JP6336400B2 - 標的タンパク質上の相互作用部位を特性決定する方法 - Google Patents
標的タンパク質上の相互作用部位を特性決定する方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP6336400B2 JP6336400B2 JP2014555897A JP2014555897A JP6336400B2 JP 6336400 B2 JP6336400 B2 JP 6336400B2 JP 2014555897 A JP2014555897 A JP 2014555897A JP 2014555897 A JP2014555897 A JP 2014555897A JP 6336400 B2 JP6336400 B2 JP 6336400B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- peptide
- phenotype
- target protein
- binding
- phylomer
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
- G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
- G16B35/00—ICT specially adapted for in silico combinatorial libraries of nucleic acids, proteins or peptides
- G16B35/20—Screening of libraries
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
- G01N33/6845—Methods of identifying protein-protein interactions in protein mixtures
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
- C12N15/1079—Screening libraries by altering the phenotype or phenotypic trait of the host
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
- G01N33/5041—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects involving analysis of members of signalling pathways
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
- G01N33/6842—Proteomic analysis of subsets of protein mixtures with reduced complexity, e.g. membrane proteins, phosphoproteins, organelle proteins
-
- G—PHYSICS
- G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
- G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
- G16B15/00—ICT specially adapted for analysing two-dimensional or three-dimensional molecular structures, e.g. structural or functional relations or structure alignment
-
- G—PHYSICS
- G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
- G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
- G16B15/00—ICT specially adapted for analysing two-dimensional or three-dimensional molecular structures, e.g. structural or functional relations or structure alignment
- G16B15/30—Drug targeting using structural data; Docking or binding prediction
-
- G—PHYSICS
- G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
- G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
- G16B35/00—ICT specially adapted for in silico combinatorial libraries of nucleic acids, proteins or peptides
-
- G—PHYSICS
- G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
- G16C—COMPUTATIONAL CHEMISTRY; CHEMOINFORMATICS; COMPUTATIONAL MATERIALS SCIENCE
- G16C20/00—Chemoinformatics, i.e. ICT specially adapted for the handling of physicochemical or structural data of chemical particles, elements, compounds or mixtures
- G16C20/60—In silico combinatorial chemistry
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
- G01N2500/10—Screening for compounds of potential therapeutic value involving cells
Description
・この表現型を表示する能力がある哺乳類細胞をin−vitroで培養した集団を、Phylomerのライブラリーと接触させる工程;
・この接触を受けてこの表現型に変化を示す細胞を集団の中から同定する工程;
・細胞のこの表現型を変化させるPhylomerを同定する工程;
・同定したPhylomerを用意する工程;
・この用意したPhylomerと結合する細胞タンパク質を同定する工程、この細胞タンパク質が、哺乳類細胞のこの表現型を調節する標的タンパク質である;
・この標的タンパク質を用意する工程;
・この標的タンパク質と結合するPhylomerの集団を用意する工程;
・この集団内の少なくとも1つのPhylomerについて、この標的タンパク質との結合立体構造を実験的に決定する工程;および
・このタンパク質標的と相互作用するこのPhylomerの少なくとも1本の側鎖の(i)結合エネルギーの存在部位;および/または(ii)配向性を、いずれの場合にしろ、この結合立体構造を解析することにより同定する工程、
そうすることで、この標的タンパク質上の相互作用部位を特性決定する。
・この表現型を表示する能力がある哺乳類細胞をin−vitroで培養した集団を、Phylomersのライブラリーと接触させる工程;
・この接触を受けてこの表現型に変化を示す細胞を集団の中から同定する工程;
・細胞のこの表現型を変化させるPhylomerを同定する工程;
・同定したPhylomerを用意する工程;および
・この用意したPhylomerと結合する細胞タンパク質を同定する工程、
この細胞タンパク質が、哺乳類細胞のこの表現型を調節する標的タンパク質である。
・この標的タンパク質を用意する工程;
・この標的タンパク質と結合するPhylomersの集団を用意する工程;
・この集団内の少なくとも1つのPhylomerについて、この標的タンパク質との結合立体構造を実験的に決定する工程;および
・このタンパク質標的と相互作用するこのPhylomerの少なくとも1本の側鎖の(i)結合エネルギーの存在部位;および/または(ii)および/または(ii)配向性を、いずれに場合にしろ、この結合立体構造を解析することにより同定する工程、
そうすることで、この標的タンパク質上の相互作用部位を特性決定する。
・この表現型を表示する能力がある哺乳類細胞をin−vitroで培養した集団を、Phylomersのライブラリーと接触させる工程;
・この接触を受けてこの表現型に変化を示す細胞を集団の中から同定する工程;
・細胞のこの表現型を変化させるPhylomerを同定する工程;
・同定したPhylomerを用意する工程;
・この用意したPhylomerと結合する細胞タンパク質を同定する工程、この細胞タンパク質が、哺乳類細胞のこの表現型を調節する標的タンパク質である;
・この標的タンパク質およびこの用意したPhylomerを用意する工程;および
・このPhylomerとこの標的タンパク質との結合に対する試験化合物の効果を測定する工程、このPhylomerとこの標的タンパク質との結合度合いを調節する試験化合物が、哺乳類細胞のこの表現型の調節剤候補である。
この表現型を表示する能力がある哺乳類細胞をin−vitro培養した集団を、Phylomerのライブラリーに接触させる工程;
この接触を受けてこの表現型に変化を示す細胞を集団の中から同定する工程;
細胞のこの表現型を変化させるPhylomerを同定する工程;
同定したPhylomerを用意する工程;
この用意したPhylomerと結合する細胞タンパク質を同定する工程、この細胞タンパク質が、哺乳類細胞のこの表現型を調節する標的タンパク質である;
この標的タンパク質を用意する工程;
この標的タンパク質に(特に相互作用部位で)結合するPhylomerの集団を用意する工程;
この集団内の少なくとも1つのPhylomerについて、この標的タンパク質との(特に相互作用部位での)結合立体構造を実験的に決定する工程;および
このタンパク質標的と相互作用するこのPhylomerの少なくとも1本の側鎖の(i)結合エネルギーの存在部位;および/または(ii)配向性を、いずれに場合にしろ、この結合立体構造を解析することにより同定する工程、
そうすることで、この標的タンパク質上の相互作用部位を特性決定する。
この表現型を表示する能力がある哺乳類細胞をin−vitroで培養した集団を、Phylomerのライブラリーと接触させる工程;
この接触を受けてこの表現型に変化を示す細胞を集団の中から同定する工程;
細胞のこの表現型を変化させるPhylomerを同定する工程;
同定したPhylomerを用意する工程;および
この用意したPhylomerと結合する細胞タンパク質を同定する工程、
この細胞タンパク質が、哺乳類細胞のこの表現型を調節する標的タンパク質である。
この標的タンパク質およびこの用意されたPhylomerを用意する工程;および
このPhylomerとこの標的タンパク質の(特に相互作用部位での)結合に対する試験化合物の効果を決定する工程、
このPhylomerとこの標的タンパク質の結合度合いを調節する試験化合物が、哺乳類細胞の上記表現型の調節剤候補である。
この表現型を表示する能力がある哺乳類細胞をin−vitroで培養した集団を、Phylomerのライブラリーと接触させる工程;
この接触を受けてこの表現型に変化を示す細胞を集団の中から同定する工程;
細胞のこの表現型を変化させるPhylomerを同定する工程;
同定したPhylomerを用意する工程;
この用意したPhylomerと結合する細胞タンパク質を同定する工程、この細胞タンパク質が、哺乳類細胞のこの表現型を調節する標的タンパク質である;
この標的タンパク質およびこの用意したPhylomerを用意する工程;および
このPhylomerとこの標的タンパク質の結合に対する試験化合物の効果を決定する工程、
このPhylomerとこの標的タンパク質の結合度合いを調節する試験化合物が、哺乳類細胞のこの表現型の調節剤候補である。
この標的タンパク質を用意する工程;
この標的タンパク質と結合するPhylomerの集団を用意する工程;
この集団内の少なくとも1種のPhylomerのこの標的タンパク質との結合立体構造を実験的に決定する工程;および
このタンパク質標的と相互作用するこのPhylomerの少なくとも1本の側鎖の(i)結合エネルギーの存在部位;および/または(ii)配向性を、いずれの場合にしろ、この結合立体構造を解析することにより同定する工程、
それにより、この標的タンパク質上の相互作用部位を特性決定する。
Phylomer断片の作成
配列決定された細菌ゲノム由来のゲノムDNA(表1)を、例えば、アメリカ培養細胞系統保存機関から入手し、ランダム低温線形増幅法用テンプレートとして用いた。増幅は、増幅の偏りを最小限にする目的で、ATとGCのどちらが豊富な配列でも等しい効率でアニーリングするように設計された増幅プロトコルで、FLAGタグを含有するランダム縮重プライマー(BGF−N6およびBGF−N9)を用いたプライマー伸長法により、クレノー断片を用いて行なわれた。増幅は、以下のとおりの4つのラウンドにわたって行なわれた:
・増幅ラウンド1:3.33uMのBGF−N6プライマー、1×のクレノー緩衝液、200uMのdNTP、DNAポリメラーゼIのクレノー断片、PEG(8500)を、合計体積で30ul。プライマー、DNA、および水を混合する;3〜5分間沸騰させ、氷上で急冷し、次いでその他の試薬の入った管に移す。15℃で30分間、室温で2時間、次いで37℃で15分間インキュベートする。
・増幅ラウンド2:管を5分間沸騰させ、急冷し、0.5ulのクレノー酵素を加える。15℃で30分間、室温で2時間、次いで37℃で15分間インキュベートする。
・増幅ラウンド3:管を5分間沸騰させ、急冷し、以下を加える:4μΙのBGF−N9プライマー(25uM)、1μΙの10×緩衝液、3ulのdNTP(2mM)、0.5ulのクレノー、1.5ulの水。15℃で30分間、室温で2時間、次いで37℃で15分間インキュベートする。
・増幅ラウンド4:管を5分間沸騰させ、急冷し、0.5μlのクレノー酵素を加える。15℃で30分間、室温で2時間、次いで37℃で15分間インキュベートする。生成物は、Ampliconスピンカラムを用いて精製した。
・BGF−N6:GACTACAAGGACGACGACGACAAGGCTTATCAATCAATCANNNNNN(配列番号1)
・BGF−N9:GACTACAAGGACGACGACGACAAGGCTTATCAATCAATCANNNNNNNNN(配列番号2)
・BGF−F5:GAGAGgaattcAGGTCAGACTACAAGGACGACGACGACAAG(配列番号3)
・BGF−R6−Acc651:GAGAGggtaccAGGTCAGACTACAAGGACGACGACGACAAG(配列番号4)
標的に基づくスクリーニング(本実施例では、酵母菌二重ハイブリッドに基づくスクリーニングを用いる)用のphylomerライブラリーを作成するため、リスト1(表2)の生物種から上記のとおりにして得た生物学的に多様な遺伝子断片を、Gateway組換えクローニングシステム(Invitrogen)のpCR8/GW/TOPO−TAエントリーベクター中にクローン化して、1.7×107cfuのライブラリーを作った。このライブラリー全体の挿入断片を、Gateway組換えクローニング技術を用いて、「デスティネーション」ベクターであるpJG4−5由来の酵母菌二重ハイブリッドプレイベクターに移した。この技術は、膜利用Ras動員二重ハイブリッドシステム(Hennemann et al.,2003;Walhout et al.,2000)に匹敵するものであった。
驚いたことに、Phylomerライブラリーで哺乳類細胞の表現型スクリーニングを行なうと非常に高いヒット率になることが見いだされた。約3,000のクローンに限定したライブラリーから、14の最初のヒットが選択された:ランダムペプチドライブラリーで既に報告されたもの(非特許文献4;Xu and Luo 2002;Xu et al.,2001)よりはるかに高いヒット率である。確認実験から、そのように同定されたPhylomerは、試験した表現型に対する特異性を示すことがわかった;哺乳類細胞の表現型に影響を及ぼす多様なPhylomerペプチドを同定するこのアプローチの正当性を立証するものである。
Rosetta2(DE3)細胞中のpDEST−HisMBP発現ベクターから、ペプチド25C3をHis−MBPタグ付き融合構築物として発現させた(Nallamsetty et al.,2005)。簡単に言うと、細胞を、500mlの2YTブロス(0.4%のグルコース、50ug/mLのカルベニシリン、30ug/mLのクロラムフェニコールを補充)中、37℃で、OD595が0.6になるまで増殖させ、0.6になったら、37℃で1mMのIPTGを用いて、2時間、タンパク質発現を誘導した。細胞をPBS(pH8.0)に入れて洗浄し、50mlの溶解緩衝液(PBS(pH8.0)、1.0mMのPMSF、コンプリートプロテアーゼインヒビタータブレット)に入れて超音波処理(2x1.0分間、デューティ比80%)することにより溶解させ、溶解液を43,146gで20分間遠心分離することにより清澄させた。SDS−PAGE(12%)分析により、溶解性画分中にペプチド融合物が保持されていることを確認した。
本発明者らは、Phylomer 25C3(好極限性細菌ディノコッカス・ラディオデュランス(Deinococcus racfiodurans)に由来する)を選択して、その細胞結合パートナーを同定するさらなる研究を行なった。驚いたことに、直接表現型スクリーニングで高いヒット率が観測されるだけでなく、一次ヒットが、哺乳類細胞の表現型を調節するタンパク質標的を同定するのに直接用いることができるほど高い安定性および親和性を有することが見いだされた。
バイオレイヤー干渉法を用いて、25C3とMAP4K4のCNHドメインとの結合親和性をin vitroで測定することにより、標的とPhylomerの相互作用の結合親和性を特性決定した(図5および表3)。
上記のバイオレイヤー干渉アッセイを用いて、Phylomerとその標的タンパク質との結合度合いに影響を及ぼす化合物を同定する。簡単に言うと、25C3/MAP4K4−CNH結合アッセイを上記のとおりに確立させるが、ただしモル過剰(例えば、10mM)の試験化合物をさらに存在させて、KDの値に対する試験化合物の効果を測定する。MAP4K4−CNHに対する25C3の結合と競合、これをかく乱、および/またはこれを阻害することができる化合物を、標的タンパク質と結合する化合物とみなす。
本発明者らは、25C3の過剰発現が、MAP4K4依存性細胞反応を歪める可能性があることを実証しようと努めた。最近のデータから、MAP4K4は遊走促進性キナーゼであり、胚発生中の細胞運動を制御していること(Xue et al.,2001)およびモデル細胞遊走アッセイで細胞運動を制御していること(Collins et al.,2006)が示されている。そこで、本発明者らは、U2oS細胞で25C3を過剰発現させ、微速度撮影法を用いて細胞が欠損を塞ぐのにかかる時間を精査した(図7)。25C3は細胞の遊走および傷の塞がりを顕著に遅くし、引っ掻いた後24時間経過してもその欠損は開いたままであった。これにより、25C3がMAP4K4阻害の効果を表現型模写する可能性があることが実証された。
酵母菌サッカロマイセス・セレビシエ中の分裂促進因子信号伝達経路の活性化に基づく、SOS動員システム(Aronheim et al.,1997)に類似した新規細胞質スクリーニングシステムが、用いられる。簡単に言うと、組換えベイトタンパク質は、ヒトMAP4K4−CNHを切断形hSos1の翻訳領域に融合させる。このベイトを構成的に発現させる発現プラスミド(Gietz and Schiestl,2007)を、Phylomerペプチドライブラリー(上記のとおりに調製)とともに、cdc25−2酵母菌株に同時形質転換させる。Phylomerペプチドは、膜付着用脂質化シグナルとの融合物として誘導GAL1プロモーターから発現される。ベイトタンパク質とプレイタンパク質の相互作用を、温度感受性変異体(cdc25−2)により内因性RAS経路を制御することができる酵母菌株で試験する。推定状の相互作用物質を、制限温度(37℃)に移し、ガラクトース依存性について試験することで、MAP4K4と相互作用するPhylomerを同定する。これらのクローンに含まれる、ペプチドをコードする挿入物を単離して、配列決定を行なうことにより、標的タンパク質MAP4K4に結合するPhylomerの集団を同定、ひいては増大および提供を行なう。
標的タンパク質MAP4K4と結合する集団に含まれるPhylomerを、上記のとおりに同定された複数のPhylomerを合成(上記のとおり)することにより用意する。そのようなPhylomerから構造的または配列的に多様な組を選択する。標的タンパク質MAP4K4を、精製した組換え産物として、および1つ以上の結合Phylomer用に用意し、そのようなPhylomerそれぞれを、標準手順を用いて精製MAP4K4と共結晶化させるか、あるいは予め確立させたMAP4K4結晶に浸透させる。次いで、Phylomer配位結晶でX線回折による結晶解析を行なうことにより、そのようなPhylomerとMAP4K4の結合立体構造を、実験的に決定する。実験による回折データは、適切な設備(Swiss Light Source、Diamond Light Source、またはEuropean Synchrotron Radiation Facilityなど)で集め、そのような実験データを適切なプログラムパッケージ(XDSなど)で処理する。CCP4プログラム群に含まれるMolrep5またはPhaser6を用いて、分子置換法により構造を解析する。Cootを用いて分子モデルを手動で再構築し、Refmacを用いて構造の精度を上げる。次いで、Phylomer/標的複合体を、画像化環境(SchrodingerまたはAccelrysのものなど)にて、使用者により査定する。
結合Phylomerと標的タンパク質の相互作用について1つ以上の結合立体構造を上記のとおりに集める。コンピューターを利用し分析の助けも借りて結合立体構造を綿密調査することにより、Phylomer上の特定残基または位置とMAP4K4の相互作用部位のアミノ酸残基とのコンセンサス結合相互作用を同定することができる。結合相互作用(エネルギー)のそのような「ホットスポット」の場所は、相互作用部位を特性決定する1つのアプローチを提供する。そのようなホットスポットは、当業者には明らかであるだろう。例えば、疎水性Phylomerアミノ酸側鎖が標的タンパク質表面にある疎水性ポケットに収まること、または電荷を帯びたPhylomerアミノ酸側鎖が標的タンパク質内の反対極性の電荷付近に行くことである。
本明細書中に記載される方法により提供されるとおりの相互作用部位の特性決定を考慮すると、1つ以上のPhylomerに結合する複数の似た領域を有する、または特性決定された相互作用部位のコンピューターモデル内にドッキング可能であるリガンドの構造を、コンピューター上の方法で、同定することができる。適切なコンピューターモデリング、画像化、仮想スクリーニング、および/またはドッキングプログラムとして、Schrodinger環境(Schridinger Inc,USA)、特に「Glide」に含まれるプログラム、およびAccelrys環境に含まれる類似プログラムが挙げられる。これらのコンピューター環境に利用される確立された力場を用いて、提案される小分子リガンドについて、結合エネルギーに寄与する相対エンタルピーおよびエントロピーを予測し、合計することで、結合の自由エネルギーを計算する。強力なコンピューター資源を併用し、市販されている小分子の構造の仮想ライブラリーを組立てて、標的タンパク質に対してスクリーニングすることができ、そのデータは順位付けされた結合自由エネルギー予測値の形となって表れる。このようにして、数百万の化合物からなる仮想ライブラリーを、もっと小数の分子ライブラリーに格付け分類することができ、そのような分子を、実験アッセイにより、標的タンパク質との結合についてより都合よく確認することができる。
Claims (39)
- 小分子リガンドによりドッキング可能な標的タンパク質上の相互作用部位を特性決定する方法であって、前記標的タンパク質は、哺乳類細胞の表現型を調節するものであり、該方法は、以下の工程を含み:
(i)該表現型を表示する能力がある哺乳類細胞をin−vitroで培養した集団を、微生物のゲノム、またはコンパクトなゲノムを有する真核生物のゲノムから得ることができる核酸断片によりコードされる、約8個〜約180個のアミノ酸からなるペプチドのライブラリーと接触させる工程;
(ii)該接触を受けて該表現型に変化を示す細胞を該集団の中から同定する工程;
(iii)該ペプチドのライブラリーから前記細胞の該表現型を変化させるペプチドを同定する工程;
(iv)前記同定したペプチドを用意する工程;
(v)該用意した同定したペプチドと結合する細胞タンパク質を同定する工程、該細胞タンパク質が、前記哺乳類細胞の該表現型を調節する標的タンパク質である;
(vi)該標的タンパク質を用意する工程;
(vii)微生物のゲノム、またはコンパクトなゲノムを有する真核生物のゲノムから得ることができる核酸断片によりコードされる、約8個〜約180個のアミノ酸からなる結合ペプチドの集団であって、該集団の前記ペプチドは該標的タンパク質と結合するために前記同定したペプチドと競合する、集団を用意する工程;
(viii)
異なる配列を有する複数の結合ペプチドであって、少なくとも1つの該結合ペプチドは前記細胞の該表現型も変化させ;該複数の結合ペプチドは結合ペプチドの該集団から同定されている、該標的タンパク質との結合立体構造を実験的に決定する工程;
(ix)該標的タンパク質と相互作用する該結合ペプチドの少なくとも1本の側鎖の(i)結合エネルギーの存在部位;および/または(ii)配向性を、いずれの場合にしろ、該結合立体構造を解析することにより該相互作用部位の三次元構造を特性決定することで、同定する工程、
(x)小分子リガンドをコンピューター上で三次元構造にドッキングする工程;および/または、
(xi)小分子リガンド候補の存在下で、前記標的タンパク質を前記少なくとも1つの該結合ペプチドと接触させる工程、および、前記小分子リガンド候補が前記少なくとも1つの結合ペプチドと前記標的タンパク質の結合度合いを調節するかどうかを決定する工程、
そうすることで、小分子リガンドによりドッキング可能な標的タンパク質上の該相互作用部位を特性決定する、方法。
- 哺乳類細胞の前記表現型は、以下:
細胞信号伝達経路の調節、
生存能力、老化、分化、遊走、侵襲、走化性、アポトーシス、免疫学的アネルギー、表面マーカー発現、細胞周期の進行、転写活動、タンパク質発現、グリコシル化、感染抵抗力、浸透、およびレポーター遺伝子活動
からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。 - (i)該ペプチドライブラリーは、複数の分離しかつアドレス指定可能なペプチドを含む;または(ii)該ペプチドライブラリーは、該ライブラリーのペプチドをコードする複数の分離しかつアドレス指定可能な核酸から発現する、
請求項1から2のいずれか1項に記載の方法。 - (i)該複数の分離しかつアドレス指定可能なペプチドは、アレイ形式に配列された該哺乳類細胞集団と接触させられ;または(ii)該複数の分離しかつアドレス指定可能な核酸は、アレイ形式に配列された該哺乳類細胞集団で発現する;および/または
該接触または該発現を受けて該表現型に変化を示す該細胞は、アレイ形式に配列された該哺乳類細胞集団から同定され;
各場合において、該アレイ形式は、プレートを利用したアッセイシステムである、
請求項3に記載の方法。 - (i)該ペプチドライブラリーは、微生物のゲノム、または真核生物の小型のゲノムから得ることができる核酸断片によりコードされる、約8個〜約180個のアミノ酸からなるプールした複数の該ペプチドを含む;または(ii)該ペプチドライブラリーは、該ペプチドをコードするプールした複数の核酸から発現される、請求項1または請求項2に記載の方法。
- (i)該ペプチドは、プールした形式に配列された該哺乳類細胞集団と接触させられる;または(ii)該複数のプールした核酸は、プールした形式に配列された該哺乳類細胞集団で発現される、請求項5に記載の方法。
- 前記集団中の前記接触または発現を受けて前記表現型に変化を示す前記細胞は、蛍光標識細胞分取法を用いて同定される、請求項5または6に記載の方法。
- (i)該ペプチドライブラリーは、3×104以上の異なるアミノ酸配列を含み;(ii)または該ペプチドライブラリーは、該ペプチドをコードする、1×106以上など3×104以上の異なる核酸配列を含む複数の核酸から発現され;および/または
(a)該ペプチドライブラリーは、1×106以上など3×104以上の異なるペプチドを含み;または(b)該ペプチドライブラリーは、微生物のゲノム、または真核生物の小型のゲノムから得ることができる核酸断片によりコードされる、約8個〜約180個のアミノ酸からなる、1×106以上など3×104以上の異なるペプチドをコードする複数の核酸から発現される、
請求項1から7のいずれか1項に記載の方法。 - 前記ペプチドライブラリーとの接触を受けて表現型に前記変化を示す前記細胞を、前記哺乳類細胞の集団から単離する工程を含む、請求項1から8のいずれか1項に記載の方法。
- (i)該単離された細胞から、前記ペプチドが単離および/または同定される;あるいは(ii)、前記単離された細胞から、前記ペプチドをコードする核酸を増幅および/またはクローン化することにより、該核酸が単離される、請求項9に記載の方法。
- (i)前記単離されたペプチドは、配列決定される;または(ii)前記ペプチドをコードする前記単離された核酸は、配列決定される、請求項10に記載の方法。
- 前記用意されたペプチドは、該ペプチドおよび親和タグを含む融合タンパク質の一部として用意される、請求項1から11のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞タンパク質を同定する工程の前に、前記用意されたペプチドと結合する細胞タンパク質を単離する工程を含む、請求項1から12のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞タンパク質は、前記用意されたペプチドと前記細胞タンパク質が結合できる条件下で、哺乳類細胞抽出物を前記用意されたペプチドと接触させ、前記用意されたペプチドとこれに結合した前記細胞タンパク質を含む複合体を単離することにより単離される、請求項10に記載の方法。
- 該複合体は、精製により単離され;
該精製は、前記用意されたペプチドおよび親和タグを含む融合タンパク質内の該親和タグを用いて実行される、
請求項14に記載の方法。 - 前記細胞タンパク質は、質量分析により、または前記用意されたペプチドを用いたタンパク質マイクロアレイ分析により同定される、請求項1から15のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ペプチド集団内に用意されるペプチドのうち少なくとも1つを、前記表現型を表示することができる哺乳類細胞の該表現型を調節する能力について試験する工程を含む、請求項1から16のいずれか1項に記載の方法であって;
該試験する工程は、前記表現型を表示することができる哺乳類細胞を該ペプチドと接触させる工程、および該哺乳類細胞の前記表現型が調節されるかどうかを決定する工程を含む、方法。 - 前記用意された標的タンパク質は、単離された形で用意される、請求項1から17のいずれか1項に記載の方法。
- 前記単離された標的タンパク質は、固定化されている、請求項18に記載の方法。
- 前記用意された標的タンパク質は、前記標的タンパク質をコードするヌクレオチド配列が宿主細胞で発現することにより用意される、請求項1から18のいずれか1項に記載の方法。
- 該結合するペプチド集団の用意に先立ち、微生物のゲノム、または真核生物の小型のゲノムから得ることができる核酸断片によりコードされる、約8個〜約180個のアミノ酸からなるペプチドのライブラリー、または該ペプチドをコードする核酸のライブラリーを、該コードされたペプチドと前記標的タンパク質の結合についてスクリーニングすることにより、該結合するペプチド集団を得る工程をさらに含む、請求項1から20のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ペプチドライブラリーまたは前記核酸ライブラリーは、請求項8で定義されるとおりのものである、請求項21に記載の方法。
- 前記ライブラリーは、二重ハイブリッドスクリーニングまたはファージディスプレイ法を用いてスクリーニングされる、請求項21または請求項22に記載の方法。
- 前記ライブラリーは、in vitroディスプレイ法を用いてスクリーニングされる、請求項21または請求項22に記載の方法。
- 前記標的タンパク質に結合するペプチドの前記集団は、少なくとも5つのペプチドを含む、請求項1から24のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ペプチド集団内で、ペプチドの亜集団を同定する工程を含み、該亜集団は、異なる配列のペプチドを含むものである、請求項1から25のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ペプチド集団内のペプチドのうち少なくとも1つについて、該標的タンパク質との結合親和性を測定する工程をさらに含む、請求項1から26のいずれか1項に記載の方法。
- 前記標的タンパク質と高い親和性で結合するペプチドの亜集団を、前記ペプチド集団内で同定する工程を含む、請求項27に記載の方法。
- 前記亜集団は、少なくとも3つのペプチドを含む、請求項26または請求項28に記載の方法。
- 前記亜集団のペプチドのうち少なくとも1つについて、前記標的タンパク質との結合立体構造が実験的に決定されている、請求項26、28、または29のいずれか1項に記載の方法。
- 前記三次元構造は、コンピューター上の方法を用いて特性決定される、請求項1から30のいずれか1項に記載の方法。
- 標的タンパク質と結合する小分子リガンドを同定する方法であって、該標的タンパク質は、哺乳類細胞の表現型を調節するものであり、該方法は、以下の:
コンピューター上の方法を用いて、該標的タンパク質の相互作用部位の三次元構造にドッキング可能な小分子リガンドの構造を同定する工程を含み、該三次元構造は請求項31に記載の方法により決定される、
方法。 - 以下の工程:
(x)前記同定された構造を有する小分子リガンドを用意する工程;
(xi)該リガンドを前記標的タンパク質と接触させる工程;および
(xii)該リガンドと前記標的タンパク質の結合を決定する工程、
をさらに含む、請求項32に記載の方法。
- 以下の工程:
前記相互作用部位と結合する、微生物のゲノム、または真核生物の小型のゲノムから得ることができる核酸断片によりコードされる、約8個〜約180個のアミノ酸からなる1つ以上のペプチドを用意する工程;および
前記リガンドが持つ、前記標的タンパク質との結合について該1つ以上のペプチドと競合する能力を決定する工程、
をさらに含む、請求項33に記載の方法。 - 以下の工程:
前記小分子リガンドが持つ、前記表現型を表示することができる哺乳類細胞の前記表現型を調節する能力を決定する工程、
をさらに含む、請求項33または請求項34に記載の方法。 - 致死表現型以外および/または増殖低下表現型以外の哺乳類細胞の表現型の調節剤候補である小分子化合物を同定する方法であって、以下の工程:
(i)該表現型を表示する能力がある哺乳類細胞をin−vitroで培養した集団を、微生物のゲノム、または真核生物の小型のゲノムから得ることができる核酸断片によりコードされる、約8個〜約180個のアミノ酸からなるペプチドのライブラリーと接触させる工程;
(ii)該接触を受けて該表現型に変化を示す細胞を該集団の中から同定する工程;
(iii)該細胞の該表現型を変化させる該ライブラリーのペプチドを同定する工程;
(iv)該同定したペプチドを用意する工程;
(v)該用意した同定したペプチドと結合する細胞タンパク質を同定する工程、該細胞タンパク質が、該哺乳類細胞の該表現型を調節する標的タンパク質である;
(vi)該標的タンパク質および該同定したペプチドを用意する工程;および
(vii)該同定したペプチドと該標的タンパク質との結合に対する小分子試験化合物の効果を決定する工程、
該同定したペプチドと該標的タンパク質との結合度合いを調節する小分子試験化合物が、該哺乳類細胞の該表現型の調節剤候補である、を含む方法。
- 以下の工程:
前記表現型を表示する能力がある哺乳類細胞を、前記調節剤候補と接触させる工程;および
前記調節剤候補が持つ、前記哺乳類細胞の前記表現型を調節する能力を決定する工程、
をさらに含む、請求項36に記載の方法。 - 哺乳類細胞の表現型を調節する標的タンパク質上の小分子リガンドによりドッキング可能な相互作用部位を特性決定する方法であって、該方法は以下の工程を含み:
(i)該標的タンパク質を用意する工程;
(ii)微生物のゲノム、または真核生物の小型のゲノムから得ることができる核酸断片によりコードされる、約8個〜約180個のアミノ酸からなるペプチドの集団を用意する工程であって、該ペプチドは該標的タンパク質と結合する、工程;
(iii)前記細胞の該表現型を変化させる該集団内の少なくとも1つのペプチドについて、該タンパク質との結合立体構造を実験的に決定する工程;および
(iv)該タンパク質標的と相互作用する該ペプチドの少なくとも1本の側鎖の(i)結合エネルギーの存在部位;および/または(ii)配向性を、いずれの場合にしろ、該結合立体構造を解析することにより同定する工程、を含み
そうすることで、該標的タンパク質上の小分子によりドッキング可能な相互作用部位を特性決定する、方法。 - 前記標的タンパク質は、細胞信号伝達経路の成分である、請求項38に記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP12154872.1 | 2012-02-10 | ||
EP12154872 | 2012-02-10 | ||
PCT/AU2013/000110 WO2013116903A1 (en) | 2012-02-10 | 2013-02-07 | Methods for the characterisation of interaction sites on target proteins |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2015508643A JP2015508643A (ja) | 2015-03-23 |
JP6336400B2 true JP6336400B2 (ja) | 2018-06-06 |
Family
ID=48946839
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2014555897A Active JP6336400B2 (ja) | 2012-02-10 | 2013-02-07 | 標的タンパク質上の相互作用部位を特性決定する方法 |
Country Status (4)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US20150105274A1 (ja) |
EP (1) | EP2812349B1 (ja) |
JP (1) | JP6336400B2 (ja) |
WO (1) | WO2013116903A1 (ja) |
Families Citing this family (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB201420218D0 (en) * | 2014-11-13 | 2014-12-31 | Cambridge Entpr Ltd | A method of screening for modulation of cell signalling pathways |
WO2017070160A1 (en) * | 2015-10-20 | 2017-04-27 | Georgetown University | Systems and methods for in silico drug discovery |
GB201522618D0 (en) * | 2015-12-22 | 2016-02-03 | Phoremost Ltd | Methods of screening |
BR112021002432A2 (pt) * | 2018-08-13 | 2021-05-04 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | seleção de proteína terapêutica em condições in vivo simuladas |
GB201816440D0 (en) | 2018-10-09 | 2018-11-28 | Phoremost Ltd | Nucleic acid libraries, peptide libraries and uses thereof |
GB201901817D0 (en) | 2019-02-11 | 2019-04-03 | Phoremost Ltd | Methods |
Family Cites Families (18)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB9015198D0 (en) | 1990-07-10 | 1990-08-29 | Brien Caroline J O | Binding substance |
DK0877752T3 (da) | 1996-01-23 | 2003-09-15 | Univ Leland Stanford Junior | Fremgangsmåder til screening af transdominante effektorpeptider og RNA molekyler |
US6551795B1 (en) * | 1998-02-18 | 2003-04-22 | Genome Therapeutics Corporation | Nucleic acid and amino acid sequences relating to pseudomonas aeruginosa for diagnostics and therapeutics |
US20060263382A1 (en) | 1998-06-20 | 2006-11-23 | Richard Hotchkiss | Membrane-permeant peptide complexes for treatment of sepsis |
WO2000041967A1 (en) | 1999-01-12 | 2000-07-20 | Western Minerals Technology Pty Ltd | Ammonia recovery |
CA2721199A1 (en) | 1999-05-05 | 2000-11-16 | Phylogica Limited | Isolating biological modulators from biodiverse gene fragment libraries |
US7270969B2 (en) * | 1999-05-05 | 2007-09-18 | Phylogica Limited | Methods of constructing and screening diverse expression libraries |
US6730293B1 (en) | 1999-08-24 | 2004-05-04 | Cellgate, Inc. | Compositions and methods for treating inflammatory diseases of the skin |
US20110131679A2 (en) * | 2000-04-19 | 2011-06-02 | Thomas La Rosa | Rice Nucleic Acid Molecules and Other Molecules Associated with Plants and Uses Thereof for Plant Improvement |
DE60142840D1 (de) * | 2000-09-08 | 2010-09-30 | Univ Texas | Durch phagendisplay identifizierte zielpeptide des menschen und der maus |
US20060105445A1 (en) | 2002-07-29 | 2006-05-18 | Klaus Godl | Medium and method for enriching, purifying or depleting atp binding proteins from a pool of proteins |
EP1732581A4 (en) | 2003-06-20 | 2008-06-04 | Univ California San Diego | POLYPEPTIDE TRANSDUCTION AND FUSOGENIC PEPTIDES |
DK1754052T3 (en) | 2004-06-03 | 2015-09-28 | Phylogica Ltd | Modulators with biochemical properties |
EP1793841B1 (en) | 2004-08-20 | 2013-04-03 | Phylogica Limited | Peptide inhibitors of c-jun dimerization and uses thereof |
US8575070B2 (en) | 2006-02-20 | 2013-11-05 | Phylogica Limited | Methods of constructing and screening libraries of peptide structures |
WO2008034161A1 (en) * | 2006-09-19 | 2008-03-27 | Phylogica Limited | Neuroprotective peptide inhibitors of ap-1 signaling and uses therefor |
US8802634B2 (en) | 2008-07-11 | 2014-08-12 | Phylogica Limited | CD40-L Inhibitory Peptides |
KR100984735B1 (ko) * | 2009-05-28 | 2010-10-01 | 동국대학교 산학협력단 | 신개념 신약개발을 위한 타겟 단백질단백질 상호작용을 저해하는 신약후보물질의 스크리닝 방법 |
-
2013
- 2013-02-07 JP JP2014555897A patent/JP6336400B2/ja active Active
- 2013-02-07 WO PCT/AU2013/000110 patent/WO2013116903A1/en active Application Filing
- 2013-02-07 EP EP13746774.2A patent/EP2812349B1/en active Active
- 2013-02-07 US US14/377,809 patent/US20150105274A1/en not_active Abandoned
-
2018
- 2018-11-13 US US16/189,848 patent/US20190204338A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2013116903A1 (en) | 2013-08-15 |
US20150105274A1 (en) | 2015-04-16 |
JP2015508643A (ja) | 2015-03-23 |
EP2812349A4 (en) | 2016-04-06 |
US20190204338A1 (en) | 2019-07-04 |
EP2812349A1 (en) | 2014-12-17 |
EP2812349B1 (en) | 2021-09-01 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US20190204338A1 (en) | Methods for the Characterisation of Interaction Sites on Target Proteins | |
Grammel et al. | A chemical reporter for protein AMPylation | |
Shen et al. | Targeting eEF1A by a Legionella pneumophila effector leads to inhibition of protein synthesis and induction of host stress response | |
Kubori et al. | Legionella translocates an E3 ubiquitin ligase that has multiple U‐boxes with distinct functions | |
Wolf et al. | In-depth profiling of the LiaR response of Bacillus subtilis | |
Minnen et al. | Control of Smc coiled coil architecture by the ATPase heads facilitates targeting to chromosomal ParB/parS and release onto flanking DNA | |
Burnaevskiy et al. | Myristoylome profiling reveals a concerted mechanism of ARF GTPase deacylation by the bacterial protease IpaJ | |
Schneider et al. | Diverse roles of TssA‐like proteins in the assembly of bacterial type VI secretion systems | |
Mitterer et al. | Sequential domain assembly of ribosomal protein S3 drives 40S subunit maturation | |
Guo et al. | Profiling substrates of protein arginine N-methyltransferase 3 with S-adenosyl-L-methionine analogues | |
Foyn et al. | Design, synthesis, and kinetic characterization of protein N-terminal acetyltransferase inhibitors | |
Jensen et al. | Histone H2A. Z acid patch residues required for deposition and function | |
Sánchez et al. | Monitoring histone methylation (H3K9me3) changes in live cells | |
Ramos et al. | Formation of tRNA wobble inosine in humans is disrupted by a millennia-old mutation causing intellectual disability | |
Verghese et al. | A lysine-rich region within fungal BAG domain-containing proteins mediates a novel association with ribosomes | |
Min et al. | Multiple Orientia tsutsugamushi ankyrin repeat proteins interact with SCF1 ubiquitin ligase complex and eukaryotic elongation factor 1 α | |
Lahiri et al. | Mycobacterium tuberculosis UvrB forms dimers in solution and interacts with UvrA in the absence of ligands | |
Chua et al. | Molecular analysis of Plasmodium falciparum co-chaperone Aha1 supports its interaction with and regulation of Hsp90 in the malaria parasite | |
Rieu et al. | The F-box protein UFO controls flower development by redirecting the master transcription factor LEAFY to new cis-elements | |
US11718849B2 (en) | Phosphopeptide-encoding oligonucleotide libraries and methods for detecting phosphorylation-dependent molecular interactions | |
Li et al. | Coupling to short linear motifs creates versatile PME-1 activities in PP2A holoenzyme demethylation and inhibition | |
Rauh et al. | MS-based in situ proteomics reveals AMPylation of host proteins during bacterial infection | |
Rogers et al. | Identification of cognate host targets and specific ubiquitylation sites on the Salmonella SPI-1 effector SopB/SigD | |
Alonso et al. | Bacterial toxin‐antitoxin systems as targets for the development of novel antibiotics | |
Izquierdo-Martinez et al. | DipM controls multiple autolysins and mediates a regulatory feedback loop promoting cell constriction in Caulobacter crescentus |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20160204 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20161108 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20170208 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20170523 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20170808 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20171020 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20171109 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20180403 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20180502 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6336400 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313117 |
|
R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |