。未結合のファージは上部（水相）相に留まっている。上部相を注意深く、間葉細胞１０５個を含む新しいチューブに移して、氷中でさらに４時間インキュベートした。次に、間葉細胞に結合した結合ファージをＢＲＡＳＩＬによって選択した。ファージを有する間葉細胞懸濁液をジブチルフタレート：シクロヘキサン（６：１）上で４℃で遠心分離した。結合ファージを有する間葉細胞はチューブの底に沈殿する。チューブを−８０℃で１０分間瞬間凍結して、結合ファージを有する細胞の沈殿物を含むチューブの底を切断して、新しいチューブに移して、ファージを回収するために、沈殿物を対数増殖期大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ９１培養物２００ μｌに注意深く再懸濁させた。２０分間感染後、ＬＢ（ルリア−ベルタニ）培地２０ ｍｌを加えて、ファージを増幅するために細胞を３７℃で攪拌しながら１６〜１８時間培養した。初回選択後、先のラウンドから得たファージを次の選択ラウンドに用いた。
【０２１５】
３回のバイオパニングラウンド後、個々のコロニーを配列決定のために選択した。幹細胞結合ペプチドを下記の表７に記載する。
【０２１６】
【表７】幹細胞（間葉細胞）ターゲティングペプチド
Figure 2004530404
Figure 2004530404
【０２１７】
受容体の同定
ペプチド配列ＣＲＶＤＦＳＫＧＣ（配列番号：１１４）を含むファージ「Ｄ５」は、レプチンホルモンと有意な相同性を示した（表８）。レプチンのこの領域は、いくつかの種（アカゲザル（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ）、ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）、汎類人猿（Ｐａｎ ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ）、ゴリラ（Ｇｏｒｉｌｌａ ｇｏｒｉｌｌａ）、オランウータン（Ｐｏｎｇｏ ｐｙｍａｅｕｓ）、ハツカネズミ（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）、クマネズミ（Ｒａｔｔｕｓ ｎｅｒｖｅｇｉｃｕｓ））において保存されている。
【０２１８】
【表８】ファージＤ５とレプチン配列との相同性
Figure 2004530404
【０２１９】
保存されたペプチドはタンパク質におけるアミノ酸９０〜９６個のあいだのループにマッピングされる（ザング（Ｚｈａｎｇ）ら、１９９７）。レプチン分子のこの領域は、レプチン活性にとって重要であることが示されている。合成ペプチド
Figure 2004530404
は、インビボでレプチン活性を遮断することが報告されている（グラッソ（Ｇｒａｓｓｏ）ら、１９９７）（太字のアミノ酸はクローンＤ５
Figure 2004530404
と類似性を有するアミノ酸を示す）。
【０２２０】
本実施例は、幹細胞に対するターゲティングペプチドを同定するために用いることができることを示している。同定されたペプチド配列の一つと内因性ホルモンとが相同であることによって、同定された配列がさらに確認される。当業者は、方法および本明細書において同定されたターゲティングペプチドが、幹細胞を同定および精製するため（例えば、アフィニティクロマトグラフィーによって）、ならびに幹細胞に存在する受容体：リガンド対を同定するためにおそらく有用となることを認識するであろう。
【０２２１】
実施例６．ＢＲＡＳＩＬによる骨髄のスクリーニング
ターゲティングペプチドに関して特に関心がある臓器の非制限的な実施例は骨髄である。骨は、前立腺癌患者の大多数において転移に好まれる部位である（フィドラー（Ｆｉｄｌｅｒ）、１９９９）。この顕著な選択性は、癌の進行にとって必須である部位特異的相互作用の例として見なされている（ラク（Ｒａｋ）、１９９５；ゼッター（Ｚｅｔｔｅｒ）、１９９８）。臨床的関連性にもかかわらず、前立腺癌の骨への転移を制御するメカニズムに関してはほとんどわかっていない。さらに、転移性前立腺癌の治療のために治療物質をターゲティングする有効な戦略はなかった（ブロッド（Ｂｒｏｄｔ）ら、１９９６）。
【０２２２】
循環を通して骨髄に選択的に回帰することができるペプチドのサブセットは、骨転移形成の際に前立腺癌細胞の挙動を刺激する可能性がある。ファージディスプレイを用いてターゲティングされる血管マーカーも同様に、腫瘍細胞が転移するために利用される可能性がある。この考え方はすでに肺回帰ペプチドに関して当てはまることが証明されている。肺血管に回帰するペプチドは実験的転移を阻害する。これらの結果は、部位特異的転移の基本となるのは、それに対して転移が選択的に起こる特定の組織の血管における回帰受容体の存在であるという「改変型種子と土壌」モデルに適合する。そのような選択的血管マーカーは、転移カスケードの第一段階である接着の際に腫瘍細胞に曝露される。骨髄回帰ペプチドを単離することは、転移プロセスの際に前立腺癌細胞の回帰を媒介するそれらの血管マーカーを同定するために、そして骨への転移を防止するための、または既に骨に転移している癌を選択的に造影および／または治療するための可能性がある治療的介入を行うために有用である。
【０２２３】
ヒト骨髄上でのファージディスプレイライブラリのスクリーニング
その下に存在する腫瘍に近づくために手術の際に摘出した新鮮なヒト肋骨を切断して骨髄表面を露出した。骨髄に対する有意な損傷は組織に認められず、その形態は技法後十分に保存されていた。骨髄試料を氷冷ＤＭＥＭ／０．１５％ＢＳＡ（濾過滅菌済み）によって５回（丁寧に）洗浄した。骨から細胞を丁寧に剥離することによって骨髄を採取した。破片および脂肪を除去するために細胞を遠心分離してＤＭＥＭ／ＢＳＡに再懸濁させることによって２回洗浄した。細胞をＤＭＥＭ／ＢＳＡ（細胞約１０７個／ｍｌ）に再懸濁させて、上記のように調製したファージディスプレイライブラリ（１０９ ＴＵ）と共にインキュベートした。氷中で３時間インキュベートした後、細胞を、ジブチルフタレート：シクロヘキサンの９：１混合物からなる有機相を通して遠心分離した。遠心分離は、１０，０００×ｇで１０分間行った。遠心管の底を−８０℃で瞬間的に凍結して、ファージを上記のように細菌感染によって回収した。選択は、３回より多くのＢＲＡＳＩＬラウンドによって繰り返して、クローン９０個を配列決定した。骨髄ターゲティング配列を下記の表９に記載する。
【０２２４】
【表９】ＢＲＡＳＩＬによって同定された骨髄ターゲティングペプチド
Figure 2004530404
Figure 2004530404
Figure 2004530404
【０２２５】
ペプチドモチーフの統計分析
システムは、ペプチドライブラリスクリーニングから得られたデータを分析するために、ＳＡＳパッケージから改変して設計した。システムは、Ｍ．Ｄ．アンダーソン癌センターからの要請に基づいて利用できる。表９に記載したファージ配列の統計分析に基づくと、ＬＧモチーフ（ロイシン−グリシン）が骨髄ターゲティングファージに認められる。このモチーフを有する選択したクローンは、陰性対照（インサートを有しないｆｄ−ｔｅｔファージ）と比較してヒト骨髄細胞に対して非常に高い結合を示した。陽性対照は、骨髄に結合することが知られているＲＧＤ−４Ｃインサートを含むファージであった。最も高い親和性ペプチド（ＣＬＧＷＲＡＡＡＣ、配列番号：２５９）は、陽性対照の２倍より高い結合を示した。結合アッセイは、ファージライブラリの代わりに単一のファージクローンを用いたことを除き、上記のようにＢＲＡＳＩＬを用いて行った。
【０２２６】
当業者は、本明細書において同定した骨髄ターゲティングペプチド配列が、治療物質または遺伝子治療の標的化輸送、正常または疾患臓器もしくは組織のインビボ造影、臓器または組織における受容体および受容体リガンドの同定、ならびに多くのヒト疾患、特に転移性前立腺癌の治療的治療を含むがこれらに限定されない、本発明の範囲内の多数の応用のために有用となることを認識するであろう。
【０２２７】
本明細書において開示および主張した組成物、方法、および装置は全て、本開示に照らして不適当な実験を行うことなく作製され、実行することができる。本発明の組成物および方法は、好ましい態様に関して説明してきたが、組成物、方法、および装置、ならびに本明細書に開示の段階または段階の順序に変更を行ってもよく、それらも本発明の概念、趣旨、および範囲に含まれることは、当業者には明らかであろう。より詳しく述べると、化学的および生理的に関連する特定の物質は、同じまたは類似の結果が得られれば、本明細書に記載の物質に置換してもよいことは明らかである。当業者に明らかであるそのような類似の置換および改変は全て、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の趣旨、範囲、および概念の範囲内であるように思われる。
【０２２８】
参照
以下の参照は、これらが、例示的手法または本明細書に記載されたもののその他の詳細を提供するという程度まで、本明細書において特に参照として組み入れられる。
Figure 2004530404
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【図面の簡単な説明】
添付の図面は、本明細書の一部であり、本発明の特定の局面をさらに示すために含まれる。本発明は、本明細書に示す特定の態様の詳細説明と共にこれらの図面の一つまたは複数を参照することによってよりよく理解されるであろう。
【図１】ＢＲＡＳＩＬの原理。上部の第一の相においてファージ（ライブラリまたは単一のクローン）と共にインキュベートした単細胞または小さな細胞塊の懸濁液を、好ましくは不混和性の下部の第二の油相の上で遠心分離する。第二の相は中間的な比密度を有するため、最適な遠心分離条件では、細胞は下層に入り、試験管の底で沈殿し、特異的に結合したファージのみをそれらと共に運ぶ。残りの未結合のファージは、上部の相に残っている。細胞沈殿物を注意深く回収する。ターゲティングペプチド配列は、宿主大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の感染によってファージを回収してまたは回収せずに、ファージインサートの増幅および配列決定によって同定してもよい。
【図２Ａ】ＢＲＡＳＩＬ法の最適化。カポジ肉腫由来細胞（ＫＳ１７６７）の単細胞懸濁液を、αｖインテグリン結合モチーフ（ＲＧＤ−４Ｃファージ）またはペプチドインサートを有しない対照ファージ（Ｆｄファージ）を示すファージの漸増力価と共にインキュベートした。ＫＳ１７６７細胞は、それらが高レベルのαｖインテグリンを発現することから選択した。細胞とファージとは、氷中で４時間インキュベートして（ファージの内部移行を防止するため）、１０，０００ ｇで１０分間遠心分離した。ＫＳ１７６７細胞に結合したファージを宿主大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の感染によって回収して、ＬＢ／Ｔｅｔ寒天プレートに３７℃で一晩播種した。最後に、ファージ形質導入単位を計数した。極めて低いバックグラウンドが認められた。非飽和条件では、Ｆｄファージに関連してＲＧＤ−４Ｃファージの濃縮の保存的平均値は５００〜１０００である。この実験を３回繰り返したが、類似の結果を生じた。平均値および標準偏差を示す。
【図２Ｂ】溶液中で合成ＲＧＤ−４Ｃペプチドは、ＫＳ１７６７細胞に対するＲＧＤ−４Ｃファージの結合を９９．９９％阻害したが、ＲＧＥ対照ペプチドは阻害しなかった。
【図３】ファージディスプレイライブラリからファージを選択的に除去するためのＢＲＡＳＩＬを用いる予め浄化するプロトコール。
【図４Ａ】固定したＶＥＧＦ受容体に対するファージクローン−１９の結合。クローン−１９（黒い棒）は、ＶＥＧＦ−Ｒ１およびＮＲＰ−１に結合するが、ＶＥＧＦ−Ｒ２またはＢＳＡには結合しない。インサートを有しないＦｄファージの結合は検出できなかった（斜線の棒）。
【図４Ｂ】ＶＥＧＦ−Ｒ１（黒丸）およびＮＲＰ−１（白四角）に対する結合は、ＶＥＧＦ１６５ １０〜２０ ｎｇ／ｍｌによって完全に阻害することができた。
【図５】ＨＵＶＥＣ細胞を２４ウェルプレートにおいて培養して、如何なる血清および添加剤も含まない基礎培地によって２４時間飢えさせた。ファージクローン−１９またはＲＧＤ．４Ｃ（ＨＵＶＥＣに結合する）を、１０１０ Ｔ．Ｕ．／ウェルで加えた。ＶＥＧＦ１６５（２０ ｎｇ／ｍｌ）または基礎（枯渇）培地を陽性および陰性対照として加えた。細胞増殖をＭＭＴ法によって測定した。クローン−１９は、陽性対照と同等の細胞増殖を促進した（ＶＥＧＦ−１６５）。同様にＨＵＶＥＣに結合するＲＧＤ．４Ｃペプチドは、陰性対照よりごくわずかに上の細胞増殖速度を示した。
【図６Ａ〜６Ｃ】サブコンフルエントヒト尿路上皮細胞単層に対する選択したファージクローンの結合。インサートを有しないｆｄ−ｔｅｔファージを陰性対照として含めた。結果は、１に設定したｆｄ−ｔｅｔファージの結合と比較したウェル３個の平均値である。ファージの添加量は１×１０８ Ｔ．Ｕ．／ウェルであった。結合したファージは、十分に洗浄した後、対数増殖期Ｋ９１細菌に感染させて、連続希釈液を播種することによって検出した。
【図７】ヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−４３５（白い棒）と共に尿路上皮腫瘍細胞株Ｔ２４（明るい灰色の棒）およびＲＴ４（暗い灰色の棒）に対する選択したファージクローンの結合。インサートを有しないｆｄ−ｔｅｔファージを対照として含めた。結果を、１に設定したｆｄ−ｔｅｔファージの結合に対するウェル３個の平均値として示す。ファージの添加量は１×１０８ Ｔ．Ｕ．／ウェルであった。結合したファージは、十分に洗浄した後、対数増殖期Ｋ９１細菌に感染させて、連続希釈液を播種することによって検出した。
【図８】ＲＴ４腫瘍細胞に対するＶＨＡＬＥＳ（配列番号：２５）ファージ結合の阻害は、合成ＶＨＡＬＥ（配列番号：２５）（黒四角）によって阻害されたが、対照ペプチドＣＡＲＡＣ（配列番号：５）（白い四角）によっては阻害されなかった。ＶＨＡＬＥＳ（配列番号：２５）ファージの結合は、インサートを有しないｆｄ−ｔｅｔファージより５．４倍高かった。ＲＴ４腫瘍細胞のサブコンフルエント単層を、ＶＨＡＬＥＳ（配列番号：２５）および対照ペプチドの増加量の存在下で、ＶＨＡＬＥＳ（配列番号：２５）ファージ１×１０８ Ｔ．Ｕ．／ウェルと共にインキュベートした。結果をウェル３個ずつの平均値として示す。結合したファージを十分に洗浄した後に、対数増殖期Ｋ９１細菌に感染させて、連続希釈液を播種することによって検出した。
【図９】ドットブロットチャンバーアッセイにおけるブタ尿路上皮に対する選択したファージクローンの結合。ウェル３個を一つの粘膜片としてプールして、１と設定したインサートを有しないｆｄ−ｔｅｔファージの結合に対する１試料あたり３個ずつの粘膜片の平均値で結果を表す。ファージの添加量は１×１０８ Ｔ．Ｕ．／ウェルであった。結合したファージを、十分に洗浄した後、対数増殖期Ｋ９１細菌に感染させ、連続希釈液を播種することによって検出した。
【図１０】ファージの結合に及ぼすＧＡＧ層の影響。ドットブロットチャンバーアッセイにおいて、ブタ膀胱粘膜の一部を０．１ Ｍ ＨＣｌによって２分間処理してから、ＧＡＧ−層を除去した。処置した表面に対する結合を、１に設定した無処置表面と比較して示した。結合したファージを十分に洗浄した後に、対数増殖期Ｋ９１細菌に感染させ、連続希釈液を播種することによって検出した。
【図１１】ＢＲＡＳＩＬによるヒト骨髄細胞に対する選択したクローンの結合。

Claims (87)

  1. 標的の密度が第二の相の密度より大きく、第二の相の密度が第一の相の密度より大きい、以下を含む組成物：
    ａ）ファージ結合のための標的；
    ｂ）ファージディスプレイライブラリ；
    ｃ）第一の相；および
    ｄ）第二の相。
  2. 標的が単離された細胞または小さな細胞塊を含む、請求項１記載の組成物。
  3. 細胞が原核細胞または真核細胞である、請求項２記載の組成物。
  4. 細胞が、細菌、単細胞生物、酵母、カビ、真菌、アメーバ、ジアルジア（Ｇｉａｒｄｉａ）、レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、白血病細胞、癌細胞、幹細胞、胚細胞、骨髄細胞、脾細胞、赤血球、リンパ球、肝細胞、リンパ節細胞、脈管形成細胞、尿路上皮細胞、哺乳類細胞、動物細胞、植物細胞、ヒト細胞、およびマウス細胞からなる群より選択される、請求項３記載の組成物。
  5. 標的が寄生虫である、請求項１記載の組成物。
  6. 標的が、プラスモジウム・ファルシパルム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、トリパノソーマ・クルジ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ）、トリパノソーマ・ブルセイ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ）、またはリーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）である、請求項５記載の組成物。
  7. 標的が、化学物質、化合物、分子、または分子集合体に結合した粒子を含む、請求項１記載の組成物。
  8. 粒子が、ガラスビーズ、プラスチックビーズ、セラミックビーズ、または磁気ビーズである、請求項７記載の組成物。
  9. 第一の相が水相である、請求項１記載の組成物。
  10. 第二の相が第一の相と不混和性である、請求項９記載の組成物。
  11. 第二の相が有機相である、請求項１記載の組成物。
  12. 第二の相の密度が約１．０２から１．０４ ｇｍ／ｍｌである、請求項１記載の組成物。
  13. 第一の相の密度が約１．００ ｇｍ／ｍｌである、請求項１２記載の組成物。
  14. 第二の相が、本質的に容量でジブチルフタレート約９に対してシクロヘキサン１からなる、請求項１１記載の組成物。
  15. 第二の相が、本質的に容量でジブチルフタレート約４に対してジイソコチルフタレート６からなる、請求項１１記載の組成物。
  16. 第二の相が、本質的に容量でジブチルフタレート約３に対してビス［２−エチルヘキシル］フタレート２からなる、請求項１１記載の組成物。
  17. 細胞が臓器または組織から得られる、請求項２記載の組成物。
  18. 細胞が培養細胞である、請求項２記載の組成物。
  19. 第二の相が水相である、請求項１２記載の組成物。
  20. 第二の相が、糖、塩、またはポリマーを含む、請求項１９記載の組成物。
  21. ポリマーがポリエチレングリコール、フィコール、またはパーコールである、請求項２０記載の組成物。
  22. 結合したファージが第二の相に入り、未結合のファージが第一の相に残る、以下を含む方法：
    ａ）第一の相において標的をファージディスプレイライブラリに曝露する段階；ｂ）第一の相を第二の相に曝露する段階；および
    ｃ）標的に結合したファージを未結合のファージから分離する段階。
  23. 第一の相が水相である、請求項２２記載の方法。
  24. 第二の相が有機相である、請求項２３記載の方法。
  25. 沈殿物を形成するために、有機相を通って標的に結合したファージを遠心分離する段階をさらに含む、請求項２４記載の方法。
  26. 標的が単離された細胞または小さな細胞塊を含む、請求項２２記載の方法。
  27. 細胞が、細菌、単細胞生物、酵母、カビ、真菌、アメーバ、ジアルジア（Ｇｉａｒｄｉａ）、レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、白血病細胞、癌細胞、幹細胞、胚細胞、骨髄細胞、脾細胞、赤血球、リンパ球、肝細胞、リンパ節細胞、脈管形成細胞、尿路上皮細胞、哺乳類細胞、動物細胞、植物細胞、ヒト細胞、およびマウス細胞からなる群より選択される、請求項２６記載の方法。
  28. 標的が寄生虫である、請求項２２記載の方法。
  29. 標的が、プラスモジウム・ファルシパルム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、トリパノソーマ・クルジ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ）、トリパノソーマ・ブルセイ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ）、またはリーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）である、請求項２８記載の方法。
  30. 標的が、化学物質、化合物、分子、または分子集合体に結合した粒子を含む、請求項２２記載の方法。
  31. 粒子が、ガラスビーズ、プラスチックビーズ、セラミックビーズ、または磁気ビーズである、請求項３０記載の方法。
  32. 第一の相の密度が約１．００ ｇｍ／ｍｌであって、第二の相の密度が約１．０２から１．０４ ｇｍ／ｍｌである、請求項２２記載の方法。
  33. 第二の相が、本質的に容量でジブチルフタレート約９に対してシクロヘキサン１からなる、請求項２４記載の方法。
  34. 第二の相が、本質的に容量でジブチルフタレート約４に対してジイソコチルフタレート６からなる、請求項２４記載の方法。
  35. 第二の相が、本質的に容量でジブチルフタレート約３に対してビス［２−エチルヘキシル］フタレート２からなる、請求項２４記載の方法。
  36. 結合したファージを沈殿物から回収する段階をさらに含む、請求項２５記載の方法。
  37. 結合したファージを回収する段階が、ファージインサートを増幅する段階を含む、請求項３６記載の方法。
  38. ファージインサートがターゲティングペプチド配列をコードする、請求項３７記載の方法。
  39. インサートを配列決定する段階をさらに含む、請求項３８記載の方法。
  40. 結合したファージを回収する段階が細菌にファージを感染させる段階を含む、請求項３６記載の方法。
  41. 以下をさらに含む、請求項２２記載の方法：
    ｉ）第一の標的に対してライブラリを予めスクリーニングする段階；
    ｉｉ）未結合のファージを回収する段階；および
    ｉｉｉ）第二の標的に対して未結合のファージをスクリーニングする段階。
  42. 第一の標的が正常細胞を含み、第二の標的が疾患細胞を含む、請求項４１記載の方法。
  43. 疾患が、癌、白血病、前立腺癌、卵巣癌、乳癌、肺癌、皮膚癌、転移性癌、糖尿病、関節炎、自己免疫疾患、アルツハイマー病、パーキンソン病、ホジキン病、カポジ肉腫、ＡＩＤＳ、ウイルス感染症、ＨＩＶ感染症、細菌感染症、心血管疾患、または変性疾患である、請求項４２記載の方法。
  44. 第一の標的が非病原性生物であって、第二の標的が病原性生物である、請求項４１記載の方法。
  45. 第一の標的が、プラスモジウム・ビバックス（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘ）またはプラスモジウム・ガリナセウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｇａｌｌｉｎａｃｅｕｍ）であって、第二の標的がプラスモジウム・ファルシパルム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）である、請求項４４記載の方法。
  46. 生物が細菌、単細胞生物、または寄生虫である、請求項４４記載の方法。
  47. 第一の標的が静止状態の細胞を含み、第二の標的が活性化細胞を含む、請求項４１記載の方法。
  48. 細胞がホルモン、増殖因子、神経伝達物質、サイトカイン、ケモカイン、薬剤、麻薬、血管新生剤、βアゴニスト、ホスホジエステラーゼ阻害剤、殺虫剤、毒素または薬物によって活性化される、請求項４７記載の方法。
  49. 所望の程度の選択性または親和性を有するターゲティングペプチドが得られるまで、スクリーニング技法を繰り返す段階をさらに含む、請求項３６記載の方法。
  50. ＢＲＡＳＩＬ（選択的相互作用リガンドのバイオパニング迅速分析法）によって調製される、ターゲティングペプチド。
  51. 請求項５０記載のターゲティングペプチドをコードする核酸を含む発現ベクター。
  52. 治療タンパク質またはペプチドをコードする核酸をさらに含む、請求項５１記載の発現ベクター。
  53. 治療タンパク質またはペプチドが、前アポトーシス剤、抗血管新生剤、血管新生剤、ホルモン、サイトカイン、ケモカイン、増殖因子、細胞毒性剤、抗生物質、生存因子、抗アポトーシス剤、ホルモン拮抗剤、抗体、または抗体のＦａｂ断片である、請求項５２記載の発現ベクター。
  54. 前アポトーシス剤がグラミシジン、マガイニン、メリチン、デフェンシン、セクロピン、
    Figure 2004530404
    である、請求項５３記載の発現ベクター。
  55. 抗血管新生剤が、トロンボスポンジン、アンジオスタチン５、色素上皮由来因子、アンジオテンシン、ラミニンペプチド、フィブロネクチンペプチド、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤、組織メタロプロテナーゼ阻害剤、インターフェロン、インターロイキン１２、ＩＰ−１０、Ｇｒｏ−β、プロリフェリン関連タンパク質、アンジオポエチン２（レジェネロン）、インターフェロン−α、１６Ｋプロラクチン断片、エンドスタチン、および血小板因子４からなる群より選択される、請求項４３記載の発現ベクター。
  56. サイトカインが、インターロイキン１（ＩＬ−１）、ＩＬ−２、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、ＩＦ−α、ＩＦ−β、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、またはＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子）である、請求項４３記載の発現ベクター。
  57. ターゲティングペプチドがＢＲＡＳＩＬによって同定される、治療物質に結合したターゲティングペプチドを含む組成物。
  58. 治療物質が、薬物、化学療法剤、放射性同位元素、前アポトーシス剤、抗血管新生剤、ホルモン、サイトカイン、増殖因子、細胞障害剤、ペプチド、タンパク質、抗生物質、抗体、抗体のＦａｂ断片、造影剤、核酸、抗原、生存因子、抗アポトーシス剤、ホルモン拮抗剤、ウイルス、細胞、細菌、酵母、または哺乳類細胞である、請求項５７記載の組成物。
  59. 配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：１１、配列番号：１３から配列番号：１２４の任意の配列、または配列番号：１２８から配列番号：２８９の如何なるものから選択される配列の少なくとも３つの連続アミノ酸を含む、大きさがアミノ酸１００個またはそれ未満の、単離ペプチド。
  60. 大きさがアミノ酸２５個またはそれ未満である、請求項５９記載の単離ペプチド。
  61. 大きさがアミノ酸１０個またはそれ未満である、請求項５９記載の単離ペプチド。
  62. 大きさがアミノ酸５個またはそれ未満である、請求項５９記載の単離ペプチド。
  63. ペプチドが、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：１１、配列番号：１３から配列番号：１２４の任意の配列、または配列番号：１２８から配列番号：２８９の任意の配列から選択される配列の、少なくとも５つの連続アミノ酸を含む、請求項５９記載の単離ペプチド。
  64. ペプチドが、薬物、化学療法剤、放射性同位元素、前アポトーシス剤、抗血管新生剤、ホルモン、サイトカイン、増殖因子、細胞障害剤、ペプチド、タンパク質、抗生物質、抗体、抗体のＦａｂ断片、造影剤、抗原、生存因子、抗アポトーシス剤、ホルモン拮抗剤、ウイルス、細胞、細菌、酵母細胞、または哺乳類細胞に結合している、請求項５９記載の単離ペプチド。
  65. 抗血管新生剤が、トロンボスポンジン、アンジオスタチン５、色素上皮由来因子、アンジオテンシン、ラミニンペプチド、フィブロネクチンペプチド、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤、組織メタロプロテナーゼ阻害剤、インターフェロン、インターロイキン１２、血小板因子４、ＩＰ−１０、Ｇｒｏ−β、２−メトキシエストラジオール、プロリフェリン関連タンパク質、カルボキシアミドトリアゾール、ＣＭ１０１、マリマスタット、ペントサンポリスルフェート、アンジオポエチン２（レジェネロン）、インターフェロン−α、ハービマイシンＡ、ＰＮＵ １４５１５６Ｅ、１６Ｋプロラクチン断片、リノミド、タリドミド、ペントキシフィリン、ゲニステイン、ＴＮＰ−４７０、エンドスタチン、パクリタキセル、ドセタキセル、ポリアミン、プロテオソーム阻害剤、キナーゼ阻害剤、ＳＵシグナル伝達阻害剤、アキュチン（ａｃｃｕｔｉｎ）、シドフォビル（ｃｉｄｏｆｏｖｉｒ）、ビンクリスチン、ブレオマイシン、ＡＧＭ−１４７０、血小板因子４およびミノサイクリンからなる群より選択される抗血管新生剤から選択される、請求項６４記載の単離ペプチド。
  66. ウイルス、バクテリオファージ、細菌、酵母細胞、リポソーム、微粒子、磁気ビーズ、細胞、または微小装置（ｍｉｃｒｏｄｅｖｉｃｅ）に結合している、請求項５９記載の単離ペプチド。
  67. 真核細胞発現ベクターに結合している、請求項５９記載の単離ペプチド。
  68. 以下を含む標的化輸送のための方法：
    ａ）ＢＲＡＳＩＬによってペプチドを選択する段階；
    ｂ）該ペプチドを治療物質に結合させる段階；および
    ｃ）該ペプチドと該物質とを被験者に提供する段階。
  69. 以下を含む造影方法：
    ａ）ＢＲＡＳＩＬによってペプチドを選択する段階；
    ｂ）該ペプチドを造影剤に結合させる段階；
    ｃ）該ペプチドと該物質とを被験者に提供する段階；および
    ｄ）被験者の像を得る段階。
  70. 以下を含む、疾患状態を診断する方法：
    ａ）ペプチドが疾患状態に関連した細胞にターゲティングされる、ＢＲＡＳＩＬによってペプチドを選択する段階；
    ｂ）被験者に該ペプチドを投与する段階；および
    ｃ）該被験者における該ペプチドの分布を決定する段階。
  71. 疾患状態が、糖尿病、炎症疾患、関節炎、アテローム性動脈硬化症、癌、自己免疫疾患、細菌感染症、ウイルス感染症、心血管疾患および変性疾患からなる群より選択される、請求項７０記載の方法。
  72. 以下を含む、疾患状態を治療する方法：
    ａ）ペプチドが疾患状態に関連した細胞にターゲティングされる、ＢＲＡＳＩＬによってペプチドを選択する段階；
    ｂ）該疾患状態を治療するために有効な、一つまたは複数の分子を該ペプチドに結合させる段階；および
    ｃ）疾患状態を有する被験者に該ペプチドを投与する段階。
  73. 疾患状態が、糖尿病、炎症疾患、関節炎、アテローム性動脈硬化症、癌、自己免疫疾患、細菌感染症、ウイルス感染症、心血管疾患および変性疾患からなる群より選択される、請求項７２記載の方法。
  74. 細胞をファージライブラリに曝露する前に細胞をソーティングする段階をさらに含む、請求項２６記載の方法。
  75. 細胞がＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞ソーティング）によってソーティングされる、請求項７４記載の方法。
  76. 細胞が白血病患者と共に被験者から得られ、白血病細胞がファージライブラリに曝露するために選択される、請求項７５記載の方法。
  77. ライブラリが同じ被験者からの正常細胞に対して予め差し引かれる、請求項７６記載の方法。
  78. 配列が
    Figure 2004530404
    から選択される、請求項５９記載の単離ペプチド。
  79. 配列が
    Figure 2004530404
    から選択される、請求項５９記載の単離ペプチド。
  80. 配列が
    Figure 2004530404
    から選択される、請求項５９記載の単離ペプチド。
  81. 配列が
    Figure 2004530404
    から選択される、請求項５９記載の単離ペプチド。
  82. 配列が
    Figure 2004530404
    から選択される、請求項５９記載の単離ペプチド。
  83. 因子によって刺激される、請求項２６記載の方法。
  84. 因子がホルモン、増殖因子、サイトカイン、ケモカイン、または神経伝達物質である、請求項８３記載の方法。
  85. 細胞がトランスジェニックタンパク質を発現するようにトランスフェクトされている、請求項２６記載の方法。
  86. 細胞がトランスジェニックタンパク質を発現するように遺伝子操作されている、請求項２６記載の方法。
  87. 細胞がトランスジェニックタンパク質を発現するように後成的に操作されている、請求項２６記載の方法。
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